CN116813786A - 抗cd73抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了抗CD73抗体及其应用。所提供的抗体能够特异性结合CD73。所提供的抗体表现出与抗原的高亲和力、特异性，具有肿瘤杀伤的效果，能够应用于***。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗CD73抗体及其应用。
背景技术
CD73，也称为胞外-5'-核苷酸酶(ecto-5'NT，EC 3.1.3.5)，蛋白分子量约为70kDa，是一种葡糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞表面的酶。CD73存在于大部分组织中，尤其是在内皮细胞及造血细胞亚组中(Resta等人，Immunol Rev 1998；161:95-109及Colgan等人，Prinergic Signal 2006；2:351-60)。CD73上游的CD39可以催化ATP产生单磷酸腺苷(AMP)，所产生的的AMP被CD73催化水解为腺苷。腺苷是经广泛研究的由若干受体(包括A1、A2A、A2B及A3)介导其生物效应的信号传导分子。在肿瘤微环境中，腺苷不仅可以增强肿瘤的增殖、血管生成和转移(Zhang等人，Cancer Res 2010；70:6407-11)，而且可以显著抑制抗肿瘤免疫反应(F.Ghiringhelli etal.,Biomed.Res,Int.2012)。因此CD73被看作是一个强有力的癌症治疗靶点。
CD73在许多不同癌症上表达，包括结直肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、白血病、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、食道癌、***癌及乳腺癌(Jin等人，Cancer Res 2010；70:2245-55及Stagg等人，PNAS2010；107:1547-52)。CD73还影响肿瘤发生的多个方面，如增殖、分化、粘附/迁移、血管生成和转移。它通过调节细胞周期、凋亡和信号通路如EGFR、β-catenin/cyclin D1、VEGF和AKT/ERK来促进肿瘤细胞的增殖(Zhi Xetal.,Clin Exp Metastasis 2007,24(6):439-448；Turcotte M etal.,Cancer Res2015,75(21):4494-4503；Wu R etal.,Oncol Rep2016,35(3):1750-1756；Gao ZW etal.,BMCcancer2017,17(1):135)。而且CD73高表达作为一种生物标志物，与多种类型肿瘤的不良预后密切相关，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌、头颈癌等。除了癌细胞，多种免疫细胞例如B细胞、T细胞、Th细胞和CD8+T细胞等也表达CD73分子(Ghasem G etal.,2019,23:2,127-142)。鉴于CD73在肿瘤生长和转移中的关键作用，它已经成为肿瘤免疫疗法领域的热门靶点之一，已经有多家公司处于临床2期或者临床1期研究，还未有针对该靶点的药物获批上市。
发明内容
本发明提供了抗CD73抗体及其在疾病治疗中的用途。所提供的抗体能够特异性结合CD73，显示出抗肿瘤效果。
本发明的第一方面提供了一种抗CD73的抗体或抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区：包含SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ IDNO:4、5和6所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列，或者与SEQ IDNO:7、8和9所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ IDNO:10、11和12所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；所述轻链可变区：包含SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ IDNO:22、23和25所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列。
本发明的第二方面提供了一种抗CD73的抗体或抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1选自SEQ ID NO:1或4或7或10或13或16或19所示的序列，HCDR2选自SEQ ID NO:2或5或8或11或14或17或20所示的序列，HCDR3选自SEQ IDNO:3或6或9或12或15或18或21所示的序列，LCDR1选自SEQ ID NO:22或26或29或33或36所示的序列，LCDR2选自SEQ ID NO:23或27或30或34或37所示的序列，LCDR3选自SEQ ID NO:24或25或28或31或32或35或38所示的序列。
本发明的第三方面提供了一种抗CD73的抗体或抗原结合片段，包括：如SEQ IDNO:39或40或41或42或43或44或45所示重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及如SEQID NO:46或47或48或49或50或51或52所示轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
本发明的第四方面提供了一种双特异性抗体，包括第一抗原结合部分和第二抗原结合部分；第一抗原结合部分特异性结合第一表位，第一抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ IDNO:4、5和6所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列，或者与SEQ IDNO:7、8和9所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ IDNO:10、11和12所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ IDNO:22、23和25所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
所述第二抗原结合部分特异性结合第二表位，所述第二抗原结合部分和所述第一抗原结合部分融合。
本发明的第五方面提供了一种双特异性抗体，包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分；所述第一抗原结合部分特异性结合第一表位，所述第一抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中HCDR1选自SEQ ID NO:1或4或7或10或13或16或19所示的序列，HCDR2选自SEQ ID NO:2或5或8或11或14或17或20所示的序列，HCDR3选自SEQ ID NO:3或6或9或12或15或18或21所示的序列，LCDR1选自SEQ ID NO:22或26或29或33或36所示的序列，LCDR2选自SEQ ID NO:23或27或30或34或37所示的序列，LCDR3选自SEQID NO:24或25或28或31或32或35或38所示的序列；所述第二抗原结合部分特异性结合第二表位，所述第二抗原结合部分和所述第一抗原结合部分融合。
本发明的第六方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述第一方面至第三方面任一所述的抗体或抗原结合片段，或者编码第四方面至第五方面任一所述的双特异性抗体。
本发明的第七方面提供了一种构建体，包含上述第六方面所述的多核苷酸。
本发明的第八方面提供了一种宿主细胞，含有上述第六方面所述的多核苷酸或者第七方面所述的构建体。
本发明的第九方面提供了一种药物组合物，包括：上述第一方面至第三方面任一所述的抗体或抗原结合片段、或第四方面至第五方面所述的双特异性抗体；以及药学上可接受的载体。
本发明的第十方面提供了一种抗体偶联物，包括上述第一方面至第三方面任一所述的抗体或抗原结合片段、或第四方面至第五方面所述的双特异性抗体；以及与所述抗体或抗原结合片段或者与所述双特异性抗体连接的功能小分子。
本发明的第十一方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面至第三方面任一所述的抗体或抗原结合片段，或者与上述第四方面至第五方面任一实施例所述的双特异性抗体。
本发明的第十二方面提供了一种生产上述抗体或抗原结合片段的方法或生产上述双特异性抗体，包括：培养第八方面所述的宿主细胞，以及从培养物中收集所述的抗体或抗原结合片段或者所述的双特异性抗体。
本发明的第十三方面提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括：给予有需要的受试者有效量的上述第一方面至第三方面任一所述的抗体或抗原结合片段，或者上述第四方面至第五方面任一所述的双特异性抗体，或者第九方面所述的药物组合物，或者第十方面所述的抗体偶联物。
本发明的第十四方面提供了一种上述第一方面至第三方面任一所述的抗体或抗原结合片段，或者上述第四方面至第五方面任一所述的双特异性抗体在制备药物或者试剂盒或者在制备抗体偶联物中的用途。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的一种双特异性抗体的结构示意图。
图2是根据本发明的实施例提供的一种双特异性抗体的结构示意图。
图3是根据本发明的实施例提供的一种双特异性抗体的结构示意图。
图4是根据本发明的实施例提供的一种双特异性抗体的结构示意图。
图5是根据本发明的实施例提供的一种双特异性抗体的结构示意图。
图6是根据本发明的实施例提供的不同抗CD73抗体的内吞结果图。
图7是根据本发明的实施例提供的不同抗CD73抗体联合抗PD-L1抗体的抗肿瘤效果图。
图8是根据本发明的实施例提供的不同双特异性抗体的酶活阻断结果。
具体实施方式
下面结合具体示例对于本发明的技术方案进行详细说明。同时，为了方便本领域技术人员理解，对于本发明的一些术语进行解释和说明，需要说明的是，这些解释和说明仅用来方便本领域技术人员的理解，而不应看作是本发明保护范围的限制。
如本说明书和权利要求书中所使用的，“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。
本文中，术语“抗体”作最广泛意义使用，指包含抗原结合位点或者抗原结合片段或者抗原结合部分的蛋白质或者多肽，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于完整抗体形式或者抗体的抗原结合片段。根据具体实施方式，所提到的抗体为单克隆抗体。
本文中，术语“双特异性抗体”即包含与至少两种不同生物分子的不同表位特异性结合的抗原结合部分，也包括与相同生物分子的至少两个表位特异性结合的抗原结合部分。为了区分，将双特异性抗体与相同抗原或者不同抗原的不同表位结合的部分，分别描述为“第一抗原结合部分”和“第二抗原结合部分”等。第一抗原结合部分和第二抗原结合部分并不指示重要性，也不指示与抗原结合的先后顺序，仅用于区分与抗原的不同表位或者用于区分与不同抗原结合。下文对于“第一抗原结合部分”和“第二抗原结合部分”也会有解释和说明。除非另外说明，否则所列出的双特异性抗体中与抗原的结合顺序是任意的。当然，双特异性抗体在与不同生物分子特异性结合时，有可能和该特定生物分子的不止一个抗原表位结合。根据本发明的优选实施方式，双特异性抗体包含与两种不同靶抗原的不同表位特异性结合的抗原结合部分。
本文中，“完整抗体”或“完全抗体”等均用来表示相同的含义，指示包含二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两条轻链(L)的蛋白。每条重链由重链可变区(缩写为VH)和重链恒定区(缩写为CH)组成。重链恒定区包括重链恒定结构域CH1、重链恒定结构域CH2和重链恒定结构域CH3。每条轻链由轻链可变区(缩写为VL)和轻链恒定结构域CL组成。VH和VL区可以进一步划分为互补决定区(也称为超变区或者高变区，缩写为CDR)，互补决定区由保守的框架区(FR)隔开。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基端(N端)到羧基端(C端)按照如下序列排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链可变区的CDR从氨基端开始分别被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区的CDR从氨基端开始分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
“抗原结合片段”，或者“抗原结合部分”(如第一抗原结合部分、第二抗原结合部分)或者“抗原结合位点”是指包含全长抗体的一部分，这部分表现出与抗原结合的性质或者功能。术语“可变区”或“可变域”是指涉及抗原与抗体重链或轻链结合的域。如上文提到的，完整抗体的重链和轻链的超变区或者高变区表现出与抗原的特异性结合。抗原结合片段或者抗原结合部分的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、双特异性Fab’和Fv片段(可变区)、线性抗体、单链抗体、单域抗体等。完整抗体经木瓜蛋白酶消化产生两个完全相同的抗原结合片段，称为Fab片段，其各自含有重链和轻链可变区以及轻链恒定结构域和重链恒定结构域CH1。Fab’片段在重链恒定结构域CH1的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。完整抗体经胃蛋白酶消化获得F(ab’)2片段。F(ab’)2片段具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合F(ab)部分，F(ab’)2片段为双价抗体。单链抗体由抗体重链可变区和轻链可变区通过一个约10-25个氨基酸组成的柔性短肽连接而成的融合蛋白。单域抗体是由单个单体的可变区组成的抗体片段。由于单域抗体通常来源于骆驼科动物抗体或鲨鱼科动物抗体重链的可变区，因此也常称为纳米抗体。纳米抗体仅仅含有重链CDR区，是具有完整功能的最小的抗原结合片段。纳米抗体包括三个CDR区(CDR1-CDR3)和四个框架区FR(FR1-FR4)。框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4，分别被互补决定区CDR1、互补决定区CDR2和互补决定区CDR3隔开。抗原结合片段可以通过重组的方式获得。例如可以构建编码目的抗原结合派那段的核酸，导入到表达载体，并在合适的宿主中表达来生产抗原结合片段。
