KR20210022650A - 항-인자 XII/XIIa 항체 및 이의 용도 - Google Patents

항-인자 XII/XIIa 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20210022650A
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단 찰로손
로리 씨. 모튼
린든 미트널
케디 라이
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

본 발명은 인자 XII(FXII) 단백질에 결합하는 단클론성 항체, 및 이의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 실시형태에서, 항체는 FXII 및 FXII의 활성화 형태(FXIIa)에 결합하는 완전한 인간 항체이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 FXII 활성을 저해하거나 중화시키는 데 유용하며, 따라서 인간의 혈전증과 연관된 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 예방하는 수단을 제공한다.

Description

항-인자 XII/XIIa 항체 및 이의 용도
관련 출원
본 발명은 2018년 6월 19일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/687,144호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 본 명세서에 전문이 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2019년 6월 18일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 10463WO01_SL.txt이고, 크기가 26,288 바이트이다.
본 발명의 분야
본 발명은 응고 인자 XII에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편, 및 이들 항체를 사용하는 치료 및 진단 방법에 관한 것이다.
혈소판과 함께 응고 인자는 혈관 손상 동안 지혈 과정에 관련되는 혈액 성분이다. 조절(즉, 생성 및/또는 활성)에서 불균형이 발생할 때 이들 성분이 혈전증의 원인이 될 수 있다는 것이 잘 확립되어 있다. 혈전증은 주로 (조직 인자를 통해) 외인성 경로에서 비정상적인 활성화로 인해 발생하는 것으로 여겨졌지만, 보다 최근에는 F12 결핍 마우스와 활성화된 FXII(FXIIa)를 표적으로 하는 분자를 이용한 전임상 연구는 응고의 내인성 경로(또한 접촉 경로라고도 함)가 또한 포함된다는 것을 시사하였다(Renne et al 2005, J. Exp. Med. 202: 271-81; Larsson et al 2014, Sci. Transl. Med. 6: 222ra17). FXIIa는 접촉 경로의 중심이며 FXI의 절단을 통해 응고를 유도하거나 혈장 프리칼리크레인의 절단을 통해 염증을 유도할 수 있다. 따라서, FXII 활성의 저해는 접촉 경로 활성화와 연관된 혈전성 응고 및 염증의 감소로 이어질 수 있다(Schousboe 2007, Biochem. Pharmacol. 75: 1007-13; Danese et al 2016, Semin. Thromb. Hemostat. 42: 682-8; Weitz 2016, Thromb. Res. 141 Suppl. 2: S40-5). 당업계에서 현재 사용되는 항응고제, 예를 들어 헤파린은 효과적인 항혈전제이지만, 이는 또한 출혈 위험을 증가시킨다. 따라서, 출혈 위험을 증가시키지 않으면서 혈전증을 예방하는 항응고제를 개발하는 것이 바람직하다.
FXII에 대한 단클론성 항체는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허/공개 제4963657호, 제5500349호, 제8119137호, 제8715672호, 제9856326호, 제9856325호, 제9518127호, 제20130095108호, 제20140072572호, 제20140072600호에, 그리고 WO2006066878, WO2013014092, EP1830924B1, EP27345522A1, 및 EP2623110A1에 기재되어 있다.
높은 친화도로 (활성화된) FXII 단백질에 특이적으로 결합하고 출혈 위험을 증가시키지 않으면서 혈전증을 예방하는 완전한 인간 항체는 다양한 FXII-연관 질환(예를 들어, 혈전증, 색전증, 부종)의 예방 및 치료에 중요할 수 있다.
본 발명은 응고 인자 XII 단백질의 활성화된 형태(FXIIa)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 실시형태에서, 항체는 또한 인자 XII(FXII)의 치모겐 형태에 결합한다. 특정 실시형태에서, 항체는 높은 친화도로 FXII 및 또한 FXIIa에 결합하는 완전한 인간 항체("이중 FXII/FXIIa 결합제")이다. 본 발명의 항체는 특히 FXII 단백질의 활성을 저해하거나 중화시키는 데 유용하다. 특정 실시형태에서, 항체는 대상체에서 FXII-연관 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 적응증을 예방, 치료 또는 개선시키는 데 유용하다. 특정 실시형태에서, 항체는 FXII-연관 질환 또는 장애를 가지고 있거나 가질 위험이 있는 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 바람직한 특정 실시형태에서. 구체적인 실시형태에서, 항체는 대상체에서 출혈 위험을 증가시키지 않으면서 혈전증을 예방한다. 이와 같은 항체는 FXII-연관 질환 또는 장애가 있는 대상체에서 덜 빈번한 투약과 함께, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 출혈 위험을 증가시키지 않으면서 항응고 치료법으로 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 전장(예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체)일 수 있거나 단지 항원-결합 부분(예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편)만 포함할 수 있고, 기능에 영향을 미치도록, 예를 들어 숙주에서 지속성을 증가시키거나 잔류 이펙터 기능을 제거하도록 변형될 수 있다(Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). 특정 실시형태에서, 항체는 이중특이적일 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 인자 XII(FXII) 및/또는 활성화된 인자 XII(FXIIa)에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서, 항체는 완전한 인간 단클론성 항체이다. 특정 실시형태에서, 항체는 FXII 및 FXIIa에 결합할 수 있는 "이중 결합제"이다.
본 발명의 예시적인 항-FXII/FXIIa 항체는 본 명세서의 표 1 및 2에 열거되어 있다. 표 1은 예시적인 항체의 중쇄 가변 영역(HCVR), 경쇄 가변 영역(LCVR), 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 표 2는 예시적인 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 핵산 서열 식별자를 제시한다.
본 발명은 표 1에 열거된 임의의 HCVR 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 LCVR 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 LCVR 아미노산 서열과 쌍을 이루는 표 1에 열거된 임의의 HCVR 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 쌍(HCVR/LCVR)을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 실시형태에 따르면, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항-FXII/FXIIa 항체 내에 포함되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 실시형태에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열번호 2/10(예를 들어, mAb26036), 18/26(예를 들어, mAb26048), 34/42(예를 들어, mAb26049), 또는 50/58(예를 들어, mAb26076) 중 하나로부터 선택된다.
