JP7461469B2 - Ｃｌｄｎ１８．２を標的とする抗体及びその製造方法並びに使用 - Google Patents

Ｃｌｄｎ１８．２を標的とする抗体及びその製造方法並びに使用 Download PDF

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Description

本願には出願日が２０１９年９月３０日の中国特許出願第２０１９１０９４１３１６３号の優先権が主張され、前記中国特許出願の全文が引用される。
本発明は、バイオ医薬品分野に関し、特に、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体及びその製造方法並びに使用に関する。
今やがんは人類にとって最も致命的な疾患の１つである。２０１８年世界保健機関（ＷＨＯ）の報告によると、毎年の新規がん症例は約１８０７万例である。毎年がんのため死亡したのは約９５５万例である。ＷＨＯの推定によると、胃がんは世界で５番目に多く診断されるがんである。また胃がんはがん関連の死亡で男性に３番目に多く、女性に４番目に多い。世界で毎年胃がんと新規に診断される患者は１００万で、米国で初めて胃がんと診断される患者のうち約３５％は転移性胃がんである。晩期胃がんと確診される患者の５年生存率は５％で、生存期間の中央値は約６ヶ月である。転移性／再発性胃がん患者の治療の第一選択薬は次の２種である。（１）ＨＥＲ２－ｎｅｕ陽性症例の場合は、トラスツズマブ（Ｔｒａｎｓｔｕｚｕｍａｂ）と化学療法薬を組み合わせて治療する。（２）ＨＥＲ２－ｎｅｕ陰性症例の場合は、化学療法薬でのみ治療するが、治療効果は満足できなかった（Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１８ Ｓｅｐ １３；９：４０４）。
ＣＬＤＮ１８（クローディン１８、Ｃｌａｕｄｉｎ１８）分子スプライスバリアント１（ＣＬＤ１８Ａ１、即ちＣＬＤＮ１８．１）のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿０５７４５３、ＮＭ０１６３６９で、スプライスバリアント２（ＣＬＤ１８Ａ２、即ちＣＬＤＮ１８．２）のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ＿００１００２０２６）であり、分子量が約２７．９／２７．７２ｋＤの内因性膜貫通型タンパク質である。クローディンは上皮と内皮の密着結合に位置する内因性膜タンパク質である。他に主な密着結合ファミリータンパク質はオクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）と接合接着分子（ＪＡＭ）の２つである。クローディンは密着結合に欠かせない成分で、上皮細胞の極性を維持し、傍細胞輸送を制御し、細胞の成長と分化を調節する上で重要な役割を果たす。クローディンは構造が整っている上皮では殆ど抗体に近づけないが、腫瘍細胞では露出すると推定される。クローディン分子は細胞膜を４回通過し、Ｎ末端とＣ末端の両方が細胞質に着地している。そのうち、ヒトＣＬＤＮ１８．２（クローディン１８．２、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２）タンパク質は全長２６１アミノ酸の膜貫通型タンパク質で、そのうち１～２３番目はシグナルペプチドであり、シグナルペプチド後方の約５５アミノ酸の細胞外ループ１（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ １、ＥＣＬ１）と２３アミノ酸のＥＣＬ２の２つの膜外領域を有する。ＣＬＤＮ１８．１（クローディン１８．１、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．１）とＣＬＤＮ１８．２は最初のＴＭとループ１（即ちＥＣＬ１）を含むＮ末端の最初の２１のアミノ酸に違いがあるが、Ｃ末端の一次タンパク質配列は同じである。ヒトＣＬＤＮ１８．２とヒトＣＬＤＮ１８．１のＥＣＬ１領域は非常に類似しており、しかもヒトＣＬＤＮ１８．２とヒトＣＬＤＮ１８．１のＥＣＬ２領域は全く同じである。したがって、ヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質を標的とする抗体の開発には、ヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質のＥＣＬ１領域又は空間構造に対する抗体を見つける必要がある。これによってその方の作業は難しくなる。ＣＬＤＮ１８．１は正常な肺と胃の上皮において選択的に発現される（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００１ Ｎｏｖ；２１（２１）：７３８０～９０．）。ＣＬＤＮ１８．２は正常な組織での発現が胃上皮の分化細胞と高度に限定されており、胃幹細胞領域には存在しない。しかし、胃、食道、膵臓、肺の腫瘍とヒトのがん細胞株など、いくつかの種類のがんでは高度な発現が認められる。当該タンパク質の分子量はいくつかのがんと隣接する正常な組織とで異なる。健常な組織で観察された高分子量のタンパク質は脱グリコシル化合物ＰＮＧａｓｅＦによって組織溶解物を処理することによりがんで観察されるのと同じ分子量に変換することができる。これは正常な組織での対応する物質と比べて、がんではクローディンのＮ－グリコシル化が少ないことを示唆している。このような構造の違いにより、変化したエピトープが生成される可能性が高い。標準的なＮ－グリコシル化モチーフは当該分子のループＤ３ドメインの１１６位アミノ酸に位置する（ＣＮ１０３５０９１１０Ｂ）。
今や、ヒトＣＬＤＮ１８．２抗体に関する研究で臨床試験段階に来ているのはクラウジキシマブ（Ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ、ＩＭＡＢ３６２）抗体だけである（ＷＯ２０１４／１４６６７２参照）。ＩＭＡＢ３６２はＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存－細胞媒介細胞傷害）効果、ＣＤＣ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、補体依存性細胞傷害）効果を誘発し、腫瘍の殺傷を媒介することができる。ＩＭＡＢ３６２は晩期胃・食道がんの治療のための第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験で喜ばしい結果を示している（Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１８ Ｓｅｐ；１００：１７～２６）。しかし、ＩＭＡＢ３６２はヒト－マウスキメラ抗体で、免疫原性のリスクがあり、親和性は不十分である。細胞学的実験により、内在化活性が弱く、ＡＤＣの開発には適さず、しかも治療効果は非常に限定的であることが示されている。悪性腫瘍に関してなおも多くの事項が実現されていないため、望ましい薬理学的特性を備えている他のＣＬＤＮ１８．２抗体はなおも必要である。当技術分野では効果的にヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質を標的とする抗体、特に完全ヒト抗体や、細胞結合活性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、成長阻害効果、内在化活性などがより優れた抗体が欠如すると言える。
本発明が解決しようとする技術的課題は本分野ではＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体が欠如するという欠点を克服するために、ＣＬＤＮ１８．２（ヒトクローディン１８．２）を標的とする抗体及びその製造方法並びに使用を提供する。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第１態様は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び／又は重鎖可変領域（ＶＨ）を含みＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、前記重鎖可変領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１は配列番号８に示すアミノ酸配列又はそのバリアント１を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１６及びそのバリアント２、配列番号１８及びそのバリアント３から選ばれるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は配列番号２６～２９のいずれか一つに示すアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ１は配列番号４２に示す配列又はそのバリアント４を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号４７に示す配列又はそのバリアント５を含み、前記ＬＣＤＲ３は配列番号５５に示す配列又はそのバリアント６を含み、前記バリアントとは初期配列に１つ、２つ又は３つのアミノ酸が置換、欠失又は追加されたものであり、前記バリアントを含む抗体又は抗原結合フラグメントにはＣＬＤＮ１８．２との結合能が保持されている。
「３つ、２つ又は１つのアミノ酸変異を有する」又は類似する文脈において、「アミノ酸変異」とは初期のアミノ酸配列と比べて、バリアントの配列にアミノ酸の変異が存在することを指し、それは初期のアミノ酸配列にアミノ酸の挿入、削除又は置換が起こったものを含む。例示的には、３つ、２つ又は１つのアミノ酸の変異を含んでもよいＣＤＲの変異と理解され、これらのＣＤＲには任意選択で同じ又は異なる数のアミノ酸残基を選択して変異させてもよく、例えば、ＣＤＲ１に１つのアミノ酸を変異させて、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸を変異させないものであってもよい。
本発明では、前記変異は当業者が知っている従来の変異を含んでもよく、例えば、抗体を生産又は使用する過程で、抗体にいくつかの変異を行わせるこができ、例えば、存在し得る、特にＣＤＲ領域の翻訳後修飾（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、ＰＴＭｓ）部位に変異を行わせ、抗体の凝集、脱アミド化感受性（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）部位（ＮＧ、ＮＳ、ＮＨなど）、アスパラギン酸異性（ＤＧ、ＤＰ）感受性部位、Ｎ－グリコシル化（Ｎ－｛Ｐ｝Ｓ／Ｔ）感受性部位、酸化感受性部位などの関連の変異を含む。
上記の「バリアント」に関して、
前記バリアント１の変異は少なくとも配列番号８に示すアミノ酸配列の６位及び／又は７位に起こることが好ましい。
前記バリアント２の変異は少なくとも配列番号１６に示すアミノ酸配列の５位に起こることが好ましい。
前記バリアント３の変異は少なくとも配列番号１８に示すアミノ酸配列の３位に起こることが好ましい。
前記バリアント４の変異は少なくとも配列番号４２に示すアミノ酸配列の８位及び／又は９位に起こることが好ましい。
前記バリアント５の変異は少なくとも配列番号４７に示すアミノ酸配列の１位及び／又は４位に起こることが好ましい。
前記バリアント６の変異は少なくとも配列番号５５に示すアミノ酸配列の３～５位の１つ又は複数に起こることが好ましい。
好ましくは、前記バリアント１は変異Ｓ６Ｇ及び／又はＹ７Ｆを含み、前記バリアント２は変異Ｇ５Ｒを含み、前記バリアント３は変異Ｄ３Ｅを含み、前記バリアント４は変異Ｓ８Ｒ及び／又はＮ９Ｙを含み、前記バリアント５は変異Ｇ１Ｄ及び／又はＴ４Ｎを含み、前記バリアント６は変異Ｙ３Ｒ／Ｎ、Ｎ４Ｓ及びＮ５Ｙの１つ又は複数を含む。
本発明の好ましい実施形態で、前記バリアント１のアミノ酸配列は配列番号６又は７に示すとおりであり、
本発明の好ましい実施形態で、前記バリアント２のアミノ酸配列は配列番号１７に示すとおりであり、
本発明の好ましい実施形態で、前記バリアント３のアミノ酸配列は配列番号１９に示すとおりであり、
本発明の好ましい実施形態で、前記バリアント４のアミノ酸配列は配列番号４０又は４１に示すとおりであり、
本発明の好ましい実施形態で、前記バリアント５のアミノ酸配列は配列番号４８に示すとおりであり、
本発明の好ましい実施形態で、前記バリアント６のアミノ酸配列は配列番号５６～５８いずれか一つに示すとおりである。
本発明のより好ましい実施形態で、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号７に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１７に示すとおりであり且つ前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２７に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１８に示すとおりであり且つ前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１６に示すとおりであり且つ前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２９に示すとおりであり、又は、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１９に示すとおりであり且つ前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２８に示すとおりであり、
且つ／又は、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４１に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４８に示すとおりであり且つ前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５６に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４２に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり且つ前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４２に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり且つ前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５５に示すとおりであり、又は、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４２に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり且つ前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりである。
好ましくは、前記ＶＨは重鎖可変領域フレームワーク領域（ＶＨ ＦＷＲ）をさらに含み、且つ／又は、前記ＶＬは軽鎖可変領域フレームワーク領域（ＶＬ ＦＷＲ）をさらに含み、
より好ましくは、前記ＶＨ ＦＷＲはヒト抗体の重鎖可変領域フレームワーク領域であり、前記ＶＬ ＦＷＲはヒト抗体の軽鎖可変領域フレームワーク領域である。
なお、前記重鎖可変領域フレームワーク領域をコードする遺伝子は生殖細胞系列Ｖ遺伝子ＩＧＨＶ３－２３に由来することが好ましく、好ましくは、前記重鎖可変領域フレームワーク領域で、ＨＦＲ１は配列番号２～４のいずれか一つに示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、ＨＦＲ２は配列番号１０～１４のいずれか一つに示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、ＨＦＲ３は配列番号２１～２４のいずれか一つに示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、ＨＦＲ４は配列番号３１～３３のいずれか一つに示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含む。
前記軽鎖可変領域フレームワーク領域をコードする遺伝子は生殖細胞系列Ｖ遺伝子ＩＧＫＶ３－１１又はＩＧＫＶ３－１５に由来することが好ましく、
好ましくは、前記軽鎖可変領域フレームワーク領域で、ＬＦＲ１は配列番号３５～３８のいずれか一つに示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、ＬＦＲ２は配列番号４４又は４５に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、ＬＦＲ３は配列番号５０～５３のいずれか一つに示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、ＬＦＲ４は配列番号６０又は６１に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含む。
本発明の最も好ましい実施形態で、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号７に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１７に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２７に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４１に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４８に示すとおりであり且つ前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５６に示すとおりであり、
前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２８に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４２に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり且つ前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり、
前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１６に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２９に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４２に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり且つ前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５５に示すとおりであり、
前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１６に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２９に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４２に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり且つ前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５８に示すとおりであり、
