KR20210093270A - 인간화 항-SIRPα 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항암 요법에 사용하기 적합한 SIRPα에 대한 인간화 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 선택적으로 추가의 항암 치료제와 조합되는, 인간 고형 종양 및 혈액 종양의 치료에서의 인간화 항-SIRPα 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

인간화 항-SIRPα 항체
본 발명은 SIRPα에 대한 인간화 항체, 및 암 치료에 있어서의, 선택적으로 항암 치료제와 조합되는 이들 항체의 용도에 관한 것이다.
1990년대 후반부터, 종양 세포의 항원을 인식하는 치료용 항체가 암의 치료에 이용되어 왔다. 이들 치료용 항체는 다양한 경로를 통해 악성 세포에 작용할 수 있다. 악성 세포 상의 그의 표적에 대한 항체의 결합에 의해 촉발되는 신호전달 경로는 세포 증식의 억제 또는 아폽토시스를 초래한다. 치료용 항체의 Fc 영역은 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 및/또는 항체 의존성 세포성 식세포 작용(ADCP)을 유발할 수 있다. 또 다른 가능한 메커니즘은 T 세포(CD8+ 및/또는 CD4+) 항-종양 반응의 항체 의존성 유도일 수 있다(항체 의존성 항원 제시(ADAP); DiLillo and Ravetch Cell 2015, 161(5), 1035-1045; Bournazos and Ravetch Immunity 2017, 47(2), 224-233). 이것은 예를 들어 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포에서 발현되는 Fc 수용체를 통해 발생한다. 그러나, 치료용 항체는 종종 단일 요법으로서 충분히 효과적이지 않다. 치료용 항체의 효능을 개선하기 위한 한 방법은 ADCC 및/또는 ADCP의 개선을 통한 것이다. 이것은, 예를 들어 아미노산 치환에 의해, Fcγ 수용체에 대한 Fc 영역의 친화성을 개선함으로써(Richards et al. Mol. Cancer Ther. 2008, 7(8), 2517-2527) 또는 Fc 영역의 글리코실화에 영향을 줌으로써(Hayes et al. J. Inflamm. Res. 2016, 9, 209-219) 이루어져 왔다.
치료용 항체의 ADCC 및/또는 ADCP를 개선하는 또 다른 방법은 치료용 항체를 신호 조절 단백질 α(SIRPα)에 대한 길항성 항체 또는 항-CD47 항체(WO2009/131453)와 조합하는 것이다. CD47(적어도 여러 인간 종양 유형에서 상향조절되는 것으로 밝혀짐)이 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 및 호중구에서 발현된 억제성 면역수용체 SIRPα에 결합할 때, SIRPα는 식세포 작용 또는 면역 이펙터 세포의 다른 Fc 수용체 의존성 세포 파괴 메커니즘에 의해 암 세포의 파괴를 방지하는 억제 신호를 전달한다. 항-CD47 또는 항-SIRPα 항체가 작용하는 것으로 가정되는 메커니즘 중 하나는 CD47-SIRPα 축을 통해 생성된 억제 신호전달을 차단하여, ADCC 및/또는 ADCP 및/또는 ADAP를 증가시키는 것이다(Tjeng et al. Proc Natl Acad Sci USA 2013, 110(27), 11103-11108; Liu et al. Nature Med. 2015, 21(10), 1209-1215).
CD47-SIRPα 상호작용과 관련된 대부분의 임상 연구는 단일 요법으로서 및 치료용 항체와 조합한 요법으로서, 항-CD47 항체에 초점을 맞추고 있다(Weiskopf. Eur. J. Cancer 2017, 76, 100-109; Advani et al. N. Engl. J. Med. 2018, 379(18), 1711-1721). CD47이 또한 대부분의 정상 조직의 세포 표면에서 널리 발현된다는 사실에도 불구하고, 항암 치료제로서의 항-CD47 항체에 관한 연구가 증가하고 있다.
항-SIRPα 항체를 사용한 항암 단일 요법 또는 조합 요법에 대한 임상 연구는 수행되지 않았다. 항-SIRPα 항체에 대한 연구의 대부분은 CD47-SIRPα 상호작용에 관한 메커니즘 연구이며, 뮤린 항-SIRPα 항체를 사용하여 수행되었으며; 예를 들어, 뮤린 12C4 및 1.23A는 트라스투주맙 옵소닌화된 SKBR3 세포의 호중구 매개 ADCC를 증가시키는 것으로 보고되었다(Zhao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347). WO2015/138600은 뮤린 항-인간 SIRPα 항체 KWAR23 및 그의 키메라 Fab 단편을 개시하고 있으며, 이는 시험관 내에서 세툭시맙 매개 식세포 작용을 증가시켰다. N297A 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 부분을 갖는 인간화 KWAR23이 WO2018/026600에 개시되어 있다. WO2013/056352는 IgG4 29AM4-5 및 다른 IgG4 인간 항-SIRPα 항체를 개시하고 있다. 8 mg/kg으로 4주 동안 주당 3회 투여된 IgG4 29AM4-5는 NOD scid 감마(NSG) 마우스의 오른쪽 대퇴골에 주사된 원발성 인간 급성 골수성 백혈병(AML) 세포의 백혈병 생착을 감소시켰다. WO2017/178653은 SIRPα1 및 SIRPαBIT에 결합하지만 SIRPγ에는 결합하지 않는 키메라 항-SIRPα 항체 HEFLB를 개시하고 있다. 그러나, 항체는 인간화시 SIRPαBIT에 대한 결합을 유지하지만, SIRPα1에는 더 이상 결합하지 않는다. 예를 들어, 백인의 51.3%가 SIRPα1의 적어도 하나의 대립유전자를 가지고 있기 때문에, 그들의 면역 세포는 SIRPαBIT에만 결합하는 항체에 반응하지 않는다(이형접합성인 경우 적어도 부분적으로)(Treffers et al. Eur J Immunol. 2018, 48(2), 344-354). WO2018/057669는 인간 SIRPα1 및/또는 인간 SIRPαBIT의 도메인 1에 대한 인간화 닭 항-SIRPα 항체를 개시하고 있다. W02018/107058은 마우스 항-SIRPα 항체 3F9 및 9C2가 SIRPβ1v1에 결합하지 않는다는 것을 개시하고 있고, 그들은 따라서 이들 항체가 각각 1.Ox10-8 및 8.0x10-8 M의 평형 결합 상수를 가지면서 SIRPα 특이적이라고 결론내렸다. W02018/190719는 인간 SIRPγ에 또한 결합하지만 인간 SIRPβ1에는 결합하지 않는 인간화 항-SIRPα 항체를 개시하고 있다.
인간 SIRPα는 그의 NH2-말단 리간드 결합 도메인에서 고도로 다형성이고(Takenaka et al. Nature Immun. 2007, 8(12),1313-1323); SIRPαBIT(v1) 및 SIRPα1(v2)이 2개의 가장 일반적이며 가장 벗어난(13개의 잔기가 다른) 다형체이고, CD47에 대한 이들의 친화성은 매우 유사하다(Hatherley et al. J. Biol. Chem. 2014, 289(14), 10024-10028; Treffers et al. Eur J Immunol. 2018, 48(2), 344-354). 다른 생화학적으로 특성화된 인간 SIRP 패밀리 구성원은, CD47에 결합하지 않고 적어도 2종의 다형 변이체(SIRPβ1v1 및 SIRPβ1v2), 및 T 세포 및 활성화된 NK 세포에서 발현되고 SIRPα에 비해 약 10배 더 낮은 친화도로 CD47에 결합하는 SIRPγ이다(van Beek et al. J Immunol. 2005, 175(12), 7781-7). CD47-SIRPγ 상호작용은 각각 항원 제시 세포와 T 세포 사이의 접촉, T 세포 활성화의 공동 자극 및 T 세포 증식의 촉진에 관여한다(Piccio et al. Blood 2005, 105, 2421-2427). 더욱이, CD47-SIRPγ 상호작용은 T 세포의 경내피 이동에서 일정 역할을 수행한다(Stefanidakis et al. Blood 2008, 112, 1280-1289).
관련 기술 분야에 공지된 항-SIRPα 항체의 단점은 (i) 인간 SIRPγ와 같은 다른 인간 SIRP 패밀리 구성원에 결합하여 바람직하지 않은 부작용을 야기하기 때문에 인간 SIRPα에 특이적이지 않거나, 또는 (ii) 그의 특이성이 너무 제한되어 SIRPα 대립유전자 변이체 중 하나(예를 들어, SIRPαBIT 또는 SIRPα1)에만 결합하고, 인간 집단의 일부가 항-SIRPα 항체가 결합하지 않는 SIRPα 대립유전자 변이체를 가지고 있기 때문에 단일 요법 또는 조합 요법에 덜 적합하게 된다. 예를 들어, 선행 기술의 항체 KWAR23, SE5A5, 29AM4-5 및 12C4는 인간 SIRPγ에도 결합하기 때문에 특이적이지 않고, 따라서 T 세포 증식 및 동원에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 이와 반대로, 예를 들어 1.23A mAb는 너무 특이적이고, 인간 SIRPα 다형 변이체 SIRPα1만을 인식하며, 적어도 백인 집단에서 우세한 변이체 SIRPαBIT는 인식하지 못한다(Zhao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347; Treffers et al. Eur J Immunol. 2018, 48(2), 344-354). 또한, WO2017/178653에 개시된 인간화 항체 HEFLB는 SIRPα1에 결합하지 않고(SPR 측정; 실시예 섹션 참조) 심지어 SIRPαBIT의 하나의 대립유전자가 존재할 때에도 SIRPα1 운반자로부터 면역 이펙터 세포의 항-종양 활성을 촉진하지 않기 때문에 너무 특이적이다(도 3).
2개의 우세한 SIRPα 다형 변이체 SIRPαBIT 및 SIRPα1에 대한 특이적 결합을 보이고 SIRPγ에 결합하지 않으며 치료용 항체(항체 2-9)의 ADCC를 증가시키는 여러 길항성 키메라 항-SIRPα 항체가 나중에 공개된 WO2018/210793에서만 개시되어 있다. WO2018/210793의 표 1에서, 2개의 키메라 항체에 대한 인간화 변이체가 개시되어 있다(항체 10-16).
결론적으로, 단독으로 또는 추가의 항암 치료용 항체와 조합하여 항암 요법에 유용한 추가의 개선된 항-SIRPα 항체에 대한 관련 기술 분야의 요구가 여전히 존재한다. 보다 특히, 인간 SIRPγ에 대한 결합을 보이지 않거나 상기 결합이 낮거나 감소되어 바람직하지 않은 부작용에 대한 위험을 감소시키고, 인간 SIRPα1 및 인간 SIRPαBIT 다형 변이체 둘 모두에 결합하여 항체를 SIRPα1/SIRPαBIT 이형접합체, SIRPαBIT 동형접합체 및 SIRPα1 동형접합체를 비롯한 인간 집단의 많은 부분에 적합하도록 만드는 길항성 항-SIRPα 항체에 대한 필요성이 계속 존재한다. 상기 특징을 갖고 억제성, 즉 SHP-1 및/또는 SHP-2 매개 SIRPα 신호전달을 감소시키는 항-SIRPα 항체에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 항체는 단독으로, 또는 바람직하게는 항암 치료용 항체와 조합하여 항암 요법에 사용하기에 적합하다.
발명의 간단한 설명
본 발명은 항암 요법에 단독으로, 또는 바람직하게는 항암 치료용 항체와 같은 항암 요법과 조합하여 사용하기에 적합한 SIRPα에 대한 인간화 항체에 관한 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이고, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
a. 서열 번호 36을 포함하는 HCDR1;
b. 서열 번호 44를 포함하는 HCDR2;
c. 서열 번호 45를 포함하는 HCDR3;
d. 서열 번호 39를 포함하는 LCDR1;
e. 서열 번호 40을 포함하는 LCDR2; 및
f. 서열 번호 41을 포함하는 LCDR3.
바람직한 실시양태에서, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어지는 군으로부터의 하나 이상의 특성을 갖는다: (a) 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 51에 제시된 인간 SIRPα1 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명(SPR)(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 적어도 10-10 M, 바람직하게는 적어도 10-11 M의 결합 친화도로 인간 SIRPα1에 결합하고; (b) 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 52에 제시된 인간 SIRPαBIT 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 SPR(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 적어도 10-10 M, 바람직하게는 적어도 10-11 M의 결합 친화도로 인간 SIRPαBIT에 결합하고; (c) 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 56에 제시된 사이노몰거스 SIRPα 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 SPR(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 적어도 10-8 M, 바람직하게는 적어도 10-9 M의 결합 친화도로 사이노몰거스 원숭이 SIRPα에 결합하고; (d) 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 유세포 분석을 사용하여, 바람직하게는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 염색을 사용하여 T 세포 결합에 의해 측정될 때 인간 SIRPγ에 결합하지 않고; (e) 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 55에 제시된 인간 SIRPγ 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 SPR(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 인간 SIRPγ에 결합하지 않고; (f) 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 IL-2 효소 결합 면역흡착 스팟(ELISpot) 및/또는 T 세포 증식 검정에 의해 결정될 때 면역원성이 아니다.
바람직한 실시양태에서, 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 51에 제시된 인간 SIRPα1 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 SPR(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 적어도 10-10 M, 바람직하게는 적어도 10-11 M의 결합 친화도로 인간 SIRPα1에 결합하고; (b) 서열 번호 52에 제시된 인간 SIRPαBIT 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 SPR(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 적어도 10-10 M, 바람직하게는 적어도 10-11 M의 결합 친화도로 인간 SIRPαBIT에 결합하고; (c) 바람직하게는 SPR(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 포획된 CD47로부터의 해리에 의해, 보다 바람직하게는 실시예 6에 기재된 바와 같이 분석될 때 SIRPα1 및 SIRPαBIT에 대한 CD47 결합을 차단하고; (d) T 세포 유세포 분석, 바람직하게는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 염색에 의해 측정될 때 인간 SIRPγ에 결합하지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것으로, 여기서 (a) 항체의 중쇄 가변 도메인은 4개의 중쇄 프레임워크 영역 HFR1 내지 HFR4, 및 HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4의 순서로 작동 가능하게 연결된 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하고, 각각의 중쇄 프레임워크 영역은 서열 번호 8의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 90%의 아미노산 동일성을 갖거나, 또는 HFR1 내지 HFR4는 표 8 내지 11에 정의된 아미노산 치환 중 하나 이상에서 서열 번호 8과 상이하고; (b) 항체의 경쇄 가변 도메인은 4개의 경쇄 프레임워크 영역 LFR1 내지 LFR4, 및 LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4의 순서로 작동 가능하게 연결된 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하고, 각각의 경쇄 프레임워크 영역은 서열 번호 9의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 90%의 아미노산 동일성을 갖거나, 또는 LFR1, LFR2 및/또는 LFR4는 표 12 내지 14에 정의된 아미노산 치환 중 하나 이상에서 서열 번호 9와 상이하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 8의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호 9의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 인간화 항-SIRPα 항체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 동일한 항-SIRPα 항체와 비교하여 인간 Fcα 또는 Fcγ 수용체에 대한 결합의 감소, 바람직하게는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%의 감소 또는 100%의 감소를 나타내는 변형된 Fc 영역을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 변형된 인간 IgG1 Fc 영역은 Eu 넘버링에 따라 L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328 및 P329로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 변형된 인간 IgG1 Fc 영역은 다음 아미노산 치환을 포함한다: L234A 및 L235A; L234E 및 L235A; L234A, L235A 및 P329A; 또는 L234A, L235A 및 P329G. 보다 바람직하게는, 항체는 아미노산 치환 L234A 및 L235A; 또는, L234E 및 L235A를 포함한다. 가장 바람직하게는, 항체는 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 다른 아미노산 치환을 포함하지 않는다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 본 발명에 따른 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이며, 여기서 치료는 치료용 항체의 투여를 추가로 포함하고, 암은 바람직하게는 인간 고형 종양 또는 혈액 종양이다. 바람직하게는, 치료용 항체는 종양 세포의 표면 상의 막 결합 표적에 대해 작용하고, 인간 면역 이펙터 세포 상에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 결합하는 인간 Fc 영역을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 인간 고형 종양은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: (HER2-양성) 유방암, (EGFR-양성) 결장 암종, (GD2-양성) 신경모세포종, 흑색종, 골육종, (CD20-양성) B-세포 림프종, (CD38-양성) 다발성 골수종, (CD52-양성) 림프종, (CD33-양성) 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프성 백혈병(CLL), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 여포성 림프종(FL) 및 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)을 포함하는 비호지킨 림프종(NHL), 간세포 암종, 다발성 골수종(MM), 방광암, 위암, 난소암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 간세포 암종 및 폐암. 바람직한 실시양태에서, 치료는 예를 들어 표적화된 치료제, 바람직하게는 면역 치료제와 같은 추가의 항암 치료 화합물의 투여를 포함한다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것으로, 바람직하게는 핵산 분자는 항체의 HCVR 및 LCVR 중 적어도 하나를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 바람직하게는 코딩 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포에서 코딩 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다.
제6 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
도 1. 유세포 분석에 의한 인간 CD3+ T 세포를 발현하는 SIRPγ에 대한 항체의 결합. 데이터는 평균 형광 강도(MFI)(도 1a) 및 양성 세포의 백분율(%)(도 1b)로 표시된다. 기호는 건강한 두 개체의 측정값을 나타낸다.
도 2. 표적 세포로서 SKBR3 HER2-양성 유방암 세포를, 이펙터 세포로서 인간 호중구를 사용하여 측정된, 트라스투주맙(Tmab) 단독, 뮤린 12C4 항-SIRPα 항체(mu12C4)와 조합된 트라스투주맙, 뮤린 12C4 가변 영역이 인간 IgG1 불변 영역에 이식된 항체(12C4huIgG1)와 조합된 트라스투주맙, 및 뮤린 12C4 가변 영역이 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역에 이식된 항체(12C4huIgG1LALA; 본원에서 12C4-LALA로도 표시됨)와 조합된 트라스투주맙의 % 세포독성으로 측정된 ADCC의 비교. 2개의 SIRPαBIT 대립유전자를 보유한 인간 공여자로부터 호중구를 단리하였다. 증가하는 농도, 각각 0, 0.05, 0.5 및 5 μg/ml의 트라스투주맙, 및 증가하는 농도의 각각의 항-SIRPα 항체(각각 0.2, 2 및 20 μg/ml)가 사용되었다.
도 3. 다양한 농도(μg/ml; 용량-반응 곡선)의 선행 기술 기반 항-SIRPα 항체와 조합된, 트라스투주맙(Tmab; 10 μg/ml) 옵소닌화된 SKBR3 세포에 대한 호중구 매개 ADCC. 호중구는 1개의 SIRPα1 및 1개의 SIRPαBIT 대립유전자를 보유한 이형접합성 인간 공여자로부터 단리되었다. 각각의 개별 호중구 공여자는 기호로 표시된다. 열은 모든 공여자의 평균이다. 대조군으로서, 미처리 세포 및 10 μg/ml 트라스투주맙으로 처리된 세포를 사용하였다. 데이터는 트라스투주맙에 대한 반응(100%로 설정)에 대해 정규화된다. 실험은 G-CSF 및 IFNγ로 O/N 자극된 호중구로 수행되었다. 세포독성은 DELFIA 세포독성 검정으로 측정되었다.
도 4. 다양한 농도(μg/ml; 용량-반응 곡선)의 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 갖는, 본 발명의 항-SIRPα 항체 1-6과 조합된, 트라스투주맙(Tmab; 10 μg/ml) 옵소닌화된 SKBR3 세포에 대한 호중구 매개 ADCC. 호중구는 1개의 SIRPα1 및 1개의 SIRPαBIT 대립유전자를 보유한 인간 공여자로부터 단리되었다. 각각의 개별 호중구 공여자는 기호로 표시된다. 열은 모든 공여자의 평균이다. 대조군으로서, 미처리 세포 및 10 μg/ml 트라스투주맙으로 처리된 세포를 사용하였다. 데이터는 트라스투주맙에 대한 반응(100%로 설정)에 대해 정규화된다. 실험은 G-CSF 및 IFNγ로 O/N 자극된 호중구로 수행되었다. 세포독성은 DELFIA 세포독성 검정으로 측정되었다.
도 5. 다양한 농도(μg/ml; 용량-반응 곡선)의 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 갖는, 본 발명의 항-SIRPα 항체 7-13과 조합된, 트라스투주맙(Tmab; 10 μg/ml) 옵소닌화된 SKBR3 세포에 대한 호중구 매개 ADCC. 호중구는 1개의 SIRPα1 및 1개의 SIRPαBIT 대립유전자를 보유한 인간 공여자로부터 단리되었다. 각각의 개별 호중구 공여자는 기호로 표시된다. 열은 모든 공여자의 평균이다. 데이터는 트라스투주맙에 대한 반응(100%로 설정)에 대해 정규화된다. 실험은 G-CSF 및 IFNγ로 O/N 자극된 호중구로 수행되었다. 세포독성은 DELFIA 세포독성 검정으로 측정되었다.
도 6. 다양한 농도(μg/ml; 용량-반응 곡선)의 선행 기술 기반 항-SIRPα 항체와 조합된, 트라스투주맙(Tmab; 10 μg/ml) 옵소닌화된 SKBR3 세포에 대한 호중구 매개 ADCC. 호중구는 2개의 SIRPα1 대립유전자를 보유한 인간 공여자로부터 단리되었다. 각각의 개별 호중구 공여자는 기호로 표시된다. 열은 모든 공여자의 평균이다. 대조군으로서, 미처리 세포 및 10 μg/ml 트라스투주맙으로 처리된 세포를 사용하였다. 데이터는 트라스투주맙에 대한 반응(100%로 설정)에 대해 정규화된다. 실험은 GM-CSF로 100분 동안 자극된 호중구로 수행되었고, 세포독성은 51Cr 방출 검정으로 측정되었다.
도 7. 다양한 농도(μg/ml; 용량-반응 곡선)의 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 갖는, 본 발명의 항-SIRPα 항체 7-13과 조합된, 트라스투주맙(Tmab; 10 μg/ml) 옵소닌화된 SKBR3 세포에 대한 호중구 매개 ADCC. 호중구는 2개의 SIRPα1 대립유전자를 보유한 인간 공여자로부터 단리되었다. 각각의 개별 호중구 공여자는 기호로 표시된다. 열은 모든 공여자의 평균이다. 대조군으로서, 미처리 세포 및 10 μg/ml 트라스투주맙으로 처리된 세포를 사용하였다. 데이터는 트라스투주맙에 대한 반응(100%로 설정)에 대해 정규화된다. 실험은 GM-CSF로 100분 동안 자극된 호중구로 수행되었고, 세포독성은 51Cr 방출 검정으로 측정되었다.
도 8. 다양한 농도(μg/ml; 용량-반응 곡선)의 선행 기술 기반 항-SIRPα 항체와 조합된, 트라스투주맙(Tmab; 10 μg/ml) 옵소닌화된 SKBR3 세포에 대한 호중구 매개 ADCC. 호중구는 2개의 SIRPαBIT 대립유전자를 보유한 인간 공여자로부터 단리되었다. 각각의 개별 호중구 공여자는 기호로 표시된다. 열은 모든 공여자의 평균이다. 대조군으로서, 미처리 세포 및 10 μg/ml 트라스투주맙으로 처리된 세포를 사용하였다. 데이터는 트라스투주맙에 대한 반응(100%로 설정)에 대해 정규화된다. 실험은 GM-CSF로 100분 동안 자극된 호중구로 수행되었고, 세포독성은 51Cr 방출 검정으로 측정되었다.
도 9. 다양한 농도(μg/ml; 용량-반응 곡선)의 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 갖는, 본 발명의 항-SIRPα 항체 1-6과 조합된, 트라스투주맙(Tmab; 10 μg/ml) 옵소닌화된 SKBR3 세포에 대한 호중구 매개 ADCC. 호중구는 2개의 SIRPαBIT 대립유전자를 보유한 인간 공여자로부터 단리되었다. 각각의 개별 호중구 공여자는 기호로 표시된다. 열은 모든 공여자의 평균이다. 대조군으로서, 미처리 세포 및 10 μg/ml 트라스투주맙으로 처리된 세포를 사용하였다. 데이터는 트라스투주맙에 대한 반응(100%로 설정)에 대해 정규화된다. 실험은 GM-CSF로 100분 동안 자극된 호중구로 수행되었고, 세포독성은 51Cr 방출 검정으로 측정되었다.
