KR20220108765A - 치료용 약학 조성물 - Google Patents

치료용 약학 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20220108765A
KR20220108765A KR1020227014718A KR20227014718A KR20220108765A KR 20220108765 A KR20220108765 A KR 20220108765A KR 1020227014718 A KR1020227014718 A KR 1020227014718A KR 20227014718 A KR20227014718 A KR 20227014718A KR 20220108765 A KR20220108765 A KR 20220108765A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pharmaceutical composition
dsm
cfu
inoculation
bacterial
Prior art date
Application number
KR1020227014718A
Other languages
English (en)
Inventor
니콜 킴스
리카르도 발라데어스
니라자 바즈랄라
Original Assignee
시올타 테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 시올타 테라퓨틱스, 인크. filed Critical 시올타 테라퓨틱스, 인크.
Publication of KR20220108765A publication Critical patent/KR20220108765A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4816—Wall or shell material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

박테리아 컨소시엄 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 이러한 약학 조성물은 세균 불균형(dysbiosis), 세균 불균형 관련 병태, 염증, 및 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 대상체에게 경구 투여될 수 있다.

Description

치료용 약학 조성물
상호 참조
본 출원은 2019년 10월 7일에 출원된 미국 가출원 제62/911,873호의 이익을 주장하며, 이는 이로써 그 전체가 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고 이로써 그 전체가 참고로 포함된다. 상기 ASCII 사본은 2020년 10월 2일에 생성하였으며, 53206-707_601_SL.txt로 명명하며 크기는 3,713바이트이다.
배경
마이크로바이옴 및 게놈 연구 분야의 최근 발전은 인간 장의 박테리아 조성이 인간의 건강, 질환 발병 및 진행에 근본적으로 영향을 미친다는 증거를 제공한다. 그러나 마이크로바이옴-숙주 관계, 마이크로바이옴 조성으로 인한 숙주의 기능 및 대사 변화, 및 치료 적용을 위한 박테리아 조성물의 잠재적 개발과 관련하여 많은 것이 여전히 알려져 있지 않다. 예를 들어, 알레르기 및 천식과 같은 염증성 질환의 위험의 원인이 되는 유전 요소가 확립되어 있지만, 미생물 노출 및 마이크로바이옴 조성을 포함한 환경 요인이 이러한 질환의 원인에 중요한 역할을 한다. 임상 시험 데이터는 결국 알레르기와 천식이 발병되는 영아의 장내 마이크로바이옴이 박테리아 종 조성과 면역 조절 활성에서 구별됨을 보여준다. 일반적으로 알레르기성 질환의 발병률 증가가 우려되며 천식은 급속히 커지는 세계적인 문제를 제기하기 때문에 걱정이 되고 있다. 이러한 알레르기성 질환에 대한 치료법이 없기 때문에, 증상을 관리하는 데 수십억 달러가 소요되는 주요 공중 보건 문제가 된다. 예를 들어 천식은 미국에서만 연간 560억 달러가 넘는 엄청난 비용 부담을 안고 있으며, 그 중 거의 200억 달러는 다양한 효능과 잠재적으로 심각한 부작용이 있는 표준 치료에 사용된다. 결과적으로, 알레르기성 질환 예방을 목표로 하는 면역조절 미생물 조성물과 같은 치료 옵션의 확장은 특히 불균형적으로 영향을 받는 소아 집단에서 심각한 충족되지 않은 요구를 해결할 것이다.
간략한 요약
고체 제형이고, 아커만시아속(Akkermansia sp .), 페칼리박테리움속(Faecalibacterium sp .), 및 락토바실러스속(Lactobacillus sp .)의 적어도 하나의 균주를 포함하는 정제된 박테리아 집단; 및 동결보호제를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 동결보호제가 탄수화물 및 항산화제를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 탄수화물이 사카로오스, 트레할로오스, 또는 이들의 조합을 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 항산화제가 아미노산을 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 아미노산이 L-글루타메이트, L-시스테인, 또는 이들의 조합을 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. L-시스테인이 중량 기준으로 약 0.05% 내지 약 1%의 양으로 존재하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 동결보호제가 중량 기준으로 약 60% 사카로오스, 약 10% 트레할로오스, 약 1% L-시스테인, 및 약 4% L-글루타메이트를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 약학 조성물이 현탁액으로 제제화되는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 약학 조성물이 경구 제형으로 제제화되는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 경구 제형이 캡슐, 정제, 에멀젼, 현탁액, 시럽, 겔, 검, 페이스트, 허브 차, 점적제, 용해 과립, 분말, 정제, 동결건조물, 아이스 캔디, 또는 아이스크림인 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 박테리아 집단이 동결건조된 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다.
액체 제형이고, 아커만시아속, 페칼리박테리움속, 및 락토바실러스속의 적어도 하나의 균주를 포함하는 정제된 박테리아 집단; 및 항산화제를 포함하는 의 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 동결보호제를 추가로 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 동결보호제가 글리세롤을 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 글리세롤이 부피 기준으로 약 10% 내지 약 30%의 양으로 존재하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 항산화제가 아미노산을 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 아미노산이 L-시스테인을 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. L-시스테인이 중량 기준으로 약 0.1%의 양으로 존재하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 완충제를 추가로 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 완충제가 인산 완충 식염수(PBS: phosphate buffered saline)이고 pH가 약 7.4인 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 약학 조성물이 약 1 mL의 총 부피를 갖는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 용기를 추가로 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 용기가 2 mL 폴리프로필렌 스크류 캡 바이알인 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다.
아커만시아속, 락토바실러스속, 및 페칼리박테리움속의 적어도 하나의 균주를 포함하는 정제된 박테리아 집단; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 약학 조성물은 캡슐에 포함되고, 캡슐은 식물 유래 물질을 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 식물 유래 물질이 셀룰로오스계 중합체를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 셀룰로오스계 중합체가 풀루란을 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 캡슐은 캡슐 내의 기체 조성으로 측정할 때 산소 투과도가 약 0.5 cm3/m2/일 미만인 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 캡슐은 탈이온수로 37℃에서 측정할 때 붕해 종말점이 약 1.6분인 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 동결보호제를 추가로 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 동결보호제가 탄수화물 및 항산화제를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 박테리아 집단이 동결건조된 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속, 페칼리박테리움속, 및 락토바실러스속의 적어도 하나의 균주가 표 1에 열거된 균주로부터 선택된 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 박테리아 집단이 에이. 뮤시니필라(A. muciniphila)(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(F. prausnitzii)(DSM 33185), 또는 엘. 크리스파투스(L. crispatus)(DSM 33187)를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 박테리아 집단이 박테리아 균주 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 중 2종 이상을 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 박테리아 집단이 박테리아 균주 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187)를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 각각의 박테리아 균주가 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU의 양으로 존재하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 각각의 박테리아 균주가 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 양으로 존재하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 각각의 박테리아 균주가 약 5x10^8 CFU의 양으로 존재하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 박테리아 집단이 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU의 총량으로 존재하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 박테리아 집단이 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 총량으로 존재하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 박테리아 집단이 약 1.5x10^9 CFU의 총량으로 존재하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다.
대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 이전에 기재된 임의의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 질환은 염증성 질환인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 염증성 질환은 알레르기 또는 피부염인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 알레르기는 알레르기성 천식, 알레르기성 소아 천식 또는 식품 알레르기인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 질환은 대사성 질환인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 또는 대사 증후군인 방법이 본원에서 추가로 제공된다.
대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 아커만시아속, 페칼리박테리움속, 및 락토바실러스속의 균주를 포함하는 정제된 박테리아 집단을 포함하는 약학 조성물을 대상체에게 경구 투여하는 단계를 포함하며, 약학 조성물은 적어도 7일 동안 적어도 1일 1회 대상체에게 투여되는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 대상체는 약 7일 이하의 신생아인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 대상체는 약 28일 내지 약 12개월의 영아인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 약학 조성물은 적어도 28일 동안 대상체에게 투여되는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 약학 조성물은 적어도 336일 동안 대상체에게 투여되는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 약학 조성물은 대상체에게 1일 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 6회 투여되는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 약학 조성물은 대상체에게 1일 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 또는 12회 투여되는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 알레르기성 병태는 아토피 피부염, 식품 알레르기, 알레르기성 비염, 또는 알레르기성 천식인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 대상체는 알레르기성 병태의 병력이 있는 생물학적 어머니, 아버지, 또는 형제자매가 있고, 알레르기성 병태는 아토피 피부염, 식품 알레르기, 알레르기성 비염, 또는 알레르기성 천식인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 대상체는 출생체중이 약 2.5 kg 내지 4.5 kg인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 각각의 박테리아 균주는 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU의 양으로 존재하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 각각의 박테리아 균주는 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 양으로 존재하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 각각의 박테리아 균주는 약 5x10^8 CFU의 양으로 존재하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 박테리아 집단은 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU의 총량으로 존재하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 박테리아 집단은 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 총량으로 존재하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 박테리아 집단은 약 1.5x10^9 CFU의 총량으로 존재하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 아커만시아속, 페칼리박테리움속, 및 락토바실러스속은 동량으로 투여되는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 아커만시아속, 페칼리박테리움속, 및 락토바실러스속은 각각 5x10^8 CFU로 투여되는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 탄수화물계 부형제를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 약학 조성물은 모유, 조제분유, 또는 식품에 혼합되는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 현탁액은 동결보호제를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 동결보호제는 글리세롤을 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 글리세롤은 부피 기준으로 약 10% 내지 약 30%의 양으로 존재하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 항산화제를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 항산화제는 아미노산을 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 아미노산은 L-시스테인을 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, L-시스테인은 중량 기준으로 약 0.1%의 양으로 존재하는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 완충제를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 완충제는 인산 완충 식염수(PBS)이고 pH가 약 7.4인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 약학 조성물은 약 1 mL의 총 부피를 갖는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 조성물은 캡슐에 포함되는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 캡슐은 식물 기반 물질을 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 캡슐은 동결보호제를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 동결보호제는 탄수화물 및 항산화제를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 탄수화물은 사카로오스, 트레할로오스, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 항산화제는 아미노산을 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 아미노산은 L-글루타메이트, L-시스테인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, L-시스테인은 중량 기준으로 약 0.05% 내지 약 1%의 양으로 존재하는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 동결보호제는 중량 기준으로 약 60% 사카로오스, 약 10% 트레할로오스, 약 1% L-시스테인, 및 약 4% L-글루타메이트를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 박테리아 집단은 동결건조된 것인 방법이 본원에서 제공된다.
아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 증가하는 양의 배양 배지로 복수의 접종 라운드를 수행하는 단계를 포함하며, 각각의 접종 라운드는 선행 접종 라운드의 총 배치 재료의 적어도 약 5%를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 아커만시아속은 아커만시아 뮤시니필라 또는 아커만시아 글리카니필라(Akkermansia glycaniphila)를 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 아커만시아 뮤시니필라는 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213)를 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 배양 배지는 약 1 L 내지 약 4,000 L인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 약 1 L 배양 배지의 초기 접종 라운드를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 접종 라운드 중 적어도 하나는 적어도 약 3000 L 배양 배지 부피인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 초기 접종 라운드는 초기 접종 라운드 배양 배지의 약 2%의 동결된 아커만시아 뮤시니필라 스톡을 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 초기 접종 라운드는 혐기 조건에서 아커만시아 뮤시니필라를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 최종 접종 라운드를 추가로 포함하며, 최종 접종 라운드는 적어도 2.5의 OD600의 양으로 존재하는 아커만시아속을 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 선행 접종 라운드의 총 배치 재료의 부피 기준으로 약 10%의 최종 접종 라운드를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 배양 배지에 대해 복수의 멸균 라운드를 수행하는 단계를 추가로 포함하며, 각각의 멸균 라운드는 N2H2CO2(90:5:5)로 배양 배지를 탈기시키는 단계를 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 배치를 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 동결건조 전에 배치를 원심분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 동결건조 후에 배치를 분쇄하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 7 미만인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 아커만시아속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 6.5 미만인 방법이 본원에서 추가로 제공된다.
페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 증가하는 양의 배양 배지로 복수의 접종 라운드를 수행하는 단계를 포함하며, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 6.5 미만인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 페칼리박테리움속은 페칼리박테리움 프라우스니치이를 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 페칼리박테리움 프라우스니치이는 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185)를 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 배양 배지는 약 1 L 내지 약 4,000 L인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 약 1 L 배양 배지의 초기 접종 라운드를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 접종 라운드 중 적어도 하나는 적어도 약 3000 L 배양 배지인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 초기 접종 라운드는 초기 접종 라운드 배양 배지의 약 0.4%의 동결된 페칼리박테리움 프라우스니치이 스톡을 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 초기 접종 라운드는 혐기 조건에서 페칼리박테리움 프라우스니치이를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 최종 접종 라운드를 추가로 포함하며, 최종 접종 라운드는 적어도 5의 OD600의 양으로 존재하는 페칼리박테리움속을 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 배양 배지에 대해 복수의 멸균 및 탈기 라운드를 수행하는 단계를 추가로 포함하며, 각각의 멸균 라운드는 배양 배지를 121℃에서 20분 동안 오토클레이브하는 단계를 포함하고, 각각의 탈기 라운드는 N2H2CO2(90:5:5)로 배양 배지를 탈기시키는 단계를 포함하는 것인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 배치를 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 동결건조 전에 배치를 원심분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 동결건조 후에 배치를 분쇄하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 6 미만인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 5.5 미만인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 5 미만인 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 각각의 접종 라운드는 선행 접종 라운드의 총 배치 재료의 적어도 약 1%를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 설명된다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시 양태를 설명하는 다음의 상세한 설명, 및 첨부 도면(본원에서 "도" 또는 "도면")을 참조하여 더 잘 이해될 것이다. 그 중:
[도 1]은 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 제조 단계를 요약하는 개략적인 흐름도를 나타낸다.
[도 2]는 변형 NAGT 배지에서 에이. 뮤시니필라의 시간 경과에 따른 성장 측정에 대한 600 나노미터 파장에서의 흡광도(본원에서 "OD600"으로도 지칭됨) 대 시간의 차트를 보여준다. 데이터는 비변형 NAGT 배지, 변형 NAGT 배지, 글루코오스 미포함 변형 NAGT 배지, 칼슘 미포함 변형 NAGT 배지 및 마그네슘 미포함 변형 NAGT 배지를 포함하는 배지의 변형에 대한 것이다.
[도 3]은 상이한 NAGT 배지에서 에이. 뮤시니필라의 시간 경과에 따른 성장 측정에 대한 600 나노미터 파장에서의 흡광도 대 시간의 차트를 보여준다. 데이터는 비변형 NAGT 배지, NAG 미포함 NAGT, 및 소이톤 미포함 NAGT를 포함하는 배지의 변형에 대한 것이다.
[도 4]는 상이한 배양 배지에서 에프. 프라우스니치이의 시간 경과에 따른 성장 측정에 대한 600 나노미터 파장에서의 흡광도 대 시간의 차트를 보여준다. 데이터는 완전 배지, 아세트산나트륨 미포함 배지, 소이톤 미포함 배지, 효모 추출물 미포함 배지, 및 시스테인 미포함 배지를 포함하는 배지의 변형에 대한 것이다.
[도 5]는 상이한 보충제를 포함한 YFAP 배지에서 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 성장에 대한 600 나노미터 파장에서의 흡광도 대 시간의 차트를 보여준다. 에프. 프라우스니치이는 비타민 미포함 YFAP에서 3번 계대 배양한 후 상이한 보충제를 포함한 YFAP 배지에서 배양하였다. 데이터는 완전한 비타민 믹스 포함 YFAP 배지(비타민 믹스 용액)(YFAP + 비타민), 비오틴 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 비오틴), 코발라민 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 코발라민), PABA 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) PABA), 엽산 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 엽산), 피리독사민 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 피리독사민), 티아민 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 티아민), 리보플라빈 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 리보플라빈), YFAP 완전한 비타민 믹스 미포함 배지(YFAP (-) 비타민)를 포함하는 배지의 변형에 대한 것이다. 비타민의 첨가는 에프. 프라우스니치이의 성장을 약 10% 증가시켰다.
[도 6]은 상이한 보충제를 포함한 YFAP 배지에서 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 성장에 대한 600 나노미터 파장에서의 흡광도 대 시간의 차트를 보여준다. 에프. 프라우스니치이는 비타민 없이 1번 계대 배양하였다. 데이터는 완전한 비타민 믹스(비타민 믹스 용액) 포함 YFAP 배지(YFAP + 비타민), 비오틴 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 비오틴), 코발라민 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 코발라민), PABA 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) PABA), 엽산 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 엽산), 피리독사민 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 피리독사민), 티아민 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 티아민), 리보플라빈 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 리보플라빈), 및 완전한 비타민 믹스 미포함 YFAP 배지(YFAP (-) 비타민)를 포함하는 배지의 변형에 대한 것이다. 완전한 비타민 믹스 또는 코발라민의 결여는 에프. 프라우스니치이의 성장을 약 30% 감소시켰다.
[도 7]은 pH를 조절하지 않은 YFAP 배지에서 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 성장에 대한 600 나노미터 파장에서의 흡광도 대 시간의 차트를 보여준다. 배양물을 제24시간에 접종하고, 100 rpm에서 교반하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. pH가 고정되지 않으면 약 5.5로 떨어졌다. 산화환원은 -400mV에서 유지되었고, 박테리아 성장은 OD600 = 1.1에 도달하였다. 제24시간 이전의 모든 판독값은 각 측정에 대한 기준 값을 나타낸다.
[도 8]은 pH를 조절한 YFAP 배지에서 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 성장에 대한 600 나노미터 파장에서의 흡광도 대 시간의 차트를 보여준다. 배양물을 제24시간에 접종하고, 100 rpm에서 교반하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 6.75에서 수산화암모늄(NH4OH)을 첨가하여 pH를 고정했을 때, 산화환원은 -460mV로 떨어졌고 박테리아 성장은 약 OD600 = 0.5에서 정체되었다. 제24시간 이전의 모든 판독값은 각 측정에 대한 기준 값을 나타낸다.
[도 9]는 상이한 배양 배지에서 시간 경과에 따른 엘. 크리스파투스의 성장의 600 나노미터 파장에서의 흡광도 대 시간의 차트를 보여준다. 차트는 Boullion vMRS 브로스와 HiMedia vMRS 브로스에서 엘. 크리스파투스의 성장을 비교한다.
[도 10]은 NAGT 배지에서 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 20리터 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장에서의 흡광도(본원에서 "OD585"로도 지칭됨)(좌측의 Y축) 및 글루코오스 농도(g/L)(우측의 Y축) 대 시간의 차트를 보여준다. 차트는 시간 경과에 따른 에이. 뮤시니필라의 성장과 글루코오스 수준 사이의 관계를 보여준다. 제27시간과 제48시간에 글루코오스(4.52 g/L) 및 N-아세틸글루코사민(5.54 g/L)의 첨가(*)는 에이. 뮤시니필라 배양물이 제25시간에서 제50시간 사이에 지수기를 유지하고 제50시간 후에 정지기로 진입하도록 하였다.
[도 11]은 Vegitone MRS 배지에서 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 20리터 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장에서의 흡광도(좌측의 Y축) 및 글루코오스 농도(g/L)(우측의 Y축) 대 시간의 차트를 보여준다. 차트는 시간 경과에 따른 엘. 크리스파투스(DSM 33187)의 성장과 글루코오스 수준 사이의 관계를 보여준다. 제10시간과 제11시간에 글루코오스(10 g/L)의 2회 첨가(1차 공급 * 및 2차 공급 **)는 엘. 크리스파투스 배양물이 제11시간에서 제14시간 사이에 지수기를 유지하고 제14시간 후에 정지기에 진입하도록 하였다.
[도 12]는 YFAP 배지에서 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 20리터 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장에서의 흡광도(좌측의 Y축) 및 글루코오스 농도(g/L)(우측의 Y축) 대 시간의 차트를 보여준다. 차트는 시간 경과에 따른 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 성장과 글루코오스 수준 사이의 관계를 보여준다. 제9시간에 글루코오스(10 g/L)의 첨가(1차 공급 *)는 에프. 프라우스니치이 배양물이 제9시간부터 제14시간까지 성장을 유지하도록 하였다.
[도 13]은 NAGT 배지에서 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 150리터 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장에서의 흡광도(좌측의 Y축) 및 글루코오스 농도(g/L)(우측의 Y축) 대 시간의 차트를 보여준다. 차트는 시간 경과에 따른 에이. 뮤시니필라의 성장과 글루코오스 수준 사이의 관계를 보여준다. 제19시간에 글루코오스(4.52 g/L) 및 N-아세틸글루코사민(5.54 g/L)의 첨가(*)는 에이. 뮤시니필라 배양물이 제20시간 후에 지수적 성장을 유지하도록 하였다.
[도 14]는 Vegitone MRS 배지에서 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 150리터 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장에서의 흡광도(좌측의 Y축) 및 글루코오스 농도(g/L)(우측의 Y축) 대 시간의 차트를 보여준다. 차트는 시간 경과에 따른 엘. 크리스파투스(DSM 33187)의 성장과 글루코오스 수준 사이의 관계를 보여준다. 제10시간에 글루코오스(35 g/L)의 첨가(*)는 엘. 크리스파투스 배양물이 제10시간에서 제12시간까지 지수적 성장을 유지하고 제12시간 후에 정지 성장에 진입하도록 하였다.
[도 15]는 YFAP-NU 배지에서 1 L 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 배양물의 시간 경과에 따른 성장 측정에 대한 600 나노미터 파장에서의 흡광도 대 시간의 차트를 보여준다.
[도 16]은 YFAP-NU 배지에서 150 L 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 배양물의 시간 경과에 따른 성장 측정에 대한 600 나노미터 파장에서의 광 흡수 대 시간의 차트를 보여준다. 제8시간에 글루코오스(10 g/L)의 첨가(*)는 에프. 프라우스니치이 배양물이 지수기에 진입하고 정지기에 도달하도록 하였다.
[도 17a-17c]는 박테리아 세포 집단, 예를 들어, 인간 대상체에게 투여될 수 있는 세포 집단에서 대사 활성의 치료 균주의 정량화를 위한 가열 사멸된 대조군 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포의 유세포 분석 게이팅 실험을 보여준다. 예시 균주로서 사용된 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포 스톡 용액을 0.9% NaCl 완충 용액에 10^-4M로 희석하고 실험을 수행하기 전에 세포 사멸을 보장하기 위해 95℃에서 20분 동안 가열 블록에 두었다. 세포는 2 μM의 프로피듐 아이오다이드와 2 μM의 SYTO9로 염색하였다. 각각 세포 크기 및 입도(granularity)에 대해 선별하기 위해 전방 산란 영역(FSC-A: Forward Scatter Area) 및 측방 산란 영역(SSC-A: Side Scatter Area)에 의해 계산된 모든 세포(도 17a)에 게이트를 적용하였다. 그 다음 단일 세포를 식별하기 위해 이들 세포를 전방 산란 높이(FSC-H: Forward Scatter Height) 및 전방 산란 영역(FSC-A)에 기초한 선형성에 대해 게이팅하였다(도 17b). 그 다음 단일 세포를 사용하여 사멸 세포(PIhighSYTO9low) 및 생존 세포(PI-SYTO9high)에 대해 게이트를 설정하였으며, 이는 50 ㎕의 용액에서 생존 세포 및 사멸 세포의 백분율을 제공하였다(도 17c)
[도 17a]는 각각 세포 크기 및 입도에 대해 선별하기 위해 전방 산란 영역(FSC-A) 및 측방 산란 영역(SSC-A)에 의해 계수된 모든 세포에 게이트를 적용하였을 때 얻은 유세포 분석 결과를 보여준다.
[도 17b]는 단일 세포를 식별하기 위해 전방 산란 높이(FSC-H) 및 전방 산란 영역(FSC-A)에 기초한 선형성에 대해 세포를 게이팅할 때 얻은 유세포 분석 결과를 보여준다.
[도 17c]는 단일 세포를 사용하여 사멸 세포(PIhighSYTO9low) 및 생존 세포(PI-SYTO9high)에 대해 게이트를 설정하였을 때 얻은 유세포 분석 결과를 보여주며, 이는 50 ㎕의 세포 현탁액에서 생존 세포 및 사멸 세포의 백분율을 제공한다.
[도 18]은 생존 세포의 유세포 분석 정량화 데이터를 (표준) 한천 평판법을 사용하여 결정된 총 생존 세포 수와 비교하는 그래프를 보여준다. 왼쪽 y축은 유세포 분석으로 측정한 총 생존 세포 수를 나타낸다. 오른쪽 y축은 생물학적 복제물에 대한 영양 한천 평판법으로부터 계산된 평균 CFU/mL 값을 나타낸다. 양측 Mann Whitney t-검정은 p-값이 0.0532로 두 정량화 방법의 평균값 사이에 유의한 차이가 없음을 보여주었다.
[도 19a-19c]는 대변 샘플에서 박테리아 균주 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213)(도 19a) 및 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185)(도 19b), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)(도 19c) 각각을 정량화하기 위한 검출 곡선의 한계(대조군 임계값은 박테리아 세포 수에 대해 플롯팅됨)를 보여준다. 점선은 측정된 데이터 포인트를 연결하고, 직선은 적합 회귀선을 나타내며, "R2"는 결정 계수이다. 표시된 데이터는 대변 DNA 배경에 희석된 세 가지 균주의 50 ng의 총 DNA(균주 DNA + 대변 DNA) 중 순수한 박테리아 DNA(10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 및 0.00001나노그램(ng))를 사용하여 생성된 표준 곡선을 나타낸다. 균주(예를 들어, 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187))의 양을 결정하기 위해 인간 샘플을 분석하는 경우, 실험에 사용된 DNA 프라이머가 박테리아 균주의 DNA를 적절하게 증폭할 수 있도록 보장하기 위해 대조군 샘플을 병행하여 실행 및 분석할 수 있다.
[도 20]은 3500 L 배양 부피에서 에이. 뮤시니필라(DSM 33213)의 최적화된 초대규모 배양 및 제조 공정에 대한 개략적인 흐름도를 나타낸다. 19.2 mL의 Working Cell Bank(WCB) 에이. 뮤시니필라(DSM 33213)를 혐기 챔버에서 해동시키고 혐기 챔버 1 L 병(2001)의 1L의 환원 NAGT 배지(2% v/v 접종 비율)에 접종하였다. OD585 > 1이거나 배양물이 48시간 동안 성장했을 때 배양을 중단하였다. (2001)의 전체 배양물을 사용하여 20 L 발효기(2002)의 16 L 배지(5% v/v 접종 비율)에 접종하였다. OD585> 1.5 또는 배양물이 48시간 동안 성장했을 때 배양을 중단하였다. (2002)의 15 L 배양물을 사용하여 300 L 발효기(2003)의 300 L 배지(5% v/v 접종 비율)에 접종하였다. OD585 > 1.5이거나 배양물이 48시간 동안 성장했을 때 배양을 중단하였다. 표 15에 정의된 240 L를 제조하였다. 100 L 당 공급물을 3500 L 발효기(2004)에 추가하였다. (2002)의 300 L 배양물을 사용하여 (2004)의 3500 L 배지(8-10% v/v 접종 비율)에 접종하였다. 글루코오스 농도가 2 g/L 미만으로 떨어지면 또 다른 100 L의 당 공급물을 첨가하였다. OD585 > 2.5이거나 배양물이 72시간 동안 성장했을 때 배양을 중단하였다. 그 다음 (2004)의 전체 배양물을 혐기 분위기하에서 원심분리하여 바이오매스로 수거하였다. 표 17에 정의된 100 L 여과 멸균 탈기된 동결보호제를 혐기성 가스로 퍼지된 혼합 탱크에서 바이오매스와 혼합하였다. 동결보호제를 포함한 바이오매스를 동결건조(동결 및 건조)하고 분쇄하였다. 각 단계에서, 박테리아 배양에 사용된 배지는 사용하기 전에 멸균(121℃에서 오토클레이브)하고 N2H2CO2(90:5:5)로 탈기시켰다. 당 성분(N-아세틸글루코사민 및 글루코오스)은 나머지 NAGT 배지 성분과 별도로 제조하였다. 당 공급물을 여과 멸균하고, 탈기시키고, 나머지 NAGT 배지 성분에 첨가하여 완전한 배양 배지를 생성하였다.
[도 21]은 3500 L 제조 공정에서 1 L 병의 NAGT 배지에서 1 L 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장에서의 흡광도(Y-축) 대 시간의 차트를 보여준다.
[도 22]는 3500 L 제조 공정에서 20 L 발효기의 NAGT 배지에서 20 L 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장에서의 흡광도(Y-축) 대 시간의 차트를 보여준다.
[도 23]은 3500 L 제조 공정에서 300 L 발효기의 NAGT 배지에서 300 L 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장(Y-축)에서의 광 흡수 대 시간의 차트를 보여준다.
[도 24]는 3500 L 제조 공정에서 3500 L 발효기의 NAGT 배지에서 3500 L 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장에서의 흡광도(Y-축) 대 시간의 차트를 보여준다.
