KR20220075393A - Bcma를 표적으로 하는 항체, 이중 특이성 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Bcma를 표적으로 하는 항체, 이중 특이성 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BCMA를 표적으로 하는 항체, BCMA 및 CD3을 표적으로 하는 이중 특이성 항체 및 이의 용도를 개시하였다. BCMA를 표적으로 하는 상기 항체는 두 개의 중쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 22, 서열번호 33, 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하거나; 서열번호 26, 서열번호 37, 서열번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한다. 상기 항체는 인간 BCMA을 효과적으로 표적화하고 사이노몰구스 원숭이 BCMA에 결합하며; 이중 특이성 항체는 인간 BCMA 및 인간 CD3을 동시에 효과적으로 표적화하고, 사이노몰구스 원숭이 BCMA 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합할 수 있다.

Description

BCMA를 표적으로 하는 항체, 이중 특이성 항체 및 이의 용도
관련된 출원의 상호참조
본원 발명은 출원일이 2019/9/30인 중국 특허 출원 2019109413110의 우선권을 주장한다. 본원 발명은 상기 중국 특허 출원의 전체를 인용한다.
본 발명은 생물 제약 분야에 관한 것으로, 특히 BCMA를 표적으로 하는 항체, 이중 특이성 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
BCMA(B-세포 성숙 항원, TNFRSF17, CD269)은 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 막횡단 단백질이다. BCMA는 비당화 막횡단 단백질로서, B세포 성숙, 성장 및 생존에 참여한다. BCMA는 고친화력 리간드 APRIL (증식 유도 리간드) 및 저친화력 리간드 BAFF(B세포 활성화 인자)와 같은 TNF 슈퍼패밀리의 두 가지 리간드의 수용체이다. BCMA는 고도로 분화된 형질세포 선택적 단백질로, 이의 발현은 B-세포 계통으로 제한되고 주로 형질세포 및 형질모세포에 존재하며, 기억 B-세포에 어느 정도 존재하지만, 말초B-세포에는 존재하지 않는다. BCMA는 다발성 골수종(MM) 환자의 악성 형질세포에서 발현되고, 다발성 골수종 세포의 성장과 생존을 지지한다.
다발성 골수종은 비호지킨 림프종에 이어 혈액계에서 두 번째로 흔한 악성 종양으로, 모든 악성 종양의 약 1%를 차지하고, 혈액계 악성 종양의 13%를 차지하며, 악성 종양으로 인한 사망의 2%를 차지한다. 일반적으로 골수종 세포는 골수 및 뼈의 해면상 연조직에서 클론 증식하여 골용해성 골격 파괴를 유발하고, 불량한 회복은 종종 빈혈, 신부전 및 골수종 세포의 골수외 침윤으로 인한 다양한 손상을 동반한다. 2006년까지, MM의 5년 상대 생산율은 약 34%로, 현재 MM에 사용되는 모든 치료법은 비치료적이다. 다발성 골수종의 새로운 표적으로, BCMA 항체는 다양한 메커니즘을 통해 MM 세포에 작용할 수 있고, BCMA의 연구 방향은 주로 단일 클론 항체, CAR-T 요법, ADC 및 이중 특이성 항체 요법에 중점을 두고 있다.
선행기술의 항체1(이하 또한 양성 대조1이라 지칭하고, 실시예에서 번호는 PR000274임)은 글락소스미스클라인(GSK) 회사의 항BCMA 항체 CA8-J6M0 hIgG1이고, 현재 GSK에서 항BCMA 항체 CA8-J6M0을 기반으로 제조한 항체 접합 약물 belantamab mafodotin (CA8-J6M0-mcMMAF, GSK2857916)은 여러 임상 시험에서 다양한 유형의 MM 환자를 치료한다. 이 대조 항체의 서열은 (Tabs-Therapeutic Antibody Database)에서 유래된다. 소형 임상 연구의 데이터에 따르면, 35명의 과잉 사전 치료(대부분 환자는 적어도 5가지 요법 치료에서 실패)를 받은 재발성 또는 난치성(R/R) 다발성 골수종(MM) 환자에서, 객관적 완화율(ORR)은 60%, 중앙 무진행 생존기간(PFS)은 12개월이다. 안전성 측면에서, 가장 흔한 부작용은 각막 이상반응, 혈소판 감소증 및 빈혈을 포함하고, 이들은 모두 ADC에 접합된 세포 독성제와 관련이 있다.
현재, 임상 개발 단계에 있는 이중 특이성 항체에는 암젠(Amgen)의 AMG-420, 리제네론(Regeneron)의 REGN-5458, 셀진(Celgene)의 CC-93269, 존슨앤존슨(Johnson and Johnson) JNJ-64007957, 애브비(Abbvie)의 TNB383B가 있다. 그러나 이러한 이중 특이성 항체에는 반감기가 짧고, 사이토카인 방출 증후군(CRS) 등 문제가 더 존재한다. 선행기술의 항체2(이하 양성 대조2라 지칭하고, 실시예에서 번호는 PR002199임)는 Teneobio 회사의 특허 WO2018052503의 항BCMA(TNB308902)ХCD3(TNB_F2B) 이중 항체로부터 유래된다. MM에 사용되는 Teneobio의 TNB383B 이중 특이성 항체는 2019년에 임상 1상에 진입하였다. Teneobio의 TNB383B는 약화된 CD3 항체를 사용하여 사이토카인 방출을 약화시키는 특징을 갖는다. 그러나 TNB383B는 사이노몰구스 원숭이의 CD3 및 사이노몰구스 원숭이의 BCMA에 결합하지 않기에, 사이노몰구스 원숭이에서 독성학적으로 평가할 수 없다.
따라서, BCMA를 표적으로 하고 사이노몰구스 원숭이의 BCMA에 결합할 수 있는 보다 안전하고 효과적인 단일 클론 항체, 및 인간의 BCMA 및 CD3을 동시에 표적화하고, 사이노몰구스 원숭이의 BCMA 및 CD3에 결합할 수 있는 보다 안전하고 효과적인 이중 특이성 항체의 개발이 시급히 요구되고 있다.
인간의 BCMA를 표적으로 하고 사이노몰구스 원숭이의 BCMA에 결합할 수 있는 보다 안전하고 효과적인 단일 클론 항체, 및 인간의 BCMA 및 CD3을 동시에 표적화하고, 사이노몰구스 원숭이의 BCMA 및 CD3에 결합할 수 있는 보다 안전하고 효과적인 이중 특이성 항체가 부족한 선행기술의 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 BCMA를 표적으로 하는 항체, BCMA 및 CD3을 표적으로 하는 이중 특이성 항체 및 이의 용도를 제공한다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제1양태의 기술적 해결수단은 다음과 같다. BCMA를 표적으로 하는 항체는, 두 개의 중쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호(SEQ ID NO) 22, 서열번호 33 및 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하거나; 서열번호 26, 서열번호 37 및 서열번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함한다. 본 발명의 BCMA 항체는 인간 BMCA 및 사이노몰구스 원숭이 BCMA에 대한 결합 활성을 갖는다. 크기는 기존 IgG 항체에 절반으로, 이중 특이성 항체의 개발에 사용되고, 경쇄 불일치 및 이종이량체화 문제를 해결할 수 있다.
하나의 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 59, 서열번호 60 또는 이의 돌연변이로 표시되고; 상기 돌연변이는 원래의 아미노산 서열 중 하나 또는 다수의 아미노산의 첨가, 치환 또는 결실이며, 상기 제1 단백질 기능 영역과 상기 BCMA 항원의 결합을 유지하거나 개선하였다. 바람직하게, 상기 돌연변이는 서열번호 59, 서열번호 60으로 표시되는 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이상의 서열 동일성을 갖는다.
하나의 바람직한 구체적인 실시예에서, BCMA를 표적으로 하는 상기 항체는 Fc 단편을 더 포함한다. 따라서, BCMA를 표적으로 하는 상기 항체는 두 가닥의 중쇄를 포함한다. 바람직하게, 상기 Fc 단편은 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4의 Fc 단편 또는 이의 돌연변이이다.
하나의 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시된다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제2양태의 기술적 해결수단은 이중 특이성 항체를 제공하는데, BCMA를 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역 및 CD3을 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역을 포함하되, 여기서, 상기 제1 단백질 기능 영역은 본 발명의 제1양태에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체의 두 개의 중쇄 가변 영역을 포함하고; 바람직하게는, 두 개의 상기 중쇄 가변 영역 사이는 (G4S)n으로 연결되며, 상기 n은 0이 아닌 자연수이고, 바람직하게는 1 내지 20이며, 보다 바람직하게는 3 또는 4이다. 본 발명의 BCMAХCD3 이중 특이성 항체는 독특한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체로서, BCMA에 결합하는 두 개의 사이트를 가지므로 종양 세포 BCMA에 결합하는 친화력 및 특이성을 향상시키고; 이중 특이성 항체의 두 개의 단백질 기능 영역은 모두 사이노몰구스 원숭이에 결합하는 우수한 활성을 갖는다.
하나의 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 제2 단백질 기능 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 함유하는 중쇄 가변 영역 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 함유하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 25, 서열번호 38 및 서열번호 44로 표시되고/거나, 상기 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 50, 서열번호 53 및 서열번호 56으로 표시된다.
바람직하게, 상기 제2 단백질 기능 영역의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 63, 서열번호 62로 표시되거나 이의 돌연변이이고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 66으로 표시되거나 이의 돌연변이이며, 상기 돌연변이는 상기 제2 단백질 기능 영역과 CD3의 결합을 유지하거나 개선한다. 본 발명의 이중 특이성 항체는 CD3단의 활성을 최적화하고, 사이토카인의 방출을 감소시키며, BCMAХCD3이중 특이성 항체의 독성을 감소시킨다.
