KR20220047311A - 생체분자 감지 및 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 화학감지 및 생체감지를 위한 나노장치에서 DNA 나노와이어에 연결된 금속화된 또는 전도성 중합체를 사용하여 전도성 나노접합체를 생성하는 방법에 관한 것이다.

Description

생체분자 감지 및 검출 방법
관련 출원의 교차참조
본원은 2019년 8월 22일에 출원된 미국 가출원 제62/890,251호에 대한 우선권을 주장하고, 이 출원의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 발명은 천연, 합성된 또는 변형된 DNA, RNA, 단백질, 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 다당류 및 이들의 유사체 등의 확인 및/또는 시퀀싱을 포함하나 이들로 제한되지 않는, 생체분자 및 생화학 반응을 감지하는 시스템, 장치 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이 개시내용은 DNA를 스카폴드 또는 주형으로서 사용하여 나노갭에서 패턴화된 전도성 나노접합체를 생성하는 실시양태를 포함한다.
전자 나노장치는 저렴한 비용으로 현장 진료에서 생체감지에 대한 큰 잠재력을 가진다. 간섭 리소그래피(Interference lithography)1에 의해 7 nm 해상도가 달성되었지만, 산업에서 이용되는 전통적인 하향식 반도체 제조 과정은 그의 한계에 도달하고 있다. 한편, DNA는 옹스트롬 정밀도로 생물학적 운영 시스템을 나노전자에 통합시키는 데 있어서 가장 유망하고 적합한 물질 중 하나이다. 첫째, DNA는 자가조립으로 2차원 및 3차원 둘 다에서 예측 가능한 나노미터 크기 구조물, 예컨대, 2D DNA 어레이, DNA-절두된 팔면체, DNA 오리가미스(origamis) 및 3D DNA를 형성하도록 프로그래밍될 수 있다2. 또한, 정교해진 핵산 화학은 본 발명자들로 하여금 DNA를 조정하고 변형시킬 수 있게 할 뿐만 아니라 새로운 DNA 기반 물질을 생성할 수 있게 한다. 따라서, DNA는 나노기계의 "상향식" 구축을 위한 선택이 되었다.
DNA 분자는 인접 염기쌍의 π-오비탈을 세로 방향으로 중첩함으로써 전자를 전도할 수 있다. 긴 천연 DNA 와이어는 단단한 기판에 참착될 때 전도성을 갖지 않으며3,4, 짧은 DNA 분자는 이를 통한 전하 수송을 허용한다(< 15 염기쌍)5는 것이 관찰되었다. 일반적으로, AT 서열은 DNA에서 그의 GC 대응물보다 더 낮은 전도성을 가진다6. AT 염기쌍은 터널링 장벽으로서 간주되고 GC 염기쌍은 전하 전달을 위한 호핑(hopping) 부위로서 간주된다. 수용액에서, 폴리(CG)n DNA 이중체의 전도도(G)는 그의 길이(L)에 따라 감소한다8. 폴리(CG)4는 약 100 nS의 전도도를 갖지만(도 2, a), 측정 가능한 전도도를 가진 폴리(CG)n에 대한 추정치는 바이어스가 1 V 미만일 때 약 n=10이다(도 2, b). 선행 연구는 (폴리G-폴리C)30 이중체만이 2 V 바이어스(약 0.5 nS) 하에서 실온 및 50% 공기 습도에서 1 nA 미만의 전도도를 가짐을 보여준다(도 1)7. 따라서, DNA는 나노전자를 위해 필요한 길이 크기의 범위에 걸쳐 충분한 전도성을 갖지 않는다.
DNA 나노구조물의 전도성을 개선하는 한 방법은 전도성 물질을 DNA에 추가하는 것이다. 전자적 상호연결을 위해, 나노구조물은 옴(ohmic) 전도성을 갖는 것이 더 좋다. DNA의 금속화는 전도성 나노와이어를 생성하는 효과적인 방식이다. 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 팔라듐(Pd) 및 로듐(Rd) 등과 같은 금속을 DNA에 도금하여 금속화된 나노와이어를 형성한다9. 일반적으로, 이 DNA 주형화된 나노와이어는 우수한 전도성을 위해 10 nm 초과의 직경을 가진다. 브라운(Braun)과 그의 동료들은 DNA 기판 상에서 패턴화하는 분자 리소그래피 기술10을 발명하였고, 이때 2개의 금 나노와이어들 사이의 절연 갭이 DNA 기판 상에 생성되었다.
본 발명은 나노갭에 부착된 DNA 나선을 따라 금속 나노입자 또는 전도성 중합체 단량체의 박층을 코팅하거나, 폴리아닐린과 같은 전도성 중합체를 접합시키거나, 이들 둘 다를 병용함으로써 DNA 나노접합체의 전기 전도성을 증가시키는 수단 및 방법을 제공한다.
비고: 본 발명은 전도성 나노와이어를 제조하거나 나노접합체를 형성하기 위해 주형 또는 기판 또는 스카폴드로서 DNA 이중체를 사용하지만, 본 발명자들은 천연 또는 비천연 RNA 이중체, 폴리펩타이드 쇄, 다당류 쇄 또는 유사한 생체중합체 또는 이들의 조합(DNA와의 조합을 포함함)과 같은 다른 물질도 상기 목적을 위해 사용됨을 배제하지 않는다. 본 발명의 원리 또는 방법은 나노와이어/나노접합체 구축 물질로서 사용되기에 적합한 임의의 다른 생체중합체에 적용된다.
본 발명은 생체분자 및 생화학 반응을 감지하는 나노갭 장치를 조립하는 방법을 제공한다. 도 3은 하향식 방식으로 표준 반도체 제조 기술을 이용하여 2개의 나노전극으로 구성된 나노갭을 제조하는 개략도를 보여준다. 따라서, 나노갭은 고수율 및 저비용으로 제조될 수 있다. 나노갭을 분자 와이어와 연결하기 위해, 도 4에 나타낸 바와 같이, 상향식 분자 리소그래피를 적용하여 나노장치 조립의 전체 과정을 완료한다.
