KR20220079572A - 치료 단백질 조성물 및 방법(therapeutic protein compositions and methods) - Google Patents

Abstract

본 발명의 조성물은 변성된 형태의 치료 단백질에 의한 오염이 2% 미만인 치료 단백질을 제공한다. 그러한 조성물은 통상적인 단리 방법으로 생성된 상응하는 치료 단백질 제제보다 보관 시에 및/또는 혈청에서 향상된 비활성 및 개선된 안정성을 제공한다.

Description

치료 단백질 조성물 및 방법(THERAPEUTIC PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS)

본 출원은 2019년 9월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 62/903,659의 이익을 주장한다. 이들 및 모든 다른 참조된 외부 자료는 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다. 참고로 포함된 참고 문헌 내의 용어의 정의 또는 사용이 본 명세서에 제공된 그 용어의 정의와 일치하지 않거나 모순되는 경우, 본 명세서에 제공된 그 용어의 정의가 우선하는 것으로 간주된다.

본 발명의 분야는 치료 단백질, 구체적으로는 혈액 또는 혈액 생성물로부터 단리된 치료 단백질이다.

배경 설명은 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본 명세서에 제공된 임의의 정보가 현재 청구된 발명의 선행 기술이거나 그와 관련이 있거나, 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 임의의 간행물이 선행 기술임을 인정하는 것이 아니다.

다양한 단백질이 현재 치료 적용을 위해 인간 혈액 생성물로부터 단리된다. 그러한 단백질의 예에는 알부민, 면역글로불린, 알파-1 항트립신, 및 다양한 응고 인자가 포함된다. 그러한 치료 단백질은 종종 다량 및 고농도로 사용된다. 알부민은 수술, 외상, 및 화상 환자의 혈액량을 회복시키기 위해 고농도(최대 25 중량%)로 사용된다. 면역글로불린 제제(preparation)(전형적으로 약 10 중량%의 IgG를 함유함)는 광범위한 질병 및 질환을 치료하기 위해 면역조절제로 사용되며, 약화된 면역 반응에 대한 지원을 제공하는 것 외에도 보체 활성을 조절하고, 특발성 항체를 억제하고, 대식세포 Fc 수용체를 포화시키고, 다양한 염증 매개 물질을 억제함으로써 작용할 수 있다. (체중 kg당 약 60 mg의) 알파-1 항트립신의 매주 주입은 알파-1 항트립신 결핍과 관련된 유전 질환을 치료하거나 이의 진행을 늦추기 위해 사용된다. 응고 인자(예컨대 인자 VIII, 인자 IX, 폰 빌레브란트 인자, 및 응고 캐스케이드의 기타 구성요소)는 혈우병을 치료하는 데 사용되며, 간단한 주사로 치료가 가능하도록 농축된 형태로 제공된다.

요구되는 양으로 인해, 그러한 치료 단백질은 확장 가능한 공정, 전형적으로 침전, 여과, 재가용화, 및 크로마토그래피 매질을 사용한 처리를 포함할 수 있는 일련의 단계를 이용하여 혈액 생성물(예컨대 혈장)로부터 단리된다. 요구되는 높은 순도는 일반적으로 다수의 분리 단계의 사용을 필요로 한다. 전형적으로, 혈청의 콘(Cohn) 분획화가 이용되며, 이는 알코올의 단계적 첨가로 인한 일련의 침전 단계를 수반한다. 그러나, 그러한 광범위한 처리는 정제된 분획에서 변성된 형태의 치료 단백질의 축적을 가져올 수 있다. 그러한 변성은 투여 시의 부작용, 활성 감소, 보관 시의 반감기 감소(특히 액체 제형의 경우), 및/또는 투여 후의 혈청 반감기 감소를 유발할 수 있다.

따라서, 최소한의 오염을 가지며 변성된 단백질 함량이 거의 없거나 전혀 없는 치료 단백질 제제가 여전히 필요하다.

본 발명은 낮은 함량의 변성된 치료 단백질 및/또는 기타 오염물질을 갖도록 처리된 치료 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 통상적인 공정에 의해 생성된 상응하는 치료 단백질 제제에 비해 높은 비활성 및/또는 안정성을 제공한다.

