CN114786690A - 治疗性药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包含细菌聚生体和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。可将该药物组合物口服施用于对象以预防和/或治疗生态失调、生态失调相关的病症、炎症和自身免疫性疾病。

Description

治疗性药物组合物
交叉引用
本申请要求于2019年10月7日提交的美国临时申请号62/911,873的权益，其全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2020年10月2日，名为53206-707_601_SL.txt，大小为3,713字节。
发明背景
微生物组和基因组研究领域的最新发展证明了人肠道的细菌组成从根本上影响人类健康、疾病发作和进展。然而，关于微生物组与宿主的关系、由于微生物组组成而导致的宿主功能和代谢变化以及用于治疗应用的细菌组合物的潜在开发，仍有许多未知之处。例如，尽管有确定的遗传成分导致诸如过敏和哮喘等炎性疾病的风险，但包括微生物暴露和微生物组组成在内的环境因素在这些疾病的病因学中起着关键作用。来自临床试验的数据表明，最终出现过敏和哮喘的婴儿的肠道微生物组在细菌种类组成和免疫调节活性方面是不同的。过敏性疾病发病率的上升通常令人担心，而哮喘令人担忧是因为它代表了迅速增长的全球问题。由于这些过敏性疾病中的任意一种都无法治愈，因此它们代表了重大的公共卫生挑战，花费了数十亿美元来控制它们的症状。例如，仅在美国，哮喘每年就花费超过560亿美元的过高成本负担，其中近200亿美元用于疗效不一且可能产生严重副作用的标准护理治疗。因此，扩大治疗选择(例如针对过敏性疾病预防的免疫调节微生物组合物)将解决严重未满足的需求，特别是在受影响不成比例的儿科人群中。
发明内容
本文提供了固体剂型的药物组合物，并且包含：纯化的细菌种群，其包括阿克曼菌属(Akkermansia sp.)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium sp.)和乳杆菌属(Lactobacillussp.)的至少一种菌株；以及冷冻保护剂。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述冷冻保护剂包括碳水化合物和抗氧化剂。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述碳水化合物包括蔗糖、海藻糖或其组合。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述抗氧化剂包括氨基酸。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述氨基酸包括L-谷氨酸、L-半胱氨酸或其组合。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述L-半胱氨酸的存在量按重量计为约0.05％至约1％。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述冷冻保护剂按重量计包含约60％的蔗糖、约10％的海藻糖、约1％的L-半胱氨酸和约4％的L-谷氨酸。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述药物组合物配制成悬浮剂。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述药物组合物配制成口服剂型。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述口服剂型为胶囊剂、片剂、乳剂、悬浮剂、糖浆剂、凝胶剂、口香糖、糊剂、凉茶、滴剂、溶解颗粒剂、粉剂、片剂、冻干剂、冰棒或冰淇淋。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述细菌种群是冻干的。
本文提供了液体剂型的药物组合物，并且包含：纯化的细菌种群，其包含阿克曼菌属(Akkermansia sp.)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium sp.)和乳杆菌属(Lactobacillussp.)的至少一种菌株；以及抗氧化剂。本文进一步提供了一种药物组合物，进一步包含冷冻保护剂。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述冷冻保护剂包括甘油。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述甘油的存在量按体积计为约10％至约30％。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述抗氧化剂包括氨基酸。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述氨基酸包括L-半胱氨酸。本文进一步提供了一种药物组合物，其中L-半胱氨酸的存在量按重量计为约0.1％。本文进一步提供了一种药物组合物，进一步包含缓冲剂。本文进一步提供了一种药物组合物，其中缓冲剂为磷酸盐缓冲盐水(PBS)并且pH为约7.4。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述药物组合物的总体积为约1mL。本文进一步提供了一种药物组合物，进一步包括容器。本文进一步提供了一种药物组合物，其中容器是2mL聚丙烯螺旋盖小瓶。
本文提供了药物组合物，包含：纯化的细菌种群，其包含阿克曼菌属(Akkermansiasp.)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium sp.)和乳杆菌属(Lactobacillus sp.)的至少一种菌株；以及药学上可接受的赋形剂，其中所述药物组合物包含在胶囊中，并且其中所述胶囊包含植物来源的材料。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述植物来源的材料包括基于纤维素的聚合物。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述基于纤维素的聚合物包括普鲁兰多糖(pullulan)。本文进一步提供了一种药物组合物，其中由胶囊中的气体组合物所测定，所述胶囊的透氧性为小于约0.5cm3/m2/天。本文进一步提供了一种药物组合物，其中由37℃用去离子水所测定，胶囊的崩解终点为约1.6分钟。本文进一步提供了一种药物组合物，进一步包含冷冻保护剂。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述冷冻保护剂包括碳水化合物和抗氧化剂。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述细菌种群是冻干的。本文进一步提供了一种药物组合物，其中阿克曼菌属(Akkermansia sp.)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium sp.)和乳杆菌属(Lactobacillus sp.)的至少一种菌株选自表1中所列的菌株。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述细菌种群包含嗜黏蛋白阿克曼菌(A.muciniphila)(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(F.prausnitzii)(DSM 33185)或卷曲乳杆菌(L.crispatus)(DSM 33187)。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述细菌种群包含细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)中的至少两种。本文进一步提供了一种药物组合物，其中所述细菌种群包含细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM33187)。本文进一步提供了一种药物组合物，其中每种细菌菌株的存在量为约10^3CFU至约10^12CFU。本文进一步提供了一种药物组合物，其中每种细菌菌株的存在量为约10^7CFU至约10^10CFU。本文进一步提供了一种药物组合物，其中每种细菌菌株的存在量为约5x10^8CFU。本文进一步提供了一种药物组合物，其中细菌种群的总存在量为约10^3CFU至约10^12CFU。本文进一步提供了一种药物组合物，其中细菌种群的总存在量为约10^7CFU至约10^10CFU。本文进一步提供了一种药物组合物，其中细菌种群的总存在量为约1.5x10^9CFU。
本文提供了一种治疗对象的疾病的方法，所述方法包括向对象施用前文描述的任意药物组合物。本文进一步提供了一种治疗对象的疾病的方法，其中所述疾病为炎性疾病。本文进一步提供了一种治疗对象的疾病的方法，其中所述炎性疾病为过敏或皮炎。本文进一步提供了一种治疗对象的疾病的方法，其中所述过敏为过敏性哮喘、过敏性小儿哮喘或食物过敏。本文进一步提供了一种治疗对象的疾病的方法，其中所述疾病为代谢疾病。本文进一步提供了一种治疗对象的疾病的方法，其中所述代谢疾病为肥胖、糖尿病或代谢综合征。
本文提供了降低对象的过敏性病症的发生率的方法，所述方法包括向对象口服施用药物组合物，所述药物组合物包含纯化的细菌种群，所述细菌种群包含阿克曼菌属、栖粪杆菌属和乳杆菌属的菌株，其中每天向所述对象施用所述药物组合物至少一次，持续至少7天。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述对象为等于或小于约7天龄的新生儿。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述对象为约28天至约12个月龄的婴儿。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中向所述对象施用所述药物组合物至少28天。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中向所述对象施用所述药物组合物至少336天。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中每天向所述对象施用所述药物组合物一次、两次、三次、四次、五次或六次。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中每天向所述对象施用所述药物组合物一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次或十二次。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述过敏性病症为特应性皮炎、食物过敏、过敏性鼻炎或过敏性哮喘。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述对象有具有过敏性病症史的生物学母亲、父亲或兄弟姐妹，其中所述过敏性病症为特应性皮炎、食物过敏、过敏性鼻炎或过敏性哮喘。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述对象的出生体重为约2.5kg至4.5kg。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中每种细菌菌株的存在量为约10^3CFU至约10^12CFU。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中每种细菌菌株的存在量为约10^7CFU至约10^10CFU。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中每种细菌菌株的存在量为约5x10^8CFU。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中细菌种群的总存在量为约10^3CFU至约10^12CFU。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中细菌种群的总存在量为约10^7CFU至约10^10CFU。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中细菌种群的总存在量为约1.5x10^9CFU。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中等量施用所述阿克曼菌属、栖粪杆菌属和乳杆菌属。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中分别以5x10^8CFU施用阿克曼菌属、栖粪杆菌属和乳杆菌属。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，进一步包括基于碳水化合物的赋形剂。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中将所述药物组合物混入母乳、配方奶或食物中。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中悬浮剂包括冷冻保护剂。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述冷冻保护剂包括甘油。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述甘油的存在量按体积计为约10％至约30％。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，进一步包含抗氧化剂。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述抗氧化剂包括氨基酸。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述氨基酸包括L-半胱氨酸。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述L-半胱氨酸的存在量按重量计为约0.1％。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，进一步包含缓冲液。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)并且pH为约7.4。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述药物组合物的总体积为约1mL。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述组合物包含在胶囊中。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述胶囊包含基于植物的材料。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述胶囊包含冷冻保护剂。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述冷冻保护剂包括碳水化合物和抗氧化剂。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述碳水化合物包括蔗糖、海藻糖或其组合。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述抗氧化剂包括氨基酸。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述氨基酸包括L-谷氨酸、L-半胱氨酸或其组合。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述L-半胱氨酸的存在量按重量计为约0.05％至约1％。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述冷冻保护剂按重量计包含约60％的蔗糖、约10％的海藻糖、约1％的L-半胱氨酸和约4％的L-谷氨酸。本文进一步提供了一种降低对象的过敏性病症的发生率的方法，其中所述细菌种群是冻干的。
本文提供了用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，所述方法包括用渐增量的生长培养基进行多轮接种，其中每轮接种都包括至少约5％的前一轮接种的总批料。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，其中所述阿克曼菌属包括嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)或Akkermansia glycaniphila。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，其中所述嗜黏蛋白阿克曼菌包括嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，其中生长培养基为约1L至约4,000L。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，进一步包括对约1L生长培养基进行初始轮接种。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，其中对体积为至少约3000L的生长培养基进行至少一轮接种。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，其中初始轮接种包括约2％的初始轮接种生长培养基的嗜黏蛋白阿克曼菌的冷冻原液。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，其中初始轮接种包括在厌氧条件下生长嗜黏蛋白阿克曼菌。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，进一步包括最后一轮接种，其中所述最后一轮接种包含以至少2.5的OD600的量存在的阿克曼菌属。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，进一步包括按体积计约10％的前一轮接种的总批料的最后一轮接种。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，进一步包括对生长培养基进行多轮灭菌，其中每轮灭菌包括用N2H2CO2(90:5:5)对生长培养基进行脱气。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，进一步包括将批料冻干。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，进一步包括在所述冻干之前将批料离心。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，进一步包括在所述冻干后研磨批料。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，其中在每轮接种的生长期间，生长培养基的pH值小于约7。本文进一步提供了一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，其中在每轮接种的生长期间，生长培养基的pH值小于约6.5。
本文提供了用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，所述方法包括用渐增量的生长培养基进行多轮接种，其中在每轮接种的生长期间，生长培养基的pH值小于约6.5。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，其中所述栖粪杆菌属包括普氏栖粪杆菌。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，其中所述栖粪杆菌属包括普氏栖粪杆菌。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，其中所述普氏栖粪杆菌包括普氏栖粪杆菌(DSM 33185)。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，其中生长培养基为约1L至约4,000L。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，进一步包括对约1L生长培养基进行初始轮接种。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，其中至少一轮接种为至少约3000L的生长培养基。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，其中初始轮接种包括约0.4％的初始轮接种生长培养基的普氏栖粪杆菌的冷冻原液。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，其中初始轮接种包括在厌氧条件下培养普氏栖粪杆菌。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，进一步包括最后一轮接种，其中所述最后一轮接种包含以至少5的OD600的量存在的栖粪杆菌属。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，进一步包括对生长培养基进行多轮灭菌和脱气，其中每一轮灭菌包括在121℃对生长培养基高压灭菌20分钟，并且其中每一轮脱气包括用N2H2CO2(90:5:5)对生长培养基进行脱气。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，进一步包括将批料冻干。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，进一步包括在所述冻干之前将批料离心。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，进一步包括在所述冻干后研磨批料。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，其中在每轮接种的生长期间，生长培养基的pH值小于约6。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，其中在每轮接种的生长期间，生长培养基的pH值小于约5.5。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，其中在每轮接种的生长期间，生长培养基的pH值小于约5。本文进一步提供了一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，其中每一轮接种包含至少约1％的前一轮接种的总批料。
附图说明
在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下用于阐述说明性实施方案(采用本发明的原理)和附图(本文中称为图)的详细描述将更好地理解本发明的特征和优点，其中附图为：
图1显示了概括如本文所述的组合物的制备步骤的示意性流程图。
图2显示了在600纳米(本文中也称为“OD600”)波长处随时间的光吸收图，用于测量嗜黏蛋白阿克曼菌在改良的NAGT培养基中随时间的生长。数据来自培养基的变化，所述培养基包括：未改良的NAGT培养基、改良的NAGT培养基、不含葡萄糖的改良的NAGT培养基、不含钙的改良的NAGT培养基和不含镁的改性NAGT培养基。
图3显示了在600纳米波长处随时间的光吸收图，用于测量嗜黏蛋白阿克曼菌在不同NAGT培养基中随时间的生长。数据来自培养基的变化，所述培养基包括：未改良的NAGT培养基、不含NAG的NAGT和不含大豆蛋白胨(soytone)的NAGT。
图4显示了在600纳米波长处随时间的光吸收图，用于测量普氏栖粪杆菌在不同生长培养基中随时间的生长。数据来自培养基的变化，所述培养基包括：完全培养基、不含乙酸钠的培养基、不含大豆蛋白胨的培养基、不含酵母提取物的培养基和不含半胱氨酸的培养基。
图5显示了在600纳米波长处随时间的光吸收图，用于测量普氏栖粪杆菌(DSM33185)在具有不同补充剂的YFAP培养基中的生长。普氏栖粪杆菌在不含维生素的YFAP中传代3次，然后在具有不同补充剂的YFAP培养基中生长。数据来自培养基的变化，所述培养基包括：含有完整维生素混合物的YFAP培养基(维生素混合溶液)(YFAP+维生素)、不含生物素的YFAP培养基(YFAP无生物素)、不含钴胺素的YFAP培养基(YFAP无钴胺素)、不含PABA的YFAP培养基(YFAP无PABA)、不含叶酸的YFAP培养基(YFAP无叶酸)、不含吡哆胺的YFAP培养基(YFAP无吡哆胺)、不含硫胺素的YFAP培养基(YFAP无硫胺素)、不含核黄素的YFAP培养基(YFAP无核黄素)和不含完整维生素混合物的YFAP培养基(YFAP无维生素)。维生素的添加使普氏栖粪杆菌的生长增加了约10％。