일부 실시양태에서, 나노갭은 2개의 전극을 포함하고, 이들 사이의 거리는 3 nm 내지 1000 nm, 바람직하게는 5 nm 내지 100 nm, 가장 바람직하게는 5 nm 내지 30 nm이다. 전극의 말단 표면은 3 nm 내지 1 ㎛, 바람직하게는 5 nm 내지 30 nm 범위 내의 폭과, 3 nm 내지 100 nm, 바람직하게는 5 nm 내지 30 nm 범위 내의 높이를 가진 실질적으로 직사각형이다. 상기 전극은 귀금속, 예를 들면, 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag), 팔라듐(Pd), 로듐(Rd), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os), 이리듐(Ir) 또는 다른 금속, 예컨대, 구리(Cu), 레늄(Re), 티타늄(Ti), 니오븀(Nb), 탄탈룸(Ta), 및 이들의 유도체, 예컨대, TiN 및 TaN 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 나노갭은 절연 층에 의해 분리된 상이한 평면에 있는 2개의 전극에 의해 형성된다(도 6 참조)(참고문헌 US62994712). 절연 층의 두께는 2 nm 내지 1000 nm, 바람직하게는 5 nm 내지 30 nm 범위 내에 있다. 절연 물질은 SiNx, SiOx, HfOx, Al2O3, 다른 산화금속, 및 반도체 산업에서 사용되는 임의의 유전체로 구성된 군으로부터 선택되나, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 나노갭을 나노와이어와 연결함으로써 나노접합체를 형성한 후, 소정의 위치에서 감지 분자를 부착시킨다. 상기 나노와이어는 2개의 금속화된 또는 전도성 중합체 접합된 나노와이어 분절에 의해 플랭킹된 반전도성 DNA 이중체 분절을 포함한다. 감지 분자는 중간에서 DNA 이중체에 부착된다. 부착된 감지 분자 및 반전도성 DNA 이중체는 "FET"로서 지칭되는 힘 효과 트랜지스터를 구성한다. 감지 분자는 그의 수용체 또는 기질과 상호작용할 때 그의 입체구조를 바꾼다. 이것은 DNA에 힘을 발휘하고 그의 염기 적층을 방해함으로써, 나노와이어를 통해 흐르는 전류의 변동을 유도한다. 그 후, 분자적 사건에 대한 반응을 나타내는 전류 신호가 기록되고, 분자 상호작용 또는 반응이 유추된다. 예를 들면, 감지 분자가 DNA 중합효소일 때, 전기 신호를 기록함으로써 뉴클레오타이드를 DNA 프라이머 내로 혼입하는 중합효소의 과정을 모니터링할 수 있다. 항체를 감지 분자로서 사용할 때, 이 나노접합 장치를 이용하여 항원을 검출할 수 있거나 그 반대의 경우도 가능하다. 유사하게, 수용체를 감지 분자로서 사용하고, 샘플 중의 그의 리간드를 확인할 수 있거나, 그 반대의 경우도 가능하다.
도 1: 나노갭 DNA 접합에 의해 측정된, 고체 기판 상의 GC 염기쌍으로 구성된 DNA의 전도성. DNA 분자(30개 염기쌍, 이중 가닥 폴리(G)-폴리(C))는 길이가 10.4 nm이고, 나노전극 갭은 폭이 8 nm이다. 실온 및 50% 공기 습도에서 2개의 금속 나노전극들 사이에 포획된 DNA 분자에 대해 측정된 전류 ± 전압 곡선. 후속 I 내지 V 곡선은 유사한 거동을 보이나, 전압 갭의 폭의 변경을 가진다.
도 2: STM 절단 접합에 의해 측정된, 용액 중의 GC 염기쌍으로 구성된 DNA의 전도성. (a) 폴리(GC)8 DNA 이중체의 전도도 히스토그램; (b) (b) (GC)n의 전도도 대 1/길이.
도 3: 나노갭을 제조하는 하향식 과정을 보여준다.
도 4: 감지 분자가 부착되어 있는 나노접합체를 제조하는 상향식 분자 리소그래피 과정을 보여주고, 이때 효소는 감지 분자의 일례로서 표시되어 있다.
도 5: 나노갭에서 점점 가늘어지는 전극 말단 표면, 및 나노갭 아래의 게이트 전극을 보여준다.
도 6: 절연 층에 의해 분리된 상이한 평면에 있는 전극에 의해 형성된 수직 나노갭을 보여준다.
도 3은 하향식 반도체 제조 방식을 이용하여 20 nm 미만의 거리에 의해 분리된 2개의 전극을 포함하는 나노갭을 제조하는 과정을 묘사한다. EBL에 의해 질화규소 절연 층(102)으로 코팅된 규소 기판(103) 상에서 백금 와이어(101)를 제조한 후, 유전체 CAP 층(104)에 이어 경질 차폐제(HM) 층(105)을 침착시킨다. 포토레지스트(106) 상에서 EBL 패턴화로 나노갭을 제조한 후, HM RIE, CAP, Pt RIE 및 HM을 제거한다.
도 4는 상기 나노갭으로 나노접합체를 조립하는 상향식 방식을 묘사한다. 먼저, 나노갭(206)을 정의하는 2개의 전극의 측벽에 DNA 앵커(201)를 부착시킨다. 그 다음, DNA 와이어(202)를 DNA 앵커에 하이브리드화시켜 나노갭을 연결함으로써, 2개의 닉(nick)을 가진 이중 가닥 DNA로 구성된 나노접합체(208)를 형성한다. 라이게이션 반응으로 상기 닉을 닫음으로써, 반전도성 DNA 이중체 분절(209)을 생성한다. 이어서, 단백질 필라멘트(205)를 첨가하여 중간 부분(210)을 차폐한 후, 금속 입자를 플랭크 분절 상에 침착시켜 반전도성 분절의 양 말단에서 전도성 와이어(211)를 생성한다. 단백질 필라멘트를 제거한 후, 효소, 중합효소 또는 항체와 같은 감지 분자(212)를 부착시키기 위해 반전도성 DNA 이중체 분절을 노출시킨다. 이 과정은 생체분자 감지 나노장치를 생성하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 DNA 앵커(201)는 상이한 말단에서 DNA 와이어(202)에 일치하는 서열을 가진 짧은 올리고뉴클레오타이드 세트(201-a 및 201-b)이다. 프로브(앵커) 올리고(201-a)는 202-a 및 202-b의 부분 둘 다에 일치한다. 동일한 방식으로, 201-b는 202-c 및 202-d의 부분 둘 다에 일치한다. 프로브 올리고(201-a 및 201-b)에 대한 서열은 동일하거나 상이하다. 이들 각각이 나노갭을 구성하는 개별 전극에 각각 부착될 때, 이들은 DNA 와이어(202)를 포획하여 닉을 함유하는 이중체를 형성한다. 라이게이션 반응 후, 완전한 이중체가 형성되고, 이의 중간 부분은 반전도성 분절(209)을 포함하고, 이의 나머지 부분은 전도성, 반전도성 또는 비전도성을 가질 수 있다. 202와 201의 하이브리드화(포획)를 위한 상보성 요구로 인해, 나노갭 크기를 조립된 분자 와이어(209)의 길이에 일치시킬 필요가 있다.
또 다른 실시양태에서, 먼저 DNA 앵커(201)를 DNA 와이어(202)에 하이브리드화시켜, 라이게이션에 의해 채워질 닉을 가진 DNA 이중체를 형성한 후, 2개의 전극에 부착시켜 나노접합체를 형성한다. 접합체 형성의 성공률을 증가시키기 위해, 전극의 말단은 DNA 이중체의 착지 및 부착을 용이하게 하도록 역사다리꼴 기하구조로서 점점 가늘어질 수 있다(도 5의 예시 참조(참고문헌 US62/833870)).
일부 실시양태에서, DNA 앵커는 전극에 부착되도록 구성된 작용기를 함유한다. 작용기는 (a) 뉴클레오사이드의 당 고리 상의 티올; (b) 뉴클레오사이드의 핵염기 상의 티올 및 셀레놀; (c) 뉴클레오사이드 상의 지방족 아민; (d) 뉴클레오사이드 상의 카테콜; (e) RXH 및 RXXR, 이때 R은 지방족 또는 방향족 기이고, X는 S 및 Se를 선호하는 칼코겐임; 및 (f) 염기 칼코겐화된 뉴클레오사이드를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 이 작용기들의 상세한 설명에 대해서는 미국 특허 제US62/812,736호를 참조한다.
일부 실시양태에서, 제3 전극인 게이트 전극을 도입하고(도 5 참조(참고문헌 US62/833870)), 기준 전압을 인가하여 나노와이어의 전도성을 조절한다. 게이트 전극은 제2 절연 층에 의해 제1 전극 및 제2 전극으로부터 분리된다.
