KR20220120643A - 비피도박테리아로부터의 리포테이코산의 용도 - Google Patents

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KR20220120643A
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페란 발라구에르 비달
마리아 엔리케 로페즈
마르타 토르타자다 세라
다니엘 라몬 비달
마르타 바레나 카스티요
블레이크 함만
베아트리즈 알바레즈 페레즈
엠파르 체놀 쿠아드로스
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Abstract

본 발명은 과량의 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터 단리된 리포테이코산에 관한 것으로, 이는 지방 감소 활성이 있어 특히 다음의 적용 영역: 식품 및 음료, 애완동물 사료를 포함한 동물 사료, 영양 보충물, 유아 영양, 화장품(영양화장품 포함), 의료용 식품, 약제학적 및 수의학 적용에 이용하기에 유용하다.

Description

비피도박테리아로부터의 리포테이코산의 용도
본 발명은 식품, 사료 및 제약 산업에 속한다. 본 발명은 특히 비피도박테리아로부터 단리된 리포테이코산(lipoteichoic acid; LTA)에 관한 것으로, 이는 지방 감소 활성이 있어 특히 다음의 적용 영역: 식품 및 음료, 애완동물 사료를 포함한 동물 사료, 영양 보충물, 유아 영양, 화장품(영양화장품 포함), 의료용 식품, 약제학적 및 수의학 적용에 이용하기에 유용하다.
세계 보건 기구(WHO)에 따르면 2016년에 세계 인구의 13%인 19억 명 이상이 과체중이었고 이 중 6억 5천만 명 이상의 성인이 비만이었다. 이러한 문제에 대한 개선된 임상 및 역학 지식에도 불구하고, 비만 및 과체중의 유병률은 산업화 및 개발도상국에서 상당히 증가하였다. 비만과 과체중은 심각한 건강 결과를 초래하는 대사 및 영양 장애이며, 과체중은 비만의 정도이다. 비만은 다양한 만성 질환/장애, 예컨대 고혈압, 허혈성 심장 질환, 뇌 졸중, 2형 당뇨병 및 특정 형태의 암의 발생에서 인지된 고위험 인자이며, 이는 서방 세계의 개발도상국에서 이환율 및 사망률의 중요한 원인이다.
과체중과 비만과의 싸움에서 식품 산업은 소비자가 적절한 체중을 유지할 수 있도록 새로운 성분을 도입하였다. 연구 및 새로운 제품 개발 분야에서, 한 가지 옵션은 지방 흡수 또는 형성을 감소시킴으로써, 또는 지방 동원을 증가된 지방분해로 자극함으로써, 또는 지질 산화 속도를 개선함으로써 지방으로서 에너지의 축적을 억제함으로써 작용하는 특정 성분을 첨가하는 것이었다.
과체중 및 비만의 예방 또는 치료에 긍정적으로 작용하는 또 다른 전략은 포만감의 유도에 의해, 식욕의 대사 조절을 활성화시킴으로써, 또는 신체가 섭취된 식품으로부터 지방을 흡수하기 어렵게 함으로써, 장이 특정 유형의 지방을 흡수하는 경우에 용량을 조절함으로써 식욕을 제어 및/또는 감소시키는 것이다.
또한 장내 미생물총과 프로바이오틱스는 건강, 즉 비만에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 연구에 따르면 장내 미생물총은 체중 및 비만 연관 질환/장애를 조절하는 역할을 하는 인자이다. 락트산균(LAB)과 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속의 종은 인간 성인 위장관의 정상적인 거주자이다. 여러 연구(EP1945235, EP2898061, EP2129386, EP3048165)는 일반적으로 프로바이오틱스(probiotics)로 지칭되는 상기 언급된 속으로부터 선택된 균주가 인간 대사 및 비만의 조절 및 조절에 효과적일 수 있다는 것을 보여주었지만, 이들 생물학적 효과의 근간을 이루는 정확한 기전에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
LTA는 지질 모이어티에 의해 세포막에 고정되어 있는 그람 양성 박테리아에서 박테리아 세포벽의 주요 구성성분으로 발견되는 거대양친매성 분자이다. 기존의 LTA 폴리머 구조는 당지질 구조 또는 앵커에 결합된 폴리-글리세롤 인산염(GroP) 골격에 의해 형성된다. 폴리올 인산염 골격은 단당류 예컨대 글루코스 또는 갈락토스, 및 아민, 예컨대 알라닌 또는 글루코사민으로 치환될 수 있다. 기존 LTA는 화학 구조에 따라 구분할 수 있는 주요 클래스(I, II, III, IV)로 분류되었다. LTA I 구조가 스타필로코쿠스 아우레스 (Staphylococcus aureus ), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis ) 및 스트렙토코쿠스 sp.(Streptococcus sp.)을 포함하나 이에 제한되지 않는 페르미쿠테스(Firmicutes) 문의 상이한 종에서 자연적으로 발견된다는 것이 최신 기술에 알려져 있다. 유익한 종 예컨대 락토바실러 스(Lactobacilli), 락토코카이 ( Lactococci ) 또는 류코노스톡( Leuconostoc )은 단일 GroP 반복 단위와 함께 유형 I LTA 구조를 보여준다. [Shiraishi 등, 2016, Bioscience of Microbiota, Food and Health, vol 35 (4) 147-161; Scheewind & Missiakas 2014, J. Bacteriology, 196 (6) 1133-1142].
일부 미생물은 일반적으로 리포글리칸 또는 세포 표면 당지질로 지칭되는 비정형 리포테이코산을 생산하는 것으로 최신 기술에 알려져 있다. 이러한 비전통적인 LTA는 V형 LTA로 그룹화되어 포스포디에스테르 연결 단위를 반복하는 대신 지질에 부착된다당류를 나타낸다. V형 LTA에는 리포글리칸, Gro-P-리포글루코갈락토푸라난 및 석시닐 리포만난과 같은 거대양친매성 물질이 포함된다. (Schneewind O. 및 Missiakas D., J Bacteriol, 196(6), 1133-42 Mar 2014).
비피도박테리아 LTA는 V형 LTA 그룹에 포함되며 일반적으로 갈락토실 당지질에 의해 세포막에 연결된 단량체 글리세로포스페이트 측쇄를 보유하는 글루코-갈락탄 사슬에 의해 형성된 리포글리칸으로 설명되었다. 거대양친매성물질에 대한 가장 가능성 있는 일반적인 구조는 다음과 같이 설명된다.
Figure pct00001
화학식 (I)
여기서, GroP는 글리세로포스페이트이고, y m은 갈락토푸라난의 반복 단위의 수이고, 그리고 n은 글루칸의 반복 단위의 수이다(Hiroyoshi Iwasaki, Yoshio Araki, Eiji Ito, Masato Nagaoka 및 Teruo Yokokura, J. Bacteriology 1990, 845-852).
여러 연구에서 인간 질환 및/또는 증후군의 치료 및/또는 예방을 위한 리포테이코산(LTA)의 사용이 보고되었다. 미국 특허 출원 US2014323430A1은 반추 동물에서 우유 에너지 효율을 개선하기 위해 대사 장애 및/또는 박테리아 감염의 치료 또는 예방을 위한 바람직하게는 바실러스 서브틸리스로부터의 리포테이코산, 및 박테리아 내독소의 조성물의 사용을 보고한다. 또한, 문서는 박테리아 감염의 치료 및 예방뿐만 아니라 복부 비만, 혈중 콜레스테롤 및 글루코스 수치 변화와 관련된 인간 대사 장애의 치료 또는 예방 가능성을 언급한다.
미국 특허 출원 US2012190634A1은 염증성 사이토카인 생성을 억제하는 기능으로 인해 진성 당뇨병과 같은 염증 과정의 치료 또는 예방을 위한 항염증제로서 락토바실러스 및 유도된 당지질의 LTA 사용을 보고한다.
LTA 형태 산성 락트산 박테리아의 유사한 용도, 즉, 그람 음성 박테리아에 의해 유도된 염증 과정을 예방 또는 감소시킬 수 있는 그람 음성 박테리아에 의해 유도되는 면역 반응을 조절하기 위한 LTA의 용도가 미국 특허 출원 US2004147010A1에 보고되어 있다.
마지막으로, 국제 특허 출원 WO9623896A1은 암의 치료 및 고 혈액 콜레스테롤의 치료 또는 예방을 위한 스트렙토코쿠스 sp.으로부터 단리된 LTA의 용도를 보고한다.
과체중 및 비만에 유익한 효과를 발휘하는 프로바이오틱스를 찾기 위한 여러 노력에도 불구하고, 이들 병태 및 관련 대사 장애의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있는 지방 감소 활성을 갖는 개선된 화합물 및 조성물을 발견하는 것이 당해 분야에 여전히 필요하다.
발명의 설명
본 발명은 비피도박테리아로부터 얻어지는 리포테이코산(LTA) 및 지방 감소제로서 그 효과에 관한 것이다.
본 발명자들은 비피도박테리움이 탄소원으로서 과량의 당, 예컨대 글루코스에서 성장될 때, 즉 글루코스가 배양물의 모든 단계, 즉 지연기, 대수증식기 및 정지기 전체에 걸쳐 제한 영양소가 아닐 때, 비피도박테리움이 대상체에게 투여될 때 체내 지방 축적을 감소시키는 예상치 못한 능력을 획득한다는 것을 관찰하였다. 본 설명의 실시예 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 놀랍게도, 비피도박테리움이 지방 축적을 감소시키는 상기 능력을 획득할 수 있게 하는 LTA 성분의 비율/비의 변화를 세포벽의 LTA 성분이 상기 과량의 글루코스 조건에서 겪는 것을 발견하는 비피도박테리움의 상이한 성분을 분석하기 시작하였다. 다음으로, LTA 구조의 단리 및 심층 분석은 과량의 글루코스에서 배양된 비피도박테리움에서 유래한 LTA가 적어도 0.5의 알라닌/글루코스 몰비 및 적어도 1.2의 글리세롤 인산염/글루코스 몰비를 포함한다는 것을 보여주었고, 이 비는 과량의 글루코스에서 배양되지 않은 비피도박테리움으로부터 단리된 LTA에서 상이하다(본 설명의 실시예 4 참조). 따라서 탄소원으로서 과량의 당으로 배양된 비피도박테리움 및 이의 단리된 LTA 둘 모두는 대상체에서 체지방을 감소시키는 능력을 나타내고, 비만, 과체중 또는 관련 질환의 치료 및/또는 예방, 뿐만 아니라 화장품 및 식품 및 사료 제품의 생산에 사용하기 위한 약제에서 활성 화합물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 LTA
전술한 관점에서, 한 양태에서, 본 발명은 적어도 0.5의 알라닌/글루코스 몰비 및 적어도 1.2의 글리세롤 인산염/글루코스 몰비를 포함하는 리포테이코산(LTA), 이하에서 "본 발명의 LTA"에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "리포테이코산" 또는 "LTA"는 과량의 글루코스에서 배양된 비피도박테리움 속의 종으로부터 단리된 리포테이코산을 지칭하고, 즉, 글루코스는 배양의 모든 단계 전체에 걸쳐 제한 영양소가 아니다: 지연기, 지수기 및 정지기. 배양물 중 글루코스 모니터링은 최신 기술에 널리 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
최신 기술에 공지된 바와 같이, 비피도박테리움으로부터 단리된 LTA는 다음과 같은 구조를 갖는다.
Figure pct00002
식 중,
- GroP는 글리세로포스페이트이고,
- Gal은 갈락토푸라난이고,
- 각각의 X는 수소 및 알라닌(Ala)으로부터 독립적으로 선택되고,
- 알라닌의 분자의 수는 m 또는 m-p이며, m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 p는 X가 수소인 Gal의 단위의 수이고,
- Glc는 글루칸이고,
- m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 10 내지 20, 바람직하게는 11 내지 18이고,
- n은 Glc의 반복 단위의 수이고, 그리고 5 내지 20, 바람직하게는 8 내지 12이다.
글리세로포스페이트, 알라닌, 갈락토푸라난 및 글루칸 화합물은 최신 기술에 널리 알려져 있다.
본원에 사용된 용어 "몰비"는 LTA를 포함하는 상이한 화합물 사이의 비율을 의미하며, 즉, 이는 한 물질의 몰수와 다른 물질의 몰수와 관련이 있다. 여기서, 본 발명의 LTA는 적어도 0.5의 알라닌/글루코스 몰비 및 적어도 1.2의 글리세롤 인산염/글루코스 몰비를 포함한다. 이는 LTA 분자 내 글루코스 몰수에 대한 알라닌의 몰수가 적어도 0.5이고, LTA 분자 내 글루코스 몰수에 대한 글리세롤 인산염의 몰수가 적어도 1.2인 것을 의미한다. 분자 내의 각 구성요소의 몰수를 측정하기 위한 수단은 최신 기술에 널리 알려져 있으며, 이는 당업자에게 일상적인 실시이다.
본 발명의 LTA의 특정 구현예에서, 알라닌/글루코스의 몰비는 적어도 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0이다.
본 발명의 LTA의 보다 특정한 구현예에서, LTA의 알라닌은 L-알라닌, D-알라닌 또는 L-알라닌과 D-알라닌의 조합이다. 본 발명자들은 LTA가 기능적일 때, 즉 체지방 감소 능력을 나타내는 경우, 대부분의 알라닌이 D-알라닌임을 관찰하였다.
본 발명의 LTA의 또 다른 특정 구현예에서, 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 적어도 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0 또는 12.5이다.
본 발명의 LTA의 보다 특정한 구현예에서, 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 12.6이다.
과량의 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터 단리된 LTA가 겪는 다른 구조적 변화는 갈락토스, 글리세롤 및 인 분자의 수와 관련이 있다. 따라서, 본 발명의 LTA의 추가의 특정 구현예에서, 몰비 갈락토스/글루코스는 적어도 0.8이고, 글리세롤/글루코스 몰비는 적어도 1.0이고/거나, 인/글루코스 몰비는 적어도 5.0, 10.0, 15.0, 20.0 또는 25.0이고, 바람직하게는 인/글루코스 몰비는 26.0, 더 바람직하게는, 26.09이다.
본 발명의 LTA는 비피도박테리움 속 또는 "비피도박테리아"의 임의의 종으로부터 수득될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "비피도박테리아"는 그람 양성, 비운동성, 종종 분지형 혐기성 박테리아인 비피도박테리움 속을 지칭한다. 따라서, "비피도박테리움" 및 "비피도박테리아"라는 용어는 본 설명 전체에서 모호하게 사용될 수 있다. 그들은 인간을 포함한 포유동물의 위장관, 질 및 입의 편재성 거주자이다. 앞서 언급된 바와 같이, 일부 비피도박테리아는 프로바이오틱스로 사용된다. "비피도박테리아"라는 용어에는 다음 종의 박테리아가 포함되지만 이에 제한되지 않는다: B. 악티노콜로니포르메(B. actinocoloniiforme), B. 아돌레센티스(B. adolescentis), B. 안굴라툼(B. angulatum), B. 아니말리스(B. animalis), B. 아퀴케피리(B. aquikefiri), B. 아스테로이데스(B. asteroides), B. 비아바티(B. biavatii), B. 비피덤(B. bifidum), B. 보헤미쿰(B. bohemicum), B. 봄비(B. bombi), B. 보움(B. boum), B. 브레베(B. breve), B. 칼리트리코스(B. callitrichos), B. 카테눌라툼(B. catenulatum), B. 코에리눔(B. choerinum), B. 코뮤네(B. commune), B. 코리네포르메(B. coryneforme), B. 쿠니컬리(B. cuniculi), B. 크루디락티스(B. crudilactis), B. 덴티콜렌스(B. denticolens), B. 덴티움(B. dentium), B. 에울레무리스(B. eulemuris), B. 파에칼레(B. faecale), B. 갈리쿰(B. gallicum), B. 갈리나룸(B. gallinarum), B. 하팔리(B. hapali), B. 인디쿰(B. indicum), B. 이노피나툼(B. inopinatum), B. 카쉬와노헨세(B. kashiwanohense), B. 레무럼(B. lemurum), B. 롱검(B. longum), B. 매그넘(B. magnum), B. 메리시쿰(B. merycicum), B. 미니멈(B. minimum), B. 몽골리엔세(B. mongoliense), B. 무칼라벤세(B. moukalabense), B. 미오소티스(B. myosotis), B. 슈도카네눌라툼(B. pseudocatenulatum), B. 슈돌론굼(B. pseudolongum), B. 사이크라에로필럼(B. psychraerophilum), B. 풀로룸(B. pullorum), B. 류테리(B. reuteri), B. 루미난티움(B. ruminantium), B. 사구이니(B. saguini), B. 스카르도비이(B. scardovii), B. 스텔렌보쉔스(B. stellenboschense), B. 스테르코리스(B. stercoris), B. 사에쿨라레(B. saeculare), B. 서브틸(B. subtile), B. 테르모필럼(B. thermacidophilum), B. 써모필룸(B. thermophilum), B. 티시에리(B. tissieri), 및 B. 츠루미엔스(B. tsurumiense).
