KR20220002149A

KR20220002149A - 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220002149A
Application number: KR1020210085248A
Authority: KR
Inventors: 심재석; 심동준; 심동훈; 심서연; 장선일; 강현주; 신재영; 조병옥; 체 데니스창
Original assignee: 임실생약영농조합법인
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2022-01-06

Abstract

본 발명은 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 간세포 모델에서 엉겅퀴 추출물, 개똥쑥 추출물 및 울금 추출물 단독에 비해 본 발명의 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 처리군에서 중성지방 및 과산화물(MDA) 함량이 유의미하게 더 감소였을 뿐만 아니라, 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물의 투여에 따른 동물 모델의 체중변화, 간 지방조직의 무게 변화 및 지질생화학적 지표들의 변화가 유의하게 나타났으므로, 본 발명의 조성물은 비알코올성 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 건강기능식품 또는 의약품 소재 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, improving or treating non-alcoholic fatty liver disease comprising mixed extract of Cirsium japonicum, Artemisia annua and Curcuma longa as effective component}

본 발명은 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

지방간은 간세포 속에 지방이 축적된 상태를 말하며, 정상 간은 지방이 차지하는 비율은 5% 정도인데, 이보다 많은 지방이 축적된 상태를 지방간이라고 한다. 지방간이 악화되어 간세포 속의 지방 덩어리가 커지면 핵을 포함한 세포의 중요한 구성성분이 한쪽으로 밀려 간세포의 기능이 저하되며, 세포 내에 축적된 지방으로 인하여 팽창된 간세포들이 간세포 사이에 있는 미세 혈관과 임파선을 압박하여 간 내의 혈액과 임파액의 순환에 장애가 생기게 된다. 이렇게 되면 간세포는 산소와 영양공급을 적절히 받을 수 없어 간기능이 저하된다.

지방간은 알코올성 지방간과 비알코올성 지방간으로 나눌 수 있다. 알코올성 지방간은 술이 원인이다. 술을 많이 마실수록 잘 발생하며, 지속적으로 술을 섭취하면 간에서 알코올을 대사하는 능력이 떨어져 지방간 발생이 더 심해진다. 또 영양상태가 나쁜 경우에도 잘 발생한다. 알코올성 지방간 중 일부는 알코올성 간염과 간경변으로 진행되어 사망할 수 있다.

비알코올성 지방간은 술 또는 바이러스 감염과 상관없이 간 내 지방축적이 증가한 경우로(간세포의 5% 초과), 간에서 지방 합성 증가 및 배출의 문제로 발생한다. 유리지방산(fatty acid)의 투입(input)과 배출(output)의 불균형에 의해 유발되는 비알코올성 지방간 환자의 약 59%는 외부로부터 유리지방산의 흡수 증가에 의해 발생하고, 약 26% 환자는 간 내 지방 생합성의 증가에 따른 유리지방산의 투입(input) 증가를 원인으로 유발되는 것으로 알려져 있다.

지방간은 병의 원인과 심각성이 밝혀졌고, 식이 조절과 운동을 통하여 증상을 개선해야 하지만, 지방간 환자가 이를 실천하지 못하는 경우가 많다. 따라서 효과적인 지방간 치료 약물의 개발 필요성이 요구되고 있다.

한편, 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense)는 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 초본으로 한방에서 지상부 또는 지하부(뿌리)를 대계라하여 약용으로 활용해왔다. 꽃, 잎, 줄기, 씨 등 지상부는 개화시기에서 씨가 여무는 5~6월에 채취하고, 뿌리는 가을에 채취하여 건조시킨 후 열수 또는 알코올 추출하여 토혈, 혈뇨, 대하, 간염, 고혈압 등 치료에 활용해 왔다.

