KR20220103315A

KR20220103315A - 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20220103315A
Application number: KR1020210005762A
Authority: KR
Inventors: 박지수
Original assignee: (주)코코베리
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2022-07-22
Also published as: KR102468908B1

Abstract

본 발명은 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 수박의 줄기 및 잎 추출물에 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체의 복합균주로 발효되어 수득된 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 화장료 조성물은 천연 원료이며 세포 독성이 없어 피부에 안전한 뿐만 아니라, 천연 원료의 천연 발효를 통한 유효 성분의 극대화로 인한 항산화 또는 항염 효과가 우수한 장점이 있다.

Description

수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물{Cosmetic composition for Anti-oxidative or Anti-inflammatory comprising the Fermented extract Stems and Leaf of Watermelon}

본 발명은 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 체내 근육과 기관을 보호하고 외부로부터 침입하는 병원균으로부터 1차적으로 신체를 보호하는 기능을 가지고 있다. 그 외에도 체온 조절과 감각 기능, 단열 효과를 나타내나, 환경적 유전적으로 피부노화에 의해서 점점 얇아지고 쉽게 상처를 받도록 변하고, 자가치유력 및 탄력 감소, 항균기능 저하 등 본원의 기능들이 약해져 피부감염에도 취약해 진다. 이러한 피부 노화를 예방 또는 가꾸기 위한 방법으로 피부 기능을 회복 또는 관리해 줄 수 있는 항산화 효능 및 항염 효능, 주름개선 등의 효능이 있는 화장품 원료인 천연물, 식물추출물, 재생인자 등의 연구가 이루어져 화장품 원료 및 화장품 개발로 이루어지고 있다. 또한 화장품 원료의 천연 발효를 통한 유효 성분의 극대화 및 독성 성분은 제거되고, 기존 원료보다 항산화 성분 및 흡수력의 증가를 장점으로 들 수 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 항산화 또는 항염증 효과를 나타내면서 부작용이 적은 천연물을 찾고자 연구 노력한 결과, 수박 부산물인 수박 줄기와 잎의 추출물에 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체의 복합균주로 발효한 발효물에서 높은 항산화 또는 항염증 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 천연물인 수박 부산물로부터 인체에 무해하고 항산화 또는 항염증 효과가 있는 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물은 물 또는 C1 내지 C4의 저급 알코올에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 추출용매로 가하여 추출하여 수득 될 수 있다.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 추출용매는 80 내지 120℃의 열수 일 수 있다.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물은 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물을 복합 균주로 발효시켜 수득 될 수 있다.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 복합 균주는 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상 일 수 있다.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 발효는 수박의 줄기 및 잎 추출물에 상기 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체의 배양액을 상기 추출물에 접종하여 30 내지 37℃에서 140 내지 200rpm에서 24시간 내지 48시간 동안 수행되어 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물 또는 상기 추출물의 발효물은 상기 화장료 조성물의 총 중량에 대해서 0.01 내지 5 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 수분크림, 영양크림, 자외선 차단크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 마스크팩 및 바디클렌저로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명은 항산화 또는 항염증용 화장료용 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물의 제조방법으로서,

a) 세척한 수박 부산물을 동결 건조하여 분말화 하는 단계;

b) 상기 a)의 분말화된 상기 수박 부산물을 물 또는 C1 내지 C4의 저급 알코올에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 추출용매로 가하여 추출하는 단계; 및

c) 상기 b) 단계의 추출물을 복합 균주로 발효시키는 단계;

를 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료용 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 c) 단계의 발효는 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물에 상기 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체의 배양액을 상기 추출물에 접종하여 30 내지 37℃에서 140 내지 200rpm에서 24시간 내지 48시간 동안 수행되는 것 일 수 있다.

본 발명은 수박의 줄기 및 잎 추출물에 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체의 복합균주로 발효되어 수득된 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로 천연 발효를 통한 유효 성분의 극대화로 인해 항산화 또는 항염 효과가 우수한 장점이 있다. 또한 천연 원료이며 세포 독성이 없어 피부에 안전하다.