또 다른 실시양태에서, DNA 앵커(201)와 DNA 와이어(202)를 전극에 부착시키기 전에 하이브리드화시키고 라이게이션시키거나, DNA 이중체(209)의 동일한 서열을 가진 사전조립된 DNA 이중체로 단순히 대체한다. 사전조립된 DNA 이중체를 나노갭에서 2개의 전극에 부착시켜 나노접합체를 형성한 후, 단백질 필라멘트를 중간 부분에 부착시키고(차폐) 측면 부분을 금속화하고 최종 감지 분자를 부착시킨다(도 4 참조). 다시 말해, 더 우수한 부착을 위해 또는 사전조립된 DNA 이중체의 길이보다 더 작거나 이 길이와 동등한 갭을 위해 점점 가늘어지는 전극이 요구될 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노와이어는 한 말단에서만 금속화된 또는 접합된 전도성 중합체 분절에 의해 플랭킹된 반전도성 DNA 이중체 분절을 포함한다. 감지 분자는 반전도성 DNA 이중체 분절 상의 소정의 위치에 부착된다.
일부 실시양태에서, 선행 가출원 제US62/794096호 및 제US62/833870호에 개시된 방법을 이용함으로써 구축된 사전조립된 DNA 나노구조물을 DNA 이중체(209) 대신에 사용하여 전극에 직접 부착시킴으로써, 차폐를 위한 DNA/단백질 필라멘트(205)와 호환 가능한 중간 부분을 가진 나노접합체를 형성한 후, 도 4의 남은 단계를 수행하여 생체감지 나노장치 구축을 완료한다. 이 사전조립된 DNA 나노구조물의 예는 차폐를 위한 단백질 필라멘트와 호환 가능한 중간 부분을 가진 천연, 비천연, 변형된 또는 합성된 단일 DNA 또는 RNA 이중체, DNA/RNA 혼합된 이중체, 이중 DNA 이중체, 삼중 DNA 이중체, DNA 오리가미 구조물, DNA 나노구조물, 펩타이드 나노구조물, PNA(펩타이드 핵산) 나노구조물, 혼합된 DNA/PNA 나노구조물 또는 임의의 DNA 또는 RNA 또는 PNA 나노구조물, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않고, 이때 상기 중간 부분은 높은 GC 함량(약 51% 내지 95%)을 가진 DNA 이중체일 수 있거나, DNA 이중체가 반전도성 또는 전도성을 갖게 만드는 변형된 DNA 염기를 가진 DNA 이중체일 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 와이어(202)와 DNA 앵커(201)는 생성된 DNA 이중체(209)가 그의 전체 길이에서 이중 가닥이도록 전체 길이에 걸쳐 상보적이다. 일부 다른 실시양태에서, DNA 와이어(202)는 나노갭 크기보다 더 짧아 DNA 앵커(201)와 완전히 상보적이지 않음으로써, 양 말단에서 플랭킹된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 가진 DNA 이중체(209)를 형성한다. DNA 이중체(209)는 모두 이중 가닥이거나 단일 가닥 말단 분절을 가진 부분적 이중 가닥이고, 생체감지 나노장치를 구축하는 남은 과정은 도 4의 과정과 동일하다. 단일 또는 이중 가닥 측면(말단) 분절의 금속화 과정은 유사하다.
일부 실시양태에서, DNA 이중체(209)의 중간 부분은 소정의 뉴클레오타이드(위치)에서 작용기를 갖고, 이 작용기는 감지 분자와 같은 다른 독립체를 와이어에 연결하기 위한 화학 반응을 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 이중체(209)의 말단 분절은 하기 예시된 구조를 가진 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure pct00001
상기 식에서, n은 3 내지 100이고; R 및 R'는 상기 나열된 다양한 작용기들일 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 포스페이트/포스포로티오에이트(PO/PS) 키메라 올리고데옥시리보뉴클레오타이드는 자동화된 DNA 합성기에서 합성될 수 있다11. 도 4의 상기 라이게이션은 R과 R' 사이의 자율적인 화학 반응 또는 효소 촉매작용 과정일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 필라멘트(205)는 DNA 와이어(202)의 반전도성 중간 분절(또는 DNA 이중체(209)의 중간 부분)의 서열과 상보적이거나 유사한(핵산 이중체 분절에 대한 적어도 약 50% 서열 상동성을 가진) 서열을 가진 단일 가닥 DNA(203), 및 이 단일 DNA 가닥 상에서 중합될 수 있는 RecA 단백질과 같은 단백질(204)을 포함한다12. 상기 필라멘트는 상동성 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합할 수 있고 분자 리소그래피를 위한 차폐제로서 사용될 수 있다10. 일부 실시양태에서, 상기 필라멘트(205)는 DNA 이중체의 말단 분절 상에서의 금속 침착(도금)을 위한 차폐제(210)로서 DNA 이중체(209)의 반전도성 부분에 결합한다.
한 실시양태에서, DNA 금속화의 일례로서, 먼저 금속 티올 공유결합을 통해 약 1.0 nm 은 나노입자를 포스포로티오에이트에 시딩한 후 물로 세척하여 과량의 은 나노입자를 제거함으로써 상기 금속 나노와이어(211)를 제조한다. 이어서, 1:1 비로 KAuCl4(0.06 M)과 혼합된 KSCN(0.6 M)의 용액을 나노접합체 영역에 첨가한 후, 금 도금 용액과 함께 동일 부피의 하이드로퀴논(25 mM)을 첨가한다. 나노접합체를 60초 동안 용액에서 인큐베이션한다. 그 다음, 용액을 플래시 아웃하고(flash out), 나노접합체를 물로 린싱한다. 그 결과, 금 나노와이어가 DNA 접합체의 두 측면 분절들에서 형성된다. 순차적으로, 표면 상에서 친수성 단일층, 예를 들면, 올리고(에틸렌 글리콜) 단일층을 형성함으로써 금 와이어를 부동화하여 비특이적 흡착을 방지한다. 단백질분해효소 K를 사용한 단백질 분해로 필라멘트 차폐제를 제거하여 반전도성 DNA 분절을 노출시킨다.
일부 실시양태에서, 시딩 나노입자는 은 대신에 금이다. 제1 전극 및/또는 제2 전극과 동일하거나 상이한 귀금속은 나노입자 유도 무전해 도금에 의해 DNA 나노접합체 상에 침착된다. 귀금속은 Au, Ag, Pd, Pt, Rd 등을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 도금 과정은 소정의 위치에서 상이한 금속을 특이적으로 침착시키는 전기화학적 과정에 의해 수행된다.
일부 실시양태에서, DNA/단백질 필라멘트 차폐제(205)를 사용하지 않으면서 잘 정의된 금속 나노입자 시딩으로 금속을 DNA 이중체 상에 침착시킨다.
