CN110944652A - T细胞抗原靶向的嵌合抗原受体(car)以及在细胞疗法中的用途 - Google Patents

Abstract

本公开涉及包含靶向的嵌合抗原受体的工程改造的细胞，诸如T细胞。在某些实施方案中，当T细胞抗原的内源性表达在所述T细胞中被敲低或降低时，T细胞靶向的嵌合抗原受体(CAR)以更高的水平表达。在某些实施方案中，所述工程改造的细胞是，与其中所述T细胞抗原的表达未改变或降低的类似定位的免疫调节细胞相比，在使得降低T细胞抗原表达导致嵌合抗原受体表达增加的条件下，经遗传修饰以阻止或减少T细胞抗原表达的免疫调节细胞，或含有降低或敲低T细胞mRNA表达的核酸的免疫调节细胞。在某些实施方案中，T细胞抗原包括但不限于CD5、CD7和CD3。

Description

T细胞抗原靶向的嵌合抗原受体(CAR)以及在细胞疗法中的 用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年6月12日提交的美国临时申请号62/518,588的权益。此申请的全部内容特此出于所有目的以引用的方式并入。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的授权1R43CA192710-01在政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。

经由办公室电子提交***(EFS-WEB)以文本文件形式提交的材料的参考引用

与本申请相关联的序列表以文本文件格式代替纸质副本提供，并且特此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是17172PCT_ST25.txt。文本文件是11KB，在2018年6月12日创建，并且经由EFS-Web电子提交。

背景

遗传修饰的T细胞的过继转移是产生抗肿瘤免疫应答的有前途的方法。据报道，在施用制备性化疗方案后，经过遗传工程改造以表达能够识别B细胞抗原CD19的嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞可使淋巴瘤消退。Kochenderfer等,Blood.2010,116(20):4099-102。然而，由于缺乏T淋巴母细胞特异性表面抗原，T细胞恶性肿瘤的治疗变得复杂。因此，产生靶向恶性T细胞的CAR T细胞有被杀死的危险，即CAR T细胞自毁。因此，它们针对靶向的癌症T细胞的活化受到损害。因此，需要确定改进的方法。

CD5是泛T细胞标志物，其常常在大多数T细胞恶性肿瘤中过表达。正常细胞的CD5表达被认为仅限于胸腺细胞、外周血T细胞和被称为B-1细胞的B淋巴细胞小亚群。Chen等报道使用抗CD5嵌合抗原受体的攻击性T细胞恶性肿瘤的临床前靶向。Leukemia,2017,31(10):2151–2160。此报道表明由于固有的CD5表达，在工程改造的CAR T细胞中存在杀伤行为。还参见Mamonkin等,Blood.2015,126(8):983–92、WO 2016/172606、WO 2016/138491、WO2017/146767和标题为Autologous T-Cells Expressing a Second Generation CAR forTreatment of T-Cell Malignancies Expressing CD5 Antigen(MAGENTA)的ClinicalTrials.gov Identifier NCT03081910。

本文引用的参考文献不是对现有技术的承认。

发明内容

本公开涉及包含靶向的嵌合抗原受体的工程改造的细胞，诸如T细胞。在某些实施方案中，当T细胞抗原的内源性表达在所述T细胞中被敲低或降低时，T细胞靶向的嵌合抗原受体(CAR)以更高的水平表达。在某些实施方案中，所述工程改造的细胞是，与其中T细胞抗原的表达未改变或降低的类似定位的免疫调节细胞相比，在使得降低T细胞抗原表达导致嵌合抗原受体表达增加的条件下，经遗传修饰以阻止或降低T细胞抗原表达的免疫调节细胞，或含有降低或敲低T细胞mRNA表达的核酸的免疫调节细胞。在某些实施方案中，T细胞抗原包括但不限于CD5、CD7和CD3。

在某些实施方案中，本公开涉及包含T细胞抗原靶向的嵌合抗原受体的工程改造的细胞。在某些实施方案中，所述工程改造的细胞是经遗传修饰以阻止或减少T细胞抗原表达的免疫调节细胞，或含有降低或敲低T细胞抗原mRNA表达的核酸的免疫调节细胞。在某些实施方案中，本公开涉及管理与异常T细胞病状相关联的病状(诸如治疗T细胞恶性肿瘤)的方法，所述方法包括向诊断患有T细胞恶性肿瘤的受试者施用具有T细胞抗原靶向的嵌合抗原受体(CARS)的工程改造的细胞，从而降低天然T细胞抗原表面表达。在某些实施方案中，与其中T细胞抗原的表达未改变或降低的类似定位的免疫调节细胞相比，T细胞抗原的表达降低导致免疫调节细胞(诸如T细胞)上包含T细胞抗原识别结构域的嵌合抗原受体的表达增加。

在某些实施方案中，本公开涉及包含CD5、CD7和/或CD3靶向的嵌合抗原受体的工程改造的细胞。在某些实施方案中，所述工程改造的细胞是经遗传修饰以阻止或减少CD5、CD7和/或CD3表达的免疫调节细胞，或含有降低或敲低CD5、CD7和/或CD3 mRNA表达的核酸的免疫调节细胞。在某些实施方案中，本公开涉及管理与异常T细胞病状相关联的病状(诸如治疗T细胞恶性肿瘤)的方法，所述方法包括向诊断患有T细胞恶性肿瘤的受试者施用具有CD5、CD7和/或CD3靶向的嵌合抗原受体(CARS)的工程改造的细胞，从而降低天然CD5、CD7和/或CD3表面表达。在某些实施方案中，与其中CD5、CD7和/或CD3的表达未改变或降低的类似定位的免疫调节细胞相比，CD5、CD7和/或CD3的表达降低导致免疫调节细胞(诸如T细胞)上包含CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域的嵌合抗原受体的表达增加。

在某些实施方案中，本公开提供了用于血液恶性肿瘤的CD5、CD7和/或CD3靶向的嵌合抗原受体(CARS)、其组合物及其使用方法。在某些实施方案中，本公开提供了工程改造的嵌合抗原受体多肽，其包含：信号肽，CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域，铰链区，跨膜结构域，至少一个共刺激结构域和信号传导结构域。

在某些实施方案中，本公开提供了工程改造的嵌合抗原受体多肽或多核苷酸，其编码具有对CD5具有选择性的抗原识别结构域的嵌合抗原受体多肽，诸如靶向CD5的scFv。在某些实施方案中，CD5靶向的scFv具有SEQ ID NO:8或其变体。在某些实施方案中，变体与SEQ ID NO:8具有大于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％或更高的同一性。在某些实施方案中，变体是轻链或重链可变区的CDR1、CDR2或CDR3外部的1或2个突变、缺失或***。在某些实施方案中，变体是轻链或重链可变区的CDR1、CDR2或CDR3外部的3或4个突变、缺失或***。在某些实施方案中，变体是轻链或重链可变区的CDR1、CDR2或CDR3内部的1或2个突变、缺失或***。

在另一个实施方案中，本公开提供了表达任意上述嵌合抗原受体多核苷酸或多肽的工程改造的细胞。在某些实施方案中，工程改造的细胞是免疫调节细胞，诸如T细胞或NK细胞。在某些实施方案中，T细胞是纯化的γδT细胞、αβT细胞或其组合的组合物。

在某些实施方案中，本公开涉及治疗癌症，其包括：从受试者中分离免疫调节细胞(诸如T细胞)；修饰分离的免疫调节细胞(诸如T细胞)使得T细胞抗原的表达降低；将载体或DNA***免疫调节细胞(诸如T细胞)中，其中在使得免疫调节细胞(诸如T细胞)表达T细胞抗原识别结构域从而提供转导或工程改造的细胞(诸如转导或工程改造的T细胞)的条件下，所述载体或DNA编码并表达包含T细胞抗原识别结构域的嵌合抗原受体；以及向所述受试者施用有效量的转导或工程改造的细胞，其任选地与IL-2组合施用于受试者。

在某些实施方案中，本公开涉及治疗癌症，其包括：从受试者中分离免疫调节细胞(诸如T细胞)；修饰分离的免疫调节细胞(诸如T细胞)使得CD5、CD7和/或CD3的表达降低；将载体或DNA***免疫调节细胞(诸如T细胞)中，其中在使得免疫调节细胞(诸如T细胞)表达CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域从而提供转导或工程改造的细胞(诸如转导或工程改造的T细胞)的条件下，所述载体或DNA编码并表达包含CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域的嵌合抗原受体；并且向所述受试者施用有效量的转导或工程改造的细胞，其任选地与IL-2组合施用于受试者。

在某些实施方案中，与其中T细胞抗原的表达未改变或降低的类似定位的免疫调节细胞相比，T细胞抗原的表达降低导致免疫调节细胞(诸如T细胞)上包含T细胞抗原识别结构域的嵌合抗原受体的表达增加。

在某些实施方案中，与其中CD5、CD7和/或CD3的表达未改变或降低的类似定位的免疫调节细胞相比，CD5、CD7和/或CD3的表达降低导致免疫调节细胞(诸如T细胞)上包含CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域的嵌合抗原受体的表达增加。

在某些实施方案中，修饰分离的免疫调节细胞(诸如T细胞)使得CD5、CD7和/或CD3的表达降低包括将载体或DNA***免疫调节细胞(诸如T细胞)中，其中所述载体或DNA编码并表达Cas核酸酶(例如Cas9)和指导RNA，所述指导RNA靶向用于切割、切开或阻断CD5、CD7和/或CD3基因或mRNA的表达的序列。在某些实施方案中，指导RNA包含用于靶向CD5的AGCGGTTGCAGAGACCCCAT(SEQ ID NO:5)。

在某些实施方案中，修饰分离的免疫调节细胞(诸如T细胞)使得CD5、CD7和/或CD3的表达降低包括将mRNA***免疫调节细胞(诸如T细胞)中，所述mRNA编码Cas核酸酶和指导RNA，所述指导RNA靶向用于切割、切开或阻断CD5、CD7和/或CD3基因或mRNA的表达的序列。在某些实施方案中，指导RNA包含用于靶向CD5的AGCGGTTGCAGAGACCCCAT(SEQ ID NO:5)。

在某些实施方案中，修饰免疫调节细胞(诸如T细胞)使得CD5、CD7和/或CD3的表达降低包括将载体或mRNA***免疫调节细胞(诸如T细胞)中，其中所述载体或mRNA编码并表达能够降低CD5、CD7和/或CD3 mRNA表达的双链或短发夹RNA。在某些实施方案中，修饰分离的免疫调节细胞(诸如T细胞)使得CD5、CD7和/或CD3的表达降低包括将双链RNA寡核苷酸***T细胞(例如***细胞质)中，其中所述RNA能够通过RNA干扰(RNAi)降低CD5、CD7和/或CD3mRNA表达。在某些实施方案中，工程改造的免疫调节细胞(诸如T细胞)被认为是如上所述的表达降低的CD5修饰的细胞。

在某些实施方案中，T细胞从受试者的自体外周血淋巴细胞(PBL)中获得，例如通过白细胞分离术分离。

在某些实施方案中，在向受试者施用淋巴细胞去除方案之后向受试者施用有效量的转导的免疫调节细胞(诸如T细胞)。在某些实施方案中，淋巴细胞去除方案是非清髓性的或清髓性的。在某些实施方案中，淋巴细胞去除方案包括施用环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。

在某些实施方案中，本公开涉及包含CD5、CD7和/或CD3靶向的嵌合抗原受体的免疫调节细胞(诸如T细胞)，以及通过使用CD5、CD7和/或CD3 CRISPR编辑的免疫调节细胞系(诸如T细胞系)来靶向T细胞恶性肿瘤的用途。在某些实施方案中，本公开涉及免疫调节细胞(诸如T细胞)，其包含1)工程改造的嵌合抗原受体多肽，所述多肽包含：CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域、铰链区、跨膜结构域、至少一个共刺激结构域和信号传导结构域，以及2)其缺失或突变使得CD5、CD7和/或CD3的表面表达降低或消除的CD5、CD7和/或CD3基因。在某些实施方案中，所述CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域包含特异性结合CD5、CD7和/或CD3的单克隆抗体的结合部分或可变区，诸如CD5、CD7和/或CD3靶向的scFv-CAR。

在某些实施方案中，本公开涉及使用CRISPR-Cas9基因组编辑在CAR T细胞中敲除靶抗原的表面表达。在某些实施方案中，本公开预期CD5、CD7和/或CD3-CRISPR编辑的T细胞，其在表达CD5、CD7和/或CD3-CAR时与CD5、CD7和/或CD3阳性T细胞相比自活化降低。

在某些实施方案中，本公开涉及，与其中CD5、CD7和/或CD3的表达未改变或降低免疫调节细胞(诸如T细胞)相比，CD5在免疫调节细胞(诸如T细胞)中表达降低，从而导致在免疫调节细胞(诸如T细胞)上包含CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域的嵌合抗原受体的表达增加。

在某些实施方案中，CD5抗原识别结构域是人类T细胞表面糖蛋白CD5同种型1，例如包含对SEQ ID NO:1RLSWYDPDFQARLTRSNSKCQGQLEVYLKDGWHMVCSQSWGRSSKQWEDPSQASKVCQRLNCGVPLSLGPFLVTYTPQSSIICYGQLGSFSNCSHSRNDMCHSLGLTCLEPQKTTPPTTRPPPTTTPEPTAPPRLQLVAQSGGQHCAGVVEFYSGSLGGTISYEAQDKTQDLENFLCNNLQCGSFLKHLPETEAGRAQDPGEPREHQPLPIQWKIQNSSCTSLEHCFRKIKPQKSGRVLALLCSGFQPKVQSRLVGGSSICEGTVEVRQGAQWAALCDSSSARSSLRWEEVCREQQCGSVNSYRVLDAGDPTSRGLFCPHQKLSQCHELWERNSYCKKVFVTCQDPNP具有选择性的多肽。

在某些实施方案中，本公开提供了一种产生表达嵌合抗原受体多肽或多核苷酸的工程改造的细胞的方法，所述多肽或多核苷酸具有特异性地结合CD5、CD7和/或CD3的抗原识别结构域以及CD5、CD7和/或CD3基因，其包含突变、添加或缺失使得CD5、CD7和/或CD3在所述工程改造的细胞上不表达，或提供表达降低的CD5、CD7和/或CD3修饰的细胞。在某些实施方案中，所述方法包括(i)提供外周血细胞或脐带血细胞；(ii)将前述多核苷酸引入前述细胞；(iii)扩增步骤(ii)的细胞；并分离步骤(iii)的细胞以提供所述工程改造的细胞或表达降低的CD5、CD7和/或CD3修饰的细胞。在某些实施方案中，所述方法包括(i)提供外周血细胞或脐带血细胞；(ii)将前述编码CD5、CD7和/或CD3靶向的嵌合抗原受体和任选的Cas核酸酶(例如Cas9)的多肽或多核苷酸以及靶向CD5、CD7和/或CD3基因或mRNA的gRNA引入前述细胞中；(iii)扩增步骤(ii)的细胞；并且分离步骤(iii)的细胞以提供所述工程改造的细胞或表达降低的CD5、CD7和/或CD3修饰的细胞。

