JP2023128590A

JP2023128590A - 腸管免疫賦活剤、ＩｇＡ産生促進剤及び遺伝子発現促進剤

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Publication number: JP2023128590A
Application number: JP2022033026A
Authority: JP
Inventors: 千秋松▲崎▼; Chiaki Matsuzaki; 宗白石; So Shiraishi; 伸一横田; Shinichi Yokota; 憲二山本; Kenji Yamamoto; 泰瑛邱; Tai-Ying Chiou; 知也高橋; Tomoya Takahashi
Original assignee: Arsoa Keio Group Corp
Current assignee: Arsoa Keio Group Corp
Priority date: 2022-03-03
Filing date: 2022-03-03
Publication date: 2023-09-14
Also published as: TW202335675A; TWI838990B

Abstract

【課題】アピラクトバチルス（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌由来のリポテイコ酸が有する新規な性質を明らかにし、これに基づいて新たな用途を提供する。【解決手段】アピラクトバチルス（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌由来のリポテイコ酸を有効成分として含む腸管免疫賦活剤、ＩｇＡ産生促進剤及び遺伝子発現促進剤。【選択図】図１

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り令和４年２月７日に日本農芸化学会２０２２年度大会（オンライン開催）の大会プログラム（オンライン）に掲載（掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｊｓｂｂａ２．ｂｉｏｗｅｂ．ｎｅ．ｊｐ／ｊｓｂｂａ２０２２／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ａｉｄ＝６１１３７＆ｐｌａｃｅ＿ｎｕｍ＝１）

本発明は、アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸を有効成分として含む腸管免疫賦活剤、ＩｇＡ産生促進剤及び遺伝子発現促進剤に関する。

従来から、乳酸菌やその発酵生産物が様々な生理機能を有することが知られている。例えば、特許文献１には、ラクトバチルスクンキーに属する乳酸菌が、高いＩｇＡ産生促進作用を有することが記載されている。

また、本出願人は、野菜黒糖発酵液から単離した乳酸菌であるラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株が、他の乳酸菌とは異なる新規なゲノム構造を有するフラクトフィリックな乳酸菌であること、及び、優れたＩｇＡ産生促進作用（ひいては免疫賦活作用）を有することを見出している（特許文献２参照。なお、特許文献２における「ラクトバチルス・コーソイ」は本明細書における「ラクトバチルスコウソイ」と同じものを指している。）。

特開２０１４－７３１３０号公報特開２０２０－９２７０４号公報

ところで、ラクトバチルス属という分類は長く使用されてきたものの、系統の多様性や菌種間で生理的特徴及び生化学的特徴が大きく異なることが以前より指摘されていた。このため、近年、ラクトバチルス属について、ゲノムレベルでの分類の再評価が実施された。例えば、上記したラクトバチルスクンキー及びラクトバチルスコウソイは、再評価後においてはアピラクトバチルス属に再分類され、学名はそれぞれアピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）及びアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）となった。

上記したようにアピラクトバチルス属乳酸菌の特定の菌種ではＩｇＡ産生促進作用（ひいては免疫賦活作用）を有することは知られているが、これが何に起因するものであるかについては知られていない。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、アピラクトバチルス属乳酸菌由来の物質の有する新規な性質を明らかにし、これに基づいて新たな用途を提供することを課題とする。

上記課題を解決するために本発明者らは、アピラクトバチルス属乳酸菌に含有されている物質のうちリポテイコ酸に着目し、アピラクトバチルス属乳酸菌におけるリポテイコ酸の構造が旧ラクトバチルス属乳酸菌におけるリポテイコ酸の典型的な構造とは異なること、及び、優れたＩｇＡ産生促進作用及び免疫賦活作用を有することを見出して本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。

（１）アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸を有効成分として含む腸管免疫賦活剤。
（２）前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）に属する乳酸菌である（１）に記載の腸管免疫賦活剤。
（３）前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）ＪＣＭ１６１７３株又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）ＪＣＭ３０７６５株である（２）に記載の腸管免疫賦活剤。
（４）飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である（１）～（３）のいずれかに記載の腸管免疫賦活剤。
（５）アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸を有効成分として含むＩｇＡ産生促進剤。
（６）前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）に属する乳酸菌である（５）に記載のＩｇＡ産生促進剤。
（７）前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）ＪＣＭ１６１７３株又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）ＪＣＭ３０７６５株である（６）に記載のＩｇＡ産生促進剤。
（８）飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である（５）～（７）のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進剤。
（９）アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸を有効成分として含み、樹状細胞においてＩＬ－６、ＩＬ－１０及びレチナールデヒドロゲナーゼ２（ＲＡＬＤＨ２）のうち少なくとも一つの因子の発現を促進させる遺伝子発現促進剤。
（１０）前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）に属する乳酸菌である（９）に記載の遺伝子発現促進剤。
（１１）前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株である（１０）に記載の遺伝子発現促進剤。
（１２）飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である請求項９～１１のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤。
（１３）ヒトまたは非ヒト動物における腸管免疫賦活用又はＩｇＡ産生促進用の医薬品、飲食品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物を製造するための、アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸の使用。
（１４）ヒトまたは非ヒト動物における樹状細胞においてＩＬ－６、ＩＬ－１０及びレチナールデヒドロゲナーゼ２（ＲＡＬＤＨ２）のうち少なくとも一つの因子の発現を促進させる遺伝子発現促進用の医薬品、飲食品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物を製造するための、アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸の使用。