又は、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１９に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２８に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４２に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり且つ前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであり。
本発明の特定の実施形態で、前記重鎖可変領域は配列番号６４に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号７１に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
前記重鎖可変領域は配列番号６７に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号７３に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
前記重鎖可変領域は配列番号６５に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号７２に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
前記重鎖可変領域は配列番号６８に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号７４に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
又は、前記重鎖可変領域は配列番号６６に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号７２に示すアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、
なお、前記バリアントには少なくとも変異前配列の機能が保持されており、且つ前記バリアントと変異前配列の相同性は少なくとも８５％であり、好ましくは少なくとも９０％であり、より好ましくは少なくとも９５％であり、さらに好ましくは少なくとも９９％である。
本願では、上記のＣＤＲのアミノ酸配列は全てＣｈｏｔｈｉａ定義方式で示される（本発明の請求項に記載の配列もＣｈｏｔｈｉａ定義方式で示される）。当業者が知っているように、本分野では、例えば、配列可変性に基づくＫａｂａｔ定義方式（Ｋａｂａｔ，ｅｔ．ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ（１９９１）参照）、構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａ定義方式（ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７～４８，１９９７参照）など、様々な方式で抗体のＣＤＲを定義することができる。本願では、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義を組み合わせた（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ）定義方式を採用して可変ドメイン配列のアミノ酸残基を決定することもできる。組み合わせた（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ）定義方式はＫａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の範囲を合わせたものであるため、範囲が拡大しており、その詳細は表１－１を参照する。当業者が理解しているように、他に規定がある場合を除いて、特定の抗体又はその領域（例えば、可変領域）の「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は本発明で説明した前記実施形態のいずれかにおいて限定された相補性決定領域を含むものと理解される。本発明の請求項で保護を求める範囲はＣｈｏｔｈｉａ定義方式で配列を示しているが、他のＣＤＲ定義方式に基づく対応するアミノ酸配列も本発明の保護範囲に含まれる。
Figure 0007461469000001
ここで、Ｌａａ－Ｌｂｂとは抗体軽鎖のＮ末端からのａａ位からｂｂ位までのアミノ酸配列を指してもよく、Ｈａａ－Ｈｂｂとは抗体重鎖のＮ末端からのａａ位からｂｂ位までのアミノ酸配列を指してもよい。例えば、Ｌ２４－Ｌ３４とは抗体軽鎖Ｎ末端から、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式による２４位から３４位までのアミノ酸配列を指してもよく、Ｈ２６－Ｈ３２とは抗体重鎖Ｎ末端から、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式による２６位から３２位までのアミノ酸配列を指してもよい。当業者が知っているように、Ｃｈｏｔｈｉａ方式でＣＤＲを番号付けする場合に、特定の位置には挿入部位がある可能性がある。例えば、本発明の配列番号１７に示すＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列の場合、次の表１－２に示すように、５２位後に５２Ａが挿入された場合がある。
Figure 0007461469000002
好ましくは、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体は抗体重鎖定常領域と抗体軽鎖定常領域とをさらに含み、
より好ましくは、前記重鎖定常領域はｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４又はそのバリアントから選ばれ、前記軽鎖定常領域はヒト抗体の軽鎖κ鎖又はλ鎖又はそのバリアントから選ばれ、
さらに好ましくは、前記重鎖定常領域はｈＩｇＧ１であり、且つ前記軽鎖定常領域はヒト抗体の軽鎖κ鎖である。
好ましくは、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体は全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、一本鎖抗体）、二重特異性抗体、多重特異性抗体、重鎖抗体もしくは単一ドメイン抗体、又は前記抗体から製造されたモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術など、様々な手段と技術で開発することができるが、ハイブリドーマ技術によって野生型又はトランスジェニックマウスからモノクローナル抗体を製造するのが主流である。
前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体が二重特異性抗体である場合に、それは第１タンパク質ドメインと第２タンパク質ドメインとを含んでもよい。前記第１タンパク質ドメインはＣＬＤＮ１８．２を標的にして結合する上記のタンパク質であってもよく、前記第２タンパク質ドメインはＣＬＤＮ１８．２を標的とせず結合するタンパク質又は同じくＣＬＤＮ１８．２を標的にして結合するが本発明に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体でないものである。前記第１タンパク質ドメインは免疫グロブリンであってもよく、前記第２タンパク質ドメインは１つ又は複数のｓｃＦｖであってもよく、又は、前記第２タンパク質ドメインは免疫グロブリンであってもよく、前記第１タンパク質ドメインは１つ又は複数のｓｃＦｖであってもよい。
好ましくは、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体は全長抗体であり、前記全長抗体は重鎖と軽鎖とを含み、前記重鎖は配列番号７７～９０のいずれか一つに示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９３～９６のいずれか一つに示すアミノ酸配列を含む。
さらに特定の実施形態で、前記重鎖は配列番号７７に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９３に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号７８に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９４に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号７９に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９３に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号８５に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９３に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号８３に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９３に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号８４に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９３に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号８１に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９５に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号８２に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９６に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号８０に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９４に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号８６に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９５に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号８７に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９６に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号８８に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９４に示すアミノ酸配列を含み、
前記重鎖は配列番号８９に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９５に示すアミノ酸配列を含み、
又は、前記重鎖は配列番号９０に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号９６に示すアミノ酸配列を含む。以下、表１－３にまとめた抗体例の配列番号を使用する。
Figure 0007461469000003
Figure 0007461469000004
前記変異とは前記ＶＬ及び／又はＶＨのアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸残基が削除、置換又は追加されたものであり、且つ前記変異アミノ酸配列は前記ＶＬ及び／又はＶＨのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有し、しかも前記抗体のＣＬＤＮ１８．２との結合が保持又は改善されており、前記少なくとも８５％の配列相同性は少なくとも９０％の配列相同性であることが好ましく、少なくとも９５％の配列相同性であることがより好ましく、少なくとも９９％の配列相同性であることが最も好ましい。
本発明では、「Ｆａｂフラグメント」は１つの軽鎖及び１つの重鎖のＣＨ１と可変領域とからなる。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆｃ」領域は抗体のＣＨ１及びＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含む。２つの重鎖フラグメントは２つ又はそれ以上のジスルフィド結合とＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一体的に保持されている。「Ｆａｂ’フラグメント」は１つの軽鎖と、ＶＨドメインとＣＨ１ドメイン及びＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の領域を含む１つの重鎖との部分を含み、これによって２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子が生成される。「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は２つの軽鎖と、ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含む２つの重鎖とを含み、これによって２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。これによってＦ（ａｂ’）２フラグメントは２つの重鎖間のジスルフィド結合によって一体的に保持された２つのＦａｂ’フラグメントからなる。用語「Ｆｖ」とは抗体のシングルアームのＶＬとＶＨドメインからなり、定常領域を欠く抗体フラグメントを指す。
本発明では、前記ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、一本鎖抗体）は重鎖可変領域と、軽鎖可変領域と、１５～２０のアミノ酸の短ペプチドとを含む本分野通常の一本鎖抗体であってもよい。ＶＬとＶＨドメインは単一のポリペプチド鎖を生成させられるリンかーによってペアリングされて一価分子を形成させる［例えば、Ｂｉｒｄ，ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ．ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３（１９８８）参照］。このようなｓｃＦｖ分子の一般的な構造はＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨであってもよい。適切な従来のリンカーは繰り返すアミノ酸配列Ｇ４Ｓ又はそのバリアントからなる。例えば、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４又は（Ｇ４Ｓ）３を有するリンカーを使用してもよいし、そのバリアントを使用してもよい。
用語「多重特異性抗体」は、複数のエピトープに特異的な抗体を含むと最も広い範囲で使用される。当該多重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み当該ＶＨ－ＶＬ単位は複数のエピトープに対する特異性を有する抗体と、２つ又はそれ以上のＶＬとＶＨ領域を有し各ＶＨ－ＶＬ単位は異なる標的又は同じ標的の異なるエピトープと結合する抗体、２つ又はそれ以上の単一可変ドメインを有し各単一可変ドメインは異なる標的又は同じ標的の異なるエピトープと結合する抗体や、全長抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、共有又は非共有に接続された抗体フラグメントなどを含み、ただしそれらに限定されない。
本発明の抗体はモノクローナル抗体を含む。本発明に記載のモノクローナル抗体又はｍＡｂ又はＡｂとは、単一のクローン細胞株から得られる抗体であり、前記細胞株は真核、原核又はファージのクローン細胞株のいずれかに限定されるものではない。
本発明では、前記「重鎖抗体」とは１つの重鎖可変領域（ＶＨＨ）と２つの通常のＣＨ２及びＣＨ３領域とを含む抗体であり、ＨＣＡｂｓとも呼ばれる。
本発明では、前記「単一ドメイン抗体」は「ナノボディ」とも呼ばれ、重鎖抗体からクローニングしたＶＨＨ構造を指し、目的抗原と結合できる既知の最小単位である。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第２態様は、本発明の第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体をコードする、分離された核酸を提供する。
前記核酸の製造方法は本分野通常の製造方法であり、好ましくは、遺伝子クローニング技術によって前記抗体をコードする核酸分子を得るステップ、又は人工完全配列合成により前記抗体をコードする核酸分子を得るステップを含む。
当業者が知っているように、前記抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列に置換、削除、改変、挿入又は追加を適切に導入してポリヌクレオチドのホモログを提供することができる。本発明でポリヌクレオチドのホモログは当該抗体配列をコードする遺伝子の１つ又は複数の塩基を、抗体の活性を保持させる範囲で置換、欠失又は追加することによって製造することができる。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第３態様は、本発明の第２態様に記載の分離された核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。
前記組換え発現ベクターは、本発明に記載の核酸分子を様々な発現ベクターに接続させるという本分野の通常の方法で構築することができる。前記発現ベクターは本分野の通常の様々なベクターで、前記核酸分子を受け入れられるものであれば問題はない。
好ましくは、前記組換え発現ベクターはプラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスベクターであり、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターであることが好ましい。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第４態様は、宿主細胞に本発明の第３態様に記載の組換え発現ベクターが含まれる形質転換体を提供する。
前記組換え発現形質転換体の製造方法は、例えば、前記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入するなど、本分野の通常の製造方法であってもよい。前記宿主細胞は本分野の通常の様々な宿主細胞で、前記組換え発現ベクターは自ら安定的に複製することができ、しかも保有する前記核酸が効果的に発現されるものであれば問題はない。好ましくは、前記宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１又はＢＬ２１細胞（一本鎖抗体又はＦａｂ抗体を発現する）、又はＣＨＯ－Ｋ１細胞（全長ＩｇＧ抗体を発現する）である。前記組換え発現プラスミドを宿主細胞に導入すれば、本発明の好ましい組換え発現形質転換体を得る。前記導入方法は本分野の通常の形質転換方法で、好ましくは、化学的形質転換法、熱処理法、又は電気穿孔法である。