术语“和/或”用于连接两个或者多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或者可选项中的任意两项或者多项。
术语“包含”或者“包括”意指包括所提到的要素或者步骤，但是不排除其他要素或者步骤。当然，除非另有说明，包含或者包括也涵盖了由所提及的要素或者步骤组成的情形。例如，当提及包含某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
本文所提到的“亲和力”或者“结合亲和力”按照本领域的通常含义来理解，用来反映抗原和抗体或者抗原结合片段上的结合位点之间的强度和/或稳定性。
“特异性结合”或“特异性结合于”、“结合”、“特异性靶向”特定抗原或表位，或对特定抗原或表位“具有特异性”或者“能够结合”意味着与非特异性相互作用相区分，这种特异性结合可以通过本领域常用的一些方法测得。抗体与抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或者本领域技术人员熟悉的其他技术来测量。例如可以通过流式细胞仪测定对携带有抗原的细胞进行检测，通过测定细胞的阳性率指标来检测待测抗体与标记抗体的竞争结合情况。由于细胞表面的抗原空间结构更接近于体内存在的形式，所以通过该方法更能反映真实情况。结合本发明的具体实施方式，所提供的抗CD73抗体具有≤10nM,≤5nM,≤1nM,≤0.5nM,≤0.1nM,≤0.09nM,≤0.08nM,≤0.07nM,≤0.06nM，≤0.05nM,≤0.04nM,≤0.03nM,≤0.02nM,≤0.01nM的EC50值。结合本发明的具体实施方式，所提供的双特异性抗体与CD73抗原具有≤10nM,≤5nM,≤1nM,≤0.5nM,≤0.1nM,≤0.09nM,≤0.08nM,≤0.07nM,≤0.06nM，≤0.05nM,≤0.04nM,≤0.03nM,≤0.02nM,≤0.01nM的EC50值，与PD-L1抗原具有≤10nM,≤5nM,≤1nM,≤0.5nM,≤0.1nM,≤0.09nM,≤0.08nM,≤0.07nM,≤0.06nM，≤0.05nM,≤0.04nM,≤0.03nM,≤0.02nM,≤0.01nM的EC50值。除此之外，还可以通过表面等粒子共振技术(SPR)或生物薄膜干涉技术(BLI)测定抗体与抗原的结合活性。
本文中所提供的无论是抗体或抗原结合片段，还是双特异性抗体，或者是多核苷酸，通常是可分离的或者重组的。“可分离的”是指能够从表达多肽或者蛋白的细胞或者细胞培养物中鉴定并且分离和/或回收。通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体或其抗原结合片段。“重组”意味着可以使用基因重组技术在外源宿主细胞中产生抗体。
“人源化”抗体通常是指基于来源于非人物种的抗原结合部分，和基于人的免疫球蛋白分子的部分结构和序列组成的抗体。例如，人源化抗体中，除CDR之外的整个抗体由人类来源的多核苷酸编码，其保留了抗原的结合活性，同时降低了免疫原性。
本文中所示出的抗体或者双特异性抗体的CDR序列可以结合已有的数据库分析获得。所提供的抗CD73的抗体或者双特异性抗体的第一抗原结合部分的CDR序列，以及第二抗原结合部分的CDR序列是结合IMGT定义方案(Ehrenmann F.,Kaas Q.and Lefranc M.-P.Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；Ehrenmann,F.,Lefranc,M.-P.Cold SpringHarbor Protoc.,6:737-749(2011))获得的。还可以通过Kabat(例如可以参见U.S.Dept.ofHealth and Human Servies,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983))、Chothia(例如可以参见J.Mol.Biol.196:901-917(1987))等定义方案获得。本领域技术人员可知的是，由于定义方法的差异所带来的CDR的差异，也都包含在本发明的保护范围之内。
抗体或抗原结合片段
本发明提供了一种抗CD73抗体或抗原结合片段，包括如SEQ ID NO:39或40或41或42或43或44或45所示重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及如SEQ ID NO:46或47或48或49或50或51或52所示轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。所提供的抗体或抗原结合片段，其含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，这些序列可经由SEQ ID NO:39或40或41或42或43或44或45所示重链可变区结合不同定义方案获得，以及经由SEQ ID NO:46或47或48或49或50或51或52所示轻链可变区结合不同定义方案获得。需要说明的是，经由这些重链可变区和轻链可变区获得的CDR序列，其作为抗CD73抗体的一部分，例如在形成重链可变区或者轻链可变区序列时，也可以和不同来源的框架区序列形成不同的重链可变区或者轻链可变区序列。这些变化均包含在本发明的保护范围之内。
根据本发明的实施方式，本发明提供了一种抗CD73抗体或抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列,或者与SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列,或者与SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列,或者与SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列,或者与SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ IDNO:36、37和38所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列。
本文中，“保守氨基酸突变”是指氨基酸突变不会引起蛋白质或多肽构象结构的显著变化，保留其生物活性。所提到的保守氨基酸突变可以为具有相似生理生化特性的不同氨基酸之间的突变。例如经过保守氨基酸突变，所提供的抗体依然保留与CD73的特异性结合活性。根据实施方式，所提到的保守氨基酸突变可以是保守氨基酸的取代、缺失或增加。根据具体实施方式，保守氨基酸的缺失是在所列出的CDR序列的基础上，缺失一个氨基酸、两个氨基酸或三个氨基酸。根据具体实施方式，保守氨基酸的增加是在所列出的CDR序列的基础上，增加一个氨基酸、两个氨基酸或三个氨基酸。根据具体实施方式，“保守氨基酸取代”意指用具有相似生理化学特性的侧链的不同氨基酸残基置换另一氨基酸残基。例如可以在具有疏水性侧链的氨基酸残基之间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)发生保守氨基酸取代，在具有中性亲水性侧链的残基之间(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)发生保守氨基酸取代，在具有酸性侧链的残基之间(例如Asp、Glu)发生保守氨基酸取代，在具有碱性侧链的氨基酸之间(例如His、Lys和Arg)发生保守氨基酸取代，或者在具有芳香族侧链的残基之间(例如Trp、Tyr和Phe)进行保守氨基酸取代。如本领域已知，保守氨基酸取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，因此可以保留蛋白质的生物活性。所提到的保守氨基酸取代可以是1个保守氨基酸取代、2个保守氨基酸取代、3个保守氨基酸取代等。本文中所用到的氨基酸的名称以本领域通用的标准的单字母或者三字母代码表示。在一些具体实施方式中，所提供的HCDR序列与所示出的HCDR序列具有一个保守氨基酸取代。在一些具体实施方式中，所提供的HCDR序列与所示出的HCDR序列具有一个保守氨基酸缺失。在一些具体实施方式中，所提供的HCDR序列与所示出的HCDR序列具有一个保守氨基酸增加。在一些具体实施方式中，所提供的LCDR序列与所示出的LCDR序列具有一个保守氨基酸取代。在一些具体实施方式中，所提供的LCDR序列与所示出的LCDR序列具有一个保守氨基酸缺失。在一些具体实施方式中，所提供的LCDR序列与所示出的LCDR序列具有一个保守氨基酸增加。
本发明还提供了一种抗CD73抗体或抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1选自SEQ ID NO:1或4或7或10或13或16或19所示的序列，HCDR2选自SEQ ID NO:2或5或8或11或14或17或20所示的序列，HCDR3选自SEQ ID NO:3或6或9或12或15或18或21所示的序列，LCDR1选自SEQ ID NO:22或26或29或33或36所示的序列，LCDR2选自SEQ ID NO:23或27或30或34或37所示的序列，LCDR3选自SEQ ID NO:24或25或28或31或32或35或38所示的序列。
根据具体实施方式，所提供的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列。根据具体实施方式，所提供的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列。根据具体实施方式，所提供的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列。根据具体实施方式，所提供的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列。根据具体实施方式，所提供的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列。根据具体实施方式，所提供的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列，和SEQ IDNO:33、34和35所示的LCDR序列。根据具体实施方式，所提供的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列。
在一些具体实施方式中，所提供的抗体或者抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区为与SEQ ID NO:39或40或41或42或43或44或45所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，轻链可变区为与SEQ ID NO:46或47或48或49或50或51或52所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
本文中所提到的“序列同一性”、“序列同源性”、“序列相似性”是指两个多肽或蛋白质或者核苷酸序列比较，序列相同的程度。为了确定序列同一性的比值，可以按照本领域已知的多种方式实现。例如可以使用公开的软件如BLAST、ALIGN、BLAST-2等软件获得。在一些具体实施方式中，序列同一性是由于保守氨基酸突变带来的。根据具体实施方式，与上述重链可变区或者轻链可变区具有序列同一性的序列，可以是由于1个保守氨基酸突变、2个保守氨基酸突变、3个保守氨基酸突变、4个保守氨基酸突变、5个保守氨基酸突变、6个保守氨基酸突变、7个保守氨基酸突变、8个保守氨基酸突变、9个保守氨基酸突变或者10个保守氨基酸突变带来的。根据具体实施方式，与上述重链可变区或者轻链可变区具有序列同一性的序列，其不同发生在框架区上。
根据具体实施方式，所提供的抗体为mab309，其包含SEQ ID NO:39所示的重链可变区和SEQ ID NO:46所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab307，其包含SEQ ID NO:40所示的重链可变区和SEQ ID NO:47所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab144，其包含SEQ ID NO:41所示的重链可变区和SEQ ID NO:48所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab235，其包含SEQ ID NO:42所示的重链可变区和SEQ ID NO:49所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab451，其包含SEQ ID NO:43所示的重链可变区和SEQ ID NO:50所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab540，其包含SEQ ID NO:44所示的重链可变区和SEQ ID NO:51所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab449，其包含SEQ ID NO:45所示的重链可变区和SEQ ID NO:52所示的轻链可变区。所示出的抗体表现出与CD73的特异性结合，例如与哺乳动物的CD73表现出强的特异性结合活性。所提到的这些抗体的重链恒定结构域如SEQ ID NO:100所示，轻链恒定结构域序列如SEQ ID NO:101所示。
