CN113325181A - 丝氨酸蛋白酶抑制剂在用于脓毒症早期预警的标志物中的应用 - Google Patents

丝氨酸蛋白酶抑制剂在用于脓毒症早期预警的标志物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPINA10)在用于脓毒症早期预警的标志物中的应用。本发明还提供了一种用于诊断脓毒症严重程度或者预后的试剂盒，所述试剂盒中含有检测体液样品中丝氨酸蛋白酶抑制剂的试剂，其可解决现有技术中无法判断烧伤后是否会出现脓毒症并发或并发趋向的问题。

Description

丝氨酸蛋白酶抑制剂在用于脓毒症早期预警的标志物中的 应用
【技术领域】
本发明属于生物工程领域，涉及一种生物标志物，具体来说是丝氨酸蛋白酶抑制剂在用于脓毒症早期预警的标志物中的应用。
【背景技术】
脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)，临床上证实有细菌存在或有高度可疑感染灶。虽然脓毒症是由感染引起，但是一旦发生后，其发生发展遵循其自身的病理过程和规律，故从本质上讲脓毒症是机体对感染性因素的反应。脓毒症发生率高，全球每年有超过1800万严重脓毒症病例，美国每年有75万例脓毒症患者，并且这一数字还以每年1.5％～8.0％的速度上升。脓毒症的病情凶险，病死率高，全球每天约14,000人死于其并发症，美国每年约21.5万人死亡。据国外流行病学调查显示，脓毒症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒症的病死率仍高达30％～70％。脓毒症治疗花费高，医疗资源消耗大，严重影响人类的生活质量，已经对人类健康造成巨大威胁。
但是，目前脓毒症原组分检测在我国的使用具有较大的局限性，国内并未出现科学的采集方法以及检测技术，给进一步的诊断和治疗增加了难度。
因此，有必要对现有技术予以改良以克服现有技术中的所述缺陷。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种丝氨酸蛋白酶抑制剂在用于脓毒症早期预警的标志物中的应用，其可以解决上述现有技术问题。
本发明提供了丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPINA10)在用于脓毒症早期预警的标志物中的应用。
在其中一个实施例中，所述脓毒症是严重烧伤后的脓毒症。
本发明还提供了一种用于诊断脓毒症严重程度或者预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有检测体液样品中丝氨酸蛋白酶抑制剂的试剂。
在其中一个实施例中，所述体液样品选自血清。
SERPINA10(ZPI)蛋白是Z-dependent蛋白酶抑制剂，组成了蛋白质Z/Z-dependent蛋白酶抑制剂(PZ/ZPI)***。蛋白Z(Protein Z,PZ)是一种维生素K依赖性凝血蛋白,蛋白Z依赖的蛋白酶抑制剂(protein Z-dependent protease inhibitor,ZPI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在磷脂和钙离子存在的条件下,蛋白Z依赖的蛋白酶抑制剂(ZPI)抑制活化的因子X(FXa),而PZ可使ZPI的作用增强1000倍，PZ通过增强ZPI的功能而发挥抗凝作用。
本发明通过一系列的探究发现，丝氨酸蛋白酶抑制剂在烧伤后一天具有统计学差异，可以作为严重烧伤脓毒症的预警标志物。
本发明通过分别在第一天、第三天、第五天和第七天进行采集正常人、烧伤未合并脓毒症以及烧伤合并脓毒症的患者的血浆，并对提取血浆中的上清液，采用BCA法对上清液进行蛋白质定量后分装样品，然后对样品进行SDS-PAGE电泳、FASP酶解、High PH RP分级、DDA质谱建库、DIA质谱分析处理，发现蛋白SERPINA10在烧伤后一天具有统计学差异，被验证为显著差异蛋白，在第三天、第五天及第七天均无统计学差异。因此，当丝氨酸蛋白酶抑制剂具有统计学差异时，即表明烧伤后有脓毒症已并发或有并发趋向。
本发明和现有技术相比，其技术进步是显著的，本发明提供了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂在用于脓毒症早期预警的标志物中的应用，用于解决现有技术中无法判断烧伤后是否会出现脓毒症并发或并发趋向的问题。
【附图说明】
图1显示了对病例血浆蛋白的样本进行DIA分析后的归一化处理前结果。
图2显示了对病例血浆蛋白的样本进行DIA分析后的归一化处理后结果。
图3显示了健康对照组、烧伤并发脓毒症患者、烧伤后未并发脓毒症患者的分别于第1天、第3天、第5天和第7天的不同时间点的病例血浆蛋白组学PCA的分析结果。
图4显示了图3中的分析结果经过PRM差异蛋白SERPINA10在第1天验证的结果。
图5显示了图3中的分析结果经过PRM差异蛋白SERPINA10在第3天验证的结果。
【具体实施方式】
实施例一：
1、采集样本信息
采集正常人、烧伤未合并脓毒症以及烧伤合并脓毒症的患者的血浆，分别在第一天、第三天、第五天和第七天进行采集。具体样本信息见表1所示。
表1
Figure BDA0003036795770000031
2、对样本进行制备
取适量样本，加入三倍体积的SDT裂解液，沸水浴10min，14000g离心15min，取上清溶液。采用BCA法进行蛋白质定量。分装样品，-80℃保存。
