KR20220004175A - 암 종양에 대한 맞춤화된 하이포면역 나노소포체 전달 시스템 - Google Patents

암 종양에 대한 맞춤화된 하이포면역 나노소포체 전달 시스템 Download PDF

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Abstract

항체 단편 scFV 영역을 통해 또는 바이러스 에피토프 인식 수용체(VERR)에 의해 표적 생체표지자를 인식할 수 있는 맞춤화된 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 하이포면역원성 유도 만능 줄기 세포(iPSC)-유도된 생체모방 나노소포체(하이포-바이오NV). 하이포-바이오NV의 제조 방법. 하이포-바이오NV를 개체에게 투여하고, 암 세포를 표적화하고, 암을 치료하는 것에 의한 암이 있는 개체의 치료 방법. 하이포-바이오NV를 개체에게 투여하고, 파괴될 또는 치료될 세포를 표적화함으로써, 개체에서 세포를 표적화하는 방법.

Description

암 종양에 대한 맞춤화된 하이포면역 나노소포체 전달 시스템
본 발명은 치료제 및 유전자 편집 화합물의 전달을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
병든 세포에 유전자 편집 치료제의 생체 내 전달을 효과적으로 표적화하는 것은 현대 생명공학에서 가장 큰 도전 중 하나로 남아있다. 최근 개선들에도, 전달 메커니즘은, 일관되지 않은 낮은 빈도의 표적화, 낮은 표적화 적응성, 비-자가성 접근의 결여, 높은 면역 중화, 높은 제조 비용, 규제 장애들(FDA 임상 보류), 적은 양의 생산/수집/확장, 패키징(packaging) 크기 제약, 비효율적 패키징, 장기 악화(organ sinking)(간 및 골수), 전달 소포체의 낮은 반감기, 및 IP 락-업(lock-up)과 같은 억제 문제들을 계속 갖고 있다.
AAV(아데노-연관 바이러스)는 유전자 편집 치료제용 벡터로서 흔히 사용되는 벡터 중 하나이다. AAV는 대략 22 nm의 크기를 갖는다. AAV는 높은 간 악화(새로운 돌연변이에서는 더 낮음), 제한된 투약(dosing)(새로운 혈청형에서는 더 높음), 대략 1100개 아미노산인 크기 제한을 가지며, 대부분의 혈청형은 크기조절이 가능하며(scalable), 표적화 효율은 혈청형 조직친화성(tropism)에 의해 제한된다.
리포솜은 또한 전달 메커니즘으로서 사용될 수 있다. 리포솜은 크기가 50 내지 1000 nm이다. 장기 악화 및 중화 효과는 RES(망상내피세포계), EPR(증진된 침투 및 유지), ABC(가속화된 혈중 제거율), CARPA(보체 활성화-관련 가성알레르기(pseudoallergy)), 및 옵소닌화(opsonization)를 포함한다. 면역 중화는 다양하며 리간드 의존적이다. 크기 제약은 없지만, 활성 부하는 대부분 값비싼 화합물을 필요로 한다. 제조는 또한 리간드 첨가 또는 PEG화(PEGylation)를 포함할 수 있다. 리포솜은 리간드로 표적화되며, 종양 침투가 좋지 않다.
조정성(tunable) 덴드리머는 1.5 내지 10 nm다. 이들은 혈액 단백질과 고도로 상호작용하며 증가된 IgG 대식세포 Fc 제거율을 갖는다. 패키징 제약은 외부적으로 컨쥬게이트된(conjugated) 핵산인 것을 포함한다. 조정성 덴드리머는 유전자 편집을 이용한 이용에서 널리 시험된 바 없다.
중합체성 마이셀(micelle)은 크기가 10 내지 100 nm이다. 장기 악화 또는 중화 효과 또는 면역 중화는 알려져 있지 않다. 크기 제약은 없을 수 있으며, 이들은 유전자 편집에 대해 널리 시험된 바 없다. 이들은 리간드로 표적화되고 자극 유도성/방출성이다.
엑소좀은 크기가 30 내지 150 nm이다. 이들의 장기 악화 및 중화 효과는 높지만, 새로운 돌연변이를 이용하여 더 낮을 수 있다. 이들은 낮은 면역원성을 갖지만, 그 정도는 각각의 리간드에 따라 다르다. 크기에서의 제약은 없지만, 이들은 부하에 있어 매우 비효율적이다. 이는 또한 치료량을 생산하는 것이 어렵다. 이들은 평균 종양 침투를 이용하여 리간드로 표적화된다.
CAR T-세포법도 또한 암을 치료하기 위해 세포를 표적화하는 데 사용되어 왔다. CAR T-세포 치료법은, 암을 치료하기 위해 환자 자신의 면역 세포(T 세포)의 수집을 필요로 하는 암 치료법이다. T-세포는 정상적으로 침입성 미생물을 공격하지만, CAR T-세포 치료법에서, T-세포는 암세포를 공격하도록 재조작된다. 먼저, T-세포는 환자의 혈액으로부터 분리되고, T-세포가 특이적 종양 항원에 부착되도록 허용하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 T-세포의 표면 상에서 생산하도록 유전자 조작된다. CAR은 자연에 존재하지 않으며, 합성 항체들의 단편들로 구성된다. CAR은 작용을 위해, 신호전달 및 T-세포 내부의 공동-자극 도메인에 의존한다.
일단 CAR T-세포가 생산되면, 이들은 확장되어 다량으로 생산되어 이후 환자에게 다시 주입될 수 있다. 일반적으로, 환자는 주입 전에 림프구를 고갈시키도록 화학요법을 받았다. CAR T-세포는 이들이 설계된 목적인 암세포 상 종양 항원에 유인되고, 그러한 항원을 갖는 암세포를 죽인다.
CAR T-세포 치료법은 아동에서 급성 림프모구 백혈병(ALL) 및 성인에서 진행성 림프종의 치료를 위해 승인되었다. 예를 들어, CD-19를 표적화하는 CAR T-세포(티산젠렉류셀(tisangenlecleucel), KYMRIAH™, Novartis)가 ALL을 치료하는 데 사용되어 왔다. YESCARTA™(악시캅타젠 사일로루셀(axicabtagene ciloleucel), Kite Pharmaceuticals)는 림프종에 사용된다. CD-19 발현을 잃은 세포에서 CD-22를 표적화하기 위한 연구도 또한 수행되어 왔다. 백혈병에서 CD-19 및 CD-123의 이중 표적화도 또한 연구되어 왔다. 다발성 골수종의 경우, BCMA를 표적화하는 CAR T-세포가 개발되어 왔다. CAR T-세포가 고형 종양을 치료할 수 있는지 여부는 그를 둘러싼 미세환경으로 인하여 현재 불명확하지만, 췌장암 및 폐암에서 발현되는 메소텔린, 및 교모세포종에서 발현되는 EGFRvIII의 표적화에 의한 연구들이 수행되고 있다.
CAR T-세포 치료법에는 몇몇 결점들이 존재한다. 고열 및 저혈압을 초래하는 시토카인 방출 증후군을 유발할 수 있다. 이는 IL-6 활성 차단을 이용하는 추가의 처리를 필요로 할 수 있다. 이는 또한 B 세포 자연 소멸(B 세포 무형성)을 유발할 수 있고, 항체를 제공하기 위해 면역글로불린을 이용하는 추가의 처리를 필요로 할 수 있다. 기타 부작용은 뇌부종 및 신경독성을 포함한다. 환자들은 또한 수확 및 조작할 충분한 T-세포를 갖지 않을 수 있다. 특히 종양 세포가 항원 발현을 잃은 경우, 2회차의 치료가 필요할 수 있다.
또 다른 전달 비히클은 생체모방 나노소포체(바이오NV(BioNV)) 또는 생체작용화된 리포솜-유사 나노소포체(BLN)로, 이는 엑소좀과 유사하지만 더 큰 생물학적으로 유도된 나노크기 소포체이다. 바이오NV는 수동적 표적화(종양 조직에 축적)(문헌 [Wu, et al. (2018)]), 활성 표적화(기능화된 나노소포체가 종양 세포에서 수용체를 인식함) (가장 최근으로는, 문헌 [Zhang, et al. (2018), Goh, et al. (2017), 및 Lunavat, et al. (2016)])을 이용하여 암세포의 치료에 성공적으로 사용되어 왔다. 나아가, 이들은 항-염증성 특성의 시험(α4β7 인테그린 - 염증성 장 질환에서의 영향)(문헌 [Corbo, et al. (2017)]), 및 일차(primary) 간세포로부터 유도된 경우 간세포 증식(문헌 [Wu, et al. (2018)])에 성공적으로 사용되어 왔다. 문헌 [Molinaro, et al. (2018)]은 마이크로유체계 플랫폼을 이용하여 생체모방 나노소포체의 이중층 내에 막 단백질을 포함시켰으며, 이는 공여체 세포의 수명을 연장시키고, 생물학적 기능을 보유하였다. 문헌 [Jang, et al. (2013)]은 공극 크기가 감소되는 필터들을 통한 일련의 압출을 이용하여 단핵구 또는 대식세포의 분해에 의해 생산된, 전신 투여 후 화학요법치료제를 종양 조직으로 전달하는 생체영감(bioinspired) 엑소좀-모방 나노소포체를 개발하였다. 나노소포체는 혈장 막 단백질의 위상배치를 유지함으로써 세포의 천연 표적화 능력을 가졌으며, 화학요법치료 약물-부하 나노소포체는 종양 조직으로 운반되어 종양 성장을 감소시켰다.
엑소좀에 비해 바이오NV를 이용하는 것에는 몇 가지 장점들이 있다. 바이오NV는 (환자로부터 수확된 경우 제한되는) 엑소좀 수집보다 제조하는 것이 훨씬 더 용이하다. 바이오NV는 따라서 훨씬 더 크기조절이 가능하며, 제조가 훨씬 더 용이하다.
바이오NV는 CRISPR Cas9 시스템에 대한 전달 비히클의 한 가지 옵션이다(미국 특허 출원 공개 20160281111, 20170022507, 20180119123, 20180155789, 20180236103, 및 20180251770). 바이오NV는 또한 CRISPR에 의해 조작될 수 있다(미국 특허 출원 공개 20190085284). 미국 특허 출원 공개 20190060483(Dooley, et al.)은 나노소포체의 정제 방법을 개시하며, 정제는 엑소좀 상의 표면 단백질에 관련될 수 있다.
신체에서 유전자 편집 산물 및 기타 치료제를 효과적으로 전달할 수 있는 전달 시스템뿐만 아니라, CAR T-세포 표적화를 이용할 수 있는 전달 시스템에 대한 요구가 여전히 남아있다.
본 발명은 초음파 처리, 세제에 의한 파열, 효소에 의한 파열, 또는 전기천공 방법에 의해 유전자 편집된 iPSC의 세포막을 파괴하여 바이오NV를 생산하고, 그후 마이크로여과, 친화 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 겔 정제, 원심분리 또는 이들의 조합의 방법에 의해 바이오NV를 정제함으로써, 유전자 편집된 iPSC로부터 생체모방 나노소포체(바이오NV)를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 방법(들)에 의해 생산된 바이오NV를 제공한다.
본 발명은 질환 치료를 위해 바이오NV 내에 패키징된 치료제의 조성물을 제공한다.