본 발명의 조성물은 혈액 생성물(예컨대 변형된 크리오-푸어(cryo-poor) 혈장)으로부터 단리된 치료 단백질을 포함하며, 여기서 치료 단백질은 천연 형태 및 변성된 형태로 존재하고, 변성된 형태는 치료 단백질의 총량 또는 치료 단백질의 천연 형태의 약 0.01% 내지 약 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%를 제공한다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 단리 동안 침전제에 노출된다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 알파-1 항트립신이고, 조성물은 N-벤조일-L-아르기닌-파라-니트로아닐리드 염산염(L-BAPNA)을 기질로 사용하여 활성-부위 적정된 돼지 췌장 트립신으로 시험할 때 90% 넘게 억제성이다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 면역글로불린의 단백질이고, 콘 분획화를 이용하여 제조된 면역글로불린 분획보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 더 긴 투여 후 생체내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 적어도 4%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%의 농도에서 무색인 알부민이다.

본 발명의 다른 구현예는, 침전제의 존재 하에 약 1℃ 내지 약 6℃의 온도에서 동결된 혈장을 해동하여 변형된 동결침전물(cryoprecipitate) 및 변형된 크리오-푸어 혈장을 생성하고, 변형된 동결침전물을 변형된 크리오-푸어 혈장과 분리하고, 변형된 크리오-푸어 혈장을 중간 침전 또는 현저한 희석(significant dilution) 단계 없이 크로마토그래피 매질에 적용하여 결합되지 않은 분획 및 결합된 분획을 생성하고, 결합되지 않은 분획 또는 결합된 분획으로부터 약 0.01% 내지 약 5%의 변성된 치료 단백질만을 갖는 치료 단백질을 회수함으로써 상기 기재된 바와 같은 치료 단백질 조성물을 제조하는 방법이다. 적합한 침전제는 유기산, 유기산의 염(예컨대 시트르산나트륨), 무기 염, 및 친수성 중합체를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예는, 혈액 생성물에 비휘발성 침전제를 첨가하여 침전물의 형성을 일으키지 않는 침전제 농도를 제공함으로써 중간 용액을 형성하는 단계, 침전제의 목표 침전 농도에 도달할 때까지 침전제를 보유하면서 중간 용액으로부터 물을 제거하여 침전물 및 상청액을 생성하는 단계, 침전물을 상청액과 분리하는 단계, 및 상청액 또는 침전물로부터 약 0.01% 내지 약 1%의 변성된 치료 단백질을 포함하는 치료 단백질을 회수하는 단계에 의해 상기 기재된 바와 같은 치료 단백질 조성물을 제조하는 방법이다. 적합한 침전제는 유기산, 유기산의 염(예컨대 시트르산나트륨), 무기 염, 및 친수성 중합체를 포함한다. 물은 (예를 들어, 감압 하에서의) 증발 또는 한외여과로 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 상청액으로부터 회수된다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 침전물로부터 회수된다.

본 발명의 다양한 목적, 특징, 양태 및 이점은 유사한 번호가 유사한 구성 요소를 나타내는 첨부 도면과 함께 바람직한 구현예의 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

다음 설명은 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본 명세서에 제공된 임의의 정보가 현재 청구된 발명의 선행 기술이거나 그와 관련이 있거나, 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 임의의 간행물이 선행 기술임을 인정하는 것이 아니다.

일부 구현예에서, 본 발명의 특정 구현예를 기술하고 청구하는 데 사용된 성분의 양, 특성, 예컨대 농도, 반응 조건 등을 표현하는 수치는 일부 경우에 용어 "약"의 수식을 받는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 파라미터는 특정 구현예에 의해 얻고자 하는 요망되는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 일부 구현예들에서, 수치 파라미터는 보고된 유효 자릿수의 개수를 고려하여 그리고 일반적인 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다. 본 발명의 일부 구현예의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위 및 파라미터는 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에서 제시된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 본 발명의 일부 구현예에 제시된 수치 값은 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 불가피하게 발생하는 특정 오차를 포함할 수 있다.

본 명세서의 설명에 그리고 하기 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 단수 형태의 의미는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 또한, 본 명세서의 설명에 사용되는 바와 같이, "에서(in)"의 의미는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 "에서(in)" 및 "상에서(on)"를 포함한다.