在某些实施方案中，本公开提供了一种产生工程改造的细胞或表达降低的CD5、CD7和/或CD3修饰的细胞的方法，所述细胞表达具有对CD5、CD7和/或CD3具有选择性的抗原识别结构域的嵌合抗原多肽或多核苷酸。在某些实施方案中，所述方法包括(i)提供胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞；(ii)将前述例如编码CD5、CD7和/或CD3靶向的scFv-CAR的多核苷酸引入步骤(i)的细胞中；(iii)扩增步骤(ii)的细胞；并且(iv)分离步骤(iii)的细胞以提供所述工程改造的细胞或表达降低的CD5、CD7和/或CD3修饰的细胞。

在某些实施方案中，本公开提供了一种减少具有在细胞表面上表达的CD5、CD7和/或CD3的免疫调节细胞的数量的方法。所述方法包括(i)使所述免疫调节细胞与有效量的表达具有CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域的CAR多肽的工程改造的细胞或表达降低的CD5、CD7和/或CD3修饰的细胞接触，从而；(ii)任选地测定免疫调节细胞减少的数量。

在一个实施方案中，本公开提供了一种治疗细胞增殖性疾病的方法。所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的工程改造的细胞或表达降低的CD5、CD7和/或CD3修饰的细胞，所述细胞表达具有T细胞靶向的抗原识别结构域的CAR多肽，例如，所述细胞编码CD5、CD7和/或CD3 scFv-CAR并任选地含有Cas核酸酶和靶向CD5、CD7和/或CD3基因或mRNA表达的gRNA。

在某些实施方案中，本公开提供了一种治疗自身免疫性疾病的方法。所述方法包括(i)向有需要的患者施用治疗有效量的工程改造的细胞或表达降低的CD5、CD7和/或CD3修饰的细胞，所述细胞表达具有CD5、CD7和/或CD3靶向的抗原识别结构域的CAR多肽。

在某些实施方案中，本公开提供了工程改造的细胞或表达降低的CD5、CD7和/或CD3修饰的细胞，所述细胞表达具有CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域的CAR多肽用于治疗细胞增殖性疾病。所述用途包括向有需要的患者施用所述工程改造的细胞或表达降低的CD5、CD7和/或CD3修饰的细胞或其组合。

在一些实施方案中，CAR通常包括细胞内信号传导、铰链和/或跨膜结构域中的至少一个。第一代CAR包括CD3ζ作为细胞内信号传导结构域，而第二代CAR包括源自例如但不限于CD28或4-IBB的单个共刺激结构域。第三代CAR包括两个共刺激结构域，诸如但不限于CD28、4-lBB(也称为CD137)和OX-40，以及任何其他共刺激分子。

在一些实施方案中，编码具有CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域的CAR的多核苷酸是表达盒中基因的一部分。在一个优选的实施方案中，表达基因或盒可以包括辅助基因、编码荧光蛋白的基因或其标签或其一部分。辅助基因可以是诱导型***基因或其一部分，包括但不限于半胱天冬酶9基因。“***基因”消融方法改进了基因疗法的安全性，并且仅在被指定化合物或分子活化时才杀死细胞。在一些实施方案中，表位标签是c-myc标签、链霉亲和素结合肽(SBP)、截短的EGFR基因(EGFRt)或其一部分或其组合。

附图说明

图1A示出了含有CD5定向的可变淋巴细胞受体(VLR)或单链可变片段(scFv)的CAR结构。示出了具有包含scFv(左图)或VLR(右图)作为抗原识别结构域的CD28的CAR结构。

图1B示出了用于表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的双顺反子转基因序列和使用P2A自切割序列的CD5-CAR。它包个5'长末端重复序列(LTR)、人泛素C启动子(hUBC)、eGFP序列、P2A序列、白介素2信号肽(IL-2SP)、CD5-VLR(上图)或CD5-scFv(下图)、myc表位标签、CD28区域、CD3ζ细胞内结构域和3'LTR。

图2A示出了使用抗CD3ζ抗体对NK-92细胞的全细胞裂解物进行的蛋白质印迹，表明在分选和扩增的细胞中存在CD5-VLR-CAR和CD5-scFv-CAR蛋白质。用eGFP-P2 A-CD5-scFv-CAR慢病毒载体转导NK-92细胞，并分选表达GFP的细胞。经过两轮分选后，产生了表达CAR的NK-92细胞的富集群体，其中eGFP的表达为99％。

图2B示出了两种表达CD5-CAR的NK-92细胞与CD5阳性靶细胞Jurkat在各种效应子中混合的数据：通过流式细胞术测量靶标比率和细胞毒性百分比。

图2C示出了MOLT-4的数据。与未修饰的NK-92细胞相比，在4小时的测定中，CD5-CAR修饰的NK-92细胞对CD5阳性的Jurkat细胞和MOLT-4细胞具有显著更大的细胞毒性(p<0.01)。此数据表明NK-92细胞使用CD5-CAR介导对CD5阳性的T-ALL细胞系的细胞毒性。

图2D示出的数据表明当CD5-CAR NK-92细胞与CD5阴性697细胞一起培养时，没有观察到细胞毒性增加。

图3A示出了用慢病毒载体转导Jurkat T细胞的方法，所述慢病毒载体编码基于scFv或VLR的CD5-CAR与eGFP的共表达。Jurkat T细胞活化测定示出了测量T细胞活化和蛋白质印迹分析的时间点。

图3B示出了转导后第四天通过表面CD69表达测量的活化数据，其随病毒载体的量增加而增加。在CD5-VLR-CAR Jurkat组中观察到了更大的活化。

图3C示出了与每个转导的细胞群获得的载体拷贝数(VCN)相比的活化细胞的百分比的数据。图中的小图定义了每个组。

图3D示出了在转导后第4和12天测量的CD69表达的数据，这表明在两个表达CD5-CAR的Jurkat T细胞组中的活化随时间降低。

图4A示出了使用CRISPR-Cas9基因组编辑的Jurkat T细胞中CD5敲除的数据。在用编码Cas9的质粒和三种不同gRNA靶序列之一的质粒模拟转染或转染之后的第五天，通过流式细胞仪测量Jurkat T细胞中的CD5表达。沿单轴示出模拟转染和转染的Jurkat T细胞中CD5表达的直方图。

图4B示出了天然Jurkat T细胞中CD5表达和流式分选的用CD5-CRISPR gRNA#2转染的CD5阴性Jurkat T细胞中CD5表达的直方图的叠加图。

图4C示出了来自天然的(左上图)CCTGCTGGGGATGCTGGGTGAGT(SEQ ID NO:2)和分选的CD5编辑的(右上图)CCGGTGGGGGGTGTGGGGGGGGA(SEQ ID NO:3)Jurkat T细胞基因组DNA针对CD5扩增的PCR的代表性测序迹线，测序基因来自基因组DNA。

图4D示出了在由Cas9产生的预测的断裂位点之后在CD5基因内的***缺失的频率的TIDE分析。结果表明，编辑了77％的CD5阴性细胞，其中27％具有-1缺失。

图5A示出了eGFP阳性细胞的百分比。CD5编辑的CD5-CAR修饰的Jurkat T细胞具有降低的自活化和增加的CD5-CAR表达。在MOI 1、10和20下用eGFP-P2 A-CD5-VLR-CAR、eGFP-P2 A-CD5-scFv-CAR或对照eGFP-P2 A-BCL-VLR-CAR慢病毒载体转导天然的(白色)和CD5编辑的Jurkat T细胞(黑色)。转导过程中未使用聚凝胺，这在MOI 1与10之间提供了更大的转导效率间隔。在MOI 1、10和20下在两个Jurkat T细胞群中通过eGFP阳性细胞测量每种CAR载体的转导效率。

图5B示出了在每个MOI下用每种CAR载体转导的两个Jurkat T细胞群中的CD5表达的数据。

图5C示出关于通过监测CD69表达测量的活化和通过eGFP表达测量的转导效率的数据。在CD5-CAR转导的Jurkat T细胞中，活化与eGFP表达之间存在相关性。与CD5编辑的CD5-CAR修饰的细胞相比，未编辑的CD5-CAR修饰的细胞具有增加的T细胞活化。

图5D示出了全细胞裂解物的蛋白质印迹，示出了在用VLR-CAR载体转导时未编辑的Jurkat T细胞(左图)和CD5编辑的Jurkat T细胞(右图)中的CD3ζ表达。内源性CD3ζ由18kDa条带表示，并且CAR构建体中的CD3ζ由CD5-VLR-CAR构建体中的48kDa条带表示。通过流式细胞术测量eGFP、CD5和CD69表面表达。

图6A示出了表明与天然靶T细胞一起培养的CD5编辑的CD5-CAR修饰的效应细胞刺激效应细胞活化和靶细胞下调CD5的数据。在MOI 5下用eGFP-P2A-CD5-scFv-CAR或eGFP-P2A-CD5-VLR-CAR慢病毒载体转导天然的和CD5编辑的Jurkat T细胞。转导过程中未使用聚凝胺。靶天然Jurkat T细胞标记有VPD450。转导后第五天，将效应细胞与标记的靶细胞以E:T比2:1、1:1和1:5一起培养。24小时后细胞通过流式细胞术来分析。白色条表示未编辑的效应细胞；黑色条表示CD5编辑的效应细胞。实验进行了三次重复，并且误差条代表与平均值的标准偏差。与表达CD5-scFv-CAR的未编辑的和CD5编辑的效应Jurkat T细胞一起培养的靶Jurkat T细胞中基线CD5表达的百分比。单独培养的靶细胞(灰色条)中的CD5表达用作基线，并设置为100％。

图6B示出了CD5-VLR-CAR的数据。

图6C示出了单独培养表达CD5-scFv-CAR的未编辑的和CD5编辑的效应Jurkat T细胞时以及将其与靶Jurkat T细胞一起培养时的T细胞活化的数据。

图6D示出了CD5-VLR-CAR的数据。

图7A示出了MOI 5下具有CD5-scFv-CAR的未编辑的Jurkat T细胞的数据。

图7B示出了MOI 5下具有CD5-scFv-CAR的CD5编辑的Jurkat T细胞的数据。

图7C示出了表明抗原编辑导致CAR表达增加的数据。

图8A示出了未编辑的Jurkat T细胞全细胞裂解物的蛋白质印迹。

图8B示出了CD5编辑的Jurkat T细胞全细胞裂解物的蛋白质印迹。

图8C示出了表明在CD5编辑的T细胞中CAR表达增加的蛋白质印迹定量数据。

具体实施方式

在更详细描述本公开之前，应理解本公开不限于所述特定实施方案，并且因此所述实施方案当然可变化。也应理解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图限制，因为本公开的范围将仅受限于随附权利要求书。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。虽然在实践或检测本公开时也可以使用与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。

本说明书中引用的所有公布和专利均以引用的方式并入本文，如同每个单独的公布或专利被具体地和单独地指示为以引用的方式并入并且以引用的方式并入本文中以公开和描述引用公布所结合的方法和/或材料。引用任何出版物都是因为它的公开内容在提交日期之前，而不应解释为认可本公开由于先前公开而无权先于所述出版物。此外，提供的公开日期可不同于可能需要独立确认的实际公开日期。

如将为本领域技术人员在阅读本公开后显而易知，本文描述和说明的每个单独的实施方案具有离散组成部分和特征，其可易于与任何其他若干实施方案的特征分开或组合而不脱离本公开的范围或精神。任何叙述的方法都可以叙述的事件的顺序或以在逻辑上可能的任何其他顺序执行。

除非另外指示，否则本公开的实施方案将采用属于本领域的医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药学等的技术。此类技术在文献中充分地说明。

在描述各种实施方案之前，提供以下定义并且除非另外指示，否则应使用所述定义。此外，本文提供的标题仅出于方便目的并且不解释权利要求书的范围或含义。

必须注意，除非本文另外清楚指示，否则如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括多个提及物。在本说明书中以及在随后权利要求书中，将提及除非相反意图是明显的，否则将被定义来具有以下含义的许多术语。

如本文所用，术语“治疗(treat或treating)”不限于受试者(例如患者)被治愈以及疾病被根除的情况。相反，本公开的实施方案还预期仅减轻症状和/或延迟疾病进展的治疗。

除非上下文另外要求，否则在整个说明书和随后权利要求书中，单词“包括(comprise)”及其变体，诸如“包含(comprises或comprising)”、“包括(including)”、“含有(containing)”或“特征在于(characterized by)”，均应以开放的、包容性的意义来解释，即“包括但不限于”，并且不排除另外的未叙述的要素或方法步骤。相反，过渡短语“由……组成”排除了权利要求书中未指明的任何要素、步骤、或成分。过渡短语“基本上由…组成”将权利要求书的范围限定为所要求保护的发明的指明的材料或步骤“以及实质上并不影响基本的和新颖的特征的那些材料或步骤”。在其中术语“包括”用作过渡短语的实施方案或权利要求书中，也可以设想用术语“包含”、术语“由……组成”或“基本上由……组成”替代此类实施方案。

关于具有氨基酸序列的肽的术语“包含”是指可以含有另外的N端(胺端)或C端(羧酸端)氨基酸的肽，即所述术语旨在包括较大肽中的氨基酸序列。关于具有氨基酸序列的肽的术语“由……组成”是指在序列中具有准确的氨基酸数量并且不超过权利要求书中明确指明的氨基酸或不超过权利要求书中明确指明的氨基酸范围的肽。在某些实施方案中，本公开预期“肽的N端可以由氨基酸序列组成”，这是指在序列中具有准确的氨基酸数量并且不超过权利要求书中指明的氨基酸或不超过权利要求书中指明的氨基酸范围的肽的N端，然而，C端可以连接至另外的氨基酸，例如作为较大肽段的一部分。类似地，本公开预期“肽的C端可以由氨基酸序列组成”，这是指在序列中具有准确的氨基酸数量并且不超过权利要求书中指明的氨基酸或不超过权利要求书中指明的氨基酸范围的肽的C端。然而，N端可以连接至另外的氨基酸，例如作为较大肽段的一部分。