본 발명은 초음파 처리, 세제에 의한 파열, 효소에 의한 파열, 또는 전기천공 방법에 의해, 표적화 표면 마커를 갖는 유전자 편집된 iPSC의 세포막을 파괴함으로써 표적화 능력을 갖는 바이오NV의 생성 방법을 제공한다.
본 발명은 표적화 능력을 갖는 바이오NV를 제공한다.
본 발명은 또한 표적화 능력을 갖는 바이오NV 내에 패키징된 치료제 조성물을 제공한다.
본 발명은, 항체 단편 scFV 영역을 통해 또는 바이러스 에피토프 인식 수용체(VERR)에 의해 표적 생체표지자(biomarker)를 인식할 수 있는 맞춤화된(tailored) 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 하이포면역원성(hypoimmunogenic) 유도 만능 줄기 세포(iPSC)-유도된 생체모방 나노소포체(하이포-바이오NV)를 제공한다. VERR의 예는 다양한 암세포 상에서 TEM8을 표적화하는 SVV의 vp1, vp2, 또는 vp3일 수 있다. 관심 대상의 임의의 세포의 바이오NV 표적화를 가능하도록 하기 위한 CAR 설계에서 어느 하나가 사용될 수 있다. 바이오NV는 또한 선택된 임의의 생물학적 약물을 캡슐화 및 전달할 수 있다.
본 발명은 하이포-바이오NV의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 하이포-바이오NV를 개체에게 투여하고, 암 세포를 표적화하고 암을 치료하는 것에 의한 암이 있는 개체의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 하이포-바이오NV를 개체에게 투여하고, 파괴 또는 치료될 세포들을 표적화함으로써 개체에서 세포를 표적화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 기타 장점은, 첨부된 도면과 함께 고려될 때 아래의 상세한 설명을 참조하여 더 잘 이해됨에 따라, 쉽게 이해된다:
도 1은 본 발명의 생체모방 나노소포체의 유도를 나타내는 도식이다;
도 2는 하이포면역원성 iPSC-유도된 생체모방 나노소포체(하이포-바이오NV)의 예다;
도 3은 유전자 편집에서의 이용을 위한 하이포-바이오NV의 예다;
도 4는 하이포-바이오NV가 어떻게 제조되는지 나타내는 도식이다;
도 5는 2개의 상이한 바이오NV의 도식이다;
도 6은 바이오NV의 두 경로의 도식이다;
도 7은 바이오NV의 두 경로의 도식이다;
도 8은 제조 공정의 도식이다;
도 9는 크기 분포의 그래프이다;
도 10은 하이포-바이오NV의 예를 나타낸다.
본 발명은 항체 단편 scFV 영역을 통해 또는 바이러스 에피토프 인식 수용체(VERR)에 의해 표적 생체표지자를 인식할 수 있는 맞춤화된 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 하이포면역원성 유도 만능 줄기 세포(iPSC)-유도된 생체모방 나노소포체(하이포-바이오NV)를 제공한다. 관심 대상의 임의의 세포의 바이오NV 표적화가 가능하도록 CAR 설계에 어느 하나가 사용될 수 있다. 바이오NV는 또한 선택된 임의의 소분자, 생물학적, 핵 및/또는 유전자 편집 치료제를 캡슐화하고, 임의의 의도된 세포 표적에 전달하여, 질환, 특히 바이러스에 의해 유발된 질환들을 치료할 수 있다. 바이오NV의 제조 방법을 도 1에 나타내고, 하이포-바이오NV의 예는 도 2에 나타낸다.
본 명세서에 사용된 것과 같은 "바이오NV(BioNV)"는 설계된 생물학적 작용화를 가질 수 있는 생물학적으로 유도된 나노크기의 소포체를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 것과 같은 "iPSC"는, 성체 세포로부터 직접 생성될 수 있는 줄기 세포인, 유도 만능 줄기 세포를 지칭한다. iPSC는 무기한적으로 증식할 수 있고, 체내에서 어떤 세포 유형이든 될 수 있다.
용어 "벡터"는 클로닝 및 발현 벡터 뿐만 아니라, 바이러스 벡터 및 통합(또는 비-통합) 벡터를 포함한다. "발현 벡터"는 조절 영역을 포함하는 벡터이다. 벡터는 또한 아래에서 추가로 기재된다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 통합 및 비-통합 렌티바이러스 벡터를 모두 포함한다.
바이러스는 두 사이클 중 하나, 즉 용균성 사이클 또는 용원성 사이클 중 하나에 의해 복제된다. 용균성 사이클에서, 먼저 바이러스는 숙주 세포에 침입하고, 바이러스 자신의 핵산을 방출한다. 그 후, 숙주 세포의 대사 기구는 바이러스 핵산을 복제하고, 숙주 세포 내에 바이러스를 축적하기 위해 사용된다. 충분한 비리온이 숙주 세포 내에 생산되면, 숙주 세포가 파열하고(용해), 비리온이 계속 추가의 세포를 감염시킨다. 용균성 바이러스는 바이러스 DNA를 숙주 게놈(genome) 내로 통합할 수 있을 뿐만 아니라, 세포의 감염 기간에 걸쳐 용균이 일어나지 않는 경우 통합되지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용된 것과 같은 "용원성 바이러스"는 용원성 사이클에 의해 복제되는 바이러스를 지칭한다(즉, 숙주 세포의 파열을 유발하지 않고, 바이러스 핵산을 숙주 세포 DNA 내로 통합함). 용원성 바이러스는 주로 용원성 사이클에 의해 복제될 수 있지만, 때때로 용균성 사이클에 의해 복제된다. 용원성 사이클에서, 비리온 DNA는 숙주 세포 내로 통합되고, 숙주 세포가 번식할 때, 비리온 DNA는 세포 분열로부터 생성된 세포 내로 복제된다. 용원성 사이클에서, 숙주 세포는 파열되지 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법으로 처리되는 용원성 바이러스는 이에 제한되지는 않지만, A형 간염, B형 간염, D형 간염, HSV-1, HSV-2, 거대세포바이러스, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 수두대상포진 바이러스, HIV1, HIV2, HTLV1, HTLV2, 라우스 육종 바이러스, HPV 바이러스, 황열, 지카, 뎅기, 웨스트 나일(West Nile), 일본 뇌염, 광견병 바이러스, 수포성바이러스, 사이토합토바이러스(cytohabdovirus), 한탄 바이러스, 리프트 밸리(Rift Valley) 바이러스, 부냠웨라(Bunyamwera) 바이러스, 라싸(Lassa) 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스, 타카리베(Tacaribe) 바이러스, 플렉살(Flexal) 바이러스, 화이트워터 아로요(Whitewater Arroyo) 바이러스, 에볼라, 마르부르크(Marburg) 바이러스, JC 바이러스, 및 BK 바이러스를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 것과 같은 "용균성 바이러스"는 용균성 사이클에 의해 복제되는 바이러스를 지칭한다(즉, 세포 내에서 바이러스의 축적 후 숙주 세포의 파열을 유발함). 용균성 바이러스는 주로 용균성 사이클에 의해 복제될 수 있지만, 때때로 용원성 사이클에 의해 복제된다. 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 처리되는 용균성 바이러스는 이에 제한되지는 않지만, A형 간염, C형 간염, D형 간염, 콕사키바이러스, HSV-1, HSV-2, 거대세포바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 수두대상포진 바이러스, HIV1, HIV2, HTLV1, HTLV2, 라우스 육종 바이러스, 로타, 세아도른바이러스(seadornvirus), 콜티바이러스(coltivirus), JC 바이러스, 및 BK 바이러스를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 활성 또는 잠재성 바이러스 중 어느 하나에 의해 유발된 감염을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은, 잠재성 바이러스가 존재하지만 바이러스의 증상을 아직 나타내지 않는 개체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 조성물은 개체에서, 이에 제한되지는 않지만 CD4+ 림프구, 대식세포, 섬유아세포, 단핵구, T 림프구, B 림프구, 천연 킬러 세포, 수지상 세포, 예컨대 랑게르한스(Langerhans) 세포 및 여포성 수지상 세포, 조혈모세포, 내피세포, 뇌 소교(microglial) 세포, 및 위장관 내피세포와 같은 임의의 세포에서 바이러스를 표적화할 수 있다.
본 명세서에 사용된 것과 같은 "gRNA"는 가이드(guide) RNA를 지칭한다. 여기서 CRISPR Cas 시스템 및 기타 CRISPR 뉴클레아제에서 gRNA는 CAR T 세포를 조작하는 데 사용된다. 이는 돌연변이와 같이 단일 gRNA에서 나타나는 문제를 피하기 위해 하나 이상의 특이적으로 설계된 gRNA를 사용함으로써 달성된다. gRNA는 코딩 또는 비코딩 서열에 상보적인 서열일 수 있고, 표적화되는 특정 서열에 대해 맞춤화될 수 있다. gRNA는 단백질 코딩 서열에 상보적인 서열, 예를 들어 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 서열일 수 있다. gRNA 서열은 센스 또는 안티센스 서열일 수 있다. 본 명세서에서 유전자 편집기 조성물이 투여될 때, 바람직하게는 (그러나 이에 제한되지는 않음) 이는 둘 이상의 gRNA를 포함하는 것으로 이해되어야 하지만, 단일 gRNA도 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 것과 같은 "핵산"은 RNA 및 DNA를 모두 지칭하며, 이는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 및 핵산 유사체를 함유하는 DNA(또는 RNA)를 포함하고, 이들 중 임의의 것들은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화할 수 있고 이들 모두가 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 임의의 3차원 구조를 가질 수 있다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥(즉, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA) 및 이의 일부, 전달 RNA, 리보솜 RNA, siRNA, 마이크로-RNA, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 간섭 RNA(RNAi), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열 중 분리된 DNA, 임의의 서열 중 분리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머뿐만 아니라 핵산 유사체를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 핵산은 그의 발현이 (바이러스 감염된 세포들의 소거를 위한) 바이러스 또는 (암세포 소거를 위한) 후생적 조절 요소에 의해 조절되는 양성 표면 마커를 암호화할 수 있다.
"분리된" 핵산은, 예를 들어 자연 발생 DNA 분자 또는 그의 단편일 수 있으며, 단, 정상적으로는 자연 발생 게놈에서 해당 DNA 분자에 바로 측접하는 것으로 발견되는 핵산 서열 중 적어도 하나는 제거되거나 또는 부재한다. 이에 따라, 분리된 핵산은 제한없이, 다른 서열들에 독립적인 별개의 분자로서 존재하는 DNA 분자(예를 들어, 화학적으로 합성된 핵산, 또는 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생산된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)를 포함한다. 분리된 핵산은 또한 벡터, 자율 복제 플라스미드, 바이러스 내로, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 포함되는 DNA 분자를 나타낸다. 추가적으로, 분리된 핵산은 혼성 또는 융합 핵산의 일부인 DNA 분자와 같은 조작된 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어 cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리 내 또는 게놈 DNA 제한 소화를 함유하는 겔 슬라이스 내의 기타 많은(예를 들어, 수십 또는 수백 내지 수백만) 핵산들 중에 존재하는 핵산은 분리된 핵산이 아니다.