하나의 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 이중 특이성 항체는 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 더 포함하고, 바람직하게는 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역이며, 상기 인간 경쇄 불변 영역은 바람직하게 인간 λ, κ 경쇄 불변 영역이고, 상기 인간 중쇄 불변 영역은 바람직하게 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4의 중쇄 불변 영역 또는 이의 돌연변이이며;
바람직하게, 상기 인간 중쇄 불변 영역의 돌연변이는,
(1) L234A/L235A 돌연변이;
(2) 놉(knob) 돌연변이 T366W 및 홀(hole) 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V;
(3) 놉 돌연변이 S354C 및 홀 돌연변이 Y349C로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보다 바람직하게, 상기 제1 단백질 기능 영역은 서열번호 8 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄를 포함하며, 상기 제2 단백질 기능 영역은 서열번호 5 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 및 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄를 포함한다. 본 발명의 이중 특이성 항체는 인간Fc 단편을 갖고, FcRn에 대한 결합 작용을 유지하여 긴 반감기를 갖는다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제3양태의 기술적 해결수단은, 본 발명의 제1양태에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체 또는 본 발명의 제2양태에 따른 이중 특이성 항체를 코딩하는 분리된 핵산을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제4양태의 기술적 해결수단은, 본 발명의 제3양태에 따른 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제5양태의 기술적 해결수단은, 본 발명의 제4양태에 따른 발현 벡터; 바람직하게, 원핵 세포 또는 진핵 세포인 숙주 세포를 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제6양태의 기술적 해결수단은, 본 발명의 제1양태에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체 또는 본 발명의 제2양태에 따른 이중 특이성 항체, 및 세포 독성제를 포함하는 항체 약물 접합체를 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제7양태의 기술적 해결수단은, 본 발명의 제1양태에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체, 본 발명의 제2양태에 따른 이중 특이성 항체 또는 본 발명의 제6양태에 따른 항체 약물 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제8양태의 기술적 해결수단은, 암을 치료 및/또는 예방하는 약물을 제조하기 위한 본 발명의 제1양태에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체, 본 발명의 제2양태에 따른 이중 특이성 항체, 본 발명의 제6양태에 따른 항체 약물 접합체 또는 본 발명의 제7양태에 따른 약물 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
이 밖에, 상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 제8양태의 기술적 해결수단은 키트 조합을 제공하는데, 키트A 및 키트B를 포함하되; 상기 키트A는 본 발명의 제1양태에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체, 제2양태에 따른 이중 특이성 항체, 제5양태에 따른 숙주 세포, 제6양태에 따른 항체 약물 접합체 또는 제7양태에 따른 약물 조성물을 포함하고; 상기 키트B는 다른 항체, 이중 특이성 항체, 숙주 세포 또는 약물 조성물을 포함하며, 상기 다른 항체, 이중 특이성 항체, 숙주 세포 또는 약물 조성물은 CD3, BCMA 또는 다른 표적을 표적으로 한다. 상기 키트A 및 키트B의 사용은 선후 순서가 없거나, 먼저 키트A를 사용하고 키트B를 사용하거나, 먼저 키트B를 사용하고 키트A를 사용한다.
본 발명의 제1양태에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체, 제2양태에 따른 이중 특이성 항체, 제5양태에 따른 숙주 세포, 제6양태에 따른 항체 약물 접합체 또는 제7양태에 따른 약물 조성물을 환자에게 투여하여 관련 종양의 치료에 사용될 수 있다.
본 분야의 상식에 부합되는 기초 상에서, 상기 각 바람직한 조건은 임의로 조합되어 본 발명의 각 바람직한 구현예를 얻을 수 있다.
본 발명에 사용된 시약 및 원료는 모두 시판되는 것이다.
본 발명의 긍정적인 진행 효과는 다음과 같다.
1. 본 발명의 BCMA 항체는 "중쇄"만을 포함하는 새로운 완전 인간 항체로서, 인간 BMCA 및 사이노몰구스 원숭이 BCMA에 결합하는 활성을 갖는다. 상기 BCMA 중쇄 항체의 크기는 단지 기존 IgG 항체의 절반이고, 경쇄를 함유하지 않는 이 특징으로 인해, 상기 항체로 하여금 이중 특이성 항체에 사용될 수 있도록 하여 경쇄 불일치 및 이종이량체화 문제를 해결한다.
2. 본 발명의 BCMAХCD3 이중 특이성 항체: a. 독특한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체로서, BCMA에 결합하는 두 개의 사이트를 가지므로 종양 세포 BCMA에 결합하는 친화력 및 특이성을 향상시킨다. b. 인간Fc 단편을 갖는 이중 특이성 항체 구조로서, Fc와 FcRn의 결합 작용을 유지시켜 긴 반감기를 갖는다. c. CD3단의 활성을 최적화하여 사이토카인의 방출을 감소시키고, BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 독성을 감소시킨다. d. BCMA단 및 CD3단 항체는 사이노몰구스 원숭이에 대한 우수한 결합 활성을 갖는다.
도 1은 FACS로 항인간 BCMA의 HCAb 단일 클론 항체 세포 수준의 결합 능력을 검출한 것이고;
도 2는 ELISA로 인간 BCMA와 리간드 BAFF 단백질 결합에 대한 항인간 BCMA의 HCAb 단일 클론 항체의 차단을 검출한 것이며;
도 3은 FACS로 BCMA를 고도로 발현하는 NCI-H929 세포계에서의 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 체외 결합을 검출한 것이고;
도 4는 FACS로 인간 및 붉은털 원숭이 BCMA를 과발현하는 HEK293T세포주에서의 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 체외 결합을 검출한 것이며;
도 5는 FACS로 BCMAХCD3 이중 특이성 항체와 인간 및 붉은털 원숭이 T세포의 체외 결합을 검출한 것이고;
도 6은 BCMA 고발현 세포계 NCI-H929에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 체외 사멸 실험 및 사이토카인의 방출을 나타내며;
도 7은 BCMA 저발현 세포계 RPIM8226에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 체외 사멸 실험 및 사이토카인의 방출을 나타내고;
도 8은 FACS로 BCMA 음성 세포계 HL-60에서의 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 결합을 검출하는 것이며;
도 9은 FACS 방법으로 BCMA 음성 세포계 HL-60에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 비특이적 사멸 및 사이토카인의 방출을 검출한 것이고;
도 10은 NCI-H929/인간 PBMC 마우스 모델에서 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 항종양 약효 평가를 나타내며;
도 11은 BIACORE로 PR003178과 인간 CD3e/g 재조합 단백질, 사이노몰구스 원숭이 CD3e/g 재조합 단백질 및 인간 BCMA 재조합 단백질, 사이노몰구스 원숭이 BCMA 재조합 단백질의 친화력을 검출한 것이다.
이하 실시예의 방식을 통해 본 발명을 추가로 설명하지만, 이로써 본 발명을 상기 실시예 범위에 한정하는 것은 아니다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은, 통상적인 방법 및 조건, 또는 제품 설명에 따라 선택하였다.
본원 발명에서, 용어 "항체"는 일반적으로 결합 항원의 일부를 포함하는 단백질, 및 선택적으로 결합 항원의 일부가 항원에 대한 항체의 결합을 촉진하는 형태를 사용하도록 하는 스캐폴드 또는 골격 부분을 지칭한다. 항체 경쇄 가변 영역(VL), 항체 중쇄 가변 영역(VH) 또는 상기 양자를 전형적으로 포함할 수 있다. 예를 들면 본원 발명의 "중쇄 항체"는 VL 영역을 포함하지 않고, VH 영역만 포함한다. VH 또는 VL영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 지칭되는 초가변 영역으로 추가로 구분될 수 있고, 이들은 프레임워크 영역(FR)이라고 지칭되는 보다 보존된 영역에 산포된다. 각 VH 또는 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열되는 세 개의 CDR 및 네 개의 FR 영역으로 구성된다, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 구현예는 전장 항체, 중쇄 항체(HCAb), 항원 결합 단편(Fab, Fab’, F(ab)2, Fv 단편, F(ab')2, scFv, di-scFv 및/또는 dAb), 면역 접합체, 다중 특이성 항체(예를 들면 이중 특이성 항체), 항체 단편, 항체 유도체, 항체 유사체 또는 융합 단백질 등을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면 된다.
본 발명에서, 용어 "가변"은 일반적으로 항체의 가변 도메인의 서열의 일부가 강하게 변화되고, 이는 특정 항원에 대한 다양한 특정 항체의 결합 및 특이성을 형성한다. 그러나, 변이성은 항체의 전체 가변 영역에 고르게 분포되지 않는다. 이는 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역(HVR)이라고 지칭되는 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 세 개의 단편에 집중되어 있고, FR은 가변 도메인에서 더 고도로 보존된 부분이다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 네 개의 FR영역을 포함하고, 대부분은 시트 구성이며, 세 개의 CDRs로 연결되어 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에는 시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬의 CDRs는 FR영역에 의해 매우 근접하고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 사이트를 형성하며, 불변 영역은 항체가 항원에 결합하는데 직접적으로 참여하지 않지만, 이들은 항체 의존적 세포 독성에 참여하는 것과 같은 다른 효과 기능을 나타낸다.
본 분야에서, 서열 가변성에 기초한 Kabat 정의 규칙(Kabat 등, 면역학의 단백질 서열, 제5버전, 미국 국립보건원, 베데스다, 메릴랜드주(1991) 참조) 및 구조적 루프 영역 위치에 기반한 Chothia 정의 규칙(A1-Lazikani 등, JMol Biol 273:927-48,1997 참조)과 같은 다양한 방법으로 항체의 CDR을 정의할 수 있다. 본원 발명에서, 또한 Kabat 정의 및 Chothia 정의를 포함하는 Combined 정의 규칙을 사용하여 가변 도메인 서열 및 전장 항체 서열의 아미노산 잔기를 결정한다(표 1).