3、SDS-PAGE电泳
各样品取蛋白质20μg分别加入6X上样缓冲液，沸水浴5min，进行12％SDS-PAGE电泳，其中，恒压250V，时长为40min，考马斯亮蓝染色。
4、FASP酶解
各样品取200ug蛋白质溶液，分别加入DTT至终浓度为100mM，沸水浴5min，冷却至室温。加入200μLUA buffer混匀，转入30kD超滤离心管中，离心参数为12500g，时长25min，弃滤液，然后重复上述步骤两次。
加入100μLIAA buffer(100m MIAA in UA)，600rpm振荡1min，室温避光反应30min，离心12500g 25min。加入100μLUA buffer，离心12500g 15min，重复该步骤两次。加入100μL40mM NH4HCO3溶液，离心12500g 15min，重复该步骤两次。加入40μL Trypsinbuffer(4μg Trypsin in 40μL 40mM NH4HCO3溶液)，600rpm振荡1min，37℃放置16-18h。换新收集管，离心12500g 15min；再加入20μL 40mM NH4HCO3溶液，离心12500g 15min，收集滤液。采用C18 Cartridge对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μL 0.1％甲酸溶液复溶，肽段定量。
5、High PH RP分级
取所有样品癿肽段混合物，采用Agilent 1260infinity II HPLC***进行分级。缓冲液A液为10mM HCOONH4,5％ACN,pH 10.0，缓冲液B液为10mM HCOONH4，85％CAN，pH10.0。色谱柱以A液平衡，样品由自动进样器上样到色谱柱(Waters，XBridge Peptide BEHC18 Column,
Figure BDA0003036795770000041
5μm,4.6mm X 100mm)进行分离，流速为1mL/min。液相梯度如下：使用线性梯度，40min内5％B至45％B，柱温维持在30℃。收集到36个组分，各个组分在真空浓缩仪中干燥待用。将样品冻干后用0.1％甲酸水溶液复溶合幵为12个Fraction。
6、DDA质谱建库
从各Fraction中取出6ul加入2ul 10×iRT肽段，混合后进样2ul，用nano-LC分离，经在线电喷雾串联质谱分析。整套液质串联***为：1)液相***：UltiMate 3000RSLCnano***(Thermo Fisher Scientific)2)质谱***：Q-Exactive HF-X(Thermo FisherScientific)。缓冲液A液为0.1％甲酸水溶液，缓冲液B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为80％)。样品以300nL/min癿流速经分析柱(Thermo Fisher Scientific，Acclaim PepMapRSLC 50um X 15cm,nano viper,P/N164943)中以非线性增长癿梯度分离：0-5min，1％B；5-95min，1％B至28％B；95-110min，28％B至38％B；110-115min，38％B至100％B，115-120min，100％B。电喷雾电压2.0kV。
质谱参数设置如下：(1)MS：scan range(m/z)＝350-1800；resolution＝60,000；AGC target＝3e6；maximum injection time＝50ms；include charge states＝2-7；Filter Dynamic Exclusion：exclusion duration＝30s；(2)dd-MS2：Isolation window＝2m/z，resolution＝15,000；AGC target＝2e5；maximum injection time＝45ms；NCE＝27％。
质谱原始数据通过Spectronaut Pulsar X(version 12，Biognosys AG)合开分析搜库开建立谱图数据库，数据库为Swissprot_human_isoform_201806(42356entries)，下载链接：http：//www.uniprot.org。设置Trypsin酶解，允许两个漏切位点。搜库参数固定修饰：Carbamidomethyl(C)，可变修饰：Oxidation(M)氧化，acetyl(Protein N-term)蛋白N端乙酰化。建库标准为1％Precursor FDR，1％Peptide FDR。
其中，根据样品来源不同，实验组样本共分为2组，总计54个样品。利用所构建的数据库，对每个样品进行DIA分析，获得的定量信息如表2所示。
表2
Precursors Peptides Protein Groups
平均定量 4781 3071 395
总定量 6951 4409 663
共同定量 2667 1844 240
7、DIA质谱分析