그럼에도 불구하고, 본 발명의 LTA의 특정 구현예에서, LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득된다.
균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145(본 발명에서 "BPL1" 또는 "BPL0001"이라고도 함)는 2012년 5월 14일에 부다페스트 조약의 조건에 따라 스페인 생물자원센터(CECT), 스페인 46980 파테르나-발렌시아, 9, 쎄/카테드라티코 아구스틴 에스카르디노, 파르크 시엔티픽 유니버시타트 데 발렌시아
Figure pct00003
Figure pct00004
)에 기탁되었다.
본 발명의 LTA의 또 다른 특정 구현예에서, LTA는 비피도박테리움 롱검, 바람직하게는, 균주 비피도박테리움 롱검 CECT 7347로부터 수득된다.
균주 비피도박테리움 롱검 CECT 7347는 3개월 미만의 건강한 모유 수유한 유아의 대변에서 단리되었으며 국제 기탁 기관(Valencia, SPAIN)으로서 스페인 생물자원센터(CECT)에 부다페스트 조약의 조건에 따라 2007년 12월 20일에 스페인 국가 연구위원회 (Consejo Superior de Investigaciones Cientificas, CSIC)[주소: 스페인, 28006 마드리드, 세라노, 142(Serrano 142, 28006 Madrid, Spain)]]에 의해 기탁되었다. 수탁 번호 CECT 7347이 지정되었다. 본 발명 CECT 7347 균주의 과학적 분류는 다음과 같다: 계: 박테리아 문: 피르미쿠테스, 강: 악티노박테리아, 목: 비피도박테리알레스, 과: 비피도박테리아세아에, 속: 비피도박테리움, 종: 비피도박테리움 롱검. 기탁자는 본 출원인(바이오폴리스, 에스. 엘. (B(OPOLIS S.L.))이 본 출원에서 상기 언급된 기탁된 생물학적 재료를 참조하도록 허가하며, 또한 그의 전적이며 최종적인 동의를 본 출원의 출원일, 또는 우선권이 주장된 경우, 우선일로부터 공중에 공개된 기탁물에 부여한다.
본 발명의 LTA는 LTA의 저장 수명을 살균, 보존 또는 연장하기 위해 가열 또는 동결건조와 같은 상이한 처리를 거칠 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 LTA는 열처리 또는 동결건조된다.
본원에 사용된 용어 "열처리된"은 공기, 유체, 가열된 표면 또는 탱크와의 직접 또는 간접 접촉에 의해 연속 또는 불연속 가열로 열 가공을 받은 생성물을 지칭하며, 이는 열 멸균 기술, 예컨대 오토클레이빙 및 저온살균, 또는 압출, 성형 또는 분무-건조를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 산업적 처리를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "동결건조된"은 승화에 의해 본 발명의 LAT-v를 함유하는 용액으로부터 유리수를 제거하고, 용액을 신속하게 동결시킨 다음, 얼음을 증기로 변형시키는 가벼운 진공 가열에 의해 얼음을 제거하는 방법을 지칭한다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 LTA는 다른 성분과 함께 조성물 내부에 포함될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 LTA를 포함하는 조성물, 이하 "본 발명의 조성물"에 관한 것이다.
당업자에게 공지된 통상적인 기술에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 부형제 및/또는 담체와 조합하여 제형화될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 부형제 및/또는 담체를 추가로 포함한다.
"부형제"라는 용어는 본 발명의 조성물의 임의의 성분을 흡수하는 것을 돕거나, 상기 성분을 안정화시키는 것을 돕거나, 일관성을 제공하거나 더 기분 좋게 만드는 풍미를 제공한다는 의미에서 조성물의 제조를 돕는 물질을 지칭한다 . 따라서, 부형제는 함께 결합된 성분, 예를 들어 전분, 당 또는 셀룰로스을 유지하는 기능, 감미제 기능, 착색제 기능, 활성 성분을 보호하는 기능, 예컨대 공기 및/또는 수분으로부터 이를 단리하는 기능, 정제, 캡슐 또는 임의의 다른 형태의 제형, 예컨대 이염기성 인산칼슘에 대한 충전제 기능, 성분의 용해 및 장에서의 그의 흡수를 용이하게 하는 붕해 기능을 가질 수 있으며, 이러한 문단에 언급되지 않은 다른 유형의 부형제를 배제하지 않는다. 따라서 용어 "부형제"는 생약 형태에 포함되는 임의의 물질로서 정의되며, 그의 제조 및 안정성을 가능하게 하거나, 그의 관능적 특성을 개질하거나, 조성물의 물리적/화학적 특성 및 그의 생체이용률을 결정하기 위해 활성 성분 또는 그의 회합물에 첨가된다. "부형제"는 조성물의 화합물의 활성을 허용해야 하며, 즉, 상기 성분과 상용성이어야 한다. 부형제의 예는 응집제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 코팅제, 감미제, 향료 및 착색제이다. 허용되는 부형제의 비제한적이고 보다 구체적인 예는 특히 전분, 당, 자일리톨, 소르비톨, 인산칼슘, 스테로이드 지방, 탈크, 실리카 또는 글리세린이다.
"비히클" 또는 "담체"는 바람직하게는 불활성 물질이다. 담체의 기능은 다른 화합물의 혼입을 촉진하고, 더 나은 투약 및 투여를 허용하거나, 조성물에 일관성 및 형태를 제공하는 것이다. 따라서, 담체는 본 발명의 조성물의 임의의 성분을 결정된 부피 또는 중량으로, 또는 심지어 상기 성분을 희석하지 않고 희석하는 데 사용되는 물질로서, 더 나은 투약 및 투여를 허용하거나 일관성 및 형태를 조성물에 제공할 수 있다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이다. 이 경우, 조성물의 부형제 또는 담체는 "약제학적으로 허용되는 부형제" 또는 "약학적으로 허용되는 담체"이다. 이는 담체 또는 부형제가 약제학적 조성물(본 명세서에서 본 발명의 LTA)의 화합물의 활성을 허용해야 하며, 즉, 상기 성분과 상용성이어야 함을 의미한다. 제시 형태가 액체인 경우, 약학적으로 허용되는 담체는 희석제이다. 마찬가지로, 성분을 포함하는 조성물은 그 투여가 포유동물과 같은 수령 대상체에 의해 허용될 수 있는 경우 "약리학적으로 허용가능한" 것으로 언급된다.
약제학적 조성물은 임의의 적절한 투여 경로에 의해 투여될 수 있으며, 이를 위해 상기 조성물은 선택된 투여 경로를 위해 적합한 약제학적 형태로 제형화될 것이다.
적합한 투여 경로는 예를 들어 데포, 경피, 경구, 직장, 경점막 또는 장 투여; 근육내, 피하, 정맥내, 수질내 주사, 뿐만 아니라 척수강내, 직접 뇌실내, 복강내, 비강내 또는 안구내 주사를 포함하는 비경구 전달을 포함할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 바람직한 투여 경로는 경구 경로이다.
비경구 투여를 위한 약제학적 제형은 수용성 형태의 LTA의 수용액을 포함한다. 추가로, 본 발명의 LTA는 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일 예컨대 참께 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 LTA와 같은 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 무발열원(SPF) 물과 함께 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다. 예시적인 예로서, 주사용으로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 수용액으로서, 예를 들어 한스(Hanks) 용액, 링거(Ringer) 용액, 또는 생리 식염수 완충제와 같은 생리학적으로 양립가능한 완충액으로 제형화될 수 있다. 경구 투여를 위해, 각각의 약제학적 조성물은 LTA를 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 조합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 LTA가 치료될 환자에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 환제, 로젠지, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있게 한다.
경구용 약제학적 제제는 고체 부형제를 첨가하고, 선택적으로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 수득될 수 있다. 적합한 부형제는 특히, 충전제 예컨대 락토스, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함하는 당; 전분 및 이의 유도체, 예컨대, 옥수수 전분, 덱스트린 및 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 하이드록시프로필 전분, 밀 전분, 젤라틴, 트라가칸쓰검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP); 셀룰로스 제제 예컨대, 예를 들어, 메틸셀룰로스, 카복실메틸셀룰로스 및 하이드록시프로필셀룰로스; 무기 화합물, 예컨대 염화나트륨, 붕산, 황산칼슘, 인산칼슘 및 침전된 탄산칼슘이다. 원할 경우, 붕해제, 예컨대 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 그의 염 예컨대 나트륨 알기네이트가 첨가될 수 있다.
당의정 코어에는 적절한 코팅물이 제공된다. 이를 위해, 아라비아검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티탄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 선택적으로 함유할 수 있는 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 염료 또는 안료는 식별을 위해 또는 본 발명의 LTA 용량의 상이한 조합을 특성화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅물에 첨가될 수 있다.
적합한 유동화제는 산화마그네슘, 합성 알루미늄 실리케이트, 메타규산, 마그네슘 알루미늄 옥사이드, 함수 규산, 무수 규산, 탈크, 스테아르산마그네슘, 및 카올린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 결합제는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 파이롤리딘, 폴리비닐 알코올, 아라비아검, 트라가칸쓰, 나트륨 알기네이트, 젤라틴, 및 글루텐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 안정화제는 단백질, 예컨대 알부민, 프로타민, 젤라틴 및 글로불린; 및 아미노산 및 그의 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 증점제는 수크로스, 글리세린, 메틸셀룰로스, 및 카복시메틸셀룰로스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 pH 조정제는 염산, 수산화나트륨, 인산염, 시트르산염, 및 탄산염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
경구로 사용될 수 있는 약제학적 조성물은 젤라틴으로 제조된 압입형(push-fit) 캡슐 뿐만 아니라 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 압입형 캡슐은 충전제 예컨대 락토스, 결합제 예컨대 전분, 및/또는 윤활제 예컨대 탈크 또는 스테아르산마그네슘 및, 선택적으로, 안정화제와 혼합된 LTA를 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, LTA는 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 유동 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한 안정제를 첨가할 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 이러한 투여에 적합한 복용량이어야 한다.
협측 투여를 위해, 각각의 약제학적 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따른 사용을 위한 약제학적 조성물은 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적절한 가스의 사용과 함께 가압 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 분무 제시의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우 복용량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 LTA와 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물을 함유하여 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물에 대한 대안으로, 또 다른 특정 구현예에서 본 발명의 조성물은 보다 특정한 구현예에서 상기 정의된 담체 또는 부형제를 포함하는 영양 조성물이다.
본 발명에서 "영양 조성물"이라는 용어는 그것을 섭취하는 대상체에게 영양소를 제공하는 것과 관계없이 신체의 하나 이상의 기능에 유익한 영향을 주어 더 나은 건강 및 웰빙을 제공하는 식품을 지칭한다. 본 발명에서, 상기 영양 조성물은 비만, 과체중 또는 관련 질환을 완화, 감소, 치료 및/또는 예방하기 위한 것이며, 바람직하게는 관련 질환은 당뇨병이다.
보다 특정한 구현예에서, 영양학 조성물은 식품이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "식품" 및 "사료 제품"은 등가이며 본 명세서 전반에 걸쳐 불분명하게 사용될 수 있다. 식료품은 액체, 분말 또는 고체 형태일 수 있다. 식품은 유아용 영양, 사료 및 동물성 식품을 포함하여 인간 또는 인간이 아닌 동물 소비를 위한 것일 수 있다. 식품은 당업계에 일반적으로 알려진 기능성 식품을 포함한다. 식품의 예로는 먹이, 유제품, 식물성 제품, 육류 제품, 스낵, 제과 제품(예를 들어, 초콜릿, 사탕 및 츄잉껌 또는 풍선껌으로 제한되지 않음), 사료, 음료, 유아 식품, 시리얼, 튀긴 식품, 산업용 베이커리 제품 및 비스킷을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유제품의 예로는 발효유(예를 들어, 요구르트 또는 치즈로 제한되지 않음) 또는 비발효유(예를 들어, 아이스크림, 버터, 마가린 또는 유장으로 제한되지 않음)에서 파생된 제품이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 식물성 제품은 예를 들어, 발효(예를 들어, 대두 요구르트, 귀리 요구르트 등) 또는 비발효된 형태의 시리얼 및 스낵을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 음료는 발효되지 않은 우유일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 식료품 또는 식품은 과일 또는 식물성 쥬스, 아이스크림, 유아 식, 밀크, 요거트, 치즈, 발효된 밀크, 분말화된 밀크, 곡류, 베이킹된 제품, 우유 기반 제품, 육류 제품, 제과 제품, 동물 사료 또는 사료 및 음료로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 특정 구현예에서, 영양 조성물은 영양 보충물이다.
용어 "식이 보충물(dietary supplement)", "식품 보충물(food supplement)", "영양 보충물(alimentary supplement)" 또는 "영양 보완물(alimentary complement)"와 동의어인 "영양 보충물(nutritional supplement)"은 영양 또는 생리학적 효과를 갖는 농축된 영양소 또는 다른 물질의 공급원으로 이루어진 정상 식이를 보충하는 것을 목적으로 하는 생성물 또는 제제를 지칭한다. 본 발명에서, 영양 보완물를 섭취했을 때 개체에게 영양적 또는 생리학적 효과를 갖는 "물질"은 본 발명의 조성물의 일부인 본 발명의 LTA이다. 영양 보충물는 단일 형태 또는 조합된 형태일 수 있고, 단일 양으로 취하도록 설계된 투여 형태, 즉 캡슐, 환제, 정제 및 다른 유사한 형태, 분말의 샤세트, 액체의 앰플 및 액적 분배 병 및 액체 및 분말의 다른 유사한 형태로 판매될 수 있다.
비타민, 미네랄, 아미노산, 필수 지방산, 섬유질, 효소, 식물 및 식물 추출물을 포함하되 이에 제한되지 않는 영양 보충물에 존재할 수 있는 광범위한 영양소 및 기타 요소가 있다. 그들의 역할은 식이에서 영양소의 공급을 보완하는 것이기 때문에, 균형 잡힌 식단의 대용으로 사용되어서는 안 되며 섭취는 의사나 영양사가 명시적으로 권장하는 일일 복용량을 초과해서는 안된다. 영양 조성물은 또한 소위 "특수 그룹을 위한 식품", 즉 특정 영양 요구를 충족시키는 식품의 일부가 될 수 있다.
약제학적 또는 영양 조성물인 본 발명의 조성물은 적어도 생체활성 화합물, 바람직하게는 비만, 과체중 또는 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 유용한 생체활성 화합물을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 관련 질환은 당뇨병이다.
본원에서 사용되는 용어 "생체활성 화합물"은 대상체의 더 나은 건강 상태를 촉진하는 하나 이상의 대사 과정을 조절하는 능력과 관련된 생물학적 활성을 갖는 본 발명의 LTA 이외의 임의의 물질을 의미한다. 생체활성 화합물은 LTA의 특성 또는 효과를 개선하기 위해 본 발명의 LTA와 상호작용할 수 있거나, 비만, 과체중 또는 관련 질환, 바람직하게는 당뇨병의 치료 및/또는 예방에서 본 발명의 LTA를 보조하는 대상체 대사와 상호작용할 수 있다.