분리된 핵산 분자는 표준 기법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법은, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 분리된 핵산을 수득하는 데 사용될 수 있다. PCR은 총 게놈 DNA 또는 총 세포성 RNA로부터의 서열을 포함하여, DNA 및 RNA로부터의 특정 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 다양한 PCR 방법은, 예를 들어 문헌 [PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995]에 기재되어 있다. 일반적으로, 관심 영역의 말단 또는 그 이상으로부터의 서열 정보는, 증폭될 주형의 반대 가닥과 서열이 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하는 데 사용된다. 부위-특이적 뉴클레오티드 서열 변형이 주형 핵산 내로 도입될 수 있도록 하는 다양한 PCR 전략도 또한 이용가능하다.
분리된 핵산은 또한, 단일 핵산 분자(예를 들어, 포스포아미다이트 기술을 이용하여 3'에서 5' 방향으로 자동화된 DNA 합성을 이용하여) 또는 일련의 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나로서 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 서열을 함유하는, 긴 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 50 내지 100개 초과의 뉴클레오티드)의 하나 이상의 쌍이 합성될 수 있으며, 각 쌍은 올리고뉴클레오티드 쌍이 어닐링될 때 이중나선(duplex)이 형성되도록 상보성의 짧은 절편(예를 들어, 약 15개의 뉴클레오티드)을 함유한다. DNA 중합효소는 올리고뉴클레오티드를 연장하는 데 사용되어 올리고뉴클레오티드 쌍 하나당 단일의 이중-가닥 핵산 분자를 생성하고, 이는 이후 벡터 내로 결찰될 수 있다. 본 발명의 분리된 핵산은 또한, (예를 들어, 상기 방식을 따라) 예를 들어 Cas9-암호화 DNA의 자연 발생 부분의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.
더 구체적으로, 본 발명은 초음파 처리, 세제에 의한 세포 파열, 효소(예를 들어, 트립신화)에 의한 세포 파열에 의해, 또는 전기천공에 의해 유전자 편집된 iPSC의 세포 막을 붕괴함으로써 유전자-편집된 iPSC로부터 생체나노소포체(BioNV)를 생성하는 방법을 제공한다. 초음파 처리가 아래에서 추가로 언급되지만, 상기 중 임의의 방법들이 세포 막을 붕괴하는 데 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 바이오NV는 일반적으로 치료제를 수송하는 데 사용될 수 있는 내부 공간을 둘러싸는 막이다. 본 방법은 셰이커(shaker) 내 순한 세제 처리를 이용한 소포 버딩(budding) 유도, 소포를 수집하기 위한 저속 원심분리, 및 코베리스(Covaris) 초음파처리(소포 크기조정 및 부하)를 포함한다. 분석은 Malvern Zetasizing 및 유세포분석을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명은 또한 본 방법에 의해 생산된 바이오NV를 제공한다. 바이오NV는 직경이 20 내지 1000 nm일 수 있다.
가장 바람직하게는, 유전자-편집된 iPSC는 CRISPR 변형된 iPSC 및 하이포면역원성(하이포-iPSC)으로, 예컨대 문헌 [Deuse, et al. (Nature Biotechnology, Vol. 37, March 2019, p. 252-258)]에 기재된 것들이 있다. 이들 iPSC는, 생성된 iPSC가 동종이계(allogenic)이고, 그들이 투여되는 환자에서 면역 반응을 유발하지 않도록, MHC 클래스 I 및 II 유전자를 불활성화하고, CD47을 과발현하도록 변형되었다. 따라서, 그러한 iPSC로부터 유도된 바이오NV는 모든 환자들에서 이용가능하다. CRISPR/Cas9 대신, 이에 제한되지는 않지만 TALEN, ZFN, RNase P RNA, C2c1, C2c2, C2c3, Cas9, Cpf1, TevCas9, Archaea Cas9, CasY.1, CasY.2, CasY.3, CasY.4, CasY.5, CasY.6, 또는 CasX과 같은 다양한 유전자 편집 방법(아래에 추가로 기재됨)이 iPSC 세포를 만드는 데 사용될 수 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 하이포-iPSC는 CRISPR 또는 기타 유전자 편집 방법을 이용하여, 임의의 질환을 치료하기 위한 표적화 전략에서 사용될 수 있는 임의의 잠재적 표면 리간드를 과발현하는 원하는 하이포-iPSC-유도된 안정적인 세포주를 조작하도록 변형된다. 하이포-iPSC는, 이에 제한되지는 않지만 CD4+ 세포를 표적화하기 위한 HIV gp120/gp41, HBV 치료를 위한 간세포용 ApoE, 또는 다양한 암 및/또는 바이러스 감염된 세포 표적을 위한 CAR 또는 VERR과 같은, 원하는 세포 또는 조직을 표적화하는 표면 마커 또는 리간드를 포함할 수 있다. 하이포-iPSC 마커/리간드 양성 세포는 이후 세포를 전단하기 위해 초음파처리되어 바이오NV를 생성하고, 마이크로여과, 친화 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 겔 정제, 원심분리, 또는 이들의 조합의 방법에 의해 정제되고, 1. 치료제를 부하(이에 제한되지는 않지만, 예컨대 DNA 벡터, 단백질, RNA, 및/또는 소분자로부터 발현되는 gRNA(들)가 있는 CRISPR Cas 뉴클레아제) 2. CRISPR Cas 뉴클레아제 및/또는 염색체내-통합된(chromosomally-integrated) 안정적인 (테트라사이클린과 같은 약물에 의해 조절될 수 있는, 즉 Tet 온/오프 시스템) '유전자 편집 카세트'로부터의 gRNA의 발현에 의해 예비-부하된다. 결과물은 주사가능한 약제이다.
따라서 바이오NV는 초음파 공정을 이용하여 크기조절이 가능하며, 더 이상 개인화될 필요가 없다. 개별 환자들로부터의 PBMC로부터 (초음파 FAF 방법을 이용하여) 바이오NV를 유도하는 이전의 방법은 바이오NV 제조 및 개발의 개인화된 접근법을 제공하였으며, 이러한 방법은 환자 개체군에 걸쳐 일어나는 면역 반응으로 인하여 개별 환자들에 제한될 것이며, 따라서 상업적으로 가능하지 않다. 본 발명은 모든 환자 개체군에서 사용될 수 있는 바이오NV를 제공함으로써 이러한 문제를 해결한다.
본 발명은 선행기술에 대해 몇몇 장점을 갖는다. 바이오NV 유도에 대한 공급원으로서 동종이계 iPSC를 이용함으로써, 바이오NV는 원하는 수용체를 표적화할 수 있는 임의의 리간드와 함께 부하되도록 조작될 수 있다. 동종이계 iPSC는 임의의 리간드를 과잉 발현하도록 조작되어 결과적으로 임의의 수용체를 인식할 수 있다. 리간드-부하된 동종이계 iPSC가 일단 조작되면, 바이오NV는 그 후 세포주로부터 유도되고, 교정(corrective) 벡터 치료제와 함께 패키징되어(예컨대, DNA 벡터 상 CRISPR Cas 뉴클레아제 및 gRNA), 이후 표적화된 세포에 전달된다.
본 발명은 또한, 바이러스 및 암에 의해 유발된 질환들과 같은 질환의 치료를 위해 바이오NV 내에 패키징된 치료제 조성물을 제공한다. 치료제는 이에 제한되지는 않지만 DNA, 플라스미드 DNA, RNA, 단백질 또는 이의 조합일 수 있다. 조성물은 초음파처리, 형질감염 또는 전기천공 방법에 의해 제조될 수 있다. 치료제는 임의의 표적에 전달될 수 있고, 바이오NV는 임의의 표면 마커 없이 iPSC로부터 유도되었기 때문에, 바이오NV 전달은 전신성일 수 있다.
본 발명은 또한 표적화 능력을 갖는 바이오NV 및 표적화 능력을 갖는 바이오NV의 제조 방법을 제공한다. 표준 세포주 개발 프로토콜을 이용하고, CRISPR(또는 기타 유전자 편집기)-변형된 동종이형 iPSC를 이용하여, 원하는 표적 기관 또는 세포 유형(예를 들어, 간세포 표적화를 위한 ApoE)의 표면 마커가 CRISPR-변형된 동종이계 iPSC 내에서 (CMV 등과 같은 강한 프로모터로부터) 구성적으로 발현되는 안정적인 세포주가 개발될 수 있다. 원하는 표면 마커의 발현은 iPSC가 세포막 상에 표면 마커를 제시하는 것을 가능하게 한다. 일단 표면 마커가 CRISPR-변형된 동종이계 iPSC의 세포막 상에서 발현되면('표적화 능력이 있는' iPSC 세포주), 바이오NV는 상기와 같이 초음파 프로토콜을 이용하여 세포주로부터 유도된다. 바이오NV는 이제 그 위에 코팅된 표면 마커(예를 들어, 간 세포 표적화를 위한 ApoE)를 갖고, 이에 따라 표적화 특성을 제공한다.
본 발명은 또한 표적화 능력을 갖는 바이오NV 내에 패키징된 치료제 조성물을 제공한다. 치료제는 상기 기재된 바와 같은 바이오NV 내에 패키징될 수 있다.
본 명세서에서 조성물은, 용원성 또는 용균성인지 또는 둘 다인지에 관계없이, 상기 기재된 임의의 바이러스(이들에 의해 유발된 질환)를 처리하는 데 사용될 수 있다. 본 조성물은 또한 전암성 세포, 암세포, 또는 바이러스에 의해 유발된 암세포와 같은 다양한 원하지 않는 세포 유형을 치료하는 데 사용될 수 있다.
하이포-바이오NV는 또한 효율적 및 교정적인 유전자 치료법을 위한 임의의 CRISPR-gRNA(또는 유전자 편집기) 발현 플라스미드 치료제와 함께 부하될 수 있다. 예를 도 3에 나타낸다.
CRISPR Cas9 유전자 편집은 인간 CD34+ 제대혈로부터 유도된 하이포-면역원성 hiPSC 세포주를 만드는 데 사용되어 왔다. 이러한 CD34+ 제대혈 유도된 세포주는 유전적 질환에 대한 유전자 편집 치료제의 전달을 위한 바이오NV 개발, 생산 및 제조를 위한 기본 공급원 및 암세포의 미세환경에 대한 항암 치료제로서의 역할을 한다. 문헌 [Deuse, et al. (2019)]은 HLA 1/2의 낮은 발현 및 CD47의 과발현을 확인하기 위해 CD34+ 제대혈-유도된 하이포-면역원성 세포주를 광범위하게 시험하였다. 일단 확인되면, 세포를 인간화 마우스 연구에서 이들의 하이포-면역 표현형에 대해 추가적으로 시험하였다. INF-γ 발현, IgM 반응, 및 NK 세포의 활성화를 유발하는 야생형 세포주에 비해, 하이포-면역원성 iPSC는 이들 반응들 중 어떤 것도 이끌어내지 않는다. iPSC 계열이 심장근육세포 및 상피 세포로 분화된 경우, 이들 실험 각각을 중복실시하였다(유사한 결과 얻음).