일부 실시양태에서, DNA 이중체(209)의 포스포로티오에이트 기는 4-브로모부티르알데하이드와 반응하여, 하기 표시된 알데하이드 작용화된 포스포로티오에이트를 생성한다:
Figure pct00002
상기 알데하이드는 금속 이온 용액, 예를 들면, AgNO3 용액을 사용한 시딩을 위한 환원제이다. 하기 표시된 구조를 가진 다른 알데하이드도 포스포로티오에이트를 작용화하는 데 사용될 수 있다:
Figure pct00003
일부 실시양태에서, DNA 이중체(209)의 말단 분절의 금속화는 전도성 중합체를 DNA 분절에 함께 연결하는 것으로 대체될 수 있다. DNA 앵커(201)는 그의 핵염기에 부착된 전도성 중합체(CP)의 단량체, 또는 보다 일반적으로 DNA 이중체(209)의 단일 가닥 말단 분절에 커플링된 전도성 중합체 단량체를 가진다. 하기 단량체들을 포함하나 이들로 제한되지 않는 단량체의 구조는 아래에 표시된다:
Figure pct00004
이 단량체들은 아래에 표시된 바와 같이 아민에 의해 작용화된 핵염기를 가진 변형된 뉴클레오사이드에 부착될 수 있다:
Figure pct00005
따라서, 이 작용화된 뉴클레오사이드는 자동화된 DNA 합성기에 의해 DNA 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입될 수 있다. 테르피롤-유리딘 포스포라미다이트(11)의 합성예는 실시예 단락에 기재되어 있다. 상기 포스포라미다이트(11)는 자동화된 DNA 합성기에 의해, 예를 들면, 서열 CXA GXT AXC GXC를 가진 DNA 내로 혼입되고, 이때 X는 테르피롤 단량체를 가진 유리딘이다. DNA는 전극에 부착시키기 위한 앵커로서 사용된다. 이것은 DNA 와이어와 하이브리드화하여 나노갭에서 나노접합체를 형성하고, 이들은 함께 라이게이션된다. 단백질 필라멘트 차폐제를 반전도성 분절에 첨가한다. 그 다음, 선행 기술 방식에 따라 중성 pH의 수용액에서 전기화학적 산화로 테르피롤 단량체를 중합한다13. 차폐제 제거 후, 나노접합체는 감지 분자에 의해 작용화될 준비가 된다. 대안적으로, 단백질 필라멘트 차폐제(205)를 사용하지 않으면서 전체 DNA 이중체(209)를 따라 테르피롤 단량체를 함께 연결하고 중합한다.
일부 실시양태에서, 아민 작용화된 뉴클레오사이드를 가진 DNA 올리고뉴클레오타이드를 합성함으로써 CP 단량체를 가진 상기 DNA 앵커를 먼저 제조한 후, 활성화된 카르복실레이트와 아민을 반응시켜 CP 단량체를 올리고뉴클레오타이드에 커플링시킨다.
일부 실시양태에서, DNA 나노접합체에서 상기 전도성 중합체는 화학적 또는 효소적 산화에 의해 합성되고, 이것은 선행 기술에서 입증되었다14,15.
일부 다른 실시양태에서, 전도성 중합체는 말단 분절로 제한되지 않는 전체 DNA 이중체(209)에 걸쳐 연결되어, DNA 스카폴드에 연결된 전도성 중합체를 포함하는 전체 나노접합체를 만든다. 한편, 아지드, 티올 및 이의 유도체와 같은 일부 작용기들은 감지 분자의 부착을 위해 DNA 이중체를 따라 소정의 위치에 배치된다.
일부 실시양태에서, 단백질 필라멘트 차폐제를 사용하거나 사용하지 않으면서 수용액에서 전도성 중합체 단량체를 DNA 주형 또는 스카폴드에 접합시켜 전도성 나노와이어를 먼저 형성한 후, 상기 나노와이어를 제1 전극 및 제2 전극에 부착시켜 나노갭을 연결함으로써 전도성 나노접합체를 형성한다.
다른 실시양태에서, 첫 번째로, 단백질 필라멘트 차폐제를 사용하거나 사용하지 않으면서 수용액에서 전도성 중합체 단량체를 DNA 주형 또는 스카폴드 상에 침착시키고; 두 번째로, DNA 주형 또는 나노와이어를 제1 전극 및 제2 전극에 부착시켜 나노갭을 연결하고; 세 번째로, 전도성 중합체 단량체를 산화시켜 나노와이어 전도성을 향상시킴으로써, 전도성 나노접합체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 나노와이어 또는 이의 언더라인(underline) DNA 또는 중합체 스카폴드 또는 주형은 제1 전극 및 제2 전극에의 부착을 위해 그의 말단에서 아지드, 알킨 또는 티올 및 이의 유도체와 같은 작용기를 가진다.
일부 실시양태에서, DNA 나노와이어(209)는 말단에서 단일 가닥 분절을 가진 이중체 또는 이중체의 혼합물이다. 일부 실시양태에서, DNA 나노와이어(209)는 삼중체이거나, 이중체, 삼중체 및 단일 가닥 분절의 혼합물이다.
일부 실시양태에서, 전도성 중합체는 말단에서 DNA 나노와이어에 연결되어, DNA 전도성 중합체 접합된 나노와이어를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA 스카폴드 언더라인 금속화된 DNA 나노와이어 분절(들)은 금속화될 수 있고 DNA 이중체 나노와이어 분절에 연결될 수 있는 임의의 중합체로 대체될 수 있고, 상기 중합체는 전도성, 반전도성 또는 비전도성을 갖고, 천연 또는 또는 비천연 중합체이다.
상기 모두에서, 전도성 중합체는 폴리피롤(PPY), 폴리티오펜(PT), 폴리아닐린(PANI), 폴리(p-페닐렌 설파이드)(PPS), 폴리(아세틸렌)(PAC), 폴리(p-페닐렌 비닐렌)(PPV), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(PEDOT), 폴리(플루오렌), 폴리페닐렌, 폴리피렌, 폴리아줄렌, 폴리나프탈렌, 폴리카르바졸, 폴리인돌, 폴리아제핀 등으로 구성된 군으로부터 선택되나, 이들로 제한되지 않는다. 처음 3개의 중합체들, 즉 PPY, PT 및 PANI는 합성이 상대적으로 용이하므로 선호된다.
일부 실시양태에서, 감지 분자는 천연, 돌연변이된, 발현된 또는 합성된 핵산 프로브, 분자 핀셋, 효소, 수용체, 리간드, 항원 및 항체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되나, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 감지 분자는 천연, 돌연변이된 또는 합성된 DNA 중합효소, RNA 중합효소, DNA 헬리카제(helicase), DNA 리가제(ligase), DNA 엑소뉴클레아제(exonuclease), 역전사효소, RNA 프리마제(primase), 리보좀, 수크라제(sucrase), 락타제(lactase) 등을 포함하나 이들로 제한되지 않는 효소이다.
일부 실시양태에서, 감지 분자는 중합효소 패밀리인 A, B, C, D, X, Y 및 RT로부터의 임의의 중합효소를 포함하나 이들로 제한되지 않는 DNA 중합효소이다. 예를 들면, 패밀리 A의 DNA 중합효소는 T7 DNA 중합효소 및 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus) 중합효소 I을 포함하고; 패밀리 B의 DNA 중합효소는 T4 DNA 중합효소, Phi29 DNA 중합효소 및 RB69를 포함하고, 패밀리 C의 DNA 중합효소는 이. 콜라이 DNA 중합효소 III을 포함한다. DNA 중합효소의 RT(역전사효소) 패밀리는 예를 들면, 레트로바이러스 역전사효소 및 진핵생물 텔로머라제(telomerase)를 포함한다.