위에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 LTA는 지방을 감소시키는 능력으로 인해 비만, 과체중 또는 관련 질환 예컨대 당뇨병의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 약제로 사용하기 위한, 이전에 개시된 이들의 모든 특정 구현예과 함께 본 발명의 LTA 또는 본 발명의 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "약제"는 인간 및 비인간 대상체 둘 모두에게 약제학적 활성 화합물을 투여하기에 적합한 약제학적 조성물을 의미한다. 이러한 약제학적 조성물 또는 약제학적 제형은 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 담체와 조합된 본 발명의 LTA를 포함하는 것으로 정의된다. 본 발명에서 사용되는 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체는 선행 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있고, 이전 단락에 개시되어 있다.
약제는 바람직하게는 치료적 유효 용량으로 투여된다. 치료적 유효 용량은 본 명세서에 언급된 질환 또는 장애를 수반하는 증상을 예방, 개선 또는 치료하도록 적용된 조성물에 사용되는 본 발명의 LTA의 양을 지칭한다. 주어진 약물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차, 예를 들어 ED50(집단의 50%에서 치료적 유효 용량) 및 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량)에 의해 결정될 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이고 LD50/ED50의 비율로 표현될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이전에 개시된 바와 같은 모든 그의 특정 구현예와 함께, 단독으로 또는 서로 조합되어, 비만, 과체중 또는 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명의 LTA, 또는 본 발명의 조성물에 관한 것이며, 바람직하게는 관련 질환은 당뇨병이다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 환자, 바람직하게는 인간 환자의 질환 또는 의학적 상태의 치료를 지칭하며, 이는 다음을 포함한다:
(a) 질환 또는 의학적 상태가 발생하는 것을 예방하는 것, 즉 환자의 예방적 치료;
(b) 질환 또는 의학적 상태를 개선하는 것, 즉 환자의 질환 또는 의학적 상태의 퇴행을 유발하는 것;
(c) 질환 또는 의학적 상태를 억제하는 것, 즉 환자의 질환 또는 의학적 상태의 진행을 늦추는 것; 또는
(d) 환자의 질환 또는 의학적 상태의 증상을 완화하는 것.
본원에서 사용된 "예방"이라는 용어는 비만(체중 증가)의 발생을 억제하는 것, 즉 비만 상태의 개시 전에 본 발명의 LTA를 투여하는 것을 의미한다. 이는 본 발명의 LTA를 예방 약물로 사용하여 체중 증가를 예방하거나, 체중 증가에 의해 유발될 수 있는 질환을 예방하는 것을 의미한다.
"비만"이라는 용어는 일반적으로 건강에 위험을 초래하는 비정상적이거나 과도한 지방 축적을 말하며, 비만의 "과체중" 수준이다. 성인에서의 비만의 조 집단 척도는 체질량 지수(BMI)로, 체중(킬로그램)을 키(미터)의 제곱으로 나눈 것이다. 용어 "비만"은 본원에서 바람직하게는 BMI가 ≥ 30 kg/m2인 것을 특징으로 하는 상태를 기재하기 위해 채택되지만, 용어 "과체중"은 본원에서 바람직하게는, BMI이 ≥ 25 kg/ m2이지만 < 30kg/m2인 것을 특징하기 위해 채택된다. 청소년의 경우, "비만"은 학령기 아동 및 청소년에 대한 세계 보건 기구(WHO) 성장 기준에서 연령 및 성별에 대한 2개의 표준 편차 체질량 지수를 특징으로 하는 상태를 지칭한다. 따라서 "비만" 및 "과체중"이라는 용어는 치료에 대한 의료 적응증을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, 과체중 및/또는 비만"에 의해 야기되는 용어 "관련된 또는 연관된 질환/장애" 및 "질환/ 장애는 당뇨병, 대사 증후군, 고혈압, 고혈당증, 염증, 2형 당뇨병, 심혈관 질환, 고콜레스테롤혈증, 호르몬 장애, 불임 등을 포함하고, 비만 또는 과체중이 앓고 있는 이들 질환 또는 장애는 이를 앓을 위험 인자이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간에서 지방 축적을 감소시키는 방법에 관한 것이고, 방법은 본 발명의 LTA 또는 본 발명의 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간에서 비만, 과체중 또는 관련 질환, 바람직하게는 당뇨병의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이고, 방법은 본 발명의 LTA 또는 본 발명의 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
유사하게, 본 발명은 또한 대상체에서 지방 축적을 감소시키기 위한, 또는 대상체에서 비만, 과체중 또는 관련 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물(또는 약제)의 제조에서의 본 발명의 LTA의 용도와 관련이 있고, 바람직하게는, 상기 대상체는 포유동물, 더 바람직하게는 인간이다.
이전 단락에서 본 발명의 LTA 및 본 발명의 조성물에 대해 개시된 모든 특정 구현예는 이전 단락에서 개시된 방법 또는 용도에 적용가능하다.
본 발명은 또한 단독으로 또는 서로 조합하여 본 발명의 LTA, 또는 본 발명의 조성물, 및 그의 모든 특정 구현예의 비치료적 용도를 포함한다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 체지방 감소를 위한 본 발명의 LTA 또는 본 발명의 조성물의 비치료적 용도에 관한 것이다. 본 발명의 LTA 또는 본 발명의 조성물에 관한 특정 구현예는 본 발명의 양태에 적용가능하다. 본 발명의 LTA 또는 본 발명의 조성물은 또한 비-비만 대상체, 즉 BMI < 25 kg/m2를 갖는 "정상-체중" 대상체 또는 상기 정의된 바와 같은 "과체중" 대상체에서 비치료적 지방 감소를 위해 그리고 임의의 비만 연관 건강 연루 없이 사용될 수 있다. 이러한 사용은 미적 또는 미용적 이유(화장품 사용)만을 위한 것이며 의료 적응증에 근거하지 않는다. 또한, 비-비만 대상체의 체지방 감소 및/또는 체중 유지는 체중 감소 및/또는 유지를 수반할 수 있다. 화장품은 체지방 감소와 관련하여 사용하는 대상체에게 독특하게 미용 효과가 있다. "미용 효과"라는 용어는 아래에 설명되어 있다. 유사하게, 본 발명은 비-비만 대상체에게 본 발명의 LTA 또는 본 발명의 조성물(이의 모든 특정 구현예를 단독으로 또는 서로 조합하여 포함)을 투여하는 것을 포함하는, 체지방 감소를 위한 비치료적 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 식품 또는 사료 제품의 정교화를 위한 본 발명의 용도 또는 본 발명의 조성물에 관한 것이다. 용어 "식품" 및 "사료 제품"은 본 명세서에서 이전에 정의되었으며 본 발명의 양태에 적용 가능하다. 식품 또는 사료 제품을 정교화하기 위한 공정 및 방법은 최신 기술에 널리 알려져 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 본 발명의 LTA를 수득하는 방법, 이하에서 "본 발명의 방법"에 관한 것이다:
(a) 탄소원으로서 과량의 당에서 비피도박테리움을 배양하는 단계, 및
(b) 박테리아의 세포벽으로부터 LTA를 단리하는 단계.
첫 번째 단계에서, 본 발명의 LTA를 얻는 방법은 탄소원으로서 과량의 당에서 비피도박테리움을 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, "탄소원"은 바이오매스를 구축하기 위한 탄소원으로서 유기체에 의해 사용되는 분자를 지칭한다. 본 발명의 LTA를 얻는 방법에서, 사용된 탄소원은 당이다. 당은 가장 단순한 탄수화물인 모든 단당류 및 이당류의 광범위한 범주를 나타내는 용어이다. 단당류에는 글루코스, 갈락토스 및 푸룩토스를 포함하고 이당류는 수크로스, 락토스, 말토스 및 트레할로스를 포함한다. 따라서 본 발명의 LTA를 얻는 방법의 특정 구현예에서, 당은 글루코스, 갈락토스, 푸룩토스, 수크로스, 락토스, 말토스 및 트레할로스로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 보다 특정한 구현예에서, 당은 글루코스이다.
비피도박테리움의 배양 조건은 최신 기술에 널리 알려져 있다. 비피도박테리움은 펩톤(1%), 육류 추출물(0,8%), 효모 추출물(0,4%), 글루코스(2%), 디칼륨 수소 포스페이트(0,2%), 아세트산나트륨 삼수화물(0,5%) 트리암모늄 시트르산염(0,2%) 황산마그네슘(0,02%) 6수화물(0,005%)로 구성되고 1 mL/L 폴리소르베이트(Tween 80)이 보충된 성장 배지 예컨대 Man, Rogosa 및 Sharpe medium(MRS medium)를 사용하여 배양될 수 있다. 인간 기원의 비피도박테리아는 36-38℃ 및 pH 6.5-7.0의 혐기성 조건에서 배양될 수 있다.
두 번째 단계에서, 본 발명의 LTA를 얻는 방법은 LTA의 단리를 포함한다. 비피도박테리움으로부터의 LTA의 단리는 비피도박테리움 바이오매스 성장이 발생하는 언제든지 수행할 수 있다. 따라서 단리는 지연기의 종료로부터 및 모든 기(phase) 동안 배양으로 수행될 수 있다. 비피도박테리움 바이오매스로부터 LTA의 단리는 LTA의 추출 및 회수를 포함한다.
비피도박테리아로부터의 LTA의 추출 및 회수는 당업자에게 공지된 기술에 의해 수행될 수 있고, 이의 검출은 혈청학(Huub J. M. Op Den Camp 등 1985. J. Gen Microbiol., 131 (3), 661-668), 및 헥소스 정량화를 위한 인산염 및 오르시놀-황산 반응을 검출하기 위한 몰리브덴 블루 테스트와 같은 생화학적 측정을 포함하는 통상적인 분석 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 LTA를 얻는 방법의 특정 구현예에서, 비피도박테리움은 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145이다.
또 다른 특정 구현예에서, 비피도박테리움은 비피도박테리움 롱검, 바람직하게는, 비피도박테리움 롱검 CECT 7347이다.
마지막으로, 또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 나타낸 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 수득된 LTA에 관한 것이다.
탄소원으로 과량의 당에서 배양된 비피도박테리움으로부터의 LTA의 의료 용도
본 발명은 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리움으로부터의 LTA는 C. 엘레간스에서 지방 감소를 유도한다는 것을 보여준다(실시예 참조). 또한, 본 발명은 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리움으로부터의 LTA의 지방 감소 수준(즉, 글루코스가 배양의 모든 기, 즉 지연기, 대수증식기 및 정지기를 통해 제한 영양소가 아님)가 락토바실러스 및 바실러스 박테리아 균주와 같은 다른 박테리아 속으로부터 얻은 LTA보다 놀랍게도 더 높다는 것을 입증한다(실시예의 표 1 참조). 또한, 실시예는 또한 LTA가 특정 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스(CECT8145)(본 발명에서 "BPL1" 또는 "B PL0001"로도 불림)는 본원에서 테스트된 모든 균주 중에서 가장 높은 수준의 지방 감소를 초래한다는 중거를 보여준다(실시예의 표 1 참조).
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 약제로 사용하기 위한, 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 리포테이코산(LTA)에 관한 것으로, 여기서 LTA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00005
식 중,
- GroP는 글리세로포스페이트이고,
- Gal은 갈락토푸라난이고,
- 각각의 X는 수소 및 알라닌(Ala)으로부터 독립적으로 선택되고,
- 알라닌의 분자의 수는 m 또는 m-p이며, m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 p는 X가 수소인 Gal의 단위의 수이고,
- Glc는 글루칸이고,
- m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 10 내지 20, 바람직하게는 11 내지 18이고,
- n은 Glc의 반복 단위의 수이고, 그리고 5 내지 20, 바람직하게는 8 내지 12이다.
LTA의 특정 구현예에서, X는 알라닌이다.
용어 "약제", "치료" 및 "예방" 뿐만 아니라 그의 특정 구현예는 이전 단락에서 정의되었으며 본 발명의 현재 양태에 적용 가능하다.
이전 단락에서 설명한 바와 같이, 비피도박테리아로부터의 LTA의 추출 및 회수는 당업자에게 공지된 기술에 의해 수행될 수 있고, 이의 검출은 혈청학(J Huub J.M. OP DEN CAMP 등 1985, Gen Microbiol., 131 (3), 661-668), 및 헥소스 정량화를 위한 인산염 및 오르시놀-황산 반응을 검출하기 위한 몰리브덴 블루 테스트와 같은 생화학적 측정을 포함하는 통상적인 분석 방법에 의해 달성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 비만, 과체중 또는 관련 질환, 바람직하게는 당뇨병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 탄소원으로서 당 과량으로 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA에 관한 것이고, LTA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00006
식 중,
- GroP는 글리세로포스페이트이고,
- X는 알라닌(Ala) 또는 수소(H)이고,
- Gal은 갈락토푸라난이고,
- 각각의 X는 수소 및 알라닌(Ala)으로부터 독립적으로 선택되고,
- 알라닌의 분자의 수는 m 또는 m-p이며, m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 p는 X가 수소인 Gal의 단위의 수이고,
- Glc는 글루칸이고,
- m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 10 내지 20, 바람직하게는 11 내지 18이고,
- n은 Glc의 반복 단위의 수이고, 그리고 5 내지 20, 바람직하게는 8 내지 12이다.
탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA의 특정 구현예에서, X는 알라닌이다.
"탄소원으로서 과량의 당에서 배양됨"이라는 표현은 본 설명의 시작 부분에서 설명되었다. 특정 구현예에서, 당은 글루코스, 갈락토스, 프룩토스, 수크로스, 락토스, 말토스 및 트레할로스로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 보다 특정한 구현예에서, 당은 글루코스이다.
"비만", "과체중" 및 "관련 질환"이라는 용어는 본 설명에서 이전에 정의되었으며 그 정의는 본 발명의 현재 양태에 적용 가능하다.
약제로 사용하고 비만, 과체중 또는 관련 질환, 바람직하게는 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA 둘 다의 특정 구현예에서, 바람직하게는 관련 질환은 당뇨병이다:
- 알라닌/글루코스 몰비는 적어도 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0이고, 그리고 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 적어도 1.2, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0 또는 12.5이고, 바람직하게는, 글리세롤 인산염 글루코스 몰비는 12.6이고/거나;
- 알라닌은 L-알라닌, D-알라닌 또는 L-알라닌과 D-알라닌의 조합이다.
탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터 단리된 LTA의 성분의 비율/비의 다른 변화는 갈락토스, 글리레콜 및 인 분자의 수와 관련이 있다. 따라서, 추가의 특정 구현예에서, 몰비 갈락토스/글루코스는 적어도 0.8이고, 글리세롤/글루코스 몰비는 적어도 1.0이고/거나, 인/글루코스 몰비는 적어도 5.0, 10.0, 15.0, 20.0 또는 25.0이고, 바람직하게는 인/글루코스 몰비는 26.0, 더 바람직하게는, 26.09이다.
"몰비"라는 용어의 의미는 본 명세서에서 이전에 설명되었다.
약제로 사용하고 비만, 과체중 또는 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA 둘다의 보다 특정한 구현예에서, LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득된다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스인 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA는 글루코스는 비피도박테리움 롱검, 바람직하게는 비피도박테리움 롱검 CECT 7347로부터 수득된다.
균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145 및 비피도박테리움 롱검 CECT 7347은 본원에서 이전에 정의되었다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 비피도박테리아로부터의 LTA는 열처리 또는 동결건조된다. "열처리된" 및 "동결건조된"이라는 용어는 이전에 정의되었다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상체, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간에서 지방 축적을 감소시키는 방법을 지칭하고, 방법은 비피도박테리아로부터의 LTA의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 대상체에서 지방 축적을 감소시키는 방법의 바람직한 구현예에서, LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득되고/거나, 대상체에서 지방 축적을 감소시키는 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, LTA는 열처리 또는 동결건조된다.
유사하게, 의료 용도의 범위 내에서, 본 발명은 또한 대상체의 지방 축적을 감소시키기 위한 또는 또는 대상체에서 비만, 과체중 또는 관련 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에서 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리움으로부터의 LTA의 용도와 관련이 있고, 바람직하게는 상기 대상체는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다.
탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리움으로부터의 LTA 및 이를 포함하는 조성물의 의료 용도에 대해 개시된 모든 특정 구현예는 이전 단락에 개시된 방법 또는 용도에 적용가능하다.
탄소원으로 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA의 비치료적 용도
상기에 설명한 바와 같이, 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA는 또한 비-비만 대상체, 즉 BMI < 25 kg/m2를 갖는 "정상-체중" 대상체 또는 상기 정의된 바와 같은 "과체중" 대상체에서 비치료적 지방 감소를 위해 그리고 임의의 비만 연관 건강 연루 없이 사용될 수 있다. 이러한 사용은 미적 또는 미용적 이유(화장품 사용)만을 위한 것이며 의료 적응증에 근거하지 않는다. 또한, 비-비만 대상체의 체지방 감소 및/또는 체중 유지는 체중 감소 및/또는 유지를 수반할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 체지방 감소를 위한 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA의 비치료적 용도(또는 화장품 용도)에 관한 것으로, 여기서 LTA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00007
식 중,
- GroP는 글리세로포스페이트이고,
- X는 알라닌(Ala) 또는 수소(H)이고,
- Gal은 갈락토푸라난이고,
- 각각의 X는 수소 및 알라닌(Ala)으로부터 독립적으로 선택되고,
- 알라닌의 분자의 수는 m 또는 m-p이며, m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 p는 X가 수소인 Gal의 단위의 수이고,
- Glc는 글루칸이고,
- m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 10 내지 20, 바람직하게는 11 내지 18이고,
- n은 Glc의 반복 단위의 수이고, 그리고 5 내지 20, 바람직하게는 8 내지 12이다.
탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA의 비치료적 용도의 특정 구현예에서:
- 알라닌/글루코스 몰비는 적어도 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0이고, 그리고 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 적어도 1.2, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0 또는 12.5이고, 바람직하게는, 글리세롤 인산염 글루코스 몰비는 12.6이고/거나;
- 알라닌은 L-알라닌, D-알라닌 또는 L-알라닌과 D-알라닌의 조합이다.
"몰비"라는 용어의 의미는 본 명세서에서 이전에 설명되었다.
탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터 단리된 LTA의 성분의 비율/비의 다른 변화는 갈락토스, 글리세롤 및 인 분자의 수와 관련이 있다. 따라서, 추가의 특정 구현예에서, 몰비 갈락토스/글루코스는 적어도 0.8이고, 글리세롤/글루코스 몰비는 적어도 1.0이고/거나, 인/글루코스 몰비는 적어도 5.0, 10.0, 15.0, 20.0 또는 25.0이고, 바람직하게는 인/글루코스 몰비는 26.0, 더 바람직하게는, 26.09이다.
탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA의 비치료적 용도의 또 다른 특정 구현예에서, 단독으로 또는 이전의 특정 구현예와 조합하여, 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득된다. 본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스인 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA는 글루코스는 비피도박테리움 롱검, 바람직하게는 비피도박테리움 롱검 CECT 7347로부터 수득된다. 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145 및 비피도박테리움 롱검 CECT 7347은 본원에서 이전에 정의되었다.
탄소원으로서 과량의 당, 바람직한 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA의 비치료적 용도의 또 다른 특정 구현예에서, 단독으로 또는 이전의 특정 구현예와 조합하여, LTA를 열처리하거나 동결건조시킨다. "열처리된" 및 "동결건조된"이라는 용어는 이전에 정의되었다.
화장품은 체지방 감소와 관련하여 사용하는 대상체에게 독특하게 미용 효과가 있다.
본원에 사용된 용어 "미용 효과"는 체지방의 손실 또는 유지, 및 바람직하게는 체형 및 정의의 향상과 관련된 외관과 관련하여, 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA의 원하는 유리한 영향을 나타낸다. 과량의 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA를 갖는 대상체의 비치료적 미용 치료는 단지 미적 이유이며 건강 위험을 유의하게 증가시키는 체지방의 양을 나타내지 않는 대상체에서만 독점적으로 달성되는 것으로 이해되어야 한다. 과량의 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA를 사용한 비치료적 미용적 치료는(비병리학적) 체지방 축적 및/또는 체중 증가를 방지하기 위해 체중 감소 및/또는 체중 조절 역할을 할 수도 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 식품 또는 사료 제품의 정교화를 위한 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA의 용도에 관한 것으로, 여기서 LTA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00008
식 중,
- GroP는 글리세로포스페이트이고,
- X는 알라닌(Ala) 또는 수소(H)이고,
- Gal은 갈락토푸라난이고,
- 각각의 X는 수소 및 알라닌(Ala)으로부터 독립적으로 선택되고,
- 알라닌의 분자의 수는 m 또는 m-p이며, m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 p는 X가 수소인 Gal의 단위의 수이고,
- Glc는 글루칸이고,
- m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 10 내지 20, 바람직하게는 11 내지 18이고,
- n은 Glc의 반복 단위의 수이고, 그리고 5 내지 20, 바람직하게는 8 내지 12이다.
식품 또는 사료 제품의 정교화를 위한 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA의 용도의 특정 구현예에서:
- 알라닌/글루코스 몰비는 적어도 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0이고, 그리고 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 적어도 1.2, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0 또는 12.5이고, 바람직하게는, 글리세롤 인산염 글루코스 몰비는 12.6이고/거나;
- 알라닌은 L-알라닌, D-알라닌 또는 L-알라닌과 D-알라닌의 조합이다.
"몰비"라는 용어의 의미는 본 명세서에서 이전에 설명되었다.
탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터 단리된 LTA의 성분의 비율/비의 다른 변화는 갈락토스, 글리레콜 및 인 분자의 수와 관련이 있다. 따라서, 추가의 특정 구현예에서, 몰비 갈락토스/글루코스는 적어도 0.8이고, 글리세롤/글루코스 몰비는 적어도 1.0이고/거나, 인/글루코스 몰비는 적어도 5.0, 10.0, 15.0, 20.0 또는 25.0이고, 바람직하게는 인/글루코스 몰비는 26.0, 더 바람직하게는, 26.09이다.
"식품" 또는 "사료 제품"이라는 용어는 이전 단락에서 정의되었다. 식품 또는 사료 제품의 예는 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스로 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA를 혼입한 기능성 식품, 프로바이오틱스, 음료, 공생 또는 신바이오틱, 식이 보충물 및/또는 기능식품, 및/또는 이를 포함하는 추출물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 원칙적으로 식품은 형태 및 유형 면에서 제한되지 않는다. 예를 들어, 식료품은 액체, 분말 또는 고체 형태일 수 있다. 본 발명에서 언급되는 식료품은 유아 영양, 사료 및 애완동물 사료를 포함하는 인간 또는 비-인간 동물 소비를 위한 것일 수 있다. 본 발명의 식료품은 당업계에 일반적으로 알려진 기능성 식품을 포함한다. 이들은 상이한 영양소, 비타민, 전해액, 풍미제, 착색제, 펙틴산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기 산, 보호 콜로이드성 증점제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료(소위 '스파클링 음료')에 사용되는 탄산화제 등를 추가로 포함할 수 있다.
과량의 글루코스에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA를 함유할 가능성이 있는 식품의 예는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 사탕, 스낵, 과자, 피자, 라면, 기타 면류, 껌, 아이스크림을 포함한 유제품, 각종 수프, 음료, 차, 드링크제, 우유, 사료 등을 포함한다.
식품 또는 사료 제품의 정교화를 위한 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스로서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA를 단독으로 또는 이전의 특정 구현예와 조합하여 사용하는 또 다른 특정 구현예에서, 식품 또는 사료 제품은 영양 보충물이다. "영양 보충물"라는 용어는 본 설명에서 이전에 정의되었다.
식품 또는 사료 제품의 정교화를 위한 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스로서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA를 단독으로 또는 이전의 특정 구현예와 조합하여 사용하는 또 다른 특정 구현예에서, LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득된다. 본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스인 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA는 글루코스는 비피도박테리움 롱검, 바람직하게는 비피도박테리움 롱검 CECT 7347로부터 수득된다. 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145 및 비피도박테리움 롱검 CECT 7347은 본원에서 이전에 정의되었다.
식품 또는 사료 제품의 정교화를 위한 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스로서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA를 단독으로 또는 이전의 특정 구현예와 조합하여 사용하는 또 다른 특정 구현예에서, LTA는 열처리되거나 건조(동결건조 포함)된다. "열처리된" 및 "동결건조"라는 용어는 본 본원에 이전에 정의되었다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 비피도박테리아로부터 LTA를 얻는 방법에 관한 것이다:
(a) 탄소원으로서 과량의 당으로 비피도박테리움을 배양하는 단계,
(b) 박테리아의 세포벽으로부터 LTA를 단리하는 단계.
용어 "탄소원" 및 "당", 뿐만 아니라 이들의 특정 구현예는 이전 단락에서 이미 정의되었으며 본 발명의 양태에 적용된다. 본 발명의 LTA를 얻는 방법의 특정 구현예에서, 당은 글루코스, 갈락토스, 푸룩토스, 수크로스, 락토스, 말토스 및 트레할로스로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 보다 특정한 구현예에서, 당은 글루코스이다.
비피도박테리움의 배양 및 상기 비피도박테리움으로부터 LTA의 단리를 수행하기 위한 조건은 최신 기술에 널리 공지되어 있고 본 설명에서 이전에 설명되었다.
LTA를 얻는 방법의 특정 구현예에서, 비피도박테리움은 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145이다. LTA를 얻는 방법의 또 다른 특정 구현예에서, 비피도박테리움은 비피도박테리움 롱검, 바람직하게는, 비피도박테리움 롱검 CECT 7347이다 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145 및 비피도박테리움 롱검 CECT 7347은 본원에서 이전에 정의되었다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 탄소원으로서 과량의 당, 바람직하게는 글루코스에서 비피도박테리움을 배양하는 단계, 및 (b) 박테리아의 세포벽으로부터 LTA를 단리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 LTA에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 하기 구현예를 포괄한다:
1. 약제로 사용하기 위한 비피도박테리아로부터의 리포테이코산(LTA)으로서, LTA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00009
여기서
- GroP는 글리세로포스페이트이고,
- m은 갈락토푸라난의 반복 단위의 수이고 10 내지 20이고, 그리고
- n은 글루칸의 반복 단위의 수이고 5 내지 20 이다.
2. 비만, 과체중 또는 당뇨병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 비피도박테리아로부터의 LTA로서, LTA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00010
여기서
- GroP는 글리세로포스페이트이고,
- m은 갈락토푸라난의 반복 단위의 수이고 10 내지 20이고, 그리고
- n은 글루칸의 반복 단위의 수이고 5 내지 20 이다.
3. 구현예 1 또는 2에 따라 사용하기 위한 비피도박테리아로부터의 LTA로서, m은 11 내지 18이고, n은 8 내지 12이다.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 따라 사용하기 위한 비피도박테리아로부터의 LTA로서, LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는, 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득된다.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 한 구현예에 따라 사용하기 위한 비피도박테리아로부터의 LTA로서, LTA는 열처리 또는 동결건조된다.
6. 체지방 감소를 위한 비피도박테리아로부터의 LTA의 비치료적 용도로서, LTA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00011
여기서
- GroP는 글리세로포스페이트이고,
- m은 갈락토푸라난의 반복 단위의 수이고 10 내지 20이고, 그리고
- n은 글루칸의 반복 단위의 수이고 5 내지 20 이다.
7. 구현예 6에 따른 비치료적 용도로서, m은 11 내지 18이고 n은 8 내지 12이다.
8. 구현예 6 또는 7에 따른 비치료적 용도로서, LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는, 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득된다.
9. 구현예 6 내지 8 중 어느 한 구현예에 따른 비치료적 용도로서, LTA는 열처리 또는 동결건조된다.
10. 식품 또는 사료 제품의 정교화를 위한 비피도박테리아로부터의 LTA의 용도로서, 여기서 LTA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00012
여기서
- GroP는 글리세로포스페이트이고,
- m은 갈락토푸라난의 반복 단위의 수이고 10 내지 20이고, 그리고
- n은 글루칸의 반복 단위의 수이고 5 내지 20 이다.
11. 구체예 10에 따른 용도로서, m은 11 내지 18이고, n은 8 내지 12이다.
12. 구현예 10 또는 11에 따른 용도로서, 식품 또는 사료 제품은 영양 보충물이다.
13. 구현예 10 내지 12 중 어느 한 구현예에 따른 용도로서, LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는, 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득된다.
14. 구현예 10 내지 13 중 어느 한 구현예에 따른 용도로서, LTA는 열처리 또는 동결건조된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질은 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐 "포함한다"라는 단어와 그 변형은 다른 기술적 특성, 첨가제, 구성요소 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다. 본 발명의 추가의 목적, 이점 및 특징은 설명의 검토시 당업자에게 명백해질 것이거나 본 발명의 실시에 의해 습득될 수 있다. 하기 실시예 및 도면은 예시로서 제공되며 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다.
도 1. B. 아니말리스 subsp. 락티스 BPL1 기능적 활성은 세포 외피 구성요소에 의존한다. A) BPL1 세포의 프로테아제 처리. B) MIC 미만의 용량에서 반코마이신 및 암피실린으로 처리된 BPL1 세포. C) 배양 배지(MRS-Cys)에서 글루코스 제한(15 g/L, 10 g/L) 조건. D) 표준 MRS-Cys 배양 배지(20 g/L 글루코스) 또는 낮은 글루코스(10 g/L)에서 MRS-Cys에서 600 nm에서 OD의 정량화에 의해 얻은 BPL1 균주의 세포 성장 곡선. 글루코스 수준은 성장 곡선을 따라 상이한 시간에 추정되었다. 데이터는 평균 ± sd.이고, 두개의 생물학적 독립 실험에서 계산되었다. E) 배양 배지(MRS-Cys)에서 푸룩토스, 사카로스, 락토스, 말토스, 또는 갈락토스(10 g/L)의 제한. F) Caco-2 상피 세포에 대한 부착. 글루코스 10 g/L(제한) 또는 20 g/L(표준)에서 성장한 5x108 CFU/mL의 BPL1 배양물을 접착 검정에 사용하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± sd이다. A), B), C)에 대해 박테리아 공급 선충(야생형-균주 N2)에서의 형광 백분율을 나타낸다. 나일 레드는 ??은 성체 단계에서 정량화되었다. 오를리스타트(6 μg/mL)를 양성 대조군으로 사용하였다. 데이터는 평균 ± sd이며 2개의 독립적인 생물학적 실험에서 계산되었다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, NS: 유의하지 않음.
도 2. BPL1로부터의 조 세포벽 분획은 지방 감소 활성을 나타낸다. 표준 조건(20 g/L의 글루코스는 있는 MRS-Cys) 및 낮은 글루코스(10 g/L)에서 성장한 세포의 BPL1의 세포벽 분획의 준비. 세포벽 분획 공급 선충(야생형 균주 N2)에서 형광 백분율이 표시된다. 나일 레드는 ??은 성체 단계에서 정량화되었다. 오를리스타트(6 μg/mL)를 양성 대조군으로 사용하였다. 데이터는 평균 ± sd.이고, 두 개의 독립적인 생물학적 실험에서 계산되었다. ** P<0.01; *** P<0.001, NS: 유의하지 않음.