도 1은 실시예 1의 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물(PWM) 및 비교예 1의 수박의 줄기 및 잎 추출물(WM)의 시료를 DPPH radical scavenging로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1의 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물(PWM) 및 비교예 1의 수박의 줄기 및 잎 추출물(WM)의 시료를 ABTS radical scavenging로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1의 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물(PWM) 및 비교예 1의 수박의 줄기 및 잎 추출물의 시료(WM)를 DCFH-DA법을 이용한 Reactive oxygen species (ROS) 생성량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1의 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물(PWM) 및 비교예 1의 수박의 줄기 및 잎 추출물의 시료(WM)에 대한 Nitric oxide (NO) 생성량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1의 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물(PWM) 및 비교예 1의 수박의 줄기 및 잎 추출물(WM)의 시료에 대한 사이토카인 TNF- α생성량 측정 결과를 나타낸 것이다.

이하에서 본 발명에 대해 내용을 구체적으로 설명한다. 이하, 첨부된 도면들을 포함한 제조예, 실시예 또는 시험예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 제조예, 실시예 또는 시험예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다.

또한 달리 정의되지 않는 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

또한 명세서 및 첨부된 특허 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.

또한 본 발명에서 사용되는 용어의 단수 형태는 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명에서, '유효성분으로 포함하는'은, 화장료 조성물로써 항산화 또는 항염증에 따른 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 포함하는 것을 의미할 수도 있다.

또한 본 발명에서 ***는 그룹간의 비교를 one-way analysis of variance (ANOVA) 방법을 이용하고, student's t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였을 때, p<0.001, 신뢰도 99.9%로 유의적으로 효과가 있는 것을 의미한다. 또한 본 발명에서 **는 그룹간의 비교를 one-way analysis of variance(ANOVA) 방법을 이용하고, student's t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였을 때, p<0.01, 신뢰도 99%로 유의적으로 효과가 있는 것을 의미한다. 또한 본 발명에서 *는 그룹간의 비교를 one-way analysis of variance(ANOVA) 방법을 이용하고, student's t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였을 때, p<0.05, 신뢰도 95%로 유의적으로 효과가 있는 것을 의미한다.

또한 본 발명에서 특별한 언급 없이 불분명하게 사용된 %의 단위는 중량%를 의미한다.

본 발명은 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 수박(Watermelon,　Citrullus lanatus)은 박목과의 쌍떡잎 식물로 체내에 흡수가 잘되는 대표적인 여름과일이다. 수박에는 시트룰린(citrulline)이 함유되어 있어 이뇨작용이 있고, 칼륨의 함량이 높아 나트륨 배설에 효과적이라고 알려져 있다. 또한 여러 연구를 통해 수박 과육에서는 항균, 미백 및 항염 활성이 보고되어 있으며, 수박 외피에서는 미백, 항산화 활성 및 수박 씨에서는 항균, 미백, 항염 활성이 보고되어 있다. 또한 수박 부산물인 수박의 줄기와 잎은 알칼로이드(Alkaloids), 플라보노이드(flavonoid), 테르펜(Terpene), 스테로이드(steroid), 타닌(tannin), 사포닌(saponin) 및 페놀(phenol)의 성분과 항균 효과 밖에 보고되어 있지 않다.

상기 수박의 줄기 및 잎 추출물은 수박 열매 외의 수박 부산물인 수박의 줄기와 잎의 추출물을 의미하며, 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물을 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 상기 추출은 물 또는 C1 내지 C4의 저급 알코올에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 추출용매로 가하여 추출하여 수득 될 수 있으며, 바람직하게는 물을 추출용매로 가하여 추출하여 수득 될 수 있다.

상기 추출용매는 80 내지 120℃의 열수 일 수 있으나, 바람직하게는 80 내지 100℃ 의 열수 일 수 있다.

상기 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물은 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물을 복합 균주로 발효시켜 수득된 것을 의미한다. 상기 복합 균주는 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상 일 수 있다.

상기 유산균은 특별한 제한이 없이, 예를 들면, 락토바실러스 속 유산균(Lactobacillus sp.), 스트렙토코쿠스 속 유산균(Streptococcus sp.), 페디오코쿠스 속 유산균(Pediococcus sp.), 류코노스톡 속 유산균(Leuconostoc sp.) 및 비피도박테리움 속 유산균(Bifidobacterium sp.)이 모두 사용될 수 있다. 구체적으로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노우수스(Lactobacillus rhamnosus), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 세레비세(Pediococcus cerevisiae), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 레코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 레코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 비피도박테 리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum) 등이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 유산균이 상기 예시된 유산균에 한정되는 것은 아니며, 유산균 배양 배지 역시 각각의 유산균에 맞게 MRS(Man-RogosaSharpe), 락토오스, M17 및 APT 배지(Asparagine Enrichment Broth)로 부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 실시예에서는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 람노우수스(Lactobacillus rhamnosus)를 사용하였다.