图6显示了在600纳米波长处随时间的光吸收图，用于测量普氏栖粪杆菌(DSM33185)在具有不同补充剂的YFAP培养基中的生长。普氏栖粪杆菌在不含维生素的YFAP中传代1次。数据来自培养基的变化，所述培养基包括：含有完整维生素混合物的YFAP培养基(维生素混合溶液)(YFAP+维生素)、不含生物素的YFAP培养基(YFAP无生物素)、不含钴胺素的YFAP培养基(YFAP无钴胺素)、不含PABA的YFAP培养基(YFAP无PABA)、不含叶酸的YFAP培养基(YFAP无叶酸)、不含吡哆胺的YFAP培养基(YFAP无吡哆胺)、不含硫胺素的YFAP培养基(YFAP无硫胺素)、不含核黄素的YFAP培养基(YFAP无核黄素)和不含完整维生素混合物的YFAP培养基(YFAP无维生素)。缺乏完整的维生素混合物或钴胺素使普氏栖粪杆菌的生长减少了约30％。
图7显示了在600纳米波长处随时间的光吸收图，用于测量普氏栖粪杆菌(DSM33185)在没有pH控制的YFAP培养基中的生长。在第24小时接种培养物，以100rpm搅拌，并在37℃温育。当pH值不固定时，其下降至约5.5。在-400mV下维持氧化还原，细菌生长达到OD600＝1.1。第24小时之前的任意读数都代表每次测量的基准值。
图8显示了在600纳米波长处随时间的光吸收图，用于测量普氏栖粪杆菌(DSM33185)在没有pH控制的YFAP培养基中的生长。在第24小时接种培养物，以100rpm搅拌，并在37℃温育。当通过添加氢氧化铵(NH4OH)将pH值固定为6.75时，氧化还原下降至-460mV，同时细菌生长稳定在约OD600＝0.5。第24小时之前的任意读数都代表每次测量的基准值。
图9显示了卷曲乳杆菌(L.cripatus)随时间在不同的生长培养基中的生长在600纳米波长处随时间的光吸收图。该图表比较了Boullionv MRS肉汤和HiMediav MRS肉汤中卷曲乳杆菌(L.cripatus)的生长情况。
图10显示了在585纳米波长处(在本文中也称为“OD585”)(左侧的Y轴)的光吸收和葡萄糖浓度(g/L)(右侧的Y轴)随时间的图，用于嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)20升培养物在NAGT培养基中的生长。该图显示了嗜黏蛋白阿克曼菌的生长和血糖水平随时间的关系。在第27和第48小时添加(*)葡萄糖(4.52g/L)和N-乙酰氨基葡萄糖(5.54g/L)使嗜黏蛋白阿克曼菌培养物在第25至第50小时之间保持在指数期并在第50小时后进入稳定期。
图11显示了在585纳米波长处(左侧的Y轴)的光吸收和葡萄糖浓度(g/L)(右侧的Y轴)随时间的图，用于卷曲乳杆菌(DSM33187)20升培养物在Vegitone MRS培养基中的生长。该图显示了卷曲乳杆菌(DSM33187)的生长和血糖水平随时间的关系。在第10和第11小时两次添加(第一次给料*和第二次给料**)葡萄糖(10g/L)使卷曲乳杆菌培养物在第11至第14小时之间保持在指数期并在第14小时后进入稳定期。
图12显示了在585纳米波长处(左侧的Y轴)的光吸收和葡萄糖浓度(g/L)(右侧的Y轴)随时间的图，用于普氏栖粪杆菌(DSM33185)20升培养物在FAP培养基中的生长。该图显示了普氏栖粪杆菌(DSM 33185)的生长和血糖水平随时间的关系。在第9小时添加(第一次给料*)葡萄糖(10g/L)使普氏栖粪杆菌培养物在第9至第14小时之间保持在指数期。
图13显示了在585纳米波长处(左侧的Y轴)的光吸收和葡萄糖浓度(g/L)(右侧的Y轴)随时间的图，用于嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)150升培养物在NAGT培养基中的生长。该图显示了嗜黏蛋白阿克曼菌的生长和血糖水平随时间的关系。在第19小时添加(*)葡萄糖(4.52g/L)和N-乙酰氨基葡萄糖(5.54g/L)使嗜黏蛋白阿克曼菌培养物在第20小时之后保持在指数期。
图14显示了在585纳米波长处(左侧的Y轴)的光吸收和葡萄糖浓度(g/L)(右侧的Y轴)随时间的图，用于卷曲乳杆菌(DSM 33187)150升培养物在Vegitone MRS培养基中的生长。该图显示了卷曲乳杆菌(DSM33187)的生长和血糖水平随时间的关系。在第10小时添加(*)葡萄糖(35g/L)使卷曲乳杆菌培养物在第10至第12小时之间保持在指数期并在第12小时后进入稳定期。
图15显示了在600纳米波长处随时间的光吸收图，用于测量1L普氏栖粪杆菌(DSM33185)培养物在YFAP-NU培养基中随时间的生长。
图16显示了在600纳米波长处随时间的光吸收图，用于测量150L普氏栖粪杆菌(DSM 33185)培养物在YFAP-NU培养基中随时间的生长。在第8小时添加(*)葡萄糖(10g/L)使普氏栖粪杆菌培养物进入指数期并达到稳定期。
图17A-图17C显示了热灭活的对照嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞的流式细胞术门控实验，用于量化细菌细胞群(例如，可施用于人对象的细胞群)中的代谢活性治疗菌株。用作示例菌株，嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞原液在0.9％NaCl缓冲溶液中稀释至10^-4M，并置于95℃的加热块中20分钟以确保细胞死亡，然后再进行实验。细胞用2μM碘化丙啶和2μM的SYTO9染色。将门应用于由前向散射面积(Forward Scatter Area，FSC-A)和侧向散射面积(Side Scatter Area，SSC-A)计数的所有细胞(图17A)，以分别选择细胞大小和粒度。然后，根据前向散射高度(FSC-H)和前向散射面积(FSC-A)对这些细胞进行线性门控，以识别单个细胞(图17B)。然后，使用单个细胞设置死细胞(PIhighSYTO9low)和活细胞(PI-SYTO9high)的门控，从而得出50μl溶液中活细胞和死细胞的百分比(图17C)。
图17A显示了当门应用于由前向散射面积(FSC-A)和侧向散射面积(SSC-A)计数的所有细胞，以分别选择细胞大小和粒度时获得的流式细胞术结果。
图17B显示了当基于前向散射高度(FSC-H)和前向散射面积(FSC-A)对细胞进行线性门控以识别单个细胞时获得的流式细胞术结果。
图17C显示了当使用单个细胞设置死细胞(PIhighSYTO9low)和活细胞(PI-SYTO9high)的门控时获得的流式细胞术结果，其给出了50μL细胞悬液中活细胞和死细胞的百分比。
图18显示了将活细胞的流式细胞术量化数据与使用(标准)琼脂平板法确定的总活细胞数量进行比较的图表。左侧y轴显示了通过流式细胞仪测量的总活细胞数。右侧y轴显示了从用于生物重复的营养琼脂板计算出的平均CFU/mL值。双尾Mann Whitney t检验显示了两种量化方法的平均值之间没有显著差异，p值为0.0532。
图19A-图19C显示了在粪便样本中分别用于量化细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM33213)(图19A)和普氏栖粪杆菌(DSM 33185)(图19B)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)(图19C)的检测曲线限制(绘制对照阈值与细菌细胞数的图)。虚线连接实测数据点，直线表示拟合回归线，并且“R2”为决定系数。所示数据代表使用在粪便DNA背景中稀释的50纳克(ng)三种菌株的总DNA(菌株DNA+粪便DNA)的纯细菌DNA(10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001和0.00001ng))生成的标准曲线。在分析人体样本以确定菌株(例如，嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM33187))DNA数量的情况下，可以并行运行和分析对照样本，以确保实验中使用的DNA引物能够适当扩增细菌菌株的DNA。
图20显示了一种用于嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)在3500L培养物中优化的超大规模生长和制备方法的示意性流程图。将19.2mL工作细胞库(WCB)嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)在厌氧室中解冻，并在厌氧室中接种于1L瓶2001中的1L还原型NAGT培养基(2％v/v接种率)。当OD585>1或培养物生长48小时时停止培养。将2001中的整个培养物用以在20L发酵罐2002中的16L培养基(5％v/v接种率)中进行接种。当OD585>1.5或培养物生长48小时时停止培养。将2002的15L培养物用以在300L发酵罐2003中的300L培养基(5％v/v接种率)中进行接种。当OD585>1.5或培养物生长48小时时停止培养。制备表15中限定的240L。将100L糖料添加到3500L发酵罐2004中。将2002中的300L培养物用以在2004的3500L培养基中(8-10％v/v接种率)中进行接种。葡萄糖浓度降至低于2g/L后，再次添加另外的100L糖料。当OD585>2.5或培养物生长72小时时停止培养。然后，将2004的整个培养物在厌氧气氛下离心，并作为生物质进行收集。在用厌氧气体吹扫的混合罐中，将100L过滤除菌的脱气表17限定的冷冻保护剂与生物质混合。将含有冷冻保护剂的生物质冻干(冷冻和干燥)并研磨。对于每个步骤，用于细菌培养的培养基在使用前经过灭菌(121℃高压灭菌)并用N2H2CO2(90:5:5)脱气。糖组分(N-乙酰氨基葡糖和葡萄糖)与剩余的NAGT培养基组分分开制备。糖料经过过滤灭菌，脱气，并添加到剩余的NAGT培养基组分中以生成完整的培养基。
图21显示了在585纳米波长(Y轴)的光吸收随时间的图，用于在3500L制备方法中在1L瓶中1L嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)培养物在NAGT培养基中的生长。
图22显示了在585纳米波长(Y轴)的光吸收随时间的图，用于在3500L制备方法中在20L发酵罐中20L嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM33213)培养物在NAGT培养基中的生长。
图23显示了在585纳米波长(Y轴)的光吸收随时间的图，用于在3500L制备方法中在300L发酵罐中300L嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)培养物在NAGT培养基中的生长。
图24显示了在585纳米波长(Y轴)的光吸收随时间的图，用于在3500L制备方法中在3500L发酵罐中3500L嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)培养物在NAGT培养基中的生长。
图25显示了用于普氏栖粪杆菌(DSM 33185)在3500L培养物体积中优化的超大规模生长和制备方法的示意性流程图。将6.4mL的工作细胞库(WCB)普氏栖粪杆菌(DSM33185)在厌氧室中解冻，并在厌氧室中接种于2L烧瓶2501中的1L还原型NAGT培养基(2％v/v接种率)。当OD600>3或培养物生长48小时时停止培养。将2501中的1.5L培养物用以在300L发酵罐2502中的150L培养基(1％v/v接种率)中进行接种。当OD585>5或培养物生长48小时时停止培养。制备表22中限定的250L。将100L糖料添加到3500L发酵罐2503中。将2502中的35L培养物用以在3500L发酵罐2503中的300L培养基中(5％v/v接种率)进行接种。当OD585>5或培养物生长72小时时停止培养。然后，将2503中的整个培养物在厌氧气氛下离心，并作为生物质进行收集。在用厌氧气体吹扫的混合罐中，将120L过滤除菌的脱气表24中限定的冷冻保护剂与生物质混合。将含有冷冻保护剂的生物质冻干(冷冻和干燥)并研磨。对于每个步骤，用于细菌培养的培养基在使用前经过灭菌(121℃高压灭菌)并用N2H2CO2(90:5:5)脱气。糖组分(葡萄糖)与剩余的YFAP培养基组分分开制备。糖料经过过滤灭菌，脱气，并添加到剩余的YFAP培养基组分中以生成完全培养基。
图26显示了在585纳米波长(Y轴)的光吸收随时间的图，用于在3500L制备方法中在2L烧瓶中2L普氏栖粪杆菌(DSM 33185)培养物在YFAP培养基中的生长。
图27显示了在585纳米波长(Y轴)的光吸收随时间的图，用于在3500L制备方法中在300L发酵罐中150L普氏栖粪杆菌(DSM 33185)培养物在YFAP培养基中的生长。
图28显示了在585纳米波长(Y轴)的光吸收随时间的图，用于在3500L制备方法中在3500L发酵罐中3500L普氏栖粪杆菌(DSM 33185)培养物在YFAP培养基中的生长。
图29显示了如本文所述的人类临床研究的三个阶段(筛选期、治疗期和洗脱期)，以及与安慰剂相比，通过向对象口服施用药物组合物来治疗不同年龄对象过敏的能力。
图30显示了固体剂型(3001)或液体剂型(3002)的药物产品。两种形式的组合物均可口服。
图31显示了如本文所述的人类临床研究的三个阶段(筛选期、治疗期和洗脱期)，以及与安慰剂相比，通过向对象口服施用药物组合物来治疗不同年龄对象过敏的能力。
图32显示了如本文所述的人类临床研究的三个阶段(筛选期、治疗期和洗脱期)，以及与安慰剂相比，通过向对象口服施用药物组合物来其治疗不同年龄对象过敏的能力。
具体实施方式
本文提供了用于治疗炎性或代谢疾病的包含细菌的药物组合物。
在一些情况下，药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。所描述的药物组合物可包含一种或多种菌种，包括一种或多种细菌菌株。在一些情况下，药物组合物可包含乳杆菌属(sp.)、阿克曼菌属和/或乳杆菌属中的任意一种或多种，基本上由其组成或由其组成。在另外的情况下，本文所述的药物组合物包含本文提及的以下属种的任意一个或多个特定菌株：乳杆菌属、阿克曼菌属和/或乳杆菌属，基本上由其组成或由其组成。例如，在一些情况下，本文所述的药物组合物包含细菌菌株卷曲乳杆菌(DSM 33187)(本文也称为“卷曲乳杆菌(L.crispatus)(DSM 33187)”)、嗜黏蛋白阿克曼菌，保藏号为DSM 33213(本文中也称为“嗜黏蛋白阿克曼菌(A.muciniphila)(DSM 33213)”)和普氏栖粪杆菌(DSM33185)(本文中也称为“普氏栖粪杆菌(F.prausnitzii)(DSM 33185)”)，基本上由其组成或由其组成。在一些情况下，药物组合物可以包括如实施例2中定义的组合物A。
本文提供了药物组合物、此类组合物的制剂、制备此类组合物的方法、此类药物组合物的给药途径以及通过使用此类药物组合物来预防和/或治疗的适应症。
本发明进一步提供了配制本文所述的药物组合物的方法以及向患有或疑似患有疾病或病症的对象施用此类药物组合物的方法。此类方法可包括将可包含一种或多种菌种和/或菌株或由其组成的本文的药物组合物配制成口服剂型。此类口服制剂可包含一种或多种菌种和/或菌株、缓冲甘油溶液(例如，由含有137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4和1.8mM KH2PO4的标准磷酸盐缓冲液、20％v/v甘油组成的缓冲甘油溶液)和0.1％w/w L-半胱氨酸等抗氧化剂，或由其组成。
本文进一步提供了允许生产本文所述的细菌菌株的制备方法。与常规制备方法相比，此类方法具有一个或多个优点。这些优点可以包括以下的任意一个或多个：(i)总产量增加，(ii)生长速率提高，和/或(iii)每总细胞数中活细菌细胞数较高。在一些情况下，此类方法可包括使用非动物来源的培养基组分。此类非动物培养基可包括植物培养基。这种植物培养基可包含各种组分，如植物蛋白胨、植物提取物、酵母提取物和其他非动物组分。在一些情况下，此类非动物培养基可包括N-乙酰氨基葡萄糖-苏氨酸(NAGT)培养基和Boullion MRS植物培养基、酵母脂肪酸植物蛋白胨(YFAP)培养基以及它们的改良形式。此类经改良的培养基可以使一种或多种培养基组分被去除、添加和/或被其他组分替代。在其他情况下，与未改良的培养基相比，培养基组分的量增加或减少。在一个实例中，改良的NAGT培养基可以不包含镁、钙或葡萄糖中的任意一种或多种。
本发明的此类口服制剂可用于预防和/或治疗对象的疾病或病症的方法，该方法包括向患有或疑似患有疾病或病症的对象(例如，人)施用口服制剂。此类疾病或病症可以是炎性疾病(例如，过敏或哮喘)或自身免疫性疾病。
定义
每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或更多个数值中第一个数值之前，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等价于大于或等于1、大于或等于2、或大于或等于3。
每当术语“不超过”、“小于”或“小于或等于”在一系列两个或更多个数值中第一个数值之前，术语“不超过”、“小于”或“小于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等于小于或等于3、小于或等于2、或小于或等于1。
如本文所用，在数值或范围的上下文中，除非另有说明，否则术语“约”通常是指所限定或要求保护的数值或数值范围的±10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
药物组合物
本发明提供了药物组合物，该药物组合物可包含细菌聚生体和一种或多种药物赋形剂，基本上由其组成或由其组成。此类药物赋形剂可包括冷冻保护剂、抗氧化剂和水性缓冲溶液。
本文提供了可包含细菌聚生体的药物组合物。此类细菌聚生体可包含一种或多种不同的菌种和/或菌株。此类菌种和/或菌株可以属于一种或多种不同的细菌门。此类细菌门可以包括疣微菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和/或拟杆菌门，或它们的组合。
在一些情况下，本文所述的细菌聚生体可包含一种或多种乳杆菌属。该一种或多种乳杆菌属可包括约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、玉米乳杆菌、酸鱼乳杆菌、嗜酸乳杆菌、能动乳杆菌、鸟乳杆菌、短乳杆菌、人***乳杆菌、卷曲乳杆菌、面包乳杆菌、弯曲乳杆菌、食二酸乳杆菌、谷糠乳杆菌、发酵乳杆菌、府中乳杆菌、哈尔滨乳杆菌、瑞士乳杆菌、希氏乳杆菌、肠乳杆菌、詹氏乳杆菌、马乳样乳杆菌、高加索酸奶乳杆菌、林氏乳杆菌、马里乳杆菌、食木薯乳杆菌、黏膜乳杆菌、Lactobacillusoeni、寡发酵乳杆菌、面包乳杆菌、美洲虎乳杆菌、类短乳杆菌、类丘状菌落乳杆菌、类高加索酸奶乳杆菌、类植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、桥乳杆菌、路氏乳杆菌、罗西氏乳杆菌、唾液乳杆菌、白面粉乳杆菌、Lactobacillus sucicola、牛粪乳杆菌、***乳杆菌、酒乳杆菌、乳酸球菌或乳酸乳球菌，或它们的组合。在一些实施方案中，乳杆菌属为约氏乳杆菌或卷曲乳杆菌。在这种情况下，本文的细菌聚生体可包含一种或多种约氏乳杆菌或卷曲乳杆菌菌株。该一种或多种卷曲乳杆菌菌株可包括卷曲乳杆菌(DSM33187)(即，卷曲乳杆菌(DSM 33187))。在各种情况下，本文的细菌聚生体包含卷曲乳杆菌(DSM 33187)。
在一些情况下，本文的细菌聚生体可包含一种或多种阿克曼菌属。该一种或多种阿克曼菌属可包括嗜黏蛋白阿克曼菌、Akkermansia glycaniphila，或它们的组合。在一些情况下，该一种或多种阿克曼菌属为嗜黏蛋白阿克曼菌。在这种情况下，本文的细菌聚生体可包含一种或多种嗜黏蛋白阿克曼菌菌株。该一种或多种嗜黏蛋白阿克曼菌菌株可包括嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)。在各种情况下，本文的细菌聚生体包含嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)。
在一些情况下，本文的细菌聚生体可包含一种或多种栖粪杆菌属。该一种或多种嗜栖粪杆菌属可包括普氏栖粪杆菌。在这种情况下，本文的细菌聚生体可包含一种或多种普氏栖粪杆菌菌株。该一种或多种普氏栖粪杆菌菌株可包括普氏栖粪杆菌(DSM 33185)、普氏栖粪杆菌(DSM 33191)、普氏栖粪杆菌(DSM 33186)或普氏栖粪杆菌(DSM 33190)，或它们的组合。在各种情况下，本文的细菌聚生体包含普氏栖粪杆菌(DSM 33185)。
本文进一步提供了细菌聚生体，该细菌聚生体可包含拟杆菌属、布劳氏菌属、双歧杆菌属、粪球菌属或多雷氏菌属中的任意一种或多种的一种或多种菌株。在这种情况下，本文的细菌聚生体可包含粪拟杆菌(DSM 22177)、多形拟杆菌(DSM 33178)、Blautiaproducta(DSM 33180)、长双歧杆菌(DSM 33179)、陪伴粪球菌(DSM 33176)或毛螺菌科(DSM33188)中的任意一种或多种。表1中列出了包含在本文所述的细菌聚生体中的示例性菌株。
表1示例性细菌菌株
细菌菌株 保藏ID# 细菌菌株 保藏ID#
嗜黏蛋白阿克曼菌 DSM 33213 普氏栖粪杆菌 DSM 33191
长双歧杆菌 DSM 33179 普氏栖粪杆菌 DSM 33186
B.producta DSM 33180 普氏栖粪杆菌 DSM 33190
多形拟杆菌 DSM 33178 卷曲乳杆菌 DSM 33187
陪伴粪球菌 DSM 33176 粪拟杆菌 DSM 22177
普氏栖粪杆菌 DSM 33185 毛螺菌科 DSM 33188
本文提供了细菌聚生体，该细菌聚生体可包含20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种菌种和/或菌株，基本上由其组成或由其组成。在一些情况下，此类细菌聚生体可包含至少一种选自表1的细菌菌株。在一些实施方案中，细菌聚生体可以由至多3种不同的细菌菌株组成。在一些实施方案中，本文所述的细菌聚生体包含表2中列出的至少一种、至少两种或所有三种细菌菌株。在一些情况下，细菌聚生体包含细菌菌株卷曲乳杆菌(DSM 33187)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)和普氏栖粪杆菌(DSM 33185)，或由其组成。
表2细菌菌株的子集
细菌菌株 保藏ID#
卷曲乳杆菌 DSM 33187
嗜黏蛋白阿克曼菌 DSM 33213
普氏栖粪杆菌 DSM 33185
本发明提供了细菌聚生体，该细菌聚生体可包含其所包含的每种菌种和/或菌株的不同数量的菌落形成单位(CFU)。在一些情况下，此类细菌聚生体可以包含约10^3CFU至约10^12CFU、约10^4CFU至约10^12CFU、约10^7CFU至约10^11CFU、约10^8CFU至约10^10CFU、或约10^9CFU至约10^10CFU的菌种或菌株。在一些实施方案中，此类细菌聚生体还可包含约10^7CFU至约10^10CFU的菌种或菌株。在一些情况下，细菌聚生体可包含至少约10^3CFU、5x10^3CFU、10^4CFU、5x10^4CFU、10^5CFU、5x10^5CFU、10^6CFU、5x10^6CFU、10^7CFU、5x10^7CFU、10^8CFU、5x10^8CFU、10^9CFU、5x10^9CFU、10^10CFU、5x10^10、CFU、10^11CFU、5x10^11CFU或10^12CFU但不超过约5x10^12CFU的菌种或菌株。所述细菌聚生体还可包含每个菌种或菌株至少约10^6至约10^11CFU。在一些情况下，细菌聚生体可包含每个菌种或菌株约10^3至约10^12CFU。在一些情况下，细菌聚生体可包含每个菌种或菌株约10^8至约5x10^10CFU。在一些情况下，细菌聚生体可包含每个菌种或菌株约10^7至约5x10^10CFU。在各种实施方案中，细菌聚生体可包含每个菌种或菌株约5x10^8CFU。在将药物组合物配制成用于给药的单位剂量的情况下，此CFU值可以是此类剂型的每质量单位(例如，5x10^8CFU/g)或体积单位(例如，5x10^8CFU/mL)。
在一些实施方案中，本发明提供了可包含不同数量的菌落形成单位(CFU)的细菌细胞的细菌聚生体。此类细菌聚生体可包含约10^3CFU至约10^12CFU、约10^4CFU至约10^12CFU、约10^7CFU至约10^11CFU、约10^8CFU至约10^10CFU、或约10^9CFU至约10^11CFU的细菌细胞。此类细菌聚生体还可包含约10^3CFU至约10^12CFU的细菌细胞。在一些实施方案中，此类细菌聚生体还可包含约10^7CFU至约10^10CFU的细菌细胞。在一些情况下，细菌聚生体可包含至少约10^3CFU、5x10^3CFU、10^4CFU、5x10^4CFU、10^5CFU、5x10^5CFU、10^6CFU、5x10^6CFU、10^7CFU、5x10^7CFU、10^8CFU、5x10^8CFU、10^9CFU、5x10^9CFU、10^10CFU、5x10^10、CFU、10^11CFU、5x10^11CFU或10^12CFU但不超过约5x10^12CFU的细菌细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种细菌种群，其总存在量可以为约10^3CFU至约10^12CFU的细菌细胞。在一些实施方案中，细菌种群的总存在量可以为至少约10^3CFU、5x10^3CFU、10^4CFU、5x10^4CFU、10^5CFU、5x10^5CFU、10^6CFU、5x10^6CFU、10^7CFU、5x10^7CFU、10^8CFU、5x10^8CFU、10^9CFU、5x10^9CFU、10^10CFU、5x10^10、CFU、10^11CFU、5x10^11CFU或10^12CFU、但不大于约5x10^12CFU的细菌细胞。在其他情况下，细菌种群的总存在量可以为约10^7CFU至约10^10CFU的细菌细胞。在一些情况下，细菌种群的总存在量可以为约1.5x10^9CFU的细菌细胞。
