JP2002000299A - 複数の電位を用いる遺伝子の発現解析 - Google Patents
複数の電位を用いる遺伝子の発現解析Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 互いに異なる二種類以上の試料中にそれぞれ
存在する試料核酸断片の量を、ＤＮＡ分析素子を用いて
電気化学的に検出する方法を提供すること。 【解決手段】 導電性基板の表面に固定された既知の塩
基配列を有するＤＮＡ断片に相補性を有し、かつ互いに
異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、各々酸化
還元電位が互いに異なる導電性物質で標識することによ
り、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製する工
程；導電性基を結合させた試料核酸断片を含む標識試料
溶液を混合した混合試料溶液をＤＮＡ分析素子に接触さ
せる工程；該分析素子に、二以上の、導電性物質が示す
電位を順次に印加し、各々の電位における、該分析素子
と導電性基との間を流れる電流を測定する工程；各電位
における電流量を互いに比較することにより、二種類以
上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検
出する方法。
存在する試料核酸断片の量を、ＤＮＡ分析素子を用いて
電気化学的に検出する方法を提供すること。 【解決手段】 導電性基板の表面に固定された既知の塩
基配列を有するＤＮＡ断片に相補性を有し、かつ互いに
異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、各々酸化
還元電位が互いに異なる導電性物質で標識することによ
り、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製する工
程；導電性基を結合させた試料核酸断片を含む標識試料
溶液を混合した混合試料溶液をＤＮＡ分析素子に接触さ
せる工程；該分析素子に、二以上の、導電性物質が示す
電位を順次に印加し、各々の電位における、該分析素子
と導電性基との間を流れる電流を測定する工程；各電位
における電流量を互いに比較することにより、二種類以
上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検
出する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、二種類以上の互い
に異なる試料に発現している遺伝子のその発現量を検出
するために有用なデファレンシャル・ハイブリダイゼー
ション（differential hybridization）技術に関する。
に異なる試料に発現している遺伝子のその発現量を検出
するために有用なデファレンシャル・ハイブリダイゼー
ション（differential hybridization）技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞や組織における遺伝子発現態様の解
析は、種々の状態の細胞や組織からｍＲＮＡを調製し、
調製したｍＲＮＡをメンブレン上に固定し、ｍＲＮＡの
特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションを行う
ノーザンブロット解析法もしくはドットブロット解析
法、または各遺伝子に特異的なプライマ（ＰＣＲ法にお
いて、ＤＮＡ合成酵素がＤＮＡの複製開始に必要とする
２０塩基程度の短いＤＮＡ断片）を用いるＲＴ−ＰＣＲ
法（逆転写反応とＰＣＲ法を組み合わせた方法）によっ
て行われてきた。一方、生命現象に関わる遺伝子研究の
進展により解析に供する遺伝子数が急速に増加し、さら
にゲノムプロジェクトの進行に伴って各生物が保持する
全遺伝子が明らかになるにつれて、多数の遺伝子の挙動
を一度に解析する必要性が高まっている。
析は、種々の状態の細胞や組織からｍＲＮＡを調製し、
調製したｍＲＮＡをメンブレン上に固定し、ｍＲＮＡの
特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションを行う
ノーザンブロット解析法もしくはドットブロット解析
法、または各遺伝子に特異的なプライマ（ＰＣＲ法にお
いて、ＤＮＡ合成酵素がＤＮＡの複製開始に必要とする
２０塩基程度の短いＤＮＡ断片）を用いるＲＴ−ＰＣＲ
法（逆転写反応とＰＣＲ法を組み合わせた方法）によっ
て行われてきた。一方、生命現象に関わる遺伝子研究の
進展により解析に供する遺伝子数が急速に増加し、さら
にゲノムプロジェクトの進行に伴って各生物が保持する
全遺伝子が明らかになるにつれて、多数の遺伝子の挙動
を一度に解析する必要性が高まっている。
【０００３】ＤＮＡマイクロアレイ法は、ゲノム構造が
解析された後に必須となるゲノム機能の大量で迅速な解
析を可能にする手段として注目されている。この方法で
は、スライドガラス等の担体上に高密度に整列化してい
るＤＮＡ断片に対して、標識した核酸断片をハイブリダ
イズさせる。ハイブリダイゼーションの解析は、その標
識方法によって異なるが、蛍光法、ラジオアイソトープ
法、電気化学的な方法等によるのが一般的である。電気
化学的な方法として、特開平９−２８８０８０号公報
に、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡ断片が担体上に高密
度に整列化してなるもの）および電気化学活性縫い込み
型インターカレータを用いて、試料ＤＮＡ断片を検出す
る方法が開示されている。
解析された後に必須となるゲノム機能の大量で迅速な解
析を可能にする手段として注目されている。この方法で
は、スライドガラス等の担体上に高密度に整列化してい
るＤＮＡ断片に対して、標識した核酸断片をハイブリダ
イズさせる。ハイブリダイゼーションの解析は、その標
識方法によって異なるが、蛍光法、ラジオアイソトープ
法、電気化学的な方法等によるのが一般的である。電気
化学的な方法として、特開平９−２８８０８０号公報
に、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡ断片が担体上に高密
度に整列化してなるもの）および電気化学活性縫い込み
型インターカレータを用いて、試料ＤＮＡ断片を検出す
る方法が開示されている。
【０００４】米国特許第５８００９９２号には、二蛍光
標識法を用いる遺伝子発現解析の技術が開示されてい
る。この原理は、互いに異なる二つの試料中の特定遺伝
子（ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡを転写したｃＤＮＡ）を
互いに異なる蛍光物質で標識し、その標識遺伝子を用い
てＤＮＡマイクロアレイ上で競合的にハイブリダイゼー
ションを行い、両者の蛍光を測定し比較することによっ
て、互いに異なる二つの試料中の遺伝子の発現の差を検
出するものである。この技術は、同一スポット上で競合
するハイブリダイズに係るシグナルを検出するので、相
対的比較ができる点で極めて有効である。二蛍光標識法
を用いる遺伝子発現解析の技術は、その他多数の文献
（P.Brown et al., Nature Genetics Supplement, 21,
1999, 33-37、細胞工学 Vol.18, No.4, 1999, 541-54
9、および実験医学 Vol.17, No.11,1999, 1362-1366）
にも報告があるが、これらは、何れも蛍光法を用いるも
のである。しかし、蛍光法では、励起光による褪色が起
こりやすいという問題点を有する。この問題点を克服す
るべく、現在では、蛍光法でこれまで一般的に使用され
てきたフルオロセインに代えて、褪色が起こりにくいＣ
ｙ色素が使用されている。しかし、Ｃｙ色素は極めて高
価であるという問題点を有し、今後、価格を含めた機器
の改善と方法の改良が必要である。
標識法を用いる遺伝子発現解析の技術が開示されてい
る。この原理は、互いに異なる二つの試料中の特定遺伝
子（ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡを転写したｃＤＮＡ）を
互いに異なる蛍光物質で標識し、その標識遺伝子を用い
てＤＮＡマイクロアレイ上で競合的にハイブリダイゼー
ションを行い、両者の蛍光を測定し比較することによっ
て、互いに異なる二つの試料中の遺伝子の発現の差を検
出するものである。この技術は、同一スポット上で競合
するハイブリダイズに係るシグナルを検出するので、相
対的比較ができる点で極めて有効である。二蛍光標識法
を用いる遺伝子発現解析の技術は、その他多数の文献
（P.Brown et al., Nature Genetics Supplement, 21,
1999, 33-37、細胞工学 Vol.18, No.4, 1999, 541-54
9、および実験医学 Vol.17, No.11,1999, 1362-1366）
にも報告があるが、これらは、何れも蛍光法を用いるも
のである。しかし、蛍光法では、励起光による褪色が起
こりやすいという問題点を有する。この問題点を克服す
るべく、現在では、蛍光法でこれまで一般的に使用され
てきたフルオロセインに代えて、褪色が起こりにくいＣ
ｙ色素が使用されている。しかし、Ｃｙ色素は極めて高
価であるという問題点を有し、今後、価格を含めた機器
の改善と方法の改良が必要である。
【０００５】二蛍光標識法ではないが、ＤＮＡマイクロ
アレイ法の応用例として、ＤＮＡのように負電荷を持た
ず、かつＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）を模倣した分子であ
るＰＮＡ（peptide nucleic acid）を用いる方法が知ら
れている。
アレイ法の応用例として、ＤＮＡのように負電荷を持た
ず、かつＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）を模倣した分子であ
るＰＮＡ（peptide nucleic acid）を用いる方法が知ら
れている。
【０００６】ＰＮＡは、いわゆるアンチセンス分子の一
つとして知られているものである。アンチセンス分子
は、遺伝子が発現する際に、一本鎖になるＤＮＡの塩基
配列の転写領域もしくはＲＮＡの塩基配列の翻訳領域に
高選択的に結合して、その領域の機能を制限するように
働く分子であり、遺伝子治療の分野ではアンチセンス医
薬品として知られている。ＰＮＡは、核酸と同様にその
分子中に核酸塩基を有し、相補的な塩基配列を有する核
酸に特異的にハイブリダイズして二本鎖を形成する（P.
E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(199
1)）。ＰＮＡは、機能的には核酸とほとんど変わりない
が、その構造は全く異なり、Ｎ−(２−アミノエチル）
グリシンを単位とするポリアミドを基本骨格としてお
り、その分子中に糖およびリン酸を含まない。核酸塩基
は、ポリアミド骨格に、通常、メチレンカルボニル基を
介して結合している。下記に、ＰＮＡの代表的な構造を
ＤＮＡの構造と共に示す。
つとして知られているものである。アンチセンス分子
は、遺伝子が発現する際に、一本鎖になるＤＮＡの塩基
配列の転写領域もしくはＲＮＡの塩基配列の翻訳領域に
高選択的に結合して、その領域の機能を制限するように
働く分子であり、遺伝子治療の分野ではアンチセンス医
薬品として知られている。ＰＮＡは、核酸と同様にその
分子中に核酸塩基を有し、相補的な塩基配列を有する核
酸に特異的にハイブリダイズして二本鎖を形成する（P.