본 발명은 또한 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 HCVR은 12개 이하의 아미노산 치환을 갖는 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 상기 LCVR은 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 HCVR은 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 예에서, 본 발명은 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 LCVR은 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 갖는다. 일 실시형태에서, 본 발명은 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항-FXII/FXIIa 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 HCVR은 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 적어도 1개의 아미노산 치환을 갖고/갖거나 상기 LCVR은 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 적어도 1개의 아미노산 치환을 갖는다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 HCDR1 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1)을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 HCDR2 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2)를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 HCDR3 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3)을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 LCDR1 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1)을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 LCDR2 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(LCDR2)를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 LCDR3 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 LCDR3 아미노산 서열과 쌍을 이루는 표 1에 열거된 임의의 HCDR3 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍(HCDR3/LCDR3)을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 실시형태에 따르면, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항-FXII 항체 내에 포함되는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 실시형태에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열번호 8/16(예를 들어, mAb26036), 24/32(예를 들어, mAb26048), 40/48(예를 들어, mAb26049) 및 56/64(예를 들어, mAb26076)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 HCVR은 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 LCVR은 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 HCVR은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 4와 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 LCVR은 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 1개의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체 내에 포함되는 6개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 실시형태에서, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 서열번호 4-6-8-12-14-16(예를 들어, mAb26036), 20-22-24-28-30-32(예를 들어, mAb26048), 36-38-40-44-46-48(예를 들어, mAb26049), 및 52-54-56-60-62-64(예를 들어, mAb26076)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
관련 실시형태에서, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체에 의해 정의되는 바와 같은 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 포함되는 6개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열번호 2/10(예를 들어, mAb26036), 18/26(예를 들어, mAb26048), 34/42(예를 들어, mAb26049), 또는 50/58(예를 들어, mAb26076)로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 포함되는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 확인하기 위한 방법 및 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며 본 명세서에 개시된 명시된 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 확인하는 데 사용될 수 있다. CDR의 경계를 확인하는 데 사용될 수 있는 예시적인 관례는, 예를 들어 카밧(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, 및 AbM 정의를 포함한다. 대체적으로, 카밧 정의는 서열 가변성을 기반으로 하고, 코티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 하며, AbM 정의는 카밧과 코티아 접근법 사이의 절충안이다. 예를 들어, 문헌[Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]; [Al-Lazikani et al., J. Mol . Biol. 273:927-948 (1997)]; 및 [Martin et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:9268-9272 (1989)]을 참조한다. 항체 내의 CDR 서열을 확인하기 위해 공개 데이터베이스도 또한 이용 가능하다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 FXII 및/또는 FXIIa에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 포함되는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 포함되는 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, HCVR은 (i) 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, (ii) 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, (iii) 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는 (iv) 12개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; LCVR은 (i) 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, (ii) 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, (iii) 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는 (iv) 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항-FXII/FXIIa 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바람직하지 않은 글리코실화 부위를 제거하기 위한 변형이 유용할 수 있거나, 예를 들어 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위해 올리고당 사슬에 존재하는 푸코스 모이어티가 없는 항체가 유용할 수 있다(문헌[Shield et al. (2002) JBC 277:26733] 참조). 다른 적용에서, 보체 의존성 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화의 변형이 이루어질 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 FXII에 대한 pH-의존적 결합을 나타내는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 산성 pH보다 중성 pH에서 더 높은 친화도로 FXII에 결합하는(즉, 산성 pH에서 결합 감소) 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 FXII 또는 FXIIa에 대한 특이적 결합에 대해 경쟁하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하는 기준 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 FXII/FXIIa에 대한 결합에 대해 교차 경쟁하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 HCVR의 3개의 CDR 및 LCVR의 3개의 CDR을 포함하는 기준 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 효현제 방식으로 FXII 및/또는 FXIIa에 특이적으로 결합할 수 있으며, 즉 이는 FXII/FXIIa 결합 및/또는 활성을 향상시키거나 자극할 수 있고; 다른 실시형태에서, 항체는 길항제 방식으로 FXII 및/또는 FXIIa에 특이적으로 결합할 수 있으며, 즉 이는 FXII 결합 및/또는 활성을 차단할 수 있다.
본 발명은 또한 FXI에 대한 FXIIa 결합을 차단하는 단리된 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서, FXI에 대한 FXIIa 결합을 차단하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 FXI와 FXIIa 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있거나 FXI와 FXIIa 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 FXII/FXIIa의 제1 에피토프에 대한 제1 결합 특이성 및 FXII/FXIIa의 제2 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적이며, 여기서 제1 및 제2 에피토프는 구별되고 중첩되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 다음 특징 중 하나 이상을 갖는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) 완전한 인간 단클론성 항체임; (b) 활성화된 인자 XII(FXIIa)에 결합함; (c) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 25℃에서 3.5nM 미만의 해리 상수(KD)로 FXII에 결합함; (d) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 37℃에서 17nM 미만의 KD로 FXII에 결합함; (e) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 25℃에서 5nM 미만, 바람직하게는 2.5nM 미만의 KD로 FXIIa에 결합함; (f) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 37℃에서 6.5nM 미만, 바람직하게는 2.5nM 미만의 KD로 FXIIa에 결합함; (g) 기능성 혈장 분석에 의해 측정할 때, 250nM 미만의 농도에서 내인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 차단함; 및 (h) 기능성 혈장 분석에 의해 측정할 때, 외인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 차단하지 않으면서 내인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 차단함.
제2 양태에서, 본 발명은 항-FXII/FXIIa 항체 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 HCVR 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 실시형태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCVR 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 LCVR 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 실시형태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCVR 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 HCDR1 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 실시형태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCDR1 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 HCDR2 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 실시형태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCDR2 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 HCDR3 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 실시형태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCDR3 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 LCDR1 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 실시형태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCDR1 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 LCDR2 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 실시형태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCDR2 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 표 1에 열거된 임의의 LCDR3 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 실시형태에서 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCDR3 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 HCVR을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 HCVR은 3개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3)를 포함하고, HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체에 의해 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 LCVR을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 LCVR은 3개의 CDR 세트(즉, LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하고, LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체에 의해 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 HCVR 및 LCVR을 둘 다 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 HCVR은 표 1에 열거된 임의의 HCVR 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 표 1에 열거된 임의의 LCVR 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCVR 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열, 및 표 1에 열거된 임의의 LCVR 핵산 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 특정 실시형태에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 인코딩하며, 여기서 HCVR 및 LCVR은 둘 다 표 1에 열거된 동일한 항-FXII 항체로부터 유래된다.
관련 양태에서, 본 발명은 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 상기 언급한 임의의 핵산 분자, 즉 표 2에 제시된 바와 같은 임의의 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 (a) FXII/FXIIa에 결합하는 항체의 HCVR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자이되, HCVR은 표 1에 열거된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 핵산 분자; 및/또는 (b) FXII/FXIIa에 결합하는 항체의 LCVR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자이되, LCVR은 표 1에 열거된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또한 본 발명의 범주는 이와 같은 벡터가 도입된 숙주 세포뿐만 아니라, 항체 또는 항체 단편의 생성을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고, 이렇게 생성된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 이의 일부를 생성하는 방법을 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포 또는 원핵 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 대장균(에스케리치아 콜라이(Escherichia coli); 이. 콜라이(E. coli)) 세포이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 HCVR 및/또는 LCVR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 핵산 서열의 발현에 유리한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 배양 배지 및/또는 숙주 세포로부터 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 단리시키는 단계를 포함한다. 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 선행기술에서 알려진 임의의 방법을 사용하여 정제될 수 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 FXII/FXIIa에 특이적으로 결합하는 치료적 유효량의 적어도 하나의 재조합 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 관련 양태에서, 본 발명은 항-FXII/FXIIa 항체 및 제2 치료제의 조합인 조성물을 특징으로 한다. 일 실시형태에서, 제2 치료제는 항-FXII/FXIIa 항체와 유리하게 조합되는 임의의 작용제이다. 항-FXII/FXIIa 항체와 유리하게 조합될 수 있는 예시적인 작용제는 FXII 활성에 결합하고/하거나 이를 저해하는 다른 작용제(다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 등을 포함함) 및/또는 FXII에 직접적으로 결합하지 않지만 그럼에도 불구하고 FXII-연관 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 적응증을 치료하거나 개선시키는 작용제(제한되지 않음)를 포함한다. 본 발명의 항-FXII 항체를 포함하는 추가적인 병용 요법 및 통합 제형은 본 명세서의 다른 곳에 개시되어 있다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-FXII/FXIIa 항체 또는 항체의 항원-결합 부분을 사용하여 대상체에서 FXII와 연관된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료 방법을 제공하며, 여기서 치료 방법은 본 발명의 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료되는 장애는 FXII 활성의 저해에 의해 개선되거나, 나아지거나, 저해되거나 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 항-FXII/FXIIa 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 FXII-연관 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 FXII-연관 질환 또는 장애를 가지거나 가질 위험이 있는 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 치료제와 조합하여 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 제2 치료제는 항응고제, 직접 트롬빈 저해제, 혈전용해 약물, 섬유소용해 약물, 항-혈소판 약물, 항-염증 약물, 항-고혈압 약물, 제2 항-FXII 항체, 지질-저하 약물, 기계적 혈병 회수, 카테터-유도 혈전용해, 압박 스타킹, 수술 및 당업계에 알려진 임의의 다른 약물 또는 치료법으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 제2 치료제는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 연관된 임의의 가능한 부작용(들)이 일어난다면, 이와 같은 부작용을 해소하거나 감소시키는 데 도움을 주는 작용제일 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 피하, 정맥내, 피내, 복강내, 경구, 또는 근육내로 투여될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 대상체의 체중 1㎏당 약 0.1㎎ 내지 체중 1㎏당 약 100㎎의 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 10㎎ 내지 600㎎을 포함하는 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 FXII/FXIIa 결합 및/또는 활성의 차단으로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 항-FXII/FXIIa 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 포함한다.