일부 다른 실시양태에서, 감지 분자는 바이러스 RNA 중합효소, 예컨대, T7 RNA 중합효소; 진핵생물 RNA 중합효소, 예컨대, RNA 중합효소 I, RNA 중합효소 II, RNA 중합효소 III, RNA 중합효소 IV 및 RNA 중합효소 V; 및 고세균 RNA 중합효소를 포함하나 이들로 제한되지 않는 RNA 중합효소이다.
Figure pct00006
일부 실시양태에서, 클릭(click) 반응을 이용하여 감지 분자를 나노접합체에 부착시킨다. 일례로서, 본 발명자들의 PCT 출원(WO 2020/150695)에 개시된 방법에 따라, 아지드에 의해 작용화된 감지 분자를 부착시키기 위해 아세틸렌을 함유하는 뉴클레오사이드를 전도성 DNA 분절 내로 혼입한다. 이의 구조는 아래에 표시되어 있다.
일부 실시양태에서, 부착된 나노와이어 및 감지 분자를 가진 단일 나노갭 장치의 모든 특징들을 각각 가진 복수의 나노갭 장치들은 생체중합체 감지 또는 시퀀싱의 고처리율 요건에 근거한 나노갭 장치의 수가 나노칩, 고체 표면 또는 웰에서 10 내지 109, 바람직하게는 103 내지 107 또는 보다 바람직하게는 104 내지 106인 어레이 포맷으로 제조될 수 있다. 상기 어레이에서 모든 나노갭 장치들은 한 유형의 감지 분자 또는 상이한 유형의 감지 분자를 갖도록 구성된다.
실시예
하기 표시된 경로를 따라 에틸 2-(2,5-디브로모-1H-피롤-일)아세테이트(4)를 합성한다:
Figure pct00007
먼저, 에틸 2-(1H-피롤-일)아세테이트(3)를 변형된 선행 기술(WO 2011/094823)의 절차에 따라 합성한다. 2,5-디메톡시테트라하이드로퓨란(2, 1.0 당량)을, 적절한 용매, 예컨대, 공용매인 물/아세트산(1:2) 중의 에틸 글리시네이트(1, 1.0 당량) 및 아세트산나트륨(1.7 당량)의 환류 용액에 첨가한다. 용액을 약 4시간 동안 환류시키고 물로 희석하고 포화된 NaHCO3 수용액으로 중화시키고 CH2Cl2 으로 추출한다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고 여과하고 회전 증발로 농축한다. 잔사를 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피로 분리하고, 50% 초과의 수율로 원하는 화합물(3)을 수득한다. 그 다음, 브롬화된 피롤(4)을 문헌16에 보고된 절차에 따라 합성한다. 무수 DMF 중의 N-브로모석신이미드(NBS, 2.0 당량)의 용액을 0℃에서 무수 THF 중의 화합물(3)(1.0 당량)의 용액에 적가한다. 첨가 후, 혼합물을 30분 동안 교반한다. 반응이 끝날 때까지 반응을 TLC로 모니터링하고 물을 첨가하여 반응을 중단시키고 클로로포름으로 3회 추출한다. 합한 유기 용액을 물로 세척하고 MgSO4 상에서 건조하고 여과하고 증발시켜 용매를 제거한다. 잔사를 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피로 분리하여, 90% 초과의 수율로 원하는 생성물을 제공한다.
(1-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1H-피롤-2-일)보론산(6)을 문헌17에 보고된 절차에 따라 합성한다:
Figure pct00008
리튬 2,2,6,6-테트라메틸피페리다이드(LiTMP)의 용액을 아르곤 하에서 -78℃에서 무수 THF 중의 1-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1H-피롤(5) 용액에 적가한다. 용액을 -78℃에서 4시간 동안 교반한 후, 트리에틸보레이트((EtO)3B)를 적가한다. 혼합물을 실온까지 가온하고 추가 12시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 포화된 NH4Cl 용액으로 켄칭하고 40분 동안 교반한다. 현탁액을 포화된 NaHCO3 수용액으로 중화시키고 20분 동안 교반한다. 용액을 에테르로 3회 추출한다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 용매를 회전 증발로 제거한다. 잔사를 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피로 분리하여 원하는 생성물(6)을 수득한다.
하기 표시된 경로를 따라 2-(1,1''-비스((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1H,1'H,1''H-[2,2':5',2''-테르피롤]-1'-일)아세트산(8)을 합성한다:
Figure pct00009
먼저, 문헌18에 보고된 방법을 기반으로 테르피롤 에스테르를 합성한다. 테르피롤 피롤보론산(6)(2.3 당량), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(10 몰%), 탄산나트륨(8 당량) 및 염화칼륨(3 당량)을 소산시키고 아르곤으로 2회 씻어낸다. 그 다음, 탈기된 톨루엔(20 ㎖), 디브로모피롤(4)(1 당량), 탈기된 에탄올 및 물을 첨가한다. 혼합물을 95℃에서 18시간 동안 가열하고 냉각시키고, 용매를 회전 증발로 제거한다. 잔사를 클로로포름으로 3회 추출하고, 합한 유기 상을 염수로 세척하고 Na2SO4 상에서 건조하고 여과한다. 용매를 회전 증발로 제거한다. 잔사를 실리카 겔 구배 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 원하는 테르피롤 에스테르(7)를 제공하고, 이 테르피롤 에스테르를 문헌19에 보고된 약한 가수분해 절차에 따라 그의 상응하는 카르복실산(8)으로 전환시킨다. 상기 에스테르를 2 부피%의 물을 함유하는 CH3CN에 용해시킨다(10 ㎖/에스테르 1 g). 트리에틸아민(3 당량)을 첨가한 후, LiBr(10 당량)을 첨가한다. 혼합물을 실온에서 격렬히 교반하고, 생성물을 실리카 겔 구배 컬럼 크로마토그래피로 분리한다.
하기 표시된 경로를 따라 2-(1,1''-비스((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1H,1'H,1''H-[2,2':5',2''-테르피롤]-1'-일)-N-(3-(데옥시유리딘-5-일)프로프-2-인-1-일)아세트아미드(10)를 합성한다:
Figure pct00010
HATU(2.0 당량) 및 DIEA(3.0 당량)를 0℃에서 DMF 중의 화합물(8)(200 mg, 1.0 당량) 용액에 첨가한 후, 5-(3-아미노프로프-1-인-1-일)-데옥시유리딘(9)(1.1 당량)을 첨가한다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 물로 희석하고 에틸 아세테이트로 3회 추출한다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조하고 여과하고 회전 증발로 농축한다. 잔사를 실리카 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피로 분리하여, 원하는 생성물(10)을 제공한다.
하기 표시된 경로를 따라 5'-O-디메톡시트리틸-2-(1,1''-비스((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1H,1'H,1''H-[2,2':5',2''-테르피롤]-1'-일)-N-(3-(데옥시유리딘-5-일)프로프-2-인-1-일)아세트아미드-3'-O-(2-칸노틸-N,N-디이소프로필포스포라미다이트(11)를 합성한다:
Figure pct00011
먼저, 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(1.30 mmol)를 피리딘(3 ㎖) 중의 변형된 데옥시유리딘(10)(1.18 mmol) 용액에 첨가한다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC 분석은 소량의 출발 물질의 존재를 표시하였다. 추가 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드를 첨가하여 반응을 완료시킨다. 혼합물을 물(50 ㎖)에 붓고 염화메틸렌(3회, 50 ㎖)으로 추출한다. 합한 유기 상을 물로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조한다. 염화메틸렌/메탄올(95:5)의 혼합물을 용출제로서 사용하여 실리카 겔 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피로 생성물을 분리한다. 이어서, 트리틸화된 생성물(0.57 mmol) 및 디이소프로필암모늄 테트라졸라이드(0.57 mmol)를 염화메틸렌(6 ㎖)에 용해시킨다. 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트(0.66 mmol)를 용액에 첨가한다. 용액을 약하게 휘젓고, 1.5시간 동안 실온에서 질소 하에서 방치한 후, 에틸 아세테이트로 희석하고 물로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조한다. 에틸 아세테이트/트리에틸아민(98:2)의 혼합물을 용출제로서 사용하여 크로마토트론(chromatotron) 상에서 실리카 겔 크로마토그래피로 생성물을 분리하였다. 화합물(11)을 포말 고체로서 수득한다.