울금(Curcuma longa L.)은 생강과에 속하는 다년생 초목으로서 원산지는 인도, 중국, 일본 등이고, 고온다습한 남부 아시아, 아프리카 및 중남미에서 자생하고 있으며 동인도 지방에서 재배가 시작되었다고 알려져 있다. 울금은 한약재, 향신료 및 식용으로, 열대지방의 남아시아와 동남아시아에서 오랜 기간 동안 사용되어 왔는데, 울금의 가루나 추출액은 "본초강목"과 "동의보감" 등의 고서나 기타 동물 실험에서 이담 작용, 위액 분비 촉진 작용, 이뇨 작용, 해독 기능, 항암 작용, 항염 작용, 항산화 작용 등이 알려져 있다.

개똥쑥(Artemisia annua)은 주로 중국에서 자생하나 국내 여러 지역에서 재배하는 국화과의 한해살이 풀이다. 개똥쑥은 전통적으로 발열, 감기, 학질, 소아경기, 소화불량, 이질 등의 치료에 사용해 왔고 항말라리아제인 아르테미시닌의 원료 식물로서 알려져 있다.

한편, 한국공개특허 제2020-0014567호에는 '엉겅퀴를 함유하는 간질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1539289호에는 '개똥쑥 추출물을 함유하는 지방간 또는 비만의 예방 또는 치료용 조성물'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하며, 간세포 모델에서 엉겅퀴 추출물, 개똥쑥 추출물 및 울금 추출물 단독에 비해 본 발명의 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 처리군에서 중성지방 및 과산화물(MDA) 함량이 유의미하게 더 감소였고, 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물의 투여에 따른 동물 모델의 체중변화, 간 지방조직의 무게 변화 및 지질생화학적 지표들이 유의미하게 변화한다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 간세포 모델에서 엉겅퀴 추출물, 개똥쑥 추출물 및 울금 추출물 단독에 비해 본 발명의 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 처리군에서 중성지방 및 과산화물(MDA) 함량이 유의미하게 더 감소였을 뿐만 아니라, 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물의 투여에 따른 동물 모델의 체중변화, 간 지방조직의 무게 변화 및 지질생화학적 지표들의 변화가 유의하게 나타났으므로, 본 발명의 조성물은 비알코올성 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 건강기능식품 또는 의약품 소재 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 3T3-L1 세포(A) 및 HepG2 세포(B)에서 엉겅퀴 추출물, 개똥쑥 추출물 및 울금 추출물의 세포독성을 확인한 것이다.
도 2는 엉겅퀴 추출물, 개똥쑥 추출물, 울금 추출물 및 본 발명의 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 처리한 HepG2 세포 내 지방구 염색이다. 혼합 추출물 1은 엉겅퀴:개똥쑥:울금=60:35:5의 중량비로 혼합한 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물이고, 혼합 추출물 2는 엉겅퀴:개똥쑥:울금=70:25:5의 중량비로 혼합한 것이며, 혼합 추출물 3은 엉겅퀴:개똥쑥:울금=80:15:5의 중량비로 혼합한 것이다.
도 3은 엉겅퀴 추출물, 개똥쑥 추출물, 울금 추출물 및 본 발명의 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 처리한 HepG2 세포 내 축적된 중성지방 함량을 확인한 것이다. Normal은 정상군이며, Control은 지방산으로 비알콜성 지방간을 유도한 대조군이다. CAC는 지방산으로 비알콜성 지방간을 유도한 세포에 본 발명의 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 처리한 실험군이고, 엉겅퀴, 울금 및 개똥쑥은 비교예로서, 각각 단독 추출물을 처리한 것이다. a~f는 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, p<0.05이다.
도 4는 엉겅퀴 추출물, 개똥쑥 추출물, 울금 추출물 및 본 발명의 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 처리한 HepG2 세포 내 축적된 지질과산화물(MDA) 함량을 확인한 것이다. Normal은 정상군이며, Control은 지방산으로 비알콜성 지방간을 유도한 대조군이다. CAC는 지방산으로 비알콜성 지방간을 유도한 세포에 본 발명의 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 처리한 실험군이고, 엉겅퀴, 울금 및 개똥쑥은 비교예로서, 각각 단독 추출물을 처리한 것이다. a~d는 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, p<0.05이다.
도 5는 본 발명의 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 처리한 HepG2 세포 내 AST(A) 및 ALT(B)의 함량을 확인한 것이다. Normal은 정상군이며, Control은 지방산으로 비알콜성 지방간을 유도한 대조군이다. CAC는 지방산으로 비알콜성 지방간을 유도한 세포에 본 발명의 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 처리한 실험군이고 MT는 양성대조군으로 밀크씨슬이다. a~d는 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, p<0.05이다.
도 6은 고지방 식이한 동물 모델에 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여에 따른 혈액 내 중성지방(TG)(A), GOT(B) 및 GPT(C) 함량을 확인한 결과이다. a~c는 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, p<0.05이다.
도 7은 고지방 식이한 동물 모델에 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여한 후, 간조직(A) 및 지방조직(B)에서의 중성지방(TG) 함량 변화를 확인한 것이다.
도 8은 고지방 식이한 동물 모델에 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여한 후, 간조직에서 중성지방(A) 및 산화손상(B, C) 변화를 확인한 것이다. a~c는 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, p<0.05이다.
도 9는 고지방 식이 동물모델에 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여한 후, 지방간염 관련 염증인자(COX-2(A), iNOS(B) 및 TNF-α(C))의 발현량 변화를 확인한 것이다. a~d는 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, p<0.05이다.
도 10은 고지방 식이 동물모델에 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여한 후, 간조직에서 고지방식이에 의해 증가된 PPAR-r의 발현량(A) 및 감소된 CEBPA의 발현량(B) 변화를 확인한 것이다. a~d는 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, p<0.05이다.
도 11은 고지방 식이 동물모델에 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여한 후, 간조직에서 고지방식이에 의해 증가된 사이토카인 IL-17 발현량 변화를 확인한 것이다. a~c는 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, p<0.05이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 혼합 추출물은 울금 뿌리 1중량부에 대하여, 개똥쑥 잎 2~10 중량부 및 엉컹퀴 잎 10~20 중량부로 혼합하는 것이 바람직하며, 더욱더 바람직하게는 울금 뿌리 1중량부에 대하여, 개똥쑥 잎 2~4 중량부 및 엉컹퀴 잎 15~17 중량부로 혼합하는 것이고, 가장 바람직하게는 울금 뿌리 1중량부에 대하여, 개똥쑥 잎 3 중량부 및 엉컹퀴 잎 16 중량부로 혼합하는 것이지만 이에 한정하는 것은 아니다.

