KR101370679B1

KR101370679B1 - 고상발효법을 이용한 산마늘 발효물의 제조방법 및 산마늘 발효물을 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101370679B1
Application number: KR1020120018159A
Authority: KR
Inventors: 도은수; 장준복; 길기정; 최명석; 양재경; 이건희; 지윤선; 정지영; 김지수
Original assignee: 경상대학교산학협력단; 중부대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-22
Filing date: 2012-02-22
Publication date: 2014-03-06
Also published as: KR20130096588A

Abstract

본 발명은 고상발효법을 이용한 산마늘 발효물의 제조방법 및 산마늘 발효물을 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 산마늘을 α-허브자임으로 처리하여 효소반응시키는 단계; 상기 효소반응시킨 반응물을 사카로마이세스 세레비시아 및 락토바실러스 델브루엑키로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 미생물과 배양시키는 단계; 상기 배양물을 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 여과하고 농축하는 단계;를 포함하는 고상발효법을 이용한 산마늘 발효물의 제조방법; 및 산마늘을 α-허브자임과 반응시키고 사카로마이세스 세레비시아 및 락토바실러스 델브루엑키로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 미생물로 발효시킨 발효물을 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

고상발효법을 이용한 산마늘 발효물의 제조방법 및 산마늘 발효물을 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물 {Method for manufacturing solid-state fermented Allium victorialis and Composition for preventing or treating anti-diabetes or anti-diabetic complication containing fermented Allium victorialis}

본 발명은 고상발효법을 이용한 산마늘 발효물의 제조방법 및 산마늘 발효물을 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

당뇨병 (Diabetes mellitus)이란 생체내 인슐린을 분비하는 췌장 β세포의 파괴 혹은 기능저하로 인해 인슐린 분비의 저하 및 유전적 요인이나 비만에 의해 조직내 인슐린 수용체의 거부반응으로 혈당이 조직으로 운반되지 않고 소변을 통해 배설되는 대사성 질환으로 고혈당, 고당뇨를 주요 특징으로 한다. 당뇨가 유발되면 인슐린과 글루카곤 (glucagon)의 분비상태가 교란되어 탄수화물뿐만 아니라 단백질 및 지질대사 등 생체 내 대사 조절기능에 이상이 생겨 여러 가지 대사질환이 나타나게 되며, 당뇨증상이 오래 지속되면 모세혈관의 상피 세포막의 비후가 일어나 순환기계 등에 많은 합병증의 유발이 문제시되고 있다.

당뇨병 치료에 있어서 가장 중요한 목표는 혈당치를 가능한 정상치에 가깝게 조절하는 것이며, 치료 방법으로 약물요법, 식이요법 및 운동요법을 실시하고 있다. 현재 제 1형 및 제 2형 당뇨병 환자에게 사용되는 경구혈당강하제로 α-글루코시다아제 (α-glucosidase) 억제제, 설포닐우레아 (sulfonylurea) 제제 및 비구아니드 (biguanide) 제제가 있으며, α-글루코시다아제 억제제는 섭취한 식이 중의 탄수화물의 소화와 흡수를 지연시켜 식후 혈당 및 혈중 인슐린의 상승을 감소시킴으로써 당뇨병의 치료효과를 나타낸다. α-글루코시다아제 저해제는 고인슐린혈증이나 저혈당을 유발하지 않고, 인슐린분비를 촉진시키며 글루카곤 분비를 억제하는 글루카곤-유사-펩티드-1 (glucagon-like peptide-1)의 소장에서의 분비를 촉진하는 장점을 가지고 있다 (Mooradian, A.D., Thurman, J.E., Drugs, 57, pp19-29, 1999; Baron, A.D. Diabetes Research and Clinical Practice, 40, ppS54-S55, 1998). 현재 임상에서 사용하고 있는 것으로는 아카보스 (acarbose), 보길리보스 (voglibose) 및 미글리톨 (miglitol) 등이 있으나, α-글리코시다아제 저해제를 장기간 복용한 경우 일부 환자에 있어서 복부팽만감, 구토 설사 등 부작용을 나타낼 수 있어 그 사용이 제한될 수 있다 (Hanefeld M., Journal of Diabetes and its Complications, 12, pp228-237, 1998).

한편, 산마늘 (Allium victorialis Linne)은 백합과 다년생 초본식물로서 우리나라 북부지방, 지리산, 설악산, 오대산, 울릉도의 숲에서 자라고, 식물전체에서 강한 마늘냄새가 나며 맛은 맵고 성질은 약간 따뜻하며 독이 없다. 장기악독을 제거하고 종자는 유정을 치료하는 효과가 있다. 현재까지 산마늘에서 보고된 주요 성분으로는 유황화합물, 냄새의 근원이 되는 메틸 알릴 디설파이드 (methyl allyl disulfide), 다이알릴 디설파이드 (diallyl disulfide), 메틸 알릴 트리설파이드 (methyl allyl trisulfide), 항혈전작용을 가지는 3,4-디하이드로-3-비닐-1,2-티인 (3,4-dihydro-3-vinyl-1,2-thiin), 2-비닐-1,3-다이티인사포닌 (2-vinyl-1,3-dithiinsaponin), 1-케토오스 (1-kestose), 네오케스토설크 (neokestoserk) 등 (Nishimura et al., 1998; Kim et al., 1996; Lee, 2008)과 아스트라갈린 (astragalin), 푸로스탄올 글리코사이드 (furostanol glycosides), 케르세틴 (quercetin), 캠프롤 (kaempfrol) 및 페룰산 (ferulic acid) (Lee et al., 2007) 등이 있으며, 이에 따라 항산화 활성, 항돌연변이 및 암세포 생육억제 활성, 동맥경화, 고지혈증 및 콜레스테롤 억제 효과 그리고 비만억제 (Park, 1997), 항동맥경화 (Kim et al., 2000), 항돌연변이원성 및 세포보호 (Ham et al., 2004), 식이성 고지혈 및 비만 (Choi et al., 2005) 등에 대한 효과가 있다.

그러나 산마늘의 생리활성 평가는 여전히 미비한 단계에 있으며, 산마늘의 처리조건 및 추출방법에 따라 유효물질의 함량이나 생리적 활성도 다르게 나타난다 (Chung, 2001).