在一些情况下，本文描述的药物组合物中的菌种或菌株的CFU数量可以是对象的微生物群中存在的该菌种或菌株中的CFU数量的一部分。该微生物群可以是肠道或***微生物群。此类对象可以是人对象。因此，在一些情况下，药物组合物中细菌的CFU与微生物群中此类细菌的CFU数量的比率可以为约1:10^4至约1:10、约1:10^3至约1:10、约1:10^2至约1:10或约1:10至约5:1。在本发明的某些实施方案中，该比率可以为至少约0.0001、0.0002、0.0005、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、1、2、3、3.5、4或5但不超过10。
在本文的一些实施方案中，用于本发明的药物组合物的细菌聚生体可包含约5x10^8CFU/mL的细菌菌株卷曲乳杆菌(DSM 33187)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)和/或普氏栖粪杆菌(DSM 33185)中的任意一种，或由其组成。在这种情况下，细菌聚生体可以由约5x10^8CFU/mL的细菌菌株卷曲乳杆菌(DSM 33187)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)和普氏栖粪杆菌(DSM 33185)组成。
本文提供了可包含一种或多种冷冻保护剂的药物组合物。当此类组合物被冷冻或冻干时，例如在使用前的运输和/或储存过程中，可使用此类冷冻保护剂来保持组合物中细菌细胞的活力。在一些情况下，该一种或多种冷冻保护剂可以是甘油、二甲亚砜、乙二醇、丙二醇、2-甲基-2,4-戊二醇、海藻糖、蔗糖(sucrose)、二乙二醇、三乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、蔗糖(saccharose)、甲酰胺、3-磷酸甘油酯、脯氨酸、甲醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、羟乙基淀粉、山梨糖醇，或其组合。冷冻保护剂可包括冰阻滞剂。冰阻滞剂可包括聚丙三醇、聚乙烯醇、X-1000和Z-1000。例如，根据药物组合物是否为固体剂型(例如，胶囊剂或片剂)或液体剂型(例如，悬浮剂或凝胶剂)，此冷冻保护剂可以以约5、10、15、20、25或30体积百分比(％v/v)或重量百分比(％w/w)的量用于药物组合物中。冷冻保护剂还可包括碳水化合物或抗氧化剂。碳水化合物可包括海藻糖、蔗糖(sucrose)、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、蔗糖(saccharose)，或其组合。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物进一步包含抗氧化剂。在一些实施方案中，抗氧化剂为L-半胱氨酸。在一些实施例中，L-半胱氨酸的存在量按重量计为约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、5％、10％、0.001％至0.005％、0.0051％至0.01％、0.011％至0.05％、0.05％至0.1％、0.051％至0.1％、0.11％至0.5％、0.51％至1％、1.1％至1.5％、1.5％至2％、2.1％至5％、或5.1％至10％。蔗糖(saccharose)的存在量按重量计可以为约0.1％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、0.1％至1％、1％至5％、5％至10％、10至15％、15至20％、20至25％、25至30％、30至35％、35至40％、40至45％、45至50％、50至55％、55至60％、60至65％、65至70％、70至75％、75至80％、51至61％、52至62％、53至63％、54至64％、55至65％、56至66％、57至67％、58至68％、或59至69％。海藻糖的存在量按重量计可以为约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、20.5％、21％、21.5％、22％、22.5％、23％、23.5％、24％、24.5％、25％、0.01％至15％、0.1％至20％、0.01％至0.1％、0.11％至1％、1至11％、2至12％、3至13％、4至14％、5至15％、6至16％、7至17％、8至18％、9至19％、10至20％、11至21％、12至22％、13至23％、14至24％、或15至25％。甘油的存在量按体积计可以为约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、1至21％、2至22％、3至23％、4至24％、5至25％、6至26％、7至27％、8至28％、9至29％、10至30％、11至31％、12至32％、13至33％、14至34％、15至35％、16至36％、17至37％、18至38％、19至39％、或20至40％。
在本文的一些实施方案中，本文药物组合物的冷冻保护剂为甘油。此甘油可以以约20％v/v的量用于药物组合物中，该药物组合物可包含选自表1的一种或多种、两种或多种或三种或多种细菌菌株的细菌聚生体。在一些实施方案中，细菌种群可以是冻干的。冻干方法可包括对细菌种群进行低温脱水。在一些实施方案中，冻干方法可包括使细菌种群处于低温和低压下。
本文提供了可包含一种或多种抗氧化剂的药物组合物。在一些情况下，此抗氧化剂可用于保护可存在于药物组合物中的厌氧菌种和/或菌株。在这种情况下，该一种或多种抗氧化剂可用于在储存和/或运输期间提供厌氧条件，和/或保护细菌细胞免受活性氧的侵害。在本文的一些实施方案中，抗氧化剂可以是抗坏血酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、酚酸(例如，没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸和迷迭香酸)、酚类二萜(例如，鼠尾草酚和鼠尾草酸)、类黄酮(例如，槲皮素和儿茶素)、挥发油(例如，丁子香酚、香芹酚、百里酚和薄荷醇)、α-生育酚(例如，维生素E)、奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox)、抗坏血酸、维生素A、维生素C、辅酶Q10、锰、碘化物、褪黑激素、α-胡萝卜素、虾青素、β-胡萝卜素、角黄素、隐黄素、叶黄素、番茄红素、玉米黄质、类黄酮(例如、黄酮，如芹黄素)、木犀草素、橘皮素、黄酮醇、异鼠李素、山奈酚、杨梅酮、原花青素、槲皮素、圣草酚、橙皮素、柚皮素、儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、茶黄素、茶红素、异黄酮植物***、黄豆苷元、金雀异黄素、大豆黄素、白藜芦醇等芪类、紫檀芪、花青素、矢车菊素、飞燕草素、锦葵素、天竺葵素、甲基花青素、牵牛花色素、菊苣酸、绿原酸、肉桂酸、鞣花酸、鞣花单宁、没食子酸、没食子单宁、迷迭香酸、姜黄素、氧杂蒽酮、辣椒素、胆红素、柠檬酸、草酸、植酸、N-乙酰半胱氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、R-α-硫辛酸、花青素、铜、隐黄素、类黄酮、吲哚、异类黄酮、木酚素、硒、锌，或其组合。该一种或多种抗氧化剂在药物组合物中的存在量可以为约0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、或0.5％w/w。L-谷氨酸的存在量按重量计可以为约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7％、8％、9％、10％、1至5％、1.1至5.1％、1.2至5.2％、1.3至5.3％、1.4至5.4％、1.5至5.5％、1.6至5.6％、1.7至5.7％、1.8至5.8％、1.9至5.9％、2至6％、2.1至6.1％、2.2至6.2％、2.3至6.3％、2.4至6.4％、2.5至6.5％、2.6至6.6％、2.7至6.7％、2.8至6.8％、2.9至6.9％、3至7％、3.1至7.1％、3.2至7.2％、3.3至7.3％、3.4至7.4％、3.5至7.5％、3.6至7.6％、3.7至7.7％、3.8至7.8％、3.9至7.9％、或4至8％。在一些情况下，冷冻保护剂按重量计可包括约60％的蔗糖(saccharose)，约10％的海藻糖、约1％的L-半胱氨酸和约4％的L-谷氨酸。
本文提供了可包含水性缓冲溶液的药物组合物。此水性介质可以用作细菌细胞的主要储存和运输介质。因此，缓冲液可含有溶解或悬浮的细菌聚生体、冷冻保护剂和抗氧化剂中的任意一种或多种，以形成如本文所述的药物组合物。在一些情况下，水性缓冲溶液可以为磷酸盐缓冲盐水(PBS)、HEPES或Tris缓冲液、任意其他合适的缓冲液，或它们的任意组合。在一些实施方案中，缓冲液为PBS，并且包含137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4和1.8mM KH2PO4。在其他情况下，缓冲液为PBS，并且pH为约6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9。
因此，在本文的一些实施方案中，药物组合物包含由约5x10^8CFU的细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)中的每一种组成的细菌聚生体、作栖粪杆菌为冷冻保护剂的约20％w/w的甘油、作为抗氧化剂的0.1％w/w的L-半胱氨酸和含有137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4和1.8mM KH2PO4的PBS缓冲液。这种药物组合物可以使用本文所述的方法和组合物来制备，并配制成可口服的剂型。
本文提供了可配制给药于对象的药物组合物。对象可以为人对象。给药可包括肠胃外给药和口服给药。肠胃外给药可包括以各种非口服途径例如以栓剂的形式施用药物组合物。在各种其他情况下，本文所述的药物组合物可以配制成口服剂型。这种口服剂型可包括胶囊剂、片剂、乳剂、悬浮剂、糖浆、凝胶、胶、糊剂、凉茶、滴剂、溶解颗粒剂、粉末、片剂、冻干剂和任意其他合适的口服剂型。胶囊可包含植物来源的材料。植物来源的材料可包括纤维素基聚合物。胶囊还可包含明胶；羟丙基甲基纤维素(HPMC)；淀粉；动物来源或纤维素基的水解胶原蛋白(酸、碱、酶或热水解)；普鲁兰多糖；木薯；或其任意组合。纤维素基聚合物可包括普鲁兰多糖。胶囊可以是肠溶衣的。肠溶胶囊可包含脂肪酸、蜡、虫胶、塑料、植物纤维或它们的任意组合。胶囊的尺寸可以是000、00、0、1、2、3、4或5空丸胶囊大小。胶囊可以不含淀粉、不含麸质和不含防腐剂。在用未配制的对乙酰氨基酚填充胶囊通过对乙酰氨基酚的溶解进行测量时，>90％的胶囊在60分钟内溶解于水、pH＝1.2溶液、乙酸钠缓冲液USP(pH＝4.5)或磷酸钠缓冲液(pH＝7.2)。由37℃温度下用去离子水所测定，胶囊的崩解终点可为约1.6分钟。由37℃温度下用去离子水所测定，胶囊的崩解终点可为约0.1、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、3.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4分钟。由37℃温度下用去离子水所测定，胶囊的崩解终点可为约0.1至0.5分钟、0.51至0.6分钟、0.61至0.7分钟、0.71至0.8分钟、0.81至0.9分钟、0.91至1分钟、1.01至1.1分钟、1.11至1.2分钟、1.21至1.3分钟、1.31至1.4分钟、1.41至1.5分钟、1.51至1.6分钟、1.61至1.7分钟、1.71至1.8分钟、1.81至1.9分钟、1.91至2分钟、2.01至2.1分钟、2.11至2.2分钟、2.21至2.3分钟、2.31至2.4分钟、2.41至2.5分钟、2.51至2.6分钟、2.61至2.7分钟、2.71至2.8分钟、2.81至2.9分钟、2.91至3分钟、3.01至3.1分钟、3.11至3.2分钟、3.21至3.3分钟、3.31至3.4分钟、3.41至3.5分钟、3.51至3.6分钟、3.61至3.7分钟、3.71至3.8分钟、3.81至3.9分钟或3.91至4分钟。胶囊的透氧性(cm3/m2/天)可为≤0.5、如通过胶囊中的气体成成测量的。由37℃温度下用去离子水所测定，胶囊的透氧性(cm3/m2/天)可为≤0.0001、≤0.0005、≤0.001、≤0.005、≤0.01、≤0.05、≤0.1、≤0.5、≤1、≤1.5、≤2、≤5或≤10。
本文进一步提供了可以冷冻的药物组合物的口服制剂。这种冷冻制剂可以以冷冻状态施用于对象，例如人类对象。在一些情况下，这种冷冻制剂可以为冰棒、冰淇淋或其他冷冻制剂。
在本文的各种实施方案中，本发明的药物组合物可以为口服给药于对象的液态悬浮液。此液体悬浮剂等分为一定的体积以提供这种口服剂型的单位剂量。此单位剂量的体积可为约0.25、0.5、1、2、3、5或10mL。在一些情况下，本文的药物组合物的单位剂量的体积为约1mL。这种药物组合物可包含细菌聚生体、冷冻保护剂、抗氧化剂、可来自液体细胞悬浮液的水性缓冲溶液。可对这种细胞悬浮液的质量控制进行测试以确保其含有一定数量的代谢活性细胞每个细菌菌株(如本文所述)。
在一些实施方案中，本文提供了可配制成单位剂量的口服给药于对象的药物组合物。这种口服制剂可包含约5x10^8CFU的细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)中的每一种、约20％w/w的甘油、0.1％w/w的L-半胱氨酸和含有137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4和1.8mM KH2PO4的PBS缓冲液，或由它们组成。此口服制剂的总体积可为约1mL。
本文提供了制备本文所述药物组合物的方法。在一些情况下，此药物组合物包含细菌聚生体，所述细菌聚生体包含一个或多个菌种和/或菌株。在一些情况下，此一种或多种细菌菌株可包括卷曲乳杆菌(DSM 33187)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)和/或普氏栖粪杆菌(DSM 33185)中的任意一个或多个。此药物组合物的制备可包括几个步骤。这些步骤可包括生长培养基制备、接种和培养、细菌细胞的收集以及通过将制备的细菌菌株批次组合以用于药物组合物来组装细菌聚生体。在一些情况下，此制备方法可用于制备临床用于人类对象的药物组合物。
本发明的用于制备细菌聚生体的方法可包括培养基制备，该培养基的制备可包括将盐、维生素、抗氧化剂等各种干燥培养基组分溶解于USP级注射用水中。完全溶解后，可调节培养基的pH值以确保各个细菌细胞得到最佳生长。然后可将经pH调节的培养基转移到生物安全柜中并进行灭菌。在各种情况下，本文的微生物聚生体可包含一种或多种厌氧细菌菌株。在这种情况下，可以将培养基转移到含有约N2H2CO2(90:5:5)气氛的厌氧室中，以在厌氧菌接种之前进行还原。
本文的制备方法可包括产生细菌菌株/菌种的起始培养物。这种方法可包括通过使用一定体积的含有过滤培养基的各个烧瓶来产生包含在药物组合物中的细菌菌株的起始培养物，并将该体积的培养物转移到无菌的预还原的螺旋盖管中，然后再使用来自包含相应细菌细胞的细胞库的原液转移解冻的细菌细胞。在使用厌氧细菌细胞的情况下，起始培养物可在厌氧条件下在约37℃生长约12-16小时。在一定的温育时间后，可以肉眼检查起始培养物的生长(浊度)，并在确认细菌生长后，将其转移到另外的更大培养瓶中进行细胞扩增。温育约12、18、24、30小时后，可以测量细胞培养基的细胞密度和吸光度。这种测量可以通过测量细胞悬浮液在600纳米处的吸光度来进行以确保吸光度在指定的OD600范围内。该OD600值或范围可以是对细菌菌株特定的。例如，表1中所示的每个细菌菌株都可具有特定的OD600值或范围。该OD600范围可以为约0.5至约1.5、约0.7至约1.3或约0.9至约1.1。在OD600测量之后，可以使用离心等各种技术来收集细菌细胞。
在一些情况下，对于细胞收集，可以选择适宜的离心参数。例如，在一些情况下，可以使用℃参数来收集表1中列出的任意细菌菌株，所述参数包括在约4℃以约5,000-10,000x g旋转约20-60分钟以确保细胞可以与上清液分离。离心后，可以将所得的细胞沉淀转移回到厌氧环境(例如，厌氧室)中，并且可以使用例如无菌血清移液器将澄清的培养物上清液从该沉淀中完全去除。然后可以通过在浓缩和预还原的冷冻保护剂溶液中再悬浮来合并细胞沉淀。在一些情况下，这种悬浮液的浓度约为生长期间细胞悬浮液的20-40倍，并且预还原的冷冻保护剂溶液可包含约20％v/v的甘油或另一种冷冻保护剂。然后可以将浓缩的细胞悬浮液分配到等分试样中，例如，分配到预还原的、预先标记的2mL螺旋盖冷冻管中，并在约-70℃或更低温度下转移至预先标记的储存箱中。在此类细菌细胞可用于药物组合物的情况下，规格测试可在制备和在约-70℃或更低温度下初始储存后约三天进行。
本文提供了用于制备一种或多种菌种和/或菌株的细胞群或细胞批次以用于药物组合物的方法。在各种情况下，在本文所述的制备方法中可以使用表1所示的任意细菌菌株。在某些情况下，可以使用菌株卷曲乳杆菌(DSM 33187)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)和/或普氏栖粪杆菌(DSM 33185)(TABLE 2)中的一种或多种来制备用于药物组合物的细胞批次。在这种情况下，本发明提供了用于制备此细胞批次的方法。
本文提供了用于制备可在本文所述药物组合物中使用的卷曲乳杆菌(DSM 33187)细胞批次的方法。此类方法可包括制备卷曲乳杆菌(DSM 33187)细胞培养基。此类培养基可以为vMRS培养基或BoullionvMRS肉汤。在某些情况下，这种培养基不为HiMediavMRS肉汤。此类培养基对卷曲乳杆菌(DSM 33187)菌株具有特异性并且可包含vMRS粉末和磷酸二钾(K2HPO4)。在这种情况下，用于生长和培养卷曲乳杆菌(DSM 33187)细胞的培养基可包含约250-300g的vMRS粉末和磷酸二钾(K2HPO4)。在某些情况下，此类培养基可包含约273g的vMRS粉末和约12.5g的磷酸二钾(K2HPO4)和约4.9L的水。这种vMRS培养基的pH值可以使用例如5M盐酸盐溶液或冰醋酸调节至约6.5±0.1。然后培养基过滤，还原至厌氧状态，并转移至例如含有卷曲乳杆菌(DSM 33187)溶液的起始培养管中，并在37℃温育约16-20小时。在温育和扩增之后，测定细胞培养物在600nm处的吸光度并重复三次以确保细胞悬浮液的吸光度在约0.8至约1.6的范围内，优选约1.0-1.4。将培养瓶中的内容物离心，在25mL含有抗氧化剂和20％v/v甘油等冷冻保护剂的无菌PBS中重悬剩余的细胞沉淀，然后合并，产生均质的细胞悬浮液。将卷曲乳杆菌(DSM33187)细胞悬浮液等分到例如冷冻管中，以获得最终的细胞浓度。这种最终的卷曲乳杆菌(DSM33187)细胞浓度可以为每单位剂量约5x10^8至约10^10个活的卷曲乳杆菌(DSM33187)细胞。此单位剂量的体积可以为约1mL。在这种情况下，单位剂量可包含约5x10^8个活的卷曲乳杆菌(DSM33187)细胞。
本文进一步提供了用于制备可在本文所述的药物组合物中使用的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM33213)细胞批次的方法。此类方法可包括制备嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞培养基。在一些情况下，此嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)培养基可以为改良的NAGT培养基。这种改良的NAGT培养基可含有大豆蛋白胨(soytone)或N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)，或既含有大豆蛋白胨又含有NAG。在一些情况下，这种改良的NAGT培养基可能不含镁、钙、葡萄糖，或其组合。在一些情况下，改良的NAGT培养基可使细胞生长得以改善。这种改善的细胞生长可以比未改良的NAGT培养基中的细胞生长高约30％、35％、40％、45％或50％。
因此，在一些情况下，此NAGT培养基对嗜黏蛋白阿克曼菌菌株(DSM33213)具有特异性，并且可包含以下成分中的任意一种或多种：大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、酵母提取物、碳酸氢钠(NaHCO3)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、氯化钠(NaCl)、硫酸镁(例如，MgSO4x7H2O)、氯化钙(CaCl2)、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、L-苏氨酸和/或L-半胱氨酸。在这种情况下，约5L的用于生长和培养嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞的改良的NAGT培养基可包含约75g至100g的SOLABIA豌豆蛋白胨、约75g至约85g的DifcoTM选择大豆蛋白胨、约10g至约15g的BactoTM酵母提取物、约2g至约8g碳酸氢钠(NaHCO3)、约10g至约15g磷酸氢二钾(K2HPO4)、约0.5g至约5g的氯化钠(NaCl)、约0.5g至约5g的七水硫酸镁(MgSO4x7H2O)、约0.5g至约5g的氯化钙(CaCl2)、约20g至约25g的葡萄糖(dextrose)、约25g至约30g的N-乙酰氨基葡萄糖、约15g至约25g的L-苏氨酸和/或约2g至约8g的L-半胱氨酸。在一些实施例中，约5L的用于生长和培养嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞的改良的NAGT培养基可包含约82.5g的SOLABIA豌豆蛋白胨、82.5g的DifcoTM选择大豆蛋白胨、约12.5g的BactoTM酵母提取物、约5g的碳酸氢钠(NaHCO3)、约12.5g的磷酸氢二钾(K2HPO4)、约1.5g的氯化钠(NaCl)、约0.5g的七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)、约0.5g的氯化钙(CaCl2)、约22.6g的葡萄糖(dextrose)、约27.7g的N-乙酰氨基葡萄糖、约20g的L-苏氨酸和/或约5g的L-半胱氨酸。
这种NAGT培养基的pH值可以使用例如5M盐酸盐溶液调节至例如约6.5±0.1。这种NAGT培养基的pH值也可调节至约7。可将嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细菌细胞可添加至制备好的含有这种NAGT生长培养基的小瓶中。在温育对嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)菌株具有特异性的一段时间后，可以测量并记录细胞培养物在600nm处的吸光度，以实现约0.5至约1.2、优选约0.7-1.1的吸光度值。然后，将培养瓶的内容物离心，去除上清液，并在含有抗氧化剂和20％v/v甘油等冷冻保护剂的无菌PBS中重悬残余的细胞沉淀。将嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞悬浮液等分到冷冻管中，以获取最终的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM33213)细胞浓度，即每单位剂量约5x10^8至约10^10个活的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞。此单位剂量的体积可以为约1mL。在这种情况下，单位剂量可包含约5x0^8个活的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞。