[도 25]는 3500 L 배양 부피에서 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 최적화된 초대규모 배양 및 제조 공정에 대한 개략적인 흐름도를 나타낸다. 6.4 mL의 Working Cell Bank(WCB) 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)를 혐기 챔버에서 해동시키고 혐기 챔버의 2 L 플라스크(2501)에 1 L의 환원된 NAGT 배지(2% v/v 접종 비율)에 접종하였다. OD600 > 3이거나 배양물이 48시간 동안 성장했을 때 배양을 중단하였다. (2501)의 1.5 L 배양물을 사용하여 300L 발효기(2502)의 150 L 배지(1% v/v 접종 비율)에 접종하였다. OD585 > 5이거나 배양물이 48시간 동안 성장했을 때 배양을 중단하였다. 표 22에 정의된 250 L를 제조하였다. 100 L 당 공급물을 3500 L 발효기(2503)에 첨가하였다. (2502)의 35 L 배양물을 사용하여 3500 L 발효기(2503)의 300 L 배지(5% v/v 접종 비율)에 접종하였다. OD585 > 5이거나 배양물이 72시간 동안 성장했을 때 반응을 중단하였다. 그 다음 (2503)의 전체 배양물을 혐기 분위기하에서 원심분리하여 바이오매스로 수거하였다. 표 24에 정의된 120 L 여과 멸균 탈기된 동결보호제를 혐기성 가스로 퍼지된 혼합 탱크에서 바이오매스와 혼합하였다. 동결보호제를 포함한 바이오매스를 동결건조(동결 및 건조)시키고 분쇄하였다. 각 단계에서 박테리아 배양에 사용된 배지는 사용하기 전에 멸균(121℃에서 오토클레이브)하고 N2H2CO2(90:5:5)로 탈기시켰다. 당 성분(글루코오스)은 나머지 YFAP 배지 성분과 별도로 제조하였다. 당 공급물을 여과 멸균하고, 탈기시키고, 나머지 YFAP 배지 성분에 첨가하여 완전한 배양 배지를 생성하였다.
[도 26]은 3500 L 제조 공정에서 2 L 플라스크의 YFAP 배지에서 2 L 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장에서의 흡광도(Y-축) 대 시간의 차트를 보여준다.
[도 27]은 3500 L 제조 공정에서 300L 발효기의 YFAP 배지에서 150 L 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장에서의 흡광도(Y-축) 대 시간의 차트를 보여준다.
[도 28]은 3500 L 제조 공정에서 3500L 발효기의 YFAP 배지에서 3500 L 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 배양물의 성장에 대한 585 나노미터 파장에서의 흡광도(Y-축) 대 시간의 차트를 보여준다.
[도 29]는 대상체에게 약학적 조성물을 경구 투여함에 의한 본원에 기재된 바와 같은 인간 임상 연구의 3단계(선별 기간, 치료 기간, 및 휴약 기간), 뿐만 아니라 위약과 비교하여 다양한 연령의 대상체에서 알레르기를 치료하는 능력을 보여준다.
[도 30]은 고체 제형(3001) 또는 액체 제형(3002)의 완제 의약품을 나타낸다. 어느 형태의 조성물이든 경구 투여될 수 있다.
[도 31]은 대상체에게 약학적 조성물을 투여함에 의한 본원에 기재된 바와 같은 인간 임상 연구의 3단계(선별 기간, 치료 기간, 및 휴약 기간), 뿐만 아니라 위약과 비교하여 다양한 연령의 대상체에서 알레르기를 치료하는 능력을 보여준다.
[도 32]는 대상체에게 약학적 조성물을 경구 투여하여, 본원에 기재된 바와 같은 인간 임상 연구의 3단계(선별 기간, 치료 기간, 및 휴약 기간), 뿐만 아니라 위약과 비교하여 다양한 연령의 대상체에서 알레르기를 치료하는 능력을 보여준다.
염증성 또는 대사성 질환의 치료를 위한 박테리아를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다. 기재된 약학 조성물은 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 하나 이상의 박테리아 종을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 약학 조성물은 락토바실러스속(sp.), 아커만시아속, 및/또는 페칼리박테리움속의 임의의 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 추가의 경우에, 본원에 기재된 약학 조성물은 본원에 언급된 하기 종의 임의의 하나 이상의 특정 균주를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다: 락토바실러스속, 아커만시아속, 및/또는 페칼리박테리움속. 예를 들어, 일부 경우에, 본원에 기재된 약학 조성물은 박테리아 균주 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)(본원에서 "엘. 크리스파투스(DSM 33187)"로도 지칭됨), 기탁 번호 DSM 33213의 아커만시아 뮤시니필라(본원에서 "에이. 뮤시니필라(DSM 33213)"로도 지칭됨), 및 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185)(본원에서 "에프. 프라우스니치이(DSM 33185)"로도 지칭됨)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 경우에, 약학 조성물은 실시예 2에 정의된 바와 같은 조성물 A를 포함할 수 있다.
약학 조성물, 이러한 조성물의 제제, 이러한 조성물의 제조 방법, 이러한 약학 조성물에 대한 투여 경로, 및 이러한 약학 조성물을 사용하여 예방 및/또는 치료될 수 있는 적응증이 본원에서 제공된다.
본 개시 내용은 또한 본원에 기재된 약학 조성물을 제제화하는 방법, 뿐만 아니라 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 이러한 약학 조성물을 투여하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 하나 이상의 박테리아 종 및/또는 균주를 포함하거나 이로 이루어질 수 있는 본원의 약학 조성물을 경구 제형으로 제제화하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 경구 제제는 하나 이상의 박테리아 종 및/또는 균주, 완충 글리세롤 용액, 예를 들어 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 및 1.8 mM KH2PO4, 20% v/v 글리세롤, 및 0.1% w/w L-시스테인과 같은 항산화제를 함유하는 표준 인산 완충 식염수로 구성될 수 있는 것을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본원에 기재된 박테리아 균주의 배치의 생산을 가능하게 하는 제조 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 이러한 방법은 종래의 제조 방법과 비교하여 하나 이상의 이점을 제공할 수 있다. 이러한 이점은 (i) 증가된 총 수율, (ii) 증가된 성장 속도, 및/또는 (iii) 총 세포 수당 더 많은 수의 생존 가능한 박테리아 세포 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 방법에는 비-동물성 유래 배지 성분의 사용이 포함될 수 있다. 이러한 비-동물성 배지는 식물성 배지를 포함할 수 있다. 이러한 식물성 배지는 식물성 펩톤, 식물성 추출물, 효모 추출물, 및 기타 비-동물성 성분과 같은 다양한 성분을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 비-동물성 배지는 N-아세틸 글루코사민-트레오닌(NAGT) 배지 및 Boullion MRS 식물성 배지, 효모 지방산 Phytone(YFAP) 배지, 뿐만 아니라 이들의 변형된 형태를 포함할 수 있다. 이러한 변형 배지는 하나 이상의 배지 성분이 제거, 추가되고/거나 다른 성분으로 대체될 수 있다. 다른 경우에, 배지 성분의 양은 비변형 배지에 비해 증가 또는 감소된다. 예에서, 변형 NAGT 배지는 마그네슘, 칼슘, 또는 글루코오스 중 임의의 하나 이상을 포함하지 않을 수 있다.
본 개시 내용의 이러한 경구 제제는 대상체에서 질환 또는 병태를 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체(예를 들어, 인간)에게 경구 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 질환 또는 병태는 염증성 질환(예를 들어, 알레르기 또는 천식) 또는 자가면역 질환일 수 있다.
정의
"적어도", "보다 큰" 또는 "이상"이라는 용어가 일련의 2개 이상의 수치에서 첫 번째 수치 앞(또는 마지막 수치 뒤)에 올 때마다, 용어 "적어도", "보다 큰" 또는 "이상" 이상"은 일련의 수치에 있는 각각의 수치에 적용된다. 예를 들어, 1, 2 또는 3 이상은 1 이상, 2 이상, 또는 3 이상이다.
"보다 크지 않은", "미만" 또는 "이하"라는 용어가 일련의 2개 이상의 수치에서 첫 번째 수치 앞(또는 마지막 수치 뒤)에 올 때마다, 용어 "보다 크지 않은", "미만" 또는 "이하"는 일련의 수치에 있는 각각의 수치에 적용된다. 예를 들어, 3, 2 또는 1 이하는 3 이하, 2 이하, 또는 1 이하이다.
수치 또는 수치 범위와 관련하여 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 일반적으로 달리 명시되지 않는 한 인용 또는 청구된 수치 또는 수치 범위의 ±10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%를 지칭한다.
약학 조성물
본 개시 내용은 박테리아 컨소시엄 및 하나 이상의 약학적 부형제를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 동결보호제, 항산화제, 및 수성 완충 용액을 포함할 수 있다.
박테리아 컨소시엄을 포함할 수 있는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 이러한 박테리아 컨소시엄은 하나 이상의 상이한 박테리아 종 및/또는 균주를 포함할 수 있다. 이러한 박테리아 종 및/또는 균주는 하나 이상의 상이한 박테리아 문에 속할 수 있다. 이러한 박테리아 문은 우미균류(Verrucomicrobia), 후벽균(Firmicutes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 방선균(Actinobacteria) 및/또는 의간균류(Bacteroidetes), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 박테리아 컨소시엄은 하나 이상의 락토바실러스속을 포함할 수 있다. 하나 이상의 락토바실러스속은 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 제에(Lactobacillus zeae), 락토바실러스 아시디피시스(Lactobacillus acidipiscis), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 아질리스(Lactobacillus agilis), 락토바실러스 아비아리우스(Lactobacillus aviarius), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 콜레오호미니스(Lactobacillus coleohominis), 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 크루스토룸(Lactobacillus crustorum), 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 디올리보란스(Lactobacillus diolivorans), 락토바실러스 파라지니스(Lactobacillus farraginis), 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 푸추엔시스(Lactobacillus fuchuensis), 락토바실러스 하르비넨시스(Lactobacillus harbinensis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 힐가르디이(Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 인테스티날리스(Lactobacillus intestinalis), 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 케피라노파시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 락토바실러스 린드네리(Lactobacillus lindneri), 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali), 락토바실러스 마니호티보란스(Lactobacillus manihotivorans), 락토바실러스 뮤코세(Lactobacillus mucosae), 락토바실러스 오에니(Lactobacillus oeni), 락토바실러스 올리고페르멘탄스(Lactobacillus oligofermentans), 락토바실러스 파니스(Lactobacillus panis), 락토바실러스 판테리스(Lactobacillus pantheris), 락토바실러스 파라브레비스(Lactobacillus parabrevis), 락토바실러스 파라콜리노이데스(Lactobacillus paracollinoides), 락토바실러스 파라케피리(Lactobacillus parakefiri), 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum), 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 폰티스(Lactobacillus pontis), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 로시에(Lactobacillus rossiae), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 실리지니스(Lactobacillus siliginis), 락토바실러스 수시콜라(Lactobacillus sucicola), 락토바실러스 박시노스테르쿠스(Lactobacillus vaccinostercus), 락토바실러스 바지날리스(Lactobacillus vaginalis), 락토바실러스 비니(Lactobacillus vini), 락토코커스 가르비에에(Lactococcus garvieae), 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 락토바실러스속은 락토바실러스 존소니이 또는 락토바실러스 크리스파투스이다. 이러한 경우에, 본원의 박테리아 컨소시엄은 하나 이상의 락토바실러스 존소니이 또는 락토바실러스 크리스파투스 균주를 포함할 수 있다. 이러한 하나 이상의 락토바실러스 크리스파투스 균주(들)은 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)(즉, 엘. 크리스파투스(DSM 33187))를 포함할 수 있다. 다양한 경우에, 본원의 박테리아 컨소시엄은 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)를 포함한다.
일부 경우에, 본원의 박테리아 컨소시엄은 하나 이상의 아커만시아속을 포함할 수 있다. 이러한 하나 이상의 아커만시아속은 아커만시아 뮤시니필라, 아커만시아 글리카니필라, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 아커만시아속은 아커만시아 뮤시니필라이다. 이러한 경우에, 본원의 박테리아 컨소시엄은 하나 이상의 아커만시아 뮤시니필라 균주를 포함할 수 있다. 이러한 하나 이상의 아커만시아 뮤시니필라 균주는 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213)를 포함할 수 있다. 다양한 경우에, 본원의 박테리아 컨소시엄은 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213)를 포함한다.
일부 경우에, 본원의 박테리아 컨소시엄은 하나 이상의 페칼리박테리움속을 포함할 수 있다. 하나 이상의 페칼리박테리움속은 페칼리박테리움 프라우스니치이를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 본원의 박테리아 컨소시엄은 하나 이상의 페칼리박테리움 프라우스니치이 균주를 포함할 수 있다. 이러한 하나 이상의 페칼리박테리움 프라우스니치이 균주는 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33191), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33186), 또는 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33190), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다양한 경우에, 본원의 박테리아 컨소시엄은 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185)를 포함한다.
박테로이데스속(Bacteroides sp.), 블라우티아속(Blautia sp.), 비피도박테리움속(Bifidobacterium sp .), 코프로코커스속(Coprococcus sp.), 또는 도레아속(Dorea sp.) 중 임의의 하나 이상의 하나 이상의 균주를 포함할 수 있는 박테리아 컨소시엄이 본원에서 추가로 제공된다. 이러한 경우에, 박테로이데스 페시스(Bacteroides faecis)(DSM 22177), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)(DSM 33178), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta)(DSM 33180), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)(DSM 33179), 코프로코커스 코메스(Coprococcus comes)(DSM 33176), 또는 도레아 롱기카테나(Dorea longicatena)(DSM 33188) 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 박테리아 컨소시엄에 포함시키기 위한 예시적인 균주는 표 1에 열거되어 있다.
Figure pct00001
20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1종의 박테리아 종 및/또는 균주(들)를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있는 박테리아 컨소시엄이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 이러한 박테리아 컨소시엄은 표 1로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 균주를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 박테리아 컨소시엄은 최대 3종의 상이한 박테리아 균주로 이루어질 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 박테리아 컨소시엄은 표 2에 열거된 적어도 하나, 적어도 2종 또는 모두 3종의 박테리아 균주를 포함한다. 일부 경우에, 박테리아 컨소시엄은 박테리아 균주 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 및 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)를 포함하거나 이로 이루어진다.
Figure pct00002
본 개시 내용은 다양한 수의 콜로니 형성 단위(CFU)의 포함된 각각의 박테리아 종 및/또는 균주를 포함할 수 있는 박테리아 컨소시엄을 제공한다. 일부 경우에, 이러한 박테리아 컨소시엄은 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU, 약 10^4 CFU 내지 약 10^12 CFU, 약 10^7 CFU 내지 약 10^11 CFU, 약 10^8 CFU 내지 약 10^10 CFU, 또는 약 10^9 CFU 내지 약 10^10 CFU의 박테리아 종 또는 균주를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이러한 박테리아 컨소시엄은 또한 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 박테리아 종 또는 균주를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 박테리아 컨소시엄은 적어도 약 10^3 CFU, 5x10^3 CFU, 10^4 CFU, 5x10^4 CFU, 10^5 CFU, 5x10^5 CFU, 10^6 CFU, 5x10^6 CFU, 10^7 CFU, 5x10^7 CFU, 10^8 CFU, 5x10^8 CFU, 10^9 CFU, 5x10^9 CFU, 10^10 CFU, 5x10^10 CFU, 10^11 CFU, 5x10^11 CFU, 또는 10^12 CFU, 그러나 약 5x10^12 CFU 이하의 박테리아 종 또는 균주를 포함할 수 있다. 박테리아 컨소시엄은 또한 박테리아 종 또는 균주당 약 10^6 내지 약 10^11 CFU를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 박테리아 컨소시엄은 박테리아 종 또는 균주당 약 10^3 내지 약 10^12 CFU를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 박테리아 컨소시엄은 박테리아 종 또는 균주당 약 10^8 내지 약 5x10^10 CFU를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 박테리아 컨소시엄은 박테리아 종 또는 균주당 약 10^7 내지 약 5x10^10 CFU를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 박테리아 컨소시엄은 박테리아 종 또는 균주당 약 5x10^8 CFU를 포함할 수 있다. 약학 조성물이 투여를 위한 단위 용량으로 제제화되는 경우, 이러한 CFU 값은 이러한 제형의 질량 단위(예를 들어, 5x10^8 CFU/g) 또는 부피 단위(예를 들어, 5x10^8 CFU/mL)에 대한 것일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본 개시 내용은 다양한 양의 박테리아 세포의 콜로니 형성 단위(CFU)를 포함할 수 있는 박테리아 컨소시엄을 제공한다. 이러한 박테리아 컨소시엄은 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU, 약 10^4 CFU 내지 약 10^12 CFU, 약 10^7 CFU 내지 약 10^11 CFU, 약 10^8 CFU 내지 약 10^10 CFU, 또는 약 10^9 CFU 내지 약 10^11 CFU의 박테리아 세포를 포함할 수 있다. 이러한 박테리아 컨소시엄은 또한 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU의 박테리아 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이러한 박테리아 컨소시엄은 또한 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 박테리아 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 박테리아 컨소시엄은 적어도 약 10^3 CFU, 5x10^3 CFU, 10^4 CFU, 5x10^4 CFU, 10^5 CFU, 5x10^5 CFU, 10^6 CFU, 5x10^6 CFU, 10^7 CFU, 5x10^7 CFU, 10^8 CFU, 5x10^8 CFU, 10^9 CFU, 5x10^9 CFU, 10^10 CFU, 5x10^10 CFU, 10^11 CFU, 5x10^11 CFU, 또는 10^12 CFU, 그러나 약 5x10^12 CFU 이하의 박테리아 세포를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본 개시 내용은 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU의 박테리아 세포의 총량으로 존재할 수 있는 박테리아 집단을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 박테리아 집단은 적어도 약 10^3 CFU, 5x10^3 CFU, 10^4 CFU, 5x10^4 CFU, 10^5 CFU, 5x10^5 CFU, 10^6 CFU, 5x10^6 CFU, 10^7 CFU, 5x10^7 CFU, 10^8 CFU, 5x10^8 CFU, 10^9 CFU, 5x10^9 CFU, 10^10 CFU, 5x10^10 CFU, 10^11 CFU, 5x10^11 CFU, 또는 10^12 CFU, 그러나 약 5x10^12 CFU 이하의 박테리아 세포의 총량으로 존재할 수 있다. 다른 경우에, 박테리아 집단은 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 박테리아 세포의 총량으로 존재할 수 있다. 일부 경우에, 박테리아 집단은 약 1.5x10^9 CFU의 박테리아 세포의 총량으로 존재할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 약학 조성물 내 박테리아 종 또는 균주의 CFU 수는 대상체의 미생물총에 존재하는 해당 박테리아 종 또는 균주의 CFU 수의 특정 분율일 수 있다. 미생물총은 장 또는 질 미생물총일 수 있다. 이러한 대상체는 인간 대상체일 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 약학 조성물 내 박테리아의 CFU 대 미생물총 내 이러한 박테리아의 CFU 수의 비는 약 1:10^4 내지 약 1:10, 약 1:10^3 내지 약 1:10, 약 1:10^2 내지 약 1:10, 또는 약 1:10 내지 약 5:1일 수 있다. 본 개시 내용의 특정 실시 양태에서, 이러한 비는 적어도 약 0.0001, 0.0002, 0.0005, 0.001, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.1, 1, 2, 3, 3.5, 4, 또는 5, 그러나 10 이하일 수 있다.
본원의 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 약학 조성물에 사용하기 위한 박테리아 컨소시엄은 약 5x10^8 CFU/mL의 임의의 박테리아 균주 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 및/또는 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 이러한 경우에, 박테리아 컨소시엄은 약 5x10^8 CFU/mL의 박테리아 균주 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 및 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)로 이루어질 수 있다.
하나 이상의 동결보호제를 포함할 수 있는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 이러한 동결보호제는 이러한 조성물이 예를 들어 운송 및/또는 사용 전 보관 동안 동결되거나 동결건조될 때 약학 조성물에서 박테리아 세포의 생존능을 유지하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 동결보호제는 글리세롤, 디메틸술폭시드(DMSO), 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 2-메틸-2,4-펜탄디올, 트레할로오스, 수크로오스, 디에틸 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 사카로오스, 포름아미드, 글리세롤 3-포스페이트, 프롤린, 메틸 알코올, 글루코오스, 소 혈청 알부민, 폴리비닐 알코올, 히드록시에틸 전분, 소르비톨, 또는 이들의 조합일 수 있다. 동결보호제는 결빙 방지제를 포함할 수 있다. 결빙 방지제는 폴리글리세롤, 폴리비닐 알코올, X-1000 및 Z-1000을 포함할 수 있다. 이러한 동결보호제는 예를 들어, 약학 조성물이 고체 제형(예를 들어, 캡슐 또는 정제) 또는 액체 제형(예를 들어, 현탁액 또는 겔)인지의 여부에 따라, 약 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30 부피 퍼센트(% v/v) 또는 중량 퍼센트(% w/w)의 양으로 약학 조성물에 사용될 수 있다. 동결보호제는 또한 탄수화물 또는 항산화제를 포함할 수 있다. 탄수화물은 트레할로오스, 수크로오스, 소르비톨, 글루코오스, 프룩토오스, 사카로오스, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 약학 조성물은 항산화제를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항산화제는 L-시스테인이다. 일부 실시 양태에서, L-시스테인은 중량 기준으로 약 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 5%, 10%, 0.001% 내지 0.005%, 0.0051% 내지 0.01%, 0.011% 내지 0.05%, 0.05% 내지 0.1%, 0.051% 내지 0.1%, 0.11% 내지 0.5%, 0.51% 내지 1%, 1.1% 내지 1.5%, 1.5% 내지 2%, 2.1% 내지 5%, 또는 5.1% 내지 10%의 양으로 존재한다. 사카로오스는 중량 기준으로 약 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 0.1% 내지 1%, 1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10 내지 15%, 15 내지 20%, 20 내지 25%, 25 내지 30%, 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 51 내지 61%, 52 내지 62%, 53 내지 63%, 54 내지 64%, 55 내지 65%, 56 내지 66%, 57 내지 67%, 58 내지 68%, 또는 59 내지 69%의 양으로 존재할 수 있다. 트레할로오스는 중량 기준으로 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 10.5%, 11%, 11.5%, 12%, 12.5%, 13%, 13.5%, 14%, 14.5%, 15%, 15.5%, 16%, 16.5%, 17%, 17.5%, 18%, 18.5%, 19%, 19.5%, 20%, 20.5%, 21%, 21.5%, 22%, 22.5%, 23%, 23.5%, 24%, 24.5%, 25%, 0.01% 내지 15%, 0.1% 내지 20%, 0.01% 내지 0.1%, 0.11% 내지 1%, 1 내지 11%, 2 내지 12%, 3 내지 13%, 4 내지 14%, 5 내지 15%, 6 내지 16%, 7 내지 17%, 8 내지 18%, 9 내지 19%, 10 내지 20%, 11 내지 21%, 12 내지 22%, 13 내지 23%, 14 내지 24%, 또는 15 내지 25%의 양으로 존재할 수 있다. 글리세롤은 부피 기준으로 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 1 내지 21%, 2 내지 22%, 3 내지 23%, 4 내지 24%, 5 내지 25%, 6 내지 26%, 7 내지 27%, 8 내지 28%, 9 내지 29%, 10 내지 30%, 11 내지 31%, 12 내지 32%, 13 내지 33%, 14 내지 34%, 15 내지 35%, 16 내지 36%, 17 내지 37%, 18 내지 38%, 19 내지 39%, 또는 20 내지 40%의 양으로 존재할 수 있다.
본원의 일부 실시 양태에서, 본원의 약학 조성물의 동결보호제는 글리세롤이다. 이러한 글리세롤은 표 1로부터 선택된 하나 이상, 2종 이상, 또는 3종 이상의 박테리아 균주의 박테리아 컨소시엄을 포함할 수 있는 약학 조성물에서 약 20% v/v의 양으로 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 박테리아 집단은 동결건조될 수 있다. 동결건조 공정은 박테리아 집단의 저온 탈수를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 동결건조 공정은 박테리아 집단을 저온 및 저압에서 적용하는 단계를 포함할 수 있다.
하나 이상의 항산화제를 포함할 수 있는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 이러한 항산화제는 약학 조성물에 존재할 수 있는 혐기성 박테리아 종 및/또는 균주(들)를 보호하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 하나 이상의 항산화제는 보관 및/또는 운송 동안 혐기 조건을 제공하고/하거나 반응성 산소 종으로부터 박테리아 세포를 보호하기 위해 사용될 수 있다. 본원의 일부 실시 양태에서, 항산화제는 아스코르브산, 디티오트레이톨, 글루타티온, 페놀산(예를 들어, 갈산, 프로토카테츄산, 카페산, 및 로즈마린산), 페놀성 디테르펜(예를 들어, 카르노솔 및 카르노스산), 플라보노이드(예를 들어, 퀘르세틴 및 카테킨), 휘발성 오일(예를 들어, 유제놀, 카바크롤, 티몰, 및 멘톨), α-토코페롤(예를 들어, 비타민 E), 트롤록스, 아스코르브산, 비타민 A, 비타민 C, 코엔자임 Q10, 망간, 요오드화물, 멜라토닌, 알파-카로틴, 아스타잔틴, 베타-카로틴, 칸타잔틴, 크립토잔틴, 루테인, 리코펜, 제아잔틴, 플라보노이드(예를 들어, 아피젠틴과 같은 플라본), 루테올린, 탄게이틴, 플라보놀, 이소르함네틴, 캠페롤, 미리세틴, 프로안토시아니딘, 퀘르세틴, 에리오딕티올, 헤스페레틴, 나린게닌, 카테킨, 갈로카테킨, 에피카테킨, 에피갈로카테킨, 테아플라빈, 테아루비긴, 이소플라본 식물성 에스트로겐, 다이드제인, 제니스테인, 글리시테인, 스틸베노이드, 예컨대 레스베라트롤, 프테로스틸벤, 안토시아닌, 시아니딘, 델피니딘, 말비딘, 펠라르고니딘, 페오니딘, 페투니딘, 치코르산, 클로로겐산, 신남산, 엘라그산, 엘라지탄닌, 갈산, 갈로탄닌, 로스마린산, 커큐민, 크산톤, 캡사이신, 빌리루빈, 시트르산, 옥살산, 피트산, N-아세틸시스테인, L-시스테인 , L-글루타메이트, L-프롤린, R-α-리포산, 안토시아닌, 구리, 크립토잔틴, 플라보노이드, 인돌, 이소플라보노이드, 리그난, 셀레늄, 아연, 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 하나 이상의 항산화제(들)는 약 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 또는 0.5% w/w의 양으로 약학 조성물에 존재할 수 있다. L-글루타메이트는 중량 기준으로 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4%, 4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 4.5%, 4.6%, 4.7%, 4.8%, 4.9%, 5%, 5.1%, 5.2%, 5.3%, 5.4%, 5.5%, 5.6%, 5.7%, 5.8%, 5.9%, 6%, 6.1%, 6.2%, 6.3%, 6.4%, 6.5%, 6.6%, 6.7%, 6.8%, 6.9%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1 내지 5%, 1.1 내지 5.1%, 1.2 내지 5.2%, 1.3 내지 5.3%, 1.4 내지 5.4%, 1.5 내지 5.5%, 1.6 내지 5.6%, 1.7 내지 5.7%, 1.8 내지 5.8%, 1.9 내지 5.9%, 2 내지 6%, 2.1 내지 6.1%, 2.2 내지 6.2%, 2.3 내지 6.3%, 2.4 내지 6.4%, 2.5 내지 6.5%, 2.6 내지 6.6%, 2.7 내지 6.7%, 2.8 내지 6.8%, 2.9 내지 6.9%, 3 내지 7%, 3.1 내지 7.1%, 3.2 내지 7.2%, 3.3 내지 7.3%, 3.4 내지 7.4%, 3.5 내지 7.5%, 3.6 내지 7.6%, 3.7 내지 7.7%, 3.8 내지 7.8%, 3.9 내지 7.9%, 또는 4 내지 8%의 양으로 존재할 수 있다. 일부 경우에, 동결보호제는 중량 기준으로 약 60% 사카로오스, 약 10% 트레할로오스, 약 1% L-시스테인, 및 약 4% L-글루타메이트를 포함할 수 있다.
수성 완충 용액을 포함할 수 있는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 이러한 수성 매질은 박테리아 세포의 주요 보관 및 운송 매질로 사용될 수 있다. 이와 같이, 완충액은 박테리아 컨소시엄, 동결보호제, 및 항산화제 중 임의의 하나 이상을 용해 또는 현탁하여 함유하여 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 수성 완충 용액은 인산 완충 식염수(PBS), HEPES, 또는 Tris 완충액, 임의의 다른 적합한 완충액, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 완충액은 PBS이고 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 및 1.8 mM KH2PO4를 포함한다. 다른 경우에, 완충액은 PBS일 수 있고 pH가 약 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9일 수 있다.
따라서, 본원의 일부 실시 양태에서, 약학 조성물은 약 5x10^8 CFU의 각각의 박테리아 균주 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187)로 이루어진 박테리아 컨소시엄, 동결보호제로서 약 20% v/v 글리세롤, 항산화제로서 0.1% w/w L-시스테인, 및 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 및 1.8 mM KH2PO4를 함유하는 PBS 완충액을 포함한다. 이러한 약학 조성물은 본원에 기재된 방법 및 조성을 사용하여 경구 투여 가능한 제형으로 제조 및 제제화될 수 있다.