本発明では、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などとすることによって、それを用いて、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞などの細胞を修飾することができる。そのために、本発明は第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントを含むものを提供する。例えば、それは前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体のｓｃＦｖを細胞外抗原結合ドメインとして利用するキメラ抗原受容体である。これに鑑みて、上記の技術的課題を解決するための本発明の第５態様は、本発明の第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を含む遺伝子修飾細胞を提供する。
好ましくは、前記遺伝子修飾細胞は真核細胞であり、好ましくは分離されたヒト細胞であり、より好ましくはＴ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔの形態）、又はＮＫ細胞などの免疫細胞である。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第６態様は、本発明の第４態様に記載の形質転換体を培養し、培養物からＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を得ることを含む、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体の製造方法を提供する。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第７態様は、細胞毒性薬と、本発明の第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体とを含む抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）を提供する。
前記細胞毒性薬は、細胞毒素、化学療法剤、放射性同位体、治療用核酸、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖性アポトーシス促進剤又は細胞溶解酵素であることが好ましく、前記細胞毒性薬はチュウブリン合成酵素阻害剤であるメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、又はメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）であることがより好ましい。
前記抗体－薬物複合体の製造方法は本分野の通常の方法であってもよく、好ましくは、「Ｄｏｒｏｎｉｎａ，２００６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７，１１４～１２４」に記載の製造方法を採用する。好ましくは、前記製造方法で最小低結合分画（ＬＣＦ）が１０％未満の抗体－薬物複合体が生成される。
前記抗体－薬物複合体は本分野で知られている任意の物理的形態で存在してもよく、好ましくは、透明な溶液である。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第８態様は、本発明の第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体及び／又は本発明の第７態様に記載の抗体－薬物複合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
前記医薬組成物は、有効成分として他の抗腫瘍抗体をさらに含み、且つ／又は、ホルモン製剤、標的化小分子製剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断剤、化学療法薬、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子活性化剤、抑制性分子阻害剤及びワクチンからなる群のうちの１種又は複数種を含むことが好ましい。
前記薬学的に許容される担体は本分野の通常の担体であってもよく、前記担体は生理学的に又は薬学的に許容される任意の適切な医薬添加物であってもよい。前記医薬添加物は本分野の通常の医薬添加物であり、好ましくは、薬学的に許容される賦形剤、充填剤、安定剤又は希釈剤などを含む。より好ましくは、前記医薬組成物は０．０１～９９．９９％の前記タンパク質及び／又は前記抗体－薬物複合体と、０．０１～９９．９９％の医薬担体とを含み、前記パーセンテージは前記医薬組成物に占める質量パーセンテージである。
好ましくは、前記医薬組成物は抗腫瘍薬である。より好ましくは、胃がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、黒色腫、腎臓がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、気管支がん、神経膠腫及び／又は白血病を治療する薬物である。
本発明に記載の医薬組成物の投与経路は、非経口投与、注射投与又は経口投与であることが好ましい。前記注射投与として好ましいのは、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射又は皮下注射などが挙げられる。前記医薬組成物は本分野の通常の様々な剤形で、好ましくは、固体、半固体又は液体の形態であり、即ち水溶液、非水溶液又は懸濁液であってもよく、より好ましくは、錠剤、カプセル、顆粒剤、注射剤又は注入剤などである。より好ましくは、血管内、皮下、腹腔内又は筋肉内で投与される。好ましくは、前記医薬組成物はエアロゾル又はスプレー剤として、即ち、鼻腔内で投与されてもよく、又は、髄腔内、髓内又は心室内で投与される。より好ましくは、前記医薬組成物は経皮、局所、経腸、膣内、舌下又は経直腸で投与されてもよい。
本発明に記載の医薬組成物の投与量レベルは所望の診断又は治療結果を得られる組成物の量に応じて調整されてもよい。投与計画は単回注射又は複数回注射であってもよいし、又は調整してもよい。選択される用量レベルと計画は、前記医薬組成物の活性や安定性（半減期）、剤型、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、検出及び／又は治療の対象となる疾患もしくは障害、及び治療対象の健康状態や治療歴などを含む様々な要因に応じて合理的に調整される。
本発明に記載の医薬組成物の治療上有効な用量は、最初に細胞培養実験、又は、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ及び／又は霊長類などの動物モデルを用いて推定することができる。動物モデルは適切な投与濃度範囲と経路の決定に用いることもできる。その後、ヒトへの投与の有効な用量と経路を決定するために利用することができる。一般に、投与有効量又は用量の決定及び調整、並びにそのような調整をいつどのように行うかの評価は当業者に知られている事項である。
併用療法の場合は、前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、前記抗体－薬物複合体及び／又は他の治療又は診断剤はそれぞれ、所望の治療又は診断を行うのに適する任意の時間枠内で単一の薬剤として投与されてもよい。したがって、これらの単一の薬剤は実質的に同時に（即ち、単一の製剤として又は数分間もしくは数時間以内に）又は連続して投与することができる。例えば、これらの単一の薬剤は、１年以内、又は１０、８、６、４もしくは２ヶ月以内に、又は４、３、２もしくは１週間以内に、又は５、４、３、２もしくは１日以内に投与される。
製剤、用量、投与計画や測定可能な治療結果についての説明は、Ｂｅｒｋｏｗ，ｅｔ．ａｌ（２０００），Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；Ｅｂａｄｉ（１９９８）ＣＲＣ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙなどの文献を参照する。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第９態様は、腫瘍を診断、予防及び／又は治療する薬物を製造するための、本発明の第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、本発明の第７態様に記載の抗体－薬物複合体及び／又は本発明の第８態様に記載の医薬組成物の使用を参照する。
好ましくは、前記腫瘍はＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍であり、より好ましくは、前記腫瘍は胃がん、食道がん、肺がん、黒色腫、腎臓がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、膀胱がん、神経膠腫及び／又は白血病である。
本発明はまた、上記の技術的課題を解決するために、腫瘍を診断、予防及び／又は治療するための、本発明の第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、本発明の第７態様に記載の抗体－薬物複合体及び／又は本発明の第８態様に記載の医薬組成物の使用を提供する。好ましくは、前記腫瘍は本発明の第９態様に記載のとおりである。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第１０態様は、キットＡとキットＢとを含む組み合わせのキットを提供し、前記キットＡは本発明の第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体、及び／又は本発明の第７態様に記載の抗体－薬物複合体、及び／又は本発明の第８態様に記載の医薬組成物であり、前記キットＢは他の抗腫瘍抗体、又は前記他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物を含み、前記キットＢは化学療法薬、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子活性化剤、抑制性分子阻害剤、ワクチン、造影剤、診断剤、ホルモン製剤、標的化小分子製剤、プロテアソーム阻害剤などを含んでもよく、又は前記キットＢは他の抗腫瘍抗体もしくは前記他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物と、ホルモン製剤、標的化小分子製剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断剤、化学療法薬、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子活性化剤、抑制性分子阻害剤、ワクチンなどの両方を含む。前記キットＡとキットＢを同時に使用してもよいし、まずキットＡ、次にキットＢを使用してもよいし、又はまずキットＢ、次にキットＡを使用してもよく、実際のニーズに応じて使用方法を決定することができる。
上記の技術的課題を解決するためには、本発明の第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体もしくはその抗原結合フラグメント、本発明に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第５態様に記載の遺伝子修飾細胞、本発明の第７態様に記載の抗体－薬物複合体、及び／又は本発明の第８態様に記載の医薬組成物は他の薬物と組み合わせて投与されてもよく、例えば、ホルモン製剤、標的化小分子製剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断剤、化学療法薬、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子活性化剤、抑制性分子阻害剤、ワクチンなど、及び／又は他の抗腫瘍抗体（又は、前記他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物）と組み合わせて投与されてもよい。本発明に記載の「ＣＬＤＮ１８．２陽性」細胞とはＣＬＤＮ１８．２タンパク質を過剰発現する細胞で、例えば、ＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞株であり、逆の場合に、「ＣＬＤＮ１８．２陰性」細胞と呼ばれる。
本発明の第１１態様は、それを必要とする患者に治療有効量の、第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体もしくはその抗原結合フラグメント、第７態様に記載の抗体－薬物複合体、又は第８態様に記載の医薬組成物を投与し、又は第１０態様に記載の組み合わせのキットを使用してそれを必要とする患者を治療することを含む、ＣＬＤＮ１８．２が媒介する疾患又は障害を診断、治療及び／又は予防する方法を提供する。
前記ＣＬＤＮ１８．２が媒介する疾患又は障害は腫瘍であってもよく、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍であり、より好ましくは、胃がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、黒色腫、腎臓がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、気管支がん、神経膠腫及び／又は白血病である。
本発明の第１２態様は、第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体もしくはその抗原結合フラグメント、第７態様に記載の抗体－薬物複合体、又は第８態様に記載の医薬組成物を使用することを含む、ＣＬＤＮ１８．２を免疫学的に検出又は測定する方法を提供する。
本発明の第１３態様は、第１態様に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体もしくはその抗原結合フラグメント、第７態様に記載の抗体－薬物複合体、又は第８態様に記載の医薬組成物と、第２治療薬とをそれぞれそれを必要とする患者に投与するステップを含む併用療法を提供し、前記第２治療薬は他の抗腫瘍抗体もしくは前記他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物、及び／又はホルモン製剤、標的化小分子製剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断剤、化学療法薬、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子活性化剤、抑制性分子阻害剤及びワクチンからなる群のうちの１種又は複数種を含むことが好ましい。
本発明では、特に説明がある場合を除いて、本明細書で使用される科学技術用語は当業者が理解している一般的な意味を有する。また、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学的な実験操作ステップは全て対応する分野で一般的に利用されるステップである。以下、本発明の一層の理解のために、関連する用語の定義と解釈を提供する。
本発明では、用語「可変」とは一般に、抗体の可変ドメインの配列の特定の部分が大きく変化し、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合と特異性に寄与することを指す。しかし、可変性は抗体の可変領域全体に均等に分布するのではない。それは軽鎖及び重鎖可変領域の、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインで高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＷＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインのそれぞれは４つのＦＷＲ領域を含み、殆どは３つのＣＤＲによって接続されてループを形成させるβシート構造であるが、場合によってはβシート構造の一部として形成される。各鎖でＣＤＲはＦＷＲ領域によって緊密に結合され、しかも別の鎖からのＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位を形成し、定常領域は抗体と抗原の結合に直接的に関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害に関与するなど、様々なエフェクター機能を示す。
本発明で使用されるアミノ酸の３文字コード及び１文字コードは当業者に知られている事項で、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２４３，ｐ３５５８（１９６８）」にも記載されている。
本明細書で使用される用語「含む」は組成物又は方法が記載された要素を含み、他の要素は除外しないことを意味し、文脈によって、「からなる」を含む場合もある。
用語「ＣＬＤＮ１８．２」はアイソフォーム、哺乳類（例えば、ヒト）ＣＬＤＮ１８．２、ヒトＣＬＤＮ１８．２の種相同体、ＣＬＤＮ１８．２との少なくとも１つの共通エピトープを含むアナログを含む。ＣＬＤＮ１８．２（例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２）のアミノ酸配列はＮＣＢＩデータベースに示されているように、本分野で知られている事項である。
用語「ＣＬＤＮ１８．１」はアイソフォーム、哺乳類（例えば、ヒト）ＣＬＤＮ１８．１、ヒトＣＬＤＮ１８．１の種相同体、ＣＬＤＮ１８．１との少なくとも１つの共通エピトープを含むアナログを含む。ＣＬＤＮ１８．１（例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．１）のアミノ酸配列はＮＣＢＩデータベースに示されているように、本分野で知られている事項である。
用語「エピトープ」とは抗体分子と特異的に相互作用する抗原（例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２）の部分を指す。本発明で用語「競合」とは抗体分子の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子の標的（例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２）との結合を妨害する能力を指す。結合への妨害は直接的ものであってもよいし又は間接的であってもよい（例えば、抗体分子又は標的のアロステリック調節を介するもの）。競合的結合アッセイ（例えば、ＦＡＣＳアッセイ、ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡＣＯＲＥアッセイ）を用いて、抗体分子が別の抗体分子とその標的の結合を妨害する程度を決定することができる。
本発明で使用される用語「抗体」は、２つの同じ重鎖と２つの同じ軽鎖が鎖間ジスルフィド結合によって接続されたテトラペプチド鎖構造である免疫グロブリンを含む。免疫グロブリンの重鎖定常領域のアミノ酸構成と配列が異なるため、その抗原性も異なる。これによって免疫グロブリンを、免疫グロブリンのアイソフォームとも呼ばれるＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥの５つのクラスに分けることができ、対応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同じクラスのＩｇはそのヒンジ領域のアミノ酸構成と重鎖のジスルフィド結合の数や位置の違いによって、異なるサブクラスに分けられ、例えば、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に分けられる。軽鎖は定常領域によってκ鎖、λ鎖に分けられる。５つのクラスのＩｇの各クラスは、いずれもκ鎖又はλ鎖を備えてもよい。