일반적인 논평:
본원에서 언급된 모든 간행물들, 특허들, 특허출원들 및 다른 문헌들은 전체적으로 참고로 포함된다. 달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 용어들 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본 발명은 다양한 실시양태들의 설명에 의해 예시되고 이 실시양태들이 상당히 상세히 기재되어 있지만, 본원의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하거나 한정하는 것은 본 출원인의 의도가 아니다. 추가 장점 및 변형은 당분야에서 숙련된 자에게 용이하게 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 그의 보다 넓은 측면에서 구체적인 세부사항, 대표적인 장치, 장비 및 방법, 및 제시되고 기재된 예시적인 예로 제한되지 않는다. 따라서, 본 출원인의 일반적인 발명적 개념의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 이러한 세부사항으로부터 벗어날 수 있다.
참고문헌
Figure pct00012

Claims (63)

  1. 생체중합체의 확인, 특징규명 또는 시퀀싱을 위한 시스템으로서,
    a. 기판;
    b. 기판 상에 서로 인접하여 배치된 제1 전극과 제2 전극에 의해 형성된 나노갭;
    c. 나노와이어의 한 말단을 제1 전극에 부착시키고 나노와이어의 또 다른 말단을 제2 전극에 부착시킴으로써, 나노갭에 근접하도록 구성되고 나노갭을 연결하도록 구성된 치수를 가진 나노와이어로서, 핵산 이중체 분절의 말단에서 적어도 금속화된 중합체 분절 또는 적어도 전도성 중합체 분절에 의해 플랭킹된 핵산 이중체 분절을 포함하는 나노와이어;
    d. 나노와이어 상의 핵산 이중체 분절에 부착되도록 구성되고 생체중합체와 상호작용하거나 생화학 반응을 수행하도록 구성된 감지 분자;
    e. 제1 전극과 제2 전극 사이에 인가되도록 구성된 바이어스 전압;
    f. 감지 분자의 활성에 의해 유도된, 나노와이어를 통한 전류 변동을 기록하도록 구성된 장치; 및
    g. 생체중합체 또는 생체중합체의 서브유닛을 확인하거나 특징규명하는 데이터 분석을 위해 구성된 소프트웨어
    를 포함하는, 생체중합체의 확인, 특징규명 또는 시퀀싱을 위한 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 기판과 제1 전극 및 제2 전극 사이에 절연 층(1)을 추가로 포함하는 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 전극의 상부에 유전체 캡 층을 추가로 포함하는 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    a. 절연 층(2)에 의해 제1 전극 및 제2 전극으로부터 분리된 게이트(gate) 전극; 및
    b. 게이트 전극에 인가되도록 구성된 기준 전압
    을 추가로 포함하는 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 생체중합체가, DNA, RNA, 올리고뉴클레오타이드, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 상기 언급된 생체중합체들 중 임의의 유사체, 상기 언급된 생체중합체들 중 임의의 천연의, 변형된 또는 합성된 것, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 감지 분자가 천연, 돌연변이된, 발현된 또는 합성된, 핵산 프로브, 분자 핀셋, 효소, 수용체, 리간드, 항원 및 항체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 시스템.
  7. 제6항에 있어서, 효소가, DNA 중합효소, RNA 중합효소, DNA 헬리카제, DNA 리가제, DNA 엑소뉴클레아제, 역전사효소, RNA 프리마제, 리보좀, 수크라제, 락타제, 상기 언급된 효소들 중 임의의 천연의, 돌연변이된, 발현된 또는 합성된 것, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 시스템.
  8. 제7항에 있어서, DNA 중합효소 또는 효소가, Φ29 DNA 중합효소, T4 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, Taq 중합효소, RB69 중합효소, DNA 중합효소 X, DNA 중합효소 Y, DNA 중합효소 Pol I, Pol II, Pol III, Pol IV 및 Pol V, Pol α(알파), Pol β(베타), Pol σ(시그마), Pol λ(람다), Pol δ(델타), Pol ε(엡실론), Pol μ(뮤), Pol Ι(이오타), Pol κ(카파), Pol η(에타), 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제, 레트로바이러스 역전사효소, 텔로머라제, 상기 언급된 효소들 중 임의의 천연의, 돌연변이된, 발현된 또는 합성된 것, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 시스템.
  9. 제7항에 있어서, RNA 중합효소가 천연, 변형된, 발현된 또는 합성된, T7 RNA 중합효소, 임의의 바이러스 RNA 중합효소, RNA 중합효소 I, RNA 중합효소 II, RNA 중합효소 III, RNA 중합효소 IV, RNA 중합효소 V, 임의의 진핵생물 RNA 중합효소, 임의의 고세균 RNA 중합효소, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 시스템.
  10. 제1항에 있어서, 감지 분자가 클릭(click) 반응을 통해 소정의 위치에서 나노와이어의 핵산 이중체 분절에 부착되도록 구성된 것인 시스템.
  11. 제1항에 있어서, 2개의 전극 사이의 나노갭 크기 또는 거리가 약 3 nm 내지 약 1000 nm, 바람직하게는 약 5 nm 내지 약 30 nm 범위 내에 있는 것인 시스템.
  12. 제1항에 있어서, 나노갭과 마주보는 전극의 말단 표면이 약 3 nm 내지 약 1 ㎛, 바람직하게는 약 5 nm 내지 약 30 nm 범위 내의 폭, 및 약 3 nm 내지 약 100 nm, 바람직하게는 약 5 nm 내지 약 30 nm 범위 내의 높이를 가진 실질적으로 직사각형인 시스템.
  13. 제1항에 있어서, 나노갭이 상부에서 나노와이어 길이보다 더 넓은 개구를 갖고 하부에서 나노와이어 길이보다 더 좁은 개구를 가진 대략적인 역사다리꼴 모양을 가진 것인 시스템.
  14. 제1항에 있어서, 전극이 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag), 팔라듐(Pd), 로듐(Rd), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os) 및 이리듐(Ir), 구리(Cu), 레늄(Re), 티타늄(Ti), 니오븀(Nb), 탄탈룸(Ta) 및 이들의 유도체, 예컨대, TiN 및 TaN, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 물질로부터 제조된 것인 시스템.
  15. 제1항에 있어서, 제1 전극과 제2 전극이 서로 중첩되고 절연 층에 의해 분리된 상이한 평면에 있고, 나노갭 크기가 절연 층의 대략적인 두께로 규정되는 것인 시스템.
  16. 제1항에 있어서, 핵산 이중체 분절이 중합체 금속화 또는 분자 리소그래피 차폐를 위해 단백질 필라멘트와 호환 가능하도록 구성된 것인 시스템.