상기 영지버섯균사체 배양액은 상기 영지버섯균사체를 25 내지 37℃에서 3 내지 10일간 배양하여 제조된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 상황버섯균사체 배양액는 상기 영지버섯균사체를 25 내지 37℃에서 3 내지 10일간 배양하여 제조된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 발효는 통상적인 방법으로 수행될 수 있으나, 상기 바람직하게는 수박의 줄기 및 잎 추출물에 상기 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체의 배양액을 상기 추출물에 접종하여 30 내지 37℃에서 140 내지 200rpm에서 24시간 내지 48시간 동안 수행되어 제조된 것일 수 있다.

상기 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물은 상기 화장료 조성물의 총 중량에 대해서 0.01 내지 5 중량%로 포함되는 것일 수 있으나 더욱 구체적으로는 0.3 내지 5 중량% 포함할 수 있으나, 제조되는 화장료 조성물의 제형 및 화장료 조성 물의 사용 목적 등에 따라 달라질 수 있다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 수분크림, 영양크림, 자외선 차단크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 마스크팩 및 바디클렌저로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

a) 세척한 수박 부산물을 동결 건조하여 분말화 하는 단계;

c) 상기 b) 단계의 추출물을 복합 균주로 발효시키는 단계;

상기 제조방법에 있어 상기 c) 단계의 발효는 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물에 상기 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체의 배양액을 상기 추출물에 접종하여 30 내지 37℃에서 140 내지 200rpm에서 24시간 내지 48시간 동안 수행되는 것 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제조방법에 있어서, 상기 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체의 배양액은 전체 부피에 대하여 각각의 배양액을 1.0~4.0(v/v)로 접종할 수 있으며, 바람직하게는 바람직하게는 2.0~4.0%(v/v)로 접종할 수 있다. 상기 접종범위 내에서는 발효가 더욱 잘 되어, 발효에 의한 상승효과가 우수할 수 있다.

상기 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물의 제조방법으로 제조된 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물은 피부의 항산화 또는 항염증용 효과가 우수한 장점이 있다.

이하, 본 발명을 제조예, 실시예 및 시험예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않으며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.

제조예 1: 유산균 배양액 제조

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 람노우수스(Lactobacillus rhamnosus)를 멸균된 250 ml의 삼각플라스크에 100 ml의 멸균된 MRS 배지 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 혐기성 조건에서 진탕 배양하였다.

제조예 2: 영지버섯 균사체 배양액 제조

영지버섯 균사체를 Potato Dextrose Agar(PDA, DIFCO, USA) 평판배지에 계대 배양하여 사용하였다. 그 다음 상기 균사체를 PDA 배지에서 30℃정도의 온도에서 10일간 배양하였다. 얻어진 상기 영지버섯 균사체를 접종용 칼로 잘라 250 ml의 멸균된 삼각플라스크에 100 ml 의 멸균된 Potato Dextrose Broth (PDB, DIFCO, USA) 배지에 접종하여 28℃에서 7일간 140 rpm으로 5일간 진탕배양 하였다.

제조예 3: 상황버섯 균사체 배양액 제조

상황버섯 균사체를 Potato Dextrose Agar(PDA, DIFCO, USA) 평판배지에 계대 배양하여 사용하였다. 그 다음 상기 균사체를 PDA 배지에서 30℃정도의 온도에서 10일간 배양하였다. 얻어진 상기 상황버섯 균사체를 접종용 칼로 잘라 250 ml의 멸균된 삼각플라스크에 100 ml 의 멸균된 Potato Dextrose Broth (PDB, DIFCO, USA) 배지에 접종하여 28℃에서 7일간 140 rpm으로 5일간 진탕 배양 하였다.

실시예 1: 수박 줄기 및 잎 추출물의 발효물(PWM)

수박 부산물인 수박 줄기와 잎을 세척 한 후 멸균 하였다. 그 다음 동결건조 한 후 분말하여 50g을 500ml의 물을 가하여 90℃에서 6시간 열수 추출하였다. 그 다음 여과하여 수박의 줄기 및 잎 열수 추출물을 수득하였다. 그 다음, 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물을 상기 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체의 배양액은 전체 부피에 대하여 각각의 배양액을 3.0%(v/v)로 상기 추출물에 접종 하고 30℃에서 24시간 동안 200rpm에서 진탕 배양함으로써 발효하였다. 발효가 완료되면, 85 ℃에서 1시간 동안 가열하여 반응을 종료시켰다. 수득된 반응용액을 여과하여 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물을 수득하였다.