대상체에게 투여하기 위해 제제화될 수 있는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 대상체는 인간 대상체일 수 있다. 투여는 비경구 투여 및 경구 투여를 포함할 수 있다. 비경구 투여는 다양한 비경구 경로, 예를 들어 좌제의 형태로 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 다른 경우에, 본원에 기재된 약학 조성물은 경구 제형으로 제제화될 수 있다. 이러한 경구 제형은 캡슐, 정제, 에멀젼, 현탁액, 시럽, 겔, 검, 페이스트, 허브 차, 점적제, 용해 과립, 분말, 정제, 동결건조물, 및 임의의 다른 적합한 경구 제형을 포함할 수 있다. 캡슐은 식물 유래 물질을 포함할 수 있다. 식물 유래 물질은 셀룰로오스계 중합체를 포함할 수 있다. 캡슐은 또한 젤라틴; 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC); 전분; 동물 기원 또는 셀룰로오스계의 가수분해 콜라겐(산, 알칼리, 효소, 또는 열 가수분해); 풀루란; 타피오카; 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 셀룰로오스계 중합체는 풀루란을 포함할 수 있다. 캡슐은 장용 코팅될 수 있다. 장용 코팅된 캡슐은 지방산, 왁스, 셸락, 플라스틱, 식물 섬유, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 캡슐은 크기가 빈 알약 캡슐 크기(Empty Pill Capsule Size) 000, 00, 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5일 수 있다. 캡슐은 전분 무함유, 글루텐 무함유, 및 방부제 무함유일 수 있다. 캡슐이 제제화되지 않은 아세트아미노펜으로 채워질 때 아세트아미노펜의 용해로 측정할 때 캡슐의 >90%는 물, pH = 1.2 용액, 아세트산나트륨 완충액 USP(pH = 4.5), 또는 인산나트륨 완충액(pH = 7.2)에 60분 이내에 용해된다. 캡슐은 탈이온수로 37℃에서 측정할 때 붕해 종말점이 약 1.6분일 수 있다. 캡슐은 탈이온수로 37℃에서 측정할 때 붕해 종말점이 약 0.1, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 3.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 또는 4분일 수 있다. 캡슐은 탈이온수로 37℃에서 측정할 때 붕해 종말점이 0.1 내지 0.5분, 0.51 내지 0.6분, 0.61 내지 0.7분, 0.71 내지 0.8분, 0.81 내지 0.9분, 0.91 내지 1분, 1.01 내지 1.1분, 1.11 내지 1.2분, 1.21 내지 1.3분, 1.31 내지 1.4분, 1.41 내지 1.5분, 1.51 내지 1.6분, 1.61 내지 1.7분, 1.71 내지 1.8분, 1.81 내지 1.9분, 1.91 내지 2분, 2.01 내지 2.1분, 2.11 내지 2.2분, 2.21 내지 2.3분, 2.31 내지 2.4분, 2.41 내지 2.5분, 2.51 내지 2.6분, 2.61 내지 2.7분, 2.71 내지 2.8분, 2.81 내지 2.9분, 2.91 내지 3분, 3.01 내지 3.1분, 3.11 내지 3.2분, 3.21 내지 3.3분, 3.31 내지 3.4분, 3.41 내지 3.5분, 3.51 내지 3.6분, 3.61 내지 3.7분, 3.71 내지 3.8분, 3.81 내지 3.9분, 또는 3.91 내지 4분일 수 있다. 캡슐은 캡슐 내의 기체 조성으로 측정할 때 산소 투과도(cm3/m2/일)가 ≤ 0.5일 수 있다. 캡슐은 캡슐 내의 기체 조성으로 측정할 때 산소 투과도(cm3/m2/일)가 ≤0.0001, ≤0.0005, ≤0.001, ≤0.005, ≤0.01, ≤0.05, ≤0.1, ≤0.5, ≤1, ≤1.5, ≤2, ≤5, 또는 ≤10일 수 있다.
동결될 수 있는 약학 조성물의 경구 제제가 본원에서 추가로 제공된다. 이러한 동결 제제는 인간 대상체와 같은 대상체에게 동결 상태로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 동결된 제제는 아이스 캔디, 아이스크림, 또는 기타 동결된 제제일 수 있다.
본원의 다양한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 약학 조성물은 대상체에게 경구 투여하기 위한 액체 현탁액일 수 있다. 이러한 액체 현탁액은 이러한 경구 제형의 단위 용량을 제공하기 위해 특정 부피로 분취될 수 있다. 이러한 단위 용량은 약 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 5, 또는 10 mL의 부피를 가질 수 있다. 일부 경우에, 본원의 약학 조성물의 단위 용량은 약 1 mL의 부피를 갖는다. 이러한 약학 조성물은 박테리아 컨소시엄, 동결보호제, 항산화제, 액체 세포 현탁액을 형성할 수 있는 수성 완충 용액을 포함할 수 있다. 이러한 세포 현탁액은 본원에 기재된 바와 같이 박테리아 균주당 특정 수의 대사 활성 세포를 함유하도록 보장하기 위해 품질 관리에 대해 테스트될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 대상체에 대한 경구 투여하기 위한 단위 용량으로 제제화된 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 이러한 경구 제제는 약 5x10^8 CFU의 각각의 박테리아 균주 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 약 20% v/v 글리세롤, 약 0.1% w/w L-시스테인, 및 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 및 1.8 mM KH2PO4를 함유하는 PBS 완충액을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 이러한 경구 제제는 약 1 mL의 총 부피를 가질 수 있다.
본원에 기재된 약학 조성물의 제조 방법이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 이러한 약학 조성물은 하나 이상의 박테리아 종 및/또는 균주를 포함하는 박테리아 컨소시엄을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 하나 이상의 박테리아 균주는 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 및/또는 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 약학 조성물의 제조는 여러 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계는 배양 배지 제조, 접종 및 배양, 박테리아 세포의 수거, 및 약학 조성물에 사용하기 위해 제조된 박테리아 균주 배치의 조합에 의한 박테리아 컨소시엄의 조립을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 제조 방법은 인간 대상체에서 임상적 사용을 위한 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
박테리아 컨소시엄을 제조하기 위한 본 개시 내용의 방법은 USP 등급 주사용수에 염, 비타민, 항산화제 등과 같은 다양한 건조 배지 성분을 용해시키는 단계를 포함할 수 있는 배지 제조를 포함할 수 있다. 완전히 용해된 후, 배지의 pH를 조정하여 각 박테리아 세포의 최적 성장을 보장할 수 있다. 그 다음 pH 조정된 배지를 생물안전 캐비닛으로 옮기고 멸균할 수 있다. 다양한 경우에, 본원의 미생물 컨소시엄은 하나 이상의 혐기성 박테리아 균주를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 배지는 대략 N2H2CO2(90:5:5)의 분위기를 포함하는 혐기 챔버로 옮겨 혐기성 박테리아를 접종하기 전에 환원시킬 수 있다.
본원의 제조 방법은 박테리아 균주/종의 스타터 배양물을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 여과된 배지를 포함하는 각 플라스크로부터 특정 부피를 사용하여 약학 조성물에 포함될 박테리아 균주에 대한 스타터 배양물을 생성하는 단계를 포함할 수 있고 이러한 부피를 멸균의 사전 환원된 스크류 캡 튜브로 옮긴 다음, 각 박테리아 세포를 포함하는 세포 은행의 스톡 용액을 사용한 해동된 박테리아 세포를 옮길 수 있다. 혐기성 박테리아 세포가 사용되는 경우, 스타터 배양물은 혐기 조건하에 약 37℃에서 약 12-16시간 동안 배양될 수 있다. 특정 인큐베이션 시간이 지나면, 스타터 배양물은 성장(탁도)에 대해 육안으로 검사할 수 있으며, 박테리아 성장이 확인되면 세포 확장을 위해 더 큰 추가 배양 플라스크로 옮길 수 있다. 약 12, 18, 24, 30시간 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지의 세포 밀도 및 흡광도를 측정할 수 있다. 이러한 측정은 흡광도가 지정된 OD600 범위 내에 속하도록 보장하기 위해 600 나노미터에서 세포 현탁액의 흡광도를 측정하여 수행할 수 있다. 이러한 OD600 값 또는 범위는 박테리아 균주에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 표 1에 나타낸 각각의 박테리아 균주는 특정 OD600 값 또는 범위를 가질 수 있다. 이러한 OD600 범위는 약 0.5 내지 약 1.5, 약 0.7 내지 약 1.3, 또는 약 0.9 내지 약 1.1일 수 있다. OD600 측정에 이어, 원심분리와 같은 다양한 기술을 사용하여 박테리아 세포를 수거할 수 있다.
일부 경우에, 세포 수거를 위해, 적절한 원심분리 매개변수를 선택할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 표 1에 열거된 임의의 박테리아 균주는 세포가 상등액으로부터 분리될 수 있도록 보장하기 위해 약 4℃에서 약 5,000-10,000 x g에서 약 20-60분 동안 회전을 포함하는 매개변수를 사용하여 수거할 수 있다. 원심분리 후, 생성된 세포 펠릿을 다시 혐기 환경(예를 들어, 혐기 챔버)으로 옮길 수 있고 청징화된 배양 상등액을 이러한 펠릿으로부터 예를 들어 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 완전히 제거할 수 있다. 그 다음 세포 펠릿은 농축되고 사전 환원된 동결보호 용액에 재현탁에 의해 합해질 수 있다. 일부 경우에, 이러한 현탁액은 성장 동안 세포 현탁액보다 약 20-40배 농축될 수 있고 사전 환원된 동결보호제 용액은 약 20% v/v 글리세롤 또는 다른 동결보호제를 포함할 수 있다. 그 다음 농축된 세포 현탁액을 사전 환원되고 사전 표시된 2 mL 스크류 캡 냉동 바이알에 분취하고 약 -70℃ 이하에서 사전 표시된 보관 상자로 옮길 수 있다. 이러한 박테리아 세포가 약학적 조성물에 사용될 수 있는 경우, 제조 약 3일 후에 규격 테스트를 수행하고 약 -70℃ 이하에서 초기 보관할 수 있다.
약학 조성물에 사용하기 위한 하나 이상의 종 및/또는 균주(들)의 세포 집단 또는 세포 배치의 제조 방법이 본원에서 제공된다. 다양한 경우에, 표 1에 나타낸 임의의 박테리아 균주가 본원에 기재된 제조 방법에 사용될 수 있다. 특정 경우에, 균주 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 및/또는 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)(표 2) 중 하나 이상을 사용하여 약학 조성물에 사용하기 위한 세포 배치를 제조할 수 있다. 이러한 경우에, 본 개시 내용은 이러한 세포 배치의 제조 방법을 제공하였다.
본원에 기재된 약학 조성물에 사용될 수 있는 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포 배치의 제조 방법이 본원에서 제공된다. 이러한 방법은 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포 배양 배지를 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 배양 배지는 vMRS 배지 또는 Boullion vMRS 브로스일 수 있다. 일부 경우에, 이러한 배양 배지는 HiMedia vMRS 브로스가 아니다. 이러한 배양 배지는 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 균주에 특이적일 수 있으며 vMRS 분말 및 인산이칼륨(K2HPO4)을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포를 성장 및 배양을 위한 배지는 약 250-300 g의 vMRS 분말 및 인산이칼륨(K2HPO4)을 포함할 수 있다. 특정 경우에, 이러한 배지는 약 273 g의 vMRS 분말 및 약 12.5 g의 인산이칼륨(K2HPO4) 및 약 4.9 L의 물을 포함할 수 있다. 이러한 vMRS 배지의 pH는 예를 들어, 5 M 염산 용액 또는 빙초산을 사용하여 약 6.5 ± 0.1로 조정될 수 있다. 그 다음 배지를 여과하고, 혐기 상태로 환원시키고, 예를 들어 스톡 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 용액을 함유하는 스타터 배양 튜브로 옮기고, 37℃에서 약 16-20시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 및 확장 후, 600 nm에서 세포 배양물의 흡광도를 측정하고 세포 현탁액의 흡광도가 약 0.8 내지 약 1.6, 바람직하게는 약 1.0 내지 1.4 범위 내에 있도록 보장하기 위해서 3회 반복할 수 있다. 배양 플라스크의 내용물을 원심분리하고, 잔류 세포 펠릿을 항산화제 및 20% v/v 글리세롤과 같은 동결보호제를 함유하는 25 mL의 멸균 PBS에 재현탁한 다음 합하여 균질한 세포 현탁액을 생성할 수 있다. 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포 현탁액은 최종 세포 농도를 달성하도록 예를 들어 냉동 바이알로 분취될 수 있다. 이러한 최종 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포 농도는 단위 용량당 약 5x10^8 내지 약 10^10 생존 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포일 수 있다. 이러한 단위 용량은 약 1 mL의 부피를 가질 수 있다. 이러한 경우에, 단위 용량은 약 5 x 10^8 생존 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 약학 조성물에 사용될 수 있는 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포 배치의 제조 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 이러한 방법은 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포 배양 배지를 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 배양 배지는 변형 NAGT 배지일 수 있다. 이러한 변형 NAGT 배지는 소이톤 또는 N-아세틸 글루코사민(NAG), 또는 소이톤과 NAG 둘 다를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 변형 NAGT 배지는 마그네슘, 칼슘, 글루코오스, 또는 이들의 조합을 함유하지 않을 수 있다. 일부 경우예, 변형 NAGT 배지는 개선된 세포 성장을 제공할 수 있다. 이러한 개선된 세포 성장은 비변형 NAGT 배지에서의 세포 성장과 비교하여 약 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상일 수 있다.
따라서, 일부 경우에, 이러한 NAGT 배양 배지는 에이. 뮤시니필라 균주(DSM 33213)에 대해 특이적일 수 있고 다음 성분 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다: 소이톤, 완두 펩톤, 효모 추출물, 중탄산나트륨(NaHCO3), 이염기성 인산칼륨(K2HPO4), 염화나트륨(NaCl), 황산마그네슘(예를 들어, MgSO4 x 7 H2O), 염화칼슘(CaCl2), 글루코오스, N-아세틸글루코사민, L-트레오닌, 및/또는 L-시스테인. 이러한 경우에, 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포의 성장 및 배양을 위한 변형 NAGT 배지 약 5 L의 부피는 약 75 g 내지 약 100 g의 SOLABIA 완두 펩톤, 약 75 g 내지 약 85 g의 Difco™ Select 소이톤, 약 10 g 내지 약 15 g의 Bacto™ 효모 추출물, 약 2 g 내지 약 8 g의 중탄산나트륨(NaHCO3), 약 10 g 내지 약 15 g의 이염기성 인산칼륨(K2HPO4), 0.5 g 내지 약 5 g의 염화나트륨(NaCl), 약 0.5 g 내지 약 5 g의 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O), 약 0.5 g 내지 약 5 g의 염화칼슘(CaCl2), 약 20 g 내지 약 25 g의 글루코오스(덱스트로스), 약 25 g 내지 약 30 g의 N-아세틸글루코사민, 약 15 g 내지 약 25 g의 L-트레오닌, 및/또는 약 2 g 내지 약 8 g의 L-시스테인을 포함할 수 있다. 한 예에서, 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포의 성장 및 배양을 위한 변형 NAGT 배지 약 5 L의 부피는 약 82.5 g의 SOLABIA 완두 펩톤, 82.5 g의 Difco™ Select 소이톤, 약 12.5 g의 Bacto™ 효모 추출물, 약 5 g의 중탄산나트륨(NaHCO3), 약 12.5 g의 이염기성 인산칼륨(K2HPO4), 약 1.5 g의 염화나트륨(NaCl), 약 0.5 g의 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O), 약 0.5 g의 염화칼슘(CaCl2), 약 22.6 g의 글루코오스(덱스트로스), 약 27.7 g의 N-아세틸글루코사민, 약 20 g의 L-트레오닌, 및/또는 약 5 g의 L-시스테인을 포함할 수 있다.
이러한 NAGT 배지의 pH는 예를 들어 5M 염산 용액을 사용하여 예를 들어 약 6.5 ± 0.1로 조정될 수 있다. 이러한 NAGT 배지의 pH는 또한 약 7로 조정될 수 있다. 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 박테리아 세포는 이러한 NAGT 배양 배지를 함유하는 제조된 바이알에 첨가될 수 있다. 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 균주에 대해 특이적일 수 있는 기간 동안 인큐베이션한 후, 600 nm에서 세포 배양물의 흡광도를 측정하고 기록하여 흡광도 값이 약 0.5 내지 약 1.2, 바람직하게는 약 0.7 내지 1.1이 되도록 할 수 있다. 그 다음 배양 플라스크의 내용물을 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 잔류 세포 펠릿을 항산화제 및 20% v/v 글리세롤과 같은 동결 방지제를 함유하는 멸균 PBS에 재현탁할 수 있다. 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포 현탁액을 냉동 바이알에 분취하여 단위 용량당 약 5 x 10^8 내지 약 10^10 생존 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포의 최종 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포 농도를 달성할 수 있다. 이러한 단위 용량은 약 1 mL의 부피를 가질 수 있다. 이러한 경우에, 단위 용량은 약 5 x 10^8 생존 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 약학 조성물의 박테리아 컨소시엄에서 사용될 수 있는 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포 배치의 제조 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 이러한 방법은 완전한 비타민 믹스 용액(예를 들어, YFAP 비타민 믹스), 및 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포 배양 배지를 제조하는 단계를 포함할 수 있다. YFAP 비타민 믹스는 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 균주에 특이적일 수 있으며 비오틴, 코발라민, p-아미노벤조산, 엽산, 피리독사민, 티아민, 및/또는 리보플라빈 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 1 L 부피의 YFAP 비타민 믹스는 약 10 mg의 비오틴, 약 10 mg의 코발라민, 약 30 mg의 p-아미노벤조산, 약 50 mg의 엽산, 약 150 mg의 피리독사민, 약 50 mg의 티아민, 및 약 50 mg의 리보플라빈을 포함할 수 있다. 모든 배지 성분을 용해하여 투명하고 고체 및 침전물이 없는 용액을 생성할 수 있다. YFAP 비타민 믹스 배지는 아래 기재된 바와 같이 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 배양 배지에서 사용하기 위해 여과 및 멸균될 수 있다.
이러한 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 배양 배지는 BBL™ Phytone 펩톤, SOLABIA 완두 펩톤, Difco™ Select 소이톤, Bacto™ 효모 추출물, 중탄산나트륨(NaHCO3), 이염기성 인산칼륨(K2HPO4), 염화나트륨(NaCl), 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O), 아세트산나트륨(NaOAc), 글루코오스(덱스트로스), 프로피온산나트륨, L-시스테인, 및/또는 YFAP 비타민 믹스 용액(예를 들어, 상기에 기재된 바와 같이 제조됨) 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 제조될 수 있다. 이러한 경우에, 약 5 L 부피의 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 배양 배지는 약 75 g 내지 100 g의 SOLABIA 완두 펩톤, 약 45 g 내지 약 55 g의 BBL™ Phytone 펩톤, 약 45 g 내지 약 55 g의 Difco™ Select 소이톤, 약 20 g 내지 약 30 g의 Bacto™ 효모 추출물, 약 2 g 내지 약 8 g의 중탄산나트륨(NaHCO3), 약 10 g 내지 약 15 g의 이염기성 인산칼륨(K2HPO4), 약 2 g 내지 약 8 g의 염화나트륨, 약 0.5 g 내지 약 2 g의 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O), 약 20 g 내지 약 30 g의 아세트산나트륨(NaOAc), 약 40 g 내지 약 60 g의 글루코오스(덱스트로스), 약 2 g 내지 약 8 g의 프로피온산나트륨, 약 2 g 내지 약 8 g의 L-시스테인, 및 약 0.5 내지 약 3 mL의 YFAP 비타민 믹스 용액(예를 들어, 상기에 기재된 바와 같이 제조됨)을 포함할 수 있다. 따라서, 한 예에서, 약 5 L 부피의 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 배양 배지는 약 100 g의 SOLABIA 완두 펩톤, 50 g의 BBL™ Phytone 펩톤, 약 50 g의 Difco™ Select 소이톤, 약 25 g의 Bacto™ 효모 추출물, 약 5 g의 중탄산나트륨(NaHCO3), 약 12.5 g의 이염기성 인산칼륨(K2HPO4), 약 5 g의 염화나트륨, 약 1 g의 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O), 약 25 g의 아세트산나트륨(NaOAc), 약 50 g의 글루코오스(덱스트로스), 약 5 g의 프로피온산나트륨, 약 5 g의 L-시스테인, 및 약 1 mL의 YFAP 비타민 믹스 용액(예를 들어, 상기에 기재된 바와 같이 제조됨)을 포함할 수 있다.
에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 배양 배지, YFAP-NU는 또한 완두 펩톤, NuCel® 783 효모 추출물, 중탄산나트륨(NaHCO3), 이염기성 인산칼륨(K2HPO4), 염화나트륨(NaCl), 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O), 아세트산나트륨(NaOAc), 글루코오스(덱스트로스), L-시스테인, 및/또는 코발라민 중 임의의 하나 이상을 포함하도록 제조될 수 있다. 이러한 경우에, 약 5 L 부피의 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 배양 배지는 약 75 g 내지 100 g 완두 펩톤, 약 50 g NuCel® 783 효모 추출물, 5 g 중탄산나트륨(NaHCO3), 약 12.5 g 이염기성 인산칼륨(K2HPO4), 약 5 g염화나트륨(NaCl), 약 1 g 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O), 약 25 g 아세트산나트륨(NaOAc), 약 50 g 글루코오스(덱스트로스), 약 5 g L-시스테인, 및 약 5 g 코발라민을 포함할 수 있다.
이러한 세포 배지의 pH는 예를 들어 빙초산을 사용하여 약 6.5 ± 0.1로 조정될 수 있다. 이러한 pH는 사용되는 박테리아 균주에 따라 약 6.2 내지 약 6.8로 다양할 수 있다. 일부 경우에, 세포 배지의 pH는 조절되지 않을 수 있다. 이러한 pH는 약 4.5 내지 약 7.5로 다양할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이러한 배지의 pH는 약 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5일 수 있다. 혐기 상태로 환원 후, 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 스타터 배양물은 특정 부피의 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 스톡 용액, 예를 들어, 약 500 ㎕의 세포 은행 스톡 용액을 환원된 배양 배지를 함유하는 스타터 배양 튜브에 첨가한 후 37℃에서 약 12-16시간 동안 인큐베이션하여 제조할 수 있다. 스타터 배양물을 확장한 후(예를 들어, 추가로 약 12-24시간의 인큐베이션 후), 600 nm에서 세포 배양물의 흡광도를 측정하고 흡광도가 특정 범위에 있도록 보장하기 위해 3회 반복할 수 있다. 이러한 흡광도 범위는 약 1.2 내지 약 2.0, 바람직하게는 약 1.4 내지 약 1.8일 수 있다. 그 다음 배양 플라스크를 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 잔류 세포 펠릿을 멸균 PBS에 재현탁하여 균질한 용액을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포 현탁액을 냉동 바이알(예를 들어, 2 mL 냉동 바이알)로 분취하여 단위 용량당 약 5 x 10^8 내지 약 10^8 생존 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포의 최종 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포 농도를 달성할 수 있다. 이러한 단위 용량은 약 1 mL의 부피를 가질 수 있다. 이러한 경우에, 이러한 단위 용량은 약 5 x 10^8 생존 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포를 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 또한 약학 조성물에 사용하기 위한 박테리아 컨소시엄에 포함될 균주의 하나 이상의 세포 배치를 조립하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 경우에, 이러한 방법은 표 1의 하나 이상의 박테리아 균주의 세포 집단을 조립하는 단계를 포함한다. 이러한 경우에, 균주 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 및 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 중 임의의 하나 이상에 대해 제조된 세포 배치를 조합하여 약학 조성물에 사용하기 위한 박테리아 컨소시엄을 형성할 수 있다.
이러한 방법은 박테리아 균주의 각 세포 집단에서 대사 활성 세포 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 약학 조성물의 박테리아 컨소시엄이 3종의 박테리아 균주 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 및 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)를 포함하거나 이로 이루어진 경우, 각각의 제조된 세포 배치에서 대사 활성 박테리아 세포 수를 결정할 수 있다. 이러한 측정은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 본원에 기재된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 측정에서 얻은 정보를 사용하여 박테리아 균주(예를 들어, 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 및/또는 에프. 프라우스니치이(DSM 33185))의 주어진 배치로부터 제조할 수 있는 단위 용량의 양을 결정할 수 있다. 예를 들어, 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 배치에서 제조할 수 있는 단위 용량의 양은 다음과 같이 결정할 수 있다: 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 배치의 잠재적인 용량 수 = ((엘. 크리스파투스(DSM 33187) 평균 효능(CFU/mL)) X (엘. 크리스파투스(DSM 33187) 배치 부피(mL))/(4 x 10^8 CFU/용량).
따라서, 일부 실시 양태에서, 본원의 약학 조성물의 박테리아 컨소시엄은 박테리아 종 또는 균주당 약 5x10^8 CFU를 포함할 수 있다. 각 균주에서 생성될 수 있는 잠재적인 단위 용량 수가 계산되면, 각각의 균주의 세포를 포함하는 각각의 바이알을 냉동고에서 꺼내 진행하기 전에 대기실에서 사전 환원시키도록 할 수 있다. 환원 및 해동 후, 각 균주에 대해 계산된 세포 현탁액 부피의 양을 1 L 유리병으로 옮기고 PBS와 같은 완충액을 사용하여 부피를 증가시켜 밀리리터당 계산된 세포 농도에 도달할 수 있다. 일부 경우에, 이렇게 계산된 농도는 약 5x10^8 CFU/박테리아 종/약학 조성물 mL일 수 있다. 생성된 균질한 현탁액은 냉동 바이알을 사용하여 단위 용량으로 분취될 수 있으며 대상체에게 투여하는 것과 같이 추가 사용까지 -80℃에서 보관할 수 있다.
본원에 제공된 박테리아 컨소시엄의 제조 방법은 각각의 조성물 내의 박테리아 균주의 세포가 생존 가능하고 정확한 균주(들)에 상응하도록 보장하기 위해 품질 관리를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 품질 관리 방법에서, 각각의 균주 배치에 대해 다양한 매개변수, 테스트 방법 및 규격을 평가할 수 있다. 이러한 평가는 약학 조성물을 대상체에게 투여하기 전에 수행될 수 있다. 예시적인 품질 관리 매개변수는 (i) 박테리아 균주(들)의 농도, 및 (ii) 콜로니 성장의 육안 검사에 의한 형태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포 콜로니의 형태는 원형, 전체 가장자리, 편평, 작은-중간 크기, 크림-황갈색을 포함할 수 있고, 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포 콜로니의 형태는 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포에 대해 원형, 전체 가장자리, 융기, 점형 크기, 불투명-반투명을 포함할 수 있고, 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포 콜로니의 형태는 원형, 전체 가장자리, 융기, 작은-중간 크기, 흰색-크림색을 포함할 수 있다.
약학 조성물의 보관 및/또는 운송을 허용하도록 설계 및 제조될 수 있는 약학 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 박테리아 컨소시엄을 포함하는 본원의 약학 조성물은 약학 조성물 내의 박테리아 세포의 생존능이 보관 및/또는 운송에 의해 영향을 받지 않거나 최소한으로만 영향을 받도록 설계될 수 있다. 이러한 경우에, 약학 조성물 내의 박테리아 세포의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 생존능이 보관 및/또는 운송 동안 유지된다.
일부 경우에, 본원의 약학 조성물은 박테리아 세포의 생존능을 보존하기 위해 약 -70℃ 또는 -80℃의 저온에서 보관을 허용하는 동결보호제를 포함한다. 이러한 경우에, 약학 조성물은 동결보호제로서 약 20% v/v 글리세롤을 포함할 수 있다. 본원의 약학 조성물은 보관 또는 운송 바이알에서 혐기 환경을 보존할 수 있고 활성 산소 종으로부터 박테리아 세포를 보호할 수 있는 항산화제를 추가로 포함할 수 있다.
한 예에서, 본원의 약학 조성물에서, 생존 영양(vegetative) 박테리아는 20% v/v 글리세롤 및 0.1% w/w 시스테인을 포함한 인산 완충 식염수(PBS)에서 동결 보존하여 생존능을 보존할 수 있다. 이러한 경우에, 생존 박테리아는 표 1에 제시된 균주 중 임의의 하나 이상에 속할 수 있다.