도 10a-d. 대표적인 건강한 이형 접합성 SIRPα1/SIRPαBIT 공여자의 전혈에서 유세포 분석에 의해 결정된, 과립구(왼쪽 패널), CD14+ 단핵구(중간 패널) 및 CD3+ T-세포(오른쪽 패널)에 대한 표시된 항-SIRPα 항체의 결합. 각각의 항-SIRPα 항체에 대한 관련 이소형 대조군이 각각의 그래프에 제공된다. 데이터는 평균 형광 강도(MFI)로 표시된다.
도 11. 유세포 분석에 의해 결정된, 건강한 공여자의 버피 코트(buffy coat)로부터 단리된 SIRPγ 발현 인간 CD3+ T 세포에 대한 표시된 항-SIRPα 항체의 결합. 각각의 항-SIRPα 항체에 대한 관련 이소형 대조군이 각각의 그래프에 제공된다. 데이터는 평균 형광 강도(MFI)로 표시된다.
도 12a. 일정 농도 범위의 항체 6 또는 이소형 대조군의 부재 또는 존재 하에 CD47 리간드 세포로서 Jurkat E6.1 세포와 함께 Jurkat SIRPαBIT 신호전달 세포를 사용하는 상대 발광 단위(RFU)에 의해 측정된, SIRPα에 대한 SHP-1의 동원. 최대 신호의 %는 다음과 같이 결정되었다: (RLU/최대 자극의 RLU(항체 없음) * 100). 결과는 2개의 독립적인 실험의 평균 +/- SEM으로 표시된다.
도 12b. Jurkat SIRPαBIT 신호전달 세포 및 CD47 리간드 세포로서 Jurkat E6.1 세포를 사용하여 측정된, SIRPαBIT 신호전달 억제에 대한 3.3 μg/ml의 표시된 항-SIRPα 항체의 효능 수준. 효능 수준은 다음과 같이 계산되었다: 100% - 3.3 μg/ml 화합물 값의 '최대 신호의 %'. 결과는 2개의 독립적인 실험의 평균 +/- SEM으로 표시된다.
도 13a-b. 본 발명의 항-SIRPα 항체 6 및 표시된 참조 항체와 조합된, 트라스투주맙(Tmab; 10 μg/ml) 옵소닌화된 SKBR3 세포에 대한 호중구 매개 ADCC. 호중구는 2개의 SIRPαBIT 대립유전자를 보유하거나 2개의 SIRPα1 대립유전자를 보유하거나 1개의 SIRPαBIT 및 1개의 SIRPα1 대립유전자를 보유한 인간 공여자로부터 단리되었다. 열은 모든 공여자의 평균 +/- SEM이다. 대조군으로서, 미처리 세포 및 10 μg/ml 트라스투주맙으로 처리된 세포를 사용하였다. 각각의 항체에 대해, 10, 1, 0.1 및 0.01 μg/ml(왼쪽에서 오른쪽으로)에서 용량-반응 곡선을 만들었다. 항체 6 및 참조 항체는 패널 (a)에 표시된다. 이소형 대조군은 패널 (b)에 표시된다. 데이터는 트라스투주맙에 대한 반응(100%로 설정)에 대해 정규화된다. 실험 섹션 10에 표시된 바와 같이 실험을 수행하였다.
도 14a-b. 본 발명의 항-SIRPα 항체 6 및 표시된 참조 항체와 조합된, 세툭시맙(5 μg/ml) 옵소닌화된 A431 세포에 대한 호중구 매개 ADCC. 호중구는 2개의 SIRPαBIT 대립유전자를 보유하거나 2개의 SIRPα1 대립유전자를 보유하거나 1개의 SIRPαBIT 및 1개의 SIRPα1 대립유전자를 보유한 인간 공여자로부터 단리되었다. 열은 모든 공여자의 평균이다. 대조군으로서, 미처리 세포 및 5 μg/ml 세툭시맙으로 처리된 세포를 사용하였다. 각각의 항체에 대해, 10, 1, 0.1 및 0.01 μg/ml(왼쪽에서 오른쪽으로)에서 용량-반응 곡선을 만들었다. 항체 6 및 참조 항체는 패널 (a)에 표시된다. 이소형 대조군은 패널 (b)에 표시된다. 데이터는 세툭시맙에 대한 반응(100%로 설정)에 대해 정규화된다. 실험 섹션 10에 표시된 바와 같이 실험을 수행하였다.
발명의 상세한 설명
정의
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체(mAb)를 지칭한다. 항체는 IgA, IgE, IgG 또는 IgM 항체와 같은 임의의 이소형일 수 있다. 항체는 또한 IgGA 교차 이소형일 수 있다(Kelton et al. Chemistry and Biology, 2014, 21, 1603-1609). 바람직하게는, 항체는 IgG 항체, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체, 보다 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 항체이다. 용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 항체와 상호 교환 가능하게 사용된다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.
기본 4쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H) 사슬로 이루어진 이종사량체 당단백질이다(IgM 항체는 J 사슬로 칭해지는 추가의 폴리펩타이드와 함께 5개의 기본 이종사량체 단위로 이루어지고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 포함하는 반면, 분비되는 IgA 항체는 중합되어 J 사슬과 함께 2-5개의 기본 4쇄 단위를 포함하는 다가 조립체를 형성할 수 있다). IgG의 경우, 4쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 반면, 2개의 H 사슬은 H 사슬 이소형에 따라 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 그러나, IgG는 그 기능을 유지하면서 하나 이상의 디설파이드 결합이 결여될 수 있다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬내 디설파이드 다리를 가지고 있다. 각각의 H 사슬은 N 말단에 가변 도메인(VH)이 있고, 이어서 α 및 γ 사슬 각각에 대해 3개의 불변 도메인(CH)이 존재하고, μ 및 ε 이소형에 대해 4개의 CH 도메인이 존재한다. 일반적으로, H 사슬은 전형적으로 제1 불변 영역과 제2 불변 영역 사이에 힌지 영역을 포함한다. 각각의 L 사슬은 N 말단에 가변 도메인(VL)을 갖고, 그의 다른 쪽 끝에 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 L 사슬과 H 사슬 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL의 쌍은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, page 71 and Chapter 6 (1994)]을 참조한다.
임의의 척추동물 종으로부터의 L 사슬은 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 칭해지는 두 가지의 분명하게 구별되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다. 중쇄(CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스 또는 이소형에 할당될 수 있다. 면역글로불린에는 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이라는 5가지 클래스가 존재한다. α 및 γ 클래스는 CH 서열 및 기능의 상대적으로 작은 차이를 기준으로 하위 클래스로 추가로 나뉘고, 예를 들어 인간은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2의 하위 클래스를 발현한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간화 또는 인간 항체이다. 훨씬 더 바람직하게는, 항체는 인간화 또는 인간 IgG 항체, 가장 바람직하게는 인간화 또는 인간 IgG1 mAb이다. 항체는 κ 또는 λ 경쇄, 바람직하게는 κ 경쇄(예를 들어, 서열 번호 26에 제시된), 즉, 인간화 또는 인간 IgG1-κ 항체를 가질 수 있다. 본 발명의 항체는 조작된 불변 영역을 포함할 수 있으며, 예를 들어 하나 이상의 돌연변이가 도입되어, 예를 들어 반감기를 증가시키고/시키거나 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체" 및 "mAb"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻은 항체를 의미한다. 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 모노클로날 항체를 생성하기 위해 관련 기술 분야에 공지된 여러 방법이 존재한다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 모노클로날 항체는 원하는 항원을 제시하는 펩타이드의 혼합물로 동물을 면역화함으로써 생성될 수 있다. 그 후, B-림프구는 단리되어 골수종 세포와 융합될 수 있거나, 단일 B-림프구는 조건화된 배지 및 피더 세포의 존재 하에 며칠 동안 배양될 수 있다. 생산된 항체를 포함하는 골수종 또는 B-림프구 상청액을 시험하여 적합한 B-림프구 또는 하이브리도마를 선택한다. 모노클로날 항체는 문헌 [Koeler et al. Nature 1975, 256, 495-497]에 의해 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 적합한 하이브리도마로부터 제조될 수 있다. 대안적으로, 적합한 B-세포 또는 림프종이 용해될 수 있고, RNA가 단리되고, 역전사되고, 서열결정될 수 있다. 항체는 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법으로 만들 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조).
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단 도메인을 의미한다. 용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 세그먼트가 항체 간에 서열이 광범위하게 다르다는 사실을 의미한다. 가변 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 약 110개 아미노산 범위에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 그 대신, 가변 영역은 각각 대략 9-12개의 아미노산 길이이지만 예를 들어 5개 아미노산 잔기의 길이를 갖는 본 발명의 mAb의 HCDR1처럼 더 짧거나 더 길 수 있는 "초가변 영역"(HVR) 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 칭해지는 극단적인 가변성의 보다 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)으로 칭해지는 비교적 불변의 스트레치로 구성된다. 자연 발생 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR을 포함하며, FR은 주로 β-시트 구성을 채택하고, 루프 연결을 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된다. 각각의 사슬에서 CDR은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합하는 데 직접 관여하지 않지만, ADCC 및/또는 ADCP에서 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 단편"은 원하는 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 나타내는 한, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 및 rIgG 단편을 포함한다. 용어 "항원 결합 단편"은 단일 사슬(sc) 항체, 단일 도메인(sd) 항체, 디아바디 또는 미니바디를 추가로 포함한다. 예를 들어, 항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편으로 칭해지는 2개의 동일한 항원 결합 단편 및 쉽게 결정화할 수 있는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 "Fc" 단편을 생성한다. Fab 단편은 H 사슬의 가변 영역 도메인(VH) 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 함께 전체 F 사슬로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가이다. 즉, 이 단편은 단일 항원 결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 2가 항원 결합 활성을 갖는 2개의 디설파이드 연결된 Fab 단편에 대략 상응하고 여전히 항원을 가교결합할 수 있는 하나의 큰 F(ab')2 단편을 생성한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 C 말단에 몇개의 잔기를 추가로 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그 사이에 힌지 시스테인이 있는 한 쌍의 Fab' 단편으로 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다. Fc 단편은 디설파이드에 의해 함께 결합된 두 H 사슬의 C 말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식되는 부분이기도 한 Fc 영역의 서열에 의해 결정된다. "Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 단단한 비공유 회합을 통해 하나의 중쇄 가변 영역 도메인 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 단일 사슬 Fv(scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 유연한 펩타이드 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있으므로, 중쇄 및 경쇄가 2개 사슬의 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합될 수 있다. 이들 2개의 도메인의 폴딩으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 F 사슬로부터 각각 3개의 루프)가 생성된다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다는 낮은 친화성지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가지고 있다. 또한, "sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일 사슬 Fv"는 단일 폴리펩타이드 사슬로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩타이드는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩타이드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. sFv에 대한 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. "rIgG"는 약 75,000달톤의 환원된 IgG을 의미하며, 예를 들어 2-메르캅토에틸아민(2-MEA)과 같은 약한 환원제를 사용하여 힌지 영역 디설파이드 결합만을 선택적으로 환원시켜 생산할 수 있다.
용어 "항-SIRPα 항체" 또는 "SIRPα에 결합하는 항체"는 항체가 SIRPα 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 SIRPα에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 항-SIRPα 항체가 관련되지 않은 비-SIRP 단백질에 결합하는 정도는 예를 들어 방사성 면역 검정(RIA), 표면 플라스몬 공명(SPR) 또는 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA)에 의해 측정될 때 SIRPα에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 비관련 표적에 대한 결합은 예를 들어 Retrogenix™와 같은 세포 마이크로어레이 기술을 사용하여 프로파일링할 수도 있다.
"단리된 항체"는 그의 자연 환경의 구성 요소로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 치료적 사용을 방해할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 결정될 때 항체의 95 중량% 초과로, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cup sequenator)의 사용에 의한 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 잔기를 수득하는데 충분한 정도로, (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue), 또는 바람직하게는 은 염색을 사용한 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 항체는, 항체의 자연 환경 중의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합체 세포 내의 동일 반응계의 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화도"는 결합쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 그의 파트너 Y에 대한 분자 X의 결합 친화도는 특정 항원-항체 상호작용의 평형 해리 상수("결합 상수"로도 지칭됨; KD)를 지칭한다. KD는 해리 속도(koff) 대 회합 속도(kon)의 비율이다. 결과적으로, KD는 koff/kon과 같고, 몰 농도(M)로서 표시된다. KD가 작을수록 결합 친화력이 강해진다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 관련 기술 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 반면, 고친화도 항체는 일반적으로 항원에 더 빨리 결합하고 더 오래 결합된 상태로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 예시적인 특정 실시양태가 다음에 설명된다. 일반적으로, KD 값은 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 결정되며, 이는 일반적으로 예를 들어 실시예 섹션에서 설명되는 바와 같이 관련 기술 분야에 알려진 방법(예를 들어, E.S. Day et al. Anal. Biochem. 2013, 440, 96-107)을 사용하여 바이오센서 시스템(예를 들어, BIAcore™)을 사용한다. 대안적으로, "결합 친화도"라는 용어는 또한 예를 들어 ELISA 검정으로 결정되거나 유세포 분석에 의해 결정되는 1/2 최대 결합(EC50)을 제공하는 항체의 농도를 지칭할 수 있다.
관심 항원 또는 관심 항원들, 예를 들어 SIRPα 항원 표적에 "결합하는" 항체는 항체가 항원(들)을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는데 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합하고 다른 단백질과 유의하게 교차 반응하지 않는 항체이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체는 인간 SIRPα, 즉, 적어도 인간 SIRPα1 및 인간 SIRPαBIT, 바람직하게는 사이노몰거스 SIRPα, 및 가능하게는 SIRPβ1v1 및/또는 SIRPβ1v2에 결합하지만, SIRPγ 또는 관련되지 않는 단백질에는 결합하지 않는다. 이러한 실시양태에서, "비표적" 단백질에 대한 항체의 결합 정도는 바람직하게는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석 또는 방사성 면역침전 검정(RIPA)에 의해 결정될 때 그의 특정 표적 단백질에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만, 보다 바람직하게는 약 5% 미만, 보다 바람직하게는 약 2% 미만, 보다 바람직하게는 약 1 미만일 것이다. 표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"이라는 용어는 비특이적 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 표지되지 않은 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우, 표지된 표적의 프로브에 대한 결합이 과량의 표지되지 않은 표적에 의해 경쟁적으로 억제되면 특이적 결합으로 표시된다. 본 명세서에서 사용되는 특정 폴리펩타이드(들) 또는 특정 폴리펩타이드 표적(들) 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인"이라는 용어는 예를 들어 25℃에서 SPR에 의해 결정될 때 적어도 약 10-7 M, 바람직하게는 적어도 약 10-8 M, 보다 바람직하게는 적어도 약 10-9 M, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 10-10 M, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 10-11 M, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 10-12 M의 표적에 대한 KD(상기 기재된 바와 같이 결정될 수 있는)를 갖는 분자에 대해 사용될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "저친화도"는 "결합하다/결합하지 않는다" 또는 "결합하고 있다/결합하고 있지 않다"라는 문구와 상호 교환 가능하고, ELISA 검정을 사용하여 결정될 때 1,500 ng/ml 초과의 EC50의 항체와 그의 항원 사이의 결합 친화도를 지칭하고/하거나, 바람직하게는 25℃에서 SPR에 의해 결정될 때 고정된 항원과 항체 사이에 특이적 결합이 관찰되지 않거나 제한된 특이적 결합이 관찰되는 경우, 예를 들어 25℃에서 SPR에 의해 결정될 때 항체와 항원 사이의 KD가 예를 들어 10-7 M 초과, 10-6 M 초과 또는 심지어 이보다 더 높을 때를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "고친화도"는 항체와 그의 항원 사이의 결합 친화도를 지칭하며, 여기서 KD는 실시예에서 설명되는 바와 같이 25℃에서 SPR에 의해 결정될 때 일반적으로 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 미만 또는 이보다 훨씬 더 낮다.
비인간(예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 항체로부터 유래 된 최소 서열을 포함하는 항체(예를 들어, 비인간-인간 키메라 항체)이다. 비인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, H 사슬(VH) 및 L 사슬(VL)의 가변 영역(VR)에 있는 항원 결합 CDR은 비인간 종, 일반적으로 마우스, 래트 또는 토끼의 항체로부터 유래한다. 이러한 비인간 CDR은 결합 친화도 및 특이성과 같은 항체의 기능적 특성이 적어도 부분적으로 유지되도록 VH 및 VL 영역의 인간 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)과 조합된다. 인간 FR에서 선택된 아미노산은 낮은 면역원성을 유지하면서 결합 친화도를 개선하는 것과 같은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 상응하는 원래의 비인간 종 아미노산으로 교체될 수 있다. 대안적으로, 인간에서 자연적으로 생성된 항체 변이체와의 유사성을 증가시키기 위해 그의 아미노산 서열을 변형함으로써 비인간 항체를 인간화할 수 있다. 예를 들어, 원래의 비인간 종 FR의 선택된 아미노산은 항체의 결합 친화도를 유지하면서 면역원성을 감소시키기 위해 상응하는 인간 아미노산으로 교체된다. 비인간 항체의 인간화를 위한 예시적인 방법은 인간 항체의 상응하는 서열을 CDR로 대체함으로써 시행되는 윈터(Winter) 및 동료의 방법이다(Jones et al. Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann et al. Nature 1988, 332, 323-327; Verhoeyen et al. Science 1988, 239, 1534-1536).
따라서, 인간화 가변 영역은 일반적으로 인간 불변 영역과 조합될 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR이 비인간 면역글로불린의 CDR에 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 면역글로불린 서열의 FR인 2개의 가변 도메인을 일반적으로 포함할 것이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 자세한 내용에 대해서는, 문헌 [Jones et al. Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann et al. Nature 1988, 332, 323-327; 및 Presta. Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2, 593-596]을 참조한다. 또한, 다음 리뷰 기사 및 여기에서 인용된 참고문헌을 참조한다: Vaswani and Hamilton. Ann. Allergy, Asthma and Immunol. 1998, 1, 105-115; Harris. Biochem. Soc. Transactions 1995, 23, 1035-1038; 및 Hurle and Gross. Curr. Op. Biotech. (1994), 5, 428-433.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "초가변 영역", "HVR"은 서열에서 초가변성이고/이거나 항원 결합을 담당하는 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 다음과 같은 6개의 초가변 영역을 포함한다. VH에 3개(H1, H2, H3), VL에 3개(LI, L2, L3). 다수의 초가변 영역 묘사가 사용되고 있으며, 본 발명에 포함된다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 따라 넘버링될 때 VL에서의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 VH에서의 대략 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3) 주위; Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991); 및/또는 "초가변 루프"의 아미노산 잔기(예를 들어, 코티아(Chothia) 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 VL에서의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 VH에서의 26-32(H1), 52-56(H2) 및 95-101(H3); Chothia and Lesk. J. Mol. Biol. 1987, 196, 901-917); 및/또는 "초가변 루프"/CDR로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, IMGT 넘버링 시스템에 따라 넘버링될 때 VL에서의 잔기 27-38(L1), 56-65(L2) 및 105-120(L3), 및 VH에서의 27-38(H1), 56-65(H2) 및 105-120(H3); Lefranc et al. Nucl. Acids Res. 1999, 27, 209-212, Ruiz et al. Nucl. Acids Res. 2000, 28, 219-221). 선택적으로, 항체는 문헌 [Honneger and Plunkthun (Mol. Biol. 2001, 309, 657-670)]에 따라 넘버링될 때 VL에서의 위치 28, 36(L1), 63, 74-75(L2) 및 123(L3) 및 VH에서의 28, 36(H1), 63, 74-75(H2) 및 123(H3) 중 하나 이상에서 대칭 삽입을 갖는다. 돈델린저(Dondelinger) 등은 몇 가지의 넘버링 시스템 및 그의 용도를 검토하였다(Dondelinger et al. Frontiers in Immunology, 2018, 9, Art2278). 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편의 HVR/CDR은 바람직하게는 카바트 넘버링 시스템에 따라 정의되고 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "차단" 항체 또는 "길항(제)" 항체는 천연 리간드가 결합하는 것을 부분적으로 또는 완전히 방지하는 항체를 의미한다. 예를 들어, 항-SIRPα 차단 항체는 CD47이 SIRPα에 결합하는 것을 방지한다. 바람직한 차단 항체 또는 길항(제) 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질, 예를 들어 항체에 의해 결합되는 분자의 부분이다. 이 용어는 항체 또는 T-세포 수용체와 같은 항원 결합 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정자를 포함한다. 에피토프는 인접하거나 비인접할 수 있다(예를 들어, 폴리펩타이드에서, 아미노산 잔기는 폴리펩타이드 서열에서 서로 인접하지 않지만, 분자의 맥락, 즉 3차 구조 내에서는 항원 결합 단백질에 의해 결합됨). 특정 실시양태에서, 에피토프는 항원 결합 단백질을 생성하기 위해 사용되는 에피토프와 유사한 3차원 구조를 포함하지만, 항원 결합 단백질을 생성하기 위해 사용되는 에피토프에서 발견되는 아미노산 잔기를 전혀 포함하지 않거나 일부만 포함한다는 점에서 모방체일 수 있다. 가장 자주, 에피토프는 단백질에 존재하지만, 일부 경우에는 핵산과 같은 다른 종류의 분자에 존재할 수 있다. 에피토프 결정자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 설포닐 또는 설페이트기와 같은 분자의 화학적 활성 표면 기들을 포함할 수 있으며, 특정 3차원 구조적 특징 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복잡한 혼합물에서 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다. SIRPα의 세포외 도메인은 예를 들어 도메인 d1, d2 또는 d3에 에피토프를 보유할 수 있다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 야생형 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 그의 C-말단까지 연장되는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산을 재조합 방식으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 온전한 항체의 조성은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 있거나 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함한다.
"기능적 Fc 영역"은 야생형 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 갖는다. 항체 이펙터 기능은 항체 이소형에 따라 다르다. 예시적인 "이펙터 기능"은 보체 성분 1q(C1q) 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; ADCP; ADAP; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절 및 B 세포 활성화를 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 하고, 예를 들어 본원의 정의에 개시된 바와 같이 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"야생형 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 야생형 서열 인간 Fc 영역은 야생형 서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 동종이인자형(allotype)); 야생형 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 야생형 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 야생형 서열 인간 IgG4 Fc 영역 및 그의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)로 인해 야생형 서열 Fc 영역의 것과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 야생형 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 야생형 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 야생형 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성을 가질 것이고, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 상동성을 가질 것이다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성"("항체 의존성 세포성 세포독성"이라고도 함) 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 단핵구/대식세포)에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원 함유 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있도록 만드는 세포독성의 형태를 지칭한다. NK 세포는 FcγRIIIA만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRIIA/B 및 FcγRIIIA를 발현한다. 또한, 인간 혈액에서 가장 풍부한 백혈구인 호중구 역시 ADCC를 매개하며, 이는 일반적으로 FcγRIIA에 의존한다(Zhao et al. Natl Acad Sci U S A. 2011, 108 (45), 18342-7; Treffers et al. Eur J Immunol. 2018, 48(2), 344-354; Matlung et al. Cell Rep. 2018, 23 (13), 3946-3959). 조혈 세포에 대한 FcR 발현은 문헌 [Bruhns and Joensson Immunol Rev. 2015, 268(1), 25-51]의 33페이지 표 2에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예를 들어 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재되어 있는 검정 또는 실시예에 기재되어 있는 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포에는 단핵구와 NK 세포의 혼합물을 포함하는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 또는 단리된 단핵구, 호중구 또는 NK 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1998, 95, 652-656]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 또는 문헌 [Zhao et al., PNAS 2011]에 기재되어 있는 B16F10 모델과 같은 잘 알려진 종양 모델에서 평가될 수 있다. "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하는 것이다. 바람직한 FcR은 야생형 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것이고 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 선택적으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위클래스의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)를 포함한다(문헌 [Daeron M. Annu. Rev. Immunol. 1997, 15, 203-234] 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet. Annu. Rev. Immunol. 1991, 9, 457-492; Capel et al. Immunomethods 1994, 4, 25-34; 및 de Haas et al. J. Lab. Clin. Med. 1995, 126, 330-341]에서 검토된 바 있다. 향후 확인될 것을 포함하는 다른 FcR이 본원에 사용되는 용어 "FcR"에 포함된다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 FcγRIIA(호중구 또는 단핵구) 또는 FcγRIIIA(NK 세포 또는 단핵구)를 발현하고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 PBMC, NK 세포, 단핵구, 대식세포 및 호중구가 포함되며, 호중구가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액, 바람직하게는 인간 혈액으로부터 단리될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료용 항체"는 인간 요법에 적합한 상기 정의된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 인간 요법에 적합한 항체는 특정 인간 질병의 치료에 충분한 품질이고 안전하며 효과적이다. 우수 의약품 제조 관리 기준(Good Manufacturing Practice)에 대해 확립된 지침을 사용하여 품질을 평가할 수 있고; 안전성 및 효능은 일반적으로 유럽 의약국(EMA) 또는 미국 식품의약국(FDA)과 같은 의약품 규제 당국의 확립된 지침을 사용하여 평가된다. 이러한 지침은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 명세서에서, 용어 "치료용 항체"는 항-SIRPα 항체를 포함하지 않는다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료용 항체"는 예를 들어 항-CD20, 항-HER2, 항-GD2, 항-EGFR 또는 항-CD70 항체와 같은 항암 항체를 의미한다.