在某些实施方案中，序列“同一性”是指在两个比对序列之间的序列比对中准确匹配的氨基酸数(表示为百分比)，其使用相同位置数除以最短序列或排除突出端的等效位置数中的较大者来计算，其中内部间隔计数为等效位置。例如，多肽GGGGGG和GGGGT具有5分之4或80％的序列同一性。例如，多肽GGGPPP和GGGAPPP具有7分之6或85％的序列同一性。在某些实施方案中，在本文中表示的序列同一性的任何表述可以被序列相似性取代。“相似性”百分比用于定量两个比对序列之间的相似性。此方法与确定同一性相同，除了某些氨基酸不必相同以具有匹配。如果氨基酸属于具有相似特性的组，则根据以下氨基酸组将其分类为匹配项：芳香族-F Y W；疏水性-A V I L；带正电：R K H；带负电-D E；极性-S T N Q。所述氨基酸组也被视为保守取代。

嵌合抗原受体多肽

在某些实施方案中，本公开提供了一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，其具有信号肽、T细胞抗原识别结构域(例如CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域)、铰链区、跨膜结构域、至少一个共刺激结构域和信号传导结构域。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指具有由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括具有由肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指短链和长链两者，所述短链在本领域中通常还称为例如肽、寡肽和低聚物，所述长链在本领域中一般称为蛋白质，其中存在许多种类型。

“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

“信号肽”包括指导肽和任何附着的多肽在细胞内转运并定位例如到特定细胞器(诸如内质网)和/或细胞表面的肽序列。信号肽是任何分泌的或跨膜蛋白的肽，其指导本公开的多肽向细胞膜和细胞表面的转运，并提供本公开的多肽的正确定位。具体地，本公开的信号肽指导本公开的多肽到细胞膜，其中所述多肽的细胞外部分显示在细胞表面上，跨膜部分跨越质膜，并且活性结构域位于细胞质部分或细胞内部。在一个实施方案中，信号肽在穿过内质网(ER)后被切割，即所述信号肽是可切割的信号肽。在一个实施方案中，信号肽是I、II、III或IV型人蛋白质。在一个实施方案中，信号肽包括免疫球蛋白重链信号肽。

“抗原识别结构域”包括对靶标或靶标的多肽的抗原、受体、肽配体或蛋白质配体具有选择性的多肽。在一个实施方案中，抗原识别结构域包括针对靶标(对其有选择性)的单克隆或多克隆抗体的结合部分或可变区。在一个实施方案中，抗原识别结构域包括片段抗原结合片段(Fab)。在另一个实施方案中，抗原识别结构域包括单链可变片段(scFV)。scFV是免疫球蛋白重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其与短接头肽连接。在另一个实施方案中，抗原识别结构域包括与它们的同源受体接合的配体。在另一个实施方案中，抗原识别结构域是人源化的。应当理解，抗原识别结构域可以在其序列内包括一些可变性，并且仍然对本文公开的靶标具有选择性。因此，预期抗原识别结构域的多肽与本文公开的抗原识别结构域多肽可以具有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％的同一性，并且仍然对本文所述的靶标具有选择性并且在本公开的范围内。

铰链区是位于例如包括但不限于嵌合抗原受体与至少一个共同刺激结构域和信号传导结构域之间的序列。铰链序列可以包括例如来自任何属(包括人)的任何合适的序列或其部分。此类铰链区在本领域是已知的。在一个实施方案中，铰链区包括人蛋白质的铰链区，所述人蛋白质包括CD-8α、CD28、4-IBB、OX40、CD3-ζ、T细胞受体a或β链、CD3ζ链、CD28、CD3s、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、其功能性衍生物及其组合。在一个实施方案中，铰链区域包括CD8和铰链区域。在一些实施方案中，铰链区包括选自但不限于免疫球蛋白中的一个(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgD)。

跨膜结构域包括跨越细胞膜的疏水性多肽。特别地，跨膜结构域从细胞膜的一侧(细胞外)跨越到细胞膜的另一侧(细胞内或细胞质)。跨膜结构域可以是α螺旋或β桶或它们的组合的形式。跨膜结构域可以包括具有许多跨膜区段、每个α-螺旋、β折叠或其组合的多蛋白。在一个实施方案中，使用与CAR中的结构域中的一个天然缔合的跨膜结构域。在另一个实施方案中，跨膜结构域可通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免此类结构域结合到相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。例如，跨膜结构域包括T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3s、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、其功能性衍生物及其组合的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是主要包含疏水性残基(诸如亮氨酸和缬氨酸)的多肽。在一个实施方案中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体存在于合成的跨膜结构域的每端。在一个实施方案中，跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在另一个实施方案中，跨膜结构域是CD28跨膜结构域。此类跨膜结构域在本领域是已知的。

信号传导结构域和共刺激结构域包括提供免疫细胞活化以刺激或活化免疫细胞信号传导通路的至少一些方面的多肽。在一个实施方案中，信号传导结构域包括CD3ζ、常规FcRγ(FCER1G)、FcγRIIIA、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DNAX活化蛋白10(DAP10)、DNAX活化蛋白12(DAP12)、其活性片段、其功能性衍生物及其组合的功能性信号传导结构域的多肽。此类信号传导结构域在本领域是已知的。在一个实施方案中，CAR多肽还包含一个或多个共刺激结构域。在一个实施方案中，共刺激结构域是来自包括以下的蛋白质的功能性信号结构域：OX40，CD27，CD28，CD30，CD40，PD-1，CD2，CD7，CD258，自然杀伤细胞2族成员C(NKG2C)，自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)，B7-H3，与CD83、ICAM-1、LFA-1(CD1la/CD 18)、ICOS和4-1BB(CD137)结合的配体，其活性片段，其功能性衍生物及其组合。

编码嵌合抗原受体的多核苷酸

本公开还提供了编码本文所述的嵌合抗原受体多肽的多核苷酸。编码CAR的多核苷酸是通过任何常规方法由指定CAR的氨基酸序列制备的。可以从前述NCBI RefSeq ID或GenBank登录号对于每个结构域的氨基酸序列获得编码氨基酸序列的碱基序列，并且可以使用标准分子生物学和/或化学方法制备本公开的核酸。例如，基于碱基序列，可以合成多核苷酸，并且可以通过使用聚合酶链式反应(PCR)组合从cDNA文库获得的DNA片段来制备本公开的多核苷酸。在一个实施方案中，本文公开的多核苷酸是基因或表达盒或克隆盒的一部分。

如本文所用，术语“多肽”被定义为核苷酸的链。多核苷酸包括DNA和RNA。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所用，核酸和多核苷酸是可互换的。本领域的技术人员具备核酸是可水解为单体“核苷酸”的多核苷酸的一般知识。单体核苷酸可水解为核苷。如本文所用，多核苷酸包含但不限于可通过本领域中可用的任何手段获得的所有核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段(即，克隆来自重组文库或细胞基因组的核酸序列、使用普通的克隆技术和聚合酶链式反应(PCR)等)和通过合成手段。

多核苷酸载体

可以将上述多核苷酸克隆到载体中。“载体”是包括分离的多核苷酸并且可用于向细胞的内部递送分离的多核核酸的物质的组合物。多种载体在本领域中是已知的，其包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲性化合物缔合的多核苷酸、质粒、噬菌粒、粘粒以及病毒。病毒包括噬菌体、噬菌体衍生物。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还应解释为包括有助于将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

在一个实施方案中，载体包括克隆载体、表达载体、复制载体、探针产生载体、整合载体和测序载体。在一个实施方案中，载体是病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一个实施方案中，病毒转导工程改造的细胞以表达多核苷酸序列。

多种基于病毒的***已经被开发用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送***提供了便利的平台。所选基因可使用本领域中已知的技术***到载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。重组的病毒然后可被分离并且在体内或离体递送到受试者的细胞。多种逆转录病毒***在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。多种腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。病毒载体技术在本领域是众所周知的，并描述于例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒以及慢病毒。一般来讲，合适的载体含有在至少一种生物体中发挥功能的复制起点、启动子序列、便利的限制核酸内切酶位点、以及一个或多个选择性标志物(例如WO 01/96584；WO01/29058；以及美国专利号6,326,193)。

嵌合抗原受体多核苷酸的表达可以使用例如表达载体来实现，所述表达载体包括但不限于SFFV或人延伸因子11a(EF)启动子、CAG(具有CMV增强子的鸡β-肌动蛋白启动子)、人延伸因子la(EF)启动子中的至少一种。利用的强度较低/表达较低的启动子的实例可包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、泛素C(UBC)启动子和磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子或其一部分。嵌合抗原受体的诱导型表达可以使用例如四环素响应性启动子来实现，所述启动子包括但不限于TRE3GV(Tet响应元件，包括所有世代，并且优选地是第三代)、诱导型启动子(Clontech Laboratories,Mountain View,CA)或其一部分或组合。

合适的启动子的一个实例为即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是一种强大的组成型启动子序列，其能够驱动与其操作性地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个实例是延伸增长因子-1a(EF-1a)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即刻早期启动子、劳氏(Rous)肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子(诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子)。此外，本公开不应限于使用组成型启动子–诱导型启动子也预期是本公开的一部分。使用诱导型启动子提供了一种分子开关，所述分子开关能够在需要这种表达时开启与它操作性地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时关闭所述表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、***启动子、以及四环素启动子。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含操作性地连接到待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的顺式作用表达元件；其他表达元件可由宿主细胞或在体外表达***中提供。表达载体包括本领域中所有已知的表达载体，诸如粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，所述表达载体并入重组多核苷酸，

另外的启动子元件(例如，增强子)调节转录引发的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-100bp区域中，虽然许多启动子最近已表明也含有起始位点下游的功能性元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此反向或移动时，启动子功能得以保留，在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到50bp。根据启动子，似乎单独的元件可协同或独立地起作用来活化转录，

为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入到细胞中的表达载体也可含有选择性标志物基因或报告基因或两者，以有助于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中识别和选择表达细胞，在其他方面，选择性标志物可被携带在单独的DNA片段上并用于共转染方法。选择性标志物和报告基因两者均可侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。可用的选择性标志物包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。

报告基因用于识别潜在被转染的细胞并且用于评价调节序列的功能性。一般来讲，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由所述受体生物体或组织表达的基因，它编码通过一些可容易地检测的特性(例如，酶活性)证明其表达的多肽。在DNA已被引入受体细胞中之后合适的时间，测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达***是众所周知的，并且可使用已知的技术来制备或商购获得。一般来讲，具有示出报告基因的最高水平表达的最小5'侧翼区的构建体被识别为启动子。此类启动子区域可连接到报告基因，并且用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。

将基因引入到细胞中并表达基因的方法在本领域中是已知的。在表达载体的情况下，所述载体可容易地通过本领域的任何方法引入宿主细胞(例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞)中。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是众所周知的。参见例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。用于将多核苷酸引入宿主细胞中的优选的方法是磷酸钙转染。

用于将目标多核苷酸引入宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因***哺乳动物(例如，人类细胞)中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。

用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散***(诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒)和基于脂质的***(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。在体外和体内用作递送媒介物的示例性胶体***是脂质体(例如，人工膜囊泡)。在利用非病毒递送***的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。预期使用脂质制剂以用于将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一方面，所述核酸可与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子连接到脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、以悬浮液形式包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合、或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于在溶液中的任何特定结构。例如，它们可存在于双层结构中、作为胶束存在、或具有“塌陷的”结构。它们也可仅散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质是脂肪物质，它们可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。

适于使用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸双十六烷基酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以储存在大约-20℃下。使用氯仿作为唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。

“脂质体”是通用术语，其涵盖各种单一和多层的脂质媒介物，所述脂质媒介物通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成。脂质体可被表征为具有囊泡结构，所述囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有被水性介质分隔的多个脂质层。它们在磷脂悬浮于过量水性溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排，并将水和溶解的溶质包埋在脂质双层之间(Ghosh等,Glycobiology 5,505-10)。然而，也涵盖与正常囊泡结构相比在溶液中具有不同结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅仅以非均一脂质分子聚集体形式存在。也预期脂质体(lipofectamine)-核酸复合物。

不管使用何种方法将外源性多核苷酸引入宿主细胞中或者以其他方式将细胞暴露于本公开的多核苷酸，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可进行各种测定。此类测定包括例如本领域的技术人员众所周知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如检测特征多肽存在或不存在，所述测定例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹法)或通过本文所述的识别落在本公开范围内的药剂的测定来进行。

工程改造的细胞

在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的细胞，其表达上述嵌合抗原受体多肽或编码所述嵌合抗原受体多肽的多核苷酸。“工程改造的细胞”是指通过添加或修饰基因、DNA或RNA序列、蛋白质或多肽而被修饰、转化或操纵的任何生物体的任何细胞。本公开的分离的细胞、宿主细胞和遗传工程改造的细胞包括分离的免疫细胞，诸如NK细胞和T细胞，其含有编码嵌合抗原受体或嵌合抗原受体复合物的DNA或RNA序列并在细胞表面上表达嵌合受体。分离的宿主细胞和工程改造的细胞可以用于例如增强NK细胞活性或T淋巴细胞活性、治疗癌症和治疗感染性疾病。

可以使用能够表达和/或能够将如本文所公开的嵌合抗原受体多肽整合到其膜中的任何细胞。在一个实施方案中，工程改造的细胞包括免疫调节细胞。免疫调节细胞包括T细胞，诸如CD4 T细胞(辅助T细胞)、CD8 T细胞(细胞毒性T细胞，CTL)和记忆T细胞或记忆干细胞T细胞。在另一个实施方案中，T细胞包括自然杀伤T细胞(NK T细胞)。T细胞由CD4和CD8细胞组成。CD4是存在于免疫细胞(如T辅助细胞)表面的一种糖蛋白，其对T细胞活化和HIV受体很重要。一些单核细胞或巨噬细胞也表达CD4。CD4也被称为OKT4。细胞毒性T细胞也被称为在其表面表达CD8糖蛋白的CD8+ T细胞或CD8 T细胞。一旦将这些CD8+ T细胞暴露于I类MHC呈递的肽抗原，它们就会被活化。在一个实施方案中，工程改造的细胞包括自然杀伤细胞。自然杀伤细胞在本领域中是众所周知的。在一实施方案中，自然杀伤细胞包括细胞系，诸如NK-92细胞。NK细胞系的另外的实例包括NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS细胞和NKL细胞。NK细胞在没有GvHD风险的情况下介导抗肿瘤作用，并且相对于T细胞而言寿命短暂。因此，在破坏癌细胞后不久，NK细胞将被耗尽，从而减少在可消除修饰的细胞的CAR构建体上对诱导型***基因的需求。