다른 실시형태는 이어지는 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.
본 방법을 기재하기 전에, 본 발명은 기재된 특정 방법, 및 실험 조건에 제한되지 않으며, 이와 같은 방법 및 조건은 다양할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하기 위한 것일 뿐, 제한적인 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 이제 바람직한 방법 및 재료가 기재된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.
정의
"인자 XII"라고도 불리는 용어 "FXII"는 하게만 인자(Hageman Factor)라고도 알려진 응고 인자 XII를 말한다. 596개 아미노산의 FXII 단백질은 아미노-말단 중쇄 및 카복시-말단 경쇄로 구성된 베타-글로불린 혈장 세린 프로테아제인 인자 XIIa의 치모겐 형태이다. 이의 중쇄는 2개의 피브로넥틴-유형 도메인(유형 I 및 II), 2개의 표피 성장 인자-유사 도메인, 크링글(Kringle) 도메인, 및 프롤린-풍부 영역을 포함하고, 이의 경쇄는 프로테아제 도메인을 포함한다. 음으로 하전된 물질 또는 인공 표면에 혈액이 노출되면 접촉 활성화로 알려진 일련의 반응을 통해 트롬빈 생성 및 피브린 형성이 촉발된다. 인자 XII는 응고 캐스케이드에서 인자 XI 및 프리칼리크레인을 활성화시킨다. 인자 XII 그 자체는 혈장 칼리크레인, 혈소판 또는 박테리아 폴리인산염, 세포외 DNA 또는 RNA, 비만 세포로부터 방출된 헤파린, 아밀로이드 펩타이드, 잘못 접힌 단백질 응집체 및 음으로 하전된 표면, 예컨대 유리에 의해 인자 XIIa로 활성화된다. 이것이 내인성 경로의 시작점이다. 전장 FXII 단백질의 아미노산 서열은 UniProtKB/Swiss-Prot에서 수탁 번호 P00748.3으로 제공되는 아미노산 서열로 예시된다. 전장 FXII 단백질의 아미노산 서열은 또한 본 명세서에 서열번호 65로 나타나 있다. 용어 "FXII"는 재조합 FXII 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 용어는 또한, 예를 들어 히스티딘 태그, 마우스 또는 인간 Fc, 또는 ROR1과 같은 신호 서열에 커플링된 FXII 단백질 또는 이의 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 구성된 면역글로불린 분자(즉, "완전한 항체 분자")뿐만 아니라, 이의 다량체(예를 들어, IgM) 또는 이의 항원-결합 단편을 말하는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역("HCVR" 또는 "VH") 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역("LCVR" 또는 "VL") 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, 이는 아미노-말단에서 카복시-말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 FR은 인간 생식세포계열 서열과 동일할 수 있거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스 서열은 둘 이상의 CDR의 병렬(side-by-side) 분석을 기반으로 정의될 수 있다.
하나 이상의 CDR 잔기의 치환 또는 하나 이상의 CDR의 생략이 또한 가능하다. 하나 또는 2개의 CDR이 결합을 위해 생략될 수 있는 항체는 과학 문헌에 기재되어 있다. Padlan 등(1995 FASEB J. 9:133-139)은 공개된 결정 구조를 기반으로 항체와 이의 항원 사이의 접촉 영역을 분석하였고, CDR 잔기의 약 1/5 내지 1/3만이 실제로 항원과 접촉한다고 결론지었다. 패드란은 또한 하나 또는 2개의 CDR이 항원과 접촉하는 아미노산을 가지지 않는 많은 항체를 발견하였다(또한, 문헌[Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428] 참조).
항원과 접촉하지 않는 CDR 잔기는 분자 모델링에 의해 및/또는 경험적으로 코티아 CDR 외부에 있는 카밧 CDR의 영역으로부터 이전 연구(예를 들어, CDRH2의 잔기 H60 내지 H65는 종종 필요하지 않음)를 기반으로 확인될 수 있다. CDR 또는 이의 잔기(들)가 생략되면, 이는 보통 또 다른 인간 항체 서열 또는 이와 같은 서열의 컨센서스에서 상응하는 위치를 차지하는 아미노산으로 치환된다. CDR 내의 치환 위치 및 치환할 아미노산은 또한 경험적으로 선택될 수 있다. 경험적 치환은 보존적 또는 비-보존적 치환일 수 있다.
본 명세서에 개시된 완전한 인간 항-FXII 단클론성 항체는 상응하는 생식세포계열 서열과 비교하여 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이와 같은 돌연변이는 본 명세서에 개시된 아미노산 서열을, 예를 들어 공개 항체 서열 데이터베이스로부터 입수 가능한 생식세포계열 서열과 비교함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 아미노산 서열로부터 유래된 항체, 및 이의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래한 생식세포계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 또 다른 인간 생식세포계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 상응하는 생식세포계열 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다(이와 같은 서열 변화는 본 명세서에서 총괄적으로 "생식세포계열 돌연변이"로 지칭됨). 당업자는 본 명세서에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 시작하여 하나 이상의 개별 생식세포계열 돌연변이 또는 이의 조합을 포함하는 수많은 항체 및 항원-결합 단편을 용이하게 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, VH 및/또는 VL 도메인 내의 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기는 항체가 유래된 원래 생식세포계열 서열에서 발견되는 잔기로 다시 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 특정 잔기만이, 예를 들어 FR1의 처음 8개 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개 아미노산 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기만이, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기만이 원래의 생식세포계열 서열로 다시 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들)는 상이한 생식세포계열 서열(즉, 항체가 원래 유래된 생식세포계열 서열과 상이한 생식세포계열 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 또한, 본 발명의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 2개 이상의 생식세포계열 돌연변이의 임의의 조합을 포함할 수 있으며, 예를 들어 여기서 특정 개별 잔기는 특정 생식세포계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 한편, 원래 생식세포계열 서열과 상이한 다른 특정 잔기는 유지되거나 상이한 생식세포계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 일단 수득되면, 하나 이상의 생식세포계열 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원-결합 단편은 하나 이상의 원하는 특성, 예컨대 결합 특이성의 개선, 결합 친화도의 증가, 길항적 또는 효현적 생물학적 특성의 개선 또는 향상(경우에 따름), 면역원성의 감소 등에 대해 용이하게 테스트될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명 내에 포함된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본 명세서에 개시된 임의의 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 완전 인간 항-FXII 단클론성 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은, 본 명세서에 개시된 임의의 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열에 대하여, 예를 들어 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환이 있는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-FXII 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 mAb는, 예를 들어 CDR에서, 구체적으로 CDR3에서, 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종(예를 들어, 마우스)의 생식세포계열에서 유래된 CDR 서열이 인간 FR 서열에 이식된 mAb를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 상기 용어는 비-인간 포유동물에서, 또는 비-인간 포유동물의 세포에서 재조합으로 생성된 항체를 포함한다. 상기 용어는 인간 대상체로부터 단리되거나 이로부터 생성된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "재조합"은, 예를 들어 DNA 스플라이싱 및 이식유전자 발현을 포함하는 재조합 DNA 기술로서 당업계에 알려진 기술 또는 방법에 의해 생성, 발현, 단리 또는 수득된 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 말한다. 상기 용어는 비-인간 포유동물(유전자이식 비-인간 포유동물, 예를 들어 유전자이식 마우스를 포함함), 또는 세포(예를 들어, CHO 세포) 발현 시스템에서 발현되거나 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체를 말한다.