본 개시 내용은 본원에 기재된 약학 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 용기 및 키트를 제공한다. 본 개시 내용은 약학 조성물을 포함하는 이러한 용기 및 키트를 사용하도록 사용자(예를 들어, 인간 사용자)를 지시할 수 있는 지침을 추가로 제공한다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 약학 조성물은 용기에 존재한다. 용기는 본 개시 내용의 약학 조성물을 배양, 보관, 운송, 분취, 및/또는 투여하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 용기는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 데 사용될 수 있다. 한 예에서, 용기는 냉동 바이알이고 인간 대상체에게 약학 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 용기는 또한 박테리아 집단, 예를 들어 하나 이상의 혐기성 박테리아 세포를 포함하는 집단의 배양, 운송, 및/또는 보관(예를 들어, 냉각 또는 냉동 보관)에 적합한 조건을 제공할 수 있다. 이러한 혐기성 박테리아 세포는 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및/또는 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 용기는 박테리아 세포의 생존능을 보존하기 위해 약학 조성물의 배양, 운송 및/또는 보관 동안 특정 산소 함량 또는 농도를 제공하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본원의 용기는 약학 조성물에서 박테리아 세포의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 생존능을 보존할 수 있다. 일부 경우에, 용기는 적어도 약 1주, 2주, 4주, 8주, 또는 12주 동안 박테리아 세포의 약 95%의 생존능을 보존할 수 있다. 용기는 이러한 약학 조성물을 대상체에게 투여하기 위한 적절한 부피, 양, 및 투약 일정을 제공하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 용기 또는 이러한 용기를 포함하는 키트는 인간 대상체에 의한 자가 투여를 위해 설계될 수 있다. 이러한 자가 투여에 대한 지침은 사용자 지침으로 제공될 수 있으며 본원에 기재된 키트의 일부일 수 있다. 다양한 경우에, 이러한 지침은 서면 지침 또는 구두 지침, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 약학 조성물은 용기에 존재한다. 용기는 2 mL 폴리프로필렌 스크류 캡 바이알을 포함할 수 있다. 바이알은 단회 용량 바이알 또는 다회 용량 바이알일 수 있다. 일부 경우에, 용기는 고리형 올레핀 공중합체(COC), 고리형 올레핀 중합체(COP), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌(HDPE), 에틸렌-비닐 알코올(EVOH)계 재료, 유리, 플라스틱 튜브, 병, 알루미늄 튜브, 디스펜서 튜브, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수도 있다. 바이알의 부피는 1/50, 1/10, 1/5, 1/3, ½, 5/8, 1, 2, 3, 4, 8, 11, 13, 16, 20, 30, 40, 50 DRAM일 수 있다. 바이알의 부피는 또한 0.01 ml, 0.05 ml, 0.1 ml, 0.2 ml, 0.3 ml, 0.4 ml, 0.5 ml, 0.6 ml, 0.7 ml, 0.8 ml, 0.9 ml, 1 ml, 1.1 ml, 1.2 ml, 1.3 ml, 1.4 ml, 1.5 ml, 1.6 ml, 1.7 ml, 1.8 ml, 1.9 ml, 2 ml, 2.1 ml, 2.2 ml, 2.3 ml, 2.4 ml, 2.5 ml, 2.6 ml, 2.7 ml, 2.8 ml, 2.9 ml, 3 ml, 3.1 ml, 3.2 ml, 3.3 ml, 3.4 ml, 3.5 ml, 3.6 ml, 3.7 ml, 3.8 ml, 3.9 ml, 4 ml, 4.1 ml, 4.2 ml, 4.3 ml, 4.4 ml, 4.5 ml, 4.6 ml, 4.7 ml, 4.8 ml, 4.9 ml, 5 ml, 5.1 ml, 5.2 ml, 5.3 ml, 5.4 ml, 5.5 ml, 5.6 ml, 5.7 ml, 5.8 ml, 5.9 ml, 6 ml, 6.1 ml, 6.2 ml, 6.3 ml, 6.4 ml, 6.5 ml, 6.6 ml, 6.7 ml, 6.8 ml, 6.9 ml, 7 ml, 7.1 ml, 7.2 ml, 7.3 ml, 7.4 ml, 7.5 ml, 7.6 ml, 7.7 ml, 7.8 ml, 7.9 ml, 8 ml, 8.1 ml, 8.2 ml, 8.3 ml, 8.4 ml, 8.5 ml, 8.6 ml, 8.7 ml, 8.8 ml, 8.9 ml, 9 ml, 9.1 ml, 9.2 ml, 9.3 ml, 9.4 ml, 9.5 ml, 9.6 ml, 9.7 ml, 9.8 ml, 9.9 ml, 또는 10 ml일 수 있다. 바이알의 부피는 또한 0.01 내지 0.1 ml, 0.11 내지 1 ml, 1.1 내지 1.11, 1.11 내지 1.2, 1.21 내지 1.3, 1.31 내지 1.4, 1.41 내지 1.5, 1.51 내지 1.6, 1.61 내지 1.7, 1.71 내지 1.8, 1.81 내지 1.9, 1.91 내지 2, 2.01 내지 2.1, 2.11 내지 2.2, 2.21 내지 2.3, 2.31 내지 2.4, 2.41 내지 2.5, 2.51 내지 2.6, 2.61 내지 2.7, 2.71 내지 2.8, 2.81 내지 2.9, 2.91 내지 3, 3.01 내지 3.1, 3.11 내지 3.2, 3.21 내지 3.3, 3.31 내지 3.4, 3.41 내지 3.5, 3.51 내지 3.6, 3.61 내지 3.7, 3.71 내지 3.8, 3.81 내지 3.9, 3.91 내지 4, 4.01 내지 4.1, 4.11 내지 4.2, 4.21 내지 4.3, 4.31 내지 4.4, 4.41 내지 4.5, 4.51 내지 4.6, 4.61 내지 4.7, 4.71 내지 4.8, 4.81 내지 4.9, 4.91 내지 5, 5.01 내지 5.1, 5.11 내지 5.2, 5.21 내지 5.3, 5.31 내지 5.4, 5.41 내지 5.5, 5.51 내지 5.6, 5.61 내지 5.7, 5.71 내지 5.8, 5.81 내지 5.9, 5.91 내지 6, 6.01 내지 6.1, 6.11 내지 6.2 ml, 6.21 내지 6.3 ml, 6.31 내지 6.4 ml, 6.41 내지 6.5 ml, 6.51 내지 6.6 ml, 6.61 내지 6.7 ml, 6.71 내지 6.8 ml, 6.81 내지 6.9 ml, 6.91 내지 7 ml, 7.01 내지 7.1 ml, 7.11 내지 7.2 ml, 7.21 내지 7.3 ml, 7.31 내지 7.4 ml, 7.41 내지 7.5 ml, 7.51 내지 7.6 ml, 7.61 내지 7.7 ml, 7.71 내지 7.8 ml, 7.81 내지 7.9 ml, 7.91 내지 8 ml, 8.01 내지 8.1 ml, 8.11 내지 8.2 ml, 8.21 내지 8.3 ml, 8.31 내지 8.4 ml, 8.41 내지 8.5 ml, 8.51 내지 8.6 ml, 8.61 내지 8.7 ml, 8.71 내지 8.8 ml, 8.81 내지 8.9 ml, 8.91 내지 9 ml, 9.01 내지 9.1 ml, 9.11 내지 9.2 ml, 9.21 내지 9.3 ml, 9.31 내지 9.4 ml, 9.41 내지 9.5 ml, 9.51 내지 9.6 ml, 9.61 내지 9.7 ml, 9.71 내지 9.8 ml, 9.81 내지 9.9 ml, 또는 9.91 내지 10 ml일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본원에 기재된 약학 조성물은 동결건조되거나 동결된다. 동결건조 또는 동결된 약학 조성물의 박테리아 세포는 -70℃에서 보관될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 박테리아 세포는 10℃, 4℃, 0℃, -5℃, -10℃, -15℃, -20℃, -25℃, -30℃, -35℃, -40℃, -45℃, -50℃, -55℃, -60℃, -65℃, -70℃, -75℃, 또는 -80℃에서 보관될 수 있다. 다른 경우에, 박테리아 세포는 또한 -80℃ 내지 -70℃, -70℃ 내지 -60℃, -60℃ 내지 -50℃, -50℃ 내지 -40℃, -40℃ 내지 -30℃, -30℃ 내지 -20℃, -20℃ 내지 -10℃, -10℃ 내지 0℃, 또는 0℃ 내지 10℃에서 보관될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 보관된 동결건조 또는 동결된 박테리아 세포의 적어도 70%는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월, 26개월, 27개월, 28개월, 29개월, 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 또는 36개월 후에 생존 가능한 상태를 유지할 수 있다. 일부 경우에, 보관된 동결건조 또는 동결된 박테리아 세포의 적어도 75%는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월, 26개월, 27개월, 28개월, 29개월, 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 또는 36개월 후에 생존 가능한 상태를 유지할 수 있다. 일부 경우에, 보관된 동결건조 또는 동결된 박테리아 세포의 적어도 80%는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월, 26개월, 27개월, 28개월, 29개월, 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 또는 36개월 후에 생존 가능한 상태를 유지할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 보관된 동결건조 또는 동결된 박테리아 세포의 적어도 85%는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월, 26개월, 27개월, 28개월, 29개월, 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 또는 36개월 후에 생존 가능한 상태를 유지할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 보관된 동결건조 또는 동결된 박테리아 세포의 적어도 90%는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월, 26개월, 27개월, 28개월, 29개월, 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 또는 36개월 후에 생존 가능한 상태를 유지할 수 있다. 보관된 동결건조 또는 동결된 박테리아 세포의 적어도 95%는 또한 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월, 26개월, 27개월, 28개월, 29개월, 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 또는 36개월 후에 생존 가능한 상태를 유지할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 보관된 동결건조 또는 동결된 박테리아 세포의 적어도 99%는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 25개월, 26개월, 27개월, 28개월, 29개월, 30개월, 31개월, 32개월, 33개월, 34개월, 35개월, 또는 36개월 후에 생존 가능한 상태를 유지할 수 있다.
본 개시 내용의 키트는 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 사용하기 위한 다양한 성분을 제공할 수 있다. 이러한 구성요소는 용기(들), 테스트 샘플(들), 및/또는 약학 조성물, 예를 들어, 그의 생존능, 보관 매질의 pH 등을 분석하기 위한 장비를 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시 내용의 키트는 약학 조성물의 사용자 친화적이고, 정확하고, 신뢰할 수 있는 사용(투약, 투여, 보관, 운송을 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 허용할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약학 조성물은 표 2에 제시된 박테리아 균주 중 임의의 하나 이상을 포함하는 미생물 컨소시엄을 포함한다. 이러한 경우에, 키트는 표 1의 적어도 하나, 적어도 2종, 또는 모든 균주를 포함하는 약학 조성물을 포함할 수 있다.
치료 방법
본 개시 내용은 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 본원에 기재된 약학 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 질환에는 염증성 질환, 대사성 질환, 또는 자가면역 질환이 포함될 수 있다. 이러한 질환은 대상체의 세균 불균형(dysbiosis) 또는 세균 불균형 관련 병태, 또는 알레르기성 유형 I 과민증의 결과일 수 있다. 이러한 질환은 또한 알레르기성 유형 II 과민증, 알레르기성 유형 III 과민증, 또는 알레르기성 유형 IV 과민증을 포함할 수 있다. 이러한 세균 불균형은 대상체의 장내 미생물총의 세균 불균형일 수 있다. 일부 경우에, 염증성 질환은 알레르기이다. 다른 경우에, 염증성 질환은 피부염이다. 이러한 알레르기는 알레르기성 소아 천식을 비롯한 알레르기성 천식, 및 식품 알레르기일 수 있다. 이러한 대사성 질환에는 비만, 당뇨병, 또는 대사 증후군이 포함될 수 있다.
따라서, 일부 경우에, 본원에 기재된 약학 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 제제화될 수 있으며, 여기서 이러한 대상체는 알레르기를 가질 수 있거나 알레르기를 갖는 것으로 의심될 수 있다. 이러한 대상체는 예를 들어 2개 이상의 알레르겐에 다중 민감화될 수 있다. 이러한 대상체는 포유동물일 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 인간이다. 이러한 약학 조성물은 설치류 또는 인간과 같은 대상체에게 투여되는 경우 염증성 질환의 예방 및/또는 치료에 유용한 항염증 효과(들)를 가질 수 있다. 일부 경우에, 이러한 항염증 효과(들)는 약학 조성물이 경구 투여될 때 유발될 수 있다.
일부 경우에, 본원의 약학 조성물을 사용하여 치료되는 대상체는 인간이다. 인간 대상체는 신생아, 영아, 유아, 어린이, 청소년, 또는 성인일 수 있다. 일부 경우에, 신생아는 약 3일 미만, 약 1주 미만, 약 2주 미만, 약 3주 미만, 약 4주 미만, 약 8주 미만일 수 있다. 일부 경우에, 영아는 약 2개월 이상, 약 6개월 이상, 약 12개월 이상일 수 있다. 일부 경우에, 약학 조성물은 약 2세 내지 약 18세일 수 있거나, 약 18세 이상일 수 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 대상체는 2세 내지 18세일 수 있거나, 18세 이상일 수 있다. 대상체는 약 2세 내지 약 18세일 수 있거나, 약 18세 이상(예를 들어, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90세)이다. 일부 경우에, 대상체는 약 2세 내지 약 18세, 또는 약 19세일 수 있다. 대상체는 약 2세 내지 약 18세, 또는 약 19세일 수 있다. 대상체는 약 2세 내지 약 18세, 또는 약 20세일 수 있다. 대상체는 약 2세 내지 약 18세, 또는 약 20세일 수 있다. 대상체는 약 2세 내지 약 18세, 또는 약 25세일 수 있다. 대상체는 약 2세 내지 약 18세, 또는 약 25세일 수 있다. 대상체는 약 2세 내지 약 18세, 또는 약 30세, 또는 그 이상일 수 있다. 대상체는 약 2세 내지 약 18세, 또는 약 30세일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 대상체는 약 18세 내지 약 40세, 약 12세 내지 약 17세, 및/또는 약 2세 내지 약 11세이다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해 모유, 조제분유(영아 수유용), 또는 식품과 혼합될 수 있다.
본원의 약학 조성물은 상이한 투여 일정에 따라 다양한 기간 동안 투여될 수 있다. 치료 기간은 대상체와 개인 간에 다양할 수 있고 본원에 기재된 바와 같은 다양한 인자, 예를 들어 질환 상태, 연령 등에 결정될 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 약 1일 내지 적어도 약 1주일 동안, 약 일주일 내지 약 1개월 동안, 또는 약 1개월 내지 약 1년 동안 치료될 수 있다. 이러한 경우에, 대상체는 약 1개월, 2개월, 또는 3개월 동안 치료될 수 있다. 일부 경우에, 치료는 연속적인 일, 연속적인 주 및/또는 연속적인 달에 수행될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 약학 조성물은 연속 약 28, 29, 또는 30일 동안 투여된다.
본원의 치료 방법은 본 개시 내용의 약학 조성물을 1일 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 또는 12회 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 경우에, 본 개시 내용의 약학 조성물은 1일 2회 투여된다. 이러한 1일 2회 투여는 아침과 저녁에 수행될 수 있다. 이러한 경우, 주어진 날의 첫 번째 투여와 두 번째 투여 사이에 약 8, 12, 또는 16시간의 간격이 있을 수 있다.
본원의 다양한 실시 양태에서, 알레르기와 같은 염증성 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 인간 대상체에게 투여되는 약학 조성물은 표 1에 열거된 박테리아 균주 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및/또는 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 중 적어도 하나를 포함한다. 이러한 약학 조성물은 2-11, 12-17, 및 18-40세의 그룹 대상체(예를 들어, 약 10, 20 또는 40명의 대상체)에게 연속 약 28일 동안 1일 2회 투여될 수 있다. 이러한 경우에, 이러한 약학 조성물은 액체 현탁액으로서 1 mL 단위 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 단위 용량은 투여를 위해 차거나 실온의 식품 및 음료에 첨가될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시 양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시 양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 많은 변형, 변경, 및 대체는 본 발명을 벗어남이 없이 당업자에게 발생할 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 실시 양태에 대한 다양한 대안이 이용될 수 있음을 이해해야 한다.
실시예
이 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며 본원에 제공된 청구항의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1: 박테리아 균주의 배양, 단리, 및 특성화
인간 샘플로부터 단리된 박테리아 균주의 배양, 단리, 및 특성화 방법이 본원에서 제공된다. 이러한 균주는 본원에 기재된 박테리아 컨소시엄의 일부로서 사용될 수 있다.
1. 박테리아의 배양
일반적으로, 절대 및 조건 혐기성 박테리아 균주를 배양하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 박테리아를 배양하기 위한 절차를 사용할 수 있다. 이 실시예에서 박테리아 균주는 인간 대변 샘플로부터 유래하였으며 선택적 배지에서 배양하였다. 계대 배양 시, 콜로니를 액체 배지로 옮기고 후속적으로 PCR 및 시퀀싱을 위해 제조하였다. 콜로니는 또한 글리세롤 스톡으로 보존하였다.
먼저, 인간 대변 샘플을 혐기 운송 매질(Anaerobic Systems As-915) 또는 혐기 대기 생성 시스템(예를 들어, AnaeroPouch Thermo Fisher R686001)을 포함하는 플라스틱 백 내에 밀봉된 대변 수집 바이알에 수집하였다. 모든 샘플은 혐기성 균주의 생존능을 보장하기 위해 운송 시간과 잠재적인 산소 노출을 최소화하기 위해 즉시 혐기 챔버로 옮겼다.
0.9 mL의 PBS+Cys(1xPBS + 0.1% w/w L-시스테인)를 13개의 튜브(부피 1.5 mL)에 분취하여 연속 희석 튜브를 제조하였다. 일회용 주걱 또는 루프를 사용하여 20-30 mg의 샘플을 0.9 mL의 PBS+Cys를 함유하는 첫 번째 1.5 mL 튜브로 옮겼다. 생성된 혼합물을 약 30초 동안 볼텍싱하고 생성된 균질한 용액 0.1 mL를 0.9 mL의 PBS+Cys를 함유하는 두 번째 1.5 mL 튜브로 옮겼다. 그 다음 13개의 모든 튜브가 샘플의 연속 희석액(예를 들어, 바이알 1-13에 1-10^-12 희석)을 함유할 때까지 이 단계를 반복하였다.
일회용 하키 스틱 스프레더를 사용하여, 희석액 10^-5 내지 10^-12(바이알 6-13)를 함유하는 샘플 튜브로부터 ~0.1 mL를 선택적 한천 배양 배지를 함유하는 별도의 한천 플레이트에 첨가하였다. 그 다음 한천 플레이트를 파라필름으로 밀봉하여 증발을 방지하고 37℃에서 72시간 동안 인큐베이터에 두었다. 콜로니(예를 들어, 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 등)의 특정 형태에 맞는 콜로니를 확인하고, 단리를 위한 사전 환원된 새로운 한천에 배치하였다. 한천 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 37℃에서 추가 72시간 동안 혐기 인큐베이터에 두었다.
배양 플레이트로부터 특이적으로 단리된 콜로니를 찍어 1 mL의 사전 환원된 액체 브로스에 콜로니를 재현탁함으로써 단리된 콜로니를 액체 배지로 옮겼다. 선택된 유기체의 양성 및 음성 대조군은 각각 성장에 대해 비교하고 오염에 대해 모니터하기 위해 병행하여 접종한다. 그 다음 모든 액체 콜로니 샘플을 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한다.
양성 및 음성 대조군을 사용하여, 양성 매치 브로스 배양물을 확인하였다. PBS 중 0.75 mL의 50% v/v 글리세롤을 함유하는 2 mL 동결 튜브(cryotube)에 0.75 mL의 브로스 배양 용액을 옮겨서 양성 매치 브로스 배양물의 글리세롤 스톡을 제조하였다. 그 다음 밀봉된 동결 튜브 샘플을 혐기 챔버에서 꺼내고 -80℃에서 보관하였다. 나머지 브로스 배양 샘플은 하기 설명된 바와 같이 16S 기반 PCR을 사용하여 단리체 확인에 사용하였다.
2. 단리체 확인을 위한 16S 기반 PCR
브로스 배양 샘플을 원심분리하여 세포 펠릿을 형성하고 생성된 상등액을 조심스럽게 제거하여 형성된 세포 펠릿을 온전하게 남긴다. 그 다음, 세포 펠릿을 0.5-1 mL 초순수에 재현탁하였다.
하기 PCR 성분(NEB E5000S) 및 부피를 사용하여 50 ㎕의 최종 반응 부피를 위한 PCR 마스터믹스를 제조하였다: 10X 완충액(5 ㎕), 10 mM dNTP(1 ㎕), 10 μM 27F 정방향 프라이머(1 ㎕), 10 μM 1492R 역방향 프라이머(1 ㎕), Tag 중합효소(0.25 ㎕), 및 멸균수(40.25 ㎕), PCR 마스터믹스(48.5 ㎕) 및 1.5 ㎕의 재현탁된 박테리아 세포를 0.2 mL PCR 스트립 튜브에 넣고 볼텍싱한 후 PCR 반응 샘플을 다음 열순환기 프로토콜에 노출시켰다(표 3):
Figure pct00003
PCR 반응이 완료되면, GENEWIZ 또는 유사한 공급업체를 이용하는 Sanger 시퀀싱을 위해 샘플을 제출하였다.
3. 단리된 박테리아 균주의 특성화
하기 표 4는 본 개시 내용의 다양한 실시 양태에서, 약학 조성물에 사용하기 위한 박테리아 컨소시엄을 형성할 수 있는 균주(표 2에도 제시됨) 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM) 33187)의 단쇄 지방산 생산, 항생제 내성, 및 전체 게놈 시퀀싱 분석을 나타낸다.
Figure pct00004
실시예 2: 박테리아 조성물 A의 제조
본원에 기재된 박테리아 균주의 수율 및 성장 속도를 증가시키기 위해 제조 조건을 생성하였다. 특히, 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187) 균주에 대해 수율 및 성장 속도 증가를 위한 제조 조건을 얻었다. 본원의 [도 1]은 이들 균주를 사용하여 조성물 A를 제조하기 위한 제조 단계를 요약한 개략적인 흐름도를 제공한다.
1. 배지 제조
이 실시예의 제조 단계에서 동물질 무함유 배양 배지를 사용하였다. 박테리아 배치를 생산하기 위해, 먼저 각 균주에 대해 5 L의 브로스 배지를 제조하였다. USP 등급의 물에서 15분 동안 격렬하게 교반하여 배지 성분을 완전히 용해시킨 후, 배지의 pH를 염산으로 조정하였다. 그 다음 pH 조정된 배지를 생물안전 캐비닛으로 옮기고 0.2 μm 진공 필터 장치를 사용하여 여과 멸균하였다(예를 들어, 1리터 분량을 5회 사용). 여과 멸균된 배양 배지는 N2H2CO2(90:5:5) 분위기를 포함하는 혐기 챔버로 즉시 옮기고 접종 전에 환원시키기 위해 12-18시간 동안 통풍 캡과 함께 보관하였다.
2. 접종 및 배양
12-18시간 동안 혐기 조건하에 배지를 환원시킨 후, 각 1 L 필터 플라스크로부터 10 mL를 멸균되고 사전 환원된 15 mL 스크류 캡 튜브로 옮기고 "멸균 대조군 #5"로 표시하였다. 추가로 40 mL의 멸균 배지를 "2의 스타터 배양물 X"라고 표시된 2개의 별개의 50 mL Falcon 튜브로 옮겼다. 하나의 2 mL master cell bank(MCB) 냉동 바이알을 -70℃ 보관소에서 꺼내고 바이알 외부를 70% EtOH로 세척하고 보푸라기가 없는 와이프로 닦아 건조하였다. 그 다음 MCB 분취량을 혐기 챔버로 옮기고 튜브 랙에 놓고 5-10분 동안 해동시켰다. 완전히 해동되면 멸균된 1 mL 여과 피펫 팁을 사용하여 500 ㎕의 해동된 1 mL MCB 분취량을 2개의 40 mL 스타터 배양물 각각에 옮겼다. 접종된 스타터 배양 튜브와 멸균 대조군의 캡을 단단히 조였고 대조군과 스타터 배양물을 혐기 조건하에 약 37℃에서 12-16시간 동안 배양한다.
12-16시간 후, 스타터 배양물 및 멸균 대조군을 인큐베이터로부터 꺼내고 성장(예를 들어, 탁도)에 대해 육안으로 검사하였다. 또한, 진행하기 전에 멸균 대조군에서 육안으로 보이는 성장 또는 탁도가 없음을 확인하였다. 일단 확인되면, 멸균된 10 mL 혈청학적 피펫 팁을 사용하여 10 mL의 스타터 배양물을 사전 환원되고 여과 멸균된 배양 배지를 함유하는 사전 가온시킨 1 L 플라스크 5개 각각에 조심스럽게 옮겼다. 그 다음 배양물을 혐기 조건하에 37℃에서 12-16시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 설정된 매개변수 내에서 성장을 확인하기 위해 흡수 분광법(Epoch 2 Plate Reader, Biotek)을 사용하여 배양물의 탁도를 정량화하였다. 배양 흡광도가 목표 OD600 범위에 속하는 것으로 확인되면 원심분리에 의해 세포를 수거하였다.
3. 수거
세포 수거 12시간 내지 18시간 전에, 스크류 캡 씰이 있는 5개의 멸균 1 L 원심분리 병(Beckman Coulter)을 혐기 챔버에 넣어 사용 전에 병이 환원되도록 하였다. 배양물 성장 및 배양물이 목표 OD600 범위 내에 속하는지를 검증한 후, 배양물을 멸균된 1L 원심분리기 병으로 옮겼다. 가스 교환을 방지하기 위해 원심분리기 병의 캡을 단단히 밀봉하였고 6 x 1L 로터를 포함하는 사전 냉각된 플로어(floor) 원심분리기로 병을 옮겼다. 세포를 4℃에서 30분 동안 8,000 x g에서 펠릿화하였다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 다시 혐기 챔버로 옮기고 멸균된 혈청학적 피펫을 사용하여 펠릿으로부터 청징화된 배양 상등액을 완전히 제거하였다. 그 다음 세포 펠릿을 사전 환원된 동결보호제 용액에서 40X 농도로 재현탁하여 합하였다. 그 다음 농축된 세포 현탁액을 사전 환원되고 사전 표시된 2 mL 스크류 캡 냉동 바이알에서 1 mL 분취량으로 분배하고 -70℃에서 사전 표시된 보관 상자로 즉시 옮겼다. 원료 의약품 균주는 -70℃에서 제조 및 초기 보관 3일 후 규격 테스트를 거쳤다.
약학 조성물에 사용되는 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포에 대한 생산 절차는 하기에 기재한다.
A. 약학 조성물에 사용하기 위한 에이. 뮤시니필라 ( DSM 33213) 세포의 생성
배양 배지의 제조를 위해, 5 L 비이커에 4.9 L 물(주사용)을 첨가한 후 혼합하면서 Difco™ Select 소이톤(82.5 ± 0.82 g), Bacto™ 효모 추출물(12.5 ± 0.12 g), 중탄산나트륨(NaHCO3)(5 ± 0.05 g), 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)(12.5 ± 0.12 g), 염화나트륨(NaCl)(1.5 ± 0.015 g), 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O)(0.5 ± 0.05 g), 염화칼슘(CaCl2)(0.5 ± 0.05 g), 글루코오스(덱스트로스)(22.6 ± 0.22 g), N-아세틸글루코사민(27.7 ± 0.27 g), L-트레오닌(20 ± 0.2 g), 및 L-시스테인(5 ± 0.05 g)을 첨가하였다. 모든 성분이 완전히 용해되고 투명하고 고체 및 침전물이 없을 때까지 혼합물을 교반하였다.
NAGT 배지의 pH를 6.5 ± 0.1로 조정하였다. 그 다음, 배지를 진공 여과하고 5개의 1L 배치로 나누었다. 배양 배지가 완전히 환원된 후(약 12-16시간 후), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 박테리아 세포의 스타터 배양물을 45 mL 부피의 배지로 제조하였다. 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 박테리아 세포(약 500 ㎕의 스톡 용액)를 세포 은행에서 꺼내고 배양 배지를 함유하는 준비된 바이알에 추가하였다. 그 다음 세포 현탁액을 가온하도록 두고 37℃ 인큐베이터 장치에서 24-60시간 동안 인큐베이션하여 탁한/흐린 현탁액을 생성한다. 이어서, 600 nm에서의 흡광도를 측정하고 약 0.7-1.1의 값을 달성하기 위해 3회 반복하여 기록하였다.
그 다음, 배양 플라스크를 JLA8.1000 원심분리기를 사용하여 4℃에서 30분 동안 8000 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 잔류 세포 펠릿을 25 mL의 멸균 PBS-GC(원래 배양 부피의 40X 농도)에 재현탁한 다음, 합하여 균질한 용액을 얻었다. 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포 현탁액을 2 mL 냉동 바이알에 분취하여 바이알당 >1 x 10^9 생존 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포의 최종 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포 농도를 달성하고 추가로 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.
B. 약학 조성물에 사용하기 위한 에프. 프라우스니치이 ( DSM 33185) 세포의 생성 .
YFAP 비타민 믹스 용액의 제조를 위해, 1 L 병에 물(주사용)을 채우고 혼합하면서 비오틴(10 ± 1 mg), 코발라민(10 ± 1 mg), p-아미노벤조산(30 ± 1 mg), 엽산(50 ± 1 mg), 피리독사민(150 ± 1mg), 티아민(50 ± 1 mg), 및 리보플라빈(50 ± 1 mg)을 첨가한다. 모든 성분이 완전히 용해되고 투명하고 고체 및 침전물이 없을 때까지 혼합물을 교반하였다. 이어서, YFAP 비타민 믹스 배지를 여과 및 멸균하였다.
배양 배지의 제조를 위해, 5 L 비이커에 4.9 L 물(주사용)을 첨가한 후 혼합하면서 BBL™ Phytone 펩톤(50 ± 0.5 g), Difco™ Select 소이톤(50 ± 0.5 g), Bacto™ 효모 추출물(25 ± 0.25 g), 중탄산나트륨(NaHCO3)(5 ± 0.05 g), 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)(12.5 ± 0.12 g), 염화나트륨(NaCl)(5 ± 0.05 g), 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O)(1 ± 0.01 g), 아세트산나트륨(NaOAc)(25 ± 0.25 g), 글루코오스(덱스트로스)(50 ± 0.25 g), 프로피온산나트륨(5 ± 0.05 g), L-시스테인(5 ± 0.05 g), 및 YFAP 비타민 믹스 용액(1 mL, 상기에 기재된 바와 같이 제조됨)을 첨가하였다. 모든 성분이 완전히 용해되고 투명하고 고체 및 침전물이 없을 때까지 혼합물을 교반하였다.