도 3. BPL1 균주로부터의 리포테이코산(LTA)은 지방 감소 활성을 보여주고 상이한 처리에서 이 용량을 보존한다. A) 표준 MRS-Cys(20 g/L)에서 BPL1 및 저 글루코스 MRS-Cys(10 g/L)에서 성장한 BPL1 세포에서 얻은 LTA 분획. B) BPL1 세포로부터의 LTA 분획의 가열 또는 동결건조는 기능에 영향을 미치지 않았다. C) 상이한 용량에서 정제된 LTA의 지방 감소 효과. D) 형광 현미경검사 하에 야생형 N2 동물에서 살아있는 젊은 성체 C. 엘레간스에서 지질 함량의 나일 레드 염색의 대표적인 이미지. 선충에 BPL1 세포, 열처리된 BPL1 세포(HT-BPL1) 또는 LTA가 공급되었다. 스케일 바, 50 μm. 이 문서의 저자가 Nikon-SMZ18 형광 입체현미경으로 찍은 원본 이미지이다. E) BPL1로부터의 정제된 LTA를 먹인 C. 엘레간스에서 트리글리세라이드 함량(mM TG/mg 단백질)의 정량화. F) 표준 MRS-Cys(20 g/L)에서 BPL1 및 저 글루코스 MRS-Cys(10 g/L)에서 성장한 BPL1 세포에서 얻은 정제된 LTA. 글루코스의 과량 또는 제한으로 성장한 BPL1 세포를 포함시켰다. A), B), C), F)에 대해 박테리아 및 LTA-공급 선충(야생형-균주 N2)에서의 형광 백분율을 나타낸다. 나일 레드는 ??은 성체 단계에서 정량화되었다. 오를리스타트(6 μg/mL)를 양성 대조군으로 사용하였다. 데이터는 평균 ± sd.이고, 두개의 생물학적 독립 실험에서 계산되었다. ** P<0.01; *** P<0.001; NS: 유의하지 않음.
도 4. BPL1 균주로부터의 리포테이코산(LTA)은 지방 감소 효과를 발휘하기 위해 인슐린 유사 신호전달 경로(IGF-I)가 필요하며 고혈당 조건에서 기능적 활성을 가지고 있다. A) 돌연변이체 daf-2 및 daf-16 균주에서 LTA로 벌레에게 먹이고; 살아있는 BPL1 세포 및 열처리된 BPL1 세포와 동일하다. B) BPL1로부터의 LTA로 처리된 SKN-1 전사 인자에 대한 C. 엘레간스 돌연변이체의 지방 함량. C) C. 엘레간스 고혈당 모델에 대한 치료의 효과. 고 글루코스(100 mM)에서 성장한 야생형 균주 N2의 선충. 메트포르민은 양성 대조군으로 사용되었다. A), B), C)에 대해 LTA-공급 선충(야생형-균주 N2, GR1307, daf -16(mgDf50), CB1370, daf -2(e1370), 또는 LG333 Skn - 1(zu 135))에서 형광의 백분율. 나일 레드 염색은 ??은 성체 단계에서 정량화되었다. 오를리스타트(6 μg/mL)를 양성 대조군으로 사용하였다. 데이터는 평균 ± sd.이고, 두 개의 독립적인 생물학적 실험에서 계산되었다. *** P<0.001, NS: 유의하지 않음.
도 5. BPL1로부터의 LTA는 지방 감소 활성을 가지며 기계적 파괴는 약간 더 효과적인 LTA를 제공한다. 살아있는(BPL1) 세포와 PANDA 균질화기 또는 초음파 처리에 의해 파괴된 세포가 양성 대조군으로 포함되었다. NGM 음성 대조군인 오를리스타트는 검정에서 양성 대조군으로 사용되는 지방 감소 약물이다.
도 6. B. 아니말리스 subsp. 락티스 BPL1(CECT 8145)로부터 얻은 LTA 분획의 C. 엘레간스에서 지방 감소 효과. 살아있는 세포(BPL1)와 열처리된 세포(HT-BPL1) 모두 양성 대조군으로 포함되었다. NGM 음성 대조군인 오를리스타트는 검정에서 양성 대조군으로 사용되는 지방 감소 약물이다.
도 7. B. 아니말리스 subsp. 락티스 BPL1(CECT 8145) 및 다른 비피도박테리움, 락토바실러스 및 바실러스 균주에서 얻은 LTA 분획의 C. 엘레간스에서 지방 감소 효과.
도 8. 다른 비피도박테리움 균주, B. 롱검 ES1 및 B. 아니말리스 BPL1에서 얻은 정제된 LTA의 C. 엘레간스에서 지방 감소 효과의 분석.
도 9. BPL1-LTA의 NMR 스펙트럼.
도 10. 다양한 성장 단계 및 표준 글루코스 배지(A) 또는 글루코스 제한(B)에서 얻은 BPL1 세포의 기능적 평가. ***유의한 P 값 <0.001; **유의한 P 값 < 0.01; NS: 유의하지 않음.
도 11. 리포테이코산(LTA)의 정제 및 특성화. (A) BPL1 세포벽 물질의 N-부탄올 추출 후 소수성 상호작용 크로마토그래피 분획의 인산염 함량에 대한 스크리닝. (B) SDSPAGE 및 알시안 블루/은 염색.
도 12. MALDI-TOF 질량 스펙트럼.
실시예
실시예 1: 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145(BPL1)로부터 리포테이코산(LTA)에 의한 지방 침착의 감소
I - 물질 및 방법
C. 엘레간스 계통 및 유지
카에노르하브디티스 엘레간스 N2 야생형 균주(Bristol) 및 돌연변이체 균주 GR1307, daf-16(mgDf50), CB1370, daf-2(e1370), 및 LG333 Skn-1(zu 135)은 Caenorhabditis Genetic Center(CGC), University of Minnesota(USA)에 의해 제공되었다.
선충 균주는 20℃에서 식품 공급원으로 에스케리치아 콜라이 균주 OP50을 사용하여 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에서 일상적으로 증식되었다. 벌레는 20℃에서 임신한 성충으로부터 알(egg)을 단리하여 동조화되었고 알은 NGM 플레이트에서 부화되었다. 지방 정량을 위한 실험에서, 벌레는 알에서 성체 단계까지 다양한 화합물을 먹였다.
고혈당 조건를 유도하기 위해, 선충을 젊은 성체 단계에 도달할 때까지 100 mM의 글루코스가 보충된 NGM 플레이트에서 성장시켰다.
비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145(BPL1) 배양 조건
B. 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145(BPL1) 균주는 이전에 설명된 바와 같이 모유를 먹고 있는 건강한 아기의 대변에서 원래 단리되었다(Martorell, P., 등 2016, J Agric Food Chem 64: 3462-3472). 본 연구는 헬싱키 선언(Helsinki declaration) 및 아동 관련 의료 연구의 윤리적 수행 지침에 따라 수행되었다. 서면 정보를 받은 후 어머니로부터 서면 동의를 받았다. 모든 실험 프로토콜은 관련 지침 및 규정에 따라 기관 위원회(Biopolis　Biosafety Committee)의 승인을 받았다. 표준 배양을 위해, 박테리아는 GasPakTM EZ Anaerobe Container System(BD)에 의해 생성된 혐기생활 대기에서 37℃에서 18시간 동안 MRS 배지(카세인으로부터의 펩톤, 트립신 소화 10 g/L; 육류 추출물 10 g/L; 효모 추출물 10 g/L; D-글루코스 20 g/L; K2HPO4 2 g/L; 디-암모늄 수소 시트르산염 2 g/L; 아세트산나트륨 5 g/L; MgSO4 0.2 g/L; MnSO4 0.05 g/L; Tween 80 1 g/L), 시스테인(Sigma, 0.05% wt/vol) 보충), MRS-Cys에서 성장되었다.
에스케리치아 콜라이 OP50 균주를 (Bacto-트립톤 10 g/L; Bacto-효모 5 g/L; NaCl 5 g/L)에서 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. E. 콜라이 OP50 배양물은 NGM 플레이트를 씨딩하는데 사용할 준비가 되었다.
BPL1 배양 상청액의 기능적 평가
BPL1의 밤새 배양물을 얻었고, 세포를 10분 동안 3220 x g에서 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청액을 새로운 튜브에 수집하고 pH를 7로 조정하였다. 마지막으로 BPL1 상청액을 0.22 기공 크기 μm 필터를 사용하여 여과하고 C. 엘레간스 지방 감소 검정에서 테스트하였다. 양성 대조군으로 오를리스타트(6 μg/mL)를 사용하여 3개의 상이한 용량(50, 100 및 200 μL/플레이트)을 테스트하였다.
BPL1로부터 DNA 단리
BPL1 세포로부터의 DNA를 제조자 지침에 따라 High Pure PCR Template Preparation Kit(11796828001, Roche)를 사용하여 밤새 배양물로부터 단리하였다. Nanodrop 분광광도계(Thermofischer)를 사용하여 DNA를 단리하고 정량화한 후, 3개의 상이한 용량(12.5 μg/플레이트, 25 μg/플레이트 및 50 μg/플레이트)을, E. 콜라이 OP50으로 이미 씨딩된 NGM 한천 플레이트의 상부에 직접 DNA를 첨가함으로써 C. 엘레간스 지방 감소 검정 상에서 시험하였다.
글루코스의 영향
BPL1 세포의 기능적 효과에 대한 글루코스의 영향을 테스트하기 위해, MRS-Cys 배지에서 글루코스 농도를 수정하였다. BPL1은 다른 성분을 일정하게 유지하면서 상이한 농도의 D-글루코스(20, 15 및 10 g/L)으로 MRS-Cys에서 성장되었다(위의 레시피 참조). GasPakTM EZ Anaerobe Container System(BD)에 의해 생성된 혐기성 분위기에서 37℃에서 18시간 후, 이러한 글루코스 조건에서 배양된 박테리아는 C. 엘레간스 지방 감소 검정에서 테스트되었다. 세포를 원심분리로 수확하고 식염수로 3회 연속적으로 세척하고, 농축된 BPL1 처리된 세포(OD600=30)를 E. 콜라이 OP50를 갖는 NGM 한천 플레이트 상단에 50 μL을 추가하여 C. 엘레간스 지방 감소 검정에서 테스트하였다.
BPL1로부터의 LTA의 기능적 효과에 대한 배양 배지에 함유된 글루코스의 영향을 테스트하기 위해, MRS-Cys 배지에서 글루코스 농도를 수정하였다. BPL1은 다른 성분을 일정하게 유지하면서 상이한 농도의 D-글루코스(20, 15 및 10 g/L)으로 MRS-Cys에서 성장되었다(위의 레시피 참조). GasPakTM EZ Anaerobe Container System(BD)에 의해 생성된 혐기성 분위기에서 37℃에서 18시간 후, 원심분리하여 세포를 수확하고 식염수로 3회 세척하고 LTA 단리 및 정제에 사용하였다.
탄소원으로 사용되는 다른 당의 영향
BPL1 균주의 배양에서 탄소원으로 사용된다른 당의 영향은 변형된 MRS-Cys 배지에서 테스트되었다. D-글루코스는 다른 성분을 일정하게 유지하면서 20 g/L 및 10 g/L의 푸룩토스, 사카로스, 락토스, 말토스 또는 갈락토스로 대체되었다(위의 레시피 참조). GasPakTM EZ Anaerobe Container System(BD)에 의해 생성된 혐기성 분위기에서 37℃에서 18시간 후, 이러한 글루코스 조건에서 배양된 박테리아는 상술된 바와 같은 C. 엘레간스 지방 감소 검정에서 테스트되었다.
항생제의 영향
BPL1은 또한 비피도박테리움 속에 MIC 미만의 용량을 사용하여 암피실린 또는 반코마이신이 보충된 MRS-Cys 배지와 함께 배양되었다. MRS-Cys 배지에 0.1 μg/mL 및 0.25 μg/mL의 각 항생제를 보충하고 BPL1 세포를 37℃에서 18시간 동안 혐기성 배양하였다. 성장 후, 세포를 원심분리에 의해 수확하고 식염수로 3회 세척하였다. 연속적으로, 농축된 BPL1 처리된 세포(OD600=30)를 E. 콜라이 OP50를 갖는 NGM 한천 플레이트 상단에 50 μL을 추가하여 C. 엘레간스 지방 감소 검정에서 테스트하였다.
효소적 치료
BPL1 세포의 프로테이나제 K 처리는 Gopal 등에 따라 수행되었다 [Gopal, P. K., 등 2001. Int J Food Microbiol 67, 207-216]. BPL1의 밤새(18시간, 37℃ 혐기성) 배양물을 프로테이나제 K(P6556, Sigma)로 처리하였다. 성장 후, 세포를 원심분리에 의해 수확하고 50 mM 인산염 완충액(pH 7)으로 3회 세척하였다. 프로테이나제 K(1 mg/mL)의 스톡 용액은 50 mM 인산염 완충액(pH 7)에서 제조되었다. 그 다음, 세척된 배양물을 37℃에서 30분 동안 프로테이나제 K와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리에 의해 회수하고 반응을 중단시키기 위해 M9 완충액(KH2PO4 3 g/L; Na2HPO4; 6 g/L; NaCl 5 g/L; 1 mL 1 M MgSO4)으로 3회 세척하였다. 처리된 세포를 농축하고(OD600=30), E. 콜라이 OP50를 갖는 NGM 플레이트의 표면 상에 50 μL의 세포를 첨가함으로써 지방 감소를 위해 C. 엘레간스에서 시험하였다.
Caco-2 배양물에서 세포 접착 검정
세포 배양 및 준비
Caco-2 세포는 10%(v:v) 우태 혈청 및 1%(v:v) 비필수 아미노산 용액이 보충된 L-글루타민을 갖는 둘베코 변형 이글스(Eagle's) 최소 필수 배지 DMEM에 배치되었다. 접착 검정을 위해, Caco-2 세포를 24-웰 표준 조직 배양 플레이트에 105개 세포/웰의 농도로 씨딩하였다. 세포가 완전히 분화된 것으로 간주되는 경우, 세포를 합류(confluence) 후 2주 동안 유지시켰다(M. Pinto, S. R.-L., 등 1983. Biol. Chem, 323- 330).
접착 검정
BLP1의 밤새 배양물을 원심분리하여 배양 배지를 제거하였다. 박테리아 펠릿을 PBS 완충액(NaCl 8 g/L; KCl 0.2 g/L; Na2HPO4 1.15 g/L; KH2PO4 0.2 g/L)으로 세척하고 세포 배양 배지에 재현탁하고 광학 밀도를 점검하여 약 1Х108, 5x108 또는 1x109개의 세포/mL를 얻었다. 그 다음 박테리아 세포를 표준 조건 하에 2시간 동안 Caco-2 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이후 PBS로 3회 세척하여 부착되지 않은 BPL1 세포를 제거하였다. 부착된 박테리아 세포를 열거하기 위해 각 웰의 단층을 피펫팅하여 회수하였다. Caco-2 세포와 부착된 프로바이오틱스의 혼합물을 MRS-Cys 한천에 플레이팅하였다. 이를 위해 104 내지 107 CFU/mL 범위의 일련의 소수(decimal) 희석액을 준비하였다. 각 희석액의 물질을 MRS-Cys 액체배지를 사용하여 부어서 페트리 접시에 접종하였다. 박테리아 배양물을 37℃에서 48시간 동안 혐기성 조건에서 인큐베이션하였다. 접착 검정에 사용된 스톡 배양물의 박테리아 세포 밀도도 추정되었다. 인큐베이션 후, 부착된 박테리아의 수를 정량화하였다. 그 결과를 바탕으로, Caco-2 상피세포 100개당 부착 박테리아의 수를 계산하였다.
C. 엘레간스에서 지방 감소 검정
카에노르하브디티스 엘레간스 N2 야생형 균주(Bristol) 및 돌연변이체 균주 GR1307, daf-16(mgDf50), CB1370, daf-2(e1370), 및 LG333 Skn-1(zu 135)은 Caenorhabditis Genetic Center(CGC), University of Minnesota(USA)에 의해 제공되었다. C. 엘레간스 지방 함량은 이전에 문헌[Martorell, P. 등 2016 J Agric Food Chem 64, 3462-3472]에 설명된 프로토콜에 따라 나일 레드(Sigma, St. Louis, MO, USA) 염색 방법을 사용하여 측정되었다. 염료는 0.05 μg/mL의 최종 농도에서 OP50으로 씨딩된 NGM 플레이트의 표면에 추가되었다. 검정의 양성 대조군은 오를리스타트(6μg/mL)를 갖는 E. 콜라이 OP50이 포함된 NGM 플레이트였다.
동조화된 벌레는 젊은 성체 단계에 도달할 때까지 3일 동안 이 플레이트에서 인큐베이션되었다. 이 기간 후, 선충을 M9 완충액으로 옮기고 λex= 480 nm 및 λem= 571 nm로 FP-6200 시스템(JASCO Analytical Instrument, Easton, MD, USA)을 사용하여 형광을 측정하였다. 조건/처리당 총 120마리의 선충을 분석하기 위해 조건당 2개의 실험을 수행하였다.