또한, 혼합 추출물은 물, C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 이용하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽, 발포정 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 비알코올성 지방간 질환은 단순 지방간, 영양성 지방간, 기아성 지방간, 비만성 지방간, 당뇨성 지방간, 지방간염, 간섬유화 및 간경화로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물의 제조

(1) 열수 추출

건조한 엉겅퀴 잎 80g, 개똥쑥 잎 15g 및 울금 뿌리 5g을 혼합한 후, 증류수 1.5ℓ에 첨가하였다. 이후 105℃에서 8시간 동안 추출하고 여과(와트만 종이 No. 2) 및 동결건조하여 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 물 추출물을 제조하였다. 비교예로, 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리 각각 100g을 사용한 것을 제외하고 상기와 동일한 방법으로 엉겅퀴 물 추출물, 개똥쑥 물 추출물 및 울금 물 추출물을 제조하였다.

(2) 30%(v/v) 에탄올 추출

건조한 엉겅퀴 잎 80g, 개똥쑥 잎 15g 및 울금 뿌리 5g을 혼합한 후, 30%(v/v) 에탄올 1.5ℓ에 첨가하였다. 이후 78℃에서 8시간 동안 추출하고 여과(와트만 종이 No. 2)하여 회전진공농축기로 농축한 후 동결건조하여 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 에탄올 추출물을 제조하였다. 비교예로, 엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리 각각 100g을 사용한 것을 제외하고 상기와 동일한 방법으로 엉겅퀴 에탄올 추출물, 개똥쑥 에탄올 추출물 및 울금 에탄올 추출물을 제조하였다.