本発明によれば、アピラクトバチルス（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌由来のリポテイコ酸の有する新規な用途として、このリポテイコ酸を含む腸管免疫賦活剤、ＩｇＡ産生促進剤及び遺伝子発現促進剤を提供することができる。

実施例３におけるリポテイコ酸のＩｇＡ産生誘導能を示すグラフである。実施例４におけるアピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株由来のリポテイコ酸の遺伝子発現解析の結果を示すグラフである。実施例５におけるリポテイコ酸の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。実施例５におけるリポテイコ酸の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。実施例６におけるリポテイコ酸のアンカー糖脂質のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳスペクトルである。実施例６におけるリポテイコ酸のアンカー糖脂質のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳスペクトルである。

次に、本発明の各実施形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、各実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。

（Ｉ）有効成分のリポテイコ酸
本発明の一実施形態における有効成分は、アピラクトバチルス（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌由来のリポテイコ酸である。好ましくは、アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）に属する乳酸菌である。また、一層好ましくは、アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）ＪＣＭ１６１７３株又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）ＪＣＭ３０７６５株である。

アピラクトバチルス属乳酸菌としては、アピラクトバチルスコウソイ、アピラクトバチルスクンキー及びアピラクトバチルスアピノーラムの他に、アピラクトバチルスミシェネリー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｍｉｃｈｅｎｅｒｉ）、アピラクトバチルスオゼンシス（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｏｚｅｎｓｉｓ）、アピラクトバチルスケヌイー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｑｕｅｎｕｉａｅ）及びアピラクトバチルスティンバーレーキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｉｍｂｅｒｌａｋｅｉ）が知られている。

アピラクトバチルス属乳酸菌は、旧ラクトバチルス属乳酸菌の中でもラクトバチルスクンキーグループと呼ばれていた一群の乳酸菌である。アピラクトバチルス属乳酸菌は、グラム陽性、桿状、ヘテロ発酵性の性質を有し、一般的に１５３７℃の範囲で増殖し、多くはｐＨ３．０未満の酸性条件でも増殖する。アピラクトバチルス属乳酸菌のゲノムサイズは１．４２～１．５８Ｍｂｐ程度であり、比較的小さい。ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量は３０．５～３６．４の範囲内である。アピラクトバチルス属乳酸菌は、フルクトースをマンニトールに変換する。また、通常、フルクトース、グルコース及びスクロースは代謝できるが、マルトース及びペントースは代謝できない（Ｚｈｅｎｇｅｔａｌ．ＡｔａｘｏｎｏｍｉｃｎｏｔｅｏｎｔｈｅｇｅｎｕｓＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ：Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆ２３ｎｏｖｅｌｇｅｎｅｒａ，ｅｍｅｎｄｅｄｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＢｅｉｊｅｒｉｎｃｋ１９０１，ａｎｄｕｎｉｏｎｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅａｎｄＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２０２０；７０：２７８２－２８５８）。

アピラクトバチルスコウソイは、最近発見されたフラクトフィリック乳酸菌（ＦＬＡＢ：Ｆｒｕｃｔｏｐｈｉｌｉｃｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ）として、従来の乳酸菌から進化した細菌であると考えられる（Ｆｉｌａｎｎｉｎｏｅｔａｌ．“Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｒｉｃｈｎｉｃｈｅｓｔｒａｃｅｄｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｔｏｗａｒｄｆｒｕｃｔｏｐｈｉｌｉｃｓｐｅｃｉｅｓ”ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．４５、Ｎｏ．１、２０１９、ｐｐ．６５－８１）。ＦＬＡＢは、花や果物、発酵食品、またフルクトースを主食とする昆虫の消化管など、フルクトースが豊富な環境に生息している。ＦＬＡＢは、グルコースではなくフルクトースを炭素源として好むヘテロ発酵性の乳酸菌であるが、酸素などの電子受容体基質を追加することで、グルコース存在下での生育が促進されるといわれている。アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株は、他のＦＬＡＢ及び乳酸菌に対して、比較的小さなゲノムサイズと低いＧＣ含量を有する（Ｆｉｌａｎｎｉｎｏｅｔａｌ．のＦｉｇｕｒｅ３参照）。

アピラクトバチルスクンキーは、発酵の遅い葡萄酒（ワイン）から単離された乳酸菌であるが、典型的にはミツバチや花と関連付けられるものである。アピラクトバチルスクンキーＪＣＭ１６１７３株はアピラクトバチルスクンキーの基準株であり、ＹＨ－１５株、ＡＴＣＣ７００３０８株、ＤＳＭ１２３６１株と同じものである。当該乳酸菌は従来からよく知られているものであるため、詳しい性質については説明を省略する。

アピラクトバチルスアピノーラムは、ミツバチの蜜胃から単離された乳酸菌である。アピラクトバチルスアピノーラムＪＣＭ３０７６５株はアピラクトバチルスアピノーラムの基準株であり、Ｆｈｏｎ１３Ｎ株、ＤＳＭ２６２５７株及びＣＣＵＧ６３２８７株と同じものである。当該乳酸菌も従来からよく知られているものであるため、詳しい性質については説明を省略する。