본 발명은 항당뇨 또는 항당뇨합병증에 최적의 활성을 나타낼 수 있는 고상발효법을 이용한 산마늘 발효방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 산마늘 발효물을 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 산마늘을 α-허브자임으로 처리하여 효소반응시키는 단계; 상기 효소반응시킨 반응물을 사카로마이세스 세레비시아 및 락토바실러스 델브루엑키로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 미생물과 배양시키는 단계; 상기 배양물을 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 여과하고 농축하는 단계;를 포함하는 산마늘 발효물의 제조방법을 제공한다.

상기 산마늘은 산마늘 잎을 분말화시킨 것일 수 있다.

상기 α-허브자임의 처리는 산마늘을 α-허브자임과 증류수를 가하여 40 내지 60℃에서 1 내지 3시간 효소반응시킨 것일 수 있다.

상기 사카로마이세스 세레비시아는 사카로마이세스 세레비시아 KCCM50549 (Saccharomyces cerevisiae KCCM 50549)를 포함하며, 상기 락토바실러스 델브루엑키는 락토바실러스 델브루엑키 변종 불가리쿠스 KCCM 35463 (L. delbrueckii subsp. bulgaricus KCCM 35463)를 포함할 수 있다.

상기 산마늘 발효물의 제조방법은 산마늘을 α-허브자임으로 처리하고 증류수를 가하여 40 내지 60℃에서 1 내지 3시간 효소반응시키는 단계; 상기 효소반응시킨 물질을 여과하고 다시 α-허브자임과 혼합하여 40 내지 60℃에서 1 내지 3시간 효소반응시키는 단계; 상기 반응시킨 반응물을 사카로마이세스 세레비시아 KCCM50549 및 락토바실러스 델브루엑키 불가리쿠스 KCCM 35463로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물과 배양시키는 단계; 상기 배양물을 60 내지 80% 에탄올 수용액으로 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 여과하고 농축하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명은 산마늘을 α-허브자임과 반응시키고 사카로마이세스 세레비시아 및 락토바실러스 델브루엑키로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물로 발효시킨 발효물을 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 고상발효법을 이용한 산마늘 발효물의 제조방법 및 산마늘 발효물은 항산화활성, SOD 유사활성, DPPH 라디칼 소거 활성, 아질산염 소거능 환원력, 히드록시 라디칼 소거 활성 등이 뛰어날 뿐만 아니라 항당뇨 효과가 뛰어나기에 이를 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물로 이용할 수 있으며, 이를 약학 조성물 또는 건강식품 조성물로 활용할 수 있다.

도 1은 산마늘을 고상발효시킨 발효물의 환원당 함량을 측정한 것으로, α-h는 α-허브자임, Ld는 락토바실러스 델브루엑키를, Sc는 사카로마이세스 세레비시아를, Av는 발효되지 않은 산마늘을 나타낸 것이다.
도 2는 산마늘을 고상발효시킨 발효물의 폴리페놀 함량을 측정한 것으로, α-h, Ld, Sc, Av 약어의 의미는 도 1과 같다.
도 3는 산마늘을 고상발효시킨 발효물의 SOD 유사활성을 측정한 것으로, α-h, Ld, Sc, Av 약어의 의미는 도 1과 같다.
도 4은 산마늘을 고상발효시킨 발효물의 전자 공여능을 측정한 것으로, α-h, Ld, Sc, Av 약어의 의미는 도 1과 같다.
도 5은 산마늘을 고상발효시킨 발효물의 pH2.5 및 pH4.2에서 아질산염 소거능을 측정한 것으로, α-h, Ld, Sc, Av 약어의 의미는 도 1과 같다.
도 6는 산마늘을 고상발효시킨 발효물의 플라보노이드 함량을 측정한 것으로, α-h, Ld, Sc, Av 약어의 의미는 도 1과 같다.
도 7는 산마늘을 고상발효시킨 발효물의 하이드록시 라디칼 소거활성을 나타낸 것으로, α-h, Ld, Sc, Av 약어의 의미는 도 1과 같다.
도 8은 사카로마이세스 세레비시아, 락토바실러스 델브루엑키, 아스퍼질러스 오리제로 발효시킨 산마늘 발효물에서 아카보스와 비교한 α-글루코시다아제 활성 억제능을 나타낸 것이다
도 9은 산마늘 발효물이 투여된 스트렙토조토신 (STZ)로 유도한 당뇨성 SD 렛 (rats)에서 혈당농도를 측정한 것이다.
도 10는 발효방법 및 발효시간에 따른 발효물의 α-글루코시다아제 활성억제능을 나타낸 것으로, 대조군은 70% 에탄올 추출물; SF-E는 미생물 처리없이 α-허브자임 처리한 것이고; SF-SD는 α-허브자임 처리없이 증류수와 사카로마이세스 세레비시아를 첨가하여 발효시킨 것이고; SF-SE는 α-허브자임과 사카로마이세스 세레비시아를 모두 첨가하여 발효시킨 것을 나타낸 것이다.
도 11는 산마늘 발효물이 투여된 스트렙토조토신 (STZ)로 유도한 당뇨성 SD 렛 (rats)에서 혈당농도를 측정한 것으로, vehicle (증류수), 대조군 (1ml 증류수), 대조군 (70% 에탄올 추출물 500mg/kg), SF-SE 5일 (500mg/kg), SF-E 3일 (500mg/kg)을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에서 사용한 알파 허브자임을 나타낸 것이다.

본 발명은 고상발효법을 이용한 산마늘 발효물의 제조방법 및 산마늘 발효물을 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

산마늘의 생리활성 평가는 여전히 미비한 단계에 있으며, 산마늘의 처리조건 및 추출방법에 따라 유효물질의 함량이나 생리적 활성 정도가 다르게 나타나기에, 본 발명에서는 당뇨 또는 당뇨합병증 치료제로서 최적의 활성을 나타낼 수 있는 산마늘 발효물의 제조방법을 제공하고 산마늘 발효물을 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

산마늘은 동북아시아 지역에 분포하고 있으며, 우리 나라에서는 주로 울릉도 및 강원도 북부 산간의 고산대에서 많이 자라고 있다. 산마늘의 일반 성분은 수분 77.3%이며 건조 상태에서 조단백 11.6%, 조지방 10.2%, 무기질 46.3%, 섬유소 22.18%를 포함하며, 잎과 줄기 부위에는 건조물 중량으로 과당이 7.86%, 포도당이 8.89%, 자당이 1.69% 함유되어 감미가 높으며, 비타민 함량도 B 2 가 0.017%. 나이신 함량은 0.8%이고, 무기물 함량은 칼륨이 3.2%로 가장 많은 함량을 보이고 있다. 이러한 산마늘은 오랫동안 생약 및 식품으로 사용되어 오던 것으로 독성 및 부작용이 거의 없으므로 치료 및 예방 목적으로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

상기 산마늘은 재배 또는 자생한 산마늘의 잎, 뿌리, 인경 또는 전초 등을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 산마늘 잎을 포함할 수 있다.