용어 "특이적으로 결합한다", 또는 "~에 특이적으로 결합한다" 등은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 생리학적 조건 하에서 비교적 안정적인 항원과 복합체를 형성함을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1×10-8 M 이하의 평형 해리 상수를 특징으로 할 수 있다(예를 들어, 더 작은 KD는 더 단단한 결합을 나타냄). 2개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평행 투석, 표면 플라즈몬 공명 등을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 항체는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 FXII에 특이적으로 결합하는 BIACORE™에 의해 확인되었다. 또한, FXII의 하나의 도메인 및 하나 이상의 추가적인 항원에 결합하는 다중특이적 항체 또는 FXII의 2개의 상이한 영역에 결합하는 이중특이적 항체는 그럼에도 불구하고 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "특이적으로 결합하는" 항체로 간주된다.
용어 "고친화도" 항체는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 BIACORE™ 또는 용액 친화성 ELISA에 의해 측정할 때, KD로 표현되는 FXII에 대한 결합 친화도가 적어도 적어도 10-8 M; 바람직하게는 10-9 M; 더 바람직하게는 10-10 M, 훨씬 더 바람직하게는 10-11 M인 mAb를 말한다.
용어 "느린 오프레이트(slow off rate)", "Koff" 또는 "kd"는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 BIACORE™에 의해 결정할 때, 1×10-3 s-1 이하, 바람직하게는 1×10-4 s-1 이하의 속도 상수로 FXII로부터 해리되는 항체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적으로 발생하는, 효소적으로 수득 가능한, 합성, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 항체의 "항원-결합 단편", 또는 "항체 단편"은 FXII 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 모이어티, 예컨대 리간드 또는 치료 모이어티("면역접합체"), 제2 항-FXII 항체, 또는 FXII-연관 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용한 임의의 다른 치료 모이어티에 접합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체(Ab)가 실질적으로 없는 항체를 말하는 것으로 의도된다(예를 들어, FXII 및/또는 FXIIa에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 단편은 FXII 또는 FXIIa이외의 항원에 특이적으로 결합하는 Ab가 실질적으로 없음).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "차단 항체" 또는 "중화 항체"(또는 "FXII 활성을 중화시키는 항체" 또는 "길항제 항체")는 FXII/FXIIa에 대한 결합이 FXII의 적어도 하나의 생물학적 활성의 저해를 초래하는 항체를 말하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 내인성 경로에 의한 응고를 예방하거나 차단할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "표면 플라즈몬 공명"은, 예를 들어 BIACORE™ 시스템(Pharmacia Biosensor AB사, 스웨덴 웁살라 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하여, 바이오센서 매트릭스 내 단백질 농도의 변경을 검출함으로써 실시간 생체분자 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 말하는 것으로 의도된다.
용어 "에피토프"는 파라토프로 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정자를 말한다. 단일 항원은 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원의 상이한 영역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효과를 나타낼 수 있다. 용어 "에피토프"는 또한 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 말한다. 이는 또한 항체에 의해 결합되는 항원의 영역을 말한다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 하위집합이며 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 잔기를 갖는다. 에피토프는 또한 입체구조일 수 있으며, 즉 비-선형 아미노산으로 구성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기, 또는 설포닐기와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹인 결정자를 포함할 수 있고, 특정 실시형태에서 특이적 3-차원 구조적 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "교차-경쟁"은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항원에 결합하여 또 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합을 저해 또는 차단하는 것을 의미한다. 상기 용어는 또한 두 방향 모두에서 2가지 항체 사이의 경쟁, 즉 결합하여 제2 항체의 결합을 차단하는 제1 항체 및 그 반대의 경우를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 항체 및 제2 항체는 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 입체 장애를 통해, 하나의 결합이 제2 항체의 결합을 저해하거나 차단하도록, 제1 및 제2 항체는 상이하지만 중첩된 에피토프에 결합할 수 있다. 항체 사이의 교차-경쟁은 당업계에 알려진 방법에 의해, 예를 들어 실시간 무표지 생체층 간섭측정 분석(label-free bio-layer interferometry assay)에 의해 측정될 수 있다. 2가지 항체 사이의 교차-경쟁은 자가-자가 결합으로 인한 배경 신호보다 적은 제2 항체의 결합으로 표현될 수 있다(여기서, 제1 및 제2 항체는 동일한 항체임). 2가지 항체 상이의 교차-결쟁은, 예를 들어 기준 자가-자가 배경 결합보다 적은 제2 항체의 결합 %로 표현될 수 있다(여기서, 제1 및 제2 항체는 동일한 항체임).
핵산 또는 이의 단편을 말할 때 용어 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실이 있으면서 또 다른 핵산(또는 이의 상보적 가닥)과 함께 최적으로 정렬되는 경우, 하기 논의된 바와 같은 임의의 잘 알려진 서열 동일성 알고리즘, 예컨대 파스타(FASTA), 블라스트(BLAST) 또는 갭(GAP)에 의해 측정할 때, 뉴클레오타이드 염기의 적어도 약 90%, 더 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 뉴클레오타이드 서열 동일성이 있는 것을 나타낸다. 기준 핵산 분자와 실질적 동일성을 갖는 핵산 분자는, 특정 경우에서 기준 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
폴리펩타이드에 적용할 때, 용어 "실질적 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은 디폴트 갭 가중치를 사용하여 갭 또는 BESTFIT 프로그램에 의해 최적으로 정렬될 때, 2가지 펩타이드 서열이 적어도 90% 서열 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 부분은 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2가지 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 유사성의 백분율 또는 정도를 상향 조정하여 치환의 보존적 특성을 수정할 수 있다. 이러한 조정을 하기 위한 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]을 참조하며, 이는 본 명세서에 참조로 포함된다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아마이드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파테이트 및 글루타메이트, 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 기는 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 대체는 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45]에 개시된 PAM250 로그 우도(log-likelihood) 행렬에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "보통의 보존적" 대체는 PAM250 로그 우도 행렬에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는, 보존적 아미노산 치환을 포함하여 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성의 측정을 사용하여 유사한 서열을 일치시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는, 디폴트 매개변수와 함께 사용되어, 유기체의 상이한 종 유래의 상동성 폴리펩타이드와 같이 밀접하게 관련된 폴리펩타이드 사이, 또는 야생형 단백질과 이의 돌연변이체 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하는 갭 및 BESTFIT과 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1을 참조한다. 폴리펩타이드 서열은 또한 GCG 버전 6.1의 프로그램인, 디폴트 또는 권장 매개변수를 이용하는 파스타를 사용하여 비교될 수 있다. 파스타(예를 들어, 파스타2 및 파스타3)는 질의 서열과 검색 서열 사이에서 가장 잘 중첩되는 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다(상기한 Pearson (2000)). 본 발명의 서열을 상이한 유기체 유래의 다수의 서열을 포함하는 데이터베이스와 비교할 때 또 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 매개변수를 사용하는 컴퓨터 프로그램 블라스트, 특히 블라스트피(BLASTP) 또는 티블라스트엔(TBLASTN)이다. 예를 들어, 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]을 참조하며, 이들 문헌 각각은 본 명세서에 참조로 포함된다.
어구 "치료적 유효량"은 투여되어 원하는 효과를 생성하는 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 목적에 따라 다를 것이며, 알려진 기법을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(예를 들어, 문헌[Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding] 참조).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 FXII-연관 질환 또는 장애, 예컨대 혈전증 또는 색전증의 개선, 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간을 말한다. 상기 용어는 이와 같은 질환 또는 장애를 가지거나 가질 위험이 있는 인간 대상체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 치료제, 예컨대 본 발명의 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것으로 인한 FXII-연관 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 적응증의 중증도의 감소 또는 개선을 말한다. 상기 용어는 질환의 진행 또는 증상/적응증의 악화의 저해를 포함한다. 상기 용어는 또한 질환의 긍정적인 예후를 포함하며, 즉 대상체는 질환이 없을 수 있거나 치료제, 예컨대 본 발명의 항체의 투여시 질환이 감소될 수 있다. 치료제는 대상체에게 치료 용량으로 투여될 수 있다.
용어 "예방하다", "예방하는" 또는 "예방"은 본 발명의 항체의 투여시 FXII-연관 질환 또는 장애 또는 이와 같은 질환 또는 장애의 임의의 증상 또는 적응증의 발현의 저해를 말한다.