트리글리세라이드(TG) 정량화
총 TG는 Triglyceride Quantification Kit(Biovision, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 과량의 글루코스에서 배양된 BPL1로부터의 단리된 LTA를 먹인 선충에서 정량화되었다. 연령 동조화된 벌레를 E. 콜라이 OP50이 이미 씨딩된 NGM 플레이트 또는 정제된 LTA(10 μg/mL, 1 μg/mL 및 0.1 μg/mL)가 보충된 NGM 플레이트에서 배양하였다. 그 다음 젊은 성체 단계의 벌레를 수집하고 M9 완충액을 사용하여 세척하였다. 벌레 침강 후, 상청액을 제거하고, 400 μL의 트리글리세라이드 분석 완충액을 벌레 펠렛에 첨가하였다. 벌레는 10% 전력에서 30초의 4개의 펄스를 사용하여 디지털 초음파 분석기(Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT, USA)로 초음파 처리되었다. 각 조건의 단백질 함량은 BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정되었다. 샘플을 열혼합기(ThermoFisher)에서 5분 동안 90°C에서 두 번 천천히 가열하여 용액에서 모든 TG를 가용화하였다. 간단한 원심분리 후, 제조사 지침에 따라 분취량(50 μL/웰)을 트리글리세라이드 분석에 사용하였다. 4개의 독립적인 실험에서 각 조건에 대해 4개의 다른 생물학적 복제물이 포함되었다.
현미경검사 분석
형광 입체현미경을 사용하여 상이한 처리 하에 선충의 나일-레드(Nile-red)로 염색된 지질 액적을 시각화하였다. 동일한 용량의 BPL1, HT-BPL1 및 LTA BPL1과 함께 나일 레드(0.05 μg/mL)를 갖는 NGM 플레이트에서 알에서 젊은 성체 단계까지 인큐베이션된 벌레 집단을 일반 C. 엘레간스 지방 감소 검정에서 테스트하였다. 연령 동조화된 벌레를 새로운 아가로스 1%(wt/v) 플레이트로 옮기고 NIS-ELEMENT 이미지 소프트웨어가 장착된 형광 입체현미경(Nikon-SMZ18)에서 형광을 측정하였다. 조건당 총 30마리의 벌레가 분석되었다. 오를리스타트(6 μg/mL)를 양성 대조군으로 사용하였다.
세포벽 분획
BPL1 밤새 배양물(100 mL)을 10분 동안 끓인 다음, 4°C에서 8분 동안 14000 x g 원심분리하였다. 펠릿화된 세포를 5%(wt/vol) 나트륨 도데실 설페이트(SDS)에 재현탁하고 25분 동안 끓였다. 그 다음 세포를 원심분리에 의해 회수하고 재현탁하고 15분 동안 4%(wt/vol) SDS에서 다시 끓였다. 불용성 물질을 60℃의 증류수로 5회 세척하였다. 이후, 불용성 세포벽 분획을 60℃에서 1시간 동안 공유적 부착 단백질을 제거하기 위해 2 mg/mL의 프로나제(10165921001, Roche)로 처리하였다. 세포벽 추출물을 원심분리에 의해 회수하고 증류수로 1회 세척한 다음, 불용성 펠렛을 400 μL의 48%(vol/vol) 플루오르화수소산(HF)(339261-100ML, Sigma)에 재현탁하고 2℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포벽 분획을 원심분리로 회수하고 50 mM 트리스-HCl(pH 7) 완충액으로 1회, 냉수로 5회 세척하여 완충액을 제거하였다. 마지막 세척 후, 불용성 세포벽 함유 분획은 206 nm에서 흡광도를 측정하는 동결건조된 마이크로코쿠스 라이소데이크티쿠스(Micrococcus lysodeikticus)(M3770, Sigma)의 표준 곡선을 사용하여 10 mg/mL로 정규화되었다(Schaub, R. E. & Dillard, J. P. 2017. Bio Protoc 7, doi:10.21769/BioProtoc.2438). 마지막으로, 세포벽 분획은 -20°C에서 보관되었다. 세포벽 분획은 27.5 μg/mL의 용량에서 C. 엘레간스 지방 감소 검정에서 평가되었다.
LTA 정제 및 분석
박테리아는 이전에 설명한 대로 부탄올 추출 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 거쳤다(Kho, K. 및 Meredith, T.C. 2018, Journal of Bacteriology 200: e00017-00018). 간단히 말해서, 박테리아 BPL1 세포를 12,000xg에서 15분 동안 원심분리하여 밤새 성장된 배양물로부터 회수하고 시트르산나트륨 50 mM pH 4.7로 2회 세척하였다. 박테리아 펠릿을 시트르산나트륨 50 mM pH 4.7에 현탁시키고 1,000bar에서 PANDA PLUS 2000 균질화기(GEA)에서 파괴하였다. 불용성 세포 물질 펠릿을 12,000xg에서 90분간 원심분리하여 수집하고, 시트르산나트륨 50 mM pH 4.7에 현탁하고 37℃에서 동일한 부피의 1-부탄올로 45분간 추출하였다. LTA를 함유하는 수성상을 회수하고, 동결 건조시키고, 시트르산나트륨 50 mM pH 4.7에 용해시키고 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼(HiTrap Octyl FF)에 로딩하였다.
LTA를 시트르산나트륨 50 mM pH 4.7에서 선형 15% 내지 65% 1-프로판올 구배로 정제하였다. LTA를 함유하는 분획은 다른 곳에서 기술된 바와 같이 인산염 분석에 의해 결정되었다(Draing, C., 등 2006, J Biol Chem 281: 455 33849-33859). 인산염 양성 샘플을 풀링하고 투석하였다(도 11a).
정제된 LTA는 산 가수분해 후 GC-Q-MS로 분석하였다. 간단히 말해서, LTA는 HCl 2M에 1g/L로 용해되었고, 산 가수분해는 100℃에서 2시간 동안 수행되었다. D-글루코스, D-갈락토스, 글리세롤 및 글리세롤-3-포스페이트가 이들의 트리메틸실릴 유도체로서 결정되었다(Fiehn, O., 등 2000, Anal Chem 72: 3573-3580). GC는 5977B 질량 검출기에 커플링된 GC 컬럼 DB5-MS를 사용하여 Agilent 7820A 기체 크로마토그래피에서 수행하고 Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL 라이브러리와 비교하여 식별한다.
LTA의 생화학적 특성.
LTA 분자는 SCSIE University of Valencia의 프로테오믹스 시설에서 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화-비과시간(MALDI-TOF) 질량 분광분석에 의해 특성화되었다(이 프로테노믹스 실험실은 Proteored STB3의 구성원이고, ISCIII 및 ERDF에 의해 지원된 PT17/0019 of PE I+D+I 2013-2016의 승인에 의해 지지된다). 간단히 말해서, 1μl의 샘플과 1μl의 매트릭스 용액(70% ACN 중 10 mg/mL CHCA, 0.1% TFA)을 샘플 플레이트에 스폿팅하였다. 건조 후, 샘플은 반사기 모드에서 질량 분광계(5800 MALDI TOFTOF, ABSciex)로 분석되었으며, 질량 범위는 1,660 내지 1,500 m/z이고 레이저 강도는 6,000이다.
LTA는 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 추가로 분석되었다. LTA의 분자량은 증진된 감수성을 위해 변형된 은 염색과 커플링된 양이온성 염료 알시안 블루를 사용하여 영상화되는 SDS-PAGE 겔에서 나타났다(Kho and Meredith, 2018, 상기 인용). LTA의 구조는 1H 핵 자기 공명(NMR) 분광분석으로 분석하였다. 간단히 말해서, 1H-NMR은 700.13MHz의 1H 주파수에서 작동하고 Z-구배가 있는 5mm TCI(동결프로브)가 장착된 Bruker AVANCE III 700 Ultrasield 분광계(Bruekr BioSpin, Rheinstetten, Germany)에서 수행되었다. 사용된 획득 펄스 시퀀스는 Bruker Topspin 3.6에서 물 사전포화 및 2초 재순환 시간을 사용한 것이다. 스펙트럼은 0 ppm에서 TSP 신호를 사용하여 참조되었다(도 9).
LTA의 순도는 검정이 LTA에 둔감하기 때문에 리뮬러스 유주세포 용해물 검정(Lonza Bioscience, Switzerland)로 내독소 함량을 측정하여 결정되었다(Morath, S., 등 2001, J Exp Med 193: 393-397). DNA 및 RNA 오염은 260 nm 및 280 nm에서 자외선(UV) 흡수를 측정하여 결정되었다(NanoDrop Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, USA). PG 골격 N-아세틸무라믹산의 당 성분은 굴절률 검출기(모델 2414, Waters Corporation 미국 매사추세츠주) 및 이온교환 칼럼(Aminex HPX-87H, Bio-Rad, CA, USA)에 커플링된 Alliance 2695 HPLC 시스템(Waters Corporation, 미국 매사추세츠주))에서 수행된 액체 크로마토그래피 분석에 의해 결정되었다. 아미노산 오르니틴, 라이신 및 세린은 정제된 LTA(HCl 2M, 100℃, 2시간)의 산 가수분해 및 트리메틸실릴 유도체화 후 GC-Q-MS에 의해 결정되었다(Fiehn, O. 등, 2000, 상기 인용). GC는 5977B 질량 검출기에 커플링된 GC 컬럼 DB5-MS를 사용하여 기체 크로마토그래피(모델 7820A, Agilent, CA, USA)에서 수행하고 Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL 라이브러리와 비교하여 식별한다.
펩티도글리칸의 효소적 가수분해를 위해, 정제된 LTA 샘플을 뮤타놀리신(SIGMA)으로 처리(0.04mg/mL 37℃, 4시간)하였다. 여과 후(Amicon Ultra-0.5, Merck Millipore, Germany) 가용성 뮤로펩티드는 5 mg/mL의 최종 농도에서 수소화붕소나트륨을 사용하여 감소되었다. 인산을 사용하여 pH를 2-4로 낮추어 20분 후 반응을 중단시켰다. 단편을 HPLC로 분리하고 Phenomenex(CA, USA)의 역상 옥타데실 실리카(ODS) C18 컬럼 용출을 30℃에서 다음과 같이 수행하였다: 0.5 mL/분의 유속으로 완충액 A(50mM 인산나트륨 pH 4.33)에서 10분 후 120분의 기간에 걸쳐 0 내지 100% 완충액 B(15%(v/v) 메탄올을 갖는 50mM 인산 나트륨 pH 5.10)의 선형 구배. Abs 206 nm를 모니터링하여 용출된 화합물을 검출하였다(Schaub 및 Dillard, 2017, 상기 인용).
통계적 분석
결과는 평균 ± 표준 편차로 제공된다. C. 엘레간스의 지방 침착에 대한 데이터는 Tukey의 다중 비교 사후 테스트를 사용하여 One Way Anova 테스트로 분석되었다. 상이한 C. 엘레간스 균주 간의 효과를 비교하기 위해, Two-Way Anova 테스트를 사용하였다. 세포 접착 검정에서 그룹 간의 차이는 스튜던트(Student) t 테스트에 의해 분석되었다. 모든 통계적 분석은 GraphPad Prism 4 소프트웨어를 사용하여 통계적 유의 수준을 5%로 설정하여 수행하였다.
II - 결과
지방 감소 기능적 활성을 담당하는 BPL1 프로바이오틱 균주의 분자(들)을 확인하기 위해, 본 발명자들은 선충 C. 엘레간스를 간단하고 신속한 모델로서 사용하여 상이한 세포 분획에 의해 생성된 지방 감소를 평가하였다. 이 선충은 피하 및 장 세포에 지질을 저장하며 염색(나일 레드)으로 쉽게 검출된다. 지질 합성, 분해 및 수송에 관여하는 많은 단백질은 C. 엘레간스와 포유류 사이에서 보존된다.
선험적으로 지방 감소 활성은 박테리아 세포 및/또는 배양 상청액에 존재할 수 있다. 따라서, 먼저 배양 배지를 테스트하였고, 즉, 야생형 균주 N2의 연령 동조화된 선충을 사육하고 MRS+Cys 배지에서 프로바이오틱 BPL1 균주의 밤새 배양 후 얻은 상청액을 공급하였다. 나일 레드 염색 및 분광형광계에서 후속 형광 정량화를 수행했을 때 이러한 선충에서 지방 감소에 대한 영향이 관찰되지 않았다(데이터는 표시되지 않음). 따라서, 본 발명자들은 활성은 성장 동안 분비가능하거나 방출된 물질로 인한 것임을 폐기할 수 있다.
세포의 주요 성분 중 하나가 DNA라는 것을 고려하고 프로바이오틱 박테리아로부터의 DNA가 일부 기능적 활성을 발휘하는 것으로 밝혀졌음을 알면, 본 발명자들은 BPL1로부터 단리된 DNA인 C. 엘레간스에서 검정하였다. 그러나 DNA는 지방 감소 효과를 나타내지 않았다(데이터는 표시되지 않음).
BPL1 세포의 가용성 또는 불용성 성분이 지방 감소 활성의 원인인지 평가하기 위해, 본 발명자들은 밤새 배양에서 얻은 BPL1 세포를 기계적으로 파괴하고 원심분리에 의해 분리된 불용성 및 가용성 세포 분획을 생성하였다. 형광 검정은 지방 감소 활성이 주로 불용성 분획에 존재함을 보여주었다(데이터는 표시되지 않음). 이 결과는 화합물이 무엇보다도 세포벽, 막 표면 연관 단백질 또는 표면 연관 다당류의 일부로 세포 외피에 존재할 수 있음을 시사한다.
BPL1의 세포 표면과 연관된 일부 단백질이 지방 감소 효과를 일으킬 수 있는지 테스트하기 위해, BPL1 프로바이오틱 균주의 전체 세포에 프로테이나제 K(50 μg/mL)를 처리한 다음, 선충의 사료로 사용하였다. 이 처리는 세포의 기능적 활성에 영향을 미치지 않으며, 이는 지방 감소 효과를 담당하는 분자가 표면 단백질이 아니거나 적어도 이 프로테아제에 의해 분해되지 않음을 시사한다(도 1a).
BPL1 세포 외피의 기능적 활성에 대한 증거를 얻은 후, 본 발명자들은 세포 외피의 조성을 수정할 수 있는 다른 배지에서 배양될 때 균주의 기능을 조사하기 위해 다양한 전략을 설계하였다. 암피실린은 트랜스펩티다제를 억제하여 세포벽 합성을 방해한다. 반코마이신은 N-아세틸무람산 및 및 N-아세틸글루코사민의 트랜스글리코실화를 차단함으로써 세포벽 합성을 억제하는 글리코펩티드이다. 따라서, 본 발명자들은 준치사 용량의 암피실린 또는 반코마이신의 존재 하에 BPL1을 배양하고, 세포에 대해 기능성을 평가하였다. 이러한 조건에서 세포는 성장할 수 있지만 세포 외피의 특성을 변경할 것으로 예상된다. 흥미롭게도 이러한 배양 조건 하에 얻은 세포는 선충에서 지방 감소 효과를 나타내지 않았다(도 1b). 이 결과는 세포 외피의 변화가 프로바이오틱스의 지방 감소 특성에 극적으로 영향을 미치고 화합물이 세포 외피의 구성 요소라는 가설을 강화함을 시사한다.
세포 외피의 특성을 변경하기 위한 두 번째 전략은 글루코스가 많은 외피 성분의 생합성에서 전구체이기 때문에 배양 배지에서 글루코스 제한 조건을 사용하는 것이었다. 세포를 MRS+Cys 배지에서 밤새 배양하고 상이한 농도의 글루코스로 제형화하였다. 놀랍게도, 글루코스 제한 하에서 배양된 BPL1 세포는 C. 엘레간스에서 지방 감소 능력을 상실하였다(도 1c). 세포의 기능적 활성은 글루코스 가용성에 따라 분명히 달랐다(도 1d). 흥미롭게도, 20 g/L의 글루코스(과량의 글루코스)로 성장된 BPL1 세포는 모든 성장기에서 수집될 때 지방 감소 활성을 발휘하였지만, 글루코스를 제한(10 g/l)하면서 배양된 BPL1 세포는 글루코스가 주로 이용가능할 때 초기 대수증식기에서만 지방 감소 효과를 발휘하였다(도 10a 및 10b). 이러한 관찰은 일부 경우에는 프로바이오틱 기능적 활성이 특정 환경 조건을 요구할 수 있음을 강조한다.