일 실시예로, 산마늘 잎을 절단한 후 동결건조한 다음 믹서로 갈아 분말화할 수 있다.

α-허브자임 (α-herbzyme)은 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 한국효소주식회사 (Korea Enzyme Co.Ltd, 경인식약청 제129호)에서 제조된 것을 사용할 수 있다 (도 12).

본 발명에서는 미생물 발효의 효과를 높이기 위하여 미생물 처리 전에 상기 α-허브자임을 전처리함으로, 본 발명에 의해 수득된 발효물의 당뇨 또는 당뇨합병증 치료효과를 극대화시킬 수 있다.

상기 산마늘을 α-허브자임으로 처리하는 단계에서, 산마늘과 α-허브자임의 혼합비율은 특별히 한정된 것은 아니나, 산마늘과 α-허브자임의 비율은 중량비를 기준으로 20 내지 50 : 1 (산마늘: α-허브자임)일 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 40 : 1 (산마늘: α-허브자임)일 수 있다.

상기 산마늘을 α-허브자임으로 처리하여 효소반응시키는 단계는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 상기 산마늘을 α-허브자임으로 처리하고 증류수를 가하여 40 내지 60℃에서 1 내지 3시간 효소반응시킬 수 있다.

상기 온도보다 낮은 온도에서 반응시 효소활성이 떨어져 반응시간이 오래 걸릴 수 있으며, 상기 온도보다 높은 온도에서는 효소의 변성이 일어나 반응성이 감소될 수 있다.

상기 산마늘과 증류수의 비는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 1 : 0.7 내지 1.5 (산마늘: 증류수)(W/V)일 수 있다.

상기 α-허브자임으로 처리한 반응액을 바로 미생물 배양을 위해 사용할 수 있고, 선택적으로 항당뇨 또는 항당뇨합병증 효과를 좀 더 최대화하기 위해 α-허브자임을 다시 처리한 다음 미생물 배양을 위해 사용할 수 있다.

일례로, 상기 α-허브자임으로 1차 처리한 효소반응물을 여과시킨 후, 다시 α-허브자임과 혼합하여 2차 효소반응시킬 수 있는데, 이때 2차 효소반응 조건은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 40 내지 60℃에서 1 내지 3시간 반응시킬 수 있다.

상기 효소반응시킨 반응물은 발효미생물과 배양시킬 수 있는데, 이때 사용가능한 발효미생물은 산마늘 추출액을 발효시킬 수 있는 것으로 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 항당뇨 또는 항당뇨합병증 활성이 뛰어난 발효물을 생산하는 사카로마이세스 세레비시아 및 락토바러스 델브루엑키로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물을 포함할 수 있다.

이때, 상기 발효미생물과의 배양 전에 상기 효소반응물을 살균시킨 후 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

상기 사카로마이세스 세레비시아는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시아 KCCM50549 (S. cerevisiae KCCM50549)을 포함할 수 있다.

상기 효소반응시킨 발효물을 사카로마이세스 세레비시아와 배양하는 일 실시예로, 효소반응시킨 반응물을 멸균시킨 후 사카로마이세스 세레비시아와 혼합하여 25 내지 40℃에서 12 내지 80시간 배양할 수 있다.

상기 락토바실러스 델브루엑키는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 락토바실러스 델브루엑키 변종 불가리쿠스 KCCM35463 (L. delbrueckii subsp. bulgaricus KCCM35463)을 포함할 수 있다.

상기 효소반응시킨 발효물을 락토바실러스 델브루엑키와 배양하는 일 실시예로, 효소반응시킨 반응물을 멸균시킨 후 락토바실러스 델브루엑키와 혼합하여 25 내지 40℃에서 12 내지 80시간 배양할 수 있다.

상기 미생물 배양물의 추출은 특별히 한정된 것은 아니며 당업계에 통상적인 추출방법인 초음파 추출법, 용매추출법, 여과법 또는 환류추출법 등에 의할 수 있으며, 용매추출법에 의할 때 상기 추출은 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출할 수 있고, 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매로 추출할 수 있다.

일 실시예로, 상기 미생물 배양물을 60 내지 80% 에탄올 수용액으로 추출물을 수득할 수 있다.

이후 상기 추출물은 여과하고 농축하는 단계를 거칠 수 있다.

본 발명에서는 산마늘 발효물의 제조방법의 일례로, 산마늘을 α-허브자임으로 처리하고 증류수를 가하여 40 내지 60℃에서 1 내지 3시간 효소반응시키는 단계; 상기 효소반응시킨 물질을 여과하고 α-허브자임과 혼합하여 40 내지 60℃에서 1 내지 3시간 효소반응시키는 단계; 상기 반응시킨 반응물을 사카로마이세스 세레비시아 KCCM50549 및 락토바실러스 델브루엑키 불가리쿠스 KCCM 35463로 이루어진 군에서 선택된 하나의 이상 미생물과 배양시키는 단계; 상기 배양물을 60 내지 80% 에탄올 수용액으로 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 여과하고 농축하는 단계;를 포함하는 산마늘 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 산마늘 발효물은 발효되지 않은 산마늘에 비해 월등히 총 폴리페놀함량, 총 플라보노이드 함량이 높게 나타나는데, 상기 폴리페놀의 페놀성 수산기 (phenolic hydroxy기)가 단백질 및 기타 거대분자들과 결합하는 성질을 통해 항산화, 항암 및 항균, 항혈전 작용, 고지혈증 및 지방간 억제 작용 등의 활성을 나타내며, 상기 플라보노이드는 지방질 산화, 활성산소의 소거 및 산화적 스트레스를 막는 역할을 하여 노화방지, 암 및 심장질환 등을 예방하거나 지연시키는 효과를 나타내기에 본 발명의 산마늘 발효물이 당뇨 및 당뇨합병증 예방 또는 치료에 효과적일 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 제조된 산마늘 발효물은 발효되지 않는 산마늘에 비해 환원당 함량이 증가되었고 SOD (superoxide dismutase) 활성을 나타내어 산화적 장애를 방어하며, 높은 전자공여능을 나타내어 지방질 산화를 억제하고, 발암이나 혈액 중 헤모글로빈 산화에 의해 중독을 일으키는 아질산염의 높은 소거능을 나타내고, 지질산화와 DNA에 손상을 주는 산소종인 하이드록시 라디칼을 소거하는 능력이 뛰어날 뿐만 아니라, α-글리코시다아제 저해능이 우수하고 인슐린 요구도를 감소시키며, 혈중 중성지방, 콜레스테롤 농도 및 혈당 농도를 낮추어 당뇨 및 당뇨합병증 치료에 효과적일 수 있다.