リポテイコ酸（Ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃａｃｉｄ、ＬＴＡ）とは、グラム陽性菌の細胞膜の構成物質である。一般的なリポテイコ酸は、グリセロールリン酸を繰り返し単位とした主鎖（グリセロールリン酸鎖）と、数個の糖及び数残基の脂肪酸を含むアンカー糖脂質とが結合した構造からなる。リポテイコ酸の構造はその由来となる菌によって異なる。リポテイコ酸はグラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）と比較して研究が進んでおらず、その詳しい構造や生理活性はまだあまり判明していない。

（ＩＩ）ＩｇＡ産生促進剤及び腸管免疫賦活剤
本明細書において、「ＩｇＡ産生促進剤」とは、ＩｇＡ産生細胞を多量に含むパイエル板細胞の培養液に添加して所定期間培養し、培養後の培養液中に分泌された分泌型ＩｇＡ量が、添加しなかった場合より増加するような、ＩｇＡ産生誘導能を有するものをいう。本発明のＩｇＡ産生促進剤は、以下に詳述するように、飲食品、医薬品、飼料又は有効成分組成物の形態等を含む。ＩｇＡ産生促進剤は、例えば、ワクチンと共に投与することにより、ワクチン中に含まれる抗原に対応する抗体の産生を増強し、ワクチンの効果を増強することができ、またワクチンの副作用を抑える可能性が高い。すなわち、ワクチンが含む抗原に対する抗体の産生を増強し、防御免疫の誘導を良好にしてワクチンの効果を増強する。

本実施形態のＩｇＡ産生促進剤をワクチンと共に用いる場合、ＩｇＡ産生促進剤をワクチン投与の前後に投与して効果を高めるワクチンの効果増強剤として利用することができる。ＩｇＡ産生促進剤の使用量は、使用したワクチンの種類及び品質、又は接種者の年齢、症状等によって異なるが、例えば、予防のために用いるには、成人１回につき固形分換算で０．０１～１ｇ程度が挙げられ、食前３０分位に１日３回服用することが望ましい。

また、本明細書において「腸管免疫賦活剤」とは、腸管の粘膜上皮におけるＩｇＡの分泌を促進し、宿主の免疫機構を賦活するために有効なものを意味する。本発明の腸管免疫賦活剤は、以下に詳述するように、飲食品、医薬品、飼料又は有効成分組成物の形態等を含む。また、これらの中でも健康食品が好ましく、特に、免疫力が低下した対象者の健康を維持増進するための食品組成物が好ましい。健康食品としての使用時には、食品の味や外観に悪影響を及ぼさない量を用いることが適当である。

（ＩＩＩ）遺伝子発現促進剤
本明細書において「遺伝子発現促進剤」とは、特定の細胞から特定の因子（遺伝子）の発現を促進するものを意味する。本発明の遺伝子発現促進剤は、以下に詳述するように、飲食品、医薬品、飼料又は有効成分組成物の形態等を含む。本発明の遺伝子発現促進剤は、樹状細胞においてＩＬ－６、ＩＬ－１０及びレチナールデヒドロゲナーゼ２（ＲＡＬＤＨ２）のうち少なくとも一つの因子の発現を促進させる遺伝子発現促進剤である。ＩＬ（インターロイキン）－６及びＩＬ－１０はサイトカインである。また、レチナールデヒドロゲナーゼ２はレチナールを代謝してレチノイン酸にする酵素である。腸内の樹状細胞におけるＩＬ－６、レチノイン酸及びＩＬ－１０の合成は、Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞に働き、Ｂ細胞と相互作用する濾胞性Ｔヘルパー細胞（Ｔｆｈｃｅｌｌｓ）へ分化させる。また、腸内の樹状細胞におけるレチノイン酸及びＩＬ－１０の合成は、パイエル板胚中心（ｇｅｒｍｉｎａｌｃｅｎｔｅｒ）内のＢ細胞におけるＩｇＡクラススイッチ組み換え及びＩｇＡ産生を促進する。また、ＩＬ－６が発現している樹状細胞は、ＩＬ－６Ｒシグナル伝達によってＢ細胞からのＩｇＡ産生を増強する。さらに、レチノイン酸はＩｇＡ産生Ｂ細胞の腸へのホーミングに必要である。このように、樹状細胞におけるＩＬ－６、ＩＬ－１０及びレチナールデヒドロゲナーゼ２の発現は、ＩｇＡ産生促進と密接に関連する。

（ＩＶ）飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物
（有効成分組成物）
本実施形態の腸管免疫賦活剤、ＩｇＡ産生促進剤及び遺伝子発現促進剤は、飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態で用いることができる。有効成分組成物として用いる場合には、有効成分であるアピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸を、乳酸菌から分離された純粋なものをそのまま用いることのみならず、リポテイコ酸を含有する粗精製物あるいは精製物、それらの凍結乾燥物、又は、菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞壁画分も用いることができる。

本実施形態の有効成分組成物は、適当な可食性担体（食品素材）、製薬上許容される担体等の適宜の配合を経て、後述するような飲食品、医薬品等の形態に調製されることが好ましい。

（医薬品）
本実施形態の腸管免疫賦活剤、ＩｇＡ産生促進剤及び遺伝子発現促進剤を医薬品の形態とする場合は、アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸と共に製剤学的に許容される適当な製剤担体を用いて医薬組成物の形態に調製されて実用される。当該製剤担体としては、通常この分野で使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を例示できる。