所提供的抗体或抗原结合片段也可以是经过人源化改造的。通过人源化，可以降低抗体或者抗原结合片段的免疫原性，同时保持和靶抗原的结合活性。在一些具体实施方式中，所提供的抗体或者抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中包含与SEQ IDNO:53或54或55或56或57或58或59或60或61或62或63或64或65所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区，和与SEQ ID NO:66或67或68或69或70或71或72或73或74或75或76或77或78或79所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab309hu1，其包含SEQ ID NO:53所示的重链可变区和SEQ ID NO:66所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab309hu3，其包含SEQ ID NO:54所示的重链可变区和SEQ ID NO:67所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab144hu1，其包含SEQ ID NO:55所示的重链可变区和SEQ ID NO:68所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab144hu2，其包含SEQ ID NO:56所示的重链可变区和SEQ ID NO:69所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab451hu1，其包含SEQ ID NO:57所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab451hu3，其包含SEQ ID NO:58所示的重链可变区和SEQ ID NO:71所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab451hu4，其包含SEQ ID NO:59所示的重链可变区和SEQ ID NO:72所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab451hu5，其包含SEQ ID NO:60所示的重链可变区和SEQ ID NO:73所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab451hu6，其包含SEQ ID NO:60所示的重链可变区和SEQ ID NO:74所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab540hu1，其包含SEQ ID NO:61所示的重链可变区和SEQ ID NO:75所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab540hu3，其包含SEQ ID NO:62所示的重链可变区和SEQ ID NO:76所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab449hu1，其包含SEQ ID NO:63所示的重链可变区和SEQ ID NO:77所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab449hu3，其包含SEQ ID NO:64所示的重链可变区和SEQ ID NO:78所示的轻链可变区。根据具体实施方式，所提供的抗体为mab449hu4，包含SEQ ID NO:65所示的重链可变区和SEQ ID NO:79所示的轻链可变区。所提到的这些抗体的重链恒定结构域如SEQ ID NO:100所示，轻链恒定结构域序列如SEQ ID NO:101所示。
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根据具体实施方式，所提供的抗体以10nM或更小的EC50结合人CD73或者猴(例如食蟹猴(cynomolgus))CD73，例如与CD73的亲和力EC50值小于5nM，小于4nM，小于3nM，小于2nM，小于1nM，小于0.8nM，小于0.5nM，小于0.3nM，或者是小于0.1nM，小于0.05nM。所提供的抗体还可以促进CD73内吞，表现出抗肿瘤活性。
所提供到的抗CD73抗体可以来自于普遍已知的同型中的任意一种，包括但不限于IgA、IgG、IgM以及分泌性IgA。IgG同型在不同物种中可以分成不同的亚类，例如在人中分为IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4，在小鼠中可以分为IgG1、IgG2a、IgG2b以及IgG3。根据实施方式，所提供的抗体进一步包括Fc区，所提到的Fc区可以来源于天然的Fc区或者经过改造的Fc区。天然的Fc区可以为任何来源的，包括但不限于鼠源的、灵长类动物来源的、人源的，优选为人源的Fc区。所提到的人源的Fc区可以在公共数据库中获得。
双特异性抗体
双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb)是能同时特异性结合两个抗原或者抗原表位的抗体。自1960年Nisonoff及其合作者首次提出BsAb的概念以来，双特异性抗体随着基因工程抗体技术的逐渐成熟，得到了快速发展。由于BsAb可以靶向多个抗原或者抗原表位，相较于单克隆抗体表现出更多的优势，而且也逐渐展现出比单克隆抗体联用疗法更高的疗效。例如，可以将特异性免疫效应细胞重定向到邻近的肿瘤细胞，以增强肿瘤杀伤；而且可以通过两个不同的细胞表面抗原的相互作用增加结合的特异性；同时相较于单一抗体联用来说，可以降低开发成本，且无需平衡两种抗体不同半衰期导致不同的给药时间，毒性低。开展有关CD73靶点的双特异性抗体，在肿瘤治疗及自身免疫性疾病等领域中具有广泛的应用。双特异性抗体用来治疗疾病，表现出优异的疾病治疗效果。
本发明提供了一种双特异性抗体，包括第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分分别特异性结合不同的表位。所提到的不同的表位可以来自于同一抗原的不同表位，也可以来自于不同抗原的不同表位。根据本发明的具体实施方式，所提供的双特异性抗体包括第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，第一抗原结合部分特异性结合第一表位，第二抗原结合部分特异性结合第二表位，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分融合。第一表位和第二表位可以来自于同一抗原，也可以来自于不同抗原。根据本发明的优选实施方式，第一抗原结合部分特异性结合第一表位，第二抗原结合部分特异性结合来自于不同抗原的第二表位。如文中所示，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量，也不用来表示先后顺序。术语“第一抗原结合部分”、“第二抗原结合部分”分别意指能够与不同抗原或者相同抗原的不同表位结合的部分，其可以是完整抗体，也可以是完整抗体的一部分，例如重链可变区、轻链可变区、Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(ScFv)、或者单域抗体(sdAb)等等。
本发明提供了一种双特异性抗体，包括第一抗原结合部分和第二抗原结合部分；第一抗原结合部分特异性结合第一表位，第二抗原结合部分特异性结合第二表位；第一抗原结合部分包括如SEQ ID NO:39或40或41或42或43或44或45所示重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及如SEQ ID NO:46或47或48或49或50或51或52所示轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。需要说明的是，所提到的各CDR序列可以经由所示出的重链可变区和轻链可变区序列结合不同定义方案获得。本领域技术人员也需理解是，所示出的重链可变区和轻链可变区序列的CDR序列，因为抗体序列的定义方案的不同，CDR序列也会稍有差异，如上文提到的经典的Kabat氨基酸序列编号***、IMGT***，Chothia***等。所分析出的不同的CDR序列，均包含在本发明的保护范围之内。这些CDR序列可与不同来源的框架区序列形成不同的重链可变区序列或者轻链可变区序列，这些变化和不同也均包括在本发明的保护范围之内。
根据本发明的实施方式，本发明还提供了一种双特异性抗体，包括第一抗原结合部分和第二抗原结合部分；第一抗原结合部分特异性结合第一表位，第二抗原结合部分特异性结合第二表位，第二抗原结合部分和第一抗原结合部分融合；所述第一抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列，或者与SEQ IDNO:33、34和35所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；或者包含SEQID NO:36、37和38所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列。
所提到的双特异性抗体的第一抗原结合部分或者第二抗原结合部分可以根据需要选择完整抗体或者仅仅其中的一部分片段，只要能够靶向不同的靶抗原即可。第一抗原结合部分或者第二抗原结合部分可以仅仅是重链可变区、Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(ScFv)、trap、或单域抗体(sdAb)等。
根据具体实施方式，所提供的双特异性抗体包含SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列。根据具体实施方式，所提供的双特异性抗体具有包含SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列，和具有SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列。根据具体实施方式，所提供的双特异性抗体具有包含SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列。根据具体实施方式中，所提供的双特异性抗体包含SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列。根据具体实施方式，所提供的双特异性抗体包含SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列。根据具体实施方式，所提供的双特异性抗体包含SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列。根据本发明的具体实施方式，所提供的双特异性抗体包含SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列。所示出的HCDR序列和LCDR序列作为双特异性抗体的第一抗原结合部分，与靶抗原特异性结合。
在一些实施方式中，所提供的双特异性抗体包括下列重链可变区和轻链可变区：与SEQ ID NO:39或40或41或42或43或44或45或53或54或55或56或57或58或59或60或61或62或63或64或65所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区，和与SEQ ID NO:46或47或48或49或50或51或52或66或67或68或69或70或71或72或73或74或75或76或77或78或79所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变区。其中SEQ ID NO:53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64和65分别为人源化的重链可变区序列。SEQ ID NO:66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78和79分别为人源化的轻链可变区序列。所示出的重链可变区和轻链可变区序列作为双特异性抗体的第一抗原结合部分，与靶抗原特异性结合。第一抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区的序列，经过人源化之后，免疫原性更低，而且保留了与靶抗原(如CD73)的结合活性。可以通过本领域常用的方法(例如互补决定区移植法)获得人源化的抗体序列。在一些实施方式中，所提供的人源化的抗体序列保留了CDR区序列，将框架区序列替换为人源的框架区序列。人源的框架区序列可以通过已经发表的人源的序列获得。例如通过数据库比对和计算机同源建模，寻找出具有最大同源性的人的FR区模板，综合考虑确定FR区需要是否需要进行回复突变以及恢复突变的关键残基，获得高亲和力的人源化抗体。这些序列通常记载在常用的数据库中，例如PDB蛋白质结构数据库、IMGT、Genebank等数据库。
在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:39所示的重链可变区和SEQ ID NO:46所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，所述第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:40所示的重链可变区和SEQ ID NO:47所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:41所示的重链可变区和SEQ ID NO:48所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:42所示的重链可变区和SEQ ID NO:49所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ IDNO:43所示的重链可变区和SEQ ID NO:50所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:44所示的重链可变区和SEQ ID NO:51所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:45所示的重链可变区和SEQ IDNO:52所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:53所示的重链可变区和SEQ ID NO:66所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:54所示的重链可变区和SEQ ID NO:67所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:55所示的重链可变区和SEQ ID NO:68所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:56所示的重链可变区和SEQ ID NO:69所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:57所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:58所示的重链可变区和SEQ ID NO:71所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:59所示的重链可变区和SEQ ID NO:72所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQID NO:60所示的重链可变区和SEQ ID NO:73所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:60所示的重链可变区和SEQ ID NO:74所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:61所示的重链可变区和SEQID NO:75所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:62所示的重链可变区和SEQ ID NO:76所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:63所示的重链可变区和SEQ ID NO:77所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:64所示的重链可变区和SEQ ID NO:78所示的轻链可变区。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:65所示的重链可变区和SEQ ID NO:79所示的轻链可变区。