本文进一步提供了用于制备可在本文所述的药物组合物的细菌聚生体中使用的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞批次的方法。这种方法可包括制备全维生素混合物溶液(例如，YFAP维生素混合物)和普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞培养基。YFAP维生素混合物为对普氏栖粪杆菌(DSM 33185)菌株具有特异性，并且可包含生物素、钴胺素、对氨基苯甲酸、叶酸、吡哆胺、硫胺素和/或核黄素中的任意一种或多种。在这种情况下，1L的YFAP维生素混合物可包含约10mg的生物素、约10mg的钴胺素、约30mg的对氨基苯甲酸、约50mg的叶酸、约150mg的吡哆胺、约50mg的硫胺素和约50mg的核黄素。所有的培养基组分都是可以溶解的，从而形成清澈且不含固体和沉淀的溶液。过滤和灭菌YFAP维生素混合培养基以用于下文所述的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)培养基。
可将这种普氏栖粪杆菌(DSM 33185)培养基制备成包含以下成分中的任意一种或多种：BBLTM植物蛋白胨、SOLABIA豌豆蛋白胨、DifcoTM选择大豆蛋白胨、BactoTM酵母提取物、碳酸氢钠(NaHCO3)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、氯化钠(NaCl)、七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)、乙酸钠(NaOAc)、葡萄糖(dextrose)、丙酸钠、L-半胱氨酸和/或YFAP维生素混合溶液，例如如上文所述制备。在这种情况下，约5L的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)培养基可包含约75g至100g的SOLABIA豌豆蛋白胨、约45g至约55g的BBLTM植物蛋白胨、约45g至约55g的DifcoTM选择大豆蛋白胨、约20g至约30g的BactoTM酵母提取物、约2g至约8g的碳酸氢钠(NaHCO3)、约10g至约15g的磷酸氢二钾(K2HPO4)、约2g至约8g的氯化钠、约0.5g至约2g的七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)、约20g至约30g的乙酸钠(NaOAc)、约40g至约60g的葡萄糖(dextrose)、约2g至约8g的丙酸钠、约2g至约8g的L-半胱氨酸和约0.5至约3mL的YFAP维生素混合溶液，例如如上文所述制备。因此，在一个实施例中，约5L的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)培养基可包含约100g的SOLABIA豌豆蛋白胨、50g的BBLTM植物蛋白胨、约50g的DifcoTM选择大豆蛋白胨、约25g的BactoTM酵母提取物、约5g的碳酸氢钠(NaHCO3)、约12.5g的磷酸氢二钾(K2HPO4)、约5g的氯化钠、约1g的七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)、约25g的乙酸钠(NaOAc)、约50g的葡萄糖(dextrose)、约5g的丙酸钠、约5g的L-半胱氨酸和约1mL的YFAP维生素混合溶液，例如如上文所述制备。
普氏栖粪杆菌(DSM 33185)培养基YFAP-NU还可以制备成包含以下组分中的任意一种或多种：豌豆蛋白胨、
Figure BDA0003680965440000321
783酵母提取物、碳酸氢钠(NaHCO3)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、氯化钠(NaCl)、七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)、乙酸钠(NaOAc)、葡萄糖(dextrose)、L-半胱氨酸和/或钴胺素。在这种情况下，约5L的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)培养基可包含约75g至100g的豌豆蛋白胨、约50g的
Figure BDA0003680965440000322
783酵母提取物、5g的碳酸氢钠(NaHCO3)、约12.5g的磷酸氢二钾(K2HPO4)、约5g的氯化钠(NaCl)、约1g的七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)、约25g的乙酸钠(NaOAc)、约50g的葡萄糖(dextrose)、约5g的L-半胱氨酸和约5g的钴胺素。
此类细胞培养基的pH可以例如使用冰醋酸调节至约6.5±0.1。根据所使用的细菌菌株，此pH值可以在约6.2至约6.8之间变化。在一些情况下，细胞培养基的pH值可以不进行调节。此pH值可以在约4.5至约7.5之间变化。在一些实施方案中，此类培养基的pH值可以为约5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。还原至厌氧状态后，普氏栖粪杆菌(DSM 33185)的起始培养物可通过以下步骤制备：向含有还原型培养基的起始培养管中加入一定体积的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)原液，例如约500μL细胞库原液，然后在37℃温育约12-16小时。在起始培养物扩增后(例如，额外温育约12-24小时后)，测定细胞培养物在600nm处的吸光度并重复三次以确保吸光度在特定范围内。此吸光度范围可以为约1.2至约2.0，优选约1.4至约1.8。然后，将培养瓶离心，去除上清液，并在无菌PBS中重悬残余的细胞沉淀以产生均质溶液。在一些情况下，将普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞悬浮液等分至冷冻管(例如，2mL冷冻管)中，以获得每单位剂量约5x10^8至约10^10个活的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞的最终细胞浓度。此单位剂量的体积可为约1mL。在这种情况下，此单位剂量可包含约5x 10^8个活的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞。
本发明还提供了方法，包括聚集一个或多个细胞批次的菌株以包含在用于药物组合物的细菌聚生体中。例如，在一些情况下，此类方法包括聚集表1中的一种或多种细菌菌株的细胞群。在这种情况下，可将制备用于菌株卷曲乳杆菌(DSM 33187)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)和普氏栖粪杆菌(DSM 33185)中的一种或多种的细胞批次组合，形成用于药物组合物的细菌聚生体。
此类方法可包括确定细菌菌株的每个细胞群中代谢活性细胞的量。可在药物组合物的细菌聚生体包含三种细菌菌株卷曲乳杆菌(DSM 33187)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM33213)和普氏栖粪杆菌(DSM 33185)或由其组成的情况下确定每个制备好的细胞批次中代谢活性细菌细胞的数量。此类测量可以使用任意适宜的方法进行，例如本文所述的那些方法。可使用从这些测量中获得的信息来确定可由给定批次的细菌菌株(例如，卷曲乳杆菌(DSM 33187)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)和/或普氏栖粪杆菌(DSM 33185))制备的单位剂量的数量。例如，可由卷曲乳杆菌(DSM 33187)批次制备的单位剂量的数量可确定如下：卷曲乳杆菌(DSM 33187)批次的潜在剂量的数量＝((卷曲乳杆菌(DSM 33187)平均效力，以CFU/mL计)X(卷曲乳杆菌(DSM 33187)批次量，以mL计))/(4x 10^8CFU/剂量)。
因此，在一些实施方案中，本文的药物组合物的细菌聚生体可包含约5x10^8CFU/菌种或菌株。一旦计算出可每个菌株产生的潜在单位剂量的数量，就可将含有相应菌株细胞的相应小瓶从冰箱中取出，并在进行前允许在前室(antechamber)中进行预还原。在还原和解冻之后，可将计算的细胞悬浮体积量的各个菌株转移到1L玻璃瓶中，并使用缓冲液(例如PBS)增加体积，以获得计算的每毫升细胞浓度。在一些情况下，这种计算的浓度可以为约5x10^8CFU/细菌种类/mL药物组合物。可以使用冷冻管将所得的均质悬浮液等分成单位剂量，并存储在-80℃，直到进一步使用，如施用于对象。
本文提供的细菌聚生体的制备方法可进一步包括进行质量控制以确保相应组合物中的细菌菌株的细胞是活的并且对应于正确的菌株。在这种质量控制方法中，可以针对每个菌株批次的各种参数、测试方法和规格进行评估。这种评估可以在将药物组合物施用于对象之前进行。示例性质量控制参数可包括(i)细菌菌株的浓度，和(ii)通过目测菌落生长的形态。例如，普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞菌落的形态可包括圆形、整个边缘、扁平、中小尺寸、奶油棕褐色；普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞菌落的形态可包括圆形、整个边缘、凸起、点状大小、不透明-半透明；以及卷曲乳杆菌(DSM 33187)细胞菌落的形态可包括圆形、整个边缘、凸起、中小尺寸、不透明-半透明、白色奶油色。
本文提供了药物组合物，该药物组合物可以设计和制备以允许存储和/或运输药物组合物。在一些情况下，可设计本文的包含细菌聚生体的药物组合物以使药物组合物中细菌细胞的活力不受存储和/或运输的影响或仅受到最小程度的影响。在这种情况下，在存储和/或运输期间药物组合物中有至少约80％、85％、90％、95％、97％或99％的细菌细胞保持了活力。
在一些情况下，本文的药物组合物包含冷冻保护剂以允许在约-70℃或-80℃的低温下储存以保持细菌细胞的活力。在这种情况下，药物组合物可包含作为冷冻保护剂的约20％v/v的甘油。本文的药物组合物可进一步包含抗氧化剂，所述抗氧化剂可以在存储或运输小瓶中保持厌氧环境并且可以保护细菌细胞免受活性氧的侵害。
在一个实例中，在本文的药物组合物中，活的植物性细菌可以在具有20％v/v甘油和0.1％w/w半胱氨酸的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冷冻保存以保持它们的活力。在这种情况下，活的细菌属于表1中所示的菌株中的任意一种或多种。
本发明提供了可以与本文描述的药物组合物组合使用的容器和试剂盒。本发明进一步提供了可以指导使用者(例如人类使用者)使用这种包含药物组合物的容器和试剂盒的说明书。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物存在于容器中。容器可用于培养、存储、运输、等分和/或施用本发明的药物组合物。例如，这种容器可用于将药物组合物施用于对象。在一个实例中，容器是冷冻管并且可以用于将药物组合物施用于人类对象。本文所述的容器还可以提供适于细菌种群(例如，包含一种或多种厌氧细菌细胞的那些群体)的生长、运输和/或存储(例如，冷却或冷冻储存)的条件。这种厌氧细菌细胞可包括嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和/或卷曲乳杆菌(DSM 33187)细胞中的任意一种或多种。在这种情况下，容器可用于在药物组合物的生长、运输和/或存储期间提供一定的氧含量或浓度，以保持细菌细胞的活力。在一些情况下，本文的容器可以使药物组合物中至少约80％、85％、90％、95％、97％或99％的细菌细胞保持活力。在一些情况下，容器可以使约95％的细菌细胞保持活力至少约1周、2周、4周、8周或12周。容器可进一步用于提供合适的体积、数量和给药方案以将此药物组合物施用于对象。在这种情况下，可以设计容器或包含此容器的试剂盒以供人类对象自行给药。这种自行给药的说明书可以作为使用说明书提供并且可以是本文所述的试剂盒的一部分。在各种情况下，这样的说明书可以是书面说明书或口头说明书，或其组合。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物存在于容器中。容器可包括2mL聚丙烯螺旋盖小瓶。小瓶可以是单剂量小瓶或多剂量小瓶。在一些情况下，容器还可以包含环状烯烃共聚物(COC)、环状烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯(HDPE)、基于乙烯-乙烯醇(EVOH)的材料、玻璃、塑料管、罐、铝管、分配器管或它们的任意组合。小瓶的体积可为1/50、1/10、1/5、1/3、1/2、5/8、1、2、3、4、8、11、13、16、20、30、40、50DRAM。小瓶的体积还可以为0.01ml、0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、1ml、1.1ml、1.2ml、1.3ml、1.4ml、1.5ml、1.6ml、1.7ml、1.8ml、1.9ml、2ml、2.1ml、2.2ml、2.3ml、2.4ml、2.5ml、2.6ml、2.7ml、2.8ml、2.9ml、3ml、3.1ml、3.2ml、3.3ml、3.4ml、3.5ml、3.6ml、3.7ml、3.8ml、3.9ml、4ml、4.1ml、4.2ml、4.3ml、4.4ml、4.5ml、4.6ml、4.7ml、4.8ml、4.9ml、5ml、5.1ml、5.2ml、5.3ml、5.4ml、5.5ml、5.6ml、5.7ml、5.8ml、5.9ml、6ml、6.1ml、6.2ml、6.3ml、6.4ml、6.5ml、6.6ml、6.7ml、6.8ml、6.9ml、7ml、7.1ml、7.2ml、7.3ml、7.4ml、7.5ml、7.6ml、7.7ml、7.8ml、7.9ml、8ml、8.1ml、8.2ml、8.3ml、8.4ml、8.5ml、8.6ml、8.7ml、8.8ml、8.9ml、9ml、9.1ml、9.2ml、9.3ml、9.4ml、9.5ml、9.6ml、9.7ml、9.8ml、9.9ml或10mL。小瓶的体积还可以为0.01至0.1ml、0.11至1ml、1.1至1.11ml、1.11至1.2ml、1.21至1.3ml、1.31至1.4ml、1.41至1.5ml、1.51至1.6ml、1.61至1.7ml、1.71至1.8ml、1.81至1.9ml、1.91至2ml、2.01至2.1ml、2.11至2.2ml、2.21至2.3ml、2.31至2.4ml、2.41至2.5ml、2.51至2.6ml、2.61至2.7ml、2.71至2.8ml、2.81至2.9ml、2.91至3ml、3.01至3.1ml、3.11至3.2ml、3.21至3.3ml、3.31至3.4ml、3.41至3.5ml、3.51至3.6ml、3.61至3.7ml、3.71至3.8ml、3.81至3.9ml、3.91至4ml、4.01至4.1ml、4.11至4.2ml、4.21至4.3ml、4.31至4.4ml、4.41至4.5ml、4.51至4.6ml、4.61至4.7ml、4.71至4.8ml、4.81至4.9ml、4.91至5ml、5.01至5.1ml、5.11至5.2ml、5.21至5.3ml、5.31至5.4ml、5.41至5.5ml、5.51至5.6ml、5.61至5.7ml、5.71至5.8ml、5.81至5.9ml、5.91至6ml、6.01至6.1ml、6.11至6.2ml、6.21至6.3ml、6.31至6.4ml、6.41至6.5ml、6.51至6.6ml、6.61至6.7ml、6.71至6.8ml、6.81至6.9ml、6.91至7ml、7.01至7.1ml、7.11至7.2ml、7.21至7.3ml、7.31至7.4ml、7.41至7.5ml、7.51至7.6ml、7.61至7.7ml、7.71至7.8ml、7.81至7.9ml、7.91至8ml、8.01至8.1ml、8.11至8.2ml、8.21至8.3ml、8.31至8.4ml、8.41至8.5ml、8.51至8.6ml、8.61至8.7ml、8.71至8.8ml、8.81至8.9ml、8.91至9ml、9.01至9.1ml、9.11至9.2ml、9.21至9.3ml、9.31至9.4ml、9.41至9.5ml、9.51至9.6ml、9.61至9.7ml、9.71至9.8ml、9.81至9.9ml或9.91至10ml。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物是冻干的或冷冻的。冻干或冷冻药物组合物中的细菌细胞可以存储在-70℃。在一些实施方案中，细菌细胞可以存储在10℃、4℃、0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-65℃、-70℃、-75℃或-80℃。在其他情况下，细菌细胞还可以存储在-80℃至-70℃、-70℃至-60℃、-60℃至-50℃、-50℃至-40℃、-40℃至-30℃、-30℃至-20℃、-20℃至-10℃、-10℃至0℃或0℃至10℃。在一些实施方案中，所存储的冻干或冷冻细菌细胞中至少有70％在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月或36个月后仍保持活力。在一些情况下，所存储的冻干或冷冻细菌细胞中至少有75％在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月或36个月后仍保持活力。在其他情况下，所存储的冻干或冷冻细菌细胞中有至少80％在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月或36个月后仍保持活力。在一些实施方案中，所存储的冻干或冷冻细菌细胞中有至少85％在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月或36个月后仍保持活力。在其他实施方案中，所存储的冻干或冷冻细菌细胞中至少有90％在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月或36个月后仍保持活力。所储存的冻干或冷冻细菌细胞中至少95％在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月或36个月后仍保持活力。在一些实施方案中，所存储的冻干或冷冻细菌细胞中至少有99％在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月或36个月后仍保持活力。
本发明的试剂盒可提供用于使用如本文所述的药物组合物的各种组分。这种组分可包括容器、测试样本和/或用于分析药物组合物(例如，其活力、存储介质的pH等)的设备。因此，本发明的试剂盒可以允许使用者友好地、准确地且可靠地使用药物组合物，包括但不限于给药、施用、存储、运输。在一些实施方案中，药物组合物包含微生物聚生体，所述微生物聚生体包含表2中所示的细菌菌株中的任意一种或由其组成。在这种情况下，试剂盒可包含药物组合物，所述药物组合物包含表1中的至少一种、至少两种或所有菌株。
治疗方法
本发明提供了使用本文所述的药物组合物来预防和/或治疗疾病的方法。该疾病可包括炎性疾病、代谢疾病或自身免疫疾病。该疾病可为对象体内生态失调或生态失调相关病症或过敏性I型超敏反应的结果。该疾病还可包括过敏性II型超敏反应、过敏性III型超敏反应或过敏性IV型超敏反应。该生态失调可以是对象肠道微生物群的生态失调。在一些情况下，炎性疾病为过敏症。在其他情况下，炎性疾病为皮炎。该过敏可以为过敏性哮喘，包括过敏性小儿哮喘和食物过敏。该代谢疾病可包括肥胖症、糖尿病或代谢综合征。
因此，在一些情况下，可配制本文所述的药物组合物以施用于对象，其中该对象可患有或疑似患有过敏症。该对象例如对两种或更多种过敏原具有多重敏感性。该对象可以为哺乳动物。在一些情况下，对象为人。在该药物组合物施用于啮齿动物或人等对象时具有可用于在预防和/或治疗炎性疾病中的抗炎作用。在一些情况下，当口服施用药物组合物时可以引发这种抗炎作用。
在一些情况下，使用本文的药物组合物进行治疗的对象为人。人对象可以为新生儿、婴儿、学步的儿童、儿童、青少年或成人。在某些情况下，新生儿可以小于约3天龄、小于约1周龄、小于约2周龄、小于约3周龄、小于约4周龄、小于约8周龄。在一些情况下，婴儿可以为至少约2个月龄、至少约6个月龄、至少约12个月龄。在一些情况下，可以使用药物组合物来治疗约2至约18岁或至少约18岁的对象。对象可以为2至18岁或至少18岁。对象可为约2至约18岁或至少约18(例如，19、20、25、30、40、50、60、70、80、90)岁。在一些情况下，对象可以为约2至约18岁或约19岁。对象可以为约2至约18岁或约19岁。对象可以为约2至约18岁或约20岁。对象可以为约2至约18岁或约20岁。对象可以为约2至约18岁或约25岁。对象可以为约2至约18岁或约25岁。对象可以为约2至约18岁或约30岁或更大年龄。对象可以为约2至约18岁或约30岁。在一些实施方案中，对象为约18岁至约40岁、约12岁至约17岁和/或约2岁至约11岁。本文的药物组合物可以与乳、母乳、配方奶(用于哺乳婴儿)或食品混合以进行给药。
本文的药物组合物可以根据不同的给药方案施用不同的时间段。治疗期可能会因对象和个体而异，并且可以取决于如本文所述的各种因素，例如疾病状态、年龄等。在一些情况下，可以治疗对象一天至至少约一周，约一周至约一个月或约一个月至约一年。在这种情况下，可以治疗对象约一个月、两个月或三个月。在一些情况下，治疗可以进行连续几天、连续几周和/或连续几个月。在一些实施方案中，连续施用药物组合物约28、29或30天。
本文的治疗方法可包括每天施用本发明的药物组合物一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次或十二次。在各种情况下，每天施用本发明的药物组合物两次。这种每天两次的给药可以在早上和晚上进行。在这种情况下，给定日的第一次和第二次给药之间可间隔约8、12或16小时的时间。
在本文的各种实施方案中，施用于人类对象以用于预防和治疗过敏等炎性疾病的药物组合物包含表1中列出的细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM33185)和/或卷曲乳杆菌(DSM 33187)的至少一种。该药物组合物可施用于2-11、12-17和18-40岁的一组对象(例如，约10、20或40位对象)，每天两次，连续约28天。在这种情况下，该药物组合物可作为液体悬浮液以1mL单位剂量进行施用。该单位剂量可以添加至冷的或室温的食品和饮料中进行服用。
尽管本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅作为实施例提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下可以作出许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。
实施例
提供这些实施例仅用于说明性目的，而不是限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1:细菌菌株的生长、分离和表征
本文提供了用于从人样本中分离的细菌菌株的生长、分离和表征的方法。该菌株可以用作本文所述的细菌聚生体的一部分。
1.细菌的生长
通常，如本文所述的生长细菌的方法可用于培养专性和兼性厌氧细菌菌株。本实施例中的细菌菌株来源于人粪便样本，并在选择性培养基上生长。传代培养后，将菌落转移到液体培养基中，随后准备用于PCR和测序。菌落还保存为甘油原液。
首先，将人粪便样本收集在厌氧运输介质(Anaerobic Systems As-915)中或密封在包含厌氧气氛产生***(例如，AnaeroPouch Thermo Fisher R686001)的塑料袋内的粪便收集小瓶中。立即将所有样本转移到厌氧室中，以最大限度地减少运输时间和潜在的氧气暴露，以确保厌氧菌株的活力。
通过将0.9mL的PBS+Cys(1xPBS+0.1％w/w的L-半胱氨酸)等分到13个管(体积为5mL)中而制备系列稀释管。使用一次性抹刀或环将20-30mg样本转移到含有0.9mL的PBS+Cys的第一个1.5mL管中。将所得混合物涡旋约30秒，并将0.1mL所得的均质溶液转移到含有0.9mL的PBS+Cys的第二个1.5mL管中。然后，重复该步骤，直到所有13个试管都包含样本的系列稀释液(例如，小瓶1-13中的1-10^-12稀释液)。
使用一次性曲棍球棒涂布器将约0.1mL含有10^-5至10^-12的稀释液的样本管(小瓶6-13)添加到不同的含有选择性琼脂生长培养基的琼脂板中。然后，将琼脂板用封口膜密封以防止蒸发，并置于37℃的温育箱中72小时。鉴定出符合菌落特定形态的菌落(例如，卷曲乳杆菌(DSM 33187)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)等)，并置于新的预还原琼脂板上以进行分离。将琼脂板用封口膜密封并置于37℃的厌氧培养箱中又72小时。
通过从培养板中挑选特定分离的菌落并将菌落在1mL预还原的液体肉汤中重悬浮而将分离的菌落转移到液体培养基中。平行接种选定生物体的阳性和阴性对照以分别比较生长和监测污染。然后，将所有液体菌落样本在37℃温育72小时。