항체의 항원-결합 부분
달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체"는 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체 분자(즉, "완전한 항체 분자")뿐만 아니라 이의 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적으로 발생하는, 효소적으로 수득 가능한, 합성, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 항체의 "항원-결합 단편", 또는 "항체 단편"은 FXII 단백질에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, dAb 단편, CDR을 포함하는 단편, 또는 단리된 CDR을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 용어 "항원-결합 단편"은 다중특이적 항원-결합 분자의 폴리펩타이드 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어 임의의 적합한 표준 기법, 예컨대 단백질 분해 소화 또는 항체 가변 및 (선택적으로) 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전자 조작 기법을 사용하여 완전한 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이와 같은 DNA는, 예를 들어 상업적 공급원, DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 공지되고/되거나 용이하게 입수할 수 있거나, 합성할 수 있다. DNA는, 예를 들어 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산을 변형, 추가 또는 결실시키는 것 등을 위한 분자 생물학 기법을 사용함으로써 또는 화학적으로 염기서열이 결정되고 조작될 수 있다.
항원-결합 단편의 비-제한적인 예는 (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일-사슬 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 서열로 이루어진 최소 인식 단위(예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 예컨대 CDR3 펩타이드), 또는 비자발적인 FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 포함한다. 다른 조작된 분자, 예컨대 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈형 면역약제(SMIP), 및 상어의 가변 IgNAR 도메인은 또한 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 표현 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있고, 일반적으로 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이며, CDR은 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 이와 프레임 내에 존재한다. VL 도메인과 연관된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 서로에 비례하여 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체일 수 있고 VH - VH, VH - VL 또는 VL - VL 이량체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비-제한적인 예시적 구성은 (i) VH -CH1; (ii) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH -CH1-CH2; (v) VH -CH1-CH2-CH3; (vi) VH -CH2-CH3; (vii) VH -CL; (viii) VL -CH1; (ix) VL -CH2; (x) VL -CH3; (xi) VL -CH1-CH2; (xii) VL -CH1-CH2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3; 및 (xiv) VL -CL을 포함한다. 상기 열거된 임의의 예시적인 구성을 포함하여, 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접 연결될 수 있거나 전체 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 적어도 2개(예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 또는 그 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 이는 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이의 유연하거나 반-유연한 연결을 초래한다. 더욱이, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 서로 및/또는 하나 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인과 비-공유적 회합으로(예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해) 상기 열거된 임의의 가변 및 불변 도메인 구성의 동종이량체 또는 이종이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다.
완전한 항체 분자와 같이, 항원-결합 단편은 단일특이적 또는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 각각의 가변 도메인은 별개의 항원에 또는 동일한 항원 상에서 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 명세서에 개시된 예시적인 이중특이적 항체 형식을 포함하여 임의의 다중특이적 항체 형식은 당업계에서 이용가능한 일상적인 기법을 사용하여 본 발명의 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서 사용하기 위해 조정될 수 있다.
인간 항체의 제조
유전자이식 마우스에서 인간 항체를 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 이와 같은 임의의 알려진 방법은 FXII 및/또는 FXIIa에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 제조하기 위해 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
하기 중 임의의 하나를 포함하는 면역원이 FXII 및/또는 FXIIa 단백질에 대한 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 전장의 천연 FXII 또는 FXIIa 단백질로(예를 들어, UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호 P00748.3 참조) 또는 상기 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 DNA로 면역화된 마우스로부터 수득된다. 대안적으로, 상기 단백질 또는 이의 단편은 표준 생화학적 기법을 사용하여 생산되고 면역원으로 변형 및 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역원은 대장균 또는 임의의 다른 진핵 또는 포유동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되는 재조합 FXII 단백질 또는 이의 단편일 수 있다.
VELOCIMMUNE® 기술(예를 들어, 미국 특허 제6,596,541호(Regeneron Pharmaceuticals사, VELOCIMMUNE®) 참조) 또는 단클론성 항체를 생성하는 임의의 다른 알려진 방법을 사용하여, 처음에 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 FXII에 대한 고친화도 키메라 항체를 단리시킨다. VELOCIMMUNE® 기술은 마우스가 항원 자극에 반응하여 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생성하도록 내인성 마우스 불변 영역 유전자좌에 작동 가능하게 연결된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 유전자이식 마우스의 생성을 포함한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 단리시키고 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 DNA에 작동 가능하게 연결시킨다. 그 다음 DNA를 완전한 인간 항체를 발현할 수 있는 세포에서 발현시킨다.
일반적으로 VELOCIMMUNE® 마우스에 관심이 있는 항원을 접종하고, 항체를 발현하는 마우스로부터 림프 세포(예컨대, B-세포)를 회수한다. 림프 세포를 골수종 세포주와 융합시켜 무한증식 하이브리도마 세포주를 제조할 수 있으며, 이와 같은 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선택하여 관심이 있는 항원에 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 확인한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 단리시키고 중쇄 및 경쇄의 바람직한 아이소타입 불변 영역에 연결시킬 수 있다. 이와 같은 항체 단백질을 세포, 예컨대 CHO 세포에서 생성할 수 있다. 대안적으로, 항원-특이적 키메라 항체 또는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 인코딩하는 DNA를 항원-특이적 림프구로부터 직접적으로 단리시킬 수 있다.
처음에, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 고친화도 키메라 항체를 단리시킨다. 하기 실험 부문에서와 같이, 친화도, 선택성, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특징에 대해 항체를 특성화하고 선택한다. 마우스 불변 영역을 원하는 인간 불변 영역으로 대체하여 본 발명의 완전한 인간 항체, 예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4를 생성한다. 선택된 불변 영역이 특정 용도에 따라 달라질 수 있지만, 고친화도 항원-결합 및 표적 특이성 특징은 가변 영역에 존재한다.
생물학적 동등성
본 발명의 항-FXII 항체 및 항체 단편은 기재된 항체의 아미노산 서열과 다르지만 FXII 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 이와 같은 변이체 항체 및 항체 단편은 모 서열과 비교할 때 아미노산의 하나 이상의 추가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 기재된 항체의 생물학적 활성과 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 유사하게, 본 발명의 항체-인코딩 DNA 서열은 개시된 서열과 비교할 때 뉴클레오타이드의 하나 이상의 추가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 본 발명의 항체 또는 항체 단편과 본질적으로 생물학적 동등성인 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 서열을 포함한다.
예를 들어 2가지 항원-결합 단백질, 또는 항체가 유사한 실험 조건 하에서 동일한 몰 용량으로 단일 용량 또는 다회용량 투여될 때 흡수 속도 및 정도가 상당한 차이를 나타내지 않는 약학적 동등물 또는 약학적 대안인 경우, 이들 항원-결합 단백질, 또는 항체는 생물학적 동등성인 것으로 간주된다. 일부 항체는 이의 흡수 정도는 동등하지만 흡수 속도는 동등하지 않은 경우 동등물 또는 약학적 대안으로 간주될 것이며, 또한 흡수 속도에서 이와 같은 차이는 의도적이며 표지에 반영되고, 예를 들어 만성적 사용에 대해서 효과적인 신체 약물 농도의 달성에 필수적이지 않으며, 연구된 특정 약품에 대해 의학적으로 중요하지 않은 것으로 간주되기 때문에 생물학적 동등성인 것으로 고려될 수 있다.
일 실시형태에서, 2가지 항원-결합 단백질에 안전성, 순도, 또는 효능에서 임상적으로 의미있는 차이가 없다면, 이들 항원-결합 단백질은 생물학적으로 동등하다.
일 실시형태에서, 기준 제품과 생물학적 제품 사이에서 1회 이상의 전환 없는 지속적인 치료법과 비교하여, 면역원성의 임상적으로 상당한 변화, 또는 유효성 감소를 포함하여 부작용 위험의 예상되는 증가 없이 환자가 기준 제품과 생물학적 제품 사이에서 1회 이상 전환될 수 있다면, 2가지 항원-결합 단백질은 생물학적으로 동등하다.
