KR20210108972A - 항페리오스틴 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20210108972A
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amino acid
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KR1020217022051A
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아리프 제타
존 프랜슨
아지 로버트 맥그레이
조엔 험
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베링거 잉겔하임 아이오 캐나다 인크.
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Abstract

본 출원에는 페리오스틴의 기능을 차단하는 항체가 기재되어 있다. 또한 본 출원에는 암을 치료하고 종양 면역 특성을 변형하는데 있어서의 이들의 용도가 기재되어 있다.

Description

항페리오스틴 항체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 12월 14일에 출원된 미국 가출원 62/779,996 및 2019년 9월 11일에 출원된 미국 가출원 62/899,075의 이익을 주장하며, 이들 모두는 전문이 본 출원에 참고로 포함된다.
페리오스틴 (POSTN)은 상피-간엽 이행 (epithelial-mesenchymal transition: EMT), 세포-기질 상호 작용 및 염증을 비롯한 많은 생리학적 과정에 관여하는 모세포 단백질이다. POSTN은 나쁜 예후와 관련이 있는 염증, 섬유증 질환 및 암을 비롯한 여러 병리학적 맥락에서 과발현된다. 암에서, POSTN은 전형적으로 암 관련 섬유아세포 (cancer associated fibroblast: CAF)와 같은 간질 세포에 의해 발현되지만, POSTN 발현은 암 개시 세포 (cancer initiating cell: CIC) 및 MDSC에서도 보고되었다. POSTN은 피브로넥틴 및 콜라겐과 같은 다른 모세포 단백질과 결합하여 세포외 재형성을 조절하고 인테그린 수용체 리간드로서 작용하여 세포 생존, 이동/침습, EMT, 혈관신생 및 면역세포의 동원을 촉진한다. POSTN은 면역 배제 (immune exclusion)를 촉진하고 종양 침윤 골수성 세포에 의한 면역억제를 증가시킴으로써 항종양 면역을 억제하는 것을 포함하여 암 생물학의 여러 양태에서 작용함으로써 종양 성장 및 진행을 유도하는 것으로 가정된다.
인테그린 매개성 세포 부착과 같은 페리오스틴 기능을 억제하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 이러한 항체는 암 치료에 유용하다. 본 출원에서 기재되는 항페리오스틴 항체는 종양의 콜라겐 함량을 감소시키고, 과립구 세포 및 종양 관련 대식 세포와 같은 억제성 골수성 세포 집단의 침윤을 감소시키면서 M1 표현형으로의 대식 세포 분극화를 증가시키고, 종양 침윤 T 세포의 축적 및 항종양 특성을 증가시킨다.
페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 기재되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1); 서열 번호 2 (ISAYNGNT), 서열 번호 3 (ISAYSGNT), 서열 번호 4 (ISAYQGNT), 서열 번호 5 (ISAYTGNT) 또는 서열 번호 6 (ISAYDGNT) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2); 서열 번호 7 (DILVVPFDY), 서열 번호 8 (DVLVVPFDY) 또는 서열 번호 9 (DMLVVPFDY) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3); 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1); 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1); 서열 번호 2 (ISAYNGNT)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2); 서열 번호 9 (DMLVVPFDY)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3); 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1); 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사람, 키메라 또는 사람화된 것이다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG 항체이다. 특정 실시 형태에서, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이는 EU 넘버링 시스템에 따른 IgG4의 N434A, N434H, T307A/E380A/N434A, M252Y/S254T/T256E, 433K/434F/436H, T250Q, T250F, M428L, M428F, T250Q/M428L, N434S, V308W, V308Y, V308F, M252Y/M428L, D259I/V308F, M428L/V308F, Q311V/N434S, T307Q/N434A, E258F/V427T, S228P, L235E, S228P/L235E/R409K, S228P/L235E, K370Q, K370E, G446의 결실, K447의 결실 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 또는 이의 세트를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이는 EU 넘버링 시스템에 따른 IgG4의 S228P, F234A 및 L235A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, F(ab)2, 단일 도메인 항체 또는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)이다. 일부 실시 형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하며: 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 상기 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기의 아미노산은 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이고, 상기 서열 번호 13의 100번 아미노산 잔기의 아미노산은 메티오닌, 이소류신 또는 발린이다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 페리오스틴에 대한 특이 결합을 위해 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기 중의 적어도 하나를 필요로 한다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 페리오스틴에 대한 특이 결합을 위해 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기 중의 적어도 2, 3, 4 또는 5개를 필요로 한다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 페리오스틴에 대한 특이 결합을 위해 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기 중의 적어도 전부를 필요로 한다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 피하 투여용으로 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 종양내 투여용으로 제형화된다. 종양의 콜라겐 함량을 감소시키기는데 사용하기 위한 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물은 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, 상기 암은 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 또는 폐암을 포함한다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 종양의 콜라겐 함량을 감소시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 종양 중의 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 종양에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출에 의해 측정되는 종양에서의 CD8+ T 세포의 기능을 증가시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 치료학적 유효량의 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암을 치료하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 암은 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 또는 폐암을 포함한다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 종양의 콜라겐 함량을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 종양에서 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 개체에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 개체의 종양에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 개체에서 CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출에 의해 측정되는 종양에서의 CD8+ T 세포의 기능을 증가시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 암을 치료하기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 암은 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 또는 폐암을 포함한다.
면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 본 출원에서 기재되며: 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 상기 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기는 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이고, 상기 서열 번호 13의 100번 아미노산 잔기는 메티오닌, 이소류신 또는 발린이다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사람 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG 항체이다. 특정 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이는 EU 넘버링 시스템에 따른 IgG4의 N434A, N434H, T307A/E380A/N434A, M252Y/S254T/T256E, 433K/434F/436H, T250Q, T250F, M428L, M428F, T250Q/M428L, N434S, V308W, V308Y, V308F, M252Y/M428L, D259I/V308F, M428L/V308F, Q311V/N434S, T307Q/N434A, E258F/V427T, S228P, L235E, S228P/L235E/R409K, S228P/L235E, K370Q, K370E, G446의 결실, K447의 결실 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 또는 이의 세트를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이는 EU 넘버링 시스템에 따른 IgG4의 S228P, F234A 및 L235A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, F(ab)2, 단일 도메인 항체 또는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)이다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 피하 투여용으로 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 종양내 투여용으로 제형화된다. 종양의 콜라겐 함량을 감소시키는데 사용하기 위한 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물은 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, 상기 암은 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암 또는 폐암을 포함한다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 종양의 콜라겐 함량을 감소시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 종양의 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 종양에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출에 의해 측정되는 종양에서의 CD8+ T 세포의 기능을 증가시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 치료학적 유효량의 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암을 치료하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 암은 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 또는 폐암을 포함한다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 종양의 콜라겐 함량을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 종양에서 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 개체에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 개체에서 종양의 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 개체에서 CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출에 의해 측정되는 종양에서의 CD8+ T 세포의 기능을 증가시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 암을 치료하기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 암은 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암 또는 폐암을 포함한다.
페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 본 출원에서 기재되며, 여기서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 페리오스틴에 결합될 때, 페리오스틴의 파시클린 (Fasciclin) 2 (FAS2) 도메인에 결합된다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 페리오스틴 (서열 번호 15)의 276 내지 302번 아미노산 잔기를 포함한 그 사이의 임의의 잔기에 결합된다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 페리오스틴에 결합될 때, 페리오스틴 (서열 번호 15)의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 적어도 하나에 결합된다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 페리오스틴에 결합될 때, 페리오스틴 (서열 번호 15)의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 2, 3, 4 또는 5개에 결합된다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 페리오스틴에 결합될 때, 페리오스틴 (서열 번호 15)의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 전부에 결합된다. 일부 실시 형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하며: 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 상기 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기는 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이고, 상기 서열 번호 13의 100번 아미노산 잔기는 메티오닌, 이소류신 또는 발린이다. 일부 실시 형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1); 서열 번호 2 (ISAYNGNT), 서열 번호 3 (ISAYSGNT), 서열 번호 4 (ISAYQGNT), 서열 번호 5 (ISAYTGNT) 또는 서열 번호 6 (ISAYDGNT) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2); 서열 번호 7 (DILVVPFDY), 서열 번호 8 (DVLVVPFDY) 또는 서열 번호 9 (DMLVVPFDY) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3); 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1); 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 항체는 사람 폐 섬유아세포 및/또는 마우스 섬유아세포를 사용하여 수행된 세포 부착 검정에서 약 50 나노몰 미만의 IC50을 갖는다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 피하 투여용으로 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물은 종양내 투여용으로 제형화된다. 종양의 콜라겐 함량을 감소시키는데 사용하기 위한 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물은 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, 상기 암은 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암 또는 폐암을 포함한다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 종양의 콜라겐 함량을 감소시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 종양의 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 종양의 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출에 의해 측정되는 종양에서의 CD8+ T 세포의 기능을 증가시키는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 치료학적 유효량의 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암을 치료하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 암은 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암 또는 폐암을 포함한다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 종양의 콜라겐 함량을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 종양에서 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 개체에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 개체의 종양에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출에 의해 측정되는 종양에서의 CD8+ T 세포의 기능을 증가시키기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는 암을 치료하기 위한 조성물을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 암은 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암 또는 폐암을 포함한다.
본 출원에서 기재되는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중의 어느 하나를 인코딩하는 핵산이 또한 본 출원에서 기재된다.
상기한 핵산을 포함하는 세포주가 또한 본 출원에서 기재된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포주는 중국 햄스터 난소 세포주이다. 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나의 발현 및 분비를 허용하기에 충분한 조건하에서 상기 세포주를 세포 배양 배지에서 인큐베이션하는 단계를 포함하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다.
본 출원에서 기재되는 신규한 특징들은 첨부된 청구 범위에서 구체적으로 제시된다. 본 출원에서 기재되는 특징들 및 특징들의 장점에 대한 더 나은 이해는 본 출원에서 기재되는 특징들의 원리가 사용되는 예시적인 실시예를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 수득될 것이다:
도 1은 500 nM의 단일 농도에서 시험된 78개의 서열 고유 IgG에 의한 페리오스틴 (POSTN) 매개성 세포 부착의 억제를 예시한 것이다.
도 2는 NB0828 또는 비히클 대조군으로 처리한 후 마우스 MB49 방광암 모델에서의 종양 성장을 예시한 것이다.
도 3은 NB0828 처리가 종양내 골수성 세포의 축적에 미치는 영향을 예시한 것이다. MB49 종양 보유 마우스를 도 2에 기재된 바와 같이 NB0828 또는 비히클로 처리하였다. 데이터는 총 CD45+ 면역 침윤의 퍼센트로서 제시된다.
도 4는 NB0828로 처리한 후 총 종양 콜라겐 함량의 변화를 예시한 것이다. MB49 종양 보유 마우스를 도 2에 기술된 바와 같이 처리하고, 종점 MB49 종양의 총 종양 콜라겐 함량을 방법에서 기재된 바와 같이 평가하였다.
도 5는 NB0828 또는 비히클 대조군으로 처리한 후 마우스 CT26 결장암 모델에서의 종양 성장을 예시한 것이다.
도 6은 NB0828 처리된 CT26 종양 보유 마우스에서 과립구 세포/TAM (종양 관련 대식 세포)의 감소된 종양내 축적 및 M1 표현형으로 편위된 대식 세포를 예시한 것이다.
도 7은 NB0828 처리된 CT26 종양 보유 마우스에서 CD8+ 및 CD4+ 종양 침윤 림프구 (TIL)의 증가된 축적 및 향상된 CD8+ TIL 기능을 예시한 것이다.
도 8은 NB0828 또는 비히클 대조군으로 처리한 후 마우스 MC38 결장암 모델에서의 종양 성장을 예시한 것이다.
도 9a~9d는 MC38 결장암 모델에서 NB0828이 종양 관련 대식 세포 (9a)의 전체 양을 감소시키는 반면 전염증성 I형 대식 세포 (9b) 및 CD8+ T 세포 (9c)의 빈도를 증가시키고 NB0828 종양 효능이 CD8+ T 세포 (9d)에 의존적이다는 것을 예시한 것이다.
도 10은 에피토프 맵핑 연구를 위한 형질전환 성장 인자 베타 유도된 단백질 (BIGH3)/페리오스틴 키메라를 생성하기 위한 개략도를 예시한 것이다.