이하 실시예 2~6에서는 상기 열수 추출물을 이용하여 그 효능을 평가하였다.

실시예 2. 세포 생존율 분석

3T3-L1 세포 및 HepG2 세포 각각에서 엉겅퀴 추출물, 울금 추출물 및 개똥쑥 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여, 96웰 플레이트에 5×10⁴세포/㎖로 100㎕씩 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 각 추출물을 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 세포생존율은 Ez-Cytox 증진된 세포 생존율 어세이 키트(DoGenbio Seoul, Korea)를 사용하였으며, 웰당 EZ-Cytox 시약 10㎕를 넣고 3시간 동안 배양한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포생존율은 대조군에 대한 생존율로 나타내었다.

그 결과, 3T3-L1 지방세포에 대한 엉겅퀴 추출물, 개똥쑥 추출물 및 울금 추출물의 세포독성은 없는 것으로 나타났으며, HepG2 세포에 대한 엉겅퀴 추출물 및 개똥쑥 추출물의 세포 독성은 없는 것으로 나타났고, 울금은 고농도인 500㎍/㎖에서 세포 생존율이 15% 정도 약간 감소하는 것으로 나타났다.

실시예 3. 간세포(HepG2) 내 중성지방 축적 억제 효과 확인

HepG2 세포 내 지방축적을 유도하기 위하여 60mm 세포 배양 디쉬에 2×10⁵세포/㎖로 세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 후 지방산(2:1의 올레산(oleic acid) 및 팔미트산(palmitic acid), 최종농도=0.3 mM)을 첨가한 DMEM 배지로 교환하여 비알콜성 지방간 세포모델을 유도하였다. 지방산을 첨가한 배지교환과 동시에 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물(100㎍/㎖); 엉겅퀴 추출물(100㎍/㎖); 울금 추출물(100㎍/㎖); 개똥쑥 추출물(100㎍/㎖); 및 양성대조군으로 밀크씨슬(100㎍/㎖);을 각각 처리하고 1일 간격으로 2일 동안 배양하였다.

(1) 간세포 내 오일 레드 오(Oil red O) 지방구 염색

비알콜성 지방간 세포모델에서 간세포 내 축적된 중성지방을 확인하기 위해서 오일 레드 오 염색을 실시하였다. 배양이 끝난 HepG2 세포를 PBS로 2회 세척한 후 10% 포르말린을 2㎖씩 넣어 실온에서 1시간 동안 고정하였다. 포르말린을 제거하고 증류수로 2회 세척한 후 60% 이소프로판올 2㎖을 넣어 5분 동안 방치한 뒤 제거하였다. 오일 레드 오 용액 및 증류수를 3:2의 비율로 혼합한 후, 10분 동안 방치하였고 사용하기 직전에 여과하여 2㎖씩 넣고 20분 동안 염색하였다. 이후, 증류수로 3~4회 세척 후, 현미경으로 40배 또는 100배로 관찰하였다.

그 결과, HepG2세포에 유리지방산을 처리하여 간세포에 중성지방 축적을 유도하였으며 Control군에서는 Normal군에 비해 지방구가 빽빽하게 축적된 것을 확인하였다. 반면 엉겅퀴 추출물과 개똥쑥 추출물을 처리하였을 때 간세포 내 중성지방이 현저히 감소한 것을 확인하였고, 특히 엉겅퀴 추출물의 효과가 가장 우수한 것을 확인하였다. 양성대조군으로 사용한 밀크씨슬은 Control군에 비해 감소되었으나 엉겅퀴 추출물 또는 개똥쑥 추출물 처리군 보다 효과가 미비한 것을 확인하였다.

한편, 본 발명의 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물을 다양한 비율로 혼합하여 제조한 혼합 추출물에 대한 간세포 내 중성지방 축적 억제 효능을 평가한 결과 도 2에 개시한 바와 같이 혼합 추출물 1(엉겅퀴:개똥쑥:울금=60:35:5의 중량비로 혼합) 또는 혼합 추출물 2(엉겅퀴:개똥쑥:울금=70:25:5의 중량비로 혼합)보다 혼합 추출물 3(엉겅퀴:개똥쑥:울금=80:15:5의 중량비로 혼합)의 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.