各样品取出6ul加入2ul 10×iRT肽段，混合后进样2ul，用nano-LC分离，经在线电喷雾串联质谱分析。整套液质串联***为：1)、液相***：UltiMate 3000RSLCnano***(Thermo Fisher Scientific)；2)、质谱***：Q-Exactive HF-X(Thermo FisherScientific)。缓冲液A液为0.1％甲酸水溶液，缓冲液B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为80％)。样品以300nL/min的流速经分析柱(Thermo Fisher Scientific，Acclaim PepMapRSLC 50um X15cm，nano viper，P/N164943)中以非线性增长的梯度分离：0-5min，1％B；5-95min，1％B至28％B；95-110min，28％B至38％B；110-115min，38％B至100％B，115-120min，100％B电喷雾电压2.0kV。
质谱参数设置如下：(1)MS:scan range(m/z)＝350–1800；resolution＝60,000；AGC target＝3e6；maximum injection time＝50ms；(2)DIA:resolution＝30,000；AGCtarget＝1e6；maximum injectiontime＝auto；NCE＝27％。
其中，DIA窗口设置参数如下：
Figure BDA0003036795770000061
Figure BDA0003036795770000071
经过评估，本次实验中成功建立了针对两组样本的DDA库；在建库的基础上对样本进行DIA分析，其DIA定量结果一致性理想、整体鉴定数量符合预期、LCMS分离分析效果理想，可以进行后续差异定量筛选。为了保证定量的准确性，对于获得的DIA结果，我们首先进行了归一化(normalization)。如图1和图2所示，左图为归一化前，右图为归一化后结果，对各组样本进行定量归一化后，在一定程度上排除了***误差。
8、主成分分析
主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，是一种统计方法。通过正交变换将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关的变量，转换后的这组变量叫主成分。将所研究的的数据进行空间降维，在二维层面上对数据的整体性进行分析，从而判断不同组别的区分度，从而进行下一步的分析研究。由图3中可看出，
9、显著分析差异蛋白的筛选
本研究对BD1 vs AD1进行显著差异分析，符合表达差异倍数大于1.5倍(上下调)且P value(t test)小于0.05筛选标准的蛋白质视为差异表达蛋白质。
其中，BD为烧伤并发脓毒症患者；AD为烧伤未并发脓毒症患者。
10、PRM蛋白验证
平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring,PRM)基于Orbitrap等为代表的高分辨、高精度质谱平台，首先利用四级杆质量分析器的选择能力，用四级杆对目标肽段的母离子进行选择，随后在碰撞池中对母离子进行碎裂，最后利用Orbitrap分析器在二级质谱中检测所选择的母离子的所有碎片信息。这样即可对复杂样本中的目标蛋白质/肽段进行选择性定量分析。将筛选出的差异蛋白进行PRM验证，进一步确保其差异蛋白的准确性。
11、PCA分析结果
利用PCA分析对所有组的整体进行了分析,分析结果如图3所示。由PCA分析结果可知，烧伤后第5天与第7天，并发脓毒症与没有并发脓毒症的两组患者，血浆蛋白质组学差异不大，在后续做趋势分析时，仅纳入烧伤后第1天与第3天的蛋白组学结果进行分析。
其中，左上：烧伤后1天；右上：烧伤后3天；左下：烧伤后5天；右下：烧伤后7天。AD组：烧伤未并发脓毒症患者；BD组：烧伤并发脓毒症患者；C组：健康人对照。
PCA分析结果显示BD1 vs AD1的差异性最明显，因此我们主要选择严重烧伤患者一天的样本进行显著差异蛋白的分析(去掉B组组内差异大的两个样本)。如表3所示：BD1vs AD1共有54个差异蛋白，其中42个蛋白上调，12个下调。
表3
Comparisons Up- Down- All-
BD1 VS AD1 42 12 54
根据上述表3筛选出的54个差异蛋白，我们选取最显著的26个蛋白进行PRM验证。本阶段纳入新的病例样本，共48例，其中烧伤后并发脓毒症患者共16例(B组)；烧伤后没有并发脓毒症患者共32例(A组)；请具体参见图4和图5，蛋白SERPINA10在烧伤后一天具有统计学差异，被验证为显著差异蛋白，在第三天均无统计学差异。
本发明还提供了一种用于诊断脓毒症严重程度或者预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有检测体液样品中丝氨酸蛋白酶抑制剂的试剂。所述体液样品选自血清。
上述仅为本发明的一个具体实施方式，其它基于本发明构思的前提下做出的任何改进都视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPINA10)在用于脓毒症早期预警的标志物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脓毒症是严重烧伤后的脓毒症。
3.一种用于诊断脓毒症严重程度或者预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有检测体液样品中丝氨酸蛋白酶抑制剂的试剂。
4.如权利要求3所述的用于诊断脓毒症严重程度或者预后的试剂盒，其特征在于，所述体液样品选自血清。
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