본 명세서에서 값의 범위에 관한 언급은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서 역할을 하도록 의도된다. 본 명세서에 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 그것이 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본 명세서에 설명된 모든 방법은 본 명세서에 달리 지시되지 않거나 문맥상 달리 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서의 특정 구현예와 관련하여 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 표현(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 본 명세서의 어떤 표현도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 명세서에 개시된 발명의 대안적인 요소들 또는 구현예들의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 아니된다. 각 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본 명세서에서 발견되는 다른 요소와의 임의의 조합으로 지칭되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의 및/또는 특허성을 이유로 그룹에 포함되거나 그룹으로부터 삭제될 수 있다. 임의의 그러한 포함 또는 삭제가 일어나는 경우, 본 명세서는 그에 따라 수정된 바와 같은 그룹을 포함하는 것으로 본원에서 간주되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹의 상세한 설명을 충족한다.

본 발명의 구현예는 변성된 치료 단백질 및 기타 오염물질의 함량이 낮은 치료 단백질 조성물을 제공한다. 생성된 조성물은 (예를 들어, 정제 기법에 적용되기 전에) 생체내에서의 상태와 더 유사한 상태의 치료 단백질을 제공한다. 그러한 치료 단백질 제제는 종래의 방법으로 생성된 상응하는 제제와 비교할 때 더 높은 비활성, 길어진 안정성, 및/또는 투여 후의 연장된 생체내 반감기를 나타낸다.

이는 단백질 변성을 철저히 피하는 제조 방법을 이용하여 적어도 부분적으로 달성된다. 그러한 방법은, 예를 들어, 변성 유기 용매(예를 들어, 알코올, 케톤 등)의 사용을 제거하고/제거하거나, 침전제의 국소 농도를 최소화하는 공정 단계를 이용하고/이용하거나, 포움(foam) 또는 프로쓰(froth)의 생성을 피하기 위해 주의 깊은 혼합을 사용하고/사용하거나, 변성 침전제(예컨대 유기 용매)의 사용을 피하거나 최소화할 수 있다. 유사하게, 그러한 공정 단계는 극단의 pH를 피하고/피하거나(예를 들어, 약 6.5 내지 약 8.5의 pH, 또는 약 6.8 내지 약 7.5의 pH를 유지함) 극단의 온도를 피할 수 있다(예를 들어, 처리 전반에 걸쳐 약 4℃ 내지 8℃의 온도 또는 18℃ 내지 25℃의 온도를 유지함). 그러한 방법의 비배타적인 예가 아래에 제공된다.

대부분의 혈액 생성물에 대한 원천 물질은 상업적 수집 센터에서 얻은 동결된 혈장이다. 이 물질을 저온(전형적으로 1 내지 6℃)에서 천천히 해동하면 침전된 단백질(즉, 동결침전물 또는 "크리오(cryo)")과 단백질-풍부 상청액(크리오-푸어 혈장)을 함유하는 중간 혈액 생성물이 생성된다. 동결침전물은 원천 혈장의 피브리노겐 함량의 일부뿐만 아니라 응고 인자 및 피브린을 포함한다. 크리오-푸어 혈장은 저온-가용성(cold-soluble) 단백질이 풍부하여 약학용 단백질의 원천으로 자주 사용된다.