CAR T-세포는 CAR 표면 수용체를 함유하는 생체모방 나노소포체의 뛰어난 공급원인 것으로 나타났다. CAR-코팅된 바이오NV는 독립된 CAR T-세포 치료법에 대해 몇몇 중요한 장점을 갖는 것으로 나타났다. 문헌 [Deuse, et al.]은 이들이 시토카인 폭풍이나 또는 세포독성 폭주의 발생 없이 강력한 항암 특성을 갖는다는 것을 보고하였다. 이들은 기능 및 종양 침투성의 손실 없이 종양 미세환경에 대한 접근성을 갖는다. 기형종 형성으로 이어질 수 있는 유전자 정보의 전달은 없다. 단일 암 유형 또는 다수의 암에 대한 다중-표적 능력이 동시에 존재한다.
문헌 [Fu, et al. (2019)]은 CAR T-세포가, 종양 성장을 억제하는 세포독성 분자를 높은 수준으로 함유하는 한편, 이들의 표면상에 동등한 농도의 CAR 수용체를 함유하는 엑소좀(통상적으로 BNV보다 10Х 더 작음)을 없애는 것으로 나타났음을 보고하였다. 문헌 [Fu, et al.]은 CAR T-세포가 항원으로 자극되는 경우, 이들이 약 7 내지 8배 더 높은 농도의 엑소좀을 방출함을 나타내었다. 면역블롯 분석은, CD28/CD3 비즈 또는 암세포 항원 자극으로 자극된 CAR T-세포로부터 유도된 전세포 추출물 및 엑소좀으로부터의 CAR T-세포의 표면 상에서의 CAR의 농도를 나타내었다. 엑소좀 CAR은 농도 의존성 방식으로 암 항원에 결합하는데, 이러한 상호작용은 차단 항체 CTX(세툭시맙(cetuximab)) 및 TTZ(트라스투주맙(trastuzumab))를 이용하여 붕괴될 수 있다. 문헌 [Fu, et al.]은 또한 CAR 엑소좀이 다양한 유형의 암에서 항암 활성을 갖는다는 것을 나타내었다. CAR-EXO-CTX(세툭시맙 scFV를 갖는 CAR 엑소좀) 및 CAR-EXO-TTZ(트라스투주맙 scFv을 갖는 CAR 엑소좀)는, 증가하는 CAR-EXO 농도 의존성 방식으로 유방암 및 폐 선암종 종양을 함유하는 마우스 이종이식 모델에서 현저한 종양 감소를 나타낸다. 피하 이종이식물로서 수립되고 100 μg 용량의 CAR-EXO-TTZ로 처리된 환자-유도된 종양 조직 단편은 HER2-양성 유방암 및 난소암 모델에서 상당한 종양 억제를 나타낸다.
본 발명에서, 중요한 유전자 공제 및 부가는 CD34+ 제대혈로부터 유도된 HLA1/HLA2 결여(null) 세포주에서 하이포-면역원성 iPSC에서 만들어질 수 있다.
B2M-/- → HLA1 하이포-면역
CIITA-/- → HLA2 하이포-면역
CD47 -/- → C47 결여(회복된 대식작용)
PD1 -/- → PDL1 내성 제거
Cpf1 가이딩된 뉴클레아제 교체(swap out) 시스템을 갖는 상류 CRISPRa CAR 발현 카세트를 사용하여 유전자에 변화를 만들 수 있다.
본 발명의 하이포-바이오NV는 다음과 같이, 도 4에서 도식으로 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다. 먼저, (Tet-조절된 것과 같은) 약물-조절된 CRISPa+ 표적화된 3Х 전사 인자 표적화된 gRNA 시스템(Drm2, Fr5, Bxp2 - 항체 생산을 상향조절하는 것으로 나타난 유전자)의 안정적인 세포 통합(게놈 위치에 안전한 정박)이 존재한다. 3개의 상류 전사 인자에 대한 CRISPR 활성화 시스템은 지정된 위치에서 대체된 내인성 항체 ORF를 갖는 CAR의 생산을 증진시키는 신호 캐스케이드 사건을 촉발시킨다. 그 후, Cpf1-지시된(directed)(또는 임의의 다른 CRISPR Cas/ZFN, TALEN) HDR을 이용한, CDR 및 H&L 항체 영역의 CAR 카세트로의 안정적인 대체가 있다. CAR 카세트가 안정적으로 통합되면, 카세트의 scFV 및 VERR 영역(카세트의 5'말단 부근)은, Cpf1-지시된(또는 임의의 다른 CRISPR Cas/ZFN, TALEN) HDR을 이용하여 임의의 원하는 scFV 또는 VERR에 대해 '교체'될 수 있다.
이 방법은 도 5에 나타낸 바와 같이 상이한 작용을 갖는 하이포-바이오NV를 만드는 데 사용될 수 있으며, 이는 하이포-바이오NV의 표면 상에서 1세대 대 2세대 CAR을 어떻게 발현하는지 상술한다. 예를 들어, 일 유형의 하이포-바이오NV는 CAR(scFV 또는 VERR) 표면 리간드만을 발현하는 표적화된 세포주로부터만 유도될 수 있다. 이들 세포주는, 최종 결과물 바이오NV 내에 패키징될 수 있는 필수 및 맞춤화된 단백질 또는 핵산을 발현하도록 추가로 조정될 수 있다. 또 다른 유형의 하이포-바이오NV는, 림프구성 과립 및 시토카인 반응의 활성화에 필요한 세포내 CAR(scFV 또는 VERR) 성분을 함유하는 표적화된 세포주로부터 유도될 수 있다. 나아가, 이러한 기본 세포주는 그의 다능성 상태에서 원하는 림프구(T-세포, NK, 대식세포)로 분화될 수 있고, 그 후 이로부터 바이오NV가 유도될 수 있다. 생성된 바이오NV는 2세대 CAR(scFV 또는 VERR) 리간드로 표면 코팅되고, 종양 살해를 이끌어내는 인자가 부하된다.
세포주는 표 1에 나타낸 바와 같이, 항암 또는 항바이러스 특성을 갖는 임의의 단백질 및/또는 핵산 치료제를 발현하도록 설계될 수 있다.
변형 표현형
B2M -/- CIITA -/- HLA1 / HLA2 하이포-면역력
CD47 -/- 대식작용-가능화
PD1 -/- PDL1 내성 제거
CORE 일차 CAR 발현 카세트 특이적 생체표지자 표적화
↑↑퍼포린& 그랜자임 B 발현 종양 세포독성/세포자멸사
Fas 리간드 +ve 세포자멸사 유도
↑↑NCAM(선택적) 세포부착(신경 & 조혈)
선택 치료제 발현 특이적 약물 작용
이는 생물학적 치료제의 과잉 발현 및 예비-패키징에 대한 필요를 없앨 수 있다. 이 공정을 이용하여 개발된 세포주는 림프구 활성화에 필요한 2세대 CAR 리간드를 함유한다. 일단 원하는 CAR 리간드가 발현되면, 세포주는 CAR-림프구로 분화되고, 적절한 항원으로 활성화되고, 그 후 가공되어 '부하 및 표적화된' 바이오NV를 생성한다. 세포주는 표 2에 열거된 변형을 가질 수 있다.
변형 표현형
B2M -/- CIITA -/- HLA1 / HLA2 하이포-면역력
CD47 -/- 대식작용-가능화
PD1 -/- PDL1 내성 제거
진전(ADVANCE) 2세대 CAR 발현 카세트 림프구 활성화를 이용한 특이적 생체표지자 표적화
림프구 활성화 변형 N/A 활성화된 림프구 부하된 바이오NV
도 6은, 다양한 유형의 약물 또는 시토카인을 전달하는 맥락에서 바이오NV의 표면 상의 1세대 대 2세대 CAR 맥락에서 바이오NV의 제조 방법을 나타낸다. 하나의 경로에서, CAR 및 단백질 발현만 있고 분화는 없다. 일차 CAR 및 원하는 단백질 치료제 발현이 있다. iPSC로부터의 바이오NV 가공이 있다. 바이오NV는 일차 표면 CAR 및 필수 (그러나 제한된) 림프구 활성화 단백질, 즉 퍼포린 및 그랜자임 B를 함유한다. 항원 활성화는 필요하지 않으며, 추가의 항암 약물이 첨가될 수 있다.
도 7에서의 또 다른 경로에서, 림프구 세포주로의 iPSC 분화가 있으며, 이는 패키징을 필요로 하지 않는다. 2세대 CAR 발현이 있다. 림프구 시토카인 레퍼토리를 발현하기 위하여 항원 자극이 필요하다. 림프구로부터의 바이오NV 가공이 있다. 림프구로부터 유도된 생성된 바이오NV는 활성화 특성 및 표적화 능력을 함유한다.
표 3에서와 같은 변형이 이루어질 수 있다. CD34+ 제대혈로부터 유도된 HLA1/HLA2 결여 세포주 내로 중요한 유전자 공제 및 부가를 조작함으로써 기재 iPSC의 하이포-면역원성이 있다.
변형 표현형
B2M -/- HLA1 하이포-면역
CIITA -/- HLA2 하이포-면역
CD47 -/- 식세포-가능화
PD1 -/- PDL1 내성 제거
↑↑NCAM(선택적) 세포 부착(신경 & 조혈)
CAR 발현 카세트 특이적 생체표지자 표적화
CRISPR 뉴클레아제/gRNA 발현 카세트 유전자 편집
도 7은 유전자 편집 치료제의 전달을 위한 바이오NV의 제조를 위한 2개의 경로를 나타낸다. 하나의 경로에서, CAR 및 단백질 발현이 있고 분화는 없다. 일차(1세대) CAR 발현이 있다. iPSC로부터의 바이오NV 가공이 있다. ASA-매개 플라스미드 또는 도기 백본 부하(doggy backbone loading)가 존재한다. 유전자 편집기 및 gRNT 암호화 플라스미드 또는 도기 백본 DNA가 있으며 이는 전기천공 또는 초음파 처리를 통해 바이오NV 내로 삽입된다.
도 7의 또 다른 경로에서, 일차(1세대) CAR 및 유전자 편집기/gRNA 과발현이 있고 분화는 없다. 일차 CAR 및 원하는 편집기/gRNA 치료제 발현이 있다. iPSC로부터의 바이오NV 가공이 있다. 예비-부하 유전자 편집기 및 안정적인 통합되고 약물 유도성 '유전자 편집 카세트'로부터 발현되는 gRNA가 있다.
도 8은 하이포-바이오NV에 대한 제조 공정을 나타낸다. 2개의 확립된 방법, 즉 1) 나트륨 데옥시콜레이트 버딩(연구 목적) 또는 2) 온건한 세제 파열(제조)을 이용하여 달성된 부모 iPSC 세포주로부터의 BNV 자유화가 있다. 이는 대식작용을 촉진하기 위한 CD47 -/-, PDL1 내성 제거를 위한 PD1 -/-를 갖는 HLA1/HLA2 음성(하이포-면역)인 1000 내지 1200 nm의 크기 범위인 하이포-바이오NV를 초래한다.
도 9는 강도에 의한 크기 분포를 나타낸다. Zetasizer Nano ZS는 레이저광 산란에 의해 용액 중 입자 크기를 측정하였다. 이 샘플은 3개의 피크를 나타낸다: 1) 약 12 nm = 단백질 집합체, 2) 약 50 nm = 세포 이하(subcellular) 파편, 막 단편, 및 3) 약 1000 nm = 맞춤화된 나노소포체. 도 10은 바이오NV의 예를 나타낸다.