根据本发明的实施方式，第一抗原结合部分的重链可变区和重链恒定结构域连接，第一抗原结合部分的轻链可变区和轻链恒定结构域连接，形成IgG型结构；第二抗原结合部分为单域抗体。根据本发明的具体实施方式，第二抗原结合部分与Fc区的羧基端(C端)直接连接或者通过连接子连接。根据本发明的具体实施方式，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的重链可变区或者轻链可变区的氨基酸(N端)直接连接或者通过连接子连接。根据本发明的具体实施方式，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的轻链恒定结构域CL的羧基端直接连接或通过连接子连接。当然，第二抗原结合部分和第一抗原结合部分融合时，可以不止限于上述提到的方式，也可以将这些融合方式组合，也可以通过其他方式连接。
根据本发明的优选实施方式，如图1所示，双特异性抗体的第一抗原结合部分的重链可变区和重链恒定结构域连接，第一抗原结合部分的轻链可变区和轻链恒定结构域连接，形成IgG型结构，第二抗原结合部分为单域抗体，第二抗原结合部分与Fc区的羧基端直通过连接子连接，两个单域抗体分别与Fc区羧基端的两端通过连接子连接。第二抗原结合部分所包含的两个单域抗体可以相同，也可以不同。当然，也可以根据需要，仅在Fc区羧基端的一端连接一个单域抗体或者更多个单域抗体。如图2所示，第二抗原结合部分也可以根据需要，包含四个单域抗体，Fc区羧基端的两端分别连接两个单域抗体。所连接的单域抗体可以相同，也可以不同。单域抗体之间可以通过连接子连接。
根据本发明的优选实施方式，双特异性抗体的第一抗原结合部分的重链可变区和重链恒定结构域连接，第一抗原结合部分的轻链可变区和轻链恒定结构域连接，形成IgG型结构，第二抗原结合部分为单域抗体，第二抗原结合部分与轻链恒定结构域的羧基端通过连接子连接。在至少一些实施方式中，第二抗原结合部分包括四个单域抗体，分别有两个单域抗体与轻链恒定结构域的羧基端通过连接子连接，如图3所示。第二抗原结合部分所包含的四个单域抗体可以相同，也可以不同。第二抗原结合部分也可以根据需要，仅包含两个单域抗体，分别有一个单域抗体与轻链恒定结构域的羧基端直接连接或者通过连接子连接，如图5所示。第二抗原结合部分也可以根据需要，包含四个单域抗体，分别有一个单域抗体与Fc区羧基端的两端通过连接子连接，分别有一个单域抗体与轻链恒定结构域的羧基端通过连接子连接，如图4所示。所连接的单域抗体可以相同，也可以不同。单域抗体之间可以通过连接子连接。需要说明的是，所示出的图1～图5仅为示意性附图，例如轻链和重链之间的链间二硫键并未在图中示出。
根据本发明的优选实施方式，第一抗原结合部分除了上述提到的重链可变区和轻链可变区之外，进一步包含重链恒定结构域CH1和轻链恒定结构域，形成(Fab’)2结构，双特异性抗体进一步包括Fc区，第二抗原结合部分包括单域抗体，单域抗体与轻链恒定结构域的羧基端连接和/或与Fc区的羧基端连接。单域抗体的个数不做特殊要求，所连接的单域抗体可以相同，也可以不相同。
本文中，“连接子”和“连接片段”具有相同的含义。连接子可以为一些寡肽或者多肽，可以是任何能够提供柔性的氨基酸序列。可用的连接子为本领域常用的连接子，包括但不限于以下组成的组：GS、SG、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS、SGGG、GGGGS、GGGGGSGS、GGGGSGS、GGGGSGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGGGS等等。
所提到的第二抗原结合部分特异性结合不同于第一表位的抗原，包括但不限于：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、4-1BB、OX40、OX40L、VEGF、VEGF trap、VEGFR、EGFR、GARP、TGF-β、CD47、c-Met、CD3、CD33、TIGIT、PVRIG、CD69、CD96、LEFA1、CD226、FAP2、GITR、CEACAM-1、CD48、TIM-1、VISTA、CD39、CD70、CD27、CD40、Claudin18.2、ICOS、BLTA、B7-H3、BCMA、MUC1/16等。例如可以将市售或者在研的抗体分子序列与本文所提到的第一抗原结合部分组成双特异性抗体，发挥疾病治疗效果。以PD-1抗体为例，纳武单抗(Nivolumab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)，替雷利珠单抗(tislelizumab)等抗体分子的部分序列或者全部序列均可以与本文提到的第一抗原结合部分融合，组成双特异性抗体发挥作用。以PD-L1抗体为例，度伐利尤单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)等抗体分子的部分序列或者全部序列均可以与本文提到的第一抗原结合部分融合，组成双特异性抗体发挥作用。再例如第二抗原结合部分可以为VEGF trap结构。阿帕西普(aflibercept或VEGF-trap)能够特异性靶向VEGFA、VEGFB和PIGF，其通过特异性结合并捕获这些蛋白，阻止血管生成。可以将VEGF-trap分子与第一抗原结合部分组成双特异性抗体，发挥疾病治疗效果。贝伐珠单抗(bevacizumab)是一种重组人源化免疫球蛋白G1(IgG1)单克隆抗体，可以结合VEGFA，抑制其与VEGFR2结合，继而抑制VEGF的生物学作用。贝伐珠单抗或其生物类似药抗体分子的部分序列或者全部序列均可以与本文提到的第一抗原结合部分融合，组成双特异性抗体发挥作用。
根据具体实施方式，本发明提供了一种双特异性抗体，包括第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，第一抗原结合部分特异性结合CD73，第二抗原结合部分特异性结合PD-L1。如上文中所提到的，第二抗原结合部分只要能够特异性靶向PD-L1即可，其表现形式不受限制。例如可以是完整抗体，也可以是完整抗体的一部分，包括但不限于重链可变区、Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体或者纳米抗体等等。第二抗原结合部分可以根据需要通过抗体库筛选获得，也可以来源于市售的或者已有的(例如文献中公开的或者临床在研的)抗体序列。在一些具体实施方式中，所述第二抗原结合部分为单域抗体。根据本发明的优选实施方式，双特异性抗体进一步包括Fc区，Fc区与第一抗原结合部分融合成IgG型结构，第二抗原结合部分与Fc区的羧基端(也称C端)直接连接或者通过连接子连接。
在一些具体实施方式中，所提供的第二抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1选自SEQ ID NO:80、83或86所示的序列，或者与SEQ ID NO:80、83和86相比，具有一个或者两个保守氨基酸突变的序列；CDR2选自SEQ ID NO:81、84或87所示的序列，或者与SEQID NO:81、84和87相比，具有一个或者两个保守氨基酸突变的序列；以及CDR3选自SEQ IDNO:82、85、88或89所示的序列，或者与SEQ ID NO:82、85、88和89相比，具有一个、两个或者三个保守氨基酸突变的序列。如上文所提到的，本领域技术人员应知的是，利用不同数据库表征CDR区时，表征出来的CDR区序列会有所差异，这些差异也应包含在本发明的保护范围之内。
根据具体实施方式，所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:80所示的CDR1序列、SEQ ID NO:81所示的CDR2序列和SEQ ID NO:82所示的CDR3序列。根据具体实施方式，所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:83所示的CDR1序列、SEQ ID NO:84所示的CDR2序列和SEQ ID NO:85所示的CDR3序列。根据具体实施方式，所述第二抗原结合部分包含SEQ IDNO:86所示的CDR1序列、SEQ ID NO:87所示的CDR2序列和SEQ ID NO:88所示的CDR3序列。根据具体实施方式，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:80所示的CDR1序列、SEQ ID NO:81所示的CDR2序列和SEQ ID NO:89所示的CDR3序列。所示出的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列可以和不同来源的框架区FR形成单域抗体。框架区FR序列不做特殊限制，可以是鼠源的，也可以是人源的，或者是部分鼠源、部分人源的。
| SEQ ID NO: | 功能区 | 氨基酸序列 |
| 80 | CDR1 | GRSFSSSG |
| 81 | CDR2 | INSSGGDT |
| 82 | CDR3 | AAKEGGGPSSIPAIYDY |
| 83 | CDR1 | GFTFSSYA |
| 84 | CDR2 | INTGSEIV |
| 85 | CDR3 | ATGLVSAEHDGI |
| 86 | CDR1 | GRDFLTYG |
| 87 | CDR2 | INWSGSMT |
| 88 | CDR3 | AARRGAVTYASSNEYEH |
| 89 | CDR3 | AAKEGGGPSSIPAIFDY |
在一些实施方式中，所述第二抗原结合部分具有如SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些实施方式中，所述第二抗原结合部分的序列与SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的氨基酸序列相比，序列同一性在85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或者99％以上。所提供的SEQ ID NO:95、96、97、98、99所示的序列为人源化后的抗体序列。所提供的人源化的序列具有低的免疫原性，而且具有和靶蛋白高的亲和力。
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所提到的上述第二抗原结合部分的序列记载在申请号为PCT/CN2022/110423、国际公布号为WO2023/011614A的PCT专利申请中，该专利文本中记载了通过羊驼免疫的方法获得抗PD-L1纳米抗体文库，并进行筛选和鉴定，获得了亲和力以及特异性结合以及肿瘤杀伤效果良好的纳米抗体。本文中，也根据需要将申请号为PCT/CN2022/110423、国际公布号为WO2023/011614A的PCT专利申请文本中所记载的内容全部或者部分援引在本文中。
本发明还提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括：第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，所述第一抗原结合部分能够结合CD73，所述第二抗原结合部分能够结合PD-L1。
根据具体实施方式，第一抗原结合部分包括SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列和SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列；第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:80或83或86所示的CDR1序列，SEQ ID NO:81或84或87所示的CDR2序列，和SEQ ID NO:82或85或88或89所示的CDR3序列。根据具体实施方式，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列；第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:80或83或86所示的CDR1序列，SEQ ID NO:81或84或87所示的CDR2序列，和SEQ ID NO:82或85或88或89所示的CDR3序列。根据具体实施方式，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列；第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:80或83或86所示的CDR1序列，SEQ ID NO:81或84或87所示的CDR2序列，和SEQ ID NO:82或85或88或89所示的CDR3序列。根据具体实施方式，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列；第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:80或83或86所示的CDR1序列，SEQ ID NO:81或84或87所示的CDR2序列，和SEQID NO:82或85或88或89所示的CDR3序列。根据具体实施方式，第一抗原结合部分包含SEQID NO:13、14和15所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列；第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:80或83或86所示的CDR1序列，SEQ ID NO:81或84或87所示的CDR2序列，和SEQ ID NO:82或85或88或89所示的CDR3序列。根据具体实施方式，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列；第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:80或83或86所示的CDR1序列，SEQ ID NO:81或84或87所示的CDR2序列，和SEQ ID NO:82或85或88或89所示的CDR3序列。根据具体实施方式，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列；第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:80或83或86所示的CDR1序列，SEQ ID NO:81或84或87所示的CDR2序列，和SEQ ID NO:82或85或88或89所示的CDR3序列。根据具体实施方式，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分通过(G4S)3-5连接子进行连接。