또한, D-글루코스는 MRS-Cys 배지에서 푸룩토스, 사카로스, 락토스, 말토스 또는 갈락토스와 같은 다른 당으로 대체되었다. 결과는 모든 경우에 당 제한 하에 성장된 세포의 지방 감소 표현형의 손실(10 g/L)을 나타내는 한편, 다량의 당(20g/l)으로 기능적임을 나타낸다(도 1e). 결과는 세포 외피의 조성이 기질로 사용되는 다량의 당의 존재에 극적으로 의존함을 시사한다.
세포 부착이 지방 감소 활성을 발휘하는 중요한 특성이 될 수 있다는 점을 고려하여, 글루코스 제한이 장관의 상피 세포에 부착하는 BPL1 세포의 능력을 변경할 수 있는지 조사하였다. 이 매개변수를 평가하기 위해, 본 발명자들은 프로바이오틱 접착 가능성을 특성화하는 데 사용되는 기존 검정을 사용하였다(Darfeuille-Michaud, A. 등 1990. Infect Immun 58, 893-902). 표준 MRS-Cys 배지(20 g/L 글루코스 포함)에서 성장한 BPL1은 10 g/L 글루코스로 성장한 균주에 비해 Caco-2 세포에 훨씬 더 큰 접착력(P<0.01%)을 나타내었다(도 1d). 따라서 이러한 결과는 BPL1로부터의 세포 외피의 구성이 글루코스에 의해 조절되고 이 조절이 세포 부착 능력에 큰 차이를 유도한다는 아이디어를 다시 강화한다.
이 단계에서 본 발명자들은 관찰된 특성을 담당할 수 있는 세포 외피의 구성요소를 조사하였다. 이러한 의미에서 본 발명자들은 펩티도글리칸(PG)을 함유하는 BPL1 세포벽 분획을 분석하였다.
C. 엘레간스 지방 감소에 대한 BPL1 유래 PG의 잠재적 활성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 과량의 글루코스(MRS-Cys 배지) 및 제한된 글루코스 농도 하에서 배양된 BPL1에서 세포벽 분획을 준비하였다. 본 발명자들의 결과는 세포벽 분획이 글루코스 제한 하에서 성장한 BPL1 세포에서 준비되었을 때 지방 감소 활성이 없었지만 세포가 글루코스 조건에서 성장했을 때 기능적임을 보여주었다(도 2). 이 결과는 세포벽 분획 또는 이 분획과 함께 추출된 성분이 지방 감소의 원인임을 지적한다.
글루코스 제한 유무에 관계없이 얻은 세포벽 분획 내의 차이를 분석하기 위해, 본 발명자들은 세포벽 분획의 아미노산 조성을 결정하였다. 그러나, 아미노산의 거울상이성질체 분석은 두 분획 사이의 약간의 차이만을 나타내었으며(데이터는 제시되지 않음), 이는 대부분 아마도 PG의 펩티드 조성이 이러한 차이에 책임이 없음을 시사한다.
반대로, 본 발명자들이 세포벽 분획을 이의 구조를 파괴해야 하는 뮤라미다제로 처리할 때, 본 발명자들은 지방-감소 활성의 임의의 감소를 관찰하지 못했고(데이터는 제시되지 않음), 이는 아마도 세포벽 분획과 공동-정제된 성분(PG는 아님)이 활성의 원인이 될 수 있음을 시사한다.
그 다음 때때로 세포벽 분획에서 불순물로 발견되는 리포테이코산(LTA)에 관심을 집중하였다. LTA는 지질 모이어티에 의해 세포막에 고정되는 중요한 세포 외피 성분이다. 글루코스 제한과 함께 및 글루코스 제한 없이 성장된 BPL1 세포로부터 LTA를 수득하고, BPLl 배양 배지에서의 글루코스 제한이 LTA 기능에 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. LTA 분획을 MRS-Cys 중의 BPL1 배양물로부터 10 g/l 및 20 g/L의 글루코스를 사용하여 수득하고, C. 엘레간스에서 지방을 감소시키는 능력에 대해 평가하였다. 글루코스 배지에서 성장한 BPL1 세포에서 추출한 LTA는 활성인 반면 제한된 글루코스 배지에서 성장한 BPL1에서 단리된 LTA는 비기능적이었다(도 3a 및 표 1).
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또한, LTA 분획의 지방 감소 활성은 열처리 및 동결건조 후에 평가되었으며 둘 다 활성을 보존하였다(도 3b). 마지막으로, LTA의 지방 감소 효과는 정제 단계 후에 입증되었다(도 3c). 더 높은 용량의 LTA도 테스트했지만(20 및 50 μg/mL), 10 μg/mL보다 유사한 감소 효과가 관찰되었다(데이터는 표시되지 않음). BPL1 세포, 열 처리된 세포(HT-BPL1) 및 BPLl로부터의 LTA를 먹인 선충에서의 지질 축적을 도 3d에 나타내었다. 트리글리세라이드(TG)가 C. 엘레간스에 저장된 지질 액적의 주요 구성성분이기 때문에, 지질 축적은 이 선충의 TG 함량 증가와 관련이 있고(Zhang, J., 등 2011, J Mol Biol 411: 537-553), 본 발명자들은 세 가지 LTA 유효 용량을 먹인 선충에서 TG 수준을 추가로 정량화하였다. 결과는 LTA(10 μg/mL; P<0.01; 1 및 0.1 μg/mL; P<0.05)를 먹인 동물에서 총 TG 함량의 상당한 감소를 나타내었다(도 3e). 이러한 결과는 관찰된 총 지방 감소를 뒷받침하며, 프로바이오틱 균주 BPL1 (및 열처리된 형태)의 지방 감소 효과와 일치한다.
또한, 표준 MRS-Cys 배지와 비교하여 글루코스 제한 조건에서 MRS-Cys에서 배양된 BPL1 세포로부터 LTA를 정제하고 C. 엘레간스에서 지방을 감소시키는 능력에 대해 평가하였다. 표준 글루코스 배지에서 성장한 BPL1 세포에서 추출한 LTA는 활성인 반면 제한된 글루코스 배지에서 성장한 BPL1에서 단리된 LTA는 비기능적이었다(도 3f).
지방 감소에서 BPL1 균주로부터의 LTA의 효능을 입증한 후, 본 발명자들은 이 기능적 효과의 기초가 되는 메커니즘을 조사하였다. 본 발명자들은 이전에 BPL1 세포의 지방 감소 및 항산화 활성이 IIS 경로에 의존한다고 보고하였다(Martorell, P. 등 2016. J Agric Food Chem 64, 3462-3472). IIS 경로의 진화적 보존으로 인해 C. 엘레간스에서 이 경로를 표적으로 하는 화합물에 대한 연구는 고등 유기체와 인간에서 그 기능을 밝힐 가능성이 있다. LTA 매개 지방 감소에서 IIS 경로의 역할을 조사하기 위해, IIS 경로의 주요 조절자인 DAF-2(인슐린 수용체)/DAF-16을 평가하였다. 형광 분석은 DAF-16 돌연변이(daf - 16(mgDf50))가 LTA 매개 지방 감소 효과를 폐지함을 보여주었다(도 4a). 이것은 BPL1 및 HT-BPL1 세포의 경우이기도 하였다. 이 결과는 BPL1에 의해 유도된 지방 감소가 DAF-16 의존적임을 강력하게 시사한다. DAF-2는 IIS 경로에서 인간 인슐린 수용체 동족체 업스트림 DAF-16 이며 인간과 마찬가지로 인슐린 수용체의 돌연변이는 지방 축적을 증가시켜 비만 표현형을 나타낸다. 결과는 DAF-2 돌연변이체(daf -2(e1370)) 벌레에게 LTA를 먹인 것이 지방 감소 표현형을 생성하지 않았음을 보여주고, 이는 DAF-16의 LTA-매개된 조절이 DAF-2에 의존적이고, 따라서 LTA 효과가 인슐린/IGF-I-유사 신호전달 경로(IIS)를 필요로 한다는 것을 나타낸다(도 4a). 여기서, 지방 감소 효과가 포유류 Nrf 전사 인자의 오쏘로그가 결핍된 C. 엘레간스 돌연변이체에서 여전히 관찰되었기 때문에 SKN-1과 무관한 BPL1 및 HT-BPL1 모두에서 다른 반응을 관찰하였다(도 4b). 유사하게, LTA는 또한 SKN-1 전사 인자의 C. 엘레간스 돌연변이체에서 지방 함량을 감소시켜(도 4b), 이는 그 기능에 SKN-1이 필요하지 않음을 시사한다.
인슐린 신호 전달 경로는 또한 글루코스 수송에 관여하여 글루코스 항상성과 인슐린 감수성에 중요한 역할을 한다. 따라서 당뇨병(또는 비만 관련 당뇨병) 연구의 표적 경로이며 이 경로를 표적으로 하는 화합물이 잠재적 치료제로 등장한다. C. 엘레간스에서, 글루코스는 IGF-I 경로(IIS) 활성을 상향 조절하거나 반응성 산소 종(ROS)을 증가시켜 수명을 단축시키는 것으로 나타났으며, 이로 인해 C. 엘레간스가 글루코스 독성을 평가하고 보다 효율적인 당뇨병 요법을 개발하기 위한 좋은 모델 시스템인 것으로 제안되었다.
따라서 본 발명자들은 당뇨병을 모델링하고 LTA의 효능을 평가하기 위해 높은 글루코스 공급 선충을 사용하였다. 글루코스는 트리글리세라이드(TG)의 알려진 전구체이고 TG는 선충의 지질 액적의 주요 구성 요소라는 점을 고려하여, 글루코스(100 mM)이 선충 지방 함량에 미치는 영향을 평가하였다. 본 발명자들의 결과는 고-글루코스 NGM 상에 공급된 선충에서 지방 함량이 20%만큼 증가하였음을 보여주었고, 이는 다른 보고와 일치한다(도 4c). 2형 당뇨병 관리에 사용되는 약물인 메트포르민(비구아나이드)은 양성 대조군으로 포함되었다. 또한 LTA는 당뇨병성 비만 C. 엘레간스 모델에서 지방 함량을 감소시킬 수 있는지 여부를 평가하였다. LTA를 먹인 고혈당 선충은 체지방 함량이 크게 감소한 것으로 나타났다(도 4c). 이 효과는 BPL1 및 HT-BPL1 세포를 먹인 선충에서도 기록되었다(도 4c). 이러한 결과는 BPL1 세포와 이의 열처리된 형태인 HT-BPL1이 당뇨병 관련 비만의 치료 및/또는 예방 용도를 위한 성분으로서의 가능성을 보여준다. 또한 LTA의 효능이 생체 내 고혈당 모델에서 처음으로 표시되어 기능적 신호 분자뿐만 아니라 입증된 유익한 효과가 있는 포스트바이오틱으로서의 관련성을 강조한다.
전반적으로, 본 발명자들의 발견은 C. 엘레간스의 전임상 모델에서 지방 감소 특성을 나타내는 새로운 지질 조절제로서의 LTA에 대한 이전에 인식되지 않은 역할을 밝혀내었다.
본 발명자들의 연구는 비피도박테리움 속으로부터의 LTA의 신규한 유익한 생물학적 역할을 보여주는 최초의 연구일 뿐만 아니라, 숙주 모델로서 C. 엘레간스를 사용하여 지방 감소 활성에 LTA가 관여한다는 것을 입증하는 최초의 연구이다. 본 발명자들의 결과는 대사 증후군 및 당뇨병 관련 장애에서 치료적 및/또는 예방적 적용을 갖는, 새로운 포스트바이오틱(postbiotic)으로서 BPL1 프로바이오틱 균주로부터 수득된 LTA의 잠재력을 예시한다. 이러한 적용은 식품 및 음료, 영양 보충물 및 의료용 식품을 포함한 인간 영양 성분으로의 사용을 포함한다.
실시예 2 : BPL1로부터의 LTA는 지방 감소 활성을 가지며 적용된다양한 추출 방법 및 처리가 이 용량을 보존한다.
I - 물질 및 방법
LTA는 본원에 설명된 절차에 따라 BPL1의 신선한 배양물과 BPL1의 열처리 배양물에서 얻었다. 먼저, 초음파 처리와 PANDA 균질화기의 두 가지 다른 세포 파괴 방법을 비교하였다. NGM 플레이트(대조군 조건)와 BPL1로부터의 해당 LTA는 보충된 NGM 플레이트에서 선충을 배양하였다. 지방 함량은 지질 액적에 특이적으로 결합하는 형광 염료인 나일 레드 염색 방법에 의해 상이한 선충 집단에서 측정되었다(Martorell P, 등, 2012, J Agric Food Chem. 60:11071-9).
II - 결과
도 5 및 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 과량의 글루코스에서 배양된 BPL1로부터의 LTA는 지방 감소 활성을 가지며 기계적 파괴는 약간 더 효과적인 LTA를 제공한다.
실시예 3 : 비피도박테리아에서 추출한 LTA, 및 락토바실러스 및 바실러스 균주에서 추출한 LTA는 지방 감소 능력을 나타내는 것으로 나타났다. 비피도박테리아 LTA는 더 높은 지방 감소 능력을 나타낸다.
I - 물질 및 방법
LTA의 단리
비피도박테리움 및 락토바실러스 균주는 MRS(10 g/L 육류 추출물, 5 g/L 효모 추출물, 20 g/L D-글루코스, 2g/L K2HPO4, 2g/L 디-암모늄 수소 시트르산염, 5 g/L 아세트산나트륨, 0.2g/L MgSO4, 0.05 g/L MnSO4, 0.05% 시스테인이 보충된 1 g/L Tween 80)에서 배양되었다. 상업용 배지 Brain heart infusion CM1135 B(Oxoid)는 바실러스 균주를 성장시키는 데 사용되었다. 배양물은 37℃의 혐기성 조건에서 밤새 인큐베이션되었다(호기성 조건에서 배양된 바실러스 균주 제외). 배양액을 1x109개의 세포/mL로 조정하고 식염수로 3회 세척하였다. LTA 추출은 문헌[Colagiorgi 등 2015(Colagiorgi A, 등, 2015. FEMS Microbiol Lett. 362: fnv141)]로부터 적응되었다. 세포를 수확하고 PANDA 균질화기에서 기계적으로 파괴하였다. 그 후, 박테리아 용해물을 동일한 부피의 n-부탄올과 혼합하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 4℃에서 13000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 상을 분리하였다. 수상을 회수하고 냉동 건조 또는 추가 정제 단계를 거쳤다.
정제를 위해, 동결건조된 샘플을 크로마토그래피 시작 완충액(0.1 M 암모늄 아세테이트 중 15% n-프로판올, pH 4.7)으로 현탁하고 10,000rpm에서 60분 동안 원심분리하고 막 여과(0.2 μm)로 멸균하였다. 상청액은 옥틸-세파로스 컬럼(GE Healthcare Life Sciences, UK)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)을 거쳤다. 시작 완충액에서 용리 완충액까지 선형 구배(0.1 M 암모늄 아세테이트 중 60% n-프로판올, pH 4.7)로 용출을 수행하였다. 얻어진 분획을 몰리브덴 블루 테스트로 평가하여 인산염 함유 분획을 검출하고, 이를 풀링하여 동결건조하였다(
Figure pct00014
R, 등 2014. Antonie Van Leeuwenhoek. 106:693-706).
II - 결과
LTA는 B. 아니말리스 subsp. 락티스 BPL1은 위에서 설명한 바와 같이 비피도박테리움, 락토바실러스 및 바실러스 속에 속하는 다른 균주와 비교된다.