하이포-바이오NV는 TALEN, ZFN, RN아제 P RNA, C2c1, C2c2, C2c3, Cas9, Cpf1, TevCas9, Archaea Cas9, CasY.1, CasY.2, CasY.3, CasY.4, CasY.5, CasY.6, 또는 CasX의 유전자 편집기와 같은 다양한 치료제를 함유할 수 있다. 유전자 편집기는 또한, 본 명세서에 사용된 것과 같이 가이드 RNA를 나타내는 gRNA를 포함할 수 있다. gRNA는 코딩 또는 비코딩 서열에 상보적인 서열일 수 있고, 표적화될 특정 서열에 대해 맞춤화될 수 있다. gRNA는 단백질 코딩 서열에 상보적인 서열, 예를 들어 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 서열(예를 들어, gag, pol, env 및 tat)일 수 있다. gRNA 서열은 센스 또는 안티-센스 서열일 수 있다. 본 명세서에서 유전자 편집기 조성물이 투여될 때, 바람직하게는 (그러나 이에 제한되지는 않음) 이는 둘 이상의 gRNA를 포함하는 것으로 이해되어야 하지만, 단일 gRNA도 또한 사용될 수 있다.
본 발명은 하이포-바이오NV를 개체에게 투여하고, 암 세포를 표적화하고 암을 치료하는 것에 의한 암이 있는 개체의 치료 방법을 제공한다. (scFV 또는 VERR 영역 중 어느 하나로 이루어질 수 있는) CAR 수용체는 암세포 상에서 그의 특이적 생체표지자를 인식할 수 있다. CAR이 일단 암세포(표적) 상에서 생체표지자와 도킹/상호작용하면, 이는 그의 탑재물(payload)(약물, 시토카인, 펩티드, 유전자 편집기/gRNA, 플라스미드 등)을 방출한다.
하이포-바이오NV는, 샘낭 암종, 부신 종양, 아밀로이드증, 항문암, 충수암, 성상세포종, 모세혈관확장성 운동실조, 약화된 가족성 선종성 용종증, 벡위스-비데만(Beckwith-Wiedermann) 증후군, 담도암, 버트-호그-듀브(Birt-Hogg-Dube) 증후군, 방광암, 뼈암, 뇌줄기 신경아교종, 뇌 종양, 유방암, 유암종, 카니(Carney) 복합체, 중추신경계 종양, 자궁경부암, 결장직장암, 코든(Cowden) 증후군, 두개인두종, 결합조직형성 유아기 신경절신경종, 내분비 종양, 뇌실막세포종, 식도암, 유잉(Ewing) 육종, 눈암, 눈꺼풀암, 나팔관암, 가족성 선종성 용종증, 가족성 악성 흑색종, 가족성 비-VHL 투명 세포 신장 세포암종, 담낭암, 가드너(Gardner) 증후군, 위장관 기질 종양, 생식세포 종양, 임신 융모 질환, 두경부암, 확산성 위암, 평활근종증 및 신장 세포암, 혼합 용종 증후군, 췌장염, 유두상 신장 세포 암종, HIV 및 AIDS-관련 암, 도세포 종양, 소아 용종증 증후군, 신장 암, 눈물샘 종양, 후두 및 하인두암, 급성 림프모구 백혈병, 급성 림프구성 백혈구, 급성 골수성 백혈병, B-세포 전림프구성 백혈병, 털세포 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 T-세포 림프구성 백혈병, 호산구성 백혈병, 리-프라우메니(Li-Fraumeni) 증후군, 간암, 폐암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 린치(Lynch) 증후군, 비만세포증, 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 중피종, 뮤어-토레(Muir-Torre) 증후군, 제1형 다발성 내분비 선종증, 제2형 다발성 내분비 선종증, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, MYH-연관 용종, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경아세포종, 신경내분비계 종양, 제1형 신경섬유종증, 제2형 신경섬유종증, 모반모양 기저세포암종증후군, 구강 및 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 포이츠-제거스(Peutz-Jeghers) 증후군, 뇌하수체 선종, 가슴막폐모세포종, 전립선암, 망막세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 치경 연부 및 심장 육종, 카포시(Kaposi) 육종, 피부암, 소장암, 위암, 고환암, 흉선종, 갑상선암, 결절성 경화증 증후군, 터코트(Turcot) 증후군, 원발병소 불명암, 자궁암, 질암, 본 히펠-린다우(Von Hippel-Lindau) 증후군, 윌름(Wilms) 종양, 또는 색소성 건피증과 연관된 암세포를 표적화할 수 있다.
본 발명은 하이포-바이오NV를 개체에게 투여하고, 파괴 또는 치료될 세포들을 표적화함으로써, 개체에서의 세포를 표적화하는 방법을 제공한다. (scFV 또는 VERR 영역 중 어느 하나로 이루어질 수 있는) CAR 수용체는 파괴 또는 치료될 세포 상에서 그의 특이적 생체표지자를 인식할 수 있다. CAR이 일단 세포(표적) 상에서 생체표지자와 도킹/상호작용하면, 이는 그의 탑재물(약물, 시토카인, 펩티드, 유전자 편집기/gRNA, 플라스미드, 등)을 방출한다. 바이오NV는 탈활성화됨이 없이 종양 미세환경으로 들어갈 수 있으며, 기타 방법들보다 더 효율적으로 이들의 탑재물을 전달할 수 있다.
하이포-바이오NV는 활성화된 T-세포의 효능이 강력한 주 성분들을 캡슐화한다. 종양 미세환경에서 제한된 효능을 갖는 CAR 치료법과 달리, 본 발명의 하이포-바이오NV는 현재 접근법들과 연관된 부작용 없이, 림프구 펀치를 병든 세포에 포장함으로써 이 문제를 해결한다. 하이포-바이오NV는 시토카인 폭퐁 가능성을 제거하고, 이는 임의의 종양 미세환경에 대한 안정적인 맞춤화된 표적화된 접근을 제공하고, 이들은 다른 전달 시스템보다 더 높은 종양 침투 효능을 갖는다. 하이포-바이오NV는 높은 빈도 및 맞춤화된 표적화의 장점을 가지며, 이들은 고도로 적응성이며, 동종이계성 기성품이고, 하이포-면역력을 갖고, 높은 품질의 제조 및 확장성(scalability), 및 균일하고 표적화된 생체분포를 가능하게 한다.
iPSC의 조작에 사용될 수 있는 유전자 편집기는 다음과 같다. 일단 iPSC가 구축되면, (약물 조절될 수 있거나 또는 조절되지 않을 수 있는) 유전자 편집기 발현 카세트도 또한 안정적으로 통합될 수 있다. iPSC 계열(line)은 이제 작동될 수 있는 유전자 편집기 발현 카세트를 가질 것이다. 일단 작동되면, 편집기(및 gRNA)는 세포 내에서 과발현될 것이다. 세포는 이후 바이오NV를 생산하도록 처리되며, 바이오NV는, 그의 의도된 세포 표적에 치료제로서의 전달을 위해, 이제 내부에 패키징된 원하는 gRNA를 갖는 유전자 편집기를 갖는다. 아래 열거된 임의의 유전자 편집기는 이러한 역할에서 작용할 것이다.
징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease; ZFN)는 특이적 DNA 위치에서 이중 가닥 절단(break)을 생성한다. ZFN은 2개의 작용 도메인, 즉 6 bp DNA 서열을 인식하는 DNA-결합 도메인, 및 뉴클레아제 Fok I의 DNA-절개 도메인을 갖는다.
TALEN(전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제)는 DNA에서 이중 가닥 절단을 생성하는 DNA 절개 도메인에 융합된 TAL 이펙터 DNA-결합 도메인을 포함한다.
인간 WRN은 베르너 증후군 유전자에 의해 암호화되는 RecQ 헬리카제(helicase)이다. 이는 복제, 재조합, 절제 회복 및 DNA 손상 반응을 포함하는 게놈 유지에 연관된다. 이들 유전적 공정 및 WRN의 발현은 많은 유형의 암에서 부수적으로 상향조절된다. 따라서, 이러한 헬리카제의 표적화된 파괴는 암세포의 제거에 유용할 수 있음이 제안되어 왔다. RN아제 P RNA가 배양된 인간 세포주에서 WRN mRNA를 효과적으로 절개시키도록 하는 외부 가이드 서열(EGS)을 적용해온 보고들이 있으며, 이에 따라 독특한 3'-5' DNA 헬리카제-뉴클레아제의 번역 및 활성을 없앤다.
제2형 부류의 VI-A CRISPR/Cas 이펙터 "C2c2"는 RNA-가이딩된 RN아제 기능을 입증하며, 상기 기재된 바와 같은 카세트를 통해 iPSC에 치료제로서 패키징되고 전달될 수 있다. 렙토트리키아 샤히이(Leptotrichia shahii) 세균으로부터의 C2c2는 RNA 파지에 대한 간섭을 제공한다. 시험관 내 생화학 분석은, C2c2가 단일 crRNA에 의해 가이드되고, 상보적인 프로토스페이서(protospacer)를 보유하는 ssRNA 표적을 절개하도록 프로그래밍될 수 있음을 나타낸다. 박테리아에서, C2c2는 특이적 mRNA를 녹다운하도록 프로그래밍될 수 있다. 절개는 2개의 보존된 HEPN 도메인에서 촉매 잔기에 의해 매개되며, 여기서 돌연변이는 촉매적으로 비활성인 RNA-결합 단백질을 생성한다. C2c2의 RNA-집중된 작용은, 세포 신원 및 기능에 대한 게놈 청사진인, DNA를 표적화하는 CRISPR-Cas9 시스템을 보완한다. 게놈 지시의 실행을 돕는 RNA만을 표적화하는 능력은 높은 산출량의 방식으로 RNA를 특이적으로 조작하고 유전자 기능을 더욱 광범위하게 조작하는 능력을 제공한다. 이들 결과는 신규 RNA-표적화 도구로서의 C2c2의 능력을 입증한다.
또 다른 제2형 부류인 V-B CRISPR/Cas 이펙터 "C2c1"이 또한 DNA 편집을 위해 본 발명에서 사용될 수 있다. C2c1은 Cpf1에 대해 관련성이 먼 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다(아래 기재됨). C2c1은 부위-특이적으로 표적 DNA의 두 가닥을 모두 표적화 및 절개할 수 있다. 문헌 [Yang, et al. (PAM-Dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2c1 CRISPR-Cas Endonuclease, Cell, 2016 Dec 15; 167(7):1814-1828))]에 따르면, 결정 구조는 알리시클로바실러스 애시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris) C2c1(AacC2c1)이 2성분 복합체로서 sgRNA에 결합하고 3성분 복합체로서 DNA를 표적화함을 확인시켜주며, 이에 의해 AacC2c1의 촉매적으로 유능한 구조를 단일 RuvC 촉매 포켓 내에 독립적으로 위치된 표적 및 비-표적 DNA 가닥 모두로 포획한다. Yang외 다수는 C2c1-매개된 절개가 표적 DNA의 겹이은(staggered) 7개의 뉴클레오티드 절단을 초래하고, crRNA가 삽입된 트립토판의 방출과 함께 2성분 복합체에서 예비-배열된 5개의 뉴클레오티드 A형 시드 서열을 취하여, 3성분 복합체 형성에서 20 bp 가이드 RNA:표적 DNA 이종이중나선(heteroduplex)의 잠금을 용이하게 하고, PAM-상호작용 클레프트(cleft)가 3성분 복합체 형성에서 "잠금된" 구조를 취함을 확인시켜준다.