E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(199
1)）。ＰＮＡは、機能的には核酸とほとんど変わりない
が、その構造は全く異なり、Ｎ−(２−アミノエチル）
グリシンを単位とするポリアミドを基本骨格としてお
り、その分子中に糖およびリン酸を含まない。核酸塩基
は、ポリアミド骨格に、通常、メチレンカルボニル基を
介して結合している。下記に、ＰＮＡの代表的な構造を
ＤＮＡの構造と共に示す。
【０００７】
【化１】
【０００８】ＰＮＡは、電気的には中性であり、塩の存
在しない条件下でも荷電することがない。ＰＮＡの有す
る機能は核酸のそれとほとんど同じと言っても、ＰＮＡ
と核酸とで形成される二本鎖は、ＤＮＡと核酸とで形成
される二本鎖よりも安定であり、核酸の塩基配列をより
厳密に認識できるという特徴を持つ（杉本直巳、日本化
学会第７４回春季大会要旨集、１２８７頁）。そのた
め、ＰＮＡは、アンチセンス医薬以外にも各種診断薬へ
の応用が期待されている分子である（特表平６−５０９
０６３号の明細書）。
在しない条件下でも荷電することがない。ＰＮＡの有す
る機能は核酸のそれとほとんど同じと言っても、ＰＮＡ
と核酸とで形成される二本鎖は、ＤＮＡと核酸とで形成
される二本鎖よりも安定であり、核酸の塩基配列をより
厳密に認識できるという特徴を持つ（杉本直巳、日本化
学会第７４回春季大会要旨集、１２８７頁）。そのた
め、ＰＮＡは、アンチセンス医薬以外にも各種診断薬へ
の応用が期待されている分子である（特表平６−５０９
０６３号の明細書）。
【０００９】特開平１１−３３２５９５号公報には、固
相担体表面にＰＮＡ断片をその一端部にて固定してなる
ＰＮＡマイクロアレイ、およびＰＮＡマイクロアレイを
用いるＤＮＡ断片の検出方法が開示されている。このＰ
ＮＡマイクロアレイは、アビジン−ビオチン法によっ
て、表面プラズモン共鳴バイオセンサ用の測定チップに
ＰＮＡ断片を固定させたものである。ＰＮＡマイクロア
レイを用いたＤＮＡ断片の検出は、表面プラズモン共鳴
シグナルを測定することによって行なわれている。ま
た、ＰＮＡマイクロアレイ、およびラジオアイソトープ
で標識した試料ＤＮＡ断片を用いて、相補性を有する試
料ＤＮＡ断片を検出する方法も知られている（P.E.Niel
sen et al., Science, 254, 1497-1500(1991)）。上記
のアビジン−ビオチン法および上記のラジオアイソトー
プ法では、何れも、ＰＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片との間
に生じる電気的反発が少なくなるため、検出感度を向上
させることができる。
相担体表面にＰＮＡ断片をその一端部にて固定してなる
ＰＮＡマイクロアレイ、およびＰＮＡマイクロアレイを
用いるＤＮＡ断片の検出方法が開示されている。このＰ
ＮＡマイクロアレイは、アビジン−ビオチン法によっ
て、表面プラズモン共鳴バイオセンサ用の測定チップに
ＰＮＡ断片を固定させたものである。ＰＮＡマイクロア
レイを用いたＤＮＡ断片の検出は、表面プラズモン共鳴
シグナルを測定することによって行なわれている。ま
た、ＰＮＡマイクロアレイ、およびラジオアイソトープ
で標識した試料ＤＮＡ断片を用いて、相補性を有する試
料ＤＮＡ断片を検出する方法も知られている（P.E.Niel
sen et al., Science, 254, 1497-1500(1991)）。上記
のアビジン−ビオチン法および上記のラジオアイソトー
プ法では、何れも、ＰＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片との間
に生じる電気的反発が少なくなるため、検出感度を向上
させることができる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、互いに異な
る二種類以上の試料中にそれぞれ存在する試料核酸断片
の量を、ＤＮＡ分析素子を用いて電気化学的に検出する
方法を提供することを、その課題とする。本発明は、ま
た、ＤＮＡ分析素子の代わりに、ＰＮＡ分析素子を用い
て該試料核酸断片の存在量を電気化学的に検出する方法
を提供することをも、その課題とする。
る二種類以上の試料中にそれぞれ存在する試料核酸断片
の量を、ＤＮＡ分析素子を用いて電気化学的に検出する
方法を提供することを、その課題とする。本発明は、ま
た、ＤＮＡ分析素子の代わりに、ＰＮＡ分析素子を用い
て該試料核酸断片の存在量を電気化学的に検出する方法
を提供することをも、その課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】〈ＤＮＡ分析素子を用い
る方法〉本発明は、（１）導電性基板の表面に固定され
た既知の塩基配列を有するＤＮＡ断片に相補性を有し、
かつ互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片
を、それぞれ、酸化還元電位が互いに異なる導電性物質
で標識することにより、導電性基を結合させた試料核酸
断片を調製する工程；（２）導電性基を結合させた試料
核酸断片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶
液を、上記のＤＮＡ断片が導電性基板の表面に固定され
てなるＤＮＡ分析素子に接触させる工程；（３）該分析
素子に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加
し、それぞれの電位における、該分析素子と導電性基と
の間を流れる電流を測定する工程；そして、（４）各電
位における電流量を互いに比較することによって、二種
類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量
を検出する方法にある。
る方法〉本発明は、（１）導電性基板の表面に固定され
た既知の塩基配列を有するＤＮＡ断片に相補性を有し、
かつ互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片
を、それぞれ、酸化還元電位が互いに異なる導電性物質
で標識することにより、導電性基を結合させた試料核酸
断片を調製する工程；（２）導電性基を結合させた試料
核酸断片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶
液を、上記のＤＮＡ断片が導電性基板の表面に固定され
てなるＤＮＡ分析素子に接触させる工程；（３）該分析
素子に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加
し、それぞれの電位における、該分析素子と導電性基と
の間を流れる電流を測定する工程；そして、（４）各電
位における電流量を互いに比較することによって、二種
類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量
を検出する方法にある。
【００１２】本発明の、ＤＮＡ分析素子を用いる検出方
法の好ましい特徴は以下の通りである。 （イ）互いに異なる酸化還元電位を示す導電性物質とし
て、共に、０乃至８００ｍＶの範囲に酸化還元電位を有
する物質であって、その酸化還元電位の差が５０ｍＶ以
上である物質を用いる。 （ロ）電流の測定をデファレンシャルパルスボルタモグ
ラフィによって行う。
法の好ましい特徴は以下の通りである。 （イ）互いに異なる酸化還元電位を示す導電性物質とし
て、共に、０乃至８００ｍＶの範囲に酸化還元電位を有
する物質であって、その酸化還元電位の差が５０ｍＶ以
上である物質を用いる。 （ロ）電流の測定をデファレンシャルパルスボルタモグ
ラフィによって行う。
【００１３】〈ＰＮＡ分析素子を用いる方法〉本発明
は、また、（１）導電性基板の表面に固定された既知の
塩基配列を有するＰＮＡ断片に相補性を有し、かつ互い
に異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、それぞ
れ、酸化還元電位が互いに異なる導電性物質で標識する
ことにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製
する工程；（２）導電性基を結合させた試料核酸断片を
含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、上記
のＰＮＡ断片が導電性基板の表面に固定されてなるＰＮ
Ａ分析素子に接触させる工程；（３）該分析素子に、二
以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、それぞ
れの電位における、該分析素子と導電性基との間を流れ
る電流を測定する工程；そして、（４）各電位における
電流量を互いに比較することによって、二種類以上の試
料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検出する
方法にもある。
は、また、（１）導電性基板の表面に固定された既知の
塩基配列を有するＰＮＡ断片に相補性を有し、かつ互い
に異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、それぞ
れ、酸化還元電位が互いに異なる導電性物質で標識する
ことにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製
する工程；（２）導電性基を結合させた試料核酸断片を
含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、上記
のＰＮＡ断片が導電性基板の表面に固定されてなるＰＮ
Ａ分析素子に接触させる工程；（３）該分析素子に、二
以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、それぞ
れの電位における、該分析素子と導電性基との間を流れ
る電流を測定する工程；そして、（４）各電位における
電流量を互いに比較することによって、二種類以上の試
料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検出する
方法にもある。
【００１４】本発明の、ＰＮＡ分析素子を用いる検出方
法の好ましい特徴は以下の通りである。 （イ）互いに異なる酸化還元電位を示す導電性物質とし
て、共に、０乃至８００ｍＶの範囲に酸化還元電位を有
する物質であって、その酸化還元電位の差が５０ｍＶ以
上である物質を用いる。 （ロ）電流の測定をデファレンシャルパルスボルタモグ
ラフィによって行う。
法の好ましい特徴は以下の通りである。 （イ）互いに異なる酸化還元電位を示す導電性物質とし
て、共に、０乃至８００ｍＶの範囲に酸化還元電位を有
する物質であって、その酸化還元電位の差が５０ｍＶ以
上である物質を用いる。 （ロ）電流の測定をデファレンシャルパルスボルタモグ
ラフィによって行う。
【００１５】
【発明の実施の形態】図１に、本発明の代表的な検出方
法を模式的に示す。互いに異なる試料ａ（１ａ）および
試料ｂ（１ｂ）に存在している試料核酸断片（２）を、
それぞれ、酸化還元電位が互いに異なる導電性物質（３
ａ）、導電性物質（３ｂ）で標識する。そして、導電性
物質（３ａ）が結合した試料核酸断片（４ａ）を含む標
識試料溶液と導電性物質（３ｂ）が結合した試料核酸断
片（４ｂ）を含む標識試料溶液とを混合し、その混合試
料溶液をＤＮＡ分析素子（５）上の一つの領域（６）に
接触させることにより、ＤＮＡ分析素子上に固定されて
いるＤＮＡ断片（７）と標識試料核酸断片（４ａ）との
ハイブリッドＤＮＡ、および該ＤＮＡ断片と標識試料核
酸断片（４ｂ）とのハイブリッドＤＮＡを形成させる。
ここで、「ＤＮＡ分析素子」は、導電性基板の表面に多
数のＤＮＡ断片がその一端部にて固定されてなる素子を
表す。ＤＮＡマイクロアレイが、一般的に、複数のＤＮ
Ａ断片が固定された領域が複数個整列したものを意味す
るのと異なり、本明細書におけるＤＮＡ分析素子では、
図１に示すように該領域の数が複数であっても、あるい
は一つであってもよい。次いで、領域（８）における、
導電性物質（３ａ）と導電性基板との間を流れる電流
量、および導電性物質（４ａ）と導電性基板との間を流
れる電流量を、それぞれ、導電性物質（３ａ）が有する
酸化還元電位、導電性物質（４ａ）が有する酸化還元電
位にて測定することにより、領域（８）における標識試
料核酸断片（４ａ）の存在量と標識試料核酸断片（４
ｂ）の存在量との比を検出することができる。領域
（８）における存在量比は、試料ａ中の標識前の試料核
酸断片の存在量と試料ｂ中の標識前の試料核酸断片の存
在量との比を示す。尚、導電性物質（３ａ）が有する酸
化還元電位とは、導電性物質（３ａ）で標識された試料
核酸断片（４ａ）が示す、極大電流値を与える酸化還元
電位の値をいう。
法を模式的に示す。互いに異なる試料ａ（１ａ）および
試料ｂ（１ｂ）に存在している試料核酸断片（２）を、
それぞれ、酸化還元電位が互いに異なる導電性物質（３
ａ）、導電性物質（３ｂ）で標識する。そして、導電性
物質（３ａ）が結合した試料核酸断片（４ａ）を含む標
識試料溶液と導電性物質（３ｂ）が結合した試料核酸断
片（４ｂ）を含む標識試料溶液とを混合し、その混合試
料溶液をＤＮＡ分析素子（５）上の一つの領域（６）に
接触させることにより、ＤＮＡ分析素子上に固定されて
いるＤＮＡ断片（７）と標識試料核酸断片（４ａ）との
ハイブリッドＤＮＡ、および該ＤＮＡ断片と標識試料核
酸断片（４ｂ）とのハイブリッドＤＮＡを形成させる。
ここで、「ＤＮＡ分析素子」は、導電性基板の表面に多
数のＤＮＡ断片がその一端部にて固定されてなる素子を
表す。ＤＮＡマイクロアレイが、一般的に、複数のＤＮ