使用阳性和阴性对照鉴定阳性匹配肉汤培养物。通过将0.75mL肉汤培养溶液转移到PBS中含有0.75mL 50％v/v甘油的2mL冷冻管中来制备阳性匹配肉汤培养物的甘油原液。然后，将密封的冷冻管样本从厌氧室中取出并存储在-80℃。剩余的肉汤培养样本用于通过使用基于16S的PCR进行分离鉴定，如下文所述。
2.用于分离鉴定的基于16S的PCR
将肉汤培养样本离心，形成细胞沉淀，并小心除去所得的上清液以使形成的细胞沉淀保持完整。然后，在0.5-1mL超纯水中重悬浮细胞沉淀。
最终反应体积为50μL的PCR Mastermix使用以下PCR组分(NEBE5000S)和体积制备：10X缓冲液(5μL)、10mM dNTPs(1μL)、10μM 27F正向引物(1μL)、10μM 1492R反向引物(1μL)、标记聚合酶(0.25μL)和无菌水(40.25μL)。将PCR Mastermix(48.5μL)和1.5μL重悬浮的细菌细胞置于0.2mL PCR条管中并进行涡旋，然后将PCR反应样本暴露于以下热循环仪方案(表3)：
表3 PCR热循环仪方案
步骤 温度 时间
1 95℃ 2分钟
2 95℃ 30秒
3 50℃ 30秒
4 68℃ 1分钟30秒(步骤2-4重复30次)
5 72℃ 5分钟
6 4℃ 保持
PCR反应完成后，使用GENEWIZ或类似的供应商提交样品用于Sanger测序。
3.分离细菌菌株的表征
下表4显示了菌株(也在表2中显示)嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)的短链脂肪酸生产、抗生素抗性和全基因组测序分析，这些菌株在各种实施方案中可形成用于药物组合物的细菌聚生体。
表4分离表征
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实施例2:细菌组合物A的制备
生成制备条件以增加本文所述细菌菌株的产量和生长速率。具体而言，获得了用于使嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM33187)菌株的产量和生长速率得以增加的生产条件。本文的图1提供了概括使用这些菌株制备组合物A的制备步骤的示意流程图。
1.培养基制备
在本实施例的制备步骤中使用了无动物培养基。为了生产细菌批次，首先为每种菌株制备5L肉汤培养基。通过在USP级水中剧烈搅拌15分钟使培养基组分完全溶解后，用盐酸调节培养基的pH值。然后，将经pH调节的培养基转移到生物安全柜中，并使用0.2μm真空过滤装置(例如，使用5次1升的部分)进行过滤灭菌。将经过滤灭菌的生长培养基立即转移到含有N2H2CO2(90:5:5)气氛的厌氧室中，并在接种前用通风帽存储12-18小时以进行还原。
2.接种与培养
在厌氧条件下还原培养基12-18小时后，将每个1L过滤瓶中的10mL转移到无菌预还原的15mL螺旋盖管中，并标记为“5的无菌对照#”。将另外40mL的无菌培养基转移到两个单独的50mL Falcon试管中，标记为“2的起始培养物X”。一个2mL主细胞库(MCB)冷冻管从-70℃存储中取出，用70％EtOH清洁小瓶外部，并用无绒抹布擦干。然后，将MCB等分试样转移到厌氧室中，并置于管架中解冻5-10分钟。完全解冻后，使用无菌的1mL过滤移液器吸头将解冻的1mL MCB中的500μL等分试样转移到两个40mL起始培养物的每一个中。将接种的起始培养物和无菌对照上的盖子安全旋紧，并在厌氧培养条件下于约37℃使对照和起始培养物生长12-16小时。
12-16小时后，从培养箱中取出起始培养物和无菌对照，并肉眼检查生长情况(例如，浊度)。此外，在无菌对照中确认无可见的生长或混浊，然后继续进行。一旦确认，使用无菌的10mL血清移液器吸头将10mL起始培养物小心地转移到5个预加热的含有预还原的过滤灭菌培养基的1L***每一个中。然后，在厌氧条件下于37℃温育培养物12-16小时。温育后，使用吸光度光谱法(Epoch 2微孔板检测仪，Biotek)对培养物的浊度进行量化，以确认在设定参数内的生长。一旦确认培养物吸光度在目标OD600范围内，离心收集细胞。
3.收集
在收集细胞前12至18小时，将五个无菌的带有螺旋盖密封的1L离心瓶(BeckmanCoulter)放置在厌氧室中，以使瓶子在使用前还原。在培养物生长并确认培养物在目标OD600范围内后，将培养物转移到无菌的1L离心瓶中。将离心瓶上的盖子紧紧密封以防止气体交换，并将瓶子转移到预冷的装有6x 1L转子的落地式离心机中。细胞在4℃以8,000x g沉淀30分钟。离心后，将细胞沉淀转移回厌氧室，并使用无菌血清吸管将澄清的培养上清液从沉淀中完全去除。然后，通过在预还原的冷冻保护剂溶液中以40X浓度进行重悬浮来合并细胞沉淀。然后，将浓缩的细胞悬浮液分装成1mL等分试样，放入预先还原、预先标记的2mL螺旋盖冷冻管中，并立即转移到-70℃的预先标记的存储箱中。药物菌株在制备三天后进行规格测试，并在-70℃初始储存。
下面描述了药物组合物中使用的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)细胞的生产方法。
A.用于药物组合物的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞的生成
为了制备培养基，在5L烧杯中，加入4.9L水(注射用)，然后在混合下加入DifcoTM选择大豆蛋白胨(82.5±0.82g)、BactoTM酵母提取物(12.5±0.12g)、碳酸氢钠(NaHCO3)(5±0.05g)、磷酸氢二钾(K2HPO4)(12.5±0.12g)、氯化钠(NaCl)(1.5±0.015g)、七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)(0.5±0.05g)、氯化钙(CaCl2)(0.5±0.05g)、葡萄糖(Dextrose)(22.6±0.22g)、N-乙酰氨基葡萄糖(27.7±0.27g)、L-苏氨酸(20±0.2g)和L-半胱氨酸(5±0.05g)。搅拌混合物直至所有组分完全溶解、澄清且没有固体和沉淀。
将NAGT培养基的pH值调节至6.5±0.1。然后，将培养基真空过滤并分成5个1L批次。将培养基完全还原后(约12-16小时后)，用45mL体积的培养基制备嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细菌细胞的起始培养物。从细胞库中移除嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细菌细胞(约500μL原液)，并加入到制备好的含有生长培养基的小瓶中。然后，使细胞悬浮液升温并在37℃温育箱中温育24-60小时，产生浑浊/混浊的悬浮液。随后，测量在600nm处的吸光度，并重复记录三次以获得约0.7-1.1的值。
然后使用JLA8.1000离心机以8000rpm于4℃离心培养瓶30分钟。去除上清液后，在25mL无菌PBS-GC(原始培养体积的40X浓度)中重悬浮残余的细胞沉淀，然后合并，产生均质溶液。将嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞悬浮液等分至2mL冷冻管中以获得最终的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞浓度，即>1x 10^9个活的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞/小瓶，并将该细胞悬浮液存储在-80℃直至进一步使用。
B.用于药物组合物的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞的生成
为了制备YFAP维生素混合溶液，将1L瓶子填满水(注射用)，然后在混合下加入生物素(10±1mg)、钴胺素(10±1mg)、对氨基苯甲酸(30±1mg)、叶酸(50±1mg)、吡哆胺(150±1mg)、硫胺素(50±1mg)和核黄素(50±1mg)。搅拌混合物直至所有组分完全溶解、澄清且没有固体和沉淀。随后，对YFAP维生素混合培养基进行过滤和灭菌。
为了制备培养基，在5L烧杯中加入4.9L水(注射用)，然后在混合下加入BBLTM植物蛋白胨(50±0.5g)、DifcoTM选择大豆蛋白胨(50±0.5g)、BactoTM酵母提取物(25±0.25g)、碳酸氢钠(NaHCO3)(5±0.05g)、磷酸氢二钾(K2HPO4)(12.5±0.12g)、氯化钠(NaCl)(5±0.05g)、七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)(1±0.01g)、乙酸钠(NaOAc)(25±0.25g)、葡萄糖(dextrose)(50±0.25g)、丙酸钠(5±0.05g)、L-半胱氨酸(5±0.05g)和YFAP维生素混合溶液(1mL，如上所述制备)。搅拌混合物直至所有组分完全溶解、澄清且没有固体和沉淀。
然后，使用5M盐酸盐溶液将YFAP培养基的pH值调节至6.5。然后，过滤培养基并在暗处静置约12-18小时以完全还原至厌氧状态。将一定体积的培养基转移到起始培养管后，将大约500μL普氏栖粪杆菌(DSM 33185)原液转移至起始培养管，并在37℃温育约12-16小时。对起始培养管的浊度进行评估，并分成5等份，加入预热的1L装有无菌培养基的烧瓶中，然后在37℃温育12-16小时。
温育后，测定600nm处的吸光度，并重复三次以确保吸光度在1.4-1.8吸光度的范围内。使用JLA8.1000离心机以8000rpm在4℃离心培养瓶30分钟。去除上清液后，在25mL无菌PBS-GC(原始培养体积的40X浓度)中重悬浮残余的细胞沉淀，然后合并，产生均质溶液。将普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞悬浮液等分至2mL冷冻管中以获得最终普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞浓度，即>1x 10^9个活的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞/小瓶，并将该细胞悬浮液存储在-80℃直至进一步使用。
C.用于药物组合物的卷曲乳杆菌(DSM 33187)细胞的生成
为了制备vMRS培养基，在5L烧杯中加入4.9L水(用于注射)，然后在混合下加入273g vMRS粉末和磷酸二钾(K2HPO4)(12.5±0.1g)。搅拌混合物直至所有组分完全溶解、澄清且没有固体和沉淀。
然后用NH4OH或乙酸将vMRS培养基的pH调节至6.5。然后，使用0.2μm真空过滤装置过滤培养基，并在暗处静置约12-18小时以完全还原至厌氧状态。将一定体积(例如，45mL)的培养基转移至起始培养管，将大约500μL的卷曲乳杆菌(DSM 33187)原液转移至起始培养管，并在37℃温育约16-20小时。评估起始培养管的浊度，将起始培养管分成5等份，并加入到含有无菌培养基的预热的1L烧瓶中，然后在37℃温育16-20小时。
温育后，测定在600nm处的吸光度，并重复三次以确保吸光度在1.0-1.4吸光度的范围内。用JLA8.1000离心机以8000rpm在4℃离心培养瓶20分钟。去除上清液后，在25mL无菌PBS-GC(原始培养体积的40X浓度)中重悬浮残余的细胞沉淀，然后合并，产生均质溶液。将卷曲乳杆菌(DSM 33187)细胞悬浮液等分至1mL冷冻管中以获得最终的卷曲乳杆菌(DSM33187)细胞浓度，即>1x 10^9个活的卷曲乳杆菌(DSM 33187)细胞/小瓶，并将该细胞悬浮液存储在-80℃直至进一步使用。
D.组合物A的组装
为了制备组合物A，其可用作本文所述药物组合物中的细菌聚生体并且包括三种细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM33187)，测定每种菌株在-80℃冷冻管中存储的最终细胞悬浮液中的代谢活性细菌细胞的数量。可以从三个菌株批次生产的最大潜在口服剂量计算如下(表5)：
表5从制备的菌株批次计算潜在剂量
Figure BDA0003680965440000481
表6提供了组合物A的完整成分列表：
表6组合物A的组成
Figure BDA0003680965440000491
含有表6中所列的菌株的原液小瓶解冻(从冰箱中取出后约15-20分钟)后，将每个菌株的计算所得体积量的细胞悬浮液转移到1L玻璃瓶中，然后使用PBS-GC增加体积以获得经计算的细胞浓度/mL(例如，在本实施例中，5x10^8CFU/菌种/mL)。将所得的混合物种药品的均质悬浮液等分成1mL体积放入冷冻管中，并存储在-80℃直至进一步使用。
E.组合物A的质量控制
出于质量控制目的，对每批次组合物A评估以下参数、测试方法和规格，如表7中所述。
表7组合物A的示例性质量控制参数
Figure BDA0003680965440000492
Figure BDA0003680965440000501
有害微生物的测试根据USP<62>使用标准方案进行。简而言之，首先通过在大豆酪蛋白消化肉汤(SCDA)或其他合适的中和培养基中进行接种使样品富集，然后在选择性琼脂上画线(streak)以测定特定/有害微生物是否存在。
样本中存在的微生物总数根据USP<61>使用标准方案进行测定。使用膜过滤法、倾注平板法或涂布平板法进行微生物计数。
实施例3:生长培养基优化
本实施例提供了用于培养本文所述细菌菌株的生长培养基组分的优化。具体地，这类菌株包括用于细菌聚生体的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)。
1.嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)
在不同pH值下评估嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞在N-乙酰氨基葡萄糖苏氨酸(NAGT)培养基中的生长，并且一次除去一种培养基组分以评估这些培养基组分对嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞生长的影响。一般的NAGT培养基的pH值为6.5，并且含有11.9mM碳酸氢钠。当嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞在含有47.6mM碳酸氢钠的pH为7.5的改良的NAGT培养基中生长时，观察到生长增加了约40％(通过OD600测量，曲线#2，图2)。还使用平板法证实了生物质有所增加。从改良的NAGT培养基中去除葡萄糖(曲线#3，图2)、硫酸镁(曲线#4，图2)或氯化钙(曲线#5，图2)对嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞的生长几乎没有影响。
图3显示了大豆蛋白胨和N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)是嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM33213)细胞生长所必需的，分别如生长曲线#2和#3所示，这表明在缺乏大豆蛋白胨或NAG的培养基中没有细菌生长。增长曲线#1显示了嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞在含有大豆蛋白胨和NAG的NAGT培养基中的生长强劲。
2.普氏栖粪杆菌(DSM 33185)
YFAP培养基中的某些组分对普氏栖粪杆菌(DSM33185)细胞生长的影响通过一次去除一种培养基组分来评估。例如，图4显示了与普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞在完全培养基中的生长(曲线#1)相比，酵母提取物(例如，曲线#3显示了FP(DSM33185)在缺乏酵母提取物的培养基中的生长)和半胱氨酸(例如，曲线#4显示了FP(DSM33185)在缺乏酵母提取物的培养基中的生长)对于普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞的生长是必要的，普氏栖乳(DSM33185)细胞的生长情况。缺乏乙酸钠(曲线#5)会减少但不是阻止普氏栖粪杆菌(DSM33185)细胞的生长，而缺乏大豆蛋白胨(曲线#2)会在后期的对数和固定相阶段导致细胞死亡。
还检查了维生素补充剂的类型对普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞生长的影响。例如，图5显示了添加维生素提高了普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞在不含维生素的YFAP培养基中传代3次的产量。栖粪杆菌在含维生素的YFAP培养基(YFAP+维生素)中生长的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)的最终OD600比在缺乏硫胺素的YFAP培养基(YFAP无硫胺素)、缺乏吡哆胺的YFAP培养基(YFAP无吡哆胺)、缺乏叶酸的YFAP培养基(YFAP无叶酸)、缺乏钴胺素的YFAP培养基(YFAP无钴胺素)、缺乏PABA的YFAP培养基(YFAP无PABA)、缺乏核黄素的YFAP培养基(YFAP无核黄素)、缺乏维生素的YFAP培养基(YFAP无维生素)、或缺乏生物素的YFAP培养基(YFAP无生物素)中生长的那些普氏栖粪杆菌(DSM 33185)的最终OD600高约10％。YFAP+维生素培养基包括添加有完全维生素混合溶液(例如，YFAP维生素混合物)的YFAP培养基。YFAP维生素包括约10mg/L的生物素、约10mg/L的钴胺素、约30mg/L的对氨基苯甲酸、约50mg/L的叶酸、约150mg/L的吡哆胺、约50mg/L的硫胺素和约50mg/L的核黄素。
在另一个实施例中，图6显示了钴胺素是在不含维生素的YFAP培养基中传代培养一次的普氏栖粪杆菌(DSM33185)细胞的最佳生长的一个显著因素。在缺乏钴胺素的YFAP(YFAP无钴胺素)中生长的普氏栖粪杆菌(DSM33185)的最终OD600比在缺乏硫胺素的YFAP培养基(YFAP无硫胺素)、缺乏吡哆胺的YFAP培养基(YFAP无吡哆胺)、缺乏叶酸的YFAP培养基(YFAP无叶酸)、缺乏PABA的YFAP培养基(YFAP无PABA)、缺乏核黄素的YFAP培养基(YFAP无核黄素)、缺乏生物素的YFAP培养基(YFAP无生物素)或添加有维生素的YFAP培养基(YFAP+维生素)中生长的那些普氏栖粪杆菌(DSM33185)的最终OD600低约30％。缺钴胺素的YFAP的生长缺点与缺乏维生素的YFAP(YFAP无维生素)的生长缺点相似。
培养基的pH值也被证明是普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞生长的一个显著因素。图7显示了在不进行pH控制的情况下普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞的生长，而图8显示了在进行pH控制的情况下普氏栖粪杆菌(DSM 33185)细胞的生长。当用氢氧化铵(NH4OH)将pH控制在6时，氧化还原下降至-460mV，而细菌生长稳定在约OD600＝0.5。当不控制pH时，氧化还原维持在-400mV，细菌生长达到OD600＝1.1。因此，不进行pH控制的培养物产生的细菌比进行pH控制的培养物多50％以上。
3.卷曲乳杆菌(DSM 33187)
卷曲乳杆菌(DSM 33187)通常在从HiMedia Laboratories获得的vMRS肉汤中生长。然而，图9显示了，与使用HiMedia vMRS(曲线#1)相比，当培养基由Biokar诊断学(参考：BK176HA)获得的Boullion MRS Vegetal(曲线#2)制作时，卷曲乳杆菌(DSM33187)细胞的生长增加了约55％。不受任意理论的束缚的情况下，认为观察到的细胞生长的改善是由于Boullion MRS Vegetal的植物蛋白胨的量比HiMedia vMRS肉汤相比更高(约为20g/L量的两倍)。
实施例4:大规模细菌生长(20L)
产生用于在20L培养物中生长细菌的制备条件以增加本文所述细菌菌株的产量和生长速率。具体地，获得了用于增加细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM33187)的产量和生长速率的制备条件。
嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)的大规模生长
为了制备用于1L接种培养物和20L原代培养物的NAGT培养基，培养基组分称重如下：豌豆蛋白胨(16.5g/L)、酵母提取物(2.5g/L)、葡萄糖(4.52g/L)、磷酸氢二钾(K2HPO4)(2.5g/L)、氯化钠(NaCl)(0.3g/L)、七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)(0.1g/L)、碳酸氢钠(NaHCO3)(1g/L)、氯化钙(0.1g/L)、N-乙酰氨基葡萄糖(5.54g/L)、L-苏氨酸(4g/L)、L-半胱氨酸(1g/L)。搅拌混合物直至所有组分完全溶解、澄清且没有固体和沉淀。
用NH4OH和乙酸将NAGT培养基的pH调节至6.5±0.1。然后通过在121℃高压灭菌20分钟来对培养基灭菌。分别对葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖料过滤灭菌。然后将培养基组分混合在一起。
将含有NAGT的接种瓶移至厌氧室，并通过在厌氧气氛下温育48小时用N2H2CO2(90:5:5)进行脱气。接种培养物用RCB或MCB(0.4％，对于嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213))接种，并在37℃、厌氧气氛、无搅拌的条件下温育。每2小时监测培养物的葡萄糖消耗和光密度。如果a)观察到减速期或b)培养物已生长24小时，则停止培养。
通过使用N2H2CO2(90:5:5)进行喷射而使20L培养基脱气。以6.5L/min的速度进行脱气，直到氧化还原值下降并稳定。原代培养物(例如，约1L的接种培养物)的接种率为5％，每2小时监测培养物的葡萄糖消耗和光密度。以100rpm搅拌培养物并在37℃生长。如图10所示，在第24小时和第48小时添加90.4g的葡萄糖和110.8g的N-乙酰氨基葡萄糖的进料，以使细菌培养物在第25至第50小时之间保持在指数期，并在第50小时后进入稳定期。如果a)观察到生长减速期或b)培养物已生长约70小时，则停止培养。
卷曲乳杆菌(DSM 33187)的大规模生长
为制备1L接种培养物和150L原代培养物的Vegitone MRS培养基，培养基组分称重如下：豌豆蛋白胨(20g/L)、酵母提取物(10g/L)、葡萄糖(20g/L)、磷酸氢二钾(K2HPO4)(2.5g/L)、柠檬酸铵(0.3g/L)、七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)(0.1g/L)、乙酸钠(NaOAc)(5.54g/L)、吐温80(4g/L)。搅拌混合物直至所有组分完全溶解、澄清且没有固体和沉淀。
用NH4OH或乙酸将Vegitone MRS培养基的pH值调节至6.5±0.1。然后通过在121℃高压灭菌20分钟来对培养基灭菌。对葡萄糖溶液过滤灭菌。然后将培养基组分混合在一起。
将含有Vegitone MRS的接种瓶移至厌氧室，并通过在厌氧气氛下温育48小时用N2H2CO2进行脱气。接种培养物用RCB或MCB(0.4％，对于卷曲乳杆菌(DSM 33187))接种，并在37℃、厌氧气氛、无搅拌的条件下温育。每2小时监测培养物的葡萄糖消耗和光密度。如果a)观察到减速期或b)培养物已生长24小时，则停止培养。
通过使用N2H2CO2(90:5:5)进行喷射而使20L培养基脱气。以6.5L/min的速度进行脱气，直到氧化还原值下降并稳定。接种原代培养物(例如，约200mL的接种培养物)的接种率为1％，每2小时监测培养物的葡萄糖消耗和光密度。以100rpm搅拌培养物并在37℃生长。如图11所示，在第10小时和第11小时加入200g的葡萄糖料，使细菌培养物在第11-14小时保持在指数期，14小时后进入稳定期。如果a)观察到生长减速期或b)培养物已经生长16小时，则停止培养。
普氏栖粪杆菌(DSM 33185)的大规模生长
为制备用于1L接种培养物和20L原代培养物的YFAP培养基，培养基组分称重如下：豌豆蛋白胨(20g/L)、酵母提取物(5g/L)、葡萄糖(10g/L)、磷酸氢二钾(K2HPO4)(2.5g/L)、氯化钠(NaCl)(1g/L)、七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)(0.2g/L)、碳酸氢钠(NaHCO3)(1g/L)、乙酸钠NaOAc)(5g/L)、L-半胱氨酸(1g/L)。YFAP维生素混合溶液如实施例3中所述制备。搅拌混合物直至所有组分完全溶解、澄清且不含固体和沉淀。
用NaOH将YFAP培养基的pH值调节至6.5±0.1。然后通过在121℃高压灭菌20分钟来对培养基灭菌。对葡萄糖和YFAP维生素混合溶液进行过滤灭菌(0.2μm过滤器)。然后将培养基组分混合在一起。