医薬品の投与単位形態としては、各種の形態が選択できるが、好適には経口投与用製剤が挙げられる。経口投与製剤の代表的なものとしては錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられる。

錠剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤等を使用できる。錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることもできるし、二重錠又は多層錠とすることもできる。

丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。

更に、医薬品中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させることもできる。

本実施形態の医薬品の投与方法には特に制限がなく、製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。また、その投与量は、用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選択されるが、通常、上記有効成分組成物が１日当り体重１ｋｇ当り約０．５～１００ｍｇ程度とするのがよい。医薬品は、１日に１～４回に分けてヒトに投与することができる。

（飲食品）
本明細書における「飲食品」とは、専ら飲食のために経口的に用いられる形態のもの全てを含み（例えば、飲料も含む）、錠剤等の形態のものであっても、専ら飲食のために用いられる限りにおいては、本明細書における飲食品に含まれる。例えば、感染防御や下痢の予防等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した、健康食品、健康補助食品、病者用食品、栄養補助食品、あるいは、厚生労働省の定める保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）も、本明細書における飲食品に含まれる。健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進等の目的とした食品を意味する。

本実施形態の腸管免疫賦活剤、ＩｇＡ産生促進剤及び遺伝子発現促進剤を飲食品とする場合は、例えば発酵乳、乳酸菌飲料、発酵野菜飲料、発酵果実飲料、発酵豆乳飲料等を挙げることができる。「発酵乳」とは、乳又は乳製品を乳酸菌又は酵母で発酵させた糊状又は液状にしたものをいう。従って該発酵乳には飲料形態と共にヨーグルト形態が包含される。また「乳酸菌飲料」とは、乳又は乳製品を乳酸菌又は酵母で発酵させた糊状又は液状にしたものを主原料としてこれを水に薄めた飲料をいう。

他の飲食品形態の例としては、漬物、味噌、発酵茶、パン等の発酵食品、離乳食、粉ミルク、ベビーフード等の乳児用食品、発泡製剤、ガム、グミ、プディング等の菓子類、麺類、カプセル、顆粒、粉末、錠剤等の栄養補助食品等、前記発酵乳及び乳酸菌飲料以外の乳製品等を挙げることができる。

本実施形態による飲食品における有効成分組成物の含有量は特に限定されるものではなく、適宜決定できる。腸管免疫賦活、ＩｇＡ産生促進又は遺伝子発現促進の効果を奏する観点から、それぞれの飲食品の全質量に対して、例えば、０．００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がより好ましい。一方、飲食品中における有効成分組成物の含有量の上限は特に制限されず、通常は、飲食品の形態に合わせて適宜調整することができる。

（飼料）
本実施形態の腸管免疫賦活剤、ＩｇＡ産生促進剤及び遺伝子発現促進剤を飼料の形態とする場合には、例えば、鶏の非抗生剤投与時期や豚、牛等の離乳期における感染症予防用として、経口投与用製剤形態（水溶液、乳化液、顆粒、粉末、カプセル、錠剤等）とすることができる。

［実施例］
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、各種成分の添加量等を示す数値の単位％は、特記がない場合には質量％を意味する。

［実施例１］乳酸菌の入手と培養
アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸を得るために、アピラクトバチルスアピノーラムＪＣＭ３０７６５株、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株及びアピラクトバチルスクンキーＪＣＭ１６１７３株を準備した。また、比較用として、アピラクトバチルス属以外の乳酸菌、ラクチプランチバチルスプランタラムサブスピーシーズプランタラム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ。以下、単に「ラクチプランチバチルスプランタラム」と記載する。）ＪＣＭ１１４９株及びラクチカゼイバチルスラムノーサス（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ株（ＡＴＣＣ５３１０３）も準備した。なお、ラクチプランチバチルスプランタラムサブスピーシーズプランタラムＪＣＭ１１４９株は基準株である。

上記乳酸菌のうち、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株は石川県立大学松▲崎▼研究室保管株を用い、ラクチカゼイバチルスラムノーサスＧＧ株（ＡＴＣＣ５３１０３）は米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手したものを用いた他は、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソース研究センター微生物材料開発室（ＪＣＭ）から入手したものを用いた。

アピラクトバチルスアピノーラムＪＣＭ３０７６５株及びアピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株については、フルクトースを１０％添加したラクトバチルス用ＭＲＳブロスを用いて培養した。アピラクトバチルスクンキーＪＣＭ１６１７３株については、トマトジュースを１０％、Ｌ－システイン塩酸塩を０．０５％、それぞれ添加したラクトバチルス用ＭＲＳブロスを用いて培養した。比較用の乳酸菌の菌株は、ラクトバチルス用ＭＲＳブロス（ディフコラボラトリ社）を用いて培養した。各菌株は３０℃にて一晩前培養を行い、その後３０℃にて一日本培養を行った。