在一个实施方案中，可以修饰工程改造的细胞，特别是从供体获得的同种异体T细胞，以灭活参与MHC识别的TCR(T细胞受体)的组分。因此，缺乏TCR的T细胞不会引起移植物抗宿主病(GVHD)。

T抗原缺陷性T细胞

T细胞淋巴瘤或T细胞白血病表达可能代表这些疾病的有用靶标的特定抗原。例如，T细胞淋巴瘤或白血病表达CD5。然而，CD5也在CAR T中表达，但在NK细胞中不表达，这抵消了它们靶向这些抗原的能力。***伤可能发生在装有靶向这些抗原中的任一种的CAR的T细胞中。这使得靶向这些抗原的CAR的产生变得困难。因此，当将内源性抗原用作武装CAR的靶标时，可能有必要灭活T细胞中的内源性抗原。

在另一个实施方案中，工程改造的细胞被进一步修饰以灭活细胞表面多肽，以防止工程改造的细胞作用于其他工程改造的细胞。例如，可以敲除或灭活工程改造的细胞的内源性CD5、CD7和/或CD3基因或基因表达。在另一个优选的实施方案中，工程改造的细胞是具有敲除或灭活的内源性CD5、CD7和/或CD3基因的T细胞。在一个实施方案中，表达具有CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域的CAR的工程改造的细胞将具有灭活或敲除的表达所述抗原的基因。例如，具有CD5、CD7和/或CD3 CAR的T细胞将具有灭活或敲除的CD5、CD7和/或CD3抗原基因。敲除或灭活基因的方法是已知的。例如，CRISPR/Cas9***、锌指核酸酶(ZFN)和TALE核酸酶(TALEN)和大范围核酸酶可用于敲除或灭活工程改造的细胞的CD5、CD7和/或CD3基因或基因表达。

细胞的来源

所述工程细改造的胞可从外周血、脐带血、骨髓、肿瘤浸润淋巴细胞、***组织或胸腺组织中获得。宿主细胞可以包括胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞或造血干细胞。所述细胞可以从人、猴子、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种中获得。可以从建立的细胞系中获得细胞。上述细胞可以通过任何已知的手段获得。对于工程改造的细胞的受体，细胞可以是自体的、同系的、同种异体的或异种的。

术语“自体的”是指来源于同一个体且后来又再引入到所述个体中的任何材料。

术语“同种异体的”是指来源于与引入所述材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座上的基因不相同时，两个或更多个个体被称为彼此同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体的材料可能在遗传学上足够不同以与抗原性同类物相互作用。

术语“异种的”是指来源于不同物种的动物的移植物。

术语“同系的”是指极其紧密的遗传相似性或同一性，尤其是在抗原或免疫反应方面。同系***包括例如其中器官和细胞(例如癌细胞及其非癌性对应物)来自同一个体的模型，和/或其中器官和细胞来自属于同一近交系的不同个体动物的模型。

******

本公开的工程改造的细胞还可包括******。******提供了一种可以灭活或破坏如上所述的工程改造的细胞的机制。这样的特征允许对其中使用所述工程改造的细胞的任何治疗进行精确的治疗控制。如本文所用，******提供了一种可以使具有******的细胞灭活或破坏的机制。******在本领域中是众所周知的。

在一个实施方案中，******包括可以被药理学活化以根据需要消除包含细胞的基因。在指定方面，***基因对携带多核苷酸或细胞的宿主没有免疫原性。在一个实例中，******包括使CD20在工程改造的细胞的细胞表面上表达的基因。因此，施用利妥昔单抗可用于破坏含有所述基因的工程改造的细胞。

在一些实施方案中，******包括表位标签。表位标签的实例包括c-myc标签、链霉亲和素结合肽(SBP)和截短的EGFR基因(EGFRt)。在此实施方案中，表位标签在工程改造的细胞中表达。因此，施用针对表位标签的抗体可用于破坏含有所述基因的工程改造的细胞。

在一个实施方案中，******包括一个使截短的表皮生长因子受体在工程改造的细胞的表面上表达的基因。因此，施用西妥昔单抗可用于破坏含有所述基因的工程改造的细胞。在另一个实施方案中，***基因可以包括半胱天冬酶8基因、半胱天冬酶9基因、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨基酶(CD)或细胞色素P450。另外的******的实例包括Jones等描述的那些******(Jones BS,Lamb LS,Goldman F和Di Stasi A(2014)Improving the safetyof cell therapy products by suicide gene transfer.Front.Pharmacol.5:254)，其全部内容以引用的方式并入本文。

工程改造的CRISPR***

工程改造的CRISPR***可用于诱导遗传修饰，诸如高度特异性的基因敲除。CRISPR-Cas***是细菌固有的，并且提供针对病毒和质粒的适应性免疫。II型CRISPR***在利用单个CRISPR相关(Cas)核酸酶(特别是Cas9)与适当的指导RNA(gRNA)形成复合体时具有理想的特征。在细菌中，Cas9指导RNA包含两个单独的RNA种类：crRNA和tracrRNA。靶标特异性CRISPR活化RNA(crRNA)指导Cas9/gRNA复合物结合并靶向指定的DNA序列。crRNA具有两个功能性结构域，即靶标特异性的5'-结构域以及将crRNA与反式活化crRNA(tracrRNA)结合的3'-结构域。tracrRNA是更长的通用RNA，其结合crRNA并介导gRNA复合物与Cas9的结合。gRNA功能也可以作为人工单指导RNA(sgRNA)提供，其中crRNA和tracrRNA融合为单一物质(参见Jinek等,Science,337,816-21,2012)。sgRNA格式允许从单个转录单位转录功能性gRNA，所述转录单位可以由含有转录启动子和sgRNA序列的双链DNA(dsDNA)盒提供。在哺乳动物***中，这些RNA通过DNA盒的转染来引入，所述DNA盒含有驱动RNA转录的RNA Pol III启动子(诸如U6或H1)、病毒载体和体外转录后的单链RNA(参见Xu等,ApplEnviron Microbiol,2014.80(5):1544-52)。

在天然***中，CRISPR相关的(Cas)蛋白之后充当核酸酶切割靶向的DNA序列。靶序列与指导序列相同，并且还含有与靶区域相邻和在靶区域下游(3’)的“原始间隔物相邻基序”(PAM)寡核苷酸，以便使***起作用。在已知的Cas核酸酶中(诸如Cas9)，酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9已被广泛报道。

Cas核酸酶通常是大型的多结构域蛋白质，其含有两个不同的核酸酶结构域。可以将点突变引入Cas核酸酶(诸如Cas9)中以消除核酸酶活性，从而使核酸酶失活的Cas核酸酶(诸如Cas9)仍然保留其以gRNA编程的方式结合DNA的能力。通过创建具有改变基因翻译为mRNA的速率的蛋白质结构域(例如转录因子和调节剂)的Cas核酸酶(诸如Cas9)融合蛋白，CRISPR-cas***起到RNA指导的基因表达控制器的作用。

野生型Cas9蛋白具有RuvC和HNH两个功能性核酸内切酶结构域。RuvC结构域切割双链DNA的一条链，而HNH结构域切割另一条链。当两个结构域都具有活性时，Cas9蛋白可以在基因组DNA中生成DSB。已经开发出仅具有一种酶促活性的Cas9蛋白。此类Cas9蛋白仅切割靶DNA的一条链。例如，来源于酿脓链球菌的Cas9蛋白的RuvC和HNH结构域分别被D10A和H840A突变灭活。天然存在的机制可以修复双链或单链切口；但修复可能会导致原始序列的添加或删除。如果Cas9蛋白的RuvC和HNH结构域都被灭活，则Cas9可能只是就位并阻断所述基因的转录。

如本文所用，术语“Cas核酸酶(诸如Cas9)”意指在gRNA存在下具有结合DNA分子的能力的蛋白质，包括同时具有RuvC和HNH核酸酶活性的Cas9蛋白质和缺乏任一种或两种核酸酶活性的Cas9蛋白质。Cas核酸酶(诸如Cas9)的DNA结合活性和核酸酶活性可以例如通过Sternberg等,Nature,507,62-67(2014)中描述的方法来测量。

通过将编码所需Cas核酸酶的氨基酸序列的DNA克隆到适用于体外转录载体中以及进行体外转录可获得Cas核酸酶mRNA或Cas9 mRNA。适用于体外转录的载体是本领域技术人员已知的。含有编码Cas9蛋白的克隆DNA的体外转录载体也是已知的，并且包括例如pT7-Cas9。体外转录的方法是本领域技术人员已知的。

如本文所用，术语“指导RNA”或“gRNA”是指具有与指导序列的融合体的合成RNA，所述指导序列与双链靶序列的模板链杂交，所述双链靶序列在有义序列和“tracrRNA杂交区段”(例如来源于crRNA的区段)上具有与其相邻的PAM。

tracrRNA杂交区段和tracrRNA可以通过接头(例如寡核苷酸接头)或其他方式连接在一起。指导RNA一般来讲以不同的形式出现。一种形式使用分开的靶向指导RNA和tracrRNA，两者杂交在一起以指导靶向，并且另一种形式使用嵌合的靶向指导RNA-tracrRNA杂交体，所述杂交体将两条单独的RNA连接在形成发夹的RNA单链中，称为“sgRNA”。还参见Jinek等,Science 2012；337:816-821。

在天然状态下，crRNA负责gRNA的序列特异性。在本文公开的实施方案中，选择靶序列使得所述序列存在于所选的双链核苷酸中紧邻原始间隔物相邻基序(PAM)的上游。靶序列可以存在于基因组DNA的任一链中。然而，在本公开的一个优选实施方案中，gRNA包含与PAM上游的有义链相同的序列。工具可用于选择靶序列和/或设计gRNA，并且可获得针对各种物种中的各种基因预测的靶序列的列表。例如，Feng Zhang实验室的靶标查找器，Michael Boutros实验室的靶标查找器(E-CRISP)、RGEN工具：Cas-OFFinder、CasFinder：用于在基因组中鉴定特异性Cas9靶标的灵活算法和CRISPR最佳靶标查找器，可以提及并且其全部内容以引用的方式并入本文。

Cas核酸酶或Cas9可以与任何具有PAM序列的DNA结合。PAM的准确序列取决于Cas核酸酶或Cas9来源的细菌物种。一种Cas9蛋白来源于酿脓链球菌，并且对应的PAM序列为NGG(SEQ ID NO:4)，其存在于紧邻靶序列的3'端的下游，其中N表示A、T/U、G和C中的任一个。各种细菌物种的PAM序列是已知的。

在细菌中，tracrRNA与gRNA的一部分杂交形成发夹环结构。所述结构被Cas9蛋白识别，并形成crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白的复合物。因此，tracrRNA负责gRNA与Cas9蛋白质结合的能力。tracrRNA来源于内源性细菌RNA，并具有细菌物种固有的序列。可以在本文中使用来源于已知具有上述CRISPR***列表的细菌物种的tracrRNA。优选地，使用来源于同一物种的tracrRNA和Cas9蛋白。

通过将具有所需的gRNA序列的DNA克隆到适用于体外转录的载体中并进行体外转录可获得gRNA。适用于体外转录的载体是本领域技术人员已知的。包含对应于gRNA的序列但没有靶序列的体外转录载体在本领域中也是已知的。gRNA可通过将靶序列的合成寡核苷酸***此类载体中并进行体外转录而获得。此类载体包括例如pUC5 7-sgRNA表达载体、pCFD1-dU6:1gRNA、pCFD2-dU6:2gRNA pCFD 3-dU6:3gRNA、pCFD4-U6:1_U6:3tandemgRNA、pRB17、pMB60、D R274、SP6-sgRNA-支架、pT7-gRNA、DR274、和可从Addgene获得的pUC57-Simple-gRNA骨架、以及可从Origene获得的pT7-Guide-IVT。体外转录的方法是本领域技术人员已知的。

制备工程改造的细胞的方法

在一个实施方案中，本公开还提供了制备上述工程改造的细胞的方法。在此实施方案中，获得或分离上述细胞。所述细胞可以通过任何已知手段进行分离。所述细胞包括外周血细胞或脐带血细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞或造血干细胞。

通过任何已知手段将编码上述嵌合抗原受体多肽的多核苷酸引入外周血细胞或脐带血细胞中。在一个实例中，通过病毒载体将编码上述嵌合抗原受体多肽的多核苷酸引入细胞中。

通过任何已知手段将编码上述嵌合抗原受体多肽的多核苷酸引入胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞或造血干细胞中。在一个实例中，通过病毒载体将编码上述嵌合抗原受体多肽的多核苷酸引入细胞中。

在其他实施方案中，嵌合抗原受体多核苷酸可被构建为瞬时RNA修饰的“可生物降解的衍生物”。可以将RNA修饰的衍生物电穿孔到T细胞或NK细胞中。在另一个实施方案中，本文所述的嵌合抗原受体可以在也称为“睡美人(Sleeping Beauty)”的转座子***中构建，所述转座子***在没有病毒载体的情况下将嵌合抗原受体多核苷酸整合到宿主基因组中。

一旦将上述多核苷酸引入细胞总以提供工程改造的细胞，就扩增所述工程改造的细胞。含有上述多核苷酸的工程改造的细胞可以通过任何已知手段进行扩增。通过任何已知手段分离扩增的细胞，以提供根据本公开的分离的工程改造的细胞。

使用方法

本公开提供了杀死免疫调节细胞、减少其数量或使其耗尽的方法。在另一个实施方案中，本公开提供了一种杀死具有CD5、CD7和/或CD3的细胞、减少其数量或使其耗尽的方法。如本文所用，“减少数量”包括减少至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少99％或100％。如本文所用，“耗尽”包括减少至少75％、至少80％、至少90％、至少99％或100％。

在一个实施方案中，本公开包括一种减少具有CD5、CD7和/或CD3的免疫调节细胞的数量的方法，所述方法通过使所述免疫调节细胞与有效量的上述表达具有CD5、CD7和/或CD3抗原识别结构域的嵌合抗原受体肽的工程改造的细胞接触。任选地，具有CD5、CD7和/或CD3的免疫调节细胞数量的减少可以通过本领域已知的任何细胞测定来确定。

如本文所用，免疫调节细胞可以在患者体内、在细胞培养中或者可以是分离的。如本文所用，“患者”包括哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(Rodentia)的哺乳动物(诸如小鼠和仓鼠)，以及兔形目(Logomorpha)的哺乳动物(诸如兔)。哺乳动物可能来自食肉目(Carnivora)，包括猫科动物(Felines(猫))和犬科动物(Canines(狗))。哺乳动物可以来自偶蹄目(Artiodactyla)，包括牛亚科(Bovines(牛))和猪属(Swines(猪))，或者属于奇蹄目(Perssodactyla)，包括马属(Equines(马))。哺乳动物可以属于灵长目(Primates)、Ceboids或Simoids(猴)，或者属于类人猿目(Anthropoids(人类和猿))。优选地，哺乳动物为人。