(2) 간세포 내 중성지방 함량 변화 확인

비알콜성 지방간 세포 모델에서 간세포 내 축적된 중성지방 함량을 측정하기 위해서 중성지방 비색 어세이 키트(Cayman chemical, E.Ellsworth Rd·Ann Arbor, MI, USA)를 사용하였다. 배양이 끝난 비알콜성 지방간 유도 HepG2 세포를 PBS로 2회 세척한 후 PBS 2㎖을 주입하여 세포를 떨어뜨린 후 원심분리(2,000×4℃, 10분)하였다. 상등액을 제거하고 재 부유시켜 초음파 처리하였고 제조사의 표준액을 이용하여 표준곡선을 작성하여 시험군의 중성지방 함량을 산출하였다.

그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이, 정상군(Normal) 대비 비알콜성 지방간을 유도한 대조군(Control)의 중성지방 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였으며, 이에 대비하여, 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물; 엉겅퀴 추출물; 울금 추출물; 개똥쑥 추출물을 처리한 군의 중성지방 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였고, 특히, 본 발명의 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물이 각각의 엉겅퀴, 울금, 개똥쑥 추출물 단독에 비해 중성지방 함량이 더 감소하였다.

실시예 4. 비알콜성 지방간 세포모델에서 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물의 지질과산화물(MDA) 측정

HepG2 세포에서 지질과산화물을 측정하였으며 TBARS 어세이 키트(Cayman, chemical, E.Ellsworth Rd·Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다. 배양이 끝난 비알콜성 지방간 유도 HepG2 세포를 PBS로 2회 세척한 후 PBS 1mL을 주입하여 세포를 떨어뜨린 뒤 균질화하여 분석에 이용하였다.

그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이, 정상군(Normal) 대비 비알콜성 지방간을 유도한 대조군(Control)의 MDA 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였으며, 이에 대비하여, 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물; 엉겅퀴 추출물; 울금 추출물; 개똥쑥 추출물을 처리한 군의 MDA 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였고, 특히, 본 발명의 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물이 각각의 엉겅퀴, 울금, 개똥쑥 추출물 단독에 비해 MDA 함량이 더 감소하였다.

실시예 5. 비알콜성 지방간 세포모델에서 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물의 아미노전이효소 활성 측정

HepG2 세포에서 아미노전이효소 활성을 측정하였으며 AST(Aspartate aminotransferase) 활성 어세이 키트(Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)와 ALT(Alanine aminotransferase) 활성 어세이 키트(Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하였다. 배양이 끝난 비알콜성 지방간 유도 HepG2 세포를 PBS로 2회 세척한 후 PBS 2mL을 주입하여 세포를 떨어뜨린 뒤 원심분리(2,000×4℃, 10분)하였다. 상등액을 제거하고 AST(또는 ALT)어세이 버퍼를 첨가하여 균질화한 다음 원심분리(15,000×4℃, 10분)한 후, 아미노전이효소 활성을 측정하였다.

그 결과, 지방산 첨가로 인해 Control군에서 간세포 내 AST와 ALT 수치가 유의적으로 증가하였으며 지방산 첨가와 동시에 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물을 처리하였을 때 AST와 ALT 수치가 감소한 것을 확인하였다. 양성대조군인 밀크씨슬 처리군보다 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물 처리군에서 현저히 감소한 것으로 나타났다(도 5).

실시예 6. in vivo 유용성 평가

[동물 모델의 사육 및 식이]

실험 동물은 4주령의 C57BL/6 수컷 마우스(18~20 g)를 오리엔트바이오에서 구입했으며, 1주일 동안 사육실 환경에 적응시켰다. 사육장의 온도는 18~24℃, 상대습도는 50~60%로 유지하였으며, 명암은 12시간 주기 (09:00~21:00)로 조절하였다.