비교예 1 : 수박 줄기 및 잎 추출물(WM)

수박 부산물인 수박 줄기와 잎을 세척 한 후 멸균 하였다. 그 다음 동결건조 한 후 분말하여 50g을 500ml의 물을 가하여 90℃에서 6시간 열수 추출하였다. 그 다음 여과하여 수박의 줄기 및 잎 열수 추출물을 수득하였다.

시험예 1: 세포 독성 측정

동결된 RAW 264.7 세포를 50 ㎖ 튜브에 옮기고 PBS 9㎖을 넣어 세포를 부유시킨 뒤 1,200 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거하였다. 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)와 1% penicillin/streptomycin으로 조성된 DMEM 배지 1 ㎖을 넣어 부유시켜 세포 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 계대배양 횟수는 5회 이상으로 하였고, 시료들을 처리하기 전에 24시간을 적응시켰다.

실험이 가능한 농도 선택을 위해 세포 독성 측정을 다음과 같이 진행하였다. RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1.5×10⁵ cells/well로 분주하여 세포 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, 실시예1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료를 각각 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 WST solution을 첨가하여 세포 배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450㎚에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다. 또한 상기 대조군은 세포 배양액만 처리한 시험군이다.

RAW 264.7 세포를 통해 실시예 1의 PWM 및 비교예 1의 WM을 세포 독성을 측정한 결과 하기 표 1과 같이 각 농도에서 세포 생존율이 100% 이상으로 확인되어, 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

세포생존율 (단위: %)

	무처리(대조군)	50 ug/ml	100 ug/ml	200 ug/ml	400 ug/ml
대조군	100±9.8
비교예 1(WM)		100.0±11.9	107.0±2.8	106.0±2.2	94.9±5.2
실시예 1(PWM)		101.2±2.3	106.5±6.9	106.9±2.0	96.2±1.5

시험예 2 : 항산화 효능 측정

시험예 2-1 : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging 측정

실시예1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료를 25, 50, 100, 200 (㎍/㎖)의 농도로 될 수 있게 희석한 용액 100 ㎕와 에탄올에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH 용액 150 ㎕를 혼합하여 세포 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 30분간 반응시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군에 증류수를 넣었고 DPPH 용액의 대조군으로써는 에탄올을 넣어 보정값을 얻은 후 DPPH 자유라디칼 소거율(%)을 ((대조군의 흡광도-시료 첨가군의 흡광도)/대조군의 흡광도)x100 식에 따라 계산하여 백분율로 나타내었다. 실시예1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료를 DPPH radical scavenging로 측정한 결과는 표 2 및 도 1과 같다. 실시예1의 PWM 시료 시험군에서 농도 의존적으로 효능이 증가하였다. 또한 DPPH radical scavenging로 측정한 결과에 있어서, 비교예 1의 WM 시료 시험군의 IC50(Half maximal inhibitory concentration)이 101.12ug/ml인 반면, 실시예 1의 PWM 시료 시험군의 IC50이 45.41ug/ml로 확인되어 실시예 1의 PWM 시료의 시험군의 항산화 효과가 비교예 1의 WM 시료 시험군 보다 2배 이상 더 우수함을 확인하였다.

DPPH radical scavenging 측정 결과 단위 (%)

	25 ug/ml	50 ug/ml	100 ug/ml	200 ug/ml
비교예 1(WM)	10.1±5.2	16.2±8.0	69.1±7.1	82.5±6.3
실시예 1(PWM)	19.0±1.1	62.5±3.0	84.6±7.1	88.1±1.5

시험예 2-2 : 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) radical scavenging 측정

실시예 1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료를 25, 50, 100, 200 (㎍/㎖)의 농도로 될 수 있게 희석한 용액 5㎕와 7.4mM ABTS(2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))와 2.6 mM potassium persulphate를 제조한 후, 암소에 하루 동안 방치하여 양이온(ABTS+)을 형성시킨 다음 732 ㎚에서 흡광도를 측정하여 흡광도 값이 1.5 이하가 나오도록 희석한 ABTS+ 용액 95 ㎕를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후, 732 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군에 증류수를 넣었으며, 대조군에 대한 ABTS 라디칼 소거율(%)을 ((대조군의 흡광도-시료 첨가군의 흡광도)/ 대조군의 흡광도))x100 의 식에 따라 계산하여 백분율로 나타내었다.