크리오-푸어 혈장은 중간 희석 또는 처리 단계 없이 통상적인 크로마토그래피 분리에 직접 적용하기에 부적합하게 만드는 단백질 함량 및/또는 변성된 단백질 함량을 가질 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은 해동 공정에서의 낮은 농도(즉, 혈청 및/또는 혈장에 적용될 때 관찰 가능한 침전을 일으키지 않는 농도)의 침전제의 포함이 생성된 제제에서 저온-가용성 분획과 저온-비가용성 분획 사이의 단백질 분포를 변경시킬 수 있음을 발견하였다. 생성된 변형된 크리오-푸어 혈장은 중간 희석 및/또는 침전 단계 없이 크로마토그래피 매질(예를 들어, 크기 배제 매질, 이온 교환 매질, 소수성 상호작용 매질, 친화성 매질, 혼합-모드 크로마토그래피 매질 등)로의 직접 적용을 가능하게 하는 단백질 함량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이는 유리하게는 각각이 원치 않는 변성 기회를 제공하는 공정 단계를 최소화한다. 그러한 크로마토그래피 단계는 단백질 변성 가능성을 줄이기 위해 초기 해동 단계에서 사용된 것과 유사하거나 동일한 저온(예를 들어, 4℃ 내지 8℃)을 유지하면서 수행될 수 있다. 유사하게, pH는 변성을 최소화하기 위해 이들 단계 동안 제한된 범위(예를 들어, pH 6 내지 pH 8, pH 6.5 내지 7.8, pH 6.8 내지 7.2) 내에서 일정하게 유지되거나 제어될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 크로마토그래피 매질은 친화성 매질이다. 이는 유리하게는 혈장 처리 시간에 요구되는 시간과 재료를 단순화하고 감소시킨다. 또한, 처리 단계의 수의 감소는 민감한 단백질 종이 변성되는 정도를 줄여서, 보관 시의 개선된 안정성, 투여 후의 개선된 생체내 반감기, 및/또는 개선된 비활성을 가져올 수 있다.

본 발명은 또한 비휘발성 침전제(예를 들어, 황산염, 인산염, 유기산의 염, 및/또는 가용성 중합체)가 하나 이상의 표적 단백질 및 하나 이상의 오염 단백질을 함유하는 혈액 생성물에 도입된 조성물 및 그렇게 하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 침전제는 가시적 침전물의 형성을 일으키지 않는 양 또는 농도로 제공된다. 이어서, 생성된 반응 혼합물로부터 물이 제거되어 단백질과 침전제 둘 모두의 농도를 동시에 증가시킨다. 단백질 농도와 침전제 농도가 원하는 목표 값에 도달한 경우, 단백질 침전물이 형성되고, 후속하여 상청액 분획과 분리된다. 침전제와의 혼합, 및 침전물과 상청액 분획의 분리는 변성을 줄이기 위해 일정한 온도에서 또는 제한된 온도 범위(예를 들어, 15℃ 내지 25℃, 18℃ 내지 22℃) 내에서 수행될 수 있다. 유사하게, pH는 변성을 최소화하기 위해 이들 단계 동안 제한된 범위(예를 들어, pH 6 내지 pH 8, pH 6.5 내지 7.8, pH 6.8 내지 7.2) 내에서 일정하게 유지되거나 제어될 수 있다.

표적 단백질 및 침전제의 특성에 따라, 표적 단백질은 침전물 또는 상청액 분획에 존재할 수 있다. 이 공정 동안 침전제 농도가 증가함에 따라 단백질 농도가 증가하기 때문에, 침전물과 상청액 분획 사이의 단백질 분포는 침전제 농도가 증가함에 따라 단백질 농도가 감소하거나 기껏해야 유지되는 통상적인 침전 공정에서 생성된 것과 상이하며 그와 구별된다. 일부 구현예에서, 그러한 침전 공정으로부터 얻은 상청액이 추가의 용매(즉, 물) 제거에 적용되어, 단백질 및 침전제 농도를 추가로 증가시키고 제2 침전물 및 제2 상청액 분획을 생성할 수 있다.

이러한 방식으로 침전제 농도를 증가시키면서 동시에 단백질 농도를 증가시키면 침전 효율이 증가하여 표적 단백질의 증가된 수율을 제공한다. 또한, 가시적인 침전물을 생성하지 않는 농도로 침전제의 초기 도입은 (통상적인 공정에서 침전제 첨가 시에 발견되는 바와 같은) 국소화된 고농도의 침전제로 인한 원치 않는 단백질 침전물의 형성을 방지하여, 바람직하지 않은 단백질 변성 가능성을 감소시키고 그러한 공정으로부터 회수된 표적 단백질의 비활성을 개선한다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 구현예에서, 침전제는 비휘발성이 되도록(즉, 현재 주위 조건하에서 단백질 수용액의 물보다 더 높은 증기압을 가짐) 선택된다. 사용되는 침전제의 양은 침전제의 특성에 따라 달라질 수 있다. 적합한 침전제는 바람직하게는 변성을 일으키지 않으며, 유기산 및 유기산의 염(예를 들어, 시트르산나트륨), 무기 염(예를 들어, 황산암모늄, 황산나트륨, 염화나트륨), 및 친수성 중합체(예를 들어, PEG, 덱스트란 등)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 시트르산나트륨과 같은 유기 염이 사용되는 경우, 이는 약 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 또는 약 20%(w/v) 미만 범위의 농도로 제공될 수 있다. 유사하게, 황산암모늄과 같은 무기 염이 사용되는 경우, 이는 약 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 또는 약 20%(w/v) 미만 범위의 농도로 제공될 수 있다. PEG와 같은 친수성 중합체가 사용되는 경우, 이는 약 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.5%, 0.7%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 7%, 또는 약 10%(w/v) 미만 범위의 농도로 제공될 수 있다.