본원 발명의 항체CDR 정의 방법(http://bioinf.org.uk/abs/를 참조할 수 있음)
CDR 영역 Kabat 정의 Chothia 정의 Combined 정의
LCDR1 L24--L34 L24--L34 L24--L34
LCDR2 L50--L56 L50--L56 L50--L56
LCDR3 L89--L97 L89--L97 L89--L97
HCDR1 H31--H35 H26--H32 H26--H35
HCDR2 H50--H65 H52--H56 H50--H65
HCDR3 H95--H102 H95--H102 H95--H102
여기서, Laa-Lbb는 항체 경쇄의 N단에서 시작하고, aa번째 위치(Chothia 코딩 규칙)에서 bb번째 위치(Chothia 코딩 규칙)까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있으며; Haa-Hbb는 항체 중쇄의 N단에서 시작하고, aa번째 위치(Chothia 코딩 규칙)에서 bb번째 위치(Chothia 코딩 규칙)까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들면, L24 내지 L34는 항체 경쇄의 N단에서 시작하고, Chothia 코딩 규칙에 따라 24번째 위치에서 34번째 위치까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있으며; H26 내지 H32는 항체 중쇄의 N단에서 시작하고, Chothia 코딩 규칙에 따라 26번째 위치에서 32번째 위치까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. ADCC 및 CDC와 같은 항체 Fc 도메인에 의해 매개되는 이펙터 기능도 매우 중요한 생물학적 기능을 갖고, 상이한 IgG 아형은 상이한 ADCC 또는 CDC 기능을 갖지며, 예를 들면 IgG1 및 IgG3은 강한 ADCC 및 CDC 효과를 갖지만, IgG2 및 IgG4의 작용은 상대적으로 약하다. 이 밖에, 아미노산 돌연변이 또는 변형을 통해 Fc 수용체에 대한 Fc의 결합 능력을 변경하는 것도 Fc의 원래 이펙터 기능을 조절할 수 있다. 예를 들면, IgG1의 "LALA" 이중 돌연변이체(L234A/L235A)는 FcγRIIIA(CD16A)에 대한 친화력을 현저히 감소시켜 ADCC 효과를 감소시킬 수 있다. 이 밖에, P329G 돌연변이는 다양한 Fcγ 수용체에 대한 결합을 현저히 감소시킬 수 있다(Schlothauer T, Herter S, Koller CF, Grau-Richards S, Steinhart V, Spick C, Kubbies M, Klein C, Umaρa P, Mφssner E. Novel human IgG1 and IgG4 Fc-engineered antibodies with completely abolished immune effector functions. Protein EngDes Sel. 2016 Oct;29(10):457-466. doi: 10.1093/protein/gzw040. Epub 2016 Aug 29. PubMed PMID: 27578889 참조). 본원 발명에서, Fcγ 수용체에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 결합을 감소시키기 위하여, 이러한 항체의 Fc에 "LALA" 이중 돌연변이체(L234A/L235A) 또는 "LALAPG" 삼중 돌연변이체(L234A/L235A/P329G)를 도입하였다.
실시예1. 마우스 면역화 및 항BCMA 항체 분자의 수득
BCMA 항원을 사용하여 실험 동물을 면역화하여 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 수득할 수 있고, 상기 실험 동물은 마우스, 래트, 토끼, 양, 낙타 등일 수 있다. 일반적으로, 얻은 항체 분자는 비인간 것이다. 비인간 항체를 수득한 후, 항체 공학 기술을 사용하여 이러한 분자를 인간화 변형시켜 면역 원성을 감소시키고 약물 가능성을 향상시킨다. 그러나, 항체의 인간화 과정에는 기술적 복잡성이 있고, 인간화 변형된 분자는 종종 항원에 대한 친화력을 감소시킨다. 다른 한편으로, 유전자 변형 기술의 진보는 인간 면역글로불린 면역 레퍼토리를 갖고 내인성 마우스의 면역 레퍼토리가 결실되도록 하는 유전자 변형 마우스를 배양할 수 있다. 이러한 유전자 변형 마우스에 의해 생성된 항체는 완전 인간화 서열을 갖기에, 인간화 변형을 추가로 수행할 필요가 없어 치료성 항체 개발의 효율을 크게 향상시켰다. Harbour HCAb마우스(Harbour Antibodies BV, WO 2002/085945 A3)는 인간 면역글로불린 면역 레퍼토리를 갖는 유전자 변형 마우스로, "중쇄"만을 갖는 새로운 항체를 생성할 수 있고, 상기 항체의 크기는 단지 기존 IgG 항체의 절반이다. 이에 의해 생성된 항체는 단지 인간의 항체 "중쇄" 가변 도메인 및 마우스 Fc 불변 도메인을 갖는다. 경쇄를 함유하지 않는 이 특징으로 인해, 상기 항체는 경쇄 불일치 및 이종이량체화 문제를 거의 해결하여 이 기술 플랫폼에서 기존 항체 플랫폼으로 달성하기 어려운 제품을 개발할 수 있다.
1.1 BCMA 항원으로 마우스의 면역화
가용성 재조합 인간 BCMA-ECD-Fc 융합 단백질로 Harbour HCAb 마우스를 여러 라운드 면역화한다. 항원 단백질과 면역 보조제를 혼합하여 면역원 시약을 형성한 후, 사타구니에 피하 주사하거나 복강 주사하였다. 각 라운드의 면역화에서, 각 마우스가 받은 총 주사 투여량은 100마이크로리터였다. 처음 라운드의 면역화에서, 각 마우스는 50 마이크로그램의 항원 단백질(재조합 인간 BCMA-ECD-Fc, ACRO, Cat.BC7-H82F0)과 완전한 프로인드 보조제(Sigma, #F5881)를 1:1의 부피비로 혼합하여 조제한 면역원 시약의 면역화를 받았다. 이후의 각 라운드의 부스터 면역에서, 각 마우스는 25 마이크로그램의 항원 단백질과 Sigma Adjuvant System 보조제(Sigma, #S6322)를 혼합하여 조제한 면역원 시약의 면역화를 받았다. 각 라운드의 부스터 면역의 간격 시간은 적어도 2주이고, 일반적으로 다섯 라운드의 부스터 면역화를 초과하지 않는다. 면역 시간은 제0, 14, 28, 42, 56, 70일이고; 제49, 77일에, 마우스의 혈청 항체 역가를 검출하였다. HCAb 마우스의 비장 B세포 분리 5일 전에, 마우스당 25마이크로그램의 항원 단백질의 투여량으로 마지막 부스터 면역화를 수행하였다.
1.2 HCAb 단일 클론 및 항체 서열의 수득
마우스의 혈청에서 BCMA 특이적 항체 역가가 일정한 수준에 도달한 후, 마우스의 비장 세포를 꺼내어 B세포를 분리하고, BD FACS AriaII Cell Sorter로 CD138 양성 형질세포 및 BCMA 항원 양성의 B세포군을 선별하였다. RNA를 추출하고, cDNA를 역전사한 후 PCR로 인간VH 유전자를 증폭하였다. 증폭된 VH 유전자 단편을 인간 IgG1 항체 중쇄 Fc 도메인 서열을 코딩하는 포유 동물 세포 발현 플라스미드 pCAG 벡터에 구축하고, 플라스미드를 포유 동물의 숙주 세포(예를 들면 인간 배아 신장 세포 HEK293)에 형질감염시켜 발현하며, 발현된 HCAb의 항체 상층액을 재조합 인간 BCMA-Fc, Avitag 재조합 단백질(ACRO, Cat.BC7-H82F0)을 Mirrorball 선별하고, 수득한 Mirrorball 양성 단일 클론 항체를 FACS로 인간 BCMA를 과발현하는 HEK293T 세포주(HEK293T/huBCMA, 북경캉왠(Beijing Kangyuan)), 사이노몰구스 원숭이 BCMA를 과발현하는 HEK293T 세포주(HEK293T/cynoBCMA, 북경캉왠) 및 인간 BCMA를 고도로 발현하는 세포계 NCI-H929( ATCC ®　CRL-9068??) 세포와의 결합 능력을 추가로 감정하였다. 수득한 양성 클론의 클론 번호는 HBM1005P63B7이고, 이하 번호는 PR001046이다. 통상적인 시퀀싱 방법을 사용하여 항체 분자의 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 대응되는 아미노산 서열을 수득하였다. 본 실시예에서, 면역화된 Harbour HCAb 마우스로부터 얻은 항BCMA 단일 클론 항체 분자 가변 도메인의 서열은 인간화 항체 서열이다.
표 2는 본 실시예에서 BCMA 항체의 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열, 중쇄 전장 아미노산 서열, 및 Combined 정의 규칙에 따라 정의된 CDR의 아미노산 서열을 나열하였다. 다른 규칙에 따라 정의된 본 발명의 항체의 CDR의 아미노산 서열은 서열 목록을 참조한다.
항BCMA의 HCAb 항체 관련 아미노산 서열
PR001046 아미노산 서열 및 서열 번호
PR001046 중쇄 서열 EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSDNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIFSGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCARRNYDDTRGTDVFDIWGQGTMVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 1)
PR001046 중쇄 가변 영역 서열 EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSDNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIFSGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCARRNYDDTRGTDVFDIWGQGTMVTVSS(서열번호 59)
PR001046 VH CDR1 (Combined) GFTVSDNYMT(서열번호 22)
PR001046 VH CDR2 (Combined) VIFSGGNTYYADSVKG(서열번호 33)
PR001046 VH CDR3 (Combined) RNYDDTRGTDVFDI(서열번호 42)
1.3 항BCMA 완전 인간 재조합 항체의 제조
항체 PR001046의 중쇄를 코딩하는 플라스미드를 포유 동물의 숙주 세포(예를 들면 인간 배아 신장 세포 HEK293)에 형질감염시키고, 통상적인 재조합 단백질 발현 및 정제 기술을 사용하여 정제된 항BCMA 재조합 중쇄 항체를 얻을 수 있다. 구체적으로, HEK293 세포를 FreeStyle?? F17 Expression Medium 배지(Thermo, A1383504)에서 증폭 배양하였다. 일시적인 형질감염이 시작되기 전에, 세포 농도를 6×105세포/mL로 조절하고, 37℃의 8% CO2 진탕기에서 24시간 동안 배양하며, 세포 농도는 1.2×106세포/mL이다. 30 mL의 배양한 세포를 준비하고, PR001046 중쇄를 코딩하는 상기 플라스미드 30 μg를 1.5 mL Opti-MEM 환원 혈청 배지(Thermo,31985088)에 용해시키며, 1.5 mL Opti-MEM을 1 mg/mL PEI(Polysciences, Inc, Cat# 23966-2) 120 μL에 용해시키고, 5분 동안 방치하였다. PEI를 플라스미드에 천천히 넣고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하며, 배양 플라스크를 흔들면서 플라스미드 PEI 혼합 용액을 천천히 적가하고, 37℃의 8% CO2 진탕기에서 5일 동안 배양하였다. 5일 후 세포 생존율을 관찰하였다. 배양물을 수집하고, 3300G 회전속도로 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하며; 다음 상층액을 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하였다. PBS(pH7.4)로 MabSelect ??(GE Healthcare Life Science, Cat#71-5020-91 AE)를 함유하는 중력 컬럼(Bio-Rad, #7311550)을 평형화하고, 2배 내지 5배의 컬럼 부피로 세척하였다. 상층액 샘플을 컬럼에 통과시켰다. 5배 내지 10배의 컬럼 부피의 PBS로 컬럼을 세척하였다. 다시 pH3.5의 0.1M 글리신으로 목적 단백질을 용출한 후, pH 8.0의 Tris-HCl로 중성으로 조정하고, 마지막으로 밀리포아(Millipore, UFC901024)로 농축하며 PBS 완충액으로 교환하여 정제된 항BCMA 중쇄 항체 용액을 얻었다.