在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:39所示的重链可变区，和SEQ ID NO:46所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:40所示的重链可变区，和SEQ ID NO:47所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:41所示的重链可变区和SEQ ID NO:48所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:42所示的重链可变区和SEQ ID NO:49所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:43所示的重链可变区和SEQ ID NO:50所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:44所示的重链可变区和SEQ ID NO:51所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:45所示的重链可变区和SEQ ID NO:52所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:53所示的重链可变区和SEQ ID NO:66所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:54所示的重链可变区和SEQ ID NO:67所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ IDNO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:55所示的重链可变区和SEQ ID NO:68所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:56所示的重链可变区和SEQ ID NO:69所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:57所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:58所示的重链可变区和SEQ ID NO:71所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:59所示的重链可变区和SEQ ID NO:72所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:60所示的重链可变区和SEQ ID NO:73所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:60所示的重链可变区和SEQ IDNO:74所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ IDNO:61所示的重链可变区和SEQ ID NO:75所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:62所示的重链可变区和SEQ ID NO:76所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:63所示的重链可变区和SEQ ID NO:77所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:64所示的重链可变区和SEQ ID NO:78所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。在一些具体实施方式中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO:65所示的重链可变区和SEQ ID NO:79所示的轻链可变区；所述第二抗原结合部分包含SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列。根据具体实施方式，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分通过(G4S)3-5连接子进行连接。
根据具体实施方式，第一抗原结合部分的重链可变区和重链恒定结构域连接，第一抗原结合部分的轻链可变区和轻链恒定结构域连接，形成IgG型结构。所形成的IgG型结构除了提到的重链可变区以及轻链可变区序列之外，其他序列可以采用哺乳动物来源的天然序列(例如可以是人源的天然序列)。根据具体实施方式，第二抗原结合部分与Fc区的羧基端(C端)连接；或者第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的重链可变区或者轻链可变区的氨基端(N端)连接；或者第二抗原结合部分与轻链恒定结构域CL的羧基端(C端)连接。
所提到的Fc区可以是天然的Fc区序列，也可以是经过修饰的Fc区序列，例如可以对Fc区的序列进行突变。通过Fc区突变可以调节抗体的ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)、ADCP(抗体依赖细胞介导的细胞吞噬作用)或者CDC(补体介导的细胞毒性作用)等。ADCC是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(例如NK细胞、巨噬细胞等)表面的Fc受体(FcR)结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。ADCP主要是通过单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞介导来吞噬靶细胞。CDC是由抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物激活补体经典途径，对靶细胞发挥裂解效应。Fc区序列突变可以是一个、两个、三个、四个或者五个等氨基酸的突变。当然除了Fc区发生氨基酸突变之外，还可以在其他区域，例如重链恒定结构域CH1、铰链区等发生突变。所提到的氨基酸突变是本领域技术人员已知的，包括但不限于L234F、L234A、L235E、G236R、G237A、D270A、K322A、P329A、P331S、P331A、N297A、N297G、A330S、V309L、P238S、G236R、L328R等。所提到的氨基酸突变还可以为L235V、R292P、K326W、E333S、S267E、H268F、S324T、F243L、R292P、Y300L、V305L、V305I、P396L、S239D、I332E、A330L、S298A、E333A、K334A等。所提到的氨基酸突变可以选自这些突变位点，或者几个突变位点的组合。在一些实施方式中，所提供的双特异性抗体发生A330S和P331S取代。在一些实施方式中，所提供的双特异性抗体发生D270A、K322A、P329A和P331A取代。在一些实施方式中，所提供的双特异性抗体发生L234F、L235E、P331S和N297A取代。在一些实施方式中，所提供的双特异性抗体发生了S267E、H268F和S324T突变。在一些实施方式中，所提供的双特异性抗体发生了K214R、L234F、L235E、P331S、D356E和L358M突变。当然还可以通过Fc区序列的修饰来改进抗体药物的半衰期，可用的氨基酸的突变位点也是本领域技术人员已知的。本文中对于突变位点的编号是根据kabat提出的EU索引(Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.5th Edition-USDepartment of Health and human severices,NIHpublication n 91-3242,pp662,680,689(1991))。
多核苷酸
本发明还提供了一种多核苷酸，其编码抗体或抗原结合片段或者双特异性抗体。所提到的多核苷酸是可分离的，包括但不限于DNA、RNA或者cDNA等等。可以采用本领域的常规方法获得分离的多核苷酸序列，用来编码双特异性抗体或者抗体或抗原结合片段。
构建体
为了制备本发明所提到的抗体，可以将编码抗体的多核苷酸序列***到可复制的表达载体中，并在宿主细胞或者无细胞表达***中表达。本发明还提供了一种构建体，包含上述所述的多核苷酸。本领域常用的多种方法都可以用来获得构建体，包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等等，例如可以将多核苷酸***到表达载体多克隆位点形成构建体。构建体中可以根据需要含有启动子、终止子、标记基因等多种操纵因子，这些操纵因子可操作地与多核苷酸进行连接。启动子通常用来提供开始转录的信号，启动子可以根据需要选择乳糖启动子(Lac)、Trp启动子、Tac启动子、噬菌体的PL和PR启动子；终止子在转录过程中提供转录终止的信号，构建体上的标记基因常用作筛选。当然还可以根据需要还有增强子，增强蛋白的表达。表达载体不做特殊限制，可以是市售的一些表达载体，也可以是根据需要人工改造后的表达载体，例如质粒、噬菌体、病毒等。病毒可以为植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒等。构建体可以在体外表达抗体或者蛋白，也可以被转入到细胞中表达抗体或者蛋白。
宿主细胞
本发明还提供了一种宿主细胞，含有上述多核苷酸或者上述构建体。任何适用于多核苷酸或者构建体进行抗体或蛋白表达的细胞都可以作为宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；也可以是真核细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞等。常用的宿主细胞可以是酵母细胞、CHO、HEK-293细胞、COS细胞、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞。采用本领域常用的方法可以获得含有多核苷酸或者构建体的宿主细胞，如显微注射法、电穿孔法、化学转染法、病毒介导的转化法等。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，包括：上述抗体或抗原结合片段，或上述双特异性抗体，以及药学上可接受的载体。
药物组合物还包括药学上可接受的盐，例如酸加成盐或者碱加成盐(例如记载在Berge，S.M.etal(1977)J.Pharma.Sci.66:1-19)。所提到的药学上可接受的载体在采用的剂量或者浓度下是可以被受试者接受的。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂或盐，例如磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，氯化钠、醋酸钠、枸橼酸、枸橼酸钠、柠檬酸盐、Tris；糖类，如海藻糖、聚山梨醇、蔗糖、甘露醇；表面活性剂如聚山梨酯；防腐剂如氯己双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵；氨基酸如组氨酸、盐酸组氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等。可以通过本领域常用的方法获得无菌的药物制剂，例如通过无菌滤膜过滤的方法获得。本领域技术人员可以根据需要将药物组合物选择不同的药学上可接受的载体，制备成不同的剂型，例如冻干剂型、注射剂等多种剂型。所制备的不同的药物剂型可以被配制成任何合适的施用途径施用于受试者，包括但不限于静脉、真皮、肌肉、腹膜、皮下、经鼻、口服、经直肠、局部、吸入、透皮等等。
所提到的药物组合物除了上述之外，还可以进一步包括其他治疗剂。所提到的治疗剂为能够发挥治疗作用的物质。例如抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG-3抗体、抗VEGF抗体、抗EGFR抗体、抗GARP抗体、抗CD3抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗TGF-β抗体等等。通过与这些治疗性抗体联用，可以进一步提高疾病的治疗效果，从而可以有效治疗多种疾病。
抗体偶联物
本发明还提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括所述的双特异性抗体或者抗体或抗原结合片段，以及与所述双特异性抗体或者抗体或抗原结合片段连接的功能小分子或蛋白酶。所提到的功能小分子可以为已开发的或者未开发的小分子药物，小分子药物通过与双特异性抗体或者单克隆抗体或抗原结合片段进行化学偶联，增强抗肿瘤药物的治疗效果，并可以减少不良反应。还可以通过连接子将毒素、化疗药物、光敏剂等小分子偶联到所提到的抗体上。当然还可以通过将抗体与protac分子等偶联，获得抗体Protac偶联物，如通过连接子将抗体和蛋白酶靶向配体(如E3连接酶配体)连接，拉近目标蛋白和细胞内的E3泛素连接酶的距离，利用泛素-蛋白酶体途径特异性的降解靶蛋白。
试剂盒或者药盒