将含有YFAP的接种瓶移至厌氧室，并通过在厌氧气氛下温育至少16小时用N2H2CO2进行脱气。接种培养物(0.4％，对于普氏栖粪杆菌(DSM 33155))用研究细胞库(ResearchCell Bank，RCB)或主细胞库(Master Cell Bank，MCB)接种，并在37℃、厌氧环境、无搅拌的条件下温育。每2小时监测培养物的葡萄糖消耗和光密度。培养物生长10-16小时后，停止培养。
所有开放式容器操作均是在生物安全柜(BSC)或厌氧室(AC)中使用良好的无菌技术进行的。通过使用N2H2CO2(90:5:5)进行喷射而对20L培养基进行脱气。以6.5L/min的速度进行脱气，直到氧化还原值下降并稳定。原代培养物(例如，约200mL接种培养物)的接种率为1％，每2小时监测培养物的葡萄糖消耗和光密度。以100rpm搅拌培养物并在37℃生长。如图12所示，在第9小时添加200g葡萄糖料，以使细胞在第9至第14小时保持生长。如果a)观察到生长减速期或b)培养物已生长16小时，则停止培养。
实施例5：大规模细菌生长(150L)
产生用于在150L培养物中生长细菌的制备条件以增加本文所述细菌菌株的产量和生长速率。具体地，获得用于增加细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)的产量和生长速率的制备条件。
嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)的大规模生长
为制备用于1L接种培养物和150L原代培养物的NAGT培养基，培养基组分称重如下：豌豆蛋白胨(16.5g/L)、酵母提取物(2.5g/L)、葡萄糖(4.52g/L)、磷酸氢二钾(K2HPO4)(2.5g/L)、氯化钠(NaCl)(0.3g/L)、七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)(0.1g/L)、碳酸氢钠(NaHCO3)(1g/L)、氯化钙(0.1g/L)、N-乙酰氨基葡萄糖(5.54g/L)、L-苏氨酸(4g/L)、L-半胱氨酸(1g/L)。搅拌混合物直至所有组分完全溶解、澄清且不含固体和沉淀。
用NH4OH和乙酸将NAGT培养基的pH调节至6.5±0.1。然后通过在121℃高压灭菌20分钟来对培养基灭菌。对葡萄糖过滤灭菌(0.2μm)。然后将培养基组分混合在一起。
将含有NAGT的接种瓶移至厌氧室，并通过在厌氧气氛下温育48小时用N2H2CO2进行脱气。接种培养物用RCB或MCB(0.4％，对于嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213))接种，并在37℃、厌氧气氛、不搅拌的条件下温育。每2小时监测培养物葡萄糖消耗和光密度。如果a)观察到减速期或b)培养物已生长48小时，则停止培养。
150L培养基通过使用N2H2CO2(90:5:5)进行喷射而脱气。以6.5L/min的速度进行脱气，直到氧化还原值下降并稳定。原代培养物(例如，约600mL的接种培养物)的接种率为0.4％，并且每2小时监测培养物的葡萄糖消耗和光密度。以100rpm搅拌培养物并在37℃生长。如图13所示，在第19小时，添加678g的葡萄糖和831g的N-乙酰氨基葡萄糖的过滤灭菌进料，以使细菌培养物在第20小时后保持在指数期。如果a)观察到生长减速期或b)培养物已生长约24小时，则停止培养。
卷曲乳杆菌(DSM 33187)的大规模生长
为制备1L接种培养物和150L原代培养物的Vegitone MRS培养基，培养基组分称重如下：豌豆蛋白胨(20g/L)、酵母提取物(10g/L)、葡萄糖(20g/L)、磷酸氢二钾(K2HPO4)(2.5g/L)、柠檬酸铵(0.3g/L)、七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)(0.1g/L)、乙酸钠(NaOAc)(5.54g/L)、吐温80(4g/L)。搅拌混合物直至所有组分完全溶解、澄清且没有固体和沉淀。
用NH4OH或乙酸将Vegitone MRS培养基的pH值调节至6.5±0.1。然后通过在121℃高压灭菌20分钟来对培养基灭菌。对葡萄糖溶液过滤灭菌。然后将培养基组分混合在一起。
将含有Vegitone MRS的接种瓶移至厌氧室，并通过在厌氧气氛下温育48小时用N2H2CO2进行脱气。接种培养物用RCB或MCB(0.4％，对于卷曲乳杆菌(DSM 33187))接种，并在37℃、厌氧气氛、无搅拌的条件下温育。每2小时监测培养物的葡萄糖消耗和光密度。如果a)观察到减速期或b)培养物已生长24小时，则停止培养。
150L培养基通过使用N2H2CO2(90:5:5)进行喷射而脱气。以6.5L/min的速度进行脱气，直到氧化还原值下降并稳定。原代培养物(例如，约600mL的接种培养物)的接种率为0.4％，并且每2小时监测培养物的葡萄糖消耗和光密度。以100rpm搅拌培养物并在37℃生长。如图14所示，在第10小时加入5250g的葡萄糖料，使细菌培养物在第10至12小时保持在指数期，并在12小时后进入稳定期。如果a)观察到生长减速期或b)培养物已经生长24小时，则停止培养。
普氏栖粪杆菌(DSM 33185)的大规模生长
为制备用于1L接种培养物和150L原代培养物的YFAP培养基，培养基组分称重如下：豌豆蛋白胨(20g/L)、酵母提取物(5g/L)、葡萄糖(10g/L)、磷酸氢二钾(K2HPO4)(2.5g/L)、氯化钠(NaCl)(1g/L)、七水硫酸镁(MgSO4 x 7H2O)(0.2g/L)、碳酸氢钠(NaHCO3)(1g/L)、乙酸钠NaOAc)(5g/L)、L-半胱氨酸(1g/L)。YFAP维生素混合溶液如实施例3中所述制备。搅拌混合物直至所有组分完全溶解、澄清且不含固体和沉淀。
用NaOH和乙酸将YFAP培养基的pH值调节至6.5±0.1。然后通过在121℃高压灭菌20分钟来对培养基灭菌。葡萄糖和YFAP维生素混合溶液进行过滤灭菌(0.2μm过滤器)。然后将培养基组分混合在一起。
将含有YFAP的接种瓶移至厌氧室，并通过在厌氧气氛下温育至少16小时用N2H2CO2进行脱气。培养物用RCB或MCB(0.4％，对于普氏栖粪杆菌(DSM 33185))接种，并在37℃、厌氧气氛、无搅拌的条件下温育。每2小时监测培养物的葡萄糖消耗和光密度。如果a)观察到减速期或b)培养物已生长24小时，则停止培养。
150L培养基通过使用N2H2CO2(90:5:5)进行喷射而脱气。以6.5L/min的速度进行脱气，直到氧化还原值下降并稳定。如图15所示，原代培养物(例如，约600mL的接种培养物)的接种率为0.4％，在第11至16小时保持在指数期，并且每2小时监测培养物的葡萄糖消耗和光密度。以100rpm搅拌培养物并在37℃生长。如图16所示，在第8小时添加150g的葡萄糖料，以使保持第8小时后保持指数生长。如果a)观察到生长减速期或b)培养物已经生长24小时，则停止培养。
实施例6：细菌冻干
为制备用于在大规模生长条件下细菌生长的冷冻保护剂溶液，将蔗糖(saccharose)(80g/L)、海藻糖(13.3g/L)、谷氨酸钠(5.3g/L)、L-半胱氨酸(1.3g/L)与水混合，过滤除菌(0.2μm过滤器)，并通过用N2H2CO2(90:5:5)气体进行喷射而脱气。用标准的校准氧化还原探针监测氧化还原状态。继续脱气，直到氧化还原值下降并稳定，表明处于完全厌氧状态(约60分钟)。将完全还原的冷冻保护剂混合物密封以防止空气侵入直至使用。通过在121℃高压灭菌20分钟来对所有Sharples离心机和混合罐组件进行原位灭菌。
细菌生长31小时，并使用设定在10℃的冷却Sharples离心机从20L或150L培养物中收集细菌。立即将圆筒中的细菌转移到无菌搅拌袋中，并测量生物质的重量。然后，将相同重量的厌氧和预还原的冷冻保护剂溶液添加到搅拌袋中。厌氧气体管线***搅拌袋的角落。使用N2H2CO2(90:5:5)气体以在6.5L/min的流速下喷射细菌和冷冻保护剂混合物5分钟。
在用厌氧气体进行喷射以确保浓缩的细菌和冷冻保护剂混合物保持在厌氧条件后，将搅拌袋密封放置在第二搅拌袋中。将双壁搅拌袋放入JumboMix3500桨式搅拌机内，以速度#3搅拌5分钟，产生均匀的厌氧混合物。
匀浆后，将含有细菌的冷冻保护剂溶液泵入一次性冷冻干燥盘中。每个盘称重。采用表8中列出的步骤将盘立即转移到预冷(-40℃)的冻干机中进行冻干：
表8冻干程序设置
Figure BDA0003680965440000591
当产品温度稳定至少两小时时，冻干结束。使用1mm研磨装置研磨冻干的产品，并在-20℃将其存储真空密封袋中直至使用。
实施例7：琼脂平板与流式细胞仪在测定样本中代谢活性细胞数量方面的比较
比较两种不同的技术传统的琼脂平板和流式细胞术，以提供关于样本中菌株的代谢活性细胞数(例如，菌株效力)的一致和准确读数的能力，例如细胞悬浮液或生物样本(例如，人粪便样本)。评估的菌株包括本文的细菌聚生体中使用的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和/或卷曲乳杆菌(DSM 33187)。
为了确定样本中例如嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和/或卷曲乳杆菌(DSM 33187)的代谢活性细菌细胞的数量(定义为CFU)，将琼脂平板法与流式细胞仪的使用进行比较。
图17A-图17C显示热灭活对照嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)(嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213))细胞的流式细胞术门控实验，用于量化细菌细胞种群中的代谢活性治疗菌株(例如，可以给予人类对象的细胞群)。用作示例菌株，嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)细胞原液在0.9％NaCl缓冲溶液中稀释至10-4M，然后在95℃的加热块中放置20分钟，以确保在进行实验前细胞死亡。细胞用2μM碘化丙啶和2μM SYTO9染色。将门应用于由前向散射面积(FSC-A)和侧向散射面积(SSC-A)计数的所有细胞(图17A)，以分别选择细胞大小和粒度。然后，根据前向散射高度(FSC-H)和前向散射面积(FSC-A)对这些细胞进行线性门控，以识别单个细胞(图17B)。然后，使用单个细胞设置死细胞(PIhighSYTO9low)和活细胞(PI-SYTO9high)的门控，这给出了50μl溶液中活细胞和死细胞的百分比(图17C)。图17A显示了当门应用于由前向散射面积(FSC-A)和侧向散射面积(SSC-A)计数的所有细胞以分别选择细胞大小和粒度时获得的流式细胞术结果。图17B显示了当根据前向散射高度(FSC-H)和前向散射面积(FSC-A)对这些细胞进行线性门控以识别单个细胞细胞时获得的流式细胞术结果。图17C显示了当使用单个细胞设置死细胞(PIhighSYTO9low)以及活细胞(PI-SYTO9high)的门控时获得的流式细胞术结果，它给出了50μL细胞悬浮液中活细胞和死细胞的百分比。该数据显示了流式细胞术方法允许准确确定代谢活性/非活性细胞的数量，如图17C所示，其显示了代谢非活性细胞(细胞已被热灭活)。
下表9显示了用于计算每个稀释液中总活细胞的计算顺序。为了计算“总细胞计数”，通过机器对稀释的和未染色的细胞进行计数，并乘以稀释因子(稀释因子X细胞数＝总细胞计数)。“标准偏差”和“平均总细胞数”来自“总细胞计数”。“活细胞百分比”通过将图17A-17C中解释的控制门应用于稀释液中的染色细胞来计算。将“活细胞百分比”应用于“平均总细胞数”，计算出嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)MCB甘油原液中的“平均总细胞数”。
表9使用流式细胞术计算活细胞数量
Figure BDA0003680965440000601
Figure BDA0003680965440000611
对于普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)也获得了类似的结果，这表明可使用流式细胞术来精确确定样本中代谢活性治疗菌株的数量。将使用平板法测定的总活细胞数与流式细胞仪测定的总活细胞数进行比较，这表明流式细胞术可以更精确地测量样本中的总活细胞(参见例如图17A-17C)。
此外，图18显示了比较活细胞的流式细胞术定量数据与使用(标准)平板法测定的总活细胞数量的图表。数据表明，与平板法相比，流式细胞术可以更精确地测量样本中的总活细胞(例如，量化为CFU/mL)。左侧y轴显示了通过流式细胞仪测量的总活细胞数。右侧y轴显示了生物复制品的由营养琼脂平板法计算出的平均CFU/mL值。双尾Mann Whitney t检验显示两种量化方法的平均值之间没有显著差异，p值为0.0532。结果显示了琼脂平板技术的可变性和FACS技术的相对一致性，验证了使用流式细胞仪作为量化生物样品中细菌菌株的方法。可使用该技术测试的样品包括可用于质量控制目的分析的人类粪便样品和细菌菌株样本。
总之，这些结果证明可使用本文所述的流式细胞术方法来确定(i)样本中代谢活性与代谢非活性细胞的比率，和(ii)样本中代谢活性细菌细胞的绝对数量。
实施例8：使用qPCR对粪便DNA中的细菌细胞进行定量
描述了使用定量聚合酶链式反应(qPCR)对样本中细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)进行定量。本实施例描述了使用特异性引物、qPCR和粪便DNA作为模板的菌株定量。
1.材料
下表10显示了用于菌株定量的示例性菌株特异性引物序列：
表10菌株的特异性引物序列
Figure BDA0003680965440000621
对提取自卷曲乳杆菌(DSM 33187)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)的基因组DNA进行PacBio测序。使用这些数据，对所有细菌菌株进行了比较基因组分析，以鉴定卷曲乳杆菌(DSM 33187)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)的基因组中的独特区域。在鉴定出独特区域后，设计qPCR引物对(参见上表10)以靶向存在于这些菌株中的独特区域。
用于该实验的其他材料包括：(i)嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)、卷曲乳杆菌(DSM 33187)DNA；(ii)人粪便DNA样本对照(不含菌株)；(iii)从临床样本中提取的DNA；(iv)金属384qPCR板架；(v)不含DNA/RNAse的无菌Eppendorf管；(vi)QuantStudio 6qPCR热循环仪。
2.方法
以电子方式计算临床样本名称和DNA浓度，并将所有样本标准化为10ng/μL，最终体积为100μL。每次运行都使用由人粪便DNA背景中稀释的纯细菌DNA生成的7个点的阳性对照标准曲线。这些标准品(缩写为“std”)是预先制作并分装的，以便于使用。对于标准曲线，运行中包括以下目标菌株DNA的系列稀释液(表11)：
表11标准菌株DNA制备
Figure BDA0003680965440000631
以下项目用于菌株DNA定量实验：
表12 DNA定量实验材料
Figure BDA0003680965440000641
将所计算量的水和DNA溶液添加到合适的孔中。将qPCR板密封、涡旋(5-10秒)并以1000rpm离心2分钟。
3.引物原液和Master Mix的制备
将正向和反向菌株特异性引物完全解冻，并将引物原液在1X TE缓冲液中保持在100μM(参见例如表10)。在两个Eppendorf管(一个用于正向引物，一个用于反向引物)中加入360μL无菌USP级WFI。然后，加入40μL正向引物溶液并均化，并且反向引物溶液重复相同步骤。将得到的10μM引物溶液与SYBR Select Master Mix(2X原液)和无菌水合并，并均化。
使用qPCR 384孔板将20μL qPCR Master Mix等分到孔A-N 1-24和O1-14中。在将主混合物等分到所有350个孔后，使用DNA标准化板将A行中所有孔的5μL DNA取出并接种到反应板A行的奇数孔中。然后，将A行所有孔中的5μL DNA转移并接种到反应板A行的偶数孔中。对所有孔重复最后2个步骤，直到将DNA添加到反应板中。随后，将适当菌株的标准曲线储备DNA板转移到生物安全柜中，然后根据反应板设置将标准品移液到P行的正确孔中。混合和离心后，将样本置于Quantstudio qPCR机器中。
如下表13中所示，使用以下循环条件：
表13循环条件
Figure BDA0003680965440000651
下表14显示了标准曲线对照循环阈值(CT)和引物解链温度(TM)值。表14进一步显示，对于每个选定的菌株普氏栖粪杆菌(DSM 33185)、卷曲乳杆菌(DSM 33187)和嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)，可使用具有标准量的菌株细胞DNA(例如，1ng、0.1ng、0.01ng和0.001ng)(用于生成标准曲线)的人粪便DNA中菌株细胞的估计量来对菌株细胞DNA的量(使用人粪便DNA背景)和水中菌株细胞DNA(例如，1ng、0.1ng、0.01ng和0.001ng)的相同量(例如，无粪便DNA背景)进行定量：
表14标准曲线对照值和引物TM值
Figure BDA0003680965440000652
Figure BDA0003680965440000661
Figure BDA0003680965440000671
图19A-19C分别显示了三种选定的菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)细胞的检测曲线限，这些曲线是通过将测量的CT值与如上表14中所示的菌株细胞的估计数作图而生成的。
实施例9:小鼠模型***
本文提供了一种用于评估包含三种细菌菌株卷曲乳杆菌(DSM 33187)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)和普氏栖粪杆菌(DSM 33185)的细菌聚生体治疗体内小鼠模型过敏性疾病等炎性疾病的能力的方案。
在使用气管内对气道过敏原致敏的幼年小鼠的过敏性气道炎症模型中，如实施例2中定义的组合物A的口服给药显著抑制了循环IgE免疫球蛋白的升高。此外，组合物A的口服给药显著降低了肺中的炎性Th2细胞扩增，同时降低了Th2相关基因表达和炎性细胞因子IL-4和IL-13的肺浓度。相反地，组合物A导致肺中抗炎Treg细胞的显著扩增，这与过敏性哮喘相关分子和免疫反应降低有关。此外，观察到循环IgE水平和气道嗜酸性粒细胞显著降低，而循环组胺和气道中性粒细胞呈下降趋势。基于这些研究，并且不受任意理论束缚，所提出的减轻过敏和哮喘反应的机制是基于Treg细胞的扩增和随后对Th2驱动生成过敏原特异性IgE的抑制。认为Treg细胞的扩增是关键的，因为组合物A的施用还与抑制过敏性哮喘相关的效应细胞的扩增有关，所述效应细胞包括嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞。与中和了负责引发过敏反应的IgE效应抗体的单克隆抗IgE抗体
Figure BDA0003680965440000681
(奥马珠单抗)相反，使用组合物A的作用机制可发生在过敏致敏级联的上游，突出了组合物A的预防潜力。组合物A的优势在于它阻止了与过敏反应相关的新IgE和炎症效应细胞的产生，因此预期副作用少得多。
这些结果证明组合物A的细菌聚生体在治疗过敏性气道炎症中是有效的。进一步观察到，这类聚生体的治疗功效可优于单克隆抗IgE抗体
Figure BDA0003680965440000682
(奥马珠单抗)，同时引起的副作用显著减少。总之，这些结果可以用作人对象临床研究的基础和基本原理。
实施例10:嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)药物(3500L)的优化的超大规模生长和制备方法
产生用于使如图20中概述的在3500L培养物中生长嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM33213)的制备条件和步骤，以增加本文所述细菌菌株的产量和生长速率。
培养基的制备
对250L糖料(表15)、3160L NAGT培养基(表16)、1.25L冰醋酸和冷冻保护剂混合物(表17)组分进行称重。
表15 250L嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)糖料的配方
组分 250L进料的重量(kg)
N-乙酰氨基葡萄糖 48.8
葡萄糖 39.8
表16 3160 L NAGT培养基的配方
组分 3160L NAGT培养基的重量(kg)
豌豆蛋白胨 63.3
酵母提取物 15.8
氯化钠 0.949
碳酸氢钠 3.16
磷酸氢二钾 7.91
七水硫酸镁 0.316
氯化钙 0.316
L-半胱氨酸HCI 3.16
L-苏氨酸 12.7
表17 100L冷冻保护剂混合物的配方
Figure BDA0003680965440000691
Figure BDA0003680965440000701
糖分和进料的制备与净化
完成了300L容器和混合罐原位清洁(CIP)。使用0.22μm过滤器将120L热软化水添加到无菌混合罐中。将三分之一重量的糖料组分添加到混合罐中，并以150rpm搅拌10分钟直到它们完全溶解。随后，将另外三分之二的糖料组分和120L热软化水加入到混合罐中并完全溶解。糖料使用0.2μm过滤器过滤灭菌并储存在无菌300L容器中。
3500L培养物培养基的制备与净化
为了生成NAGT培养基，3,500L搅拌发酵罐通过CIP灭菌，并配备校准的pH值和氧化还原传感探针。将总共400L的0.22μm过滤水加入到预先灭菌的混合罐中，并与NAGT培养基组分合并。以150rpm将混合物均化10分钟。将浓缩的培养基转移到3500L生物反应器中，并将3070L的0.22μm过滤的软化水添加到发酵罐中。将培养基的pH调节至pH＝6.5。在121℃将培养基原位灭菌20分钟。使用蒸汽灭菌连通将100L糖料添加到灭菌的NAGT培养基中。然后，使用喷雾器，以0.1vvm的速率添加N2H2CO2(90:5:5)气体混合物，同时以100rpm进行搅拌并保持0.2巴的顶部空间压力，从而将完全NAGT培养基脱气。从脱气开始监测NAGT培养基的氧化还原值。继续脱气直到氧化还原值下降并保持在稳定值1小时。然后，将NAGT存储在10℃±2℃，以90RPM进行搅拌和喷射0.01vvm的气体混合物直至使用。
20L和300L发酵罐的制备和净化以及培养基转移
完成20L和300L发酵罐的原位清洁(CIP)。使用来自3500L发酵罐的无菌连接器分别将17L和300L无菌培养基转移到20L发酵罐和300L发酵罐中。
初始接种的准备
将1L无菌NAGT培养基从20L发酵罐转移到无菌的1L瓶中。然后，将无菌瓶转移到厌氧室。在厌氧室中解冻19.2mL WCB嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)，并使用无菌移液器将其接种于1L还原的NAGT培养基(2％v/v接种率)中。通过轻轻旋转将细胞和培养基混合物均化，并在37℃温育，并在585nm处定期测量光密度(OD600)。图21显示了在此期间培养物的OD585稳步上升。当a)OD600>1或b)如果培养物生长48小时时停止培养。
20L接种
将20L培养基加热至37℃。使用表18中列出的参数对培养基进行脱气。
表18脱气接种的参数
参数 设置
搅拌 100rpm
温度 37±2℃
pH 6.5
气体 N<sub>2</sub>H<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>(90:5:5)
气体流量 0.01vvm
高压(Overlay) 0.2巴
继续脱气直到氧化还原值稳定1小时，由标准氧化还原传感器测量。将灭菌的三通阀连接到20L发酵罐。通过三通阀将嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)的全部1L接种培养物(5％v/v接种物)添加至20L发酵罐中。使用OD585监测20L培养物的光密度。图22显示了在此期间培养物的OD585稳步上升。当达到以下任一标准时停止培养：a)OD585>1.5，b)总培养时间达到48小时，或c)在三个后续OD585读数后检测到生长速率减慢。
300L接种
将300L培养基加热至37℃。使用表18中列出的参数对培养基进行脱气。继续脱气，直到氧化还原值稳定1小时，如通过标准氧化还原传感器测量的。将灭菌的三通阀连接到300L发酵罐。通过三通阀将来自20L发酵罐的15L嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)(5％v/v接种物)的接种培养物添加到300L发酵罐中。使用OD585监测20L培养物的光密度。图23显示了在此期间培养物的OD600稳步上升。当达到以下任一标准时停止培养：a)OD585>1.5，b)总培养时间达到48小时，或c)在三个后续OD585读数后检测到生长速率减慢。