다음 표는 양성 대조1, 즉 전장 항체PR000274의 경쇄, 중쇄 서열이고, 경쇄, 중쇄 가변 영역 서열 및 Combined 정의 규칙에 따라 정의된 CDR의 아미노산 서열이다.
완전 인간 재조합 항체 관련 아미노산 서열
PR000274 아미노산 서열 및 서열 번호
PR000274중쇄 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 2)
PR000274중쇄 가변 영역 서열 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYDGYDVLDNWGQGTLVTVSS(서열번호 58)
PR000274 VH CDR1 (Combined) GGTFSNYWMH(SEQIDNO: 21)
PR000274 VH CDR2 (Combined) ATYRGHSDTYYNQKFKG(서열번호34)
PR000274 VH CDR3 (Combined) GAIYDGYDVLDN(서열번호 40)
PR000274 경쇄 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 45)
PR000274 경쇄 가변 영역 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIK(서열번호 64)
PR000274 VL CDR1 (Combined) SASQDISNYLN(서열번호 48)
PR000274 VL CDR2 (Combined) YTSNLHS(서열번호 51)
PR000274 VL CDR3 (Combined) QQYRKLPWT(서열번호 54)
실시예2. FACS로 항인간 BCMA의 HCAb 단일 클론 항체 세포 수준의 결합 능력을 검출
본 실시예는 체외에서 인간 및 사이노몰구스 원숭이 BCMA에 결합하는 항인간 BCMA의 HCAb 단일 항체의 활성을 연구하기 위한 것이다. 인간 BCMA를 과발현하는 HEK293T 세포주(HEK293T/huBCMA, 북경캉왠), 사이노몰구스 원숭이 BCMA를 과발현하는 HEK293T 세포주(HEK293T/cynoBCMA, 북경캉왠) 및 인간 BCMA를 고도로 발현하는 세포계 NCI-H929( ATCC ®　CRL-9068??)를 사용하여 세포 수준에서의 항체 결합 실험을 수행하였다. 간단히 말해서, 세포 HEK293T/huBCMA 및 HEK293T/cynoBCMA 세포를 소화하고, DMEM 완전 배지로 재현탁시키며, NCI-H929세포 현탁액을 수집하였다. 3가지 세포 밀도를 각각 1×10 6세포/mL로 조정하였다. 100 μL의 세포/웰로 96웰 V형 바닥 플레이트(Corning, Cat#: 3894)에 접종한 후, 100 μL/웰을 넣고, 최종 농도의 3배 농도 구배로 희석된 시험할 항체에 2배가 되도록 하였다. 세포를 4℃에 놓고, 빛을 피하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 100 μL/웰의 미리 냉각된 PBS를 넣어 세포를 2회 세척하고, 500 g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하며, 상층액을 제거하였다. 100 μL/웰 형광 2차 항체(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, Cat#:109-545-06, 1: 500 희석)를 더 넣고, 4℃에서, 빛을 피하여 30분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 미리 냉각된 PBS로 세포를 2회 세척하고, 500 g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하며, 상층액을 제거하였다. 마지막으로, 200 μL/웰의 미리 냉각된 PBS로 세포를 재현탁시키고, BD FACS CANTOII를 사용하여 형광 발광 신호값을 판독하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 인간 BCMA를 과발현하는 HEK293T 세포주(A), 사이노몰구스 원숭이 BCMA를 과발현하는 HEK293T 세포주(B) 및 인간 BCMA를 고도로 발현하는 세포계NCI-H929(C)에서의 항인간 BCMA의 HCAb단일 클론 항체 PR001046의 결합 능력은 모두 양성 대조1(PR000274)보다 우수하였다. 구체적으로, PR001046 결합 곡선의 EC50은 모두 양성 대조1보다 작은 것으로 나타났고, 구체적인 최대 형광값 및 EC50은 도 1의 (D)를 참조한다.
실시예3. ELISA로 인간 BCMA와 리간드 BAFF 단백질의 결합에 대한 항인간 BCMA의 HCAb 단일 클론 항체의 차단을 검출
본 실시예는 인간 BCMA(ACRO, BCA-H522y-100μg)와 리간드 BAFF 단백질(ACRO, BAF-H5248-50ug)의 결합에 대한 항인간 BCMA의 HCAb 단일 클론 항체의 차단 능력을 평가하기 위한 것이다. 비오틴화 키트(ThermoFisher, A39257, EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)를 사용하여 지침 요구에 따라 BAFF 단백질을 비오틴화하였다. 1 μg/mL의 인간 BCMA 단백질, Fc Tag (ACRO, Cat#: BC7-H5254)로 하룻밤 코팅(Corning, Cat#: 9018)하였다. PBST로 3회 세척한 후 2% BSA를 넣어 실온에서 1시간 동안 차단하였다. PBST로 3회 세척한 후 100 μL/웰의 3배 농도 구배로 희석된 시험할 항체를 넣고, 시작 농도는 50 nM이며, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 상층액을 제거하고, 100 μL/웰의 0.5 μg/mL 비오틴화된 인간 BAFF 단백질(본 분야의 통상적인 방법에 근거하여 제조)을 넣으며, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 제거하고, 100 μL/웰의 1:4000로 희석된 스트렙타비딘 결합된 HRP(Bio-RAD, Cat#: 1610380)를 넣었다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBST로 3회 세척하였다. 100 μL/웰의 TBM을 넣어 발색하고, 15분 후 정지액을 넣어 반응을 종료하였다. Enspire(Perkin Elmer)을 사용하여 OD450값을 측정하였다.
도 2에 (A)에 나타낸 바와 같이, 항인간 BCMA의 HCAb 단일 클론 항체PR001046은 양성 대조1 항체에 해당되는 인간 BCMA와 이의 리간드 BAFF 단백질의 결합을 차단하는 능력을 갖는다. 구체적인 IC50값은 도 2의 (B)를 참조한다.
실시예4. CD3 항체의 인간화 변형
항CD3 항체는 T세포 엔가저 이중 특이성 항체(T-Cell Engager Bispecific Antibody)를 구축하는 중요한 부분이다. 인간 CD3e(CD3 epsilon 단일 서브 유닛 또는 CD3e를 함유하는 복합체)에 결합하는 알려진 마우스 항체 SP34를 인간화 변형시켰다. WO2017084495A1(강소헝루이(Jiangsu Hengrui)) 또는 CN104136610B(Yakushi Yakus Co., LTD)에 설명되어 있고, 다음과 같이 간략하게 설명한다.
본 실시예는 "CDR 이식" 방법을 사용하여 서열의 인간화를 수행하고, 즉, 마우스 항VH의 CDR을 인간 항체 VH의 프레임워크 영역에 이식하며, 마우스 항VL의 CDR을 인간 항체 VL의 프레임워크 영역에 이식하였다. 인간 항체 VH 또는 VL의 프레임워크 영역의 서열은 인간의 생식계열 유전자 서열 또는 V(D)J 재배열된 항체 서열 또는 인간 항체 특정 VH 또는 VL 유전자 패밀리의 일치성(consensus) 서열로부 유래될 수 있다. 본 실시예는 인간 생식계열 유전자 서열에 의해 제공되는 프레임워크 영역 서열을 인간화 주형 서열로 사용하고, 즉, 인간 생식계열 V유전자 단편은 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3의 서열을 제공하며, 인간 생식계열 J유전자 단편은 프레임워크 영역 FR4의 서열을 제공하였다. 마지막으로 (인간)FR1-(마우스)CDR1-(인간)FR2-(마우스)CDR2-(인간)FR3-(마우스)CDR3-(인간)FR4의 배열 방식으로 인간화 가변 영역(VH 또는 VL) 서열을 구축하였다.
본 실시예는 인간 생식계열 V유전자 단편 IGHV3-73*01 또는 인간 생식계열 J유전자 단편 IGHJ1*01에 결합하는 인간 생식계열 V유전자 단편 IGHV3-23*01의 서열을 인간화 주형으로 사용하여 프레임워크 영역 서열을 제공하였다. 30번째 위치, 73번째 위치, 76번째 위치, 78번째 위치, 93번째 위치 또는 94번째 위치(Chothia 코딩 규칙)에 하나 또는 다수의 사이트의 아미노산 돌연변이를 도입하여 다수의 상이한 VH 변이체 서열을 얻었다.
본 실시예는 인간 생식계열 J유전자 단편 IGLJ2*01에 결합하는 인간 생식계열 V유전자 단편 IGLV7-46*02의 서열 또는 인간 생식계열 J유전자 단편 IGKJ4*01에 결합하는 인간 생식계열 V유전자 단편 IGKV1-39*01의 서열을 인간화 주형으로 사용하여 프레임워크 영역 서열을 제공하였다. 2번째 위치, 36번째 위치, 46번째 위치, 49번째 위치, 66번째 위치, 69번째 위치, 71번째 위치 또는 87번째 위치(Chothia 코딩 규칙)에 0개 또는 다수의 사이의 아미노산 돌연변이를 도입하여 다수의 상이한 VL 변이체 서열을 얻었다. 하기 표 4는 CD3 항체 중 하나의 아미노산 서열이고, 상기 항체의 경쇄(LC), 중쇄(이하, 본 발명의 CD3 항체의 중쇄, 중쇄 가변 영역은 각각 이중 특이성 항체에서 HC1, VH1이라 약칭함)와 본 발명의 BCMA 항체의 중쇄(이하, 본 발명의 BCMA 항체의 중쇄, 중쇄 가변 영역은 각각 이중 특이성 항체에서 HC2, VH2라 약칭함) 서열은 이중 특이성 항체 PR003178, PR002299(구체적인 구축 방법은 실시예5를 참조)를 구성한다.