"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 두 서열의 길이에 따라 전역 또는 국소 정렬 알고리즘을 사용하여 두 개의 아미노산 서열 또는 두 개의 뉴클레오타이드 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는 전역 정렬 알고리즘(예를 들어, 니들만 및 분쉬(Needleman and Wunsch))을 사용하여 정렬되는 것이 바람직한 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 국소 정렬 알고리즘(예를 들어, Smith Waterman)을 사용하여 정렬되는 것이 바람직하다. 이 때, 서열은 (예를 들어, 디폴트 파라미터를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되는 경우) 서열 동일성의 특정 최소 백분율(하기 정의된 바와 같음)을 공유할 때, "실질적으로 동일한" 또는 "본질적으로 유사한" 것으로 언급될 수 있다. GAP은 니들만 및 분쉬 전역 정렬 알고리즘을 사용하여 이들의 전체 길이(전장)에 걸쳐 두 개의 서열을 정렬하고, 일치하는 수를 최대화하며, 갭을 최소화한다. 전역 정렬은 두 서열이 유사한 길이를 갖는 경우 서열 동일성을 결정하는데 적절히 사용된다. 일반적으로, 갭 생성 페널티 = 50(뉴클레오타이드)/8(단백질) 및 갭 연장 페널티 = 3(뉴클레오타이드)/2(단백질)의 GAP 디폴트 파라미터가 사용된다. 뉴클레오타이드에 대해, 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스는 nwsgapdna이며, 단백질에 대해 디폴트 스코어링 매트릭스는 Blosum62이다(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). 서열 정렬 및 서열 동일성 백분율에 대한 스코어는 GCG 위스콘신 패키지(Wisconsin Package), Version 10.3(미국 92121-3752 캘리포니아주 샌 디에고 스크랜턴 로드 9685 소재의 Accelrys Inc.로부터 구입가능함)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 또는 EmbossWIN version 2.10.0으로 프로그램 "니들(needle)"(global Needleman Wunsch 알고리즘 사용) 또는 "워터(water)"(local Smith Waterman 알고리즘 사용)과 같은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여, 또는 디폴트 설정('니들' 및 '워터' 둘 모두에 대해, 및 단백질 및 DNA 정렬 둘 모두에 대해, 디폴트 갭 오프닝 페널티는 10.0이며, 디폴트 갭 연장 페널티는 0.5이고; 디폴트 스코어링 매트릭스는 단백질에 대해 Blossum62이며, DNA에 대해 DNAFull임)을 사용하여 결정될 수 있다. 전반적인 서열의 길이가 실질적으로 다른 경우, Smith Waterman 알고리즘을 사용하는 것과 같은 국소 정렬이 바람직하다. 대안적으로, FASTA, BLAST 등과 같은 알고리즘을 사용하여 공공 데이터베이스를 검색함으로써 유사성 또는 동일성 백분율을 결정할 수 있다.
상기 정렬 프로그램 중 임의의 프로그램을 사용하여 두 개의 아미노산 서열이 정렬되면, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에 대한 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표시될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다: 100 x X/Y(여기서 X는 A 및 B의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의한 동일한 매치로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것이다.
선택적으로, 아미노산 유사성의 정도를 결정함에 있어서, 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호 교환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이며; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이며; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이며; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-루신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 자연 발생 아미노산 각각에 대한 예시적인 보존적 치환은 다음과 같다: ala에서 ser으로; arg에서 lys으로; asn에서 gln 또는 his으로; asp에서 glu로; cys에서 ser 또는 ala으로; gln에서 asn으로; glu에서 asp로; gly에서 pro로; his에서 asn 또는 gln으로; ile에서 leu 또는 val으로; leu에서 ile 또는 val으로; lys에서 arg, gln 또는 glu로; Met에서 leu 또는 ile으로; phe에서 met, leu 또는 tyr로; ser에서 thr로; thr에서 ser로; trp에서 tyr로; tyr에서 trp 또는 phe로; 및 val에서 ile또는 leu으로의 치환.
본원에서 "핵산 구축물" 또는 "핵산 벡터"는 본 명세서에서 재조합 DNA 기술의 사용으로부터 생성된 인공 핵산 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 용어 "핵산 구축물"은 자연 발생 핵산 분자를 포함하지 않지만, 핵산 구축물은 자연 발생 핵산 분자(의 일부)를 포함할 수 있다. 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구축물"은 숙주 세포 또는 해당 서열과 상용 가능한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 유전자의 발현을 수행할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 발현 벡터는 전형적으로 적어도 적절한 전사 조절 서열을 포함하고, 선택적으로 3' 전사 종결 신호를 포함한다. 발현을 수행하는데 필요하거나 도움이 되는 추가적인 인자, 예를 들어 발현 인핸서 요소가 존재할 수 있다. 발현 벡터는 적합한 숙주 세포 내로 도입되고, 숙주 세포의 시험관내 세포 배양시에 코딩 서열의 발현을 수행할 수 있다. 발현 벡터는 본 발명의 숙주 세포 또는 유기체에서의 복제에 적합할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터" 또는 "전사 조절 서열"은 하나 이상의 코딩 서열의 전사를 조절하는 기능을 하는 핵산 단편을 지칭하며, 코딩 서열의 전사 개시 부위의 전사 방향에 대해 상류에 위치하며, DNA 의존성 RNA 폴리머라아제에 대한 결합 부위, 전사 개시 부위, 및 전사 인자 결합 부위, 리프레서 및 활성화제 단백질 결합 부위를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 다른 DNA 서열, 및 상기 프로모터로부터 전사의 양을 조절하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 것으로 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 뉴클레오타이드의 임의의 다른 서열의 존재에 의해 구조적으로 확인된다. "구성적(constitutive)" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발달 조건 하에서 대부분의 조직에서 활성을 보이는 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 예를 들어 화학 유도제의 적용에 의해 생리학적으로 또는 발달적으로 조절되는 프로모터이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"이란 용어는 기능적 관계에 있는 폴리뉴클레오타이드 요소의 연결을 의미한다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓이면 "작동 가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 전사 조절 서열은 코딩 서열의 전사에 영향을 주면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 작동 가능하게 연결된다는 것은 연결되는 DNA 서열이 일반적으로 인접하며, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는데 필요한 경우 인접하고 판독 프레임으로 존재함을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ADC"는 링커를 통해 상기 정의된 바와 같은 치료용 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 접합된 세포독성 약물을 지칭한다. ADC에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항-SIRPα 항체가 아니다. 일반적으로, 세포독성 약물은 예를 들어 듀오카르마이신, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체, 메이탄시노이드 또는 아우리스타틴 유도체와 같이 매우 강력한다. 링커는 절단 가능한, 예를 들어 절단 가능한 디펩타이드 발린-시트룰린(vc) 또는 발린-알라닌(va)을 포함하거나, 절단 불가능한, 예를 들어 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편
SIRPα가 종양 면역 회피 메커니즘에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났지만, 현재 SIRPα에 대한 승인된 치료제는 없다.
SIRPα(CD172 항원 유사 패밀리 구성원 A, CD172a, SHPS-1, MyD-1로도 알려짐)는 면역 이펙터 세포에 존재하는 세포외 Ig 유사 도메인을 가진 막 횡단 당단백질 인 신호 조절 단백질(SIRP) 패밀리의 구성원이다. CD47(인테그린 관련 단백질(IAP)로도 알려짐)은 SIRPα의 리간드이다. SIRPα의 NH2 말단 리간드 결합 도메인은 고도로 다형성이다(Takenaka el al. Nature Immun. 2007, 8(12), 1313-1323). 그러나, 상기 다형성은 CD47에 대한 결합에 크게 영향을 미치지 않는다. SIRPαBIT(v1) 및 SIRPα1(v2)는 2개의 가장 일반적이고 가장 벗어난(13개의 잔기가 상이한) 다형체이다(Hatherley et al. J. Biol. Chem. 2014, 289(14), 10024-10028). CD47 외에도, SIRPα는 또한 계면활성제 단백질(SP-A 및 SP-D; Gardai et al. 2003, Janssen et al. 2008, Fournier et al. 2012)에 의해 결합될 수도 있다. 실제로, CD47은 SIRPα 도메인 D1에 결합할 수 있는 반면, SP-D는 (동시에) SIRPα 도메인 D3에 결합할 수 있다. SIRPα와 마찬가지로, 계면활성제 단백질은 예를 들어 대식세포 및/또는 호중구를 포함하는 아폽토시스 세포 및 미생물에 대한 선천 면역/염증 반응과 관련이 있다. 다른 생화학적으로 특성화된 인간 SIRP 패밀리 구성원은 SIRPβ1 및 SIRPγ이다. SIRP 패밀리 명명법은 문헌 [van den Berg et al. J Immunology 2005, 175(12), 7788-9]에 기재되어 있다.
SIRPβ1(CD172B로도 알려짐)는 CD47(van Beek et al. J. Immunol. 2005, 175(12), 7781-7787, 7788-7789)에 결합하지 않으며, 적어도 2개의 SIRPβ1 다형성 변이체, 즉 SIRPβ1v1(ENSP00000371018) 및 SIRPβ1v2(ENSP00000279477)가 알려져 있다. SIRPβ1의 천연 리간드는 아직 알려져 있지 않지만, 항-SIRPβ1 특이적 항체를 사용한 시험관내 연구에 따르면, SIRPβ1의 참여는 DAP12, Syk 및 SLP-76의 티로신 인산화를 유도하여 대식세포에서 식세포 작용을 촉진하고, MEK-MAPK-미오신 경쇄 키나아제 캐스케이드를 후속적으로 활성화하는 것으로 밝혀졌다(Matozaki et al. J. Biol. Chem. 2004, 279(28), 29450-29460). 인간 SIRPβ1은 골수 세포, 예를 들어 단핵구 및 과립구에서 발현되지만, 림프구에서는 발현되지 않는다(Hayashi et al. J. of Biol Chem. 2004, 279(28); Dietrich et al. The Journal of Immunology 2000, 164, 9-12).
SIRPγ(CD172G로도 알려짐)는 T 세포 및 활성화된 NK 세포에서 발현되며, SIRPα에 비해 10배 더 낮은 친화도로 CD47에 결합한다. CD47-SIRPγ 상호작용은 항원 제시 세포와 T 세포 사이의 접촉에 관여하여 T 세포 활성화를 공동 자극하고 T 세포 증식을 촉진한다(Piccio et al. Blood 2005, 105, 2421-2427). 더욱이, CD47-SIRPγ 상호작용은 T 세포의 경내피 이동에서 일정 역할을 수행한다(Stefanidakis et al. Blood 2008, 112, 1280-1289). WO2017/178653은 특히 CD47과 상호작용하는 영역에서 SIRPα와 SIRPγ 사이의 높은 서열 유사성으로 인해, 선행 기술의 항-SIRPα 항체가 또한 SIRPγ에 결합하고 T 세포 증식의 억제 및 면역 반응의 감소와 같은 인간에게 바람직하지 않은 효과를 갖는다고 개시하고 있다. 따라서, T 세포 상의 SIRPγ에 결합하지 않는 본 발명의 항-SIRPα 항체는 T 세포 상의 SIRPγ에 결합하는 항-SIRPα 항체와 달리, T 세포 유출의 억제가 적거나 전혀 없고/없거나, T 세포의 경내피 이동의 억제가 적거나 전혀 없는 것으로 가정된다.
본 발명은 적어도 2개의 우세한 인간 SIRPα 다형성 변이체 SIRPαBIT 및 SIRPα1에 특이적 결합을 나타내는 길항성 항-SIRPα 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 항-SIRPα 항체는 (바람직하게는 실시예 섹션에 따라 CD3+ T 세포 FACS 염색 또는 표면 플라스몬 공명(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 측정된 바와 같이) 인간 SIRPγ에 대한 친화도가 감소되거나, 낮거나 또는 가장 바람직하게는 친화도를 갖지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 항-SIRPα 항체는 인간 SIRPβ1v1 및/또는 인간 SIRPβ1v2에 대해 감소되거나 낮은 친화도를 갖는다. 바람직하게는, 이들은 치료용 항체의 ADCC 및/또는 ADCP를 증가시킨다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체는 또한 사이노몰거스 원숭이 SIRPα에 결합한다.
길항성 항체는 특정 항원에 대한 친화도를 가지며, 그의 항원에 대한 항체의 결합은 수용체에서 효능제 또는 역효능제의 기능을 억제한다. 현재, 길항성 항-SIRPα 항체가 SIRPα에 결합하면, CD47이 SIRPα에 결합하는 것을 방지할 수 있다는 가설이 세워졌다. 길항성 항-SIRPα 항체는 CD47이 결합하는 동일한 부위, 즉 오르토스테릭(orthosteric) 부위에 결합하여 CD47에 의한 SIRPα의 라이게이션을 방지하고, 결과적으로 면역 이펙터 세포의 Fc 수용체 의존적 작용을 음성 조절하는 신호전달을 억제할 수 있다. 대안적으로, 길항성 항-SIRPα 항체는 CD47이 결합하는 부위에 가까운 곳에서 결합하여, 입체 장애를 통해 CD47과 SIRPα 사이의 상호작용을 방지할 수 있다. 대안적으로, CD47 상호작용 부위에서 멀리 존재하는 항체는 예를 들어 비수용적 입체형태를 유도함으로써 CD47/SIRPα 결합을 차단할 수 있다. 임의의 이론에 얽매이지 않으면서, SIRPα에 대한 CD47 결합을 차단하면 SIRPα 신호전달 캐스케이드를 3.3 μg/ml의 항-SIRPα 항체 농도에서 실시예에 표시된 바와 같이 측정될 때 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 가장 바람직하게는 적어도 80% 감소시키거나 방지할 수 있다는 가설이 세워졌다.
항체가 표적 이외의 다른 항원, 예를 들어 SIRPβ1v1, SIRPβ1v2 및 SIRPγ에도 결합하는 경우, 특히 항체가 높은 친화도로 항원에 결합될 때, 이러한 항원은 항체 싱크(sink)로 기능할 수 있다. 따라서, 표적을 벗어난 항체 결합을 최소화함으로써 임의의 항체 싱크 효과가 감소하여, 동일한 특징을 추가로 갖는 항체에 비해 더 낮은 용량에서 효능을 나타내거나 동일한 용량에서 더 높은 효과를 초래할 수 있다는 가설을 세웠다.
현재 SIRPβ1의 역할은 잘 알려져 있지 않다. 따라서, 본 발명의 항체는 다형성 변이체(SIRPβ1v1 및 SIRPβ1v2) 둘 모두에 대해 상대적으로 낮은 결합 친화도를 갖는 것이 바람직하다. 그러나, SIRPα(면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)을 통한 신호전달) 및 SIRPβ1(면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 통한 신호전달)의 활성화는 대식세포 및 PMN/호중구와 같은 면역 이펙터 세포의 기능에 반대되는 영향을 미친다고 보고되었다(van Beek et al. J Immunol. 2005, 175(12), 7781-7787, 7788-7789). 더욱이, 뮤린 SIRPβ1 수용체의 촉발은 대식세포에서 식세포 작용을 촉진하는 것으로 보고되었다(Hayashi et al. J. Biol. Chem. 2004, 279(28), 29450-29460). 문헌 [Liu et al. J. Biol. Chem. 2005, 280 (43), 36132-36140]은 SIRPβ1의 항체 매개 라이게이션이 fMLP-유도 PMN 경상피 이동을 향상시켰다고 언급하고 있다. 이론에 얽매이지 않으면서, SIRPβ1에도 결합하는 항-SIRPα 차단 항체는 SIRPα 및 SIRPβ1에 대해 반대 효과를 가질 수 있다. 항-종양 세포 반응의 최대 자극을 얻기 위해서는, SIRPß1 기능에 영향을 주는 것을 제한하거나 방지하면서 SIRPα를 차단하고 이와 동시에 SIRPγ에 대한 결합을 통한 적응 면역 세포, 즉 T 세포의 차단을 회피함으로써 선천 면역 세포(예를 들어, PMN/호중구 및/또는 대식세포)의 활성을 자극하는 항체에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 다음과 같은 특징을 모두 갖는다: (i) 항체는 SIRPαBIT 및 SIRPα1에 대한 CD47 결합을 차단할 수 있고, (ii) 항체는 인간 CD3+ T 세포에 결합하지 않고, (iii) 항체는 SIRPα 신호전달을 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 SPR에 의해 측정될 때 SIRPβ1v1 및/또는 SIRPβ1v2에 대해 감소되거나 낮은 결합을 갖는다. 이와 대조적으로, 알려진 항-SIRPα 항체는 단일 항체에서 원하는 모든 특이성을 조합하지 않는다: SIRPαBIT 및 SIRPα1에 대한 CD47 결합을 차단할 수 있는 모든 항체는 또한 SIRPγ에 대한 결합을 보이는 반면, HEFLB는 SIRPγ에 결합하지 않으면서 SIRPαBIT를 차단할 수 있지만, SIRPα1를 차단하는 것은 말할 것도 없고 결합하는 능력을 갖지 않는다. SIRPγ에 결합하지 않으면서 SIRPα1 및 SIRPαBIT 둘 모두에 결합할 수 있는 일부 다른 선행 기술 항체는 SIRPα에 대한 CD47 결합을 차단할 수 없거나, 또는 SHP-1 동원의 차단에 의해 측정될 때 SIRPα 신호전달을 차단하지 않거나 오직 높은 IC50 농도에서만 차단한다. SIRPα1 및 SIRPαBIT 둘 모두에 결합하고 이들을 차단할 수 있음에도 불구하고, SE5A5는 SHP-1 동원의 차단에 의해 측정될 때 SIRPα 신호전달을 차단할 수 없다. 이러한 특성은 실시예에서 설명되거나 언급되는 바와 같이 결정된다.
제1 측면에서, 본 발명은 SIRPα에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항-SIRPα 항체는 바람직하게는 단리된 항체이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 영장류 SIRPα, 보다 바람직하게는 인간 SIRPα, 가장 바람직하게는 적어도 대립유전자 변이체 SIRPα1 및 SIRPαBIT에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 바람직하게는 실시예에 따른 인간 CD3+ T 세포 FACS 염색 또는 실시예에 제시되는 바와 같은 Biacore 실험을 사용하여 측정될 때 선행 기술 항체와 비교하여 감소된 결합을 가지며, 보다 바람직하게는 낮은 결합을 가지며, 가장 바람직하게는 SIRPγ에 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 치료용 항체의 ADCC 및/또는 ADCP를 증가시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 항-SIRPα 항체는 0.1 μg/ml의 항-SIRPα 항체에서 10 μg/ml의 트라스투주맙의 ADCC를, 실시예에서 사용되는 DELFIA 또는 51Cr 방출 검정을 사용하여 측정할 때 트라스투주맙 단독에 비해 적어도 1.2배; 보다 바람직하게는 1.3배; 보다 바람직하게는 적어도 1.4배; 보다 바람직하게는 적어도 1.5배; 보다 바람직하게는 적어도 1.6배; 보다 바람직하게는 적어도 1.7배; 보다 바람직하게는 적어도 1.8배; 보다 바람직하게는 적어도 1.9배; 보다 바람직하게는 적어도 2.0배; 보다 바람직하게는 적어도 2.1배; 보다 바람직하게는 적어도 2.2배; 가장 바람직하게는 적어도 2.3배 증가시킨다.
대안적으로 또는 본원의 다른 실시양태 중 어느 하나와 조합하여, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-SIRPα 항체는 인간화 또는 인간 항-SIRPα 항체이고, 본 발명에 따른 항원 결합 단편은 인간화 또는 인간 항-SIRPα 항체로부터의 상기 정의된 바와 같은 항원 결합 단편이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항-SIRPα 항체는 인간화 항-SIRPα 항체이고, 본 발명의 항원 결합 단편은 인간화 항-SIRPα 항체로부터 유래된다.
본 발명에 따른 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 바람직하게는 항체 또는 단편이 투여되는 대상체에서 항체에 대한 면역원성 반응을 거의 또는 전혀 유발하지 않는다. 원래의 비인간 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 항체와 같은 설치류 항체, 또는 토끼 항체 또는 비인간 키메라 항체는 잠재적으로 인간 항-비인간 동물 항체 반응을 유도할 수 있으며, 이 경우 본 발명에 따른 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 원래의 비인간 항체와 비교하여 또는 비인간 키메라 항체와 비교하여 실질적으로 감소된 수준에서 면역원성 반응을 숙주 대상체에서 유도하고/하거나, 유도할 것으로 예상된다. 바람직하게는, 인간화 항체는 인간 항-비인간 항체 반응을 최소화하거나 전혀 유발하지 않고/않거나, 항체 반응을 최소화하거나 유발하지 않을 것으로 예상된다. 면역원성 시험은 문헌 [Baker et al. Immunogenicity of protein therapeutics 2010, 1(4), 314-322; Harding et al. MAbs 2010, 2(3), 256-265; 또는 Joubert et al. PLoS.One 2016, 11(8), e0159328]에 기재된 바와 같이 관련 기술 분야의 방법에 의해 알려진 바와 같이 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 항-비인간 동물 항체 반응, 특히 인간 항-토끼 항체(HARA) 반응을 유발하는데, 이는 임상적으로 허용되는 수준 이하의 반응이다. 항원에 대한 높은 친화도 및 기타 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 항체를 인간화하는 것이 더욱 중요하다.
CDR은 카바트(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991, NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689), 코티아(Chothia and Lesk. J. Mol. Biol. 1987, 196, 901-917; Antibody Engineering Vol. 2, Chapter 3 by Martin, 2010, Kontermann and Duebel Eds. Springer-Verlag Berlin Heidelberg) 또는 IMGT(Lefranc. The Immunologist 1999, 7, 132-136)의 방식을 사용하여 결정될 수 있다. 본원에서 사용되는 중쇄 및 경쇄의 CDR은 카바트를 사용하여 결정되고, 표 1a에 나타낸 바와 같이 서열 번호 아래의 서열 목록에 제시되어 있다. 본 발명의 맥락에서, Eu 넘버링은 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역에서의 위치를 나타내기 위해 사용된다. 표현 "Eu 넘버링"은 문헌 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991, NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689]에 제시된 바와 같은 Eu 인덱스를 지칭한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항-SIRPα 항체, 바람직하게는 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다: (a) HCDR1은 SHGIS(서열 번호 36)을 포함하고; HCDR2는 TIGTGVITYFASWAKG(서열 번호 44)를 포함하고; HCDR3은 GSAWNDPFDP(서열 번호 45)를 포함하고; LCDR1은 QASQSVYGNNDLA(서열 번호 39)를 포함하고; LCDR2는 LASTLAT(서열 번호 40)를 포함하고; LCDR3은 LGGGDDEADNT(서열 번호 41)를 포함하고; (b) HCDR1은 SYVMG(서열 번호 30)를 포함하고; HCDR2는 IISSSGSPYYASWVNG(서열 번호 31)를 포함하고; HCDR3은 VGPLGVDYFNI(서열 번호 32)를 포함하고; LCDR1은 RASQSINSYLA(서열 번호 33)를 포함하고; LCDR2는 SASFLYS(서열 번호 34)를 포함하고; LCDR3은 QSWHYISRSYT(서열 번호 35)를 포함하고; (c) HCDR1은 SHGIS(서열 번호 36)를 포함하고; HCDR2는 TIGTGVITYYASWAKG(서열 번호 37)를 포함하고; HCDR3은 GSAWNDPFDY(서열 번호 38)를 포함하고; LCDR1은 QASQSVYGNNDLA(서열 번호 39)를 포함하고; LCDR2는 LASTLAT(서열 번호 40)를 포함하고; LCDR3은 LGGGDDEADNV(서열 번호 46)를 포함하고; (d) HCDR1은 SHGIS(서열 번호 36)를 포함하고; HCDR2는 TIGTGVITYYASWAKG(서열 번호 37)를 포함하고; HCDR3은 GSAWNDPFDY(서열 번호 38)를 포함하고; LCDR1은 QASQSVYGNNDLA(서열 번호 39)를 포함하고; LCDR2는 LASTLAT(서열 번호 40)를 포함하고; LCDR3은 LGGGDDEADNT(서열 번호 41)를 포함하고; (e) HCDR1은 SHGIS(서열 번호 36)를 포함하고; HCDR2는 TIGTGGITYYASWAKG(서열 번호 42)를 포함하고; HCDR3은 GSAWNDPFDI(서열 번호 43)를 포함하고; LCDR1은 QASQSVYGNNDLA(서열 번호 39)를 포함하고; LCDR2는 LASTLAT(서열 번호 40)를 포함하고; LCDR3은 LGGGDDEADNT(서열 번호 41)을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 HCDR 및 LCDR을 포함한다: (a) HCDR1은 SHGIS(서열 번호 36)를 포함하고; HCDR2는 TIGTGVITYFASWAKG(서열 번호 44)를 포함하고; HCDR3은 GSAWNDPFDP(서열 번호 45)를 포함하고; LCDR1은 QASQSVYGNNDLA(서열 번호 39)를 포함하고; LCDR2는 LASTLAT(서열 번호 40)를 포함하고; LCDR3은 LGGGDDEADNT(서열 번호 41)를 포함하고; (b) HCDR1은 SYVMG(서열 번호 30)를 포함하고; HCDR2는 IISSSGSPYYASWVNG(서열 번호 31)를 포함하고; HCDR3은 VGPLGVDYFNI(서열 번호 32)를 포함하고; LCDR1은 RASQSINSYLA(서열 번호 33)를 포함하고; LCDR2는 SASFLYS(서열 번호 34)를 포함하고; LCDR3은 QSWHYISRSYT(서열 번호 35)를 포함한다.
대안적으로 또는 선행 실시양태 중 어느 하나와 조합하여, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다음과 같은 기능적 특성 중 하나 이상을 갖는다.
바람직하게는, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 51에 제시된 인간 SIRPα1 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 인간 SIRPα1에 10-9 M 미만의 KD로, 보다 바람직하게는 10-10 M 미만의 KD로, 훨씬 더 바람직하게는 10-11 M 미만의 KD로 결합한다. 바람직하게는, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 52에 제시된 인간 SIRPαBIT 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 인간 SIRPαBIT에 10-9 M 미만의 KD로, 보다 바람직하게는 10-10 M 미만의 KD로, 훨씬 더 바람직하게는 10-11 M 미만의 KD로 결합한다. 바람직하게는, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 56에 제시된 사이노몰거스 SIRPα 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 사이노몰거스 원숭이 SIRPα에 10-7 M 미만의 KD로, 보다 바람직하게는 10-8 M 미만의 KD로, 훨씬 더 바람직하게는 10-9 M 미만의 KD로 결합한다. 바람직하게는, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 실시예에 따른 CD3+ T 세포 FACS 염색에 의해 측정된 바와 같이 인간 SIRPγ에 검출 가능하게 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 55에 제시된 인간 SIRPγ 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석된 바와 같이 인간 SIRPγ에 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 IL-2 ELIspot 및/또는 T 세포 증식 검정에 의해 결정된 바와 같이 면역원성이 아니다. 바람직하게는, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 54에 제시된 인간 SIRPβ1v2 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석된 바와 같이 중간 내지 낮은 친화도로 인간 SIRPβ1v2에 결합한다. 바람직하게는, KD는 10-10 M 초과, 보다 바람직하게는 10-9 M 초과이다. 바람직하게는, SIRPβ1v2의 중간 내지 낮은 친화도 결합과 함께, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 53에 제시된 인간 SIRPβ1v1 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 10-11 M 초과, 보다 바람직하게는 3x10-11 M 초과, 훨씬 더 바람직하게는 10-10 M 초과, 훨씬 더 바람직하게는 10-9 M 초과의 KD로 SIRPβ1v1에 결합한다. 이들 검정은 실시예에서 설명되거나 언급되어 있다.
대안적으로 또는 선행 실시양태 중 어느 하나와 조합하여, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 항체는 인간 SIRPαBIT 및 인간 SIRPα1 둘 모두에 대한 특이적 결합을 보이고, 둘 모두 실시예에서 설명되는 CD3+ T 세포 염색 및/또는 SPR을 사용하여 인간 SIRPγ에 검출 가능하게 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 SIRPαBIT에 10-9 M 미만의 KD로, 보다 바람직하게는 10-10 M 미만의 KD로, 훨씬 더 바람직하게는 10-11 M 미만의 KD로 결합하고; 인간 SIRPα1에 10-8 M 미만의 KD로, 보다 바람직하게는 10-9 M 미만의 KD로, 보다 바람직하게는 10-10 M 미만의 KD로, 훨씬 더 바람직하게는 10-11 M 미만의 KD로 결합하고, 여기서 KD는 25℃에서 SPR로 측정된다(실시예 참조). 바람직하게는, 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SIRPγ에 10-8 M 초과의 KD로, 보다 바람직하게는 10-7 M 초과의 KD로, 보다 바람직하게는 10-6 M 초과의 KD로, 훨씬 더 바람직하게는 10-5 M 초과의 KD로 결합하고, 가장 바람직하게는 결합은 검출되지 않고, 여기서 KD는 25℃에서 SPR로 측정된다(실시예 참조).
대안적으로 또는 선행 실시양태 중 어느 하나와 조합하여, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 51에 제시된 인간 SIRPα1 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명(SPR; 바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 인간 SIRPα1에 10-8 M 미만의 KD로, 보다 바람직하게는 10-9 M 미만의 KD로, 보다 바람직하게는 10-10 M 미만의 KD로, 훨씬 더 바람직하게는 10-11 M 미만의 KD로 결합하고(실시예 참조); (b) 서열 번호 52에 제시된 인간 SIRPαBIT 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 SPR(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 인간 SIRPαBIT에 10-9 M 미만의 KD로, 보다 바람직하게는 10-10 M 미만의 KD로, 훨씬 더 바람직하게는 10-11 M 미만의 KD로 결합하고(실시예 참조); (c) 바람직하게는 SPR(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 포획된 CD47로부터의 해리에 의해, 보다 바람직하게는 실시예 6에 기재된 바와 같이 분석될 때 SIRPα1 및 SIRPαBIT에 대한 CD47 결합을 차단하고; (d) CD3+ T 세포 유세포 분석, 바람직하게는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 염색 및/또는 SPR(둘 모두 실시예에서 설명됨)에 의해 측정될 때 인간 SIRPγ에 결합하지 않는다. 바람직하게는, 이전 실시양태와 조합하여, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 54에 제시된 인간 SIRPβ1v2 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 SPR(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석된 바와 같이 중간 내지 낮은 친화도로 인간 SIRPβ1v2에 결합한다. 바람직하게는, KD는 10-10 M 초과, 보다 바람직하게는 10-9 M 초과이다. 바람직하게는, SIRPβ1v2의 중간 내지 낮은 친화도 결합과 함께, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 53에 제시된 인간 SIRPβ1v1 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 SPR(바람직하게는 BiaCore™)에 의해 분석될 때 10-11 M 초과, 보다 바람직하게는 3x10-11 M 초과, 훨씬 더 바람직하게는 10-10 M 초과, 훨씬 더 바람직하게는 10-9 M 초과의 KD로 SIRPβ1v1에 결합한다. 이들 검정은 실시예에서 설명되거나 언급되어 있다.
대안적으로 또는 선행 실시양태 중 어느 하나와 조합하여, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이고, 여기서 (a) 항체의 중쇄 가변 도메인은 4개의 중쇄 프레임워크 영역 HFR1 내지 HFR4, 및 HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4의 순서로 작동 가능하게 연결된 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하고, 각각의 중쇄 프레임워크 영역은 서열 번호 1, 3 - 6, 8, 10 - 15 중 임의의 하나의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, 또는 HFR1 내지 HFR4는 표 8 내지 11에 정의된 아미노산 치환 중 하나 이상에서 서열 번호 1, 3 - 6, 8, 10 - 15 중 임의의 하나와 상이하고; (b) 항체의 경쇄 가변 도메인은 4개의 경쇄 프레임워크 영역 LFR1 내지 LFR4, 및 LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4의 순서로 작동 가능하게 연결된 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하고, 각각의 경쇄 프레임워크 영역은 서열 번호 2, 7 또는 9 중 임의의 하나의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, 또는 LFR1, LFR2 및/또는 LFR4는 표 12 내지 14에 정의된 아미노산 치환 중 하나 이상에서 서열 번호 2, 7 또는 9 중 임의의 하나와 상이하다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이고, 여기서 (a) 항체의 중쇄 가변 도메인은 4개의 중쇄 프레임워크 영역 HFR1 내지 HFR4, 및 HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4의 순서로 작동 가능하게 연결된 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하고, 각각의 중쇄 프레임워크 영역은 서열 번호 8의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, 또는 HFR1 내지 HFR4는 표 8 내지 11에 정의된 아미노산 치환 중 하나 이상에서 서열 번호 8과 상이하고; (b) 항체의 경쇄 가변 도메인은 4개의 경쇄 프레임워크 영역 LFR1 내지 LFR4, 및 LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4의 순서로 작동 가능하게 연결된 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하고, 각각의 경쇄 프레임워크 영역은 서열 번호 9의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, 또는 LFR1, LFR2 및/또는 LFR4는 표 12 내지 14에 정의된 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 9와 상이하다.
바람직하게는, 중쇄의 가변 도메인의 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 각각의 위치(카바트 넘버링에 따름)에 존재하는 아미노산 잔기는 각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4에 대해 표 8 내지 11에 나타낸 잔기 또는 그의 보존적 아미노산 치환이거나, 또는 경쇄의 가변 도메인의 FR1, FR2 및 FR4의 각각의 위치(카바트 넘버링에 따름)에 존재하는 아미노산 잔기는 바람직하게는 각각 FR1, FR2 및 FR4에 대해 표 12 내지 14에 나타낸 잔기 또는 그의 보존적 아미노산 치환이다. 그러나, 보다 바람직하게는, 프레임워크 영역 내의 임의의 위치에 대한 프레임워크 아미노산 잔기는 표 8 내지 14의 상응하는 위치에 제시된 아미노산 잔기로부터 선택된다.
본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 바람직하게는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 HCDR, LCDR 및 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역을 포함한다: (a) HCDR1은 서열 번호 36을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 44를 포함하고; HCDR3은 서열 번호 45를 포함하고; LCDR1은 서열 번호 39를 포함하고; LCDR2는 서열 번호 40을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 41을 포함하고; HFR1 내지 HFR4는 서열 번호 8의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, HFR1 내지 HFR4는 표 8 내지 11에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 8과 상이하고; LFR1 내지 LFR4는 서열 번호 9의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, LFR1, LFR2 및/또는 LFR4는 표 12 내지 14에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 9와 상이하고; (b) HCDR1은 HCDR1은 서열 번호 30을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 31을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 32를 포함하고; LCDR1은 서열 번호 33를 포함하고; LCDR2는 서열 번호 34를 포함하고; LCDR3은 서열 번호 35를 포함하고; HFR1 내지 HFR4는 서열 번호 1, 3, 4, 5, 14 또는 15 중 임의의 하나의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, HFR1 내지 HFR4는 표 8 내지 11에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 1, 3, 4, 5, 14 또는 15 중 임의의 하나와 상이하고; LFR1 내지 LFR4는 서열 번호 2의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, LFR1, LFR2 및/또는 LFR4는 표 12 내지 14에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 2와 상이하고; (c) HCDR1은 서열 번호 36을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 37을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 38을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 39를 포함하고; LCDR2는 서열 번호 40을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 46을 포함하고; HFR1 내지 HFR4는 서열 번호 6 또는 13의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, HFR1 내지 HFR4는 표 8 내지 11에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 6 또는 13과 상이하고; LFR1 내지 LFR4는 서열 번호 7의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, LFR1, LFR2 및/또는 LFR4는 표 12 내지 14에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 7과 상이하고; (d) HCDR1은 서열 번호 36을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 37을 포함하고; HCDR3은 서열 번호 38을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 39를 포함하고; LCDR2는 서열 번호 40을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 41을 포함하고; HFR1 내지 HFR4는 서열 번호 6, 10 또는 11의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, HFR1 내지 HFR4는 표 8 내지 11에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 6, 10 또는 11 중 임의의 하나와 상이하고; LFR1 내지 LFR4는 서열 번호 9의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, LFR1, LFR2 및/또는 LFR4는 표 12 내지 14에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 9와 상이하고; (e) HCDR1은 서열 번호 36을 포함하고; HCDR2는 서열 번호 42를 포함하고; HCDR3은 서열 번호 43을 포함하고; LCDR1은 서열 번호 39를 포함하고; LCDR2는 서열 번호 40을 포함하고; LCDR3은 서열 번호 41을 포함하고; HFR1 내지 HFR4는 서열 번호 12의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, HFR1 내지 HFR4는 표 8 내지 11에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 12와 상이하고; LFR1 내지 LFR4는 서열 번호 9의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, LFR1, LFR2 및/또는 LFR4는 표 12 내지 14에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 9와 상이하다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 서열 번호 36을 포함하는 HCDR1; 서열 번호 44를 포함하는 HCDR2; 서열 번호 45를 포함하는 HCDR3; 서열 번호 39를 포함하는 LCDR1; 서열 번호 40을 포함하는 LCDR2; 및 서열 번호 41을 포함하는 LCDR3을 포함하고; 여기서, (i) HFR1 내지 HFR4는 서열 번호 8의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, HFR1 내지 HFR4는 표 8 내지 11에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 8과 상이하고; (ii) LFR1 내지 LFR4는 서열 번호 9의 프레임워크 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100%의 아미노산 동일성을 갖거나, LFR1, LFR2 및/또는 LFR4는 표 12 내지 14에 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환에서 서열 번호 9와 상이하다.
대안적으로 또는 선행 실시양태 중 어느 하나와 조합하여, 바람직한 실시양태에서, 프레임워크 치환은 표 8 내지 14에 제공된 잔기로 제한된다. 따라서, 프레임워크 영역 내의 다른 위치에서 치환이 이루어지지 않는 것이 바람직하고, 치환은 표 8 내지 14에 제시된 잔기 또는 그의 보존적 아미노산 치환으로 제한되는 것이 또한 바람직하다.
대안적으로 또는 선행 실시양태 중 어느 하나와 조합하여, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR을 포함한다: (a) 서열 번호 8의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 9의 LCVR 아미노산 서열; (b) 서열 번호 1의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 2의 LCVR 아미노산 서열; (c) 서열 3의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 2의 LCVR 아미노산 서열; (d) 서열 4의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 2의 LCVR 아미노산 서열; (e) 서열 번호 5의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 2의 LCVR 아미노산 서열; (f) 서열 번호 6의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 7의 LCVR 아미노산 서열; (g) 서열 번호 10의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 9의 LCVR 아미노산 서열; (h) 서열 번호 6의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 9의 LCVR 아미노산 서열; (i) 서열 번호 11의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 9의 LCVR 아미노산 서열; (j) 서열 번호 12의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 9의 LCVR 아미노산 서열; (k) 서열 13의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 7의 LCVR 아미노산 서열; (l) 서열 번호 14의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 2의 LCVR 아미노산 서열; 및 (m) 서열 번호 15의 HCVR 아미노산 서열; 서열 번호 2의 LCVR 아미노산 서열. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR을 포함한다: (a) 서열 번호 8의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호 9의 LCVR 아미노산 서열; (b) 서열 번호 1의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호 2의 LCVR 아미노산 서열; (c) 서열 번호 3의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호 2의 LCVR 아미노산 서열; (d) 서열 번호 4의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호 2의 LCVR 아미노산 서열; (e) 서열 번호 5의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호 2의 LCVR 아미노산 서열; (f) 서열 번호 14의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호 2의 LCVR 아미노산 서열; 및 (g) 서열 번호 15의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 2의 LCVR 아미노산 서열. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 번호 8의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호 9의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
인간 (hu)SIRPαBIT 및 (hu)SIRPα1 둘 모두에 결합하는 것 이외에, 본 발명에 따른 항체는 또한 사이노몰거스 원숭이 (cy)SIRPα에 결합하여 관련 동물 모델에서 생체내 연구를 가능하게 할 수 있다. 다른 종으로부터의 SIRPα에 대한 본 발명에 따른 항체의 친화도는 배제되지 않는다.
어떤 이론에 얽매이지 않으면서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다음 중 하나에 의해 작용할 수 있다고 생각된다. 본 발명의 항체는 CD47이 결합하는 동일한 부위에 결합하여 CD47에 의한 SIRPα의 결합을 방지하고, 결과적으로 면역 이펙터 세포의 Fc 수용체 의존적 작용을 음성 조절하는 신호전달을 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 바람직하게는 공지된 항-SIRPα 항체보다 더 특이적이고, 바람직하게는 실시예에 따른 인간 CD3+ T 세포 염색을 사용하여 측정할 때 인간 SIRPαBIT 및 인간 SIRPα1 둘 모두에 대해 우수한 친화도를 나타내지만, 인간 SIRPγ에 대해서는 감소된, 보다 바람직하게는 낮은 친화도를 나타내며, 훨씬 더 바람직하게는 검출 가능한 친화도를 타나내지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-SIRPα 항체는 경쇄 및/또는 중쇄 항체 불변 영역을 포함한다. 관련 기술 분야에 공지된 임의의 항체 불변 영역이 사용될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 예를 들어 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 예를 들어 알파형, 델타형, 엡실론형, 감마형 또는 뮤형 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 알파형, 델타형, 엡실론형, 감마형 또는 뮤형 중쇄 불변 영역일 수 있다. 한 실시양태에서, 경쇄 또는 중쇄 불변 영역은 자연 발생 불변 영역의 단편, 유도체, 변이체 또는 뮤테인이다.
한 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체는 인간 면역 이펙터 세포에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 결합하는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 항-SIRPα 항체는 ADCC 및/또는 ADCP를 유도할 수 있기 때문에 SIRPα-양성 종양, 바람직하게는 신장 세포 암종 또는 흑색종의 단일 요법에 적합할 수 있다(Yanagita et al. JCI Insight 2017, 2(1), e89140). 임의의 이론에 얽매이지 않으면서, 상기 항체에 의한 암세포의 파괴는 적어도 부분적으로는 ADCC를 통해 발생한다고 생각된다. 인간 면역 이펙터 세포는 라이게이션시 식세포 작용, 트로곱토시스(trogoptosis), 페르포린 및 그랜자임 방출, 사이토카인 방출, ADCC, ADCP, ADAP 및/또는 기타 메커니즘을 유발하는 다양한 활성화 Fc 수용체를 보유한다. 이러한 수용체의 예는 Fcγ 수용체, 예를 들어 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32a), FcγRIIIA(CD16a), FcγRIIIB(CD16b), FcγRIIC(CD32c) 및 Fcα 수용체 FcαRI(CD89)이다. 다양한 천연 항체 이소형은 다양한 이러한 수용체에 결합한다. 예를 들어, IgG1은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB에 결합하고; IgG2는 FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA에 결합하고; IgG3은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB; IgG4는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA에 결합하고; IgA는 FcαRI에 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체는 IgA 또는 IgG 이소형의 Fc 영역을 포함한다. 보다 바람직한 것은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 Fc 영역을 포함하는 항-SIRPα 항체이고; IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소형이 훨씬 더 바람직한다. 가장 바람직한 것은 바람직하게는 서열 번호 24에 제시된 IgG1 이소형의 Fc 영역을 포함하는 항-SIRPα 항체이다.
인간 면역 이펙터 세포에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 결합하는 Fc 영역을 포함하는 항-SIRPα 항체는 치료용 항체와의 조합 요법에서 CD47을 발현하는 암을 치료하는 데 적합하지만, 인간 면역 이펙터 세포 상에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 결합하는 인간 Fc 영역을 포함하는 치료용 항체(트라스투주맙)(즉, ADCC 및/또는 ADCP를 유도할 수 있는 항체)와 조합한 키메라 항-SIRPα IgG1 항체의 시험관내 ADCC 실험은 뮤린 항체를 사용한 이전 결과를 기초로 하여 예상된 ADCC의 증가를 나타내지 않았다(도 2). 임의의 이론에 얽매이지 않으면서, 면역 이펙터 세포(이 경우 호중성 과립구)의 활성화 Fc 수용체에 대한 결합을 위해 치료용 항체(이 경우 트라스투주맙)와 경쟁할 수 있는 항-SIRPα 항체에 대해 컬랜더(Kurlander) 효과가 발생할 수 있다고 생각된다(Kurlander J Immunol 1983, 131(1), 140-147). 따라서, 항-SIRPα의 Fc 꼬리는 관련 식세포 작용성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 과립구, 대식세포 또는 수지상 세포 상의 Fc 수용체에 시스로(in cis) 결합하여 ADCC 및/또는 ADCP 및/또는 ADAP를 감소시키거나 억제할 수 있다. 결과적으로, 예를 들어 Fc 꼬리를 변형함으로써 인간 면역 이펙터 세포에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 대한 항-SIRPα 항체의 Fc 영역의 결합 감소는 치료용 항체(트라스투주맙; 도 2)에 의해 ADCC를 개선하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 면역 이펙터 세포에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 대해 감소된 결합 및/또는 낮은 친화도를 나타내고 섹션 "본 발명의 항체 또는 그의 단편의 용도"에서 추가로 설명되는 바와 같이 치료용 항체와의 조합 요법에서 유리하게 사용될 수 있는 항-SIRPα 항체에 관한 것이다. 이러한 항-SIRPα 항체는 Fc 수용체에 대해 낮은 친화도를 갖는 천연 Fc 영역, 예를 들어 IgG4 또는 IgG2 Fc를 포함할 수 있거나, 이러한 항-SIRPα 항체는 하나 이상의 아미노산이 유사한 비변형 Fc 영역과 비교할 때 다른 아미노산(들)으로 치환된 변형된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 효소에 의한 탈글리코실화는 아미노산 돌연변이를 요구하지 않으면서 Fc 감마 수용체에 대한 Fc의 결합을 감소시킨다. 이러한 맥락에서 감소된 결합은 활성화 Fc 수용체에 대한 변형된 Fc 영역을 포함하는 항-SIRPα 항체의 친화도가 유사한 비변형된 Fc 영역을 포함하는 동일한 가변 영역을 갖는 항-SIRPα 항체의 친화도보다 낮다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 친화도는 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3배, 바람직하게는 적어도 4배, 바람직하게는 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 50배, 바람직하게는 적어도 100배, 바람직하게는 적어도 1000배 감소한다. 활성화 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도는 일반적으로 관련 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Harrison et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 2012, 63, 23-28]의 방법을 사용하여 SPR 또는 유세포 분석을 사용하여 측정된다. 치료용 항체와 조합하여 인간 Fcα 또는 Fcγ 수용체에 대해 감소된 결합 또는 낮은 친화도를 나타내는 항-SIRPα 항체는 면역 이펙터 세포의 ADCC 및/또는 ADCP 및/또는 ADAP를 증가시킴으로써 암 세포의 세포 파괴에서 특히 효과적이다. 전형적으로, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체의 Fc 영역은 인간 면역 이펙터 세포에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키도록 변형된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체는 인간 Fcα 또는 Fcγ 수용체에 대해 감소된 결합 또는 낮은 친화도를 나타내는, 바람직하게는 결합하지 않는 변형된 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, Fcγ 수용체에 대한 IgG1 결합은 L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328, 및 P329(Eu 넘버링)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 IgG1 아미노산을 치환함으로써 감소될 수 있고, IgG2 결합은 예를 들어 아미노산 치환 V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, 및/또는 P331S; 또는 H268Q, V309L, A330S, 및/또는 P331S(IgG1 Eu 넘버링과 유사한 넘버링) 중 하나 이상을 도입함으로써 감소될 수 있고(Vafa et al. Methods 2014, 65, 114-126); IgG3 결합은 예를 들어 아미노산 치환 L234A 및 L235A, 또는 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P331S를 도입하여 감소시킬 수 있고(Leoh et al. Mol. Immunol. 2015, 67, 407-415); IgG4 결합은 예를 들어 아미노산 치환 S228P, L234A 및/또는 L235A(IgG1 Eu 넘버링과 유사한 넘버링)를 도입함으로써 감소될 수 있다(Parekh et al. mAbs 2012, 4(3), 310-318). Fcα 수용체에 대한 IgA 결합은 예를 들어 아미노산 치환 L257R, P440A, A442R, F443R 및/또는 P440R 중 하나 이상을 도입함으로써 감소될 수 있다(순차적인 넘버링, Pleass et al. J. Biol. Chem. 1999, 271(33), 23508-23514).
바람직하게는, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 동일한 항-SIRPα 항체와 비교하여 인간 Fcα 또는 Fcγ 수용체에 대해 감소된 결합 또는 낮은 친화도를 나타내는, 바람직하게는 상기 수용체에 결합하지 않는 변형된 Fc 영역을 포함한다. 보다 바람직하게는, 변형된 Fc 영역은 IgG 이소형의 Fc 영역이다. 훨씬 더 바람직하게는, 변형된 Fc 영역은 IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소형의 Fc 영역이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체는 L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328 및 P329(Eu 넘버링)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-SIRPα 항체는 L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, D270A, D270E, D270N, N297A, N297G, A327Q, P328A, P329A 및 P329G로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다. 보다 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 치환은 L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, N297A, P328A, P329A 및 P329G로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 대안적으로 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 치환은 L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, D270A, D270E, D270N, A327Q, P328A, P329A 및 P329G로 이루어지는 군에서 선택된다. 훨씬 더 바람직하게는, 본 발명의 항-SIRPα 항체는 L234A, L234E, L235A, G237A, D265A, D265E, D265N, P328A, P329A 및 P329G로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 변형된 인간 IgG1 Fc 영역은 다음 아미노산 치환을 포함한다: (i) L234A 및 L235A; (ii) L234E 및 L235A; (iii) L234A, L235A 및 P329A; 또는 (iv) L234A, L235A 및 P329G. 보다 바람직하게는, 변형된 인간 IgG1 Fc 영역은 다음 아미노산 치환을 포함한다: (i) L234A 및 L235A; 또는 (ii) L234E 및 L235A. 가장 바람직하게는, 변형된 인간 IgG1 Fc 영역은 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함한다. 이전 실시양태 중 어느 하나와 조합하여, 바람직한 실시양태에서 변형된 Fc IgG1 영역은 아미노산 치환 N297A 또는 N297G를 포함하지 않는다. 보다 바람직하게는, 변형된 Fc IgG1 영역은 위치 N297에 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 따라서, Eu 넘버링에 따른 위치 297의 아미노산 잔기는 아스파라긴인 것이 바람직하다. 이 실시양태에 따른 항-SIRPα 항체는 바람직하게는 서열 번호 25에 제시된 IgG1 유전자형의 변형된 Fc 영역을 포함한다(L234A 및 L235A 돌연변이는 위치 117 및 118에 제시됨).
본 발명의 항체 또는 그의 단편의 생산 및 정제
본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다수의 통상적인 기술 중 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 이들은 일반적으로 관련 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 재조합 발현 시스템에서 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Shukla and Thoemes, Trends in Biotechnol. 2010, 28(5), 253-261, Harlow and Lane. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, 및 Sambrook and Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001]을 참조한다. 관련 기술 분야에 공지된 임의의 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 요구되는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 하나의 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 항-SIRPα 항체의 경쇄의 적어도 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하고; 또 다른 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 항-SIRPα 항체의 중쇄의 적어도 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 핵산 분자는 항체의 HCVR 및 LCVR 중 적어도 하나를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직한 핵산 분자는 본 발명의 항체 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포에서 코딩 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위한 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및 리더 서열(신호 펩타이드, 신호 서열, 표적화 신호, 국소화 신호, 국소화 서열, 전이 펩타이드 또는 리더 펩타이드로도 칭해짐)에 작동 가능하게 연결된 발현 벡터이다. 중쇄에 대한 바람직한 리더 서열은 서열 번호 28에 제시되어 있다. 경쇄에 대한 바람직한 리더 서열은 서열 번호 29에 제시되어 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 또 다른 적합한 리더 서열은 서열 번호 27에 제시되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이 섹션에서 상기 정의된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 세포는 바람직하게는 단리된 세포 또는 배양된 세포이다. 사용될 수 있는 숙주 세포 중에는 원핵 생물, 효모 또는 고등 진핵 세포가 있다. 원핵 생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실러스(Bacillus)를 포함한다. 고등 진핵 세포에는 곤충 세포 및 포유동물 기원의 확립된 세포주가 포함된다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 원숭이 신장 세포의 COS-7 계통(Gluzman et al. Cell 1981, 23, 175), 인간 배아 신장(HEK) 293 세포, L 세포, C127 세포, 3T3 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포주, 및 문헌 [McMahan et al. EMBO J. 1991, 10, 2821]에 의해 설명된 바와 같이 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CVI로부터 유래된 CVI/EBNA 세포주가 포함된다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 예를 들어 문헌 [Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985]에 의해 설명되어 있다.
형질전환된 세포는 폴리펩타이드의 발현을 촉진하는 조건 하에서 배양될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생산하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 조건 하에서 본원에서 정의되는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 예를 들어 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A-세파로스, 단백질 G-세파로스 등), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 혼합 방식) 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 통상적인 단백질 정제 절차에 의해 회수될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Low et al. J. Chromatography B 2007, 848, 48-63; Shukla et al. J. Chromatography B 2007, 848, 28-39] 참조). 친화도 크로마토그래피는 낙타류(Camelid) 유래 단일 도메인(VHH) 항체 단편을 기반으로 하는 고유한 친화도 정제 솔루션을 제공하는 CaptureSelect™ 리간드를 사용하는 친화도 크로마토그래피를 포함한다(예를 들어, 문헌 [Eifler et al. Biotechnology Progress 2014, 30(6), 1311-1318] 참조). 본원에서 사용하기 위해 고려되는 폴리펩타이드는 오염된 내인성 물질이 실질적으로 없는 실질적으로 균질한 재조합 항-SIRPα 항체 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오타이드 변화를 항체 코딩 핵산에 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 요구되는 특징을 가지고 있다면 최종 구축물을 달성하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어진다. 또한, 아미노산 변화는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 번역후 과정을 변경할 수 있고, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변경할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드에 이르는 길이 범위의 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩타이드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 다른 삽입 변이체는 항체 또는 항원 결합 단편의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드와의 융합을 포함한다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 상이한 잔기로 대체된다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 이러한 치환 돌연변이 유발은 상기 나타낸 바와 같은 FR 변경뿐만 아니라, 상기 나타낸 바와 같은 수용체 활성화를 방지하기 위해 Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 결합을 감소시키는 변경을 포함한다.
항체의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 원래의 글리코실화 패턴을 변경한다. 변경이란 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 삭제하고/하거나, 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다. 폴리펩타이드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결이다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 의미한다. 트리펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소에 의해 부착하기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에 이들 트리펩타이드 서열 중 임의의 서열이 존재하면, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 모노사카라이드 또는 모노사카라이드 유도체 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나를 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착하는 것을 의미하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 사용될 수 있다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 상기 기재된 트리펩타이드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 수행된다(N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 원래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 치환함으로써 이루어질 수 있다(O-연결된 글리코실화 부위의 경우). 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리(자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 이전에 제조된 변이체 또는 비변이체 버전의 올리고뉴클레오타이드 매개(또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 약학적 유도체 또는 프로드러그를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어 약학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
이러한 약학 조성물은 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 이를 필요로하는 대상체에게 유효량의 조성물을 투여함으로써 아래에서 설명되는 치료 방법에 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유동물로 분류된 모든 동물을 지칭하고, 영장류 및 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대상체는 바람직하게는 인간이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는 부형제"는 약학적 투여에 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장성 및 흡착 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다(예를 들어, 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al. Eds. 7th edition, 2012], www.pharmpress.com 참조). 약학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 물질의 사용은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 조성물에서 그의 사용이 고려된다. 담체 또는 안정화제를 포함하는 허용 가능한 부형제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 히스티딘 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(잔기 약 10개 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐 피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 착물(예를 들어: Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리소르 베이트(예를 들어, TWEEN™), 폴록사머(예를 들어, PLURONICS™), 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제를 포함한다.
보충 활성 화합물이 또한 본 발명의 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 다른 활성제의 유효량은 무엇보다도 약학 조성물에 존재하는 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양, 질병 또는 장애 또는 치료의 유형 등에 따라 달라진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 예를 들어 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템, 예를 들어 리포솜을 포함하는 제어 방출 제제와 같이 신체로부터의 신속한 제거로부터 상기 화합물을 보호할 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성 생체적합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 표적화된 리포솜을 포함하는 리포솜 현탁액은 또한 약학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호 또는 W02010/095940에 기재된 바와 같이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 동맥내, 림프내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 정맥내 형태의 비경구 투여가 바람직하다. "전신 투여"는 경구, 정맥내, 복강내 및 근육내 투여를 의미한다. 치료 또는 예방 효과에 필요한 항체의 양은 물론 선택한 항체, 치료할 병태의 특성 및 중증도 및 대상체에 따라 달라질 것이다. 또한, 항체는 예를 들어 항체의 감소하는 용량과 함께 펄스 주입에 의해 적절하게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 부분적으로는 투여가 일시적인지 만성적인지에 따라, 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 적절한 단위 투여 형태의 멸균 용액, 현탁액 또는 동결 건조 제품과 같은 비경구 투여에 적합한 형태일 수 있다. 주사 용도에 적합한 약학 조성물은 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, CremophorEM(BASF, 미국 뉴저지주 파시파니 소재) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 무균이어야 하고, 주사가 용이할 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 약학적으로 허용되는 폴리올, 예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항박테리아 및 항진균제에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에 등장제, 예를 들어 당, 다가알코올, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직하다.
주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분의 하나 또는 조합물과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물(예를 들어, 폴리펩타이드 또는 항체)을 혼입한 후, 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산매 및 위에서 열거된 것으로부터 필요한 기타 성분을 포함하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조로서, 이것은 활성 성분 및 이전에 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 요구되는 성분의 분말을 생성한다.
특정 실시양태에서, 상기 약학 조성물은 정맥내(IV) 또는 피하(SC) 경로를 통해 투여된다. 증량제, 완충제 또는 계면활성제와 같은 적절한 부형제를 사용할 수 있다. 언급된 제제는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Allen Ed. 22nd edition, 2012](www.pharmpress.com)를 포함하는 다양한 출처에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이 비경구 투여 가능한 조성물을 제조하기 위한 표준 방법을 사용하여 제조될 것이다.
투여를 용이하게 하고 투여량의 균일성을 위해 약학 조성물, 즉 비경구 조성물을 단위 투여 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 단위 투여 형태는 치료될 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 필요한 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물(본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편)을 필요한 약학적 담체와 함께 포함한다. 본 발명의 단위 투여 형태에 대한 기준은 활성 화합물의 고유한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위해 상기 활성 화합물을 배합하는 기술에 내재된 한계에 의해 좌우되고 이에 직접적으로 의존한다.
일반적으로, 본 발명의 항-SIRPα 항체의 유효 투여량은 선택된 화합물의 상대적 효능, 치료할 장애의 중증도 및 대상체의 체중에 따라 달라질 것이다. 그러나, 활성 화합물은 전형적으로 1일 1회 이상, 예를 들어 1일 1, 2, 3 또는 4회 투여될 것이며, 전형적인 일일 총 투여량은 0.001 내지 1,000 mg/kg(체중)/일, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 100 mg/kg(체중)/일, 가장 바람직하게는 약 0.05 내지 10 mg/kg(체중)/일일 것이다. 항체의 적절한 용량을 선택하는 지침이 이용 가능하다(예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 1999, 348, 601-608; Milgrom et al. New Engl. J. Med. 1999, 341, 1966-1973; Slamon et al.New Engl. J. Med. 2001, 344, 783-792; Beniaminovitz et al.New Engl. J. Med. 2000, 342, 613-619; Ghosh et al.New Engl. J. Med. 2003, 348, 24-32; Lipsky et al.New Engl. J. Med. 2000, 343, 1594-1602] 참조).
적절한 용량의 결정은 예를 들어 치료에 영향을 미치거나 치료에 영향을 미칠 것으로 예측되는 관련 기술 분야에 공지되거나 의심되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 투여량은 최적 투여량보다 다소 적은 양으로 시작하며, 그 후 어떤 부정적인 부작용과 관련하여 원하는 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 조금씩 증가한다. 중요한 진단 척도에는 예를 들어 염증 증상 또는 생성된 염증성 사이토카인의 수준이 포함된다. 항체 또는 항체 단편은 연속 주입에 의해, 또는 예를 들어 1일, 1주, 또는 주당 1-7회 간격으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 항체 단편은 매일 1회, 격일로, 매주 2-3회, 2주에 1회, 3주에 1회, 6주에 1회 투여될 수 있다. 바람직한 투여 프로토콜은 중대한 바람직하지 않은 부작용을 피하는 최대 용량 또는 투여 빈도를 포함하는 것이다. 총 또는 평균 주간 용량은 일반적으로 적어도 0.05 μg/kg(체중), 보다 일반적으로는 적어도 0.2 μg/kg, 가장 일반적으로는 적어도 0.5 μg/kg, 일반적으로 적어도 1 μg/kg, 보다 일반적으로 적어도 10 μg/kg, 가장 일반적으로 적어도 100 μg/kg, 바람직하게는 적어도 0.2 mg/kg, 보다 바람직하게는 적어도 1.0 mg/kg, 가장 바람직하게는 적어도 2.0 mg/kg, 최적으로 적어도 10 mg/kg, 보다 최적으로 적어도 25 mg/kg, 가장 최적으로 적어도 50 mg/kg이다(예를 들어, 문헌 [Yang et al. New Engl. J. Med. 2003 349, 427-434; Herold et al. New Engl. J. Med.2002, 346, 1692-1698; Liu et al. J. Neurol. Neurosurg. Psych. 1999, 67, 451-456; Portielje et al. Cancer Immunol. Immunother. 2003, 52, 133-144] 참조). 바람직하게는, 총 또는 평균 주간 용량은 0.001 내지 100 mg/kg(체중), 바람직하게는 약 0.01 내지 50 mg/kg(체중), 바람직하게는 약 0.05 내지 30 mg/kg(체중), 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 10 mg/kg(체중)의 범위이다.
약학 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 바람직하게는 다음 섹션에서 더 자세히 설명되는 바와 같이 치료용 항체와 조합하여, 가능하게는 다른 약물과 조합하여 사용된다. 치료용 항체는 동일한 조성물의 일부를 형성하거나, 동시에 또는 상이한 시간에 투여하기 위한 별도의 조성물로 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 임의의 이전 실시양태와 조합하여, 임의의 다른 약물이 동일한 조성물의 일부를 형성하거나 또는 동시에 또는 상이한 시간에 투여하기 위한 별도의 조성물로서 제공될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 정맥내 투여 전에 (수성) 용해(즉, 재구성)를 필요로 하는 동결건조 케이크(동결건조 분말), 또는 투여 전에 해동을 필요로 하는 동결(수성) 용액의 형태이다. 가장 바람직하게는, 약학 조성물은 동결건조된 케이크의 형태이다. 본 발명에 따른 약학 조성물에 (동결건조 전에) 포함시키기에 적합한 약학적으로 허용되는 부형제는 완충 용액(예를 들어, 물 내의 시트레이트, 아세테이트, 히스티딘 또는 숙시네이트 함유 염), 동결보호제(예를 들어, 수크로스, 트레할로스), 장성 조절제(예를 들어, 염화나트륨), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 또는 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린) 및 증량제(예를 들어, 만니톨, 글리신)을 포함한다. 동결건조된 단백질 제제에 사용되는 부형제는 동결건조 과정 동안 및 보관 동안 단백질 변성을 억제하는 그의 능력에 대해 선택된다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편의 용도
본 발명의 항-SIRPα 항체, 그의 항원 결합 단편 및 약학 조성물은 SIRPα가 발현되거나 또는 SIRPα 및 CD47이 발현되는, 바람직하게는 과다발현되는 질병, 병태 및 적응증의 치료, 특히 CD47 발현 암의 치료에 유용할 것이다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 치료, 바람직하게는 CD47 발현 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다.
CD47은 급성 골수성 백혈병(AML), 유방암, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프성 백혈병(CLL), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 여포성 림프종(FL) 및 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)을 포함하는 비호지킨 림프종(NHL), 간세포 암종, 다발성 골수종(MM), 방광암, 결장암, 위암, 난소암, 두경부암, 신경모세포종, 흑색종, 골육종, 췌장암, 신장 암종, 전립선암, 간세포 암종, 폐암 및 다른 고형 종양을 포함하는 여러 인간 종양 유형에서 발현되는 것으로 밝혀졌다(Chao et al. Curr Opin Immunol. 2012, 24(2), 225-232; Chao et al. Cell 2010, 142(5), 699-713; Roesner et al. Mol Cancer Ther. 2018). 그의 정상 세포 대응물과 비교하여 이들 종양 중 여러 종양에 대해 증가된 발현이 관찰되었다(Russ et al. Blood Rev. 2018, doi: 10.1016/j.blre.2018.04.005). 다른 CD47 메커니즘 가설과 함께, 종양 세포에서 CD47의 상향조절은 종양이 식세포 작용의 회피를 통해 선천 면역계 감시를 벗어날 수 있게 한다는 가설이 세워졌다(Chao et al. Curr Opin Immunol. 2012, 24(2), 225-232).
흥미롭게도, 야나기타(Yanagita) 등은 인간 신장 세포 암종 및 흑색종이 SIRPα를 고도로 발현한다고 보고하였다(Yanagita et al. JCI Insight 2017, 2(1), e89140). 또한, SIRPα 발현은 일부 신경모세포종 세포 및 급성 골수성 백혈병(AML)에서 발견되었다. 소살레(Sosale) 등은 폐 암종 및 교모세포종에서 SIRPα의 발현을 보고하였다(Sosale et al. Mol. Ther. Methods Clin. Dec. 2016, 3, 16080). 첸(Chen) 등은 성상세포종 및 교모세포종에서 SIRPα의 발현을 보고하였다(Chen et al. Cancer Res 2004, 64(1), 117-127). 중피종 및 B 세포 림프종은 또한 SIRPα 양성일 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 SIRPα가 발현되는 질환, 병태 또는 적응증의 치료에, 특히 SIRPα 발현 암, 예를 들어 인간 신장 세포 암종 및 흑색종, 및 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스 관절염, 다발성 경화증 및 아마도 다발 혈관염(GPA)을 동반한 육아종증, 현미경 다발 혈관염(MPA) 및 심상성 천포창(PV)의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다. 항-SIRPα 항체는 또 다른 항체가 병원성 또는 감염된 세포를 고갈시키는 데 사용되는지의 여부에 관계없이 질병에서 상기 항체의 효능을 증가시킬 수도 있다. SIRPα 발현 종양의 경우, 야생형 인간 Fc를 포함하는 본 발명의 항-SIRPα 항체가 단일 요법으로 적합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 SIRPα-양성 인간 고형 종양 및 혈액 종양, 바람직하게는 신장 세포 암종 또는 악성 흑색종의 치료에 사용하기 위해 인간 면역 이펙터 세포 상에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 결합하는 Fc 영역을 포함하는 항-SIRPα 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 인간 면역 이펙터 세포에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 결합하는 Fc 영역은 IgA 또는 IgG 이소형이다. 보다 바람직한 것은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 Fc 영역을 포함하는 항-SIRPα 항체이고; IgG1, IgG2, 또는 IgG4 이소형이 훨씬 더 바람직한다. 가장 바람직한 것은 IgG1 이소형의 Fc 영역을 포함하는 항-SIRPα 항체이다.
상기 나타낸 바와 같이, 바람직하게는 Fc 이펙터 기능이 부분적으로 또는 완전히 파괴된 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 치료용 항체의 이펙터 기능을 개선하기 위해, 예를 들어 ADCC를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 치료용 항체으로 치료되는 암은 SIRPα를 발현하지 않는다. 이러한 치료 방법은 바람직하게는 하나 이상의 추가 항암 요법과 조합된다. 인간 Fcα 또는 Fcγ 수용체에 대한 결합의 감소를 나타내는 변형된 Fc 영역을 포함하는 항-SIRPα 항체는 상기 설명된 야생형 Fc 영역을 포함하는 동일한 항-SIRPα 항체와 비교할 때, 이펙터 세포로서 호중구를 사용하는 치료용 항체의 시험관내 ADCC를 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 실시예에서 제공되는 항체 1-13은 이형접합성 SIRPα1/SIRPαBIT 공여자의 호중구를 사용하여 시험관내 ADCC의 용량 의존적 증가를 보여준다. 바람직한 항체는 호중구를 사용하여 시험관 내 ADCC를 최대한으로 증가시키면서, 바람직하게는 T 세포 증식 검정 및/또는 IL-2 ELIspot을 사용하여 시험관 내에서 면역원성의 징후를 보이지 않는 항체이다. 가장 바람직한 것은 항체 1-6, 12 및 13, 바람직하게는 항체 6이다.
바람직하게는, 치료용 항체는 EMA(European Medicines Agency) 또는 FDA(Food and Drug Administration)와 같은 의약품 규제 당국에 의해 승인된 항체이다. 대부분의 규제 당국의 온라인 데이터베이스를 참조하여 항체 승인 여부를 확인할 수 있다.
전형적으로, 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체(바람직하게는 그의 Fc 영역의 결합이 감소된) 또는 그의 항원 결합 단편과 조합하여 사용하기 위한 치료용 항체는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표적에 결합하는 HCVR 및 LCVR 중 적어도 하나를 포함하는 단일 특이적 또는 이중 특이적 항체 또는 항체 단편이다: 아넥신 A1, AMHR2, AXL, BCMA, B7H3, B7H4, CA6, CA9, CA15-3, CA19-9, CA27-29, CA125, CA242, CCR2, CCR4, CCR5, CD2, CD4, CD16, CD19, CD20, CD22, CD27, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD47, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79, CD98, CD115, CD123, CD138, CD203c, CD303, CD333, CEA, CEACAM, CLCA-1, CLL-1, c-MET, 크립토, CTLA-4, DLL3, EGFL, EGFR, EPCAM, EPh(예를 들어, EphA2 또는 EPhB3), 엔도텔린 B 수용체(ETBR), FAP, FcRL5(CD307), FGF, FGFR(예를 들어, FGFR3), FOLR1, 푸코실-GM1, GCC, GD2, GPNMB, gp100, HER2, HER3, HMW-MAA, 인테그린 α(예를 들어, αvβ3 및 αvβ5, IGF1R, IL1RAP, 카파 골수종 항원, TM4SF1(또는 L6 항원), 루이스(Lewis) A 유사 탄수화물, 루이스 X, 루이스 Y, LIV1, 메조텔린, MUC1, MUC16, NaPi2b, 넥틴-4, PD-1, PD-L1, 프로락틴 수용체, PSMA, PTK7, SLC44A4, STEAP-1, 5T4 항원(또는 TPBG, 영양모세포 당단백질), TF(조직 인자), 톰젠-프리덴라이히(Thomsen-Friedenreich) 항원(TF-Ag), Tag72, TNF, TNFR, TROP2, VEGF, VEGFR, 및 VLA.
이러한 표적을 발현하는 암의 비제한적인 예는 다음과 같다: (HER2-양성) 유방암, (EGFR-양성) 결장 암종, (GD2-양성) 신경모세포종, 흑색종, 골육종, (CD20-양성) B 세포 림프종, (CD38-양성) 다발성 골수종, (CD52-양성) 림프종, 및 (CD33-양성) 급성 골수성 백혈병(AML).
단일 특이적 치료용 항체가 바람직하다. 보다 바람직한 것은 종양 세포의 표면 상의 막 결합 표적에 대한 치료용 항체이다.
바람직한 실시양태에서, 종양 세포의 표면 상의 막 결합 표적에 대한 치료용 항체는 인간 면역 이펙터 세포에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 결합하는 인간 Fc 영역을 포함한다. 위에서 설명된 이들 활성화 Fc 수용체에 대한 결합을 통해, 인간 면역 이펙터 세포에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 결합하는 인간 Fc 영역을 포함하는 치료용 항체는 ADCC 및/또는 ADCP를 유도할 수 있다. 인간 IgG, IgE 또는 IgA 이소형의 치료용 항체는 인간 면역 이펙터 세포에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 결합하는 인간 Fc 영역을 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 치료용 항체는 IgG 또는 IgA 이소형의 치료용 항체이다. 보다 바람직한 것은 IgG 이소형의 치료용 항체, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 항체이다. 훨씬 더 바람직한 것은 IgG1 또는 IgG2 이소형의 치료용 항체이다. 가장 바람직한 것은 IgG1 이소형의 치료용 항체이다.
본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 조합하여 사용하기에 적합한 치료용 항체는 다음을 포함한다: 알렘투주맙(예를 들어 다발성 경화증의 치료에서), 오비누투주맙(예를 들어 CLL, FL의 치료에서), 오파투주맙(예를 들어, MM의 치료에서), 다라투무맙(예를 들어, MM의 치료에서), 트라스투주맙(예를 들어, HER-2 과다발현 유방암, 위암, 위식도 접합부 선암종의 치료에서), 디누툭시맙(예를 들어, 신경모세포종, 소아 환자의 치료에서), 파니투무맙, 세툭시맙(예를 들어, 두경부암, 결장직장암의 치료에서), 리툭시맙, 오파투무맙(예를 들어, NHL, CLL, FL, DLBCL의 치료에서), 우블리툭시맙, 마르게툭시맙, 페르투주맙, 벨투주맙, 브렌툭시맙, 엘로투주맙, 이브리투모맙, 이파보투주맙, 파를레투주맙, 오티에르투주맙, 카로툭시맙, 에프라투주맙, 이네빌리주맙, 룸레투주맙, 모가물리주맙, 류코툭시맙, 이사툭시맙, 오포르투주맙, 엔시툭시맙, 세미플리맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 두르발루맙, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 스파르탈리주맙, 티슬렐리주맙, 캄렐리주맙, 신틸리맙, 세미플리맙. 이러한 치료용 항체는 또한 항체-약물 접합체(ADC)의 일부로 제공될 수도 있다. 본 발명에 따른 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 조합하여 사용하기에 적합한 ADC는 트라스투주맙 듀오카르마진, 트라스투주맙 데룩스테칸, 트라스투주맙 엠탄신, 겜투주맙 오조가미신, 이노투주맙 오조가미신, 폴라투주맙 베도틴, 나라툭시맙 엠탄신, 이브리투모맙 티욱세탄 및 브렌툭시맙 베도틴을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 치료용 항체는 동일한 제제에 존재할 수 있거나 상이한 제제로 투여될 수 있다. 투여는 동시 또는 순차적일 수 있으며, 어느 순서로든 효과적일 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 면역 이펙터 세포 상에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 결합하는 인간 Fc 영역을 포함하는, 종양 세포의 표면 상의 막 결합 표적에 대해 작용하는 치료용 항체와 조합하여 인간 고형 종양 및 혈액 종양의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이고, 여기서 항-SIRPα 항체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 동일한 항-SIRPα 항체와 비교할 때 인간 Fcα 또는 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합을 나타내는 변형된 Fc 영역, 바람직하게는 L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328, 및 P329(Eu 넘버링)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
대안적으로 또는 임의의 다른 실시양태와 조합하여, 한 실시양태에서, 본 발명은 CD47이 발현되는, 바람직하게는 과다발현되는 질병, 병태 및 적응증의 치료, 특히 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라 치료되는 예시적이고 비제한적인 암에 대해서는 상기 내용을 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명의 약학 조성물은 상기 설명한 바와 같은 치료용 항체와 동시에 또는 순차적으로 투여하기 위한 것이다.
대안적으로 또는 임의의 다른 실시양태와 조합하여, 한 실시양태에서, 본 발명은 SIRPα 발현 암, 예를 들어 인간 신장 세포 암종 또는 흑색종의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명의 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명의 약학 조성물은 상기 설명한 바와 같은 치료용 항체와 동시에 또는 순차적으로 투여하기 위한 것이다.
대안적으로 또는 임의의 다른 실시양태와 조합하여, 한 실시양태에서, 본 발명은 암, 특히 종양 세포가 CD47 또는 SIRPα를 발현하는 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 방법을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 암은 CD47을 발현하는, 잠재적으로 CD47을 과다발현하는 종양 세포를 특징으로 하는 암이다. 본 발명에 따라 치료되는 예시적이고 비제한적인 CD47 발현 암에 대해서는 상기 내용을 참조한다. 대안적인 실시양태에서, SIRPα를 발현하는 암은 인간 신장 세포 암종 또는 흑색종 또는 신경모세포종 또는 급성 골수성 백혈병(AML)이다.
본 발명의 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 본 발명의 조성물은 치료용 항체와 조합하여 사용될 때 CD47을 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 것이 바람직하다. "CD47을 발현하는 종양 세포의 성장 억제" 또는 "성장 억제"는 암 세포(CD47을 발현하는 또는 과다발현하는)의 측정 가능한 성장 억제가 달성되는 것이다. 바람직한 성장 억제성 항-SIRPα 항체는 CD47 발현 종양 세포의 성장을 적절한 대조군과 비교하여 20% 초과, 바람직하게는 약 20% 내지 약 50%, 훨씬 더 바람직하게는 50% 초과(예를 들어, 약 50% 내지 약 100%)의 수준으로 억제하고, 상기 대조군은 전형적으로 시험되는 항체로 처리되지 않은 종양 세포이다. 한 실시양태에서, 성장 억제는 세포 배양액에서 약 0.1 내지 30 mg/ml 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 항체 농도에서 측정될 수 있으며, 여기서 성장 억제는 항체에 대한 종양 세포 노출 1-10일 후에 결정된다. 생체 내에서 종양 세포의 성장 억제는 예를 들어 EP2474557B1에 기재된 것과 같은 다양한 방식으로 결정될 수 있다. 항-SIRPα 항체를 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg(체중)으로 투여할 때 종양 크기 또는 종양 세포 증식이 항체의 처음 투여시로부터 약 5일 내지 3개월 이내, 바람직하게는 약 5 내지 30일 이내에 감소하면, 항체는 생체 내에서 성장 억제성인 것이다.
"세포 사멸을 유도하는" 항체는 생존 세포를 생존 불가능하게 만드는 항체이다. 세포는 CD47을 발현하는 세포이다. 시험관 내에서의 세포 사멸은 ADCC에 의해 유도된 세포 사멸을 구별하기 위해 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 결정될 수 있다. 따라서, 세포 사멸에 대한 검정은 면역 이펙터 세포가 없는 상태에서 열 불활성화된 혈청을 사용하여(즉, 보체의 부재 하에) 수행될 수 있다. 항체가 세포 사멸을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 프로피디움 요오다이드(PI), 트리판 블루(문헌 [Moore et al. Cytotechnology 1995; 17, 1-11] 참조), 또는 7-AAD의 흡수에 의해 평가되는 막 완전성의 손실을 처리되지 않은 세포와 비교하여 평가하거나, 또는 세포 생존력의 손실을 평가할 수 있다(테트라졸륨 감소, 레사주린 감소, 프로테아제 마커, 및 ATP 검출).
표현 "치료 유효량"은 이전에 정의된 바와 같이 암 치료에 효과적인 양을 의미하고; 상기 양은 원하는 반응을 나타내거나, 예를 들어 전이 또는 원발성 종양 진행, 크기 또는 성장의 증상 또는 징후를 개선하기에 충분한 양일 수 있다. 특정 대상체에 대한 치료 유효량은 치료되는 병태, 대상체의 전반적인 건강, 투여 방법, 경로 및 투여량 및 부작용의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 반응 평가 기준은 문헌에서 설명되었다(RECIST; Eisenhauer et al. European Journal of Cancer 2009; 45, 228-247; Schwartz et al. European Journal of Cancer 2016; 62, 138-145; Cheson et al. Journal of Clinical Oncology 2003; 21(24), 4642-4649; Moghbel et al. Journal of Nuclear Medicine 2016, 57(6), 928-935; 참고문헌은 그 전부가 참고로 포함됨). 바람직하게는, 효과는 종양 정체(즉, 감소는 없지만, 현상 유지), 기준선 종양 크기에 비해 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 50%, 70%, 또는 심지어 90% 또는 그 초과의 병변의 수 감소 또는 종양 크기의 감소, 바람직하게는 기준선 직경 합계를 기준으로 하여 표적 병변의 직경 합계의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%의 감소를 초래할 것이다. 조합된 경우, 치료 유효량은 성분의 조합물에 대한 비율이며, 효과는 개별 성분 단독으로 국한되지 않는다. 치료 유효량은 바람직하게는 적어도 약 10%; 바람직하게는 적어도 약 20%; 바람직하게는 적어도 약 30%; 보다 바람직하게는 적어도 약 50%까지 증상을 조절할 것이다. 대안적으로, 이동의 조절은 다양한 세포 유형의 이동 또는 이송이 영향을 받는 것을 의미한다. 이는 예를 들어 통계적으로 유의하고 정량할 수 있는, 영향을 받는 세포 수의 변화를 초래할 것이다. 이는 일정 기간 또는 표적 영역 내에서 유인되는 표적 세포의 수의 감소일 수 있다. 원발성 종양 진행률, 크기, 전파 또는 성장도 모니터링할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치료용 항체의 사용과 조합하고 추가로 하나 이상의 다른 항암 요법과 조합하여, CD47 발현 질환, 병태 또는 적응증, 특히 암, 보다 특히 인간 고형 종양 또는 혈액 종양의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 적합한 다른 항암 요법은 수술, 화학 요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 및 소분자 표적화된 요법, 예를 들어 혈관 신생 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 설명한 바와 같은 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물은 하나 이상의 다른 항암 요법의 사용과 조합하여 인간 고형 종양 및 혈액 종양의 치료에 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 특히, 상기 설명한 바와 같은 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물은 하나 이상의 다른 항암 요법의 사용 후에 인간 고형 종양 및 혈액 종양의 치료에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 하나 이상의 추가의 항암 치료 화합의 사용과 조합하여 CD47 발현 질환, 병태 또는 적응증의 치료에 사용하기 위한 상기 설명한 바와 같은 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "항암 치료 화합물"은 치료용 항체를 포함하지 않는 것으로 의도된다. 치료용 항체는 상기에서 정의된 바와 같다. 따라서, 상기 설명한 바와 같은 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물은 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 치료용 항체와 조합하여, 하나 이상의 다른 항암 치료 화합물의 사용 전, 후 또는 사용과 동시에 인간 고형 종양 및 혈액 종양의 치료에 사용될 수 있다.
적합한 항암 치료 화합물은 세포독성제, 즉 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 포함한다. 이 용어는 화학 치료제, 즉 암 치료에 유용한 화학적 화합물, 방사선 치료제, 예를 들어 방사성 동위원소, 호르몬 치료제, 표적화된 치료제 및 면역 치료제를 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 화학 치료제는 질소 머스타드, 니트로소우레아, 테트라진 및 아지리딘과 같은 알킬화제; 항폴레이트, 플루오로피리미딘, 데옥시뉴클레오사이드 유사체 및 티오퓨린과 같은 항대사산물; 빈카 알칼로이드 및 탁산과 같은 항미세관제; 토포이소머라제 I 및 II 억제제; 및 안트라사이클린 및 블레오마이신과 같은 세포독성 항생제를 포함한다. 예를 들어, 화학 요법은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다: CHOP(시클로포스파미드, 독소루비신(하이드록실 다우노루비신으로도 칭해짐), 빈크리스틴(온코빈으로도 칭해짐) 및 프레드니손), ICE(이다루비신, 시타라빈 및 에토포사이드), 미톡산트론, 시타라빈, DVP(다우노루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손), ATRA(all-트랜스 레티노산), 이다루비신, 횔저(Hoelzer) 화학 요법제, ABVD(블레오마이신, 다카르바진, 독소루비신 및 빈크리스틴), CEOP(사이클로포스파미드, 에피루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론), 2-CdA(2-클로로데옥시아데노신), FLAG & IDA(플루다라빈, 시타라빈, 필가스트림 및 이다루비신)(후속적으로 G-CSF(과립구-콜로니 자극 인자) 또는 GM-CSF 치료를 사용하거나 사용하지 않음), VAD(빈크리스틴, 독소루비신 및 덱사메타손), M & P(멜팔란 및 프레드니손), C(사이클로포스파미드)-Weekly, ABCM(아드리아마이신, 블레오마이신, 사이클로포스파미드 및 미토마이신-C), MOPP(메클로레타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진) 및 DHAP(덱사메타손, 시타라빈 및 시스플라틴). 바람직한 화학 요법은 CHOP이다. 적합한 방사선 치료는 131I-메타요오도벤질구아니딘(MIBG), 인산나트륨으로서의 32P, 223Ra 클로라이드, 89Sr 클로라이드 및 153Sm 디아민 테트라메틸렌 포스포네이트(EDTMP)와 같은 방사성 동위원소를 포함한다. 호르몬 치료제로서 사용하기 적합한 작용제는 호르몬 합성 억제제, 예를 들어 아로마타제 억제제 및 GnRH 유사체; 및 호르몬 수용체 길항제, 예를 들어 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 및 항안드로겐을 포함한다. 본원에서 사용되는 표적화된 치료제는 종양 형성 및 증식에 관여하는 특정 단백질을 방해하는 치료제이며, 소분자 약물; 또는 펩타이드 또는 펩타이드 유도체일 수 있다. 표적화된 소분자 약물의 예는 에베롤리무스, 템시롤리무스 및 라파마이신과 같은 mTOR 억제제; 이마티닙, 다사티닙 및 닐로티닙과 같은 키나아제 억제제; 소라페닙 및 레고라페닙과 같은 VEGF 억제제; 및 게피티닙, 라파티닙 및 에를로티닙과 같은 EGFR/HER2 억제제를 포함한다. 펩타이드 또는 펩타이드 유도체 표적화된 치료제의 예는 보르테조밉 및 카르필조밉과 같은 프로테아솜 억제제를 포함한다. 면역 치료제는 사이토카인(IL-2 및 IFN-α)과 같은 면역 반응을 유도, 강화 또는 억제하는 작용제; 탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드와 같은 면역 조절 아마미드 약물; 탈리모겐 라헤르파렙벡과 같은 치료용 암 백신; 수지상 세포 백신, 입양 T 세포 및 키메라 항원 수용체 변형 T 세포와 같은 세포 기반 면역 치료제; 또는 목세투모맙 파수도톡스와 같은 면역 독소를 포함한다.
상기 언급된 임의의 치료 방법은 예를 들어, 포유동물, 바람직하게는 예를 들어 비인간 영장류를 포함하는 영장류, 가장 바람직하게는 인간을 포함하는, 그 치료를 필요로 하는 임의의 대상체에 적용될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서, "포함하다"라는 동사 및 그의 활용은 단어 뒤에 오는 항목이 포함되지만 구체적으로 언급되지 않은 항목이 제외되는 것은 아님을 의미하는 비제한적인 의미로 사용된다. 또한, 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 요소의 언급은 문맥상 요소 중 오직 하나만 있을 것을 명확하게 요구하지 않는 한, 하나 초과의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 부정 관사 "a" 또는 "an"은 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
본 명세서에 언급되는 모든 특허 및 참고문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
다음의 실시예는 단지 예시 목적으로만 제공되며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.
실시예
1. 항체의 일시적 발현
a) cDNA 구축물 및 발현 벡터의 준비
항체의 중쇄 가변 영역(HCVR) 아미노산 서열은 각각 N 말단에서 리더 서열(항체 1-13의 경우 서열 번호 28)에 연결되고, C 말단에서 서열 번호 25에 따른 인간 IgG1 HC LALA의 불변 도메인에 연결되었다(인 실리코(in silico)). 항체 12C4, 12C4-LALA, 29AM4-5-LALA 또는 KWAR23-LALA의 HCVR 아미노산 서열은 각각 N 말단에서 HAVT20 리더 서열(서열 번호 27)에 연결되고, C 말단에서 서열 번호 25에 따른 인간 IgG1 HC LALA의 불변 도메인 또는 야생형 인간 IgG1 HC(서열 번호 24)에 연결되었다. KWAR23은 중쇄의 표준 아달리무맙 불변 도메인을 가지고 있지만, LALA 돌연변이는 존재하지 않는다. HEFLB 중쇄는 IgG4이고, WO 2017/178653의 서열 번호 42에 개시된 바와 같이 사용되었다. 생성된 아미노산 서열은 인간 세포(호모 사피엔스(Homo sapiens))에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 cDNA 서열로 역번역되었다. 이와 유사하게, 구축물의 LC(경쇄 가변 영역; LCVR)에 대한 cDNA 서열은 리더 서열(항체 1-13의 경우 서열 번호 29, 12C4, 12C4-LALA, 29AM4-5-LALA, KWAR23, KWAR23-LALA 및 (인간화) HEFLB의 경우 서열 번호 27)의 서열을 N 말단에서 항체 1-13, 12C4, 12C4-LALA, 29AM4-5-LALA, KWAR23, KWAR23-LALA 및 (인간화) HEFLB의 LCVR에 및 C 말단에서 인간 항체 κ 경쇄 불변 영역(서열 번호 26)에 연결함으로써 수득하였다. 표 1a-c에 따른 HCVR 및 LCVR 서열이 사용되었다. 항-SIRPα 항체 SE5A5(마우스 IgG1κ)는 바이오레전드(Biolegend, 미국 샌 디에고 소재; 정제된 항-인간 CD172a/b(SIRPα/β 항체)로부터 구입하였다. 표 1c에 제시된 비교용 항-SIRPα 항체 및 표 1d에 제시된 이소형 대조군에 대한 cDNA 구축물 및 발현 벡터를 유사하게 제조하였다.
표 1a: (i) 각각의 인간화 항-SIRPα 항체 1-13에서 중쇄 및 경쇄에 포함된 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 아미노산 서열(서열 번호), 및 (ii) 인간화 항-SIRPα 항체 1-13의 CDR을 포함하는 각각의 HCVR 및 LCYR의 아미노산 서열을 제시한다.
Figure pct00001
표 1b: 대조군 항체의 HC 및 LC를 제시한다.
Figure pct00002
*HEFLB는 IgG4 항체이고, 따라서 중쇄 가변 도메인은 IgG1 백본에 연결되지 않지만, IgG4 Fc 서열에는 연결된다(WO 2017/178653).
표 1c: 추가의 비교용 항-SIRPα 항체의 HC 및 FC의 아미노산 서열을 제시한다. 이들 항체는 WO2018/190719, WO2018/057669, WO2019/023347, WO2018/107058 및 WO01/40307로부터 선택되었다.
Figure pct00003
Figure pct00004
모든 참조 항체 HC 및 LC 서열은 리더 서열로서 서열 번호 27의 HAVT20 리더 서열을 포함한다. 리더 서열은 발현되고, 세포 외부로의 수송을 위해 필요하며, 그 과정에서 절단된다.
표 1d: 이소형 대조군 항체의 목록을 제시한다.
Figure pct00005
*iso7은 바이오레전드(cat#400102)로부터 구입하였다.
b) 벡터 구축 및 클로닝 전략
항체 사슬의 발현을 위해 CMV: TKpA 발현 카세트를 포함하는 포유동물 발현 벡터(pcDNA3.4; ThermoFisher)가 사용되었다. HC 또는 LC 발현 카세트(각각 CMV:HC: TKpA 및 CMV:LC- TKpA)를 포함하는 최종 벡터를 이. 콜라이 NEB 5-α 세포로 옮기고, 확장시켰다. 맥시프렙(Maxiprep) 또는 메가프렙(Megaprep) 키트(Qiagen)를 사용하여 형질감염을 위한 최종 발현 벡터의 대규모 생산을 수행하였다.
c) 포유동물 세포에서 일시적인 발현
시판되는 Expi293F 세포(Thermo Fisher)를 다음과 같이 제조업체의 지침에 따라 ExpiFectamine 형질감염제를 사용하여 발현 벡터로 형질감염시켰다: 75x107개의 세포를 300 ml FortiCHO 배지에 접종하고, 300 μg의 발현 벡터를 800 μl의 ExpiFectamine 형질감염와 조합하여 세포에 첨가하였다. 형질감염 1일 후에, 1.5 ml 인핸서 1 및 15 ml 인핸서 2를 배양물에 첨가하였다. 형질감염 6일 후에, 세포 배양 상청액을 4,000 g에서 15분 동안 원심분리하고 PES 병 필터/MF 75 필터(Nalgene)를 통해 정화된 수확물을 여과하여 수거하였다. 항체는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
2. 항체 결합 및 특이성
실험
표면 플라스몬 공명(SPR) 검정: 25℃에서 표면 플라스몬 공명 장치(BiaCore™ T200 시스템, GE Life Sciences)에서 단일 주기 동역학 분석에 의해 친화도 분석을 수행하였다. 비오티닐화된 SIRP 항원(서열 번호 51-56)은 10 μl/min에서 60초 동안 20x 희석된(러닝 완충제 내의) 비오틴 포획 시약(GE Life Sciences)의 주입 후에 10 μl/min에서 60초 동안 러닝 완충제(pH 7.4의 10 mM HEPES 완충제, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% v/v 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트(계면활성제 P20) 보유)에 5 ㎍/ml의 SIRP 항원을 주입함으로써 비오티닐화된 분자(Sensor Chip CAP, GE Life Sciences)에 적합한 칩의 표면에 포획되었다. 기준선 안정화를 1분으로 설정한 후, 러닝 완충제에서 5가지의 증가하는 농도의 항-SIRP 항체를 주입하였다. 각각의 단계에서, 모두 30 μl/min의 유속에서, 150초의 회합 시간을 사용하였고, 이후, 최고 농도에서만 1200초의 해리 시간을 사용하였다. 6 M 구아니딘-HCl, 0.25 M NaOH 용액(유속 30 μL/min으로 60초)으로 재생을 수행하였다. 비-항-SIRP(블랭크) 고정된 참조 유동 채널 및 러닝 완충제 주입을 사용하여 관찰된 센서그램에 대해 이중 블랭크 공제를 수행하였다. 센서그램에는 모든 시험된 항-SIRP 항체에 대해 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델이 적합화되었다. 동역학 파라미터(회합 속도 [ka], 해리 속도 [kd] 및 결합 상수(평형 해리 상수 또는 결합 친화도 [KD]로도 지칭됨)를 Biacore™ T200 평가 소프트웨어(v3.1)를 사용하여 계산하였다.
유세포 분석 검정: 인간 SIRPαBIT 항원을 내인적으로 발현하는 U937 세포 및 인간 SIRPα1, SIRPαBIT 또는 cySIRPα 항원 중 하나를 발현하는 CHO-S 차이니즈 햄스터 난소 세포(ExpiCHO-S) 세포로부터 스크리닝되고 단리된 비조작된 서브클론으로부터 유래된 세포(96웰 플레이트에서 100,000개의 세포/웰)를, 0.1% v/w BSA(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 및 0.02% v/w NaN3(Sigma-Aldrich)를 함유한 빙냉 FACS 완충제(1x PBS (LONZA))로 3회 세척하고, 이후에 빙냉 FACS 완충제에서 희석된 일정 농도 범위의 각각의 1차 mAb(50 μl/웰)을 첨가하였다. 4℃에서 30분의 인큐베이팅 시간 후, 세포를 빙냉 FACS 완충제로 3회 세척하고, 50 μl/웰의 2차 mAb를 첨가하였다(인간 항체에 대해, AffiniPure F(ab')2 단편 염소-항-인간 IgG-APC, 1:6,000 희석, Jackson Immuno Research를 첨가하고, 마우스 항체에 대해 AffiniPure Fab 단편 염소 항-마우스 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488, 1:1,000 희석, Jackson Immuno Research를 첨가하였다). 4℃에서 30분 후, 세포를 2회 세척하고, 150 μl FACS 완충제에 재현탁하였다. 형광 강도는 유세포 분석(BD FACSVerse, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)에 의해 결정되었고, U937 세포 및 ExpiCHO-S 세포에 대한 평균 형광 강도(MFI-Mean)로서 표시되었다. GraphPad Prism(Windows의 경우 버전 7.02, GraphPad, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 가변 기울기(4개의 파라미터)를 갖는 시그모이드 용량-반응 방정식을 사용하여 비선형 회귀에 의해 곡선을 피팅하였다. EC50 값은 4-파라미터 로지스틱 피트(logistic fit)를 사용할 때 곡선의 하단과 상단의 중간의 반응을 제공하는 μg/mL의 농도로서 계산되었다.
결과
SPR 검정: 항체 1-13 및 참조 항체의 인간 SIRPα1(huSIRPα1), 인간 SIRPαBIT(huSIRPαBIT), 사이노몰거스 원숭이 SIRPα(cySIRPα), 인간 SIRPγ(huSIRPγ), 인간 SIRPβ1v1(huSIRPβ1v1) 및 인간 SIRPβ1v2(huSIRPβ1v2)에 대한 결합에 대한 KD 값(즉, '평형 해리 상수' 또는 '결합 친화도'로도 지칭되는 결합 상수)이 표 2에 요약되어 있다. 항체 1-13은 huSIRPαBIT 및 huSIRPα1 둘 모두에 결합하며, huSIRPγ에 결합하지 않는다. 항체 1-13 중 일부, 예를 들어 항체 6은 때때로 SIRPγ와 약한 회합을 나타내지만, 매우 낮은 반응 단위(RU)를 가지며, 이는 아래 실시예의 세포 결합 실험에 나타난 바와 같이 관련성이 없는 것으로 보인다. 인간화 HEFLB는 huSIRPαBIT 변이체만을 인식하고, huSIRPα1 및 huSIRPγ 및 cySIRPα는 인식하지 않는다. KWAR23, 29AM4-5, SE5A5 및 12C4 항체는 huSIRPγ를 포함한 모든 SIRP 변이체에 결합한다.
표 2. SPR에 의해 측정된 인간 SIRPα1, 인간 SIRPαBIT, 인간 SIRPγ, 인간 SIRPβ1v1, 인간 SIRPβ1v2 및 사이노몰거스 원숭이 SIRPα에 대한 항-SIRPα 항체의 결합 친화도(KD(M)).
Figure pct00006
huSIRPα1 및 huSIRPαBIT의 KD 값은 농도 시리즈 1.56-6.25-25-100-400 ng/ml로부터 얻었다. cySIRPα, huSIRPγ, huSIRPβ1v1 및 huSIRPβ1v2의 KD 값은 농도 시리즈 6.25-25-100-400-1600 ng/ml로부터 얻었다. n.r.: 반응 없음 또는 계산된 Rmax 의 10 반응 단위(RU) 컷오프 미만. 1.0E-11 M 미만이 KD 값으로 주어지면, 친화도가 기기 범위를 벗어나거나 계산된 KD가 약 1.OE-11 M이지만 표면 포화가 관찰되었기 때문에 샘플을 정확하게 결정할 수 없었다. 1.OE-11 M 미만의 KD 값은 높은 친화도를 의미한다. #은 1:1 랭뮤어 모델에 대한 최적 미만의 적합성이 관찰되었음을 의미한다.
유세포 분석 검정: 세포에서 발현된 huSIRPα1, huSIRPαBIT 및/또는 cySIRPα에 대한 다양한 항체의 결합은 유세포 분석에 의해 결정되었다. 결합은 EC50 값, 즉, 곡선의 하단과 상단 사이의 중간 반응을 제공하는 항체 농도(μg/ml)로서 표시되고, 표 3에 제시된다. 항체 1-13은 huSIRPαBIT(ExpiCHO-S 세포에서 일시적으로 발현되거나 또는 U937 세포에서 내인적으로 발현됨) 및 huSIRPα1에 결합한다. 항체 1-4, 6, 12, 13은 낮은 μg/ml 범위에서 cySIRPα에 결합한다. 이들 항체는 또한 동일한 EC50 값 범위(낮은 μg/ml)로 huSIRPαBIT를 내인적으로 발현하는 U937 세포에도 결합한다. 참조 항체 KWAR23, KWAR23huIgG1LALA, 12C4huIgG1LALA, 12ChuIgG1, 29AM4-5huIgG1LALA 및 HEFLB는 U937 세포에서 발현된 huSIRPαBIT에 대해 유사한 결합을 보여준다. HEFLB는 huSIRPα1 및 cySIRPα에 결합하지 않는다.
표 3. 인간 SIRPαBIT를 내인적으로 발현하는 U937 세포에 대한 및 인간 SIRPα1, 인간 SIRPαBIT 또는 사이노몰거스 원숭이 SIRPα로 일시적으로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포에 대한 항-SIRPα 항체의 세포 결합
Figure pct00007
Figure pct00008
3. 인간 SIRPγ 결합 - T 세포 FACS 염색
실험
유세포 분석 검정: 퍼콜(Percoll) 구배를 사용하여 건강한 개체의 신선한 혈액에서 말초 단핵 세포(PBMC)를 단리하였다. 세포를 HEPES+완충제(132 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSCO4, 1.2 mM 인산칼륨, 20 mM HEPES, 5.5 mM 글루코스 및 0.5% (w/v) 인간 혈청 알부민, pH 7.4)에서 세척하고, FACS 완충제(PBS+인간 알부민 1% 완충제 w/v, 인간 알부민 200 g/ml, Sanquin Plasma Products B.V., 네덜란드 암스테르담 소재)에 1x106/ml의 농도로 재현탁하고, 원심분리하고, PBS+20% 정상 염소 혈청(NGS)에 재현탁하였다. 이어서, 세포(96웰 플레이트에서 200,000개의 세포/웰)는 빙상에서 30분 동안 2차 항체 단독(2차 염소 항-인간 IgG Alexa 633 F(ab')2 단편, 희석 1:1000, Jackson Immuno Research, 및 2차 염소 항-마우스 IgG Alexa 633 F(ab')2 단편, 희석 1:250, Invitrogen)과 함께 대조군 조건 또는 시험된 항체의 존재 하에서 인큐베이팅되었다. 그 후, 세포를 FACS 완충제로 세척하고, 항-인간 CD3 FITC 항체(희석 1:100, Invitrogen)와 각각의 2차 항체(항-인간 또는 항-마우스)의 혼합물에 재현탁하고, 빙상에서 암소에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 세포를 FACS 완충제로 세척하고, 150 μl의 FACS 완충제에 재현탁하고, 형광 강도를 유세포 분석(LSRII HTS 또는 LSRFortessa, BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 소재)에 의해 결정하고, 중앙 형광 강도(MFI-Median) 및 양성 세포의 비율로 표시하였다.
결과
CD3+ T 세포를 발현하는 SIRPγ에 대한 항체의 결합은 도 1에 제시되어 있다(평균 형광 강도(도 1a), 양성 세포의 백분율(도 1b)). 인간화된 HEFLB를 제외한 모든 참조 항체는 SIRPγ에 대한 결합을 나타냈다. 항체 1-13은 인간 CD3+ T 세포에 대한 결합을 나타내지 않았으며, 이것은 세포 기반 환경에서 SIRPγ의 결합이 없음을 확인해주는 것이다.
4. 비교용 항-SIRPα 항체의 특성화
실험
유세포 분석 검정: 인간 SIRPαBIT 항원을 내인적으로 발현하는 U937 세포(인간 단핵구 세포주) 및 인간 SIRPα1 또는 SIRPαBIT 항원을 일시적으로 발현하는 CHO-S 차이니즈 햄스터 난소 세포(ExpiCHO-S) 세포로부터 스크리닝되고 단리된 비조작된 서브클론으로부터 유래된 세포(96웰 플레이트에서 100,000개의 세포/웰)를, 0.1% v/w BSA(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 및 0.02% v/w NaN3(Sigma-Aldrich)를 함유한 빙냉 FACS 완충제(1x PBS (LONZA))로 2회 세척하고, 이후에 빙냉 FACS 완충제에서 희석된 일정 농도 범위의 각각의 1차 항체(50 μl/웰)을 첨가하였다. 4℃에서 30분의 인큐베이팅 시간 후, 세포를 빙냉 FACS 완충제로 2회 세척하였다. 이어서, 50 μl/웰의 2차 mAb를 첨가하였다(AffiniPure™ F(ab')2 단편 염소-항-인간 IgG-APC, 1:6,000 희석, Jackson Immuno Research). 4℃에서 30분 후, 세포를 2회 세척하고, 150 μl FACS 완충제에 재현탁하였다. 형광 강도는 FACSVerse(BD Biosciences)를 사용한 유세포 분석에 의해 결정되었고, U937 세포에 대한 중앙 형광 강도(MFI-Median) 및 ExpiCHO-S 세포에 대한 평균 형광 강도(MFI-Mean)로서 표시되었다. GraphPad Prism(Windows의 경우 버전 7.02, GraphPad, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 가변 기울기(4개의 파라미터)를 갖는 비선형 회귀에 의해 곡선을 피팅하였다. EC50 값은 4-파라미터 로지스틱 피트를 사용할 때 곡선의 하단과 상단의 중간의 반응을 제공하는 μg/mL의 농도로서 계산되었다.
표면 플라스몬 공명(SPR) 검정: 친화도 분석은 25℃에서 BiaCore™ T200 기기(GE life Sciences)에서 단일 주기 동역학 분석에 의해 수행되었다. AVI 태그 부착된 비오티닐화된 SIRP 항원은 비오틴 포획 키트(GE life Sciences)를 사용하여 포획하였다. 스트렙타비딘 표면은 비오틴 포획 시약을 주입하여 준비하였다. 후속적으로, 비오티닐화된 SIRP 변이체를 약 40-50 반응 단위(RU)의 포획 수준으로 러닝 완충제(pH 7.4의 10 mM HEPES 완충제, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% v/v 계면활성제 P20 보유)에 주입하였다. 1분 기준선 안정화 후에, 5개의 증가하는 농도의 항-SIRPα 항체를 150초의 회합 시간으로 주입하였다. 해리는 600초 동안 모두 30 μl/min의 유속에서 관찰하였다. 농도 범위는 예상되는 KD 근처에서 선택되었다. 6M 구아니딘-HCl, 0.25 M NaOH 용액을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 재생을 수행하였다. (결합된 비오틴 포획 시약) 참조 유동 채널 및 러닝 완충제 주입을 사용하여 얻은 센서그램에 대해 이중 참조 공제를 수행하였다. 센서그램에는 모든 시험된 항-SIRP 항체에 대해 1:1 랭뮤어 모델이 적합화되었다. 동역학 파라미터(ka, kd 및 KD)를 Biacore™ T200 평가 소프트웨어(v3.1)를 사용하여 계산하였다. huSIRPβ1v1 및 huSIRPβ1v2는 단량체 형태로 시험되었다. 추정된 KD는 시험된 농도 범위 내에 있다. 1.0E-11 미만이 보고된 KD 값이면, 동역학 파라미터가 기기 사양을 벗어나기 때문에 친화도를 정확하게 결정할 수 없다.
결과
유세포 분석 검정: 세포 상에 발현된 huSIRPα1 및 huSIRPαBIT에 대한 결합에 대한 SIRPα 항체의 비교는 유세포 분석에 의해 결정되었다. 결합은 표 4에서 EC50 값으로 표시된다. 여기에서 시험된 모든 항체는 huSIRPαBIT(Expi-CHO-S 세포에서 일시적으로 발현되거나 U937 세포에서 내인적으로 발현됨) 및 huSIRPα1에 대한 결합을 나타낸다. 대부분의 항체는 낮은 μg/ml 범위에서 EC50 값을 제시하지만, AB115-LALA, 3F9-LALA 및 7H9-LALA는 U937 세포에 대한 결합에 대해 1 μg/ml보다 큰 EC50 값을 보여준다. 또한, 3F9-LALA는 1 μg/ml보다 큰 EC50 값으로 ExpiCHO-S 세포 상에 발현된 huSIRPα1 및 huSIRPαBIT에 결합한다. 참고로, 상응하는 이소형 대조군은 이러한 세포에 대한 결합을 나타내지 않는다.
표 4. 인간 SIRPαBIT을 내인적으로 발현하는 U937 세포 및 인간 SIRPα1 또는 인간 SIRPαBIT로 일시적으로 형질감염된 ExpiCHO-S 세포에 대한 항-SIRPα 항체의 세포 결합
Figure pct00009
SPR 검정: 인간 SIRPβ 변이체 β1v1 및 β1v2에 대한 선택성에 대한 SIRPα 항체의 비교를 SPR을 사용하여 수행하였고, 그 결과는 표 5에 요약되어 있다. 3F9-LALA를 제외하고, 모든 항체는 huSIRPβ1v1을 인식하였다. 시험된 모든 항체가 huSIRPβ1v2에 결합하고, 항체 6이 가장 높은 KD를 갖고 따라서 가장 낮은 친화도를 갖는다. 참고로, 상응하는 이소형 대조군은 huSIRPβ1v1 및 huSIRPβ1v2에 대한 결합을 보이지 않는다.
표 5. SPR에 의해 측정된 인간 SIRPβ1v1 및 인간 SIRβ1v2에 대한 항-SIRPα 항체의 결합 친화도(KD (M)).
Figure pct00010
5. 항-SIRPα 항체의 1차 세포에 대한 결합: 과립구, 단핵구 및 T 세포
실험
유세포 분석 검정, 전혈 염색: 헤파린 처리된 전혈 샘플을 건강한 공여자(Sanquin 혈액 은행 Nijmegen, 네덜란드 소재)로부터 얻었고, 실온에서 밤새 보관하였다. 전혈 샘플을 실온에서 15분 동안 1X BD FACS™ 용해 용액(349202, BD Biosciences)으로 용해시키고, FACS 완충제(0.1% BSA 및 2 mM EDTA를 함유하는 PBS)로 세척하였다. 웰당 1.5x105개의 세포를 4℃에서 30분 동안 96웰 미량역가 플레이트(353,910, Falcon)에서 웰당 50 μl의 항-SIRPα 항체(농도 범위: 10 μg/ml 또는 90 μg/ml에서 시작하여 3.16x 희석함)로 염색하였다. FACS 완충제로 세척한 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 FACS 완충제 내에서 1:800 희석된 항-인간 CD3-PB 클론 UCHT1(558117, BD Biosciences), 1:800 희석된 항-인간 CD14-FITC 클론 MφP9(345784, BD Biosciences) 및 1:6000 희석된 APC-표지된 염소 항-인간 IgG F(ab')2 2차 항체(109-136-098, Jackson ImmunoResearch)의 칵테일과 함께 인큐베이팅하였다. FACS 완충제로 세척한 후, 세포를 볼텍싱에 의해 혼합하여 세포 응집을 방지하고, 웰당 50 μl의 BD Cytofix™ 고정 완충제(4.2% PFA)(554655, BD Biosciences)와 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이팅하고, 분석 전에 세척하였다. FACSVerse(BD Biosciences)로 샘플을 수집하고, FlowJo 소프트웨어(BD Biosciences)에서 분석하였다. 과립구는 FSC-A/SSC-A를 기반으로 게이팅된 후, CD14- 게이팅이 이어졌다. T 세포 및 단핵구가 먼저 FSC-A/SSC-A를 기반으로 게이팅되었다. 이어서, T 세포는 CD3+CD14- 세포로 확인되었고, 단핵구는 CD14+CD3- 세포로 확인되었다.
유세포 분석 검정, 단리된 T 세포에 결합: 건강한 개인(Sanquin 혈액 은행 Nijmegen, 네덜란드 소재)의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 음성 선택(11344D Dynabeads Untouched Human T Cell Kit, ThermoFisher Scientific)에 의해 T 세포를 단리하였다. 세포를 HEPES+완충제(132 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 1.2 mM 인산칼륨, 20 mM HEPES, 5.5 mM 글루코스 및 0.5%(w/v) 인간 혈청 알부민, pH 7.4)에서 세척하고, 단리 완충제(PBS+인간 알부민 1% 완충제 w/v, 인간 알부민 200 g/ml, Sanquin Plasma Products B.V., 네덜란드 암스테르담 소재)에 1x106/ml의 농도로 재현탁하고, 원심분리하고, 0.1% v/w BSA(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 및 0.02% v/w NaN3(Sigma-Aldrich) 함유 FACS 완충제(1x PBS(LONZA))에 재현 탁하였다. 세포(96웰 플레이트에서 100,000개의 세포/웰)는 빙냉 FACS 완충제로 세척한 후, 빙냉 FACS 완충제에서 희석된 일정 농도 범위의 각각의 1차 mAb(50 μl/웰)을 첨가하였다. 4℃에서 30분의 인큐베이팅 시간 후, 세포를 빙냉 FACS 완충제로 2회 세척하고, 50 μl/웰의 2차 mAb를 첨가하였다(인간 항체에 대해, AffiniPure™ F(ab')2 단편 염소-항-인간 IgG-APC, 1:6,000 희석, Jackson Immuno Research; 마우스 항체에 대해 AffiniPure™ Fab 단편 염소 항-마우스 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488, 1:1,000 희석, Jackson Immuno Research). 4℃에서 30분 후, 세포를 2회 세척하고, 150 μl FACS 완충제에 재현탁하였다. 형광 강도는 FACSVerse(BD Biosciences)를 사용한 유세포 분석에 의해 결정되었고, 평균 형광 강도(MFI-Mean)로서 표시되었다. GraphPad Prism(Windows의 경우 버전 7.02, GraphPad, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 가변 기울기(4개의 파라미터)를 갖는 비선형 회귀에 의해 곡선을 피팅하였다. EC50 값은 4-파라미터 로지스틱 피트를 사용할 때 곡선의 하단과 상단의 중간의 반응을 제공하는 μg/mL의 농도로서 계산되었다.
결과
유세포 분석 검정, 전혈 염색: 다양한 SIRPα 항체의 1차 세포에 대한 결합은 유세포 분석에 의해 결정되었다. 대표적인 건강한 이형접합성 SIRPα1/SIRPαBIT 공여자에 대한 용량-반응 곡선은 도 10a-d에 제시되어 있다. 반응의 정확한 높이가 반드시 SIRPα 항체의 특징은 아니라는 점에 유의하여야 하고, 이것은 상기 높이가 또한 2차 항체에도 의존할 수 있기 때문이다. 대신에, EC50 값은 검출 항체와 무관하고, 따라서 비교되어야 한다. EC50 값의 요약은 표 6에 제시되어 있다. 정확한 EC50 값은 다양하지만, 모든 항체는 이형접합성 SIRPαBIT/SIRPα1 공여자의 과립구 및 단핵구에 대한 결합을 보여준다. HEFLB를 제외하고, 모든 항체는 또한 변동하는 EC50 값으로 동형접합성 SIRPα1 공여자의 과립구 및 CD14+ 단핵구에 대한 결합을 보여준다. 이러한 데이터는 표 2 및 3의 SPR 및 세포 데이터와 일치하며, HEFLB에는 또한 SIRPα1에 대한 결합이 결여된다. 인간 혈액에서 순환하는 CD3+ T 세포는 SIRPα 또는 SIRPβ를 발현하지 않고 SIRPγ만을 발현하므로, CD3+ T 세포 결합은 SIRPγ 결합으로 해석될 수 있다. 대부분의 항체는 CD3+ T 세포에 대한 결합을 나타내지만, 항체 6, AB3-LALA, 3F9-LALA, 7H9-LALA 및 HEFLB는 CD3+ T 세포에 대한 결합을 나타내지 않는다. 이 전혈 염색 검정에서, AB136-LALA는 보다 높은 항체 농도에서 T 세포에 대한 결합을 보여준다. 이는 Ab136이 SIRPγ에 결합하지만 KD가 낮다는 WO2018/057669의 개시내용과 일치하는 것으로 보인다.
표 6. 건강한 이형접합성 SIRPα1/SIRPαBIT 공여자(α1/aBIT) 또는 동형접합성 SIRPα1/SIRPα1 공여자(α1/α1)의 전혈에서 과립구, CD14+ 단핵구 및 CD3+ T 세포에 대한 항-SIRPα 항체의 세포 결합.
Figure pct00011
Figure pct00012
> 10 = 10 μg/ml 초과의 EC50,
# = 제외됨, 비정상적인 결합 프로파일 생성,
^ = 용량-반응 곡선이 관찰됨; 그러나, 값은 이소형 대조군 미만임,
* = 불완전한 곡선(포화에 도달하지 않음),
~ = 모호한 피팅.
유세포 분석 검정, 단리된 T 세포에 대한 결합: 또 다른 접근법을 사용하여 다양한 항체의 SIRPγ 의존성 T 세포 결합을 확인하기 위해, 단리된 1차 T 세포(SIRPα 양성 또는 SIRPβ 양성 골수 세포가 없는)를 항체의 패널로 염색하였다. 그 결과는 도 11에 제시되어 있다. 대부분의 항체는 T 세포에 결합하지만, 항체 6, AB3-LALA, 3F9-LALA, 7H9-LALA, SE5A5 및 HEFLB는 T 세포에 대한 결합을 나타내지 않는다. 다시, AB136-LALA는 높은 항체 농도에서 결합을 보여준다.
따라서, 상기 실시예는 huSIRPβ1v2에 대한 항체 6의 친화도가 상기 나열된 광범위한 패널에서 시험된 임의의 비교용 항-SIRPα 항체의 친화도보다 더 낮음을 보여준다. 또한, SIRPβ1v1에 대한 비 T 세포 결합 항체 6의 친화도는 SIRPγ에 대한 친화도가 낮거나 없는 AB136-LALA, 7H9-LALA 및 HEFLB의 친화도와 비슷하고, 또한 SIRPγ에 대한 친화도가 낮거나 없는 AB3 및 SE5A5의 친화도보다 더 낮았다.
종합적으로, 항체 6은 두 SIRPα-대립유전자 모두에 대한 높은 결합 효능을 갖는 반면에, 다른 비-억제성 SIRP-패밀리 구성원인 SIRPβ1v1, SIRPβ1v2 및 SIRPγ에 대해서는 결합이 상대적으로 낮거나 결합을 보이지 않는다.
6. CD47 차단 능력
실험
CD47 차단 능력: CD47에 대한 SIRPα1 또는 SIRPαBIT 결합을 차단하는 항-SIRPα 항체의 능력을 평가하기 위해, SIRPα1 또는 SIRPαBIT을 항-SIRPα 항체와 함께 사전 인큐베이팅한 다음, 포획된 CD47로부터의 해리를 시험하였다. 간단히 설명하면, AVI 태그 부착된 비오티닐화된 CD47-Fc는 비오틴 포획 키트(GE life Sciences)를 사용하여 포획하였다. 스트렙타비딘 표면은 비오틴 포획 시약을 주입하여 준비되었다. 이어서, 비오티닐화된 CD47-Fc를 약 1000 RU의 포획 수준으로 러닝 완충제(150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% v/v 계면활성제 P20을 포함하는 pH 7.4의 10 mM HEPES 완충제)에 주입하였다. 5배 몰 과량의 항체와 10 μg/ml SIRPα1 또는 10 μg/ml SIRPαBIT를 포함하는 혼합물을 주위 온도에서 30분 동안 사전 인큐베이팅하고, CD47-Fc 표면 위에 5 μl/분으로 120초 동안 주입하였다. 제조업체의 지침에 따라 6 M 구아니딘-HCl, 0.25 M NaOH(3:1)로 재생하기 전에 300초 동안 해리가 관찰되었다. 차단/비-차단 항체의 특성화는 이중 참조 공제 후에 시각적 평가에 의해 수행되었다.
결과
CD47 차단 능력: CD47 결합을 차단하는 SIRPα 표적화 항체의 능력은 SPR을 사용하여 연구하였다(표 7). 항체 6을 포함하여 대부분의 항체가 CD47-SIRPαBIT 및 CD47-SIRPα1 상호작용을 차단하지만, AB3-LALA, AB136-LALA, 3F9-LALA 및 7H9-LALA는 CD47-SIRPαBIT 및 CD47-SIRPα1 상호작용을 차단하지 않고, 따라서 비차단성이다. 또한, HEFLB는 CD47-SIRPαBIT의 상호작용만 차단하고, CD47-SIRPα1의 상호작용은 차단하지 않으며, 이것은 HEFLB에 의한 SIRPα1의 인식 결여와 일치한다.
표 7. CD47-SIRPαBIT 및 CD47-SIRPα1 상호작용의 차단에 대한 SIRPα-항체의 특성화.
Figure pct00013
7. SHP-1 동원을 차단하는 능력
실험
SIRPαBIT 신호전달은 DiscoverX®의 PathHunter 효소 단편 보완(Enzyme Fragment Complementation) 기술을 사용하여 분석하였다. 이 검정에서, CD47이 결핍 된 Jurkat 세포는 신호전달 단백질 SHP-1의 SH2 도메인에 융합된 Prolink(PK) 및 효소 수용자(Enzyme Acceptor; EA)로 태그 부착된 SIRPαBIT +를 과다발현하도록 유전적으로 조작된다. 이러한 Jurkat SIRPαBIT 신호전달 세포를 CD47(CD47 리간드 세포)을 발현하는 세포와 함께 인큐베이팅하면, SHP-1 및 SIRPαBIT가 상호작용하여 PK 및 EA의 보완을 유도할 것이다. 이것은 기질을 절단하여 화학발광 신호를 생성할 수 있는 활성 β-갈락토시다제 효소를 생성한다. 이 시스템은 SIRPα에 대한 SHP-1 동원을 길항하는 SIRPα 표적화 항체의 능력을 연구하는 데 사용할 수 있다. Jurkat SIRPαBIT 신호전달 세포는 CD47 리간드 세포와 조합된 일정 농도 범위의 항-SIRPα 항체와 함께 인큐베이팅되었다. Jurkat E6.1 세포는 CD47 리간드 세포로서 사용되었으며, 검정은 384웰 플레이트 형식으로 수행되었다. 먼저, 12.5 μl의 Jurkat SIRPαBIT 신호전달 세포 현탁액(80만 개의 세포/ml)을 각각의 웰에 첨가한 다음, 2.5 μl의 일정 농도 범위의 항-SIRPα 항체 용액(11x 농축)을 첨가하였다. 검정은 EC80에서 12.5 μl의 CD47 리간드 세포 현탁액(160만 개의 Jurkat E6.1 세포/ml)을 첨가하여 시작되었다. 플레이트는 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이팅되었다. 인큐베이팅 후에, 2x 희석된 시약 A(0.1% BSA를 포함하는 PBS 내의 DiscoverX 검출 키트) 2 μl를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 암실에서 진탕기(300 rpm)에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 μl의 2x 희석된 시약 B(0.1% BSA를 포함하는 PBS 내의 DiscoverX 검출 키트)를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 암실에서 진탕기(300 rpm)에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 발광은 Envision® 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 0.1 sec/웰의 통합 시간에서 측정되었다. 모든 세포 현탁액은 0.1% BSA를 함유하는 PBS(Sigma) 내의 항체 희석액인 세포 플레이팅 배지(DiscoverX)에서 준비되었다. GraphPad Prism 8 소프트웨어에서 그래프를 분석하였다. 최대 신호의 %는 다음과 같이 결정되었다: (상대 발광 단위(RFU)/최대 자극의 RFU(항체 없음) x 100). 효능 수준은 다음과 같이 계산되었다: 100% - 3.3 μg/ml의 화합물 값의 '최대 신호의 %'.
결과
SIRPα의 활성화는 잘 특성화된 억제성 신호 캐스케이드로 이어진다. CD47의 결합시, SIRPα의 세포질 도메인 면역 수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)가 인산화되고, 이것은 Src 상동성 영역 2 도메인 함유 포스파타제-1(SHP-1)의 동원 및 활성화를 유도한다. SHP-1은 활성화 FcγR을 포함한 특정 기질의 단백질 탈인산화를 통해 억제성 신호전달을 매개한다. 이것은 면역 반응의 약화를 유발한다. SIRPα 매개 신호전달을 억제하는 SIRPα-표적화 항체의 능력은 CD47 결핍 Jurkat SIRPαBIT 신호전달 세포를 사용하여 연구되었다. 이러한 세포를 CD47 함유 Jurkat E6.1 세포와 함께 배인큐베이팅하면, SHP-1이 SIRPαBIT에 동원되어 화학발광 신호를 생성한다. 항체 6은 용량 의존적 방식으로 상기 신호를 길항할 수 있다(도 12a). 다른 SIRPα 표적화 항체는 SIRPαBIT 신호전달을 길항하는 능력에 대해 고정된 용량(3.3 μg/ml)으로 시험되었다(도 12b). SE5A5를 제외하고, SIRPαBIT 신호전달을 억제하는 효능은 모든 CD47-SIRPα 차단 항체와 유사하다(흰색 막대로 표시됨). 비-차단 항체 AB3-LALA, AB136-LALA, 3F9-LALA 및 7H9-LALA(검정색 막대로 표시됨)는 차단 항체에 비해 신호 억제 효능이 더 낮거나 억제 효능을 보이지 않고, 따라서 SIRPα 매개 신호전달을 길항할 수 있는 능력이 적거나 없는 것으로 보이다.
종합적으로, 항체 6은 CD47이 두 SIRPα-대립유전자에 결합하는 것을 차단하고, 이것은 비-차단 항체와 대조적으로 하류 신호전달의 높은 억제로 이어진다.
8. 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)
실험
DELFIA® 세포독성 검정(비-방사성 검정):
SIRPα1 또는 SIRPαBIT에 대해 동형접합성인 공여자의 호중구를 단리하고, 문헌 [Chao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347]의 방법에 따라 배양하였다. 새로 단리된 호중구를 인간 G-CSF(10 ng/ml) 및 IFNγ(50 ng/ml)와 함께 밤새 배양하였다. 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)은 비방사성 유로퓸 TDA(EuTDA) 세포독성 검정(DELFIA®, PerkinElmer)를 이용하여 결정되었다. SKBR3(인간 HER2 양성 유방암 세포주) 세포가 표적 세포로서 사용되었고, 비스(아세톡시메틸)2,2':6',2"-테르피리딘-6,6"-디카르복실레이트(BATDA 시약, Delfia)로 37℃에서 5분 동안 표지되었다. PBS로 2회 세척한 후, 웰당 5x103개의 표적 세포를, 96-웰 U-바닥 플레이트 내의 10%(v/v) 초저 IgG 소 태아 혈청(FBS, Gibco)으로 보충된 IMDM 배양 배지에서 호중구와 함께, 50:1의 이펙터 대 표적 세포 비에서 적절한 항체의 존재 하에, 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후, 상청액을 수거하고, 유로퓸 용액(DELFIA, PerkinElmer)에 첨가하고, 유로퓸 2,2':6',2"-테르피리딘-6,6"-디카르복실산(EuTDA) 형광을 분광형광계(Envision, PerkinElmer)를 사용하여 측정하였다. 세포독성의 백분율을 [(실험적 방출 - 자발적 방출)/(총 방출 - 자발적 방출)] x 100%로 계산하였다. 모든 조건을 2회 및/또는 3회 측정하였다.
51 Cr 방출 검정(방사성 검정):
SIRPα1 또는 SIRPαBIT에 대해 동형접합성 공여자의 호중구를 문헌 [Zhao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347]의 방법에 따라 단리하였다. 도 2에 제시된 것을 제외하고 모든 51Cr 방출 검정 실험에 대해, 새로 단리된 호중구를 10 ng/ml의 인간 GM-CSF와 함께 100분 동안 배양하였다. 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)은 51Cr 방출 검정을 사용하여 결정되었다. SKBR3(인간 유방암 세포주) 세포를 표적 세포로 사용하고, 37℃에서 90분 동안 100 μCi 51Cr(Perkin-Elmer)로 표지하였다. PBS로 2회 세척한 후, 웰당 5x103개의 표적 세포를 적절한 항체의 존재 하에 50:1의 이펙터 대 표적 세포 비율로 호중구와 함께 96웰 U-바닥 플레이트에서 10%(v/v) 소 태아 혈청으로 보충된 IMDM 배양 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후, 상청액을 수거하고, 감마 계수기(Wallac)에서 방사성을 분석하였다. 세포독성의 백분율은 [(실험적 방출 - 자발적 방출)/(총 방출 - 자발적 방출)] x 100%로 계산하였다. 모든 조건을 2회 및/또는 3회 측정하였다.
결과
12C4의 인간화는 ADCC의 손실을 초래했으며, 이는 IgG 1 불변 영역에서 감소된 이펙터 기능에 의해 회복되었다.
도 2는 51Cr 방출 검정에 의해 측정된 세포독성(%)으로서 ADCC 검정의 결과를 보여준다. 이펙터 세포로서의 동형접합성 SIRPαBIT 공여자로부터의 호중구 및 트라스투주맙 단독을 사용하여 SKBR3 세포에서 측정된 세포독성 %는 뮤린 12C4 항체(mu12C4)와 조합한 트라스투주맙의 세포독성 % 미만이다. 12C4 가변 영역이 인간 IgG1 불변 영역에 이식된 항체(12C4huIgG1)와 조합된 트라스투주맙은 낮은 농도의 12C4huIgG1에서 트라스투주맙 단독과 비교하여 유사한 세포독성 %를 나타낸다. 보다 높은 농도의 12C4huIgG1에서, 세포독성 %의 감소가 관찰된다. 12C4 가변 영역이 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역에 이식된 항체(12C4huIgG1LALA)와 조합된 트라스투주맙은 트라스투주맙 단독의 세포독성 %에 비해 증가된 세포독성 %를 나타내고, 0.2 μg/ml의 12C4huIgG1 및 트라스투주맙의 조합에 비해 증가된 세포독성 %를 나타낸다.
트라스투주맙 매개 ADCC의 용량 의존적 증가:
SRBR3 HER2 양성 유방암 세포에 대한, 다양한 농도(μg/ml; 용량 반응 곡선)에서 아미노산 치환 L234A 및 L235A(LALA)를 포함하는 인간 IgG1 불변 영역을 갖는 항체 1-13의 존재 하에 또는 참조 항체의 존재 하에서의 트라스투주맙(10 μg/ml)의 ADCC/세포독성 백분율이 도 3-9에 제시되어 있다. 항체 1-13의 경우, ADCC는 이형접합성 SIRPα1/SIRPαBIT 공여자에서 용량 의존적으로 증가한 반면(도 4 및 5), 이형접합성 공여자에서 12C4huIgG1에 대해서는 용량 의존적 감소가 관찰되고, 인간화 HEFLB에 대해서는 명확한 효과가 보이지 않으며, KWAR23huIgG1 및 SE5A5의 경우에는 최소한의 효과가 관찰되고, KWAR23-LALA 참조 항체에 대해서는 용량 의존적 증가가 나타난다(도 3). 또한, 항체 7-13 및 참조 항체는 동형접합성 SIRPα1 또는 SIRPαBIT 배경에 대해서도 시험되었다(도 6-9). 모든 항체는 보다 다양한 결과를 제시하는 것으로 나타났다.
9. 면역원성
CD4+ T 세포 에피토프는 생체 내에서 면역원성(항-약물 항체)의 중요한 동인이다. 항-SIRPα 항체 6에서 T 세포 에피토프에 대한 T 세포 반응을 검출하기 위해 생체외 T 세포 검정을 사용하였다. CD4+ T 세포 반응을 유도하는 그의 능력에 대해 EpiScreen™ 시간 경로 T 세포 검정을 사용한 면역원성 평가를 위해 항체 6을 아브제나(Abzena, 영국 캠브리지 소재)에 보냈다. 유럽 및 북미 인구를 대표하는 50명의 건강한 공여자 코호트(HLA 동종이인자형 기준)로부터의 PBMC를 시험 샘플과 함께 인큐베이팅하였다. T 세포 반응은 증식 검정([3H]-티미딘 흡수) 및 사이토카인 분비 검정(IL-2 ELISpot)을 사용하여 측정하였다. 항체 6은 T 세포 증식 검정 및 IL-2 ELISpot의 조합에서 면역원성이 아닌 것으로 밝혀졌다.
10. 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC); 비교예
실험
SIRPα1 또는 SIRPαBIT에 동형접합성인 또는 두 대립유전자에 대한 이형접합성인 공여자의 인간 호중구를 문헌 [Zhao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347]의 방법에 따라 단리하였다. 이어서, 호중구를 10 ng/ml의 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF, Peprotech)로 30분 동안 자극하였다. 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)은 문헌 [Zhao et al. PNAS 2011, 108(45), 18342-18347]의 방법에 따라 51Cr 방출 검정(PerkinElmer)을 사용하여 결정되었다. 간단히 설명하면, SKBR3(인간 유방암 세포주) 또는 A431(피부 표피 암종 세포주) 세포를 표적 세포로 사용하고, 37℃에서 90분 동안 100 μCi 51Cr(Perkin-Elmer)로 표지하였다. PBS로 2회 세척한 후, 웰당 5x103개의 표적 세포를 트라스투주맙(SKBR3의 경우 최종 농도 10 μg/ml) 또는 세툭시맙(A431의 경우 최종 농도 5 μg/ml)으로 옵소닌화하고, 도 13-14에 제시된 용량-반응 범위의 항체의 존재 하에 50:1의 이펙터 대 표적 세포 비율로 호중구와 함께 96웰 U-바닥 플레이트에서 20%(v/v)의 저 IgG 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 IMDM 배양 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후, 상청액을 수거하고, LumaPlates(Perkin Elmer)로 옮기고, MicroBeta 계수기(Perkin Elmer)에서 방사성을 분석하였다. 세포독성의 백분율은 [(실험적 방출 - 자발적 방출)/(총 방출 - 자발적 방출)] x 100%로 계산하였다. 모든 조건을 2회 및/또는 3회 측정하였다.
결과
항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC): 항-SIRPα 항체의 효과는 이펙터 세포로서 GM-CSF 활성화된 1차 인간 호중구 및 암 표적화 치료용 항체 및 종양 표적 세포의 다양한 조합을 사용하는 ADCC 실험에서 시험되었다(도 13a-b, 14a-b). 후자는 트라스투주맙과 조합된 HER2 발현 SKBR3 유방암 세포(도 13) 및 세툭시맙과 조합된 EGFR 발현 A431 암종 세포(도 14)를 포함하였다. 결과는 항체 6이 두 암 표적화 항체-표적 암세포 조합에서 호중구 ADCC를 향상시킬 수 있음을 입증한다. 유사한 발견이 몇몇 다른 항-SIRPα 항체에 대해 얻어졌지만, 예를 들어 40A-1, 40A-2, 3F9-LALA, 7H9-LALA, 12C4, 29AM4-5-LALA, SE5A5에 대해서는 얻어지지 않았다.
종합적으로, 항체 6은 비-억제성 SIRP 패밀리 구성원인 SIRPβ1v1, SIRPβ1v2 및 SIRPγ에 대한 친화도가 상대적으로 낮거나 친화도가 없는 유일한 항체이고, 기능 검정에서 하류 신호전달을 효과적으로 억제하는 동시에, SIRPαBIT 및 SIRPα1 유전자형 둘 모두에서 향상된 ADCC를 나타낸다.
서열 목록: 항체 1-13은 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 가변 영역(VR) 아미노산 서열에 밑줄이 그어진 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 갖는다(카바트의 방법에 따라 결정된 VR 잔기; 서열의 넘버링은 순차적이고, 카바트의 넘버링에 따른 것이 아님).
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표 8. 중쇄 FR1에서 아미노산 잔기 치환의 예
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표 9. 중쇄 FR2에서 아미노산 잔기 치환의 예
Figure pct00031
표 10. 중쇄 FR3에서 아미노산 잔기 치환의 예
Figure pct00032
표 11. 중쇄 FR4에서 아미노산 잔기 치환의 예
Figure pct00033
표 12. 경쇄 FR1에서 아미노산 잔기 치환의 예
Figure pct00034
표 13. 경쇄 FR2에서 아미노산 잔기 치환의 예
Figure pct00035
표 14. 경쇄 FR4에서 아미노산 잔기 치환의 예
Figure pct00036
SEQUENCE LISTING <110> Synthon Biopharmaceuticals B.V. <120> Humanized Anti-SIRPalpha antibodies <130> P1729PC00 <150> EP 18206594.6 <151> 2018-11-15 <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized HCVR <400> 1 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Gly Gln Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Val 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met Asn 65 70 75 80 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Gly 85 90 95 Pro Leu Gly Val Asp Tyr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized LCVR <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr 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Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 35 40 45 Thr Ile Gly Thr Gly Val Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Gly Ser Lys Thr Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Thr 65 70 75 80 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser 85 90 95 Ala Trp Asn Asp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized HCVR <400> 11 Arg Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser His Gly 20 25 30 Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 35 40 45 Thr Ile Gly Thr Gly Val Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Gly Ser Lys Thr Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Thr 65 70 75 80 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser 85 90 95 Ala Trp Asn Asp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 12 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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 210 215 220 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 225 230 235 240 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 245 250 255 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 290 295 300 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 305 310 315 320 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 325 330 335 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 340 345 350 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 355 360 365 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 370 375 380 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 385 390 395 400 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 405 410 415 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 435 440 445 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 74 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain 3F9-LALA including leader sequence <400> 74 Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu 1 5 10 15 Glu Phe Ser Met Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Val Ser Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln His Asn Arg Glu Leu Pro Cys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 75 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain 7H9-LALA including leader sequence <400> 75 Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu 1 5 10 15 Glu Phe Ser Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu 20 25 30 Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Phe 35 40 45 Ser Ile Ser Arg Gly Tyr Asp Trp His Trp Ile Arg His Phe Pro Gly 50 55 60 Asn Ile Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ile Ser Asn 65 70 75 80 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr His Asp Thr Ser 85 90 95 Lys Asn His Phe Phe Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gly Ala Trp Phe Thr Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 76 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain 7H9-LALA including leader sequence <400> 76 Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu 1 5 10 15 Glu Phe Ser Met Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Ser Ile Ser Asp Ser Leu His Trp Tyr His Gln Lys Ser His Glu Ser 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Ala Gly Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly 100 105 110 His Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

Claims (17)

  1. 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이
    a. 서열 번호 36을 포함하는 HCDR1;
    b. 서열 번호 44를 포함하는 HCDR2;
    c. 서열 번호 45를 포함하는 HCDR3;
    d. 서열 번호 39를 포함하는 LCDR1;
    e. 서열 번호 40을 포함하는 LCDR2; 및
    f. 서열 번호 41을 포함하는 LCDR3
    을 포함하는 것인 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 다음으로 이루어지는 군으로부터의 하나 이상의 특성을 갖는 것인 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    a. 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열 번호 51에 제시된 인간 SIRPα1 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 분석될 때, 적어도 10-10 M, 바람직하게는 적어도 10-11 M의 결합 친화도로 인간 SIRPα1에 결합함;
    b. 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열 번호 52에 제시된 인간 SIRPαBIT 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 분석될 때, 적어도 10-10 M, 바람직하게는 적어도 10-11 M의 결합 친화도로 인간 SIRPαBIT에 결합함;
    c. 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열 번호 56에 제시된 사이노몰거스(cynomolgus) SIRPα 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 분석될 때, 적어도 10-8 M, 바람직하게는 적어도 10-9 M의 결합 친화도로 사이노몰거스 원숭이 SIRPα에 결합함;
    d. 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 유세포 분석을 사용하여, 바람직하게는 형광 활성화 세포 분류 염색을 사용하여 T 세포 결합에 의해 측정될 때, 인간 SIRPγ에 결합하지 않음;
    e. 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열 번호 55에 제시된 인간 SIRPγ 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 분석될 때, 인간 SIRPγ에 결합하지 않음; 및
    f. 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, IL-2 효소 결합 면역흡착 스팟(ELISpot) 및/또는 T 세포 증식 검정에 의해 결정될 때, 면역원성이 아님.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a. 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열 번호 51에 제시된 인간 SIRPα1 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 분석될 때, 적어도 10-10 M, 바람직하게는 적어도 10-11 M의 결합 친화도로 인간 SIRPα1에 결합하고;
    b. 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열 번호 52에 제시된 인간 SIRPαBIT 세포외 도메인을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 분석될 때, 적어도 10-10 M, 바람직하게는 적어도 10-11 M의 결합 친화도로 인간 SIRPαBIT에 결합하고;
    c. 표면 플라스몬 공명에 의해 포획된 CD47로부터의 해리에 의해 분석될 때, SIRPα1 및 SIRPαBIT에 대한 CD47 결합을 차단하고;
    d. 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, T 세포 유세포 분석 염색, 바람직하게는 형광 활성화 세포 분류 염색에 의해 측정될 때, 인간 SIRPγ에 결합하지 않는 것
    인 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 항체의 중쇄 가변 도메인이 4개의 중쇄 프레임워크 영역 HFR1 내지 HFR4, 및 HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4의 순서로 작동 가능하게 연결된 3개의 상보성 결정 영역 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하고, 중쇄 프레임워크 영역 각각이 서열 번호 8의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 90%의 아미노산 동일성을 갖거나, 또는 HFR1 내지 HFR4는 표 8 내지 11에 정의된 아미노산 치환 중 하나 이상에서 서열 번호 8과 상이하고;
    b. 항체의 경쇄 가변 도메인이 4개의 경쇄 프레임워크 영역 LFR1 내지 LFR4, 및 LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4의 순서로 작동 가능하게 연결된 3개의 상보성 결정 영역 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하고, 경쇄 프레임워크 영역 각각이 서열 번호 9의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 90%의 아미노산 동일성을 갖거나, 또는 LFR1, LFR2 및/또는 LFR4는 표 12 내지 14에 정의된 아미노산 치환 중 하나 이상에서 서열 번호 9와 상이한 것
    인 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열 번호 8의 HCVR 아미노산 서열 및 서열 번호 9의 LCVR 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간화 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 Fc 영역을 포함하는 동일한 항-SIRPα 항체와 비교하여 인간 Fcα 또는 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합을 나타내는 변형된 Fc 영역을 포함하는 인간화 항-SIRPα 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Eu 넘버링에 따라 L234, L235, G237, D265, D270, N297, A327, P328 및 P329로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 인간화 항-SIRPα 항체.
  8. 제7항에 있어서, 아미노산 치환 L234A 및 L235A; L234E 및 L235A; L234A, L235A 및 P329A; 또는 L234A, L235A 및 P329G를 포함하는 인간화 항-SIRPα 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항-SIRPα 항체 또는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 그의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  10. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항-SIRPα 항체, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 그의 항원 결합 단편, 또는 제9항에 따른 약학 조성물.
  11. 암 치료에 사용하기 위한 것이며, 치료가 치료용 항체의 투여를 추가로 포함하고, 암이 바람직하게는 인간 고형 종양 또는 혈액 종양(haematological malignancy)인 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항-SIRPα 항체, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 그의 항원 결합 단편 또는 제9항에 따른 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 치료용 항체가 종양 세포의 표면 상의 막 결합 표적에 대해 작용하고, 인간 면역 이펙터 세포 상에 존재하는 활성화 Fc 수용체에 결합하는 인간 Fc 영역을 포함하는 것인, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항-SIRPα 항체, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 그의 항원 결합 단편 또는 제9항에 따른 약학 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 인간 고형 종양이 (HER2-양성) 유방암, (EGFR-양성) 결장 암종, (GD2-양성) 신경모세포종, 흑색종, 골육종, (CD20-양성) B-세포 림프종, (CD38-양성) 다발성 골수종, (CD52-양성) 림프종, (CD33-양성) 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프성 백혈병(CLL), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 여포성 림프종(FL) 및 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)을 포함하는 비호지킨 림프종(NHL), 간세포 암종, 다발성 골수종(MM), 방광암, 위암, 난소암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 간세포 암종 및 폐암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항-SIRPα 항체, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 그의 항원 결합 단편 또는 제9항에 따른 약학 조성물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 추가의 항암 치료 화합물의 투여를 포함하는 것인, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항-SIRPα 항체, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 그의 항원 결합 단편 또는 제9항에 따른 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 추가의 항암 치료 화합물이 표적화된 치료제, 바람직하게는 면역 치료제인, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항-SIRPα 항체, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 그의 항원 결합 단편 또는 제9항에 따른 약학 조성물.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항-SIRPα 항체, 또는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 바람직하게는 핵산 분자가 항체의 HCVR 및 LCVR 중 적어도 하나를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 바람직하게는 코딩 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포에서 코딩 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위한 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 것인 핵산 분자.
  17. 제16항에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
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