그 다음, YFAP 배지의 pH를 5 M 염산 용액을 사용하여 6.5로 조정하였다. 그 다음, 배지를 여과하고 혐기 상태로 완전히 환원시키기 위해 약 12-18시간 동안 암소에 방치하였다. 특정 부피의 배지를 스타터 배양 튜브로 옮긴 후, 약 500 ㎕의 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 스톡 용액을 스타터 배양 튜브로 옮기고 37℃에서 약 12-16시간 동안 인큐베이션하였다. 스타터 배양 튜브를 탁도에 대해 평가하고 5개의 분취량으로 나누고 멸균 배양 배지를 함유하는 사전 가온시킨 1 L 플라스크에 첨가한 다음 37℃에서 12-16시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 600 nm에서의 흡광도를 측정하고 흡광도가 1.4-1.8 흡광도 범위 내에 있도록 보장하기 위해 3회 반복하였다. 배양 플라스크를 JLA8.1000 원심분리기를 사용하여 4℃에서 30분 동안 8000 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 잔류 세포 펠릿을 25 mL의 멸균 PBS-GC(원래 배양 부피의 40X 농도)에 재현탁한 다음, 합하여 균질한 용액을 얻었다. 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포 현탁액을 2 mL 냉동 바이알에 분취하여 바이알당 >1 x 10^9 생존 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포의 최종 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포 농도를 달성하고 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
C. 약학 조성물에 사용하기 위한 엘. 크리스파투스 ( DSM 33187) 세포의 생성 .
vMRS 배지의 제조를 위해, 5 L 비이커에 4.9 L 물(주사용)을 첨가한 후 혼합 하면서 273 g의 vMRS 분말 및 인산이칼륨(K2HPO4)(12.5 ± 0.1 g)을 첨가하였다. 모든 성분이 완전히 용해되고 투명하고 고체 및 침전물이 없을 때까지 혼합물을 교반하였다.
그 다음, vMRS 배지의 pH를 NH4OH 또는 아세트산을 사용하여 6.5로 조정하였다. 그 다음 배지를 0.2 μm 진공 필터 장치를 사용하여 여과하고 혐기 상태로 완전히 환원시키기 위해 약 12-18시간 동안 암소에 두었다. 특정 부피(예를 들어, 45 mL)의 배지를 스타터 배양 튜브로 옮긴 후, 약 500 ㎕의 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 스톡 용액을 스타터 배양 튜브로 옮기고 37℃에서 약 16~20시간 동안 인큐베이션하였다. 스타터 배양 튜브를 탁도에 대해 평가하고, 5개의 분취액으로 나누고 멸균 배양 배지를 함유하는 사전 가온시킨 1L 플라스크에 첨가한 다음, 37℃에서 16-20시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 600 nm에서의 흡광도를 측정하고 흡광도가 1.0-1.4 흡광도 범위 내에 있도록 보장하기 위해 3회 반복하였다. 배양 플라스크를 JLA8.1000 원심분리기를 사용하여 4℃에서 20분 동안 8000 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 잔류 세포 펠릿을 25 mL의 멸균 PBS-GC(원래 배양 부피의 40X 농도)에 재현탁한 다음, 합하여 균질한 용액을 얻었다. 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포 현탁액을 1 mL 냉동 바이알에 분취하여 바이알당 >1 x 10^9 생존 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포의 최종 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포 농도를 달성하고 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
D. 조성물 A의 조립
본원에 기재된 약학 조성물에서 박테리아 컨소시엄으로서 사용될 수 있고 3종의 박테리아 균주 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187)를 포함하는 조성물 A를 제조하기 위해서, 각 균주에 대해 -80℃에서 냉동 바이알에 보관된 최종 세포 현탁액에서 대사 활성 박테리아 세포 수를 결정하였다. 3종의 균주 배치로부터 생산할 수 있는 잠재적 경구 용량의 최대 수는 다음과 같이 계산할 수 있다(표 5).
Figure pct00005
조성물 A에 대한 전체 성분 목록은 표 6에 제공한다:
Figure pct00006
표 6에 열거된 균주를 함유하는 스톡 바이알이 해동되면(냉동고에서 꺼낸 후 약 15-20분), 각 균주에 대해 계산된 양의 세포 현탁액 부피를 1 L 유리병으로 옮기고 부피를 mL당 계산된 세포 농도에 도달하기 위해 PBS-GC를 사용하여 증가시켰다(예를 들어, 이 실시예에서 5x10^8 CFU/박테리아 종/mL). 생성된 균질한 현탁액을 혼합 종 완제 의약품의 1 mL 부피로 동결 바이알에 분취하고 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
E. 조성물 A의 품질 관리
하기 매개변수, 테스트 방법 및 규격은 표 7에 기재된 바와 같이 품질 관리 목적을 위해 조성물 A의 각 배치에 대해 평가하였다.
Figure pct00007
유해 미생물에 대한 테스트는 표준 프로토콜을 사용하여 USP <62>에 따라 수행하였다. 간략하게, 샘플은 먼저 대두 카제인 소화 액체 배지(SCDA: Soybean Casein Digest Broth), 또는 기타 적절한 중화 배지에 접종하여 농축한 다음 특정/유해 미생물의 존재를 결정하기 위해 선택적 한천에 도말하였다.
샘플에 존재하는 총 미생물 수는 표준 프로토콜을 사용하여 USP <61>에 따라 수행하였다. 이러한 미생물 계수는 막 여과, 주입 평판법, 또는 스프레드 평판법을 사용하여 수행하였다.
실시예 3: 배양 배지 최적화
본 실시예에서는 본원에 기재된 박테리아 균주를 배양하기 위한 배양 배지 조성의 최적화를 제공한다. 특히, 이러한 균주에는 박테리아 컨소시엄에서 사용하기 위한 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)가 포함된다.
1. 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213)
N-아세틸글루코사민 트레오닌(NAGT) 배지에서 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포의 성장을 상이한 pH 값에서 평가하고, 동시에 한 번에 하나의 배지 성분을 제거하여 이러한 배지 성분이 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포의 성장에 미치는 영향을 평가하였다. 일반 NAGT 배지는 pH가 6.5이고 11.9 mM 중탄산나트륨을 함유하였다. 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포가 47.6 mM 중탄산나트륨을 함유하는 pH 7.5의 변형 NAGT 배지에서 배양되었을 때 ~40%의 성장 증가(OD600으로 측정, 곡선 #2, 도 2)가 관찰되었다. 바이오매스의 증가는 또한 평판법을 사용하여 확인하였다. 변형 NAGT 배지에서 글루코오스(곡선 #3, 도 2), 황산마그네슘(곡선 #4, 도 2) 또는 염화칼슘(곡선 #5, 도 2)을 제거하면 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포의 성장에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
[도 3]은 소이톤 또는 N-아세틸 글루코사민(NAG)가 없는 배지에서 박테리아가 성장이 없음을 입증하는 성장 곡선 #2 및 #3에 의해 각각 나타낸 바와 같이 소이톤 및 NAG가 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포의 성장에 필요한 것으로 보임을 나타낸다. 성장 곡선 #1은 소이톤과 NAG를 모두 함유하는 NAGT 배지에서 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포의 강한 성장을 보여준다.
2. 페칼리박테리움 프라우스니치이 ( DSM 33185)
에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포의 성장에 대한 YFAP 배지의 특정 성분의 효과를 한 번에 하나의 배지 성분을 제거하여 평가하였다. 예를 들어, [도 4]는 효모 추출물(예를 들어, 곡선 #3은 효모 추출물이 없는 배지에서 FP(DSM 33185) 성장을 나타냄) 및 시스테인(예를 들어, 곡선 #4는 효모 추출물이 없는 배지에서 FP(DSM 33185) 성장을 나타냄)이 완전 배지(곡선 #1)에서 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포의 성장과 비교할 때 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포의 성장에 필요한 것으로 보임을 나타낸다. 아세트산나트륨의 부재(곡선 #5)는 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포의 성장을 방해하지 않고 약간 감소시키는 것으로 보이는 반면, 소이톤의 부재(곡선 #2)는 후기 지수기 및 정지기 동안 세포 사멸로 이어지는 것으로 보인다.
에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포 성장에 대한 비타민 보충제 유형에 대한 영향도 조사하였다. 예를 들어, [도 5]는 비타민 첨가가 비타민 미포함 YFAP 배지에서 3회 계대 배양된 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포의 수율을 증가시켰음을 보여준다. 비타민 포함 YFAP(YFAP + 비타민)에서 성장하는 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 최종 OD600은 티아민(YFAP (-) 티아민), 피록사민(YFAP (-) 피록사민), 엽산(YFAP (-) 엽산), 코발라민(YFAP (-) 코발라민), PABA(YFAP (-) PABA), 리보플라빈(YFAP (-) 리보플라빈), 비타민(YFAP (-) 비타민), 또는 비오틴(YFAP (-) 비오틴)이 없는 YFAP 배지에서 성장하는 것보다 약 10% 더 높았다. YFAP + 비타민 배지는 완전한 비타민 믹스 용액(예를 들어, YFAP 비타민 믹스)이 첨가된 YFAP 배지를 포함한다. YFAP 비타민은 약 10 mg/L의 비오틴, 약 10 mg/L의 코발라민, 약 30 mg/L의 p-아미노벤조산, 약 50 mg/L의 엽산, 약 150 mg/L의 피리독사민, 약 50 mg/L의 티아민, 및 약 50 mg/L of 리보플라빈을 포함한다.
또 다른 예에서, [도 6]은 비타민 미포함 YFAP 배지에서 1회 계대 배양된 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포의 최적 성장에 대해 주목할 만한 인자였음을 보여준다. 코발라민이 없는 YFAP 배지(YFAP (-) 코발라민)에서 성장하는 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 최종 OD600은 티아민(YFAP (-) 티아민), 피록사민(YFAP (-) 피록사민), 엽산(YFAP (-) 엽산), PABA (YFAP (-) PABA) 리보플라빈(YFAP (-) 리보플라빈), 비오틴 (YFAP (-) 비오틴)이 없는 YFAP 배지 또는 비타민이 첨가된 YFAP 배지(YFAP + 비타민)에서 성장한 것보다 약 30% 낮았다. 코발라민이 없는 YFAP의 성장 단점은 비타민이 없는 YFAP(YFAP (-) 비타민)의 성장 단점과 유사하였다.
배양 배지의 pH는 또한 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포의 성장에 대해 주목할 만한 인자인 것으로 나타났다. [도 7]은 pH를 조절하지 않은 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포의 성장을 보여주는 반면, [도 8]은 pH를 조절한 에프. 프라우스니치이(DSM 33185) 세포의 성장을 보여준다. 수산화암모늄(NH4OH)으로 pH를 6으로 조절했을 때, 산화환원은 -460mV로 떨어지는 한편 박테리아 성장은 OD600 = 0.5 부근에서 정체되었다. pH를 조절하지 않았을 때, 산화환원은 -400mV에서 유지되었고, 박테리아 성장은 OD600 = 1.1에 도달하였다. 따라서, pH를 조절하지 않은 배양은 pH를 조절한 배양보다 > 50% 더 많은 박테리아를 생산하였다.
3. 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)
엘. 크리스파투스(DSM 33187)는 일반적으로 HiMedia Laboratories로부터 구입한 vMRS 브로스에서 배양하였다. 그러나 [도 9]는 Biokar diagnostics(Ref: BK176HA)에서 구입한 Boullion MRS Vegetal로 배지를 만든 경우(곡선 #2) HiMedia vMRS 브로스의 사용(곡선 #1)과 비교하여 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포의 성장이 약 55% 증가했음을 보여준다. 어떤 이론에도 구애받지 않고 세포 성장에서 관찰된 개선은 HiMedia vMRS 브로스와 비교하여 Boullion MRS Vegetal의 식물성 펩톤의 더 많은 양(20 g/L의 경우 약 2배)에 기인하는 것으로 추정된다.
실시예 4: 박테리아의 대규모 배양(20 L)
본원에 기재된 박테리아 균주의 수율 및 성장 속도를 증가시키기 위해 20 L 부피의 배양물에서 박테리아를 배양하기 위한 제조 조건을 생성하였다. 특히, 박테리아 균주 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)에 대해 수율 및 성장 속도 증가를 위한 제조 조건을 얻었다.
아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213)의 대규모 배양
1L 접종 배양물 및 20L 1차 배양물을 위한 NAGT 배지를 제조하기 위해, 배지 성분을 다음과 같이 칭량한다: 완두 펩톤(16.5 g/L), 효모 추출물(2.5 g/L), 덱스트로스(4.52 g/L), 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)(2.5 g/L), 염화나트륨(NaCl)(0.3 g/L), 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O)(0.1 g/L), 중탄산나트륨(NaHCO3)(1 g/L), 염화칼슘(0.1 g/L), N-아세틸글루코사민(5.54 g/L), L-트레오닌(4 g/L), L-시스테인(1 g/L). 모든 성분이 완전히 용해되고 투명하고 고체 및 침전물이 없을 때까지 혼합물을 교반하였다.
NAGT 배지의 pH를 NH4OH 및 아세트산을 사용하여 6.5 ± 0.1로 조정하였다. 그 다음 배지를 121℃에서 20분 동안 오토클레이브하여 멸균하였다. 글루코오스 및 N-아세틸글루코사민 공급물을 별도로 여과 멸균하였다. 그 다음 배지 성분을 함께 혼합하였다.
NAGT를 함유하는 접종 플라스크를 혐기 챔버로 옮기고 48시간 동안 혐기 분위기하에서 인큐베이션하여 N2H2CO2(90:5:5)로 탈기시켰다. RCB 또는 MCB(에이. 뮤시니필라(DSM 33213)의 경우 0.4%)로부터 접종 배양물을 접종하고 37℃의 혐기 분위기하에서 교반 없이 인큐베이션하였다. 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도를 2시간마다 모니터하였다. a) 감속기가 관찰되거나 b) 배양물이 24시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
N2H2CO2(90:5:5)를 사용하여 살포함으로써 20 L 배지를 탈기시켰다. 산화환원 값이 떨어지고 안정화될 때까지 6.5 L/분으로 탈기를 수행하였다. 1차 배양물을 5%(예를 들어, ~1 L의 접종 배양물)로 접종하고, 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도를 2시간마다 모니터하였다. 배양물을 100 rpm에서 교반하고 37℃에서 성장시켰다. [도 10]에서 도시된 바와 같이, 제24시간과 제48시간에 90.4 g의 글루코오스와 110.8 g의 N-아세틸글루코사민의 공급물을 첨가하여 박테리아 배양이 제25시간에서 제50시간 사이에 지수기를 유지하고 제50시간 후에 정지기로 진입하도록 하였다. a) 성장 감속기가 관찰되거나 b) 배양물이 약 70시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)의 대규모 배양
1L 접종 배양물 및 150L 1차 배양물을 위한 Vegitone MRS 배지를 제조하기 위해, 배지 성분을 다음과 같이 칭량한다: 완두 펩톤(20 g/L), 효모 추출물(10 g/L), 덱스트로스(20 g/L), 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)(2.5 g/L), 시트르산암모늄(0.3 g/L), 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O)(0.1 g/L), 아세트산나트륨(NaOAc)(5.54 g/L), Tween 80(4 g/L). 모든 성분이 완전히 용해되고 투명하고 고체 및 침전물이 없을 때까지 혼합물을 교반하였다.
Vegitone MRS 배지의 pH를 NH4OH 또는 아세트산을 사용하여 6.5 ± 0.1로 조정하였다. 그 다음 배지를 121℃에서 20분 동안 오토클레이브하여 멸균하였다. 글루코오스 당 용액을 여과 멸균하였다. 그 다음 배지 성분을 함께 혼합하였다.
Vegitone MRS를 함유하는 접종 플라스크를 혐기 챔버로 옮기고 48시간 동안 혐기 분위기하에서 인큐베이션하여 N2H2CO2로 탈기시켰다. RCB 또는 MCB(엘. 크리스파투스(DSM 33187)의 경우 0.4%)로부터 접종 배양물을 접종하고, 37℃의 혐기 분위기하에서 교반 없이 인큐베이션하였다. 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도를 2시간마다 모니터하였다. a) 감속기가 관찰되거나 b) 배양이 24시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
N2H2CO2(90:5:5)를 사용하여 살포함으로써 20 L 배지를 탈기시켰다. 산화환원 값이 떨어지고 안정화될 때까지 6.5 L/분으로 탈기를 수행하였다. 1차 배양물을 1%(예를 들어, ~200 mL의 접종 배양물)로 접종하고, 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도를 2시간마다 모니터하였다. 배양물을 100 rpm에서 교반하고 37℃에서 성장시켰다. [도 11]에 도시된 바와 같이, 제10시간과 제11시간에 200 g의 글루코오스의 공급물을 첨가하여 박테리아 배양이 제11시간에서 제14시간 사이에 지수기를 유지하고 제14시간 후에 정지기로 진입하도록 하였다. a) 성장 감속기가 관찰되거나 b) 배양이 16시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185)의 대규모 배양
1L 접종 배양물 및 20L 1차 배양물을 위한 YFAP 배지를 제조하기 위해, 배지 성분을 다음과 같이 칭량한다: 완두 펩톤(20 g/L), 효모 추출물(5 g/L), 덱스트로스(10 g/L), 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)(2.5 g/L), 염화나트륨(NaCl)(1 g/L), 황산마그네슘칠수화물(MgSO4 x 7 H2O)(0.2 g/L), 중탄산나트륨(NaHCO3)(1 g/L), 아세트산나트륨(NaOAc)(5 g/L), L-시스테인(1 g/L). YFAP 비타민 믹스 용액을 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 모든 성분이 완전히 용해되고 투명하고 고체 및 침전물이 없을 때까지 혼합물을 교반하였다.
YFAP 배지의 pH를 NaOH를 사용하여 6.5 ± 0.1로 조정하였다. 그 다음 배지를 121℃에서 20분 동안 오토클레이브하여 멸균하였다. 글루코오스 및 YFAP 비타민 믹스 용액을 여과 멸균하였다(0.2 μm 필터). 그 다음, 배지 성분을 함께 혼합하였다.
YFAP를 함유하는 접종 플라스크를 혐기 챔버로 옮기고 혐기 분위기하에서 적어도 16시간 동안 인큐베이션하여 N2H2CO2로 탈기시켰다. Research Cell Bank(RCB) 또는 Master Cell Bank(MCB)부터 접종 배양물(에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 경우 0.4%)을 접종하고, 37℃의 혐기 분위기하에서 교반 없이 인큐베이션하였다. 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도는 2시간마다 모니터하였다. 배양물을 10-16시간 동안 배양한 후 배양을 중단하였다.
모든 개방 용기 작업은 우수한 무균 기술을 사용하여 생물학적 안전 캐비닛(BSC: Biological Safety Cabinet) 또는 혐기 챔버(AC: Anaerobic chamber)에서 수행하였다. N2H2CO2(90:5:5)를 사용하여 살포함으로써 20L 배지를 탈기시켰다. 산화환원 값이 떨어지고 안정화될 때까지 6.5 L/분으로 탈기를 수행하였다. 1차 배양물을 1%(예를 들어, ~200 mL의 접종 배양물)로 접종하고, 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도를 2시간마다 모니터하였다. 배양물을 100 rpm에서 교반하고 37℃에서 성장시켰다. [도 12]에 도시된 바와 같이, 제9시간에 200 g의 글루코오스의 공급물을 첨가하여 세포가 제9시간부터 제14시간까지 성장을 유지하도록 하였다. a) 성장 감속기가 관찰되거나 b) 배양물이 16시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
실시예 5: 박테리아의 대규모 배양(150 L)
본원에 기재된 박테리아 균주의 수율 및 성장 속도를 증가시키기 위해 150 L 부피의 배양물에서 박테리아를 배양하기 위한 제조 조건을 생성하였다. 특히, 박테리아 균주 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)에 대해 수율 및 성장 속도 증가를 위한 제조 조건을 얻었다.
아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213)의 대규모 배양
1L 접종 배양 및 150L 1차 배양을 위한 NAGT 배지를 제조하기 위해, 배지 성분을 다음과 같이 칭량된다: 완두 펩톤(16.5 g/L), 효모 추출물(2.5 g/L), 덱스트로스(4.52 g/L), 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)(2.5 g/L), 염화나트륨(NaCl)(0.3 g/L), 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7H2O)(0.1 g/L), 중탄산나트륨(NaHCO3)(1 g/L), 염화칼슘(0.1 g/L), N-아세틸글루코사민(5.54 g/L), L-트레오닌(4 g/L), L-시스테인(1 g/L). 모든 성분이 완전히 용해되고 투명하고 고체 및 침전물이 없을 때까지 혼합물을 교반하였다.
NAGT 배지의 pH를 NH4OH 또는 아세트산을 사용하여 6.5 ± 0.1로 조정하였다. 그 다음 배지를 121℃에서 20분 동안 오토클레이브하여 멸균하였다. 글루코오스를 여과 멸균(0.2 μm)하였다. 그 다음 배지 성분을 함께 혼합하였다.
NAGT를 함유하는 접종 플라스크를 혐기 챔버로 옮기고 48시간 동안 혐기 분위기하에서 인큐베이션하여 N2H2CO2로 탈기시켰다. RCB 또는 MCB(에이. 뮤시니필라(DSM 33213)의 경우 0.4%)로부터 접종 배양물을 접종하고, 37℃의 혐기 분위기하에서 교반 없이 인큐베이션하였다. 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도를 2시간마다 모니터하였다. a) 감속기가 관찰되거나 b) 배양물이 48시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
N2H2CO2(90:5:5)를 사용하여 살포함으로써 150L 배지를 탈기시켰다. 산화환원 값이 떨어지고 안정화될 때까지 6.5 L/분으로 탈기를 수행하였다. 1차 배양물을 0.4%(예를 들어, ~600 mL의 접종 배양물)로 접종하고, 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도를 2시간마다 모니터하였다. 배양물을 100 rpm에서 교반하고 37℃에서 성장시켰다. [도 13]에 도시된 바와 같이, 제19시간에 678 g의 글루코오스와 831 g의 N-아세틸글루코사민의 여과 멸균된 공급물을 첨가하여 제20시간 후에 박테리아 배양이 지수적 성장을 유지하도록 하였다. a) 성장 감속기가 관찰되거나 b) 배양이 24시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)의 대규모 배양
1L 접종 배양물 및 150L 1차 배양물을 위한 Vegitone MRS 배지를 제조하기 위해, 배지 성분을 다음과 같이 칭량한다: 완두 펩톤(20 g/L), 효모 추출물(10 g/L), 덱스트로스(20 g/L), 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)(2.5 g/L), 시트르산암모늄(0.3 g/L), 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O)(0.1 g/L), 아세트산나트륨(NaOAc)(5.54 g/L), Tween 80(4 g/L). 모든 성분이 완전히 용해되고 투명하고 고체 및 침전물이 없을 때까지 혼합물을 교반하였다.
Vegitone MRS 배지의 pH를 NH4OH 또는 아세트산을 사용하여 6.5 ± 0.1로 조정하였다. 그 다음 배지를 121℃에서 20분 동안 오토클레이브하여 멸균하였다. 글루코오스를 별도로 여과 멸균하였다. 그 다음 배지 성분을 함께 혼합하였다.
Vegitone MRS를 함유하는 접종 플라스크를 혐기 챔버로 옮기고 48시간 동안 혐기 분위기하에서 인큐베이션하여 N2H2CO2로 탈기시켰다. RCB 또는 MCB로부터 접종 배양물(엘. 크리스파투스(DSM 33187)의 경우 0.4%)을 접종하고 교반 없이 37℃의 혐기 분위기하에서 인큐베이션하였다. 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도를 2시간마다 모니터하였다. a) 감속기가 관찰되거나 b) 배양이 24시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
N2H2CO2(90:5:5)를 사용하여 살포함으로써 150L 배지를 탈기시켰다. 산화환원 값이 떨어지고 안정화될 때까지 6.5 L/분으로 탈기를 수행하였다. 1차 배양물을 0.4%(예를 들어, ~600 mL의 접종 배양물)로 접종하고, 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도를 2시간마다 모니터하였다. 배양물을 100 rpm에서 교반하고 37℃에서 성장시켰다. [도 14]에 도시된 바와 같이, 제10시간에 5250 g의 글루코오스의 공급물을 첨가하고, 박테리아 배양물이 제10시간부터 제12시간까지 지수적 성장을 유지하고 제12시간 후에 정상 성장에 진입하도록 하였다. a) 성장 감속기가 관찰되거나 b) 배양이 24시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185)의 대규모 배양
1L 접종 배양물 및 150L 1차 배양물을 위한 YFAP 배지를 제조하기 위해, 배지 성분을 다음과 같이 칭량한다: 완두 펩톤(20 g/L), 효모 추출물(5 g/L), 덱스트로스(10 g/L), 이염기성 인산칼륨(K2HPO4)(2.5 g/L), 염화나트륨(NaCl)(1 g/L), 황산마그네슘 칠수화물(MgSO4 x 7 H2O)(0.2 g/L), 중탄산나트륨(NaHCO3)(1 g/L), 아세트산나트륨(NaOAc)(5 g/L), L-시스테인(1 g/L). YFAP 비타민 믹스 용액은 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 모든 성분이 완전히 용해되고 투명하고 고체 및 침전물이 없을 때까지 혼합물을 교반하였다.
YFAP 배지의 pH를 NaOH 및 아세트산을 사용하여 6.5 ± 0.1로 조정하였다. 그 다음 배지를 121℃에서 20분 동안 오토클레이브하여 멸균하였다. 글루코오스 및 YFAP 비타민 믹스 용액을 여과 멸균하였다(0.2 μm 필터). 그 다음 배지 성분을 함께 혼합하였다.
YFAP를 함유하는 접종 플라스크를 혐기 챔버로 옮기고 혐기 분위기하에서 적어도 16시간 동안 인큐베이션하여 N2H2CO2로 탈기시켰다. RCB 또는 MCB로부터 접종 배양물(에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 경우 0.4%)을 접종하고, 37℃의 혐기 분위기하에서 교반 없이 배양하였다. 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도를 2시간마다 모니터하였다. a) 감속기가 관찰되거나 b) 배양이 24시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
N2H2CO2(90:5:5)를 사용하여 살포함으로써 150L 배지를 탈기시켰다. 산화환원 값이 떨어지고 안정화될 때까지 6.5 L/분으로 탈기를 수행하였다. [도 15]에 도시된 바와 같이, 1차 배양물을 0.4%(예를 들어, ~600 mL의 접종 배양물)로 접종하고 제11시간에서 제16시간까지 지수적 성장을 유지하였고, 배양물 글루코오스 소비 및 광학 밀도는 2시간마다 모니터하였다. 배양물을 100 rpm에서 교반하고 37℃에서 성장시켰다. [도 16]에 도시된 바와 같이, 제8시간에 150 g의 글루코오스의 공급물을 첨가하여 박테리아 배양이 제8시간 후에 지수적 성장을 유지하도록 하였다. a) 성장 감속기가 관찰되거나 b) 배양이 24시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
실시예 6: 박테리아의 동결건조
대규모 배양 조건에서 배양한 박테리아에 대한 동결보호제 용액을 제조하기 위해, 사카로오스(80 g/L), 트레할로오스(13.3 g/L), 글루타민산나트륨(5.3 g/L), L-시스테인(1.3 g/L)을 물과 혼합하고, 여과 멸균하고(0.2 μm 필터), N2H2CO2(90:5:5) 가스를 살포함으로써 탈기시켰다. 표준 보정된 산화환원 프로브로 산화환원 상태를 모니터하였다. 산화환원 값이 떨어지고 안정화될 때까지 탈기를 계속하였으며, 이는 완전한 혐기 상태를 나타냈다(약 60분). 완전히 환원된 동결보호제 믹스는 사용할 때까지 공기 침입으로부터 보호하기 위해 밀봉하였다. 모든 Sharples 원심분리기 및 혼합 탱크 구성요소는 121℃에서 20분 동안 오토클레이브하여 제자리에서 멸균하였다.
박테리아를 31시간 동안 배양하고 10℃로 설정된 냉각된 Sharples 원심분리기를 사용하여 20L 또는 150 L 배양물로부터 수거하였다. 실린더의 박테리아를 멸균 블렌더 백으로 즉시 옮겼고 바이오매스의 중량을 측정한다. 그 다음 동일한 중량의 혐기성 및 사전 환원된 동결보호제 용액을 블렌더 백에 첨가하였다. 혐기 가스 라인을 블렌더 백의 모서리에 삽입하였다. N2H2CO2(90:5:5) 가스를 사용하여 박테리아와 동결보호제 믹스를 6.5 L/분 유속으로 5분 동안 살포하였다.
농축된 박테리아 및 동결보호제 믹스가 혐기 조건에서 유지되도록 보장하기 위해서 혐기 가스로 살포한 후, 블렌더 백을 밀봉하여 2차 블렌더 백에 넣었다. 이중벽 블렌더 백을 JumboMix 3500 패들 믹서 내부에 놓고 속도 #3에서 5분 동안 블렌딩하여 균질한 혐기 혼합물을 생성하였다.
균질화 후, 박테리아를 함유한 동결보호제 용액을 1회용 동결-건조 플레이트에 펌핑하였다. 각 플레이트를 칭량한다. 플레이트를 표 8에 나열된 단계를 사용하여 동결건조를 위해 사전 냉각된(-40℃) 동결건조기로 즉시 옮겼다:
Figure pct00008
제품 온도가 적어도 2시간 동안 안정할 때 동결건조 절차를 완료하였다. 동결건조된 제품을 1 mm 분쇄 설정을 사용하여 분쇄하고 사용할 때까지 -20℃에서 진공 밀봉 백에 보관하였다.