Ａ断片が固定された領域が複数個整列したものを意味す
るのと異なり、本明細書におけるＤＮＡ分析素子では、
図１に示すように該領域の数が複数であっても、あるい
は一つであってもよい。次いで、領域（８）における、
導電性物質（３ａ）と導電性基板との間を流れる電流
量、および導電性物質（４ａ）と導電性基板との間を流
れる電流量を、それぞれ、導電性物質（３ａ）が有する
酸化還元電位、導電性物質（４ａ）が有する酸化還元電
位にて測定することにより、領域（８）における標識試
料核酸断片（４ａ）の存在量と標識試料核酸断片（４
ｂ）の存在量との比を検出することができる。領域
（８）における存在量比は、試料ａ中の標識前の試料核
酸断片の存在量と試料ｂ中の標識前の試料核酸断片の存
在量との比を示す。尚、導電性物質（３ａ）が有する酸
化還元電位とは、導電性物質（３ａ）で標識された試料
核酸断片（４ａ）が示す、極大電流値を与える酸化還元
電位の値をいう。
【００１６】本発明の検出方法では、ＤＮＡ分析素子に
固定されているＤＮＡ断片と完全な相補性を有する試料
核酸断片であって、同一の塩基配列を有する試料核酸断
片を対象とする。試料ａおよび試料ｂには、何れも、複
数の種類の試料核酸断片が存在していてもよいが、複数
の種類の試料核酸断片の内で、特定のＤＮＡ断片と完全
相補する試料核酸断片は一種類しか存在しないものと
し、その試料核酸断片の塩基配列は完全に同一であるこ
ととする。互いに異なる試料は、三種類以上の試料であ
ってもよいが、各試料に存在している試料核酸断片の性
質は、上記と同様である。
固定されているＤＮＡ断片と完全な相補性を有する試料
核酸断片であって、同一の塩基配列を有する試料核酸断
片を対象とする。試料ａおよび試料ｂには、何れも、複
数の種類の試料核酸断片が存在していてもよいが、複数
の種類の試料核酸断片の内で、特定のＤＮＡ断片と完全
相補する試料核酸断片は一種類しか存在しないものと
し、その試料核酸断片の塩基配列は完全に同一であるこ
ととする。互いに異なる試料は、三種類以上の試料であ
ってもよいが、各試料に存在している試料核酸断片の性
質は、上記と同様である。
【００１７】以下、ＤＮＡ分析素子を用いる検出方法を
中心に説明するが、特に断らない限りＰＮＡ分析素子を
用いる場合についても同様とする。本明細書において用
いる用語を次のように定義する。「ＰＮＡ断片」には、
合成によって得られたＰＮＡを切断等の操作により断片
化したものを含まない。「ハイブリッドＤＮＡ」とは、
ＤＮＡ分析素子上に固定されたＤＮＡ断片と標識試料核
酸断片とで形成される二本鎖断片を、「ハイブリッドＰ
ＮＡ」とは、ＰＮＡ分析素子上に固定されたＰＮＡ断片
と標識試料核酸断片とで形成される二本鎖断片をいう。
「導電性基」とは、一つ以上の結合手を有する導電性物
質をいう。試料核酸断片に結合している状態の導電性物
質を導電性基とする。「存在」とは、試料中に試料核酸
断片が含まれている状態をいい、遺伝子の発現を含む。
中心に説明するが、特に断らない限りＰＮＡ分析素子を
用いる場合についても同様とする。本明細書において用
いる用語を次のように定義する。「ＰＮＡ断片」には、
合成によって得られたＰＮＡを切断等の操作により断片
化したものを含まない。「ハイブリッドＤＮＡ」とは、
ＤＮＡ分析素子上に固定されたＤＮＡ断片と標識試料核
酸断片とで形成される二本鎖断片を、「ハイブリッドＰ
ＮＡ」とは、ＰＮＡ分析素子上に固定されたＰＮＡ断片
と標識試料核酸断片とで形成される二本鎖断片をいう。
「導電性基」とは、一つ以上の結合手を有する導電性物
質をいう。試料核酸断片に結合している状態の導電性物
質を導電性基とする。「存在」とは、試料中に試料核酸
断片が含まれている状態をいい、遺伝子の発現を含む。
【００１８】［導電性基板］導電性基板としては、疎水
性（あるいは低親水性）の導電性基板、または疎水性
（あるいは低親水性）の電気絶縁性の担体上に複数の疎
水性（あるいは低親水性）の導電性基板が設けられてな
る基板であることが好ましい。導電性の疎水性基板およ
び電気絶縁性の疎水性担体は、何れも、その表面が凹凸
を有する平面性の低いものであっても好ましく用いるこ
とができる。電気絶縁性の担体の材質としては、何れ
も、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしく
はニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、
酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネー
ト、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリ
マー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミ
ックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織
布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルタ等の多孔質物質
などを挙げることができるが、各種ポリマー、ガラスも
しくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表
面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さに
よるものである。電気絶縁性の担体の厚さは、特に限定
されないが、板状である場合には、１００乃至１０００
０μｍの範囲にあることが好ましい。疎水性の導電性基
板としては、電極、光ファイバ、フォトダイオード、サ
ーミスタ、ピエゾ素子、表面弾性波素子なども好ましく
用いることができるが、電極を用いることが特に好まし
い。電極の材料としては、グラファイト、グラシーカー
ボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等
の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、
酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等
の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることが
できるが、金もしくはグラシーカーボンを用いることが
が特に好ましい。これらの電子伝導体は、導電性高分子
によって被覆されていても、単分子膜によって被覆され
ていてもよい。
性（あるいは低親水性）の導電性基板、または疎水性
（あるいは低親水性）の電気絶縁性の担体上に複数の疎
水性（あるいは低親水性）の導電性基板が設けられてな
る基板であることが好ましい。導電性の疎水性基板およ
び電気絶縁性の疎水性担体は、何れも、その表面が凹凸
を有する平面性の低いものであっても好ましく用いるこ
とができる。電気絶縁性の担体の材質としては、何れ
も、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしく
はニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、
酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネー
ト、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリ
マー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミ
ックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織
布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルタ等の多孔質物質
などを挙げることができるが、各種ポリマー、ガラスも
しくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表
面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さに
よるものである。電気絶縁性の担体の厚さは、特に限定
されないが、板状である場合には、１００乃至１０００
０μｍの範囲にあることが好ましい。疎水性の導電性基
板としては、電極、光ファイバ、フォトダイオード、サ
ーミスタ、ピエゾ素子、表面弾性波素子なども好ましく
用いることができるが、電極を用いることが特に好まし
い。電極の材料としては、グラファイト、グラシーカー
ボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等
の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、
酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等
の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることが
できるが、金もしくはグラシーカーボンを用いることが
が特に好ましい。これらの電子伝導体は、導電性高分子
によって被覆されていても、単分子膜によって被覆され
ていてもよい。
【００１９】導電性基板としては、疎水性の電気絶縁性
の担体上に、複数の疎水性の導電性基板が設けられてな
る基板を用いることが特に好ましい。このとき、導電性
基板は、互いに接しないように、かつ規則的に電気絶縁
性の担体上に配置されていることが好ましい。電気絶縁
性の担体上に導電性基板を設ける前に、電気絶縁性の担
体上に、電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や
架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設け
ることによって該担体の凹凸を軽減することができる。
また、担体の種類によっては、その担体中に電荷を有す
る親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、こ
のような処理を施した担体も好ましく用いることができ
る。
の担体上に、複数の疎水性の導電性基板が設けられてな
る基板を用いることが特に好ましい。このとき、導電性
基板は、互いに接しないように、かつ規則的に電気絶縁
性の担体上に配置されていることが好ましい。電気絶縁
性の担体上に導電性基板を設ける前に、電気絶縁性の担
体上に、電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や
架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設け
ることによって該担体の凹凸を軽減することができる。
また、担体の種類によっては、その担体中に電荷を有す
る親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、こ
のような処理を施した担体も好ましく用いることができ
る。
【００２０】電気絶縁性の担体上に複数の電極が配置さ
れたものとしては、文献（Sosnowski,R.G. et al., Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 1119-1123(1997))に記載
の、核酸断片が未固定のシリコンチップも好ましく用い
ることができる。また、プリント配線導電性基板のよう
に、電極が導電性基板上に印刷されてなるものであって
もよい。
れたものとしては、文献（Sosnowski,R.G. et al., Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 1119-1123(1997))に記載
の、核酸断片が未固定のシリコンチップも好ましく用い
ることができる。また、プリント配線導電性基板のよう
に、電極が導電性基板上に印刷されてなるものであって
もよい。
【００２１】［ＤＮＡ断片］ＤＮＡ断片としては、導電
性基板表面に二本鎖のＤＮＡ断片を固定した後、一方の
鎖のみを固定させる処理を施したもの、あるいは固定前
に二本鎖のＤＮＡ断片を一本鎖のＤＮＡ断片としたもの
であることが好ましい。また、ＤＮＡ断片としては、合
成オリゴヌクレオチドあるいは導電性基板表面で直接合
成して得られたオリゴヌクレオチドであることも好まし
い。
性基板表面に二本鎖のＤＮＡ断片を固定した後、一方の
鎖のみを固定させる処理を施したもの、あるいは固定前
に二本鎖のＤＮＡ断片を一本鎖のＤＮＡ断片としたもの
であることが好ましい。また、ＤＮＡ断片としては、合
成オリゴヌクレオチドあるいは導電性基板表面で直接合
成して得られたオリゴヌクレオチドであることも好まし
い。
【００２２】二本鎖のＤＮＡ断片を固定させるために
は、一般的に、導電性基板表面に該ＤＮＡ断片の固定の
ための反応性基（反応性基Ｄ1とする。）を導入するこ
とが好ましい。反応性基Ｄ1は、導電性基板表面をポリ
陽イオン（例えば、ポリ−Ｌ−リシン、ポリエチレンイ
ミンもしくはポリアルキルアミンであることが好まし
く、ポリ−Ｌ−リシンであることが特に好ましい）で被
覆処理することによって導入されたものであっても、ま
たは反応性基Ｄ1を有するシランカップリング剤を導電
性基板表面に接触させることによって導入されたもので
あることが好ましい。反応性基Ｄ1としては、アミノ
基、メルカプト基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボ
キシル基もしくは水酸基であることが特に好ましい。ア