在某些实施方案中，患者是0至6个月、6至12个月、1至5岁、5至10岁、5至12岁、10至15岁、15至20岁、13到19岁、20到25岁、25到30岁、20到65岁、30到35岁、35到40岁、40到45岁、45到50岁、50岁至55岁、55至60岁、60至65岁、65至70岁、70至75岁、75至80岁、80至85岁、85至90岁、90至95岁或95至100岁的人。

如本文所用，工程改造的细胞的术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以提供所需治疗或生理或效果或结果的工程改造的细胞的量。这种效果或结果包括细胞疾病症状的减轻或改善。不良影响(例如副作用)有时会与所需的治疗效果一起出现；因此，从业者在确定适当的“有效量”是多少时，应平衡潜在利益与潜在风险。所需的准确量将根据受试者的种类、年龄和一般状况、施用模式等而在受试者与受试者之间变化。因此，可能不能指定准确的“有效量”。然而，本领域普通技术人员可仅使用常规实验确定在任何单独情况下的适当的“有效量”。一般来讲，以足以减少靶细胞增殖的量和条件给予工程改造的细胞。

在一个实施方案中，本公开包括一种减少具有T细胞抗原(诸如CD5、CD7和/或CD3)的免疫调节细胞的数量的方法，所述方法通过使免疫调节细胞与有效量的上述表达具有T细胞抗原识别结构域的嵌合抗原受体肽的工程改造的细胞接触。任选地，具有T细胞抗原的免疫调节细胞数量的减少可以通过本领域已知的任何细胞测定来确定。

治疗方法

在另一个实施方案中，本公开提供了用于治疗细胞增殖性疾病的方法。所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的上述工程改造的细胞。细胞增殖性疾病是癌症、赘生性疾病或任何涉及不受控制的细胞增殖(例如细胞团形成)的疾病中的任一种，这些细胞没有分化为特化的和不同的细胞。细胞增殖性疾病还包括恶性肿瘤或癌前病状，诸如骨髓增生异常综合征或白血病前期或淋巴瘤前期。关于所公开的方法，癌症可以是任何癌症，包括以下中的任一种：急性淋巴细胞癌，急性髓系白血病，腺泡型横纹肌肉瘤，膀胱癌(例如膀胱上皮肿瘤(bladder carcinoma))，骨癌，脑癌(例如髓母细胞瘤)，乳腺癌，***、肛管或***直肠癌，眼癌，肝内胆管癌，关节癌，颈、胆囊或胸膜癌，鼻、鼻腔或中耳癌，口腔癌，外阴癌，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓系癌，结肠癌，食道癌，***，纤维肉瘤，胃肠类癌肿瘤，头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，肾癌，喉癌，白血病，液体肿瘤，肝癌，肺癌(例如非小细胞肺癌)，淋巴瘤，恶性间皮瘤，肥大细胞瘤，黑素瘤，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，非霍奇金淋巴瘤，B-慢性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，急性淋巴细胞白血病(ALL)，T细胞急性淋巴细胞白血病和伯基特淋巴瘤，结外NK/T细胞淋巴瘤，NK细胞白血病/淋巴瘤，移植后淋巴增殖疾病，卵巢癌，胰腺癌，腹膜、大网膜和肠系膜癌，咽癌，***癌，直肠癌，肾癌，皮肤癌，小肠癌，软组织癌，实体瘤，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌和输尿管癌。优选地，癌症是血液***恶性肿瘤(例如，白血病或淋巴瘤，包括但不限于霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞癌、急性髓系白血病、B-慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)和伯基特淋巴瘤)、胸腺上皮肿瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和慢性淋巴白血病(CLL)、T细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤。

本公开提供了一种用于治疗急性器官排斥的方法，所述方法通过耗尽与T细胞抗原(诸如CD5、CD7和/或CD3)相关联的T细胞。

在一个实施方案中，本公开包括一种用于治疗急性或慢性移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法通过耗尽与T细胞抗原(诸如CD5、CD7和/或CD3)中的至少一种相关联的T细胞。

在一个实施方案中，本公开包括一种用于在体内使用CAR T细胞耗尽或减少供体和宿主T细胞用于干细胞移植的方法。这可以通过在输注骨髓干细胞移植物之前立即向患者施用CAR T细胞来实现。

本公开提供了一种免疫疗法的方法，其作为用于治疗与T细胞抗原(诸如CD5、CD7和/或CD3)相关联的细胞增殖性疾病的调节或桥接移植策略或独立疗法。

本公开提供了一种用于治疗与T细胞抗原(诸如CD5、CD7和/或CD3)相关联的细胞增殖性疾病的方法。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于治疗与T细胞抗原(诸如CD5、CD7和/或CD3)的表达相关联的非癌症相关疾病的方法。

在一些实施方案中，用于治疗细胞增殖性疾病的具有T细胞抗原识别结构域的CAR与另一种抗癌剂组合。在某些实施方案中，所述抗癌剂选自玻玛西林(abemaciclib)、醋酸阿比特龙(abiraterone acetate)、甲氨蝶呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、阿霉素(adriamycin)、阿卡布鲁替尼(acalabrutinib)、本妥昔单抗维多汀(brentuximabvedotin)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、阿柏西普(aflibercept)、阿法替尼(afatinib)、奈妥吡坦(netupitant)、帕洛诺司琼(palonosetron)、咪喹莫特(imiquimod)、阿地白介素(aldesleukin)、阿来替尼(alectinib)、阿仑单抗(alemtuzumab)、培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)、库潘尼西(copanlisib)、美法仑(melphalan)、布格替尼(brigatinib)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氨磷汀(amifostine)、氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)、阿那曲唑(anastrozole)、阿帕鲁胺(apalutamide)、阿瑞匹坦(aprepitant)、帕米膦酸二钠(pamidronate disodium)、依西美坦(exemestane)、奈拉滨(nelarabine)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、奥法木单抗(ofatumumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、阿利库单抗(avelumab)、西罗来塞-阿卡他近(axicabtagene ciloleucel)、阿昔替尼(axitinib)、阿扎胞苷(azacitidine)、卡莫司汀(carmustine)、贝利司他(belinostat)、苯达莫司汀(bendamustine)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺(bicalutamide)、博莱霉素(bleomycin)、博纳吐单抗(blinatumomab)、硼替佐米(bortezomib)、博舒替尼(bosutinib)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、布格替尼(brigatinib)、白消安(busulfan)、依利替康(irinotecan)、卡培他滨(capecitabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡铂(carboplatin)、卡非佐米(carfilzomib)、色瑞替尼(ceritinib)、柔红霉素(daunorubicin)、西妥昔单抗(cetuximab)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、氯法拉滨(clofarabine)、考比替尼(cobimetinib)、苹果酸卡博替尼(cabozantinib-S-malate)、更生霉素(dactinomycin)、克唑替尼(crizotinib)、异环磷酰胺(ifosfamide)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、阿糖胞苷(cytarabine)、达拉菲尼(dabrafenib)、达卡巴嗪(dacarbazine)、地西他滨(decitabine)、达雷木单抗(daratumumab)、达沙替尼(dasatinib)、去纤苷(defibrotide)、地加瑞克(degarelix)、地尼白介素(denileukindiftitox)、地诺单抗(denosumab)、***(dexamethasone)、右雷佐生(dexrazoxane)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、度伐鲁单抗(durvalumab)、拉布立酶(rasburicase)、盐酸表柔比星(epirubicin)、依洛妥珠单抗(elotuzumab)、奥沙利铂(oxaliplatin)、艾曲波帕乙醇胺(eltrombopag olamine)、依那德尼(enasidenib)、恩扎鲁胺(enzalutamide)、艾日布林(eribulin)、维莫德吉(vismodegib)、厄洛替尼(erlotinib)、依托泊苷(etoposide)、依罗莫司(everolimus)、雷洛昔芬(raloxifene)、托瑞米芬(toremifene)、帕诺司他(panobinostat)、氟维司群(fulvestrant)、来曲唑(letrozole)、非格司亭(filgrastim)、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、普拉曲沙(pralatrexate)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、格非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、奥-吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)、谷卡匹酶(glucarpidase)、戈舍瑞林(goserelin)、心得安(propranolol)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、拓扑替康(topotecan)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、依鲁替尼(ibrutinib)、珀那替尼(ponatinib)、伊达比星(idarubicin)、艾拉利司(idelalisib)、伊马替尼(imatinib)、拉-他利莫近(talimogene laherparepvec)、伊匹单抗(ipilimumab)、罗米地辛(romidepsin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、伊沙佐米(ixazomib)、鲁索替尼(ruxolitinib)、卡巴它赛(cabazitaxel)、帕利夫明(palifermin)、派姆单抗(pembrolizumab)、瑞博西尼(ribociclib)、tisagenlecleucel、兰瑞肽(lanreotide)、拉帕替尼(lapatinib)、奥拉妥单抗(olaratumab)、来那度胺(lenalidomide)、仑伐替尼(lenvatinib)、亚叶酸(leucovorin)、亮丙瑞林(leuprolide)、洛莫司汀(lomustine)、曲氟尿苷(trifluridine)、奥拉帕利(olaparib)、长春新碱(vincristine)、甲基苄肼(procarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、甲地孕酮(megestrol)、曲美替尼(trametinib)、替莫唑胺(temozolomide)、溴甲纳曲酮(methylnaltrexone bromide)、米哚妥林(midostaurin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普乐沙福(plerixafor)、长春瑞滨(vinorelbine)、奈西妥木单抗(necitumumab)、诺拉替尼(neratinib)、索拉非尼(sorafenib)、尼鲁米特(nilutamide)、尼洛替尼(nilotinib)、尼拉帕利(niraparib)、纳武单抗(nivolumab)、他莫昔芬(tamoxifen)、洛米司亭(romiplostim)、索尼地吉(sonidegib)、三尖杉碱(omacetaxine)、培门冬酶(pegaspargase)、昂丹司琼(ondansetron)、奥希替尼(osimertinib)、帕尼单抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、干扰素α-2b(interferon alfa-2b)、珀妥珠单抗(pertuzumab)、泊马度胺(pomalidomide)、巯嘌呤(mercaptopurine)、瑞格拉非尼(regorafenib)、利妥昔单抗(rituximab)、洛拉吡坦(rolapitant)、卢卡帕尼(rucaparib)、司妥昔单抗(siltuximab)、舒尼替尼(sunitinib)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、西罗莫司(temsirolimus)、沙利度胺(thalidomide)、塞替派(thiotepa)、曲贝替定(trabectedin)、伐柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、长春花碱(vinblastine)、维罗非尼(vemurafenib)、伏立诺他(vorinostat)、唑来膦酸(zoledronic acid)或其组合。

在一些实施方案中，用于治疗细胞增殖性疾病的具有T细胞抗原(例如CD5、CD7和/或CD3抗原)识别结构域的CAR与检查点阻断(诸如CTLA-4和PDl/PD-Ll)组合。在某些实施方案中，化疗剂是抗PD-1、抗CTLA4抗体或其组合，诸如抗CTLA4(例如，伊匹单抗、曲美利木单抗(tremelimumab))和抗PD1(例如，纳武单抗、派姆单抗、阿特朱单抗、阿利库单抗、度伐鲁单抗)。在某些实施方案中，在患有淋巴衰竭的环境的受试者中施用所述方法。在某些实施方案中，淋巴细胞清除剂是例如环磷酰胺和氟达拉滨。

在一些实施方案中，具有T细胞抗原(例如CD5、CD7和/或CD3抗原)识别结构域的CAR或与其他辅助疗法组合被用作加深、去除、减少、阻止和/或延长对初始化疗的应答的策略。所有治疗或预防疾病状况的可用辅助疗法均被视为本公开的一部分，并且在本公开的范围内。

在另一个实施方案中，施用具有T细胞抗原(例如CD5、CD7和/或CD3抗原)识别结构域的CAR多肽可用于治疗类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，T细胞抗原(例如CD5、CD7和/或CD3)-CAR可用作骨髓移植疗法(BMT)之后的移植物抗宿主病的预防剂。在另一个实施方案中，T细胞抗原(例如CD5、CD7和/或CD3)-CAR可用于修饰在自身免疫性病症和恶性肿瘤治疗中的表达。

在一些实施方案中，本公开中的具有对CD5具有选择性的嵌合抗原受体的工程改造的细胞，可以充当不再对化疗有应答或残留疾病极少且不符合骨髓移植条件的患者的骨髓移植的桥梁。

在特定的实施方案中，CD5、CD7和/或CD3-CAR a T细胞靶向表达CD5、CD7和/或CD3的细胞。靶细胞可以是但不限于是癌细胞，诸如T细胞淋巴瘤或T细胞白血病，前体急性T细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，CD5、CD7和/或CD3阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤和胸腺上皮肿瘤。

在一个实施方案中，CD5、CD7和/或CD3-CAR可用于治疗非血液病症，其包括但不限于类风湿性关节炎、移植物抗宿主病和自身免疫性疾病。

工程改造的或修饰的T细胞可在IL-2和/或IL-7和IL-15二者的存在下扩增，或使用其他分子进行扩增。

可以在灭活CD5、CD7和/或CD3之前或之后，通过在向患者施用之前体外扩增工程改造的T细胞来实现CAR的引入。

在一些实施方案中，将CD5、CD7和/或CD3靶向的CAR T细胞与免疫调节药物(诸如但不限于CTLA-4和PD-1/PD-L1阻断剂)或细胞因子(诸如IL-2和IL12)或集落刺激因子-1受体(CSF1R)抑制剂(诸如FPA008)共同施用。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种赋予、帮助、增加或增强抗白血病或抗淋巴瘤免疫力的方法。

包括表达CAR的工程改造的细胞作为有效成分的治疗剂可以通过皮内、肌内、皮下、腹膜内、鼻内、动脉内、静脉内施用，或通过肠胃外施用(例如注射或输注)到传入***内，但是施用途径不受限制。

本公开的任何方法还可以包括向个体递送另外的癌症疗法的步骤，所述另外的癌症疗法诸如手术、放射、激素疗法、化疗、免疫疗法或其组合。化疗包括但不限于CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、***)、EPOCH(依托泊苷、长春新碱、多柔比星、环磷酰胺、***)或任何其他多药治疗方案。在一个优选的实施方案中，CD54靶向的CAR细胞用于治疗或预防干细胞移植和/或化疗后的残留疾病。