상기와 같은 발효되지 않은 산마늘에 비해 본 발명의 발효 산마늘이 당뇨 또는 당뇨합병증 치료에 효과적인 것은, 본 발명의 산마늘 발효물의 제조방법에 사용된 균주 및 효소의 선택이 탁월하였으며 제조방법의 각 단계가 당뇨 및 당뇨합병증 치료효과를 나타내도록 산마늘 발효물을 제조하는데 최적화되었기 때문이다.

본 발명은 산마늘을 α-허브자임과 반응시키고 사카로마이세스 세레비시아 및 락토바실러스 델브루엑키로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 미생물로 발효시킨 발효물을 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 발효물의 제조방법은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 발효물일 수 있다.

상기 당뇨합병증은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 당뇨성 망막증, 당뇨성 백내장, 당뇨성 각막증, 당뇨성 신증, 당뇨성 신경병증, 당뇨성 말초신경장해, 아테롬성 동맥경화, 심혈관계질환, 신장병변 및 당뇨성 혈관합병증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

당뇨합병증은 혈당이 정상적으로 회복되었음에도 불구하고 발병하는 경우가 많다. 최종당화산물은 고혈당의 농도에 비례하여 조직에 축적되는 단백질 당화산물로 특이한 흡광도 및 형광을 나타내고, 특히 단백질의 아미노기가 서로 cross-link 반응을 일으키는 성질을 가지고 있다. 최종당화산물은 한번 생성되면 혈당이 정상적으로 조절되어도 분해되지 않고 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시키며, atheroma성 동맥경화증, DNA의 돌연변이, 노화, 알츠하이머병, 당뇨합병증등에 관여한다고 알려져 있다.

상기 발효물은 항산화활성, SOD 유사활성, DPPH 라디칼 소거 활성, 아질산염 소거능 환원력, 히드록시 라디칼 소거 활성 등이 뛰어날 뿐만 아니라 혈당조절 및 인슐린 조절 효과가 뛰어나기에, 이를 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물을 약학 조성물 또는 건강식품 조성물로 활용할 수 있다.

본 발명의 발효물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 다른 약학적 활성을 지닌 화합물과 결합할거나 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 발효물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 발효물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 일례로, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 발효물의 바람직한 투여량은 특별히 한정된 것은 아니나, 통상 1 내지 500 mg/kg일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 300mg/kg일 수 있으나, 상기 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 증감될 수 있는 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 일례로, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 당뇨 또는 당뇨합병증의 예방 또는 개선 효과를 나타내는 상기 발효물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 산마늘 발효물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 당뇨 및 당뇨합병증 치료 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 발효물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02∼5 g, 바람직하게는 0.3∼1g의 비율로 가할 수 있으나, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 발효물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 ∼ 20g, 바람직하게는 약 5 ∼ 12g이나, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: 산마늘 준비

본 실험에 사용된 산마늘 (A. victorialis Linne)은 울릉도 자연산 산마늘과 강원도 재배 산마늘을 채취하여 실험에 사용하였으며, 구매 직후 수세하여 이물질을 제거하고 물기를 제거한 다음 적당하게 절단하여 초저온냉동기 (deep freezer)에 두었다가 동결건조하고 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.

실시예 2: 산마늘 추출물의 발효 최적조건 구명

실시예 2-1: 발효미생물의 수집 및 분리

염장 산마늘 잎 현탁액 1mL를 평판배지에 떨어뜨린 후 삼각유리막대를 사용하여 배지의 표면에 넓게 펴는 확산평판법 (spread plate method)과 현탁액을 페트리디쉬 (petri dish)에 1mL처리한 후 45~50℃로 식힌 배지를 주입하고 혼합하는 주입평판법 (pour plate method)으로 산마늘 발효미생물을 분리하였다.

실시예 2-2: 발효미생물의 수집 및 분리

한국미생물 보존협회로부터 락토바실러스 델브루엑키 변종 불가리쿠스 KCCM35463 (L. delbrueckii subsp. bulgaricus KCCM35463), 사카로마이세스 세레비시아 KCCM50549 (Saccharomyces cerevisiae KCCM50549) 및 아스퍼질러스 오리제 KCCM60241 (A. oryzae KCCM60241) 발효균주를 수집 및 분리하였다.

각 발효균주의 배양에 사용된 배지는 락토바실러스 델브루엑키 변종 불가리쿠스 KCCM35463는 Lactobacilli MRS Broth (Difco 0881), 사카로마이세스 세레비시아 KCCM50549, 아스퍼질러스 오리제 KCCM60241는 Malt Extract Agar를 사용하였다.

실시예 2-3: 발효조건에 따른 발효균주의 생장

실시예 2-3-1: 발효전후 환원당 ( Reducing sugar ) 함량

발효 산마늘의 환원당 함량은 DNS법에 따라 각각 측정하였다 (Kim et al., 2007). 발효 산마늘 분말 1 g에 초순수 100 mL를 가하여 마쇄한 후 여과하여 초순수로 100 mL로 정용한 후 100배 희석하여 시료액을 제조한 후, 시료액 1 mL에 DNS 시약 (7.5 g DNS, 14.0 g NaOH, 126.1 g Rochelle염, 5.4 mL 페놀 및 5.9 g Na₂S₂O₅/증류수 1 L) 1 mL를 혼합하여 끓는 물에서 15분간 반응시킨 후 흐르는 찬물에서 5분간 냉각한 다음 반응액에 증류수 3 mL를 가한 후 UV-Vis 스펙트로포도메터 (spectrophotometer)를 사용하여 546 nm에서 흡광도를 측정한 후 글루코오스 (glucose)의 검량선으로부터 환원당 함량을 환산하였다.