本発明では、前記抗体軽鎖可変領域は軽鎖定常領域をさらに含んでもよく、前記軽鎖定常領域はヒトκ、λ鎖又はそのバリアントを含む。本発明では、本発明に記載の抗体重鎖可変領域は重鎖定常領域をさらに含んでもよく、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、２、３、４又はそのバリアントを含む。
抗体の重鎖と軽鎖のＮ末端付近の約１１０のアミノ酸の配列は大きく変化するものであるから、可変領域（Ｖ領域）である。Ｃ末端付近の残りのアミノ酸配列は比較的安定しており、定常領域（Ｃ領域）である。可変領域は３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、配列が保存された４つのフレームワーク領域（ＦＷＲ）とを含む。３つの超可変領域は抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）のそれぞれは３つのＣＤＲ領域と４つのＦＷＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシ末端まではＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３、ＦＷＲ４の順に配列される。軽鎖の３つのＣＤＲ領域とはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３で、重鎖の３つのＣＤＲ領域とはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３である。
軽鎖と重鎖内で、可変領域と定常領域は約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接続され、重鎖は約３つ又はそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。各重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。抗体の定常領域は免疫グロブリンと宿主組織、又は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）や古典的な補体系の最初の成分（Ｃ１ｑ）などの因子との結合を媒介することができる。ＶＨとＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＷＲ）と呼ばれる保存された領域が点在する変動性の高い領域［相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる］に細分することができる。ＶＨ及びＶＬのそれぞれは、ＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３、ＦＷＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された３つのＣＤＲと４つのＦＷＲからなる。重鎖／軽鎖のそれぞれに対応する可変領域（ＶＨ及びＶＬ）はそれぞれ抗体結合部位を形成する。特に、重鎖は３つ以上、例えば、６つ、９つ又は１２のＣＤＲをさらに含んでもよい。例えば、本発明の二重特異性抗体では、重鎖はＩｇＧ抗体の重鎖のＮ末端が別の抗体に接続されているＳｃＦｖであってもよく、この場合に重鎖は９つのＣＤＲを含む。
用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の可変及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的変異誘発又はインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含む。ただし、用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフト化された抗体（即ち、「ヒト化抗体」）を含まない。
本発明で抗体に関して使用される用語「特異性」とは、特異性抗原を認識するが、サンプルの他の分子を実質的には認識又は結合しない抗体である。例えば、１つの種からの抗原と特異的に結合する抗体は、１つ又は複数の種からの当該抗原とも結合できる。ただし、このような種間交差反応性は特異性に基づく抗体の分類を変えない。もう１つの例では、抗原と特異的に結合する抗体は異なる対立遺伝子の当該抗原のとも結合できる。ただし、このような交差反応性は特異性に基づく抗体の分類を変えない。場合によっては、用語「特異性」又は「特異的結合」とは抗体、タンパク質又はペプチドの第２化学物質との相互作用を指し、当該相互作用は化学物質の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は一般に、タンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識してそれと結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合に、標識された「Ａ」と抗体を含む反応において、エピトープＡを含む分子（又は遊離の非標識Ａ）の存在で抗体と結合する標識されたＡの量が減少する。
本明細書で使用される用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」とは、抗原と結合できる細胞外ドメイン（細胞外結合ドメイン）、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン（膜貫通領域）及び細胞質シグナルを伝達させるドメイン（即ち、細胞内シグナル伝達ドメイン）を含むポリペプチドを指す。ヒンジドメインを細胞外抗原結合領域に柔軟性を提供するための部分と見なすことができる。細胞内シグナル伝達ドメインとは、決定されたシグナル伝達経路がセカンドメッセンジャーを生成することによって情報を細胞内に伝達して細胞の活動を調節するタンパク質、又はそのようなメッセンジャーに対応してエフェクターとして機能するタンパク質を指し、それはＣＡＲ細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。細胞内シグナル伝達ドメインはシグナル伝達ドメインを含み、共刺激分子に由来する共刺激細胞内ドメインをさらに含んでもよい。
「相同性」、「変異配列」、「変異」とは２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド間の配列類似性を指す。２つの対象配列における位置がいずれも同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合に、例えば、２つのＤＮＡ分子の各位置がアデニンによって占められている場合に、前記分子は当該位置で相同である。２つの配列間のパーセント相同性は２つの配列に共有する一致又は相同位置の数を対象位置の数×１００で割った関数である。例えば、配列が最適に整列されている場合に、２つの配列の１０の位置で６つが一致する又は相同であれば、２つの配列は６０％相同である。一般に、２つの配列を比較して最大のパーセント相同性を得ると比較する。「最適化」とは前記抗体の抗原との結合が保持又は改善されている変異であり、本発明では、ＣＬＤＮ１８．２との結合が保持、維持又は改善されている変異である。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」と「タンパク質」（一本鎖の場合）は本発明で入れ替えて使用される。用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」又は「ポリヌクレオチド配列」と「ポリヌクレオチド」は入れ替えて使用される。
用語「変異」はアミノ酸又はヌクレオチドの置換、追加及び／又は削除を含み、「アミノ酸置換」はアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換されること、「保存的アミノ酸置換」は類似する側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されることである。
本明細書で使用される「レンチウイルス」とはレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）の属を指す。レンチウイルスは非***細胞に感染できるためレトロウイルスの中でも独特なものであり、大量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達できるため、遺伝子送達ベクターとして最も効果的な手段である。ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶはいずれもレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターはインビボで有意な遺伝子水平伝播を実現する手段を提供している。
本明細書で使用される用語「ベクター」は分離された核酸を含み、分離された核酸を細胞の内部に送達するために利用できる組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスを含みただしそれらに限定されない多くのベクターは、本分野で知られている。したがって、用語「ベクター」は自律的に複製するプラスミド又はウイルスを含む。当該用語は細胞への核酸の転移を促す非プラスミド及び非ウイルス化合物、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどを含むとも解釈される。ウイルスベクターの例はアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含み、ただしそれらに限定されない。
本発明で使用される用語「細胞」、「細胞株」は入れ替えて使用され、しかもそのように命名するものには子孫が含まれる。用語「宿主細胞」とは、ベクターを導入するために使用できる細胞を指し、それは、大腸菌などの原核細胞、酵母細胞などの真菌細胞、又は、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はヒト細胞などの動物細胞を含み、ただしそれらに限定されない。
用語「トランスフェクション」とは外因性核酸を真核細胞に導入することを指す。ＤＮＡ－リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、バイオリスティック法（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）など、本分野で知られている様々な手段でトランスフェクションを実現することができる。
用語「免疫細胞」とは免疫応答を誘発できる細胞を指し、「免疫細胞」と同等な用語は任意の由来の免疫細胞を指すことができる。「免疫細胞」は、例えば、骨髄で生成される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄に由来する細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）を含む。用語「免疫細胞」は、ヒトであってもよいし、又は非ヒトであってもよい。
本明細書で使用される用語「Ｔ細胞」とは、胸腺で成熟するリンパ球のクラスを指す。Ｔ細胞は細胞性免疫において重要な役割を果たし、細胞の表面にＴ細胞受容体が存在することで他のリンパ球（例えば、Ｂ細胞）と違う。「Ｔ細胞」には、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）、γ－δＴ細胞など、ＣＤ３を発現する全ての種類の免疫細胞が含まれる。「細胞傷害性細胞」にはＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球が含まれ、これらの細胞は細胞傷害性応答を媒介することができる。本明細書で使用される用語「ＮＫ細胞」とは、骨髄に由来し、自然免疫系において重要な役割を果たすリンパ球のクラスを指す。ＮＫ細胞は細胞の表面に抗体や主要な組織適合性複合体が存在しなくても、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞又は他のストレスを受けた細胞に対する迅速な免疫応答を提供する。
例えば、免疫細胞は、自家Ｔ細胞、他家Ｔ細胞、自家ＮＫ細胞、他家ＮＫ細胞など、血液に由来するものであってもよいし、ＥＢＶウイルス感染によって得られたＮＫ細胞株、胚性幹細胞やｉＰＳＣから誘発分化されたＮＫ細胞やＮＫ９２細胞株など、細胞株に由来するものであってもよい。
「任意選択」、「いずれか」、「任意」又は「いずれか一項」とは、後で説明する事象又は状況が発生する可能性はあるが、必ずしもそうであるとは限らないことを意味し、当該説明には当該事象又は状況が発生する場合と発生しない場合が含まれる。例えば、「任意選択で１つの抗体重鎖可変領域を含む」とは特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在してもよいが、必ずしもそうであるとは限らないことを意味する。本発明で使用される「１つ」又は「１種」は１つ又はそれ以上の対象を指す。明確な説明がある場合を除いて、用語「又は」は本発明で用語「及び／又は」の意味でそれと入れ替えて使用される。「約」は一般に測定の性質又は精度により、測定された量に認められる誤差の程度を指すように使用される。例示的に、誤差は一般に１０％の範囲にあり、より一般的には５％の範囲である。本発明で開示されている方法と組成物には、所定の配列、変異配列又はそれらと実質的に同じもしくは類似する配列、例えば、所定の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上同じである配列を有する、ポリペプチドと核酸が含まれる。アミノ酸配列である場合に、用語「実質的に同じ」は本発明で第１アミノ酸配列を指す。
本明細書で使用される用語「ＥＣ５０」とは、半数効果濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ）、即ち、最大反応の５０％を示す濃度を指す。
本発明の医薬組成物は、所望により様々な剤形に製剤化することができ、しかも医師は患者のタイプ、年齢、体重、一般的な病状、投与経路などの要因で患者に有効な用量を決定して投与することができる。投与経路としては、例えば、注射又は他の治療方式を採用する。
本発明で用語「抗体－薬物複合体」と「ＡＤＣ」は入れ替えて使用される。
アウリスタチンは、その物理的特性と創薬可能性を最適化するために化学構造が比較的変えやすい完全合成薬である。抗体との結合に使用されるアウリスタチン誘導体には主にモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）が含まれ、前者は天然のチュウブリンポリメラーゼ阻害剤であるドラスタチン１０（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ－１０）から誘導された合成ペンタペプチドであり、Ｃ末端に２－アミノ－１－フェニルプロピル－１－オールを付加して合成される。ＭＭＡＥは様々なヒト腫瘍細胞株に対する阻害活性が１ｎｍｏｌ未満である。ＭＭＡＥ自体の細胞毒性活性を低減させるために、ＭＭＡＦにはドラスタチン１０のＣ末端にフェニルアラニンを付加させている。１つのカルボキシ基が導入されているため、細胞膜透過性が悪く、細胞に対するＭＭＡＦの生物学的活性が明らかに低下するが、抗体と結合した後、細胞に対する阻害活性が大幅に向上している（ＵＳ７７５０１１６）。
いくつかの実施形態で、抗体－細胞毒性薬物複合体、又は薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物は１つ又は複数のメイタンシノイド分子を結合した本発明の抗体を含む。メイタンシノイドはチュウブリンの多量体化を阻害することによって機能しない有糸***阻害剤である。マイタンシンは最初にアフリカの低木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａ）から分離されていた（米国特許第３８９６１１１号）。その後、一部の微生物が、マイタンシノールやマイタンシノールのＣ－３エステル（米国特許第４１５１０４２号）などのメイタンシノイドを生成することを発見した。メイタンシノイド薬物部分は抗体－薬物複合体で有益な部分である。その理由としては（ｉ）発酵又は発酵生成物の化学修飾又は誘導体化によって製造しやすいこと、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーによって抗体に結合するのに適する官能基から誘導体化しやすいこと、（ｉｉｉ）血漿中で安定していること、（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であることが挙げられる。メイタンシノイド薬物部分として使用するのに適するマイタンシン化合物は本分野で知られている事項で、しかも既知の方法に従って天然源から分離するか、又は遺伝子工学技術を使用して生産することができる（Ｙｕ，ｅｔ．ａｌ，（２００２）ＰＮＡＳ９９：７９６８～７９７３参照）。マイタンシノールとマイタンシノールアナログは既知の方法に従って合成することができる。メイタンシノイド薬物部分の例示的な実施形態としては、本明細書で開示されているＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４が挙げられる。
本発明に記載の方法、組成物、併用療法は他の活性剤又は治療手段と組み合わせることができ、前記方法は疾患（例えば、がん）の治療又は予防に有効な量の、本発明に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子、任意選択でＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、Ｔｉｍ－３抗体（免疫療法）又はＨｅｒ－２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ抗体などの他の腫瘍治療抗体、ＡＤＣ（例えば、Ｔ－ＤＭ１）、二重特異性抗体、化学療法薬などの１種又は複数種の阻害剤との組み合わせを対象に投与するステップを含み、さらに、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子、追加の活性剤又はその全てを、単独（例えば、単剤療法）で使用する各種の活性剤の量又は用量より高く、より低く又は等しい量又は用量で投与するステップをさらに含む。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、追加の活性剤又はその全ての投与量又は用量は単独（例えば、単剤療法）で使用する各種の活性剤の量又は用量より（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％）低い。