C2c3은 C2c1에 관련성이 먼 V-C 형의 유전자 편집기 이펙터이며, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유한다. C2c3은 아래 기재되는 CasY.1 내지 CasY.6과도 유사하다.
본 명세서에 사용된 것과 같은 "CRISPR Cas9"는 일정 간격으로 놓인 짧은 회문 반복 서열 집합체(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat; CRISPR)-연관 엔도뉴클라제 Cas9를 지칭한다. 세균에서, CRISPR/Cas 유전자좌는 이동성 유전 요소에 대하여 RNA-가이딩된 적응성 면역계를 암호화한다(바이러스, 수송가능한 요소 및 접합 플라스미드). CRISPR 시스템의 3개 유형(I 내지 III)이 확인되었다. CRISPR 클러스터는, 선조 이동 성분에 상보적인 서열인 스페이서를 함유한다. CRISPR 클러스터는 성숙한 CRISPR(일정 간격으로 놓인 짧은 회문 반복 서열 집합체) RNA(crRNA)로 전사 및 가공된다. CRISPR-연관 엔도뉴클레아제인 Cas9는 제II형 CRISPR/Cas 시스템에 속하고, 표적 DNA를 절단하기 위한 강한 엔도뉴클레아제 활성을 갖는다. Cas9는 약 20개 염기쌍(bp)의 독특한 표적 서열(스페이서라 명명됨)을 함유하는 성숙한 crRNA 및 예비-crRNA의 리보뉴클레아제 III-보조된 가공에 대한 가이드로서 역할을 하는 트랜스-활성화된 소형 RNA(tracrRNA)에 의해 가이딩된다. crRNA:tracrRNA 이중나선은 crRNA 상의 스페이서와 표적 DNA 상의 상보적 서열(프로토스페이서로 명명됨)간의 상보적 염기 쌍형성을 통해 Cas9가 DNA를 표적화하도록 한다. Cas9는 3뉴클레오티드(NGG) 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)가 절단 부위(PAM으로부터 세 번째 뉴클레오티드)를 특정하도록 인지한다. crRNA 및 tracrRNA는 천연 crRNA/tracrRNA 이중나선을 모방하도록 합성 줄기 루프(AGAAAU)를 통해 인공 융합 소형 가이드 RNA(sgRNA) 내로 개별적으로 발현되거나 조작될 수 있다. 인공 sgRNA의 절개 효율은 개별적으로 발현된 crRNA 및 tracrRNA를 이용한 시스템에 대한 것들보다 더 낮지만, shRNA와 같이 그러한 sgRNA는 합성될 수 있거나, 직접 RNA 형질감염을 위해 시험관 내 전사될 수 있거나, U6 또는 H1-촉진된 RNA 발현 벡터로부터 발현될 수 있다.
CRISPR/Cpf1은 CRISPR/Cas9 계와 유사한 DNA-편집 기술로, Broad Institute와 MIT로부터의 Feng Zhang 그룹에 의해 2015년에 특성화된 것이다. Cpf1은 II형 부류의 CRISPR/Cas 시스템의 RNA-가이딩된 엔도뉴클레아제이다. 이러한 후천성 면역 메커니즘은 프레보텔라(Prevotella) 및 프란시셀라(Francisella) 세균에서 발견된다. 이는 바이러스로부터의 유전적 손상을 방지한다. Cpf1 유전자는 CRISPR 유전자좌와 연관되어, 바이러스 DNA를 찾고 절개하는 가이드 RNA를 이용하는 엔도뉴클레아제를 암호화한다. Cpf1은 Cas9보다 작고 더 간단한 엔도뉴클레아제로, CRISPR/Cas9 시스템의 일부 제한들을 극복한다. CRISPR/Cpf1은 다수의 적용분야를 가질 수 있고, 이는 유전병 및 퇴행성 병태들의 치료를 포함한다.
CRISPR/TevCas9 계가 또한 사용될 수 있다. 일부 경우들에서, 일단 CRISPR/Cas9가 하나의 지점에서 DNA를 절단하면, 생물의 세포 내 DNA 회복시스템은 그 절단 부위를 회복시킬 것이다. TevCas9 효소는 표적의 두 부위에서 DNA를 절단하도록 개발되어서, 세포의 DNA 회복시스템이 그 절단을 회복하기 더 어렵다(문헌 [Wolfs, et al., Biasing genome-editing events toward precise length deletions with an RNA-guided TevCas9 dual nuclease, PNAS, doi:10.1073)]). TevCas9 뉴클레아제는 I-Tevi 뉴클레아제 도메인의 Cas9로의 융합체이다.
Cas9 뉴클레아제는 야생형 스트렙코커스 파이로제네스(Streptococcus pyrogenes) 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR-연관된 엔도뉴클레아제는 기타 종, 예를 들어 써모필러스(thermophilus)와 같은 기타 스트렙토코커스 종; 녹농균(Psuedomona aeruginosa), 대장균(Escherichia coli) 또는 기타 서열결정된 세균 게놈 및 고세균(archaea), 또는 기타 원핵성 미생물로부터의 서열일 수 있다. 대안적으로, 야생형 스트렙토코커스 파이로제네스 Cas9 서열은 변형될 수 있다. 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 효율적인 발현을 위해 코돈 최적화, 즉 "인간화"될 수 있다. 인간화 Cas9 뉴클레아제 서열은, 예를 들어 Genbank 수탁 번호 KM099231.1 GI:669193757; KM099232.1 GI:669193761; 또는 KM099233.1 GI:669193765에서 열거된 임의의 발현 벡터에 의해 암호화된 Cas9 뉴클레아제 서열일 수 있다. 대안적으로, Cas9 뉴클레아제 서열은, 예를 들어 Addgene(미국 매사추세스츠주 케임브리지 소재)으로부터 PX330 또는 PX260과 같은 상업적으로 입수가능한 벡터 내에 함유된 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 Genbank 수탁 번호 KM099231.1 GI:669193757; KM099232.1 GI:669193761; 또는 KM099233.1 GI:669193765의 임의의 Cas9 엔도뉴클레아제 서열의 변이체 또는 단편인 아미노산 서열 또는 PX330 또는 PX260(Addgene, 미국 매사추세스츠주 케임브리지 소재)의 Cas9 아미노산 서열을 가질 수 있다. Cas9 뉴클레오티드 서열은 Cas9의 생물학적으로 활성인 변이체들을 암호화하기 위해 변형될 수 있고, 이들 변이체들은 하나 이상의 돌연변이(예를 들어 부가, 결실 또는 치환 돌연변이 또는 이들 돌연변이들의 조합)를 함유함으로 인해, 예를 들어 야생형 Cas9와 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있거나 포함할 수 있다. 하나 이상의 치환 돌연변이들은 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환)일 수 있다. 예를 들어, Cas9 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 변이체는 야생형 Cas9 폴리펩티드에 대해 적어도 또는 약 50%의 서열 상동성(예를 들어, 적어도 또는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성)을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 다음 군에 속하는 치환을 통상적으로 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소류신, 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. Cas9 아미노산 서열 내 아미노산 잔기는 비-자연 발생 아미노산 잔기일 수 있다. 자연 발생 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 자연적으로 암호화된 것들 및 비-표준 아미노산들도 포함한다(예를 들어, L-위치배열 대신, D-위치배열을 갖는 아미노산). 존재하는 펩티드들은 또한 표준 잔기의 변형된 형태인 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다(예를 들어, 피롤리신은 리신 대신 사용될 수 있고, 셀레노시스테인은 시스테인 대신 사용될 수 있다). 비-자연 발생 아미노산 잔기들은 자연에서 발견되지 않는 것들이지만, 아미노산의 기본 화학식에 따르며, 펩티드 내에 포함될 수 있다. 이들은 D-알로이소류신인 (2R,3S)-2-아미노-3-메틸펜타논산 및 L-시클로펜틸 글리신인 (S)-2-아미노-2-시클로펜틸 아세트산을 포함한다. 다른 예들로, 교과서나 웹(캘리포니아 공대 (California Institute of Technology)에 의해 현재 유지되고, 기능성 단백질 내에 성공적으로 포함된 비천연 아미노산의 구조를 보여주는 사이트)을 참조할 수 있다. Cas-9는 또한 아래 표 4에 나타낸 임의의 것일 수 있다.
변이체 번호 4개의 알라닌 치환 돌연변이(야생형 Cas9에 비교) 시험됨*
1 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A 예
2 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A + D1135E 예
3 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A + L169A 예
4 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A + Y450A 예
5 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A + M495A 예측됨
6 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A + M694A 예측됨
7 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A + H698A 예측됨
8 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A + D1135E + L169A 예측됨
9 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A + D1135E + Y450A 예측됨
10 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A + D1135E + M495A 예측됨
11 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A + D1135E + M694A 예측됨
12 SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A + D1135E + M698A 예측됨
3개의 알라닌 치환 돌연변이(야생형 Cas9에 비교) 시험됨*
13 SpCas9 R661A, Q695A, Q926A 없음(단지 표적에만)
14 SpCas9 R661A, Q695A, Q926A + D1135E 예측됨
15 SpCas9 R661A, Q695A, Q926A + L169A 예측됨
16 SpCas9 R661A, Q695A, Q926A + Y450A 예측됨
17 SpCas9 R661A, Q695A, Q926A + M495A 예측됨
18 SpCas9 R661A, Q695A, Q926A + M694A 예측됨
19 SpCas9 R661A, Q695A, Q926A + H698A 예측됨
20 SpCas9 R661A, Q695A, Q926A + D1135E + L169A 예측됨
21 SpCas9 R661A, Q695A, Q926A + D1135E + Y450A 예측됨
22 SpCas9 R661A, Q695A, Q926A + D1135E + M495A 예측됨
23 SpCas9 R661A, Q695A, Q926A + D1135E + M694A 예측됨
RNA-가이딩된 엔도뉴클레아제 Cas9는 다능성 게놈-편집 플랫폼으로서 알려졌지만, 일부는 흔히 사용되는 스트렙토코커스 파이로제네스로부터의 Cas9(SpCas9)의 크기는 기본 연구에 대한 그의 이용성 및 고도로 다능성인 아데노-연관 바이러스(AAV) 전달 비히클을 이용하는 치료 적용을 제한함을 보고하였다. 이에 따라, 6개의 더 작은 Cas9 동원체가 사용되어 왔으며, 보고는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)으로부터의 Cas9(SaCas9)는, 1 킬로염기를 초과하여 더 짧은 한편, SpCas9의 효율에 유사한 효율을 갖는 게놈을 편집할 수 있음을 나타내었다. SaCas9는 1053 bp이며, 한편 SpCas9는 1358 bp이다.