실시예 1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료를 ABTS radical scavenging로 측정한 결과는 하기 표 3 및 도 2와 같다. 실시예 1의 PWM의 시료에서 농도 의존적으로 효능이 증가하였다.

	25 ug/ml	50 ug/ml	100 ug/ml	200 ug/ml
비교예 1(WM)	10.50±0.1	19.80±0.4	24.20±0.2	46.10±3.2
실시예 1(PWM)	8.40±0.4	25.80±3.6	40.10±0.2	46.30±2.7

시험예 2-3 : DCFH-DA법을 이용한 Reactive oxygen species (ROS) 생성량 측정

RAW 264.7 세포를 12 well plate에 2×10⁵ cells/well로 분주하여 세포 배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였으며, WM와 PWM 시료는 50, 100, 200(㎍/㎖)의 농도에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, 1,200rpm에서 5분간 원심 분리하여 모은 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고 DCFH-DA를 20 μM이 되도록 첨가하여 15분 동안 세포 배양기에서 염색시켰다. 염색 후 차가운 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심분리 한 다음 상청액을 제거하고 다시 PBS 400㎕를 부유시켜 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 측정하여 대조군에 대한 ROS 생성량을 백분율로 나타내었다.

RAW 264.7 세포를 통해 실시예1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료를 ROS 생성량을 측정한 결과는 하기 표 4와 도3과 같다. 하기 표 4와 도 3에서 정상군은 세포에 세포 배양액만 처리한 군이며, 대조군은 LPS를 1 ㎍/㎖만 처리한 시험군이다. 하기 표 4와 도 3와 같이 실시예1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료의 시험군은 농도 의존적으로 유의성 있는 감소를 나타내었다. 또한 실시예1의 PWM 시료의 시험군에서 대조군 및 비교예 1의 WM 시료 시험군 보다 ROS 생성량이 100ug/ml 및 200ug/ml에서 신뢰도 95% 또는 신뢰도 99%로 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다.

ROS 생성량 측정 결과 (단위 %)

	정상군(Normal)	대조군(Control)	50 ug/ml	100 ug/ml	200 ug/ml
	26.40±0.8	100.00±1.0
비교예 1(WM)			96.30±0.7	88.50±1.4*	85.90±0.9*
실시예 1(PWM)			86.40±0.6*	83.60±0.7*	78.70±0.7**

시험예 3 : 항염증 효능 측정

시험예 3-1: Nitric oxide (NO) 생성량 측정

RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1.5×10⁵ cells/well로 분주하여 세포 배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하고 실시예 1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료를 항산화 효능 측정에서 효과가 좋았던 100 및 200 (㎍/㎖)의 농도에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, Nitric oxide assay kit에 구성된 N1 buffer 및 N2 buffer를 10분 단위로 순차적으로 50㎕씩 첨가하고 10분간 반응시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 생성량을 백분율로 표시하였다.

RAW 264.7 세포를 통해 실시예1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료의 NO 생성량을 측정한 결과는 하기 표 5 및 도4와 같다. 하기 표 5 및 도 4에서, 정상군은 세포에 세포 배양액만 처리한 군이며, 대조군은 LPS를 1 ㎍/㎖만 처리한 시험군이다. 실시예1의 PWM 시료의 시험군에서 농도 의존적으로 유의성 있는 감소를 나타내었다. 또한 실시예1의 PWM 시료의 시험군에서 대조군 및 비교예 1의 WM 시료 시험군 보다 NO 생성량이 100ug/ml 및 200ug/ml에서 신뢰도 95% 또는 신뢰도 99%로 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다. 또한 실시예 1의 PWM 시료의 시험군은 대조군 대비하여 100ug/ml에서는 1.4배 감소, 200ug/ml에서는 1.6배 감소 양상이 나타났다.

NO 생성량 측정 결과 (단위 %)

	정상군(Normal)	대조군(Control)	100 ug/ml	200 ug/ml
	13.2±7.1	100.0±2.1
비교예 1(WM)			79.70±3.9*	64.50±1.3**
실시예 1(PWM)			69.20±3.0**	60.40±2.8**