［実施例２］リポテイコ酸の精製
リポテイコ酸の精製は公知の方法（Ｍｏｒａｔｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９３：３９３－３９７，２００１、及びＣｌａｅｓｅｔａｌ．，ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｉｅｓ，１１：１６１－１６８，２０１２）を参考に実施した。まず、本培養後の乳酸菌細胞を遠心分離で集菌し、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）を加えて懸濁させた。次に、マルチビーズショッカー（登録商標）（安井器械株式会社製）を用いて、０．３ｍｍのジルコニアビーズを用いて氷上で破砕した。破砕時間は１分間とし、これを６回繰り返した。破砕した乳酸菌細胞を一旦－８０℃で凍結させた後、親油性の細胞分子を取り除くため、等量のブタノールを加えて２時間攪拌した。これを遠心分離し、水層を回収した後に凍結乾燥させた。凍結乾燥させたサンプルをカラム平衡緩衝液（１５％のｎ－プロパノールを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．７）に溶解させ、３０分間の遠心分離により固形分を除去し、ｏｃｔｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア社製）にロードして疎水性クロマトグラフィーを実施した。リポテイコ酸は、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）中におけるｎ－プロパノールの１５％から６０％への線形勾配を用いて溶出した。リポテイコ酸を含む画分は、リン酸塩及び糖の含有量を測定することにより同定した。リン酸塩の含有量は、ホスホモリブデン試験により測定した。糖の含有量は、グルコースを標準としたフェノール硫酸法により測定した。また、回収した画分に核酸及びタンパク質が含まれていないことについて、それぞれ２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することにより確認した。このようにして回収した画分をいったん凍結乾燥させ、１０ｍｌのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に懸濁させた後Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で透析し、もう一度凍結乾燥させた。リポテイコ酸の純度は、ＬＡＬ試薬（＜０．０００１％）（生化学工業株式会社製）を用いてエンドトキシン含有量を測定することにより決定した。

［実施例３］ＩｇＡ産生誘導能の測定
（パイエル板細胞の調製）
６週齢オスＢＡＬＢ／ｃＡマウス（ＣＲＥＡＪａｐａｎより購入）を、ＡＩＮ－７６ｄｉｅｔ（ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓより購入）を基礎飼料として飼育した。ＡＩＮ－７６ｄｉｅｔは２０．０％のミルクカゼイン、０．３％のＤＬ－メチオニン、５．０％のコーンオイル、５０．０％のスクロース、１５．０％のコーンスターチ、５．０％のセルロースパウダー、１．０％のＡＩＮ－７６ビタミンミックス、３．５％のＡＩＮ－７６ミネラルミックス及び０．２％の酒石酸水素コリンを含有する混合物である。

マウスは日本学術会議が２００６年に発行した動物実験の適切な実施に関するガイドラインに従って取り扱われた。マウスを１週間飼育した後炭酸ガスにて安楽死させ、開腹手術により小腸のパイエル板を摘出した。

パイエル板は氷温のＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＳＭＦ）［ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５５μｍｏｌ／ｌの２－メルカプトエタノール及び１０％非働化牛胎児血清（ＦＢＳ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）］を満たしたペトリ皿に置き、当該培地で３回洗浄した。その後、２５ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）及び１ｍｍｏｌ／ｌのジチオスレイトールを加えたＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＳＭＦ）にて４５分、３７℃で培養した。パイエル板を再度５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＳＭＦ）で洗浄した後、４００Ｕ／ｍｌのタイプＩコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）と、３０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ株式会社）とを加えたＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＳＭＦ）にて５０分、３７℃で処理した。得られた混合物を４０μｍのナイロンメッシュで濾過し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＳＭＦ）で２回洗浄し、ＩｇＡ産生誘導能の測定に用いるパイエル板細胞を取得した。パイエル板細胞の生存率はトリパンブルー染色により確認した。パイエル板細胞の最終濃度が１．２５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製し、評価に使用した。

（ＩｇＡの測定）
実施例２で得たリポテイコ酸を、最終的な濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにパイエル板細胞の懸濁液に加え、９６－ｗｅｌｌＴ－ｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｐｌａｔｅ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で５日間、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で共培養した。その後、得られた培養上清中のＩｇＡ量を、ｍｏｕｓｅＩｇＡＥＬＩＳＡｋｉｔ（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で測定した。

その結果を図１に示す。なお、図１においては、最上部にネガティブコントロールである生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）の結果を配置している。また、図１における「ａ」、「ｂ」及び「ｃ」の表示は、異なるアルファベットを付した群ごとに有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。実験の結果、アピラクトバチルス属乳酸菌、つまり、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株、アピラクトバチルスクンキーＪＣＭ１６１７３株及びアピラクトバチルスアピノーラムＪＣＭ３０７６５株に由来するリポテイコ酸においては、他の乳酸菌由来のリポテイコ酸と比較して明確に高いＩｇＡ産生誘導能が確認できた。

上記の結果より、アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸、特にアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）に属する乳酸菌由来のリポテイコ酸、さらに言えば、アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）ＪＣＭ１６１７３株又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）ＪＣＭ３０７６５株由来のリポテイコ酸は、顕著な効果を有する免疫賦活剤として期待できる。

［実施例４］樹状細胞における遺伝子発現解析
（マウス骨髄細胞からの骨髄由来樹状細胞の生成）
骨髄由来樹状細胞は、４週齢メスＢＡＬＢｃ／Ａマウス（ＣＲＥＡＪａｐａｎより購入）の大腿骨及び脛骨の骨髄細胞から生成したものを用いた。マウスから採取した骨髄細胞を洗浄後、細胞数を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとして、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＳＭＦ）に２０ｎｇ／ｍＬの濃度となるように顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を加えたものに懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。培養３日目及び５日目に、培地の半分を新しいものに交換した。培養６日目に樹状細胞を含む細胞を収集し、抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）で磁気的にラベルし、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社製）を用いて常法により樹状細胞を分離した。