도 1는 고체발효한 산마늘의 환원당 측정 결과를 나타낸 것으로 α-허브자임 (α-herbzyme) 발효물은 68.4 ~87.7 mg%로 48시간 발효물에서 제일 높았고, 사카로마이세스 세레비시아 발효물은 발효시간이 길어짐에 따라 환원당 함량이 증가하였으며, 락토바실러스 델브루엑키은 발효시간에 따른 차이가 나타나지 않았다. 발효하지 않은 산마늘의 환원당 함량 36.30 mg%와 비교하면 발효한 산마늘의 환원당 함량이 높게 나타나 발효가 환원당 함량을 높이는 것으로 나타났다.

실시예 3: 고상발효방법

동결건조된 산마늘 잎 분말 100g에 α-허브자임 (α-herbzyme) 3g에 100 mL 증류수를 가하여 50℃에서 2시간 침출한 다음 거즈로 1차 거른 후 여과지로 여과시키고 이를 다시 α-허브자임을 처리하여 50℃에서 2시간 동안 효소 반응시켰다. 그 후 95℃에서 10분간 살균한 다음 미리 활성화시켜 둔 발효균주를 접종하여 각 발효균주의 생육에 적당한 온도로 조정된 항온기에 넣어 24, 48 및 72시간 동안 발효시켰다. 이것을 70% 에탄올 (EtOH)로 추출하고 거즈와 여과지로 여과한 다음 45℃ 수욕상에서 회전진공농축기 (rotary vaccum evaporator)를 이용하여 농축 후 -45℃ 저온냉동고 (deep freezer)에 12시간 두었다가 동결건조기 (freeze dryer)에 넣고 동결건조한 다음 각 시료로 사용하였다.

실시예 4: 발효물의 생리활성 검정

산마늘 발효물의 항산화활성은 총 폴리페놀함량, 과산환 제거효소 (superoxide dismutase, SOD)활성, 전자공여능 (electron donating activity, EDA), 아질산염 소거능, 총 플라보노이드 함량, 하이드록시 라디칼 제거 (Hydroxy radical scavenging) 활성을 측정하였다.

실시예 4-1: 총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법 (1915)을 응용하여 측정하였다. 산마늘의 발효물을 ㎎/g 농도로 만든 후, 시료 0.4 mL에 Folin-ciocalteau reagent 0.2 mL를 첨가하여 충분히 혼합한 후 실온에 3분간 반응시켰다. 정확히 3분간 반응시킨 후 Na₂CO₃포화용액 0.4 mL를 가하여 실온에서 1시간 동안 방치한 다음 UV/VIS 스펙트로포토메터 (UV-1250. Shimadzu, Japan)를 사용하여 625 nm에서 흡광도를 측정하였다. 폴리페놀 함량은 타닌산 (tannic acid)를 표준물질로 하여 표준검량곡선을 작성하여 구하였다.

도 2은 페놀성화합물 함량은 α-허브자임 처리한 발효물의 경우 23.37~40.41mg/g, 락토바실러스 델브루엑키는 27.44~31.15 mg/g로 발효시간이 길어지면 증가하였고, 반면에 사카로마이세스 세레비시아 27.44~24.11 mg/g 으로 나타나 이들 균주 처리 발효물의 페놀화합물 함량은 발효시간이 길어질수록 감소하는 경향을 나타냈다. 상기 발효물의 페놀성화합물의 함량은 발효하지 않은 산마늘 페놀성화합물의 함량이 잎과 인경의 물 추출물이 각각 10.13 mg/g, 4.38 mg/g, 70% 에탄올 추출물이 각각 10.98 mg/g, 3.80mg/g임과 비교하면 발효물의 경우 높게 나타나 발효로 인해 페놀성화합물의 함량이 증가하였다.

실시예 4-2: 과산화 제거효소 ( Superoxide dismutase , SOD )활성 측정

SOD유사활성 측정은 Marklund와 Marklund의 방법 (1974)에 따라 활성 산소종을 과산화수소 (H₂O₂)로 전환시키는 반응을 촉매하는 피로갈롤 (pyrogallol)의 생성량을 측정하여 나타냈다. 즉, 일정 농도의 시료 0.2 mL씩 첨가한 후, Tris-HCl 버퍼 (50 mM Tris aminom-mthane+10 mM EDTA, pH 8.5) 3 mL와 7.2 mM 피로갈롤 0.2 mL를 첨가하여, 실온에서 10분간 반응시키고, 1N HCl 1 mL을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. SOD유사활성은 추출물 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다

도 3는 고체발효한 산마늘의 SOD 유사활성을 나타낸 것이다. α-허브자임 (α-herbzyme)과 락토바실러스 델브루엑키의 SOD 유사활성은 각각 9.90~33.75%, 21.99~46.74%로 발효시간이 길어짐에 따라 활성이 증가하였고, 사카로마이세스 세레비시아는 19.24~42.81%로 발효시간이 길어짐에 따라 활성이 증가하여 48시간 발효에서 가장 높은 값을 나타낸 후 그 이후에는 활성이 감소하는 경향을 나타냈다.

실시예 4-3: 전자 공여능 ( Electron donating activity , EDA ) 측정

전자공여능은 Choi et al.의 방법 (2006)에 준하여 측정하였다. 즉, 에탄올에 용해한 100 μM의 DPPH 용액 900 ㎕와 시료 용액 100 ㎕를 혼합하여 잘 교반하고, 이 혼합 시료를 암소에서 30분간 반응시킨 후 517 에서 흡광도를 측정하였다. 수소전자공여능은 각 실험을 3회 반복하여 평균을 낸 다음 대조구에 대한 흡광도의 감소 정도를 다음 식에 의하여 계산하였다.

도 4은 고체발효한 산마늘의 전자공여능을 DPPH 소거능으로 나타낸 것이다.

발효물의 DPPH 라디칼 소거능은 α-허브자임 (α-herbzyme) 발효물 45.69~48.65%, 락토바실러스 델브루엑키 발효물은 45.35~50.24%, 사카로마이세스 세레비시아 발효물 49.77~51.19%로 나타나 발효하지 않은 산마늘의 라디칼 소거능과 비교하면 발효에 의해 약간의 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였다.