ミノ基を有するシランカップリング剤としては、具体的
には、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β
（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキシシラ
ンおよびＮ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルメ
チルジメトキシシランを挙げることができ、γ−アミノ
プロピルトリエトキシシランを用いることが特に好まし
い。
は、一般的に、導電性基板表面に該ＤＮＡ断片の固定の
ための反応性基（反応性基Ｄ1とする。）を導入するこ
とが好ましい。反応性基Ｄ1は、導電性基板表面をポリ
陽イオン（例えば、ポリ−Ｌ−リシン、ポリエチレンイ
ミンもしくはポリアルキルアミンであることが好まし
く、ポリ−Ｌ−リシンであることが特に好ましい）で被
覆処理することによって導入されたものであっても、ま
たは反応性基Ｄ1を有するシランカップリング剤を導電
性基板表面に接触させることによって導入されたもので
あることが好ましい。反応性基Ｄ1としては、アミノ
基、メルカプト基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボ
キシル基もしくは水酸基であることが特に好ましい。ア
ミノ基を有するシランカップリング剤としては、具体的
には、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β
（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキシシラ
ンおよびＮ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルメ
チルジメトキシシランを挙げることができ、γ−アミノ
プロピルトリエトキシシランを用いることが特に好まし
い。
【００２３】二本鎖のＤＮＡ断片は、ｍＲＮＡに対して
ＲＴ（reverse transcription）法によって得たｃＤＮ
Ａ断片をベクターに組み込んだもの（ｃＤＮＡのライブ
ラリ）をテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して
調製することが好ましい。一本鎖のｃＤＮＡ断片をＰＣ
Ｒ法により増幅して得られる二本鎖のｃＤＮＡ断片は、
一方の鎖がその末端部に反応性基（反応性基Ｄ2とす
る。）を持ち、かつ他方の鎖が反応性基を持たないもの
であり、これは、二種類のプライマ（反応性基Ｄ2を
５’末端に有するプライマと反応性基を有しないプライ
マ）を用いて調製することができる。このような反応性
基Ｄ2としては、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、
カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカ
ルボキシイミド基であることが好ましく、アミノ基であ
ることが特に好ましい。
ＲＴ（reverse transcription）法によって得たｃＤＮ
Ａ断片をベクターに組み込んだもの（ｃＤＮＡのライブ
ラリ）をテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して
調製することが好ましい。一本鎖のｃＤＮＡ断片をＰＣ
Ｒ法により増幅して得られる二本鎖のｃＤＮＡ断片は、
一方の鎖がその末端部に反応性基（反応性基Ｄ2とす
る。）を持ち、かつ他方の鎖が反応性基を持たないもの
であり、これは、二種類のプライマ（反応性基Ｄ2を
５’末端に有するプライマと反応性基を有しないプライ
マ）を用いて調製することができる。このような反応性
基Ｄ2としては、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、
カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカ
ルボキシイミド基であることが好ましく、アミノ基であ
ることが特に好ましい。
【００２４】固定は、ＰＣＲ法によって得られた二本鎖
のｃＤＮＡ断片の一方の鎖の末端部（好ましくは、５’
末端）に有する反応性基Ｄ2と導電性基板表面に導入さ
れた反応性基Ｄ1との共有結合によって行うことが好ま
しい。反応性基Ｄ1と反応性基Ｄ2との共有結合は、スペ
ーサを介して行ってもよい。ｃＤＮＡ断片の塩基数は、
３乃至１０００００の範囲にあることが好ましく、３乃
至１００００の範囲にあることがより好ましく、５０乃
至１０００の範囲にあることが特に好ましい。導電性基
板表面に固定した二本鎖のｃＤＮＡ断片を解離させる変
性処理の方法としては、公知の方法を用いることができ
る。変性処理によって、反応性基Ｄ2を有する鎖が固定
される。また、特願平９−２８８０８０号公報に記載
の、導電性基板として、金で蒸着処理されているものや
グラシーカーボンが塗布されているものを用いる固定方
法も好ましい。
のｃＤＮＡ断片の一方の鎖の末端部（好ましくは、５’
末端）に有する反応性基Ｄ2と導電性基板表面に導入さ
れた反応性基Ｄ1との共有結合によって行うことが好ま
しい。反応性基Ｄ1と反応性基Ｄ2との共有結合は、スペ
ーサを介して行ってもよい。ｃＤＮＡ断片の塩基数は、
３乃至１０００００の範囲にあることが好ましく、３乃
至１００００の範囲にあることがより好ましく、５０乃
至１０００の範囲にあることが特に好ましい。導電性基
板表面に固定した二本鎖のｃＤＮＡ断片を解離させる変
性処理の方法としては、公知の方法を用いることができ
る。変性処理によって、反応性基Ｄ2を有する鎖が固定
される。また、特願平９−２８８０８０号公報に記載
の、導電性基板として、金で蒸着処理されているものや
グラシーカーボンが塗布されているものを用いる固定方
法も好ましい。
【００２５】ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配
列決定法によって予めその配列が決定されていることが
好ましく、その塩基種も既知であることが好ましい。Ｄ
ＮＡ分析素子が複数の領域を有するものである場合に
は、導電性基板表面に区画された複数の領域のそれぞれ
に、互いに異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片を固定さ
せることもできるが、その場合、ＤＮＡ断片としては、
複数の種類のものを用いることができる。
列決定法によって予めその配列が決定されていることが
好ましく、その塩基種も既知であることが好ましい。Ｄ
ＮＡ分析素子が複数の領域を有するものである場合に
は、導電性基板表面に区画された複数の領域のそれぞれ
に、互いに異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片を固定さ
せることもできるが、その場合、ＤＮＡ断片としては、
複数の種類のものを用いることができる。
【００２６】ＤＮＡ断片の固定は、ＤＮＡ断片が溶解あ
るいは分散されてなる水性液を導電性基板上に点着して
行うことが好ましい。ＤＮＡ断片を含む水性液中には、
その水性液の粘性を高める添加剤を含有させてもよい。
このような添加剤としては、ショ糖、ポリエチレングリ
コール、グリセロール等を挙げることができる。点着
後、所定の温度でそのまま数時間放置するとＤＮＡ断片
が固定される。点着は、マニュアル操作によっても行う
ことができるが、汎用されているＤＮＡチップ作製装置
に装備されたスポッタを用いて行うこともできる。点着
後は、インキュベーションを行ってもよい。インキュベ
ート後、未固定のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが
好ましい。上記のようにして作製したＤＮＡ分析素子の
寿命は、通常、数日間乃至数週間の範囲にある。
るいは分散されてなる水性液を導電性基板上に点着して
行うことが好ましい。ＤＮＡ断片を含む水性液中には、
その水性液の粘性を高める添加剤を含有させてもよい。
このような添加剤としては、ショ糖、ポリエチレングリ
コール、グリセロール等を挙げることができる。点着
後、所定の温度でそのまま数時間放置するとＤＮＡ断片
が固定される。点着は、マニュアル操作によっても行う
ことができるが、汎用されているＤＮＡチップ作製装置
に装備されたスポッタを用いて行うこともできる。点着
後は、インキュベーションを行ってもよい。インキュベ
ート後、未固定のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが
好ましい。上記のようにして作製したＤＮＡ分析素子の
寿命は、通常、数日間乃至数週間の範囲にある。
【００２７】［ＰＮＡ断片］本発明で好ましく用いられ
るＰＮＡ断片は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物で
ある。
るＰＮＡ断片は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物で
ある。
【００２８】
【化２】
【００２９】式中、Ｂ11は、リガンドであって、天然の
核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＩもしくはＵ）あるいは塩
基類似体を表す。Ｂ11は、天然に見出される位置、即
ち、アデニン、グアニンもしくはイノシンを含むプリン
については、９位において、チミン、ウラシルもしくは
シトシンを含むピリミジンについては、１位において結
合している。塩基類似体とは、天然に存在しない核酸塩
基に類似の有機塩基をいい、プリン環やピリミジン環の
一部がＣからＮへ、もしくはＮからＣへ置換された化合
物、またはプリン環やピリミジン環の一部に新たな修飾
を施された化合物（スルフヒドリル基やハロゲン原子が
導入された化合物）をいう。また、Ｂ11は、核酸塩基を
含まない芳香族部分、炭素原子数が１乃至４のアルカノ
イル基、水酸基あるいは水素原子であってもよい。塩基
類似体としては、７−デアザアデニン、６−アザウラシ
ルおよび５−アザシトシンを挙げることができる。典型
的な核酸塩基リガンドおよび例示的合成リガンドについ
ては、ＷＯ９２／２０７０２に図示されており、５−プ
ロピルチミンおよび３−デアザウラシルは、ＤＮＡ断片
への結合親和性を増加させることが知られている（特開
平１１−２３６３９６号公報）。他の有用な天然にない
核酸塩基としては、６−チオグアニンやピラゾロ［４，
３ｄ］−ピリミジンが有用である（国際出願ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９２／０４７９５）。さらに、Ｂ11は、ＤＮＡインタ
ーカレータ、レポーターリガンド（例えば、フルオロフ
ォア）、ハプテンやビオチンのタンパク質標識、スピン
標識、あるいは放射性標識であってもよい。Ｂ11は、核
酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧもしくはＵ）であることが特に
好ましい。
核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＩもしくはＵ）あるいは塩
基類似体を表す。Ｂ11は、天然に見出される位置、即
ち、アデニン、グアニンもしくはイノシンを含むプリン
については、９位において、チミン、ウラシルもしくは
シトシンを含むピリミジンについては、１位において結
合している。塩基類似体とは、天然に存在しない核酸塩
基に類似の有機塩基をいい、プリン環やピリミジン環の
一部がＣからＮへ、もしくはＮからＣへ置換された化合
物、またはプリン環やピリミジン環の一部に新たな修飾
を施された化合物（スルフヒドリル基やハロゲン原子が
導入された化合物）をいう。また、Ｂ11は、核酸塩基を
含まない芳香族部分、炭素原子数が１乃至４のアルカノ
イル基、水酸基あるいは水素原子であってもよい。塩基
類似体としては、７−デアザアデニン、６−アザウラシ
ルおよび５−アザシトシンを挙げることができる。典型
的な核酸塩基リガンドおよび例示的合成リガンドについ
ては、ＷＯ９２／２０７０２に図示されており、５−プ
ロピルチミンおよび３−デアザウラシルは、ＤＮＡ断片
への結合親和性を増加させることが知られている（特開
平１１−２３６３９６号公報）。他の有用な天然にない
核酸塩基としては、６−チオグアニンやピラゾロ［４，
３ｄ］−ピリミジンが有用である（国際出願ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９２／０４７９５）。さらに、Ｂ11は、ＤＮＡインタ
ーカレータ、レポーターリガンド（例えば、フルオロフ
ォア）、ハプテンやビオチンのタンパク質標識、スピン
標識、あるいは放射性標識であってもよい。Ｂ11は、核
酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧもしくはＵ）であることが特に
好ましい。
【００３０】Ｒ11は、水素原子、もしくは天然のα−ア
ミノ酸の側鎖を表す基を表す。天然のα−アミノ酸の側
鎖を表す基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル
基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、炭素原子数
が１乃至６のアルキル基を含む炭素原子数が７乃至２６
のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のヘテロアリ
ール基、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ
基、炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基、−ＮＲ13
Ｒ14基、−ＳＨ基、および炭素原子数が１乃至６のアル
キル基からなる群より選ばれる基であることが好まし
い。炭素原子数が１乃至６のアルキル基は、さらに、水
酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基もしくは炭
素原子数が１乃至６のアルキルチオ基で置換されていて
もよい。Ｒ13およびＲ14は、互いに独立に、水素原子、
炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が１乃
至３のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至３のアルキル
チオ基および水酸基からなる群より選ばれる原子もしく
は水酸基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基
は、Ｒ11が結合している炭素原子の水素原子と一緒にな
って脂環あるいは複素環を形成していてもよい。
ミノ酸の側鎖を表す基を表す。天然のα−アミノ酸の側
鎖を表す基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル
基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、炭素原子数
が１乃至６のアルキル基を含む炭素原子数が７乃至２６
のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のヘテロアリ
ール基、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ
基、炭素原子数が１乃至６のアルキルチオ基、−ＮＲ13
Ｒ14基、−ＳＨ基、および炭素原子数が１乃至６のアル
キル基からなる群より選ばれる基であることが好まし
い。炭素原子数が１乃至６のアルキル基は、さらに、水
酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基もしくは炭
素原子数が１乃至６のアルキルチオ基で置換されていて
もよい。Ｒ13およびＲ14は、互いに独立に、水素原子、
炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が１乃
至３のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至３のアルキル
チオ基および水酸基からなる群より選ばれる原子もしく
は水酸基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基
は、Ｒ11が結合している炭素原子の水素原子と一緒にな
って脂環あるいは複素環を形成していてもよい。
【００３１】Ｌ11は、連結基を表し、−ＣＯ−基もしく
は−ＣＯ−ＮＲ12−基であることが好ましく、−ＣＯ−
基であることが特に好ましい。Ｒ12は、水素原子、炭素
原子数が１乃至４のアルキレン基、水酸基、炭素原子数
が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基からなる群よ
り選ばれる原子もしくは基を表す。炭素原子数が１乃至
４のアルキレン基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ
基およびアミノ基は、何れも炭素原子数が１乃至４のア
ルキル基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基もしく
は水酸基で置換されていてもよい。
は−ＣＯ−ＮＲ12−基であることが好ましく、−ＣＯ−
基であることが特に好ましい。Ｒ12は、水素原子、炭素
原子数が１乃至４のアルキレン基、水酸基、炭素原子数
が１乃至４のアルコキシ基およびアミノ基からなる群よ
り選ばれる原子もしくは基を表す。炭素原子数が１乃至
４のアルキレン基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ
基およびアミノ基は、何れも炭素原子数が１乃至４のア
ルキル基、炭素原子数が１乃至４のアルコキシ基もしく
は水酸基で置換されていてもよい。
【００３２】ｄは、１乃至６０の整数を表す。ｄは、１
乃至４０の整数であることが好ましい。ａ、ｂおよびｃ
は、それぞれ独立に０乃至５の整数を表す。ａ、ｂおよ
びｃは、何れも１であることが好ましい。
乃至４０の整数であることが好ましい。ａ、ｂおよびｃ
は、それぞれ独立に０乃至５の整数を表す。ａ、ｂおよ
びｃは、何れも１であることが好ましい。
【００３３】本発明で用いるＰＮＡ断片は、下記一般式
(ＩＩ)で表される化合物であることが特に好ましい。式
中、Ｂ11およびｄは、それぞれ、上記一般式（Ｉ）のＢ
11、ｄを表す。
(ＩＩ)で表される化合物であることが特に好ましい。式
中、Ｂ11およびｄは、それぞれ、上記一般式（Ｉ）のＢ
11、ｄを表す。
【００３４】
【化３】
【００３５】ＰＮＡは、ペプチドと同様に液相法や固相
法によって合成することができ、合成されたものは市販
もされている。ＰＮＡの合成法については、特表平６−
５０９０６３号の明細書、米国特許２７５８９８８号の
明細書、P.E.Nielsen et al., Journal of American Ch
emical Society, 114, 1895-1987(1992)、P.E.Nielsen
et al., Journal of American Chemical Society, 114,
9677-9678(1992)などに詳細が記載されている。
法によって合成することができ、合成されたものは市販
もされている。ＰＮＡの合成法については、特表平６−
５０９０６３号の明細書、米国特許２７５８９８８号の
明細書、P.E.Nielsen et al., Journal of American Ch
emical Society, 114, 1895-1987(1992)、P.E.Nielsen
et al., Journal of American Chemical Society, 114,
9677-9678(1992)などに詳細が記載されている。
【００３６】［ハイブリダイゼーション］ハイブリダイ
ゼーションは、ＤＮＡ分析素子に、互いに異なる二種類
以上の、標識試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる
標識試料溶液を接触させることによって実施する。互い
に異なる二種類以上の標識試料溶液は、混合したものを
接触させる。混合の割合は、特にその割合を問わない
が、通常等量である。ハイブリダイゼーションは、室温
乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２０時間の
範囲で実施することが好ましいが、導電性基板に固定す
るＤＮＡ断片の鎖長、試料核酸断片の種類などに応じ
て、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定すること
が望ましい。例えば、遺伝子発現の解析を目的とする場
合には、低発現の遺伝子も充分に検出できるように、長
時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後は、洗浄を行い、未反応
の標識試料核酸断片を除去することが好ましい。
ゼーションは、ＤＮＡ分析素子に、互いに異なる二種類
以上の、標識試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる
標識試料溶液を接触させることによって実施する。互い
に異なる二種類以上の標識試料溶液は、混合したものを
接触させる。混合の割合は、特にその割合を問わない
が、通常等量である。ハイブリダイゼーションは、室温
乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２０時間の
範囲で実施することが好ましいが、導電性基板に固定す
るＤＮＡ断片の鎖長、試料核酸断片の種類などに応じ
て、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定すること
が望ましい。例えば、遺伝子発現の解析を目的とする場
合には、低発現の遺伝子も充分に検出できるように、長
時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後は、洗浄を行い、未反応
の標識試料核酸断片を除去することが好ましい。
【００３７】［標識試料核酸断片］試料核酸断片として
は、生物試料に存在しているｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ
を逆転写反応させることによって得られるｃＤＮＡ断片
を用いることが好ましい。標識試料核酸断片は、試料核
酸断片の一方の末端部（もしくは末端部付近）に導電性
物質を結合させることによって調製することができる。
その調製方法については、文献（S.Takenaka et al., A
nalytical Biochemistry, 218, 436-443(1994)）に詳細
が記載されている。標識試料核酸断片は、試料核酸断片
に、導電性基を結合させたｄＮＴＰを逆転写反応により
取り込ませることによって調製することもできる。さら
に、試料核酸断片に、アミノアリル基を結合させたｄＮ
ＴＰを逆転写反応により取り込ませて、複数のアミノ基
を有するｃＤＮＡ断片に導き、次いで、導電性物質の活
性体をこれらのアミノ基と反応させる方法によって、標
識試料核酸断片を調製する方法も知られている。この方
法は、導電性物質を結合させたｄＮＴＰの取り込み率が
低いことに比べ、多数の導電性物質を取り込むことがで
きる点で優れた方法である。上記前者の、導電性基を結
合させたｄＮＴＰを取り込ませる方法、およびアミノア
リル基を結合させたｄＮＴＰを取り込ませる方法では、
何れも、互いに異なる試料核酸断片への取り込み率は同
一であることが好ましい。
は、生物試料に存在しているｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ
を逆転写反応させることによって得られるｃＤＮＡ断片
を用いることが好ましい。標識試料核酸断片は、試料核
酸断片の一方の末端部（もしくは末端部付近）に導電性
物質を結合させることによって調製することができる。
その調製方法については、文献（S.Takenaka et al., A
nalytical Biochemistry, 218, 436-443(1994)）に詳細
が記載されている。標識試料核酸断片は、試料核酸断片
に、導電性基を結合させたｄＮＴＰを逆転写反応により
取り込ませることによって調製することもできる。さら
に、試料核酸断片に、アミノアリル基を結合させたｄＮ
ＴＰを逆転写反応により取り込ませて、複数のアミノ基
を有するｃＤＮＡ断片に導き、次いで、導電性物質の活
性体をこれらのアミノ基と反応させる方法によって、標
識試料核酸断片を調製する方法も知られている。この方
法は、導電性物質を結合させたｄＮＴＰの取り込み率が
低いことに比べ、多数の導電性物質を取り込むことがで
きる点で優れた方法である。上記前者の、導電性基を結
合させたｄＮＴＰを取り込ませる方法、およびアミノア
リル基を結合させたｄＮＴＰを取り込ませる方法では、
何れも、互いに異なる試料核酸断片への取り込み率は同
一であることが好ましい。
【００３８】［導電性物質］互いに異なる二種類以上の
試料中に含まれる試料核酸断片は、それぞれ、互いに異
なる導電性物質で標識する。互いに異なる導電性物質と
は、試料核酸断片に結合していない状態で導電性物質そ
のものが与える極大電流値を比較したとき、極大電流値
を与える酸化還元電位が互いに異なるような物質をい
う。但し、互いに異なる導電性物質であって、その当量
（モル）の導電性物質が与える極大電流値は同一の値を
示すことが好ましい。極大電流値である必要はないが、
極大電流値を与える酸化還元電位を比較することが望ま
しい。互いに異なる酸化還元電位は、酸化還元電位が何
れも０乃至８００ｍＶの範囲にあることが好ましく、互
いの酸化還元電位の差が５０ｍＶ以上であることが好ま
しい。
試料中に含まれる試料核酸断片は、それぞれ、互いに異
なる導電性物質で標識する。互いに異なる導電性物質と
は、試料核酸断片に結合していない状態で導電性物質そ
のものが与える極大電流値を比較したとき、極大電流値
を与える酸化還元電位が互いに異なるような物質をい
う。但し、互いに異なる導電性物質であって、その当量
（モル）の導電性物質が与える極大電流値は同一の値を
示すことが好ましい。極大電流値である必要はないが、
極大電流値を与える酸化還元電位を比較することが望ま
しい。互いに異なる酸化還元電位は、酸化還元電位が何
れも０乃至８００ｍＶの範囲にあることが好ましく、互
いの酸化還元電位の差が５０ｍＶ以上であることが好ま
しい。
【００３９】導電性物質の具体例を以下に示す。導電性
物質としては、有機金属化合物と金属原子を含まないが
導電性を有する物質とを挙げることができる。結合手に
ついては省略する。
物質としては、有機金属化合物と金属原子を含まないが
導電性を有する物質とを挙げることができる。結合手に
ついては省略する。
【００４０】有機金属化合物としては、配位子から中心
金属原子の電子供与に加えて、中心金属原子の軌道から
配位子の原子の空軌道へ電子がπ結合を通じて供与され
るタイプのπ錯体を用いることが好ましい。また、有機
金属化合物としては、繰り返し単位どうしが配位結合に
よって結合している配位高分子も好ましく用いることが