임의의 적합한 방법으로 침전제를 함유한 단백질 수용액으로부터 물이 제거할 수 있다. 이용되는 방법은 침전제의 특성에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 침전제가 친수성 중합체인 경우, 친수성 중합체의 분자량보다 작은 분자량 컷오프를 갖는 막을 이용하는 여과(예를 들어, 한외여과, 정용여과)를 이용하여 수용액으로부터 물을 제거할 수 있다. 다른 구현예에서, (주위 압력 또는 감압에서의) 증발을 이용하여 수용액으로부터 물을 제거할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 그렇게 얻어진 치료 단백질은 혈액 생성물의 처리의 결과이다. 적합한 혈액 생성물은 혈청, 혈장, 크리오-푸어 혈장, 상기 기재된 바와 같은 변형된 크리오-푸어 혈장, 재가용화된 동결침전물, 및 상기 기재된 바와 같은 변형된 재가용화된 동결침전물을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈액 생성물은 본 발명의 방법에 도입되기 전에 다양한 공정 단계(예를 들어, 희석, pH 조정, 프로테아제 억제제의 첨가, 항응고제의 첨가, 침전 등)를 거쳤을 수 있다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 상청액 또는 침전물은 하나 이상의 표적 단백질을 회수하고/회수하거나 바람직하지 않은 오염물질을 제거하기 위해 추가로 처리될 수 있다. 그러한 구현예에서, 방법에 의해 생성된 침전물은 추가적인 처리 전에 재용해될 수 있다. 적합한 추가적인 처리 단계는 상청액으로부터의 추가 물 제거, 침전시키는 양의 침전제의 첨가에 의한 통상적인 침전, 및/또는 (예를 들어, 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화성, 혼합-모드, 및/또는 크기 배제 크로마토그래피 매질을 사용한) 크로마토그래피를 포함한다.

그러한 추가적인 처리에 이용되는 크로마토그래피 매질은 임의의 적합한 제형 및 구성을 가질 수 있다. 크기 배제, 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화성, 및/또는 혼합 모드 분리를 위해 적합한 매질이 제형화될 수 있다. 적합한 매질은 다공성 과립 또는 비드, 비-다공성 과립 또는 비드, 필터, 섬유, 및/또는 다공성 막으로 제공될 수 있다. 크로마토그래피 매질의 구조적 부분은 임의의 적합한 물질을 기반으로 할 수 있다. 예에는 다당류(예컨대 가교된 덱스트란), 합성 중합체 및/또는 무기 물질(예컨대 수산화인회석)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 크로마토그래피 매질은 임의의 적합한 기하 구조로 제공될 수 있다. 적합한 기하 구조는 개방형 또는 밀폐형 크로마토그래피 컬럼, 방사형 크로마토그래피 컬럼, 카트리지, 막 하우징 등을 포함한다.

본 발명의 방법의 예에서, 혈액 생성물(예컨대 혈장)을 얻고 빠른 교반에 의해 동등한 부피의 8%(w/v) 시트르산나트륨과 블렌딩하여, 4%(w/v)의 비-침전성(non-precipitating) 시트르산나트륨 농도를 갖는 단백질 수용액을 형성한다. 단백질 수용액을 밀폐된 용기로 옮기고 공기 압력을 주위 온도에서 물의 증기압 미만으로 낮추어, 용액으로부터의 물의 빠른 증발을 일으킨다. 일부 구현예에서, 밀폐된 챔버 내에서 수증기의 평형을 방지하기 위해 이 공정 동안 소량의 공기를 밀폐된 용기 내로 연속적으로 흘려 보낸다. 수용액의 부피가 감소하여 시트르산나트륨 농도가 약 10% 내지 12%가 되도록 하면서 단백질 농도를 증가시킬 때까지 물을 제거하여, 가시적인 침전물의 형성을 일으킨다. 이어서, 침전물을 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 상청액 분획과 분리할 수 있다. 이러한 분리는 주위 압력 또는 감압에서 수행될 수 있다.