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述双特异性抗体或者上述单克隆抗体或抗原结合片段。试剂盒还可以根据需要包括容器，缓冲试剂、对照物如阳性对照物和阴性对照物。本领域技术人员可以根据需要进行相应的选择。相应地，试剂盒中还可以包括使用说明书，以便于本领域技术人员的操作和使用。在一些实施方式中，本发明还提供了一种药盒，所述药盒包括上述抗CD73抗体或抗原结合片段，或者包括上述双特异性抗体。所述药盒还可以进一步包括免疫治疗剂，其中所述免疫治疗剂为抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体或者抗CTLA-4抗体等多种治疗性抗体中的一种或者多种。所提到的抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体或者CTLA-4抗体为已上市的或者文献中公开的或者未来上市的药物。
生产抗体的方法
本发明又提供了一种生产上述双特异性抗体的方法，包括：培养上述宿主细胞，以及从培养物中收集所述的双特异性抗体。
本发明还提供了一种生产抗体或抗原结合片段的方法，包括：培养上述宿主细胞，以及从培养物中收集所述的抗体或抗原结合片段。
从培养物中收集的双特异性抗体或者单克隆抗体或抗原结合片段经过纯化可以获得基本上纯的产物。“基本上纯的”是指双特异性抗体或者单克隆抗体或抗原结合片段的纯度达到95％以上，96％以上，97％以上，98％以上，99％以上，甚至是99.5％、99.6％、99.7％、99.8％以上。
预防和/或治疗疾病的方法
另外，本发明又提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括：给予有需要的受试者有效量的上述双特异性抗体，或者上述所提到的抗体或抗原结合片段。
所提到的“治疗”意指能够导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病引起的痛苦降低。预防疾病所用到的抗体有效量通常会低于治疗疾病所用到的抗体有效量。“有效量”为足以实现或者至少部分实现期望效果的量。经过双特异性抗体或者单克隆抗体或抗原结合片段的治疗后，相较于未经过抗体治疗的受试者来说，受试者体内细胞的抑制率达到10％以上，15％以上，20％以上，25％以上，30％以上，40％以上，45％以上，50％以上，55％以上，60％以上，65％以上，70％以上，75％以上，80％以上，85％以上，甚至是90％以上或者95％以上。所提到的受试者可以是动物也可以是人。例如可以是哺乳动物，包括牛、羊、鼠、马等。
所提供的双特异性抗体或者单克隆抗体或其抗原结合片段，可以用于治疗的疾病包括但不限于癌症、炎性疾病、慢性感染、心脑血管疾病、纤维化、神经退行性疾病、免疫调节疾病、中枢神经***疾病和糖尿病等。在一些实施方式中，本发明所提供的方法可以用于治疗CD73靶点相关疾病，也可以用于治疗PD-1/PD-L1相关的疾病。所提到癌症包括但不限于非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、神经胶质瘤、结肠癌、肾癌、泌尿道上皮癌、***癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃肠癌、食道癌、***癌、子***、子宫癌、头颈癌、肾上腺癌、尿道癌、***癌、膀胱癌、黑色素瘤和血液癌症等等。在一些实施方式中，所提到的疾病为非小细胞肺癌、黑色素瘤。
所提到的抗体或抗原结合片段或者双特异性抗体还可以与其他治疗手段联合，用来治疗疾病。所提到的其他治疗手段可以为化疗或者放疗等。通过临床上结合化疗或者放疗等治疗手段，可以进一步提高药物的治疗效果，改善患者的治疗效果。
本发明还提供了双特异性抗体或者单克隆抗体或抗原结合片段在制备药物或者试剂盒中的用途。所述药物用于治疗癌症。应用所提供的双特异性抗体或者单克隆抗体或抗原结合片段，可以制备药物，用于治疗多种疾病。还可以用来制备试剂盒，作为免疫诊断试剂使用。
下面参考实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要说明的是，这些实施例仅用于方便本领域技术人员的理解，不应看作是对本发明保护范围的限制。下面详细描述本发明的实施例，所描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。来源于第二抗原结合部分的PD-L1结合部分，为通过羊驼免疫获得的纳米抗体，其序列制备以及获得方式记载于申请号为PCT/CN2022/110423、国际公布号为WO2023/011614A的PCT国际专利申请文本中，根据需要将该申请中所记载的内容全部或者部分援引在本申请中。首先通过羊驼免疫的方法获得抗PD-L1纳米文库，进行筛选和鉴定，获得候选纳米抗体。具体为：将人源的PD-L1蛋白胞外域序列和人免疫球蛋白Fc区序列构成的融合蛋白和弗氏佐剂混合，乳化，免疫健康羊驼，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。然后采集羊驼血，分离淋巴细胞，采用Trizol法提取总RNA，反转录获得cDNA，并从反转录的cDNA中PCR扩增获得VHH抗体基因片段。VHH基因片段与酵母展示载体共同电转化感受态酵母菌中，酵母同源重组酶将片段与载体连接形成完整质粒，建立库***率高和多样性优越的酵母转化子文库，并在营养缺陷培养基中保持传代稳定。将表达抗体的酵母细胞和富集了靶蛋白抗原的磁珠共孵育，并多次的富集培养后，用流式细胞仪鉴定磁珠富集产物，并进行分选。经过多轮筛选，筛选获得5个高表达的阳性克隆，分别命名为抗体A～抗体E。抗体A的氨基酸序列如SEQ ID NO:90所示，抗体B的氨基酸序列如SEQ ID NO:91所示，抗体C的氨基酸序列如SEQ ID NO:92所示，抗体D的氨基酸序列如SEQ ID NO:93所示，抗体E的氨基酸序列如SEQID NO:94所示。经过人源化的抗体为抗体Ahu，氨基酸序列如SEQ ID NO:95所示；抗体Bhu，氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示；抗体Chu，氨基酸序列如SEQ ID NO:97所示；抗体D1hu，氨基酸序列如SEQ ID NO:98所示；抗体D2hu，氨基酸序列如SEQ ID NO:99所示。
这些抗体以及人源化后的抗体经FACS和ELISA实验证实和hPD-L1、食蟹猴PD-L1具有高的结合活性。而且表现出对于PD-1/PD-L1的阻断活性以及对于CD80/PD-L1的阻断活性。
例如，通过FACS检测抗体和人源的PD-L1的结合活性。实验过程为：采用流式细胞仪对不同抗体与抗原的亲和力进行检测。将内源性表达PD-L1抗原的MDA-MB-231细胞按1×105个/孔加入到96孔板中。然后加入不同浓度的样品，4摄氏度条件下孵育30分钟。然后加入荧光标记的羊抗人IgG二抗(厂家：Abcam)，以检测结合到细胞表面的抗体。利用几何值生成抗体-抗原结合剂量反应曲线，并利用Graphpad Prism V6.0软件绘制四参数的原始数据，确定抗体结合抗原的EC50结果。实验结果表明，抗体A、抗体B、抗体C、抗体D和抗体E的EC50值分别为0.089nM、0.031nM、0.042nM、0.039nM、0.053nM，和阳性对照(阿替利珠单抗，0.059nM)相似，表现出高的结合活性。采用类似的方法测定人源化的抗体的结合活性，抗体Ahu、抗体Bhu、抗体Chu、抗体D1hu、抗体D2hu的EC50值分别为0.051nM、0.18nM、0.023M、0.18nM和0.29nM。
再例如通过FACS测定抗体对于PD-1/PD-L1的阻断活性。实验过程为：采用基于竞争性流式细胞的方法，检测抗体对于PD-1与其配体PD-L1的阻断作用。复苏过表达PD-1的293T-PD-1细胞系(厂家：康源博创生物科技(北京)有限公司)，将细胞按1×105个/孔铺在96孔板中，将不同浓度的抗体稀释液(起始工作浓度为200nM，4倍稀释)和PD-L1-Biotin稀释液(2ug/ml，50ul/孔)混合，室温孵育30分钟。然后将混合液按100ul每孔加入细胞中，混匀，4摄氏度孵育60分钟，然后用含FACS缓冲液(含2％FBS的PBS)洗涤，在1200rpm下离心4分钟，弃掉上清。按照100ul/孔加入PE标记的链霉亲和素，避光孵育30分钟，孵育结束后用FACS缓冲液洗涤。加入120ul的FACS缓冲液重悬细胞，上机检测。根据FSC/SSC对活细胞进行射门，并测量其平均荧光值。用几何值生成抗体-抗原阻断反应曲线，并利用GraphpadPrism V6.0软件绘制四参数图形，确定IC50值。实验结果表明，抗体A、抗体B、抗体C、抗体D和抗体E的IC50值分别为1.0nM、2.1nM、1.7nM、2.1nM、2.5nM，抗体均能阻断抗原和其配体的结合。采用类似的方法测定人源化的抗体的阻断活性，抗体Ahu、抗体Bhu、抗体Chu、抗体D1hu、抗体D2hu的IC50值分别为4.0nM、3.4nM、1.0nM、2.6nM和12nM。
通过FACS测定抗体对于CD-80/PD-L1的阻断活性。实验过程为：采用基于竞争性流式细胞的方法，检测抗体对于PD-L1与CD-80的阻断作用。复苏过表达PD-L1的293T-PD-L1细胞系(厂家：康源博创生物科技(北京)有限公司)，将细胞按1×105每孔铺在96孔板中，将不同浓度的抗体稀释液(起始工作浓度为200nM，4倍稀释)加入细胞中，4℃孵育60分钟。孵育结束后用含FACS缓冲液洗涤，在1200rpm条件下离心4分钟，弃掉上清。然后按照100ul/孔加入human-CD80-mFc(2ug/ml)，4℃避光孵育30分钟。孵育结束后用FACS缓冲液洗涤。每孔加入100ul 1:200稀释的荧光标记的羊抗鼠二抗(厂家：Abcam)，4℃避光孵育30分钟。孵育结束后用FACS缓冲液洗涤，流式上机检测。测量其平均荧光值。用几何值生成抗体-抗原阻断反应曲线，并利用Graphpad Prism V6.0软件绘制四参数图形，确定IC50值。实验结果表明，抗体A、抗体B、抗体C、抗体D和抗体E的IC50值分别为4.0nM、3.4nM、4.1nM、4.8nM、3.0nM，抗体均能阻断抗原和其配体的结合。类似的方法测定人源化的抗体的阻断活性，抗体Ahu、抗体Bhu、抗体Chu和抗体D1hu的IC50值分别约为1.8nM、1.7nM、3.2nM和1.5nM。
实施例1制备获得单克隆抗体
利用CD73抗原免疫小鼠，通过杂交瘤的方式筛选获得单克隆抗体。将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠的脾脏细胞融合，融合后的细胞铺板。然后加入HAT选择性培养基筛选，骨髓瘤细胞无法存活，而脾脏细胞存活时间也很短。最终使得只有融合了淋巴细胞的骨髓瘤细胞存活，即筛选获得杂交瘤细胞。
然后通过有限稀释克隆细胞的方法选出能够产生特定抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，培养增殖，当克隆长到一定大小后，利用ELISA的方式检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，可与特定抗原(CD73)结合的培养孔为阳性孔，并继续进行稀释，直至获得单克隆细胞。
通过上述方法，筛选获得多个阳性克隆，并从中进行差异化筛选，获得7个活性高的克隆，分别编号为clone309、clone307、clone144、clone235、clone451、clone540、clone449。所获得的7个克隆均表现出与人CD73抗原的高亲和力，以及高的酶活阻断活性。
对所选择的克隆进行测序，并将所选择的克隆可变区与人类来源的恒定区序列进行融合，构建至PCDNA3.1哺乳动物表达载体中，构建成嵌合抗体的形式。然后利用哺乳动物细胞体系对所获得的不同抗体进行表达纯化，获得纯度至少在90％以上的不同的抗体，所表达的抗体分别编号为mab309、mab307、mab144、mab235、mab451、mab540和mab449。
实施例2抗体与CD73结合活性鉴定
使用人CD73(hCD73，厂家：ACRO)包被酶标板，100ng/孔，4℃孵育过夜。然后使用PBST清洗，每孔加入200ul 2％ BSA，于37℃条件下封闭1h。使用PBST清洗，并按照100uL/孔加入不同浓度的待测抗体(各抗体的初始浓度为31.25nM，4倍梯度稀释)，37℃条件下孵育2h。使用PBST清洗，并按照100uL/孔加入羊抗人二抗(1％BSA稀释，1：10000，厂家：Jackson)，37℃孵育1h。使用PBST清洗，加入100ul TMB显色液显色10-15min后，加入50ul2M硫酸终止反应。采用酶标仪读取OD450值，并使用数据处理软件Graphpad Prism8.0计算得到待测抗体的EC50值，如下表1所示，其中阳性对照为来自阿斯利康子公司Medimune的抗CD73抗体olecumab(MEDI9447)，以下实施例中采用相同的阳性对照。
表1
实验结果表明，所示出的抗体均能够与CD73发生特异性结合。
实施例2抗体与MDA-MB-231细胞结合活性
MDA-MB-231细胞表面高表达CD73抗原，利用FACS检测抗体与MDA-MB-231细胞的结合活性。培养MDA-MB-231细胞，调整细胞浓度至1-2×106个/ml，然后按照100ul/孔加入96孔板中。1000rpm条件下离心5min，弃掉培养基上清，然后按100ul/孔加入不同的待测抗体(抗体初始浓度为200nM，4倍梯度稀释)，于4℃孵育30min。利用缓冲液清洗，加入荧光标记的羊抗人二抗(厂家：Abcam)，4℃孵育30min。使用缓冲液清洗细胞2次，加入缓冲液重悬细胞，流式上机检测荧光信号。使用数据处理软件Graphpad Prism8.0计算得到待测样品的EC50值，如下表2所示。
表2
从表2的结果可以看出，所有抗体均可与人CD73结合，表现出与阳性对照相似的性质。
实施例3抗体与猴CD73交叉反应
使用猴CD73(CynoCD73，厂家：ACRO)包被酶标板，100ng/孔，4℃孵育过夜。然后使用PBST清洗，每孔加入200ul 2％ BSA，于37℃条件下封闭1h。使用PBST清洗，并按照100uL/孔加入不同浓度的待测抗体(抗体的初始浓度为31.25nM，4倍梯度稀释)，37℃条件下孵育2h。使用PBST清洗，并按照100uL/孔加入羊抗人二抗(1％BSA稀释，厂家：Jackson)，37℃孵育1h。使用PBST清洗，加入100ul TMB显色液显色10-15min后，加入50ul 2M硫酸终止反应。采用酶标仪读取OD450值，并使用数据处理软件Graphpad Prism8.0计算得到待测抗体的EC50值，如下表3所示。
表3
| 抗体编号 | EC50(nM) |
| mab309 | 0.028 |
| mab307 | 0.013 |
| mab144 | 0.027 |
| mab235 | 0.020 |
| mab451 | 0.024 |