さらに、本発明の実施例で説明したように、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及びＣＬＤＮ１８．２抗体－薬物複合体はＣＬＤＮ１８．２と結合して標的細胞（腫瘍細胞）のアポトーシスを誘発し、腫瘍細胞の成長を阻害し、インビボで腫瘍細胞に対するエフェクター細胞のＡＤＣＣ、ＣＤＣ殺傷効果を高めてがん患者を治療する目的を達成する。したがって、いくつかの実施形態で、本発明に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及びＣＬＤＮ１８．２抗体－薬物複合体は上記の原理により本発明に係る抗体抗腫瘍効果、及び、治療有効量の本発明に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及びＣＬＤＮ１８．２抗体－薬物複合体を受験者に投与するステップを含む腫瘍細胞成長の阻害方法を実現する。当該方法はがんのインビボ治療に適する。標的特異的な治療効果を得るために、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子を他の抗体と一緒に投与することができる。ＣＬＤＮ１８．２抗体とＣＬＤＮ１８．２抗体－薬物複合体を１種又は複数種の活性剤と組み合わせて投与する場合に、当該組み合わせを任意の順番で又は同時に、がん患者に、特にＣＬＤＮ１８．２を高発現する腫瘍患者に投与することができる。いくつかの態様で、対象における過形成状態又は疾患（例えば、がん）を治療（例えば、軽減又は緩和）する方法を提供する。当該方法は、本発明に記載の１種又は複数種の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体又はＣＬＤＮ１８．２抗体－薬物複合体を単独で又は他の活性剤又は治療手段と組み合わせて対象に投与するステップを含む。
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子を単独で又は別の免疫調節剤（例えば、抗ＬＡＧ－３、抗Ｔｉｍ－３、抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子）と組み合わせて使用して胃がん、膵臓がん、肺がん、食道がん、卵巣がんなどを治療する。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体分子は、免疫療法、標的薬（例えば、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体などのＶＥＧＦ阻害剤）、スニチニブ、ソラフェニブ、アパチニブなどのＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害剤などのＲＮＡｉ阻害剤又はＶＥＧＦシグナル伝達下流メディエーターの阻害剤の１種又は複数種と組み合わせて投与することができる。
本発明で使用される用語「がん」、「がん患者」には、組織病理学的タイプ又は侵襲性の段階に関係なく、全種類のがん性増殖物又は腫瘍形成過程、転移性組織又は悪性形質転換細胞、組織又は器官を含むことが意図されている。その例は、固形腫瘍、血液がん、軟部組織腫瘍、転移性病変を含み、ただしそれらに限定されない。
本発明で開示されているＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体を使用して治療するのに適するがんの例は、胃がん、食道がん、肺がん、黒色腫、腎臓がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、膀胱がん、神経膠腫及び／又は白血病、又はその転移性病変を含み、ただしそれらに限定されない。
なお、本発明で「バリアント１」、「バリアント２」などが言及される場合に、その数字「１」、「２」には実際の意味を持たず、同じものを指す。
本分野の常識に矛盾しない限り、前記各好ましい条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好ましい実施例を得ることができる。本発明で使用する試薬と原料はいずれも市販品であってもよい。
本発明の有益な効果は次のとおりである。
本発明の抗体は従来技術と比べて、その結合親和性、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存－細胞媒介細胞傷害）、ＣＤＣ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、補体依存性細胞傷害）、成長阻害効果、内在化活性などにいずれも明らかな利点があるため、腫瘍の治療のための利用が見込まれる。本発明の好ましい実施例で、抗体ＨＢＭ１０２９、ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３３４０、ＰＲ００３２９２、ＰＲ００３２９３、ＰＲ００３２４０、ＰＲ００３２９１、ＰＲ００３２８９、ＰＲ００３８９０、ＰＲ００３８９１、ＰＲ００３８９４、ＰＲ００３８９７及びＰＲ００３８９８はＩＭＡＢ３６２アナログと比べて、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対してより高い結合親和性を示している。本発明の抗体ＨＢＭ１０２９、ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３３４０、ＰＲ００３２４０、ＰＲ００３８９４は用量依存的にＮＵＧＣ４＿Ｄ８においてＩＭＡＢ３６２アナログより強いＡＤＣＣ効果を特異的に誘発することができ、抗体ＨＢＭ１０２９、ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３３４０は用量依存的にＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２においてＩＭＡＢ３６２アナログより強いＣＤＣ効果を誘発することができ、抗体ＨＢＭ１０２９は用量依存的にＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２においてＩＭＡＢ３６２アナログより強い成長阻害効果を誘発することができ、抗体ＨＢＭ１０２９は用量依存的にＮＵＧＣ４＿Ｄ８においてＩＭＡＢ３６２アナログより強い内在化活性を誘発することができ、抗体ＨＢＭ１０２９をＭＭＡＦ結合抗ヒトＩｇＧ抗体と共培養する場合に、用量依存的にＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞においてＩＭＡＢ３６２アナログより強い細胞毒性効果を生み出すこができる。
図１のＡ、Ｂ、Ｃはそれぞれ、抗体ＨＢＭ１０２９及びＰＲ００２７２７の、ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対する結合親和性を示す。 図２のＡ、Ｂは、抗体ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３２９２、ＰＲ００３２９３、ＰＲ００３３４０のＮＵＧＣ４＿Ｄ８、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対する結合親和性を示し、図２のＣは抗体ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３２９２、ＰＲ００３２９３、ＰＲ００３３４０、ＰＲ００２７２５のＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対する結合親和性を示す。 図３のＡ、Ｂはそれぞれ、抗体ＰＲ００３２４０、ＰＲ００３２９１、ＰＲ００３２８９及びＨＢＭ１０２９の、ＮＵＧＣ４＿Ｄ８、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対する結合親和性を示す。 図４のＡ、Ｂはそれぞれ、抗体ＰＲ００３８９０、ＰＲ００３８９１、ＰＲ００３８９４、ＰＲ００３８９７、ＰＲ００３８９８のＮＵＧＣ４＿Ｄ８、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対する結合親和性を示し、Ｃは抗体ＰＲ００３８９０、ＰＲ００３８９１、ＰＲ００３８９４、ＰＲ００３８９７、ＰＲ００３８９８、ＰＲ００２７２５及びＨＢＭ１０２９のＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に対する結合親和性を示す。 図５は抗体ＨＢＭ１０２９がヒトＰＢＭＣによってＮＵＧＣ４＿Ｄ８、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１細胞にＡＤＣＣ活性をを示すことを示す。 図６はＰＲ００３８９４、ＰＲ００３２４０、ＰＲ００３３４０、ＰＲ００３１９７及びＨＢＭ１０２９がヒトＰＢＭＣによってＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞にＡＤＣＣ活性を示すことを示す。 図７はＨＢＭ１０２９、ＰＲ００３８９４、ＰＲ００３２４０、ＰＲ００３３４０、ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３８９１、ＰＲ００３８９８がレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）細胞によってＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞にＡＤＣＣ活性を示すことを示す。 図８は抗体ＨＢＭ１０２９がＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及びＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞にＣＤＣ効果を誘発することを示す。 図９はＨＢＭ１０２９、ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３３４０がＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞にＣＤＣ効果を誘発することを示す。 図１０は抗体ＨＢＭ１０２９がＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２に誘発した成長阻害活性を示す。 図１１はＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞における抗体ＨＢＭ１０２９の内在化活性を示す。（Ａ）はＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞を２００ｎＭ抗体と混合して異なる時間インキュベートしたもの、（Ｂ）はＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞を異なる濃度の抗体と混合して１時間インキュベートしたものである。 図１２は抗体ＨＢＭ１０２９をＭＭＡＦ結合抗ヒトＩｇＧ抗体と共培養する場合の標的細胞の生存率である。 図１３は抗体ＨＢＭ１０２９とＩＭＡＢ３６２－ＦＩＴＣアナログのＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞における競合的結合親和性である。異なる濃度の抗体ＨＢＭ１０２９、２０ｎＭ ＩＭＡＢ３６２－ＦＩＴＣアナログ、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を混合してインキュベートした。 図１４はＩＭＡＢ３６２アナログ、ＨＢＭ１０２９の薬物動態プロファイルである。 図１５はＩＭＡＢ３６２アナログ、ＨＢＭ１０２９のインビボ薬力学的研究である。
以下、実施例によって本発明を一層説明し、本発明はこれらの実施例の範囲に限定されない。下記の実施例で条件を詳しく記載していない実験方法は、通常の方法と条件で行われ、又は商品の取扱説明書に基づいて選択する。
実施例１：抗原の製造、マウスの免疫化及びハイブリドーマの調製
ａ．マウスの免疫化のための発現ベクターの調製
完全ヒト化トランスジェニックマウスを免疫化するためのヒトＣＬＤＮ１８．２発現ベクターの調製方法は次のとおりである。ヒトＣＬＤＮ１８．２（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ５６８５６－ｉｓｏ２）をコードするｃＤＮＡ配列を合成し、酵素消化により前記遺伝子のコード配列をｐＣＡＧＧＳプラスミド（ＹＯＵＢＩＯ、ＶＴ１０７６）ににクローニングする。
ｂ．安定発現細胞株の調製
ヒトＣＬＤＮ１８．１又はＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＣＲＬ－１５７３）細胞株の構築は具体的に次のとおりである。ヒトＣＬＤＮ１８．１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＯＨｕ２９１７４Ｄ）又はＣＬＤＮ１８．２（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＯＨｕ０３３７４Ｄ）をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、ヒトＣＬＤＮ１８．１又はＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する安定細胞株を生成した。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によってＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２の発現を検出した。具体的には、２万個の遺伝子導入細胞を９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングし、その後、ウサギ抗ヒトＣＬＤＮ１８抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏ、Ｃａｔ＃ＬＳ－Ｃ１６８８１２－４００）市販品を加えた。４℃下で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、さらにＡＦ－６８０結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃Ａ２１１０９）を加えた。４℃下で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、その後、ＦＡＣＳ装置（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔｉＱｕｅ Ｐｌｕｓ ＢＲ）を使用して細胞の蛍光を監視した。
実施例２：ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体の生成及びスクリーニング
上記のように調製したヒトＣＬＤＮ１８．２発現ベクター及びヒトＣＬＤＮ１８．２を発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞）を使用して、完全ヒト化トランスジェニックマウス（ＨａｒｂｏｕｒＨ２Ｌ２マウス、市販品、和ハク医薬より購入）を免疫化した。ヒトＣＬＤＮ１８．２ベクターと金粉で遺伝子銃の弾丸を作って、遺伝子銃を用いてマウスの腹部の複数の部位で免疫化した。毎回は発現ベクターのＤＮＡ５０μｇで免疫化し、２週間の間隔で３回免疫化した後、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞で免疫化し、各マウスを毎回４×１０６の細胞で免疫化し、２週間の間隔で、２回免疫化した後にマウスから採血して力価を測定した。ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現するＣＨＯＫ１細胞（ＣＨＯＫ１ ｈＣＬＤＮ１８．２、ｋｙｉｎｎｏより購入（ＫＣ－１１８０））又はＣＬＤＮ１８．１を発現するＣＨＯＫ１細胞（ＣＨＯＫ１ ｈＣＬＤＮ１８．１、ｋｙｉｎｎｏより購入（ＫＣ－１１８１））を使用してＦＡＣＳによってマウス血清の結合親和性を検出した。免疫化マウスの血清力価検出結果に基づいて、ハイブリドーマ融合用のマウスを選択し、融合の３日前にマウスを強化免疫し、免疫原はＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞であり、用量は４×１０６の細胞であった。マウスの脾臓細胞及びリンパ節細胞を採取してマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０と２：１の比率（細胞数比）で混合し、電気融合装置（ＢＴＸ ＥＣＭ２００１）を用いて混合後の細胞を融合させ、融合した細胞を９６ウェル細胞培養プレートにプレーティングし、二酸化炭素インキュベータにおいて３７℃下で１０日間培養した後、ハイブリドーマの一次スクリーニングを行った。一次スクリーニングではＭｉｒｒｏｒｂａｌｌにおいてヒトＣＬＤＮ１８．２を発現するＣＨＯＫ１細胞を用いて検出し、詳しくは次のとおりである。細胞を培地（Ｆ１２Ｋ １０％ＦＢＳ）に再懸濁させて、細胞の密度を５×１０４細胞／ｍＬに調整し、３８４ウェルプレートの各ウェルに４０μＬの細胞懸濁液を加えて、二酸化炭素インキュベータにおいて３７℃下で一晩培養した。ウェルに核染色色素ＤＲＡＱ５を加えて染色し、次にウェルプレートから上清を捨て、ハイブリドーマ培養プレートから５０μＬの上清を取り分けて３８４マイクロウェルプレートに加え、４℃下で２時間インキュベートした後、ＡＦ４８８結合蛍光二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃Ａ１１００６）を加えて４℃下で一晩インキュベートし、次に３８４マイクロウェルプレートをＭｉｒｒｏｒｂａｌｌにセットして検出した。陽性ハイブリドーマを選別し、９６ウェル培養プレートから２４ウェル培養プレートに移して拡大培養し、５日後に２４ウェル培養プレートのウェルから上清を取って再スクリーニングした。再スクリーニングではＣＨＯＫ１ ｈＣＬＤＮ１８．１及びＣＨＯＫ１ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を使用してＦＡＣＳによって検出した。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、次に、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で再懸濁させた。細胞の密度を１０６細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加えた。９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの上清を加えた。４℃下で２時間インキュベートした後、プレートをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。その後、ＡＰＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ二次抗体を含むＦＡＣＳバッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃４０５４０７）を加えた。４℃下で１時間インキュベートした後、プレートをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。細胞を固定液で再懸濁させた後、ＦＡＣＳ装置（ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を使用して細胞の蛍光を監視した。特異性の良いハイブリドーマを限界希釈によってサブクローニングし、二酸化炭素インキュベータにおいて３７℃下で７日間培養した後、サブクローンの一次スクリーニングを行った。サブクローンの一次スクリーニングではＭｉｒｒｏｒｂａｌｌにおいてヒトＣＬＤＮ１８．２を発現するＣＨＯＫ１細胞を使用して検出した。検出結果と顕微鏡下での観察により、モノクローナルであって且つＣＨＯＫ１／ＣＬＤＮ１８．２との結合が陽性であるクローンを選択し、２４ウェル細胞培養プレートに拡大し、二酸化炭素インキュベータにおいて３７℃下で３日間培養した後、ウェルから上清を取って再スクリーニングした。再スクリーニングではＣＨＯＫ１ ｈＣＬＤＮ１８．１及びＣＨＯＫ１ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞株を使用してＦＡＣＳによって検出した（ステップは上記の再スクリーニングと同じ）。特異的に結合するモノクローナルに対し、サブタイプ同定キット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃８８－５０６４０－８８）を用いてサブタイプを同定した。抗体サブタイプがＩｇＧ２ｂの細胞を選択して配列決定を行った（実施は金唯智生物科技有限公司）。