3500L接种
将3500L培养基加热至37℃。使用表18中列出的参数对培养基进行脱气。继续脱气，直到氧化还原值稳定1小时，如通过标准氧化还原传感器测量的。将300L发酵罐连接到3500L发酵罐。通过将来自300L发酵罐的300L嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)(8-10％v/v接种物)的接种培养物添加到3500L发酵罐中。葡萄糖浓度降至低于2g/L后加入另外90L的糖料。使用OD585监测20L培养物的光密度。图24显示了在此期间培养物的OD585稳步上升。当达到以下任一标准时停止培养：a)OD585>2.5，b)总培养时间达到72小时，或c)在三个后续OD585读数后检测到生长速率减慢。当满足这些参数之一时，将发酵罐设置为4℃+/-3℃以开始冷却培养物。
离心
完成GEA离心机和混合罐的原位清洁(CIP)。将混合气体管线(N2H2CO2,90:5:5)连接到GEA离心机，并对GEA离心机和混合罐进行脱气30分钟。使用表19中列出的Sharples参数对3500L培养物进行离心。
表19用于3500L培养物的离心的Sharples参数
参数 设置
进料流量 600L/h
反压力 1.5巴
在脱气的混合罐中收集浓缩的细菌部分(生物质)。称重所收集的浓缩生物质的重量。
冷冻保护剂溶液的制备及其添加至浓缩生物质中
完成混合罐的原位清洁(CIP)。将75L的0.22μm过滤热软化水添加到混合罐中。将三分之一的冷冻保护剂混合物组分添加到混合罐中直到它们完全溶解。再加入20L的软化过滤水。以150rpm将混合物均化10分钟。将冷冻保护剂溶液转移到无菌生物反应器中。记录溶液的基线氧化还原值。使用表20中列出的参数对冷冻保护剂溶液进行脱气。
表20冷冻保护剂溶液脱气的参数
参数 设置
搅拌 100rpm
气体 N<sub>2</sub>H<sub>2</sub>CO<sub>2</sub>(90:5:5)
气体流量 0.1vvm
高压(Overlay) 0.3巴
将脱气的冷冻保护剂溶液以1:1(w/w)的比例添加到混合罐中的厌氧浓缩生物质中。记录可用于冻干的生物质和冷冻保护剂的总质量和体积。
冻干和研磨
装载无菌塑料冷冻干燥托盘以使总厚度不超过1cm，对应于每个托盘1.5L细胞和冷冻保护剂混合物。托盘在装满时移到预冷冻的冻干机架子中，以加快冷冻过程。根据表21中列出的参数启动冻干循环。
表21浓缩生物质的冻干循环参数
Figure BDA0003680965440000731
使用垫片1和1mm网格以速度1研磨冻干材料。研磨后，将冻干的细胞材料立即密封在聚乙烯(PE)袋中，每个袋中含有1.5kg或更少的材料。将冻干的细胞材料存储在<-18℃，并用于制备如实施例2中定义的组合物A。
实施例11:普氏栖粪杆菌(DSM 33185)药物(3500L)的优化的超大规模生长和制备方法
产生用于在3500L培养物中培养普氏栖粪杆菌(DSM 33185)的制备条件和步骤，如图25中概述的，以增加本文所述的细菌菌株的产量和生长速率。
培养基的制备
对250L糖料(表22)、3160LYFAP培养基(表23)和冷冻保护剂混合物(表24)的组分进行称重。
表22 250L普氏栖粪杆菌(DSM 33185)糖料的配方
组分 250L进料的重量(kg)
葡萄糖 85
表23 3160 LYFAP培养基的配方
组分 3160 LYFAP培养基的重量(kg,除非另有说明)
豌豆蛋白胨 63.3
酵母提取物 15.8
氯化钠 3.16
碳酸氢钠 3.16
磷酸氢二钾 7.9
七水硫酸镁 0.632
乙酸钠 15.8
L-半胱氨酸HCI 3.16
维生素混合溶液 632ml
表24 120L冷冻保护剂混合物的配方
组分 120L冷冻保护剂混合物的重量(kg)
蔗糖 9.6
海藻糖 1.596
谷氨酸钠 0.66
L-半胱氨酸HCI 0.156
糖部分和进料的制备与净化
完成300L容器和混合罐的原位清洁(CIP)。使用0.22μm过滤器将120L热软化水添加到无菌混合罐中。将三分之一重量的糖料组分添加到混合罐中，并以150rpm搅拌10分钟直到它们完全溶解。随后，将另外三分之二的糖料组分和130L热软化水加入到混合罐中并完全溶解。糖料使用0.2μm过滤器过滤灭菌，并存储在无菌的300L容器中。
3500L培养基的制备与净化
为了生成YFAP培养基，3,500L搅拌罐生物反应器通过CIP灭菌，并配备校准的pH和氧化还原传感探针。将总共400L的0.22μm过滤水添加到预先灭菌的混合罐中，并与YFAP培养基组分合并，并在150rpm下均化10分钟。将浓缩培养基转移到3500L生物反应器中，并将3070L的0.22μm过滤软化水添加到生物反应器中。使用蒸汽灭菌连接，将100L糖料添加到灭菌的YFAP培养基中。添加632ml的维生素混合溶液。然后，使用喷雾器以0.1vvm的速率添加N2H2CO2(90:5:5)气体混合物，同时以100rpm搅拌并保持0.2巴的顶部空间压力对完成的YFAP培养基进行脱气。
初始接种的准备
将1.6L无菌的YFAP培养基从300L发酵罐转移到2L无菌烧瓶中。然后，将无菌瓶转移到厌氧室中。在厌氧室中解冻6.4mL的WCB普氏栖粪杆菌(DSM 33185)，并使用无菌移液器将其接种到1L还原的YFAP培养基(0.4％v/v接种率)中。通过轻轻旋转将细胞和培养基混合物均化，并在37℃温育，并在585nm处定期测量光密度(OD585)。图26显示了在此期间培养物的OD585稳步上升。当a)OD585>3，或b)如果培养物生长48小时，停止培养。
300L培养
将150L的无菌培养基转移到无菌的300L发酵罐中。经喷雾器用N2H2CO2(90:5:5)以0.1vvm将300L发酵罐中的YFAP培养基脱气2小时。将300L培养基升温至37℃。使用表18中列出的参数对培养基进行脱气。
继续脱气直到氧化还原值稳定1小时，如通过标准氧化还原传感器测量的。将灭菌的三通阀连接到300L发酵罐。通过三通阀将整个1L的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)(2％v/v接种物)加入到20L发酵罐中。使用OD585监测20L培养物的光密度。图27显示了在此期间培养物的OD585稳步上升。当达到以下任一标准时停止培养：a)OD585>5，b)总培养时间达到48小时，或c)在三个后续OD585读数后检测到生长速率减慢。
3500L培养
将约3500L培养基加热至37℃。使用表18中列出的参数对培养基进行脱气。继续脱气直到氧化还原值稳定1小时，如通过标准氧化还原传感器测量的。将300L发酵罐与3500L发酵罐相连。将来自300L发酵罐的30L普氏栖粪杆菌(DSM 33185)接种物(8-10％v/v接种物)加入到3500L发酵罐中。使用OD585监测20L培养物的光密度。图28显示了在此期间培养物的OD585稳步上升。当达到以下任一标准时停止培养：a)OD585>5，b)总培养时间达到72小时，或c)在三个后续OD585读数后检测到生长速率减慢。当满足这些参数之一时，将发酵罐设置为4℃+/-3℃以开始冷却培养物。
离心
完成GEA离心机和混合罐的原位清洁(CIP)。将混合气体管线(N2H2CO2,90:5:5)连接到GEA离心机和混合罐，并对其进行脱气30分钟。使用表19中列出的Sharples参数离心3500L培养物。
在脱气的混合罐中收集浓缩的细菌部分(生物质)。称重所收集的浓缩生物质的重量。
冷冻保护剂溶液的制备及将其添加至浓缩的生物质中
完成混合罐的原位清洁(CIP)。将75L的0.22μm过滤热软化水添加到混合罐中。将三分之一的冷冻保护混合物组分添加到混合罐中，直到它们完全溶解。再加入20L的软化过滤水。随后，将另外三分之二的冷冻保护剂混合物组分添加到混合罐中，直到它们完全溶解。以150rpm将混合物均化10分钟。将冷冻保护剂溶液转移到无菌生物反应器中。记录溶液的基线氧化还原值。使用表18中列出的参数对冷冻保护剂溶液进行脱气。
将脱气的冷冻保护剂溶液以1:1(w/w)的比例添加到混合罐中的厌氧浓缩生物质中。记录可用于冻干的生物质和冷冻保护剂的总质量和体积。
冻干和研磨
装载无菌塑料冷冻干燥托盘以使总厚度不超过1cm，对应于每个托盘1.5L细胞和冷冻保护剂混合物。托盘在装满时移到预冷冻的冻干机架子中以加快冷冻过程。根据表21中列出的参数启动冻干循环。
使用垫片1和1mm网格以速度1研磨冻干材料。研磨后，将冻干的细胞材料立即密封在聚乙烯(PE)袋中，每个袋中含有1.5kg或更少的材料。将冻干的细胞材料存储在<-18℃，并用于制备实施例2中定义的组合物A。
实施例12:临床研究设计
使用首次人体研究的设计来评估包含由细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)组成的细菌聚生体的可口服给药的药物组合物，以用于预防和治疗过敏性疾病。
本实施例的研究设计为在多重过敏的(对两种或多种过敏原)但其他方面健康的人对象中的细菌聚生体的1b期、多中心、随机化、双盲、安慰剂对照、平行组、栖粪杆菌三连续部分的研究，所述细菌聚生体由细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)组成。
细菌组合物A的治疗功能通过确定循环IgE(总的和特异性的)水平、免疫细胞计数、粪便微生物组组成、粪便和血浆代谢特性、粪便和血浆免疫刺激能力(体外分析)以及从基线到治疗结束的症状评分来进行评估。
将对象分成3个类别(参见例如图29)。第一类别包含大约20名年龄18-40岁、对两种或多种过敏原多重过敏但其他方面健康(男性:女性；大约1:1)(随机化3:1测试:安慰剂)的对象；第二类别包含大约20名年龄12-17岁、对两种或多种过敏原多重过敏但其他方面健康(男性:女性；大约1:1)(随机化3:1测试:安慰剂)的对象；第三类别包含大约20名年龄2-11岁、对两种或多种过敏原多重过敏但其他方面健康(男性:女性；大约1:1)的对象。关于组合物A与安慰剂，对象按3:1随机化。
对人对象的治疗包括每天口服组合物A(大约每12小时+/-4小时，与食物或牛奶混合)两次，持续28天。每1mL剂量的组合物A含有5x10^8CFU/每种卷曲乳杆菌(DSM 33187)、嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)和普氏栖粪杆菌(DSM 33185)的菌种。
组合物A为活的生物治疗产品，其含有三种活细菌菌株，每种菌株的存在量为5x10^8CFU/剂量：卷曲乳杆菌(DSM 33187)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)。组合物A以含有所有三种菌种的单一冷冻甘油原液形式提供。每剂量的组合物A都装在带有硅胶垫圈密封的2mL聚丙烯螺旋盖小瓶中。该小瓶包含悬浮在缓冲甘油溶液中的所有三种活细菌菌株。缓冲甘油溶液由标准磷酸盐缓冲盐水(PBS、137mM NaCl、2.7mMKCl、10mM Na2HPO4和1.8mM KH2PO4)、20％v/v甘油和0.1％w/w作为抗氧化剂的半胱氨酸组成。组合物A剂量的体积为约1mL。
出于本实施例的目的，组合物A存储在-70℃，并保持温度的对数。将组合物A提供给人对象后即存储在-18℃或低于-18℃的冰箱中。组合物A剂量在解冻以供食用之前保持密封在其冷冻管(例如，2mL冷冻管)容器中，以保持产品的效力和纯度。组合物A的冷冻原液在室温下解冻5-10分钟，并如给药说明书中所述立即食用。
本实施例中的安慰剂治疗包括每天口服(大约每12±4小时，与食物或牛奶混合)赋形剂(安慰剂:磷酸盐缓冲盐水(PBS)如含20％v/v甘油和0.1％w/w半胱氨酸的产品制剂所述)两次，持续28天。每1mL剂量与测试产品的体积相同。冷冻原液在室温下解冻5-10分钟。之后，立即将小瓶中的内容物与足量(1-2盎司)的冷牛奶或室温牛奶(包括母乳、液态婴儿配方奶、牛奶、杏仁奶和豆奶)或食品(苹果酱和酸奶)混合。
如图29所示，筛选随访在第1天前的第28天至第7天进行(基线随访)。给药从第1天开始。对象治疗28天，随后在第8、15、22和29天进行随访。在第43天和第57天进行随访。基线后的每次随访都有±1天的窗口。
评估在28天治疗期间和之后至多28天(第57天)的洗脱期间进行，通过(i)报告不良事件进行；(ii)报告伴随用药；(iii)进行身体检查和生命体征；和(iv)实验室检查(包括血清化学、肝肾功能检查、血液学、全血细胞计数，有差异、及尿液分析)。在本研究的第三部分，不收集血液和尿液样本进行安全评估。进行除需要血液和尿液取样的评估以外的所有其他评估。
通过评估以下参数从基线到治疗结束的变化来进行额外的评估：(i)粪便微生物组分析(细菌组成)；(ii)粪便和血浆代谢分析；(iii)粪便和血浆免疫刺激能力(体外分析)；(iv)总IgE和特异性IgE水平；(v)循环免疫细胞分析；(vi)问卷和不良反应(AE)以及日记中的药物使用报告。
在本研究中确定了各种实验室变量。血液学变量包括血细胞比容、血红蛋白、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、平均红细胞体积、血小板计数、红细胞分布宽度、红细胞计数和白细胞计数，有差异。尿液分析参数包括外观(例如，颜色和特征)、胆红素、***原、蛋白质含量、葡萄糖水平、酮、白细胞酯酶、尿潜血、亚硝酸盐、pH和比重。生化参数包括葡萄糖水平、尿酸、BUN(血尿素氮)、肌酐、BUN/肌酐比、eGFR(估计肾小球滤过率)、钠、钾、氯化物、碳酸氢盐、钙、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶水平、AST(天冬氨酸氨基转移酶)水平、ALT(丙氨酸转氨酶)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、总胆固醇水平和甘油三酯水平。
实施例13：冷冻细菌细胞的活力
检查甘油中冷冻的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)的活力。将约5x10^8CFU的嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、约5x10^8CFU的普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和约5x10^8CFU的卷曲乳杆菌(DSM 33187)混合，并冷冻在甘油中。将冷冻的细菌细胞存储在-70℃。在存储后1个月、2个月、3个月、6个月、9个月和12个月对细菌细胞的活力进行评分。分数列于表22中：
表22甘油中冷冻的细菌细胞的活力
Figure BDA0003680965440000801
实施例14：冻干药品胶囊和液体组合物容器
实施例2中定义的组合物A包含在具有药学上可接受的赋形剂的胶囊中。胶囊采用标准尺寸0或尺寸1。胶囊由木薯普鲁兰多糖等植物来源的材料制成。它不含淀粉、不含麸质且不含防腐剂37℃胶囊崩解。>90％的胶囊在60分钟内溶于水、pH＝1.2的溶液、乙酸钠缓冲液USP(pH＝4.5)或磷酸钠缓冲液(pH＝7.2)。胶囊的崩解终点为1.6分钟，由在37℃用去离子水所测量。胶囊的透氧性(cm3/m2/天)为≤0.5，由通过胶囊中的气体组成所测量。可口服胶囊，如图30所示。组合物A也存在于2mL聚丙烯螺旋盖小瓶中并可口服，如图30所示。
实施例15：预防婴儿和新生儿过敏性病症的临床研究设计
组合物A的进一步研究：与安慰剂(相同外观的赋形剂溶液)相比，在具有高风险患过敏性疾病的新生儿和婴儿对象中每剂量总共含有1.5×10^9CFU(每个成分含量相等(5×10^8CFU/嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM33187)))和碳水化合物基赋形剂。组合物A或安慰剂每天施用1mL一次，持续28天(A部分)和336天(B部分)，可口服(经口)，可混入母乳、配方奶或食物中。
在A部分中：如图31所示，最初招募28天至小于12个月的婴儿接受28天的治疗，然后再观察1个月(停止治疗)，进而在招募新生儿(B部分)之前评估其安全性/耐受性。在A部分中，将符合条件的对象随机化到：组合物A，包括每天口服组合物A(与母乳、配方奶或食物混合)一次，持续28天；或安慰剂，包括每天口服安慰剂(与母乳、配方物或食物混合)一次，持续28天。共招募20名符合条件的婴儿，按3:1(15:5)随机化。
在B部分中：如图32所示，将小于或等于7天大的新生儿随机化到：组合物A，包括每日口服组合物A(与母乳、配方物或食物混合)一次，持续336天；或安慰剂，包括每天口服安慰剂(与母乳、配方奶或食物混合)一次，持续336天的治疗。
招募符合条件的新生儿，按分娩方式(***或剖宫产)和按招募时的喂养方法(母乳喂养或非母乳喂养)进行分层的1:1(112:112)随机化。在怀孕期间或出生后的第一周内鉴定可能符合条件的新生儿。组合物A或安慰剂的施用在出生后7天内开始并持续一年，随后是一年的观察期(停止治疗)，随后从招募开始的第672天的10次随访(8次临床就诊和2次电话随访)期间进行测量。
与安慰剂相比，在新生儿和婴儿对象中测量组合物A中的免疫生物标志物、额外的粪便代谢特征和粪便微生物组分析。通过确定循环IgE(总的和特异性的)水平、免疫细胞计数、粪便微生物组组成、粪便和血浆代谢特征、粪便和血浆免疫刺激能力(体外分析)以及从基线到治疗结束的症状评分的变化(二级终点(secondary endpoint))来评估细菌组合物A的治疗功能。
认为一级终点是敏感的PD标记物，根据对活细菌治疗剂能潜在地改变过敏性疾病发展的作用的先前研究，该PD标记物可能与减少过敏性疾病的发展有关。
其他终点包括：在168天和672天时医生诊断的特应性皮炎的发病率；在第168天、第336天和第672天时医生诊断的食物过敏、慢性鼻炎/过敏性鼻炎、荨麻疹和喘息性疾病/哮喘的发病率(每个诊断均独立评估)；在168、336和672天时对食物和气源性过敏原过敏的发生率(如通过对蛋清、花生、牛奶、猫、屋尘螨、狗、链格孢属(Alternaria)(霉菌)和混合草花粉的血清过敏原特异性IgE测试评估的)；特应性皮炎的严重程度(如在第168、336和672天研究者全球评估(IGA)、评分特应性皮炎(SCORAD)和IGAxBSA评估的)；在第168天、第336天和第672天时喘息性疾病/哮喘的严重程度(如通过恶化史评估的)；在168、336和672天时开处方/用于过敏症状或诊断的伴随药物以及使用特应性皮炎和喘息/哮喘的急救药物的总血清IgE水平；在第168、336和672天时的外周嗜酸性粒细胞计数；药物遗传学样本(任选的)；粪便微生物组分析(微生物组成)；粪便和血浆代谢特征(仅限选定部位)；通过胶带评估的生物标记物和RNA测序分析；循环免疫细胞特征(仅限选定部位)；脐带血(生物标记物/免疫细胞分析)(任选的；仅限选定部位)；粪便和血浆免疫刺激能力(离体分析)(仅限选定部位)；破伤风/白喉疫苗滴度；在第168、336和672天时喘息性疾病/哮喘的严重程度(通过哮喘控制问卷(Asthma Control Questionnaire，ACQ)评估)。
作为一级研究终点，安全性评估在28天的治疗期和之后至多28天(第57天)的洗脱期间通过以下进行：(i)报告不良事件进行；(ii)报告伴随用药；(iii)进行身体检查和生命体征；(iv)实验室检查，包括血清化学、肝肾功能检查、血液学、全血细胞计数，有差异、以及尿液分析。在本研究的第三部分，不收集血液和尿液样本来进行安全评估。除需要血液和尿液取样的评估外，进行所有其他评估。
通过评估以下参数从基线到治疗结束的变化来进行二次研究评估：(i)粪便微生物组分析(细菌组成)；(ii)粪便和血浆代谢分析；(iii)粪便和血浆免疫刺激能力(体外分析)；(iv)总IgE和特异性IgE水平；(v)循环免疫细胞分析；(vi)问卷和不良反应(AE)以及日记中的药物使用报告。
本文表1中列出的菌株于2019年6月27日保藏在位于Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig的Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，符合国际承认用于专利程序的微生物保藏的《布达佩斯条约》的规定。菌株由DSMZ进行测试，并确定为具有活力。DSMZ为各菌株分配了以下DSMZ保藏登录号：DSM33213(嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213))、DSM 33179(长双歧杆菌(DSM 33179))、DSM 33180(DSM 33180)、DSM 33178(多形拟杆菌(DSM 33178))、DSM 33176(陪伴粪球菌(DSM33176))、DSM 33185(普氏栖粪杆菌(DSM 33185))、DSM 33191(普氏栖粪杆菌(DSM33191))、DSM 33186(普氏栖粪杆菌(DSM 33213))、DSM 33190(普氏栖粪杆菌(DSM33190))、DSM 33187(卷曲乳杆菌(DSM 33187))、DSM 22177(粪拟杆菌(DSM 22177))和DSM33188(毛螺菌科(DSM 33188))。
其他实施方式
1.一种药物组合物，其中所述药物组合物包含：细菌聚生体，其中所述细菌聚生体包含至少一种表1中所列的菌株；和至少一种抗氧化剂。
2.根据实施方案1所述的药物组合物，其中所述细菌聚生体包含至少两种表1中所列的菌株。
3.根据实施方案1所述的药物组合物，其中所述至少一种表1所列的菌株包括嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)或卷曲乳杆菌(DSM 33187)。
4.根据实施方案1所述的药物组合物，其中所述至少一种表1所列的菌株包括嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)。
5.根据实施方案1所述的药物组合物，其中所述至少一种表1所列的菌株中的每种菌株的存在量为约10^7CFU至约10^9CFU。
6.根据实施方案5所述的药物组合物，其中所述至少一种表1中所列的菌株的存在量为约5x10^8CFU。
7.根据实施方案1所述的药物组合物，其中所述至少一种表1中所列的菌株的总存在量为约10^7CFU至约10^10CFU。
8.根据实施方案7所述的药物组合物，其中所述至少一种表1中所列的菌株的存在量为约5x10^9CFU。
9.根据实施方案1所述的药物组合物，其中所述至少一种抗氧化剂为L-半胱氨酸。
10.根据实施方案9所述的药物组合物，其中所述L-半胱氨酸的存在量为约0.05％w/w至约0.5％w/w。
11.根据实施方案1所述的药物组合物，其还包含冷冻保护剂。
12.根据实施方案11所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂为甘油。
13.根据实施方案12所述的药物组合物，其中所述甘油的存在量为约10％v/v至约30％v/v。
14.根据实施方案1所述的药物组合物，其包含缓冲液。
15.根据实施方案14所述的药物组合物，其中所述缓冲液为PBS。
16.根据实施方案1所述的药物组合物，其中所述药物组合物配制成口服剂型。
17.根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述口服剂型为胶囊剂、片剂、乳剂、悬浮剂、糖浆剂、凝胶剂、口香糖、糊剂、凉茶、滴剂、溶解颗粒剂、粉剂、片剂、冻干剂、冰棒或冰淇淋。
18.根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述口服剂型为悬浮剂。
19.根据实施方案16所述的药物组合物，其中所述口服剂型为冰棒或冰淇淋。
20.一种药物组合物，其中所述药物组合物包含：细菌混合物，其中所述混合物包括：嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM33187)；L-半胱氨酸；以及冷冻保护剂。
21.根据实施方案20所述的药物组合物，其中所述细菌混合物的每种菌株的存在量为约5x10^8CFU。
22.根据实施方案20所述的药物组合物，其中所述L-半胱氨酸的存在量为约0.1％w/w。
23.根据实施方案20所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂为甘油。
24.根据实施方案23所述的药物组合物，其中所述甘油的存在量为约20％v/v。
25.根据实施方案22所述的药物组合物，其还包含缓冲液。
26.根据实施方案25所述的药物组合物，其中所述缓冲液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)并且pH为约7.4。
27.根据实施方案20所述的药物组合物，其中所述药物组合物的总体积为约1mL。
28.根据实施方案20所述的药物组合物，其中所述药物组合物配制成用于口服给药的悬浮剂。
29.一种容器，其包含根据实施方案1-28中任一项所述的药物组合物。
30.根据实施方案29所述的容器，其中所述容器为2mL聚丙烯螺旋盖小瓶。
31.根据实施方案29所述的容器，其中所述容器将所述药物组合物中至少95％的细菌细胞的活力保持约12周。
32.一种试剂盒，其包括根据实施方案29-31中任一项所述的容器。
33.根据实施方案32所述的试剂盒，其还包括指导人类使用者如何使用所述容器中的所述药物组合物的说明书。