できる。π錯体は、金属原子に対する配位が、単座配
位、二座配位、多座配位もしくは架橋配位の何れの配位
によるものであってもよい。π錯体の具体例としては、
下記式に示すメタロセン錯体をあげることができる。Ｍ
は、金属原子を表す。
金属原子の電子供与に加えて、中心金属原子の軌道から
配位子の原子の空軌道へ電子がπ結合を通じて供与され
るタイプのπ錯体を用いることが好ましい。また、有機
金属化合物としては、繰り返し単位どうしが配位結合に
よって結合している配位高分子も好ましく用いることが
できる。π錯体は、金属原子に対する配位が、単座配
位、二座配位、多座配位もしくは架橋配位の何れの配位
によるものであってもよい。π錯体の具体例としては、
下記式に示すメタロセン錯体をあげることができる。Ｍ
は、金属原子を表す。
【００４１】
【化４】
【００４２】上記式で表されるメタロセン錯体の金属原
子は、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｍｏ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｔｌ、Ｔ
ａ、Ｔｉ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｗ、Ｖ、ＲｕもしくはＯｓであ
ることが好ましく、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｖ
もしくはＣｒであることがさらに好ましく、Ｆｅである
ことが特に好ましい。
子は、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｍｏ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｔｌ、Ｔ
ａ、Ｔｉ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｗ、Ｖ、ＲｕもしくはＯｓであ
ることが好ましく、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｖ
もしくはＣｒであることがさらに好ましく、Ｆｅである
ことが特に好ましい。
【００４３】π錯体としては、下記式で表されるシクロ
ブタジエン錯体、シクロペンタジエニル錯体、フェナン
トロリン錯体、ビピリジン錯体もしくはトリフェニルホ
スフィン錯体も好ましく用いることができる。
ブタジエン錯体、シクロペンタジエニル錯体、フェナン
トロリン錯体、ビピリジン錯体もしくはトリフェニルホ
スフィン錯体も好ましく用いることができる。
【００４４】
【化５】
【００４５】
【化６】
【００４６】ビピリジン錯体としては、［Ｐｄ（ｂｐ
ｙ）2］2+、［ＣｏＣｌ2（ｂｐｙ）2］+、［Ｆｅ（ｂｐ
ｙ）３］n、もしくは［Ｃｒ（ｂｐｙ）３］nであること
が好ましい。但し、ｂｐｙは２，２’−ビピリジンを表
し、ｎは、−１乃至３の整数を表わす。トリフェニルホ
スフィン錯体としては、ＣｏＣＨ3（ＰＰｈ3）3、Ｃｏ
Ｈ（Ｎ2）（ＰＰｈ3）3、ＲｕＨ2（ＰＰｈ3）4もしくは
ＲｈＨ（ＰＰｈ3）4であることが好ましい。Ｐｈは、フ
ェニル基を示す。
ｙ）2］2+、［ＣｏＣｌ2（ｂｐｙ）2］+、［Ｆｅ（ｂｐ
ｙ）３］n、もしくは［Ｃｒ（ｂｐｙ）３］nであること
が好ましい。但し、ｂｐｙは２，２’−ビピリジンを表
し、ｎは、−１乃至３の整数を表わす。トリフェニルホ
スフィン錯体としては、ＣｏＣＨ3（ＰＰｈ3）3、Ｃｏ
Ｈ（Ｎ2）（ＰＰｈ3）3、ＲｕＨ2（ＰＰｈ3）4もしくは
ＲｈＨ（ＰＰｈ3）4であることが好ましい。Ｐｈは、フ
ェニル基を示す。
【００４７】導電性物質としては、クロロクルオロヘ
ム、クロロフィリド、クロロフィル、ヘム、ビタミンＢ
12等のポルフィリン系錯体も好ましく用いることができ
る。
ム、クロロフィリド、クロロフィル、ヘム、ビタミンＢ
12等のポルフィリン系錯体も好ましく用いることができ
る。
【００４８】金属原子を含まない導電性物質としては、
下記式で表されるビオロゲン、２，２’−ビピリジン、
１，１０−フェナントロリン、カテコールアミン等を挙
げることができる。但し、ＲA、ＲBは、互いに独立に、
炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃
至６のアルコキシ基、炭素原子数が６乃至１２のアリー
ル基、並びにＮ、ＯおよびＳからなる群より選ばれるヘ
テロ原子を１乃至４個含む炭素原子数が２乃至１２の複
素環基からなる群より選ばれる基であることが好まし
い。上記のアルキル基、アルコキシ基、アリール基およ
び複素環基は、何れも炭素原子数が１乃至６のアルキル
基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基および炭素原
子数が６乃至１０のアリール基からなる群より選ばれる
基で置換されていてもよい。ＲA、ＲBは、何れも、炭素
原子数が１乃至６のアルキル基もしくは炭素原子数が６
乃至１２のアリール基であることがさらに好ましく、フ
ェニル基であることが特に好ましい。
下記式で表されるビオロゲン、２，２’−ビピリジン、
１，１０−フェナントロリン、カテコールアミン等を挙
げることができる。但し、ＲA、ＲBは、互いに独立に、
炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃
至６のアルコキシ基、炭素原子数が６乃至１２のアリー
ル基、並びにＮ、ＯおよびＳからなる群より選ばれるヘ
テロ原子を１乃至４個含む炭素原子数が２乃至１２の複
素環基からなる群より選ばれる基であることが好まし
い。上記のアルキル基、アルコキシ基、アリール基およ
び複素環基は、何れも炭素原子数が１乃至６のアルキル
基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基および炭素原
子数が６乃至１０のアリール基からなる群より選ばれる
基で置換されていてもよい。ＲA、ＲBは、何れも、炭素
原子数が１乃至６のアルキル基もしくは炭素原子数が６
乃至１２のアリール基であることがさらに好ましく、フ
ェニル基であることが特に好ましい。
【００４９】
【化７】
【００５０】
【化８】
【００５１】導電性物質は、置換基を有していてもよ
い。特定の構造を持つ導電性物質を主骨格とした場合、
酸化還元電位の相違は、その導電性物質が有する置換基
の性質に依存することが多い。従って、互いに異なる導
電性物質としては、上記の導電性物質を主骨格として、
その主骨格に互いに異なる性質の置換基が結合してなる
ものを用いることが、調製の簡便さの点からも好まし
い。上記置換基は、試料核酸断片と結合する際に、結合
手となる二価の基を含むものであることが特に好まし
い。置換基の数が複数の場合には、その内の一つが結合
手となる二価の基を含むものであることが好ましい。
い。特定の構造を持つ導電性物質を主骨格とした場合、
酸化還元電位の相違は、その導電性物質が有する置換基
の性質に依存することが多い。従って、互いに異なる導
電性物質としては、上記の導電性物質を主骨格として、
その主骨格に互いに異なる性質の置換基が結合してなる
ものを用いることが、調製の簡便さの点からも好まし
い。上記置換基は、試料核酸断片と結合する際に、結合
手となる二価の基を含むものであることが特に好まし
い。置換基の数が複数の場合には、その内の一つが結合
手となる二価の基を含むものであることが好ましい。
【００５２】結合手となる二価の基を含む置換基を有す
る導電性物質の好ましい具体例を下記式（ＩＩＩ）に示
す。結合手となる二価の基とは、−Ｘ−、−Ｙ−もしく
は−Ｘ−Ｙ−をいう。−Ｘ−および−Ｙ−の内何れか一
方は単結合であってもよい。。−Ｘ−の左側に核酸断片
が結合する。
る導電性物質の好ましい具体例を下記式（ＩＩＩ）に示
す。結合手となる二価の基とは、−Ｘ−、−Ｙ−もしく
は−Ｘ−Ｙ−をいう。−Ｘ−および−Ｙ−の内何れか一
方は単結合であってもよい。。−Ｘ−の左側に核酸断片
が結合する。
【００５３】
【化９】
【００５４】上記式中、Ｘは、試料核酸断片との縮合反
応によって形成される基を表す。Ｙは、単結合、置換基
を有していてもよい炭素原子数が１乃至６のアルキレン
基、あるいは置換基を有していてもよい炭素原子数が１
乃至６のアルケニレン基を表す。炭素原子数が１乃至６
のアルキレン基としては、メチレン基もしくはエチレン
基であることが好ましい。置換基としては、ヒドロキシ
ル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、シア
ノ基、ニトロ基、ホルミル基、ホルミルアミノ基、炭素
原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃至６
のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロゲン
化アルキル基、炭素原子数が５乃至７のシクロアルキル
アミノ基、炭素原子数が２乃至１２のジアルキルアミノ
基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原子数
が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至１
８のアラルキル基、１乃至６のアルキル基を有する炭素
原子数が７乃至１８のアラルキルアミノ基、炭素原子数
が２乃至７のアルカノイル基、炭素原子数が２乃至７の
アルカノイルアミノ基、炭素原子数が３乃至１０のＮ−
アルカノイル−Ｎ−アルキルアミノ基、アミノカルボニ
ル基、炭素原子数が２乃至７のアルコキシカルボニル
基、Ｓ、ＮおよびＯからなる群より選ばれるヘテロ原子
を１乃至４個含む炭素原子数２乃至１０の複素環基、並
びに置換基として炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭
素原子数１乃至６のアルコキシ基、もしくはハロゲン原
子を１乃至５個有していてもよい環構成炭素原子数の数
が６乃至１２のアリール基からなる群より選ばれる原子
もしくは基である。置換基の数は、炭素原子数が１乃至
６のアルキレン基については、１乃至１２個であること
が好ましく、１乃至３個であることが特に好ましい。炭
素原子数が１乃至６のアルケニレン基については、その
数は１乃至１０個であることが好ましく、１乃至３個で
あることが特に好ましい。
応によって形成される基を表す。Ｙは、単結合、置換基
を有していてもよい炭素原子数が１乃至６のアルキレン
基、あるいは置換基を有していてもよい炭素原子数が１
乃至６のアルケニレン基を表す。炭素原子数が１乃至６
のアルキレン基としては、メチレン基もしくはエチレン
基であることが好ましい。置換基としては、ヒドロキシ
ル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、シア
ノ基、ニトロ基、ホルミル基、ホルミルアミノ基、炭素
原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃至６
のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロゲン
化アルキル基、炭素原子数が５乃至７のシクロアルキル
アミノ基、炭素原子数が２乃至１２のジアルキルアミノ
基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原子数
が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至１
８のアラルキル基、１乃至６のアルキル基を有する炭素
原子数が７乃至１８のアラルキルアミノ基、炭素原子数
が２乃至７のアルカノイル基、炭素原子数が２乃至７の
アルカノイルアミノ基、炭素原子数が３乃至１０のＮ−
アルカノイル−Ｎ−アルキルアミノ基、アミノカルボニ
ル基、炭素原子数が２乃至７のアルコキシカルボニル
基、Ｓ、ＮおよびＯからなる群より選ばれるヘテロ原子
を１乃至４個含む炭素原子数２乃至１０の複素環基、並
びに置換基として炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭
素原子数１乃至６のアルコキシ基、もしくはハロゲン原
子を１乃至５個有していてもよい環構成炭素原子数の数
が６乃至１２のアリール基からなる群より選ばれる原子
もしくは基である。置換基の数は、炭素原子数が１乃至
６のアルキレン基については、１乃至１２個であること
が好ましく、１乃至３個であることが特に好ましい。炭
素原子数が１乃至６のアルケニレン基については、その
数は１乃至１０個であることが好ましく、１乃至３個で
あることが特に好ましい。
【００５５】フェロセン分子は、−Ｘ−Ｙ−基の結合位
置を除く他の位置がさらに置換されていてもよい。置換
基としては、カルボン酸基、炭素原子数が２乃至６のジ
アルキルアミノ基を有する炭素原子数が８乃至１２のジ
アルキルアミノアルキレン基、および−ＣＯＮＨ−炭素
原子数が１乃至６のアルキレン基−炭素原子数が２乃至
６のジアルキルアミノ基からなる群より選ばれる基であ
ることが好ましい。置換基の数は、フェロセン一分子に
ついて１乃至９個であることが好ましく、１個であるこ
とが特に好ましい。フェロセン一分子が有する置換基の
種類は複数であってもよい。
置を除く他の位置がさらに置換されていてもよい。置換
基としては、カルボン酸基、炭素原子数が２乃至６のジ
アルキルアミノ基を有する炭素原子数が８乃至１２のジ
アルキルアミノアルキレン基、および−ＣＯＮＨ−炭素
原子数が１乃至６のアルキレン基−炭素原子数が２乃至
６のジアルキルアミノ基からなる群より選ばれる基であ
ることが好ましい。置換基の数は、フェロセン一分子に