도 11a~11c는 페리오스틴의 FAS2 도메인에 대한 NB0828 결합을 예시한 것이다. 도 11a는 도 10에서 생성된 키메라 단백질에 대한 NB0828 결합을 예시한 것인 반면 도 11b 및 11c는 POSTN EMI-FAS4의 FAS2 도메인에서 알라닌 돌연변이에 대한 NB0828 결합을 예시한 것이다.
도 12는 NB0828 에피토프의 위치가 박스로 표시되어 하반부에 확대되어 있는 이량체 POSTN EMI-FAS4의 결정 구조를 예시한 것이다.
도 13a 및 13b는 페리오스틴에 대한 사람 테나신 C의 결합 EC80 및 NB0828 기능 차단 활성 (13a), 및 페리오스틴에 대한 사람 I형 콜라겐의 결합 EC80 및 NB0828 기능 차단 활성 (13b)을 예시한 것이다.
도 14a는 면역 조직 화학으로 측정한 다양한 종양 유형에서의 페리오스틴 발현의 우세도 (prevalence)를 예시한 것이다.
도 14b는 페리오스틴 저, 중, 고 발현 유방암 샘플에 대한 IHC 염색의 대표적인 묘사를 도시한 것이다.
페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 기재되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1); (b) 서열 번호 2 (ISAYNGNT), 서열 번호 3 (ISAYSGNT), 서열 번호 4 (ISAYQGNT), 서열 번호 5 (ISAYTGNT) 또는 서열 번호 6 (ISAYDGNT) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2); (c) 서열 번호 7 (DILVVPFDY), 서열 번호 8 (DVLVVPFDY) 또는 서열 번호 9 (DMLVVPFDY) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3); (d) 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1); (e) 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및 (f) 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)를 포함한다.
페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에기재되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1); (b) 서열 번호 16 (ISAYXGNT)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2); (c) 서열 번호 17 (DXLVVPFDY)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3); (d) 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1); (e) 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및 (f) 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3) 중 어느 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개를 포함하며, 여기서, X는 임의의 아미노산 잔기이다.
면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 기재되며, (a) 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 여기서, 상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기는 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이거나, 상기 서열 번호 13의 100번 아미노산 잔기는 메티오닌, 이소류신 또는 발린이다.
면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 기재되며: (a) 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 여기서, 상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는, 페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 기재되며: (a) 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 서열 번호 13에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 여기서, 상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 서열 번호 14에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
페리오스틴의 파시클린 2 (FAS2) 도메인에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 페리오스틴에 결합될 때 서열 번호 15의 아미노산 276 내지 302로부터 선택된 아미노산 잔기와 접촉한다. 특정 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 페리오스틴에 결합될 때 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 아미노산 잔기 중 하나와 접촉한다.
하기 설명에서, 특정 구체적인 세부사항은 다양한 실시 형태들에 대한 완전한 이해를 제공하기 위해 제시된다. 그러나, 당해 분야의 통상의 기술자는 제공된 실시 형태들이 이러한 세부사항 없이도 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 문맥이 달리 요구하지 않는다면, 하기 명세서 및 청구 범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다 (comprise)" 및 이의 변형, 예를 들어, "포함한다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)"은 개방적이고 포괄적인 의미로, 즉 "포함하지만, 이에 한정되지 않는 (including, but not limited to)" 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는다면 복수의 지시 대상을 포함한다. 또한, "또는"이라는 용어는 일반적으로 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는다면 "및/또는 (and/or)"을 포함하는 의미로 사용된다는 것에 유의해야 한다. 또한, 본 출원에서 제공되는 표제는 편의를 위한 것이며 청구된 실시 형태의 범위 또는 의미를 해석하지 않는다.
본 출원에서 사용되는 "약"이라는 용어는 10% 이하까지 명시된 양 부근의 양을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "개체 (individual)", "환자 (patient)" 또는 "대상체 (subject)"라는 용어는는 기술된 조성물 및 방법이 치료에 유용한 적어도 하나의 질병으로 진단되거나 질병에 걸린 것으로 의심되거나, 질병을 발병할 위험이 있는 개체를 지칭한다. 특정 실시 형태에서, 상기 개체는 포유 동물이다. 특정 실시 형태에서, 상기 포유 동물은 마우스, 래트, 래빗, 개, 고양이, 말, 암소, 양, 돼지, 염소, 라마, 알파카 또는 야크이다. 특정 실시 형태에서, 상기 개체는 사람이다.
본 출원에서 사용되는 "치료하다 (treat)" 또는 "치료하는 (treating)"이라는 용어는 상기 생리학적 또는 질병 상태와 관련된 적어도 하나의 징후 또는 증상을 개선하도록 설계되거나 의도된 개체의 생리적 또는 질병 상태에 대한 개입을 지칭한다. 통상의 기술자는 질병에 걸린 이종 개체군을 고려할 때, 모든 개체가 주어진 치료에 대해 똑같이 반응하거나 또는 전혀 반응하지 않지 않을 것이다는 것을 인지할 것이다. 개체는 객관적인 반응 기준에 관계없이 치료되는 것으로 간주된다.
제공된 항체 중에는 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이 항체 (예를 들어, 이중특이 항체 및 다중반응 항체) 및 항체 단편이 있다. 항체는 항체-컨쥬게이트 및 키메라 분자와 같은 항체를 포함하는 분자를 포함한다. 따라서, 항체는 전장 및 천연 항체 뿐만 아니라 이의 결합 특이성을 보유하는 이의 단편 및 부분, 예를 들어, 임의의 수의 면역글로불린 클래스 및/또는 이소타입을 포함하는 이의 임의의 특정 결합 부분 (예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE 및 IgM); 및 Fab, F(ab')2, Fv, 및 scFv (단일 쇄 또는 관련 엔티티)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 생물학적으로 관련된 (항원 결합) 단편 또는 이들의 특정 결합 부분을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 단클론 항체는 일반적으로 실질적으로 균질한 항체의 조성물 내에 있는 것이며; 따라서, 단클론 항체 조성물 내에 포함된 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 다클론 항체는 일반적으로 둘 이상의 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시되는 다양한 서열의 상이한 항체를 포함하는 제제이다. 단클론 항체는 사람 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 단클론 항체는 사람 IgG4 불변 영역을 포함할 수 있다.
"항체"라는 용어는 본 출원에서 가장 넓은 의미로 사용되며 온전한 항체 및 단편 항원 결합 (Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 단일 쇄 가변 단편 (sFv 또는 scFv)을 포함한 단일 쇄 항체 단편, 및 단일 도메인 항체 (예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함한 이의 기능적 (항원 결합) 항체 단편을 포함하는 다클론 및 단클론 항체를 포함한다. 상기 용어는 면역글로불린의 유전자 조작된 및/또는 달리 변형된 형태, 예를 들어, 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 사람 항체, 사람화 항체 및 헤테로컨쥬게이트 항체, 다중특이적, 예를 들어, 이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디, 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한면, "항체"라는 용어는 이의 기능적 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 하위 클래스, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함한 모든 클래스 또는 하위 클래스의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포함한다. 항체는 사람 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 항체는 사람 IgG4 불변 영역을 포함할 수 있다.
"초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어인 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"이라는 용어는 항원 특이성 및/또는 결합 친화성을 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비연속 서열을 지칭하는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 각 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) 및 각 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 있다. "프레임워크 영역" 및 "FR"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 비-CDR 부분을 지칭하는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 각 전장 중쇄 가변 영역에 4개의 FR (FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4), 및 각 전장 경쇄 가변 영역에 4개의 FR (FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4)이 있다. 주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme)], [Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" numbering scheme]); [MacCallum et al., J. Mol . Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol . Biol. 262, 732-745. ("Contact" numbering scheme)]; [Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27 (1):55-77 ("IMGT" numbering scheme)]; [Honegger A and Plukthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309 (3):657-70, ("Aho" numbering scheme)]; 및 [Whitelegg NR and Rees AR, "WAM: an improved algorithm for modelling antibodies on the WEB," Protein Eng.　2000 Dec;13 (12):819-24 ("AbM" numbering scheme]에 기술된 것들을 포함한 다수의 널리 공지된 방식 중의 어느 것을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별에 사용되는 방식에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Kabat 방식은 구조적 정렬을 기반으로 하는 반면, Chothia 방식은 구조 정보를 기반으로 한다. Kabat 및 Chothia 방식 둘 다에 대한 넘버링은 삽입 문자, 예를 들어, "30a"에 의해 제공된 삽입 및 일부 항체에서 보이는 결실을 갖는 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이를 기반으로 한다. 두 방식은 상이한 위치에 특정 삽입 및 결실 ("indel")를 배치하여 차등 넘버링을 초래한다. 접촉 방식은 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 하며, Chothia 넘버링 방식과 여러 면에서 유사하다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이라는 용어는 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 CDR을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 항원에 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; [Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 참조).
제공된 항체 중에는 항체 단편이 있다. "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원을 결합시키는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv 또는 sFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이 항체를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시 형태에서, 항체는 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 단일 쇄 항체 단편, 예를 들어, scFv이다.
"특이적 결합" 또는 "결합"이라는 용어는, 본 출원에서 사용되는 경우, 언급된 항체 또는 단편의 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 언급된 항체 또는 단편의 하나 이상의 가변 영역 아미노산 잔기에 의해 매개되는 결합을 지칭한다. 본 출원에서 사용되는 "접촉하다 (contact)" 또는 "접촉한다 (contacts)"라는 용어는, 항체 결합 또는 특정 표적에 결합되는 것과 관련하여, 인용된 접촉 잔기의 5, 4, 3 또는 그 이하의 옹스트롬 내에 드는 가변 영역 또는 CDR의 아미노산 잔기를 지칭한다. 접촉은 항체의 가변 영역 또는 CDR의 아미노산 잔기와 언급된 잔기 사이의 수소 결합, 반 데르 발스 상호 작용 및 염 브릿지 형성을 포함한다.
항체 단편은 온전한 항체의 단백질 분해 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체는 합성 링커, 예를 들어, 폴리펩타이드 링커에 의해 결합된 2개 이상의 항체 영역 또는 쇄를 갖는 것 및/또는 자연 발생 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생산되지 않는 것과 같은 자연적으로 발생하지 않는 배열을 포함하는 단편과 같은 재조합적으로 생산된 단편이다. 일부 양태에서, 항체 단편은 scFv이다.
"사람화" 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비-사람 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 사람 FR로부터 유래되는 항체이다. 사람화 항체는 임의로 사람 항체로부터 유래되는 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비-사람 항체의 "사람화 형태"는 부모 비-사람 항체의 특이성과 친화성을 보유하면서 전형적으로 사람에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 사람화를 겪은 비-사람 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 사람화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복시키거나 개선하기 위해 비-사람 항체로부터의 상응하는 잔기 (예를 들어, CDR 잔기가 유도되는 항체)로 치환된다.
제공된 항체 중에는 사람 항체가 있다. "사람 항체"는 사람 항체 라이브러리를 포함하는 사람 항체 레퍼토리 또는 다른 사람 항체 인코딩 서열을 이용하는 사람 또는 사람 세포 또는 비-사람 공급원에 의해 생산되는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 상기 용어는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR이 비-사람인 것과 같은 비-사람 항원 결합 영역을 포함하는 비-사람 항체의 사람화 형태를 배제한다.
사람 항체는 온전한 사람 항체 또는 항원 챌린지에 대한 반응으로 사람 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 유전자이식 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 사람 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하며, 이것은 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합된다. 이러한 유전자이식 동물에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 사람 항체는 또한 파지 디스플레이를 포함하는 사람 항체 라이브러리 및 사람 레퍼토리로부터 유래된 항체 인코딩 서열을 함유하는 세포 비함유 라이브러리로부터 유래되거나 선택될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 사람 항체는 파지 디스플레이와 같은 방법에 의한 연속 라운드의 선택에 의해 서열 책임 (sequence liabilities)이 제거되고 이의 친화성이 증가될 수 있다.
"폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환 가능하게 사용되며 최소 길이로 제한되지 않는다. 제공된 항체 및 항체 쇄 및 다른 펩타이드, 예를 들어, 링커 및 결합 펩타이드를 포함한 폴리펩타이드는 천연 및/또는 비-천연 아미노산 잔기를 포함한 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 단백질이 목적하는 활성을 유지하는 한 천연 또는 자연 서열과 관련한 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 부위 지정 돌연변이유발을 통해서와 같이 고의적일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통해서와 같이 우발적일 수 있다.