실험디자인은 난괴법에 따라 군당 6마리씩 아래와 같은 군으로 설정하였다.

(1) 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물(CAC)의 투여에 따른 체중, 간 조직의 무게, 부고환 주변 지방의 무게 및 지방 크기 관찰

- 정상 사료 투여군(정상군 ND)

- 고지방 사료 투여군(대조군 HFD)

- 고지방 사료 및 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물 투여군(CAC 100mg/kg, 200mg/kg)

- 고지방 사료 및 밀크시슬 추출물투여군(MT 100mg/kg)

엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물은 하루에 한 번씩 경구투여하였다. 일반 사료는 D12450B(10% kcal fat), 고지방 사료는 D12492 (60 % kcal fat) 사료를 중앙실험동물(주)에서 구입하여 사용하였다. 고지방 사료는 4℃에 냉장 보관하면서 급여하였고, 음수와 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 체중은 일주일 간격으로 측정하였다. 본 발명은 전주대학교 동물실험윤리위원회의 규정에 맞추어서 진행하였다.

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 고지방 식이에 의해 마우스의 체중이 증가하는 것을 확인하였고, 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금 혼합 추출물 투여에 의해 체중의 증가량이 고지방식이군에 비해 약 6.7% 감소하였다.

또한, 실험이 종료되는 마지막 12주에 12시간 동안 절식시키고, 간 조직을 적출하여 정밀전자저울로 전체 무게를 측정하였으며, 부고환 주변 지방 조직을 적출하여 정밀전자저울로 무게를 측정하였다.

식염수로 세척한 후 물기를 제거한 후, 4%(v/v) 파라포름알데히드(paraformaldehyde, pH 7.4)로 고정하고 일련의 과정을 통하여 파라핀 블록을 제작하였다. 상기 파라핀 블록 조직은 5㎛ 두께로 절단하였으며, 절단된 조직 절편은 탈파라핀(deparaffin)과 함수 과정을 거친 후 H&E로 염색하여 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 지방의 크기를 확인하였다. 그 결과, 간 조직 및 부고환 지방 조직의 무게 또한 추출물 투여에 의해 감소하는 것을 확인하였다(표 1).

	정상군	고지방식이군	CAC 100㎎/㎏	CAC 200㎎/㎏	MT 100㎎/㎏
초기 체중(g)	23.98±1.83^a	23.74±0.78^a	23.88±1.05^a	23.60±0.50^a	23.03±1.24^a
최종 체중(g)	34.60±1.77^c	48.99±1.83^a	47.54±2.45^ab	47.14±1.29^ab	46.30±1.02^b
체중 증가량(g)	10.63±1.80^c	25.25±2.58^a	23.66±3.03^b	23.54±1.92^b	23.27±1.24^b
간 무게(g)	1.14±0.14^c	2.12±0.34^a	1.74±0.22^b	1.93±0.09^ab	1.78±0.35^a
부고환 주위지방 무게(g)	1.39±0.26^c	2.33±0.62^a	1.77±0.24^ab	1.65±0.26^b	1.93±0.50^ab

a~c: 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것으로, p<0.05이다.

[혈액의 채취 및 보관]

혈액은 실험이 종료되는 마지막 12주에 12시간 동안 절식시키고, 마취한 후 심장에서 채혈하였다. 채혈한 혈액은 4℃에서 3,000rpm으로 15분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였으며, 분리된 혈청은 분석 전까지 -80℃에 보관하면서 사용하였다.

(2) 혈액의 생화학적 분석

혈액 내 중성지방, GOT, GPT의 함량은 측정용 키트(Asan)를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 고지방 식이에 의해 증가된 총 중성지방의 함량은 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물(CAC) 투여에 의해 고지방식이군에 비해서 약 17% 정도 감소하였고(도 6A), 고지방 식이에 의해 증가된 GOT 및 GPT는 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여에 의해 고지방식이군에 비해서 GOT 함량이 약 31% 정도, GPT 함량이 약 34% 감소하였다(도 6B, 6C).