当業者が知っているように、本分野では、例えば、配列可変性に基づくＫａｂａｔ定義方式（Ｋａｂａｔ，ｅｔ．ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ（１９９１）参照）、構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａ定義方式（ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－４８，１９９７参照）など様々な方式で抗体のＣＤＲを定義することができる。本願では、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義を組み合わせた（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ）定義方式を採用して可変ドメイン配列のアミノ酸残基を決定することもできる。組み合わせた（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ）定義方式はＫａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の範囲を合わせたものであるため、範囲が拡大しており、詳細は発明の開示の部分の表１－１を参照する。当該実施例で配列決定した後の生殖細胞系列遺伝子分析及びＰＴＭ部位分析は次の表２に示すとおりである。抗原結合タンパク質変異部位の設計情報は次の表３に示すとおりである。抗原結合タンパク質の配列番号情報は次の表４に示すとおりである。
Figure 0007461469000005
Figure 0007461469000006
Figure 0007461469000007
実施例３：全長ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体の発現、精製及び特性評価
抗体分子の軽鎖、重鎖可変ドメインをコードする配列を得た後、通常の組換えＤＮＡ技術を採用して、軽鎖、重鎖可変ドメイン配列と対応するヒト抗体の軽鎖、重鎖定常ドメイン配列の融合発現を行って、組換え抗体分子を得ることができる。本実施例では、抗体重鎖可変ドメイン配列（ＶＨ）を遺伝的に合成しヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常ドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングすることによってＩｇＧ１抗体を生成する全長重鎖をコードする。抗体軽鎖可変ドメイン配列（ＶＬ）を遺伝的に合成しヒト抗体Ｉｇκ軽鎖定常ドメイン配列をコードする哺乳動物細胞発現プラスミドベクターにクローニングすることによって抗体を生成する全長軽鎖をコードする。本実施例では、免疫化されたＨａｒｂｏｕｒ Ｈ２Ｌ２マウスから得たモノクローナル抗体分子の可変ドメインの配列がヒト抗体配列であるため、本実施例では完全ヒト抗ＣＬＤＮ１８．２組換えＩｇＧ１抗体を得た。
抗体重鎖をコードするプラスミド（米Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）と抗体軽鎖をコードするプラスミド（米Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の両方で哺乳動物宿主細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３）をトランスフェクトし、通常の組換えタンパク質の発現と精製技術を利用して、軽鎖と重鎖が正しくペアリングして組み立てられた精製組換え抗体を得ることができる。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃Ａ１３８３５０４）において拡大培養した。一過性トランスフェクションを始める前に、細胞濃度を６～８×１０５細胞／ｍＬに調整し、３７℃と８％ＣＯ２でシェーカーにおいて２４時間培養し、細胞濃度は１．２×１０６細胞／ｍＬであった。培養細胞を３０ｍＬ用意した。前記抗体重鎖をコードするプラスミドと抗体軽鎖をコードするプラスミドを質量比２：３で混合し合計で３０μｇのプラスミドを１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃３１９８５０８８）に溶解し、０．２２μｍメンブレンフィルターで濾過して除菌した。さらに１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを１ｍｇ／ｍＬ ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃２３９６６－２）１２０μＬに溶解し、５分間静置した。ＰＥＩをゆっくりとプラスミドに加えて、室温下で１０分間インキュベートし、培養フラスコを振りながらゆっくりとプラスミドとＰＥＩの混合溶液を滴加し、３７℃と８％ＣＯ２でシェーカーにおいて５日間培養した。５日後に細胞生存率を計測した。培養物を回収し、３３００ｇで１０分間遠心分離した後に上清を得、次に、高速遠心分離で上清から不純物を除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ＃７１－５０２０－９１ ＡＥ）を含む重力流カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ＃７３１１５５０）を平衡化し、カラム２～５個分の体積で洗い流した。上清サンプルをカラムに通し、カラム５～１０個分の体積のＰＢＳでカラムを洗い流し、さらにｐＨ３．５の０．１Ｍグリシンで目的タンパク質を溶出し、その後、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌで中性に調整し、最後に限外濾過遠心管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ＃ＵＦＣ９０１０２４）で濃縮してＰＢＳバッファーに交換して、精製抗体溶液を得た。最後にＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｏｎｅ）で濃度を測定し、分注して、保管しておく。
上記のように精製したサンプルの適量を、それぞれ分析用ＳＥＣカラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（ＨＰＬＣ装置型番はアジレント・テクノロジー、１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）に注入して、サンプルの純度を検出し、均質なサンプルの純度が９５％以上となることを確認した。当該方法で移動相はｐＨ７．４の１×ＰＢＳ（生工生物工程、Ｃａｔ＃Ｅ６０７０１６）であり、室温で、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎであり、サンプル濃度は１ｍｇ／ｍＬであり、注入量は２０μＬであり、検出波長は２８０ｎｍである。データを収集した後、ソフトウェアＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを用いてクロマトグラムを積分して関連データを計算した。上記のように精製したサンプルの適量を、それぞれ分析用ＨＩＣカラムＴＳＫｇｅ１ Ｂｕｔｙ１－ＮＰＲ ４．６×３５（ＨＰＬＣ装置型番はアジレント・テクノロジー、１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）に注入して、サンプルの純度と疎水性を検出した。当該方法で１００％移動相Ａ（２０ｍＭ ＰＢ、１．８Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ６．０）から１００％移動相Ｂ（２０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ６．０）までの１６分間の線形勾配で構成される。流速を０．７ｍＬ／ｍｉｎに設定し、サンプル濃度は１ｍｇ／ｍＬであり、注入量は２０μＬであり、検出波長は２８０ｎｍである。データを収集した後、ソフトウェアＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを用いてクロマトグラムを積分して関連データを計算した。示差走査蛍光定量法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＦ）はタンパク質の熱安定性を測定するために一般的に利用されるハイスループットな方法である。リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置を使用して、折り畳まれていないタンパク質分子と結合した色素の蛍光強度の変化を監視することによって、タンパク質変性のプロセスを反映し、タンパク質分子の熱安定性を反映するものである。本実施例ではＤＳＦ法を用いてタンパク質分子の熱変性温度（Ｔｍ）を測定した。１０μｇのタンパク質を９６ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃ＡＢ－０７００／Ｗ）に加え、続いて２μＬの１００×希釈した色素ＳＹＰＲＯＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２００８１３８）を加え、次にバッファーを加えて最終体積は各ウェル４０μＬとした。ＰＣＲプレートを密封し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）に静置して、まず２５℃下で５分間インキュベートし、次に０．２℃／０．２ｍｉｎの勾配で２５℃から徐々に９５℃に加熱し、試験が終了した時に温度を２５℃に下げた。ＦＲＥＴ走査方式でソフトウェアＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏを用いてデータを分析しサンプルのＴｍを算出した。結果は次の表５に示すとおりである。
Figure 0007461469000008
実施例４：ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体の結合親和性
ヒトＣＬＤＮ１８．２又はＣＬＤＮ１８．１を発現するＨＥＫ２９３細胞及びヒトＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞（ＪＣＲＢより購入したＮＵＧＣ細胞株（Ｃａｔ＃ＪＣＲＢ０８３４）を、限界希釈でスクリーニングしてＮＵＧＣ４＿Ｄ８サブクローン細胞を得る）を使用してＦＡＣＳによって抗体の結合親和性を検出し、具体的には次のとおりである。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、次に、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で再懸濁させた。細胞の密度を１０６細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加えた。抗体をＦＡＣＳバッファーで異なる濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの抗体希釈液を加えた。４℃下で２時間インキュベートした後、プレートをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。その後、ＡＰＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を含むＦＡＣＳバッファー（最終濃度１．５μｇ／ｍＬ、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ＃１０９－６０５－０９８）を加えた。４℃下で１時間インキュベートした後、プレートをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。細胞を固定液で再懸濁させた後、ＦＡＣＳ装置（ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を使用して細胞の蛍光を監視した。ＩＭＡＢ３６２アナログ（ＩＭＡＢ３６２アナログは自ら調製したもので、重鎖アミノ酸配列は配列番号７５に示すとおりであり、軽鎖アミノ酸配列は配列番号９１に示すとおりである（合成はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社）。ＩＭＡＢ３６２と可変領域が全く同じで、定常領域ではいくつかのアミノ酸が違うだけで、活性は類似している）を陽性コントロールとし、ｈｕｍａｎ Ｉｓｏ ＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃａｔ＃Ｃ０００１－４）抗体を陰性コントロールとした。図１は、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞及びヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２）又はヒトＣＬＤＮ１８．１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１）に対する抗体ＨＢＭ１０２９の結合親和性を示す。抗体ＰＲ００２７２７は用量依存的にＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞と結合することができる。抗体ＨＢＭ１０２９は用量依存的にＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２及びＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞と結合することができる。抗体ＨＢＭ１０２９はＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対する結合親和性がＩＭＡＢ３６２アナログと同等であり、抗体ＨＢＭ１０２９はＩＭＡＢ３６２アナログよりもＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞と高い結合親和性を示している。ＨＢＭ１０２９のＥＣ５０を表７に示し、ＨＢＭ１０２９はＩＭＡＢ３６２アナログよりもＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対する結合親和性を示すＥＣ５０が低かった。ＨＢＭ１０２９はＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１細胞との結合親和性が低い。また、ＨＢＭ１０２９はヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質のＥＣＬ２ではなくＥＣＬ１（細胞外ループ１、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ １）と結合すると推察できよう。図２、図３及び図４はＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞又はヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２）又はヒトＣＬＤＮ１８．１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１）に対するＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性を示す。結果では、抗体ＨＢＭ１０２９、ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３３４０、ＰＲ００３２９２、ＰＲ００３２９３、ＰＲ００３２４０、ＰＲ００３２９１、ＰＲ００３２８９、ＰＲ００３８９０、ＰＲ００３８９１、ＰＲ００３８９４、ＰＲ００３８９７、ＰＲ００３８９８はＩＭＡＢ３６２アナログよりもＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞と高い結合親和性を示し、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１細胞との結合親和性が低く、ＰＲ００２７２５の方はＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１との親和性が高いことが示されている。
Figure 0007461469000009
Figure 0007461469000010
実施例５：ＣＬＤＮ１８．２抗体のＡＤＣＣ活性
ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ１７８０）を使用して、ＣＬＤＮ１８．２抗体のヒトＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１にＡＤＣＣ効果を誘発する活性を検出した。ヒトＰＢＭＣ（Ｍｉａｏｔｏｎｇ）を３００ｇで５分間遠心分離し、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）で一晩培養した。標的細胞及びヒトＰＢＭＣを３００ｇで５分間遠心分離し、次に、培地（ＲＰＭＩ１６４０＋２％ＦＢＳ）で再懸濁させた。標的細胞の密度を２×１０５細胞／ｍＬに調整して、ＰＢＭＣの細胞密度を少なくとも６×１０６／ｍＬに調整し、２種類の細胞を各５０μＬ、９６ウェルプレートのウェルに加えた（感染多重度は少なくとも３０：１）。被検抗体を培地（ＲＰＭＩ１６４０＋２％ＦＢＳ）で異なる濃度に希釈して各ウェルに加えた。サンプルを３７℃下で少なくとも４時間インキュベートし、次に、標的細胞最大ＬＤＨ放出コントロールウェル及び体積補正コントロールウェル（Ｖｏｌｕｍｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）に１０×Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００ Ｌｙｓａｔｅ（ＲＰＭＩ１６４０＋２％ＦＢＳ＋１０％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００）を加え、均一に混合して３７℃下で３０分間インキュベートした。９６ウェルプレートを３００ｇで５分間遠心分離し、上清から５０μＬ取り分けて、次に５０μＬ／ウェルでＬＤＨ発色溶液を加えた。混合物を暗所で常温下２０分間静置した後、プレートをＭＤ ＳｔａｋＭａｘにセットしてＯＤ４９０を読み取った。ＩＭＡＢ３６２アナログを陽性コントロールとし、ｈｕｍａｎ Ｉｓｏ ＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃａｔ＃Ｃ０００１－４）抗体を陰性コントロールとした。結果を得てまず補正測定値を計算し、試験ウェル、標的細胞ＬＤＨ自発放出コントロールウェル、エフェクター細胞ＬＤＨ自発放出コントロールウェルの測定値から培地バックグラウンドコントロールウェルの測定値を差し引き、次に、標的細胞最大ＬＤＨ放出コントロールウェルの測定値から体積補正コントロールウェルの測定値を差し引いた。ＡＤＣＣ活性（％）＝（試験ウェルの補正測定値－エフェクター細胞ＬＤＨ自発放出コントロールウェルの補正測定値－標的細胞ＬＤＨ自発放出コントロールウェルの補正測定値）／（標的細胞最大ＬＤＨ放出コントロールウェルの補正測定値－標的細胞ＬＤＨ自発放出コントロールウェルの補正測定値）×１００。図５はＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１に対する抗体ＨＢＭ１０２９のＡＤＣＣ活性を示す。抗体ＨＢＭ１０２９は用量依存的にＮＵＧＣ４＿Ｄ８においてＩＭＡＢ３６２アナログより強いＡＤＣＣ効果を特異的に誘発することができるが、ＣＬＤＮ１８．１を過剰発現するＨＥＫ－２９３細胞には細胞毒性効果が見られなかった。ＨＢＭ１０２９のＥＣ５０を表８に示し、ＨＢＭ１０２９はＩＭＡＢ３６２アナログよりＮＵＧＣ４＿Ｄ８にＡＤＣＣを誘発するＥＣ５０が低かった。