실시예 7: 샘플에서 대사 활성 세포 수를 결정하기 위한 한천 평판법 대 유세포 분석의 비교
세포 현탁액 또는 생물학적 샘플(예를 들어, 인간 대변 샘플)과 같은 샘플에서 균주의 대사 활성 세포 수(예를 들어, 균주 효능)에 대한 일관되고 정확한 판독값을 제공하는 능력에 대해 종래의 한천 평판법과 유세포 분석의 두 가지 상이한 기술을 비교하였다. 평가된 균주에는 본원의 박테리아 컨소시엄에서 사용될 수 있는 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및/또는 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)가 포함된다.
샘플에서 대사 활성 박테리아 세포 수(CFU로 정의됨), 예를 들어, 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및/또는 락토바실러스 크리스파투스 샘플(DSM 33187)의 대사 활성 박테리아 세포 수를 결정하기 위해, 한천 평판법 절차를 유세포 분석의 사용과 비교하였다.
[도 17a-17c]는 박테리아 세포 집단, 예를 들어, 인간 대상체에게 투여될 수 있는 세포 집단에서 대사 활성의 치료용 균주의 정량화를 위한 가열 사멸된 대조군 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포의 유세포 분석 게이팅 실험을 보여준다. 예시 균주로서 사용된 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 세포 스톡 용액을 0.9% NaCl 완충 용액에 10-4M로 희석하고 실험을 수행하기 전에 세포 사멸을 보장하기 위해 95℃에서 20분 동안 가열 블록에 두었다. 세포는 2 μM의 프로피듐 아이오다이드와 2 μM의 SYTO9로 염색하였다. 각각 세포 크기 및 입도에 대해 선별하기 위해 전방 산란 영역(FSC-A) 및 측방 산란 영역(SSC-A)에 의해 계산된 모든 세포(도 17a)에 게이트를 적용하였다. 그 다음 단일 세포를 식별하기 위해 이들 세포를 전방 산란 높이(FSC-H) 및 전방 산란 영역(FSC-A)에 기초한 선형성에 대해 게이팅하였다(도 17b). 그 다음 단일 세포를 사용하여 사멸 세포(PIhighSYTO9low) 및 생존 세포(PI-SYTO9high)에 대해 게이트를 설정하였으며, 이는 50 ㎕의 용액에서 생존 세포 및 사멸 세포의 백분율을 제공하였다(도 17c) [도 17a]는 각각 세포 크기 및 입도에 대해 선별하기 위해 전방 산란 영역(FSC-A) 및 측방 산란 영역(SSC-A)에 의해 계수된 모든 세포에 게이트를 적용하였을 때 얻은 유세포 분석 결과를 보여준다. [도 17b]는 단일 세포를 식별하기 위해 전방 산란 높이(FSC-H) 및 전방 산란 영역(FSC-A)에 기초한 선형성에 대해 세포를 게이팅할 때 얻은 유세포 분석 결과를 보여준다. [도 17c]는 단일 세포를 사용하여 사멸 세포(PIhighSYTO9low) 및 생존 세포(PI-SYTO9high)에 대한 게이트를 설정하였을 때 얻은 유세포 분석 결과를 보여주며, 이는 50 ㎕의 세포 현탁액에서 생존 세포 및 사멸 세포의 백분율을 제공한다. 이 데이터는 유동 세포 측정법이 대사 비활성 세포(세포는 열로 비활성화됨)를 나타내는 [도 17c]에서 입증된 바와 같이 대사 활성/비활성 세포 수를 정확하게 결정할 수 있음을 보여준다.
하기 표 9는 각 희석액에서 총 생존 세포를 계산하는 데 사용된 계산 순서를 보여준다. "계수된 총 세포"를 계산하기 위해, 희석되고 염색되지 않은 세포를 기계로 계수하고 희석 계수를 곱하였다(희석 계수 X 세포 = 계수된 총 세포). "표준 편차" 및 "평균 총 세포"는 "계산된 총 세포"에서 유도되었다. "퍼센트 생존 세포"는 [도 17a-17c]에 설명된 대조군 게이트를 희석액 내 염색된 세포에 적용하여 계산하였다. 퍼센트 생존 세포"를 "평균 총 세포"에 "적용하여 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) MCB 글리세롤 스톡의 "총 생존 세포"를 계산하였다.
Figure pct00009
균주 페칼리박테리움 프라우스니치이 균주(DSM 33185), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)에 대해 샘플에서 대사 활성의 치료용 균주 수를 정확하게 결정하기 위해 유세포 분석이 사용될 수 있음을 입증하는 유사한 결과를 얻었다. 평판법을 사용하여 결정된 총 생존 세포의 수를 유세포 분석에 의해 결정된 것과 비교하면 유세포 분석이 샘플에서 총 생존 세포의 보다 정확한 측정을 허용할 수 있음을 나타낸다(예를 들어, [도 17a-17c] 참조).
또한, [도 18]은 생존 세포의 유세포 분석법 정량화 데이터를 (표준) 평판법을 사용하여 결정된 총 생존 세포 수와 비교하는 그래프를 나타낸다. 데이터는 유세포 분석법이 평판법에 비해 샘플의 총 생존 세포(예를 들어, CFU/mL로 정량화됨)를 훨씬 더 정확하게 측정할 수 있음을 나타낸다. 왼쪽 y축은 유세포 분석법으로 측정한 총 생존 세포 수를 나타낸다. 오른쪽 y축은 생물학적 복제물에 대한 영양 한천 평판법에서 계산된 평균 CFU/mL 값을 나타낸다. 양측 Mann Whitney t-검정은 p-값이 0.0532로 두 정량화 방법의 평균값 사이에 유의한 차이가 없음을 보여주었다. 결과는 한천 평판 기술의 가변성과 FACS 기술의 상대적 일관성을 보여주며, 이는 생물학적 샘플에서 박테리아 균주를 정량화하는 방법으로 유세포 분석법의 사용을 검증한다. 이 기술을 사용하여 테스트할 수 있는 샘플에는 품질 관리 목적으로 분석될 수 있는 인간 대변 샘플 및 박테리아 균주 샘플이 포함된다.
종합하여, 이러한 결과는 본원에 기재된 유세포 분석 방법이 (i) 샘플에서 대사 활성 대 대사 비활성 세포의 비율, 및 (ii) 샘플 내 대사 활성 박테리아 세포의 절대 수를 결정하는 데 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 8: qPCR을 사용한 대변 DNA의 박테리아 세포 정량화
샘플에서 박테리아 균주 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)의 정량화에 대해 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)의 사용을 기재한다. 이 실시예에서는 특정 프라이머, qPCR 및 대변 DNA를 주형으로 사용하는 균주 정량화를 기재한다.
1. 재료
하기 표 10은 균주 정량화에 사용된 예시적인 균주 특이적 프라이머 서열을 보여준다:
Figure pct00010
엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213)로부터 추출된 게놈 DNA에 대해 PacBio 시퀀싱을 수행하였다. 이 데이터를 사용하여, 모든 박테리아 균주의 비교 게놈 분석을 수행하여 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213)의 게놈 내의 고유 영역을 식별하였다. 고유한 영역을 식별한 후, qPCR 프라이머 쌍(상기 표 10 참조)을 이들 균주 내에 존재하는 고유한 영역을 표적화하도록 설계하였다.
이 실험에 사용된 추가 재료는 다음을 포함하였다: (i) 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 엘. 크리스파투스(DSM 33187) DNA; (ii) 인간 대변 DNA 샘플 대조군(균주를 포함하지 않음); (iii) 임상 샘플로부터 추출된 DNA; (iv) 금속 384 qPCR 플레이트 홀더; (v) DNA/RNAse가 없는 멸균 Eppendorf 튜브; 및 (vi) QuantStudio 6 qPCR 열순환기.
2. 절차
임상 샘플 명칭 및 DNA 농도는 전자적으로 계산하였고, 모든 샘플은 100 ㎕의 최종 부피로 10 ng/㎕에 정규화하였다. 각 실행은 인간 대변 DNA 배경에서 희석된 순수 박테리아 DNA로 생성된 7점의 양성 대조군 표준 곡선을 활용하였다. 이러한 표준(약칭 "std")을 사용하기 쉽도록 미리 만들고 분취하였다. 표준 곡선의 경우, 표적 균주 DNA의 다음의 연속 희석액이 실행에 포함되었다(표 11).
Figure pct00011
다음 항목을 균주 DNA 정량화 실험에 사용하였다.
Figure pct00012
계산된 양의 물 및 DNA 용액을 적절한 웰에 첨가하였다. qPCR 플레이트를 밀봉하고, 볼텍싱(5-10초)하고 1000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다.
3. 프라이머 스톡 및 마스터 믹스의 제조
정방향 및 역방향 균주 특이적 프라이머를 완전히 해동시키고, 프라이머 스톡을 1X TE 완충액에 100 μM로 유지하였다(예를 들어, 표 10 참조). 2개의 Eppendorf 튜브(하나는 정방향 프라이머용, 하나는 역방향 프라이머용)에 360 ㎕의 멸균 USP 등급 WFI를 첨가하였다. 그 다음, 40 ㎕의 정방향 프라이머 용액을 첨가하여 균질화하고, 역방향 프라이머 용액에 대해 동일한 단계를 반복하였다. 생성된 10 μM 프라이머 용액을 SYBR Select 마스터 믹스(2X 스톡) 및 멸균수와 합하고 균질화하였다.
qPCR 384 웰 플레이트를 사용하여, 20 ㎕의 qPCR 마스터 믹스를 웰 A-N 1-24 및 O 1-14에 분취하였다. 마스터 믹스를 DNA 정규화 플레이트를 사용하여 350개 모든 웰에 분취한 후, A 행의 모든 웰의 5 ㎕의 DNA를 취하고 반응 플레이트의 A 행의 홀수 웰에 접종하였다. 그 다음, A 행의 모든 웰로부터 5 ㎕의 DNA를 옮겨 반응 플레이트의 A 행의 짝수 웰에 접종하였다. DNA가 반응 플레이트에 첨가될 때까지 모든 웰에 대해 마지막 2단계를 반복하였다. 이어서, 적절한 균주의 표준 곡선 스톡 DNA 플레이트를 생물안전 캐비넷으로 옮긴 다음, 반응 플레이트 설정에 따라 표준을 P 행의 정확한 웰에 피펫팅하였다. 혼합 및 원심분리 후, 샘플을 Quantstudio qPCR 기기에 넣었다.
아래 표 13에 나타낸 바와 같이 하기 순환 조건을 사용하였다:
Figure pct00013
하기 표 14는 표준 곡선 대조군 사이클 역치(CT) 및 프라이머 용융 온도(TM) 값을 보여준다. 표 14는 선택된 균주 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 및 에이. 뮤시니필라(DSM 33213) 각각에 대해, 균주 세포 DNA의 양(일반 대변 DNA 배경을 사용함), 및 물(예를 들어, 대변 DNA 배경 없이) 중 균주 세포 DNA의 동량(예를 들어, 1 ng, 0.1 ng, 0.01 ng, 및 0.001 ng)을 정량화하는 데 사용될 수 있는 표준 곡선을 생성하는 데 사용된 균주 세포 DNA의 표준 양(예를 들어, 1 ng, 0.1 ng, 0.01 ng 및 0.001 ng)을 이용하여 추정된 균주 세포 수를 또한 나타낸다.
Figure pct00014
[도 19a-19c]는 상기 표 14에 나타낸 바와 같이 추정된 균주 세포 수에 대해 측정된 CT 값을 플롯팅하여 생성된 3종의 선택된 균주 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포 각각에 대한 검출 곡선의 한계를 각각 보여준다.
실시예 9: 마우스 모델 시스템
생체 내 마우스 모델에서 알레르기 질환과 같은 염증성 질환의 치료를 위한 3종의 박테리아 균주 엘. 크리스파투스(DSM 33187), 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 및 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)를 포함하는 박테리아 컨소시엄의 능력을 평가하기 위한 프로토콜을 본원에서 제공한다.
기도 알레르겐에 기관 내 감작된 젊은 성체 마우스를 사용한 알레르기 기도 염증 모델에서, 실시예 2에 정의된 바와 같은 조성물 A의 경구 투여는 순환 IgE 면역글로불린의 상승을 유의하게 억제하였다. 또한, 조성물 A의 경구 투여는 Th2 관련 유전자 발현 및 염증성 사이토카인 IL-4 및 IL-13의 폐 농도의 동시 감소와 함께 폐에서 염증성 Th2 세포 확장을 유의하게 감소시켰다. 역으로, 조성물 A는 폐에서 항염증성 Treg 세포의 유의한 확장을 초래하였으며, 이는 감소된 알레르기성 천식 관련 분자 및 면역학적 반응과 관련된다. 또한, 순환 IgE 수준과 기도 호산구 증가의 유의한 감소가 관찰된 반면, 순환 히스타민과 기도 호중구는 감소하는 경향이 있었다. 이러한 연구를 기반으로 하고 어떤 이론에도 얽매이지 않고, 알레르기 및 천식 반응 완화에 대해 제안된 기전은 Treg 세포의 확장과 Th2에 의해 유도된 알레르겐 특이적 IgE의 생성의 후속적인 억제를 기반으로 하였다. 조성물 A 투여가 또한 호산구 및 호중구를 포함하는 이펙터 세포의 알레르기성 천식 관련 확장의 억제와 관련되어 있기 때문에 Treg 세포의 확장이 핵심인 것으로 추정되었다. 알레르기 반응 개시를 담당하는 IgE 이펙터 항체를 중화시킨 단클론 항-IgE 항체 Xolair®(오말리주맙)와 대조적으로, 조성물 A를 사용한 작용 기전은 조성물 A의 예방 가능성을 강조하는 알레르기 감작 캐스케이드의 상류에서 발생했을 수 있다. 조성물 A는 알레르기 반응과 관련된 새로운 IgE 및 염증성 이펙터 세포의 생성을 방지하고 그 결과 부작용이 훨씬 적을 것으로 예상된다는 점에서 유리하였다.
이러한 결과는 조성물 A의 박테리아 컨소시엄이 알레르기성 기도 염증을 치료하는데 효과적임을 입증한다. 이러한 컨소시엄의 치료 효능은 단클론 항-IgE 항체 Xolair®(오말리주맙)의 효능보다 우수할 수 있지만 부작용을 유의하게 감소시킨다는 것이 추가로 관찰되었다. 종합하여, 이러한 결과는 인간 대상체에서 임상 연구를 위한 기초 및 근거로 사용될 수 있다.
실시예 10: 아커만시아 뮤시니필라 ( DSM 33213) 원료 의약품에 대한 최적화된 초대규모 배양 및 제조 공정(3500 L)
본원에 기재된 박테리아 균주의 수율 및 성장 속도를 증가시키기 위해 3500 L 부피의 배양물에서 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213)를 배양하기 위한 제조 조건 및 절차를 도 20에 개략적으로 설명된 바와 같이 생성하였다.
배지 제조
250 L 당 공급물(표 15), 3160 L의 NAGT 배지(표 16), 1.25 L 빙초산, 및 동결보호제 믹스(표 17)에 대한 성분을 칭량하였다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
당 분획 및 공급물 제조 및 오염 제거
300 L 용기 및 혼합 탱크 제자리 세척(CIP: Clean in place)을 완료하였다. 0.22 μm 필터를 사용하여 멸균 혼합 탱크에 뜨거운 연수 120 L를 추가하였다. 중량 기준으로 당 공급물 성분의 1/3을 혼합 탱크에 첨가하고 완전히 용해될 때까지 150 rpm에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 당 공급물 성분의 추가 2/3와 120 L의 뜨거운 연수를 혼합 탱크에 첨가하고 완전히 용해시켰다. 당 공급물을 0.2 μm 필터를 사용하여 여과 멸균하고 멸균된 300 L 용기에 보관하였다.
3500 L 배양 배지 제조 및 오염 제거
NAGT 배지를 생성하기 위해, 3,500 L 교반 발효기를 CIP로 멸균하고 보정된 pH 및 산화환원 감지 프로브를 장착한다. 총 400 L의 0.22 μm 여과수를 사전 멸균된 혼합 탱크에 첨가하고 NAGT 배양 배지 성분과 합하였다. 혼합물을 150 rpm에서 10분 동안 균질화하였다. 농축된 배지를 3500 L 생물반응기로 옮기고 3070 L의 0.22 μm 여과된 연수를 발효기에 첨가한다. 배양 배지의 pH를 pH=6.5로 조정하였다. 배지를 121℃에서 20분 동안 제자리 멸균하였다. 증기 멸균 연결을 사용하여, 100 L의 당 공급물을 멸균된 NAGT 배양 배지에 첨가하였다. 그 다음 완성된 NAGT 배양 배지를 100 rpm에서 교반하고 0.2 bar의 헤드스페이스 압력을 유지하면서 0.1 vvm의 속도로 N2H2CO2(90:5:5) 가스 혼합물을 첨가하는 스파저를 사용하여 탈기시켰다. NAGT 배지의 산화환원 값을 탈기 시작부터 모니터하였다. 탈기는 산화환원 값이 떨어질 때까지 계속하였고 1시간 동안 일정한 값에서 유지하였다. 그 다음 NAGT를 90 RPM으로 교반하면서 10℃ ± 2℃에서 보관하고 사용할 때까지 0.01 vvm의 가스 혼합물을 살포하였다.
20 L 및 300 L 발효기 제조 및 오염 제거 및 배지 이동
20 L 및 300 L 발효기 제자리 세척(CIP)을 완료하였다. 17 L 및 300 L의 멸균 배양 배지를 3500 L 발효기의 멸균 커넥터를 사용하여 각각 20 L 발효기 및 300 L 발효기로 옮겼다.
초기 접종물 제조
1L의 멸균 NAGT 배지를 20 L 발효기로부터 멸균된 1개의 병으로 옮겼다. 그 다음 멸균된 병을 혐기 챔버로 옮겼다. 19.2 mL의 WCB 에이. 뮤시니필라(DSM 33213)를 혐기 챔버에서 해동시키고 멸균 피펫 접종을 사용하여 1 L의 환원된 NAGT 배지(2% v/v 접종 비율)에 접종하였다. 세포와 배지 혼합물을 부드럽게 휘저어 균질화하고 585 nm에서 광학 밀도(OD600)를 주기적으로 측정하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. [도 21]은 배양물의 OD585가 이 기간 동안 꾸준히 상승하였음을 보여준다. a) OD600>1일 때, 또는 b) 배양물이 48시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
20 L 접종
20 L 배양 배지를 37℃로 가온하였다. 표 18에 열거된 매개변수를 사용하여 배지를 탈기시켰다.
Figure pct00018
표준 산화환원 센서로 측정했을 때 산화환원 값이 1시간 동안 안정화될 때까지 탈기를 계속하였다. 멸균된 3방향 밸브를 20 L 발효기에 연결하였다. 에이. 뮤시니필라(DSM 33213)의 전체 1L 접종 배양물(5% v/v 접종물)을 3방향 밸브를 통해 20 L 발효기에 첨가하였다. OD585를 사용하여 20 L 배양물의 광학 밀도를 모니터하였다. [도 22]는 배양물의 OD585가 이 기간 동안 꾸준히 상승하였음을 보여준다. 다음 기준 중 어느 하나에 도달하면 배양을 중단하였다. a) OD585 > 1.5, b) 총 배양 시간이 48시간에 도달, 또는 c) 3회의 후속 OD585 판독 후 성장 속도의 둔화 감지.
300 L 접종
300 L 배양 배지를 37℃로 가온하였다. 표 18에 열거된 매개변수를 사용하여 배지를 탈기시켰다. 표준 산화환원 센서로 측정했을 때 산화환원 값이 1시간 동안 안정화될 때까지 탈기를 계속하였다. 멸균된 3방향 밸브를 300 L 발효기에 연결하였다. 20 L 발효기로부터 에이. 뮤시니필라(DSM 33213)(5% v/v 접종원)의 15 L 접종 배양물을 3방향 밸브를 통해 300 L 발효기에 첨가하였다. OD585를 사용하여 20 L 배양물의 광학 밀도를 모니터하였다. [도 23]은 배양물의 OD600이 이 기간 동안 꾸준히 상승하였음을 보여준다. 다음 기준 중 어느 하나에 도달하면 배양을 중단하였다. a) OD585 > 1.5, b) 총 배양 시간이 48시간에 도달, 또는 c) 3회의 후속 OD585 판독 후 성장 속도의 둔화 감지.
3500 L 접종
3500 L 배양 배지를 37℃로 가온하였다. 표 18에 열거된 매개변수를 사용하여 배지를 탈기시켰다. 표준 산화환원 센서로 측정했을 때 산화환원 값이 1시간 동안 안정화될 때까지 탈기를 계속하였다. 300 L 발효기를 3500 L 발효기에 연결하였다. 300 L 발효기로부터 에이. 뮤시니필라(DSM 33213)(8-10% v/v 접종원)의 300 L 접종 배양물을 3500 L 발효기에 첨가하였다. 글루코오스 농도가 2 g/L 미만으로 떨어지면 또 다른 90 L의 당 공급물을 첨가하였다. OD585를 사용하여 20 L 배양물의 광학 밀도를 모니터하였다. [도 24]는 배양물의 OD585가 이 기간 동안 꾸준히 상승하였음을 보여준다. 다음 기준 중 어느 하나에 도달하면 배양을 중단하였다. a) OD585 > 2.5, b) 총 배양 시간이 72시간에 도달, 또는 c) 3회의 후속 OD585 판독 후 성장 속도의 둔화 감지. 이러한 매개변수 중 하나가 충족되면, 발효기를 4℃ +/- 3℃로 설정하여 배양물 냉각을 시작하였다.
원심분리
GEA 원심분리기 및 혼합 탱크 제자리 세척을 완료하였다. 혼합 가스 라인(N2H2CO2, 90:5:5)을 GEA 원심분리기와 혼합 탱크에 연결하고 30분 동안 탈기시켰다. 표 19에 열거된 Sharples 매개변수를 사용하여 3500 L 배양물을 원심분리하였다.
Figure pct00019
농축된 박테리아 분획(바이오매스)을 탈기된 혼합 탱크에 수집하였다. 수집된 농축 바이오매스의 중량을 칭량하였다.
동결보호제 용액 준비 및 농축 바이오매스에 첨가
혼합 탱크 제자리 세척(CIP)을 완료하였다. 0.22 μm 여과된 뜨거운 연수 75 L를 혼합 탱크에 첨가하였다. 동결보호제 믹스 성분의 1/3을 완전히 용해될 때까지 혼합 탱크에 첨가하였다. 추가로 20 L의 연화 여과된 물을 첨가하였다. 혼합물을 150 rpm에서 10분 동안 균질화하였다. 동결보호제 용액을 멸균 생물반응기로 옮겼다. 용액의 기준선 산화환원 값을 기록하였다. 표 20에 나열된 매개변수를 사용하여 동결보호제 용액을 탈기시켰다.
Figure pct00020
탈기된 동결보호제 용액을 1:1(w/w) 비율로 혼합 탱크의 혐기성 농축 바이오매스에 첨가하였다. 동결건조에 이용 가능한 바이오매스 및 동결보호제의 총 질량 및 부피를 기록하였다.
동결건조 및 분쇄
멸균 플라스틱 동결 건조 트레이를 총 두께가 트레이당 1.5 L의 세포 및 동결보호제 믹스에 해당하는 1 cm를 초과하지 않도록 로딩하였다. 동결 과정을 신속히 처리하기 위해 트레이를 채울 때 사전 동결된 동결건조기 선반으로 옮겼다. 표 21에 나열된 매개변수에 따라 동결건조 주기를 시작하였다.
Figure pct00021
동결건조된 물질을 스페이서 1 및 1 mm 격자를 사용하여 속도 1로 분쇄하였다. 분쇄 후, 동결건조된 세포 물질을 각각 1.5 kg 이하의 물질을 함유하는 폴리에틸렌(PE) 백에 즉시 밀봉하였다. 동결건조된 세포 물질을 <-18℃에서 보관하고 실시예 2에 정의된 바와 같이 조성물 A를 제조하는 데 사용하였다.
실시예 11: 페칼리박테리움 프라우스니치이 ( DSM 33185) 원료 의약품에 대한 최적화된 초대규모 배양 및 제조 공정(3500 L)
본원에 기재된 박테리아 균주의 수율 및 성장 속도를 증가시키기 위해 3500 L 부피의 배양액에서 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185)를 배양하기 위한 제조 조건 및 절차를 [도 25]에 개략적으로 설명된 바와 같이 생성하였다.
배지 제조
250 L 당 공급물(표 22), 3160 L의 YFAP 배지(표 23), 및 동결보호제 믹스(표 24)에 대한 성분을 칭량하였다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
당 분획 및 공급물 제조 및 오염 제거
1,6 L 용기 및 혼합 탱크 제자리 세척(CIP)을 완료하였다. 0.22 μm 필터를 사용하여 멸균 혼합 탱크에 뜨거운 연수 120 L를 추가하였다. 중량 기준으로 당 공급 성분의 1/3을 혼합 탱크에 첨가하고 완전히 용해될 때까지 150 rpm에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 당 공급물 성분의 추가 2/3와 130 L의 뜨거운 연수를 혼합 탱크에 첨가하고 완전히 용해시켰다. 당 공급물을 0.2 μm 필터를 사용하여 여과 멸균하고 멸균된 300 L 용기에 보관하였다.
3500 L 배양 배지 제조 및 오염 제거
YFAP 배지를 생성하기 위해, 3500 L 교반 탱크 생물반응기를 CIP로 멸균하고 보정된 pH 및 산화환원 감지 프로브를 장착한다. 총 400 L의 0.22 μm 여과수를 사전 멸균된 혼합 탱크에 첨가하고 YFAP 배양 배지 성분과 합하고 150 rpm에서 10분 동안 균질화한다. 농축된 배지를 3500 L 생물반응기로 옮기고 3070 L의 0.22 μm 여과된 연수를 생물반응기에 첨가한다. 증기 멸균된 연결을 사용하여, 100 L의 당 공급물을 멸균된 YFAP 배양 배지에 첨가한다. 632 ml 비타민 믹스 용액을 첨가하였다. 그 다음 완성된 YFAP 배양 배지를 100 rpm에서 교반하고 0.2 bar의 헤드스페이스 압력을 유지하면서 0.1 vvm의 속도로 N2H2CO2(90:5:5) 가스 혼합물을 첨가하는 스파저를 사용하여 탈기시킨다.
초기 접종물 제조
1.6 L의 멸균 YFAP 배지를 300 L 발효기로부터 멸균된 2 L 플라스크로 옮겼다. 그 다음 멸균된 병을 혐기 챔버로 옮겼다. 6.4 mL의 WCB 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)를 혐기 챔버에서 해동시키고 멸균 피펫 접종을 사용하여 1 L의 환원된 NAGT 배지(0.4% v/v 접종 비율)에 접종하였다. 세포와 배지 혼합물을 부드럽게 휘저어 균질화하고 585 nm에서 광학 밀도(OD585)를 주기적으로 측정하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. [도 26]은 배양물의 OD585가 이 기간 동안 꾸준히 상승하였음을 보여준다. a) OD600>3일 때, 또는 b) 배양물이 48시간 동안 성장한 경우 배양을 중단하였다.
300 L 접종
150 L의 멸균 배양 배치를 멸균 300 L 발효기로 옮겼다. 300 L 발효기의 YFAP 배양 배지를 0.1 vvm의 속도로 2시간 동안 스파저를 사용하여 N2H2CO2(90:5:5)로 탈기시켰다. 300 L 배양 배지를 37℃로 가온하였다. 표 18에 열거된 매개변수를 사용하여 배지를 탈기시켰다.
표준 산화환원 센서로 측정했을 때 산화환원 값이 1시간 동안 안정화될 때까지 탈기를 계속하였다. 멸균된 3방향 밸브를 300 L 발효기에 연결하였다. 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)의 전체 1L 접종 배양물(2% v/v 접종물)을 3방향 밸브를 통해 20 L 발효기에 첨가하였다. OD585를 사용하여 20 L 배양물의 광학 밀도를 모니터하였다. [도 27]은 배양물의 OD585가 이 기간 동안 꾸준히 상승하였음을 보여준다. 다음 기준 중 어느 하나에 도달하면 배양을 중단하였다. a) OD585 > 1.5, b) 총 배양 시간이 48시간에 도달, 또는 c) 3회의 후속 OD585 판독 후 성장 속도의 둔화 감지.
3500 L 접종
약 3500 L 배양 배지를 37℃로 가온하였다. 표 18에 열거된 매개변수를 사용하여 배지를 탈기시켰다. 표준 산화환원 센서로 측정했을 때 산화환원 값이 1시간 동안 안정화될 때까지 탈기를 계속하였다. 300 L 발효기를 3500 L 발효기에 연결하였다. 300 L 발효기로부터 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)(8-10% v/v 접종원)의 30 L 접종 배양물을 3500 L 발효기에 첨가하였다. OD585를 사용하여 20 L 배양물의 광학 밀도를 모니터하였다. [도 28]은 배양물의 OD585가 이 기간 동안 꾸준히 상승하였음을 보여준다. 다음 기준 중 어느 하나에 도달하면 배양을 중단하였다. a) OD585 > 2.5, b) 총 배양 시간이 72시간에 도달, 또는 c) 3회의 후속 OD585 판독 후 성장 속도의 둔화 감지. 이러한 매개변수 중 하나가 충족되면, 발효기를 4℃ +/- 3℃로 설정하여 배양물 냉각을 시작하였다.