얻어진 LTA를 선충 배양물(NGM)에 첨가하였다. 상이한 조건에서 벌레를 먹이고 실시예 1에 기술된 동일한 프로토콜에 따라 지질 액적에 특이적으로 결합하는 형광 염료인 나일 레드 염색으로 총 지방 함량을 측정하였다.
결과는 비피도박테리움 균주 중에서, B. 아니말리스 subsp. 락티스 BPL1로부터의 LTA이 가장 효과적이었고(지방 감소의 30.79%), 이는 다른 비피도박테리아에 비해 BPLl LTA의 우수한 활성을 명백하게 보여준다. 또한, 비피도박테리움 균주로부터 얻은 LTA는 락토바실러스 및 바실러스 균주로부터의 LTA에 비해 더 높은 지방 감소 효과를 나타내었다(도 7 및 표 2).
Figure pct00015
다른 비피도박테리아 균주로부터의 LTA를 이전에 설명한 프로토콜에 따라 단리하고 정제하였다. B. 롱검 ES1(CECT7347)로부터의 LTA는 C. 엘레간스의 지방 감소 능력에 대해 기능적으로 평가되었다. 결과는 ES1-LTA가 선충의 지방 함량을 유의하게 감소시켰지만 BPL1-LTA보다 적은 양으로 감소시켰음을 보여주었다(도 8).
실시예 4: 지방 감소 LTA(BPL1로부터)는 탄소원으로 과량의 당에서 배양할 때 특정 구조적 특징을 나타낸다.
I - 물질 및 방법
과량의 글루코스에서 비피도박테리아 배양으로부터의 LTA의 단리
BPL1로부터의 LTA를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 얻었다.
LTA의 분석
BPL1에서 얻은 LTA의 구조와 조성은 문헌에 기술된 방법에 따라 결정되었으며 D-글루코스, D-갈락토스, 글리세롤, 인 및 알라닌을 함유하는 것으로 나타났다.
간단히 말해서, 1H 핵 자기 공명(NMR) 실험은 700.13MHz의 1H 주파수에서 작동하고 Z-구배가 있는 5mm TCI(동결프로브)가 장착된 Bruker AVANCE III 700 Ultrasield 분광계(Bruekr BioSpin, Rheinstetten, Germany)에서 수행되었다. 사용된 획득 펄스 시퀀스는 Bruker Topspin 3.6에서 물 사전포화 및 2초 재순환 시간을 사용한 것이다. 스펙트럼은 0 ppm에서 TSP 신호를 사용하여 참조되었다.
D-글루코스, D-갈락토스, 글리세롤, 글리세롤-P 및 전체 알라닌은 DB5-MS 컬럼을 사용하여 5977B 질량 검출기에 커플링된 Agilent 7820A 가스 크로마토그래피 시스템으로 수행된 기체 크로마토그래피에 의한 샘플의 산 가수분해 후 트리메틸실릴 유도체로 결정되었다. Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library에 포함된 체류 시간 및 스펙트럼 질량을 비교하여 식별을 수행하였다.
알라닌의 L- 및 D- 이성질체는 포토다이오드 어레이 검출기(모델 2996, Waters)에 커플링된 Waters의 Alliance 2695 HPLC 시스템에서 수행된 액체 크로마토그래피 분석으로 결정되었다. 분리는 Phenomenex의 키랄 컬럼인 Chirex 3126(D)-페니실아민에서 이루어지며 식별은 D- 및 L-알라닌 분석 표준과 비교하여 체류 시간 및 흡수 스펙트럼에 의해 이루어진다.
II - 결과
BPL1 LTA의 상이한 화학 성분의 양은 당업자에게 공지된 바와 같이 상기 기재된 기술에 의해 결정되었다. 간단히 말해서, 갈락토스, 글리세롤, 알라닌, 글리세롤-P 및 인의 양은 과량의 글루코스(BPL1, 20 g/L 글루코스)의 존재 하에 및 글루코스의 제한 하에 성장된 BPL1 배양물로부터 비롯된, 정제된 LTA 샘플에서 결정되었다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 글리세롤 및 글리세롤-포스페이트 대 글루코스 및 알라닌 대 글루코스의 상대적 함량은 글루코스 과량으로 성장시킨 BPL1로부터 정제된 LTA 샘플에서 놀랍게도 더 높은 것으로 밝혀졌으며, C. 엘레간스에서 지방 감소를 발휘하는 것으로 나타났다.
Figure pct00016
Figure pct00017
결과는 도 1에 도시된다.
이를 시험하기 위해, 본 발명자들은 MRS-Cys에서 성장시킨 배양물을 밤새 BPL1 균주로부터 LTA를 단리하고 정제하였다. LTA의 단리 및 정제를 BPL1 세포 용해물의 불용성 분획의 부탄올 추출에 의해 수행한 후, 전술된 바와 같이 소수성 교환 크로마토그래피를 수행하여 고품질 LTA를 수득하였다(Morath, 등, 2001(상기 인용); Draing, 등 2006(상기 인용);
Figure pct00018
및 Schneewind, 2007, Proceedings of the National Academy of Sciences 104: 8478-8483; Kho and Meredith, 2018(상기 인용)). 단일 용출 피크는 인산염 검에 의해 얻어졌다(도 11a). 피크를 형성하는 분획을 풀링하고 정제된 LTA로 사용하였다. 잠재적인 교차 오염 물질, 세포벽 물질 및 핵산에 대한 LTA의 순도는 특정 분석에 의해 결정되었다. 내독소 오염은 LAL 검정을 통해 제외되었으며 내독소 함량은 동결건조된 LTA에서 <5 EU/mg이었다. 핵산 오염은 260 nm 및 280 nm에서 UV 흡수를 측정하여 결정되었다. DNA/RNA는 1.5% wt/wt 미만을 차지하였다. 펩티도글리칸 단편의 피크가 검출되지 않은 뮤타놀리신 처리 후 유도된 뮤로펩티드의 분석에 의해 펩티도글리칸 오염이 배제되었다. 또한, N-아세틸뮤람산(MurNAc) 또는 BPL1의 PG에 존재하는 것으로 공지된 아미노산 오르니틴, 리신 및 세린(이전에 BPLl의 펩티도글리칸의 총 가수분해물의 1D- 및 2D-TLC에 의해 결정됨, 데이터는 제시되지 않음)은 정제된 LTA의 전체 가수분해물의 기체 또는 액체 크로마토그래피에 의해 검출되지 않았다. 정제된 LTA를 추가로 특성화하기 위해, 샘플을 SDS-PAGE(도 11b)에 따라 알시안 블루/은 염색을 통해 염색하고, MALDI-TOF 질량 분광측정법 및 핵 자기 공명(도 12)을 사용하여 분석하고, 8-10 kDa 범위의 추정 분자량 분포를 갖는 화합물을 밝혀내었다.

Claims (47)

  1. 적어도 0.5의 알라닌/글루코스 몰비 및 적어도 1.2의 글리세롤 인산염/글루코스 몰비를 포함하는 리포테이코산(LTA).
  2. 제1항에 있어서, 알라닌/글루코스의 몰비는 적어도 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0인, LTA.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, LTA의 알라닌은 L-알라닌, D-알라닌 또는 L-알라닌과 D-알라닌의 조합인, LTA.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 적어도 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0 또는 12.5인, LTA.
  5. 제4항에 있어서, 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 12.6인, LTA.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는, 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득되는 것인, LTA.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, LTA는 비피도박테리움 롱검, 바람직하게는, 균주 비피도박테리움 롱검 CECT 7347로부터 수득되는 것인, LTA.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, LTA는 열처리 또는 동결건조된 것인, LTA.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 LTA를 포함하는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 조성물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 생체활성 화합물을 추가로 포함하는, 조성물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적 조성물 또는 영양 조성물인, 조성물.
  13. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 LTA, 또는 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  14. 비만, 과체중 또는 관련 질환, 바람직하게는 당뇨병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 LTA, 또는 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  15. 체지방 감소를 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 LTA 또는 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 비치료적 용도.
  16. 식품 또는 사료 제품의 정교화를 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 LTA 또는 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 LTA를 얻는 방법으로서,
    (a) 탄소원으로서 과량의 당에서 비피도박테리움을 배양하는 단계,
    (b) 박테리아의 세포벽으로부터 LTA를 단리하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 비피도박테리움은 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 비피도박테리움은 비피도박테리움 롱검, 바람직하게는, 균주 비피도박테리움 롱검 CECT 7347로부터 유래한 것인, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 프룩토스, 수크로스, 락토스, 말토스 및 트레할로스로 이루어진 목록으로부터 선택되는 것인, 방법.
  21. 약제로 사용하기 위한, 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA로서, 그 구조가 다음인, LTA:
    Figure pct00019

    식 중,
    - GroP는 글리세로포스페이트이고,
    - X는 알라닌(Ala) 또는 수소(H)이고,
    - Gal은 갈락토푸라난이고,
    - 각각의 X는 수소 및 알라닌(Ala)으로부터 독립적으로 선택되고,
    - 알라닌의 분자의 수는 m 또는 m-p이며, m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 p는 X가 수소인 Gal의 단위의 수이고,
    - Glc는 글루칸이고,
    - m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 10 내지 20, 바람직하게는 11 내지 18이고,
    - n은 Glc의 반복 단위의 수이고, 그리고 5 내지 20, 바람직하게는 8 내지 12이다.
  22. 비만, 과체중 또는 관련 질환, 바람직하게는 당뇨병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA로서, 그 구조가 다음인, LTA:
    Figure pct00020

    식 중,
    - GroP는 글리세로포스페이트이고,
    - X는 알라닌(Ala) 또는 수소(H)이고,
    - Gal은 갈락토푸라난이고,
    - 각각의 X는 수소 및 알라닌(Ala)으로부터 독립적으로 선택되고,
    - 알라닌의 분자의 수는 m 또는 m-p이며, m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 p는 X가 수소인 Gal의 단위의 수이고,
    - Glc는 글루칸이고,
    - m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 10 내지 20, 바람직하게는 11 내지 18이고,
    - n은 Glc의 반복 단위의 수이고, 그리고 5 내지 20, 바람직하게는 8 내지 12이다.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, m은 11 내지 18이고, n은 8 내지 12인, 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 알라닌/글루코스 몰비는 적어도 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0이고, 그리고 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 적어도 1.2, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0 또는 12.5인, 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA.
  25. 제24항에 있어서, 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 12.6인, 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 알라닌은 L-알라닌, D-알라닌 또는 L-알라닌과 D-알라닌의 조합인, 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는, 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득되는 것인, 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 비피도박테리움은 비피도박테리움 롱검, 바람직하게는, 균주 비피도박테리움 롱검 CECT 7347로부터 유래한 것인, 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, LTA는 열처리 또는 동결건조된 것인, 탄소원으로 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA.
  30. 체지방 감소를 위한, 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA의 비치료적 용도, LTA의 구조는 다음인, 비치료적 용도:
    Figure pct00021

    식 중,
    - GroP는 글리세로포스페이트이고,
    - X는 알라닌(Ala) 또는 수소(H)이고,
    - Gal은 갈락토푸라난이고,
    - 각각의 X는 수소 및 알라닌(Ala)으로부터 독립적으로 선택되고,
    - 알라닌의 분자의 수는 m 또는 m-p이며, m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 p는 X가 수소인 Gal의 단위의 수이고,
    - Glc는 글루칸이고,
    - m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 10 내지 20, 바람직하게는 11 내지 18이고,
    - n은 Glc의 반복 단위의 수이고, 그리고 5 내지 20, 바람직하게는 8 내지 12이다.
  31. 제30항에 있어서, m은 11 내지 18이고 n은 8 내지 12인, 비치료적 용도.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 알라닌/글루코스 몰비는 적어도 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0이고, 그리고 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 적어도 1.2, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0 또는 12.5인, 비치료적 용도.
  33. 제32항에 있어서, 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 12.6인, 비치료적 용도.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 알라닌은 L-알라닌, D-알라닌 또는 L-알라닌과 D-알라닌의 조합인, 비치료적 용도 용도.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는, 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득되는 것인, 비치료적 용도.
  36. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 비피도박테리움은 비피도박테리움 롱검, 바람직하게는 균주 비피도박테리움 롱검 CECT 7347로부터 유래한 것인, 비치료적 용도.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, LTA는 열처리 또는 동결건조된 것인, 비치료적 용도.
  38. 식품 또는 사료 제품의 정교화를 위한, 탄소원으로서 과량의 당에서 배양된 비피도박테리아로부터의 LTA의 용도로서, LTA의 구조는 다음인, 용도:
    Figure pct00022

    - GroP는 글리세로포스페이트이고,
    - X는 알라닌(Ala) 또는 수소(H)이고,
    - Gal은 갈락토푸라난이고,
    - 각각의 X는 수소 및 알라닌(Ala)으로부터 독립적으로 선택되고,
    - 알라닌의 분자의 수는 m 또는 m-p이며, m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 p는 X가 수소인 Gal의 단위의 수이고,
    - Glc는 글루칸이고,
    - m은 Gal의 반복 단위의 수이고, 그리고 10 내지 20, 바람직하게는 11 내지 18이고,
    - n은 Glc의 반복 단위의 수이고, 그리고 5 내지 20, 바람직하게는 8 내지 12이다.
  39. 제38항에 있어서, m은 11 내지 18이고, n은 8 내지 12인, 용도.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 알라닌/글루코스 몰비는 적어도 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0이고, 그리고 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 적어도 1.2, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0 또는 12.5인, 용도.
  41. 제40항에 있어서, 글리세롤 인산염/글루코스 몰비는 12.6인, 용도.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 알라닌은 L-알라닌, D-알라닌 또는 L-알라닌과 D-알라닌의 조합인, 용도.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 식품 또는 사료 제품은 영양 보충물인, 용도.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, LTA는 비피도박테리움 아니말리스, 바람직하게는 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스, 더 바람직하게는, 균주 비피도박테리움 아니말리스 subsp. 락티스 CECT 8145로부터 수득되는 것인, 용도.
  45. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 비피도박테리움은 비피도박테리움 롱검, 바람직하게는 균주 비피도박테리움 롱검 CECT 7347로부터 유래한 것인, 용도.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, LTA는 열처리 또는 동결건조된 것인, 용도.
  47. 제21항 내지 제29항, 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항, 또는 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 당은 글루코스, 갈락토스, 프룩토스, 수크로스, 락토스, 말토스 및 트레할로스로 이루어진 목록으로부터 선택되는 것인, 용도.
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CA2208780C (en) 1995-01-30 2010-03-30 Peter Truog Antitumor and anticholesterol preparations comprising lipoteichoic acid lta-t of streptococcus sp dsm 8747
EP1260227A1 (en) 2001-05-23 2002-11-27 Societe Des Produits Nestle S.A. Lipoteichoic acid from lactic acid bacteria and its use to modulate immune responses mediated by gram-negative bacteria, potential pathogenic gram-positive bacteria
SE529185C2 (sv) 2005-10-07 2007-05-22 Arla Foods Amba Användning av probiotiska bakterier för tillverkning av livsmedel eller läkemedel för förhindrande av övervikt
EP1974734A1 (en) 2007-03-28 2008-10-01 Nestec S.A. Probiotics for reduction of risk of obesity
CN102596980A (zh) 2009-08-26 2012-07-18 Rna公司 源自脂磷壁酸的糖脂及含有该糖脂的组合物
CA2828612A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 The Governors Of The University Of Alberta Use of bacterial endotoxins and lipoteichoic acids to improve postpartal health and productivity of dairy cows and their newborns
CN104968780A (zh) 2012-09-20 2015-10-07 普洛特拉有限公司 用于治疗肥胖和肥胖相关病症的益生菌组合物和方法
ES2526986B1 (es) 2013-07-18 2015-11-02 Biopolis, S.L. Nueva cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis CECT 8145 y su uso para el tratamiento y/o prevención de sobrepeso y obesidad y enfermedades asociadas
CN103911326B (zh) * 2014-03-28 2016-08-10 内蒙古和美科盛生物技术有限公司 凝结芽孢杆菌益生菌制剂的制备

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