在另一个实施方案中，本公开的任何方法还可以包括抗病毒疗法、西多福韦(cidofovir)和白介素2、MS患者的阿糖胞苷(也被称为ARA-C)或那他珠单抗(natalizumab)治疗、或牛皮癣患者的依法珠单抗(efalizumab)治疗、或PML患者的其他治疗。在另外的方面，本公开的T细胞可用于与以下组合的治疗方案：诸如但不限于化疗、放射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消融剂(诸如CAMPATH、抗CD3抗体、或其他抗体疗法)、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子、以及辐射。抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)的药物(Liu等,Cell 66:807-815,1991；Henderson等,Immun.73:316-321,1991；Bierer等,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)也可以使用。在另一方面，本公开的细胞组合物与骨髓移植，使用化疗剂(诸如氟达拉滨)、外部波束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)的T细胞消融疗法一起(例如，之前、同时或之后)向患者施用。在一方面，本公开的细胞组合物在B细胞消融疗法(诸如与CD20反应的药剂，例如，瑞图宣(Rituxan))之后施用。例如，在一个实施方案中，受试者可经历使用高剂量化疗、之后进行外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施方案中，在移植之后，受试者接受本公开的扩增的免疫细胞的输注。在另一个实施方案中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。

如本文所用，术语“自身免疫性疾病”定义为由自身免疫应答引起的病症。自身免疫性疾病是对自身抗原的不适当的且过度应答的结果。自身免疫性疾病的实例包括但不限于艾迪森氏病、斑秃(alopecia greata)、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(1型)、营养不良性大疱性表皮松解症、***、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本病、溶血性贫血、***性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常性天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、脉管炎、白癜疯、黏液性水肿、恶性贫血症和溃疡性结肠炎。

参考下面阐述的实施例可以更好地理解本公开。提出以下实施例以便向本领域的普通技术人员提供对如何制造和评价本文要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且意图仅是示例性的而不意图限制本公开。在施用用于治疗、抑制或预防癌症的递送***之后，可以以熟练从业者众所周知的各种方式评估治疗性工程改造的细胞的功效。例如，通过观察到治疗性工程改造的细胞降低癌细胞负荷或防止癌细胞负荷进一步增加，与化学佐剂一起递送的治疗性工程改造的细胞有效治疗或抑制受试者的癌症。癌细胞负荷可以通过本领域已知的方法来测量，例如，使用聚合酶链式反应测定来检测血液中某些癌细胞核酸的存在或鉴定某些癌细胞标志物，例如，使用抗体测定来检测样品(例如但不限于血液)中标志物的存在，或通过测量患者中循环癌细胞抗体水平的水平来测量。

在NK和CRISPR编辑的T细胞系中使用两种结构上不同的抗CD5抗原结合结构域开发靶向T细胞恶性肿瘤的嵌合抗原受体

患有复发性T细胞急性淋巴细胞白血病或淋巴母细胞淋巴瘤(T-ALL/T-LLy)的患者在单独使用化疗治疗时结果不佳，其死亡率大于80％。同种异体造血干细胞移植(HSCT)为这些患者提供了最大的治愈机会。国际血液和骨髓移植研究中心最近的一项研究表明，对于能够在移植前实现完全第二次缓解(CR2)的患者，HSCT的3年总体存活率(OS)为48％。对于T-ALL/LLy首次复发的患者，实现CR2是HSCT之前最重要的步骤，因为移植时的疾病状态仍然是与总体存活率相关联的最重要因素。然而，复发后达到临床缓解仍然是T细胞疾病的最大治疗挑战，并且鉴于复发性疾病的侵略性，大多数患者无法接受移植。因此，为了最大化和改进同种异体HSCT的益处，仍然需要开发更新的策略以诱导这些复发型患者的缓解。

基于CAR的免疫疗法可通过在复发后提供持续缓解来发挥重要作用，从而充当干细胞移植的桥梁。与B细胞恶性肿瘤的CAR疗法不同，由于脱靶毒性引起的持续性B细胞发育不全可以通过定期静脉内免疫球蛋白输注来管理，由T细胞定向CAR疗法引起的持续性T细胞发育不全将导致威胁生命的严重的免疫抑制。因此，在CAR T细胞疗法后允许进行免疫重建的造血干细胞移植(HSCT)是合理的策略。

使用抗CD5-VLR-CAR证明细胞毒性和T细胞活化。一起使用CD5-CAR T细胞与CRISPR-Cas9基因组编辑是预防杀伤的一种方法。CD5阳性CD5-CAR修饰的效应细胞的自活化是由于与自身和邻近的CD5抗原的相互作用而发生的。使用基于scFv和VLR两者的CD5-CAR进行的测试表明，随着每细胞平均转基因拷贝数的减少，这种作用会随着时间的推移而减弱。在不存在恶性细胞的情况下防止效应细胞活化的一种方法是使用经修饰以表达抗CD5 CAR的CD5阴性NK细胞。体外和体内数据表明，经修饰以表达CD5-CAR的NK-92细胞可有效靶向CD5阳性T细胞白血病细胞系。预期任选地与IL-2组合的NK-92细胞、效应细胞()的持久性可包括重复给药或通过转变为原代NK CD5-CAR细胞以增强T细胞白血病小鼠模型中的抗肿瘤功效。

另一种方法是使用基因组编辑从效应细胞中敲除靶抗原。CD5编辑的CD5-CAR修饰的Jurkat T细胞表现出降低的自活化，但与靶细胞一起培养时活性却增加。与单独在培养物中的初始活化水平相比，当与靶T细胞一起培养时，CD5编辑的效应细胞被显著更多地活化。T细胞中CD5-CAR的表达导致CD5的下调。有趣的是，本文报道的数据表明与CD5编辑的CAR修饰的T细胞相比，未编辑的CAR修饰的T细胞具有降低的CD5-CAR蛋白质表达。此数据在Jurkat T细胞和原代T细胞两者中示出。此外，在CD5编辑的效应细胞和靶细胞的培养物中，效应细胞与靶细胞上的CD5相互作用更牢固；而CD5阳性的未编辑的效应T细胞与效应细胞和靶细胞两者上的CD5抗原相互作用，从而降低其效能。总体而言，所述数据表明与CD5阳性效应细胞相比，CD5阴性效应细胞由于其自活化减少和CAR表达增加而具有优势。

CD5编辑的效应细胞对靶细胞CD5表达具有更大的作用。CAR构建体中使用的CD5-VLR是基于亲和力的抗体，与单体形式相比，VLR抗体的多聚形式与人CD5的结合效率更高。scFv来源于鼠H65抗人CD5 IgG抗体。从体外研究不能得出哪种CD5-CAR将最有利的结论，因为两者都证明了实质性的靶细胞缔合和效应细胞活化。然而，体内研究表明VLR-CAR的性能不如scFv-CAR。

作为效应细胞的NK细胞和用CD5-CAR修饰的效应T细胞中的CD5敲除具有克服自活化和杀伤的屏障的潜力，这些都是妨碍将CAR疗法应用于T细胞恶性肿瘤治疗的问题。本公开的一个目的是为复发性患者提供同种异体移植的桥梁。使用CAR修饰的免疫活性细胞的策略也被认为是在这些患者中获得长期缓解的治疗方法。

实施例

CD5定向的CAR的构建

使用示出对CD5抗原具有特异性的VLR蛋白质序列生成CD5-VLR-CAR。CD5-scFv的序列是使用已发表的人源化鼠免疫球蛋白的蛋白质序列生成的。Studnicka等,Human-engineered monoclonal antibodies retain full specific binding activity bypreserving non-CDR complementarity-modulating residues.Protein Eng.1994,7(6):805–14。针对人细胞表达将设计用于表达scFv的cDNA序列进行密码子优化。使用编码甘氨酸和丝氨酸五肽重复序列(G₄S)₃的15bp接头，将VH的C端与VL的N端相连。

与较短的570bp CD5-VLR序列相比，整个CD5-scFv序列总计720bp。将这两种CD5序列克隆到CAR盒中，所述CAR盒是第二代CAR，其由N端IL-2信号肽、之后是CD5-VLR或-scFV抗原结合结构域、CD28的跨膜和胞内结构域以及CD3ζ的细胞内信号传导结构域组成(图1A)。通过自切割2A肽序列(P2A)共表达eGFP和CD5-CAR的双顺反子载体能够用于通过流式分选选择阳性转导的细胞(图1B)。

CD5 VLR CAR质粒序列：N端IL-2信号序列，之后是CD5 VLR(粗体)、CD28(粗体)和CD3ζ

CD5 scFv CAR质粒序列：IL-2信号序列，之后是CD5 scFv(粗体)、CD28(粗体)和CD3ζ

CD5 scFv(CDR为粗体)

CD5-CAR NK细胞介导的细胞毒性

为了证明CAR定向的细胞毒性，使用特征明确的细胞毒性人NK细胞系NK-92，它是一种白介素2(IL-2)依赖性永生化细胞系，保持了其细胞毒性能力。NK-92细胞在其表面上不显示CD5，并且这允许表达CD5-CAR，而不会自活化以及杀伤转导细胞。为了生成表达CD5-scFv-CAR的NK-92细胞，将它们用表达eGFP和CD5-scFv-CAR的双顺反子构建体转导。初始慢病毒载体转导之后，观察到较低的转导效率(<5％)。与表达CD5-VLR-CAR的NK-92细胞一样，使用eGFP作为阳性转导细胞的选择标志物，使用流式分选方生成表达CD5-scFv-CAR的NK-92细胞系。在两轮针对eGFP的流式分选之后，生成了表达CD5-scFv-CAR的NK-92群体，其中eGFP的表达为99％。qPCR分析表明，在分选和扩增的细胞中平均有1.0个转导的基因拷贝/细胞。为了确认流式分选的NK-92细胞系中CD5-CAR的表达，使用CD3ζ抗体进行蛋白质印迹分析。可观察到的48kDa和55kDa的条带分别对应于CD5-VLR-CAR和CD5-scFv-CAR蛋白质(图2A)。

为了评估其细胞毒性潜力，将表达CD5-CAR的NK-92效应(E)细胞与CD5阳性Jurkat和MOLT-4 T细胞白血病靶(T)细胞以不同的E:T比一起培养。CD5阴性的B细胞白血病细胞系697被用作阴性对照。靶细胞用膜染料PKH26预先标记，其可以使用流式细胞仪轻松地与未标记的效应细胞区分开。通过将7-AAD(一种细胞死亡的标志物)摄取到靶细胞中来测量细胞毒性。与天然NK-92细胞相比，即使在最低的E:T比下，表达CD5-CAR的NK-92细胞的细胞毒性也显著增加(图2B和图2C)。在较高的E:T比下，CD5-scFv-CAR组中观察到更大的细胞毒性，然而，在较低的1:1的E:T比下，VLR-CAR与scFv-CAR之间的细胞毒性差异并不显著。当针对CD5阴性的697细胞系测试CD5-CAR NK-92细胞时，未观察到细胞毒性的增加(图2D)。

CD5 CAR定向的T细胞活化

为了分析CD5-CAR对T细胞的作用，用编码eGFP和CD5-CAR的慢病毒载体在1至20的MOI范围下转导CD5阳性的Jurkat T细胞白血病细胞系。为了测量CD5-CAR与邻近细胞上的CD5的接合诱导的T细胞活化，在转导后第4天和第12天通过流式细胞仪测量T细胞活化标志物CD69的表面表达(图3A)。活化的程度与转导载体的量相关，其中活化以剂量依赖性方式增加。与表达CD5-scFv-CAR的Jurkat T细胞相比，在表达CD5-VLR-CAR的Jurkat T细胞中观察到更高的活化，而在eGFP阴性细胞中未观察到活化。

为了确认CD5-CAR转基因整合到Jurkat T细胞基因组中，使用定量PCR测量前病毒载体的拷贝数(VCN)。VCN的增加与载体量的增加和活化的增加相关(图3C)。与在对应MOI下的CD5-scFv-CAR细胞相比，CD5-VLR-CAR Jurkat T细胞具有更高的VCN，这可能是在CD5-VLR-CAR细胞中观察到稍高活化的原因(图3B)。当比较两个CD5-CAR修饰的细胞群之间的活化与VCN的函数关系时，两组中均存在线性相关(CD5-VLR-CAR的R2＝0.91，CD5-scFv-CAR的R2＝0.82)并且与CD5-VLR-CAR细胞相比，CD5-scFv-CAR细胞表现出更高的活化(图3C)。作为测量转导的T细胞中CD5-CAR蛋白表达的一种手段，在转导后第9天对全细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。使用抗CD3ζ抗体检测CD5-CAR蛋白质。观察到大约48kDa和55kDa的蛋白质，其分别对应于CD5-VLR-CAR和CD5-scFv-CAR的预测大小，以及18kDa的条带，其对应于已知在Jurkat T细胞中表达的内源性CD3ζ蛋白质的分子量。CAR表达以载体MOI依赖性方式增加。转导后第12天，在两个表达CD5-CAR的Jurkat T细胞群中再次测量活化和VCN。从第4天至第12天观察到VCN降低，CD69表达也对应降低(图3D)。尽管这种Jurkat T细胞活化和VCN的降低可能部分归因于假转导，但这也可能是由于未修饰的细胞比表达CD5-CAR的细胞具有更快的增殖速率，以及由于与自身和邻近细胞上的CD5抗原相互作用而连续活化转导的细胞群所导致的活化诱导的细胞死亡。

使用CRISPR-Cas9基因组编辑的Jurkat T细胞中的CD5敲除

为了提高抗CD5定向的CAR T细胞的有效性，使用CRISPR-Cas9基因组编辑在Jurkat T细胞中敲除CD5表达。在T细胞中，仅表达全长CD5蛋白。但是，在CD5阳性B细胞中，外显子1的可变剪接产生一个称为外显子1B的替代外显子，其编码截短的胞质CD5蛋白。在剪接位点上游的基因中的早期靶向序列可能会生成无功能的蛋白质产物，并避免可变剪接事件。尽管T细胞天然地不表达外显子1B，但已在T细胞中涉及外显子1A与外显子1B的表达之间的平衡，这可能在编辑1A下游的外显子时发生。在外显子1A的前100bp内以不同的靶向序列生成三个gRNA，