  17. 제16항에 있어서, 단백질 필라멘트가 핵산 이중체 분절에 상보적인 단일 가닥 핵산 서열, 또는 핵산 이중체 분절에 대한 적어도 약 50% 서열 상동성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  18. 제1항에 있어서, 핵산 이중체 분절이 핵산 이중체 분절 전도성을 향상시키는 변형된 핵염기를 포함하고, 변형된 핵염기가 천연 또는 비천연 핵염기인 시스템.
  19. 제1항에 있어서, 핵산 이중체 분절이 감지 분자의 부착을 위한 작용기를 가진 변형된 핵염기를 포함하고, 변형된 핵염기가 천연 또는 비천연 핵염기인 시스템.
  20. 제19항에 있어서, 작용기가 아지드 또는 티올 기인 시스템.
  21. 제1항에 있어서, 금속화된 중합체 분절이 금속 입자를 중합체 기판 상에 시딩하고/하거나 침착시킴으로써 제조되고, 중합체 기판이 핵산 이중체 분절의 부분 또는 연장부이거나 핵산 이중체 분절에 연결된 중합체이고, 상기 중합체가 전도성, 반전도성 또는 비전도성, 또는 이들의 조합을 갖는 것인 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 금속 입자가 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag), 팔라듐(Pd), 로듐(Rd), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os) 및 이리듐(Ir), 및 제1 전극 및/또는 제2 전극과 동일한 금속, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 시스템.
  23. 제21항에 있어서, 시딩 금속 입자가 금 나노입자 또는 은 나노입자를 포함하는 것인 시스템.
  24. 제21항에 있어서, 금속화된 중합체 분절이 부동화(passivation) 단일층에 의해 덮이는 것인 시스템.
  25. 제21항에 있어서, 중합체가 천연, 비천연, 변형된 또는 합성된, DNA 이중체, RNA 이중체, DNA/RNA 이중체, 부분적 DNA 이중체, 부분적 RNA 이중체, 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, DNA 나노구조물, 펩타이드 나노구조물, PNA 나노구조물, 상기 언급된 생체중합체들 중 임의의 부분, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 시스템.
  26. 제1항에 있어서, 핵산 이중체 분절이 천연, 비천연, 변형된 또는 합성된, 이중 DNA 이중체, 삼중 DNA 이중체, DNA 오리가미(origami) 구조물, DNA 나노구조물, 펩타이드 나노구조물, PNA 나노구조물, 혼합된 DNA 및 PNA 나노구조물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 생체중합체 분절로 대체되고, 상기 생체중합체 분절이 감지 분자의 부착을 위한 작용기를 갖도록 구성되고 중합체 금속화 또는 분자 리소그래피 차폐를 위한 단백질 필라멘트와 호환 가능한 것인 시스템.
  27. 제1항에 있어서, 전도성 중합체 분절이 효소적, 전기화학적 또는 화학적 산화 접합, 또는 이들의 조합을 통해 전도성 중합체 단량체를 핵산 스카폴드 또는 기판 상에 코팅함으로써 제조된 것인 시스템.
  28. 제1항에 있어서, 전도성 중합체 분절이 천연, 비천연, 변형된 또는 합성된, 폴리피롤(PPY), 폴리티오펜(PT), 폴리아닐린(PANI), 폴리(p-페닐렌 설파이드)(PPS), 폴리(아세틸렌)(PAC), 폴리(p-페닐렌 비닐렌)(PPV), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(PEDOT), 폴리(플루오렌), 폴리페닐렌, 폴리피렌, 폴리아줄렌, 폴리나프탈렌, 폴리카르바졸, 폴리인돌, 폴리아제핀, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는 것인 시스템.
  29. 제1항에 있어서, 전도성 중합체가 감지 분자 부착을 위해 나노와이어의 중간에서 또는 중간 근처에서 함께 연결된 핵산 이중체 분절을 가진 전체 나노와이어 전체에 걸쳐 연장된 것인 시스템.
  30. 제1항에 있어서, 부착된 나노와이어 및 감지 분자를 가진 단일 나노갭 장치의 모든 특징들을 각각 가진 복수의 나노갭 장치들이 어레이 포맷으로 제작되도록 구성된 것인 시스템.
  31. 제30항에 있어서, 나노갭 장치의 수가 나노칩, 고체 표면 또는 웰에서 약 10 내지 약 109인 시스템.
  32. 제30항에 있어서, 나노갭 장치의 수가 약 104 내지 약 106인 시스템.
  33. 생체중합체의 확인, 특징규명 또는 시퀀싱을 위한 방법으로서,
    a. 기판을 제공하는 단계;
    b. 제1 전극과 제2 전극을 기판 상에 서로 인접하여 배치함으로써 나노갭을 형성하는 단계;
    c. 나노갭과 유사한 치수를 갖도록 구성된 나노와이어를 제공하는 단계로서, 상기 나노와이어가 그의 말단에서 적어도 중합체 분절에 의해 플랭킹된 핵산 이중체 분절을 포함하고, 상기 중합체 분절이 전도성을 갖고 핵산 이중체 분절에 연결되는 것인 단계;
    d. 나노와이어를 한 말단에서 제1 전극에 부착시키고 다른 말단에서 제2 전극에 부착시키는 단계;
    e. 감지 분자를 핵산 이중체 분절의 소정의 위치에 부착시키는 단계로서, 상기 감지 분자가 생체중합체와 상호작용하거나 생화학 반응을 수행하도록 구성된 것인 단계;
    f. 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스 전압을 인가하는 단계;
    g. 감지 분자의 활성에 의해 유도된, 나노와이어를 통한 전류 변동을 기록하도록 구성된 장치를 제공하는 단계; 및
    h. 생체중합체 또는 생체중합체의 서브유닛을 확인하거나 특징규명하는 데이터 분석을 위한 소프트웨어를 제공하는 단계
    를 포함하는 생체중합체의 확인, 특징규명 또는 시퀀싱을 위한 방법.
  34. 제33항에 있어서, 기판과 제1 전극 및 제2 전극 사이에 절연 층(1)을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 전극의 상부에 유전체 캡 층을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제33항에 있어서,
    a. 절연 층(2)에 의해 제1 전극 및 제2 전극으로부터 분리된 게이트 전극을 제공하는 단계; 및
    b. 기준 전압을 게이트 전극에 인가하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제33항에 있어서, 생체중합체가, DNA, RNA, 올리고뉴클레오타이드, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 상기 언급된 생체중합체들 중 임의의 유사체, 상기 언급된 생체중합체들 중 임의의 천연의, 변형된 또는 합성된 것, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  38. 제33항에 있어서, 감지 분자가 천연, 돌연변이된, 발현된 또는 합성된, 핵산 프로브, 분자 핀셋, 효소, 수용체, 리간드, 항원 및 항체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 효소가, DNA 중합효소, RNA 중합효소, DNA 헬리카제, DNA 리가제, DNA 엑소뉴클레아제, 역전사효소, RNA 프리마제, 리보좀, 수크라제, 락타제, 상기 언급된 효소들 중 임의의 천연의, 돌연변이된, 발현된 또는 합성된 것, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, DNA 중합효소 또는 효소가, Φ29 DNA 중합효소, T4 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, Taq 중합효소, RB69 중합효소, DNA 중합효소 X, DNA 중합효소 Y, DNA 중합효소 Pol I, Pol II, Pol III, Pol IV, Pol V, Pol α(알파), Pol β(베타), Pol σ(시그마), Pol λ(람다), Pol δ(델타), Pol ε(엡실론), Pol μ(뮤), Pol Ι(이오타), Pol κ(카파), Pol η(에타), 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제, 레트로바이러스 역전사효소, 텔로머라제, 상기 언급된 효소들 중 임의의 천연의, 돌연변이된, 발현된 또는 합성된 것, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, RNA 중합효소가 천연, 변형된, 발현된 또는 합성된, T7 RNA 중합효소, 임의의 바이러스 RNA 중합효소, RNA 중합효소 I, RNA 중합효소 II, RNA 중합효소 III, RNA 중합효소 IV, RNA 중합효소 V, 임의의 진핵생물 RNA 중합효소, 임의의 고세균 RNA 중합효소, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  42. 제33항에 있어서, 감지 분자가 클릭 반응을 통해 소정의 위치에서 나노와이어의 DNA 이중체 분절에 부착되도록 구성된 것인 방법.