일 실시형태에서, 2가지 항원-결합 단백질이 둘 다 사용 조건 또는 조건들에 대한 공통 메커니즘 또는 메커니즘들에 의해, 이와 같은 메커니즘이 알려진 정도까지 작용한다면, 이들 항원-결합 단백질은 생물학적으로 동등하다.
생물학적 동등성은 생체내 및/또는 시험관내 방법에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 동등성 측정은, 예를 들어 (a) 시간에 따라 혈액, 혈장, 혈청, 또는 다른 생물학적 유체에서 항체 또는 이의 대사산물의 농도를 측정하는, 인간 또는 다른 포유동물에서 생체내 테스트; (b) 인간 생체내 생체이용률 데이터와 상관관계가 있고 이를 합리적으로 예측하는 시험관내 테스트; (c) 항체(또는 이의 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과가 시간에 따라 측정되는 인간 또는 다른 포유동물에서 생체내 테스트; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용률 또는 생물학적 동등성을 확립하는 잘 제어된 임상 시험을 포함한다.
본 발명의 항체의 생물학적으로 동등한 변이체는, 예를 들어 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 수행하거나 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 구축될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산으로 대체되어 복원시 불필요하거나 부정확한 분자내 이황화 가교의 형성을 방지할 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적 등가성인 항체는, 항체의 글리코실화 특징을 변형시키는 아미노산 변화를 포함하는 항체 변이체, 예를 들어 글리코실화를 없애거나 제거하는 돌연변이를 포함할 수 있다.
Fc 변이체를 포함하는 항- FXII 항체
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 예를 들어 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 FcRn 수용체에 결합하는 항체를 향상시키거나 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-FXII 항체가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에 돌연변이를 포함하는 항-FXII 항체를 포함하며, 여기서 돌연변이(들)는 산성 환경에서(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이와 같은 돌연변이는 동물에게 투여될 때 항체의 혈청 반감기의 증가를 초래할 수 있다. 이와 같은 Fc 변형의 비-제한적인 예는, 예를 들어 위치 250(예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428(예를 들어, L 또는 F); 252(예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254(예를 들어, S 또는 T), 및 256(예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433(예를 들어, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예를 들어, A, W, H, F 또는 Y[N434A, N434W, N434H, N434F 또는 N434Y])에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308(예를 들어, 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 변형은 428L(예를 들어, M428L) 및 434S(예를 들어, N434S) 변형; 428L, 259I(예를 들어, V259I), 및 308F(예를 들어, V308F) 변형; 433K(예를 들어, H433K) 및 434(예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254 및 256(예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예를 들어, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 변형은 265A(예를 들어, D265A) 및/또는 297A(예를 들어, N297A) 변형을 포함한다.
예를 들어, 본 발명은 250Q 및 248L(예를 들어, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예를 들어, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예를 들어, M428L 및 N434S); 257I 및 311I(예를 들어, P257I 및 Q311I); 257I 및 434H(예를 들어, P257I 및 N434H); 376V 및 434H(예를 들어, D376V 및 N434H); 307A, 380A 및 434A(예를 들어, T307A, E380A 및 N434A); 및 433K 및 434F(예를 들어, H433K 및 N434F)로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 그룹을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-FXII 항체를 포함한다. 본 명세서에 개시된 항체 가변 도메인 내의 상기 Fc 도메인 돌연변이 및 다른 돌연변이의 모든 가능한 조합이 본 발명의 범주 내에서 고려된다.
본 발명은 또한 키메라 중쇄 불변(CH) 영역을 포함하는 항-FXII 항체를 포함하며, 여기서 키메라 CH 영역은 하나 초과의 면역글로불린 아이소타입의 CH 영역으로부터 유래된 분절을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래된 CH2 도메인의 일부 또는 전부를, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래된 CH3 도메인의 일부 또는 전부와 조합하여 포함하는 키메라 CH 영역을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, 본 발명의 항체는 키메라 힌지 영역을 갖는 키메라 CH 영역을 포함한다. 예를 들어, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "상부 힌지" 아미노산 서열(EU 번호매김에 따르면 위치 216 내지 227 유래의 아미노산 잔기)을, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "하부 힌지" 서열(EU 번호매김에 따르면 위치 228 내지 236 유래의 아미노산 잔기)과 조합하여 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, 키메라 힌지 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 상부 힌지로부터 유래된 아미노산 잔기 및 인간 IgG2 하부 힌지로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 키메라 CH 영역을 포함하는 항체는 항체의 치료적 또는 약동학적 특성에 악영향을 주지 않으면서 변형된 Fc 이펙터 기능을 나타낼 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2014/0243504를 참조하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참조로 포함됨).
항체의 생물학적 특징
일반적으로, 본 발명의 항체는 FXII 단백질에 결합하여 FXIIa 및 FXIIb로의 상기 단백질의 절단을 방지함으로써 기능한다. 특정 실시형태에서, 항체는 인자 XII(FXIIa)의 활성화된 형태("이중 FXII/FXIIa 결합제")에 결합한다. 예를 들어, 본 발명은, 예를 들어 본 명세서의 실시예 3에 정의된 바와 같은 분석 형식을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 때 (예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서) 20nM 미만의 KD로 FXII 단백질에 결합하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 예를 들어 본 명세서의 실시예 3에 정의된 바와 같은 분석 형식, 또는 실질적으로 유사한 분석을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 때 약 20nM 미만, 약 17nM 미만, 약 10nM 미만, 약 5nM 미만, 또는 약 1nM 미만의 KD로 FXII에 결합한다.
본 발명은 또한, 예를 들어 본 명세서의 실시예 3에 정의된 바와 같은 분석 형식, 또는 실질적으로 유사한 분석을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 때 25℃ 또는 37℃에서 약 1분 초과의 해리 반감기(t½)로 인간 FXII 단백질에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들어 본 명세서의 실시예 3에 정의된 바와 같은 분석 형식, 또는 실질적으로 유사한 분석을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 때 25℃ 또는 37℃에서 약 5분 초과, 약 10분 초과, 약 20분 초과, 약 30분 초과, 약 40분 초과, 약 50분 초과, 약 60분 초과, 또는 약 70분 초과의 t½로 FXII 단백질에 결합한다.
본 발명은, 예를 들어 본 명세서의 실시예 3에 정의된 바와 같은 분석 형식을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 때 (예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서) 9nM 미만의 KD로 FXIIa 단백질에 결합하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 예를 들어 본 명세서의 실시예 3에 정의된 바와 같은 분석 형식, 또는 실질적으로 유사한 분석을 사용하여, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 때 약 9nM 미만, 약 5nM 미만, 약 2nM 미만, 약 1nM 미만, 또는 약 500 pM 미만의 KD로 FXIIa에 결합한다.
본 발명은 또한, 예를 들어 본 명세서의 실시예 3에 정의된 바와 같은 분석 형식, 또는 실질적으로 유사한 분석을 사용하여, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 때 약 1분 초과의 해리 반감기(t½)로 인간 FXIIa에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들어 본 명세서의 실시예 3에 정의된 바와 같은 분석 형식, 또는 실질적으로 유사한 분석을 사용하여, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정할 때 약 5분 초과, 약 10분 초과, 약 20분 초과, 약 30분 초과, 약 40분 초과, 약 50분 초과, 약 60분 초과, 또는 약 70분 초과의 t½로 FXIIa 단백질에 결합한다.