以敲除CD5表达。每个gRNA与来源于酿脓链球菌的Cas9一同在单个质粒上表达。

使用CRISPR技术的基因敲除可以通过Cas9介导的dsDNA或ssDNA断裂来完成。断裂或切口消失后，自然修复机制(诸如非同源末端连接(NHEJ))经常导致缺失和***，从而导致移码而干扰改变序列的转录。当使用酿脓链球菌Cas9时，潜在的靶位点是[5'-20nt-NGG-3']和[5'-CCN-20nt-3']两者，其中N是任何核苷酸。因此，可以靶向DNA的编码链或模板链。

CD5信号肽(CD5翻译的开始)

PAM和CD5靶序列(粗体)

CRISPR指导RNA和TracrRNA序列#2：序列包括U6启动子，之后是CD5靶gRNA(粗体)，以及TracrRNA–靶向与编码链杂交

使用核穿孔，将天然Jurkat T细胞用每种CRISPR-Cas9构建体转染，并确定转染后第五天CD5阴性细胞的百分比。与模拟转染细胞相比，CD5-CRISPR gRNA#2产生了CD5阴性Jurkat T细胞的最大增加，导致了48％的CD5阴性细胞，所述模拟转染细胞是天然15％CD5阴性的克隆。gRNA#1和gRNA#3分别产生38％和24％的CD5阴性细胞(图4A)。使用一种公共网络工具COSMID(具有错配、***和缺失的CRISPR脱靶位点)，可以鉴定人基因组内可能被CRISPR***靶向的位点。使用相同的搜索参数，鉴定出可能由于使用gRNA#1和#2而产生的潜在脱靶位点；预测gRNA#1在三个基因中可能具有脱靶位点，其中一个位点位于CD5基因内(与预期靶位点分开的位置)，而gRNA#2预测仅在CD5基因内可能具有脱靶位点。鉴于更有效的CD5敲除和降低的脱靶结合潜力，在随后的实验中使用了gRNA#2。

流式分选允许从用CD5-CRISPR gRNA#2编辑的混合细胞群中分离并扩增CD5阴性Jurkat T细胞群。仅2.1％的分选细胞表达CD5(图4B)。

CD5编辑的CAR修饰的T细胞具有降低的自活化和增加的CD5-CAR表达

用编码eGFP和CD5-CAR的慢病毒载体转导天然和分选的CD5-CRISPR编辑的JurkatT细胞。另外，将编码eGFP和BCL-VLR-CAR的第三慢病毒载体用作阴性对照。在不存在BCL细胞的情况下，在Jurkat T细胞中表达的BCL-VLR-CAR不会刺激T细胞活化。可能两种CD5-CAR都会将天然Jurkat T细胞活化到比CD5编辑的Jurkat T细胞更大的程度，而BCL-VLR-CAR会刺激所有Jurkat T细胞中较低且相当的T细胞活化水平。eGFP表达用作转导的Jurkat T细胞的标志物以鉴定表达CAR的群体，并以细胞在1、10或20的MOI下进行转导。对于所有三种载体，随着载体滴度的增加，eGFP阳性细胞增加，并且这种增加在两个细胞群中都是相似且一致的(图5A)。随着CD5-CAR的载体量增加，未编辑的Jurkat T细胞上CD5的表达减少(图5B)。这种减少在CD5-scFv-CAR修饰的Jurkat T细胞中最明显。在BCL-VLR-CAR修饰的T细胞中未观察到此效果，表明这些结果是CD5-CAR表达的后果。此外，在所有细胞组中将CD69表达与eGFP表达进行比较。在基于scFv和VLR两者的CAR中，以及在编辑和未编辑的细胞中，eGFP表达与活化之间都存在正相关(图5C)。在表达CD5-VLR-CAR或CD5-scFv-CAR的CD5编辑的细胞中，活化的增加被显著抑制。BCL-VLR-CAR仅刺激了非常低水平的T细胞活化。使用转导后第9天收集的全细胞裂解物进行的蛋白质印迹分析证实，与天然Jurkat T细胞和BCL-CAR修饰的Jurkat T细胞相比，

CD5-CAR修饰的Jurkat T细胞中CD5表达降低。蛋白质印迹分析表明，对于转导和未转导的细胞两者而言，与未编辑的细胞相比，CD5编辑的Jurkat T细胞具有较低的CD5表达。如果CD5水平的降低是由于CD5-CAR与CD5细胞表面蛋白之间的相互作用，那么CD5-CAR水平也可能受到CD5表达的影响。因此，由于与CD5抗原的相互作用减少，具有较低CD5表达水平的细胞将具有增加的CD5-CAR蛋白质表达。为了测试这一结果，使用了由与IgG的Fc部分融合的CD5抗原组成的CD5-Fc融合蛋白运行流式细胞术。将Jurkat T细胞用CD5-Fc蛋白染色，并且然后使用与藻红蛋白(PE)缀合的抗IgG Fc抗体进行第二次染色。CD5-scFv-CAR修饰的CD5编辑的Jurkat T细胞结合CD5-Fc的程度比CD5-scFv-CAR修饰的未编辑Jurkat T细胞更高。此数据在第4天还示出潜在的假转导，然后CD5-Fc结合在第8天下降，并且然后呈现平台期。在转导后早期观察到显著差异，然而在未编辑的细胞中CD5-CAR表达降低并正常化后，差异变得不那么显著。转导后第8天，18.6％的未修饰的Jurkat T细胞与CD5-Fc蛋白和eGFP结合，而35.7％的CD5修饰的Jurkat T细胞与CD5-Fc蛋白和eGFP结合。Jurkat T细胞的实验充当使用原代T细胞的基础。在含有IL-2和IL-7的培养基中扩增原代T细胞，并使用与Jurkat T细胞中使用的相同的CRISPR-Cas9***，在我们的38.6％的原代T细胞中敲除CD5表达。用CD5-scFv-CAR慢病毒载体转导未编辑和CD5编辑的原代T细胞，并在转导后第9天通过流式细胞术测量eGFP和CD5-Fc结合。Jurkat T细胞数据示出与未编辑的细胞相比，与CD5-Fc蛋白质结合的CD5编辑的细胞的百分比增加，其中CD5-Fc结合的CD5编辑的细胞为64.4％，相比CD5-Fc结合的未编辑的细胞为6.1％。

与未编辑的细胞相比，CD5-Fc与编辑的细胞结合的差异可能是由于CD5与未编辑细胞上的CAR结合的空间位阻，从而阻断CD5-Fc结合CAR，这与这些细胞上CAR表达降低相反。为了测试这一结果，使用CD3ζ抗体对Jurkat全细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，以检测内源性CD3ζ(18kDa)和CAR构建体中的CD3ζ(CD5-VLR-CAR、CD5-scFv-CAR和BCL-VLR-CAR构建体中分别为48、55和47kDa)。使用内源性CD3ζ作为参考，与未编辑的Jurkat T细胞相比，CD5编辑的Jurkat T细胞以更高的水平表达两种CD5-CAR(图5D)。此外，在比较具有或不具有CD5编辑的转导细胞时，对BCL-CAR表达没有影响，这表明未编辑的Jurkat T细胞具有下调的CD5-CAR表达。

CD5编辑的效应细胞被靶T细胞有效刺激，这会下调CD5

与天然Jurkat T细胞一起培养CD5-CAR修饰的效应细胞可能会导致i)由于在CAR修饰细胞上表达的CD5与靶细胞上表达的CD5之间的竞争，未编辑的效应CD5表达增加，ii)靶细胞下调CD5表达，以及iii)CD5编辑的效应细胞与未编辑的细胞相比活性增加。在MOI为5下

用编码CD5-scFv-CAR或CD5-VLR-CAR的慢病毒载体转导未编辑和CD5编辑的Jurkat T细胞。转导后第五天的流式细胞术证实了eGFP表达以及未编辑的Jurkat T细胞上CD5表达的降低。将天然Jurkat T细胞用紫色增殖染料(Violet Proliferation Dye 450(VPD450))标记以将靶细胞与效应细胞区分开，并且随后将其与CAR修饰的效应细胞以2:1、1:1和1:5的E:T比一起培养。24小时后，收集细胞并使用流式细胞仪测量效应细胞和靶细胞上的CD5表达，以及效应细胞上的CD69表达。当与靶细胞共培养时，在编辑的和未编辑的转导细胞中，效应细胞中的CD5表达较低，这表明在共培养期间其对效应细胞中CD5表达的影响很小。为了比较靶细胞中的CD5表达，将单独培养的VPD450标记的天然Jurkat T细胞中的CD5表达水平设置为靶细胞中的基线CD5表达。当与CD5-scFv-CAR修饰的效应细胞(图6A)和CD5-VLR-CAR修饰的效应细胞(图6B)一起培养时，靶细胞中的CD5表达下降，其中在与CD5-scFv-CAR修饰的细胞一起培养的靶细胞中观察到更大的下降。在2:1和1:1的E:T比下，与CD5编辑的CD5-scFv-CAR效应细胞(图6A)和CD5编辑的CD5-VLR-CAR效应细胞(图6B)一起培养的组之间的靶细胞CD5表达存在显著差异。另外，与未编辑的效应细胞组和CD5编辑的效应细胞组相比，在所有E:T比下均发现靶细胞CD5表达的显著差异。但是，在低E:T比(靶细胞相对于效应细胞的百分比较高)下，CD5表达的降低不太明显(图6A和图6B，在1:5的E:T比下，在CD5-scFv-CAR-效应细胞和CD5-VLR-CAR效应细胞中分别为p＝0.028和p＝0.045)。这些结果表明，与未编辑的CAR修饰的效应T细胞相比，CD5编辑的CAR修饰的效应T细胞与靶细胞的缔合增加，这导致靶细胞上的CD5表达显著降低。为了确定效应细胞活化中是否存在差异，测量了CD69表达。在所有E:T比下，与它们在和天然靶细胞一起培养之前的活化(图6C和6D)相比，CD5编辑的CD5-scFv-CAR修饰的效应T细胞(图6C)和CD5编辑的CD5-VLR-CAR修饰的效应T细胞(图6D)的活化显著增加。使用非CAR修饰的CD5编辑的效应细胞测量相同参数的对照实验表明单独的细胞没有效果。此数据表明，与未编辑的效应T细胞相比，CD5编辑的效应T细胞与靶细胞的相互作用增加，这导致效应细胞活化增加。

在异种移植T细胞白血病小鼠模型中，CD5-scFv-CAR NK-92细胞在延迟疾病进展方面优于CD5-VLR-CAR NK-92细胞

为了进一步比较两种CD5-CAR结构的细胞毒性潜力，在T细胞白血病异种移植小鼠模型中测试了表达CD5-CAR的NK-92细胞的功效。表达萤光素酶的Jurkat T细胞用于建立白血病模型，其允许使用生物发光成像监测肿瘤负荷。肿瘤注射后第七天开始治疗。每周两次注射NK-92细胞，共4剂，不补充IL-2。每周两次的给药方案是基于我们的实验，所述实验表明在IL-2不存在的情况下未辐射的NK-92细胞，在三天后不会在外周血中持续存在，并且也没有示出植入骨髓的迹象。在第21天，CD5-scFv-CAR NK-92治疗组的肿瘤负荷显著减少。通过Holm-Sidak方法进行的多个比较测试对CD5-scFv-CAR与生理盐水、CD5-scFv-CAR与天然NK-92组显示出显著性，但对CD5-scFv-CAR与CD5-VLR-CAR组则没有显著性。就疾病负荷而言，在第14天和第28天观察到类似的总体趋势，但单因素方差分析无法比较所有组。尽管仅观察到了适度的效果，但由于细胞剂量和NK-92细胞的持久性，与所有其他三个组相比，scFv-CAR治疗组的存活具有显著优势，其中中位存活期为49天，相比在生理盐水、天然NK-92和CD5-VLR-CAR NK-92组中的中位存活期分别为40天、41天和42天。相比之下，CD5-VLR-CAR-NK-92小鼠没有表现出比生理盐水和天然NK-92治疗组显著的存活优势。

编码CAR的慢病毒载体的生成。

使用四质粒***产生了高滴度、重组、自我失活(SIN)HIV慢病毒载体。通过磷酸钙转染将编码CD5-CAR构建体和BCL-VLR-CAR构建体的表达质粒以及含有gag、pol和包膜(VSV-g)基因的包装质粒瞬时转染到HEK-293 T细胞中。将细胞在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中培养。转染后第二十四小时将细胞培养基替换为新鲜培养基。在第48和72小时收集载体上清液，通过0.22mm过滤器过滤并保存在-80℃。最后一次收集后，合并载体上清液，并在4℃下通过10,000x g离心浓缩过夜。然后将沉淀的载体重悬在无血清的StemPro培养基中。使用定量聚合酶链式反应(qPCR)对HEK-293T细胞基因组DNA进行滴定。浓缩的重组病毒载体的滴度约为1x10⁷TU/mL。

细胞系的慢病毒载体转导。

除非另有说明，否则通过将细胞与载体在补充有6mg/mL聚凝胺的适当培养基中一起孵育来进行重组的基于HIV-1的慢病毒载体颗粒的转导。转导后第二十四小时将培养基替换为新鲜培养基。然后将转导的细胞培养至少3天，然后用于下游应用。将Jurkat T细胞在1至20的多重指数(MOI)下进行转导。

原代T细胞的慢病毒载体自旋接种。

通过将细胞与载体在补充有5mg/mL聚凝胺的适当培养基中一起孵育，并且然后在3000RPM下离心2.5小时来进行重组的基于HIV-1的慢病毒载体的转导。自旋接种后第二十四小时将培养基替换为新鲜培养基。然后将转导的细胞培养至少3天，然后用于下游应用。

Jurkat T细胞和原代T细胞的转染。

根据制造商的方案，分别使用Lonza Nucleofector 2b装置

和Amaxa细胞系核转染试剂盒V或人T细胞核转染试剂盒转染Jurkat T细胞和原代T细胞。将细胞用6mg的单质粒CRISPR Cas9***转染，所述***同时编码引导RNA(gRNA)和Cas9。转染后第5天，使用BD LSRII流式细胞仪确认CD5敲除。

使用CAR修饰的效应T细胞和天然靶T细胞进行共培养测定。

通过在MOI 5下与编码eGFP-P2A-CD5-scFv-CAR或eGFP-P2A-CD5-VLR-CAR的高滴度、重组、自灭活(SIN)慢病毒载体一起孵育来转导天然和CD5编辑的Jurkat T细胞。24小时后，用新鲜培养基替换培养基。转导后第5天，使用BD LSRII流式细胞仪的流式细胞术确认eGFP的表达。当天，将转导的细胞与用紫色增殖染料450(VPD450)标记的天然Jurkat T细胞一起以2:1、1:1和1:5的效应子(E)与靶标(T)比一起培养。每个培养的终浓度是5x10⁵细胞/mL。将天然Jurkat T细胞根据制造商的方案进行标记。共培养开始后24小时，使用流式细胞仪分析效应细胞和靶细胞上CD5的变化，以及效应细胞上的CD69表达。