  43. 제33항에 있어서, 2개의 전극 사이의 나노갭 크기 또는 거리가 약 3 nm 내지 약 1000 nm, 바람직하게는 약 5 nm 내지 약 30 nm 범위 내에 있도록 구성된 것인 방법.
  44. 제33항에 있어서, 나노갭과 마주보는 전극의 말단 표면이 약 3 nm 내지 약 1 ㎛, 바람직하게는 약 5 nm 내지 약 30 nm 범위 내의 폭, 및 약 3 nm 내지 약 100 nm, 바람직하게는 약 5 nm 내지 약 30 nm 범위 내의 높이를 가진 실질적으로 직사각형인 방법.
  45. 제33항에 있어서, 나노갭이 상부에서 나노와이어 길이보다 더 넓은 개구를 갖고 하부에서 나노와이어 길이보다 더 좁은 개구를 가진 대략적인 역사다리꼴 모양을 가진 것인 방법.
  46. 제33항에 있어서, 전극이 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag), 팔라듐(Pd), 로듐(Rd), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os), 이리듐(Ir), 구리(Cu), 레늄(Re), 티타늄(Ti), 니오븀(Nb), 탄탈룸(Ta) 및 이들의 유도체, 예컨대, TiN 및 TaN, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 물질로부터 제조된 것인 방법.
  47. 제33항에 있어서, 핵산 이중체 분절이 핵산 이중체 분절 전도성을 향상시키는 변형된 핵염기를 포함하는 것인 방법.
  48. 제33항에 있어서, 핵산 이중체 분절이 감지 분자의 부착을 위한 작용기를 가진 변형된 핵염기를 포함하는 것인 방법.
  49. 제33항에 있어서, 작용기가 아지드 또는 티올 기인 방법.
  50. 제33항에 있어서, 중합체 분절이 효소적, 전기화학적 또는 화학적 산화 접합, 또는 이들의 조합을 통해 전도성 중합체 단량체를 핵산 스카폴드 또는 기판에 코팅함으로써 제조되고, 핵산 스카폴드가 단일 가닥 핵산 서열, 이중 가닥 핵산 서열, 부분적 단일 가닥 및 부분적 이중 가닥 핵산 서열, 또는 중간 핵산 이중체의 연속적 부분, 또는 이들의 조합인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 전도성 중합체 단량체의 코팅이 나노와이어를 전극에 부착시키기 전 또는 후에 수행되는 것인 방법.
  52. 제33항에 있어서, 중합체 분절이 천연, 비천연, 변형된 또는 합성된, 폴리피롤(PPY), 폴리티오펜(PT), 폴리아닐린(PANI), 폴리(p-페닐렌 설파이드)(PPS), 폴리(아세틸렌)(PAC), 폴리(p-페닐렌 비닐렌)(PPV), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜)(PEDOT), 폴리(플루오렌), 폴리페닐렌, 폴리피렌, 폴리아줄렌, 폴리나프탈렌, 폴리카르바졸, 폴리인돌, 폴리아제핀, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는 것인 방법.
  53. 제33항에 있어서, 중합체 분절이 감지 분자 부착을 위해 나노와이어의 중간에서 또는 중간 근처에서 함께 연결된 핵산 이중체를 가진 나노와이어 전체에 걸쳐 연장된 것인 방법.
  54. 제33항에 있어서,
    1) 핵산 이중체 분절 또는 핵산 이중체 분절의 소정의 부분과 호환 가능하도록 구성된 단백질 필라멘트를 제공하는 단계;
    2) 인접 중합체 분절의 금속화를 위한 차폐제로서 단백질 필라멘트를 핵산 이중체 분절에 부착시키는 단계;
    3) 기판 또는 주형으로서 중합체 분절을 사용하는 분자 리소그래피 방식을 이용하여 중합체 분절을 금속화하는 단계; 및
    4) 핵산 이중체 분절로부터 단백질 필라멘트를 제거하는 단계
    를 단계 d 후 및 단계 e 전에 추가로 포함하고, 중합체 분절이 전도성, 반전도성 또는 비전도성을 가진 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 중합체 분절이 핵산 이중체 분절의 연속적 부분 또는 연장부인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 단백질 필라멘트가 핵산 이중체 분절에 상보적인 단일 가닥 핵산 서열, 또는 핵산 이중체 분절에 대한 적어도 약 50% 서열 상동성을 가진 서열을 포함하는 것인 방법.
  57. 제54항에 있어서, 중합체 분절의 금속화가 금속 입자를 중합체 기판 상에 시딩하거나 침착시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 금속 입자가 백금(Pt), 금(Au), 은(Ag), 팔라듐(Pd), 로듐(Rd), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os) 및 이리듐(Ir), 및 제1 전극 및/또는 제2 전극과 동일한 금속, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 시딩 금속 입자가 금 나노입자 또는 은 나노입자를 포함하는 것인 방법.
  60. 제54항에 있어서, 중합체가 천연, 비천연, 변형된 또는 합성된, DNA 이중체, RNA 이중체, DNA/RNA 이중체, 부분적 DNA 이중체, 부분적 RNA 이중체, 또는 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, DNA 나노구조물, 펩타이드 나노구조물, PNA 나노구조물, 상기 언급된 생체중합체들 중 임의의 부분, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  61. 제54항에 있어서, 금속화된 중합체 분절이 부동화 단일층에 의해 덮이는 것인 방법.
  62. 제33항에 있어서, 적절히 디자인된 금속 입자 시딩으로 핵산 이중체 분절을 차폐하지 않으면서 중합체 분절을 금속화하는 단계를 추가로 포함하고, 중합체 분절이 전도성, 반전도성 또는 비전도성을 가진 것인 방법.
  63. 제33항에 있어서, 핵산 이중체 분절이 천연, 비천연, 변형된 또는 합성된, 혼합된 DNA/RNA 이중체, 이중 DNA 이중체, 삼중 DNA 이중체, DNA 오리가미 구조물, DNA 나노구조물, 펩타이드 나노구조물, PNA 나노구조물, 혼합된 DNA 및 PNA 나노구조물, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 생체중합체 분절로 대체되고, 상기 생체중합체 분절이 감지 분자의 부착을 위한 작용기를 포함하고 중합체 금속화 또는 분자 리소그래피 차폐를 위한 단백질 필라멘트와 호환 가능하도록 구성된 것인 방법.
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