본 발명은 또한, 예를 들어 본 명세서의 실시예 5에 정의된 바와 같은 분석 형식, 또는 실질적으로 유사한 분석을 사용하여 측정할 때 250nM 미만, 200nM 미만 또는 150nM 미만의 농도로 내인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 저해하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들어 본 명세서의 실시예 5에 정의된 바와 같은 분석 형식, 또는 실질적으로 유사한 분석을 사용하여 측정할 때 외인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 차단하지 않으면서 내인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 저해하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 FXII 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 단편은 다음 특징 중 하나 이상을 나타낸다: (a) 완전한 인간 단클론성 항체임; (b) 활성화된 인자 FXII(FXIIa)에 결합함; (c) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 25℃에서 3.5nM 미만의 해리 상수(KD)로 FXII에 결합함; (d) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 37℃에서 17nM 미만의 KD로 FXII에 결합함; (e) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 25℃에서 5nM 미만, 바람직하게는 2.5nM 미만의 KD로 FXIIa에 결합함; (f) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 37℃에서 6.5nM 미만, 바람직하게는 2.5nM 미만의 KD로 FXIIa에 결합함; (g) 기능성 혈장 분석에 의해 측정할 때, 250nM 미만의 농도에서 내인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 차단함; 및 (h) 기능성 혈장 분석에 의해 측정할 때, 외인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 차단하지 않으면서 내인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 차단함.
본 발명의 항체는 상기 언급한 생물학적 특징 중 하나 이상, 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 본 발명의 항체의 다른 생물학적 특징은 본 명세서의 작업 실시예를 포함하여 본 개시내용의 검토로부터 당업자에게 명백할 것이다.
에피토프 맵핑 및 관련 기술
본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하여 FXII/FXIIa 단백질 분자의 하나 이상의 영역 내에서 발견되는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 항-FXII/FXIIa 항체를 포함한다. 항체가 결합하는 에피토프는 FXII 단백질 분자의 상기 언급한 임의의 도메인 내에 위치한 3개 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상)의 아미노산의 단일 연속 서열로 이루어질 수 있다(예를 들어, 도메인 중 선형 에피토프). 대안적으로, 에피토프는 단백질 분자의 상기 언급한 도메인 중 어느 하나 또는 둘 다의 내에 위치한 복수의 비-연속 아미노산(또는 아미노산 서열)로 이루어질 수 있다(예를 들어, 입체형태 에피토프).
당업자에게 알려진 다양한 기법이 항체가 폴리펩타이드 또는 단백질 내에서 "하나 이상의 아미노산과 상호작용"하는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 기법은, 예를 들어 일상적인 교차-차단 분석, 예컨대 문헌[Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)]에 기재된 것을 포함한다. 다른 방법은 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석(Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), 펩타이드 절단 분석 결정학 연구 및 NMR 분석을 포함한다. 추가적으로, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 이용될 수 있다(Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내 아미노산을 확인하는 데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법에 의해 검출된 수소/중수소 교환이다. 대체적으로, 수소/중수소 교환 방법은 관심이 있는 단백질을 중수소로 표지한 다음, 중수소-표지 단백질에 항체를 결합하는 것을 포함한다. 그 다음에, 단백질/항체 복합체는 물로 이동되고 항체 복합체에 의해 보호되는 아미노산 내의 교환가능한 양성자는 계면의 일부가 아닌 아미노산 내의 교환가능한 양성자보다 더 느린 속도로 중수소-대-수소 역교환을 거친다. 결과적으로, 단백질/항체 계면의 일부를 형성하는 아미노산은 중수소를 보유할 수 있으므로, 계면에 포함되지 않는 아미노산에 비하여 상대적으로 더 높은 질량을 나타낸다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테아제 절단 및 질량 분석법 분석을 거치고, 이에 의해 항체가 상호작용하는 특정 아미노산에 해당하는 중수소-표지 잔기가 드러나게 된다. 예를 들어, 문헌[Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259]; [Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A]을 참조한다.
용어 "에피토프"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 말한다. B-세포 에피토프는 연속적인 아미노산 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 비연속적인 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 연속적인 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 고유의 공간 형태로 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
항원 구조-기반 항체 프로파일링(ASAP)으로도 알려진 변형-지원 프로파일링(MAP)은 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 각각의 항체의 결합 프로파일링의 유사성에 따라 동일한 항원에 대한 다수의 단클론성 항체(mAb)를 분류하는 방법이다(미국 특허 출원 공개 제2004/0101920호를 참조하며, 이는 본 명세서에 구체적으로 전문이 참조로 포함됨). 각각의 카테고리는 또 다른 카테고리에 의해 표현되는 에피토프와 완전히 상이하거나 상기 에피토프와 부분적으로 중첩되는 고유한 에피토프를 반영할 수 있다. 이 기술은 특성화가 유전적으로 구별되는 항체에 초점을 맞출 수 있도록, 유전적으로 동일한 항체의 신속한 필터링을 가능하게 한다. 하이브리도마 스크리닝에 적용될 때, MAP는 원하는 특징을 갖는 mAb를 생성하는 희귀 하이브리도마 클론의 확인을 용이하게 할 수 있다. MAP는 본 발명의 항체를 상이한 에피토프에 결합하는 항체의 그룹으로 분류하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 FXIIa의 중쇄 및/또는 경쇄 내에서 발견되는 하나 이상의 에피토프와 상호작용하는 항-FXII 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 에피토프(들)는 FXIIa의 중쇄 및/또는 경쇄 내에 위치한 3개 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상)의 아미노산의 하나 이상의 연속적인 서열로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 FXIIa 내에 위치한 복수의 비-연속적인 아미노산(또는 아미노산 서열)로 이루어질 수 있다.
본 발명은 표 1에 열거된 임의의 구체적인 예시적 항체와, 동일한 에피토프, 또는 상기 에피토프의 부분에 결합하는 항-FXII 항체를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 또한 FXII 단백질 또는 이의 단편에 결합하기 위해 표 1에 열거된 임의의 구체적인 예시적 항체와 경쟁하는 항-FXII 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 FXII 단백질에 결합하기 위해 표 1에 열거된 하나 이상의 항체와 교차-경쟁하는 항-FXII 항체를 포함한다.
항체가 당업계에 알려진 일상적인 방법을 사용함으로써 기준 항-FXII 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 결합하기 위해 기준 항-FXII 항체와 경쟁하는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 테스트 항체가 본 발명의 기준 항-FXII 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 기준 항체는 포화 조건 하에서 FXII 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 것이 허용된다. 그 다음에, FXII 단백질 분자에 결합하는 테스트 항체의 능력을 평가한다. 테스트 항체가 기준 항-FXII 항체와 포화 결합한 다음 FXII에 결합할 수 있다면, 테스트 항체는 기준 항-FXII 항체와 상이한 에피토프에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다. 한편, 테스트 항체가 기준 항-FXII 항체와 포화 결합한 다음 FXII 단백질에 결합할 수 없다면, 테스트 항체는 본 발명의 기준 항-FXII 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
항체가 기준 항-FXII 항체와 결합하기 위해 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해, 상기 기재된 결합 방법을 2가지 방향으로 수행한다: 제1 방향에서, 기준 항체가 포화 조건 하에서 FXII 단백질에 결합하는 것을 허용한 다음, FXII 분자에 대한 테스트 항체의 결합을 평가한다. 제2 방향에서, 테스트 항체가 포화 조건 하에서 FXII 분자에 결합하는 것을 허용한 다음, FXII 분자에 대한 기준 항체의 결합을 평가한다. 두 방향 모두에서 단지 제1(포화) 항체만 FXII 분자에 결합할 수 있다면, 테스트 항체 및 기준 항체는 FXII에 결합하기 위해 경쟁한다는 결론을 내린다. 당업자가 이해할 바와 같이, 기준 항체와 결합하기 위해 경쟁하는 항체는 반드시 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없을 수 있지만, 중첩된 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
2개의 항체는 각각이 항원에 대한 다른 것의 결합을 경쟁적으로 저해(차단)하는 경우 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다. 즉, 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100-배 과잉의 하나의 항체는 경쟁적 결합 분석으로 측정할 때 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%만큼 다른 것의 결합을 저해한다(예를 들어, 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502] 참조). 대안적으로, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거한다면 2개의 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거한다면 2개의 항체는 중첩되는 에피토프를 갖는다.