ついて１乃至９個であることが好ましく、１個であるこ
とが特に好ましい。フェロセン一分子が有する置換基の
種類は複数であってもよい。
【００５６】二つの、互いに異なる上記式（ＩＩＩ）で
表される導電性物質の特に好ましい組み合わせとして
は、Ｙが単結合を表す導電性基とＹがメチレン基を表す
導電性基との組み合わせを挙げることができる。Ｙを変
化させずに、導電性基の何れか一方のフェロセン分子に
電子吸引性基あるいは電子供与性基を置換させてもよ
い。
表される導電性物質の特に好ましい組み合わせとして
は、Ｙが単結合を表す導電性基とＹがメチレン基を表す
導電性基との組み合わせを挙げることができる。Ｙを変
化させずに、導電性基の何れか一方のフェロセン分子に
電子吸引性基あるいは電子供与性基を置換させてもよ
い。
【００５７】［標識量の検出］電流量の測定は、導電性
基板と導電性物質との間を流れる電流量が測定できる方
法であれば如何なる方法であってもよい。サイクリック
ボルタモグラフィ（ＣＶ）、デファレンシャルパルスボ
ルタモグラフィ（ＤＰＶ）、リニアスィープボルタモグ
ラフィ、ポテンショスタット等を用いることが好まし
い。カウンタ電極とハイブリッドＤＮＡが固定された導
電性電極を電解質溶液に浸漬し、一対の電解系を形成さ
せ、デファレンシャルパルスボルタモグラフィを測定す
ることが特に好ましい。
基板と導電性物質との間を流れる電流量が測定できる方
法であれば如何なる方法であってもよい。サイクリック
ボルタモグラフィ（ＣＶ）、デファレンシャルパルスボ
ルタモグラフィ（ＤＰＶ）、リニアスィープボルタモグ
ラフィ、ポテンショスタット等を用いることが好まし
い。カウンタ電極とハイブリッドＤＮＡが固定された導
電性電極を電解質溶液に浸漬し、一対の電解系を形成さ
せ、デファレンシャルパルスボルタモグラフィを測定す
ることが特に好ましい。
【００５８】本発明の検出方法では、上述の通り、互い
に異なる二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸
断片の存在量（数）比を求めることができる。互いに異
なる二種類の試料の例としては、正常細胞と異常細胞と
の組み合わせ、あるいは特定の菌体の野生株と変異株と
の組み合わせを挙げることができる。具体的には、ＤＮ
Ａ分析素子上のＤＮＡ断片が、例えば、フィブロネクチ
ン産生に関与する遺伝子に相補性を有する塩基配列を持
つものであれば、正常細胞に発現しているフィブロネク
チン産生に関与する遺伝子と胃がん由来の株細胞ＮＵＧ
Ｃ３に発現している該遺伝子とについて、それらの量比
を求めることができる。また、分析素子上のＤＮＡ断片
の種類を変えることによって、例えば、正常細胞と慢性
骨髄性白血病由来の株細胞Ｋ５６２とにそれぞれ発現し
ているフィブロネクチン産生に関与する遺伝子の量比を
求めることもできる。さらに、ＤＮＡ分析素子上の複数
の領域のそれぞれに互いに異なる種類のＤＮＡ断片を固
定しておけば、互いに異なる試料中にそれぞれ発現して
いる複数の種類の遺伝子について、同時に、各遺伝子の
発現量比の解析を行うこともできる。
に異なる二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸
断片の存在量（数）比を求めることができる。互いに異
なる二種類の試料の例としては、正常細胞と異常細胞と
の組み合わせ、あるいは特定の菌体の野生株と変異株と
の組み合わせを挙げることができる。具体的には、ＤＮ
Ａ分析素子上のＤＮＡ断片が、例えば、フィブロネクチ
ン産生に関与する遺伝子に相補性を有する塩基配列を持
つものであれば、正常細胞に発現しているフィブロネク
チン産生に関与する遺伝子と胃がん由来の株細胞ＮＵＧ
Ｃ３に発現している該遺伝子とについて、それらの量比
を求めることができる。また、分析素子上のＤＮＡ断片
の種類を変えることによって、例えば、正常細胞と慢性
骨髄性白血病由来の株細胞Ｋ５６２とにそれぞれ発現し
ているフィブロネクチン産生に関与する遺伝子の量比を
求めることもできる。さらに、ＤＮＡ分析素子上の複数
の領域のそれぞれに互いに異なる種類のＤＮＡ断片を固
定しておけば、互いに異なる試料中にそれぞれ発現して
いる複数の種類の遺伝子について、同時に、各遺伝子の
発現量比の解析を行うこともできる。
【００５９】
【実施例】［実施例１］ （１）ＤＮＡ分析素子の作製 面積が２．２５ｍｍ2の金電極に、Ｃ末端にメルカプト
ヘキシル基を導入した１００ピコモル／１μＬのチミン
の２０量体を含む水溶液２μＬを滴下し、室温で１時間
放置することによってＤＮＡ分析素子を作製した。 （２）標識試料ＤＮＡ断片の調製 文献（Takenaka et al., Analytical Biochemistry, 21
8, 436-443(1994)）に記載された方法に従って、下記式
で順に表される、酸化還元電位が互いに異なる二種類の
フェロセン標識オリゴヌクレオチド、Ｆ１−Ａ20および
Ｆ２−Ａ20を調製した。Ａはアデニンを示す。
ヘキシル基を導入した１００ピコモル／１μＬのチミン
の２０量体を含む水溶液２μＬを滴下し、室温で１時間
放置することによってＤＮＡ分析素子を作製した。 （２）標識試料ＤＮＡ断片の調製 文献（Takenaka et al., Analytical Biochemistry, 21
8, 436-443(1994)）に記載された方法に従って、下記式
で順に表される、酸化還元電位が互いに異なる二種類の
フェロセン標識オリゴヌクレオチド、Ｆ１−Ａ20および
Ｆ２−Ａ20を調製した。Ａはアデニンを示す。
【００６０】
【化１０】
【００６１】
【化１１】
【００６２】（３）試料ＤＮＡ断片の検出 （イ）Ｆ１−Ａ20の検出 前記（１）で得たＤＮＡ分析素子の表面に、８０ピコモ
ルのフェロセン標識オリゴヌクレオチドＦ１−Ａ20を含
む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）溶液の２μＬを
滴下し、２５℃にて３０分間インキュベートした。次い
で、分析素子表面を純水にて洗浄し、未反応のＦ１−Ａ
20を除去した。３８℃にて、０．１Ｍ塩化カリウム−
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）溶液に、純水で洗浄
後の分析素子を浸漬し、印加電圧が１００乃至７００ｍ
Ｖの範囲にて、デファレンシャル・パルス・ボルタンメ
トリを行ったところ、４６０ｍＶにおいてＦ１−Ａ20に
由来する応答電流が認められ、その電流値は６．０μＡ
であった（図２の１）。 （ロ）Ｆ２−Ａ20の検出 Ｆ１−Ａ20の代わりにＦ２−Ａ20を用いる以外は上記
（イ）と同様にしてデファレンシャル・パルス・ボルタ
ンメトリを行ったところ、２６０ｍＶの印加電圧におい
てＦ２−Ａ20に由来する応答電流が認められ、その電流
値は６．０μＡであった（図２の２）。
ルのフェロセン標識オリゴヌクレオチドＦ１−Ａ20を含
む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）溶液の２μＬを
滴下し、２５℃にて３０分間インキュベートした。次い
で、分析素子表面を純水にて洗浄し、未反応のＦ１−Ａ
20を除去した。３８℃にて、０．１Ｍ塩化カリウム−
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）溶液に、純水で洗浄
後の分析素子を浸漬し、印加電圧が１００乃至７００ｍ
Ｖの範囲にて、デファレンシャル・パルス・ボルタンメ
トリを行ったところ、４６０ｍＶにおいてＦ１−Ａ20に
由来する応答電流が認められ、その電流値は６．０μＡ
であった（図２の１）。 （ロ）Ｆ２−Ａ20の検出 Ｆ１−Ａ20の代わりにＦ２−Ａ20を用いる以外は上記
（イ）と同様にしてデファレンシャル・パルス・ボルタ
ンメトリを行ったところ、２６０ｍＶの印加電圧におい
てＦ２−Ａ20に由来する応答電流が認められ、その電流
値は６．０μＡであった（図２の２）。
【００６３】［参考例］チミンの２０量体の代わりにア
デニンの２０量体を用いる以外は実施例１の（１）と同
様にしてＤＮＡ分析素子を作製し、そのＤＮＡ分析素子
を使用する以外は、実施例１の（３）と同様にして、Ｆ
１−Ａ20およびＦ２−Ａ20についてそれぞれデファレン
シャル・パルス・ボルタンメトリを行ったところ、何れ
の場合にも応答電流は認められなかった。
デニンの２０量体を用いる以外は実施例１の（１）と同
様にしてＤＮＡ分析素子を作製し、そのＤＮＡ分析素子
を使用する以外は、実施例１の（３）と同様にして、Ｆ
１−Ａ20およびＦ２−Ａ20についてそれぞれデファレン
シャル・パルス・ボルタンメトリを行ったところ、何れ
の場合にも応答電流は認められなかった。
【００６４】［実施例２］ＤＮＡ分析素子上のＤＮＡ断
片に相補的な試料ＤＮＡ断片の試料中の存在量比の確認 試料ＤＮＡ断片として、４０ピコモルのＦ１−Ａ20と４
０ピコモルのＦ２−Ａ 20とからなる混合物を含むトリス
緩衝液を用いる以外は、実施例１と同様にして、印加電
圧４６０ｍＶおよび２６０ｍＶにおける応答電流をそれ
ぞれ測定した（図３）。また、Ｆ１−Ａ20のモル数が
０、２０、６０および８０ピコモルの場合についても、
それぞれ、混合物の総モル数が８０ピコモルとなるよう
に調製した混合物を用いて、印加電圧４６０ｍＶおよび
２６０ｍＶにおける応答電流を測定した（図３）。図３
の−黒塗り四角−は、印加電圧４６０ｍＶにおける応答
電流を、−黒塗り丸−は、印加電圧２６０ｍＶにおける
応答電流をそれぞれ表す。
片に相補的な試料ＤＮＡ断片の試料中の存在量比の確認 試料ＤＮＡ断片として、４０ピコモルのＦ１−Ａ20と４
０ピコモルのＦ２−Ａ 20とからなる混合物を含むトリス
緩衝液を用いる以外は、実施例１と同様にして、印加電
圧４６０ｍＶおよび２６０ｍＶにおける応答電流をそれ
ぞれ測定した（図３）。また、Ｆ１−Ａ20のモル数が
０、２０、６０および８０ピコモルの場合についても、
それぞれ、混合物の総モル数が８０ピコモルとなるよう
に調製した混合物を用いて、印加電圧４６０ｍＶおよび
２６０ｍＶにおける応答電流を測定した（図３）。図３
の−黒塗り四角−は、印加電圧４６０ｍＶにおける応答
電流を、−黒塗り丸−は、印加電圧２６０ｍＶにおける
応答電流をそれぞれ表す。
【００６５】図３より、２６０ｍＶにおけるピーク電流
値と４６０ｍＶにおけるピーク電流値との比は、試料に
含まれるＦ２−Ａ20の濃度とＦ１−Ａ20の濃度との比に
対応することが分かる。
値と４６０ｍＶにおけるピーク電流値との比は、試料に
含まれるＦ２−Ａ20の濃度とＦ１−Ａ20の濃度との比に
対応することが分かる。
【００６６】［実施例３］ＰＮＡ分析素子上のＰＮＡ断
片に相補的な試料ＤＮＡ断片の試料中の存在量比の確認 （１）ＰＮＡ分析素子の作製 下記式で表されるペプチド核酸：ＰＮＡ−Ｈ2Ｎ−Ｌｙ
ｓ−Ｔ10−Ｈ（以下「ＰＮＡ−Ｔ10」という。）を、文
献（P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemic
al Society, 114, 1895-1897(1992)および同114, 9677-
9678(1992)）に記載の方法に従って合成した。Ｔは、チ
ミンを表し、式の左端がＰＮＡのＣ末端、右端がＰＮＡ
のＮ末端をそれぞれ表す。
片に相補的な試料ＤＮＡ断片の試料中の存在量比の確認 （１）ＰＮＡ分析素子の作製 下記式で表されるペプチド核酸：ＰＮＡ−Ｈ2Ｎ−Ｌｙ
ｓ−Ｔ10−Ｈ（以下「ＰＮＡ−Ｔ10」という。）を、文
献（P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemic
al Society, 114, 1895-1897(1992)および同114, 9677-
9678(1992)）に記載の方法に従って合成した。Ｔは、チ
ミンを表し、式の左端がＰＮＡのＣ末端、右端がＰＮＡ
のＮ末端をそれぞれ表す。
【００６７】
【化１２】
【００６８】表面にメルカプト基を有する面積が２．２
５ｍｍ2の金電極に、１，２−ビス（ビニルスルホニル
アセトアミド）エタンのリン酸緩衝液を滴下して得られ
る、一方の端部のビニルスルホニル基が遊離な金電極
に、１００ピコモル／１μＬのチミンの１０量体である
ＰＮＡ−Ｔ10の水溶液（２μＬ）を滴下し、室温で１時
間放置してＰＮＡ修飾電極を作製した。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ＤＮＡ分析素子を用いる代わりに上記（１）で作製した
ＰＮＡ分析素子を用いる以外は実施例２と同様の操作を
行って、Ｆ１−Ａ20とＦ２−Ａ20とからなる混合物の応
答電流を測定した。図４の−黒塗り四角−は、印加電圧
４６０ｍＶにおける応答電流を、−黒塗り丸−は、印加
電圧２６０ｍＶにおける応答電流をそれぞれ表す。
５ｍｍ2の金電極に、１，２−ビス（ビニルスルホニル
アセトアミド）エタンのリン酸緩衝液を滴下して得られ
る、一方の端部のビニルスルホニル基が遊離な金電極
に、１００ピコモル／１μＬのチミンの１０量体である
ＰＮＡ−Ｔ10の水溶液（２μＬ）を滴下し、室温で１時
間放置してＰＮＡ修飾電極を作製した。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ＤＮＡ分析素子を用いる代わりに上記（１）で作製した
ＰＮＡ分析素子を用いる以外は実施例２と同様の操作を
行って、Ｆ１−Ａ20とＦ２−Ａ20とからなる混合物の応
答電流を測定した。図４の−黒塗り四角−は、印加電圧
４６０ｍＶにおける応答電流を、−黒塗り丸−は、印加
電圧２６０ｍＶにおける応答電流をそれぞれ表す。
【００６９】図４より、ＰＮＡ分析素子を用いても、Ｄ
ＮＡ分析素子を用いた場合と同様な結果が認められた。