(3) 지방 축적, 콜라겐 관찰 및 생화학적 분석

간 무게를 측정한 후, 간 조직의 일부는 급속으로 냉동(-80℃)시켰고, 조직 일부는 식염수로 세척한 후 물기를 제거하고, 4%(v/v) 파라포름알데히드(paraformaldehyde, pH 7.4)로 고정한 후 파라핀 블록으로 제작하였다.

상기 파라핀 블록은 5㎛ 두께로 절단하여 탈파라핀(deparaffin)과 함수 과정을 거친 후 간 조직의 지방 축적은 H&E로 염색하여 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였고, 간섬유화 정도는 콜라겐 섬유 생성을 확인하는 트라이크롬 염색 키트(trichrome staining kit, Abcam, Inc., Cambridge, UK)로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 간 조직에서의 중성지방, MDA, 카탈라아제(catalase) 활성은 상업적으로 이용 가능한 분석 키트(Cayman Chemical., 미국)를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다.

적출한 간 조직을 H&E 염색한 결과, 고지방 식이에 의해 간 조직 내 증가된 지방 함량이 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여시 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 7A).

또한, 지방 조직을 H&E 염색하여 100배율로 관찰한 결과, 고지방 식이에 의해 비대해진 지방조직이 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여시 크기가 작아지는 것을 확인할 수 있었다(도 7B).

(4) 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물의 간 조직의 생화학적 분석

고지방 식이 동물모델 간에서 중성지방 및 산화손상에 대한 변화를 확인한 결과, 고지방 식이에 의해 증가된 총 중성지방의 함량은 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여에 의해 감소하였다(도 8). 이러한 효과는 밀크시슬 처리군보다 우수하였으며, 고지방식이군에 비해서 중성지방 함량이 약 15.9% 감소하였다(도 8).

또한, 간의 과산화반응을 알아보기 위해 MDA 농도를 측정하였다. 고지방 식이에 의해 증가된 MDA 농도는 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여시 고지방식이군에 비해서 MDA 함량이 약 50% 감소하였다. 간 내 항산화 효소인 catalase 활성을 분석한 결과, 고지방 식이에 의해 감소한 효소 활성이 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여 시 고지방식이군에 비해 약 25% 증가하였다(도 8).

(5) 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물의 지방간염 관련 염증인자 발현 분석

고지방 식이 동물모델 간에서 지방간염 관련 염증인자의 발현에 대한 변화를 확인하였다. 그 결과, 간 조직에서 고지방식이에 의해 증가된 COX-2, iNOS 및 TNF-α의 발현량이 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여에 의해 감소하는 것을 확인하였다(도 19).

(6) 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물의 지방산 산화 및 지방 형성 인자 발현 분석

고지방 식이 동물모델 간에서 지방산 산화 및 지방 형성 인자의 발현에 대한 변화를 확인하였다. 그 결과, 간 조직에서 고지방식이에 의해 증가된 PPAR-r의 발현량이 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여에 의해 감소하는 것을 확인하였고, 고지방식이에 의해 감소된 CEBPA의 발현량이 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여에 의해 증가하는 것을 확인하였다(도 10).

(7) 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물의 지방간염 관련 사이토카인 IL-17 발현 분석

고지방 식이 동물모델 간에서 지방간염 관련 사이토카인 IL-17의 발현에 대한 변화를 확인하였다. 그 결과, 간 조직에서 고지방식이에 의해 증가된 사이토카인 IL-17의 발현량이 엉겅퀴, 개똥쑥 및 울금의 혼합 추출물 투여에 의해 감소하는 것을 확인하였다(도 11).

Claims

엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 울금 뿌리 1중량부에 대하여, 개똥쑥 잎 2~4 중량부 및 엉컹퀴 잎 15~17 중량부로 혼합하여 추출한 것을 특징으로 하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 물, C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽, 발포정 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
엉겅퀴 잎, 개똥쑥 잎 및 울금 뿌리의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.