（遺伝子発現解析）
上記のようにして得られた骨髄由来樹状細胞について、１．０×１０^９ｃｅｌｌｓ／ウェル（３ｍｌ）でＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＳＭＦ）を用いて６時間培養を行った。当該培養は、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株由来のリポテイコ酸を５０μｇ／ｍｌの濃度で含有させたものと、リポテイコ酸を入れなかったもの（コントロール）と、両方について実施した。その後、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐＴｏｔａｌＲＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて骨髄由来樹状細胞から全ＲＮＡを単離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲ法は、ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）及びＰｏｗｅｒＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて実施した。ＤＮＡを増幅するためのプライマーとしては以下のものを用いた。

（ＩＬ－６増幅用プライマー：ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌＩＬ－６ＰＣＲｐｒｉｍｅｒ）
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＡＴＡＧＴＣＣＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＡＴＴＴＣ－３’（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＡＴＴＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＣＴ－３’（配列番号２）
（ＩＬ－１０増幅用プライマー：ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌＩＬ－１０ＰＣＲｐｒｉｍｅｒ）
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＴＡＡＧＧＧＴＴＡＣＴＴＧ－３’（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＣＴＣＣＴＴＧＡＴＴＴＣＴ－３’（配列番号４）
（ＲＡＬＤＨ２増幅用プライマー：ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌＲＡＬＤＨ２ＰＣＲｐｒｉｍｅｒ）
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＧＡＣＴＴＧＴＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＴ－３’（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＣＡＣＣＣＡＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＴＴＴＣＣ－３’（配列番号６）

内在性コントロールとして、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。これを増幅するためのプライマーとしては以下のものを用いた。

（ＧＡＰＤＨ増幅用プライマー：ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌＧＡＰＤＨＰＣＲｐｒｉｍｅｒ）
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＴＴＧＴＣＴ－３’（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＡＴＴＧＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴ－３’（配列番号８）

統計解析は、エクセル統計（株式会社社会情報サービス）を用いて実施した。測定結果は一元配置のＡＮＯＶＡを用いて解析し、ＤｕｎｎｅｔｔのＰｏｓｔ－ｈｏｃ解析をおこなった。＊＊＊ｐ＜０．００１

その結果を図２に示す。図２における遺伝子発現の度合いは、コントロールの結果とリポテイコ酸を含有させたサンプルとの比率で示している。実験の結果、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株に由来するリポテイコ酸は、骨髄由来樹状細胞についてＩＬ－６、ＩＬ－１０及びレチナールデヒドロゲナーゼ２（ＲＡＬＤＨ２）の遺伝子発現を促進する効果があることが確認できた。

上記の結果より、アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸、特にアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）に属する乳酸菌由来のリポテイコ酸、さらに言えば、アピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株由来のリポテイコ酸は、樹状細胞においてＩＬ－６、ＩＬ－１０及びレチナールデヒドロゲナーゼ２（ＲＡＬＤＨ２）の発現を促進させる遺伝子発現促進剤として期待できる。

［実施例５］リポテイコ酸のグリセロールリン酸鎖の解析
リポテイコ酸のグリセロールリン酸鎖（繰り返し構造、ポリマー部位）の解析は、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを取得することにより実施した。まず、実施例２で得たリポテイコ酸を０．６ｍｌの９９．８％Ｄ_２Ｏ（富士フイルム和光純薬株式会社より購入）に溶解させた。^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、２５℃の条件で、５００ＭＨｚのＶａｒｉａｎＵｎｉｔｙＩｎｏｖａ５００ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（アジレントテクノロジー社製）を用いて取得した。化学シフトの基準物質としては、３－（トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウム－２，２，３，３－ｄ_４（富士フイルム和光純薬株式会社より購入）を用いた。

その結果を図３及び図４に示す。まず、アピラクトバチルス属乳酸菌以外の乳酸菌由来のリポテイコ酸におけるグリセロールリン酸鎖の構造から説明する。

ラクチプランチバチルスプランタラムＪＣＭ１１４９株由来のリポテイコ酸については、過去の論文（Ｈａｔａｎｏｅｔａｌ．ＳｃａｖｅｎｇｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃａｃｉｄｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐｏｔｅｎｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍｓｔｒａｉｎＬ－１３７ｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ｐ４０．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２５：３２１－３３１，２０１５）を参考に、各ピークを帰属した（図３（ｂ）参照。）。ラクチプランチバチルスプランタラムＪＣＭ１１４９株由来のリポテイコ酸は、ＧｒｏＰユニット、ＡｌａＧｒｏＰユニット及びＧｌｃＧｒｏＰユニットで構成されたグリセロールリン酸鎖を有すると考えられる。