수득된 CD3 항체 아미노산 서열
PR003178에 사용되는 CD3 항체 서열 정보
PR003178 HC1 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 5)
PR003178 VH1 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS(서열번호 63)
PR002299 HC1 서열 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 4)
PR002299 VH1 서열 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS(서열번호 62)
PR003178/ PR002299 VH1 CDR1 (Combined) GFTFSTYAMN(서열번호 25)
PR003178/ PR002299 VH1 CDR2 (Combined) RIRSKYNNYATYYADSVKD(서열번호 38)
PR003178/ PR002299 VH1 CDR3 (Combined) HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 44)
PR003178/ PR002299LC서열 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGDKAALTLLGAQPEDEAEYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(서열번호 47)
PR003178 VL서열 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGDKAALTLLGAQPEDEAEYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL(서열번호 66)
PR003178/ PR002299 LCDR1 (Combined) RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 50)
PR003178/ PR002299 LCDR2 (Combined) GTNKRAP(서열번호 53)
PR003178/ PR002299 LCDR3 (Combined) ALWYSNLWV(서열번호 56)
실시예5. BCMAХCD3이중 특이성 항체의 제조
실시예4 이후에 선택된 항BCMA 항체 및 항CD3 세포는 이중 특이성 항체의 제조에 사용되었다. 이러한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 제조에서 이중 항체는 두 개의 표적에 동시에 결합할 수 있고, 일단은 종양 세포 표면에 특이적으로 발현된 BCMA를 인식할 수 있으며, 타단은 T세포의 CD3 분자에 결합할 수 있다. BCMAХCD3 이중 항체 분자가 종양 세포 표면에 결합한 후, 종양 세포 근처의 T세포를 모집하고 활성화시켜 종양 세포를 사멸할 수 있다.
각각의 이중 특이성 항체에 있어서, 세 가닥의 단백질 사슬이 관련되고, 이는 상응한 항BCMA 항체의 중쇄, 및 상기 항CD3 항체의 중쇄 및 경쇄를 각각 포함한다. 불일치한 중쇄(예를 들면 항CD3 항체의 두 가닥의 중쇄 불일치)를 갖는 부산물 형성을 최소화하기 위해, WO2009080251 및 WO2009080252에 기재된 바와 같이 상기 돌연변이의 이종이량체 Fc영역을 사용하고, "놉-홀" 돌연변이 및 변형된 이황화 결합을 갖는다. BCMAХCD3 이중 특이성 항체는 Fc 돌연변이 L234A 및 L235A(EU 색인에 따라 넘버링함)를 갖는 IgG1이다.
세 개의 상이한 포유 동물 발현 벡터를 동시에 공동 형질감염시켜 매 하나의 이중 특이성 항체를 생성하되, 각각 1) Fc영역에서 "폴" 돌연변이를 가져 이종이량체 항체를 생성하고, Fc의 CH3은 L234A, L235A 돌연변이를 갖는 상응한 BCMA 항체의 중쇄; 2)Fc영역에서 "놉" 돌연변이를 가져 이종이량체 항체를 생성하고, Fc의 CH3은 L234A, L235A 돌연변이를 갖는 상응한 CD3 항체의 중쇄; 3)상응한 CD3 항체의 경쇄로 넘버링한다. 인간 IgG1 Fc영역의 "놉" 돌연변이는 T366W로 구성되고, "폴" 돌연변이는 T366S, L368A, Y407V로 구성된다. 이 밖에, "놉" Fc 영역의 S354C 및 "폴" Y349C를 포함하여 한 쌍의 이황화 결합을 형성하여 안정성 및 이종이량체 항체 수율을 증가시킨다. 하기 표 5 내지 표 7은 각각 본 발명의 이중 특이성 항체 및 양성 대조2의 서열 정보이다.
PR003178 이중 특이성 항체 BCMA 사슬의 서열 정보
PR003178 HC2 서열 EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSDNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIFSGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCARRNYDDTRGTDVFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSDNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIFSGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCARRNYDDTRGTDVFDIWGQGTMVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 8)
PR003178 VH2 서열 EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSDNYMTWVRQAPGKGLEWVSVIFSGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCARRNYDDTRGTDVFDIWGQGTMVTVSS(서열번호 59)
PR003178 VH2 CDR1 (Combined) GFTVSDNYMT(서열번호 22)
PR003178 VH2 CDR2 (Combined) VIFSGGNTYYADSVKG(서열번호 33)
PR003178 VH2 CDR3 (Combined) RNYDDTRGTDVFDI(서열번호 42)
PR002299 이중 특이성 항체 BCMA 사슬의 아미노산 서열 정보
PR002299 HC2서열 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSGISESGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCVKDLDDILTGYYKDYWGQGTLVTVSSRTGGGGSKLEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSGISESGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCVKDLDDILTGYYKDYWGQGTLVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 7)
PR002299 VH2서열 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEWVSGISESGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCVKDLDDILTGYYKDYWGQGTLVTVSS(서열번호 60)
PR002299 VH2 CDR1 (Combined) GFTFSSYAMI(서열번호 26)
PR002299 VH2 CDR2 (Combined) GISESGGSTYYADSVKG(서열번호 37)
PR002299 VH2 CDR3 (Combined) DLDDILTGYYKDY(서열번호 41)
양성 대조2(PR002199)의 아미노산 서열 정보
PR002199 아미노산 서열 및 서열 번호
PR002199 HC1 서열 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 3)
PR002199 VH1 서열 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSS(서열번호 61)
PR002199 VH1 CDR1 (Combined) GFTFDDYAMH(서열번호 23)
PR002199 VH1 CDR2 (Combined) GISWNSGSIGYADSVKG(서열번호 35)
PR002199 VH1 CDR3 (Combined) DSRGYGDYRLGGAY(서열번호 43)
PR002199 HC2 서열 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYGMSWVRQAPGKGPEWVSGIRGSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQGENDGPFDHRGQGTLVTVSSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYGMSWVRQAPGKGPEWVSGIRGSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQGENDGPFDHRGQGTLVTVSSASEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 6)
PR002199 VH2 서열 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYGMSWVRQAPGKGPEWVSGIRGSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQGENDGPFDHRGQGTLVTVSS(서열번호 57)
PR002199 VH2 CDR1 (Combined) GFTVSSYGMS(서열번호 24)
PR002199 VH2 CDR2 (Combined) GIRGSDGSTYYADSVKG(서열번호 36)
PR002199 VH2 CDR3 (Combined) QGENDGPFDH(서열번호 39)
PR002199 LC 서열 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 46)
PR002199 VL 서열 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPWTFGQGTKVEIK(서열번호 65)
PR002199 VL CDR1 (Combined) RASQSVSSNLA(서열번호 49)
PR002199 VL CDR2 (Combined) GASTRAT(서열번호 52)
PR002199 VL CDR3 (Combined) QQYNNWPWT(서열번호 55)
실시예6. FACS로 BCMA를 고도로 발현하는 NCI-H929 세포계에서의 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 체외 결합을 검출
인간 BCMA에 결합하는 BCMAХCD3 이중 특이성 항체 BCMA 암(arm)의 활성을 연구하기 위하여, BCMA를 고도로 발현하는 NCI-H929 세포계를 사용하여 세포에서 인간 BCMA와의 결합 실험을 수행하였다. 간단히 말해서, NCI-H929 세포 현탁액을 수집하였다. 세포 밀도를 각각 1×10 6세포/mL로 조정하였다. 100 μL세포/웰로 96웰 V형 바닥 플레이트(Corning, Cat#: 3894)에 접종한 후, 100 μL/웰을 넣고, 최종 농도의 3배 농도 구배로 희석된 시험할 항체에 2배를 넣었다. 세포를 4℃에 놓고, 빛을 피하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 100 μL/웰의 미리 냉각된 PBS를 넣어 세포를 2회 세척하고, 500 g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하며, 상층액을 제거하였다. 100 μL/웰 형광 2차 항체(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, Cat#:109-545-06, 1: 500 희석)를 더 넣고, 4℃, 빛을 피하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 미리 냉각된 PBS로 세포를 2회 세척하고, 500 g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하며, 상층액을 제거하였다. 마지막으로, 200 μL/웰의 미리 냉각된 PBS로 세포를 재현탁시키고, BD FACS CANTOII를 사용하여 형광 발광 신호값을 판독하였다.
도 3의 (A) 및 (B)에 도시된 바와 같이, NCI-H929 세포계에서 인간 BCMA 분자에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체 PR003178의 결합은 양성 대조2보다 우수하고, 구체적으로, 항체 PR003178 결합 곡선의 EC50은 양성 대조2보다 약 8배 작은 것으로 나타났다. 동시에, NCI-H929 세포계에서 인간 BCMA 분자에 대한 항체 PR002299의 결합은 최대 결합 형광값 및 결합 곡선의 EC50 두 측면에서 모두 항체 PR003178보다 약하였다.
실시예7. FACS로 인간 및 사이노몰구스 원숭이 BCMA를 과발현하는 HEK293T 세포주에서의 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 체외 결합을 검출
BCMAХCD3 이중 특이성 항체 BCMA 암의 체외 결합 활성을 연구하기 위하여, 인간 BCMA를 과발현하는 HEK293T 세포주(HEK293T/huBCMA) 및 사이노몰구스 원숭이 BCMA를 과발현하는 HEK293T 세포주(HEK293T/cynoBCMA)를 사용하여 세포 수준에서의 항체 결합 실험을 수행하였다. 간단히 말해서, 세포HEK293T/huBCMA 및 HEK293T/cynoBCMA 세포를 소화하고, DMEM 완전 배지에 재현탁시켰다. 2가지 세포 밀도를 각각 1×10 6세포/mL로 조정하였다. 100 μL의 세포/웰로 96웰 V형 바닥 플레이트(Corning, Cat#: 3894)에 접종한 후, 100 μL/웰을 넣고, 최종 농도의 3배 농도 구배로 희석된 시험할 항체에 2배를 넣었다. 세포를 4℃에 놓고, 빛을 피하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 100 μL/웰의 미리 냉각된 PBS를 넣어 세포를 2회 세척하고, 500 g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하며, 상층액을 제거하였다. 100 μL/웰 형광 2차 항체(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, Cat#: 109-545-06, 1: 500 희석)를 더 넣고, 4℃에서, 빛을 피하여 30분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 미리 냉각된 PBS로 세포를 2회 세척하고, 500 g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하며, 상층액을 제거하였다. 마지막으로, 200 μL/웰의 미리 냉각된 PBS로 세포를 재현탁시키고, BD FACS CANTOII를 사용하여 형광 발광 신호값을 판독하였다.