본 발명의 방법의 다른 예에서, 혈액 생성물(예컨대 혈장)을 얻고 빠른 교반을 이용하여 동등한 부피의 평균 분자량이 5 kD인 2%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 블렌딩하여, 1%(w/v)의 비-침전성 PEG 농도를 갖는 단백질 수용액을 형성한다. 단백질 수용액을 3 kD 분자량 컷오프를 갖는 비-오염 막을 이용한 한외여과에 적용하여, 침전제를 보유하면서 용액으로부터의 물 및 기타 저분자량 종의 빠른 제거를 가져온다. 한외여과는 수용액의 부피가 단백질 수용액의 원래 부피의 약 25%로 줄어들 때까지 계속되어, PEG 농도가 약 4% w/v가 되도록 하면서 단백질 농도를 증가시키고 가시적인 침전물의 형성을 일으킨다. 이어서, 침전물을 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 상청액 분획으로부터 분리할 수 있다.

다양한 약학적으로 유용한 단백질은 본 발명의 방법으로부터 높은 수율, 비활성, 순도,시험관내 안정성, 및/또는 생체내 안정성으로 얻어질 수 있다. 그러한 단백질은 피브리노겐, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자, 피브로넥틴, 면역글로불린, 알파-1 항트립신, 단백질 C, 단백질 S, C1 에스테라제 억제제, 안티트롬빈 3, 트롬빈, 및/또는 알부민을 포함한다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 조성물에서 발견되는 치료 단백질은 낮은 함량의 변성된 치료 단백질을 갖는다. 적합한 출발 물질에 대한 본 발명의 방법의 적용 후에 변성된 상태로 존재하는 치료 단백질의 부분은 총 치료 단백질 함량 또는 혼합물 중의 천연 치료 단백질 함량의 약 0.01% 내지 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 8%, 또는 10% 범위일 수 있다. 그렇게 생성된 치료 단백질은 높은 정도의 보관 안정성 및/또는 투여 후의 생체내 안정성을 가질 수 있고/있거나 통상적인 방법(예를 들어, 콘 분획화)을 이용하여 제조된 상응하는 치료 단백질 제제에 비해 높은 비활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 면역글로불린 제제는 통상적인 콘 분획화(즉, 에탄올 침전)에 의해 제조된 상응하는 면역글로불린 제제보다 유의하게 더 긴(예를 들어, 적어도 10% 더 긴) 저장 수명 및/또는 투여 후의 생체내 반감기를 가질 수 있다. 유사하게, 본 발명의 알파-1 항트립신 제제는 N-벤조일-L-아르기닌-파라-니트로아닐리드 염산염(L-BAPNA)을 기질로 사용하여 활성-부위 적정된 돼지 췌장 트립신으로 시험할 때 90% 넘게 억제성일 수 있다.

유사하게, 오염물질(예를 들어, 빌리루빈, 지방산 등)은 치료 단백질의 90% 내지 99.99%를 활성 천연 형태로 유지하면서 매우 높은 정도로 제거되어, 높은 단백질 농도(예를 들어, 10 mgmL^-1 또는 그 초과)에서 무색이거나 본질적으로 무색인 단백질 용액을 생성한다. 이는 알부민의 경우 특히 유용할 수 있으며, 이는 오염물질의 그러한 감소가 치료적으로 적용될 때 이 단백질에 의한 바람직하지 않은 분자, 예컨대 순환성 아밀로이드 플라크 물질 및/또는 작은 유기 분자(예를 들어, 치료 약물, 남용 약물, 약물 대사 산물 등)의 흡착을 위한 부수적으로 증가된 능력을 가져올 수 있기 때문이다.