Figure 0007461469000011
図６はＨＢＭ１０２９、ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３３４０、ＰＲ００３２４０、ＰＲ００３８９４のＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対するＡＤＣＣ活性を示し、ＨＢＭ１０２９、ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３３４０、ＰＲ００３２４０、ＰＲ００３８９４は用量依存的にＮＵＧＣ４＿Ｄ８においてＩＭＡＢ３６２アナログより強いＡＤＣＣ効果を特異的に誘発することができる。
Ｊｕｒｋａｔ ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ１５８／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞を使用して、ＣＬＤＮ１８．２抗体のＮＵＧＣ４＿Ｄ８及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１にＡＤＣＣ効果を誘発する活性を検出した。ＮＵＧＣ４＿Ｄ８及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１を３００ｇで５分間遠心分離し、次に、ＲＰＭＩ１６４０＋４％ＦＢＳ血清培地で再懸濁させた。細胞の密度を６×１０５細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加えて、３７℃下で一晩インキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ１５８／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞を４００ｇで４分間遠心分離し、次に、ＲＰＭＩ１６４０＋４％ＦＢＳ血清培地で再懸濁させた。細胞の密度を３×１０６細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加えた。抗体をＲＰＭＩ１６４０＋４％ＦＢＳ培地で異なる濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの抗体希釈液を加えた。細胞と抗体を３７℃下で５時間インキュベートした。９６ウェルプレートを常温下で３０分間静置し、６０μＬ／ウェルで常温のＯｎｅ－Ｇｌｏ発色溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。その後、サンプルを暗所で常温下１０分間インキュベートした。ＰＥ Ｅｎｓｐｉｒｅにおいて読み取った。ＩＭＡＢ３６２アナログを陽性コントロールとし、ｈｕｍａｎ Ｉｓｏ ＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃａｔ＃Ｃ０００１－４）抗体を陰性コントロールとした。図７はＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対するＣＬＤＮ１８．２抗体のＡＤＣＣ活性を示し、ＨＢＭ１０２９、ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３３４０、ＰＲ００３２４０、ＰＲ００３８９４、ＰＲ００３８９１、ＰＲ００３８９８は用量依存的にＮＵＧＣ４＿Ｄ８においてＩＭＡＢ３６２アナログより強いＡＤＣＣ効果を特異的に誘発することができる。
実施例６：ＣＬＤＮ１８．２抗体のＣＤＣ活性
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ７５７３）を使用して、ＣＬＤＮ１８．２抗体のＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２及びＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞にＣＤＣ効果を誘発する能力を検出した。標的細胞ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２を３００ｇで５分間遠心分離し、次に、ＤＭＥＭ無血清培地で再懸濁させた。標的細胞ＮＵＧＣ４＿Ｄ８を３００ｇで５分間遠心分離し、次に、ＲＰＭＩ１６４０無血清培地で再懸濁させた。標的細胞の密度を４×１０５細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに２５μＬの細胞懸濁液を加えた。抗体を無血清培地で異なる濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに２５μＬの抗体希釈液を加えた。５０μＬの正常ヒト血清（ＧｅｍＣｅｌｌ、Ｃａｔ＃１００－５１２）を加えて、最終濃度は５０％であり、混合物を得て３７℃下で２４時間インキュベートした。９６ウェルプレートを常温下で３０分間静置し、１００μＬ／ウェルで常温のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発色溶液を加えた。その後、サンプルを暗所で常温下１０分間インキュベートした。ＰＥ Ｅｎｓｐｉｒｅにおいて読み取った。ＣＤＣ活性（％）＝［１－（発光サンプル［ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓａｍｐｌｅ］）／（発光モックコントロール［ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｍｏｃｋ ｃｏｎｔｒｏｌ］）］×１００。ＩＭＡＢ３６２アナログを陽性コントロールとし、ｈｕｍａｎ Ｉｓｏ ＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃａｔ＃Ｃ０００１－４）抗体を陰性コントロールとした。図８はＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞、ヒトＣＬＤＮ１８．１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞及びヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対する抗体ＨＢＭ１０２９のＣＤＣ活性を示す。抗体ＨＢＭ１０２９は用量依存的にＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２においてＩＭＡＢ３６２アナログより強いＣＤＣ効果を誘発することができるが、ＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞及びヒトＣＬＤＮ１８．１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞にはＣＤＣ活性が見られなかった。ＨＢＭ１０２９のＥＣ５０を表９に示し、ＨＢＭ１０２９はＩＭＡＢ３６２アナログよりもＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２にＣＤＣを誘発するＥＣ５０が低かった。
Figure 0007461469000012
図９はヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対するＰＲ００３１９７、ＰＲ００３３４０のＣＤＣ活性を示す。抗体ＰＲ００３１９７、ＰＲ００３３４０は用量依存的にＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２においてＩＭＡＢ３６２アナログより強いＣＤＣ効果を誘発することができる。
実施例７：ＣＬＤＮ１８．２抗体の成長阻害活性
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ７５７３）を使用して、ＣＬＤＮ１８．２抗体のＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２に成長阻害を誘発する能力を検出した。ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、次に、ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳ血清培地で再懸濁させた。細胞の密度を１．２×１０５細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加えて、３７℃下で一晩インキュベートした。抗体を培地で異なる濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの抗体希釈液を加えた。ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞と抗体を３７℃下で３日間インキュベートした。９６ウェルプレートを常温下で３０分間静置し、１００μＬ／ウェルで常温のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発色溶液を加えた。その後、サンプルを暗所で常温下１０分間インキュベートした。ＰＥ Ｅｎｓｐｉｒｅにおいて読み取った。成長阻害活性（％）＝［１－（発光サンプル［ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓａｍｐｌｅ］）／（発光モックコントロール［ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｍｏｃｋ ｃｏｎｔｒｏｌ］）］×１００。ＩＭＡＢ３６２アナログを陽性コントロールとし、ｈｕｍａｎ Ｉｓｏ ＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃａｔ＃Ｃ０００１－４）抗体を陰性コントロールとした。図１０は抗体ＨＢＭ１０２９のＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２に成長阻害を誘発する活性を示す。抗体ＨＢＭ１０２９は用量依存的にＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２においてＩＭＡＢ３６２アナログより強い成長阻害効果を誘発することができる。ＨＢＭ１０２９のＥＣ５０を表１０に示す。
Figure 0007461469000013
実施例８：ＣＬＤＮ１８．２抗体の内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）活性（ＦＡＣＳに基づくアッセイ［ＦＡＣＳ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ］）
ＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞を使用してＦＡＣＳによって抗体の内在化活性を検出した。トリプシンで細胞を処理し、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で１回洗浄した。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、次に、ＦＡＣＳバッファーで再懸濁させた。細胞の密度を４×１０６細胞／ｍＬに調整して、氷上に置いて３０分間予冷した。抗体をＦＡＣＳバッファーで異なる濃度に希釈して、氷上に置いて３０分間予冷した。予冷したディープウェルプレートのウェルに７００μＬの細胞懸濁液、及び７００μＬの抗体希釈液を加えた。４℃下で２時間インキュベートした後、予冷したＦＡＣＳバッファーでプレートを３回洗浄した。２５０μＬの予冷したＦＡＣＳバッファーで細胞を再懸濁させ、３７℃下で予熱したディープウェルプレートのウェルに１００μＬの細胞懸濁液、及び１．１ｍＬの３７℃下で予熱したＦＡＣＳバッファーを加え、４℃下で予冷したディープウェルプレートのウェルに１００μＬの細胞懸濁液、及び１．１ｍＬの４℃下で予冷したＦＡＣＳバッファーを加えた。混合物を得てそれぞれ０、３０、６０、１２０及び２４０分間で５０μＬの細胞懸濁液を取り分けて（１０５／ウェルで）、予め予冷したディープウェルプレート（１．２ｍＬのＦＡＣＳバッファーを含む）に入れた。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、その後、ＡＦ６４７結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を含む予冷ＦＡＣＳバッファー（最終濃度１．５μｇ／ｍＬ、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ＃１０９－６０５－０８８）を加えた。４℃下で１時間インキュベートした後、予冷したＦＡＣＳバッファーでプレートを２回洗浄した。細胞を固定液で再懸濁させ、その後、ＦＡＣＳ装置（ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）を使用して細胞の蛍光を検出した。内在化活性（％）＝（１－ＭＦＩ３７℃／ＭＦＩ４℃）×１００。ＩＭＡＢ３６２アナログを陽性コントロールとし、ｈｕｍａｎ Ｉｓｏ ＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃａｔ＃Ｃ０００１－４）抗体を陰性コントロールとした。図１１は異なる時間インキュベートした抗体ＨＢＭ１０２９のＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対する内在化活性を示す。抗体ＨＢＭ１０２９を３０分間インキュベートした後、約５０％の内在化活性が誘発された。また図１１には、抗体ＨＢＭ１０２９は用量依存的にＮＵＧＣ４＿Ｄ８においてＩＭＡＢ３６２アナログより強い内在化活性を誘発できることが示されている。ＨＢＭ１０２９のＥＣ５０を表１１に示し、ＨＢＭ１０２９はＩＭＡＢ３６２アナログよりもＮＵＧＣ４＿Ｄ８に内在化を誘発するＥＣ５０が低かった。
Figure 0007461469000014
実施例９：ＣＬＤＮ１８．２抗体の内在化活性（細胞毒性に基づく方法［ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ］）
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ７５７３）を使用して、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２及びＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞に対し、ＭＭＡＦ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｍｏｒａｄｅｃ、Ｃａｔ＃ＡＨ－１０２－ＡＦ）と共培養した抗体ＨＢＭ１０２９の細胞毒性を誘発する能力を検出した。ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、次に、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ血清培地で再懸濁させ、細胞の密度を４×１０４細胞／ｍＬに調整した。ＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、次に、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ血清培地で再懸濁させ、細胞の密度を２×１０４細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加えて、３７℃下で一晩インキュベートした。抗体ＨＢＭ１０２９を培地で異なる濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに２５μＬの抗体希釈液を加えた。ＭＭＡＦ結合抗ヒトＩｇＧ抗体を培地で希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに２５μＬの抗体希釈液を加え、最終濃度は６．６ｎＭであった。細胞と抗体を３７℃下で３日間インキュベートした。９６ウェルプレートを常温下で３０分間静置し、１００μＬ／ウェルで常温のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発色溶液を加えた。その後、サンプルを暗所で常温下１０分間インキュベートした。ＰＥ Ｅｎｓｐｉｒｅにおいて読み取った。細胞生存率（％）＝［（発光サンプル［ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓａｍｐｌｅ］）／（発光モックコントロール［ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｍｏｃｋ ｃｏｎｔｒｏｌ］）］×１００。ＩＭＡＢ３６２アナログを陽性コントロールとし、ｈｕｍａｎ Ｉｓｏ ＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃａｔ＃Ｃ０００１－４）抗体を陰性コントロールとした。図１２は抗体ＨＢＭ１０２９をＭＭＡＦ結合抗ヒトＩｇＧ抗体と共培養する場合の標的細胞の生存率を示す。抗体ＨＢＭ１０２９をＭＭＡＦ結合抗ヒトＩｇＧ抗体と共培養する場合に、用量依存的にＮＵＧＣ４＿Ｄ８細胞及びＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞においてＩＭＡＢ３６２アナログより強い細胞毒性効果を生み出すこができるが、ＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．１細胞には細胞毒性効果が見られなかった。
実施例１０：抗体ＨＢＭ１０２９の競合的結合活性
