CN103797023B - 通过序贯多元酸沉淀进行的血浆蛋白分级分离 - Google Patents
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Abstract
本发明透露了用于使用水相体系(经由添加相对低浓度的单个聚合物在血液或含血液的溶液中形成)实现自血细胞中分离(澄清)血浆蛋白的方法。本发明亦透露了替代广泛使用的科恩型血浆蛋白分级分离法的使用多元酸的简单序贯添加的方法,科恩型血浆蛋白分级分离法基于序贯添加高达40%(v/v)乙醇及其它沉淀剂。其亦可支持基于聚合物膜的容器在新型无溶剂血浆分级分离方法中的用途。所公开的方法亦可适用于研究和诊断应用中较小规模的血浆蛋白分离。所述一般方法为稳健的并且可在广泛范围的工艺变量(例如温度和pH)内起作用。
Description
本发明的技术领域
本发明涉及血液组分的分离。具体而言其涉及用于将血浆分级分离成药学上有用的组分的方法。
发明背景
用于大分子分离和纯化的非色谱法
来自天然来源的血浆蛋白的生产者长期依赖于基于乙醇的差异蛋白质沉淀以在经由柱色谱法纯化各蛋白质之前序贯地分离蛋白质级分。这类方法尤其适于以密集型生产经济运行的较大规模分离。然而,它们为技术上复杂的并且需要高度培训的技术人员以及昂贵的设备和设施。
涉及生物技术分离过程的科学家正在处理甚至更大型的过程以及对于降低生产产品的成本的需要。他们重新检验诸如双水相体系中的沉淀和分配等技术的用途(1, 2,3)。分配的主要优点为其基于两个液(L)相的形成,由此可在L-L相界面收集细胞和细胞碎片,所述细胞和细胞碎片通过界面张力维持在所述界面。因此,如果靶蛋白可以选择性方式显著程度地分配到一相中,则可能全在一步中实现某种程度的靶标澄清(细胞碎片去除)、纯化和浓缩(上述参考文献)。分配的主要缺点为含水聚合物两相体系的形成通常需要向含有靶标的溶液中加入诸如葡聚糖和聚乙二醇[PGE]等两种聚合物或者加入一种聚合物和一种高浓度盐(例如PEG和0.5 M磷酸盐)。所述双聚合物体系可以是昂贵的而聚合物-盐体系具有低容量(溶解性)——对于抗体蛋白而言常常为1-2 g/L (3)。最近公开了通过加入相对低浓度的单种生物相容性向温聚合物来澄清生物技术原料的方法(4),其允许经由基本上无聚合物相的形成来澄清,所述相包含大部分蛋白质,并且通常漂浮于密度更大的富含聚合物的下相之上。亦可经由添加沉淀剂来改良上相以实现靶标的进一步浓缩和纯化。
单聚合物双水相体系
早已知道蛋白质可在含水聚合物两相体系的相之间选择性分配,所述体系使用两种聚合物(例如葡聚糖和聚乙二醇)或一种聚合物(例如PEG)和相对高浓度的水构造盐(water structuring salt)(例如磷酸钠)自发形成。后一种体系更不昂贵但是它们趋于具有更低的蛋白质溶解性并因此具有更低的容量(3,4)。亦早已理解的是,细胞和细胞碎片,以及其它微米级胶体,趋于蓄积在两相的界面,它们通过界面张力维持在所述界面。上述两种类型的LL体系的一个变型为聚合物-聚合物体系,其中一种聚合物为热响应性聚合物,其在升高的温度和其它条件下自缔合(3,4)。先前将此行为用于在相分离和两相离析之后从一相的聚合物中分离蛋白质,并回收相聚合物以再使用。除所述两种类型的相体系之外,还已认可第三种类型——单聚合物体系。这些体系在这样的条件下形成,其中加入的亲水聚合物自缔合并因此形成较轻的贫聚合物相,其漂浮于密度大得多的富聚合物相之上(4,5)。合适的聚合物包括制备自环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)组分的所谓的“EOPO”聚合物(例如Pluronic®、Tergitol®、Breox®家族)。其它合适的聚合物可包括用含乙氧基的基团二级修饰的纤维素或其它多糖聚合物。从生物分离角度来看,这类单聚合物低盐两相体系的主要缺点为蛋白质趋于不以任何选择性分配到上(贫聚合物)相中。因此已写到“水-EOPO体系因此仅适于疏水分子的分配(例如变性蛋白或富含色氨酸的肽或者用于通过选择性水去除进行的溶液浓缩)”(5)。一个可能的理论解决方案为疏水地修饰EOPO聚合物(6),然而其可能导致去污性和其它复杂状态。最近发现,EOPO聚合物可直接加入发酵液中,利用发酵温度和盐来实现两相体系的形成,其中细胞碎片会集中在相界面而诸如蛋白质等可溶性物质会分配到贫聚合物相中,在所述相中其可随后容易地进行过滤和色谱分离(4)。一般而言此项工作聚焦于与重组蛋白相关的发酵以及具体而言聚焦于单克隆抗体生产。
蛋白质沉淀
尽管已提出将絮凝和沉淀(在本文中认为等同的术语)用于细胞碎片去除(2),但它们亦对加工生物过程原料具有某些吸引力,所述生物过程原料使用离心随后过滤的经典方法预澄清(1,2,7-12)。在所述情况下,靶标纯化可能受到诸如宿主细胞蛋白质(HCP)等污染物沉淀的影响。幸运的是大多数单克隆抗体以及血液中许多天然存在的抗体在pH 7时带净正电荷,而许多HCP和核酸污染物带净负电荷(7)。因此聚阳离子聚合物可用于使许多HCP和核酸污染物沉淀,将带净正电荷的靶单克隆抗体(Mab)蛋白留在溶液中(8,10)。或者可能希望使用带净负电荷的聚合物使带净正电荷的Mab靶标沉淀并将带净负电荷的蛋白质和核酸留在溶液中(7-9)。在两种情况下均需要某种形式的过滤、离心或其它方法以从上清液中分离沉淀(11)。
将抗体或其它靶蛋白沉淀的一个优点为靶标在沉淀物中可以是相当稳定的,并因此能够在加工期间间歇地储存(12,13)。缺点为分离沉淀物和再溶解靶蛋白(例如用于经由色谱法的后续纯化)可能需要稀释所述蛋白质,其增加处理体积(例如8)。其亦可能需要用缓冲液再悬浮,所述缓冲液的电导率、pH或其它特性不适应于通过色谱法或其它所需分离方法的加工。最近公开了在诸如柠檬酸钠等盐的存在下使用聚羧酸来纯化诸如Mab和相关抗体片段(Fab)等生物技术蛋白质的方法(7)。
在上述实例中,通常控制pH以实现其中待沉淀的物质带有和与其相互作用的沉淀剂相反的净电荷的情况。如果使用诸如硫酸铵等盐将诸如抗体等蛋白质优先沉淀,则类似的考虑亦适用,再次利用pH的控制来确保抗体带有与主要污染物相反的净电荷(11)。这有助于确保蛋白质在其中其为电荷中性的复合物中缔合。当沉淀剂不带电时,例如在溶剂如乙醇或中性(不带电的)聚合物(例如聚乙二醇)的情况下,控制溶液pH以匹配靶蛋白的等电电荷的pH (pI)常常非常有效(12)。这是因为沉淀剂通常结合水分子并减少靶标溶剂化。
乙醇(14,15)和盐(22)均已用于通过序贯沉淀将复杂的蛋白质混合物分离成数个级分,其中随着沉淀剂的浓度增加,将一个接着一个的蛋白质级分沉淀并回收。这可能是因为a)不同的蛋白质在不同的沉淀剂浓度下沉淀和b)一旦某种蛋白质已沉淀,其在沉淀剂浓度进一步增加时仍不溶解。然而如在(8,10)中未将使用带电聚合物的沉淀用于通过序贯沉淀的分级分离,因为在加入过量的沉淀剂聚合物后沉淀物趋于再溶解(8,9,10)。此行为使得当两种或更多种靶蛋白表现出显著不同的溶解性时,基本上不可能控制序贯沉淀过程。
血浆蛋白分级分离
血浆为相对廉价的治疗用蛋白质的宝贵来源;尤其是在发展中国家。每年数十亿美元的血浆蛋白被分离并销售用于治疗用途。主要的关注蛋白质为以相当高浓度在血浆中高丰度的蛋白质并包括白蛋白、纤维蛋白原和各种免疫球蛋白,例如属于IgG、IgA和IgM类的免疫球蛋白。然而诸如凝血因子V、VII、VIII、IV和冯维勒布兰德因子(vWF),以及转铁蛋白、纤连蛋白和α-1-抗胰蛋白酶等其它蛋白质,有日渐增长的商业重要性(14,15)。
表1. 一些高丰度的人血浆蛋白
蛋白质 | Mw (kDa) | pI | 血浆(g/l) |
血清白蛋白 | 69 | 5.6 | 35-55 |
免疫球蛋白 | 145-190 | 6.5-9.5 | 14 |
纤维蛋白原 | 340 | 5.1-6.3 | 1.5-3 |
转铁蛋白 | 80 | 5.6-6.0 | 2.3 |
因子VIII | 280 | 5-6 | 0.20 |
一般而言将捐献的血液离心以产生富含细胞的级分和血浆。对于大规模离心和无菌的需求可限制这类过程的灵活性。血浆常常冷冻储存。血浆蛋白质基于级分的色谱处理来纯化,所述级分首先使用称为科恩分级分离法(Cohn Fractionation)的通用方法分离。其在第二次世界大战期间由美国的科恩(Cohn)等首先开发并由Kistler和Nitschmann以及其它科学家随后改进(14,15)。其通常应用于大(例如4000 L)体积的融化血浆以产生冷沉淀,所述冷沉淀含有部分纤维蛋白原以及许多因子VIII和缔合的vWF。然后在具有各种变化的pH、温度和电导率的乙醇存在下,使上清液经历复杂的一系列低温沉淀步骤(图1,重绘自参考文献16)。在现***分级分离过程中(例如图2A和2B,来自参考文献15),这些不同的沉淀步骤得到随后经历使用色谱过程的进一步纯化的级分。一般而言科恩分级分离法的优点包括以下事实,其可应用于大量血浆;血浆蛋白级分最终成为可根据需要间歇储存的沉淀物;一些纤维蛋白原在所述过程的早期去除,由此其在后续分离步骤中不会堵塞色谱柱;所述过程灭活某些细菌、病毒和可能的朊病毒的能力;所述过程匹配溶剂-去污剂(SD)或相关抗病毒方法的能力。缺点包括:a.需要使用大量和相当浓缩量的乙醇,其存在健康和***/火灾隐患,导致昂贵的加工设备和设施。b.需要微调(+/- 3℃)的温度控制,其在大量液体体积的情况下使过程和相关的设备和设施进一步复杂化。c.包括高浓度的乙醇(高达40%)和低pH以及相对长的加工时间的单元操作,其可使一些靶蛋白变性。d.诸如纤维蛋白原和免疫球蛋白等蛋白质必须作为不同阶段的沉淀物(部分地)回收(例如图2A和2B)。e.蛋白质回收率可能相当差,例如在某些过程中对免疫球蛋白而言为50% (上述参考文献)。使用盐沉淀用于分级分离的备选方案(22)导致回收的蛋白质级分中非常高的盐含量,迫使需要在这些级分的进一步加工之前进行昂贵的额外操作,如稀释或渗滤。其亦可导致蛋白质的变性。亦已尝试利用使用非离子型聚乙二醇(PEG)和氯化钠的沉淀来分级分离(23),但这需要非常高浓度的PEG和腐蚀性氯化钠。此外,此过程为非常pH-敏感的并且在每个沉淀剂添加后均需要小心调节pH和电导率。其亦需要复杂的额外加工以从蛋白质中去除PEG。
鉴于上述情况,需要鉴定更简单、稳健且容易扩展的备选方案来进行自血浆中的基于离心机的血细胞分离。亦需要鉴定比科恩分级分离更简单、可容易扩展的备选方案(14,15)。亦应注意的是,需要鉴定快速而简单的方法来分离血浆蛋白以用于诊断和研究目的。
发明概述
本发明的一方面涉及从分离自血液的血浆中选择性分离蛋白质的方法。这使用依照权利要求1的方法来完成。所述方法可以选择性方式用于分离特定的高丰度蛋白质,例如纤维蛋白原、免疫球蛋白和白蛋白。选择性和蛋白质回收率可经由使用pH和盐组成来进一步控制。就以下而言所述方法亦为稳健的:在面对聚合物类型、聚合物浓度、温度、pH等方面的正常预计的工艺变化(即规定操作值的+/- 10%)时仍提供相似的分离,并且不需要沉淀步骤之间的缓冲pH、电导率等的复杂调节。其对蛋白质浓度亦为稳健的,由此其可在血浆加工的不同阶段使用,所述阶段包含高于血浆水平的蛋白质浓度。与先前的血浆分级分离方法相比,其甚至可直接用于未稀释的血浆,这允许显著的成本降低。
本发明的第二方面亦涉及自血细胞和血脂组分中自发分离血浆蛋白的方法。这通过依照权利要求33的方法来完成。所述方法可单独使用或者作为步骤与第一方面的方法一起用于血浆分离过程。本发明的优点包括:a.除混合之外需要很少能量或者不需要能量来实现分离,b.其可在多种容器中进行,包括一次性单次使用塑料容器,c.其使用相对廉价和生物相容的试剂,d.其在大范围的规模和温度内起作用,e.其将大部分蛋白质留在可适于直接用于进一步的靶标加工的水相中,所述加工包括经由深层过滤(以去除任何细胞、细胞碎片、细菌或其它胶体污染物)并随后通过沉淀、色谱法等进行的蛋白质的进一步纯化。
对于血液和血浆的加工,上述两种方法可一起使用或独立使用以实现蛋白质的澄清和选择性沉淀。
本发明的其它合适的实施方案在从属权利要求中描述。
参考文献
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23. Y-Z Lee等,J. Agr. Food Chem. 35, 958-962, 1987。
附图简述
图1.图表以pH和乙醇浓度的变化来显示科恩分级分离法方法6 (1946年)的复杂性,重绘自科恩等,参考文献16。
图2A和B.分图显示现代基于科恩的沉淀和相关色谱法血浆分级分离方法的复杂性,摘录自Burnouf,参考文献15。
图3.无细胞血浆样品的基于科恩的沉淀和相关色谱法血浆分级分离方法,与基于单聚合物相体系用于在基于多元酸的沉淀之前大量去除细胞的本发明方法进行比较的简要概述。在两种情况下,纤维蛋白原均在第一个沉淀步骤中去除(未显示)。
图4.显示与高丰度的血清蛋白及其亚基相关的某些共有条带的正常人血浆和蛋白质MW标准的一维(ID)十二烷基硫酸钠(SDS)还原凝胶电泳分析(来自本项工作),与显示其复杂性的血浆的二维(2D)等电pH接着SDS还原凝胶电泳分析的文献图片(18)进行比较。
图5.对比十个主要条带各自的相对强度(峰)及其相对像素位置的ImageQuantTLTM分析,显示人血浆的1D还原SDS凝胶电泳分析(左边从下往上具有渐增的MW)。SDS凝胶顶部的数字7是指泳道。所述凝胶包含与更低丰度的蛋白质相关的许多其它可重现的峰。
图6.在代表性EOPO相体系(即8% EOPO、150mM NaCl、100mM柠檬酸钠,pH7,40℃)中分配的人血浆蛋白的1D还原SDS凝胶电泳分析,认为所述EOPO相体系对血液澄清和蛋白质分离有用。泳道;1-HSA聚合物相,2-HSA水相,3-IgG水相,4-IgG聚合物相,7-纤维蛋白原水相,8-纤维蛋白原聚合物相。泳道7中的三个纤维蛋白原亚基用箭头显示。
图7.借助于10%聚丙烯酸沉淀的人血浆蛋白的1D还原SDS凝胶电泳分析。大部分血清蛋白沉淀,但许多白蛋白(HSA)和转铁蛋白似乎保留在上清液中。体系(5 ml):1.5 ml血浆、10% (w/w) PAA 15 000、250 mM柠檬酸钠pH 7、150 mM NaCl。
图8.在200 mM柠檬酸钠,pH7存在下与血浆蛋白的多元酸沉淀有关的沉淀物和上清液样品的1D还原SDS凝胶电泳分析。PVS (11% (w/w)聚乙烯磺酸3 000、CMD (20%羧甲基葡聚糖)、PAA (10%聚丙烯酸15 000),改变聚合物浓度以在溶液中产生大致相似浓度的带电基团。
图9.显示向5 ml血浆沉淀溶液中以不同浓度(4-10% w/w)添加聚丙烯酸(PAA 15000)的影响的1D还原SDS凝胶电泳分析,所述血浆沉淀溶液由1.5 ml血浆、50 mM柠檬酸钠,pH 7、50 mM NaCl组成。分析了沉淀物(PPT)和上清液(SUP)级分。新突显的蛋白条带的出现用箭头指出。
图10.存在于沉淀物中作为PAA浓度的函数的IgG、HSA和纤维蛋白原的总量的百分数。数据基于图9电泳的ImageQuantTL分析。亦显示抗体的Biacore SPR分析结果。
图11.用于使用含不同% w/w浓度的聚丙烯酸(PAA)和至少50 mM柠檬酸钠,pH 7的溶液将血浆分级分离的三步四级分方法。加入5% PAA然后接着通过沉降、过滤或离心(显示的)将沉淀物分离,使上清液浓度增加到8% PAA并随后接着将沉淀物分离,使上清液浓度增加到10% PAA。然后将沉淀物重悬浮,留下三个沉淀物级分和最终的上清液级分。
图12.显示按照图11使用增加浓度的PAA将血浆蛋白序贯分级分离的1D还原SDS凝胶电泳。体系(5ml):1.5 ml血浆,4-10% (w/w) PAA (15 000)、50mM柠檬酸钠(pH 7)、50mMNaCl。
图13.在含50 mM NaCl和50 mM柠檬酸钠,pH 7的溶液中与PAA 15 000浓度(%w/w)相对的电导率。
图14.在加入1.5 ml血浆加上50或250 mM柠檬酸钠,pH 7的含5% (w/w) PAA 15000的5 ml体系中的血浆蛋白分级分离的1D还原SDS凝胶电泳。箭头指出在沉淀物样品中新突显蛋白质条带的出现。
图15.来自立方面心(cubic centered face,CCF)实验设计研究的结果,其中PAA15 000的浓度% w/w和柠檬酸钠的mM浓度在含200 mM NaCl的5 ml体系中为变化的,以优化其中抗体或白蛋白可选择性沉淀的条件。
图16.在含8% (w/w) PAA 15 000、50 mM NaCl和50 mM柠檬酸钠的5 ml体系(最终体系pH 6-8)中pH对血浆蛋白分级分离的影响。箭头指出沉淀物中新突显的条带。
图17.在含1.5 ml血浆加上8% PAA 15 000、50 mM NaCl和50 mM柠檬酸钠,pH 7的5 ml体系中温度对血浆沉淀的影响。
定义
术语“多元酸”在本文中意指包含在pH 6及更高pH下带负电荷的官能团的聚合物。
术语“自缔合响应性聚合物(self-associating responsive polymer)”在本文中意指包含疏水区段并具有浊点(即在其之上聚合物的水溶液分开成两相的温度)的水溶性聚合物。
发明详述
在一方面,本发明公开用于从血浆的样品中分离至少第一和第二蛋白质的方法,所述方法包括以下步骤:
a)在容器中提供血浆的样品,
b)向血浆中加入诸如多元酸等聚电解质和盐,导致第一蛋白质沉淀物的形成并回收所述第一蛋白质沉淀物和第一上清液,
c)向所述第一上清液中加入聚电解质/多元酸和/或盐,导致第二蛋白质沉淀物和第二上清液的形成并单独地回收所述第二蛋白质沉淀物,
其中所述第一蛋白质沉淀物包含第一蛋白质浓缩物以及所述第二蛋白质沉淀物包含第二蛋白质浓缩物。
浓缩物意指讨论中的蛋白质(第一或第二蛋白质)与蛋白质沉淀物中总蛋白量的质量比显著高于血浆中或第一上清液中的所述质量比。例如其可以是至少两倍高、至少10倍高或者至少50倍高。这亦可以所述第一和第二蛋白质在各自蛋白质沉淀物中富集的方式来表达。此外,所述第一蛋白质沉淀物可包含血浆样品中第一蛋白质总量的至少50%重量,例如至少70%重量或至少90%重量,以及所述第二蛋白质沉淀物可包含第一上清液中或血浆样品中第二蛋白质总量的至少50%重量,例如至少70%重量或至少90%重量。使用的血浆样品可以是未稀释的血浆。
所述方法经由多元酸的添加自血浆中选择性浓缩并分离蛋白质,所述血浆通过诸如离心和过滤等标准方法或分配法分离自血液。所述方法可与盐(包括柠檬酸盐抗凝剂)一起使用以非特异性地沉淀大多数血浆蛋白。其亦可以选择性方式用于分离诸如纤维蛋白原等特定的高丰度蛋白质,然后将上清液暴露给更高的聚合物浓度以分级地沉淀免疫球蛋白。然后可将来自分离的上清液暴露给再更高的聚合物和/或盐浓度,以从血清白蛋白中分离其它残留的蛋白质。血浆含有大量蛋白质——除最高丰度的蛋白质(表1)之外还有约100种蛋白质,凝胶电泳表明上述沉淀剂级分将含有其它蛋白质,所述其它蛋白质亦可具有商业、诊断或研究意义。选择性和蛋白质回收率可经由使用pH和盐组成来进一步控制。然而对于聚合物类型、聚合物浓度、温度、pH等方面的正常工艺变化(即规定操作值的+/- 10%)的影响,所述方法为非常稳健的。在步骤b)和c)之一或二者中,其可在0-40℃ (例如4-20℃)的温度下操作。所述方法亦可与病原体灭活或去除步骤组合,所述步骤例如溶剂-去污剂步骤、病毒过滤步骤和/或低pH病毒灭活步骤。血浆可以是人的,但其亦可以是动物来源的,例如牛血浆或马血浆。
所述多元酸沉淀方法的优点为:
I.其不需要任何有机溶剂。
II.其可在包括一次性单次使用塑料容器在内的多种容器中进行。
III.其使用温和而廉价的试剂。
IV.预期其将核酸和一些其他污染物分离到上清液中。
V.其可在大范围的温度内进行。
VI.其产生确定、稳定且容易处理的沉淀物,所述沉淀物亦易于再溶解在多种溶液中以用于进一步加工。
VII.其可适于从小规模(微升)到大规模(千升)的血浆蛋白样品的加工。
VIII.其不仅可适于加工人血浆蛋白,而且还可适于加工来自其它来源(例如牛血浆)的混合物中的蛋白质。
所述组合方法的基本优点在图3中显示,该图提供标准的基于科恩的血浆蛋白分级分离方法(在图1和2中更详细地显示)与其中可经由分配(或者用经典的离心法)分离细胞接着基于多元酸的沉淀的方法进行比较的简述。
所述多元酸沉淀法似乎满足对代替科恩分级分离法的方法的所有要求,所述要求如下所概述。组合的分配和沉淀方法的优点在表2中概述。上述方法的其它特征将从以下详细的实施例中以及从权利要求中显而易见。
对科恩分级分离法代替方法的要求:
1.与科恩分级分离法具有可比性以便容易地应用于现有设施和方法。例如其应将纤维蛋白原、免疫球蛋白和白蛋白蛋白质分离在单独的级分中,并且能够在(容易再溶解的)沉淀剂复合物中分离所述蛋白质,所述沉淀剂复合物亦可提供稳定的短期储存。
2.涉及少量或者不涉及机溶剂以便减少健康、安全和成本问题;以及供给在较简单设施上的加工。
3.可适于在4℃-室温(例如20℃)的均匀温度下加工,由此不需要用于变化温度的复杂控制***。
4.提供同样好或者更好的蛋白质(例如免疫球蛋白)产率。
5.在方法早期去除大部分纤维蛋白原以便促进有效的经由色谱或者基于其它多孔介质的步骤的后续纯化。
6.与科恩分级分离法的复杂的pH、电导率和溶剂组成变化(图1)相比,可能在不需要显著改变工作液组成的情况下操作。
7.与科恩分级分离法相比包括更少的沉淀步骤并且不包括需要诸如聚乙二醇等其它沉淀剂的步骤(图2A)。例如在单个温度下以及以相对低浓度(与科恩分级分离法的20-40%乙醇水平相比(16))序贯加入单一沉淀剂。
8.就利用相对低浓度的生物相容性试剂而言具有成本效益,所述试剂可经由后续色谱步骤容易地去除。
9.容易使用无菌塑料袋和其它一次性设备实施以便允许柔性制造,并简化新设施的装配。
10.涉及液体工艺流和稳健的方法以便容易地允许简单整合低pH步骤、溶剂-去污剂步骤和过滤步骤以帮助去除诸如细菌、病毒、朊病毒等病原性污染物和相关物质。这在整个方法相关的色谱步骤所提供的任何去除之外。
11.除整个方法相关的色谱步骤提供的任何去除之外,提供核酸和其它污染物的显著降低(10-100x)。
12.可适于添加稳定剂、抗聚集剂、抗蛋白水解剂(如果需要的话),以促进处于天然功能状态的活性蛋白质靶标的回收。
表2.基于科恩和基于新聚合物的血浆分级分离方法的概述
在一些实施方案中,所述第一蛋白质可以是纤维蛋白原。所述第二蛋白质可以是免疫球蛋白,例如免疫球蛋白G。与免疫球蛋白相比纤维蛋白原通常在更低的多元酸浓度下沉淀,以及沉淀选择性与在科恩分级分离法中观察到的沉淀选择性相似为所述方法的优点。这减少与纤维蛋白原相关的污垢或者其它工艺复杂性。纤维蛋白原和免疫球蛋白G均为有价值的蛋白质并且常用作药物。在一些实施方案中,所述第一和第二蛋白质适于用作药物,意味着它们(任选在进一步分离步骤之后)具有足以用于药物用途的纯度并且不含由所述方法引入的毒性污染物。在某些实施方案中,在步骤b)或c)中加入足量的多元酸以使第二蛋白质沉淀物包含基本上所有的来自血浆的残留蛋白质。此沉淀物然后可进一步加工以用于众多蛋白质的单独回收或分析。
在某些实施方案中,控制步骤b)中的盐添加以使在步骤b)中血浆包含至少50mmol/l (例如50-250 mmol/L或50-100 mmol/L)的盐(以盐的阴离子计算)。亦可对其控制以使步骤b)中的总盐浓度为至少50 mmol/l,例如50-250 mmol/L或50-100 mmol/L(再次以阴离子计算)。所述多元酸和盐显示强大的协同效应,意味着相对低的盐浓度可用于获得有效的分级分离。这是有利的,因为沉淀物中的低盐浓度允许通过诸如阳离子交换色谱等方法直接加工再溶解的沉淀物而无需过度稀释或渗滤。如果使用氯化物盐,在低盐浓度下工作的又一个优点为减少了不锈钢设备的腐蚀。所述盐可作为水溶液或作为固体粉末添加。
在一些实施方案中,步骤b)中的多元酸以这样的量添加,所述量得到至少3%重量(例如4-10%重量或4-5%重量)的在血浆中的总多元酸浓度。待使用的确切浓度在某种程度上取决于盐浓度并且将需要一些有限的实验来确定用于具体分离任务的浓度。如果亦需要作为混合的多元酸-盐溶液,则多元酸可适宜地以水溶液的形式添加。可按照例如立方面心(CCF)实验设计,使用纯蛋白质或者经由以简单电泳分析进行的实验来进行优化,如在图8、9、15、16中所示。
在某些实施方案中,步骤c)中的多元酸以这样的量添加,所述量得到等于或高于步骤b)中的多元酸浓度的在所述第一上清液中的总多元酸浓度,该浓度为至少4%重量,例如介于5-20%重量、5-15%重量或者5-8%重量之间。如果步骤c)中的盐浓度与步骤b)中的相同,则在步骤c)中将需要比在步骤b)中更高的多元酸浓度,但如果在步骤c)中加入另外的盐,则多元酸浓度可等于或高于步骤b)中的多元酸浓度。在某些实施方案中,具体而言当多元酸浓度为约15-20%时,步骤c)中的第二蛋白质沉淀物可作为漂浮相或上相回收。
在一些实施方案中,控制步骤c)中的盐添加以使在步骤c)中第一上清液包含至少50 mmol/l (例如50-250 mmol/L或50-100 mmol/L)的以盐的阴离子计算的盐。亦可对其控制以使步骤c)中的总盐浓度为至少50 mmol/l,例如50-250 mmol/L或50-100 mmol/L。步骤c)中的盐浓度可等于步骤b)中的浓度(在步骤c)中未添加盐)或者在加入另外的盐时其可高于步骤b)中的浓度。总盐浓度可保持在低水平以利于沉淀物的进一步下游加工并将腐蚀降至最低,这又是一个优点。
在某些实施方案中,所述多元酸选自聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸(PMAA)、聚乙烯基磺酸(PVS)、聚苯乙烯磺酸(PSS)、羧甲基葡聚糖(CMD)和羧甲基纤维素(CMC)。这些聚合物市购可得以及可生产达到足够的纯度并具有合适的分子量。一般而言,所述多元酸可以是包含例如羧酸根、磺酸根和/或硫酸根基团的聚合物,所述基团在pH大于约5时均带负电荷并且这些基团的含量可以是约2-15 mmol/g聚合物(例如5-15 mmol/g),如计算自所述聚合物的酸式(PAA 14 mmol/g、PMAA 12 mmol/g、PVS 9 mmol/g、PSS 5 mmol/g,CMD和CMC取决于取代度)。所述多元酸的分子量可以是至少5 000 Da,例如5 000-40 000 Da或者5000-15 000 Da。较低的分子量可得到更不稳健的沉淀,而过高的分子量产生具有高粘度的溶液。
在一些实施方案中,在步骤b)中(以及任选在步骤c)中)加入的盐选自磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵或其任何组合。数种这些盐具有多价阴离子并且可根据体系的pH使用这些阴离子的一元盐、二元盐、三元盐以及混合的盐。要理解的是,加入对应于盐的阴离子的酸与氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵的混合溶液等同于加入这样的盐。一般而言所述盐可根据众所周知的霍夫迈斯特序(Hofmeister series)选自产生高盐析效应并且不会产生毒性或其它消极作用的感胶离子盐(lyotropic salt)。磷酸钠和柠檬酸钠为有利的,因为它们常常用于血浆加工,其中它们提供pH缓冲作用和抗凝特性。盐可单独使用(如根据图1)或者组合使用。这包括与其它盐(例如氯化钠)组合,如根据图15和16。可有利地避免在使用的条件下盐浓度超过任何所用盐的溶度积。
在某些实施方案中,在步骤b)和/或c)中pH为4-9,例如6-8。pH可在分级分离中始终保持恒定或者可针对各沉淀步骤使其最优化。在一些实施方案中,在沉淀步骤之间不进行pH调节。虽然对于这些间隔内正常的工艺pH变化(例如+/- 0.2),所述方法为相对稳健的,但是pH可用于微调沉淀步骤的选择性。
在一些实施方案中,步骤c)进一步包括回收第二上清液以及另外包括步骤d):向所述第二上清液中加入多元酸和/或盐,导致第三蛋白质沉淀物(其包含第三蛋白质浓缩物)的沉淀,并回收此第三蛋白质沉淀物。此第三蛋白质可以是白蛋白,例如人血清白蛋白,但其亦可以是更低丰度的蛋白质,例如因子VIII或转铁蛋白。浓缩物意指蛋白质沉淀物中第三蛋白质与总蛋白量的质量比显著高于血浆中或第二上清液中的所述质量比。例如其可以是至少两倍高、至少10倍高或者至少50倍高。这亦可以所述第三蛋白质在所述第三蛋白质沉淀物中富集的方式来表达。此外,所述第三蛋白质沉淀物可包含血浆样品中或第二上清液中的第三蛋白质总量的至少50%重量,例如至少70%重量或至少90%重量。
所述沉淀物可包含多于一种靶蛋白,这需要进一步加工混合物。在某些实施方案中,将至少一种蛋白质沉淀物(例如各蛋白质沉淀物)再溶解并经历诸如沉淀、结晶、色谱法和/或过滤等另外的步骤以分离所述第一、第二和/或第三蛋白质。因再溶解沉淀物中的相对低盐含量所致,离子交换色谱为用于后续步骤的令人关注的方法。阳离子交换和阴离子交换色谱二者以及多元离子交换色谱均可直接用于再溶解的沉淀物。存在于沉淀物中的残留量的多元酸可通过流通型阴离子交换色谱步骤去除。亦可能使用结合-洗脱色谱,例如经由疏水相互作用、亲和力、混合模式或阳离子交换色谱。
在一些实施方案中,在步骤a)之前为通过双水相分离自血液中分离血细胞的步骤a’)。步骤a’)可进而包括以下子步骤:
i)向血样中加入自缔合响应性聚合物以及任选盐,
ii)增加温度或加入盐,导致富聚合物水相、贫聚合物水相以及包含血细胞的相界面的形成和
iii)将贫聚合物水相回收为血浆。
此步骤对提供无细胞血浆有用,但是亦对自血液中回收血细胞和脂质有用。
在一些实施方案中,在步骤ii)中的总响应性聚合物含量构成总体系的约4-20%重量。
在某些实施方案中,步骤ii)中的pH为6-8,例如7.3-7.5。
在一些实施方案中,在步骤ii)中加入盐的浓度在1-500 mmol/L的范围,例如在100-300 mmol/L的范围。此步骤中的盐可选自氯化钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钠、硫酸铵和醋酸钠;或其任何组合。
在某些实施方案中,在子步骤i)或ii)中向血液中加入1-10%重量乙醇。这可增强相形成,尤其是富脂相的形成。
在一些实施方案中,所述自缔合响应性聚合物在2-100℃ (例如2-40℃)的1%水溶液中表现出浊点。所述聚合物可包含聚乙二醇或寡乙二醇区段以及可选自环氧乙烷-环氧丙烷共聚物以及乙基羟乙基纤维素。这类聚合物的一个实例为可获自Cognis, Germany的商品名Breox和Dow, USA的商品名Ucon的环氧乙烷-环氧丙烷无规共聚物。另一个实例为可获自BASF, Germany的商品名Pluronic和Dow, USA的商品名Tergitol L的环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物。再另一个实例为可作为Bermocoll获自Akzo Nobel CellulosicSpecialties, Sweden的乙基羟乙基纤维素。所述自缔合响应性聚合物可具有900-100 000Da范围的分子量。
在一些实施方案中,可将诸如葡聚糖、聚丙烯酸、淀粉或淀粉衍生物等第二种聚合物与所述自缔合响应性聚合物联用以形成双聚合物水相体系。
在某些实施方案中,步骤a’)例如通过应用沉降式离心机或连续重力沉降器以连续的模式运行以分离所述相。
在一些实施方案中,序贯沉淀步骤b)-d)的一个或多个和/或所述双水相分离步骤a’)在一个或多个柔性的单次使用容器中进行,所述容器例如一个或多个柔性塑料袋。所述步骤良好地适于这类容器,因为它们不涉及挥发性和易燃性溶剂并且这是非常有用的特征,因为其减少对于昂贵的清洁验证以及对于在重型不锈钢设备上投资的需要。对于沉淀和/或双水相分离而言的必要搅拌可通过将所述柔性塑料袋安装在摇动平台上或者经由与例如单次使用的生物反应器一起使用的其它混合方案提供。
在某些实施方案中,可将步骤ii)的贫聚合物水相冷冻干燥或者在低温下储存至少1天或1周。储存温度可低于8℃ (例如4 8℃),或低于0℃ (例如-10- -20℃或-50- -80℃)。这意味着所述方法步骤可在时间上分隔开,这在许多制造或分析状况下可以是实用的。来自分配步骤的残留聚合物可具有冷冻保护剂作用,其改善敏感性蛋白质在储存期间的稳定性。
在一些实施方案中,步骤ii)的贫聚合物水相可包含添加的稳定剂、抗聚集剂和/或抗蛋白水解剂(如果需要的话),以促进处于天然功能状态的活性蛋白质靶标的储存和回收。
在一些实施方案中,步骤a’)在塑料容器中进行,例如柔性塑料袋、微量滴定板等。所述塑料袋可与塑料管连接,形成用于实施分配步骤的一次性装置。在向容器中引入血液之前,所述自缔合响应性聚合物以及任选盐和任何其它液体或试剂可存在于所述塑料容器中。这类预装填的塑料容器连同用于实施所述分离的书面说明书可以试剂盒的形式提供。
亦特别关注的是用于分析或实验室规模制备的沉淀和分配方法,所述方法可分离高丰度的血浆蛋白,所述高丰度的血浆蛋白趋于掩盖较低丰度但生理学上重要的蛋白质的分析。这类方法可以高通量模式以微升体积在自动式液体处理站运行并且不涉及诸如色谱、电泳或离心等主动的(积极驱动的)分离法。分析和实验室规模沉淀和/或分配通常将应用于规模<500 ml,例如低于10 ml。
本发明的第二方面公开用于制备血浆的方法,所述方法包括以下步骤:i)向血样中加入自缔合响应性聚合物以及任选盐,
ii)增加温度或加入盐,导致富聚合物水相、贫聚合物水相以及包含血细胞的相界面的形成和
iii)将贫聚合物水相回收为血浆。
换言之,这是在所述聚合物诱导两相体系形成的温度的条件下经由向血液中简单添加热响应性聚合物自血细胞和血脂组分中自发分离血浆蛋白的方法。一相具有相对高浓度(即富含)聚合物而另一相含有远低浓度的聚合物(例如1%重量)并且富含水。蛋白质主要分配至不含细胞和脂质组分并且含极少聚合物(例如1%)的水相。如果存在大量脂质,则其可存在于第三相中。在一些情况下,与其它相相比,加入少量%重量溶剂(例如5-10%乙醇)可助于分离脂相。细胞组分存在于相界面处,其通过界面张力维持在所述相界面。可在处于与抗凝作用相应的浓度的柠檬酸钠存在下混合所述体系。所述方法可用于自细胞组分中分离血蛋白(和脂质组分)以用于多种目的,包括大体积血浆蛋白分级分离,或者小体积诊断或研究目的。其尤其可用作血浆加工中的第一步,接着是其中向血浆中加入水溶性聚合物的至少一个步骤,导致至少一种蛋白质的沉淀。此步骤可以是例如依照本发明的第一方面的多元酸序贯沉淀步骤。
所述分配方法的主要优点为:
a.除混合之外需要很少能量或者不需要能量来实现分离,
b.可在各种容器中进行,包括一次性单次使用的塑料容器,
c.采用相对廉价和生物相容的试剂,
d.在大范围的规模和温度内起作用,
e.将大部分蛋白质留在可适于直接用于进一步的靶标加工的水相中,所述加工包括经由深层过滤(以去除任何细胞、细胞碎片、细菌或其它胶体污染物)并随后通过沉淀、色谱法等进行的蛋白质的进一步纯化。
在一些实施方案中,可将步骤ii)或iii)的贫聚合物水相与自缔合响应性聚合物以及任选盐混合,导致富聚合物水相和贫聚合物水相的第二次形成。然后可将不同的靶蛋白富集在各相中并回收用于后续加工或分析。亦可伴随回收使用的聚合物溶液实施所述操作并且亦可以级联模式实施所述操作。
实施例
A.材料和方法
聚合物
用于本研究的阴离子聚合物为聚丙烯酸钠(PAA)、聚乙烯磺酸(PVA)和羧甲基葡聚糖(CMD),图8。不同分子量和贮存浓度(Mw 8000,45% (w/w)和Mw 15000,35% (w/w),假定每个Mw 72的单体具有一个羧酸根基团)的PAA钠盐的贮存液,以及Mw 3000,25% (w/w)的PVS(假定每个Mw107的单体具有一个磺酸根基团)购自Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)。MW40000、取代度(DS) 1.39的CMD购自Meito Sangyo (Japan)。聚合物通常表现出一定范围的pKa。预期PAA和CMD具有低于5的pKa范围而PVS具有低于4的pKa范围,因此预期它们在pH >6时均为高度带负电荷的。用于本研究协助ATPS形成的“EOPO”型共聚物为称为Breox®的常见工业表面活性剂。包括Pluronic®嵌段共聚物和Tergitol®无规共聚物在内的相当相似的共聚物可获自数个来源。某些共聚物用于食品工业或者用作生物加工中的表面活性剂。Breox 50 A 1000为由50%环氧乙烷和50%环氧丙烷组成的无规共聚物。其分子质量为3900以及其获自International Speciality Chemicals (Southampton, UK)。Breox聚合物目前以适于食品和其它加工的形式由Cognis供应。所有聚合物均可从运输容器中直接使用。
蛋白质和血浆
用于本研究的蛋白质Gammanorm (165mg/ml)为购自Octapharma AB (Stockholm,Sweden)的血液来源的人多克隆Ig,其在本文各处称为IgG。人血清白蛋白(HSA)和牛纤维蛋白原购自Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)而人转铁蛋白购自Kabi (Uppsala, Sweden)。用于本研究的mAb (20.7 mg/ml)内部获得(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)并且用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生(mAb2,20mM柠檬酸盐pH 7,0.22µm过滤)。血浆购自Uppsala血液中心,获自血浆去除术并且为新鲜冷冻的。其在实验之前未经脱脂或其它处理。
缓冲液、盐及其它溶液
当基于EOPO聚合物和使用PAA对血浆蛋白的沉淀来检测血浆蛋白在双水相体系(ATPS)中的分配时,使用以下缓冲液: 柠檬酸钠0.8M,pH 3、5、7、9;磷酸钠0.8M pH 7;NaCl5M
在HiTrap™ Q Sepharose™ Fast Flow分析中,使用以下缓冲液;
缓冲液A 50mM柠檬酸钠,pH 4.5;缓冲液B 50mM柠檬酸钠 pH 4.5+1M NaCl
原位清洗(CIP) 1M NaOH (Merck, Darmstadt, Germany);储存:20% (v/v)乙醇。
不同浓度和pH的柠檬酸钠缓冲液通过在MilliQ水(使用Millipore水净化装置制备)中混合适量的柠檬酸钠×2H2O (Merck, Darmstadt, Germany)和柠檬酸(Merck,Darmstadt, Germany)来配制。使用的磷酸钠缓冲液通过在MilliQ水中混合适量的NaH2PO4(Merck, Darmstadt, Germany)和Na2HPO4×2H2O (Merck, Darmstadt, Germany)来配制。所述5M氯化钠溶液通过将14.6g NaCl (VWR, Leuven, Belgium)溶于50ml MilliQ水来配制。
用于双缩脲测定法的双缩脲溶液如下配制:
将3.0g CuSO4×5 H2O、9g C4H4KNaO6×4 H2O、5.0g KI溶于800ml MilliQ水。加入100ml NaOH (6M)并用MilliQ水将体积调为1000ml。所有化学品均购自Merck (Darmstadt,Germany)。
在Biacore分析中,使用HBS-EP+ (10X) (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)作为缓冲液。其含有10mM羟乙基哌嗪乙磺酸(pH 7.4)、150mM NaCl、0.5mM EDTA和0.5%表面活性剂P20并用MilliQ水稀释10倍。
双水相体系(ATPS)
为了评估使用双水相体系(ATPS)获得血浆蛋白的分配的可能性(如对于mAb所见),在10ml Sarstedt管(Sarstedt, Nümbrecht, Germany)中制备基于EOPO聚合物和纯化的血浆蛋白的ATPS。首先在10ml Sarstedt管中配制以下蛋白质溶液:
Gammanorm (5mg/ml):将0.15ml Gammanorm (165mg/ml)溶于5ml MilliQ水。
人血清白蛋白(HSA) (5mg/ml):将25mg HSA溶于5ml MilliQ水并随后用0.45μm无菌过滤器(Sarstedt, Nümbrecht, Germany)过滤。
纤维蛋白原(2mg/ml):将10mg纤维蛋白原溶于5ml水溶液并随后用0.45μm无菌过滤器(Sarstedt)过滤,所述水溶液含有150mM NaCl和100mM柠檬酸钠、100mM磷酸钠或250mM柠檬酸钠(取决于待研究的体系(3.1))、MilliQ水。
在10ml Sarstedt管中将适当体积适当pH的柠檬酸钠或者磷酸钠缓冲液、氯化钠、蛋白质和聚合物混合至5ml的最终体积以达到所需浓度。对于各ATPS蛋白质体系,制备含有相同缓冲液、盐和蛋白质浓度但无聚合物的对照样品以用作物料衡算中的参照。此外,对于各ATPS体系制备含有除蛋白质之外的所有试剂的样品以用作分光光度计分析中的空白。将所述体系混合并根据待检测的体系随后于室温下或40℃水浴中静置以进行相形成。亦检测了4˚C下的ATPS形成,但正如考虑到所用聚合物的约40-50℃的浊点(Tc)所预期的,未观察到相形成。也许有可能使用另一种类型的EOPO聚合物在4˚C下实现相形成。相形成之后,用0.4ml MilliQ水稀释来自各相的0.1ml样品以用于SDS-PAGE分析。
血浆蛋白的聚合物沉淀
将PAA直接用于血浆以检测选择性沉淀并随后自血浆蛋白质的复杂混合物中分离有价值的治疗用血浆蛋白的可能性。亦研究了诸如PVS和CMD等其它阴离子聚合物在血浆蛋白的分级分离中的用途。
向10 ml Sarstedt管中加入适当体积的血浆,加上待测聚合物,以及所需pH的优选缓冲液(上述)和氯化钠并涡旋约1分钟。随后将混合物于室温下静置15分钟以允许沉淀。使沉淀物沉降并通过在室温下以4000或更低rpm (参见下文)离心10分钟或更短时间(参见结果)来采集(Eppendorf 5810 R离心机)。自沉淀物中分离上清液并转移到新的10 mlSarstedt管中。用适当体积的MilliQ水以及氯化钠(需要时)将所述沉淀物重悬浮。用960 μl MilliQ水稀释来自上清液和沉淀物的40 μl样品以用于SDS-PAGE分析。
分光光度法
在含EOPO聚合物的ATPS中的相形成之后,提取来自各相的0.1 ml样品并在2 ml微量离心管(Axygen Scientific, California, US)中用0.9 ml MilliQ水稀释。将所述管进行涡旋并将溶液转移至1.5ml比色皿(Plastibrand, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)。纯化的血浆蛋白在两相之间的分配以分光光度法在280nm处监测(Thermo SpectronicUV1, Thermo Fisher Scientific, Walthman, Mass., USA)。
对各体系计算分配系数(G),方程[1],以及各蛋白质在水相中的百分浓度(C/o),方程(2)。各蛋白质的回收率借助参比样品计算(%回收率),方程(3)。
对于此分析法的误差估计为约± 5%,这是下文列举的G值在范围上可能不同的原因,对于HSA为12-15,对于HSA为171-209,以及对于IgG为18-22。溶解纯纤维蛋白原伴随的问题亦促成在绝对G值估计上的可能误差。然而认为下文给出的值为指示性的并且应记住的是,超过10的G值(例如在一相中有90%蛋白质)通常随G值增加而变得更不准确。
电泳
将1维聚丙烯酰胺凝胶电泳(1D PAGE)用于分析和显现蛋白质在ATPS中的分配以及使用PAA的血浆蛋白沉淀二者。向含50% NuPAGE LDS样品缓冲液(4x) (Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)和20% (w/w) β-巯基乙醇的10 μl SDS-PAGE上样缓冲液中加入10 μl待分析的样品并通过在70℃加热10 min将所述混合物还原。使样品冷却并将10 μl上样至NuPage® 4-12% Bis Tris凝胶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)并在5 μl PrecisionPlus®未染色的蛋白质分子量标志物(Biorad, Hemel Hempstead, UK)旁进行分析。使电泳在NuPage MOPS SDS电泳缓冲液(20x) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中于150V下进行1小时。使用GelCode Blue® (考马斯型)染色试剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham, Massachusetts, USA)对蛋白质条带染色,振荡过夜之后用MilliQ水脱色24小时。1D凝胶分析提供对于主要的血浆蛋白在血液和在其它样品(例如分离的级分)中的相对分布的了解(图4)。使用ImageQuantTL™ (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)软件分析凝胶的各泳道中各条带的分子量和相对量,即样品中的各蛋白质占样品中蛋白质总量的百分比(图5)。蛋白质的分子量借助基于分子量标志物的标准曲线计算。基于蛋白质条带与泳道中其它条带相比的强度来估计各蛋白质的相对量。
图像分析和定量的精确性
通过上述方法,图5所示的十个主要的蛋白质峰具有以下相对MW (kDa)丰度(总量的%):1 = 374 kDa,1.1%;2 = 190 kDa,2.6%;3 = 139,1.1%;4 = 119 kDa,2.2%;5 = 77kDa,6.3%;6 = 60 kDa,55.4%;7 = 55 kDa,4.7%;8 = 53 kDa,10.5%;9 = 52 kDa,1.6%和10 = 25 kDa,14.5%。因此预期的是,条带5很可能表示转铁蛋白,条带6表示白蛋白,条带8和10表示Ig轻链亚基,条带7和9表示纤维蛋白原亚基。白蛋白一般占60%的总蛋白,转铁蛋白占4%以及IgG占20% (重链和轻链),由此在合理的人样品变化和不同的分析方法(光学染料定量对比蛋白质分析)范围之内,所述ImageQuantTL图像分析允许相当精确的蛋白质分析。
然而与诸如纤维蛋白原等低浓度的蛋白质相比,对于诸如白蛋白等高浓度的蛋白质而言此方法更精确。其亦需要蛋白质条带的准确识别。预期的是蛋白质(例如Ig)的不同亚基会以相同的丰度存在,然而并非如此。在此血浆样品中,对于纤维蛋白原仅两个条带可见,第三个条带可能因为与白蛋白分子量相当类似而被白蛋白条带隐藏。某些Ig蛋白质可出现在认为与纤维蛋白原亚基相关的条带中。另一个关注为,指定何种蛋白质与电泳凝胶中的哪个条带有关亦为基于计算的分子量标准曲线和蛋白质条带的相对位置的估测。虽然此分析法得到样品中各蛋白质的量的良好估算,但其仅为估计值。亦必须记住的是血浆为蛋白质的复杂混合物并且Ig水平可显著地因人而异,以及甚至对于数小时之内的一个个体而言亦基于个体的健康而显著不同。
将获自ImageQuantTL分析的信息与来自双缩脲测定的信息一起使用以估计样品中的总蛋白浓度以及各血浆蛋白的样品浓度。
双缩脲测定
对于上清液和沉淀物中蛋白质浓度的分别定量,使用双缩脲测定。双缩脲测定为用于借助铜(II)离子检测肽键存在情况的化学测定法。铜(II)离子在肽键存在下形成紫色复合物并且根据Lambert-Beer定律,在540nm处测定的吸光度与蛋白质浓度成正比。
根据样品中的预期浓度制作高标准曲线或低标准曲线。所述高标准曲线范围从80mg/ml至5mg/ml,以及所述低标准曲线范围从5 mg/ml至0.5 mg/ml。标准品使用含人血清白蛋白和γ-球蛋白(Sigma Aldrich, St. Louis, USA)的80mg/ml蛋白质标准品制作。当使用高标准曲线时,向96-孔微量滴定板(Grenier Bio-One, US)中一式两份加入10 μl标准品以及一式两份加入各样品的10 μl和5 μl等份。当使用低标准曲线时,向96-孔微量滴定板中一式两份加入100 μl标准品以及各样品的100 μl等份,亦一式两份加入。使用MilliQ水以及用MilliQ稀释的PAA作为空白以检测PAA是否干扰测定。其后向各孔加入200μl双缩脲溶液并使平板在振荡器上孵育30min并随后用分光光度计(SPECTRA max PLUS384,Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA)在540nm处监测吸光度。上清液和沉淀物中的蛋白质浓度借助标准曲线来确定。为了能够将沉淀物中的浓度与上清液中的浓度进行比较,如下将沉淀物中的浓度反推算至5 ml
沉淀物浓度=([沉淀物]*重悬浮体积)/5ml) [4]
为了定量血浆样品(沉淀物和上清液)中各蛋白质的浓度,将用ImageQuantTL (参见上文)分析电泳凝胶时获得的各样品中各蛋白质的百分比乘以获自双缩脲测定的各样品中的总蛋白浓度,参见下文;
沉淀物和上清液中各蛋白质的浓度;
血浆或血浆级分或条带样品中单个类型的蛋白质的浓度如下计算:
浓度(mg/ml)=样品中蛋白质的% (ImageQuantTL) ×样品中的总蛋白浓度(双缩脲测定) (mg/ml) [5]
为了验证用双缩脲测定法获得的浓度的准确性,计算起始样品(沉淀物(ppt) +上清液(sup))中的总蛋白浓度以及起始样品(ppt + sup)中各蛋白质的总浓度并与估计值进行比较。血浆样品通常具有约70 g/l的总蛋白浓度以及当样品稀释3.3倍时(1.5ml血浆/5ml体系),预期起始样品(ppt + sup)中的总蛋白浓度为约23g/l。因此预期起始实验样品中的主要血浆蛋白浓度接近白蛋白约14 g/l、IgG约4.7 g/l和纤维蛋白原约1.2 g/l,这与它们稀释3.3x的正常值(表1)一致。为了定量在不同样品条件下沉淀的各蛋白质的百分比,将沉淀物中各蛋白质的浓度(如上所述计算)除以起始样品(ppt + sup)中所述蛋白质的总浓度。
HiTrap™ Q Sepharose™ Fast Flow色谱
在不同的PAA浓度下研究了纯化的血浆蛋白的沉淀。将适当体积的人血清白蛋白(HSA)、γ球蛋白(Gammanorm)和单克隆抗体溶于MilliQ水以达到5mg/ml的终浓度。随后用0.45µm无菌过滤器(Sarstedt, Nümbrecht, Germany)将HSA样品过滤。如上所述进行蛋白质的沉淀并以分光光度法检测结果(参见上文)。在大于7% (w/w)的PAA浓度下,所述聚合物似乎显著干扰A280-分析。为了降低PAA浓度,用0.45µm无菌过滤器(Sarstedt, Nümbrecht,Germany)将上清液过滤并将1ml上样至置于以Unicorn™软件(GE Healthcare, Uppsala,Sweden)控制的ÄKTA™ explorer (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)中的用QSepharose(基于季胺的强阴离子交换剂)预装填的HiTrapTM Q Sepharose™ Fast Flow柱(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)。在280nm、260nm和220nm处监测洗脱液。将PAA (用水稀释以达到PAA的样品浓度)和标准的蛋白质溶液上样至所述柱。将上清液中的蛋白质浓度计算为A280 (上清液) - A280 (空白)。然后沉淀物中的蛋白质浓度可计算为A280 (标准品) -A280 (上清液)。
基于Biacore™的表面等离子体共振分析
为了评价借助于SDS-PAGE分析和双缩脲测定估计的蛋白质浓度的可靠性,使用基于Biacore的分析法分析某些沉淀物和上清液中IgG的浓度。用于此研究的仪器为Biacore™ T100 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)和来自GE Healthcare (Uppsala, Sweden)的Series S Sensor Chip CM5 (羧甲基葡聚糖涂覆的)芯片。来自小鼠的抗体单克隆抗人IgG (Fc) (Human Antibody Capture Kit™的部分, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)与芯片的固定采用来自制造商的标准方案用Amine Coupling Kit™ (GE Healthcare,Uppsala, Sweden)进行。使用HBS-EP +缓冲液(缓冲盐水)将所有上清液稀释100倍(10 μl+ 990 μl)接着两次两倍稀释以及将沉淀物稀释200倍(5 μl + 995μl)接着三次两倍稀释以拟合在标准曲线内。标准曲线范围从50 μg/ml至0.512 μg/ml,稀释因子为2.5 (240 μl+ 360 μl缓冲液)。标准品使用来自Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)的人IgG配制。在20μl/min的流速下注入样品达20秒。在30 μl/min的流速下用3M MgCl2 (Human AntibodyCapture Kit的部分, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)进行再生达30秒。使用20 μg/ml和1.28 μg/ml的用来自Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)的人IgG配制的对照样品。启动周期(startup cycle)在8 μg/ml下进行并使用与标准曲线和对照样品相同的抗体制备。
电导率测定
测定了体系的电导率。通过混合适当体积的血浆、柠檬酸盐缓冲液、氯化钠和PAA达到所需浓度来制备所述体系,并用MilliQ水将体积变为1ml。使用PharmaciaConductivity Monitor (Pharmacia Biotech, 目前GE Healthcare, Uppsala, Sweden)监测电导率。
实施例1.血浆蛋白在ATPS中的分配
使代表性的纯化的主要血浆蛋白样品在双水相体系(ATPS)中分配。在三个不同的体系中检测HSA、人Ig (Gammanorm)和纤维蛋白原的分配;
1. 8% EOPO、150mM NaCl、100mM柠檬酸钠(pH 7),40℃。
2. 8% EOPO、150mM NaCl、250 mM柠檬酸钠(pH 7),RT。
3. 8% EOPO、150mM NaCl、100mM 磷酸钠(pH 7),40℃。
在所有三个体系中,双相体系均快速建立。在体系1和3中,富聚合物相(p-相)密度大于互补相并存在于容器的底部。在体系2中,相分离在室温下发生并且含盐的富水相密度更大,使其相对容易通过排水来分离。所有三个体系的富聚合物相和富水相均通过A280nm分光光度法和SDS-PAGE分析以研究三种蛋白质在相之间的分配。所有三个体系的结果均在表3中显示以及代表性的电泳分析(对于体系1结果)在图6中显示。
表3. EOPO单聚合物相体系中的血浆蛋白分配的A280-分析
研究的全部三种主要血浆蛋白均显著分配到富水相中。纤维蛋白原结果是基于相对低浓度的蛋白质并显示某些变化。体系2中的一些纤维蛋白原聚集可能影响其估计回收率。然而,在富聚合物相中没有纤维蛋白原吸光度或者与富聚合物相有关的电泳凝胶中没有纤维蛋白原蛋白质条带支持以下结论:在所有三个体系中纤维蛋白原均显著分配到富水相中。
实施例2.使用聚丙烯酸沉淀血浆蛋白
选择10% (w/w) PAA (15000)、250mM柠檬酸钠(pH 7)和150mM NaCl的体系(如上所述制备)用于血浆样品的初步分级分离,依照亦如上所述的方法进行分析。上清液和重悬浮的沉淀物的电泳结果在图7中显示。包括纤维蛋白原和抗体蛋白在内的大部分血清蛋白质沉淀而许多白蛋白(HSA)和转铁蛋白似乎留在上清液中。
实施例3.使用聚丙烯酸沉淀纯化的血浆蛋白
将磷酸钠、柠檬酸钠或相似的离液盐连同PAA包含在本项工作中似乎给远更稳健的方法提供了途径(上述实施例2),在所述方法中可能仅必须改变PAA浓度来实现选择性。首先使用纯化的血浆蛋白HSA、IgG和Mab以及含5%、7%和9% (w/w) PAA连同50 mM柠檬酸钠和50 mM NaCl,pH 7的沉淀体系来测试该途径。如上所述使用HiTrap™ Q Sepharose™Fast Flow进行上清液的分析,结果表达为总蛋白相对于对照的百分比。不加入PAA 15000的参考为5 mg/ml蛋白质溶液。结果在表4中记录。
含PAA的实验溶液与对照溶液相比在极性、电导率或其它特性上的差异可能得到超过100%的某些值。可发现的是,PAA使血浆蛋白从溶液中沉淀出的趋势遵循与基于乙醇(即科恩分级分离法)的沉淀中相同的一般顺序(即纤维蛋白原,然后抗体,然后白蛋白)。所述结果表明基于PAA浓度的某些蛋白质选择性。其它因素在下文实施例中研究。注意的是所述分析法未必测定所有沉淀(絮凝)微粒,其可适合使用过滤或其它捕获方法进行的生物加工。在5% PAA时外观上记为溶液混浊的某些抗体沉淀未出现在数据中——或许是因为微小复合体在这些初期研究的离心条件下未沉淀下来。似乎与使用真实血浆的结果(参见下文)相似的结果表明,即便从诸如血浆等复杂溶液中沉淀时,不同类型的蛋白质亦具有某种程度相互独立的行为。其亦表明的是,尽管PAA浓度变化(即1% w/w的变化)可允许对选择性的某些控制,但是所述一般方法为稳健的并且不会被聚合物浓度、PAA聚合物样品MW或其它特性上的轻微变化(即0.2% w/w)不利地影响。
表4.暴露给使用不同PAA浓度进行的沉淀的上清液中的相关蛋白质
实施例4. PAA MW对血浆蛋白沉淀的影响
聚丙烯酸聚合物溶液趋于随聚合物分子量增加而显著增加粘度。此外,越高MW的PAA聚合物趋于表现出越广泛的MW范围并因此在其溶液性能上更不可再现。随着聚合物大小增加,预期的是任何残留聚合物可能更难以自靶蛋白中分离(例如使用过滤或大小排阻色谱法)并且可能更容易堵塞用于靶蛋白的进一步纯化的滤床或色谱床。因此决定使用10%(w/w) PAA、250 mM柠檬酸钠和150 mM NaCl考察不同的PAA MW 8000与15000的效果。在两个实验中,电泳分析结果(未显示)几乎与图7中对10% PAA 15000显示的电泳分析结果相同,这强调了所述方法的稳健性。
实施例5.聚合物酸类型、MW和取代的影响
研究了下列基于三种不同聚合物的沉淀体系(实验);聚乙烯基磺酸(PVS) 5ml最终体积溶液,由1.5ml血浆、200mM柠檬酸钠(pH7)、11% (w/w) PVS (3000 MW)、加至5 ml的MilliQ水组成;羧甲基葡聚糖(CMD) 1.25 ml最终体积的溶液,由0.4 ml血浆、200 mM柠檬酸钠(pH 7)、20% (w/w) CMD (40000 MW,DS 1.39)、加至1.25 ml的MilliQ水组成;聚丙烯酸(PAA) 5 ml最终体积,由1.5 ml血浆、200 mM柠檬酸钠(pH 7)、10% (w/w) PAA (15000)、加至最终5 ml的MilliQ水组成。聚合物浓度略有不同,以基于pKa或取代度(DS)(在CMD的情况下)平衡电离基团。注意所述聚合物显示不同的分子量(3 000-40 000)和三种不同的酸性基团(图8)、不同的聚合物浓度(10-20%)以及不同的取代度——基于1-1.39的单体基团与酸部分的比率(参见上文)。如通过图8中电泳结果所示,在包含200 mM的柠檬酸钠pH 7的条件下,所有三种聚合物均良好地起作用,并提供几乎相同的沉淀选择性。上述所有均导致蛋白质-聚合物复合物可容易地经由低水平(4 000 rpm)台式离心自上清液中分离。因此使用多元酸连同诸如柠檬酸钠等感胶离子盐的方法似乎非常稳健。另外的稳健性在与多元酸浓度的影响有关的下一个实验中证实。
实施例6.聚丙烯酸浓度的选择性作用
图9显示与向5 ml血浆沉淀溶液中加入不同浓度(4-10% w/w)的聚丙烯酸(PAA15000)的作用相关的1D还原SDS PAGE分析,所述血浆沉淀溶液由1.5 ml血浆、50 mM柠檬酸钠,pH7、50 mM NaCl组成。沉淀物(PPT)和上清液(SUP)级分如上文在方法部分中所述分析。某些蛋白质条带在凝胶中的首次显著出现通过箭头显示。这些结果与实施例3中显示的纯血浆蛋白的结果一致。可见随着多元酸浓度增加,不同的蛋白质趋于沉淀。似乎在分离以显著浓度存在的血浆蛋白(以及在某些情况下以较小浓度存在的蛋白质)上的某些选择性可仅通过改变多元酸浓度来实现,而无需加入溶剂或改变pH或盐浓度。所述方法的稳健性使得可在4-10%时选择性沉淀不同的蛋白质,然而在多元酸浓度上的轻微操作变化(例如+/-0.2% w/w)应不会明显影响结果。注意与实施例5中的200 mM柠檬酸钠相比,本研究使用50mM柠檬酸钠和50 mM NaCl的盐浓度完成。这亦提供对于所述一般方法的稳健性的某些了解。更多的离子强度影响数据在后面的实施例中显示。
鉴于血浆具有约70 g/l的总蛋白浓度并在实验中稀释约3倍(即1.5 ml血浆稀释至总共5 ml),预计所述体系中的总蛋白浓度为约23 g/l。HSA通常占总蛋白质量的60%,Ig占20%以及纤维蛋白原占5%。因此对于HSA、Ig和纤维蛋白原可分别预期约14、5和1.2 mg/ml的总体平均mg/ml值,其与双缩脲测定法测定的起始样品中13、5和1.3的值(未显示数据)良好地匹配。
通过Biacore SPR测定法针对抗体分析沉淀物和上清液级分并通过ImageQuantTL分析法进一步分析来自使用GelCode Blue的考马斯型染色的主要蛋白质凝胶电泳条带。此外,将主要蛋白质条带MW估计值用于蛋白质(亚基)鉴定。这些结果在下文中论述。
PAGE结果(图9)表明在低于7% (w/w)的PAA浓度时,沉淀物中主要有纤维蛋白原连同似乎为不同量的一种或多种约60kDa的蛋白质。这可代表小部分的HSA或者其可代表其它蛋白链,例如与IgD、IgA或IgM相关的蛋白链。在6% (w/w) PAA时,血浆IgG开始沉淀,如通过其约20kD的轻链所指示,以及当PAA浓度达到10% (w/w)时,几乎所有血浆蛋白均沉淀;包括一些HSA。大部分的球状蛋白质HSA样品以及略微更大的蛋白质(假定为球状蛋白质转铁蛋白)留在溶液中。总蛋白和蛋白质级分的Biacore和ImageQuant TL分析支持上述一般解释。
图10显示作为PAA浓度的函数的沉淀物中独立的纤维蛋白原、IgG和白蛋白(HSA)蛋白质的估计百分比。ImageQuantTL分析结果表明在4% PAA时仅30%的纤维蛋白原沉淀,而表面上看来电泳凝胶会表明沉淀了更多的纤维蛋白原。这可能是因在较低蛋白质浓度时光学法的非线性以及图像分析的灵敏性降低所致。不论如何,所述数据表明应可能鉴定其中主要蛋白质级分选择性沉淀的PAA浓度范围。注意在上述实施例中仅PAA浓度为变化的,以至于在各浓度下许多蛋白质在不同程度上相互竞争以包含在沉淀复合物中。随着蛋白质在大小、扩散性、净电荷和其它因素(固有疏水性和溶解性)上相当不同,这可有助于减少图10中数据的线性区的斜率。因此,如果按照下一个实施例以分步方式改变聚合物浓度和沉淀,则预期出现更好的选择性。
实施例7.基于三个PAA浓度的三步血浆分级分离方法
图11显示基于上述结果的可能的三步血浆分级分离。注意所述方法得到四个级分——三个沉淀物级分(其可重悬浮)和一个最终的上清液级分。图12显示1D还原PAGE,其显示按照图11使用增加浓度的PAA将血浆蛋白序贯分级分离。体系(5ml):1.5ml血浆、4-10%(w/w) PAA (15000)、50mM柠檬酸钠(pH 7)、50mM NaCl。在这些实验中调节PAA浓度,假定在先前沉淀步骤中去除了无关紧要的相对少量的PAA。结果与实施例6中的结果一致,然而因在先前沉淀步骤中去除形成复合物的蛋白质所致,蛋白质级分似乎更澄清。
表5.来自按照图12的分级分离的5 ml上清液和5 ml重悬浮的沉淀物中纤维蛋白原、IgG和白蛋白(HSA)的估计浓度(mg/ml)。
表6.总计回收的各蛋白质的%,估算自表5。
表5显示来自按照图12的分级分离的5 ml上清液和(5 ml重悬浮的)沉淀物中纤维蛋白原、IgG和白蛋白(HSA)的估计浓度(mg/ml)。经由双缩脲测定法确定总蛋白并经由考马斯染色凝胶的ImageQuantTL分析确定各PAGE条带(图13)的相对量。如上所述,基于正常血浆值,预期5%、8%和10%沉淀物以及10%上清液的HSA、Ig和纤维蛋白原的总值为约14、5和1.2,其与测定的总值13、5和1.3相当良好地匹配,所述测定的总值表明对于HAS、Ig和纤维蛋白原而言10.6 (82%)、2.6 (52%)和1.0 (77%)的回收值。ImageQuantTL估计值低于预期的趋势,可能是因为PAA对蛋白质-染料相互作用的影响、各凝胶中的大量低丰度蛋白质条带以及蛋白质条带的错误指配所致。具体而言,因存在的抗体亚型的复杂性及其对还原的相对敏感性,以及IgG亚基凝胶条带在MV上与其它蛋白质条带重叠的趋势所致,IgG估计值可能低于预期。预计上述计算值具有相当大的标准误差(或许为记录值的+/- 0.1),但即便允许所述误差仍证实图11中的方法可得到三个级分(5% PPT、8% PPT和10% SUP),所述级分各自含有大部分纤维蛋白原、IgG和HSA蛋白质。图12所示的电泳结果亦表明所述四个级分富含可能具生物医学重要性的其它(至今仍未鉴定的)蛋白质,大量的所述蛋白质出现在10% PAA沉淀物中。就纤维蛋白原、IgG和HAS而言,所述序贯方法改善各级分的纯度的能力可能与总蛋白或在各步中竞争复合物形成的特定蛋白质类型上的相对减少有关。
预期的是10% PAA上清液中的大量HSA可能在涉及更高浓度PAA的另一步中沉淀。在上述实施例中,当PAA浓度增加到15%时,可使超过35%的白蛋白沉淀(未显示数据)。渐增的盐浓度进一步增加白蛋白沉淀(参见下文)。以沉淀形式获取白蛋白对于进一步加工之前HSA的体积减小和临时储存而言可以是有用的。其亦可能利于沉淀物在具有较低的PAA净浓度的溶液中重悬浮。然而预期的是,所述10%可溶性级分亦可容易地经历经由过滤和色谱法的进一步纯化(包括自蛋白质中分离PAA)。
实施例8.电导率的影响
研究了电导率对使用多元酸和感胶离子盐体系分级分离血浆蛋白的选择性的影响。在多个pH 7体系中测定具有不同浓度的柠檬酸钠缓冲液、NaCl和15000 MW聚丙烯酸(PAA)的体系的电导率(表7和图13)。所述体系的电导率随PAA浓度增大而增加(图13)。正如预期,PAA浓度对体系电导率的影响在较低的所加盐浓度下更明显,以及加入的盐对体系电导率的影响在较低PAA浓度下更明显。在含10% PAA 15000的5 ml总体积体系中沉淀1.5 ml血浆时,沉淀物和上清液级分的电泳分析表明,当从100 mM柠檬酸钠(39.8 mS/cm)至200mM柠檬酸钠(42.8 mS/cm)变化时,在电导率或者级分之间的蛋白质分布上几乎没有变化。然而在含5% PAA的体系中,当从50 mM柠檬酸钠(24.5 mS/cm)至250 mM柠檬酸钠(39.0 mS/cm)变化时,在电导率和蛋白质分布二者上均有显著变化,更多的蛋白质条带出现在沉淀物级分电泳凝胶中(图14)。因此,就电导率上的轻微变化而言,似乎所述一般方法非常稳健,以及至少在较低的多元酸浓度下,可改变沉淀溶液中的盐组成来部分控制蛋白质沉淀的选择性(亦参见实施例9)。
上述结果表明,尽管可基于改变的多元酸浓度使用盐浓度来微调分级分离方法的选择性(按照实施例7),但是亦有可能开发其中多元酸浓度保持恒定而盐浓度逐步增加的方法。支持此的数据在实施例9中显示。
表7.具有不同浓度的柠檬酸钠、NaCl和PAA 15000的体系的电导率。
实施例9.对经由高通量筛选优化的适应性及实验设计
将标准立方面心(CCF)实验设计(DOE)与小规模(5 ml)实验一起使用以进一步研究变化浓度的PAA 15000 (4-12%)和柠檬酸钠 (50-250 mM)在含1.5 ml血浆和0 mM-200mM的NaCl的体系中实现将白蛋白和抗体包含在沉淀物中的选择性的能力。在200 mM NaCl时的实例结果在图15中显示。在更高的PAA (12%)并将柠檬酸钠增加到250 mM时,预计56%的存在的白蛋白连同多于90%的抗体在沉淀物中。随着柠檬酸钠减少到60 mM,抗体沉淀仍接近90%,然而仅25%的白蛋白在沉淀物中。所述一般的多元酸-感胶离子盐方法可适于所述快速筛选的简易性,及其应允许的选择性控制,支持所述方法的商业潜力。
实施例10. pH的影响
为了研究体系pH的影响,在pH 3、5、7和9配制柠檬酸钠(0.8M)的贮存液。在含8%(w/w) PAA和50mM NaCl的同等体系中加入柠檬酸钠达50 mM。因血浆和水的pH以及柠檬酸盐的pKa所致,最终体系中的pH分别增加到6.3、7、8.2和8.3。使用1D SDS-PAGE (和GelCodeBlue考马斯染色)分析pH对蛋白质沉淀的影响(图16)并将那些结果与双缩脲测定(总蛋白)加上ImageQuantTL (相对蛋白量的PAGE凝胶条带分析)组合以提供沉淀物中各蛋白质(白蛋白、抗体和纤维蛋白原)的百分比的估计值。纤维蛋白原在上述体系中向沉淀物中的几乎全部掺入以及白蛋白在上述体系中向沉淀物中的相对低水平掺入,几乎不受从6至8的pH变化影响。然而抗体向沉淀物中的掺入随pH升高而增加(未显示数据)。某些其它未指配的较高MW蛋白质的沉淀亦受pH影响(图16)。因此pH或许有可能用于微调通过所述一般方法对特定蛋白质的分级分离。经凝胶显现的在pH 8.2和8.3之间在抗体沉淀上的微小变化再次表明方法稳健性。
在本实施例中使用具有相对低浓度的柠檬酸钠的体系,这限制所述体系的缓冲能力和研究的pH范围。科恩分级分离法可涉及从4至8改变pH (参考文献16,亦参见图1)。如果使用较高浓度的离液序列高的缓冲盐(例如柠檬酸钠或磷酸钠)或者如果将另一种缓冲体系与任何所需的感胶离子盐组合使用,则或许有可能在更广泛的范围内改变pH。
考虑到研究蛋白质的等电pH范围(表1),预期在本实施例研究的条件下(即pH 6-8),白蛋白应带净负电荷并保持带负电荷,纤维蛋白原应主要带净负电荷,以及通常存在于血浆中的不同抗体(pI范围为6-10)可以是中性的、带净负电荷或带净正电荷的。亦预期诸如转铁蛋白和因子VIII等许多其它的血浆蛋白在研究的pH范围内主要为中性的或净负电的。因此,电泳结果显示在纤维蛋白原的情况下,所述一般方法能够沉淀带净负电荷的蛋白质,以及带净正电荷的抗体。此外,随着pH增加以及多种抗体蛋白似乎变为带更少净正电荷,其复合作用似乎增加。这对仅基于带净负电荷的聚合物与带净正电荷的蛋白质的电荷-电荷相互作用的方法而言是反直觉的。这可能与蛋白质溶解性(表面疏水性)以及蛋白质-盐和蛋白质-蛋白质相互作用的显著作用有关。沉淀似乎为多种现象组合的结果,不受理论所约束,推测蛋白质大小、相对表面疏水性和其它因素(例如净正电性质的表面区)可能起作用。与研究条件下所涉及的机制无关,多元酸PAA能够介导与蛋白质的复合物形成,所述蛋白质可以是净负电的、净正电的或中性的。
实施例11.离心、温度和盐添加的影响
亦研究了关于所述一般方法的实用大规模应用的某些关注变量。这些变量包括离心速度和时间、作为盐而不是以贮存液添加柠檬酸盐以及温度上的变化。
假定任何絮凝物/沉淀物将通过离心或过滤回收。在本项工作中使用离心将沉淀物沉降下来以能够将其自上清液中分离。5ml或更小体积的离心以4000转/分钟(rpm)进行10分钟(参见上文的方法),结果成功。以4000 rpm达5分钟或甚至以2000 rpm达5分钟亦获得同样成功的结果。在这些研究中沉淀物良好地分离和回收并且对于含1.5 ml血浆、50 mMNaCl和50 mM柠檬酸钠pH 7的5 ml体系,1D SDS凝胶电泳分析未显示沉淀物或上清液样品上的变化(未显示数据)。这些结果亦表明聚合物-蛋白质复合物既足够紧密又在机械上足够稳健以应对过滤或其它可能的方法。
与作为贮存液相比,作为固体添加盐可为有利的。因此在涉及含有1.5 ml血浆加上终浓度8%的PAA和200 mM柠檬酸钠的5 ml体系的实验中,将柠檬酸盐作为盐晶体而不是自贮存液中添加(参见上文的方法)。沉淀以表观正常的方式出现以及沉淀物和上清液级分的1D SDS凝胶电泳分析显示相当相似的结果(未显示数据)。
PAA沉淀物相关的实验通常在22℃ (室温)进行。然而在基于科恩分级分离法的血浆加工中,冷冻血浆应融化至4℃ (其影响血浆的第一次分级分离,亦参见参考文献15、16)。其后可改变溶液温度以增加对各种分级分离步骤的选择性。即便对于基于等温PAA-沉淀的方法,在4℃进行所述方法亦可为合乎需要的。因此,使用血浆在4℃制备一个体系并使所述样品在沉淀期间保持在4℃。与在22℃制备的沉淀物或上清液样品相比时,未能看到显著差异(图17)。
实施例12.未稀释血浆的序贯沉淀
在微温水中融化冷冻的合并肝素化血浆。在15 ml Falcon管中将10 g血浆与聚丙烯酸(35%水溶液, Aldrich 411637-500 ml, MW 15000)混合。
于RT下将混合物在实验台上静置1 h。
于室温下将混合物在Eppendorf台式离心机中以500 g离心10 min。
稀释澄清的上层溶液并测定A280。结果在表8中显示。
表8.来自第一沉淀系列的结果。
10% PAA不足以使血浆中的所有蛋白质(A280吸光度的化合物)沉淀。因此,进行第二轮,将PAA浓度进一步增加到20%。来自此轮的结果在表9中显示。
表9.来自第二沉淀系列的结果。
在PAA浓度高达15%和20%时,大部分血浆蛋白沉淀。在这些浓度下,pH增加约1个单位,因此加工期间的pH调节可有益于某些敏感血浆蛋白的稳定性。用15%和20% PAA获得的沉淀物漂浮在液相之上,这亦为令人关注的观察结果。这对沉淀物的回收而言可具有优势。
此书面描述使用实施例来公开本发明(包括最佳模式),并且亦使本领域的任何技术人员能够实施本发明,包括制备和使用任何装置或体系以及进行任何掺入的方法。指出的是,上文公开的本发明的各方面的具体的有利实施方案可自由组合成本方明的范围之内的其它实施方案。本发明可取得专利权的范围通过权利要求限定,以及可包括本领域技术人员想到的其它实施例。预期所述其它实施例在权利要求的范围之内,如果它们不具有区别于权利要求的字面语言的结构要素,或者如果它们包含与权利要求的字面语言无实质差别的等同的结构要素。
Claims (26)
1.一种自血浆的样品中分离至少第一和第二蛋白质的方法,其中所述第一蛋白质为纤维蛋白原,所述第二蛋白质为免疫球蛋白G,所述方法包括以下步骤:
a)在容器中提供血浆的样品;
b)向所述血浆中加入多元酸和盐,从而所述血浆包含介于6和8之间的pH的50-100mmol/L的总盐,导致包含所述样品中的大部分纤维蛋白原的第一蛋白质沉淀物的形成,并分别回收所述第一蛋白质沉淀物和第一上清液;和
c)向所述第一上清液中加入另外量的多元酸,导致包含所述样品中的大部分免疫球蛋白G的第二蛋白质沉淀物和第二上清液的形成,并单独回收所述第二蛋白质沉淀物,其中多元酸的加入量得到在所述第一上清液中的5-8%的总多元酸浓度;
其中所述第一蛋白质沉淀物包含所述第一蛋白质的浓缩物以及所述第二蛋白质沉淀物包含所述第二蛋白质的浓缩物;
其中所述多元酸是包含在pH 6及更高pH下带负电荷的官能团的聚合物;和
其中所述盐选自磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵或其任何组合。
2.依照权利要求1的方法,其中所述多元酸选自聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯基磺酸、聚苯乙烯磺酸、羧甲基葡聚糖和羧甲基纤维素。
3.依照权利要求1的方法,其中步骤b)和/或步骤c)中的温度介于0-40℃之间。
4.依照权利要求1的方法,其中在步骤c)中所述第二蛋白质沉淀物包含基本上所有的来自血浆的残留蛋白质。
5.依照权利要求1的方法,其中步骤c)进一步包括回收第二上清液以及进一步包括步骤d):向所述第二上清液中加入多元酸和/或盐,导致包含第三蛋白质浓缩物的第三蛋白质沉淀物的形成,并回收所述第三蛋白质沉淀物。
6.依照权利要求5的方法,其中所述第三蛋白质为白蛋白。
7.依照权利要求1的方法,其中所述血浆是人血浆或动物血浆。
8.依照权利要求1的方法,其进一步包含病原体灭活或去除的步骤。
9.依照权利要求1的方法,其中将至少一种蛋白质沉淀物再溶解并经历另外的步骤以分离所述第一、第二和/或第三蛋白质。
10.依照权利要求9的方法,其中另外的步骤是沉淀、结晶、色谱法和/或过滤。
11.依照权利要求1的方法,其中在步骤a)之前为通过双水相分离自血液中分离血细胞的步骤a’)。
12.依照权利要求11的方法,其中步骤a’)包括以下子步骤:
i)向血样中加入自缔合响应性聚合物以及任选盐;
ii)增加温度或加入盐,导致富聚合物水相、贫聚合物水相以及包含血细胞的相界面的形成;和
iii)将贫聚合物水相回收为血浆。
13.依照权利要求12的方法,其中在步骤ii)中的总响应性聚合物含量构成总体系的4-20%重量。
14.依照权利要求12的方法,其中步骤ii)中的pH介于6-8之间。
15.依照权利要求12的方法,其中在步骤ii)中加入盐的浓度在1-500 mmol/L的范围。
16.依照权利要求12的方法,其中所述盐选自氯化钠、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸钠、硫酸铵和醋酸钠;或其任何组合。
17.依照权利要求12的方法,其中在子步骤i)或ii)中向血液中加入1-10%重量乙醇。
18.依照权利要求12的方法,其中所述自缔合响应性聚合物显示介于2-100℃之间的浊点。
19.依照权利要求18的方法,其中所述自缔合响应性聚合物选自环氧乙烷-环氧丙烷共聚物和乙基羟乙基纤维素。
20.依照权利要求12的方法,其中所述自缔合响应性聚合物具有0.9-100 kDa的重均分子量。
21.依照权利要求12的方法,其中步骤a’)以连续模式运行。
22.依照权利要求12的方法,其中步骤a’)在塑料容器中进行。
23.依照权利要求22的方法,其中所述自缔合响应性聚合物以及任选盐在向所述容器中引入血液之前便存在于所述塑料容器中。
24.依照权利要求12的方法,其中将所述贫聚合物水相冷冻干燥或者在低于8℃的温度下储存至少1天或1周。
25.依照权利要求12的方法,其中所述第一和第二蛋白质适于用作药物。
26.依照权利要求12的方法,其中向水相中添加稳定剂、抗聚集剂和/或抗蛋白水解剂以促进处于天然功能状态的活性靶标的储存和回收。
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