시험예 3-2: RAW 264.7 세포를 이용한 Cytokine (IL-1β, TNF-α) 생성량 측정

RAW 264.7 세포를 12 well plate에 2×10⁵ cells/well로 분주하여 세포 배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하고 실시예 1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료를 25, 50, 100, 200 (㎍/㎖)의 농도에 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 다시 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 세포를 trypsin/EDTA로 분리 및 원심 분리하여 상층액을 획득하여 Milliplex map mouse cytokine/chemokine magnetic bead panel-immunology multiplex assay kit에 구성된 물품을 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 96 well plate에 상층액 25 ㎕씩 분주하고 assay buffer 및 matrix buffer, antibody-immobilized beads를 각 25 ㎕씩 가하여 혼합한 후 2시간 동안 실온에서 반응시키고 washing 완충 용액을 이용하여 2회 세척하였다. 이를 다시 25 ㎕의 detection antibody을 가하여 1시간 동안 실온에서 암소 반응시키고 추가로 25 ㎕의 Streptavidin-Phycoerythrin을 가하여 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 washing 완충 용액을 이용하여 2회 세척하였다. 세척 후 PBS를 150 ㎕ 넣고 5분 간 shaking한 후 Luminex를 이용하여 측정하였다.

RAW 264.7 세포를 통해 실시예1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료의 IL-1β 생성량을 측정한 결과는 하기 표 6과 같다. IL-1β 생성량은 하기 표 6에서 정상군은 세포에 세포 배양액만 처리한 군이며, 대조군은 LPS를 1 ㎍/㎖만 처리한 시험군이다. 하기 표 6 과 같이 대조군과 대비하여 유의성 있는 생성량 감소가 확인되었다.

사이토카인 IL-1β 측정 결과(단위: pg/ml)

	정상군 (Normal)	대조군 (Control)	50 ug/ml	100 ug/ml	200 ug/ml
	0.85±0.0	4916.2±25.2
비교예 1(WM)			5203.1±139.5	4576.6±278.5	2970.4±57.1***
실시예 1(PWM)			5043.1±74.8	4767.5±100.5	2910.44±3.5***

RAW 264.7 세포를 통해 실시예1의 PWM 및 비교예 1의 WM 시료의 TNF-α 생성량을 측정한 결과는 하기 표 7 및 도 4와 같다. 실시예 1의 PWM 시료의 시험군의 모든 농도에서 신뢰도 95% 또는 신뢰도 99%로 유의성 있는 생성량 감소가 확인되었다. 또한 LPS만 처리한 대조군 및 비교예 1의 WM 시험군보다 TNF-α 생성량이 훨씬 더 감소하는 것이 확인되었다. 실시예 1의 PWM 시료의 시험군은 대조군 대비하여 TNF-α 생성량이 100ug/ml에서는 1.4배 감소, 200ug/ml에서는 1.6배 감소하는 것이 확인되었다.

사이토카인 TNF-α 생성량 측정 결과(단위: pg/ml)

	정상(Normal)	대조군(Control)	50 ug/ml	100 ug/ml	200 ug/ml
	1305.08	2272.5250
비교예 1(WM)			1961.7±107.7*	2021.4±22.1*	1931.0±266.6
실시예 1(PWM)			1903.5±79.4*	1942.7±92.8*	1699.9±28.0**

Claims

수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 수박의 줄기 및 잎 추출물은 물 또는 C1 내지 C4의 저급 알코올에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 추출용매로 가하여 추출하여 수득된 것인 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 추출용매는 80 내지 120℃의 열수인 것인 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물은 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물을 복합 균주로 발효시켜 수득된 것인, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 복합 균주는 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 발효는 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물에 상기 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체의 배양액을 상기 추출물에 접종하여 30 내지 37℃에서 140 내지 200rpm에서 24시간 내지 48시간 동안 수행되어 제조된 것인 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물은 상기 화장료 조성물의 총 중량에 대해서 0.01 내지 5 중량%로 포함되는 것인 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 수분크림, 영양크림, 자외선 차단크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 마스크팩 및 바디클렌저로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형인, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물.
항산화 또는 항염증용 화장료용 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물의 제조방법으로서,
a) 세척한 수박 부산물을 동결 건조하여 분말화 하는 단계;
b) 상기 a)의 분말화된 상기 수박 부산물을 물 또는 C1 내지 C4의 저급 알코올에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물을 추출용매로 가하여 추출하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 추출물을 복합 균주로 발효시키는 단계;
를 포함하는 항산화 또는 항염증용 화장료용 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 c) 단계의 발효는 상기 수박의 줄기 및 잎 추출물에 상기 유산균, 영지버섯균사체 및 상황버섯균사체의 배양액을 상기 추출물에 접종하여 30 내지 37℃에서 140 내지 200rpm에서 24시간 내지 48시간 동안 수행되는 것인 항산화 또는 항염증용 화장료용 수박의 줄기 및 잎 추출물의 발효물의 제조방법.