また、ＤＮＡ分析素子と比べると、さらに感度よく検出
できることが分かる。
ＮＡ分析素子を用いた場合と同様な結果が認められた。
また、ＤＮＡ分析素子と比べると、さらに感度よく検出
できることが分かる。
【００７０】
【発明の効果】本発明の検出方法は、互いに異なる二種
類以上の試料中における試料核酸断片の存在量の差を検
出する二蛍光標識法に対して、標識を導電性物質に変え
た初めての電気化学的な方法である。本発明の検出方法
は、従来の二蛍光標識法と比較して、迅速・簡便であ
り、感度が高く、コストが低い。また、試料核酸断片と
して、試料中に発現しているｍＲＮＡあるいはそのｍＲ
ＮＡから作製されたｃＤＮＡを用いれば、互いに異なる
試料中の、特定のタンパク質の産生に関与する遺伝子の
発現の差を求めることもできる。ＤＮＡ分析素子をＰＮ
Ａ分析素子に代えても、上記と同様な検出が可能であ
る。
類以上の試料中における試料核酸断片の存在量の差を検
出する二蛍光標識法に対して、標識を導電性物質に変え
た初めての電気化学的な方法である。本発明の検出方法
は、従来の二蛍光標識法と比較して、迅速・簡便であ
り、感度が高く、コストが低い。また、試料核酸断片と
して、試料中に発現しているｍＲＮＡあるいはそのｍＲ
ＮＡから作製されたｃＤＮＡを用いれば、互いに異なる
試料中の、特定のタンパク質の産生に関与する遺伝子の
発現の差を求めることもできる。ＤＮＡ分析素子をＰＮ
Ａ分析素子に代えても、上記と同様な検出が可能であ
る。
【図１】本発明の遺伝子の発現解析の代表的な方法を示
す模式図である。
す模式図である。
【図２】実施例１における、印加電圧と応答電流との関
係を示すグラフである。
係を示すグラフである。
【図３】実施例２にける、混合試料中のＦ１−Ａ20の割
合と応答電流との関係を示すグラフである。
合と応答電流との関係を示すグラフである。
【図４】実施例３にける、混合試料中のＦ１−Ａ20の割
合と応答電流との関係を示すグラフである。
合と応答電流との関係を示すグラフである。
１ａ 試料ａ １ｂ 試料ｂ ２ 試料ａから得られた試料核酸断片あるいは試料ｂか
ら得られた試料核酸断片 ３ａ 導電性物質ａ ３ｂ 導電性物質ｂ ４ａ 導電性物質ａが結合した試料核酸断片 ４ｂ 導電性物質ｂが結合した試料核酸断片 ５ ＤＮＡ分析素子 ６ ＤＮＡ分析素子上の一領域 ７ ＤＮＡ分析素子上の一領域に固定されている、試料
核酸断片に相補性を有するＤＮＡ断片 ８ ＤＮＡ分析素子上の一領域におけるハイブリッドＤ
ＮＡ
ら得られた試料核酸断片 ３ａ 導電性物質ａ ３ｂ 導電性物質ｂ ４ａ 導電性物質ａが結合した試料核酸断片 ４ｂ 導電性物質ｂが結合した試料核酸断片 ５ ＤＮＡ分析素子 ６ ＤＮＡ分析素子上の一領域 ７ ＤＮＡ分析素子上の一領域に固定されている、試料
核酸断片に相補性を有するＤＮＡ断片 ８ ＤＮＡ分析素子上の一領域におけるハイブリッドＤ
ＮＡ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｂ ３３６Ｇ ３３６Ｍ (72)発明者 小川 雅司 東京都港区西麻布２丁目26番30号 富士写 真フイルム株式会社内 (72)発明者 高木 誠 福岡県福岡市博多区昭南町３−４−29 (72)発明者 竹中 繁織 福岡県古賀市舞の里４−23−21 (72)発明者 山下 健一 福岡県福岡市城南区堤団地17−104 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 AA20 CA01 CA09 CA11 CA20 HA13 HA14 4B029 AA07 AA21 BB20 CC01 CC03 CC08 FA12 FA15 4B063 QA01 QA20 QQ42 QQ52 QR31 QR32 QR38 QR41 QR55 QR84 QS34 QX05
Claims (4)
- 【請求項１】 （１）導電性基板の表面に固定された既
知の塩基配列を有するＤＮＡ断片に相補性を有し、かつ
互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、そ
れぞれ、酸化還元電位が互いに異なる導電性物質で標識
することにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を
調製する工程；（２）導電性基を結合させた試料核酸断
片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、
上記のＤＮＡ断片が導電性基板の表面に固定されてなる
ＤＮＡ分析素子に接触させる工程；（３）該分析素子
に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、
それぞれの電位における、該分析素子と導電性基との間
を流れる電流を測定する工程；そして、（４）各電位に
おける電流量を互いに比較することによって、二種類以
上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検
出する方法。 - 【請求項２】 （１）導電性基板の表面に固定された既
知の塩基配列を有するＰＮＡ断片に相補性を有し、かつ
互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、そ
れぞれ、酸化還元電位が互いに異なる導電性物質で標識
することにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を
調製する工程；（２）導電性基を結合させた試料核酸断
片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、
上記のＰＮＡ断片が導電性基板の表面に固定されてなる
ＰＮＡ分析素子に接触させる工程；（３）該分析素子
に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、
それぞれの電位における、該分析素子と導電性基との間
を流れる電流を測定する工程；そして、（４）各電位に
おける電流量を互いに比較することによって、二種類以
上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検
出する方法。 - 【請求項３】 互いに異なる酸化還元電位を示す導電性
物質として、共に、０乃至８００ｍＶの範囲に酸化還元
電位を有する物質であって、その酸化還元電位の差が５
０ｍＶ以上である物質を用いることを特徴とする請求項
１もしくは２に記載の方法。 - 【請求項４】 電流の測定をデファレンシャルパルスボ
ルタモグラフィによって行うことを特徴とする請求項１
もしくは２に記載の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000187486A JP4272800B2 (ja) | 2000-06-22 | 2000-06-22 | 複数の電位を用いる遺伝子の発現解析 |
| US09/887,625 US6864055B2 (en) | 2000-06-22 | 2001-06-22 | Method for detecting nucleic acids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000187486A JP4272800B2 (ja) | 2000-06-22 | 2000-06-22 | 複数の電位を用いる遺伝子の発現解析 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002000299A true JP2002000299A (ja) | 2002-01-08 |
| JP4272800B2 JP4272800B2 (ja) | 2009-06-03 |
Family
ID=18687457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000187486A Expired - Fee Related JP4272800B2 (ja) | 2000-06-22 | 2000-06-22 | 複数の電位を用いる遺伝子の発現解析 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP4272800B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010004781A (ja) * | 2008-06-25 | 2010-01-14 | Canon Inc | 核酸増幅装置およびそれを用いた核酸分析装置 |
| US8026348B2 (en) | 2003-05-02 | 2011-09-27 | Lesnikowski Zbigniew J | Nucleoside derivative, modified oligonucleotide, method for their synthesis and applications thereof |
| JP2013539981A (ja) * | 2010-10-22 | 2013-10-31 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | チオフィリック固相およびチオオキソヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの間のコンジュゲート |
Families Citing this family (4)
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|---|---|---|---|---|
| JP3398366B2 (ja) * | 2000-08-09 | 2003-04-21 | 富士写真フイルム株式会社 | Ｄｎａ分析用マイクロアレイの製造方法 |
| JP4262426B2 (ja) * | 2001-09-03 | 2009-05-13 | 富士フイルム株式会社 | 核酸断片固定電極及びその利用 |
| GB0205455D0 (en) | 2002-03-07 | 2002-04-24 | Molecular Sensing Plc | Nucleic acid probes, their synthesis and use |
| WO2018213790A2 (en) * | 2017-05-18 | 2018-11-22 | Arizona Board Of Regents On Behaft Of Arizona State University | Apparatus for analyzing and detecting interactions and reactions of molecules |
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|---|---|---|---|---|
| US6541617B1 (en) * | 1998-10-27 | 2003-04-01 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Detection of target analytes using particles and electrodes |
| US6361671B1 (en) * | 1999-01-11 | 2002-03-26 | The Regents Of The University Of California | Microfabricated capillary electrophoresis chip and method for simultaneously detecting multiple redox labels |
-
2000
- 2000-06-22 JP JP2000187486A patent/JP4272800B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-06-22 US US09/887,625 patent/US6864055B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8026348B2 (en) | 2003-05-02 | 2011-09-27 | Lesnikowski Zbigniew J | Nucleoside derivative, modified oligonucleotide, method for their synthesis and applications thereof |
| JP2010004781A (ja) * | 2008-06-25 | 2010-01-14 | Canon Inc | 核酸増幅装置およびそれを用いた核酸分析装置 |
| JP2013539981A (ja) * | 2010-10-22 | 2013-10-31 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | チオフィリック固相およびチオオキソヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの間のコンジュゲート |
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|---|---|
| JP4272800B2 (ja) | 2009-06-03 |
| US6864055B2 (en) | 2005-03-08 |
| US20020076717A1 (en) | 2002-06-20 |
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