도 4의 (A)에 도시된 바와 같이, HEK293T/huBCMA 세포의 인간 BCMA에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체 PR003178의 결합은 양성 대조2보다 강하였다. 구체적으로, 항체 PR003178 결합 곡선의 EC50은 도 4의 (C)에 도시된 바와 같이 양성 대조2보다 약 5배 작은 것으로 나타났다. 동시에, 도 4의 (B)에 도시된 바와 같이, PR003178은 HEK293T/cynoBCMA 세포의 사이노몰구스 원숭이 BCMA와 교차 결합할 수 있지만, 양성 대조2는 사이노몰구스 원숭이 BCMA와 교차 결합하는 능력이 없다.
실시예8. FACS로 인간 및 사이노몰구스 원숭이 T세포에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 체외 결합을 검출
BCMAХCD3 이중 특이성 항체 CD3 암의 체외 결합 활성을 연구하기 위하여, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 T세포를 사용하여 세포 수준에서의 항체 결합 실험을 수행하였다. 간단히 말해서, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 T세포 밀도를 각각 1×10 6세포/mL로 조정하였다. 100 μL의 세포/웰로 96웰 V형 바닥 플레이트(Corning, Cat#: 3894)에 접종한 후, 100 μL/웰을 넣고, 최종 농도의 3배 농도 구배로 희석된 시험할 항체에 2배를 넣었다. 세포를 4℃에 놓고, 빛을 피하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 100 μL/웰의 미리 냉각된 PBS를 넣어 세포를 2회 세척하고, 500 g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하며, 상층액을 제거하였다. 100 μL/형광 2차 항체(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, Cat#:109-545-06, 1: 500 희석)를 더 넣고, 4℃에서, 빛을 피하여 30분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 미리 냉각된 PBS로 세포를 2회 세척하고, 500 g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하며, 상층액을 제거하였다. 마지막으로, 200 μL/웰의 미리 냉각된 PBS로 세포를 재현탁시키고, BD FACS CANTOII를 사용하여 형광 발광 신호값을 판독하였다.
도 5의 (A)에 도시된 바와 같이, 인간 T세포의 인간 CD3에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체 PR003178의 결합은 양성 대조2보다 강하였다. 구체적인 표현은, 동일한 항체 농도 하에서, PR003178 결합의 형광값은 양성 대조2 결합의 형광값보다 높았다. 동시에 도 5의 (B)에 도시된 바와 같이, 항체 PR003178은 사이노몰구스 원숭이 T세포의 사이노몰구스 원숭이 CD3과 교차 결합할 수 있지만, 양성 대조2는 사이노몰구스 원숭이 CD3과 교차 결합하는 능력이 없다.
실시예9. BCMA 고발현 세포계 NCI-H929에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 체외 사멸 실험 및 사이토카인의 방출
체외에서 BCMAХCD3 이중 특이성 항체에 의해 매개되는 표적 세포 사멸 능력을 연구하기 위하여, 인간 PBMC를 이펙터 세포로 사용하고, BCMA를 고도로 발현하는 세포계 NCI-H929를 표적 세포로 사용하여 체외 사멸 실험 및 사이토카인 방출을 검출하였다. 구체적으로, RPMI1640/5% FBS 배지로 PBMC의 밀도를 1.1×10 6세포/mL로 조정하고, NCI-H929의 밀도를 0.11×10 6세포/mL로 조정하며, 두 가지 세포 현탁액 각각을 90 μL의 세포/웰로 96웰 U형 바닥 플레이트(Corning, Cat#: 3799)에 접종한 후, 20 μL/웰을 넣고, 최종 농도의 4배 농도 구배로 희석된 시험할 항체에 10배를 넣으며, 여기서 항체의 최고 최종 농도는 30 nM이고, 각 항체는 총 10개의 농도이며, 최종 효과 표적 비율은 10:1이고, 두 개의 중복을 설치하였다. 동시에, 플레이트에 ER(0): NCI-H929 + PBMC + RPMI1640/5% FBS 배지; ESR: PBMC + RPMI1640/5% FBS 배지; TSR: NCI-H929 + RPMI1640/5% FBS 배지; CMB: RPMI1640/5% FBS 배지만; TMR: NCI-H929 + RPMI1640/5% FBS 배지 + 용해 완충액(24시간 동안 배양한 후 넣음); VCC: RPMI1640/5% FBS 배지 + 용해 완충액(24시간 동안 배양한 후 넣음)과 같은 상이한 대조군을 설정하였다. 96웰 플레이트를 37℃ 이산화탄소 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 50 μL의 상층액을 취하고, 96웰 플레이트(Corning, Cat#: 3599)에 넣으며, 50 μL의 세포 독성 검출 시약(CytoTox　96® 비방사성 세포 독성 검출 키트, Promega, USA, cat# G1780)을 넣고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하며, 정지 용액을 넣어 반응을 정지시키고 Enspire(Perkin Elmer)로 OD490값을 판독하였다. OD490 판독값은 이하 공식에 따라 사멸 효과를 계산하고, 특이성 사멸% = {(ER-CMB)-[(ESR-CMB)+(TSR-CMB)]}/(TMR-VCC)*100%이다. 세포 배양 상층액을 수집하여 사이토카인IL-6 및 TNF-α의 방출을 검출하는데 사용하였다. ELISA 검출 방법은 IL-6(IL-6 Human Uncoated ELISA Kit, Thermo, Cat#: 88-7066-88) 및 TNF-α (TNF alpha Human Uncoated ELISA Kit, Thermo, Cat#:88-7346-88) 키트 작업 지침을 참조하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, BCMA를 고도로 발현하는 세포계 NCI-H929에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체 PR003178에 의해 매개되는 PBMC의 사멸은 양성 대조2(A)보다 우수하였다. 구체적으로, 고농도에서 PR003178에 의해 달성된 사멸 백분율은 양성 대조2보다 높고 PR003178 사멸 곡선의 EC50은 양성 대조2보다 약 10배(D) 작은 것으로 나타났다. 동시에, PR003178의 사멸 시스템에서 생성된 사이토카인IL-6 및 TNF-α의 방출은 모두 양성 대조2(B, C, E)보다 높았다.
실시예10. BCMA 저발현 세포계 RPMI8226에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 체외 사멸 실험 및 사이토카인의 방출
체외에서 BCMAХCD3 이중 특이성 항체에 의해 매개되는 표적 세포 사멸 능력을 연구하기 위하여, 인간 PBMC를 이펙터 세포로 사용하고, BCMA를 저발현하는 세포계 RPMI8226(중국과학원 CAS 세포 은행)을 표적 세포로 사용하여 체외 사멸 실험 및 사이토카인 방출을 검출하였다. 구체적으로, RPMI1640/5% FBS 배지로 PBMC의 밀도를 1.1×10 6세포/mL로 조정하고, RPMI8226의 밀도를 0.11×10 6세포/mL로 조정하며, 두 가지 세포 현탁액 각각을 90 μL의 세포/웰로 96웰 U형 바닥 플레이트(Corning, Cat#: 3799)에 접종한 후, 20 μL/웰을 넣고, 최종 농도의 4배 농도 구배로 희석된 시험할 항체에 10배를 넣으며, 여기서 항체의 최고 최종 농도는 30 nM이고, 각 항체는 총 10개의 농도이며, 최종 효과 표적 비율은 10:1이고, 두 개의 중복을 설치하였다. 동시에, 플레이트에 ER(0): RPMI8226 + PBMC + RPMI1640/5% FBS 배지; ESR: PBMC + RPMI1640/5% FBS 배지; TSR: RPMI8226 + RPMI1640/5% FBS 배지; CMB: RPMI1640/5% FBS 배지만; TMR: RPMI8226 + RPMI1640/5% FBS 배지 + 용해 완충액(24시간 동안 배양한 후 넣음); VCC: RPMI1640/5% FBS 배지 + 용해 완충액(24시간 동안 배양한 후 넣음)과 같은 상이한 대조군을 설정하였다. 96웰 플레이트를 37 ℃ 이산화탄소 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 50 μL의 상층액을 취하고, 96웰 플레이트(Corning, Cat#: 3599)에 넣으며, 50 μL의 세포 독성 검출 시약(CytoTox　96® 비방사성 세포 독성 검출 키트, Promega, USA, Cat#: G1780)을 넣고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하며, 정지 용액을 넣어 반응을 정지시키고 Enspire(Perkin Elmer)로 OD490값을 판독하였다. OD490 판독값은 이하 공식에 따라 사멸 효과를 계산하고, 특이성 사멸 % = {(ER-CMB)-[(ESR-CMB)+(TSR-CMB)]}/(TMR-VCC)*100%이다. 세포 배양 상층액을 수집하여 사이토카인IL-6 및 TNF-α의 방출을 검출하는데 사용하였다. ELISA 검출 방법은 IL-6(IL-6 Human Uncoated ELISA Kit, Thermo, Cat#: 88-7066-88) 및 TNF-α (TNF alpha Human Uncoated ELISA Kit, Thermo, Cat#: 88-7346-88) 키트 작업 지침을 참조하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, BCMA를 저발현하는 세포계에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체 PR003178에 의해 매개되는 PBMC의 사멸은 양성 대조2(A)보다 우수하였다. 구체적으로, 고농도에서 PR003178에 의해 달성된 표적 세포의 사멸 백분율은 양성 대조2(D)보다 높은 것으로 나타났다. 동시에, PR003178의 사멸 시스템에서 생성된 사이토카인IL-6 및 TNF-α의 방출은 모두 양성 대조2(B, C, E)보다 높았다.