34.一种制备根据实施方案1-28中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括培养所述药物组合物的至少两种菌株，其中在非动物培养基中进行培养；以及合并培养步骤的产物，从而形成细菌聚生体。
35.根据实施方案34所述的方法，其中所述非动物培养基为植物培养基。
36.根据实施方案35所述的方法，其中所述植物培养基包含植物蛋白胨、植物提取物、酵母提取物、N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)、苏氨酸，或其组合。
37.一种生产一批表1的菌株的细菌细胞的方法，所述方法包括在非动物培养基中培养细菌细胞。
38.根据实施方案37所述的方法，其中所述非动物培养基为植物培养基。
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述植物培养基包含植物蛋白胨、植物提取物、酵母提取物、N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)、苏氨酸，或其组合。
40.根据实施方案39所述的方法，其中表1的菌株为嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM33213)。
41.根据实施方案39所述的方法，其中表1的菌株为普氏栖粪杆菌(DSM 33185)。
42.根据实施方案39所述的方法，其中表1的菌株为卷曲乳杆菌(DSM 33187)。
43.一种制备包含细菌聚生体的药物组合物的方法，所述细菌聚生体包含表1的嗜黏蛋白阿克曼菌菌株，所述方法包括在改良的NAGT生长培养基中培养阿克曼菌属细胞以产生嗜黏蛋白阿克曼菌细胞批次。
44.根据实施方案43所述的方法，其中所述改良的NAGT生长培养基包含大豆蛋白胨、N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)或其组合。
45.根据实施方案43所述的方法，其中所述改良的NAGT生长培养基不包含镁、钙、或葡萄糖中的任意一种或多种。
46.根据实施方案43所述的方法，其中与未改良的NAGT生长培养基相比，所述改良的NAGT生长培养基使嗜黏蛋白阿克曼菌细胞的生长速率提高了30-50％。
47.根据实施方案46所述的方法，其中生长速率的提高是通过测量细胞培养50小时后生长培养基在600nm处的吸收差异来确定的。
48.根据实施方案43所述的方法，其中所述嗜黏蛋白阿克曼菌菌株为嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)。
49.根据实施方案43所述的方法，其中所述嗜黏蛋白阿克曼菌细胞批次包括约5x10^8CFU/mL。
50.一种制备包含细菌聚生体的药物组合物的方法，所述细菌聚生体包含栖粪杆菌属，所述方法包括在非动物培养基中培养栖粪杆菌属细胞以产生栖粪杆菌属细胞批次。
51.根据实施方案50所述的方法，其中所述非动物培养基为酵母基生长培养基。
52.根据实施方案51所述的方法，其中所述酵母基生长培养基包含YFAP维生素混合物。
53.根据实施方案51所述的方法，其中所述酵母基生长培养基包含乙酸钠、大豆蛋白胨、酵母提取物、半胱氨酸，或其组合。
54.根据实施方案51所述的方法，其中所述酵母基生长培养基包含乙酸钠、大豆蛋白胨、酵母提取物和半胱氨酸。
55.根据实施方案50所述的方法，其中所述栖粪杆菌属为普氏栖粪杆菌(DSM33185)。
56.根据实施方案50所述的方法，其中所述栖粪杆菌属细胞批次包括约5x10^8CFU/mL。
57.一种制备包含细菌聚生体的药物组合物的方法，所述细菌聚生体包括卷曲乳杆菌(DSM33187)，所述方法包括在酵母基生长培养基中培养卷曲乳杆菌(DSM33187)细胞以产生卷曲乳杆菌(DSM33187)细胞批次。
58.根据实施方案57所述的方法，其中所述乳杆菌属细胞批次包括5x10^8CFU/mL。
59.一种治疗对象疾病的方法，所述方法包括向对象施用实施方案1-27中任一项所述的药物组合物。
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述对象为人。
61.根据实施方案60所述的方法，其中所述人类对象为约18至约40岁。
62.根据实施方案60所述的方法，其中所述人类对象为婴儿或新生儿。
63.根据实施方案62所述的方法，其中所述婴儿为约0.5岁至约3岁。
64.根据实施方案62所述的方法，其中所述新生儿不超过6个月。
65.根据实施方案62所述的方法，其中所述新生儿不超过3个月。
66.根据实施方案57所述的方法，其中向对象口服施用所述药物组合物。
67.根据实施方案59所述的方法，其中所述细菌聚生体由嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)组成。
68.根据实施方案59所述的方法，其中所述疾病为炎性疾病。
69.根据实施方案59所述的方法，其中所述炎性疾病为过敏或皮炎。
70.根据实施方案69所述的方法，其中所述过敏为过敏性哮喘、过敏性小儿哮喘或食物过敏。
71.根据实施方案59所述的方法，其中所述疾病为代谢疾病。
72.根据实施方案71所述的方法，其中所述代谢疾病为肥胖、糖尿病或代谢综合征。
尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以例举的形式提供。本发明并不意在受说明书中提供的具体实施例的限制。尽管已经参照前述说明书描述了本发明，但是本文中实施方案的描述和说明并不意味着解释为限制意义。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员将想到许多变化、改变和替换。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应理解，在实施本发明时可以采用对本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明还应涵盖任意这种替代方案、修改、变化或等价物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
序列表
<110> 谢尔塔治疗公司
<120> 治疗性药物组合物
<130> 53206-707.601
<140>
<141>
<150> 62/911,873
<151> 2019-10-07
<160> 14
<170> PatentIn版本3.5
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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引物"
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<213> 人工序列
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引物"
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> /注释="人工序列的描述：合成的
引物"
<400> 14
gggctttctt caaacctggc 20

Claims (119)

1.一种药物组合物，其中所述药物组合物为固体剂型，并且包含：
i.纯化的细菌种群，所述细菌种群包含阿克曼菌属、栖粪杆菌属和乳杆菌属的至少一种菌株；和
ii.冷冻保护剂。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂包括碳水化合物和抗氧化剂。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述碳水化合物包括蔗糖、海藻糖或其组合。
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述抗氧化剂包括氨基酸。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述氨基酸包括L-谷氨酸、L-半胱氨酸或其组合。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述L-半胱氨酸的存在量按重量计为约0.05％至约1％。
7.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂按重量计包含约60％的蔗糖、约10％的海藻糖、约1％的L-半胱氨酸和约4％的L-谷氨酸。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物配制成悬浮剂。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物配制成口服剂型。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述口服剂型为胶囊剂、片剂、乳剂、悬浮剂、糖浆剂、凝胶剂、口香糖、糊剂、凉茶、滴剂、溶解颗粒剂、粉剂、片剂、冻干剂、冰棒或冰淇淋。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述细菌种群是冻干的。
12.一种药物组合物，其中所述药物组合物为液体剂型，并且包含：
i.纯化的细菌种群，所述细菌种群包含阿克曼菌属、栖粪杆菌属和乳杆菌属的至少一种菌株；和
ii.抗氧化剂。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，进一步包含冷冻保护剂。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂包括甘油。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中甘油的存在量按体积计为约10％至约30％。
16.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述抗氧化剂包括氨基酸。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述氨基酸包括L-半胱氨酸。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述L-半胱氨酸的存在量按重量计为约0.1％。
19.根据权利要求12所述的药物组合物，进一步包含缓冲液。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)并且pH为约7.4。
21.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述药物组合物的总体积为约1mL。
22.根据权利要求12所述的药物组合物，进一步包括容器。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述容器是2mL的聚丙烯螺旋盖小瓶。
24.一种药物组合物，包含：
i.纯化的细菌种群，所述细菌种群包含阿克曼菌属、乳杆菌属和栖粪杆菌属的至少一种菌株；和
ii.药学上可接受的赋形剂，
其中所述药物组合物包含在胶囊中，并且其中所述胶囊包含植物来源的材料。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述植物来源的材料包括基于纤维素的聚合物。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述基于纤维素的聚合物包括普鲁兰多糖。
27.根据权利要求24所述的药物组合物，其中由胶囊中的气体组成所测定，所述胶囊的透氧性为小于约0.5cm3/m2/天。
28.根据权利要求24所述的药物组合物，其中由37℃温度下用去离子水所测定，所述胶囊的崩解终点为约1.6分钟。
29.根据权利要求24所述的药物组合物，进一步包含冷冻保护剂。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述冷冻保护剂包括碳水化合物和抗氧化剂。
31.根据权利要求29或30所述的药物组合物，其中所述细菌种群是冻干的。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的药物组合物，其中阿克曼菌属、栖粪杆菌属和乳杆菌属的所述至少一种菌株选自表1中所列的菌株。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述细菌种群包含嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)或卷曲乳杆菌(DSM 33187)。
34.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述细菌种群包含细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)中的至少两种。
35.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述细菌种群包含细菌菌株嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)、普氏栖粪杆菌(DSM 33185)和卷曲乳杆菌(DSM 33187)。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物，其中每种细菌菌株的存在量为约10^3CFU至约10^12CFU。
37.根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物，其中每种细菌菌株的存在量为约10^7CFU至约10^10CFU。
38.根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物，其中每种细菌菌株的存在量为约5x10^8CFU。
39.根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物，其中所述细菌种群的总存在量为约10^3CFU至约10^12CFU。
40.根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物，其中所述细菌种群的总存在量为约10^7CFU至约10^10CFU。
41.根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物，其中所述细菌种群的总存在量为约1.5x10^9CFU。
42.一种治疗对象的疾病的方法，所述方法包括向对象施用权利要求1-41中任一项所述的药物组合物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述疾病为炎性疾病。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述炎性疾病为过敏或皮炎。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述过敏为过敏性哮喘、过敏性小儿哮喘或食物过敏。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述疾病为代谢疾病。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述代谢疾病为肥胖、糖尿病或代谢综合征。
48.一种降低对象过敏性病症发生率的方法，所述方法包括向对象口服施用药物组合物，所述药物组合物包含纯化的细菌种群，所述细菌种群包含阿克曼菌属、栖粪杆菌属和乳杆菌属的菌株，其中每天向所述对象施用所述药物组合物至少一次，持续至少7天。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述对象为等于或小于约7天龄的新生儿。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述对象为约28天至约12个月龄的婴儿。
51.根据权利要求48所述的方法，其中向所述对象施用所述药物组合物至少28天。
52.根据权利要求48所述的方法，其中向所述对象施用所述药物组合物至少336天。
53.根据权利要求48所述的方法，其中每天向所述对象施用所述药物组合物一次、两次、三次、四次、五次或六次。
54.根据权利要求48所述的方法，其中所述过敏性病症为特应性皮炎、食物过敏、过敏性鼻炎或过敏性哮喘。
55.根据权利要求48所述的方法，其中所述对象有具有过敏性病症史的生物学母亲、父亲或兄弟姐妹，其中所述过敏性病症为特应性皮炎、食物过敏、过敏性鼻炎或过敏性哮喘。
56.根据权利要求48所述的方法，其中所述对象的出生体重为约2.5kg至约4.5kg。
57.根据权利要求48-56中任一项所述的方法，其中每种细菌菌株的存在量为约10^3CFU至约10^12CFU。
58.根据权利要求48-56中任一项所述的方法，其中每种细菌菌株的存在量为约10^7CFU至约10^10CFU。
59.根据权利要求48-56中任一项所述的方法，其中每种细菌菌株的存在量为约5x10^8CFU。
60.根据权利要求48-56中任一项所述的方法，其中所述细菌种群的总存在量为约10^3CFU至约10^12CFU。
61.根据权利要求48-56中任一项所述的方法，其中所述细菌种群的总存在量为约10^7CFU至约10^10CFU。
62.根据权利要求48-56中任一项所述的方法，其中所述细菌种群的总存在量为约1.5x10^9CFU。
63.根据权利要求48所述的方法，其中等量施用所述阿克曼菌属、栖粪杆菌属和乳杆菌属。
64.根据权利要求48所述的方法，其中分别以5x10^8CFU施用所述阿克曼菌属、栖粪杆菌属和乳杆菌属。
65.根据权利要求48所述的方法，进一步包含基于碳水化合物的赋形剂。
66.根据权利要求48所述的方法，其中将所述药物组合物混入母乳、配方奶或食物中。
67.根据权利要求48所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含冷冻保护剂。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述冷冻保护剂包括甘油。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述甘油的存在量按体积计为约10％至约30％。
70.根据权利要求48所述的方法，进一步包含抗氧化剂。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述抗氧化剂包括氨基酸。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述氨基酸包括L-半胱氨酸。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述L-半胱氨酸的存在量按重量计为约0.1％。
74.根据权利要求48所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含缓冲液。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)并且pH为约7.4。
76.根据权利要求48所述的方法，其中所述药物组合物的总体积为约1mL。
77.根据权利要求48所述的方法，其中所述药物组合物包含在胶囊中。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述胶囊包含基于植物的材料。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述胶囊包含冷冻保护剂。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述冷冻保护剂包括碳水化合物和抗氧化剂。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述碳水化合物包括蔗糖、海藻糖或其组合。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述抗氧化剂包括氨基酸。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述氨基酸包括L-谷氨酸、L-半胱氨酸或其组合。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述L-半胱氨酸的存在量按重量计为约0.05％至约1％。
85.根据权利要求79所述的方法，其中所述冷冻保护剂按重量计包含约60％的蔗糖、约10％的海藻糖、约1％的L-半胱氨酸和约4％的L-谷氨酸。
86.根据权利要求79-85中任一项所述的方法，其中所述细菌种群是冻干的。
87.一种用于阿克曼菌属的大规模生长的方法，所述方法包括用渐增量的生长培养基进行多轮接种，其中每轮接种都包括至少约5％的前一轮接种的总批料。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述阿克曼菌属包括嗜黏蛋白阿克曼菌或Akkermansia glycaniphila。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述嗜黏蛋白阿克曼菌包括嗜黏蛋白阿克曼菌(DSM 33213)。
90.根据权利要求87所述的方法，其中所述生长培养基为约1L至约4,000L。
91.根据权利要求87所述的方法，进一步包括对约1L生长培养基进行初始轮接种。
92.根据权利要求87所述的方法，其中对体积为至少约3000L的生长培养基进行至少一轮接种。
93.根据权利要求92所述的方法，其中初始轮接种包括约2％的初始轮接种生长培养基的嗜黏蛋白阿克曼菌的冷冻原液。
94.根据权利要求91所述的方法，其中所述初始轮接种包括在厌氧条件下生长嗜黏蛋白阿克曼菌。
95.根据权利要求87所述的方法，进一步包括最后一轮接种，其中所述最后一轮接种包含以至少2.5的OD585的量存在的阿克曼菌属。
96.根据权利要求87所述的方法，进一步包括按体积计约10％的前一轮接种的总批料的最后一轮接种。
97.根据权利要求87-96中任一项所述的方法，进一步包括对所述生长培养基进行多轮灭菌和脱气，其中每一轮灭菌包括在121℃对生长培养基高压灭菌20分钟，并且其中每一轮脱气包括用N2H2CO2(90:5:5)对所述生长培养基进行脱气。
98.根据权利要求87-97中任一项所述的方法，进一步包括将批料冻干。
99.根据权利要求98所述的方法，进一步包括在所述冻干之前将所述批料离心。
100.根据权利要求98所述的方法，进一步包括在所述冻干后研磨所述批料。
101.根据权利要求87所述的方法，其中在每轮接种的生长期间，所述生长培养基的pH值小于约7。
102.根据权利要求87所述的方法，其中在每轮接种的生长期间，所述生长培养基的pH值小于约6.5。
103.一种用于栖粪杆菌属的大规模生长的方法，所述方法包括用渐增量的生长培养基进行多轮接种，其中在每轮接种的生长期间，所述生长培养基的pH值小于约6.5。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述栖粪杆菌属包括普氏栖粪杆菌。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述普氏栖粪杆菌包括普氏栖粪杆菌(DSM33185)。
106.根据权利要求103所述的方法，其中所述生长培养基为约1L至约4,000L。
107.根据权利要求103所述的方法，进一步包括对约1L生长培养基进行初始轮接种。
108.根据权利要求103所述的方法，其中至少一轮接种为至少约3000L的生长培养基。
109.根据权利要求107所述的方法，其中所述初始轮接种包括约0.4％的初始轮接种生长培养基的普氏栖粪杆菌的冷冻原液。
110.根据权利要求107所述的方法，其中所述初始轮接种包括在厌氧条件下生长普氏栖粪杆菌。
111.根据权利要求103所述的方法，进一步包括最后一轮接种，其中所述最后一轮接种包含以至少5的OD585的量存在的栖粪杆菌属。
112.根据权利要求103-111中任一项所述的方法，进一步包括对所述生长培养基进行多轮灭菌和脱气，其中每一轮灭菌包括在121℃对生长培养基高压灭菌20分钟，并且其中每一轮脱气包括用N2H2CO2(90:5:5)对所述生长培养基进行脱气。
113.根据权利要求103-112中任一项所述的方法，进一步包括将批料冻干。
114.根据权利要求113所述的方法，进一步包括在所述冻干之前将所述批料离心。
115.根据权利要求113所述的方法，进一步包括在所述冻干后研磨所述批料。
116.根据权利要求103所述的方法，其中在每轮接种的生长期间，所述生长培养基的pH值小于约6。
117.根据权利要求103所述的方法，其中在每轮接种的生长期间，所述生长培养基的pH值小于约5.5。
118.根据权利要求103所述的方法，其中在每轮接种的生长期间，所述生长培养基的pH值小于约5。
119.根据权利要求103所述的方法，其中每一轮接种包含至少约1％的前一轮接种的总批料。
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