원심분리
GEA 원심분리기 및 혼합 탱크 제자리 세척을 완료하였다. 혼합 가스 라인(N2H2CO2, 90:5:5)을 GEA 원심분리기와 혼합 탱크에 연결하고 30분 동안 탈기시켰다. 표 19에 열거된 Sharples 매개변수를 사용하여 3500 L 배양물을 원심분리하였다.
농축된 박테리아 분획(바이오매스)을 탈기된 혼합 탱크에 수집하였다. 수집된 농축 바이오매스의 중량을 칭량하였다.
동결보호제 용액 준비 및 농축 바이오매스에 첨가
혼합 탱크 제자리 세척(CIP)을 완료하였다. 0.22 μm 여과된 뜨거운 연수 75 L를 혼합 탱크에 첨가하였다. 동결보호제 믹스 성분의 1/3을 완전히 용해될 때까지 혼합 탱크에 첨가하였다. 추가로 20 L의 연화 여과된 물을 첨가하였다. 이어서, 동결보호제의 추가 2/3를 혼합 탱크에 첨가하고 용해시켰다. 혼합물을 150 rpm에서 10분 동안 균질화하였다. 동결보호제 용액을 멸균 생물반응기로 옮겼다. 용액의 기준선 산화환원 값을 기록하였다. 표 18에 열거된 매개변수를 사용하여 동결보호제 용액을 탈기시켰다.
탈기된 동결보호제 용액을 1:1(w/w) 비율로 혼합 탱크의 혐기성 농축 바이오매스에 첨가하였다. 동결건조에 이용 가능한 바이오매스 및 동결보호제의 총 질량 및 부피를 기록하였다.
동결건조 및 분쇄
멸균 플라스틱 동결 건조 트레이를 총 두께가 트레이당 1.5 L의 세포 및 동결보호제 믹스에 해당하는 1 cm를 초과하지 않도록 로딩하였다. 동결 과정을 신속히 처리하기 위해 트레이를 채울 때 사전 동결된 동결건조기 선반으로 옮겼다. 표 21에 나열된 매개변수에 따라 동결건조 주기를 시작하였다.
동결건조된 물질을 스페이서 1 및 1 mm 격자를 사용하여 속도 1로 분쇄하였다. 분쇄 후, 동결건조된 세포 물질을 각각 1.5 kg 이하의 물질을 함유하는 폴리에틸렌(PE) 백에 즉시 밀봉하였다. 동결건조된 세포 물질을 <-18℃에서 보관하고 실시예 2에 정의된 바와 같이 조성물 A를 제조하는 데 사용하였다.
실시예 12: 임상 연구 설계
인간 연구에서 최초의 설계를 사용하여 알레르기성 질환의 예방 및 치료를 위해 제공되는 박테리아 균주 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33)로 이루어진 박테리아 컨소시엄을 포함하는 경구 투여 가능한 약학 조성물을 평가한다.
이 실시예의 연구는 다민감성(2개 이상의 알레르겐에 대해)이며 그 외 건강한 인간 대상체에서 박테리아 균주 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)로 이루어진 박테리아 컨소시엄의 1b상 다중 중심, 무작위, 이중 맹검, 위약 대조, 병렬군, 3개의 순차적 부분 연구로서 설계된다.
박테리아 조성물 A의 치료 기능은 순환 IgE(총 IgE 및 특정 IgE) 수준, 면역 세포 수, 대변 마이크로바이옴 조성, 대변 및 혈장 대사 프로파일, 대변 및 혈장 면역 자극 능력(시험관 내 분석), 및 기준선에서 치료 종료까지의 증상 점수의 변화를 결정하여 평가한다.
대상체는 3가지 범주로 구분한다(예를 들어, [도 29] 참조). 첫 번째 범주는 2개 이상의 알레르겐에 다민감성이고 그 외 건강한(남성:여성; 약 1:1)(무작위 배정 3:1 테스트:위약) 18-40세의 약 20명의 대상체를 포함한다. 두 번째 범주는 2개 이상의 알레르겐에 다민감성이고 그 외 건강한(남성:여성; 약 1:1)(무작위 배정 3:1 테스트:위약) 12-17세의 약 20명의 대상체를 포함한다. 세 번째 범주는 2개 이상의 알레르겐에 다민감성이고 그 외 건강한(남성:여성; 약 1:1) 2-11세의 약 20명의 대상체를 포함한다. 대상체는 조성물 A 대 위약과 관련하여 3:1로 무작위 배정한다.
인간 대상체의 치료는 28일 동안 조성물 A의 1일 2회 경구 투여(식품 또는 우유와 혼합하여 대략 12시간 +/- 4시간마다)로 이루어진다. 조성물 A의 각 1 mL 용량은 각각의 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187), 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 및 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185)의 박테리아 종당 5x10^8 CFU를 함유한다.
조성물 A는 용량당 각각 5x10^8 CFU로 존재하는 3종의 생균 균주 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및 아커만시아 뮤시니필라(332)를 함유하는 살아있는 생물치료용 제품이다. 조성물 A는 3종의 박테리아 종을 모두 함유하는 단일 동결 글리세롤 스톡으로 공급된다. 조성물 A의 각 용량은 실리콘 와셔 씰(silicone washer seal)이 있는 2 mL 폴리프로필렌 스크류 캡 바이알에 제공된다. 바이알은 완충 글리세롤 용액에 현탁된 3종의 생균 균주를 모두 함유한다. 완충 글리세롤 용액은 표준 인산 완충 식염수(PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 및 1.8 mM KH2PO4), 20% v/v 글리세롤, 및 항산화제로서 0.1% w/w 시스테인으로 구성된다. 조성물 A 용량의 부피는 대략 1 mL이다.
이 실시예의 목적을 위해, 조성물 A는 -70℃에서 보관하고 온도 로그를 유지한다. 인간 대상체에게 제공되면, 조성물 A는 -18℃ 이하의 냉동고에 보관한다. 제품의 효능 및 순도를 유지하기 위해 조성물 A 용량은 소비를 위해 해동시키기 전에 냉동 바이알(예를 들어, 2 mL 냉동 바이알) 용기에 밀봉된 상태로 유지한다. 동결된 조성물 A 스톡을 실온에서 5-10분 동안 해동시키고 투약 지침에 언급된 대로 즉시 소비한다.
이 실시예에서 위약 치료는 28일 동안 부형제(위약: 20% v/v 글리세롤 및 0.1% w/w 시스테인과 함께 제품 제제에 대해 기재된 바와 같은 인산 완충 식염수(PBS))의 1일 2회 경구 투여(식품 또는 우유와 혼합하여 대략 12 ± 4시간마다)로 이루어진다. 각 1 mL 용량은 테스트 제품과 부피가 동일하다. 동결된 스톡은 실온에서 5-10분 동안 해동시킨다. 그 후 바이알의 내용물을 적절한 양(1-2 온스)의 차가운 또는 실온 우유(모유, 액체 영아용 조제분유, 우유, 아몬드 우유, 및 두유 포함) 또는 사과 소스 및 요거트와 같은 식품과 즉시 혼합한다.
[도 29]에 예시된 바와 같이, 선별 방문은 제1일(기준선 방문) 전 28일부터 7일까지 수행된다. 투약은 제1일에 시작된다. 대상체는 제8일, 제15일, 제22일, 및 제29일에 후속 방문과 함께 28일 동안 치료를 받는다. 추적 방문은 제43일 및 제57일에 수행된다. 기준선 이후의 각 방문은 ± 1일의 범위를 가진다.
28일 치료 기간 및 그 후 최대 28일(제57일)의 휴약 기간 동안 (i) 이상 반응 보고; (ii) 병용 약물 보고, (iii) 신체 검사 수행 및 활력 징후; 및 (iv) 혈청 화학, 간 및 신장 기능 패널, 혈액학, 전체 혈구 감별 계산, 및 소변 검사를 포함한 실험실 테스트에 의해 평가를 수행한다. 이 연구의 세 번째 부분에서는 안전성 평가를 위해 혈액 및 소변 샘플을 수집하지 않는다. 혈액 및 소변 샘플링이 필요한 평가를 제외한 다른 모든 평가를 수행한다.
하기 매개변수에서 기준선에서 치료 종료까지의 변화를 평가함으로써 추가 평가를 수행한다: (i) 대변 마이크로바이옴 분석(박테리아 조성); (ii) 대변 및 혈장 대사 프로파일링; (iii) 대변 및 혈장 면역 자극 능력(시험관 내 분석); (iv) 총 IgE 및 특정 IgE 수준; (v) 순환 면역 세포 프로파일링; (vi) 설문지(들) 및 이상 반응(AE: adverse effect) 및 일기의 약물 사용 보고.
이 연구에서 다양한 실험실 변수가 결정된다. 혈액학적 변수에는 헤마토크릿, 헤모글로빈, 평균 적혈구 혈색소량, 평균 적혈구 혈색소 농도, 평균 적혈구 용적, 혈소판 수, 적혈구 분포 폭, 적혈구 수, 및 백혈구 감별 계산이 포함된다. 소변검사 매개변수에는 외관(예를 들어, 색깔 및 특성), 빌리루빈, 유로빌리노겐, 단백질 함량, 글루코오스 수준, 케톤, 백혈구 에스테라제, 소변 혈액, 아질산염, pH 및 비중이 포함된다. 생화학적 매개변수에는 글루코오스 수준, 요산, BUN(혈액 요소 질소), 크레아티닌, BUN/크레아티닌 비율, eGFR(예상 사구체 여과율), 나트륨, 칼륨, 염화물, 중탄산염, 칼슘, 알부민, 총 빌리루빈, 알칼리성 인산분해효소 수준, AST(아스파테이트 아미노트랜스퍼라제) 수준, ALT(알라닌 트랜스아미나제), 감마-글루타밀트랜스퍼라제(GGT), 총 콜레스테롤 수준, 및 트리글리세리드 수준이 포함된다.
실시예 13: 동결된 박테리아 세포의 생존능
글리세롤에서 동결된 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)의 생존능을 조사하였다. 약 5x10^8 CFU의 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 약 5x10^8의 CFU의 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 약 5x10^8의 CFU의 엘. 크리스파투스(DSM 33187)를 혼합하여 글리세롤에 동결시켰다. 동결된 박테리아 세포는 -70℃에 보관하였다. 박테리아 세포의 생존능은 보관 후 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 및 12개월에 점수를 매겼다. 점수는 표 22에 나열한다.
[표 22]
Figure pct00025
실시예 14: 동결건조된 완제 의약품 캡슐 및 액체 조성물 용기
실시예 2에 정의된 바와 같은 조성물 A는 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 캡슐에 포함된다. 캡슐은 표준 크기 0 또는 크기 1이다. 캡슐은 타피오카 풀루란과 같은 식물 유래 물질로 만든다. 전분, 글루텐 및 방부제 무함유이다. 캡슐은 37℃에서 붕해된다. 캡슐의 >90%가 60분 이내에 물, pH 1.2 용액, 아세트산나트륨 완충액 USP(pH = 4.5), 또는 인산나트륨 완충액(pH = 7.2)에 용해된다. 캡슐은 탈이온수로 37℃에서 측정했을 때 붕해 종말점이 1.6분이다. 캡슐의 산소 투과도(cm3/m2/일)는 캡슐 내의 기체 조성으로 측정했을 때 ≤ 0.5이다. 캡슐은 [도 30]에 도시된 바와 같이 경구 투여된다. 조성물 A는 또한 [도 30]에 도시된 바와 같이 2 mL 폴리프로필렌 스크류 캡 바이알에 존재하고 경구 투여된다.
실시예 15: 영아 및 신생아의 알레르기성 병태를 예방하기 위한 임상 연구 설계
조성물 A에 대한 추가 연구: 알레르기성 질환 발병 위험이 높은 신생아 및 영아 대상체에서 위약(동일하게 보이는 부형제 용액)과 비교하여, 각 용량은 각각 동량으로 총 1.5 × 10^9 CFU 및 탄수화물계 부형제를 포함한다(5 Х 10^8 CFU/아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213), 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185), 및 락토바실러스 크리스파투스(DSM 33187)). 조성물 A 또는 위약은 28일 동안(파트 A) 및 336일 동안(파트 B) 1일 1회 1 mL를 모유, 조제분유, 또는 식품에 혼합하여 경구(입으로) 투여한다.
파트 A에서: [도 31]에 예시된 바와 같이, 28일 내지 12개월 미만의 영아는 초기에 28일의 치료에 등록하고, 신생아(파트 B) 등록 전에 안전성/내약성을 평가하기 위해 1개월 추가 관찰(오프 치료(off treatment))을 따른다. 파트 A에서, 적격 대상체는 28일 동안 1일 1회 조성물 A(모유, 조제분유 또는 식품과 혼합됨)의 경구 투여로 이루어진 조성물 A, 또는 28일 동안 1일 1회 위약(모유, 조제분유 또는 식품과 혼합됨)의 경구 투여로 이루어진 위약 중 어느 하나에 무작위 배정한다. 총 20명의 적격 영아가 3:1(15:5) 무작위 배정으로 등록된다.
파트 B에서: [도 32]에 예시된 바와 같이, 생후 7일 이하의 신생아는 336일 동안 1일 1회 조성물 A(모유, 조제분유, 또는 식품과 혼합됨)의 경구 투여로 이루어진 조성물 A, 또는 336일 동안 1일 1회 위약(모유, 조제분유 또는 식품과 혼합됨)의 경구 투여로 이루어진 치료인 위약 중 어느 하나에 무작위 배정한다.
적격 신생아는 분만 방식(질 또는 제왕 절개) 및 등록 시 수유 방법(모유 수유 또는 모유 수유 없음)으로 계층화된 1:1(112:112) 무작위 배정으로 등록된다. 잠재적 적격 신생아는 임신 중 또는 출생 후 첫 주 동안 확인된다. 조성물 A 또는 위약의 투여는 생후 7일 이내에 시작하여 1년 동안 계속된 후 1년 동안 관찰 기간(오프 치료)에 이어 등록부터 672일에 걸쳐 10번의 방문(8회의 병원 방문 및 2회의 전화 통화) 측정이 뒤따른다.
신생아 및 영아 대상체에서 위약과 비교하여 조성물 A에서 면역학적 바이오마커, 추가 대변 대사 프로파일링, 및 대변 마이크로바이옴 분석을 측정한다. 순환 IgE(총 IgE 및 특정 IgE) 수준, 면역 세포 수, 대변 마이크로바이옴 조성, 대변 및 혈장 대사 프로파일, 대변 및 혈장 면역 자극 능력(시험관 내 분석) 및 기준선에서 치료 종료까지의 증상 점수의 변화를 결정함으로써 박테리아 조성물 A의 치료 기능을 평가한다(2차 종점).
1차 종점은 잠재적으로 알레르기성 질환의 발병을 변형시키는 생균 치료제의 역할에 대한 이전 연구에 기초하여, 알레르기성 질환 발병의 감소와 연관될 수 있는 민감한 PD 마커로 간주한다.
추가 종점에는 다음이 포함된다: 168일 및 672일에 의사가 진단한 아토피 피부염의 발병률; 168일, 336일, 및 672일에 의사가 진단한 식품 알레르기, 만성 비염/알레르기성 비염, 두드러기 및 천명 질환/천식의 발생률(각 진단은 독립적으로 평가됨); 168일, 336일, 및 672일에 식품 및 공기 알레르겐에 대한 과민성의 발병률(계란 흰자, 땅콩, 우유, 고양이, 집 먼지 진드기, 개, 알테나리아(Alternaria)(곰팡이) 및 혼합 잡초 꽃가루에 대한 혈청 알레르겐 특이적 IgE 테스트에 의해 평가됨); 아토피 피부염의 중증도(168, 336, 및 672일에 연구자 종합 평가(IGA: investigator global assessment), SCORAD(SCORing Atopic Dermatitis) 및 IGAxBSA에 의해 평가됨); 168, 336, 및 672일에 천명 질환/천식의 중증도(악화 병력에 의해 평가됨); 알레르기 증상 또는 진단을 위해 처방/사용되는 병용 약물 및 아토피 피부염 및 천명/천식에 대한 구조 약물의 사용; 168, 336, 및 672일에 총 혈청 IgE 수준; 168, 336, 및 672일에 말초 호산구 수; 약리 유전학 샘플(선택 사항); 대변 마이크로바이옴 분석(미생물 조성); 대변 및 혈장 대사 프로파일링(선택된 부위만); 테이프 스트립에 의해 평가된 피부 바이오마커 및 RNA seq 프로파일링; 순환 면역 세포 프로파일링(선택된 부위만); 제대혈(바이오마커/면역 세포 프로파일링)(선택 사항; 선택된 부위만); 대변 및 혈장 면역 자극 능력(생체 외 분석)(선택된 부위만); 파상풍/디프테리아 예방 접종에 대한 역가; 168, 336, 및 672일에 천명 질환/천식의 중증도(천식 조절 설문지(ACQ: Asthma Control Questionnaire)에 의해 평가됨).
1차 연구 종점으로서, 28일 치료 기간 및 그 후 최대 28일(제57일)의 휴약 기간 동안 (i) 이상 반응 보고; (ii) 병용 약물 보고, (iii) 신체 검사 수행 및 활력 징후; 및 (iv) 혈청 화학, 간 및 신장 기능 패널, 혈액학, 전체 혈구 감별 계산 및 소변 검사를 포함한 실험실 테스트에 의해 안전성 평가를 수행한다. 이 연구의 세 번째 부분에서는 안전성 평가를 위해 혈액 및 소변 샘플을 수집하지 않는다. 혈액 및 소변 샘플링이 필요한 평가를 제외한 다른 모든 평가를 수행한다.
하기 매개변수에서 기준선에서 치료 종료까지의 변화를 평가함으로써 2차 연구 평가를 수행한다: i) 대변 마이크로바이옴 분석(박테리아 조성); (ii) 대변 및 혈장 대사 프로파일링; (iii) 대변 및 혈장 면역 자극 능력(시험관 내 분석); (iv) 총 IgE 및 특정 IgE 수준; (v) 순환 면역 세포 프로파일링; (vi) 설문지(들) 및 이상 반응(AE) 및 일기의 약물 사용 보고.
본원의 표 1에 열거된 균주는 2019년 6월 27일 특허 절차상 미생물 기탁의 국제 승인에 관한 부다페스트 조약의 조항하에 또는 그에 따라 독일 브라운슈바이크 D-38124 인호펜슈트 7B에 위치한 Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁되었다. 균주는 DSMZ에 의해 테스트되었고 생존 가능한 것으로 결정되었다. DSMZ는 각각의 균주에 다음의 DSMZ 기탁 등록 번호를 할당하였다: DSM 33213(에이. 뮤시니필라(DSM 33213)), DSM 33179(비. 롱검(DSM 33179)), DSM 33180(비. 프로덕타(DSM 33180)), DSM 33178(비. 테타이오타오미크론(DSM 33178)), DSM 33176(씨. 코메스(DSM 33176)), DSM 33185(에프. 프라우스니치이(DSM 33185)), DSM 33191(에프. 프라우스니치이 (DSM 33191)), DSM 33186(에프. 프라우스니치이(DSM 33213)), DSM 33190(에프. 프라우스니치이(DSM 33190)), DSM 33187(엘. 크리스파투스(DSM 33187)), DSM 22177(비. 페시스(DSM 22177)), 및 DSM 33188(디. 롱기카테나(DSM 33188)).
추가 실시 양태
1. 표 1에 열거된 적어도 하나의 균주를 포함하는 박테리아 컨소시엄; 및 하나 이상의 항산화제를 포함하는 약학 조성물.
2. 실시 양태 1에 있어서, 박테리아 컨소시엄은 표 1에 열거된 2종 이상의 균주를 포함하는 것인 약학 조성물.
3. 실시 양태 1에 있어서, 표 1에 열거된 하나 이상의 균주는 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 또는 엘. 크리스파투스(DSM 33187)를 포함하는 것인 약학 조성물.
4. 실시 양태 1에 있어서, 표 1에 열거된 적어도 하나의 균주는 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187)를 포함하는 것인 약학 조성물.
5. 실시 양태 1에 있어서, 표 1에 열거된 적어도 하나의 균주의 각각의 균주는 약 10^7 CFU 내지 약 10^9 CFU의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
6. 실시 양태 5에 있어서, 표 1에 열거된 적어도 하나의 균주는 약 5x10^8 CFU의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
7. 실시 양태 1에 있어서, 표 1에 열거된 적어도 하나의 균주는 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 총량으로 존재하는 것인 약학 조성물.
8. 실시 양태 7에 있어서, 표 1에 열거된 적어도 하나의 균주는 약 5x10^9 CFU의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
9. 실시 양태 1에 있어서, 하나 이상의 항산화제는 L-시스테인인 약학 조성물.
10. 실시 양태 9에 있어서, L-시스테인은 약 0.05% w/w 내지 약 0.5% w/w의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
11. 실시 양태 1에 있어서, 동결보호제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
12. 실시 양태 11에 있어서, 동결보호제는 글리세롤인 약학 조성물.
13. 실시 양태 12에 있어서, 글리세롤은 약 10% v/v 내지 약 30% v/v의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
14. 실시 양태 1에 있어서, 완충제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
15. 실시 양태 14에 있어서, 완충제는 PBS인 약학 조성물.
16. 실시 양태 1에 있어서, 약학 조성물은 경구 제형으로 제제화되는 약학 조성물.
17. 실시 양태 16에 있어서, 경구 제형은 캡슐, 정제, 에멀젼, 현탁액, 시럽, 겔, 검, 페이스트, 허브 차, 점적제, 용해 과립, 분말, 정제, 동결건조물, 아이스 캔디 또는 아이스크림인 약학 조성물.
18. 실시 양태 16에 있어서, 경구 제형은 현탁액인 약학 조성물.
19. 실시 양태 16에 있어서, 경구 제형은 아이스 캔디, 또는 아이스크림인 약학 조성물.
20. 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187)를 포함하는 박테리아 혼합물; L-시스테인; 및 동결보호제를 포함하는 약학 조성물.
21. 실시 양태 20에 있어서, 박테리아 혼합물의 각각의 균주는 약 5x10^8 CFU의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
22. 실시 양태 20에 있어서, L-시스테인은 약 0.1% w/w의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
23. 실시 양태 20에 있어서, 동결보호제는 글리세롤인 약학 조성물.
24. 실시 양태 23에 있어서, 글리세롤은 약 20% v/v의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
25. 실시 양태 22에 있어서, 완충제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
26. 실시 양태 25에 있어서, 완충제는 인산 완충 식염수(PBS)이고 pH가 약 7.4인 약학 조성물.
27. 실시 양태 20에 있어서, 약학 조성물은 약 1 mL의 총 부피를 갖는 것인 약학 조성물.
28. 실시 양태 20에 있어서, 약학 조성물은 경구 투여를 위한 현탁액으로 제제화되는 약학 조성물.
29. 실시 양태 1 내지 28 중 어느 하나의 약학 조성물을 포함하는 용기.
30. 실시 양태 29에 있어서, 용기는 2 mL 폴리프로필렌 스크류 캡 바이알인 용기.
31. 실시 양태 29에 있어서, 용기는 약 12주 동안 약학 조성물에서 적어도 95%의 박테리아 세포의 생존능을 보존하는 용기.
32. 실시 양태 29 내지 31 중 어느 하나의 용기를 포함하는 키트.
33. 실시 양태 32에 있어서, 인간 사용자에게 용기 내의 약학 조성물을 사용하는 방법을 지시하는 지침을 추가로 포함하는 키트.
34. 실시 양태 1 내지 28 중 어느 하나의 약학 조성물의 제조 방법으로서, 상기 약학 조성물의 2종 이상의 균주를 배양하는 단계로, 배양은 비-동물성 배지에서 수행되는 것인 단계; 및 배양 단계의 생성물을 합하여 박테리아 컨소시엄을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
35. 실시 양태 34에 있어서, 비-동물성 배양 배지는 식물성 배양 배지인 방법.
36. 실시 양태 35에 있어서, 식물성 배양 배지는 식물 펩톤, 식물 추출물, 효모 추출물, N-아세틸 글루코사민(NAG), 트레오닌, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
37. 표 1의 균주의 박테리아 세포 배치의 생산 방법으로서, 비-동물성 배양 배지에서 박테리아 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
38. 실시 양태 37에 있어서, 비-동물성 배양 배지는 식물성 배양 배지인 방법.
39. 실시 양태 38에 있어서, 식물성 배양 배지는 식물 펩톤, 식물 추출물, 효모 추출물, N-아세틸 글루코사민(NAG), 트레오닌, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
40. 실시 양태 39에 있어서, 표 1의 균주는 에이. 뮤시니필라(DSM 33213)인 방법.
41. 실시 양태 39에 있어서, 표 1의 균주는 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)인 방법.
42. 실시 양태 39에 있어서, 표 1의 균주는 엘. 크리스파투스(DSM 33187)인 방법.
43. 표 1의 에이. 뮤시니필라 균주를 포함하는 박테리아 컨소시엄을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법으로서, 에이. 뮤시니필라 세포 배치를 생산하기 위해 변형 NAGT 배양 배지에서 아커만시아속 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
44. 실시 양태 43에 있어서, 변형 NAGT 배양 배지는 소이톤, N-아세틸 글루코사민(NAG), 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
45. 실시 양태 43에 있어서, 변형 NAGT 배양 배지는 마그네슘, 칼슘, 또는 글루코오스 중 임의의 하나 이상을 포함하지 않는 것인 방법.
46. 실시 양태 43에 있어서, 변형 NAGT 배양 배지는 비변형 NAGT 배양 배지와 비교하여 에이. 뮤시니필라 세포의 30-50% 증가된 성장 속도를 제공하는 것인 방법.
47. 실시 양태 46에 있어서, 성장 속도의 증가는 50시간의 세포 배양 후 배양 배지의 600 nm에서의 흡광도의 차이를 측정함으로써 결정되는 것인 방법.
48. 실시 양태 43에 있어서, 에이. 뮤시니필라 균주는 에이. 뮤시니필라(DSM 33213)인 방법.
49. 실시 양태 43에 있어서, 에이. 뮤시니필라 세포 배치는 약 5x10^8 CFU/mL를 포함하는 것인 방법.
50. 페칼리박테리움속을 포함하는 박테리아 컨소시엄을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법으로서, 페칼리박테리움속 세포 배치를 생산하기 위해 비-동물성 배양 배지에서 페칼리박테리움속 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
51. 실시 양태 50에 있어서, 비-동물성 배양 배지는 효모 기반 배양 배지인 방법.
52. 실시 양태 51에 있어서, 효모 기반 배양 배지는 YFAP 비타민 믹스를 포함하는 것인 방법.
53. 실시 양태 51에 있어서, 효모 기반 배양 배지는 아세트산나트륨, 소이톤, 효모 추출물, 시스테인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
54. 실시 양태 51에 있어서, 효모 기반 배양 배지는 아세트산나트륨, 소이톤, 효모 추출물, 및 시스테인을 포함하는 것인 방법.
55. 실시 양태 50에 있어서, 페칼리박테리움속은 에프. 프라우스니치이(DSM 33185)인 방법.
56. 실시 양태 50에 있어서, 페칼리박테리움속 세포 배치는 약 5x10^8 CFU/mL를 포함하는 것인 방법.
57. 엘. 크리스파투스(DSM 33187)를 포함하는 박테리아 컨소시엄을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법으로서, 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포 배치를 생산하기 위해서 효모 기반 배양 배지에서 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
58. 실시 양태 57에 있어서, 락토바실러스속 세포 배치는 5x10^8 CFU/mL를 포함하는 것인 방법.
59. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 실시 양태 1 내지 27 중 어느 하나의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
60. 실시 양태 59에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
61. 실시 양태 60에 있어서, 인간 대상체는 약 18세 내지 약 40세인 방법.
62. 실시 양태 60에 있어서, 인간 대상체는 영아 또는 신생아인 방법.
63. 실시 양태 62에 있어서, 영아는 약 0.5세 내지 약 3세인 방법.
64. 실시 양태 62에 있어서, 신생아는 6개월 이하인 방법.
65. 실시 양태 62에 있어서, 신생아는 3개월 이하인 방법.
66. 실시 양태 57에 있어서, 약학 조성물은 대상체에게 경구 투여되는 것인 방법.
67. 실시 양태 59에 있어서, 박테리아 컨소시엄은 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187)로 이루어진 것인 방법.
68. 실시 양태 59에 있어서, 질환은 염증성 질환인 방법.
69. 실시 양태 59에 있어서, 염증성 질환은 알레르기 또는 피부염인 방법.
70. 실시 양태 69에 있어서, 알레르기는 알레르기성 천식, 알레르기성 소아 천식, 또는 식품 알레르기인 방법.
71. 실시 양태 59에 있어서, 질환은 대사성 질환인 방법.
72. 실시 양태 71에 있어서, 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 또는 대사 증후군인 방법.