Cas9 뉴클레아제 서열, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 유전자 편집기 이펙터 서열은 돌연변이된 서열일 수 있다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제는 보존된 HNH 및 RuvC 도메인에서 돌연변이될 수 있고, 이는 가닥 특이적 절개에 연관된다. 예를 들어, RuvC 촉매 도메인에서 아스파르테이트에서 알라닌으로의 (D10A) 돌연변이는 Cas9 니카제(nickase) 돌연변이(Cas9n)가 DNA를 절개하기보다는 틈을 내도록 하여 단일 가닥 절단을 산출하도록 하며, HDR을 통한 이후의 우선적 회복은 표적 이탈 이중 가닥 절단으로부터의 원하지 않는 삽입결실 돌연변이의 빈도를 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 일반적으로, 유전자 편집기 이펙터 서열의 돌연변이는 표적 이탈을 최소화 또는 방지할 수 있다.
유전자 편집기 이펙터는 또한 고세균 Cas9일 수 있다. 고세균 Cas9의 크기는 950aa ARMAN 1 및 967aa ARMAN 4이다. 고세균 Cas9는 ARMAN-1(캔디다투스 미크라케움 애시도필룸(Candidatus Micrarchaeum acidiphilum) ARMAN-1) 또는 ARMAN-4(캔디다투스 파르바케움 애시도필룸(Candidatus Parvarchaeum acidiphilum ARMAN-4))로부터 유도될 수 있다.
본 명세서의 임의의 유전자 편집기 이펙터는 또한 Tev 또는 임의의 기타 적합한 회귀(homing) 단백질 도메인으로 태깅될 수 있다. 문헌 [Wolfs, et al. (Proc Natl Acad Sci USA.　2016 Dec 27;113(52):14988-14993. doi: 10.1073/pnas.1616343114. Epub 2016 Dec 12)]에 따르면, Tev는 RNA-가이딩된 이중 활성 부위 뉴클레아제로, 이는 표적 부위에서 2개의 비상용성 DNA 절단을 생성하여, 그가 재생될 수 없도록 대다수의 표적 부위를 효과적으로 결실시킨다.
본 명세서에 기재된 것과 같은 핵산 함유 벡터가 또한 제공된다. "벡터"는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같이, 그 안으로 또 다른 DNA 절편이 삽입되어 그 삽입된 절편의 복제를 일으킬 수 있는 레플리콘(replicon)이다. 일반적으로, 적절한 제어 요소와 연관된 경우 벡터는 복제 가능하다. 적합한 벡터 백본은, 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, BAC, YAC, 또는 PAC와 같이 당업계에서 일상적으로 사용되는 것들을 포함한다. 용어 "벡터"는 클로닝 및 발현 벡터, 및 바이러스 벡터 및 통합 벡터를 포함한다. "발현 벡터"는 조절 영역을 포함하는 벡터이다. 수많은 벡터 및 발현 시스템은 Novagen(미국 위스콘신주 메디슨 소재), Clontech(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), Stratagene(미국 캘리포니아주 라호야 소재), 및 Invitrogen/Life Technologies(미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)와 같은 회사들로부터 상업적으로 입수가능하다.
본 명세서에서 제공된 벡터는 또한, 예를 들어 복제 기원, 스캐폴드 부착 영역(SAR), 및/또는 마커를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 선택가능한 표현형을 숙주 세포에 부여할 수 있다. 예를 들어, 마커는 살생물제 내성, 예컨대 항생제(예를 들어 카나마이신, G418, 블레오마이신, 또는 하이그로마이신)에 대한 내성을 부여할 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 발현 벡터는 발현된 폴리펩티드의 조작 또는 탐지(예를 들어, 정제 또는 국재화)를 용이하게 하도록 설계된 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST), 폴리히스티딘, c-myc, 혈구응집소, 또는 Flag™ 태그(Kodak, 미국 코네티컷주 뉴헤이븐 소재) 서열은 통상적으로 암호화된 폴리펩티드와 융합체로서 발현된다. 그러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단을 포함하는 어느 하나에서 폴리펩티드 내 임의의 위치에 삽입될 수 있다.
추가적인 발현 벡터는 또한, 예를 들어 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열의 절편을 포함할 수 있다. 적합한 벡터는 SV40의 유도체 및 알려진 세균 플라스미드, 예를 들어 대장균 플라스미드 col E1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX, pMB9 및 이들의 유도체들, RP4와 같은 플라스미드; 파지 DNA, 예를 들어 파지 1의 다수의 유도체, 예를 들어 NM989, 및 기타 파지 DNA, 예를 들어 M13 및 사상 단일 가닥 파지 DNA; 2μ 플라스미드 또는 그의 유도체와 같은 효모 플라스미드, 곤충 또는 포유동물 세포에서 유용한 벡터와 같이, 진핵세포에서 유용한 벡터; 파지 DNA 또는 기타 발현 제어 서열을 이용하도록 변형된 플라스미드와 같이 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터를 포함한다.
벡터는 또한 조절 영역을 포함할 수 있다. 용어 "조절 영역"은 전사 또는 번역 개시 및 속도, 및 전사 또는 번역 생성물의 안정성 및/또는 이동성에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 영역은 제한 없이, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 반응 요소, 단백질 인식 부위, 유도성 요소, 단백질 결합 서열, 5' 및 3' 비번역 영역(UTR), 전사 출발 부위, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 핵 국재화 신호, 및 인트론을 포함한다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "작동적으로 연결된"은 조절 영역 및 핵산 내에서 전사될 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미치도록 하는 상기 서열의 배치를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터의 제어 하에 암호화 서열을 가져오기 위하여, 폴리펩티드의 번역 판독 프레임의 번역 개시 부위는 통상적으로 프로모터의 1 내지 약 50개 뉴클레오티드의 하류에 위치한다. 그러나 프로모터는 번역 개시 부위의 약 5,000개 뉴클레오티드 상류 또는 전사 출발 부위의 약 2,000개 뉴클레오티드 상류에 위치할 수 있다. 프로모터는 통상적으로 적어도 하나의 코어(기본) 프로모터를 포함한다. 프로모터는 또한 인핸서 서열, 상류 요소 또는 상류 활성화 영역(UAR)과 같은 적어도 하나의 제어 요소를 포함할 수 있다. 포함될 프로모터의 선택은 이에 제한되지 않지만, 효율, 선택성, 유도성, 원하는 발현 수준, 및 세포 또는 조직-우선성 발현을 포함하는 몇몇 인자들에 따라 달라진다. 암호화 서열에 대해 프로모터 및 기타 조절 영역을 적절히 선택 및 배치함으로써 암호화 서열의 발현을 조절하는 것은 당업자에게는 일상적인 일이다.
벡터는, 예를 들어 바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스("Ad"), 아데노-연관 바이러스(AAV), 및 수포성 구내염 바이러스(VSV) 및 레트로바이러스), 리포솜 및 기타 지질-함유 복합체, 및 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드의 전달을 매개할 수 있는 기타 거대분자 복합체를 포함한다. 벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나, 다르게는 표적화된 세포에 유익한 특성을 제공하는 기타 성분 또는 작용기를 포함할 수 있다. 아래에서 더 상세히 기재 및 예시되는 바와 같이, 그러한 기타 성분들은, 예를 들어 세포에의 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분(세포 유형 또는 조직 특이적 결합을 매개하는 성분들 포함); 세포에 의해 벡터 핵산의 흡수에 영향을 미치는 성분; 흡수 후에 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 국재화에 영향을 미치는 성분(예컨대, 핵 국재화를 매개하는 성분); 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미치는 성분을 포함한다. 그러한 성분들은 또한, 벡터에 의해 전달된 핵산을 취하고 발현하는 세포를 탐지 또는 선택하는 데 사용될 수 있는 탐지가능한 및/또는 선택가능한 마커와 같은, 마커를 포함할 수 있다. 그러한 성분들은 벡터의 자연적 특징으로 제공될 수 있거나(예컨대, 결합 및 흡수를 매개하는 성분 또는 작용기들을 갖는 특정 바이러스 벡터의 이용), 벡터가 그러한 작용기들을 제공하도록 변형될 수 있다. 기타 벡터는 문헌 [Chen et al; BioTechniques, 34: 167-171 (2003)]에 기재된 것들을 포함한다. 그러한 매우 다양한 벡터는 당업계에 알려져 있으며 일반적으로 입수가능하다.
"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종성 유전자 생성물 또는 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 지칭한다. 많은 바이러스 벡터는 패키징과 연관된 크기-제약을 나타내기 때문에, 이종성 유전자 생성물 또는 서열은 통상적으로 바이러스 게놈의 하나 이상의 부분을 대체함으로써 도입된다. 그러한 바이러스는 복제-결함이 될 수 있어서, (예를 들어, 복제 및/또는 캡슐화에 필요한 유전자 생성물을 보유하는 헬퍼 바이러스 또는 패키징 세포주를 이용함으로써) 결실된 작용(들)은 바이러스 복제 및 캡슐화 동안 트랜스로(in trans) 제공되는 것을 필요로 한다. 전달될 폴리뉴클레오티드가 바이러스 입자의 외부에 전달되는 변형된 바이러스 벡터도 또한 기재된 바 있다(예를 들어, 문헌 [Curiel, D T, et al. PNAS 88: 8850-8854, 1991] 참조).
적합한 핵산 전달 시스템은 재조합 바이러스 벡터, 통상적으로 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스(AAV), 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스, 또는 일본-리포솜 혈청응집 바이러스(HVJ) 복합체 중 적어도 하나로부터의 서열을 포함한다. 그러한 경우에, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 강한 진핵성 프로모터, 예를 들어 거대세포바이러스(CMV) 프로모터를 포함한다. 재조합 바이러스 벡터는 내부에 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 약 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 바이러스 벡터는 약 108 내지 약 5Х1010 pfu의 pfu(플라그(plague) 형성 단위)를 갖는다. 폴리뉴클레오티드가 비-바이러스 벡터와 함께 투여되는 구현예에서, 약 0.1 나노그램 내지 약 4000 마이크로그램, 예를 들어 약 1 나노그램 내지 약 100 마이크로그램의 이용이 종종 유용할 것이다.
추가의 벡터는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학 컨쥬게이트를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 및 HIV-계 바이러스를 포함한다. 한 가지 HIV-계 바이러스 벡터는, gag 및 pol 유전자가 HIV 게놈으로부터 유래되고, env 유전자가 또 다른 바이러스로부터 유래한 적어도 2개의 벡터를 포함한다. DNA 바이러스 벡터는 오르토폭스(orthopox) 또는 조류폭스(avipox) 벡터와 같은 폭스(pox) 벡터, 단순 포진 바이러스 I(HSV) 벡터와 같은 헤르페스바이러스 벡터(문헌 [Geller, A.I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:90 7603 (1993); Geller, A.I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149 (1990)]), 아데노바이러스 벡터(문헌 [LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995)]) 및 아데노-연관 바이러스 벡터(문헌 [Kaplitt, M.G., et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)])를 포함한다.