ヒトＣＬＤＮ１８．２を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用して、ＦＡＣＳによって抗体の競合的結合親和性を検出した。ＩＭＡＢ３６２アナログはＦＩＴＣ蛍光カップリングキット（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ＃ａｂ１８８２８５）を使用して結合させてＩＭＡＢ３６２－ＦＩＴＣアナログにした。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、次に、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で再懸濁させた。細胞の密度を１０６細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加えた。ＦＩＴＣカップリング抗体をＦＡＣＳバッファーで希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬのカップリング抗体希釈液を加えた。競合的結合に用いる抗体をＦＡＣＳバッファーで異なる濃度に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬの抗体希釈液を加えた。４℃下で２時間インキュベートした後、プレートをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。細胞を固定液で再懸濁させた後、ＦＡＣＳ装置（ＡＣＥＡ ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を使用して細胞の蛍光を監視した。ｈｕｍａｎ Ｉｓｏ ＩｇＧ１（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、Ｃａｔ＃Ｃ０００１－４）抗体を陰性コントロールとした。図１３は抗体ＨＢＭ１０２９とＩＭＡＢ３６２－ＦＩＴＣアナログのＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞における競合的結合親和性を示す。抗体ＨＢＭ１０２９は用量依存的にＨＥＫ２９３ ｈＣＬＤＮ１８．２細胞と競合的に結合することができるため、抗体ＨＢＭ１０２９はＩＭＡＢ３６２アナログと結合するエピトープが類似すると推察できよう。ＨＢＭ１０２９はＩＭＡＢ３６２アナログと競合して、ＣＬＤＮ１８．２発現細胞とのその結合を阻害することができ、またＩＭＡＢ３６２アナログはＣＬＤＮ１８．１と結合せずＣＬＤＮ１８．２としか結合しないと知っているため、ＨＢＭ１０２９はヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質のＥＣＬ２ではなくＥＣＬ１（細胞外ループ１、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ １）と結合すると推察できよう。
実施例１１：ＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物動態研究
以下の手順でＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物動態を検討した。体重１８～２２ｇの雌ＢＡＬＢ／ｃヌード（ｎｕｄｅ）マウス６匹を選択し、５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射により抗体薬を投与し、１群の３匹は投与前及び投与後の１５分、２４時間（１日）、４日目、１０日目に全血を採取し、もう１群の３匹は投与前及び投与後の５時間、２日目、７日目、１４日目に全血を採取した。全血を３０分間静置して凝固させ、その後、４℃下で２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、分離した血清サンプルを－８０℃下で分析に備えて凍結させた。本実施例ではＥＬＩＳＡ法でマウス血清中の薬物濃度を定量的に測定した。ＥＬＩＳＡ法とは、９６ウェルプレートにコーティングされたヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体でマウス血清中のヒトＦｃ含有抗体を捕捉し、次に、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体を加えて検出した。ソフトウェアＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎのバージョン８．２を用いて、非コンパートメントモデル（ＮＣＡ）で血中薬物濃度データを分析することによってその薬物動態パラメーターを評価した。
図１４及び表１２に示すのはＩＭＡＢ３６２アナログ、ＨＢＭ１０２９の薬物動態パラメーターである。結果では、マウスにおけるＩＭＡＢ３６２アナログ、ＨＢＭ１０２９の半減期がそれぞれ２４８、２８２時間であることが示されていた。
Figure 0007461469000015
実施例１１：ＣＬＤＮ１８．２抗体のインビボ薬力学的研究
以下の手順でＣＬＤＮ１８．２抗体のインビボ薬力学的研究を行った。細胞播種の当日に、各ＮＣＧマウスに５×１０６のＮＵＧＣ４＿Ｄ８腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍細胞をまずＰＢＳとマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の１：１混合液（０．１ｍＬ）に再懸濁させ、次に、ＰＢＭＣ（０．０５ｍＬのＰＢＳに再懸濁したもの）と混合して、皮下接種した。各群のマウスの平均腫瘍体積が９０ｍｍ３になると群分け投与を行い、１８匹のマウスを３群に分け、群分けした後に投与を開始し、投与頻度は週２回で、合計で６回投与し、投与経路は尾静脈注射であった。投与が始まってから、週２回体重と腫瘍体積を測定し、腫瘍体積の計算式は腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×腫瘍長径×腫瘍短径２である。投与後２１日目に実験を終了し、その後、全てのマウスを安楽死させた。データ分析ではｔ検定（ｔ－ｔｅｓｔ）を採用した。図１５に示すのはＩＭＡＢ３６２アナログ、ＨＢＭ１０２９のインビボ薬力学的研究結果である。投与後２１日目に、コントロール群のマウスの平均腫瘍体積は１５２６ｍｍ３であった。試験薬ＩＭＡＢ３６２アナログ（５０ｍｇ／ｋｇ）治療群では投与後２１日目に平均腫瘍体積が７２８ｍｍ３で、ビヒクルコントロール群と有意差が認められ（ｐ＝０．００５２）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は５２．２９％であった。試験薬ＨＢＭ１０２９（５０ｍｇ／ｋｇ）治療群は投与後２１日目に平均腫瘍体積が６１８ｍｍ３で、ビヒクルコントロール群と有意な腫瘍阻害効果が認められ（ｐ＝０．０００９）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は５９．４７％であった。治療－投与期間全体を通じて、動物は良好な忍容性を示しており、深刻な体重減少又は死亡はなかった。
本発明の実施形態は上記のように詳しく記載されているが、当業者は、これらが単なる例に過ぎず、本発明の原理と趣旨を逸脱することなく、これらの実施形態に様々な変更又は修正を行えることを理解できる。したがって、本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲から限定される。

Claims (21)

  1. 軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
    前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号７に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１７に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２７に示すとおりであり、且つ前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４１に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４８に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５６に示すとおりである、又は
    前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２８に示すとおりであり、且つ前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４２に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりである、又は
    前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１６に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２９に示すとおりであり、且つ前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４２に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５５もしくは５８に示すとおりである、又は
    前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１９に示すとおりであり、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２８に示すとおりであり、且つ前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４２に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４７に示すとおりであり、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５７に示すとおりであることを特徴とするＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 前記重鎖可変領域は配列番号６４に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号７１に示すアミノ酸配列を含む、又は
    前記重鎖可変領域は配列番号６７に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号７３に示すアミノ酸配列を含む、又は
    前記重鎖可変領域は配列番号６５に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号７２に示すアミノ酸配列を含む、又は
    前記重鎖可変領域は配列番号６８に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号７４に示すアミノ酸配列を含む、又は、
    前記重鎖可変領域は配列番号６６に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号７２に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. 前記ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体は全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、又は多重特異性抗体であることを特徴とする請求項１に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 前記全長抗体は重鎖と軽鎖とを含み、
    前記重鎖は配列番号７７に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９３に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号７８に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９４に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号７９に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９３に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号８５に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９３に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号８３に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９３に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号８４に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９３に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号８１に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９５に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号８２に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９６に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号８０に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９４に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号８６に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９５に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号８７に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９６に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号８８に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９４に示すアミノ酸配列を含む、
    前記重鎖は配列番号８９に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９５に示すアミノ酸配列を含む、又は、
    前記重鎖は配列番号９０に示すアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号９６に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項３に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、分離された核酸。
  6. 請求項５に記載の分離された核酸を含む組換え発現ベクター。
  7. 請求項６に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞である、形質転換体。
  8. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキメラ抗原受容体。
  9. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、遺伝子修飾細胞。
  10. 前記遺伝子修飾細胞はＴ細胞又はＮＫ細胞である、請求項９に記載の遺伝子修飾細胞。
  11. 請求項７に記載の形質転換体を培養し、培養物からＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントを得ることを含むＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法。
  12. 細胞毒性剤と、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体又はその抗原結合フラグメントとを含む、抗体－薬物複合体。
  13. 前記細胞毒性剤はＭＭＡＦ又はＭＭＡＥである、請求項１２に記載の抗体－薬物複合体。
  14. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体もしくはその抗原結合フラグメント、及び／又は請求項１２もしくは１３に記載の抗体－薬物複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  15. ホルモン製剤、標的化小分子製剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断剤、化学療法薬、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子活性化剤、抑制性分子阻害剤及びワクチンからなる群のうちの１種又は複数種をさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 腫瘍の診断、予防及び／又は治療における使用のための、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項１２もしくは１３に記載の抗体－薬物複合体、及び／又は請求項１４もしくは１５に記載の医薬組成物であって、前記腫瘍は、ＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍である、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗体－薬物複合体、及び／又は医薬組成物。
  17. 前記腫瘍は、胃がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、黒色腫、腎臓がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、気管支がん、神経膠腫及び／又は白血病である、請求項１６に記載の使用のための請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項１２もしくは１３に記載の抗体－薬物複合体、及び／又は請求項１４もしくは１５に記載の医薬組成物。
  18. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項８に記載のキメラ抗原受容体、請求項９もしくは１０に記載の遺伝子修飾細胞、請求項１２もしくは１３に記載の抗体－薬物複合体、又は請求項１４もしくは１５に記載の医薬組成物を含む、キット。
  19. （ｉ）抗体もしくはその抗原結合フラグメント又は抗体－薬物複合体又は医薬組成物の投与装置、及び／又は（ｉｉ）取扱説明書をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
  20. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項８に記載のキメラ抗原受容体、請求項９もしくは１０に記載の遺伝子修飾細胞、請求項１２もしくは１３に記載の抗体－薬物複合体、及び／又は請求項１４もしくは１５に記載の医薬組成物を含むキットＡと、
    他の抗腫瘍抗体もしくは前記他の抗腫瘍抗体を含む医薬組成物、及び／又はホルモン製剤、標的化小分子製剤、プロテアソーム阻害剤、造影剤、診断剤、化学療法薬、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、共刺激分子活性化剤、抑制性分子阻害剤及びワクチンからなる群のうちの１種又は複数種を含むキットＢとを含む組み合わせのキット。
  21. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項８に記載のキメラ抗原受容体、請求項１２もしくは１３に記載の抗体－薬物複合体、又は請求項１４もしくは１５に記載の医薬組成物を使用するステップを含むＣＬＤＮ１８．２を免疫学的に検出又は測定する方法。
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