본 발명의 바람직한 실시 양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시 양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 명세서 내에 제공된 특정 예에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명이 전술한 명세서를 참조하여 설명되었지만, 본원의 실시 양태의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되어서는 안 된다. 수많은 변형, 변경, 및 대체가 이제 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 발생할 것이다. 또한, 본 발명의 모든 측면은 다양한 조건 및 변수에 의존하는 본원에 기재된 구체적 묘사, 구성 또는 상대적 비율로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에 기재된 본 발명의 실시 양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 임의의 이러한 대안, 변형, 변화 또는 균등물도 포함하는 것으로 고려된다. 다음 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이러한 청구범위 및 그 균등물의 범위 내의 방법 및 구조는 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> SIOLTA THERAPEUTICS, INC. <120> THERAPEUTIC PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS <130> 53206-707.601 <140> <141> <150> 62/911,873 <151> 2019-10-07 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 tatccggact cctccatctg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 tgttcgtgcg ttcttacctg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 3 attcctgaga aggccaggat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 4 ctgccgacaa gcattcctat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 5 accaaggtta gccgcttttt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6 cttgcccaac aaaatgacct 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 7 gtaagctctg tttcggcagc ac 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 8 acattgcacg ctttgccgac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 9 aattcaggtt cggctgctgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 10 caggcagacg ttctgctact 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 11 acgcgtctct ttttgagcac 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 12 ccaaattcaa aggacttggg ct 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 13 cgtagtccac ttaagaaggc cg 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 14 gggctttctt caaacctggc 20

Claims (119)

  1. 고체 제형이고
    i. 아커만시아속(Akkermansia sp .), 페칼리박테리움속(Faecalibacterium sp.), 및 락토바실러스속(Lactobacillus sp .)의 적어도 하나의 균주를 포함하는 정제된 박테리아 집단; 및
    ii. 동결보호제
    를 포함하는 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 동결보호제는 탄수화물 및 항산화제를 포함하는 것인 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 탄수화물은 사카로오스, 트레할로오스, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 항산화제는 아미노산을 포함하는 것인 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 아미노산은 L-글루타메이트, L-시스테인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, L-시스테인은 중량 기준으로 약 0.05% 내지 약 1%의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 동결보호제는 중량 기준으로 약 60% 사카로오스, 약 10% 트레할로오스, 약 1% L-시스테인, 및 약 4% L-글루타메이트를 포함하는 것인 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 약학 조성물은 현탁액으로 제제화되는 약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약학 조성물은 경구 제형으로 제제화되는 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 경구 제형은 캡슐, 정제, 에멀젼, 현탁액, 시럽, 겔, 검, 페이스트, 허브 차, 점적제, 용해 과립, 분말, 정제, 동결건조물, 아이스 캔디, 또는 아이스크림인 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 박테리아 집단은 동결건조된 것인 약학 조성물.
  12. 액체 제형이고
    i. 아커만시아속, 페칼리박테리움속, 및 락토바실러스속의 적어도 하나의 균주를 포함하는 정제된 박테리아 집단; 및
    ii. 항산화제
    를 포함하는 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 동결보호제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 동결보호제는 글리세롤을 포함하는 것인 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 글리세롤은 부피 기준으로 약 10% 내지 약 30%의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 항산화제는 아미노산을 포함하는 것인 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 아미노산은 L-시스테인을 포함하는 것인 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, L-시스테인은 중량 기준으로 약 0.1%의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
  19. 제12항에 있어서, 완충제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 완충제는 인산 완충 식염수(PBS: phosphate buffered saline)이고 pH가 약 7.4인 약학 조성물.
  21. 제12항에 있어서, 약학 조성물은 약 1 mL의 총 부피를 갖는 약학 조성물.
  22. 제12항에 있어서, 용기를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 용기는 2 mL 폴리프로필렌 스크류 캡 바이알인 약학 조성물.
  24. i. 아커만시아속, 락토바실러스속, 및 페칼리박테리움속의 적어도 하나의 균주를 포함하는 정제된 박테리아 집단; 및
    ii. 약학적으로 허용 가능한 부형제
    를 포함하는 약학 조성물로서,
    약학 조성물은 캡슐에 포함되고, 캡슐은 식물 유래 물질을 포함하는 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 식물 유래 물질은 셀룰로오스계 중합체를 포함하는 것인 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 셀룰로오스계 중합체는 풀루란을 포함하는 것인 약학 조성물.
  27. 제24항에 있어서, 캡슐은 캡슐 내의 기체 조성으로 측정할 때 산소 투과도가 약 0.5 cm3/m2/일 미만인 약학 조성물.
  28. 제24항에 있어서, 캡슐은 탈이온수로 37℃에서 측정할 때 붕해 종말점이 약 1.6분인 약학 조성물.
  29. 제24항에 있어서, 동결보호제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 동결보호제는 탄수화물 및 항산화제를 포함하는 것인 약학 조성물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 박테리아 집단은 동결건조된 것인 약학 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아커만시아속, 페칼리박테리움속, 및 락토바실러스속의 적어도 하나의 균주는 표 1에 열거된 균주로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 박테리아 집단은 에이. 뮤시니필라(A. muciniphila)(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(F. prausnitzii)(DSM 33185), 또는 엘. 크리스파투스(L. crispatus)(DSM 33187)를 포함하는 것인 약학 조성물.
  34. 제32항에 있어서, 박테리아 집단은 박테리아 균주 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187) 중 2종 이상을 포함하는 것인 약학 조성물.
  35. 제32항에 있어서, 박테리아 집단은 박테리아 균주 에이. 뮤시니필라(DSM 33213), 에프. 프라우스니치이(DSM 33185), 및 엘. 크리스파투스(DSM 33187)를 포함하는 것인 약학 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각각의 박테리아 균주는 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각각의 박테리아 균주는 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
  38. 제1항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각각의 박테리아 균주는 약 5x10^8 CFU의 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
  39. 제1항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 박테리아 집단은 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU의 총량으로 존재하는 것인 약학 조성물.
  40. 제1항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 박테리아 집단은 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 총량으로 존재하는 것인 약학 조성물.
  41. 제1항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 박테리아 집단은 약 1.5x10^9 CFU의 총량으로 존재하는 것인 약학 조성물.
  42. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제41항 중 어느 하나의 항의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 질환은 염증성 질환인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 염증성 질환은 알레르기 또는 피부염인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 알레르기는 알레르기성 천식, 알레르기성 소아 천식 또는 식품 알레르기인 방법.
  46. 제42항에 있어서, 질환은 대사성 질환인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 또는 대사 증후군인 방법.
  48. 대상체에서 알레르기성 병태의 발병률을 감소시키는 방법으로서, 아커만시아속, 페칼리박테리움속, 및 락토바실러스속의 균주를 포함하는 정제된 박테리아 집단을 포함하는 약학 조성물을 대상체에게 경구 투여하는 단계를 포함하며, 약학 조성물은 적어도 7일 동안 적어도 1일 1회 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 대상체는 약 7일 이하의 신생아인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 대상체는 약 28일 내지 약 12개월의 영아인 방법.
  51. 제48항에 있어서, 약학 조성물은 적어도 28일 동안 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  52. 제48항에 있어서, 약학 조성물은 적어도 336일 동안 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  53. 제48항에 있어서, 약학 조성물은 대상체에게 1일 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 6회 투여되는 것인 방법.
  54. 제48항에 있어서, 알레르기성 병태는 아토피 피부염, 식품 알레르기, 알레르기성 비염, 또는 알레르기성 천식인 방법.
  55. 제48항에 있어서, 대상체는 알레르기성 병태의 병력이 있는 생물학적 어머니, 아버지, 또는 형제자매가 있고, 알레르기성 병태는 아토피 피부염, 식품 알레르기, 알레르기성 비염, 또는 알레르기성 천식인 방법.
  56. 제48항에 있어서, 대상체는 출생체중이 약 2.5 kg 내지 4.5 kg인 방법.
  57. 제48항 내지 제56항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각각의 박테리아 균주는 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU의 양으로 존재하는 것인 방법.
  58. 제48항 내지 제56항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각각의 박테리아 균주는 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 양으로 존재하는 것인 방법.
  59. 제48항 내지 제56항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각각의 박테리아 균주는 약 5x10^8 CFU의 양으로 존재하는 것인 방법.
  60. 제48항 내지 제56항 중 어느 하나의 항에 있어서, 박테리아 집단은 약 10^3 CFU 내지 약 10^12 CFU의 총량으로 존재하는 것인 방법.
  61. 제48항 내지 제56항 중 어느 하나의 항에 있어서, 박테리아 집단은 약 10^7 CFU 내지 약 10^10 CFU의 총량으로 존재하는 것인 방법.
  62. 제48항 내지 제56항 중 어느 하나의 항에 있어서, 박테리아 집단은 약 1.5x10^9 CFU의 총량으로 존재하는 것인 방법.
  63. 제48항에 있어서, 아커만시아속, 페칼리박테리움속, 및 락토바실러스속은 동량으로 투여되는 것인 방법.
  64. 제48항에 있어서, 아커만시아속, 페칼리박테리움속, 및 락토바실러스속은 각각 5x10^8 CFU로 투여되는 것인 방법.
  65. 제48항에 있어서, 탄수화물계 부형제를 추가로 포함하는 방법.
  66. 제48항에 있어서, 약학 조성물은 모유, 조제분유, 또는 식품에 혼합되는 것인 방법.
  67. 제48항에 있어서, 약학 조성물은 동결보호제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 동결보호제는 글리세롤을 포함하는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 글리세롤은 부피 기준으로 약 10% 내지 약 30%의 양으로 존재하는 것인 방법.
  70. 제48항에 있어서, 항산화제를 추가로 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 항산화제는 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 아미노산은 L-시스테인을 포함하는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, L-시스테인은 중량 기준으로 약 0.1%의 양으로 존재하는 것인 방법.
  74. 제48항에 있어서, 약학 조성물은 완충제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 완충제는 인산 완충 식염수(PBS)이고 pH가 약 7.4인 방법.
  76. 제48항에 있어서, 약학 조성물은 약 1 mL의 총 부피를 갖는 것인 방법.
  77. 제48항에 있어서, 약학 조성물은 캡슐에 포함되는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 캡슐은 식물 기반 물질을 포함하는 것인 방법.
  79. 제77항에 있어서, 캡슐은 동결보호제를 포함하는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 동결보호제는 탄수화물 및 항산화제를 포함하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 탄수화물은 사카로오스, 트레할로오스, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  82. 제80항에 있어서, 항산화제는 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 아미노산은 L-글루타메이트, L-시스테인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, L-시스테인은 중량 기준으로 약 0.05% 내지 약 1%의 양으로 존재하는 것인 방법.
  85. 제79항에 있어서, 동결보호제는 중량 기준으로 약 60% 사카로오스, 약 10% 트레할로오스, 약 1% L-시스테인, 및 약 4% L-글루타메이트를 포함하는 것인 방법.
  86. 제79항 내지 제85항 중 어느 하나의 항에 있어서, 박테리아 집단은 동결건조된 것인 방법.
  87. 아커만시아속의 대규모 배양(large-scale growth)을 위한 방법으로서, 증가하는 양의 배양 배지로 복수의 접종 라운드를 수행하는 단계를 포함하며, 각각의 접종 라운드는 선행 접종 라운드의 총 배치 재료의 적어도 약 5%를 포함하는 것인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 아커만시아속은 아커만시아 뮤시니필라 또는 아커만시아 글리카니필라(Akkermansia glycaniphila)를 포함하는 것인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 아커만시아 뮤시니필라는 아커만시아 뮤시니필라(DSM 33213)를 포함하는 것인 방법.
  90. 제87항에 있어서, 배양 배지는 약 1 L 내지 약 4,000 L인 방법.
  91. 제87항에 있어서, 약 1 L 배양 배지의 초기 접종 라운드를 추가로 포함하는 방법.
  92. 제87항에 있어서, 접종 라운드 중 적어도 하나는 적어도 약 3000 L 배양 배지 부피인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 초기 접종 라운드는 초기 접종 라운드 배양 배지의 약 2%의 동결된 아커만시아 뮤시니필라 스톡을 포함하는 것인 방법.
  94. 제91항에 있어서, 초기 접종 라운드는 혐기 조건에서 아커만시아 뮤시니필라를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  95. 제87항에 있어서, 최종 접종 라운드를 추가로 포함하며, 최종 접종 라운드는 적어도 2.5의 OD585의 양으로 존재하는 아커만시아속을 포함하는 것인 방법.
  96. 제87항에 있어서, 선행 접종 라운드의 총 배치 재료의 부피 기준으로 약 10%의 최종 접종 라운드를 추가로 포함하는 방법.
  97. 제87항 내지 제96항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양 배지에 대해 복수의 멸균 및 탈기 라운드를 수행하는 단계를 추가로 포함하며, 각각의 멸균 라운드는 배양 배지를 121℃에서 20분 동안 오토클레이브하는 단계를 포함하고, 각각의 탈기 라운드는 N2H2CO2(90:5:5)로 배양 배지를 탈기시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  98. 제87항 내지 제97항 중 어느 하나의 항 있어서, 배치를 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 동결건조 전에 배치를 원심분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  100. 제98항에 있어서, 동결건조 후에 배치를 분쇄하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  101. 제87항에 있어서, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 7 미만인 방법.
  102. 제87항에 있어서, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 6.5 미만인 방법.
  103. 페칼리박테리움속의 대규모 배양을 위한 방법으로서, 증가하는 양의 배양 배지로 복수의 접종 라운드를 수행하는 단계를 포함하며, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 6.5 미만인 방법.
  104. 제103항에 있어서, 페칼리박테리움속은 페칼리박테리움 프라우스니치이를 포함하는 것인 방법.
  105. 제104항에 있어서, 페칼리박테리움 프라우스니치이는 페칼리박테리움 프라우스니치이(DSM 33185)를 포함하는 것인 방법.
  106. 제103항에 있어서, 배양 배지는 약 1 L 내지 약 4,000 L인 방법.
  107. 제103항에 있어서, 약 1 L 배양 배지의 초기 접종 라운드를 추가로 포함하는 방법.
  108. 제103항에 있어서, 접종 라운드 중 적어도 하나는 적어도 약 3000 L 배양 배지인 방법.
  109. 제107항에 있어서, 초기 접종 라운드는 초기 접종 라운드 배양 배지의 약 0.4%의 동결된 페칼리박테리움 프라우스니치이 스톡을 포함하는 것인 방법.
  110. 제107항에 있어서, 초기 접종 라운드는 혐기 조건에서 페칼리박테리움 프라우스니치이를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  111. 제103항에 있어서, 최종 접종 라운드를 추가로 포함하며, 최종 접종 라운드는 적어도 5의 OD585의 양으로 존재하는 페칼리박테리움속을 포함하는 것인 방법.
  112. 제103항 내지 제111항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양 배지에 대해 복수의 멸균 및 탈기 라운드를 수행하는 단계를 추가로 포함하며, 각각의 멸균 라운드는 배양 배지를 121℃에서 20분 동안 오토클레이브하는 단계를 포함하고, 각각의 탈기 라운드는 N2H2CO2(90:5:5)로 배양 배지를 탈기시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  113. 제103항 내지 제112항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배치를 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  114. 제113항에 있어서, 동결건조 전에 배치를 원심분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  115. 제113항에 있어서, 동결건조 후에 배치를 분쇄하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  116. 제103항에 있어서, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 6 미만인 방법.
  117. 제103항에 있어서, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 5.5 미만인 방법.
  118. 제103항에 있어서, 각각의 접종 라운드의 배양 기간 동안 배양 배지는 pH 값이 약 5 미만인 방법.
  119. 제103항에 있어서, 각각의 접종 라운드는 선행 접종 라운드의 총 배치 재료의 적어도 약 1%를 포함하는 것인 방법.
KR1020227014718A 2019-10-07 2020-10-06 치료용 약학 조성물 KR20220108765A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962911873P 2019-10-07 2019-10-07
US62/911,873 2019-10-07
PCT/US2020/054444 WO2021071864A1 (en) 2019-10-07 2020-10-06 Therapeutic pharmaceutical compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220108765A true KR20220108765A (ko) 2022-08-03

Family

ID=73060072

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227014718A KR20220108765A (ko) 2019-10-07 2020-10-06 치료용 약학 조성물

Country Status (7)

Country Link
US (3) US11406675B2 (ko)
EP (1) EP4041264A1 (ko)
JP (1) JP2022551201A (ko)
KR (1) KR20220108765A (ko)
CN (1) CN114786690A (ko)
CA (1) CA3153884A1 (ko)
WO (1) WO2021071864A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3016059A1 (en) * 2016-03-04 2017-09-08 The Regents Of The University Of California Microbial consortium and uses thereof
WO2019199895A1 (en) 2018-04-10 2019-10-17 Siolta Therapeutics, Inc. Microbial consortia
WO2021071864A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Siolta Therapeutics, Inc. Therapeutic pharmaceutical compositions
WO2022251309A2 (en) * 2021-05-26 2022-12-01 Siolta Therapeutics, Inc. Pharmaceutical compositions and uses thereof
WO2023113541A1 (en) * 2021-12-16 2023-06-22 Enterobiome Inc. Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or inflammatory disease

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4801680A (en) 1987-12-30 1989-01-31 Ppg Industries, Inc. Hydroxyalkylamide powder coating curing system
US8697051B2 (en) 1999-06-09 2014-04-15 Vsl Pharmaceuticals Inc. Composition comprising alkaline sphingomyelinase for use as a dietetic preparation, food supplement or pharmaceutical product
US6641808B1 (en) 1999-09-22 2003-11-04 Lacpro Industries, Llc Composition for treatment of obesity
EP1294886A2 (en) 2000-03-15 2003-03-26 Northwestern University THREE-DIMENSIONAL MODEL OF A Fc REGION OF AN IGE ANTIBODY AND USES THEREOF
CA2437958C (en) 2001-03-09 2018-10-30 University Of Chicago Polymeric immunoglobulin fusion proteins that target low-affinity fc.gamma.receptors
WO2006045347A1 (en) 2004-10-22 2006-05-04 Medinova Ag Lactobacillus helveticus strain useful in the treatment or prevention of infections caused by urogenital pathogens
US7488804B2 (en) 2005-02-02 2009-02-10 The Regents Of The University Of California Modified fusion molecules for treatment of allergic disease
CN101370729B (zh) 2005-07-26 2012-08-29 三菱电机株式会社 乘客输送机
EP2369016A1 (en) 2006-05-25 2011-09-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for diagnosing and treating graft rejection and inflammatory conditions
TW200819540A (en) 2006-07-11 2008-05-01 Genelux Corp Methods and compositions for detection of microorganisms and cells and treatment of diseases and disorders
EP2102350A4 (en) 2006-12-18 2012-08-08 Univ St Louis INTESTINAL MICROBIOMA AS A BIOMARKER AND THERAPEUTIC TARGET FOR TREATING OBESITY OR OBESITY-RELATED DISORDER
TWI356680B (en) 2007-01-05 2012-01-21 Promd Biotech Co Ltd Anti-allergy lactic acid bacteria
EP2337569A4 (en) 2008-09-25 2013-04-03 Univ New York COMPOSITIONS AND METHODS FOR CHARACTERIZING AND RESTORING THE GASTROINTESTINAL, SKIN AND NASAL MICROBIOTA
SI2486141T1 (en) 2009-10-07 2018-06-29 Macrogenics, Inc. FC REGION-CONTAINING POLYPETHYDE, AFFECTING A BETTERED EFFECTORAL FUNCTION, BY CHANGES IN THE SCOPE OF FUKOZILATION AND METHODS FOR THEIR USE
US20110189220A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 New Chapter Inc. Mushroom compositions and methods for making and using
WO2011151941A1 (ja) 2010-06-04 2011-12-08 国立大学法人東京大学 制御性ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する組成物
WO2012039615A2 (en) 2010-09-21 2012-03-29 Winclove Bio Industries B.V. Commensal rat ileum bacterium (crib)
CN102132788B (zh) 2011-03-22 2012-11-21 淮阴工学院 水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备及应用方法
WO2013037067A1 (en) 2011-09-14 2013-03-21 University Of Guelph Media supplements and methods to culture human gastrointestinal anaerobic microorganisms
EP2773357A4 (en) * 2011-11-04 2015-08-26 Gen Mills Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING GASTROINTESTINAL BACTERIA TO PROMOTE HEALTH
EP2828375B1 (en) 2012-01-19 2017-11-22 University College Cork-National University of Ireland, Cork Gaba-producing culturable bacteria derived from the human gastrointestinal tract
CN108771687A (zh) 2012-02-29 2018-11-09 伊西康内外科公司 微生物区系的组合物及与其相关的方法
US9421233B2 (en) 2012-04-27 2016-08-23 Cedars-Sinai Medical Center Fungal mycobiome as probiotics, diagnostics and therapeutics
US9834597B2 (en) 2012-09-21 2017-12-05 The Regents Of The University Of California Modified FC polypeptides, FC conjugates, and methods of use thereof
US10036074B2 (en) 2012-10-17 2018-07-31 Institut Pasteur Gene signatures of inflammatory disorders that relate to the liver
WO2014075745A1 (en) 2012-11-19 2014-05-22 Université Catholique de Louvain Use of akkermansia for treating metabolic disorders
US8906668B2 (en) 2012-11-23 2014-12-09 Seres Health, Inc. Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
NZ709392A (en) 2012-11-23 2016-10-28 Seres Therapeutics Inc Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
BR112015018625A2 (pt) 2013-02-04 2017-09-19 Seres Therapeutics Inc composições e métodos
JP6464142B2 (ja) 2013-03-14 2019-02-06 セラバイオーム，エルエルシー プロバイオティクス生物及び／又は治療剤の標的化胃腸管デリバリー
AU2014232370B2 (en) * 2013-03-15 2018-11-01 Seres Therapeutics, Inc. Network-based microbial compositions and methods
US20150004161A1 (en) 2013-07-01 2015-01-01 University Of Maryland Fc Coupled Compositions and Methods of Their Use
US9558491B2 (en) 2013-09-30 2017-01-31 Square, Inc. Scrambling passcode entry interface
US10058576B2 (en) 2013-10-03 2018-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods comprising a defined microbiome and methods of use thereof
BR112016011830A2 (pt) 2013-11-25 2017-09-26 Seres Therapeutics Inc composições bacterianas sinergísticas e métodos para produção e uso das mesmas.
WO2015095241A2 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Seres Health, Inc. Bacterial compositions and methods of use thereof for treatment of immune system disorders
CN106535908A (zh) 2014-02-14 2017-03-22 凡赛尔医药股份有限公司 包括动物双歧杆菌亚种乳酸菌lmg p‑28149的组合物
US20150246081A1 (en) 2014-03-03 2015-09-03 Shayne Kenneth Morris Probiotics with methods for growth and use separately and in combination
CA2943775A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods and genetic systems for cell engineering
KR101445243B1 (ko) 2014-03-28 2014-09-29 서울대학교산학협력단 장내 세균의 군집과 기능의 변화를 이용한 대사성 및 염증성 질환의 조기진단
CA2956179C (en) 2014-07-25 2023-12-12 The University Of Queensland Bacillus amyloliquefaciens probiotic compositions, methods of production, and methods of use
US20160108105A1 (en) 2014-10-06 2016-04-21 Genexine, Inc. Human igg4 fc polypeptide variant
CA2964480A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Whole Biome Inc. Methods and compositions relating to microbial treatment and diagnosis of disorders
MA41020A (fr) 2014-11-25 2017-10-03 Evelo Biosciences Inc Compositions probiotiques et prébiotiques, et leurs procédés d'utilisation pour la modulation du microbiome
WO2016130830A1 (en) 2015-02-11 2016-08-18 The Fix, Llc Compositions and methods for combination ingredient delivery
EP3270938A4 (en) 2015-03-18 2018-12-19 Whole Biome Inc. Methods and compositions relating to microbial treatment and diagnosis of skin disorders
US20170235902A1 (en) 2015-04-13 2017-08-17 uBiome, Inc. Method and system for characterization of clostridium difficile associated conditions
EA201800199A1 (ru) 2015-09-10 2018-12-28 Университе Католик Де Лувен Применение akkermansia muciniphila для лечения метаболических расстройств, увеличения расхода энергии и снижения веса, композиции, лекарственное стедство
US20190216861A1 (en) 2015-09-22 2019-07-18 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for using biomarkers which predict susceptibility to clostridium difficile infection
JP2018534277A (ja) 2015-10-05 2018-11-22 シュヴァイツェリッシェ フォルシュングスインスティテュート フュア ホーフゲブリクスクリーマ ウント メディツィン イン ダヴォス 炎症性状態を治療するためのアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の使用
IL298281A (en) * 2015-11-03 2023-01-01 Brigham & Womens Hospital Inc Medical microbiota for the treatment and/or prevention of food allergy
ES2960781T3 (es) 2016-02-04 2024-03-06 Univ Gent Uso de comunidades microbianas para la salud humana y animal
CA3016059A1 (en) * 2016-03-04 2017-09-08 The Regents Of The University Of California Microbial consortium and uses thereof
CA3016911A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Holobiome, Inc. Modulation of the gut microbiome to treat mental disorders or diseases of the central nervous system
DK3443071T3 (da) 2016-04-11 2022-01-31 Univ Wageningen Hidtil ukendt bakterieart
US11090342B2 (en) 2016-04-11 2021-08-17 President And Fellows Of Harvard College Probiotic formulations for improving athletic performance
EP3442546A4 (en) 2016-04-15 2020-03-25 National Health Research Institutes ANTI-OBESITY MICROBIOTE COMPOSITIONS AND METHODS OF PREPARATION AND USES THEREOF
EP3522902A1 (en) 2016-10-04 2019-08-14 Institut National de la Recherche Agronomique Use of ahr agonist for the preventive or curative treatment of metabolic syndrome and the associated disorders
CN110267669A (zh) 2016-12-06 2019-09-20 潘德勒姆治疗公司 与分离并纯化的微生物有关的方法和组合物
CA3058943C (en) 2017-04-03 2023-10-17 Gusto Global, Llc Rational design of microbial-based biotherapeutics
EP3612199A4 (en) 2017-04-17 2021-01-06 Baylor College of Medicine COMMENSAL BACTERIA AS A NEW TREATMENT FOR DRY EYE AND SJÖGREN'S SYNDROME
US20200360450A1 (en) 2017-08-07 2020-11-19 Finch Therapeutics, Inc. Treatment of liver disease by modulation of the microbiome
CN111328331A (zh) 2017-08-07 2020-06-23 芬奇治疗公司 用于将肠道中的抗生素抗性细菌去定植的组合物和方法
AU2018313766A1 (en) 2017-08-07 2020-02-20 Finch Therapeutics, Inc. Compositions and methods for maintaining and restoring a healthy gut barrier
US20200197451A1 (en) 2017-08-18 2020-06-25 Baylor College Of Medicine Lectin-bound bacteria and uses thereof
US20200188310A1 (en) * 2017-08-29 2020-06-18 Chr. Hansen A/S Stable capsules with fecal microbiota or a culture of microorganisms
CN111372596A (zh) 2017-08-30 2020-07-03 潘德勒姆治疗公司 用于治疗微生物组相关病症的方法和组合物
EP3723776A4 (en) 2017-12-11 2022-07-27 Vedanta Biosciences, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR SUPPRESSING PATHOGENIC ORGANISMS
JP2021509904A (ja) 2018-01-05 2021-04-08 ニューバイヨタ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＮｕｂｉｙｏｔａ， ＬＬＣ 共選択された微生物叢を含む組成物及びその使用方法
US20190262407A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 LifeBridge Health, Inc. Probiotic compositions and methods of use thereof
WO2019168990A1 (en) 2018-02-27 2019-09-06 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Probiotics and probiotic compositions for regulating body weight
WO2019166533A1 (en) 2018-03-01 2019-09-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for prognosing and treating metabolic diseases
WO2019199895A1 (en) 2018-04-10 2019-10-17 Siolta Therapeutics, Inc. Microbial consortia
CN108891725B (zh) * 2018-09-28 2020-04-03 河北大学 肠道菌群重建试剂盒及其应用
WO2020172473A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Siolta Therapeutics, Inc. Compositions for disease treatment
WO2021071864A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Siolta Therapeutics, Inc. Therapeutic pharmaceutical compositions

Also Published As

Publication number Publication date
US20210401909A1 (en) 2021-12-30
EP4041264A1 (en) 2022-08-17
CN114786690A (zh) 2022-07-22
CA3153884A1 (en) 2021-04-15
WO2021071864A1 (en) 2021-04-15
US20240173368A1 (en) 2024-05-30
US11806373B2 (en) 2023-11-07
US11406675B2 (en) 2022-08-09
JP2022551201A (ja) 2022-12-07
US20220362313A1 (en) 2022-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11806373B2 (en) Therapeutic pharmaceutical compositions
US11464812B2 (en) Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
US20230226126A1 (en) Synergistic Bacterial Compositions and Methods of Production and Use Thereof
US20220133814A1 (en) Faecalibacterium prausnitzii and desulfovibrio piger for use in the treatment or prevention of diabetes and bowel diseases
JP2015512936A (ja) プレバイオティクス組成物およびその使用方法
US11083761B2 (en) High potency stable formulations of vaginal Lactobacillus
US20130195820A1 (en) Use of blood group status iii
JP2010265303A (ja) 下痢の処置方法
Herfel et al. Dietary supplementation of Bifidobacterium longum strain AH1206 increases its cecal abundance and elevates intestinal interleukin-10 expression in the neonatal piglet
US20240183861A1 (en) Pharmaceutical compositions and uses thereof
KR20090115960A (ko) 인플루엔자 백신에 의해 제공된 보호를 증가하기 위한 락토바실러스 카제이의 용도
CN107427461B (zh) 活化乳酸细菌的方法
Kubašová et al. Application of canine-derived DSM 32820 in dogs with acute idiopathic diarrhoea
US20240091278A1 (en) Pharmaceutical compositions for treating diseases
RU2797466C2 (ru) Faecalibacterium prausnitzii и desulfovibrio piger для применения при лечении или предупреждении диабета и заболеваний кишечника
Fresno et al. Effect of feeding dairy calves with milk fermented with selected probiotic strains on occurrence of diarrhoea, carriage of pathogenic and zoonotic microorganisms and growth performance