폭스 바이러스 벡터는 세포의 세포질 내로 유전자를 도입한다. 조류폭스 바이러스 벡터는 핵산의 단기간 발현만을 초래한다. 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 및 단순 포진 바이러스(HSV) 벡터는 일부 발명의 구현예의 표시일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스보다 더 단기간의 발현(예를 들어, 약 1달 미만)을 초래하며, 일부 구현예에서는 훨씬 더 긴 발현을 나타낼 수 있다. 선택된 특정 벡터는 표적 세포 및 처리되는 조건에 따라 달라질 것이다. 적절한 프로모터의 선택은 쉽게 달성될 수 있다. 적합한 프로모터의 예는 763개 염기쌍의 거대세포바이러스(CMV) 프로모터이다. 유전자 발현에 사용될 수 있는 다른 적합한 프로모터는, 이에 제한되지는 않지만 라우스 육종 바이러스(RSV)(문헌 [Davis, et al., Hum Gene Ther 4:151 (1993)]), SV40 초기 프로모터 영역, 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터, 메탈로티오네인(MMT) 유전자의 조절 서열, 원핵성 발현 벡터, 예컨대 β-락타마제 프로모터, tac 프로모터, 효모 또는 기타 진균류로부터의 프로모터 요소, 예컨대 GAL4 프로모터, ADH(알코올 탈수소화제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼리성 포스파타제 프로모터; 및 조직 특이성을 나타내고, 유전자이식 동물에서 사용된, 동물의 전사 제어 영역: 췌장 선방세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역, 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역, 림프구 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역, 고환, 유방, 림프구 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역, 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역, 간에서 활성인 알파-태아단백질 유전자 제어 영역, 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 제어 영역, 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역, 뇌 내 희소돌기교세포에서 활성인 미엘린 기본 단백질 유전자 제어 영역, 골격 근육에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역, 및 시상하부에서 활성인 생식선 방출 호르몬 유전자 제어 영역을 포함한다. 특정 단백질은 그의 천연 프로모터를 이용하여 발현될 수 있다. tat 유전자 및 tar 요소와 같은 높은 발현 수준을 초래하는 시스템 또는 인핸서와 같이, 발현을 증진시킬 수 있는 기타 요소가 또한 포함될 수 있다. 이 카세트는 그 후 벡터, 예를 들어 pUC19, pUC118, pBR322 또는 예를 들어 대장균 복제 기원을 포함하는 기타 알려진 플라스미드 벡터와 같은 플라스미드 벡터 내에 삽입될 수 있다. 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, (1989)]을 참조한다. 플라스미드 벡터는 또한 암피실린 내성을 위한 β-락타마제 유전자와 같이 선택가능한 마커를 포함할 수 있으며, 단 마커 폴리펩티드는 치료될 생물의 대사에 불리한 영향을 미치지 않는다. 카세트는 또한, WO 95/22618에 개시된 시스템과 같은 합성 전달 시스템 내 핵산 결합 모이어티에 결합될 수 있다.
원하는 경우, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 양이온성 리포솜 및 아데노바이러스 벡터와 같은 미세전달 비히클과 함께 사용될 수 있다. 리포솜 제조, 표적화 및 내용물의 전달을 위한 절차의 검토를 위해, 문헌 [Mannino and Gould-Fogerite, BioTechniques, 6:682 (1988)]을 참조한다. 또한, 문헌 [Felgner and Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21 (1989) 및 Maurer, R.A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25 (1989)]을 참조한다.
복제-결함 재조합 아데노바이러스 벡터는 알려진 기법들에 따라 생산될 수 있다. 문헌 [Quantin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet, et al., J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992); 및 Rosenfeld, et al., Cell, 68:143-155 (1992)]을 참조한다.
또 다른 전달 방법은 세포내에서 발현된 생성물을 생산할 수 있는 단일 가닥 DNA 생성 벡터를 이용하는 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 그 전체로 참고로서 포함된, 문헌 [Chen et al, BioTechniques, 34: 167-171 (2003)]을 참조한다.
상기 기재된 것과 같이, 본 발명의 조성물은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 상기 조성물의 원래 공급원 또는 수득된 방식에 관계없이, 본 발명의 조성물은 이들의 용도에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 핵산 및 벡터는 조직 배양물 내 세포에의 적용 또는 환자나 대상체에의 투여를 위한 조성물 내에 제형화될 수 있다. 본 발명의 임의의 약학 조성물은 의약 제조에서의 용도를 위해 제형화될 수 있고, 특정 용도는 아래에서 치료 맥락, 예를 들어 바이러스를 갖는 대상체 또는 바이러스 감염에 대한 위험이 있는 대상체의 치료의 맥락에서 표시된다. 약제로서 이용된 경우, 임의의 핵산 및 벡터는 약학 조성물 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 약학 기술분야에서 잘 알려진 방식으로 제조될 수 있으며, 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 여부 및 치료될 영역에 따라 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여는 국소(눈, 및 비강내, 질 및 직장 전달을 포함한 점막 포함), 폐(예를 들어, 네블라이저에 의한 것을 포함하여, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입에 의해; 기관 내, 비강내, 표피 및 경피), 눈, 경구 또는 비경구일 수 있다. 눈 전달 방법은 국소 투여(점안액), 결막하, 눈 주위 또는 유리체내 주사 또는 풍선 카테터(balloon catheter)나 결막낭에 수술적으로 위치되는 안과 삽입물에 의한 도입을 포함할 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내, 예를 들어, 척추강 또는 심실내 투여를 포함한다. 비경구 투여는 단일 볼러스 투약의 형태일 수 있거나, 예를 들어 연속 관류 펌프에 의할 수 있다. 국소 투여를 위한 약학 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌약, 분무, 액체, 분말 등을 포함할 수 있다. 통상의 약학 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 활성 성분으로서 본 명세서에 기재된 핵산 및 벡터를 함유하는 약학 조성물을 포함한다. 용어 "약학적으로 허용가능한"(또는 "약물학적으로 허용가능한")은, 적절하게 동물 또는 인간에 투여된 경우 부작용, 알레르기 또는 기타 부적절한 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 광범위한 종, 예를 들어 인간, 인간이 아닌 영장류(예를 들어, 원숭이), 말 또는 기타 가축, 개, 고양이, 페렛, 또는 반려동물로서 두는 기타 포유동물, 래트, 마우스, 또는 기타 실험용 동물에 적용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 것과 같은 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산액 매질, 코팅제, 항균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충액, 부형제, 결합제, 활제, 겔, 계면활성제 등을 포함하고, 이는 약학적으로 허용가능한 물질에 대한 매질로서 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 제조에 있어서, 활성 성분은 통상적으로 부형제와 혼합되고, 부형제에 의해 희석되거나, 또는 예를 들어 캡슐, 정제, 사쉐, 종이, 또는 기타 용기 형태의 그러한 담체 내에 밀봉된다. 부형제가 희석제로서 제공되는 경우, 이는 고체, 반고체, 또는 액체 재료(예를 들어, 일반 식염수)일 수 있으며, 이는 활성 성분용 비히클, 담체 또는 매질로서 작용한다. 이에 따라, 조성물은 정제, 알약, 분말, 로젠지, 사쉐, 카시에제(cachet), 엘릭시르(elixir), 현탁액, 유화액, 용액, 시럽, 에어로졸(고체로서 또는 액체 매질 중), 로션, 크림, 연고, 겔, 연성 및 경성 젤라틴 캡슐, 좌약, 멸균 주사가능한 용액, 및 멸균 포장된 분말의 형태일 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 희석제 형태는 의도된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 생성된 조성물은 보존제와 같은 추가의 약제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 지질-기재 또는 중합체-기재 콜로이드일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 담체 재료는 리포솜으로서 제형화된 콜로이드, 수성겔, 미세입자, 나노입자, 또는 블록 공중합체 마이셀일 수 있다. 나타낸 바와 같이, 담체 재료는 캡슐을 형성할 수 있고, 재료는 중합체-기재 콜로이드일 수 있다.
바이오NV는 또한 장치(예를 들어, 카테터)의 표면에 적용될 수 있거나, 펌프, 패치 또는 기타 약물 전달 장치 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 핵산 및 벡터는 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체(예를 들어, 생리학적 식염수) 존재 하에, 혼합물 형태로 투여될 수 있다. 부형제 또는 담체는 투여 방식 및 경로를 기준으로 선택된다. 약학 제형에서의 사용에 적합한 약학 담체 및 약물학적 필수품은 이 분야에서 잘 알려진 참고 교과서인 [Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)], 및 USP/NF(미국 약전 및 국가의약품집)에 기재되어 있다.
본 출원 전체에 걸쳐, 미국 특허를 포함한 다양한 간행물들은 저자, 연도 및 특허 번호로 언급되어 있다. 간행물의 전체 인용은 아래에 열거된다. 그 전체 내용으로서 이들 간행물 및 특허의 개시 내용은 이에 의해, 본 발명이 속하는 현 기술 수준을 더욱 완전히 설명하기 위하여 본 출원에 참고로서 포함된다.
본 발명은 예시적인 방식으로 기재되었으며, 사용된 용어는 제한보다는 설명의 단어의 성격으로 의도된 것으로 이해되어야 한다.
명백하게, 본 발명의 많은 변형 및 변경이 상기 교시에 비추어 가능하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 범주 내에서, 본 발명은 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (1)

  1. 항체 단편 scFV 영역을 통해 또는 바이러스 에피토프 인식 수용체(VERR)에 의해 표적 생체표지자를 인식할 수 있는 조작된/맞춤화된 키메라 항원 수용체(CAR)로 표면 코팅되고 소분자, 생물학적, 핵 및/또는 유전자 편집 치료제를 임의의 의도된 세포 표적에 전달할 수 있는, 하이포면역원성 유도 만능 줄기 세포(iPSC)-유도된 생체모방 나노소포체(하이포-바이오NV)를 포함하는 조성물.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022250880A1 (en) * 2021-05-25 2022-12-01 Malcolm Thomas Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors, hereditary and infectious diseases
WO2022266399A1 (en) * 2021-06-17 2022-12-22 Malcolm Thomas Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors, hereditary and infectious diseases
US20230144704A1 (en) * 2021-11-05 2023-05-11 Thomas Malcolm Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors, hereditary and infectious diseases
WO2023230568A2 (en) * 2022-05-25 2023-11-30 Malcolm Thomas Hypoimmunogenic cells for generating biomimetic nanovesicles
WO2023230231A1 (en) * 2022-05-25 2023-11-30 Malcolm Thomas Controlled expression of therapeutically relevant biomolecules for lumen-localized payloads in biomimetic nanovesicles and exosomes

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1447079A1 (de) 2003-02-15 2004-08-18 Fraunhofer-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. Vesikel mit chimären Rezeptoren zur Induktion einer gerichteten T-Zellantwort in vivo
EP3253866A1 (en) 2015-02-06 2017-12-13 Cellectis Primary hematopoietic cells genetically engineered by slow release of nucleic acids using nanoparticles
JP6887685B2 (ja) 2015-08-12 2021-06-16 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ナノ粒子の細胞表面共役
GB2552473A (en) * 2016-07-21 2018-01-31 Evox Therapeutics Ltd Surface decoration of extracellular vesicles
CN108175759B (zh) * 2016-12-08 2021-03-19 暨南大学 一种抗肿瘤靶向给药***及其制备方法与应用
CN110832075A (zh) 2017-03-22 2020-02-21 诺华股份有限公司 用于免疫肿瘤学的组合物和方法
WO2018208728A1 (en) * 2017-05-08 2018-11-15 Flagship Pioneering, Inc. Compositions for facilitating membrane fusion and uses thereof
WO2019045775A1 (en) * 2017-09-01 2019-03-07 Orig3N, Inc. SECRETED COMPOSITIONS DERIVED FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS, AND ASSOCIATED SYSTEMS AND METHODS

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