실시예 4-4: 아질산염 소거능

아질산염 소거능 측정은 Kato et al.의 방법(1987)으로 측정하였다. 즉, 농도별로 희석한 시료액 2 mL에 1 mM NaNO 1 mL을 넣은 다음 0.1 N HCI을 이용하여 pH를 각각 2.5와 4.2로 조정한 후 반응용액의 부피를 10 mL로 하였다. 이 용액을 37℃에서 1시간 반응시킨 후 반응액 1 mL을 취하여 2% 아세트산 (acetic acid) 5 mL과 글리에스 (Griess) 시약 0.5 mL를 가한 후 vortex하여 실온에서 15분간 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 글리에스 (Griess)시약 대신 증류수 0.1 mL를 가하여 상기와 동일한 방법으로 측정하여 추출물을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 아질산염 소거율을 백분율(%)로 계산하여 BHT 처리구와 비교하였다.

N(%) = [1 - (A -C) / B] × 100

(N : nitrite scavenging ability, A : absorbance of 1 mM NaNO₂ added sample after standin for 1 hour, B : absorbance of 1 mM NaNO₂)

산마늘을 고체발효시킨 발효물물을 1.0mg/mL의 농도로 pH 2.5 및 4.2에서 아질산염 소거능을 측정한 결과는 도 5와 같다.

pH 4.2에서 소거능은 α-허브자임 (α-herbzyme) 5.73~11.28%,사카로마이세스 세레비시아 6.00~10.52%,%로 나타나 발효시간이 길어짐에 따라 소거능은 감소하는 경향을 나타냈으며, 락토바실러스 델브루엑키는 5.51~21.02%로 나타나 발효 48시간에서 최대 소거능을 나타내고 그 이후는 감소하는 경향을 나타냈다.

그러나 pH 2.5에서는 α-허브자임 (α-herbzyme) 13.67~32.08%, 락토바실러스 델브루엑키 9.69~29.69%, 사카로마이세스 세레비시아 14.01~37.17%로 발효시간이 길어질수록 소거능이 높아져 72시간 발효에서 가장 높은 소거능을 나타냈다. 고체발효는 사카로마이세스 세레비시아 균주의 72시간 발효물이 37.17%로 가장 높은 소거능을 나타냈다.

발효하지 않은 산마늘의 아질산염 소거능은 pH 2.5일 때 잎의 물 추출물에서 최고 19.18%로 나타났고, pH 4.2일 때 잎의 70%에탄올 추출물에서 최고 9.86%로 나타난 것과 비교하면 발효에 의해 소거능이 상당히 높아짐을 알 수 있다. 합성 항산화제인 BHT의 45.58 % (pH 2.5)임을 고려하면 높은 소거능을 나타내고 있다.

실시예 4-5: 총 플라보노이드 함량 측정

시료 중 총 플라보노이드 함량은 Zhishen et al.(1999)이 개발한 분광분석법을 이용하여 측정하였다. 즉, 증류수 4 mL가 들어있는 시험관에 시료 1 mL를 가하고 5분이 경과한 다음 5% NaNO₂ 0.3 mL와 10% AlCl₃ 0.3 mL를 차례로 가하였다. 대조군은 시료 대신 증류수 1 mL를 가하였다. 시작시간으로부터 6분이 경과한 시간에 1 M NaOH 2 mL를 가하고 증류수를 추가로 가하여 10 mL로 만든 다음 골고루 희석하였다. 분홍색을 띄는 시료를 510 nm파장에서 흡광도를 측정하여 L 당 catechin equivalent (CE) mg으로 환산하여 플라보노이드 함량을 표시하였다.

도 6는 고체발효한 산마늘의 1 mg/mL 농도에서 플라보노이드 함량을 나타낸 것이다.

산마늘을 고체발효시킨 발효물의 사용 균주별 1mg/mL 농도에서 플라보노이드 함량은α-허브자임 (α-herbzyme) 6.05~8.84 mg/mL로 발효시간에 길어지면 플라보노이드 함량은 증가하는 경향을 나타냈고, 락토바실러스 델브루엑키는 각각 3.38~14.52 mg/mL으로 나타나 발효시간에 따른 큰 차이를 나타내지 않았다. 발효물 모두 발효를 하지 않은 산마늘의 플라보노이드 함량 4.43 mg/mL보다 높은 함량을 나타내고 있다.

실시예 4-6: 하이드록시 라디칼 ( Hydroxy radical ) 소거 활성의 측정

하이드록시 라디칼 (Hydroxy radical) 소거활성은 Halliwell et al.의 방법(1997)을 변형하여 측정하였다. 즉, 희석한 시료 50 ㎕에 2.5 mM 2-디옥시-D-리보오스 (2-deoxy-D-ribose)를 함유한 10 mM PBS 용액 345 ㎕를 혼합한 다음 1 mM FeCl₃와 1.04 mM EDTA 용액 50 ㎕, 1 mM 아스코르브산염 (ascorbate) 50 ㎕ 및 0.1 M H₂O₂ 5 ㎕를 각각 첨가하였다. 37℃에서 10분간 배양한 후 2.8% 트라이클로로아세트산 (trichloroacetic acid) 500 ㎕와 1% 2-티오바르비탈산 (2-thiobarbituric acid) 250 ㎕를 첨가하고 95℃에서 8분간 가열하였다. 반응물을 냉각시킨 후 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 7은 고체발효한 산마늘의 1 mg/mL 농도에서 하이드록시 라디칼 (hydroxy radical) 소거활성을 나타낸 것이다.

발효 균주별 소거활성은 α-허브자임 (α-herbzyme) 58.23~67.76 %, 락토바실러스 델브루엑키는 52.73~58.74%로 발효시간이 길어질수록 소거활성이 감소하는 경향을 나타냈다. 사카로마이세스 세레비시아 46.72~56.01%로 48시간 발효물에서 가장 높은 소거활성을 나타냈고 72 시간에서는 감소하는 경향을 나타냈다. 비발효 산마늘의 하이드록시 라디칼 (Hydroxy radical) 소거 활성 30.33%와 비교하면 발효물의 소거능은 대부분 비발효물보다 높은 소거활성을 나타냈으며, 일부는 합성 항산화제인 BHT에 근접하는 높은 소거활성을 나타냈다.

실시예 5: 시료의 항당뇨성 효과 검증

실시예 5-1: 시료의 α- 글루코시다아제 활성 저해 실험

시료의 α-글리코시다아제 (α-Glucosidase) 활성은 96 웰 플레이트 (well plate)를 이용하여 Watanabe 등의 방법(1997)에 준하여 분석한다. 즉, α-글리코시다아제 (α-Glucosidase) 용액(50 ㎕, 0.7 U)을 대조의 아카보스 (Acarbose) 용액 (5 mg/50㎕ distilledwater)이나 시료용액 (5 mg/50㎕ distilled water)을 함유하고 있는 96-well plate의 각 well에 첨가하고 405 nm에서의 흡광도를 Anthos 2020 microplate reader (Cambridge, England)로 측정한다(zero time 흡광도). 다음, 50㎕ 기질용액 (5 mM p-nitrophenyl-a- D-glucopyranoside in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0)을 α-글리코시다아제와 시료 또는 α-글리코시다아제와 아카보스를 함유하는 각 well에 첨가하고 조심스럽게 잘 혼합하고, 기질 첨가 5분 후에 다시 405 nm에 흡광도를 측정하여 α-글리코시다아제 (α-Glucosidase) 활성을 구하였다.

도 8는 각 분획의 α-글리코시다아제 활성 억제능을 아카보스와 비교하여 검토하였다. 사카로마이세스 세레비시아 발효추출물과 락토바실러스 델브루엑키 발효추출물 100㎍은 아카보스 (Acarbose) 50㎍보다 각각 187%와 170%의 효과를 나타내었고, 아카보스 25㎍보다 271%, 260%의 효과를 나타내었다. 이 값은 단위량으로 계산할 때 이들 분획의 활성은 아카보스의 효과와 거의 동일하였다. 이들 분획물에는 실제 유효성분이 있는 경우와 in vitro 효소 억제 분석에서 default result 즉 실제 효소작용을 억제하는 것이 아니라, 효소활성을 방해하는 물질이 존재할 가능성이 있기 때문에 순순한 물질을 분리, 동정하여야 할 것이다. 사카로마이세스 세레비시아 발효추출물과 락토바실러스 델브루엑키 발효추출물외 아스퍼질러스 오리제 발효추출물에서도 상당한 α-글리코시다아제 활성을 억제하였지만 이들 추출물보다 훨씬 낮았다.

도 10에 발효방법과 발효시간에 따른 발효물의 α-글리코시다아제 활성억제능을 나타냈다.

각 시료의 α-글리코시다아제 활성억제능은 SF-SE 5일, SF-E 3일, SF-SD 3일, SF-E 7일, SF-E 5일, 대조군, SF-SD 7일, SF-SE 3일,SF-SE 7일 및 SF-SD 5일에서 각각 17.7%, 17.3%, 15.9%, 14.2%, 13.3%, 11.6%, 11.3%, 10.6%, 9.3% 및 4.7%로 나타났다.

실시예 5-2: SD 렛 ( rat) 을 이용한 시료의 항당뇨실험 (제1형 당뇨)

수컷 SD rat (6~7 weeks, 300~350 g)을 Samtako (오산시)로부터 구입하여 표준사료 시트레이트 버퍼 (Citrate buffer)의 제조는 다음과 같이 하였다. 즉, 0.01M 시트르산 (citric acid) 25.5 mL와 (Samtako)를 먹이면서 온도 (23±2℃)와 습도 (50±10%)가 조절되는 시설 (12 hr light-and-dark cycle control system)에서 1주일간 환경적응시키고 평균몸무게별로 그룹을 지정하였다. 사육 7일이 지난 다음, 10시간 절식 후 SD rat의 복강에 1 mL STZ (Streptozotocin) [65 mg/kg body weight; STZ 용액은 0.01 M 시트레이트 버퍼 (pH 4h)를 사용하여 사용 전에 제조하여 얼음 위에 보관]를 주사하였다. 이때 사용한 pH 4.6 0.01 M 시트르산나트륨수화물 (sodium citrate dihydrate) 24.5 mL를 혼합한 후 100 mL로 보정하였으며 syringe filter (0.22 ㎛)로 여과하고 pH 4.6으로 보정 후 냉동 보관하여 사용하였다.

STZ투여 후 4시간 동안은 물과 사료를 공급하지 않았고 4시간이 지난 후에 다시 공급하였으며, 72시간이 지난 다음 혈당을 측정 (10시간 공복혈당)하여 250 mg/dL 이상인 동물을 당뇨병 렛 (diabetic rat)으로 간주하였다.

STZ투여 후 일주일 간 실험시작 전 까지는 자유 식이를 하였고, 공복 (10시간) 후 시료를 경구투여 하고 30분 후 글루코오스 (3 g/kg)를 증류수 (1 mL)에 녹여 경구 투여하였다. 글루코오스는 40℃ 항온수조에서 녹여 사용하였고, 각 시료의 농도는 대조군 (1 mL PBS), 사카로마이세스 세레비시아 발효추출물 (200 mg/kg) (각 처리당 6마리)을 경구투여 하였다. 시료처리 30분 후 1 mL 증류수에 용해한 글루코오스 (3 g/kg )를 경구투여 하였다. 글루코오스 투여 0, 30, 60, 120, 180 분 후에 꼬리 정맥으로부터 피를 뽑아 헤파린 처리된-배양튜브 (heparin-treated culture tubes)에 보관하여 혈당을 측정하였다.

STZ로 유도한 SD rats를 대상으로 산마늘 시료의 혈당농도를 측정하였다. 도 9에서 보는 바와 같이 산마늘 처리구는 혈당의 농도가 대조구에 비해 유의성 있게 낮게 나타났다. STZ유도 당뇨 SD rat는 처리후 30분에 혈당량이 급격히 증가하였고 그 증가 정도는 메트포르민 (metformin)<아스퍼질러스 오리제 발효추출물<락토바실러스 델브루엑키 발효추출물< 사카로마이세스 세레비시아 발효추출물<무발효추출물<대조군 (control)의 순으로 나타났다. 그러나 30분 경과 후부터 모든 처리구에서 혈당량은 감소하였고, 특히 120분이 지난 후 사카로마이세스 세레비시아 발효추출물과 락토바실러스 델브루엑키 발효추출물의 혈당감소가 두드러져 당뇨치료제로 알려진 메트포르민 (metformin)과 거의 유사한 효과를 나타내었다. 이에 비해 발효를 하지 않은 조추출물의 경우는 대조구보다는 혈당감소가 관찰 되었지만 발효물에 비해서는 혈당감소에 크게 관여하지 않는 것으로 나타났다.

도 11에서 나타난 바와 같이, 스트렙토조토신 (Streptozotocin)으로 유도된 당뇨쥐를 대조군 (1 mL PBS), 대조군^* (70 % ethanol extractives), SF-SE 5일 (사카로마이세스 세레비시아 + α-허브자임을 모두 첨가한 발효물) 및 SF-E 3일 (미생물 없이 α-허브자임만을 첨가한 발효물) 처리구로 그룹을 지어 10시간 절식시킨 뒤 시료 (500mg/kg)처리하고 30분 후 글루코오스 (3g/kg)를 처리한 시간 (0분)을 기준으로 30, 60, 120, 180분 후의 혈당수치를 뺀 값을 수치화한 값으로 산마늘 처리구가 대조군에 비하여 초기 글루코오스의 흡수를 저해하는 결과를 나타내었다.

실시예 5-3: 플라즈마의 헤모글로빈 A1c ( HbAlc ) 분석

HbAlc은 HbA1c 마이크로 컬럼분석 (micro column assay) (Bio-Rad, Hercules, CA)로 분석하였다. 플라즈마 시료를 용해 (lysis) 용액 (0.6 M borate in a 2-N-morpholino ethanesulfonic acid buffer에 0.33% polyethoxyethanol 함유)에 혼합하였다. HbA1c은 Bio-Rad HbA1c 마이크로 컬럼 (weak cation exchange resin 함유)을 이용하여 다른 Hb로부터 분리하였다. HbAlc의 색깔을 550 nm에서 측정하였다(model DU 650 spectrophotometer). Data는 총 Hb에 대한 HbA1c의 백분율로 나타내었고, 상기 결과는 표 1에 나타나 있다.

실시예 5-4: 혈액 플라즈마 ( Blood plasma )의 글루코오스와 인슐린 함량 측정

글루코오스는 글루코오스 분석 키트 (glucose assay kit, Sigma-Aldrich), 인슐린 (insulin)은 효소결합면역흡착측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay kit, Mercodia, Uppsala, Sweden)로 분석하였다. 글루코오스의 흡광도는 540 nm, 인슐린의 흡광도는 450 nm에서 Anthos 2020 마이크로플레이트 오토리더 (microplate autoreader)를 이용하여 측정하였고, 상기 결과는 표 1에 나타나 있다.

표 1에 나타난 바와 같이, Db/db 마우스에 있어서 사카로마이세스 세레비시아 발효추출물과 락토바실러스 델브루엑키 발효추출물의 섭취는 공복혈당과 혈장 인슐린 농도를 유의적으로 감소시켰다 (P<0.05). 당화헤모글로빈 농도는 사카로마이세스 세레비시아 발효추출물과 락토바실러스 델브루엑키 발효추출물에서 감소하는 경향을 나타내었다. 당뇨치료에 있어서 가장 중요한 목표는 혈당조절로 사카로마이세스 세레비시아 발효추출물과 락토바실러스 델브루엑키 발효추출물의 활성성분은 공복 혈당을 낮추어 당뇨치료에 효과가 있음을 나타내었다.

실시예 5-5: 플라즈마의 콜레스테롤과 트리글리세리드 분석

총콜레스테롤 (Total cholesterol) 함량은 EnzyChrom^T콜레스테롤 분석키트 (BioAssay Systems, Hayward, CA)로, 트리글리세리드 (triglyceride) 함량은 EnzyChrom^T트리글리세리드 분석키트 (BioAssay Systems)로 분석하였다. 흡광도는 model DU 650 스펙트로포토메터 (spectrophotometer)로 측정하였다.

표 2에 나타난 바와 같이, 혈장 중성지방 농도 및 콜레스테롤 농도는 사카로마이세스 세레비시아 발효추출물과 락토바실러스 델브루엑키 발효추출물의 처리군에서 낮은 경향을 나타내었다. 당뇨상태의 지질 농도 감소는 신장의 병변 및 관상 동맥질환 등의 당뇨합병증 예방에 도움이 된다고 알려져 있다. 따라서 사카로마이세스 세레비시아 발효추출물과 락토바실러스 델브루엑키 발효 추출물의 섭취는 당뇨 합병증인 심혈관계질환 및 신장의 병변 예방에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.

Claims

산마늘 발효물을 유효성분을 포함하며,
상기 산마늘 발효물은 산마늘을 α-허브자임으로 처리하여 효소반응시키는 단계; 상기 효소반응시킨 반응물을 사카로마이세스 세레비시아 및 락토바실러스 델브루엑키로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물과 배양시키는 단계; 상기 배양시킨 배양물을 추출하는 단계; 및 상기 추출한 추출물을 여과하고 농축하는 단계를 포함하여 제조된 것을 특징으로 하는, 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 산마늘은 산마늘 잎을 분말화시킨 것인, 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 α-허브자임의 처리는 산마늘을α-허브자임과 증류수를 가하여 40 내지 60℃에서 1 내지 3시간 효소반응시키는, 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 사카로마이세스 세레비시아는 사카로마이세스 세레비시아 KCCM50549 (Saccharomyces cerevisiae KCCM50549)를 포함하며, 상기 락토바실러스 델브루엑키는 락토바실러스 델브루엑키 변종 불가리쿠스 KCCM 35463 (L. delbrueckii subsp. bulgaricus KCCM 35463)를 포함하는, 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 산마늘 발효물은
산마늘을 α-허브자임으로 처리하고 증류수를 가하여 40 내지 60℃에서 1 내지 3시간 동안 1차 효소반응시키는 단계;
상기 1차 효소반응시킨 물질을 여과하고 다시 α-허브자임과 혼합하여 40 내지 60℃에서 1 내지 3시간 동안 2차 효소반응시키는 단계;
상기 2차 효소반응시킨 반응물을 사카로마이세스 세레비시아 KCCM50549 및 락토바실러스 델브루엑키 불가리쿠스 KCCM 35463로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물과 배양시키는 단계;
상기 배양시킨 배양물을 60 내지 80 부피% 에탄올 수용액으로 추출하는 단계; 및
상기 추출한 추출물을 여과하고 농축하는 단계;
를 포함하는, 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물.
삭제