ラクチカゼイバチルスラムノーサスＧＧ株由来のリポテイコ酸についても、過去の論文（Ｃｌａｅｓｅｔａｌ．Ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃａｃｉｄｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｉｃｒｏｂｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｔｅｒｎｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓＧＧ．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｉｅｓ，１１：１６１－１６８，２０１２）を参考に、各ピークを帰属した（図３（ｃ）参照。）。ラクチカゼイバチルスラムノーサスＧＧ株は、ＧｒｏＰユニット及びＡｌａＧｒｏＰユニットで構成されたグリセロールリン酸鎖を有すると考えられる。

上記したラクチプランチバチルスプランタラムＪＣＭ１１４９株及びラクチカゼイバチルスラムノーサスＧＧ株由来のリポテイコ酸におけるグリセロールリン酸鎖の構造は、旧ラクトバチルス属乳酸菌におけるリポテイコ酸として一般的に見られる構造である。

一方、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株由来のリポテイコ酸における^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、ラクチプランチバチルスプランタラムＪＣＭ１１４９株及びラクチカゼイバチルスラムノーサスＧＧ株由来のリポテイコ酸における^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルとは明らかに異なる（図３（ａ）参照。）。各ピークの帰属は現在進めている最中であり、過去の報告と^１３Ｃ－ＮＭＲ及び二次元ＮＭＲの結果（図示せず。）も考慮すると、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株由来のリポテイコ酸は、おそらくＧｌｃＧｒｏＰユニットを有しているように考えられる。しかし、他にも不明なピークが多く存在するため、今後も構成分析等によって明らかにしていく予定である。少なくとも、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株由来のリポテイコ酸におけるグリセロールリン酸鎖は、一般的な構造ではないユニークな構造を有していると考えられる。

また、アピラクトバチルスクンキーＪＣＭ１６１７３株由来のリポテイコ酸における^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（図４（ｂ）参照。）及びアピラクトバチルスアピノーラムＪＣＭ３０７６５株由来のリポテイコ酸における^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（図４（ｃ）参照。）も、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株由来のリポテイコ酸における^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（図４（ａ）参照。なお、図４（ａ）は図３（ａ）と同様のものである。）とよく似た結果を示した。このため、アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸におけるグリセロールリン酸鎖は、旧ラクトバチルス属乳酸菌由来の一般的なリポテイコ酸におけるグリセロールリン酸鎖とはかなり異なり、かつ、属内である程度共通する構造を有していると考えられる。

［実施例６］リポテイコ酸のアンカー糖脂質の解析
リポテイコ酸のアンカー糖脂質の解析は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳスペクトルを取得することにより実施した。

（アンカー糖脂質の単離）
まず、ＰＰ製のチューブにリポテイコ酸１００μｇを採取した。次に、４８％（ｗ／ｖ）フッ化水素酸を０．１ｍｌ添加し、４℃で３時間静置した。フッ化水素酸をドラフト内での窒素ガス吹き付けにより除去した後、クロロホルム、メタノール、水をそれぞれ１ｍｌ、１ｍｌ、０．９ｍｌ添加し、よく攪拌した後に遠心分離（２０℃、２００×ｇ、３０秒間）にかけ、下層の有機層を回収した。有機溶媒をドラフト内での窒素ガス吹き付けにより除去し、リポテイコ酸のアンカー糖脂質を得た。

（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳスペクトルの取得）
アンカー糖脂質をクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）１００μｌに溶解させ、さらにターゲットプレート上で同量のマトリックス剤（０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する、１０ｍｇ／ｍｌの２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）の水／メタノール（７：３、ｖ／ｖ）溶液）と混合した。混合物が共結晶化した後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量スペクトルを陽イオンモード、リフレクトロンモードで取得した。質量分析装置としては、ＴＯＦ／ＴＯＦ５８００ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢサイエックス社製）を用いた。

その結果を図５及び図６に示す。まず、アピラクトバチルス属乳酸菌以外の乳酸菌由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質の構造から説明する。

ラクチプランチバチルスプランタラムＪＣＭ１１４９株由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質の主要な構造は、Ｈｅｘ_３ＤＡＧ、つまり、３糖にジアシルグリセロールが結合している構造であると考えられる（図５（ｂ）参照。）。また、ピーク強度が弱く背景に隠れているが、ＡｃｙｌＨｅｘ_３ＤＡＧに起因すると考えられるピークも存在する。さらに、Ｈｅｘ_２ＤＡＧ、つまり、２糖にジアシルグリセロールが結合している構造に起因すると考えられるピーク（９５６）も存在するが、これもピーク強度が弱く、確実に存在しているとまでは言えないと考えられる。

ラクチカゼイバチルスラムノーサスＧＧ株由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質の主要な構造は、Ｈｅｘ_３ＤＡＧであると考えられる（図５（ｃ）参照。）。ＡｃｙｌＨｅｘ_３ＤＡＧに起因すると考えられるピークについては１本（１３６８）のみしか見られず、ピークも弱いため、ラクチカゼイバチルスラムノーサスＧＧ株由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質はＡｃｙｌＨｅｘ_３ＤＡＧを有していない可能性がある。Ｈｅｘ_２ＤＡＧに起因すると考えられるピークについては、ラクチプランチバチルスプランタラムＪＣＭ１１４９株の場合と同様に存在するが（９４２，９５６）、やはりピーク強度が弱い。