| mab540 | 0.041 |
| mab449 | 0.030 |
| hIgG1 | 不结合 |
| 阳性对照 | 0.023 |
实验结果表明，所列出的抗体与cynoCD73均表现出结合活性。
实施例4抗体酶活阻断实验
培养MDA-MB-231肿瘤细胞，培养条件为DMEM+10％FBS+1％PS。消化细胞并重悬计数，调整细胞密度至4.5×105个/mL，按100ul/孔铺于96孔细胞培养板中。用培养基稀释待测抗体(初始浓度为200nM,4倍梯度稀释)。稀释混匀后按50uL/孔加入细胞培养板中，于37℃、5％ CO2培养箱孵育1h后，每孔加入50uL 0.8mM的AMP(厂家：Sigma)。混匀后置于37℃、5％ CO2培养箱孵育2h。于1000rpm条件下离心5min，吸取50uL上清置于新的96孔板中。每孔加入50uL 130uM的ATP(厂家：Sigma)。混匀后每孔加入100ul的Cell titer glo检测试剂(厂家：Promega)，避光孵育5-10分钟。利用酶标仪读取96孔板中的荧光信号。以相对荧光值作为y-轴，抗体样品的浓度作为x-轴，画出四参数曲线。使用GraphPad Prism 8.0软件分析该曲线并得出抗体的IC50值。
表4
| 抗体编号 | IC50(nM) |
| mab144 | 0.30 |
| mab235 | 0.22 |
| mab451 | 0.25 |
| mab540 | 0.18 |
| mab449 | 0.15 |
| hIgG1 | 未阻断 |
实验结果表明，mab144抗体、mab235抗体、mab451抗体、mab540抗体、mab449抗体均表现出酶活阻断活性，且与阳性对照类似。
实施例5抗体内吞实验
培养MDA-MB-231肿瘤细胞，用0.25％胰酶消化细胞并重悬计数，调整细胞密度至1×106个/mL，按100ul/孔铺于96孔培养板中。1000rpm条件下离心5分钟，弃掉上清。用FACS缓冲液稀释待测抗体至20nM，然后按100uL/孔加入96孔板中，与细胞混匀后置于4℃冰箱放置30分钟。然后在1000rpm条件下离心10min，用FACS缓冲液清洗。其中一份标记为0h，放置于冰上，并暂存于4℃冰箱，其它样品放置于37℃恒温培养箱培养4h。然后取出冰上0h样品和37℃4h样品，离心弃去上清，加入100ul羊抗人荧光二抗(1：200稀释，Abcam)混匀，置于4℃冰箱孵育30min。然后用FACS缓冲液清洗。加入缓冲液重悬细胞，流式上机检测荧光信号。根据读取的荧光信号计算抗体的内吞比率，计算公式为：
内吞比率(％)＝(0h荧光信号-4h荧信号)/0h荧光信号*100％。
实验结果如图6所示。结果表明，抗CD73抗体能够促进CD73的内吞。
实施例6抗体抗肿瘤药效
培养CT26-hPDL1-hCD73细胞至对数生长期，收集细胞，去除培养液并用PBS洗涤，将其接种至BALB/C-hPD1/hPDL1/hCD73三转基因小鼠(表达人PD1、人PDL1胞外区蛋白和人CD73蛋白的人源化小鼠模型，厂家：江苏集萃药康生物科技股份有限公司)，接种量为1×106cells/100μL/只。当平均肿瘤体积达到80-120mm3左右时，将小鼠随机分成10组，每组6只。分组当天定义为D0天，并于D0天开始进行抗PD-L1抗体(抗体编号为D2hu，给药浓度为1.5mpk(mg/kg))和抗CD73抗体(给药浓度为10mpk)联合给药，一周给药两次、给药两周，腹腔注射，肿瘤体积变异系数CV不超过1/3。给药后根据肿瘤生长情况进行2-3次每周的测量肿瘤体积和小鼠体重。瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm3)＝0.5×肿瘤长径×肿瘤短径2。实验结果如图7所示。其中G1为PBS，G2为抗PD-L1抗体给药(给药浓度为1.5mpk)，G3为抗PD-L1抗体和mab307抗体联合给药，G4为抗PD-L1抗体和mab309抗体联合给药，G5为抗PD-L1抗体和mab235抗体联合给药，G6为抗PD-L1抗体和mab540抗体联合给药，G7为抗PD-L1抗体和mab144抗体联合给药，G8为抗PD-L1抗体和mab449抗体联合给药，G9为抗PD-L1抗体和mab451抗体联合给药。
结果显示，mab309抗体、mab307抗体、mab235抗体、mab540抗体、mab144抗体、mab449抗体、mab451抗体与PD-L1抗体联用小鼠抗肿瘤药效优于PD-L1抗体单独使用。
实施例7
采用互补决定区移植法(CDR-Grafting method)获得人源化抗体，通过将抗体和模板的氨基酸序列统一划分为FR区和CDR区，然后将CDR区移植到模板的FR区上，使得决定抗体特异性的CDR区和人源抗体的框架区相互组合，达到人源化的目的。同时为了避免抗体亲和力下降，通过计算机模拟等技术计算出关键氨基酸残基位点，利用回复突变的方法保证人源化抗体的亲和力。获得上述抗体的人源化抗体，经过人源化的抗体在命名时在抗体的编号后面加入字母“hu”，同时带上不同的数字以表示不同的人源化抗体。另外，对抗体人源的Fc区进行突变，经过突变后的抗体在命名时加入字母“mu”作为后缀。其中一种突变包括L234F、L235E、P331S和N297A突变，经过突变后的抗体在命名时加入字母“mu1”作为后缀。另一种突变包括K214R、L234F、L235E、P331S、D356E和L358M突变，经过突变的抗体在命名时加入字母“mu2”作为后缀。例如mab309hu1表示mab309抗体经人源化的第一个抗体。mab144hu2表示mab144抗体经人源化的第二个抗体。mab309hu3mu表示mab309抗体经人源化的第三个抗体，同时抗体的Fc区又发生了突变。
实施例8人源化抗体与MDA-MB-231细胞结合活性
MDA-MB-231细胞表面高表达CD73抗原，将MDA-MB-231细胞按照100ul/孔加入96孔板中，细胞浓度为1-2×106个/ml。利用FACS缓冲液(即含2％FBS的PBS溶液)清洗，然后按100ul/孔加入不同的待测抗体(抗体初始浓度为200nM，4倍梯度稀释)，于4℃孵育30min。利用缓冲液清洗，加入荧光标记的羊抗人二抗(厂家：Abcam)，4℃孵育30min。使用缓冲液清洗细胞2次，加入缓冲液重悬细胞，流式上机检测荧光信号。使用数据处理软件GraphpadPrism8.0计算得到待测样品的EC50值，如下表5所示。
表5
| 抗体编号 | EC50(nM) |
| mab309hu1mu1 | 1.1 |
| mab309hu3mu1 | 3.0 |
| mab144hu2mu1 | 1.5 |
| mab451hu4mu1 | 0.68 |
| mab451hu5mu1 | 0.88 |
| mab451hu6mu1 | 0.73 |
| mab540hu1mu1 | 1.3 |
| mab540hu3mu1 | 0.87 |
| mab449hu4mu1 | 0.53 |
| 阳性对照 | 0.55 |
| hIgG1 | 不结合 |
经人源化的抗体表现出与MDA-MB-231细胞的高结合活性，与阳性对照类似。
实施例9人源化抗体酶活阻断活性
培养A375肿瘤细胞，用0.25％胰酶消化细胞，调整细胞密度至4.5×105个/mL，按100ul/孔铺于96孔细胞培养板中。用培养基稀释不同的待测抗体(初始浓度为200nM,4倍梯度稀释)。稀释混匀后按50uL/孔加入细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养箱孵育1h后，每孔加入50uL 0.8mM的AMP(厂家：Sigma)。混匀后于37℃、5％CO2培养箱孵育2h。于1000rpm离心5min，吸取50uL上清于新的96孔细胞培养板，每孔加入50uL 130uM的ATP(厂家：Sigma)。混匀后每孔加入100ul的Cell titer glo检测试剂(厂家：Promega)。避光孵育5-10分钟，并用酶标仪读取96孔板中的荧光信号。以相对荧光值作为y-轴，抗体样品的浓度作为x-轴，画出四参数曲线。使用GraphPad Prism 8.0软件分析该曲线并得出抗体的IC50值，如下表6所示。
表6
| 抗体编号 | IC50(nM) |
| mab144hu1mu1 | 0.087 |
| mab144hu2mu1 | 0.055 |
| mab449hu4mu1 | 0.061 |
| mab451hu4mu1 | 0.072 |
| mab451hu5mu1 | 0.049 |
| mab451hu6mu1 | 0.035 |
| hIgG1 | 未阻断 |
结果表明，人源化抗体表现出酶活阻断活性。
实施例10构建双特异性抗体
将抗CD73抗体作为第一抗原结合部分，抗PD-L1片段作为第二抗原结合部分，进行基因工程改造，构建双特异性抗体，其中抗PD-L1片段与抗CD73抗体通过(G4S)4接头连接在一起。在连接的过程中，抗PD-L1片段和IgG型结构的重链恒定区结构域CH3的羧基端连接。分别有一个抗PD-L1单域抗体(抗PD-L1单域抗体的编号为D2hu)和IgG结构的重链恒定区结构域CH3的羧基端链接，如图1所示。所形成的双特异性抗体以“b”开头进行编号。例如b144mu-D12hu代表mab144抗体(且Fc区发生突变)作为第一抗原结合部分，D2hu作为第二抗原结合部分，二者形成的双特异性抗体。再例如b144hu2mu1-D2hu代表mab144人源化后第二个抗体(且Fc区发生了第一突变)作为第一抗原结合部分，D2hu作为第二抗原结合部分，二者形成的双特异性抗体。以此类推。
然后通过瞬时转染CHO-S细胞生产双特异性抗体蛋白，收集上清，并通过蛋白A亲和柱进行纯化，通过HPLC和SDS-PAGE测定纯化后的抗体的纯度，检测确定双特异性抗体的纯度均在90％以上。
实施例11双特异性抗体结合活性
将CHO-K1-CD73过表达细胞按照100ul/孔加入96孔板中，细胞浓度为1-2×106个/ml。利用FACS缓冲液(即含2％FBS的PBS溶液)清洗，然后按100ul/孔加入不同的待测抗体(抗体初始浓度为200nM，4倍梯度稀释)，于4℃孵育30min。利用缓冲液清洗，加入荧光标记的羊抗人二抗(厂家：Abcam)，4℃孵育30min。使用缓冲液清洗，加入缓冲液重悬细胞，流式上机检测荧光信号。使用数据处理软件Graphpad Prism8.0计算得到待测样品的EC50值，如下表7所示。
表7
| 抗体编号 | EC50(nM) |
| b144mu1-D2hu | 1.5 |
| b144hu2mu1-D2hu | 1.8 |
| b449mu1-D2hu | 0.28 |
| b309mu1-D2hu | 0.50 |
| b451mu1-D2hu | 0.67 |
| hIgG | 不结合 |
实施例12双特异性抗体酶活阻断活性测定
参考实施例9的方法检测双特异性抗体的酶活阻断活性，其结果如表8-1和表8-2所示以及图8所示。双特异性抗体的酶活阻断活性相较于阳性对照更强，至少为阳性对照的2～5倍。
表8-1
表8-2
| 抗体编号 | EC50(nM) |
| b144hu2mu2-D2hu | 0.40 |
| mab144hu2mu2 | 0.30 |
| mab449hu4mu1 | 0.42 |
| b451hu4mu1-D2hu | 0.68 |
| mab451hu4mu2 | 0.25 |
| hIgG | 未阻断 |
| hIgG1mu2 | 未阻断 |
实施例13双特异性抗体报告基因阻断活性
通过报告基因实验研究了双特异性抗体对于PD-L1/PD-1通路的阻断作用。该实验借助于Jurkat-PD1-CD3zeta-NFAT-Luc2细胞株(厂家：康源博创生物技术(北京)有限公司)和293T-hPD-L1细胞(厂家：康源博创生物技术(北京)有限公司)两种细胞系完成。Jurkat-PD1-CD3zeta-NFAT-Luc2细胞株在Jurkat细胞中稳定表达PD-1ECD及CD3zeta组成的融合蛋白，同时***了NF-AT所驱动的荧光素酶报告基因；293T-hPD-L1细胞为表达人PD-L1的293T细胞。当两种细胞共培养时，PD-1/PD-L1相互作用作为第一信号，胞内的CD3zeta链作第二信号向内传递活化信号，NFAT驱动的荧光素酶报告基因得以表达，发出荧光；当在培养体系中加入PD-L1抗体时，会阻断PD-1/PD-L1的结合，抑制活化信号的传递，荧光素酶报告基因不能表达。实验过程如下：
将293T-hPD-L1细胞按2×104个/孔铺于96孔板中，将Jurkat-PD1-CD3zeta-NFAT-Luc2效应细胞按照2×104/孔继续加到96孔板中；然后加入不同浓度的待测抗体(起始浓度为60ug/ml，4倍梯度稀释)，于37℃下孵育18-24h。每孔加入100ul的荧光素酶底物ONE-GloTMLuciferase Assay system检测试剂，避光孵育5分钟；酶标仪读取96孔板中的荧光信号。以相对荧光值作为y-轴，抗体样品的浓度作为x-轴，画出四参数曲线。使用GraphPad Prism8.0软件分析该曲线并得出双抗的IC50值，如下表9-1和表9-2所示。
表9-1
表9-2
| 抗体编号 | IC50(nM) |
| b144hu2mu2-D2hu | 4.6 |
| b451hu4mu2-D2hu | 5.1 |
| D2hu | 5.0 |
| hIgG1mu2 | 未阻断 |
在本说明书的描述中，参考术语“实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体实施方式”、或“实施方式”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (19)
1.一种抗CD73的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区：
包含SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列，或者与SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
所述轻链可变区：
包含SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列；
或者包含SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列，或者与SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列具有一个、两个或三个保守氨基酸突变的序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，选自下列至少之一：
(1)包含SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列；或者