특정 실시 형태에서, 감소된 이펙터 기능을 갖는 항체가 본 출원에서 제공된다. 본 출원에서 사용되는 "이펙터 기능"이라는 문구는 FcγR에 결합시 Fc 함유 단백질에 의해 부여된 기능적 능력을 포함하는 것으로 의도된다. 어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, Fc/FcγR 복합체의 형성은 결합된 항원의 부위에 다양한 이펙터 세포를 동원하여, 전형적으로 세포 내에서 다양한 신호 전달 이벤트와 중요한 후속적인 면역 반응을 초래한다. 이펙터 기능은 항체 의존성 세포성 세포독성 및 보체 의존적 세포독성 둘 다를 지칭한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합은 결여되지만 (따라서 ADCC 활성도 결여될 가능성이 있음) FcRn 결합 활성은 보유하는 것을 보장하기 위해 수행될 수 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적인 예는 미국 특허 US 5,500,362 및 US 5,821,337에 기재되어 있다. 대안으로, 비-방사성 검정 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, ACTI™ 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정). 이러한 검정을 위한 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 단핵구, 대식 세포 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다.
참조 폴리펩타이드 서열에 대한 서열 동일성 퍼센트 (%)는 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 그리고 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고서, 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후 참조 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율이다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하려는 목적을 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 공지된 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 알고리즘을 포함하여 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본 출원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었으며 소스 코드는 워싱턴 D.C., 20559에 소재하는 미국 저작권 사무소에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기서, 이것은 미국 저작권 등록 번호 제TXU510087호로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재하는 Genentech, Inc.로부터 공개적으로 이용 가능하거나, 소스 코드에서 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 운영 체제에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, (주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 대안으로 표현될 수 있는) 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %는 다음과 같이 계산된다: 분수 X/Y의 100배, 여기서, X는 A와 B의 그 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치로 채점된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 인지할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는다면, 본 출원에서 사용되는 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에서 제공되는 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 변이체는 전형적으로 하나 이상의 치환, 결실, 추가 및/또는 삽입에 있어서 본 출원에 구체적으로 개시된 폴리펩타이드와 상이하다. 이러한 변이체는 자연 발생적일 수 있거나, 예를 들어, 본 발명의 상기 폴리펩타이드 서열 중 하나 이상을 변형시키고 본 출원에서 기재되는 바와 같이 및/또는 다수의 공지된 기술을 사용하여 폴리펩타이드의 하나 이상의 생물학적 활성을 평가함으로써 합성적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적당한 변형을 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물이 목적하는 특성, 예를 들어, 항원 결합을 갖는다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환에 의한 돌연변이 유발을 위한 관심 부위는 CDR 및 FR을 포함한다. 아미노산 치환은 목적하는 활성, 예를 들어, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC를 위해 관심 항체 및 스크리닝된 산물에 도입될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 하나 이상의 CDR 내에서 일어날 수 있으며, 여기서 치환, 삽입 또는 결실은 항원에 대한 항체 결합을 실질적으로 감소시키지 않는다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보전적 치환이 CDR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟"의 외부에 있을 수 있다. 변이체 VH 및 VL 서열의 일부 실시 형태에서, 각각의 CDR은 변경되지 않는다.
변경 (예를 들어, 치환)은, 예를 들어, 항체 친화성을 개선하기 위해 CDR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 체세포 성숙 동안 높은 돌연변이율을 갖는 코돈을 인코딩하는 CDR에서 이루어질 수 있으며 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 생성된 변이체는 결합 친화성에 대해 시험될 수 있다. 친화성 성숙 (예를 들어, 오류가 발생하기 쉬운 PCR, 쇄 셔플링, CDR의 무작위화, 또는 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발을 사용함)은 항체 친화성을 개선하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2001)] 참조). 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)] 참조). 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다. 대안으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 포함하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입 및 결실은 하나의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입 및 결실을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 폴리펩타이드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다. 항체 분자의 서열내 삽입 변이체의 예는 경쇄에 3개 아미노산의 삽입을 포함한다. 말단 결실의 예는 경쇄의 말단에 7개 이하의 아미노산의 결실을 갖는 항체를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항체는 (예를 들어, 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써) 이들의 글리코실화를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포로부터의 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N 결합에 의해 부착된 분지형 바이안테너리 (biantennary) 올리고당을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조). 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 시알산, 바이안테너리 올리고당 구조의 줄기에서 GlcNAc에 부착된 푸코스일 수 있다. 예를 들어, 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 항체에서 올리고당의 변형이 이루어질 수 있다. 항체 글리코실화 변이체는 개선된 ADCC 및/또는 CDC 기능을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65%, 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 Asn297에 부착된 모든 당구조의 합에 비해 Asn297에서의 당 사슬 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다 (예를 들어, 국제공개공보 WO 08/077546 참조). Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭한다 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링; 예를 들어, 문헌 [Edelman et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May; 63 (1):78-85] 참조). 그러나, Asn297은 또한 항체의 사소한 서열 변이로 인해 위치 297의 상류 또는 하류 약 ±3개 아미노산에, 즉 294와 300번 위치 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); and Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)] 참조). 세포주, 예를 들어, 녹아웃 세포주 및 이들의 사용방법은 탈푸코실화된 항체, 예를 들어, 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 및 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 (FUT8) 녹아웃 CHO 세포를 생산하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem . Biophys. 249:533-545 (1986)]; [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; [Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng., 94 (4):680-688 (2006)] 참조). 다른 항체 글릴코실화 변이체가 또한 포함된다 (예를 들어, 미국 특허 US 6,602,684 참조).
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본 출원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 본 출원에서 Fc 영역은 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역이다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 사람 Fc 영역 서열 (예를 들어, 사람 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
항체는 증가된 반감기와 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 개선된 결합을 가질 수 있다 (예를 들어, 미국 출원공개 US 2005/0014934 참조). 이러한 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있고, Fc 영역 잔기 중의 하나 이상에 치환을 가진 것을 포함한다: EU 넘버링 시스템에 따라 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 (예를 들어, 미국 특허 US 7,371,826 참조). Fc 영역 변이체의 또 다른 예가 또한 고려된다 (예를 들어, 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 US 5,648,260 및 5,624,821; 및 국제공개공보 WO 94/29351 참조).
일부 실시 형태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근 가능한 부위에서 발생한다. 반응성 티올 그룹은 면역 컨쥬게이트를 생성하기 위해 약물 모이어티 (moiety) 또는 링커 약물 모이어티와 같은 다른 모이어티에 컨쥬게이션하기 위한 부위에 위치할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 다음 잔기 중의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링).
일부 실시 형태에서, 본 출원에 제공된 항체는 공지되고 이용 가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리 (n 비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있으며, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 두 개 이상의 중합체가 부착된 경우 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다.
본 출원에서 기재되는 항체는 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 핵산은 둘 이상의 뉴클레오티드 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 한 유형이다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 폴리펩타이드 인코딩 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달하는데 사용될 수 있는 벡터의 구성요소이다. 본 출원에서 사용되는 "벡터"라는 용어는 이것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 가지 유형은 게놈 통합 벡터 또는 "통합 벡터"이며, 이것은 숙주 세포의 염색체 DNA에 통합될 수 있다. 벡터의 또 다른 유형은 "에피솜" 벡터, 예를 들어, 염색체외 복제가 가능한 핵산이다. 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 본 출원에서는 "발현 벡터"라고 한다. 적합한 벡터는 플라스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 발현 벡터에서 프로모터, 인핸서, 전사 조절에 사용하기 위한 폴리아데닐화 신호와 같은 조절 요소는 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유도될 수 있다. 통상적으로 복제 원점에 의해 부여되는 숙주에서 복제하는 능력 및 형질전환체의 인식을 촉진하는 선택 유전자가 추가로 포함될 수 있다. 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 등과 같은 바이러스로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있다. 플라스미드 벡터는 염색체 위치로의 통합을 위해 선형화될 수 있다. 벡터는 정의된 위치 또는 게놈의 제한된 부위 세트로 부위 특이이적 통합을 지시하는 서열을 포함할 수 있다 (예를 들어, AttP-AttB 재조합). 추가로, 벡터는 수송 가능한 요소로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, 참조 서열에 대한 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 기술하기 위해 본 출원에서 사용될 때 "상동성인 (homologous)", "상동성 (homology)" 또는 "상동성 퍼센트 (percent homology)"라는 용어는 문헌 [Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, modified as in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993]에 기술된 식을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 식은 Altschul 등의 기본 로컬 정렬 검색 도구 (BLAST) 프로그램에 통합된다 (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). 서열의 상동성 퍼센트는 본 출원의 출원일 현재 BLAST의 최신 버전을 사용하여 결정될 수 있다.
본 출원에서 기재되는 항체를 인코딩하는 핵산은 핵산에 대한 이식유전자를 가진 적합한 세포를 감염, 형질 감염, 형질 전환 또는 달리 제공하는데 사용될 수 있으며, 따라서 상업적 또는 치료적 용도를 위한 항체의 생산을 가능하게 한다. 대규모 세포 배양으로부터 항체를 생산하기 위한 표준 세포주 및 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Li et al., "Cell culture processes for monoclonal antibody production." Mabs. 2010 Sep-Oct; 2 (5): 466-477]을 참조한다. 특정 실시 형태에서, 세포는 진핵 세포이다. 특정 실시 형태에서, 진핵 세포는 포유류 세포이다. 특정 실시 형태에서, 포유류 세포는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO) 세포, NS0 쥐과 동몰 골수종 세포 또는 PER.C6® 세포이다. 특정 실시 형태에서, 항체를 인코딩하는 핵산은 항체 생산에 유용한 세포의 게놈 유전자좌에 통합된다. 특정 실시 형태에서, 본 출원에는 항체의 생산 및 분비를 허용하기에 충분한 시험관내 조건하에서 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법이 기재되어 있다.
특정 실시 형태에서, (a) 게놈 위치에 통합된 본 출원에서 기재되는 항체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 포유 동물 세포주; 및 (b) 동결 보호제를 포함하는 마스터 세포 은행이 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 동결 보호제는 글리세롤, DMSO, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 마스터 세포 은행은 (a) 게놈 위치에서 통합된 (i) 서열 번호 13에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 중쇄 아미노산 서열; 및 (ii) 서열 번호 14에 제시된 것과 적어도 90% 동일한 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 CHO 세포주; 및 (b) 동결보호제를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 동결 보호제는 글리세롤, DMSO 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 마스터 세포 은행은 액체 질소에 의한 동결을 견딜 수 있는 적합한 바이알 또는 용기에 담겨 있다.
본 출원에서 기재되는 항체를 제조하는 방법이 또한 본 출원에서 기재된다. 이러한 방법은 항체의 발현 및 분비를 허용하기에 충분한 조건하에 세포 배양 배지에서 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포 또는 세포주를 인큐베이션하는 단계 및 추가로 세포 배양 배지로부터 항체를 수확하는 단계를 포함한다. 수확은 생세포, 세포 파편, 비-항체 단백질 또는 폴리펩타이드, 원하지 않는 염, 완충액 및 배지 성분을 제거하기 위한 하나 이상의 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 추가 정제 단계 (들)는 원심분리, 초원심분리, 투석, 탈염, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 또는 단백질 L 정제, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.
항페 리오스틴 항체
페리오스틴 (POSTN) 기능을 억제하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 이러한 항체는 암 치료에 유용하다. 본 출원에서 기재되는 항체는 종양의 콜라겐 함량을 감소시키고, 과립구 및 종양 관련 대식 세포의 침윤을 감소시키면서 M1 표현형으로의 대식 세포 분극화를 증가시키고, 종양 침윤 T 세포의 축적 및 항종양 특성을 증가시킨다. 특정 실시 형태에서, 항페리오스틴 항체는 비처리 또는 대조군 처리에 비해 종양 콜라겐 함량을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 감소시킨다. 특정 실시 형태에서, 항페리오스틴 항체는 비처리 또는 대조군 처리에 비해 과립구 및 종양 관련 대식 세포의 침윤을 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 감소시킨다. 특정 실시 형태에서, 항페리오스틴 항체는 비처리 또는 대조군 처리에 비해 CD11b+ 세포의 침윤을 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 감소시킨다. 특정 실시 형태에서, 항페리오스틴 항체는 비처리 또는 대조군 처리에 비해 M1 타입 (CD11b+, MHC 클래스 II+, CD206-)으로의 종양 관련 대식 세포의 분극화를 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 증가시킨다. 특정 실시 형태에서, 항페리오스틴 항체는 비처리 또는 대조군 처리에 비해 종양에서의 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 축적을 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 증가시킨다. 특정 실시 형태에서, 항페리오스틴 항체는 비처리 또는 대조군 처리에 비해 종양 침윤 CD8+ T 세포의 인터페론 감마의 생산을 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 증가시킨다.
페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 기재되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1); (b) 서열 번호 16 (ISAYXGNT)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2); (c) 서열 번호 17 (DXLVVPFDY)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3); (d) 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1); (e) 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 또는 (f) 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)을 포함하고; 여기서, X는 임의의 아미노산이다.
페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 기재되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1); (b) 서열 번호 16 (ISAYXGNT)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2); (c) 서열 번호 17 (DXLVVPFDY)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3); (d) 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1); (e) 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및 (f) 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)으로부터 선택된 어느 1, 2, 3, 4 또는 5개의 상보성 결정 영역을 포함하고; 여기서, X는 임의의 아미노산이다.
페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 출원에서 기재되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1); (b) 서열 번호 2 (ISAYNGNT), 서열 번호 3 (ISAYSGNT), 서열 번호 4 (ISAYQGNT), 서열 번호 5 (ISAYTGNT) 또는 서열 번호 6 (ISAYDGNT) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2); (c) 서열 번호 7 (DILVVPFDY), 서열 번호 8 (DVLVVPFDY) 또는 서열 번호 9 (DMLVVPFDY) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3); (d) 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1); (e) 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및 (f) 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 사람, 사람화 또는 키메라 항체이다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 IgG 항체이다. 특정 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 이펙터 기능이 결여되거나 감소된 Fc 부분을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 사람 폐 섬유아세포 및/또는 마우스 섬유아세포를 사용하여 수행된 세포 부착 검정에서 약 50 나노몰 미만의 IC50을 갖는다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 사람 폐 섬유아세포 및/또는 마우스 섬유아세포를 사용하여 수행된 세포 부착 검정에서 약 40 나노몰 미만의 IC50을 갖는다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 사람 폐 섬유아세포 및/또는 마우스 섬유아세포를 사용하여 수행된 세포 부착 검정에서 약 30 나노몰 미만의 IC50을 갖는다.
재조합 항체 또는 항원 결합 단편이 또한 본 출원에서 기재되며, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1); (b) 서열 번호 2 (ISAYNGNT)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2); (c) 서열 번호 9 (DMLVVPFDY)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3); (d) 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1); (e) 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및 (f) 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 사람, 사람화 또는 키메라 항체이다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 IgG 항체이다. 특정 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 이펙터 기능이 결여되거나 감소된 Fc 부분을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 사람 폐 섬유아세포 및/또는 마우스 섬유아세포를 사용하여 수행된 세포 부착 검정에서 약 50 나노몰 미만의 IC50을 갖는다. 특정 실시 형태에서, 항체는 사람 폐 섬유아세포 및/또는 마우스 섬유아세포를 사용하여 수행된 세포 부착 검정에서 약 40 나노몰 미만의 IC50을 갖는다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 사람 폐 섬유아세포 및/또는 마우스 섬유아세포를 사용하여 수행된 세포 부착 검정에서 약 30 나노몰 미만의 IC50을 갖는다.
면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 본 출원에서 기재되며: (a) 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 13에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 여기서, 상기 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 14에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 상기 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기는 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이고, 상기 서열 번호 13의 100번 아미노산 잔기는 메티오닌, 이소류신 또는 발린이다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 IgG 항체이다. 특정 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 이펙터 기능이 결여되거나 감소된 Fc 부분을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 사람 폐 섬유아세포 및/또는 마우스 섬유아세포를 사용하여 수행된 세포 부착 검정에서 약 50 나노몰 미만의 IC50을 갖는다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 사람 폐 섬유아세포 및/또는 마우스 섬유아세포를 사용하여 수행된 세포 부착 검정에서 약 40 나노몰 미만의 IC50을 갖는다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 사람 폐 섬유아세포 및/또는 마우스 섬유아세포를 사용하여 수행된 세포 부착 검정에서 약 30 나노몰 미만의 IC50을 갖는다.
본 출원에서 기재되는 가변 영역 및 CDR 영역을 포함하는 항체 결합 영역은 이펙터 기능이 감소된 항체의 일부로서 적합하게 포맷될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 Fc 영역이 없는 F (ab')2일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 항체 의존성 세포성 세포독성 또는 보체 의존적 세포독성과 같은 이펙터 기능을 감소시키는 항체 중쇄의 불변 영역에 대한 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 IgG4 불변 영역을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이는 EU 넘버링 시스템에 따른 IgG4의 N434A, N434H, T307A/E380A/N434A, M252Y/S254T/T256E, 433K/434F/436H, T250Q, T250F, M428L, M428F, T250Q/M428L, N434S, V308W, V308Y, V308F, M252Y/M428L, D259I/V308F, M428L/V308F, Q311V/N434S, T307Q/N434A, E258F/V427T, S228P, L235E, S228P/L235E/R409K, S228P/L235E, K370Q, K370E, G446의 결실, K447의 결실 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 돌연변이 또는 이의 세트를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 EU 넘버링 시스템에 따라 중쇄의 S228P에 상응하는 돌연변이를 갖는 IgG4 불변 영역을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 EU 넘버링 시스템에 따라 중쇄의 S228P, F234A 및 L235A에 상응하는 돌연변이를 갖는 IgG4PAA 불변 영역을 포함할 수 있다. 문헌 [Parekh et al. "Development and validation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter gene assay." MAbs 2012 May 1; 4 (3): 310-318]을 참조한다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체에 비해 Clq에 대해 감소된 친화성을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 상기 항체는 상응하는 야생형 항체의 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 미만인 Clq 수용체에 대한 친화성을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체의 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30%, 적어도 20%, 적어도 10%, 또는 적어도 5% 미만인 Clq에 대한 친화성을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 약 100 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 10 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 1 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 100 μM인 Clq에 대한 친화성을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 1 μM 이상, 5 μM 이상, 10 μM 이상, 25 μM 이상, 50 μM 이상 또는 100 μM 이상인 Clq에 대한 친화성을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 Fc 항체에 비해 감소된 CDC 활성을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체의 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 미만인 CDC 활성을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체에 비해 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%), 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 100%, 또는 적어도 200%, 또는 적어도 300%, 또는 적어도 400%, 또는 적어도 500% 감소된 CDC 활성을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 검출 가능한 CDC 활성을 나타내지 않는다. 일부 실시 형태에서, CDC 활성의 감소 및/또는 제거는 Fc 리간드 및/또는 수용체에 대한 본 출원에서 기재되는 항체의 감소된 친화성에 기인할 수 있다.
생물학적 요법은 원치 않는 세포 및/또는 표적을 인식하고 공격하도록 면역계를 지시하는 복잡한 특성과 관련된 유해한 독성 문제를 가질 수 있는 것으로 당해 분야에서 이해된다. 치료가 필요한 곳에서 공격에 대한 인식 및/또는 표적화가 일어나지 않는 경우, 유해한 독성과 같은 결과가 발생할 수 있다. 예를 들어, 비-표적화된 조직의 항체 염색은 잠재적인 독성 문제를 나타낼 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체에 비해 비-표적화된 조직의 감소된 염색을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체의 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 미만인 비-표적화된 조직의 감소된 염색을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체에 비해 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 100%, 또는 적어도 200%, 또는 적어도 300%, 또는 적어도 400%, 또는 적어도 500% 감소된 비-표적화된 조직의 감소된 염색을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체에 비해 감소된 항체 관련 독성을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체의 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 미만인 독성을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체에 비해 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%), 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 100%, 또는 적어도 200%, 또는 적어도 300%, 또는 적어도 400%, 또는 적어도 500% 감소된 독성을 나타낸다.
생물학적 요법이 혈소판 응집에 악영향을 미칠 수 있는 것으로 당해 분야에서 이해된다. 시험관내 및 생체내 검정이 혈소판 응집을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체에 비해 시험관내 검정에서 감소된 혈소판 응집을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체의 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 미만인 시험관내 검정에서의 감소된 혈소판 응집을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체에 비해 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 100%, 또는 적어도 200%, 또는 적어도 300%, 또는 적어도 400%, 또는 적어도 500% 감소된 시험관내 검정에서의 감소된 혈소판 응집을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체에 비해 감소된 생체내 혈소판 응집을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체의 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 20배, 또는 적어도 30배, 또는 적어도 40배, 또는 적어도 50배, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 70배, 또는 적어도 80배, 또는 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배 미만인 생체내 검정에서의 감소된 혈소판 응집을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체에 비해 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 100%, 또는 적어도 200%, 또는 적어도 300%, 또는 적어도 400%, 또는 적어도 500% 감소된 생체내 검정에서의 감소된 혈소판 응집을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항체는 상응하는 야생형 항체에 비해 감소된 혈소판 활성화 및/또는 혈소판 응집을 나타낸다.
치료학적으로 유용한 페리오스틴 항체에 의해 결합된 에피토프
결합될 때 페리오스틴 생물학적 활성 (예를 들어, 인테그린 매개성 세포 부착)을 억제하고 종양 미세환경 (콜라겐 재형성 및 면역 세포에서의 변화)을 변경하는 사람 페리오스틴의 독특한 에피토프 또는 영역이 본 출원에서 기재된다. 이 결합은 항체 CDR 아미노산 잔기와 페리오스틴의 아미노산 잔기 (예를 들어, 접촉 잔기) 사이의 약한 (반 데르 발스 인력), 중간 (수소 결합), 및 강한 (염 브릿지) 상호 작용의 조합이다. 특정 실시 형태에서, 접촉 잔기는 항페리오스틴 항체 상의 잔기와 수소 결합을 형성하는 페리오스틴 상의 잔기이다. 특정 실시 형태에서, 접촉 잔기는 항페리오스틴 항체 상의 잔기와 염 브릿지를 형성하는 페리오스틴 상의 잔기이다. 특정 실시 형태에서, 접촉 잔기는 항페리오스틴 항체 상의 잔기와 반 데르 발스 인력을 야기하고 적어도 5, 4, 또는 3 옹스트롬 이내인 페리오스틴 상의 잔기이다.
특정 실시 형태에서, 본 출원에서 기재되는 항페리오스틴 항체는 테나신 C 또는 콜라겐, I형에 결합하지 않는다.
특정 실시 형태에서, 페리오스틴 (서열 번호 15)의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기 중의 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 단리된 항체가 본 출원에 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기 모두에 결합하는 단리된 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 일부 실시 형태에서, 상기 항체는 종양 부위에서 CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출을 증가시킨다. 일부 실시 형태에서, 상기 항체는 침윤 종양에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 TAM 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시킨다. 일부 실시 형태에서, 상기 항체는 침윤 종양에서 전염증성 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시킨다. 일부 실시 형태에서, 상기 항체는 종양 부위로 CD8+ T 세포를 증가시키고, TAM을 감소시키고, 침윤 종양에서 전염증성 M1 대식 세포 표현형을 증가시킨다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 모두에 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과는 상이한 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 서열 번호 11, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과는 상이한 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과는 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 잔기가 상이하고 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과는 상이한 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 페리오스틴에 특이적으로 결합하고 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 페리오스틴에 특이적으로 결합하고 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 모두에 결합하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 모두에 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (여기서, 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기는 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이고, 서열 번호 13의 100번 아미노산 잔기는 메티오닌, 이소류신 또는 발린이다); 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 페리오스틴에 특이적으로 결합하고 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (여기서, 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기는 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이고, 서열 번호 13의 100번 아미노산 잔기는 메티오닌, 이소류신 또는 발린이다); 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 페리오스틴에 특이적으로 결합하고 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 모두에 결합하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (여기서, 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기는 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이고, 서열 번호 13의 100번 아미노산 잔기 번호는 메티오닌, 이소류신 또는 발린이다); 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 페리오스틴에 특이적으로 결합하고 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 항체가 본 출원에 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 적어도 하나에 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (여기서, 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기는 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이고, 서열 번호 13의 100번 아미노산 잔기는 메티오닌, 이소류신 또는 발린이다); 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 페리오스틴에 특이적으로 결합하고 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 모두에 결합하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체와 결합을 위해 경쟁하고 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 모두에 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체와 결합을 위해 경쟁하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체의 결합 영역과 적어도 부분적으로 중첩하고 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 결합 영역을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 모두와 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체의 결합 영역과 적어도 부분적으로 중첩하는 결합 영역을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체와 결합을 위해 경쟁하는 항체가 본 출원에서 기재된다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 영역과 적어도 부분적으로 중첩하는 결합 영역을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체와 결합을 위해 경쟁하고 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하며 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 모두에 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체의 결합 영역과 적어도 부분적으로 중첩하고 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하며 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중의 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 결합 영역을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 모두에 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체와 결합을 위해 경쟁하고 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (여기서, 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기는 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이고, 서열 번호 13의 100번 아미노산 잔기는 메티오닌, 이소류신 또는 발린이다); 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하며 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 모두에 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
특정 실시 형태에서, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체의 결합 영역과 적어도 부분적으로 중첩하고 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (여기서, 서열 번호 13의 55번 잔기의 아미노산은 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이고, 서열 번호 13의 100번 잔기의 아미노산은 메티오닌, 이소류신 또는 발린이다); 및 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 동일한 사람 또는 사람화 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하며 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에 결합하는 결합 영역을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 잔기들 중 모두에 결합하는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체가 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 또는 중간 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 강한 상호 작용에 항체와 참여하는 잔기에만 결합한다.
치료학적 방법
본 출원에서 개시된 항체는 암 또는 종양의 치료에 유용한 항체이다. 치료는 치료중인 상태를 개선하거나 개량하려는 방법을 지칭한다. 암과 관련하여 치료는 종양 체적의 감소, 종양 체적의 성장 감소, 무진행 생존률 또는 전체 기대 수명의 증가를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시 형태에서, 상기 치료는 치료중인 암의 완화에 영향을 미칠 것이다. 특정 실시 형태에서, 상기 치료는 이전에 치료된 암 또는 종양의 재발 또는 진행을 방지하기 위한 예방 또는 유지 용량으로서의 사용을 포함한다. 항체가 안전하고 효과적일 수 있지만 모든 개체가 투여되는 치료에 동등하게 반응하는 것은 아니며, 그럼에도 불구하고 이들 개체는 치료되는 것으로 간주된다고 당해 분야의 통상의 기술자들에 의해 이해된다.
본 출원에서 기재되는 항체에 의해 치료 가능한 종양은 페리오스틴을 발현하는 것들을 포함한다. 페리오스틴은 암 관련 섬유아세포에 의해 분비되는 세포외 기질의 성분이며, 따라서 대부분의 종양은 페리오스틴을 발현하거나 포함한다. 특정 실시 형태에서, 치료되는 종양은 페리오스틴 양성이고 검출 가능한 페리오스틴을 갖거나 유사한 종양의 모집단 분석을 기반으로 검출 가능한 페리오스틴을 갖는 것으로 알려진 종양이다. 특정 실시 형태에서, 페리오스틴 고 종양은 IHC-점수가 약 50 이상인 종양이다.
특정 실시 형태에서, 암 또는 종양은 고형 암 또는 종양이다. 특정 실시 형태에서, 암 또는 종양은 혈액 암 또는 종양이다. 특정 실시 형태에서, 암 또는 종양은 유방, 심장, 폐, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 머리, 목, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환 또는 간 종양을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 종양 또는 암은 선종, 선암, 맥관육종, 성상세포종, 상피암종, 배세포종, 교모세포종, 신경교종, 혈관내피종, 혈관육종, 혈종, 간모세포종, 백혈병, 림프종, 수모세포종, 흑색종, 신경아세포종, 골육종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종 및/또는 기형종을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 종양/암은 말단 흑자 흑색종, 광선 각화증, 선암, 선낭 암종, 선종, 선육종, 선편평세포 암종, 성상세포 종양, 바르톨린선 암종, 기저 세포 암종, 기관지선 암종, 모세혈관 암양종, 암종, 암육종, 담관암종, 연골육종, 낭선종, 내배엽동 종양, 자궁내막 증식증, 자궁내막 간질 육종, 자궁내막모양 선암, 뇌실막 육종, 스윙 육종 (Swing's sarcoma), 국소 결절성 과증식, 가스트로노마 (gastronoma), 생식 계열 종양, 교모세포종, 글루카곤종, 혈관모세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간 선종, 간 선종증, 간세포 암종, 인슐리나이트 (insulinite), 상피내 종양, 상피내 편평 세포 종양, 침습성 편평 세포 암종, 대세포 암종, 지방육종, 폐 암종, 림프모구 백혈병, 림프성 백혈병, 평활근육종, 흑색종, 악성 흑색종, 악성 중피 종양, 신경초종, 수모세포종, 수질상피종, 중피종, 점막표피양 암종, 골수성 백혈병, 신경모세포종, 신경상피 선암, 결절성 흑색종, 골육종, 난소 암종, 유두상 장액 선암, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가육종, 전립선 암종, 폐 모세포종, 신세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 장액 암종, 편평 세포 암종, 소세포 암종, 연조직 암종, 소마토스타틴 분비 종양, 편평 암종, 편평 세포 암종, 미분화 암종, 포도막 흑색종, 사마귀모양 암종, 질/음문 암종, 비포마 (VIPoma), 및 빌름스 종양의 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 하나 이상의 항체로 치료되는 종양/암은 뇌암, 두경부암, 두경부 편평 세포 암종, 결장직장 암종, 급성 골수성 백혈병, 전-B-세포 급성 림프모구성 백혈병, 방광암, 성상세포종, 바람직하게는 등급 II, III 또는 IV 성상세포종, 교모세포종, 다형성 교모세포종, 소세포암, 및 비-소세포 암, 바람직하게는 비-소세포 폐암, 폐 선암, 전이성 흑색종, 안드로겐-비의존성 전이성 전립선 암, 안드로겐-의존성 전이성 전립선 암, 전립선 선암, 및 유방암, 바람직하게는 유방 관 암 및/또는 유방 암종을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암 또는 폐암을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 항체로 치료되는 암은 교모세포종을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 하나 이상의 항체로 치료되는 암은 췌장암을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 하나 이상의 항체로 치료되는 암은 난소암을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 하나 이상의 항체로 치료되는 암은 폐암을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 하나 이상의 항체로 치료되는 암은 편평 세포 폐암을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 하나 이상의 항체로 치료되는 암은 전립선암을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 하나 이상의 항체로 치료되는 암은 결장암을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 치료되는 암은 교모세포종, 췌장암, 난소암, 결장암, 전립선암, 또는 폐암을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 암은 다른 치료에 불응성이다. 특정 실시 형태에서, 치료되는 암은 재발된다. 특정 실시 형태에서, 암은 재발성/불응성 교모세포종, 췌장암, 난소암, 결장암, 전립선암, 또는 폐암이다.
특정 실시 형태에서, 항체는, 예를 들어, 피하, 복강내, 정맥내, 근육내, 종양내 또는 뇌내 등과 같은 항체-함유 약제학적 조성물의 투여에 적합한 임의의 경로에 의해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 항체는 정맥내 투여된다. 특정 실시 형태에서, 항체는 피하 투여된다. 특정 실시 형태에서, 항체는 종양내 투여된다. 특정 실시 형태에서, 항체는 적절한 투여 일정으로, 예를 들어, 매주, 매주 두 번, 매월, 매월 두 번, 2주에 한 번, 3주에 한 번, 또는 한 달에 한 번 등으로 투여된다. 특정 실시 형태에서, 항체는 3주에 한 번 투여된다. 항체는 임의의 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 치료학적으로 허용되는 양은 약 0.1mg/kg 내지 약 50mg/kg이다. 특정 실시 형태에서, 치료학적으로 허용되는 양은 약 1mg/kg 내지 약 40mg/kg이다. 특정 실시 형태에서, 치료학적으로 허용되는 양은 약 5mg/kg 내지 약 30mg/kg이다. 치료학적 유효량은 치료하고자 하는 질환 또는 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 개선하기에 충분한 양을 포함한다.
본 출원에서 기재되는 항페리오스틴 항체는 또한 개체에서 종양의 콜라겐 함량을 감소시키는 방법에서 유용하다.
본 출원에서 기재되는 항페리오스틴 항체는 또한 개체에서 종양에 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시키는 방법에서 유용하다.
본 출원에서 기재되는 항페리오스틴 항체는 또한 개체에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시키는 방법에서 유용하다.
본 출원에서 기재되는 항페리오스틴 항체는 또한 개체의 종양에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키는 방법에서 유용하다.
본 출원에서 기재되는 항페리오스틴 항체는 또한 개체에서 종양에 CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출을 증가시키는 방법에서 유용하다.
본 출원에서 기재되는 항체는 개체에서 종양 중의 콜라겐 함량을 감소시키기 위한 약제의 제조에 유용하다.
본 출원에서 기재되는 항체는 개체에서 종양에서 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시키기 위한 약제의 제조에 유용하다.
본 출원에서 기재되는 항체는 개체에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시키기 위한 약제의 제조에 유용하다.
본 출원에서 기재되는 항체는 개체의 종양에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키기 위한 약제의 제조에 유용하다.
본 출원에서 기재되는 항체는 개체에서 종양에서 CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출을 증가시키기 위한 약제의 제조에 유용하다.
약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 , 및 희석제
본 출원에서 기재되는 항체는 사람 개체에게 투여하기에 충분히 순수한 단리된 및 정제된 형태로 제공될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 항페리오스틴 항체는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 및 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 포함된다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 항체는 멸균 용액에 현탁되어 투여된다. 특정 실시 형태에서, 용액은 0.9% NaCl, 또는 5% 덱스트로오스, 글루코오스 또는 수크로오스를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 용액은 다음 중의 하나 이상을 추가로 포함한다: 완충제, 예를 들어, 아세트산염, 시트르산염, 히스티딘, 숙신산염, 인산염, 중탄산염 및 하이드록시메틸아미노메탄 (Tris); 계면 활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80 (Tween 80), 폴리소르베이트 20 (Tween 20) 및 폴록사머 188; 폴리올/이당류/다당류, 예를 들어, 글루코오스, 덱스트로오스, 만노오스, 만니톨, 소르비톨, 수크로오스, 트레할로오스 및 덱스트란 40; 아미노산, 예를 들어, 글리신 또는 아르기닌; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌; 또는 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA 또는 EGTA.
특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 항체는 동결건조된 상태로 배송/저장되고 투여 전에 재구성된다. 특정 실시 형태에서, 동결건조된 항체 제형은 만니톨, 소르비톨, 수크로오스, 트레할로오스, 덱스트란 40 또는 이들의 조합과 같은 증량제를 포함한다. 동결건조된 제형은 유리 또는 기타 적합한 비-반응성 물질로 구성된 바이알에 함유될 수 있다. 항체는, 재구성되는지 여부에 관계없이, 제형화될 때 특정 pH, 일반적으로 7.0 미만에서 완충될 수 있다. 특정 실시 형태에서, pH는 4.5 내지 6.5, 4.5 내지 6.0, 4.5 내지 5.5, 4.5 내지 5.0, 또는 5.0 내지 6.0일 수 있다.
적당한 용기 중의 하나 이상의 본 출원에서 기재되는 항체 및 사용 지침; 희석제, 부형제, 담체, 및 투여용 장치로부터 선택된 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 키트가 또한 본 출원에서 기재된다.
특정 실시 형태에서, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제 및 본 개시 내용의 항체를 혼합하는 단계를 포함하는 암 치료제를 제조하는 방법이 본 출원에서 기재된다. 특정 실시 형태에서, 하나 이상의 본 개시 내용의 항체를 동결 건조시키는 단계를 포함하는 저장 또는 배송용 암 치료제를 제조하는 방법이 본 출원에서 기재된다.
실시예
다음의 예시적인 실시예는 본 출원에서 기재되는 조성물 및 방법의 실시 형태를 대표하며 어떠한 방식으로든 제한하는 것을 의미하지 않는다.
실시예 1 - 항체 생성 및 스크리닝
완전 사람 파지 라이브러리를 사용하여 페리오스틴에 대한 결합제를 단리하기 위해 파지 디스플레이 항체 발견 캠페인을 수행하였다. 간단히 말해서, 재조합 사람 페리오스틴, 재조합 마우스 페리오스틴 또는 이들의 조합을 사용하여 마우스 교차-반응성 결합제를 식별하는데 중점을 두고 3차례의 패닝을 수행하였다. 이러한 패닝 전략으로부터, 마우스 페리오스틴과 교차-반응하는 78개의 서열 고유 ScFv를 식별하고 세포 부착 검정에서 기능적 스크리닝을 위해 사람 IgG1 형식으로 생산하였다. 도 1 참조.
재조합 사람 또는 마우스 페리오스틴을 4℃에서 밤새 96 웰 플레이트 상에 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBS로 세척하고 37℃에서 1시간 동안 2% BSA로 차단하였다. 차단 후, 항체를 플레이트에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 50,000개 IMR90 사람 폐 섬유아세포 또는 50,000개 MLG 마우스 섬유아세포를 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션되도록 하였다. 그후 플레이트를 PBS로 2회 세척하고 웰의 융합도 (confluency)를 IncuCyte 플랫폼을 사용하여 측정하였다. 500nM의 고농도 단일 용량 스크린으로부터, 21개의 IgG가 도 1에 나타난 바와 같이 >50% 억제를 갖는 것으로 확인되었으며, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 사람 및 마우스 페리오스틴에 대한 상대적 친화도를 결정하기 위해 결합 스크린으로 이월시켰다.
재조합 사람 또는 마우스 페리오스틴에 대한 상대적 친화도를 결정하기 위해, 이들 단백질을 4℃에서 밤새 maxisorp 플레이트 상에 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 카제인 차단 완충액으로 차단하였다. 각 항체의 적정물을 플레이트에 첨가하고 RT에서 1시간 동안 결합되도록 하였다. 플레이트를 PBST로 4x 세척한 다음 HRP 컨쥬게이션된 항-사람 Fc 2차 항체와 함께 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그후 플레이트를 4x PBST로 다시 세척한 다음 TMB 기질 및 1M HCl을 사용하여 현상하였다. 이 스크린으로부터, 사람 및 마우스 페리오스틴 둘 다에 대해 <1nM 결합 EC50 값을 갖는 4개의 클론이 선택되었다 (표 1에 굵게 이탤릭체로 표시됨).
Figure pct00001
실시예 2-NB0828 및 서열 변이체의 생성
4명의 후보자를 IC50 값을 결정하기 위해 세포 부착 검정에서 용량 반응으로 재시험하였다. 이 스크린으로부터, NB0627이 특히 적합한 IgG로 확인되었다 (표 2).
Figure pct00002
그후 NB0627을 이펙터 침묵 IgG4PAA 이소타입으로 전환하여, 리드 후보 NB0828을 생성하였다. NB0828의 서열 분석은 VH 영역에서 두 개의 번역후 변형 책임을 확인하였다. 첫 번째, 탈아미드화 부위는 CDR-H2에 위치하고, 두 번째, 산화 부위는 CDR-H3에 위치한다. 따라서, 이러한 책임을 제거하기 위한 시도로, 여러 단일 및 이중 돌연변이체를 생성하였으며 이들의 결합 및 활성을 측정하였다. NB0828 및 이의 변이체에 대한 IC50 및 EC50 값에 대한 결과 요약은 표 3에 열거되어 있다.
Figure pct00003
실시예 3-마우스 방광 MB49 및 결장 CT26 종양 모델에서 NB0828의 생체내 효능
NB0828의 효능을 두 가지 별개의 종양 모델, 방광 MB49 및 결장 CT26 종양 모델에서 시험하였다. 간단히 말해서, 250,000개 MB49 세포를 암컷 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피내 주사하거나, 50,000개 CT26 세포를 암컷 Balb/c 마우스의 옆구리에 피내 주사하였다. 종양 이식 3일 후, 마우스를 NB0828 (50mg/kg, 3QW) 또는 비히클 대조군 (PBS)으로 복강내 처리하였다. 종양 체적을 캘리퍼 측정 후 매주 2회 평가하고 (길이 x 폭2)/2로서 계산하였다. 종양 크기가 단일 방향으로 15mm를 초과할 때 또는 인도적 종점으로서 종양 궤양으로 인해 마우스를 안락사시켰다.
도 2 (MB49) 및 도 5 (CT26)에 나타낸 바와 같이, NB0828은 두 모델 모두에서 종양 성장을 줄이는데 효과가 있었다. MB49 모델에서 종양 성장의 이러한 감소는 도 3에 나타난 바와 같은 종양내 과립구 골수성 세포의 낮은 빈도 및 도 4에 나타난 바와 같은 낮은 콜라겐 함량과 관련이 있었다. MB49 모델과 마찬가지로, CT26 모델은 과립구 골수성 세포의 감소를 보였다. 또한, NB0828은 도 6에 나타난 바와 같이 NB0828 처리의 결과로서 종양 침윤 대식 세포의 빈도를 감소시켰고, 존재하는 대식 세포는 M1 표현형으로 치우쳐졌다. CT26 마우스 모델에서, NB0828 처리는 또한 도 7에 나타난 바와 같이 인터페론 감마의 더 높은 발현에 의해 측정된 바와 같이 종양 침윤 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 더 높은 빈도 및 증가된 CD8+ T 세포 기능과 관련이 있었다.
면역표현형 분석
MB49 또는 CT26 종양 보유 마우스를 기술된 바와 같이 3일차에 시작하여 NB0828 또는 비히클 대조군으로 처리하였다. 나타낸 데이터의 경우, MB49 및 CT26에 대해 각각 종양 이식 후 20일 및 18일에 면역표현형 분석을 수행하였다. Miltenyi 마우스 종양 해리 효소 혼합물을 사용하여 효소적으로 소화되기 전에 종양을 절제하고, 피부를 제거하고, 메스 블레이드를 사용하여 기계적으로 파괴하였다. 소화된 샘플을 40㎛ 스트레이너를 통해 통과시키고, RPMI에서 세척한 다음 RPMI + 10% FBS로 2차 세척하였다. 그후 세포를 계수를 위해 재현탁하고 샘플당 최대 2 x 106개의 백혈구를 플레이팅하고 유세포 분석법에 의한 분석을 위해 염색하였다. CT26 모델에서 CD8+ 종양 침윤 림프구 기능의 평가를 위해, 종양으로부터의 소화된 단일 세포 현탁액을 항-CD28 및 브레펠딘 A의 존재하에 37℃에서 5시간 동안 AH1 펩타이드[H2-Ld 제한된 gp70 (423-431) MuLV 에피토프, CT26 세포에 의해 발현되는 면역우세 CD8+ T 세포 에피토프]로 자극하였다. 자극 후, 세포를 염색하여, 표준 표면/세포내 염색 방법에 의한 유세포 분석을 사용하여 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ의 생산을 검출하였다. 표시된 세포 집단을 평가하는데 사용되는 유동 염색 패널은 아래 표 4에 포함되어 있다. 생존성 염색 (Thermo Fisher, Live/Dead Fixable Violet Stain)을 사용하여 생세포 이벤트만 조사하였으며 면역 구획 내 집단의 정규화를 허용하기 위해 pan 백혈구 마커 CD45를 포함시켰다. 관심 면역 집단은 다음과 같이 표현형/기능별로 정의되었다: 총 골수성 세포 (CD45+ CD11b+), 과립구 (CD45+ CD11b+ Gr-1 hi 또는 CD45+ CD11b+ Ly6G+ Ly6C lo), 대식 세포 (CD45+ CD11b+ Ly6G- Ly6C lo/neg F4/80+), M1 대식 세포 (MHC II+ CD206-), M2 대식 세포 (MHC II- CD206+), CD8+ TILs (CD45+ CD11b- CD3+ CD90.2+ CD8+), CD4+ TILs (CD45+ CD11b- CD3+ CD90.2+ CD4+), IFN-γ+ CD8+ TILs (CD45+ CD11b- CD3+ CD8+ IFN-γ+). 형광 강도 중간값 (MFI)는 IFN-γ+CD8+ TIL로부터 IFN-γ 염색 강도를 결정하는데 사용되었다.
Figure pct00004
콜라겐 함량
종양의 총 콜라겐 함량은 Quickzyme 총 콜라겐 분석을 사용한 하이드록시프롤린의 정량화에 의해 평가하였다. 샘플 준비를 위해, MB49 종양을 종양이 종점에 도달했을 때 종양 보유 마우스로부터 절제하고 액체 질소에서 급속 냉동시켜 분석 전에 -80℃에서 저장하였다. 종양 물질을 칭량하고 200mg 종양/ml HCl로 6M HCl에 재현탁하고, 볼텍싱하고 95℃에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 냉각시키고, 13,000 RPM에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 상청액을 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 Milli Q 물에 희석한 다음 4M HCl로 희석하고 제공된 완충액 및 검출 시약을 사용하여 하이드록시프롤린의 검출을 위해 기술적 중복으로 플레이팅하였다. OD570nm 값을 측정하고 제공된 콜라겐을 사용하여 생성된 표준 곡선과 비교하여 각 샘플의 콜라겐 양을 계산하였다. 각 샘플에 대해 계산된 총 콜라겐 (㎍)을 종양 투입물의 총 질량 (mg)으로 나누어 종양 샘플에 걸쳐 데이터를 정규화하였다.
실시예 4-마우스 결장 MC38 종양 모델에서 NB0828의 생체내 효능
NB0828을 마우스 결장 MC38 종양 모델에서 종양 성장을 감소시키는 이들의 효능에 대해 시험하였으며, 결과는 도 8에 나타나 있다. 간단히 말해서, 200,000개의 MC38 세포를 암컷 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피내 주사하였다. 종양 이식 3일 후, 마우스를 NB0828 (50mg/kg, 3QW) 또는 비히클 대조군 (PBS)으로 복강내 처리하였다. CD8+ T 세포의 고갈을 위해, 항-마우스 CD8a (클론 2.43) 또는 IgG 이소타입 대조군 (클론 LTF-2)을 처음 6회 용량 (10mg/kg, 3QW)에 대해 NB0828과 함께 전달하였다. T 세포의 고갈은 표 5에 열거된 유동 염색 패널을 사용하여 유세포 분석에 의해 혈액에서 확인되었다. 종양 체적은 MB49 및 CT26 모델에 대해 기술된 바와 동일한 방법을 사용하여 측정하였다. NB0828은 MC38 모델에서 종양 성장을 감소시키는데 효과적이었다 (도 8). NB0828은 또한 도 9a 및 9c에 나타난 바와 같이 CD8+ T 세포를 증가시키고, 종양-관련 대식 세포 (TAM)의 빈도를 감소시키고, 전염증성 대식 세포의 비율을 증가시키기 위해 종양 미세환경을 변경하는데 효과적이었다. 이 모델에서 종양 성장을 감소시키는 NB0828의 효능은, 도 9d에 나타난 바와 같이 NB0828 처리 동안 CD8+ T 세포의 고갈이 NB0828의 유익한 효과를 역전시켰기 때문에 CD8+ T 세포에 의존적이었다. 전반적으로, 이 데이터는 NB0828이 종양 성장을 효과적으로 감소시키고 CD8+ T 세포를 종양 부위로 증가시키며, TAM을 감소시키고 침윤 종양에서 전염증성 M1 대식 세포 표현형을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
면역표현형 분석
Miltenyi 마우스 종양 해리 효소 혼합물을 사용하여 효소적으로 소화 (37℃에서 진탕 플랫폼 상에 45분 인큐베이션)되기 전에 종양을 절제하고, 피부를 제거하고, 메스 블레이드를 사용하여 기계적으로 파괴하였다. 소화된 샘플을 40㎛ 스트레이너를 통해 통과시키고, RPMI에서 세척한 다음 RPMI + 10% FBS로 2차 세척하였다. 그후 세포를 계수를 위해 재현탁하고 샘플당 최대 2 x 106개의 백혈구를 플레이팅하고 유세포 분석법에 의한 분석을 위해 염색하였다. MC38 모델에서 CD8+ 종양 침윤 림프구 (CD8+ TIL) 기능의 평가를 위해, 종양으로부터의 소화된 단일 세포 현탁액 (샘플당 최대 2 x 106개의 백혈구)을 항-CD28 및 브레펠딘 A의 존재하에 37℃에서 5시간 동안 p15E 펩타이드[MC38 종양에 의해 발현된 H2-Kb 제한된 p15E (604-611) MuLV 에피토프]로 자극하였다. 자극 후, 세포를 염색하여, eBioscience 세포내 Fix & Perm 완충액 세트를 사용한 표준 표면/세포내 염색 방법에 의한 유세포 분석을 사용하여 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ의 생산을 검출하였다. 표시된 세포 집단을 평가하는데 사용되는 유동 염색 패널은 아래 표에 포함되어 있다. 생존성 염색 (Thermo Fisher, Live/Dead Fixable Violet Stain)을 사용하여 생세포 이벤트만 조사하였으며 면역 구획 내 집단의 정규화를 허용하기 위해 pan 백혈구 마커 CD45를 포함시켰다. MC38에서의 연구를 위해, 보고된 관심 면역 집단은 다음과 같이 표현형/기능별로 정의되었다: 총 골수성 세포 (CD45+ CD11b+), 대식 세포 (CD45+ CD11b+ Ly6G- Ly6C lo/neg F4/80+), M1 대식 세포 (MHC II+), M2 대식 세포 (MHC II-), CD8+ TILs (CD45+ CD11b- CD3+ SSC lo CD8+), IFN-γ+ CD8+ TILs (CD45+ CD11b- CD3+ SSC lo CD8+ IFN-γ+).
Figure pct00005
실시예 5-NB0828은 페리오스틴 (POSTN)의 FAS2 도메인에 결합한다
NB0828의 결합 영역을 조사하여 항체를 추가로 특성화하였다.
BIGH3 / POSTN 키메라 단백질의 생성
서열상 페리오스틴과 가장 가까운 상동성 단백질은 단백질의 EMI-FAS4 영역 내에서 48%의 서열 상동성을 갖는 형질전환 성장 인자-베타-유도 단백질 (BIGH3)이다. 두 단백질 간의 서열 상동성은 낮지만, 전체 도메인 구조는 매우 유사하며 1개의 EMI 도메인과 4개의 탠덤 파시클린 (FAS) 도메인을 포함한다. NB0828은 페리오스틴에 높은 친화도로 결합하지만 BIGH3에는 결합하지 않는다. NB0828의 결합 도메인을 추가로 특성화하기 위해, BIGH3/POSTN 키메라 단백질을 생성하여, 페리오스틴의 각 도메인을 BIGH3의 상응하는 도메인으로 대체하여 5개의 BIGH3/POSTN 키메라를 생성하였다 (도 10). NB0828 결합 연구를 ELISA에 의해 이들 단백질에 대해 수행하였다. 도 11a에 나타난 바와 같이, NB0828은 FAS2 키메라를 제외한 모든 BIGH3/POSTN 키메라에 대한 결합을 유지한다. POSTN FAS2 도메인을 BIGH3 FAS2 도메인으로 대체할 때 관찰 가능한 이러한 결합 손실은 NB0828이 POSTN의 FAS2 도메인에 결합한다는 것을 나타낸다.
POSTN FAS2 변이체의 생성
페리오스틴의 FAS2 도메인은 132개의 아미노산으로 구성된 입체형태 구조이다. NB0828 에피토프 또는 결합 영역을 추가로 정의하고 중요한 접촉 잔기를 확인하기 위해 FAS2 도메인에 걸쳐 다양한 위치에 있는 단일 아미노산 치환 (알라닌) 변이체를 생성하였다 (표 5). 공개된 결정 구조를 사용하여 계산 분석 도구인 MOE의 표면 노출을 기반으로 돌연변이유발에 대해 잔기를 확인하였다 (Liu et al, 2018; PDB # 5YJG).
Figure pct00006
전체 FAS2 도메인에 걸친 잔기에 걸쳐있는 23개의 알라닌 변이체가 초기 라운드에서 생성되었다. NB0828 결합 연구를 이러한 변이체에 대해 수행하였으며 분석 내에서 최대 신호로부터 >50% 손실을 갖는 변이체가 결합에 중요한 잔기로 확인되었다. 도 11b는 그 스크린으로부터의 결과를 예시한다. NB0828 결합을 위한 중요한 아미노산을 나타내는 두 가지 변이체가 확인되었다: NB1205 (R284A) 및 NB1207 (E288A). 이러한 두 아미노산이 매우 근접함을 고려하여 (도 12), 제2 라운드의 11개의 추가 변이체를 생성하였으며, 보다 특이적으로 이 영역 내의 잔기에 집중하였다. 도 11c는 제2 스크린으로부터의 결과를 예시한다. 제2 스크린으로부터의 ELISA 결과를 기반으로, NB0828 결합에 중요한 아미노산을 나타내는 추가 4개의 변이체가 확인되었다: NB1243 (L287A), NB1246 (V295A), NB1248 (K302A) 및 NB1202 (N276A). 특히, 최대 신호 컷오프로부터 >50% 손실에 매우 가깝지만 그 아래로 떨어지지 않는 NB1190 (D245A)은 나머지 잔기와는 별도의 루프에 위치하지만 FAS2 도메인 내의 N276과 및 NB0828 결합 루프 상에 접촉점을 형성한다 (도 12). N276이 NB0828 결합을 위한 중요한 잔기로 확인되었다는 점을 고려할 때, D245 잔기 또한 NB0828에 대한 접촉 잔기일 수 있거나 결합에 중요한 NB0828 에피토프 루프에 구조적 무결성을 제공할 수 있다.
종에 걸친 NB0828 친화도 결정
NB0828의 결합 친화도를 사람, 마우스, 래트 및 cyno 종에 걸쳐 결정하였다. NB0828 친화도는 옥텟 레드 (octet red) 시스템을 사용하여 결정하였다. 간단히 말해서, 항-사람 Fc (AHC) 바이오센서를 사용하여 NB0828을 포획한 다음 적정량의 재조합 사람, 마우스, 래트 또는 cyno 페리오스틴 (100nM → 0nM; 1:2 희석)과 연관시켰다. 재조합 사람, 마우스, 및 래트 페리오스틴은 R&D 시스템에서 상업적으로 구입한 반면 cyno 페리오스틴은 내부에서 생산하였다. 결과는 네 가지 종에 걸친 페리오스틴에 대한 NB0828의 친화도가 0.1-0.5nM 범위로 매우 유사한 것으로 나타났다. 이 데이터는 기술된 NB0828 결합 루프의 서열 동일성이 네 가지 종에 걸쳐 100%였기 때문에 위에 상세하게 설명된 에피토프 맵핑 실험을 강력하게 뒷받침한다.
Figure pct00007
실시예 6- NB0828은 테나신 C 및 1형 콜라겐에 대한 페리오스틴 결합을 차단하지 않지만 세포 부착을 차단한다
NB0828이 세포외 단백질, 테나신 C 및 I형 콜라겐에 대한 페리오스틴 결합을 차단하는지 여부를 결정하기 위해, 경쟁 ELISA 검정을 수행하였다. 재조합 사람 페리오스틴 (2ng/mL)을 4℃에서 밤새 maxisorp 플레이트 상에 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 카제인 차단 완충제로 차단하였다. 재조합 사람 테나신 C와 사람 콜라겐 I형에 대한 결합 EC80을 결정하기 위해, 단백질을 EZ-Link™ NHS-PEG4-비오틴 (Fisher)을 사용하여 10:1 비오틴화하고 각 비오틴화된 단백질의 적정물을 플레이트에 첨가하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 4x 세척한 다음 30분 동안 아비딘-HRP를 사용하여 검출하였다. 그후 플레이트를 4x PBST로 다시 세척하고 TMB 기질 및 1M HCl을 사용하여 현상하였다. 각 단백질에 대한 EC80을 Graphpad Prism 7 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 경쟁 ELISA의 경우, NB0828, 대조군 IgG 또는 PBST의 적정물을 플레이트에 첨가하고 RT에서 30분 진탕하면서 인큐베이션하였다. 그후 플레이트를 PBST로 4x 세척하고, 결합 EC80 농도의 비오틴화된-테나신 C (0.9nM, 13a, 왼쪽) 또는 콜라겐 (100nM, 13b, 왼쪽) 또는 미리 혼합된 차단 대조군을 플레이트에 첨가하였다. 미리 혼합된 차단 대조군은 EC80 농도의 비오틴화된 단백질을 플레이트에 첨가하기 전에 RT에서 30분 동안 진탕하면서 인큐베이션한 재조합 사람 페리오스틴의 적정물과 혼합함으로써 제조하였다. 그후 플레이트를 RT에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하고, 상기한 바와 같이 세척, 검출 및 현상하였다.
테나신 C 및 I형 콜라겐은 각각 0.9nM 및 100nM의 EC80 결합으로 페리오스틴에 결합되었다 (도 13a 및 13b). 도 13a 및 13b에 나타난 바와 같이, NB0828은 사전 혼합된 양성 대조군과 달리 테나신 C 및 I형 콜라겐에 대한 페리오스틴 결합을 억제하지 않았다. 종합하면, 이러한 데이터는 NB0828이 세포외 기질 단백질, 테나신 C 및 I형 콜라겐에 대한 페리오스틴의 상호 작용을 차단하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 7 - 사람 종양 징후에 걸친 페리오스틴 발현의 면역조직화학 (IHC) 평가
상이한 사람 암에 걸쳐 페리오스틴 발현 수준을 평가하기 위해, 면역조직화학 (IHC) 우세도 연구를 수행하였다. 18개의 종양 징후와 대략 750개의 개별 샘플을 포함하는 조직 마이크로어레이 (TMA)를 페리오스틴 발현에 대해 평가하였다. 샘플을 1:50으로 희석된 항페리오스틴 항체 EPR20806 (Abcam cat id: ab215199, lot id: GR3192974-3)으로 염색하였다. 염색을 디지털 병리학 방법 (HALO, Indica labs)을 사용하여 정량화하여 IHC 점수를 계산하였다 (IHC 점수 = [% 저강도 염색 영역*1] + [% 중간 강도 염색 영역*2] + [% 고강도 염색 영역*3]). 저/고 페리오스틴 염색에 대한 컷-포인트는 모든 샘플에 걸친 대략적 평균 페리오스틴 IHC 점수를 기준으로 50의 페리오스틴 IHC 점수로서 계산되었다. 우세도 연구는 시험된 징후 전체 및 내에서 다양한 페리오스틴 염색을 입증하였으며, 췌장암, 유방암 및 편평 폐암이 가장 높은 수준의 페리오스틴 염색을 보였다 (도 14a). 페리오스틴 고 종양은 빈도는 다르지만 모든 징후에서 존재하였다 (도 14a). 유방암에서 페리오스틴 발현의 대표적인 IHC 이미지가 도 14b에 제시되어 있다. 종합해보면, 이러한 데이터는 페리오스틴이 다중 종양 유형에 걸쳐 광범위하게 발현된다는 것을 입증한다.
본 발명의 바람직한 실시 형태들이 본 출원에 제시되고 기재되어 있지만, 이러한 실시 형태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당해 분야의 통상의 기술자들에게 명백할 것이다. 이제 본 발명으로부터 벗어나지 않고 많은 변형, 변경 및 치환이 당해 분야의 통상의 기술자들에게 발생할 것이다. 본 출원에서 기재되는 본 발명의 실시 형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 발행된 특허, 및 기타 문서는 각 개별 간행물, 특허 출원, 발행된 특허, 또는 기타 문서가 구체적으로 및 개별적으로 전문이 참고로 포함됨을 나타내는 것처럼 본 출원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 텍스트에 포함된 정의는 이들이 본 개시 내용의 정의와 상반되는 정도까지 제외된다.
Figure pct00008
<110> NORTHERN BIOLOGICS INC. <120> ANTI-PERIOSTIN ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 48885-724.601 <140> PCT/IB2019/001307 <141> 2019-12-13 <150> 62/899,075 <151> 2019-09-11 <150> 62/779,996 <151> 2018-12-14 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Asn Thr 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Ile Ser Ala Tyr Gln Gly Asn Thr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Arg Ile Met Gly Asp Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys Tyr His 290 295 300 Ile Leu Asn Thr Leu Gln Cys Ser Glu Ser Ile Met Gly Gly Ala Val 305 310 315 320 Phe Glu Thr Leu Glu Gly Asn Thr Ile Glu Ile Gly Cys Asp Gly Asp 325 330 335 Ser Ile Thr Val Asn Gly Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp Ile Val 340 345 350 Thr Asn Asn Gly Val Ile His Leu Ile Asp Gln Val Leu Ile Pro Asp 355 360 365 Ser Ala Lys Gln Val Ile Glu Leu Ala Gly Lys Gln Gln Thr Thr Phe 370 375 380 Thr Asp Leu Val Ala Gln Leu Gly Leu Ala Ser Ala Leu Arg Pro Asp 385 390 395 400 Gly Glu Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser Asp Asp 405 410 415 Thr Leu Ser Met Asp Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln Asn His 420 425 430 Ile Leu Lys Val Lys Val Gly Leu Asn Glu Leu Tyr Asn Gly Gln Ile 435 440 445 Leu Glu Thr Ile Gly Gly Lys Gln Leu Arg Val Phe Val Tyr Arg Thr 450 455 460 Ala Val Cys Ile Glu Asn Ser Cys Met Glu Lys Gly Ser Lys Gln Gly 465 470 475 480 Arg Asn Gly Ala Ile His Ile Phe Arg Glu Ile Ile Lys Pro Ala Glu 485 490 495 Lys Ser Leu His Glu Lys Leu Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ser Thr Phe 500 505 510 Leu Ser Leu Leu Glu Ala Ala Asp Leu Lys Glu Leu Leu Thr Gln Pro 515 520 525 Gly Asp Trp Thr Leu Phe Val Pro Thr Asn Asp Ala Phe Lys Gly Met 530 535 540 Thr Ser Glu Glu Lys Glu Ile Leu Ile Arg Asp Lys Asn Ala Leu Gln 545 550 555 560 Asn Ile Ile Leu Tyr His Leu Thr Pro Gly Val Phe Ile Gly Lys Gly 565 570 575 Phe Glu Pro Gly Val Thr Asn Ile Leu Lys Thr Thr Gln Gly Ser Lys 580 585 590 Ile Phe Leu Lys Glu Val Asn Asp Thr Leu Leu Val Asn Glu Leu Lys 595 600 605 Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His Val Val 610 615 620 Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala Asp Thr Pro Val Gly Asn Asp Gln Leu 625 630 635 640 Leu Glu Ile Leu Asn Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys Phe Val 645 650 655 Arg Gly Ser Thr Phe Lys Glu Ile Pro Val Thr Val Tyr Thr Thr Lys 660 665 670 Ile Ile Thr Lys Val Val Glu Pro Lys Ile Lys Val Ile Glu Gly Ser 675 680 685 Leu Gln Pro Ile Ile Lys Thr Glu Gly Pro Thr Leu Thr Lys Val Lys 690 695 700 Ile Glu Gly Glu Pro Glu Phe Arg Leu Ile Lys Glu Gly Glu Thr Ile 705 710 715 720 Thr Glu Val Ile His Gly Glu Pro Ile Ile Lys Lys Tyr Thr Lys Ile 725 730 735 Ile Asp Gly Val Pro Val Glu Ile Thr Glu Lys Glu Thr Arg Glu Glu 740 745 750 Arg Ile Ile Thr Gly Pro Glu Ile Lys Tyr Thr Arg Ile Ser Thr Gly 755 760 765 Gly Gly Glu Thr Glu Glu Thr Leu Lys Lys Leu Leu Gln Glu Glu Val 770 775 780 Thr Lys Val Thr Lys Phe Ile Glu Gly Gly Asp Gly His Leu Phe Glu 785 790 795 800 Asp Glu Glu Ile Lys Arg Leu Leu Gln Gly Asp Thr Pro Val Arg Lys 805 810 815 Leu Gln Ala Asn Lys Lys Val Gln Gly Ser Arg Arg Arg Leu Arg Glu 820 825 830 Gly Arg Ser Gln 835 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <400> 16 Ile Ser Ala Tyr Xaa Gly Asn Thr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <400> 17 Asp Xaa Leu Val Val Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 18 His His His His His His 1 5

Claims (66)

  1. 페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이,
    a) 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1);
    b) 서열 번호 2 (ISAYNGNT), 서열 번호 3 (ISAYSGNT), 서열 번호 4 (ISAYQGNT), 서열 번호 5 (ISAYTGNT) 또는 서열 번호 6 (ISAYDGNT) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2);
    c) 서열 번호 7 (DILVVPFDY), 서열 번호 8 (DVLVVPFDY) 또는 서열 번호 9 (DMLVVPFDY) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3);
    d) 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1);
    e) 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및
    f) 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)
    을 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이,
    a) 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1);
    b) 서열 번호 16 (ISAYXGNT)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2);
    c) 서열 번호 17 (DXLVVPFDY)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3);
    d) 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1);
    e) 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및
    f) 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)
    중 어느 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함하며;
    여기서, X가 임의의 아미노산 잔기인, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이,
    a) 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1);
    b) 서열 번호 2 (ISAYNGNT)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2);
    c) 서열 번호 9 (DMLVVPFDY)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3);
    d) 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1);
    e) 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및
    f) 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)
    을 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 사람, 키메라 또는 사람화 형태인, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 IgG 항체인, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이가 EU 넘버링 시스템에 따른 IgG4의 N434A, N434H, T307A/E380A/N434A, M252Y/S254T/T256E, 433K/434F/436H, T250Q, T250F, M428L, M428F, T250Q/M428L, N434S, V308W, V308Y, V308F, M252Y/M428L, D259I/V308F, M428L/V308F, Q311V/N434S, T307Q/N434A, E258F/V427T, S228P, L235E, S228P/L235E/R409K, S228P/L235E, K370Q, K370E, G446의 결실, K447의 결실 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 또는 이의 세트를 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제6항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이가 EU 넘버링 시스템에 따른 IgG4의 S228P, F234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 Fab, F (ab)2, 단일 도메인 항체 또는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)인, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    a) 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역이 서열 번호 13에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 여기서, 상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 서열 번호 14에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    여기서, 상기 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기가 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이거나, 상기 서열 번호 13의 100번 아미노산 잔기가 메티오닌, 이소류신 또는 발린인, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 페리오스틴에 결합될 때, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 및 K302 아미노산 잔기 중 하나와 접촉하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 페리오스틴에 결합될 때, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 및 K302 아미노산 잔기 중 2, 3, 4 또는 5개와 접촉하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 페리오스틴에 결합될 때, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 및 K302 아미노산 잔기의 모두와 접촉하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    a) 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역이 서열 번호 13에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 여기서, 상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 서열 번호 14에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    여기서, 상기 서열 번호 13의 55번 아미노산 잔기가 아스파라긴, 세린, 글루타민, 트레오닌 또는 아스파르트산이거나, 상기 서열 번호 13의 100번 아미노산이 메티오닌, 이소류신 또는 발린인, 페리오스틴에 결합하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    a) 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역이 서열 번호 13에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 여기서, 상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 서열 번호 14에 제시된 것과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    a) 여기서, 상기 면역글로불린 중쇄 가변 영역이 서열 번호 13에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 여기서, 상기 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 서열 번호 14에 제시된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 페리오스틴에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제14항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 사람, 사람화 또는 키메라 형태인, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제14항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 IgG 항체인, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제14항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  20. 제19항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이가 EU 넘버링 시스템에 따른 IgG4의 N434A, N434H, T307A/E380A/N434A, M252Y/S254T/T256E, 433K/434F/436H, T250Q, T250F, M428L, M428F, T250Q/M428L, N434S, V308W, V308Y, V308F, M252Y/M428L, D259I/V308F, M428L/V308F, Q311V/N434S, T307Q/N434A, E258F/V427T, S228P, L235E, S228P/L235E/R409K, S228P/L235E, K370Q, K370E, G446의 결실, K447의 결실 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 또는 이의 세트를 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  21. 제19항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이가 EU 넘버링 시스템에 따른 IgG4의 S228P, F234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  22. 제14항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 Fab, F (ab)2, 단일 도메인 항체 또는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)인, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  23. 페리오스틴의 파시클린 2 (FAS2) 도메인에 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  24. 제23항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 페리오스틴에 결합될 때, 서열 번호 15의 276 내지 302번 아미노산으로부터 선택된 아미노산 잔기와 접촉하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 페리오스틴에 결합될 때, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 아미노산 잔기 중 하나와 접촉하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  26. 제23항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 페리오스틴에 결합될 때, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 및 K302 아미노산 잔기 중 2, 3, 4 또는 5개와 접촉하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  27. 제23항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 페리오스틴에 결합될 때, 서열 번호 15의 N276, R284, E288, L287, V295 또는 K302 아미노산 잔기의 모두와 접촉하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  28. 제23항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이,
    a) 서열 번호 1 (GYTFTSYG)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR1 (CDR-H1);
    b) 서열 번호 2 (ISAYNGNT), 서열 번호 3 (ISAYSGNT), 서열 번호 4 (ISAYQGNT), 서열 번호 5 (ISAYTGNT) 또는 서열 번호 6 (ISAYDGNT) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR2 (CDR-H2);
    c) 서열 번호 7 (DILVVPFDY), 서열 번호 8 (DVLVVPFDY) 또는 서열 번호 9 (DMLVVPFDY) 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 CDR3 (CDR-H3);
    d) 서열 번호 10 (SSDIGSNR)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR1 (CDR-L1);
    e) 서열 번호 11 (SND)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR2 (CDR-L2); 및
    f) 서열 번호 12 (AAWDDSLSTYV)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 CDR3 (CDR-L3)
    을 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  29. 제23항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 키메라, 사람화 또는 사람 형태인, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  30. 제23항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 IgG 항체인, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  31. 제23항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  32. 제31항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이가 EU 넘버링 시스템에 따른 IgG4의 N434A, N434H, T307A/E380A/N434A, M252Y/S254T/T256E, 433K/434F/436H, T250Q, T250F, M428L, M428F, T250Q/M428L, N434S, V308W, V308Y, V308F, M252Y/M428L, D259I/V308F, M428L/V308F, Q311V/N434S, T307Q/N434A, E258F/V427T, S228P, L235E, S228P/L235E/R409K, S228P/L235E, K370Q, K370E, G446의 결실, K447의 결실 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 또는 이의 세트를 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  33. 제31항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 하나 이상의 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이가 EU 넘버링 시스템에 따른 IgG4의 S228P, F234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  34. 제23항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 Fab, F (ab)2, 단일 도메인 항체 또는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)인, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  35. 제1항 내지 제34항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 폐 섬유아세포 및/또는 마우스 섬유아세포로 수행된 세포 부착 검정에서 약 50 나노몰 미만의 IC50을 갖는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  36. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산.
  37. 제36항의 핵산을 포함하는 세포주.
  38. 제37항에 있어서, 상기 세포주가 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary) 세포주인, 세포주.
  39. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 정맥내 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  41. 제39항에 있어서, 피하 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  42. 제39항에 있어서, 종양내 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
  43. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양의 콜라겐 함량을 감소시키는 방법.
  44. 종양의 콜라겐 함량을 감소시키는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  45. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 암이 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암 또는 폐암을 포함하는, 방법.
  47. 암을 치료하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 암이 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암 또는 폐암을 포함하는 용도.
  49. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양에 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시키는 방법.
  50. 종양에서 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  51. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시키는 방법.
  52. 종양에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  53. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 종양에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키는 방법.
  54. 종양에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  55. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양에 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키는 방법.
  56. 종양에서 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  57. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출에 의해 측정되는 CD8+ T 세포 기능을 증가시키는 방법.
  58. CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출에 의해 측정되는 CD8+ T 세포 기능을 증가시키는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제39항 내지 제42항 중의 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  59. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는, 종양의 콜라겐 함량을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법.
  60. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는, 종양에서 M1 대식 세포 표현형을 증가시키고/시키거나 M2 대식 세포 표현형을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법.
  61. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는, 개체에서 억제성 과립구 골수성 세포 및/또는 종양 관련 대식 세포의 축적을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는 방법.
  62. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는, 개체의 종양에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시키기 위한 조성물을 제조하는 방법.
  63. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양의 CD8+ T 세포에 의한 인터페론 감마 발현 및/또는 방출을 증가시키기 위한 조성물을 제조하는 방법.
  64. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 혼합하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 조성물을 제조하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 암이 교모세포종, 췌장암, 유방암, 방광암, 신장암, 두경부암, 난소암, 피부암, 위암, 중피종, 간암, 자궁내막암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암 또는 폐암을 포함하는, 방법.
  66. 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현 및 분비를 허용하기에 충분한 조건하에 제37항 또는 제38항의 세포주를 세포 배양 배지에서 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제35항 중의 어느 한 항의 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법.
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