T细胞白血病鼠异种移植模型的生成和使用表达CD5-CAR的NK-92细胞的治疗

NOD/SCID/IL2Rgnull(NSG)小鼠购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)，并保持在无指定病原体的环境中。根据机构动物护理和使用委员会(IACUC)的既定原则对小鼠进行护理，并且所有动物方案均得到IACUC的批准。Douglas Graham博士(Atlanta,GA)善意地向我们提供了表达荧光素酶的Jurkat T细胞白血病细胞系。为了确定使用NK-92细胞的治疗给药方案，向NSG小鼠注射不补充IL-2的未辐射的CD5-scFv-CAR NK-92细胞，并且之后确定NK-92细胞随时间推移的持久性。在注射后第1、3和18天，通过流式细胞术评价小鼠的外周血、骨髓和脾脏中NK-92细胞的证据。根据此实验的结果，建立了不补充IL-2的未辐射的NK-92细胞每周两次的给药方案。然后在第0天向七至九周大的NSG小鼠静脉内注射2x10⁶个表达荧光素酶的Jurkat T细胞以建立疾病。注射前将细胞重悬于100uL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。肿瘤注射后的第7天开始治疗。有四个治疗组：接受PBS(对照)、未修饰的天然NK-92细胞、CD5-VLR-CAR NK-92细胞或CD5-scFv-CAR NK-92细胞的小鼠。对于接受细胞的小鼠，每种治疗均包含10⁷个NK-92细胞，所述细胞重悬于100uL PBS中，通过眼眶后注射静脉内施用。每只小鼠在第7、11、14和18天接受4种治疗。每隔七天对小鼠进行一次体内生物发光成像，以监测肿瘤负荷。经常监测动物，并根据白血病进展的迹象(体重减轻>20％、活动减少和/或后肢麻痹)对动物实施安乐死。

与未编辑的Jurkat T细胞相比，在所有MOI下CD5编辑的T细胞中VLR-CAR和scFv-CAR蛋白质表达均增加

在MOI 5下用抗CD5 scFv CAR转导未编辑和CD5编辑的T细胞系。在转导后第五天，使用流式细胞术测量GFP和CD5-Fc细胞表面表达，其为CAR表达的量度。在类似的转导水平下，如通过GFP表达所测量(图7A示出未编辑的细胞，并且图7B示出编辑的T细胞)的，与未编辑的T细胞(图7C)相比，CD5编辑的T细胞示出了至少增加2倍的CAR表达。另外，从在MOI 1、10和20下用CD5 VLR CAR和CD5 scFv CAR慢病毒载体转导的未编辑的和CD5编辑的T细胞中分离出全细胞裂解物。使用抗CD3ζ抗体通过蛋白质印迹测量CAR蛋白的表达，这证实，与未编辑的T细胞相比，CD5编辑的T细胞中的CAR蛋白质表达更高。检测到内源性CD3ζ为18kDa，而在CD5 VLR CAR和CD5 scFv CAR中，CAR构建体中的CD3ζ分别为48kDa和55kDa(图8A和8B)。关于内源性CD3ζ的条带强度的定量表明，与未编辑的Jurkat T细胞相比，在所有MOI下CD5编辑的T细胞中VLR-CAR和scFv-CAR蛋白质的表达增加(图8C)。

序列表

<110> 爱莫里大学(Emory University)

亚特兰大儿童保健公司(Children's Healthcare of Atlanta, Inc.)

哈罗德.T.斯宾塞(Spencer, Harold T.)

克里斯托弗·德林(Doering, Christopher)

苏尼尔·雷卡尔(Raikar, Sunil)

劳伦·弗莱舍(Fleischer, Lauren)

<120> T细胞抗原靶向的嵌合抗原受体(CAR)以及在细胞疗法中的用途

<130> 17172 PCT

<150> US 62/518,588

<151> 2017-06-12

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 348

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Arg Leu Ser Trp Tyr Asp Pro Asp Phe Gln Ala Arg Leu Thr Arg Ser

1 5 10 15

Asn Ser Lys Cys Gln Gly Gln Leu Glu Val Tyr Leu Lys Asp Gly Trp

20 25 30

His Met Val Cys Ser Gln Ser Trp Gly Arg Ser Ser Lys Gln Trp Glu

35 40 45

Asp Pro Ser Gln Ala Ser Lys Val Cys Gln Arg Leu Asn Cys Gly Val

50 55 60

Pro Leu Ser Leu Gly Pro Phe Leu Val Thr Tyr Thr Pro Gln Ser Ser

65 70 75 80

Ile Ile Cys Tyr Gly Gln Leu Gly Ser Phe Ser Asn Cys Ser His Ser

85 90 95

Arg Asn Asp Met Cys His Ser Leu Gly Leu Thr Cys Leu Glu Pro Gln

100 105 110

Lys Thr Thr Pro Pro Thr Thr Arg Pro Pro Pro Thr Thr Thr Pro Glu

115 120 125

Pro Thr Ala Pro Pro Arg Leu Gln Leu Val Ala Gln Ser Gly Gly Gln

130 135 140

His Cys Ala Gly Val Val Glu Phe Tyr Ser Gly Ser Leu Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ile Ser Tyr Glu Ala Gln Asp Lys Thr Gln Asp Leu Glu Asn Phe Leu

165 170 175

Cys Asn Asn Leu Gln Cys Gly Ser Phe Leu Lys His Leu Pro Glu Thr

180 185 190

Glu Ala Gly Arg Ala Gln Asp Pro Gly Glu Pro Arg Glu His Gln Pro

195 200 205

Leu Pro Ile Gln Trp Lys Ile Gln Asn Ser Ser Cys Thr Ser Leu Glu

210 215 220

His Cys Phe Arg Lys Ile Lys Pro Gln Lys Ser Gly Arg Val Leu Ala

225 230 235 240

Leu Leu Cys Ser Gly Phe Gln Pro Lys Val Gln Ser Arg Leu Val Gly

245 250 255

Gly Ser Ser Ile Cys Glu Gly Thr Val Glu Val Arg Gln Gly Ala Gln

260 265 270

Trp Ala Ala Leu Cys Asp Ser Ser Ser Ala Arg Ser Ser Leu Arg Trp

275 280 285

Glu Glu Val Cys Arg Glu Gln Gln Cys Gly Ser Val Asn Ser Tyr Arg

290 295 300

Val Leu Asp Ala Gly Asp Pro Thr Ser Arg Gly Leu Phe Cys Pro His

305 310 315 320

Gln Lys Leu Ser Gln Cys His Glu Leu Trp Glu Arg Asn Ser Tyr Cys

325 330 335

Lys Lys Val Phe Val Thr Cys Gln Asp Pro Asn Pro

340 345

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

cctgctgggg atgctgggtg agt 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

ccggtggggg gtgggggggg a 21

<210> 4

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n为a、c、g或t

<400> 4

ngg 3

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

agcggttgca gagaccccat 20

<210> 6

<211> 1298

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

atgtacagga tgcaactccg tcttgcattg cactaagtct tgcacttgtc acgaattcgg 60

gcgcgccttg tccttcacag tgctcctgca gcggaaccga ggtccattgt cagagaaaat 120

ccctggcttc agtccctgcc ggaatcccaa ccacaacaag ggtgctgtac ctgcacgtca 180

acgagattac taagttcgaa ccaggagtgt ttgaccgcct ggtcaacctg cagcagctgt 240

atctgggagg aaatcagctg agcgccctgc cagacggcgt gttcgatcga ctgactcagc 300

tgaccagact ggatctgtac aacaatcagc tgaccgtgct gcctgccggg gtctttgacc 360

gactggtgaa tctgcagaca ctggatctgc acaacaatca gctgaagtct atccccagag 420

gcgcattcga caacctgaaa agtctgaccc atatttggct gtttgggaat ccttgggact 480

gcgcctgtag cgatatcctg tatctgtccg gatggctggg acagcatgca gggaaagagc 540

agggacaggc tgtctgctct ggcaccaaca cacccgtgcg ggctgtcacc gaggcatcaa 600

catccccatc aaagtgtcct ggctacgtgg caacaaccag atctgctagc gagcagaagc 660

tgatcagcga ggaggacctg gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag 720

ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg 780

tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt 840

tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactccca 900

ggaggcctgg gccaacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag 960

cctatcgctc cagcaggagc gcagacgctc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct 1020

ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc 1080

gggaccctga gatgggaggc aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg 1140

aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc 1200

ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct 1260

acgacgccct tcacatgcag gccctgcctc ctcgctga 1298

<210> 7

<211> 1439

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

ggcgcgcctg aaattcagtt ggtgcaaagc ggaggtggcc ttgtgaagcc aggaggcagt 120

gtgcgaatta gttgtgcagc ctccggttac acgttcacca actatggcat gaactgggtg 180

agacaggccc ccggcaaggg gttggaatgg atgggctgga ttaacacaca tacgggcgaa 240

ccgacatacg ccgacagctt taaaggtcga tttactttta gcttggacga ttccaaaaat 300

acggcatacc tgcaaataaa ctcactgcgg gcagaggata cggccgtata tttttgtacg 360

cggagagggt acgattggta ctttgatgtc tggggacagg ggacgacagt aaccgtgtct 420

agtggcgggg gaggatcagg tggtggcggt agcggtggag gtggaagtga tatccagatg 480

acacaatcac cgagttccct gtccgcgtca gtaggggatc gggtgacaat tacatgtaga 540

gcatctcaag acatcaatag ctacctgagc tggtttcagc aaaagcccgg aaaagctccg 600

aaaactctga tttatcgggc caatcgcctt gagtctgggg tgccaagtag attttcaggc 660

tccgggagcg ggacggacta tacgttgacc atatcaagtc ttcagtacga ggacttcggg 720

atatactatt gccaacagta cgatgagagc ccgtggacct tcgggggtgg gacaaagttg 780

gagatcaaag ctagcgagca gaagctgatc agcgaggagg acctggacaa tgagaagagc 840

aatggaacca ttatccatgt gaaagggaaa cacctttgtc caagtcccct atttcccgga 900

ccttctaagc ccttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg 960

ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac 1020

agtgactaca tgaacatgac tcccaggagg cctgggccaa cccgcaagca ttaccagccc 1080

tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctcagcag gagcgcagac gctcccgcgt 1140

accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg 1200

atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg aggcaagccg agaaggaaga 1260

accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg 1320

agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc 1380

tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg cctcctcgc 1439

<210> 8

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr His Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ser Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Gly Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

145 150 155 160

Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Gln Tyr Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

210 215 220

Asp Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

<210> 9

<211> 401

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 9

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgtaaggtc gggcaggaag agggcctatt 60

tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattagaat 120

taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt 180

tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt 240

aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaaacaccga 300

gcggttgcag agaccccatg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 360

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt t 401

<210> 10

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

accatgccca tggggtctct gcaaccgctg gccaccttgt acctgctggg gatgctggtc 60

gcttcctgcc tcggacggct 80

Claims (20)

1.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：

从受试者中分离T细胞；

修饰所述分离的T细胞，使得T细胞抗原的表达降低；

将载体***所述T细胞中，其中在使得所述T细胞表达抗原识别结构域从而提供转导的T细胞的条件下，所述载体编码并表达包含所述T细胞抗原识别结构域的嵌合抗原受体，其中，与其中所述T细胞抗原的表达未改变或降低的T细胞相比，所述T细胞抗原的表达降低导致所述T细胞上包含所述T细胞抗原识别结构域的嵌合抗原受体的表达增加；以及

向所述受试者施用有效量的转导的T细胞，其任选地与IL-2组合施用于所述受试者。

2.如权利要求1的方法，其中所述T细胞抗原是CD5、CD7或CD3。

3.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：

从受试者中分离T细胞；

修饰所述分离的T细胞，使得CD5的表达降低；

将载体***所述T细胞，其中在使得所述T细胞表达CD5抗原识别结构域从而提供转导的T细胞的条件下，所述载体编码并表达包含所述CD5抗原识别结构域的嵌合抗原受体；以及

向所述受试者施用有效量的转导的T细胞，其任选地与IL-2组合施用于所述受试者。

4.如权利要求3所述的方法，其中，与其中所述CD5的表达未改变或降低的T细胞相比，CD5的表达降低导致所述T细胞上包含CD5抗原识别结构域的嵌合抗原受体的表达增加。

5.如权利要求3所述的方法，其中修饰所述分离的T细胞使得CD5的表达降低包括将载体***所述T细胞中，其中所述载体编码并表达Cas核酸酶和指导RNA，所述指导RNA靶向用于切割、切开或阻断所述CD5基因或CD5 mRNA的表达的序列。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述指导RNA包含AGCGGTTGCAGAGACCCCAT(SEQ IDNO:5)。

7.如权利要求3所述的方法，其中修饰所述分离的T细胞使得CD5的表达降低包括将mRNA***所述T细胞中，其中所述mRNA编码Cas核酸酶和指导RNA，所述指导RNA靶向用于切割或切开CD5基因或CD5 mRNA的序列。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述指导RNA包含AGCGGTTGCAGAGACCCCAT(SEQ IDNO:5)。

9.如权利要求3所述的方法，其中修饰所述分离的T细胞使得CD5的表达降低包括将载体或mRNA***所述T细胞中，其中所述载体或mRNA编码并表达能够减少CD5 mRNA表达的短发夹RNA。

10.如权利要求3所述的方法，其中修饰所述分离的T细胞使得CD5的表达降低包括将双链RNA寡核苷酸***所述T细胞中，其中所述RNA能够通过RNA干扰(RNAi)降低CD5 mRNA表达。

11.如权利要求3所述的方法，其中所述T细胞从所述受试者的自体外周血淋巴细胞(PBL)获得。

12.如权利要求3所述的方法，其中在向所述受试者施用淋巴细胞去除方案之后，向所述受试者施用有效量的转导的T细胞。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述淋巴细胞去除方案是非清髓性的。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述淋巴细胞去除方案包括施用环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。

15.如权利要求3所述的方法，其中所述CD5抗原识别结构域包含EIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(SEQ IDNO:8)。

16.一种多肽，其包含EIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:8)。

17.一种核酸，其编码如权利要求16所述的多肽。

18.一种载体，其包含与启动子可操作地组合的如权利要求17所述的核酸。

19.一种融合蛋白，其编码如权利要求16所述的多肽。

20.如权利要求19所述的融合蛋白，其包含跨膜结构域、至少一个共刺激结构域和信号传导结构域。

Images