(2)包含SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列；或者
(3)包含SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列；或者
(4)包含SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列；或者
(5)包含SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列；或者
(6)包含SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列；或者
(7)包含SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列。
3.一种抗CD73的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1选自SEQ ID NO:1或4或7或10或13或16或19所示的序列，
HCDR2选自SEQ ID NO:2或5或8或11或14或17或20所示的序列，
HCDR3选自SEQ ID NO:3或6或9或12或15或18或21所示的序列，
LCDR1选自SEQ ID NO:22或26或29或33或36所示的序列，
LCDR2选自SEQ ID NO:23或27或30或34或37所示的序列，
LCDR3选自SEQ ID NO:24或25或28或31或32或35或38所示的序列。
4.一种抗CD73的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括：
如SEQ ID NO:39或40或41或42或43或44或45所示重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及如SEQ ID NO:46或47或48或49或50或51或52所示轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，包含：
与SEQ ID NO:39或40或41或42或43或44或45或53或54或55或56或57或58或59或60或61或62或63或64或65所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变区，和
与SEQ ID NO:46或47或48或49或50或51或52或66或67或68或69或70或71或72或73或74或75或76或77或78或79所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变区。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，选自下列至少之一：
具有SEQ ID NO:39所示的重链可变区和SEQ ID NO:46所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:40所示的重链可变区和SEQ ID NO:47所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:41所示的重链可变区和SEQ ID NO:48所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:42所示的重链可变区和SEQ ID NO:49所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:43所示的重链可变区和SEQ ID NO:50所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:44所示的重链可变区和SEQ ID NO:51所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:45所示的重链可变区和SEQ ID NO:52所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:53所示的重链可变区和SEQ ID NO:66所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:54所示的重链可变区和SEQ ID NO:67所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:55所示的重链可变区和SEQ ID NO:68所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:56所示的重链可变区和SEQ ID NO:69所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:57所示的重链可变区和SEQ ID NO:70所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:58所示的重链可变区和SEQ ID NO:71所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:59所示的重链可变区和SEQ ID NO:72所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:60所示的重链可变区和SEQ ID NO:73所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:60所示的重链可变区和SEQ ID NO:74所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:61所示的重链可变区和SEQ ID NO:75所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:62所示的重链可变区和SEQ ID NO:76所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:63所示的重链可变区和SEQ ID NO:77所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:64所示的重链可变区和SEQ ID NO:78所示的轻链可变区；或者
具有SEQ ID NO:65所示的重链可变区和SEQ ID NO:79所示的轻链可变区。
7.根据权利要求1～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体选自下组中的至少一种：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、或其变体；
任选地，所述抗体或抗原结合片段具有下述性质中至少之一：
(a)抑制CD73酶活性；
(b)以10nM或更小的Kd结合人CD73；
(c)以10nM或更小的Kd结合猴CD73。
8.一种双特异性抗体，其特征在于，包括第一抗原结合部分和第二抗原结合部分；
所述第一抗原结合部分特异性结合第一表位，所述第一抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和所述轻链可变区为权利要求1～7中任一项所述抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区；
所述第二抗原结合部分特异性结合第二表位，所述第二抗原结合部分和所述第一抗原结合部分融合；
任选地，所述第二抗原结合部分特异性结合以下中的至少一种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、4-1BB、OX40、VEGF、VEGF trap、VEGFR、EGFR、GARP、TGF-β、CD47、c-Met、CD3、CD33、TIGIT、PVRIG、CD96、LEFA1、CD226、FAP2、GITR、VISITA、Claudin 18.2、ICOS、BTLA、B7-H3、BCMA、MUC1/16；
任选地，所述第一抗原结合部分选自下列至少之一：
(1)具有SEQ ID NO:1、2和3所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和24所示的LCDR序列；或者
(2)具有SEQ ID NO:4、5和6所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和25所示的LCDR序列；或者
(3)具有SEQ ID NO:7、8和9所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:26、27和28所示的LCDR序列；或者
(4)具有SEQ ID NO:10、11和12所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:29、30和31所示的LCDR序列；或者
(5)具有SEQ ID NO:13、14和15所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:22、23和32所示的LCDR序列；或者
(6)具有SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:33、34和35所示的LCDR序列；或者
(7)具有SEQ ID NO:19、20和21所示的HCDR序列，和SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR序列。
9.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一抗原结合部分的重链可变区和重链恒定结构域连接，所述第一抗原结合部分的轻链可变区和轻链恒定结构域连接，形成IgG样结构；
所述第二抗原结合部分和所述IgG样结构连接，所述第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的单域抗体；
任选地，所述第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的单域抗体，所述第二表位选自PD-1、PD-L1、VEGF trap、TGF-β、GARP、TIGIT、PVRIG、CD96中的至少一种；
任选地，所述第二抗原结合部分包含CDR1、CDR2和CDR3，所述第二抗原结合部分选自下列至少之一：
(1)具有SEQ ID NO:80所示的CDR1序列、SEQ ID NO:81所示的CDR2序列和SEQ ID NO:82所示的CDR3序列；或者
(2)具有SEQ ID NO:83所示的CDR1序列、SEQ ID NO:84所示的CDR2序列和SEQ ID NO:85所示的CDR3序列；或者
(3)具有SEQ ID NO:86所示的CDR1序列、SEQ ID NO:87所示的CDR2序列和SEQ ID NO:88所示的CDR3序列；或者
(4)具有SEQ ID NO:80所示的CDR1序列、SEQ ID NO:81所示的CDR2序列和SEQ ID NO:89所示的CDR3序列；
任选地，所述第二抗原结合部分选自：
(a)具有如SEQ ID NO:90或91或92或93或94或95或96或97或98或99所示的序列；
(b)与(a)相比，序列同一性在85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或者99％以上的序列。
10.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一抗原结合部分的重链可变区和重链恒定结构域连接，所述第一抗原结合部分的轻链可变区和轻链恒定结构域连接，形成IgG型结构；
所述第二抗原结合部分与Fc区的羧基端(C端)连接；或者
所述第二抗原结合部分与所述第一抗原结合部分的重链可变区或轻链可变区的氨基端(N端)连接；或者
所述第二抗原结合部分与所述轻链恒定结构域CL的羧基端(C端)连接；
任选地，所述双特异性抗体至少具有下列性质之一：
(a)以10nM或更小的EC50值与PD-L1特异性结合；
(b)以10nM或更小的EC50值与CD73特异性结合；
(c)具有抗肿瘤活性；
(d)促进CD73内吞。
11.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗原结合片段或者编码权利要求8～10中任一项所述的双特异性抗体。
12.一种构建体，其特征在于，包含权利要求11所述的多核苷酸。
13.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求11所述的多核苷酸或者权利要求12所述的构建体。
14.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗原结合片段、或权利要求8～10中任一项所述的双特异性抗体；以及
药学上可接受的载体。
15.一种抗体偶联物，其特征在于，包括：
权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗原结合片段、或权利要求8～10中任一项所述的双特异性抗体；以及
与所述抗体或抗原结合片段或者所述双特异性抗体连接的功能小分子。
16.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗原结合片段或者权利要求8～10中任一项所述的双特异性抗体。
17.一种生产权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗原结合片段或者生产权利要求8～10中任一项所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，包括：
培养权利要求13所述的宿主细胞，以及
从培养物中收集所述的抗体或抗原结合片段或者所述的双特异性抗体。
18.一种预防和/或治疗疾病的方法，其特征在于，包括：
给予有需要的受试者有效量的权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，或者权利要求8～10中任一项所述的双特异性抗体，或者权利要求14所述的药物组合物，或者权利要求15所述的抗体偶联物；
任选地，所述疾病选自癌症或者自身免疫性疾病。
19.权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，或者权利要求8～10中任一项所述的双特异性抗体在制备药物或者试剂盒或抗体偶联物中的用途。
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