본 명세서에서의 발명 개념을 벗어남이 없이 이미 기재된 것들 이외의 더 많은 변형이 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 본 발명은 첨부된 청구범위의 사상을 제외하고는 제한되지 않아야 한다. 더욱이, 명세서 및 청구범위 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 비-배타적 방식으로 요소, 구성성분, 또는 단계를 지칭하는 것으로 해석되어야 하며, 이는 지칭된 요소, 구성성분, 또는 단계가 존재할 수 있거나, 이용될 수 있거나, 명시적으로 지칭되지 않은 다른 요소, 구성성분, 또는 단계와 조합될 수 있음을 나타낸다. 본 명세서의 청구범위가 A, B, C ... 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 것 중 적어도 하나를 지칭하는 경우, 텍스트는 A + N, 또는 B + N 등이 아닌 군으로부터의 단지 하나의 요소를 요구하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (17)

1. 치료 단백질을 포함하는 조성물로서, 상기 치료 단백질은 제1 양의 천연 형태 및 제2 양의 변성된 형태로 존재하고, 상기 제2 양은 상기 제1 양의 0.01% 내지 5%이고, 상기 치료 단백질은 혈액 생성물로부터 단리되는, 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질은 단리 동안 침전제에 노출되는, 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혈액 생성물은 변형된 크리오-푸어(cryo-poor) 혈장인, 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질은 알파-1 항트립신이고, 상기 조성물은 N-벤조일-L-아르기닌-파라-니트로아닐리드 염산염(L-BAPNA)을 기질로 사용하여 활성-부위 적정된 돼지 췌장 트립신으로 시험할 때 90% 넘게 억제성인, 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질은 면역글로불린이고, 상기 조성물은 콘(Cohn) 분획화를 이용하여 제조된 면역글로불린 분획보다 적어도 10% 더 긴 생체내 반감기를 갖는, 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질은 적어도 10% 농도의 알부민이고, 상기 조성물은 무색인, 조성물.
7. 제1항의 조성물을 제조하는 방법으로서,
   동결된 혈장을 얻는 단계;
   상기 동결된 혈장을 침전제의 존재 하에 1℃ 내지 6℃의 온도에서 해동하여, 변형된 동결침전물(cryoprecipitate) 및 변형된 크리오-푸어 혈장을 생성하는 단계;
   상기 변형된 동결침전물을 상기 변형된 크리오-푸어 혈장과 분리하는 단계;
   상기 변형된 크리오-푸어 혈장을 중간 침전 또는 상당한 희석 단계 없이 크로마토그래피 매질에 적용하여 결합되지 않은 분획 및 결합된 분획을 생성하는 단계; 및
   상기 결합되지 않은 분획 또는 상기 결합된 분획으로부터 0.01% 내지 5%의 변성된 치료 단백질을 포함하는 치료 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 침전제는 유기산, 유기산의 염, 무기 염, 및 친수성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 침전제는 시트르산나트륨인, 방법.
10. 제1항의 조성물을 제조하는 방법으로서,
    혈액 생성물을 얻는 단계;
    상기 혈액 생성물에 비휘발성 침전제를 첨가하여 침전물의 형성을 일으키지 않는 침전제 농도를 제공함으로써 제1 중간 용액을 형성하는 단계;
    상기 침전제의 목표 침전 농도에 도달할 때까지 상기 침전제를 보유하면서 상기 제1 중간 용액으로부터 물을 제거하여 침전물 및 상청액을 생성하는 단계;
    상기 침전물을 상기 상청액과 분리하는 단계; 및
    상기 상청액 또는 상기 침전물로부터 0.01% 내지 5%의 변성된 치료 단백질을 포함하는 치료 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 침전제는 유기산, 유기산의 염, 무기 염, 및 친수성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 침전제는 시트르산나트륨인, 방법.
13. 제10항에 있어서, 물은 증발에 의해 제거되는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 증발은 감압 하에서 수행되는, 방법.
15. 제10항에 있어서, 상기 침전제는 친수성 중합체이고, 물은 한외여과에 의해 제거되는, 방법.
16. 제10항에 있어서, 상기 치료 단백질은 상기 상청액으로부터 회수되는, 방법.
17. 제10항에 있어서, 상기 치료 단백질은 상기 침전물로부터 회수되는, 방법.