いずれにしても、上記したラクチプランチバチルスプランタラムＪＣＭ１１４９株及びラクチカゼイバチルスラムノーサスＧＧ株由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質の構造はＨｅｘ_３ＤＡＧであると考えられる。３糖のアンカー糖脂質は旧ラクトバチルス属乳酸菌におけるリポテイコ酸として一般的に見られる構造である。

一方、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質の主要な構造は、Ｈｅｘ_２ＤＡＧ（９４２，９５６，９８２）であると考えられる（図５（ａ）参照。）。２糖のアンカー糖脂質は、乳酸菌の中では、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属乳酸菌及びロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｋ）属乳酸菌由来のリポテイコ酸において一般的に見られる構造である。一方、旧ラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸で一般的に見られるのは、３糖又は４糖のアンカー糖脂質である。しかし、アピラクトバチルス属乳酸菌は旧ラクトバチルス属に属するにもかかわらず、リポテイコ酸におけるアンカー糖脂質は主に２糖であることが確認できた。また、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質は、多くの旧ラクトバチルス属乳酸菌やラクトコッカス属乳酸菌由来のリポテイコ酸に共通して見られる、３残基の脂肪酸が結合したアンカー糖脂質も有していない。このため、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質の構造には、これまでに明らかになっている代表的な乳酸菌に共通するアンカー糖脂質の構造とは大きく異なるという特徴が見られる。

また、アピラクトバチルスクンキーＪＣＭ１６１７３株由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳスペクトル（図６（ｂ）参照。）及びアピラクトバチルスアピノーラムＪＣＭ３０７６５株由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳスペクトル（図６（ｃ）参照。）も、アピラクトバチルスコウソイ１０Ｈ株由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳスペクトル（図６（ａ）参照。なお、図６（ａ）は図５（ａ）と同様のものである。）と、Ｈｅｘ_２ＤＡＧを主要な構造としているという点で類似した結果を示した。このため、アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質も、旧ラクトバチルス属乳酸菌由来の一般的なリポテイコ酸におけるアンカー糖脂質とはかなり異なり、かつ、属内である程度共通する構造を有していると考えられる。

上記実施例５、６により、アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸は、旧ラクトバチルス属乳酸菌由来の一般的なリポテイコ酸とは全体的に異なる構造を有していることが判明した。アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸と旧ラクトバチルス属乳酸菌由来の一般的なリポテイコ酸との構造の違いは、アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸が高いＩｇＡ産生誘導能を示すことに関連していると考えられる。

アピラクトバチルス属乳酸菌は、旧ラクトバチルス属乳酸菌の中でもラクトバチルスクンキーグループと呼ばれていた一群の乳酸菌である。アピラクトバチルス属乳酸菌は、グラム陽性、桿状、ヘテロ発酵性の性質を有し、一般的に１５～３７℃の範囲で増殖し、多くはｐＨ３．０未満の酸性条件でも増殖する。アピラクトバチルス属乳酸菌のゲノムサイズは１．４２～１．５８Ｍｂｐ程度であり、比較的小さい。ＤＮＡ中のＧ＋Ｃ含量は３０．５～３６．４の範囲内である。アピラクトバチルス属乳酸菌は、フルクトースをマンニトールに変換する。また、通常、フルクトース、グルコース及びスクロースは代謝できるが、マルトース及びペントースは代謝できない（Ｚｈｅｎｇｅｔａｌ．ＡｔａｘｏｎｏｍｉｃｎｏｔｅｏｎｔｈｅｇｅｎｕｓＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ：Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆ２３ｎｏｖｅｌｇｅｎｅｒａ，ｅｍｅｎｄｅｄｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＢｅｉｊｅｒｉｎｃｋ１９０１，ａｎｄｕｎｉｏｎｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅａｎｄＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２０２０；７０：２７８２－２８５８）。

Claims

アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸を有効成分として含む腸管免疫賦活剤。
前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）に属する乳酸菌である請求項１に記載の腸管免疫賦活剤。
前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）ＪＣＭ１６１７３株又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）ＪＣＭ３０７６５株である請求項２に記載の腸管免疫賦活剤。
飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である請求項１～３のいずれかに記載の腸管免疫賦活剤。
アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸を有効成分として含むＩｇＡ産生促進剤。
前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）に属する乳酸菌である請求項５に記載のＩｇＡ産生促進剤。
前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株、アピラクトバチルスクンキー（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｕｎｋｅｅｉ）ＪＣＭ１６１７３株又はアピラクトバチルスアピノーラム（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｐｉｎｏｒｕｍ）ＪＣＭ３０７６５株である請求項６に記載のＩｇＡ産生促進剤。
飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である請求項５～７のいずれかに記載のＩｇＡ産生促進剤。
アピラクトバチルス属乳酸菌由来のリポテイコ酸を有効成分として含み、樹状細胞においてＩＬ－６、ＩＬ－１０及びレチナールデヒドロゲナーゼ２（ＲＡＬＤＨ２）のうち少なくとも一つの因子の発現を促進させる遺伝子発現促進剤。
前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）に属する乳酸菌である請求項９に記載の遺伝子発現促進剤。
前記アピラクトバチルス属乳酸菌がアピラクトバチルスコウソイ（Ａｐｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株である請求項１０に記載の遺伝子発現促進剤。
飲食品、医薬品、飼料又はこれらに配合する有効成分組成物の形態である請求項９～１１のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤。