KR20220075396A - Cldn18.2를 표적으로 하는 항체, 이의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

Cldn18.2를 표적으로 하는 항체, 이의 제조 방법 및 이의 용도 Download PDF

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웨이 장
질리 왕
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하버 바이오메드 (쑤저우) 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 제조 방법과 용도를 개시하였다. 상기 항체는 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 선행기술에 비해, 본 발명의 항체의 결합 친화력, ADCC, CDC, 성장 억제 효과, 내재화 활성 등은 현저한 장점을 갖는다.

Description

CLDN18.2를 표적으로 하는 항체, 이의 제조 방법 및 이의 용도
관련된 출원의 상호참조
본원 발명은 출원일이 2019/9/30인 중국 특허 출원 2019109413163의 우선권을 주장한다. 본원 발명은 상기 중국 특허 출원의 전체를 인용한다.
본 발명은 생물 의약 분야에 관한 것으로, 특히 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 및 이의 제조 방법과 용도에 관한 것이다.
암은 오늘날 인류에게 가장 치명적인 질환 중 하나이다. 2018년 세계보건기구(WHO) 보고서에 따르면, 매년 약 1807만건의 암 사례가 발생한다. 암으로 인해 매년 약 955만명이 사망한다. WHO의 추정에 따르면, 위암은 전세계적으로 다섯번째로 많이 진단되는 암이다. 위암은 암 관련 사망의 세번째(남성의 경우) 및 네번째(여성의 경우) 병인이다. 전세계적으로 매년 100만명의 새로운 위암 환자가 진단되고 있고, 미국에서 위암으로 진단된 환자의 약 35%는 전이성 위암이다. 진행성 위암으로 진단된 환자의 5년 생존율은 5%이고, 중앙 생존 기간은 약 6개월이다. 전이성/재발성 위암 환자를 치료하는 1차 약물은, ①HER2-neu 시험이 양성인 환자에게 트랜스투주맙(Transtuzumab)과 화학요법제를 병용하여 치료하는 경우; ②HER2-neu 시험이 음성인 환자에게 화학요법제로만 치료하는 경우로 구분되고, 그 치료 효과는 좋지 않다(Front Pharmacol. 2018 Sep 13; 9: 404).
CLDN18(클라우딘18, Claudin18) 분자 스플라이스 변이체1(CLD18A1, 즉 CLDN18.1)의 Genbank수탁번호는 NP_057453, NM016369이고, 스플라이스 변이체2(CLD18A2, 즉 CLDN18.2)의 Genbank수탁번호는 NM_001002026, NP_001002026)이며 분자량이 약 27.9/27.72kD인 고유의 막관통 단백질이다. 클라우딘은 상피와 내피의 치밀한 연결부에 위치한 고유의 막 단백질이다. 다른 두 개의 주요한 치밀 결합 패밀리 단백질은 오클루딘(occludin) 및 연결 접착 분자(JAM)이다. 클라우딘은 치밀 결합의 필수 성분으로, 상피 세포 극성을 유지하고, 세포 주변 확산을 제어하며, 세포 성장과 분화를 조절하는데 중요한 역할을 한다. 추측에 따르면, 클라우딘은 구조가 우수한 상피에서 항체에 거의 접근할 수 없지만 종양 세포에서는 노출된다. 클라우딘 분자는 세포막을 4회 통과하고, N단 및 C단은 모두 세포질에 있게 된다. 여기서, 인간CLDN18.2(클라우딘18.2, Claudin 18.2) 단백질은 하나의 막관통 단백질로서, 전장는 261개의 아미노산이고, 여기서 1 내지 23은 신호 펩타이드이며; 그 중 두 개의 막외 영역은 각각 신호 펩타이드 뒤에 약 55개의 아미노산의 세포외 루프1(Extracellular loop 1, ECL1) 및 23개의 아미노산ECL2이다. CLDN18.1(클라우딘18.1, Claudin 18.1) 및 CLDN18.2는 1번째 TM 및 루프1(즉 ECL1)을 포함하는 N단의 처음 21개 아미노산에서 차이가 존재하지만 C단의 1차 단백질 서열은 동일하다. 인간CLDN18.2와 인간CLDN18.1의 ECL1영역은 매우 유사하고, 인간CLDN18.2와 인간CLDN18.1의 ECL2영역은 완전히 동일하다. 따라서 인간CLDN18.2 단백질 표적에 대한 항체의 개발은 인간CLDN18.2 단백질의 ECL1영역 또는 공간 구조에 대한 항체를 찾아야 한다. 이것은 이 분야의 작업을 더 어렵게 한다. CLDN18.1은 정상 폐 및 위의 상피에서 선택적으로 발현된다(Mol Cell Biol. 2001 Nov;21(21):7380-90.). 정상 조직에서 CLDN18.2의 발현은 매우 제한되고, 위 상피의 분화된 세포에만 한정되지만 위 줄기세포 영역에는 존재하지 않는다. 그러나 위, 식도, 췌장과 폐 종양 및 인간 암 세포계를 포함하는 여러 암 유형에서 강력하게 발현된다. 상기 단백질의 분자량은 일부 암 및 인접한 정상 조직에서 상이하다. 건강한 조직에서 관찰되는 고분자량의 단백질은 디글리코실화 화합물 PNGaseF로 조직 용해물을 처리하여 암에서 관찰되는 것과 동일한 분자량으로 전환될 수 있다. 이것은 클라우딘이 정상 조직 대응물에 비해 암에서 N-글리코실화가 적음을 시사한다. 이러한 구조 차이는 변경된 에피토프를 생성할 가능성이 있다. 전형적인 N-글리코실화 모티프는 상기 분자 루프 D3 도메인의 116번째 위치의 아미노산에 있다(CN103509110B).
현재 Claudiximab(IMAB362) 항체(WO 2014/146672 참조)만이 인간CLDN18.2 항체 연구를 위한 임상 시험 단계에 있다. IMAB362는 ADCC(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity, 항체 의존 세포에 의해 매개된 세포 독성) 효과와 CDC(complement dependent cytotoxicity, 보체 의존 세포 독성) 효과를 유도하고, 종양 사멸을 매개할 수 있다. IMAB362는 진행성 위식도암 채료에 대한 I상 및 II상 임상 시험에서 고무적인 효능을 나타냈다(Eur J Cancer. 2018 Sep; 100:17-26). 그러나 IMAB362는 인간, 뮤린의 키메라 항체로, 면역 원성의 위험성이 있고, 친화력이 높지 않다. 세포학적 실험에 따르면 내재화 활성이 약하여 ADC 개발에 적합하지 않고, 치료 효과가 극히 제한적이다. 다수의 악성 종양에 대한 충족되지 않은 의학적 요구로 인해, 보다 바람직한 약리학적 특성을 갖는 다른 CLDN18.2 항체가 필요하다. 따라서, 인간CLDN18.2 단백질을 표적으로 하는 효과적인 항체, 특히 완전한 인간 항체, 및 세포 결합 활성, ADCC활성, CDC활성, 성장 억제 효과, 내재화 활성이 보다 우수한 항체가 본 분야에 부족하다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 본 분야에서 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체가 결실된 흠결을 극복하기 위하여, CLDN18.2(인간 클라우딘18.2)를 표적으로 하는 항체 및 이의 제조 방법과 용도를 제공하였다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제1양태는 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 경쇄 가변 영역(VL) 및/또는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며; 여기서, 상기 HCDR1은 서열번호(SEQ ID NO) 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체1을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 16 및 이의 변이체2, 서열번호 18 및 이의 변이체3으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 HCDR3은 서열번호 26 내지 29 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 42로 표시되는 서열 또는 이의 변이체4를 포함하며, 상기 LCDR2는 서열번호 47로 표시되는 서열 또는 이의 변이체5를 포함하고, 상기 LCDR3은 서열번호 55로 표시되는 서열 또는 이의 변이체6을 포함하며; 상기 변이체는 원래 서열 기초 상에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 수행하고, 상기 변이체를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 CLDN18.2와의 결합 능력을 유지한다.
"3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는" 것과 유사하게, "아미노산 돌연변이"는 원래 아미노산 서열과 비교하여, 변이체의 서열에 원래 아미노산 서열의 기초 상에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 대체가 발생하는 것을 포함하는 아미노산의 돌연변이가 존재하는 것을 지칭한다. 예시적인 해석은 CDR에 대한 돌연변이는 3개, 2개 또는 1개의 아미노산의 돌연변이를 포함할 수 있고, 이러한 CDR 사이에서 동일하거나 상이한 개수의 아미노산 잔기를 임의로 선택하여 돌연변이시킬 수 있으며, 예를 들면 CDR1에 대해 1개의 아미노산의 돌연변이를 수행할 수 있고, CDR2 및 CDR3에 대해 아미노산 돌연변이를 수행하지 않는다.
본 발명에서, 상기 돌연변이는 현재 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 돌연변이를 포함할 수 있고, 예를 들면 항체의 생산 또는 응용 과정에서, 항체에 대한 일부 돌연변이, 예를 들면 존재할 수 있는, 특히 CDR 영역의 전사 후 변형(Potential post-translational modifications, PTMs)된 사이트를 돌연변이시킬 수 있으며, 항체의 응집, 탈아미드화 민감성(asparaginedeamidation, 사이트(NG, NS, NH 등), 아스파르트산 이성질체화(DG, DP) 민감 사이트, N글리코실화(N-{P}S/T) 민감 사이트 및 산화에 민감한 사이트와 같은 관련 돌연변이를 포함한다.
상술한 "변이체"에 관련하여, 여기서,
상기 변이체1의 돌연변이는 바람직하게 적어도 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열의 6번째 위치 및/또는 7번째 위치에서 발생한다.
상기 변이체2의 돌연변이는 바람직하게 적어도 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열의 5번째 위치에서 발생한다.
상기 변이체3의 돌연변이는 바람직하게 적어도 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열의 3번째 위치에서 발생한다.
상기 변이체4의 돌연변이는 바람직하게 적어도 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열의 8번째 위치 및/또는 9번째 위치에서 발생한다.
상기 변이체5의 돌연변이는 바람직하게 적어도 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 위치 및/또는 4번째 위치에서 발생한다.
상기 변이체6의 돌연변이는 바람직하게 적어도 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열의 3번째 내지 5번째 위치 중 하나 또는 여러 위치에서 발생한다.
바람직하게는, 상기 변이체1은 돌연변이 S6G 및/또는 Y7F를 함유하고, 상기 변이체2는 돌연변이 G5R을 함유하며, 상기 변이체3은 돌연변이 D3E를 함유하고, 상기 변이체4는 돌연변이 S8R 및/또는 N9Y를 함유하며, 상기 변이체5는 돌연변이 G1D 및/또는 T4N을 함유하고, 상기 변이체6은 돌연변이 Y3R/N, N4S 및 N5Y 중 하나 또는 복수개를 함유한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 변이체1의 아미노산 서열은 서열번호 6 또는 7로 표시된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 변이체2의 아미노산 서열은 서열번호 17로 표시되고;
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 변이체3의 아미노산 서열은 서열번호 19로 표시되며;
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 변이체4의 아미노산 서열은 서열번호 40 또는 41로 표시되고;
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 변이체5의 아미노산 서열은 서열번호 48로 표시되며;
본 발명의 하나의 바람직한 실시형태에서, 상기 변이체6의 아미노산 서열은 서열번호 56 내지 58 중 어느 하나로 표시된다.
본 발명의 하나의 보다 바람직한 실시형태에서, 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 17로 표시되며 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 27로 표시되고; 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시되며, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 18로 표시되고 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 28로 표시되며; 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시되며 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 29로 표시되거나; 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 19로 표시되며 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 28로 표시되고/거나;
상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 41로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48로 표시되며 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 56으로 표시되고; 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 42로 표시되며, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 57로 표시되며; 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 42로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 47로 표시되며 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 55로 표시되거나; 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 42로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 47로 표시되며 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 58로 표시된다.
바람직하게는, 상기 VH는 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역(VH FWR)을 더 포함하고/거나, 상기 VL은 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역(VL FWR)을 더 포함하며;
보다 바람직하게는, 상기 VH FWR은 인간 항체 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역이고, 상기 VL FWR은 인간 항체의 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역이다. 여기서,
상기 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역을 코딩하는 유전자는 바람직하게 생식계열 V유전자 IGHV3-23으로부터 유래되고; 바람직하게는, 상기 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역에서, HFR1은 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하며, HFR2는 서열번호 10 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, HFR3은 서열번호 21 내지 24 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하며, HFR4는 서열번호 31 내지 33 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
상기 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역을 코딩하는 유전자는 바람직하게 생식계열 V유전자 IGKV3-11 또는 IGKV3-15로부터 유래되고;
바람직하게는, 상기 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역에서, LFR1은 서열번호 35 내지 38 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하며, LFR2는 서열번호 44 또는 45로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, LFR3은 서열번호 50 내지 53 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하며, LFR4는 서열번호 60 또는 61로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
본 발명의 가장 바람직한 실시형태에서, 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 17로 표시되며, 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 27로 표시되고, 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 41로 표시되며, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 48로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 56으로 표시되며;
상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 18로 표시되며, 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 28로 표시되고, 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 42로 표시되며, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 57로 표시되며;
상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시되며, 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 29로 표시되고, 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 42로 표시되며, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 55로 표시되며;
상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시되며, 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 29로 표시되고, 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 42로 표시되며, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 58로 표시되며;
또는, 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 19로 표시되며, 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 28로 표시되고, 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 42로 표시되며, 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 57로 표시된다.
본 발명의 하나의 구체적인 실시형태에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 64로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하며;
상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 73으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하며;
상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 72로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하며;
상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 68로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 74로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하거나;
상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 66으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 72로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하되;
여기서, 상기 변이체는 적어도 돌연변이 전의 서열의 기능을 유지하고, 상기 변이체와 돌연변이 전의 서열의 동일성은 적어도 85%이며, 바람직하게는 적어도 90%이고, 보다 바람직하게는 적어도 95%이며, 보다 더 바람직하게는 적어도 99%이다.
본원 발명에서, 상기 열거된 CDR의 아미노산 서열은 모두 Chothia 정의 규칙에 따라 표시된다(본 발명의 특허청구범위에서도 Chothia 정의 규칙에 따라 표시된 서열). 그러나, 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 본 분야에서 서열 가변성에 기반한 Kabat 정의 규칙(Kabat 등, 면역학의 단백질 서열, 제5버전, 미국 국립보건원, 베데스다, 메릴랜드주(1991) 참조)과 구조적 루프 영역 위치에 기반한 Chothia 정의 규칙(JMol Biol 273:927-48,1997 참조)과 같은 다양한 방법을 통해 항체의 CDR를 정의할 수 있다는 것을 알 수 있다. 본원 발명에서, 또한 Kabat 정의 및 Chothia 정의를 포함하는 Combined 정의 규칙을 사용하여 가변 도메인 서열의 아미노산 잔기를 결정할 수 있다. 여기서 Combined 정의 규칙은 Kabat 정의 및 Chothia 정의의 범위를 결합하는 것으로, 이를 기반으로 더 큰 범위를 선택하였고, 상세하게는 표 1-1을 참조한다. 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 달리 명시되지 않는 한, 용어 주어진 항체 또는 이의 영역(예를 들면 가변 영역)의 "CDR" 및 "상보성 결정 영역"은 본 발명에서 설명하는 상기 공지된 방법 중 임의의 하나에 의해 정의된 바와 같은 상보성 결정 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 특허청구범위에서 청구된 보호 범위는 Chothia 정의 규칙에 기반하여 표시되는 서열이지만 다른 CDR의 정의 규칙에 대응되는 아미노산 서열도 본 발명의 보호범위에 속하여야 한다.
[표 1-1]
본원 발명의 항체 CDR 정의 방법(http://bioinf.org.uk/abs/를 참조할 수 있음)
Figure pct00001
여기서, Laa-Lbb는 항체 경쇄의 N단에서 시작하고, aa번째 위치에서 bb번째 위치까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있으며; Haa-Hbb는 항체 중쇄의 N단에서 시작하고, aa번째 위치에서 bb번째 위치까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들면, L24 내지 L34는 항체 경쇄의 N단에서 시작하고, Chothia 코딩 규칙에 따라 24번째 위치에서 34번째 위치까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있으며; H26 내지 H32는 항체 중쇄의 N단에서 시작하고, Chothia 코딩 규칙에 따라 26번째 위치에서 32번째 위치까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자는, Chothia로 CDR을 코딩할 경우, 일부 위치에 삽입 사이트가 있는 경우가 있을 수 있음을 알 수 있고, 예를 들면 본 발명에서 서열번호 17로 표시되는 VH CDR2 아미노산 서열은, 52번째 위치 다음에 52A가 삽입되는 경우가 있으며, 하기 표 1-2에 나타낸 바와 같다.
[표 1-2]
Figure pct00002
바람직하게, CLDN18.2를 표적으로 하는 상기 항체는 항체 중쇄 불변 영역 및 항체 경쇄 불변 영역을 더 포함하되; 보다 바람직하게, 상기 중쇄 불변 영역은 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4 또는 이의 돌연변이로부터 선택되고, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 항체의 경쇄 κ사슬 또는 λ사슬 또는 이의 돌연변이로부터 선택되며;
보다 더 바람직하게, 상기 중쇄 불변 영역은 hIgG1이고, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 항체의 경쇄 κ사슬이다.
바람직하게, CLDN18.2를 표적으로 하는 상기 항체는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv(single chain antibody fragment, 단일 사슬 항체), 이중 특이성 항체, 다중 특이성 항체, 중쇄 항체 또는 단일 도메인 항체이거나, 상기 항체에 의해 제조된 단일 클론 항체 또는 다중 클론 항체이다. 상기 단일 클론 항체는 하이브리도마 기술, 파지 디스플레이 기술, 단일 림프구 유전자 클로닝 기술을 포함하는 다양한 경로 및 기술에 의해 제조될 수 있고, 주로 하이브리도마 기술을 통해 야생형 또는 유전자 변형된 마우스로부터 단일 클론 항체를 제조한다.
CLDN18.2를 표적으로 하는 상기 항체가 이중 특이성 항체일 경우, 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역을 포함할 수 있다. 상기 제1 단백질 기능 영역은 상기 단백질일 수 있고, CLDN18.2에 표적화 결합하며; 상기 제2 단백질 기능 영역은 CLDN18.2에 비표적화 결합하는 단백질이거나 마찬가지로 CLDN18.2에 표적화 결합하지만 본 발명의 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체가 아니다. 여기서, 상기 제1 단백질 기능 영역은 면역 글로불린일 수 있고, 상기 제2 단백질 기능 영역은 하나 또는 복수개의 scFv일 수 있거나; 상기 제2 단백질 기능 영역은 면역 글로불린일 수 있으며, 상기 제1 단백질 기능 영역은 하나 또는 복수개의 scFv일 수 있다.
바람직하게, CLDN18.2를 표적으로 하는 상기 항체는 전장 항체이고, 상기 전장 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 상기 중쇄는 서열번호 77 내지 90 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 93 내지 96 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
보다 구체적인 실시형태에서, 상기 중쇄는 서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 78로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 95로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 82로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 96으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 80으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 86으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 95로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 96으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며; 상기 중쇄는 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 95로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 중쇄는 서열번호 90으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 서열번호 96으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 이하 표 1-3을 사용하여 예시적인 항체의 서열 번호를 요약하였다.
[표 1-3]
Figure pct00003
참고: 상기 표에서 숫자는 서열 목록에 있는 각 항체 또는 이의 기능적 단편의 서열번호 를 대표하고, 항체 명칭은 항체 구조에 어떠한 한정도 하지 않는다. 상기 돌연변이는 상기 VL 및/또는 VH의 아미노산 서열에 하나 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 치환 또는 첨가가 발생하였고, 상기 돌연변이의 아미노산 서열은 상기 VL 및/또는 VH의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 가지며, 상기 항체와 CLDN18.2의 결합을 유지 또는 개선하였고; 상기 적어도 85% 서열 동일성은 바람직하게 적어도 90% 서열 동일성이며; 보다 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성이고; 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성이다.
본 발명에서, "Fab단편"는 한 가닥의 경쇄 및 한 가닥의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다. "Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2도메인을 포함하는 두 개의 중쇄 단편을 함유한다. 두 개의 중쇄 단편은 두 개 또는 복수개의 이황화 결합 및 CH3도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다. "Fab'단편"는 한 가닥의 경쇄 및 VH도메인과 CH1도메인 및 CH1과 CH2도메인 사이의 영역을 포함하는 한 가닥의 중쇄의 일부를 함유함으로써 두 개의 Fab'단편의 두 가닥의 중쇄 사이에 사슬 사이의 이황화 결합을 형성하여 F(ab')2분자를 형성한다. "F(ab')2단편"는 두 가닥의 경쇄 및 CH1과 CH2도메인 사이의 불변 영역의 일부를 포함하는 두 가닥의 중쇄를 함유함으로써 두 가닥의 중쇄 사이에 사슬 사이의 이황화 결합을 형성한다. 따라서, F(ab')2단편은 두 개의 중쇄 사이의 이황화 결합에 의해 함께 유지된 두 개의 Fab'단편으로 구성된다. 용어 "Fv"는 항체의 외팔(one-armed)의 VL 및 VH도메인으로 구성되지만 불변 영역이 결실된 항체 단편을 의미한다.
본 발명에서, 상기 scFv(single chain antibody fragment, 단일 사슬 항체)는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 15개 내지 20개의 아미노산의 짧은 펩타이드를 포함하는 본 분야의 통상적인 단일 사슬 항체일 수 있다. 여기서 VL 및 VH도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬로 생성될 수 있도록 하는 링커의 쌍에 의해 1가 분자를 형성한다[예를 들면, Bird 등, Science 242:423-426 (1988) 및 Huston 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988) 참조]. 이러한 scFv분자는 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH와 같은 일반 구조를 가질 수 있다. 적합한 선행기술의 링커는 중복되는 G4S아미노산 서열 또는 이의 변이체로 구성된다. 예를 들면, 아미노산 서열(G4S)4 또는 (G4S)3을 갖는 링커를 사용할 수 있지만 이의 변이체도 사용할 수 있다.
용어 "다중 특이성 항체"는 다중 에피토프에 대한 특이성을 갖는 항체를 포괄하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 이러한 다중 특이성 항체는, VH-VL 유닛이 다중 에피토프 특이성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체; 매 하나의 VH-VL 유닛이 상이한 표적 또는 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합하는 두 개 또는 복수개의 VL 및 VH영역을 갖는 항체; 매 하나의 단일 가변 영역이 상이한 표적 또는 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합하는 두 개 또는 더 많은 단일 가변 영역을 갖는 항체; 전장 항체, 항체 단편, 이중 특이성 항체(diabodies), 및 삼중 항체(triabodies), 공유적 또는 비공유적으로 함께 연결된 항체 단편 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 단일 클론 항체를 포함한다. 본 발명의 단일 클론 항체 또는 mAb 또는 Ab는, 단일 클론 세포주로부터 얻은 항체를 지칭하고, 상기 세포주는 진핵 세포주, 원핵 세포주 또는 파지 클론 세포주에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 상기 "중쇄 항체"는 하나의 중쇄 가변 영역(VHH) 및 두 개의 통상적인 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 항체를 지칭하고, 또한 HCAbs라고 지칭한다.
본 발명에서, 상기 "단일 도메인 항체"는 또한 "나노 항체"라고 지칭하고, 중쇄 항체로부터 클로닝된 VHH 구조를 지칭하며, 표적 항원에 결합할 수 있는 공지된 가장 작은 단위이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제2양태는 본 발명의 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체를 포함하는 분리된 핵산을 제공하였다.
상기 핵산의 제조 방법은 본 분야의 통상적인 제조 방법이고, 바람직하게는, 유전자 클로닝 기술을 통해 상기 항체를 코딩하는 핵산 분자를 수득하거나, 인공적인 전체 서열 합성 방법을 통해 상기 항체를 코딩하는 핵산 분자를 얻는 단계를 포함한다.
본 분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 상기 항체를 코딩하는 아미노산 서열의 염기 서열은 대체, 결실, 변경, 삽입 또는 증가를 적절하게 인입하여 하나의 폴리뉴클레오티드의 동족체를 제공할 수 있다. 본 발명에서 폴리뉴클레오티드의 동족체는 항체 활성을 유지하는 범위에서 상기 항체 서열 유전자를 코딩하는 하나 또는 복수개의 염기를 대체, 결실 또는 증가하여 제조할 수 있다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제3양태는 본 발명의 제2양태에 따른 분리된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하였다.
상기 재조합 발현 벡터는 본 분야의 통상적인 방법, 즉, 본 발명의 핵산 분자를 다양한 발현 벡터에 연결시켜 수득할 수 있다. 상기 발현 벡터는 전술한 핵산 분자를 수용할 수 있는 한, 본 분야의 통상적인 다양한 벡터이다.
바람직하게는, 상기 재조합 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지 또는 바이러스 벡터이고, 상기 바이러스 벡터는 바람직하게 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 연관 바이러스 벡터이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제4양태는 본 발명의 제3양태에 따른 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 포함하는 형질전환체를 제공하였다.
상기 재조합 발현 형질전환체의 제조 방법은, 본 분야의 통상적인 제조 방법일 수 있고, 예를 들면, 상기 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 형질전환시켜 제조한다. 상기 숙주 세포는 본 분야의 통상적인 다양한 숙주 세포이고, 상기 재조합 발현 벡터가 안정적으로 자가 복제되는 것을 충족시킬 수 있으며, 운반되는 상기 핵산이 효과적으로 발현될 수 있으면 된다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 E.coli TG1 또는 BL21세포(단일 사슬 항체 또는 Fab항체 발현)이거나, CHO-K1세포(전장 IgG항체 발현)이다. 전술한 재조합 발현 플라스미드를 숙주 세포에 형질전환시키면 본 발명의 바람직한 재조합 발현 형질전환체를 얻을 수 있다. 여기서 상기 형질전환 방법은 본 분야의 통상적인 형질전환 방법이고, 바람직하게는 화학적 형질전환법, 열충격법 또는 전기 천공법이다.
본 발명에서, CLDN18.2를 표적으로 하는 상기 항체는 키메라 항원 수용체(CAR) 등을 제조하는데 사용될 수 있음으로써 T세포 또는 NK세포와 같은 세포에서 변형시킨다. 본 발명은 본 발명의 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들면, 세포외 항원 결합 도메인으로서 CLDN18.2를 표적으로 하는 상기 항체의 scFv를 사용하는 키메라 항원 수용체이다. 따라서, 상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제5양태는 본 발명의 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체를 포함하는 유전자 변형된 세포를 제공하였다.
바람직하게, 상기 유전자 변형된 세포는 진핵 세포이고, 바람직하게는 분리된 인간 세포이며; 보다 바람직하게는 T세포(예를 들면 CAR-T의 형태), 또는 NK세포와 같은 면역 세포이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제6양태는 본 발명의 제4양태에 따른 형질전환체를 배양하고, 배양물로부터 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체를 수득하는 단계를 포함하는 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체의 제조 방법을 제공하였다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제7양태는 세포 독성제, 및 본 발명의 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체를 포함하는 항체 약물 접합체(ADC)를 제공하였다.
상기 세포 독성제는 바람직하게 세포 독소, 화학 치료제, 방사성 동위원소, 치료용 핵산, 면역 조절제, 항혈관 신생제, 항증식제 및 세포사멸 촉진제 또는 세포 용해 효소이고; 보다 바람직하게, 상기 세포독성제는 튜불린 생성효소 억제제――메틸아우리스타틴F(MMAF), 또는 메틸아우리스타틴E(MMAE)이다.
상기 항체 약물 접합체의 제조 방법은 본 분야의 통상적인 방법일 수 있고, 바람직하게는 Doronina, 2006, Bioconjugate Chem.17,114-124에 기재된 제조 방법을 사용한다. 바람직하게, 상기 제조 방법은 10% 미만의 최소 낮은 공분수(LCF)를 갖는 항체 약물 접합체이다.
상기 항체 약물 접합체는 본 분야의 공지된 임의의 물리적 형태, 바람직하게는 투명한 용액으로 존재할 수 있다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제8양태는 본 발명의 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 및/또는 본 발명의 제7양태에 따른 항체 약물 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하였다.
상기 약학 조성물은 바람직하게 다른 항종양 항체를 활성 성분으로 더 포함하고/거나, 호르몬 제제, 표적화된 소분자 제제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양 용해제, 세포 독성제, 사이토카인, 공동 자극 분자의 활성화제, 억제성 분자의 억제제 및 백신으로 이루어진 군 중 하나 또는 여러 가지를 포함한다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 본 분야의 통상적인 담체일 수 있고, 상기 담체는 임의의 적합한 생리학적 또는 약학적으로 허용 가능한 약물 보조제일 수 있다. 상기 약물 보조제는 본 분야의 통상적인 약물 보조제이고, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 부형제, 충진제, 안정제 또는 희석제 등을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 약학 조성물은 0.01% 내지 99.99%의 상기 단백질 및/또는 상기 항체 약물 접합체, 및 0.01% 내지 99.99%의 약용 담체를 포함하고, 상기 백분율은 상기 약학 조성물에서 차지하는 질량 백분율이다.
바람직하게, 상기 약학 조성물은 항종양 약물이다. 보다 바람직하게는 위암, 식도암, 폐암, 난소암, 흑색종, 신장암, 유방암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 방광암, 두경부암, 기관지암, 신경교종 및/또는 백혈병을 치료하는 약물이다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 바람직하게 비경구 투여, 주사 투여 또는 경구 투여이다. 상기 주사 투여는 바람직하게 정맥 주사, 근육 주사, 복강 주사, 피내 주사 또는 피하 주사 등 경로를 포함한다. 상기 약학 조성물은 본 분야의 통상적인 다양한 제형이고, 바람직하게는 고체, 반고체 또는 액체 형태이며, 즉 수용액, 비수용액 또는 현탁액일 수 있고, 보다 바람직하게는 정제, 캡슐, 과립제, 주사제 또는 주입제 등이다. 보다 바람직하게는 혈관내, 피하, 복강내 또는 근육내 투여된다. 바람직하게, 상기 약학 조성물은 또한 에어로졸 또는 거친 스프레이로서 투여될 수 있고, 즉 비강 투여되거나; 척추강내, 골수내 또는 심실내 투여된다. 보다 바람직하게, 상기 약학 조성물은 투피, 경피, 국소, 장내, 질내, 설하 또는 직장 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량 수준은 원하는 진단 또는 치료 결과를 달성하는 조성물의 양에 근거하여 조정할 수 있다. 투여 방법은 또한 단일 주사 또는 다중 주사, 또는 조정할 수 있다. 선택된 투여량 수준 및 방법은 상기 약학 조성물을 포함하는 활성 및 안정성(즉, 반감기), 제제, 투여 경로, 다른 약물 또는 치료와의 조합, 검출 및/또는 치료할 질환 또는 병증, 및 치료할 피험자의 건강 상태 및 과거 진료 기록 등 다양한 요인에 의존하여 합리적으로 조정한다.
본 발명의 약학 조성물에 대한 치료 유효량은 세포 배양 실험 또는 설치류 동물, 토끼, 개, 돼지 및/또는 영장류 동물과 같은 동물 모델에서 최초로 추정할 수 있다. 동물 모델은 또한 적합한 투여 농도 범위와 경로를 측정하는데 사용될 수 있다. 그런 다음, 인간에게 투여된 유용한 투여량 및 경로를 결정하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 투여 유효량 또는 투여량의 결정과 조정 및 이러한 조정을 수행하는 시기 및 방법의 평가는 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 것이다.
병용 요법의 경우, CLDN18.2를 표적으로 하는 상기 항체, 상기 항체 약물 접합체 및/또는 별도의 치료제 또는 진단제는 각각 단일 약제로서, 원하는 치료 또는 진단을 수행하기에 적합한 시간 범위 내에서 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 단일 약제는 기본적으로 동시에(즉 단일 제제로서 또는 몇분 또는 몇시간 내) 또는 순서에 따라 연속적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 이러한 단일 약제는 1년 이내, 또는 10, 8, 6, 4 또는 2개월 이내, 또는 4, 3, 2, 또는 1주 이내, 또는 5, 4, 3, 2 또는 1일 이내에 투여될 수 있다.
제제, 투여량, 투여 방법 및 측정 가능한 치료 결과 결과에 대한 별도의 지도는, Berkow 등 (2000)The Merck Manual of Medical Information(Merck 의학 정보 메뉴얼) 및 Merck&Co.Inc., Whitehouse Station, New Jersey; Ebadi (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology(임상 약리학 메뉴얼) 등 저작을 참조한다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제9양태는 종양을 진단, 예방 및/또는 치료하는 약물을 제조하기 위한 본 발명의 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체, 본 발명의 제7양태에 따른 항체 약물 접합체 및/또는 본 발명의 제8양태에 따른 약학 조성물의 용도를 제공하였다.
바람직하게, 상기 종양은 CLDN18.2양성 종양이고; 보다 바람직하게, 상기 종양은 위암, 식도암, 폐암, 흑색종, 신장암, 유방암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 방광암, 신경교종 및/또는 백혈병이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 종양을 진단, 예방 및/또는 치료하는 본 발명의 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체, 본 발명의 제7양태에 따른 항체 약물 접합체 및/또는 본 발명의 제8양태에 따른 약학 조성물의 용도를 더 제공하였다. 바람직하게는, 상기 종양은 본 발명의 제9양태에 기재된 바와 같다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제10양태는 키트A 및 키트B를 포함하는 키트 세트를 제공하는데, 상기 키트A는 본 발명의 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체, 및/또는 본 발명의 제7양태에 따른 항체 약물 접합체, 및/또는 본 발명의 제8양태에 따른 약학 조성물이고; 상기 키트B는 다른 항종양 항체 또는 상기 다른 항종양 항체를 포함하는 약학 조성물을 함유하며, 상기 키트B는 또한 화학요법제, 종양 용해제, 세포 독성제, 사이토카인, 공동 자극 분자의 활성화제, 억제성 분자의 억제제, 백신, 영상화제, 진단제, 호르몬 제제, 표적화된 소분자 제제, 프로테아좀 억제제 등을 함유할 수 있거나, 상기 키트B는 다른 항종양 항체 또는 상기 다른 항종양 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 호르몬 제제, 표적화된 소분자 제제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양 용해제, 세포 독성제, 사이토카인, 공동 자극 분자의 활성화제, 억제성 분자의 억제제, 백신 등을 동시에 함유할 수 있다. 상기 키트A와 키트B를 동시에 사용할 수 있거나, 먼저 키트A를 사용한 다음 키트B를 사용할 수 있고, 또한 먼저 키트B를 사용한 다음 키트A를 사용할 수 있으며, 구체적인 응용 시의 실제 요구 사항에 근거하여 결정할 수 있다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체, 본 발명의 제5양태에 따른 유전자 변형된 세포, 본 발명의 제7양태에 따른 항체 약물 접합체 및/또는 본 발명의 제8양태에 따른 약학 조성물은 또한 호르몬 제제, 표적화된 소분자 제제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양 용해제, 세포 독성제, 사이토카인, 공동 자극 분자의 활성화제, 억제성 분자의 억제제, 백신 등 및/또는 다른 항종양 항체(또는 상기 다른 항종양 항체를 포함하는 약학 조성물)와 같은 다른 약물과 병용하여 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 "CLDN18.2양성" 세포는 NUGC4_D8세포주와 같은 CLDN18.2단백질을 과발현하는 세포이고; 그렇지 않으면 "CLDN18.2음성" 세포라고 지칭한다.
본 발명의 제11양태는 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제7양태에 따른 항체 약물 접합체 또는 제8양태에 따른 약학 조성물을 투여하거나, 제10양태에 따른 키트 세트를 사용하여 필요로 하는 환자를 치료하는 단계를 포함하는 CLDN18.2에 의해 매개된 질환 또는 병증을 진단, 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하였다.
여기서 CLDN18.2에 매개되는 상기 질환 또는 병증은 종양일 수 있고, 바람직하게는 CLDN18.2양성 종양이며, 보다 바람직하게는 위암, 식도암, 폐암, 난소암, 흑색종, 신장암, 유방암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 방광암, 두경부암, 기관지암, 신경교종 및/또는 백혈병이다.
본 발명의 제12양태는 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제7양태에 따른 항체 약물 접합체 또는 제8양태에 따른 약학 조성물을 사용하는 단계를 포함하는 CLDN18.2의 면역 검출 또는 측정 방법을 제공하였다.
본 발명의 제13양태는 필요로 하는 환자에게 각각 제1양태에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제7양태에 따른 항체 약물 접합체 또는 제8양태에 따른 약학 조성물, 및 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함하되; 상기 제2 치료제는 바람직하게 다른 항종양 항체 또는 상기 다른 항종양 항체를 포함하는 약학 조성물, 및/또는 호르몬 제제, 표적화된 소분자 제제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양 용해제, 세포 독성제, 사이토카인, 공동 자극 분자의 활성화제, 억제성 분자의 억제제 및 백신으로 이루어진 군 중 하나 또는 다수를 포함하는 병용 요법을 제공하였다.
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 본문에 사용된 과학 및 기술 명사는 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 본문에 사용된 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 면역학 실험실 작업 단계는 모두 해당 분야에서 널리 사용되는 통상적인 단계이다. 동시에, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위하여, 이하 관련 용어의 정의 및 해석을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "가변"은 일반적으로 항체의 가변 도메인의 서열의 일부가 강하게 변화되고, 이는 특정 항원에 대한 다양한 특정 항체의 결합 및 특이성을 형성한다. 그러나, 변이성은 항체의 전체 가변 영역에 고르게 분포되지 않는다. 이는 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역(HVR)이라고 지칭되는 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 세 개의 단편에 집중되어 있다. 가변 도메인에서 더 많이 보존된 부분을 프레임워크(FWR)라고 지칭한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 네 개의 FWR영역을 포함하고, 대부분은 β-시트 구성이며, 세 개의 CDRs로 연결되어 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬의 CDRs는 FWR영역에 의해 매우 근접하고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 사이트를 형성하며, 불변 영역은 항체가 항원에 결합하는데 직접적으로 참여하지 않지만 이들은 항체 의존적 세포 독성에 참여하는 것과 같은 다른 효과 기능을 나타낸다.
본 발명에 사용된 아미노산에 대한 3문자 코드 및 1문자 코드는 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있거나, J. Biol. Chem, 243, p3558(1968)에 기재된 바와 같다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "포함" 또는 "포함"은 조성물 및 방법이 상기 원소를 포함하지만 다른 원소를 배제하지 않는 것을 지칭하고, 문맥의 이해에 근거하여, "????로 구성"되는 상황도 포함한다.
용어 "CLDN18.2"는 동종형, 포유 동물(예를 들면 인간)의 CLDN18.2, 인간CLDN18.2의 종 상동체 및 CLDN18.2와 적어도 하나의 공동 에피토프를 포함하는 유사체를 포함한다. CLDN18.2(예를 들면 인간CLDN18.2)의 아미노산 서열은 NCBI 데이터베이스에 나타난 바와 같이 본 분야에 공지된 것이다.
용어 "CLDN18.1"는 동종형, 포유 동물(예를 들면 인간)의 CLDN18.1, 인간CLDN18.1의 종 상동체 및 CLDN18.1와 적어도 하나의 공통 에피토프를 포함하는 유사체를 포함한다. CLDN18.1(예를 들면 인간CLDN18.1)의 아미노산 서열은 NCBI 데이터베이스에 나타난 바와 같이 본 분야에 공지된 것이다.
용어 "에피토프"는 항체 분자와 특이적으로 상호 작용하는 항원(예를 들면, 인간CLDN18.2)의 일부를 지칭한다. 용어 "경쟁"은 본 발명에서 표적(예를 들면, 인간CLDN18.2)에 대한 항CLDN18.2 항체 분자의 결합을 간섭하는 항체 분자의 능력을 지칭한다. 결합 작용에 대한 간섭은 직접적이거나 간접적일 수 있다(예를 들면, 항체 분자 또는 표적의 알로스테릭 조절 작용을 통해). 경쟁적 결합 측정법(예를 들면, FACS 측정법, ELISA 또는 BIACORE 측정법)으로 항체 분자가 표적에 대한 다른 항체 분자의 결합을 간섭할 수 있는 정도를 결정할 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"는 사슬간 이황화 결합으로 연결된 두 가닥의 동일한 중쇄 및 두 가닥의 동일한 경쇄로 구성된 테트라펩타이드 사슬 구조인 면역 글로불린을 포함한다. 면역 글로불린 중쇄 불변 영역의 아미노산 조성과 배열 순서가 상이하므로, 그 항원성도 상이하다. 이에 따라, 면역 글로불린을 5가지로 분류하거나, 면역 글로불린의 동종형, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 지칭될 수 있고, 이들의 상응한 중쇄는 각각 μ사슬, δ사슬, γ사슬, α사슬 및 ε사슬이다. 동일한 종류의 Ig는 이의 힌지 영역의 아미노산 조성 및 중쇄 이황화 결합의 개수와 위치의 차이에 근거하여, 또한 상이한 서브 클래스로 분류할 수 있되, 예를 들면 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 분류될 수 있다. 경쇄는 불변 영역의 차이에 의해 κ사슬 또는 λ사슬로 분류된다. 5가지 Ig에서 각 Ig는 모두 κ사슬 또는 λ사슬을 가질 수 있다,
본 발명에서, 본 발명의 항체 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있고, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 κ, λ사슬 또는 이의 변이체를 포함한다. 본 발명에서, 본 발명의 항체 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 인간IgG1, 2, 3, 4 또는 이의 변이체를 포함한다.
N단에 접근하는 항체 중쇄 및 경쇄의 약 110개의 아미노산의 서열 변화는 매우 크고, 가변 영역(V영역)이며; C단에 접근하는 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정하고, 불변 영역(C영역)이다. 가변 영역은 3개의 초가변 영역(HVR) 및 4개의 서열 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FWR)을 포함한다. 3개의 초가변 영역은 항체의 특이성을 결정하고, 또한 상보성 결정 영역(CDR)이라고 지칭한다. 각 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)은 3개의 CDR 영역과 4개의 FWR 영역으로 구성되고, 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 순차적으로 배열된 순서는 FWR1, CDR1, FWR2, CDR2, FWR3, CDR3, FWR4이다. 경쇄의 3개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고; 중쇄의 3개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다.
경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 약 3개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH)과 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인CL으로 구성된다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들면, 효과 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제1 조성성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개한다. VH 및 VL영역은 또한 프레임워크 영역(FWR)이라고 지칭되는 보다 보존된 영역이 산재된 높은 변동성 영역[상보성 결정 영역(CDR)이라고 지칭]으로 산포될 수 있다. 각 VH 및 VL은, FWR1, CDR1, FWR2, CDR2, FWR3, CDR3, FWR4의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열되는 3개의 CDR 및 4개의 FWR로 구성된다. 각 중쇄/경쇄에 대응되는 가변 영역(VH 및 VL)은 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 특히, 중쇄는 3개 이상, 예를 들면 6, 9 또는 12개의 CDR을 더 포함할 수 있다. 예를 들면 본 발명의 이중 특이성 항체에서, 중쇄는 IgG항체 중쇄의 N단에 다른 항체가 연결된 ScFv일 수 있고, 이 경우 중쇄는 9개의 CDR을 포함한다.
용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역 글로불린 서열의 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역 글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들면 체외 무작위 또는 사이트 특이적 돌연변이 유발 또는 체내 및 체외 세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 용어 "인간 항체"는 다른 포유 동물 종(예를 들면 마우스)의 생식계열로부터 유래된 CDR서열이 인간 골격 서열에 이식된 항체(즉 "인간화 항체")를 포함하지 않는다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 항체와 관련된 용어 "특이성"은 특이성 항원을 인식하지만 샘플의 다른 분자를 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들면, 하나의 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종의 상기 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 종간 교차 반응성은 그 자체로 특이성에 따른 항체 분류를 변경하지 않는다. 다른 구현예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 상기 항원의 상이한 대립형질 형태에도 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성 자체는 특이성에 따른 항체의 분류를 변경하지 않는다. 일부 경우, 용어 "특이성" 또는 "특이적 결합"은 항체, 단백질 또는 펩타이드와 두번째 화학물질의 상호 작용을 나타내는데 사용될 수 있고, 상기 상호 작용이 화학물질의 특정 구조(예를 들면, 항원은 클러스터 또는 에피토프를 결정)의 존재에 의해 결정되는 것을 의미하며; 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질이 아닌 특정 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 만약 항체가 에피토프"A"에 특이성을 가지면 표지된 "A"와 항체를 함유하는 반응에서, 에피토프A를 함유하는 분자(또는 유리, 표지되지 않은 A)를 함유하는 존재는 항체에 결합하는 표지된 A의 양을 감소시킨다.
본문에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은, 항원에 결합할 수 있는 세포외 도메인(세포외 결합 도메인), 힌지 도메인, 막횡단 도메인(막횡단 영역) 및 세포질 신호를 도메인에 전달하도록 하는 폴리펩타이드(즉 세포내 신호 도메인)를 포함한다. 힌지 도메인은 세포외 항원 결합 영역에 유연성을 제공하는 부분으로 간주될 수 있다. 세포내 신호 영역은 결정된 신호 전달 경로를 통해 제2 메신저를 생성하여 세포 활성을 조절하기 위해 정보를 세포에 전달하는 단백질, 또는 이러한 메신저에 대응하여 이펙터로서 역할을 발휘하는 단백질을 지칭하고, CAR의 세포(예를 들면 CART세포)의 면역 이펙터 기능을 촉진할 수 있는 신호를 생성한다. 세포내 신호 도메인은 신호 전달 도메인을 포함하고, 공동 자극 분자로부터 유래된 공동 자극 세포내 도메인을 더 포함할 수 있다.
"동일성", "변이체 서열", "돌연변이"는 두 개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이 또는 두 개의 폴리펩타이드 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 두 개의 비교 서열의 위치가 모두 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브 유닛에 의해 점유될 경우, 예를 들면, 두 개의 DNA분자의 각 위치가 모두 아데닌에 의해 점유되면 상기 위치에서 상기 분자는 상동이다. 두 개의 서열 사이의 동일성 백분율은 두 개의 서열이 공유하는 일치 또는 상동 위치의 수를 비교되는 위치의 수Х100으로 나눈 함수이다. 예를 들면, 서열이 최적으로 정렬될 경우, 만약 두 개의 서열의 10개의 위치 중 6개가 일치하거나 상동이면 두 개의 서열은 60% 상동이다. 일반적으로, 두 개의 서열을 정렬하여 최대 동일성 백분율을 얻을 경우 비교한다. "최적화"는 항원에 대한 상기 항체의 결합을 유지하거나 개선한 돌연변이를 지칭하고, 본 발명에서, CLDN18.2에 대한 결합을 유지, 유지하거나 개선한 돌연변이를 지칭한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"(단일 사슬인 경우)은 본 발명에서 상호 교환하여 사용된다. 용어 "핵산", "핵산 서열”, "뉴클레오티드 서열” 또는 "폴리뉴클레오티드 서열” 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 교환하여 사용된다.
용어 "돌연변이"는 아미노산 또는 뉴클레오티드의 치환, 첨가 및/또는 결실을 포함하고, "아미노산 치환" 및 "보존적 아미노산 치환"은 각각 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기에 의한 치환 및 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의한 치환이다.
본문에 사용된 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과(Retroviridae family)의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스에서 특별하고; 이들은 현저한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있으므로, 유전자가 벡터를 전달하는 가장 효과적인 방법이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 구현예이다. 렌티바이러스에서 유래된 벡터는 체내에서 현저한 수준의 유전자 전이를 달성하는 수단을 제공하였다.
본문에 사용된 용어 "벡터"는 분리된 핵산을 포함하고 분리된 핵산을 세포 내부에 전달하는데 사용될 수 있는 조성물이다. 본 분야에 많은 벡터가 공지되었고, 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 및 양친성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 따라서, 용어 "벡터"는 자가 복제되는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 세포 내로 핵산의 전달을 촉진하는 비플라스미드 및 비바이러스성 화합물을 포함하고, 예를 들면 폴리리신 화합물, 리포솜 등이다. 바이러스 벡터의 구현예는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용된 표현 "세포", "세포계"는 상호 교환하여 사용될 수 있고, 모든 이러한 명칭은 모두 후대를 포함한다. 용어 "숙주 세포"는, 벡터를 도입하는데 사용할 수 있는 세포를 지칭하고, 대장균과 같은 원핵 세포, 효모 세포와 같은 진균, 또는 섬유아세포, CHO세포, COS세포, NSO세포, HeLa세포, BHK세포, HEK 293세포 또는 인간 세포와 같은 동물 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "형질감염"은 외인성 핵산을 진핵 세포로 도입하는 것을 지칭한다. 형질감염은 인산칼슘-DNA공침전, DEAE-포도당 매개 형질감염, 폴리브렌 매개 형질감염, 전기천공, 미세주입, 리포솜 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염 및 유전자총 기술(biolistics)을 포함하는 본 분야에 공지된 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
용어 "면역 세포"는 면역 응답을 유발할 수 있는 세포를 지칭하고, "면역 세포" 및 이의 다른 문법적 형태는 임의의 유래의 면역 세포를 지칭할 수 있다. "면역 세포"는 예를 들면, 골수에서 생성되는 조혈 줄기 세포(HSC)로부터 유래된 백혈구(백혈구), 림프구(T세포, B세포, 자연 살해(NK) 세포 및 골수 유래 세포(호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포)를 포함한다. 용어 "면역 세포"는 또한 인간 또는 비인간일 수 있다.
본문에 사용된 바와 같이, 용어 "T세포"는 흉선에서 성숙되는 림프구를 지칭한다. T세포는 세포 매개 면역에서 중요한 역할을 하고, 다른 림프구(예를 들면 B세포)와의 차이점은 세포 표면에 T세포 수용체가 존재하는 것이다. "T세포"는 CD3을 발현하는 모든 유형의 면역 세포를 포함하되, T헬퍼 세포(CD4+세포), 세포 독성 T세포(CD8+세포), 자연 살해 T세포, T조절 세포(Treg) 및 δT세포를 포함한다. "세포 독성 세포"는 CD8+ T세포, 자연 살해(NK) 세포 및 호중구를 포함하고, 이러한 세포는 세포 독성 반응을 매개할 수 있다. 본문에 사용된 바와 같이, 용어 "NK세포"는 골수에서 유래되고 선천 면역계에서 중요한 역할을 하는 림프구를 지칭한다. NK세포는 세포 표면에 항체 및 주요 조직적합성 복합체가 존재하지 않는 경우에도 바이러스에 감염된 세포, 종양 세포 또는 다른 스트레스 세포의 신속한 면역 반응을 제공한다.
예를 들면, 면역 세포는 자가 T세포, 동종 T세포, 자가 NK세포, 동종 NK세포와 같은 혈액 유래일 수 있거나, EBV바이러스 감염에 의해 제조된 NK세포계, 배아줄기세포 및 iPSC로부터 유도 및 분화된 NK세포 및 NK92세포계와 같은 세포계로부터 유래될 수 있다.
"선택적", "임의의 하나", "임의의" 또는 "어느 한 항"은 이후에 설명된 이벤트 또는 환경이 발생할 수 있지만 반드시 발생할 필요는 없음을 의미하고, 상기 설명은 상기 이벤트 또는 환경이 발생한 경우 또는 발생하지 않은 경우를 포함한다. 예를 들면, "선택적으로 1개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함"은 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있지만 반드시 존재할 필요는 없음을 의미한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "하나" 및 "한가지"는 본 발명에서 하나 또는 하나 이상의 문법적 대상을 지칭하기 위한 것이다. 내용이 명백하게 달리 언급되지 않는 한, 용어 "또는"은 본 발명에서 용어 "및/또는"을 의미하고 그와 상호 교환하여 사용된다. "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 특성 또는 정밀도를 고려할 때, 측정된 양의 허용 가능한 오차 정도를 의미한다. 예시적인 오차 정도는 일반적으로 10% 범위 이내이고 더 일반적으로 5% 범위 이내이다. 본 발명에 개시된 방법 및 조성물은 특정된 서열, 변이체 서열 또는 이와 기본적으로 동일하거나 유사한 서열, 예를 들면, 특정 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 핵산을 포함한다. 아미노산 서열의 경우, 용어 "기본적으로 동일한"은 본 발명에서 제1 아미노산 서열을 지칭하기 위해 사용된다.
본문에 사용된 용어 EC50은 절반 최대 효과 농도(concentration for 50% of maximal effect), 즉 50%의 최대 효과를 유도하는 농도를 지칭한다.
본 발명의 약학 조성물은 필요에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 환자의 종류, 연령, 체중 및 일반적인 질환 상황, 투여 방식과 같은 요인에 따라 의사가 투여할 수 있다. 투여 방식은 예를 들면 주사 또는 다른 치료 방식을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "항체 약물 접합체" 또는 "ADC"는 상호 교환하여 사용될 수 있다.
아우리스타틴은 완전 합성 약물이고, 물리적 특성과 약물 가능성 특성을 최적화하기 위해 화학적 구조를 변형하기가 상대적으로 용이하다. 항체와의 접합에 사용되는 아우리스타틴 유도체는 주로 모노메틸아우리스타틴E(MMAE) 및 모노메틸아우리스타틴F(MMAF)가 있고, 전자는 C-단에 2-아미노-1-페닐프로필-1-올이 첨가되어 합성된 천연 튜불린 중합 효소 억제제 돌라스타틴10(dolastatin-10)에서 유래된 합성 펜타펩타이드이다. 다양한 인간 종양 세포주에 대한 MMAE의 억제 활성은 1나노몰 미만이다. MMAE의 자가 세포 독성 활성을 감소시키기 위해, MMAF는 돌라스타틴10의 C-단에 페닐알라닌을 첨가하고, 구조에 카르복실기를 도입하기에MMAF의 세포막 투과성이 좋지 않으므로, 세포의 생물학적 활성이 현저히 저하되지만 세포에 대한 억제 활성은 항체와의 접합 후 크게 향상된다(US7750116).
일부 실시형태에서, 항체 세포 독성 약물 접합체 또는 약학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물은 하나 또는 복수개의 메이탄시노이드 분자에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다. 메이탄시노이드는 튜불린 다량체화를 억제하여 기능을 발휘하지 않은 유사 분열 억제제이다. 메이탄신은 최초 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)에서 분리되었다(미국 특허 No.3,896,111). 이후에 일부 미생물도 메이탄시놀 및 C-3메이탄시놀 에스테르와 같은 메이탄시노이드를 생성하는 것을 발견하였다(미국 특허 No.4,151, 042). 메이탄시노이드 약물 모이어티는 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티인데, 그 이유는 (i)발효 또는 발효 생성물의 화학적 변형 또는 유도체화에 의해 비교적 쉽게 제조할 수 있고; (ii)비-이황화 링커를 통해 항체에 접합하기에 적합한 작용기로 쉽게 유도체화되며; (iii)혈장에서 안정하고; (iv)다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문이다. 메이탄시노이드 약물 모이어티로서 사용하기에 적합한 메이탄신 화합물은 본 분야에 공지된 것이고, 공지된 방법에 따라 천연 공급원으로부터 분리하거나, 유전 공학 기술을 사용하여 생산할 수 있다(Yu 등 (2002)PNAS99: 7968-7973 참조). 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체는 또한 공지된 방법에 따라 합성 및 제조할 수 있다. 메이탄시노이드 약물 모이어티의 예시적인 실시형태는 본문에 개시된 바와 같은 DM1, DM3 및 DM4를 포함한다.
본 발명의 방법, 조성물, 병용 치료는 다른 활성제 또는 치료 방식과 조합될 수 있고, 상기 방법은 질환(예를 들면, 암)을 효과적으로 치료하거나 예방하는 양의 본 발명의 항CLDN18.2 항체 분자, 선택적으로, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, CTLA-4, Tim-3항체(면역 치료) 또는 다른 종양 치료 항체, Her-2, EGFR, VEGF, VEGFR항체 등, 및 ADC(예: T-DM1), 이중 특이성 항체, 화학 요법 약물 등의 하나 또는 다수 억제제와의 조합을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항CLDN18.2 항체 분자, 별도의 활성제 또는 전부를 단독(예를 들면, 단일 요법으로서)으로 사용되는 각 활성제의 양 또는 투여량보다 높거나 낮거나 동일한 양 또는 투여량으로 투여하는 단계를 더 포함한다. 항CLDN18.2 항체, 별도의 활성제 또는 전부를 투여하는 양 또는 투여량은 단독(예를 들면, 단일 요법으로서)으로 사용되는 각 활성제의 양 또는 투여량보다 낮다(예를 들면, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50%).
이 밖에, 본 발명의 실시예에서 설명된 바와 같이, 항CLDN18.2 항체 및 CLDN18.2 항체의 약물 접합체는 CLDN18.2에 결합하여 표적 세포(종양 세포)의 사멸을 유도하고, 종양 세포 성장을 억제하며, 종양 세포ADCC, CDC에 대한 체내 효과 세포의 살해 작용을 증가시켜 암 환자를 치료하는 목적을 달성한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명에 설명된 항CLDN18.2 항체 및 CLDN18.2 항체의 약물 접합체는 이러한 메커니즘을 통해 본 발명의 항체의 항종양 효과, 및 종양 세포 성장을 억제하는 방법을 나타내고, 치료 유효량의 본 발명의 항CLDN18.2 항체 및 CLDN18.2 항체의 약물 접합체를 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 암의 체내 치료에 적용된다. 표적 특이적 치료 효과를 얻기 위해, 항CLDN18.2 항체 분자는 다른 항체와 함께 투여될 수 있다. CLDN18.2 항체 및 CLDN18.2 항체의 약물 접합체를 하나 또는 다수 활성제로 조합하여 투여할 경우, 상기 조합은 암 유형, 특히 높은 CLDN18.2를 발현하는 종양 환자에게 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 대상체에서 과증식성 병태 또는 질환(예를 들면, 암)을 치료(예를 들면, 감소 또는 완화)하는 것을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 하나 또는 다수 항CLDN18.2 항체 또는 CLDN18.2 항체의 약물 접합체를 단독으로 또는 다른 활성제 또는 치료 방식과 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
단독으로 또는 다른 면역 조절제(예를 들면, 항LAG-3, 항Tim-3, 항PD-l 또는 항PD-L1, 항CTLA-4 항체 분자)와 조합된 항CLDN18.2 항체 분자를 사용하여 위암, 췌장암, 폐암, 식도암, 난소암 등을 치료한다. 항CLDN18.2 항체 분자는 면역 기반 전략, 표적 약물(예를 들면, VEGF에 대한 단일 클론 항체와 같은 VEGF 억제제); 수니티닙, 소라페닙, 아파티닙과 같은 VEGF티로신 키나아제 억제제; RNAi 억제제 또는 VEGF 신호 전달의 다운스트림 매개체 억제제, 예를 들면, 라파마이신 포유 동물의 표적(mTOR)의 억제제 중 하나 또는 다수와 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "암", "암", "암 환자"는 조직 병리학적 유형 또는 침습성 단계에 관계없이 모든 유형의 암성 성장물 또는 종양형성 과정, 전이성 조직 또는 악성 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다. 예에는 고형 종양, 혈액암, 연조직 종양 및 전이성 병소가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 개시된 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체를 사용하여 치료에 적합할 수 있는 암의 비제한적 구현예는 위암, 식도암, 폐암, 흑색종, 신장암, 유방암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 방광암, 신경교종 및/또는 백혈병 등, 또는 이들의 전이성 병소를 포함한다.
본 발명에서 "변이체1", "변이체2"가 언급될 경우, 용어 뒤의 아라비아 숫자 "1", "2"는 실제 의미가 없고, 단지 동일한 용어를 지칭함을 이해해야 한다.
본 분야의 상식에 부합되는 기초 상에서, 상기 각 바람직한 조건은 임의로 조합되어 본 발명의 각 바람직한 구현예를 얻을 수 있다. 본 발명에 사용된 시약 및 원료는 모두 시판되고 있다.
본 발명의 긍정적인 진행 효과는 다음과 같다.
선행기술에 비해, 본 발명의 항체의 결합 친화력, ADCC(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity, 항체 의존 세포 매개 세포 독성), CDC(complement dependent cytotoxicity, 보체 의존 세포 독성), 성장 억제 효과, 내재화 활성 등은 모두 현저한 장점이 있어 종양을 치료하는 큰 잠재력을 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, HBM1029 항체, PR003197, PR003340, PR003292, PR003293, PR003240, PR003291, PR003289, PR003890, PR003891, PR003894, PR003897 및 PR003898은 IMAB362 유사체에 비해, CLDN18.2을 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8세포에 대해 더 큰 결합 친화력을 나타내고; 본 발명의 HBM1029, PR003197, PR003340, PR003240, PR003894 항체는 투여량 의존 방식으로 NUGC4_D8에서 IMAB362 유사체보다 강한 ADCC효과를 특이적으로 유도할 수 있으며; HBM1029, PR003197, PR003340 항체는 투여량 의존 방식으로 HEK293 hCLDN18.2에서 IMAB362 유사체보다 강한 CDC효과를 유도할 수 있고; HBM1029 항체는 투여량 의존 방식으로 HEK293 hCLDN 18.2에서 IMAB362 유사체보다 강한 성장 억제 효과를 유도할 수 있으며; HBM1029 항체는 투여량 의존 방식으로 NUGC4_D8에서 IMAB362 유사체보다 강한 내재화 활성을 유도할 수 있고; HBM1029 항체를 MMAF 접합된 항인간IgG 항체와 공동 배양할 경우, 투여량 의존 방식으로 NUGC4_D8세포와 HEK293 hCLDN18.2 세포에서 IMAB362 유사체보다 강한 세포 독성 효과를 발생할 수 있다.
도 1의 A, B, C는 각각 NUGC4_D8, HEK293 hCLDN18.2, HEK293 hCLDN18.1세포에 대한 HBM1029 및 PR002727항체의 결합 친화력을 나타낸다.
도 2의 A, B는 NUGC4_D8, HEK293 hCLDN18.2 세포에 대한 PR003197, PR003292, PR003293, PR003340항체의 결합 친화력을 나타내고; 도 2C는 HEK293 hCLDN18.1세포에 대한 PR003197, PR003292, PR003293, PR003340, PR002725항체의 결합 친화력을 나타낸다.
도 3의 A, B는 각각 NUGC4_D8, HEK293 hCLDN18.1세포에 대한 PR003240, PR003291, PR003289 및 HBM1029 항체의 결합 친화력을 나타낸다.
도 4의 A, B는 각각 NUGC4_D8, HEK293 hCLDN18.2 세포에 대한 PR003890, PR003891, PR003894, PR003897, PR003898항체의 결합 친화력을 나타내고; C는 HEK293 hCLDN18.1세포에 대한 PR003890, PR003891, PR003894, PR003897, PR003898, PR002725 및 HBM1029 항체의 결합 친화력을 나타낸다.
도 5는 인간 PBMC에 의한 NUGC4_D8, HEK293 hCLDN 18.1세포에 대한 HBM1029 항체의 ADCC활성을 나타낸다.
도 6은 인간 PBMC에 의한 NUGC4_D8세포에 대한 PR003894, PR003240, PR003340, PR003197 및 HBM1029의 ADCC활성을 나타낸다.
도 7은 reporter세포에 의한 NUGC4_D8세포에 대한 HBM1029, PR003894, PR003240, PR003340, PR003197, PR003891, PR003898의 ADCC활성을 나타낸다.
도 8은 HBM1029 항체가 HEK293 hCLDN18.2 세포, HEK293 hCLDN18.1세포 및 NUGC4_D8세포에서 CDC 효과를 유도함을 나타낸다.
도 9은 HBM1029, PR003197, PR003340이 HEK293 hCLDN18.2 세포에서 CDC 효과를 유도함을 나타낸다.
도 10은 HBM1029 항체가 HEK293 hCLDN18.1 및 HEK293 hCLDN18.2에서 유도한 성장 억제 활성을 나타낸다.
도 11은 NUGC4_D8세포에서 HBM1029 항체의 내재화 활성을 나타낸다. 여기서, (A)는 NUGC4_D8세포와 200 nM항체를 혼합하여 인큐베이션하는 상이한 시간대이고, (B)는 NUGC4_D8세포와 상이한 농도의 항체를 혼합하여 1시간 동안 인큐베이션한 것이다.
도 12는 HBM1029 항체를 MMAF 접합된 항인간IgG 항체와 공동 배양할 경우의 표적 세포의 생존율이다.
도 13은 HEK293 hCLDN18.2 세포에서 IMAB362-FITC 유사체에 대한 HBM1029 항체의 경쟁적 결합 친화력이다. 상이한 농도의 HBM1029 항체, 20 nM IMAB362-FITC 유사체, HEK293 hCLDN18.2 세포를 혼합하여 인큐베이션한다.
도 14는 IMAB362 유사체, HBM1029의 약동학적 프로파일이다.
도 15는 IMAB362 유사체, HBM1029의 체내 약력학적 연구이다.
이하 실시예의 방식을 통해 본 발명을 추가로 설명하지만 이로써 본 발명을 상기 실시예 범위에 한정하는 것은 아니다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은, 통상적인 방법 및 조건, 또는 제품 설명에 따라 선택하였다.
실시예1. 항원 제조, 마우스 면역화 및 하이브리도마 제조
a. 면역화된 마우스의 발현 벡터의 제조
완전 인간화된 유전자 변형 마우스를 면역화하기 위한 인간CLDN18.2 발현 벡터의 제조 방법은 인간CLDN18.2(Uniprot ID P56856-iso2)를 코딩하는 cDNA서열을 합성하고, 효소 절단을 통해 상기 유전자의 코딩 서열을 pCAGGS 플라스미드(YOUBIO, VT1076)에 클로닝하였다.
b. 안정적으로 형질전환된 세포주의 제조
인간CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 안정적으로 발현하는 HEK293(ATCC, Cat#: CRL-1573) 세포주의 구축은 구체적으로 다음과 같다. 인간CLDN18.1(GenScript, OHu29174D) 또는 CLDN18.2(GenScript, OHu03374D)를 코딩하는 플라스미드를 EK293세포에 형질감염시키고, 인간CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 과발현하는 안정한 세포주를 생성하였다. CLDN18.1 및 CLDN18.2의 발현은 형광 활성화 세포 분류 기술(FACS)에 의해 검출되었다. 구체적으로, 20,000개의 형질감염된 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅한 후, 시판되는 토끼 항-인간CLDN18 항체(LifeSpan Bio, Cat#: LS-C168812-400)를 넣었다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, AF-680 결합된 염소 항-토끼IgG 2차 항체(Invitrogen, Cat#: A21109)를 더 넣었다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS로 3회 세척한 후, FACS 기기(IntelliCytiQue Plus BR)를 사용하여 세포 형광을 모니터링하였다.
실시예2. CLDN18.2단일 클론 항체의 생성 및 스크리닝
상기 제조된 인간CLDN18.2 발현 벡터 및 상기 제조된 인간CLDN18.2를 발현하는 HEK293 세포(HEK293 hCLDN18.2 세포)를 사용하여 완전 인간화된 유전자 변형 마우스(HarbourH2L2 마우스, 상업적으로 구매한 마우스, 허버 바이오(HARBOUR BIOMED)에서 구입)를 면역화하였다. 인간CLDN18.2 벡터와 금가루를 유전자총의 총알로 제조하고, 마우스 복부를 유전자총으로 여러 지점에서 면역화하였다. 발현 벡터 DNA는 매회 50μg씩, 2주 간격으로 면역화하고, 3회 면역 후, HEK293 hCLDN18.2 세포로 면역화하며, 각 마우스는 매회 4Х106개의 세포, 2주 간격으로 면역화하고, 2회 세포 면역 후 마우스에서 혈액을 채취하여 역가를 측정하였다. 마우스 혈청의 결합 친화력은 FACS를 통해 인간CLDN18.2를 발현하는 CHO K1 세포(CHOK1 hCLDN18.2, kyinno(KC-1180)에서 구입) 또는 CLDN18.1을 발현하는 CHO K1 세포(CHOK1 hCLDN18.1, kyinno(KC-1181)에서 구입)를 사용하여 검출하였다. 면역화된 마우스의 혈청 역가 검출 결과에 근거하여, 마우스를 선택하여 하이브리도마 융합하고, 융합 3일 전에 마우스를 스프린트 면역화하며, 면역원은 HEK293 hCLDN18.2 세포이고, 투여량은 4Х106개 세포이다. 마우스의 비장 세포 및 림프절 세포를 마우스의 골수종 세포SP2/0과 2:1(세포 수 비율)의 비율로 혼합하고, 혼합된 세포를 전기융합 장치(BTX ECM2001)로 세포 융합시키며, 융합된 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하고, 37℃의 이산화탄소 인큐베이터에서 10일 동안 배양한 후 하이브리도마의 1차 스크리닝을 수행하였다. 1차 스크리닝은 Mirrorball를 통해 인간CLDN18.2를 발현하는 CHO K1 세포를 사용하여 검출하였고, 구체적으로 다음과 같다. 세포를 배지(F12K 10 % FBS)로 재현탁시키고, 세포의 밀도를 5Х104 세포/ml로 조정하며, 384웰 플레이트의 각 웰에 40 μl의 세포 현탁액을 넣고, 37℃의 이산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 배양하였다. 웰에 핵염료 DRAQ5를 넣은 후, 웰 플레이트의 상층액을 제거하고, 하이브리도마 배양 플레이트의 상층액 50μl를 취하여 384마이크로 웰 플레이트에 넣으며, 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션 한 후, AF488 접합된 형광 2차 항체(invitrogen, Cat#: A11006)를 넣어 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 384마이크로 웰 플레이트를 Mirrorball로 온보드 검출하였다. 양성 하이브리도마를 선별하여 96웰 배양 플레이트에서 24웰 배양 플레이트에 옮겨 확대 배양하고, 5일 후 24웰 배양 플레이트의 웰에 있는 상층액을 재선별하였다. 재선별은 FACS를 통해 CHOK1hCLDN18.1 및 CHOK1hCLDN18.2 세포를 검출하였다. 세포를 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, FACS 완충액(2%의 FBS를 함유하는 PBS)으로 재현탁시켰다. 세포의 밀도를 106세포/ml로 조정하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 세포 현탁액을 넣었다. 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 상층액을 넣었다. 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 다음, APC 접합된 염소 항-래트IgG 2차 항체를 함유하는 FACS 완충액(BiolegendCat#: 405407)을 넣었다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정액으로 재현탁시킨 후, FACS 기기(ACEA NovoCyte)를 사용하여 세포 형광을 모니터링하였다. 특이성이 우수한 하이브리도마를 제한 희석법으로 서브클로닝하고, 37℃의 이산화탄소 인큐베이터에서 7일 동안 배양한 후 서브클로닝을 1차 스크리닝하였다. 서브클로닝의 1차 스크리닝은 Mirrorball을 통해 인간CLDN18.2를 발현하는 CHO K1 세포를 사용하여 검출하였다. 검출 결과 및 현미경 관찰에 근거하여, 단일 클론이면서 CHOK1/CLDN18.2에 양성 결합하는 클론을 선별하고, 24웰 세포 배양 플레이트에 확장하며, 37℃의 이산화탄소 인큐베이터에서 3일 동안 배양한 후 웰의 상층액을 재선별하였다. 재선별은 FACS(상기 재선별 단계와 동일함)에 의해 CHOK1hCLDN18.1 및 CHOK1hCLDN18.2 세포계를 검출하였다. 특이적으로 결합한 단일 클론은, 아형 감정 키트(invitrogen, Cat#: 88-50640-88)로 아형 감정하였다. 항체 아형이 IgG2b인 세포를 선별하여 시퀀싱하였다(시퀀싱 회사는 진워이즈바이오유한회사(GENEWIZ, Inc.)).
본 분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 본 분야에서 서열 가변성에 기반한 Kabat 정의 규칙(Kabat 등, 면역학의 단백질 서열, 제5버전, 미국 국립보건원, 베데스다, 메릴랜드주(1991) 참조)과 구조적 루프 영역 위치에 기반한 Chothia 정의 규칙(JMol Biol 273:927-48,1997 참조)과 같은 다양한 방법을 통해 항체의 CDR을 정의할 수 있다. 본원 발명에서, 또한 Kabat 정의 및 Chothia 정의를 포함하는 Combined 정의 규칙을 사용하여 가변 도메인 서열의 아미노산 잔기를 결정할 수 있다. 여기서 Combined 정의 규칙은 Kabat 정의 및 Chothia 정의의 범위를 결합하는 것으로, 이를 기반으로 더 큰 범위를 선택하였고, 상세하게는 표 1-1을 참조한다. 상기 실시예에서 시퀀싱 후 얻은 생식계열 유전자 분석 및 PTM 사이트 분석은 표 2에 나타낸 바와 같다. 항원 결합 단백질 돌연변이 사이트 설계 정보는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다. 항원 결합 단백질 서열 번호 목록 정보는 표 4에 나타낸 바와 같다.
항체의 생식계열 유전자 분석 및 PTM 사이트 분석
클론 번호 VH 생식계열 V유전자 VL 생식계열 V유전자 VH PTM VL PTM 재조합 항체 재조합 항체 아형
11C12-13C2 VH3-23 VK3-15 없음 없음 PR002725 인간 IgG1
13E6F4 VH3-23 VK3-11 없음 없음 PR002726 인간 IgG1
31H3E2 VH3-30 VK3-15 DG (HCDR2), DG (HCDR3) 없음 PR002727 인간 IgG1
205A7F1D3 VH3-23 VK3-15 없음 없음 PR003289 인간 IgG1
214C4G11 VH3-23 VK3-15 없음 없음 PR003291 인간 IgG1
항원 결합 단백질 돌연변이 사이트 설계
초기 항체 변이체 가변 영역 돌연변이 재조합 항체 아형 Fc 돌연변이
PR002726 PR003197 없음 인간 IgG1 S239D, I332E
PR002726 PR003292 없음 인간 IgG1 M252Y, S254T, T256E
PR002726 PR003293 없음 인간 IgG1 S239D, I332E, M252Y, S254T, T256E
PR002726 PR003340 없음 인간 IgG1 S239D, I332E, K274Q, Y300F, L309V, Y296F, A339T, V397M
PR003289 PR003890 없음 인간 IgG1 S239D, I332E
PR003289 PR003897 없음 인간 IgG1 S239D, I332E, K274Q, Y300F, L309V, Y296F, A339T, V397M
PR003291 PR003891 없음 인간 IgG1 S239D, I332E
PR003291 PR003898 없음 인간 IgG1 S239D, I332E, K274Q, Y300F, L309V, Y296F, A339T, V397M
PR002727 PR003240 VH:D54E 인간 IgG1 S239D, I332E
PR002727 PR003894 VH:D54E 인간 IgG1 S239D, I332E, K274Q, Y300F, L309V, Y296F, A339T, V397M
항원 결합 단백질 서열 번호 목록
항체 번호 경쇄 중쇄 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000400 91 75 69 62 39 46 54 5 15 25
PR002725 92 76 70 63 40 47 55 6 16 26
PR002726 93 77 71 64 41 48 56 7 17 27
PR002727 94 78 72 65 42 47 57 8 18 28
PR003197 93 79 71 64 41 48 56 7 17 27
PR003340 93 85 71 64 41 48 56 7 17 27
PR003292 93 83 71 64 41 48 56 7 17 27
PR003293 93 84 71 64 41 48 56 7 17 27
PR003289 95 81 73 67 42 47 55 8 16 29
PR003291 96 82 74 68 42 47 58 8 16 29
PR003240 94 80 72 66 42 47 57 8 19 28
PR003890 95 86 73 67 42 47 55 8 16 29
PR003891 96 87 74 68 42 47 58 8 16 29
PR003894 94 88 72 66 42 47 57 8 19 28
PR003897 95 89 73 67 42 47 55 8 16 29
PR003898 96 90 74 68 42 47 58 8 16 29
참조: 이상 표에서 언급된 PR002726C는 HBM1029이고, 본 발명에서 양자는 동일한 항체를 나타내며; PR000400은 IMAB362 유사체이고, 본 발명에서 양자는 동일한 항체를 나타낸다.
실시예3. 전장 CLDN18.2 단일 클론 항체의 발현, 정제 및 특성화
항체 분자를 코딩하는 경쇄, 중쇄 가변 도메인 서열을 얻은 후, 통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 경쇄, 중쇄 가변 도메인 서열 및 상응한 인간 항체의 경쇄, 중쇄 불변 도메인 서열을 융합 발현하여 재조합 항체 분자를 얻었다. 본 실시예에서, 항체 중쇄 가변 도메인 서열(VH)은 유전자를 통해 합성되고 인간IgG1 항체 중쇄 불변 도메인 서열을 코딩하는 포유 동물 세포 발현 플라스미드 벡터에 클로닝하여 IgG1 항체를 생성하는 전장 중쇄를 코딩하였다. 항체 경쇄 가변 도메인 서열(VL)은 유전자를 통해 합성되고 인간 항체Igκ 경쇄 불변 도메인 서열을 코딩하는 포유 동물 세포 발현 플라스미드 벡터에 클로닝하여 항체를 생성하는 전장 경쇄를 코딩하였다. 본 실시예에서, 면역화된 Harbour H2L2 마우스로부터 얻은 단일 클론 항체 분자의 가변 도메인의 서열은 인간 항체 서열이기에, 본 실시예도 완전 인간화된 항CLDN18.2 재조합 IgG1 항체를 얻었다.
항체 중쇄를 코딩하는 플라스미드(Genscript US) 및 항체 경쇄를 코딩하는 플라스미드(Genscript US)를 포유 동물 숙주 세포(예를 들면 인간 배아 신장 세포HEK293)에 동시에 형질감염시키고, 통상적인 재조합 단백질 발현 및 정제 기술을 사용하여 경쇄 및 중쇄의 정확한 쌍을 이루는 조합으로 정제된 재조합 항체를 얻었다. 구체적으로, HEK293 세포를 FreeStyle?? F17 Expression Medium 배지(Thermo, Cat#: A1383504)에서 확장 배양하였다. 일시적인 형질감염이 시작되기 전에, 세포 농도를 6Х105세포/ml 내지 8Х105세포/ml로 조정하고, 37℃의 8% CO2 쉐이커에서 24시간 동안 배양하며, 세포 농도는 1.2Х106세포/ml이다. 30 ml의 배양 세포를 준비하였다. 항체 중쇄를 코딩하는 플라스미드 및 항체 경쇄를 코딩하는 플라스미드를 2:3(질량비)의 비율로 혼합하고 총 30 μg의 플라스미드를 1.5 ml의 Opti-MEM의 혈청 감소 배지(Thermo, Cat#: 31985088)에 용해시키며, 0.22 μm의 여과막으로 여과하여 세균을 제거하였다. 다시 1.5 ml의 Opti-MEM을 취하여 1 mg/ml의 PEI(Polysciences, Cat#: 23966-2) 120 μl에 용해시키고, 5분 동안 방치하였다. PEI를 플라스미드에 천천히 넣고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하며, 배양 플라스크를 흔들면서 플라스미드 PEI 혼합 용액을 천천히 적가하고, 37℃의 8% CO2 쉐이커에서 5일 동안 배양하였다. 5일 후에 세포 생존율을 관찰하였다. 배양물을 수집하고, 3300g의 회전속도로 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하며; 다음 상층액을 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하였다. PBS(pH7.4)로 MabSelect ??(GE Healthcare Life Science, Cat#: 71-5020-91 AE)를 함유하는 중력 컬럼(Bio-Rad , Cat#: 7311550)을 평형화하고, 2배 내지 5배 컬럼 부피로 세척하였다. 상층액 샘플을 컬럼에 통과시키고; 5배 내지 10배 컬럼 부피의 PBS로 컬럼을 세척하며, 다시 pH3.5의 0.1M 글리신으로 목적 단백질을 용출한 후, pH 8.0의 Tris-HCl로 중성으로 조절하고, 마지막으로 밀리포어(Millipore, Cat#: UFC901024)로 농축하며 PBS 완충액으로 교환하여 정제된 항체 용액을 얻었다. 마지막으로 NanoDrop(Thermo Scientific?? NanoDrop?? One)로 농도를 측정하고, 포장하여 보관하였다.
상기 정제된 샘플을 적당량 취하여 각각 분석형 SEC 컬럼 TSKgel G3000SWxl (HPLC 기기 모델: 애질런트 1260 Infinity II)에 놓고, 샘플의 순도를 검출하며, 균일 샘플의 순도를 95% 이상으로 확보하였다. 상기 방법의 이동상은 1ХPBS, pH7.4(셩공(Sangon Biotech Co., Ltd.), Cat#: E607016), 실온, 유속 1.0 ml/min, 샘플 농도 1 mg/ml, 주입 부피 20 μl, 검출 파장 280nm이다. 수집 후 ChemStation 소프트웨어로 크로마토그램을 적분하고 관련 데이터를 계산하였다. 상기 정제된 샘플을 적정량 취하여 각각 분석형 HIC 컬럼 TSKge1 Buty1-NPR 4.6*35 (HPLC기기 모델: 애질런트 1260 Infinity II)에 놓고, 샘플의 순도 및 소수성을 검출하였다. 상기 방법은 16분 이내에 100% 이동상A(20 mM PB, 1.8 M (NH4)2SO4, pH6.0)에서 100% 이동상B(20 mM PB, pH6.0)의 선형 구배로 구성되었다. 유속을 0.7 ml/min로 설정하고, 샘플 농도는 1 mg/ml이며, 주입 부피는 20 μl이고, 검출 파장은 280nm이다. 수집 후 ChemStation 소프트웨어로 크로마토그램을 적분하고 관련 데이터를 계산하였다. 차등 스캔 형광법(Differential Scanning Fluorimetry, DSF)은 단백질 열안정성을 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 고처리량 방법이다. 실시간 형광 정량 PCR 기기를 사용하여 접힌 단백질 분자에 결합된 염료의 형광 강도 변화를 모니터링하여 단백질 변성 과정을 반영함으로써 단백질 분자의 열안정성을 반영하였다. 본 실시예는 DSF 방법으로 단백질 분자의 열변성 온도(Tm)를 측정하였다. 10 μg의 단백질을 96-웰 PCR 플레이트(Thermo, Cat#: AB-0700/W)에 넣고, 다음 2 μl 100Х희석 염료 SYPROTM (Invitrogen, 2008138)을 넣은 후, 완충액을 넣어 최종 부피가 웰당 40 μl가 되도록 하였다. PCR 플레이트를 밀봉하고, 실시간 형광 정량 PCR 기기(Bio-Rad CFX96 PCR System)에 놓으며, 먼저 25 ℃에서 5 min 동안 인큐베이션한 후, 0.2 ℃/0.2 min의 구배로 25 ℃에서 95 ℃로 점차적으로 승온시키고, 테스트가 종료되면 온도를 25 ℃로 낮추었다. FRET 스캔 모드를 사용하고 Bio-Rad CFX Maestro 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하며 샘플의 Tm을 계산하였다. 얻은 결과는 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.
SEC-HPLC순도(%) HIC-HPLC순도(%) HIC-HPLC 체류 시간
(min)		 Tm1 (℃) Tm2 (℃)
HBM1029 98 100 15.653 62.8 68.2
실시예4. CLDN18.2 단일 클론 항체의 결합 친화력
항체의 결합 친화력은 FACS를 통해 인간CLDN18.2 또는 CLDN18.1을 발현하는 HEK293 세포 및 인간CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8세포(NUGC세포계는 JCRB(Cat#: JCRB0834)에서 구입하고, 유한 희석법으로 NUGC4_D8 서브클로닝 세포를 수득)를 사용하여 검출하였다. 구체적으로, 세포를 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, FACS 완충액(2% FBS를 함유한 PBS)으로 재현탁시켰다. 세포의 밀도를 106세포/ml로 조정하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 세포 현탁액을 넣었다. 항체를 FACS 완충액으로 상이한 농도로 희석하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 항체 희석액을 넣었다. 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 다음, APC 접합된 염소 항-인간IgG 2차 항체의 FACS 완충액(최종 농도 1.5 μg/ml, JacksonCat#: 109-605-098)을 넣었다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정액으로 재현탁시킨 후, FACS 기기(ACEA NovoCyte)를 사용하여 세포 형광을 모니터링하였다. IMAB362 유사체(IMAB362 유사체는 자가 제조한 것이고, 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 75에 도시된 바와 같으며, 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 91에 도시된 바와 같이 (Genscript 바이오 회사에서 합성하며), 이는 IMAB362의 가변 영역과 완전히 동일하고, 불변 영역에서 개별 아미노산만 상이하며, 양자의 활성은 유사)를 양성 대조로 사용하고, human Iso IgG1(CrownBio, Cat#: C0001-4) 항체를 음성 대조로 사용하였다. 도 1는 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8세포 및 인간CLDN18.2를 과발현하는 HEK293 세포(HEK293 hCLDN 18.2) 또는 인간CLDN18.1을 과발현하는 HEK293 세포(HEK293 hCLDN18.1)의 HBM1029 항체의 결합 친화력을 나타냈다. PR002727 항체는 투여량 의존 방식으로 NUGC4_D8세포에 결합할 수 있다. HBM1029 항체는 투여량 의존 방식으로 HEK293 hCLDN18.2 및 NUGC4_D8세포에 결합할 수 있다. HEK293 hCLDN18.2 세포에 대한 HBM1029 항체의 결합 친화력은 IMAB362 유사체와 상당하고; HBM1029 항체는 IMAB362 유사체에 비해, CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8 세포에 대해 더 큰 결합 친화력을 나타냈다. HBM1029의 EC50값을 표 7에 나타냈고, CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8세포에 대한 HBM1029의 결합 친화력의 EC50값은 IMAB362 유사체보다 낮았다. HBM1029와 HEK293 hCLDN18.1 세포의 결합 친화력은 낮았다. 동시에 HBM1029는 인간CLDN18.2 단백질의 ECL1(세포외 루프1, Extracellular loop 1)에 결합하고 ECL2에 결합하지 않는 것을 추론할 수 있다. 도 2, 도 3 및 도 4는CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8세포 또는 인간CLDN18.2를 과발현하는 HEK293 세포(HEK293 hCLDN 18.2) 또는 인간CLDN18.1을 과발현하는 HEK293 세포(HEK293 hCLDN18.1)에 대한 CLDN18.2 항체의 결합 친화력을 나타냈다. 결과는, HBM1029, PR003197, PR003340, PR003292, PR003293, PR003240, PR003291, PR003289, PR003890, PR003891, PR003894, PR003897, PR003898항체가 IMAB362 유사체에 비해 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8세포에 대해 더 큰 결합 친화력을 나타내고, HEK293 hCLDN18.1세포와의 결합 친화력이 낮지만 PR002725와 HEK293 hCLDN18.1와의 친화력은 높았다.
IMAB362 유사체의 아미노산 서열(Genscript 바이오 회사에서 합성)
중쇄 아미노산 서열 서열번호 75
경쇄 아미노산 서열 서열번호 91
HBM1029 항체의 결합 친화력 EC50
세포 HBM1029 IMAB362 유사체
HEK293 hCLDN18.2 최대 결합(MFI) 976,754 1,022,190
EC50 (nM) 3.8 4.0
NUGC4_D8 최대 결합(MFI) 490,220 313,021
EC50 (nM) 4.4 20.7
실시예5. CLDN18.2 항체의 ADCC 활성
CytoTox 96® 비방사성 세포 독성 분석 키트(Promega, Cat#: G1780)를 사용하여 인간CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8세포 및 HEK293 hCLDN 18.1에 대하여 ADCC 효과를 유도하는 CLDN18.2 항체의 활성을 검출하였다. 인간PBMC(Miaotong)는 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 배지(RPMI1640+10% FBS)에서 하룻밤 배양하였다. 표적 세포 및 인간PBMC를 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, 배지(RPMI1640+2% FBS)로 재현탁시켰다. 표적 세포의 밀도를 2Х105세포/ml로 조정하고, PBMC의 세포 밀도를 적어도 6Х106 /ml로 조정하며, 두 가지 세포를 각각 50μl씩 96웰 플레이트의 웰에(유효 타겟 비율은 적어도 30: 1) 넣었다. 시험할 항체를 배지(RPMI1640+2% FBS)로 상이한 농도로 희석하여 각 웰에 넣었다. 샘플을 37℃에서 적어도 4시간 동안 인큐베이션한 후, 표적 세포 최대 LDH 방출 대조웰 및 부피 보정 대조웰(Volume correction control)에 10ХTriton-X 100 용해액(RPMI1640 + 2% FBS + 10% Triton-X 100)을 넣고, 균일하게 혼합하여 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 50μl의 상층액을 취한 후, 50μl/웰의 농도로 LDH 발색 용액을 넣었다. 혼합물을 실온에서 빛을 피하여 20분 동안 놓은 후, 플레이트를 MD StakMax에서 판독하였다(OD490). IMAB362 유사체를 양성 대조로 사용하고, human Iso IgG1(CrownBio, Cat#: C0001-4) 항체를 음성 대조로 사용하였다. 결과는 먼저 보정된 판독값을 계산하고, 실험웰, 표적 세포 자발적 방출 LDH 대조웰, 효과 세포 자발적 방출 LDH 대조웰의 판독값에서 배지 배경 대조웰의 판독값을 감하고, 표적 세포 최대 LDH 방출 대조웰의 판독값에서 부피 보정 대조웰의 판독값을 감하였다. ADCC활성(%) = (실험웰 보정 판독값-효과 세포 자발적 방출 LDH 대조웰의 보정 판독값-표적 세포 자발적 방출 LDH 대조웰의 보정 판독값)/ (표적 세포 최대 LDH 방출 대조웰의 보정 판독값-표적 세포 자발적 방출 LDH 대조웰의 보정 판독값) Х 100. 도 5는 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8 세포 및 HEK293 hCLDN18.1에 대한 HBM1029 항체의 ADCC 활성을 나타냈다. HBM1029 항체는 투여량 의존 방식으로 특이적으로 NUGC4_D8에서 IMAB362 유사체보다 강한 ADCC 효과를 유도하지만 CLDN18.1을 과발현하는 HEK-293 세포에서는 세포 독성 효과가 관찰되지 않았다. HBM1029의 EC50값을 표 8에 나타내고, NUGC4_D8에서 ADCC를 유도하는 HBM1029의 EC50값은 IMAB362 유사체보다 낮았다.
HBM1029의 ADCC 활성
세포 HBM1029 IMAB362 유사체
NUGC4_D8 최대 용해 (%) 20.9 26.9
EC50 (nM) 0.05 0.91
도 6은 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8 세포에 대한 HBM1029, PR003197, PR003340, PR003240, PR003894의 ADCC활성을 나타내고, HBM1029, PR003197, PR003340, PR003240, PR003894는 투여량 의존 방식으로 특이적으로 NUGC4_D8에서 IMAB362 유사체보다 강한 ADCC 효과를 유도하였다. Jurkat FcγRIIIa-V158/NFAT-Luc 세포를 사용하여 NUGC4_D8 및 HEK293 hCLDN18.1에 대한 CLDN18.2 항체의 ADCC 효과 유도 활성을 검출하였다. NUGC4_D8 및 HEK293 hCLDN18.1를 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, RPMI1640 + 4 % FBS 혈청 배지로 재현탁시켰다. 세포의 밀도를 6Х105세포/ml로 조정하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 세포 현탁액을 넣으며, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. Jurkat FcγRIIIa-V158/NFAT-Luc 세포를 400 g에서 4분 동안 원심분리한 후, RPMI1640 + 4 % FBS 혈청 배지로 재현탁시켰다. 세포의 밀도를 3Х106세포/ml로 조정하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 세포 현탁액을 넣었다. 항체를 RPMI1640 + 4 % FBS 배지로 상이한 농도로 희석하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 50μl의 항체 희석액을 넣었다. 세포와 항체를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 실온에서 30분 동안 방치하고, 60μl/웰의 상온 One-Glo 발색액(Promega)을 첨가하였다. 다음 샘플을 실온에서 빛을 피하여 10분 동안 인큐베이션하였다. PE Enspire로 판독하였다. IMAB362 유사체를 양성 대조로 사용하고, human Iso IgG1(CrownBio, Cat#: C0001-4) 항체를 음성 대조로 사용하였다. 도 7은 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8 세포에 대한 CLDN18.2 항체의 ADCC활성을 나타내고, HBM1029, PR003197, PR003340, PR003240, PR003894, PR003891, PR003898은 투여량 의존 방식으로 특이적으로 NUGC4_D8에서 IMAB362 유사체보다 강한 ADCC 효과를 유도한다.
실시예6. CLDN18.2 항체의 CDC활성
CellTiter-Glo 발광법 세포 활성 검출 키트(Promega, Cat#: G7573)를 사용하여 HEK293 hCLDN18.1, HEK293 hCLDN18.2 및 NUGC4_D8 세포에 대한 CDC 효과를 유도하는 CLDN18.2 항체의 능력을 검출하였다. 표적 세포 HEK293 hCLDN18.1 및 HEK293 hCLDN18.2를 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, DMEM 무혈청 배지로 재현탁시켰다. 표적 세포 NUGC4_D8을 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, RPMI1640 무혈청 배지로 재현탁시켰다. 표적 세포의 밀도를 4Х105세포/ml로 조정하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 25 μl의 세포 현탁액을 넣었다. 항체를 무혈청 배지로 상이한 농도로 희석하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 25 μl의 항체 희석액을 넣었다. 50 μl의 정상 인간 혈청(GemCell, Cat#: 100-512)를 넣고, 최종 농도는 50%이며, 수득된 혼합물을 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 실온에서 30분 동안 방치하고, 100μl/웰의 상온 CellTiter-Glo 발색액을 첨가하였다. 다음 샘플을 실온에서 빛을 피하여 10분 동안 인큐베이션하였다. PE Enspire로 판독하였다. CDC 활성(%)=[1 - (luminescent sample)/(luminescent mock control)]Х100. IMAB362 유사체를 양성 대조로 사용하고, human Iso IgG1(CrownBio, Cat#: C0001-4) 항체를 음성 대조로 사용하였다. 도 8은 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8 세포, 인간CLDN18.1을 과발현하는 HEK293 세포 및 인간CLDN18.2를 과발현하는 HEK293 세포에 대한 HBM1029 항체의 CDC 활성을 나타낸다. HBM1029 항체는 투여량 의존 방식으로 HEK293 hCLDN18.2에서 IMAB362 유사체보다 강한 CDC 효과를 유도하지만 NUGC4_D8 세포 및 인간CLDN18.1을 과발현하는 HEK293 세포에서는 CDC 활성이 관찰되지 않았다. HBM1029의 EC50값을 표 9에 나타내고, HEK293 hCLDN18.2에서 CDC를 유도하는 HBM1029의 EC50값은 IMAB362 유사체보다 낮았다.
HBM1029의 CDC 활성
세포 HBM1029 IMAB362 유사체
HEK293 hCLDN18.2 최대 용해(%) 100.0 100.9
EC50 (nM) 0.42 1.07
도 9는 인간CLDN18.2를 과발현하는 HEK293 세포에 대한 PR003197, PR003340의 CDC 활성을 나타낸다. PR003197, PR003340항체는 투여량 의존 방식으로 HEK293 hCLDN18.2에서 IMAB362 유사체보다 강한 CDC 효과를 유도할 수 있다.
실시예7. CLDN18.2 항체의 성장 억제 활성
CellTiter-Glo 발광법 세포 활성 검출 키트(Promega, Cat#: G7573)를 사용하여 HEK293 hCLDN18.1 및 HEK293 hCLDN18.2에 대한 성장 억제를 유도하는 CLDN18.2 항체의 능력을 검출하였다. 세포 HEK293 hCLDN18.1 및 HEK293 hCLDN18.2를 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, DMEM + 0.5 % FBS 혈청 배지로 재현탁시켰다. 세포의 밀도를 1.2Х105세포/ml로 조정하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 세포 현탁액을 넣으며, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 항체를 배지로 상이한 농도로 희석하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 50μl의 항체 희석액을 넣었다. HEK293 hCLDN18.1 및 HEK293 hCLDN18.2 세포와 항체를 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 실온에서 30분 동안 방치하고, 100μl/웰의 상온 CellTiter-Glo 발색액을 첨가하였다. 다음 샘플을 실온에서 빛을 피하여 10분 동안 인큐베이션하였다. PE Enspire로 판독하였다. 성장 억제 활성(%) = [ 1 - (luminescent sample) / (luminescent mock control) ] Х 100. IMAB362 유사체를 양성 대조로 사용하고, human Iso IgG1(CrownBio, Cat#: C0001-4) 항체를 음성 대조로 사용하였다. 도 10은 HBM1029 항체가 HEK293 hCLDN18.1 및 HEK293 hCLDN18.2에 대하여 유도한 성장 억제 활성을 나타낸다. HBM1029 항체는 투여량 의존 방식으로 HEK293 hCLDN 18.2에서 IMAB362 유사체보다 강한 성장 억제 효과를 유도할 수 있다. HBM1029의 EC50값을 표 10에 나타낸다.
HBM1029의 성장 억제 활성
세포 HBM1029 IMAB362 유사체
HEK293 hCLDN18.2 최대 성장 억제(%) 25.0 N/A
EC50 (nM) 1.45 N/A
실시예8. CLDN18.2 항체의 내재화(internalization) 활성(FACS-based assay)
항체의 내재화 활성은 FACS를 통해 NUGC4_D8 세포를 사용하여 검출하였다. 세포를 트립신으로 소화하고, FACS 완충액(2%의 FBS를 함유하는 PBS)으로 1회 세척하였다. 세포를 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, FACS 완충액으로 재현탁시켰다. 세포의 밀도를 4Х106 세포/ml로 조정하고, 얼음 위에 놓아 30분 동안 미리 냉각시켰다. 항체를 FACS 완충액으로 상이한 농도로 희석하고, 얼음 위에 놓아 30분 동안 미리 냉각시켰다. 미리 냉각된 딥웰 플레이트의 웰에 700 μl의 세포 현탁액, 및 700 μl의 항체 희석액을 넣었다. 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 미리 냉각된 FACS 완충액으로 3회 세척하였다. 250 μl의 미리 냉각된 FACS 완충액으로 세포를 재현탁시키고, 37℃의 예열된 딥웰 플레이트의 웰에 100μl의 세포 현탁액, 및 1.1 ml의 37℃에서 예열된 FACS 완충액을 넣으며, 4℃의 미리 냉각된 딥웰 플레이트의 웰에 100 μl의 세포 현탁액, 및 1.1 ml의 4℃에서 미리 냉각된 FACS 완충액을 넣었다. 수득한 혼합물을 각각 0, 30, 60, 120 및 240분에 50 μL의 세포 현탁액(105/웰)을 취하여 미리 냉각된 딥웰 플레이트(1.2 mL FACS 완충액 함유)에 놓았다. 세포를 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, AF647 접합된 염소 항-인간IgG 2차 항체를 함유하는 FACS 미리 냉각 완충액(최종 농도는 1.5 μg/ml, Jackson, Cat#: 109-605-088)을 넣었다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 미리 냉각 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정액으로 재현탁시킨 후, FACS 기기(BD Canto II)를 사용하여 세포 형광을 검출하였다. 내재화 활성(%)= (1-MFI37℃/MFI4℃)Х100. IMAB362 유사체를 양성 대조로 사용하고, human Iso IgG1(CrownBio, Cat#: C0001-4) 항체를 음성 대조로 사용하였다. 도 11은 상이한 시간 동안 인큐베이션한 NUGC4_D8세포에 대한 HBM1029 항체의 내재화 활성을 나타낸다. HBM1029 항체를 30분 동안 인큐베이션한 후 약 50%의 내재화 활성을 유도하였다. 도 11은 또한 HBM1029 항체가 투여량 의존 방식으로 NUGC4_D8에서 IMAB362 유사체보다 강한 내재화 활성을 유도할 수 있음을 나타낸다. HBM1029의 EC50값을 표 11에 나타내고, NUGC4_D8에서 유도된 HBM1029의 내재화된 EC50令값은 IMAB362 유사체보다 낮았다.
HBM1029의 내재화 활성.
세포 HBM1029 IMAB362 유사체
NUGC4_D8 최대 내재화 (%) 45.4 64.1
EC50 (nM) 0.05 0.40
실시예9. CLDN18.2 항체의 내재화 활성(cytotoxicity-based method)
CellTiter-Glo 발광법 세포 활성 검출 키트(Promega, Cat#: G7573)를 사용하여 HEK293 hCLDN18.1, HEK293 hCLDN18.2 및 NUGC4_D8 세포에 대하여, HBM1029 항체를 MMAF 접합된 항인간IgG 항체(Moradec, Cat#: AH-102-AF)와 공동 배양하여 세포 독성을 유도하는 능력을 검출하였다. 세포HEK293 hCLDN18.1 및 HEK293 hCLDN18.2를 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, DMEM + 10 % FBS 혈청 배지를 재현탁시키고, 세포의 밀도를 4Х104세포/ml로 조정하였다. 세포NUGC4_D8을 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, RPMI1640+ 10 % FBS 혈청 배지로 재현탁시키고, 세포의 밀도를 2Х104세포/ml로 조정하며, 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 세포 현탁액을 넣고, 37 ℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. HBM1029 항체를 배지로 상이한 농도로 희석하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 25μl의 항체 희석액을 넣었다. MMAF 접합된 항인간IgG 항체를 배지로 희석하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 25μl의 항체 희석액을 넣으며, 최종 농도는 6.6 nM이다. 세포와 항체를 37 ℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 실온에서 30분 동안 방치하고, 100μl/웰의 상온 CellTiter-Glo 발색액을 첨가하였다. 다음 샘플을 실온에서 빛을 피하여 10분 동안 인큐베이션하였다. PE Enspire로 판독하였다. 세포 생존율(%) = [(luminescent sample)/(luminescent mock control)] Х 100. IMAB362 유사체를 양성 대조로 사용하고, human Iso IgG1(CrownBio, Cat#: C0001-4) 항체를 음성 대조로 사용하였다. 도 12는 HBM1029 항체를 MMAF 접합된 항인간IgG 항체와 공동 배양할 경우의 표적 세포의 생존율을 나타낸다. HBM1029 항체를 MMAF 접합된 항인간IgG 항체와 공동 배양할 경우, 투여량 의존 방식으로 NUGC4_D8세포 및 HEK293 hCLDN18.2 세포에서 IMAB362 유사체보다 강한 세포 독성 효과를 발생하지만 HEK293 hCLDN18.1 세포에서는 세포 독성 효과를 발생하지 않았다.
실시예10. HBM1029 항체의 경쟁적 결합 활성
항체의 경쟁적 결합 친화력은 FACS를 통해 인간CLDN18.2를 발현하는 HEK293 세포를 사용하여 검출하였다. IMAB362 유사체는 FITC 형광 결합 키트(Abcam, Cat#: ab188285)를 사용하여 IMAB362-FITC 유사체로 접합되었다. 세포를 300 g에서 5분 동안 원심분리한 후, FACS 완충액(2%의 FBS를 함유하는 PBS)으로 재현탁시켰다. 세포의 밀도를 106세포/ml로 조정하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 세포 현탁액을 넣었다. FITC 접합된 항체를 FACS 완충액으로 희석하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 결합된 항체 희석액을 넣었다. 경쟁적으로 결합할 항체를 FACS 완충액으로 상이한 농도로 희석하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μl의 항체 희석액을 넣었다. 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정액으로 재현탁시킨 후, FACS 기기(ACEA NovoCyte)를 사용하여 세포 형광을 모니터링하였다. human Iso IgG1(CrownBio, Cat#: C0001-4) 항체를 음성 대조로 사용하였다. 도 13은 HEK293 hCLDN 18.2 세포에서 IMAB362-FITC 유사체에 대한 HBM1029 항체의 경쟁적 결합 친화력을 나타낸다. HBM1029 항체는 투여량 의존 방식으로 HEK293 hCLDN18.2 세포에 경쟁적으로 결합할 수 있고, HBM1029 항체와 IMAB362 유사체의 결합 에피토프가 유사한 것을 추론하였다. HBM1029는 IMAB362 유사체와 경쟁할 수 있고, CLDN18.2를 발현하는 세포에 대한 결합을 억제하지만; IMAB362 유사체는 CLDN18.2에만 결합하며, CLDN18.1에 결합하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 HBM1029는 인간CLDN18.2 단백질의 ECL1(세포외 루프1, Extracellular loop 1)에 결합하고 ECL2에 결합하지 않는 것을 추론하였다.
실시예11. CLDN18.2 항체의 약동학 연구
CLDN18.2 항체의 약동학에서, 방법은 다음과 같다. 체중이 18g 내지 22g인 암컷 BALB/c nude 마우스 6마리를 선택하고, 5 mg/kg의 투여량으로 항체 약물을 정맥 주사하며; 한 그룹의 3마리에서 투여 전 및 투여 후 15분, 24시간(1일), 제4일, 및 제10일에 전혈을 수집하고, 다른 한 그룹의 3마리에서 투여 전 및 투여 후 5시간, 제2일, 제7일, 및 제14일에 전혈을 수집하였다. 전혈을 30분 동안 방치하여 응고시킨 후, 4℃에서 2,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고 분리된 혈청 샘플을 -80℃에서 분석할 때까지 냉동보존하였다. 본 실시예는 ELISA 방법을 사용하여 마우스 혈청의 약물 농도를 정량적으로 측정하였다. ELISA 방법은, 96웰 플레이트에 코팅된 염소 항-인간Fc 다중 클론 항체를 통해 마우스 혈청에서 인간Fc가 함유된 항체를 포획한 후, HRP 표지된 염소 항-인간Fc 2차 항체를 넣어 검출하였다. Phoenix WinNonlin 소프트웨어8.2버전을 사용하여 비구획 모델(NCA)을 사용하여 혈액 농도 데이터를 분석하여 약동학적 파라미터를 평가하였다.
도 14 및 표 12는 IMAB362 유사체, HBM1029의 약동학적 파라미터를 나타낸다. 결과는, 마우스에서 IMAB362 유사체, HBM1029의 반감기가 각각 248, 282시간임을 입증하였다.
IMAB362 유사체, HBM1029의 약동학적 파라미터
　 IMAB362 유사체 HBM1029
T1/2 (hr) 248 282
Vd (mL/kg) 112 94
AUCall (μg/mL hr) 9,542±385 12,062±418
Cl (mL/hr/kg) 0.32 0.24
C0 (μg/mL) 90 104
실시예11. CLDN18.2 항체의 체내 약력학 연구
CLDN18.2 항체의 체내 약력학 연구에서, 방법은 다음과 같다. 세포 접종일에 각 NCG 마우스에 5Х106 NUGC4_D8종양 세포를 피하 접종하고, 종양 세포를 먼저 PBS와 Matrigel (1:1)의 혼합액(0.1ml)에 재현탁시킨 후, PBMC (0.05mL의 PBS에 재현탁)와 혼합하며, 피하 접종하였다. 각 그룹의 마우스의 평균 종양 부피가 90 mm3 일 경우 그룹화 투여하고, 18마리의 마우스는 3개의 그룹으로 나뉘며, 그룹화 후 투여를 시작하고, 투여 주기는 주 2회이며, 총 6회 투여하고, 투여 방식은 꼬리 정맥 투여이다. 투여 시작 후, 체중과 종양 부피를 주 2회 칭량하고, 종양 부피의 계산 방식은, 종양 부피(mm3)= 0.5Х종양 장경Х종양 단경2이다. 투여 후 제21일에 실험 관찰을 종료하고, 모든 마우스를 안락사 처리하였다. 데이터 분석은 t-test를 사용하였다. 도 15는 IMAB362 유사체, HBM1029의 체내 약력학 연구 결과를 나타낸다. 투여 후 제21일, 대조군 마우스의 평균 종양 부피는 1526 mm3이다. 시험약 IMAB362 유사체(50mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 투여 후 제21일에 728 mm3로, 용매 대조군에 비해 유의한 차이(p값은 0.0052)가 있었고, 종양 억제율 TGI (%)는 52.29%이다. 시험약 HBM1029(50mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 투여 후 제21일에 618 mm3로, 용매 대조군에 비해 유의한 종양 억제 효과(p값은 0.0009)가 있었고, 종양 억제율 TGI (%)는 59.47%이다. 전체 치료 및 투여 기간 동안, 동물은 모두 우수한 약물 내성을 나타냈고, 심각한 체중 감소 및 동물 사망 현상은 나타나지 않았다.
이상 본 발명의 구체적인 실시형태를 설명하였지만 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 이들은 예시에 불과하고, 본 발명의 원리 및 실질을 벗어나지 않는 전제 하에 이러한 실시형태에 대하여 다양한 변형 또는 수정이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된다.
SEQUENCE LISTING <110> Harbour BioMed (Suzhou) Co., Ltd. <120> CLDN18.2-TARGETING ANTIBODY, PREPARATION METHOD THEREFOR, AND USE THEREOF <130> P21419383KR <140> PCT/CN2020/118650 <141> 2020-09-29 <150> 201910941316.3 <151> 2019-09-30 <160> 98 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody PR000400 HFWR1 Chothia <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody PR002725 HFWR1 Chothia, Antibody PR002726 HFWR1 Chothia, Antibody PR003197 HFWR1 Chothia <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody PR002727 HFWR1 Chothia, Antibody PR003240 HFWR1 Chothia, Antibody PR003894 HFWR1 Chothia <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 90 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody PR003898 HC <400> 90 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Val Val Asn Trp Gly Ser Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Phe Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 91 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody PR000400 LC <400> 91 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 92 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody PR002725 LC <400> 92 Glu Met Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 93 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody PR002726 LC, Antibody PR003197 LC, Antibody PR003292 LC, Antibody PR003293 LC, Antibody PR003340 LC <400> 93 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 94 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody PR002727 LC, Antibody PR003240 LC, Antibody PR003894 LC <400> 94 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Tyr Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 95 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody PR003289 LC, Antibody PR003890 LC, Antibody PR003897 LC <400> 95 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Asp Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 96 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody PR003291 LC, Antibody PR003891 LC, Antibody PR003898 LC <400> 96 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 97 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 constant region <400> 97 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 98 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human kappa constant region <400> 98 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (24)

  1. 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역이 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고; 상기 HCDR1이 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체1을 포함하고, 상기 HCDR2가 서열번호 16 및 이의 변이체2, 서열번호 18 및 이의 변이체3으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3이 서열번호 26 내지 29 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR1이 서열번호 42로 표시되는 서열 또는 이의 변이체4를 포함하고, 상기 LCDR2가 서열번호 47로 표시되는 서열 또는 이의 변이체5를 포함하고, 상기 LCDR3이 서열번호 55로 표시되는 서열 또는 이의 변이체6을 포함하고; 상기 변이체가 원래 서열 기초 상에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 수행하고, 상기 변이체를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이 CLDN18.2와의 결합능을 유지하는 것을 특징으로 하는, CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 변이체1의 돌연변이가 적어도 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열의 6번째 위치 및/또는 7번째 위치에서 발생하고;
    상기 변이체2의 돌연변이가 적어도 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열의 5번째 위치에서 발생하고;
    상기 변이체3의 돌연변이가 적어도 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열의 3번째 위치에서 발생하고;
    상기 변이체4의 돌연변이가 적어도 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열의 8번째 위치 및/또는 9번째 위치에서 발생하고;
    상기 변이체5의 돌연변이가 적어도 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 위치 및/또는 4번째 위치에서 발생하고;
    상기 변이체6의 돌연변이가 적어도 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열의 3번째 내지 5번째 위치 중 하나 또는 여러 위치에서 발생하고; 바람직하게는,
    상기 변이체1이 돌연변이 S6G 및/또는 Y7F를 함유하고, 상기 변이체2가 돌연변이 G5R을 함유하고, 상기 변이체3이 돌연변이 D3E를 함유하고, 상기 변이체4가 돌연변이 S8R 및/또는 N9Y를 함유하고, 상기 변이체5가 돌연변이 G1D 및/또는 T4N을 함유하고, 상기 변이체6이 돌연변이 Y3R/N, N4S 및 N5Y 중 하나 또는 복수개를 함유하고; 보다 바람직하게는,
    상기 변이체1의 아미노산 서열은 서열번호 6 또는 7로 표시되고;
    상기 변이체2의 아미노산 서열은 서열번호 17로 표시되고;
    상기 변이체3의 아미노산 서열은 서열번호 19로 표시되고;
    상기 변이체4의 아미노산 서열은 서열번호 40 또는 41로 표시되고;
    상기 변이체5의 아미노산 서열은 서열번호 48로 표시되고;
    상기 변이체6의 아미노산 서열은 서열번호 56 내지 58 중 어느 하나로 표시되는 것을 특징으로 하는, CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 HCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 7로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 17로 표시되고 상기 HCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 27로 표시되고;
    상기 HCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 18로 표시되고 상기 HCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 28로 표시되고;
    상기 HCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 16으로 표시되고 상기 HCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 29로 표시되거나,
    상기 HCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 19로 표시되고 상기 HCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 28로 표시되고;
    바람직하게는, 상기 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역이 인간 항체 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역이고, 상기 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역을 코딩하는 유전자가 바람직하게 생식계열 V유전자 IGHV3-23으로부터 유래되고;
    보다 바람직하게는, 상기 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역에서, HFR1이 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, HFR2가 서열번호 10 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, HFR3이 서열번호 21 내지 24 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, HFR4가 서열번호 31 내지 33 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는, CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 LCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 41로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 48로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 56으로 표시되고;
    상기 LCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 42로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 57로 표시되고;
    상기 LCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 42로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 55로 표시되거나,
    상기 LCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 42로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 58로 표시되고;
    바람직하게는, 상기 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역이 인간 항체의 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역이고, 상기 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역을 코딩하는 유전자가 바람직하게 생식계열 V유전자 IGKV3-11 또는 IGKV3-15로부터 유래되고;
    보다 바람직하게는, 상기 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역에서, LFR1이 서열번호 35 내지 38 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, LFR2가 서열번호 44 또는 45로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, LFR3이 서열번호 50 내지 53 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, LFR4가 서열번호 60 또는 61로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는, CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 HCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 7로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 17로 표시되고, 상기 HCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 27로 표시되고, 상기 LCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 41로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 48로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 56으로 표시되고;
    상기 HCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 18로 표시되고, 상기 HCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 28로 표시되고, 상기 LCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 42로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 57로 표시되고;
    상기 HCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 16으로 표시되고, 상기 HCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 29로 표시되고, 상기 LCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 42로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 55로 표시되고;
    상기 HCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 16으로 표시되고, 상기 HCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 29로 표시되고, 상기 LCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 42로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 58로 표시되거나,
    상기 HCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 8로 표시되고, 상기 HCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 19로 표시되고, 상기 HCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 28로 표시되고, 상기 LCDR1의 아미노산 서열이 서열번호 42로 표시되고, 상기 LCDR2의 아미노산 서열이 서열번호 47로 표시되고 상기 LCDR3의 아미노산 서열이 서열번호 57로 표시되는 것을 특징으로 하는, CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 64로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고;
    상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 73으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고;
    상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 72로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고;
    상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 68로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 74로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하거나,
    상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 66으로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 72로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하되,
    상기 변이체가 적어도 돌연변이 전의 서열의 기능을 유지하고, 상기 변이체와 돌연변이 전의 서열의 동일성이 적어도 85%이고, 바람직하게는 적어도 90%이고, 보다 바람직하게는 적어도 95%이고, 보다 더 바람직하게는 적어도 99%인 것을 특징으로 하는, CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    CLDN18.2를 표적으로 하는 상기 항체가 항체 중쇄 불변 영역 및 항체 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하되; 바람직하게는, 상기 중쇄 불변 영역이 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4 또는 이의 변이체로부터 선택되고, 상기 경쇄 불변 영역이 인간 항체의 κ사슬 또는 λ사슬 또는 이의 변이체로부터 선택되고; 보다 바람직하게는, 상기 중쇄 불변 영역이 hIgG1이고, 상기 경쇄 불변 영역이 인간 항체의 κ사슬인 것을 특징으로 하는 CLDN18.2를 표적으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    CLDN18.2를 표적으로 하는 상기 항체가 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 이중 특이성 항체, 다중 특이성 항체, 중쇄 항체 또는 단일 도메인 항체이거나, 상기 항체에 의해 제조된 단일 클론 항체 또는 다중 클론 항체인 것을 특징으로 하는, CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    전장 항체이고, 상기 전장 항체가 중쇄 및 경쇄를 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 77 내지 90 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 93 내지 96 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고; 바람직하게는,
    상기 중쇄가 서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 78로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 93으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 95로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 82로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 96으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 80으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 86으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 95로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 96으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 94로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 중쇄가 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 95로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나,
    상기 중쇄가 서열번호 90으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 96으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  11. 제10항에 따른 분리된 핵산을 포함하되; 바람직하게는, 상기 재조합 발현 벡터가 플라스미드, 코스미드, 파지 또는 바이러스 벡터이고, 상기 바이러스 벡터가 바람직하게 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 연관 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
  12. 숙주 세포에 제11항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하되; 바람직하게는, 상기 숙주 세포가 E.coli TG1, BL21세포, 또는 CHO-K1세포인 것을 특징으로 하는, 형질전환체.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하되; 바람직하게는, 상기 유전자 변형된 세포가 진핵 세포이고, 바람직하게는 분리된 인간 세포이고; 보다 바람직하게는 T세포, 또는 NK세포와 같은 면역 세포인 것을 특징으로 하는, 유전자 변형된 세포.
  15. 제12항에 따른 형질전환체를 배양하고, 배양물로부터 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  16. 세포 독성제, 및 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하되; 바람직하게는, 상기 세포 독성제가 MMAF 또는 MMAE인 것을 특징으로 하는, 항체 약물 접합체.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 제16항에 따른 항체 약물 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로서,
    바람직하게는, 상기 약학 조성물이 호르몬 제제, 표적화된 소분자 제제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양 용해제, 세포 독성제, 사이토카인, 공동 자극 분자의 활성화제, 억제성 분자의 억제제 및 백신으로 이루어진 군 중 하나 또는 다수를 더 함유하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  18. 종양을 진단, 예방 및/또는 치료하는 약물을 제조하기 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제16항에 따른 항체 약물 접합체 및/또는 제17항에 따른 약학 조성물의 용도로서,
    바람직하게는, 상기 종양이 CLDN18.2 양성 종양이고; 보다 바람직하게는, 상기 종양은 위암, 식도암, 폐암, 난소암, 흑색종, 신장암, 유방암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 방광암, 두경부암, 기관지암, 신경교종 및/또는 백혈병인 것을 특징으로 하는, 용도.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제13항에 따른 키메라 항원 수용체, 제14항에 따른 유전자 변형된 세포, 또는 제16항에 따른 항체 약물 접합체 또는 제17항에 따른 약학 조성물을 포함하는 키트로서,
    바람직하게는, 상기 키트가 (i)항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항체 약물 접합체 또는 약학 조성물을 투여하는 장치; 및/또는 (ii)사용 설명서를 추가로 포함하는 것을 특징으로, 하는 키트.
  20. 키트A 및 키트B를 포함하되,
    상기 키트A가 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제13항에 따른 키메라 항원 수용체, 제14항에 따른 유전자 변형된 세포, 제16항에 따른 항체 약물 접합체 및/또는 제17항에 따른 약학 조성물을 함유하고;
    상기 키트B가 다른 항종양 항체 또는 상기 다른 항종양 항체를 포함하는 약학 조성물, 및/또는 호르몬 제제, 표적화된 소분자 제제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양 용해제, 세포 독성제, 사이토카인, 공동 자극 분자의 활성화제, 억제성 분자의 억제제 및 백신으로 이루어진 군 중 하나 또는 다수를 함유하는 것을 특징으로 하는, 키트 세트.
  21. 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제13항에 따른 키메라 항원 수용체, 제16항에 따른 항체 약물 접합체 또는 제17항에 따른 약학 조성물을 투여하거나, 제20항에 따른 키트 세트를 사용하여 필요로 하는 환자를 치료하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 CLDN18.2에 의해 매개된 질환 또는 병증을 진단, 치료 및/또는 예방하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 질환 또는 병증이 종양이고, 바람직하게는 CLDN18.2 양성 종양이고, 보다 바람직하게는 위암, 식도암, 폐암, 난소암, 흑색종, 신장암, 유방암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 방광암, 두경부암, 기관지암, 신경교종 및/또는 백혈병인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제13항에 따른 키메라 항원 수용체, 제16항에 따른 항체 약물 접합체 또는 제17항에 따른 약학 조성물을 사용하는 단계를 포함하되; 바람직하게는, 상기 검출이 비진단적 및/또는 치료적 목적인 것을 특징으로 하는 CLDN18.2의 면역 검출 또는 측정 방법.
  24. 필요로 하는 환자에게 각각 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 CLDN18.2를 표적으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제13항에 따른 키메라 항원 수용체, 제16항에 따른 항체 약물 접합체 또는 제17항에 따른 약학 조성물, 및 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함하되; 상기 제2 치료제가 바람직하게 다른 항종양 항체 또는 상기 다른 항종양 항체를 포함하는 약학 조성물, 및/또는 호르몬 제제, 표적화된 소분자 제제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양 용해제, 세포 독성제, 사이토카인, 공동 자극 분자의 활성화제, 억제성 분자의 억제제 및 백신으로 이루어진 군 중 하나 또는 다수를 포함하는 것을 특징으로 하는, 병용 요법.
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