실시예11. BCMA를 발현하지 않는 세포계 HL-60에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 결합
BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 체외 결합의 특이성을 연구하기 위하여, 인간 BCMA를 발현하지 않는 세포계 HL-60(ATCC®　CCL-240??)를 사용하여 세포 수준의 항체 결합 실험을 수행하였다. 간단히 말해서, HL-60 세포 현탁액을 수집하였다. 세포 밀도를 각각 1×10 6세포/mL로 조정하였다. 100 μL의 세포/웰로 96웰 V형 바닥 플레이트(Corning, Cat#: 3894)에 접종한 후, 100 μL/웰을 넣고, 최종 농도의 3배 농도 구배로 희석된 시험할 항체에 2배를 넣었다, 항체의 최고 최종 농도는 300 nM이고, 각 항체는 4개의 농도이다. 세포를 4℃에 놓고, 빛을 피하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 100 μL/웰의 미리 냉각된 PBS를 넣어 세포를 2회 세척하고, 500 g, 4 ℃에서 5분 동안 원심분리하며, 상층액을 제거하였다. 100 μL/웰 형광 2차 항체(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, Cat#: 109-545-06, 1: 500 희석)를 더 넣고, 4℃에서, 빛을 피하여 30분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL/웰의 미리 냉각된 PBS로 세포를 2회 세척하고, 500 g, 4℃에서 5분 동안 원심분리하며, 상층액을 제거하였다. 마지막으로, 200 μL/웰의 미리 냉각된 PBS로 세포를 재현탁시키고, BD FACS CANTOII를 사용하여 형광 발광 신호값을 판독하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, 300 nM, 100 nM, 33.3 nM 및 11.1 nM에서, BCMAХCD3 이중 특이성 항체 PR003178과 양성 대조2는 모두 BCMA 음성 세포계 HL-60에 비특이적으로 결합할 수 없다.
실시예12. FACS 방법으로 BCMA 음성 세포계 HL60에 대한 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 비특이적 사멸 및 사이토카인의 방출을 검출
체외에서 BCMAХCD3 이중 특이성 항체에 의해 매개되는 표적 세포의 사멸 능력의 특이성을 연구하기 위하여, 인간 PBMC를 이펙터 세포로 사용하고, BCMA를 발현하지 않는 세포계 HL-60을 표적 세포로 사용하여 체외 사멸 실험 및 사이토카인 방출을 검출하였다. 구체적으로, 표적 세포 HL-60을 0.5 μM의 CFSE 염료로 표지하였다. RPMI1640/5% FBS 배지로 3개의 기증자의 PBMC의 밀도를 1.1×10 6세포/mL로 조정하고, CFSE 표지된 HL-60 세포의 밀도를 0.11×10 6세포/mL로 조정하며, 두 가지 세포 현탁액 각각을 90 μL의 세포/웰로 96웰 U형 바닥 플레이트(Corning, Cat#: 3799)에 접종한 후, 20 μL/웰을 넣고, 10배를 최종 농도의 시험할 항체에 넣으며, 여기서 항체의 최종 농도는 100 nM, 30 nM, 10 nM 및 3 nM 총 4개의 농도이고, 최종 효과 표적 비율은 10:1이며, 두 개의 중복을 설치하였다. 96웰 플레이트를 37 ℃ 이산화탄소 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 종료된 후, 세포 배양 상층액을 수집하여 사이토카인IL-6 및 TNF-α의 방출을 검출하는데 사용하였다. ELISA 검출 방법은 IL-6(IL-6 Human Uncoated ELISA Kit, Thermo, Cat#: 88-7066-88) 및 TNF-α (TNF alpha Human Uncoated ELISA Kit, Thermo, Cat#: 88-7346-88) 키트 작업 지침을 사용하였다. 배양된 세포를 96웰 V형 바닥 플레이트(Corning, Cat#: 3894)에 옮기고, 100 μL/웰의 7-AAD(BD, Cat#: 559925, 1:100) 염색 시스템으로 염색하며, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 100 μL/웰의 PBS를 넣어 반응을 정지시켰다. BD FACS CANTOII를 사용하여 검출하였다. 이하 공식에 따라 사멸 효과를 계산하고, 특이성 사멸 % = 7-AAD+ CFSE+ 백분율/ (7-AAD+ CFSE+백분율 + 7-AAD- CFSE+백분율) * 100%이다.
도 9의 A-E에 도시된 바와 같이, 100 nM, 30 nM, 10 nM 및 3 nM에서, BCMAХCD3 이중 특이성 항체 PR003178 및 양성 대조2가 매개할 수 없는 2개의 기증자 PBMC는 BCMA 음성 세포계 HL-60에 대하여 비특이적 사멸을 발생하고(도 9의 A, D), 상기 시스템에서 비특이적 사이토카인IL-6(도 9의 B, E) 및 TNF-α(도 9의 C, F)의 방출은 또한 검출되지 않았다.
실시예13. NCI-H929/인간 PBMC 마우스 모델에서 BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 항종양 약효 평가
BCMAХCD3 이중 특이성 항체의 체내 항종양 약효를 평가하기 위하여, 6-8주령 암컷 NCG 마우스를 사용하고, 종양 세포 접종 3일 전에, 모든 마우스에 (i.p.)3×106 인간 PBMC를 복강 주사한 후, 종양 세포 접종일에 각 실험 마우스에 5×106 NCI-H929 세포를 피하 접종하며, 세포를 PBS와 Matrigel(1:1) 혼합액(0.1 mL/마리)에 재현탁시켰다. 종양 부피가 90 mm3에 도달할 경우 마우스를 무작위로 그룹화하고, 각 군에 6마리의 마우스이다. 그룹화 후 특정 농도의 PBS로 희석한 약물을 주 1회 정맥 주사(i.v.), 총 2회 투여(QW*2)하는 방식으로 투여하고, PBS를 블랭크 대조군으로 사용하였다. 초기 투여 후 제3일, 7일, 10일 및 14일에 종양 부피 및 마우스 체중을 측정하였다. 종양 크기 계산 공식은 종양 부피(mm3)= 0.5Х(종양 장경Х종양 단경2)이다.
도 10의 (A)에 도시된 바와 같이, BCMAХCD3 이중 특이성 항체 PR003178은 10마이크로그램/마우스 및 3마이크로그램/마우스에서 모두 종양 성장을 억제하는 약효를 갖고, 10 마이크로그램/마우스군의 약효는 3 마이크로그램/마우스군의 약효보다 우사하였다. 동시에, 10마이크로그램/마우스의 투여량 하에서 PR003178의 약효는 동일한 투여량의 양성 대조2보다 우수하였다. 도 10의 (B)에 도시된 바와 같이, 피시험 각 군의 마우스 체중 변화는 모두 정상 범위에 있었다.
실시예14. BIACORE로 PR003178과 인간 CD3e/g 재조합 단백질, 사이노몰구스 원숭이 CD3e/g 재조합 단백질 및 인간 BCMA 재조합 단백질, 사이노몰구스 원숭이 BCMA 재조합 단백질의 친화력을 검출
전체 테스트는 HBS-EP +(10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.05% P20, pH7.4, GE Healthcare, Cat#BR-1006-69)를 실행 완충액으로 사용하고, 시리즈 S CM5(GE Healthcare, Cat#BR-1005-30)를 실험 칩이다. 인간 BCMA-Fc, Avitag 재조합 단백질(ACRO, Cat.BC7-H82F0), 사이노몰구스 원숭이 BCMA-Fc, Avitag(ACRO, Cat.BCA-C82F4)는 ACRO에서 구입하고, 인간 CD3e/g ECD-hFc 재조합 단백질(Lot.20190508002), 사이노몰구스 원숭이 CD3e/g ECD-hFc 재조합 단백질 및 인간 (Lot.2018040001)은 루이즈 캐미컬(ChemPartner)에서 구입하였다.
14.1 항원의 접합
유속을 10 μL/min으로 설정하고, 두 개의 CM5의 4개 채널에서 4가지 항원을 접합하였다. 1)주입 시간을 300s로 설정하고, 50mM NHS 및 200mM EDC를 1: 1 부피비로 신선하게 혼합한 후 4개의 채널에 주입하며; 2)pH4.5의 아세트산나트륨(Cat#BR-1003-50)으로 인간 BCMA-Fc,Avitag 재조합 단백질, 사이노몰구스 원숭이 BCMA-Fc,Avitag, 인간 CD3e/g ECD-hFc 재조합 단백질, 사이노몰구스 원숭이 CD3e/g ECD-hFc 재조합 단백질을 모두 1ug/mL로 희석하고, 각각 칩1의 2, 3, 4 및 칩2의 2채널에 주입하며; 3)1M pH8.5 에탄올아민을 300s 동안 주입하여 칩 표면에 남아 있는 활성 카르복실기를 차단하였다. 차단 후 계속하여 1ХHBS-EP+완충액으로 기기를 두 시간 동안 평형시키고, 인간 BCMA-Fc,Avitag 재조합 단백질, 사이노몰구스 원숭이 BCMA-Fc,Avitag, 인간 CD3e/g ECD-hFc 재조합 단백질 및 사이노몰구스 원숭이 CD3e/g ECD-hFc 재조합 단백질의 최종 결합량은 각각 120RU, 70RU, 200RU 및 290RU였다.
14.2 친화력 측정
다중 사이클 동력학 모드를 설정하고, 각 사이클은 PR003178의 결합 및 칩의 재생을 포함한다. PR003178을 2배 구배로 희석하고 네 개의 채널에 주입하며, 유속은 30 μL/min이고, 결합 시간을 180s로 설정하며, 해리 시간을 400s 또는 600s로 설정하였다. 마지막으로 동일한 유속으로 10mM의 글리신-염산 pH1.5(GE Life Sciences, Cat# BR-1003-54)를 60s 동안 주입하여 칩을 재생하였다.
Biacore T200 분석 소프트웨어로 실험 결과를 분석하였고, 1채널은 참조 채널로 차감하였으며, 분석 모델은 1: 1 동력학 피팅 모델을 사용하였다.
도 11의 (B), (D)에 도시된 바와 같이, BCMAХCD3 이중 특이성 항체 PR003178과 인간 BCMA는 높은 친화력 결합을 갖고, 인간 BCMA-Fc와의 친화력은 약 9.493E-11 M이며, 인간과 사이노몰구스 원숭이 BCMA에 교차 결합하는 우수한 활성을 갖는다. 도 11의 (A), (C)에 도시된 바와 같이, BCMAХCD3 이중 특이성 항체 PR003178과 인간 CD3 e/g ECD-hFc의 친화력은 약 2.541E-08 M이고, 인간과 사이노몰구스 원숭이 CD3 e/g ECD-hFc에 교차 결합하는 우수한 활성을 갖는다. 도 11의 (E)는 BCMAХCD3 이중 특이성 항체 PR003178이 BCMA 및 CD3 e/g ECD-hFc와의 친화력 측정의 구체적인 데이터로서, Ka(1/Ms), Kd(1/s), KD를 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Harbour BioMed (Suzhou) Co., Ltd. <120> ANTIBODY TARGETING BCMA, BISPECIFIC ANTIBODY, AND USE THEREOF <130> P21419394KR <140> PCT/CN2020/118780 <141> 2020-09-29 <150> CN 201910941311.0 <151> 2019-09-30 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC of antibody PR001046, Chothia definition <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asp Asn 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Phe Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Arg Asn Tyr Asp Asp Thr Arg Gly Thr Asp Val Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp 115 120 125 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 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antibody PR002199, Kabat definition <400> 12 Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 HCDR1 of antibody PR002299 or PR003178, Kabat definition <400> 13 Thr Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 HCDR1 of antibody PR002299, Kabat definition <400> 14 Ser Tyr Ala Met Ile 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of antibody PR000274, Chothia definition <400> 15 Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of antibody PR001046 or VH2 HCDR1 of PR003178, Chothia definition <400> 16 Gly Phe Thr Val Ser Asp Asn 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 HCDR1 of antibody PR002199, Chothia definition <400> 17 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 HCDR1 of antibody PR002199, Chothia definition <400> 18 Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 HCDR1 of antibody PR002299 or antibody PR003178, Chothia definition <400> 19 Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 HCDR1 of antibody PR002299, Chothia definition <400> 20 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of antibody PR000274, Combined definition <400> 21 Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of antibody PR001046 or VH2 HCDR1 of antibody PR003178, Combined definition <400> 22 Gly Phe Thr Val Ser Asp Asn Tyr Met Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 HCDR1 of antibody PR002199, Combined definition <400> 23 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 HCDR1 of antibody PR002199, Combined definition <400> 24 Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 HCDR1 of antibody PR002299 or PR003178, Combined definition <400> 25 Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 HCDR1 of antibody PR002299, Combined definition <400> 26 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ile 1 5 10 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of antibody PR001046 or VH2 HCDR2 of PR003178, Chothia definition <400> 27 Phe Ser Gly Gly Asn 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of antibody PR000274, Chothia definition <400> 28 Tyr Arg Gly His Ser Asp 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 HCDR2 of antibody PR002199, Chothia definition <400> 29 Ser Trp Asn Ser Gly Ser 1 5 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 HCDR2 of antibody PR002199, Chothia definition <400> 30 Arg Gly Ser Asp Gly Ser 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 HCDR2 of antibody PR002299, Chothia definition <400> 31 Ser Glu Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 HCDR2 of antibody PR002299 or PR003178, Chothia definition <400> 32 Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala 1 5 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of antibody PR001046 or VH2 HCDR2 of antibody PR003178, Combined or Kabat definition <400> 33 Val Ile Phe Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of antibody PR000274, Combined or Kabat definition <400> 34 Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 HCDR2 of antibody PR002199, Combined or Kabat definition <400> 35 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 HCDR2 of antibody PR002199, Combined or Kabat definition <400> 36 Gly Ile Arg Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 HCDR2 of antibody PR002299, Combined or Kabat definition <400> 37 Gly Ile Ser Glu Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 38 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 HCDR2 of antibody PR002299 or PR003178, Combined or Kabat definition <400> 38 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Asp <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 HCDR3 of antibody PR002199, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 39 Gln Gly Glu Asn Asp Gly Pro Phe Asp His 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of antibody PR000274, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 40 Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn 1 5 10 <210> 41 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 HCDR3 of antibody PR002299, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 41 Asp Leu Asp Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Lys Asp Tyr 1 5 10 <210> 42 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of antibody PR001046 or VH2 HCDR3 of antibody PR003178 , Chothia, Combined or Kabat definition <400> 42 Arg Asn Tyr Asp Asp Thr Arg Gly Thr Asp Val Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 HCDR3 of antibody PR002199, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 43 Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala Tyr 1 5 10 <210> 44 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 HCDR3 of antibody PR002299 or antibody PR003178, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 44 His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC of antibody PR000274, Chothia definition <400> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 46 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC of antibody PR002199, Chothia definition <400> 46 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 47 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC of antibody PR002299 or PR003178, Chothia definition <400> 47 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105 110 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 115 120 125 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 130 135 140 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 145 150 155 160 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 165 170 175 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 180 185 190 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 195 200 205 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL LCDR1 of antibody PR000274, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 48 Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL LCDR1 of antibody PR002199, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 49 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL LCDR1 of antibody PR002299 or antibody PR003178, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 50 Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL LCDR2 of antibody PR000274, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 51 Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL LCDR2 of antibody PR002199, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 52 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL LCDR2 of antibody PR002299, or VL LCDR2 of PR003178, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 53 Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL LCDR3 of antibody PR000274, Chothia definitionVL LCDR3 of PR000274, Combined definitionVL LCDR3 of PR000274, Kabat definition <400> 54 Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL LCDR3 of antibody PR002199, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 55 Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp Thr 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL LCDR3 of antibody PR002299 or antibody PR003178, Chothia, Combined or Kabat definition <400> 56 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val 1 5 <210> 57 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 of antibody PR002199, Chothia definition <400> 57 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Arg Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Gly Glu Asn Asp Gly Pro Phe Asp His Arg Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 58 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of antibody PR000274, Chothia definition <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 59 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 of antibody PR001046 or PR003178, Chothia definition <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asp Asn 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Phe Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Arg Asn Tyr Asp Asp Thr Arg Gly Thr Asp Val Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 60 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 of antibody PR002299, Chothia definition <400> 60 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Glu Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Lys Asp Leu Asp Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Lys Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 61 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 of antibody PR002199, Chothia definition <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 of antibody PR002299, Chothia definition <400> 62 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 63 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 of antibody PR003178, Chothia definition <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 64 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of antibody PR000274, Chothia definition <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 65 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of antibody PR002199, Chothia definition <400> 65 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 66 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of antibody PR002299 or antibody PR003178, Chothia definition <400> 66 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105

Claims (15)

  1. 두 개의 중쇄 가변 영역을 포함하는 BCMA를 표적으로 하는 항체로서,
    상기 중쇄 가변 영역이 각각 서열번호 22, 서열번호 33 및 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하거나, 각각 서열번호 26, 서열번호 37 및 서열번호 41의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는, BCMA를 표적으로 하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 59로 표시되거나, 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 60으로 표시되는, BCMA를 표적으로 하는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    BCMA를 표적으로 하는 상기 항체가 Fc 단편을 추가로 포함하고; 바람직하게는, 상기 Fc 단편이 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4의 Fc 단편 또는 이의 돌연변이인, BCMA를 표적으로 하는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    BCMA를 표적으로 하는 상기 항체의 중쇄의 아미노산 서열이 서열번호 1 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는, BCMA를 표적으로 하는 항체.
  5. BCMA를 표적으로 하는 제1 단백질 기능 영역 및 CD3을 표적으로 하는 제2 단백질 기능 영역을 포함하는 이중 특이성 항체로서,
    상기 제1 단백질 기능 영역이 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체의 두 개의 중쇄 가변 영역을 포함하고; 바람직하게는, 두 개의 상기 중쇄 가변 영역이 (G4S)n으로 연결되고, 상기 n이 0이 아닌 자연수이고, 바람직하게는 1 내지 20이고, 보다 바람직하게는 3 또는 4인, 이중 특이성 항체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제2 단백질 기능 영역이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 아미노산 서열이 각각 서열번호 25, 서열번호 38 및 서열번호 44로 표시되고/거나, 상기 경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 아미노산 서열이 각각 서열번호 50, 서열번호 53 및 서열번호 56으로 표시되는, 이중 특이성 항체.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제2 단백질 기능 영역의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 63 또는 서열번호 62로 표시되거나 이의 돌연변이이고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 66으로 표시되거나 이의 돌연변이이고, 상기 돌연변이가 상기 제2 단백질 기능 영역과 CD3의 결합 능력을 유지하거나 개선하는, 이중 특이성 항체.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이중 특이성 항체가 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역, 바람직하게는 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 상기 인간 경쇄 불변 영역이 바람직하게는 인간 λ 또는 κ 경쇄 불변 영역이고, 상기 인간 중쇄 불변 영역이 바람직하게는 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4의 중쇄 불변 영역 또는 이의 돌연변이인, 이중 특이성 항체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 인간 중쇄 불변 영역의 돌연변이가
    (1) L234A/L235A 돌연변이;
    (2) 놉(knob) 돌연변이 T366W 및 홀(hole) 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V; 및
    (3) 놉 돌연변이 S354C 및 홀 돌연변이 Y349C
    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 제1 단백질 기능 영역이 서열번호 8 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄를 포함하고, 상기 제2 단백질 기능 영역이 서열번호 5 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 및 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄를 포함하는, 이중 특이성 항체.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항체를 코딩하는 분리된 핵산.
  11. 제10항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로서,
    바람직하게는, 원핵 세포 또는 진핵 세포인 숙주 세포.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항체, 및 세포 독성제를 포함하는 항체 약물 접합체.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체, 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항체 또는 상기 이중 특이성 항체를 포함하는 제13항에 따른 항체 약물 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물.
  15. 암을 치료 및/또는 예방하는 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 BCMA를 표적으로 하는 항체, 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항체, 제13항에 따른 항체 약물 접합체 또는 제14항에 따른 약물 조성물의 용도.
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