그 다음 테스트 항체의 관찰된 결합 결여가 실제로 기준 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합에 기인한 것인지 또는 입체 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합 결여의 원인인지 여부를 확인하기 위해 추가적인 일상적 실험(예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행할 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유세포 분석 또는 당업계에서 이용가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 분석을 사용하여 수행할 수 있다.
면역접합체
본 발명은 FXII-연관 질환 또는 장애(예를 들어, 혈전증)를 치료하기 위해 치료 모이어티("면역접합체")에 접합된 인간 항-FXII 단클론성 항체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역접합체"는 방사능제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 펩타이드 또는 단백질 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결된 항체를 말한다. 항체는 항체가 표적에 결합할 수 있는 한 분자를 따라 임의의 위치에서 방사능제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 펩타이드 또는 치료제에 연결될 수 있다. 면역접합체의 예는 항체 약물 접합체 및 항체-독소 융합 단백질을 포함한다. 일 실시형태에서, 작용제는 FXII 단백질에 대한 제2의 상이한 항체일 수 있다. 항-FXII 항체에 접합할 수 있는 치료 모이어티의 유형은 치료될 병태 및 달성할 원하는 치료 효과를 고려할 것이다. 면역접합체를 형성에 적합한 작용제의 예는 당업계에 알려져 있으며; 예를 들어 WO 05/103081을 참조한다.
다중특이적 항체
본 발명의 항체는 단일특이적, 이중특이적, 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나 하나 초과의 표적 폴리펩타이드에 특이적인 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69]; [Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244]을 참조한다.
본 발명의 임의의 다중특이적 항원-결합 분자, 또는 이의 변이체는 당업자에게 알려질 바와 같이 표준 분자 생물학적 기법(예를 들어, 재조합 DNA 및 단백질 발현 기술)을 사용하여 구축될 수 있다.
일부 실시형태에서, FXII-특이적 항체는 FXII 단백질의 별개의 도메인에 결합하는 가변 영역이 함께 연결되어 단일 결합 분자 내에 이중-도메인 특이성을 부여하는 이중특이적 형식("이중특이적")으로 생성된다. 적절하게 설계된 이중특이성은 특이성과 결합력을 둘 다 증가시키는 것을 통해 전반적인 FXII-단백질 저해 효능을 향상시킬 수 있다. 개별 도메인(예를 들어, N-말단 도메인의 분절)에 대한 특이성을 가지거나, 하나의 도메인 내의 상이한 영역에 결합할 수 있는 가변 영역은 각각의 영역이 별개의 에피토프에, 또는 하나의 도메인 내의 상이한 영역에 동시에 결합할 수 있게 하는 구조적 스캐폴드 상에서 쌍을 형성한다. 이중특이적에 대한 일 예에서, 하나의 도메인에 대한 특이성을 갖는 결합제 유래의 중쇄 가변 영역(VH)은 제2 도메인에 대한 특이성을 갖는 일련의 결합제 유래의 경쇄 가변 영역(VL)과 재조합되어 원래 VH에 대한 원래 특이성을 방해하지 않으면서 원래 VH와 쌍을 형성할 수 있는 비-동족체 VL 파트너를 확인한다. 이러한 방식으로, 단일 VL 분절(예를 들어, VL1)은 2가지 상이한 VH 도메인(예를 들어, VH1 및 VH2)과 조합되어 2개의 결합 "팔(arm)"(VH1- VL1 및 VH2- VL1)로 구성된 이중특이성을 생성할 수 있다. 단일 VL 분절의 사용은 시스템의 복잡성을 감소시키고 이에 의해 이중특이성을 생성하는 데 사용되는 클로닝, 발현, 및 정제 공정의 효율성을 증가시킨다(예를 들어, USSN13/022759 및 US2010/0331527 참조).
대안적으로, 하나 초과의 도메인 및 제2 표적에 결합하는 항체, 예컨대 제2 상이한 항-FXII 항체(이에 제한되는 것은 아님)는 본 명세서에 기재된 기법, 또는 당업자에게 알려진 다른 기법을 사용하여 이중특이적 형식으로 제조될 수 있다. 별개의 영역에 결합하는 항체 가변 영역은, 예를 들어 FXII의 세포외 도메인 상의 관련 부위에 결합하는 가변 영역과 함께 연결되어 단일 결합 분자 내에 이중-항원 특이성을 부여할 수 있다. 이러한 특성의 적절하게 설계된 이중특이성은 이중 기능을 제공한다. 세포외 도메인에 대한 특이성을 갖는 가변 영역은 세포외 도메인 외부에 대하여 특이성을 갖는 가변 영역과 조합되고 각각의 가변 영역이 별개의 항원에 결합하는 것을 가능하게 하는 구조적 스캐폴드 상에서 쌍을 형성한다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 이중특이적 항체 형식은 제1 면역글로불린(Ig) CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인의 사용을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 적어도 하나의 아미노산이 서로 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중특이적 항체와 비교하여 단백질 A에 대한 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고 제2 Ig CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 번호매김에 의함; EU 번호매김에 의하면 H435R)과 같은 단백질 A 결합을 감소시키거나 없애는 돌연변이를 포함한다. 제2 CH3은 Y96F 변형(IMGT에 의함; EU에 의하면 Y436F)을 더 포함할 수 있다. 제2 CH3 내에서 발견될 수 있는 추가 변형은, IgG1 항체의 경우에 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I); IgG2 항체의 경우에 N44S, K52N, 및 V82I(IMGT; EU에 의하면 N384S, K392N, 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우에 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I)를 포함한다. 상기 기재된 이중특이적 항체 형식 상의 변화는 본 발명의 범주 내에서 고려된다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 다른 예시적인 이중특이적 형식은 제한없이, 예를 들어 scFv-기반 또는 디아바디 이중특이적 형식, IgG-scFv 융합, 이중 가변 도메인(DVD)-Ig, 쿼드로마(Quadroma), 놉스-인투-홀(knobs-into-holes), 공통 경쇄(예를 들어, 놉스-인투-홀을 갖는 공통 경쇄 등), 크로스Mab, 크로스Fab, (시드(SEED))바디, 류신 지퍼, 듀오바디(Duobody), IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab(DAF)-IgG, 및 Mab2 이중특이적 형식을 포함한다(상기 형식의 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11], 및 여기에 인용된 참고 문헌 참조). 이중특이적 항체는 또한 펩타이드/핵산 접합을 사용하여 구축될 수 있으며, 예를 들어 여기서 직교 화학적 반응성을 갖는 비천연 아미노산을 사용하여 부위-특이적 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 생성한 다음 정의된 조성, 원자가 및 기하학적 구조를 갖는 다량체 복합체로 자기 조립한다(예를 들어, 문헌[Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]] 참조).
치료적 투여 및 제형
본 발명은 본 발명의 항-FXII 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 치료 조성물은 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 이송, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제형 내로 포함되는 다른 작용제와 함께 투여될 것이다. 다수의 적절한 제형은 모든 제약 화학자에게 알려진 처방집 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]에서 찾을 수 있다. 이러한 제형은, 예를 들어 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포(예컨대, LIPOFECTIN™), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카보왁스를 포함하는 반고체 혼합물을 포함한다. 또한 문헌[Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]을 참조한다.
항체의 용량은 투여되는 대상체의 연령 및 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 항체가 성인 환자의 질환 또는 장애를 치료하거나 이와 같은 질환을 예방하기 위해 사용되는 경우, 본 발명의 항체를 일반적으로 체중 1 ㎏당 약 0.1 내지 약 100㎎의 단일 용량으로 투여하는 것이 유리하다. 병태의 중증도에 따라, 치료 빈도 및 기간을 조정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 약 0.1㎎ 내지 약 800㎎, 약 1 내지 약 600㎎, 약 5 내지 약 500㎎, 또는 약 10 내지 약 400㎎의 초기 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 초기 용량에 이어 초기 용량과 거의 동일하거나 이보다 적을 수 있는 양으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제2 또는 복수의 후속 용량을 투여할 수 있으며, 여기서 후속 용량은 적어도 1일 내지 3일; 적어도 1주, 적어도 2주; 적어도 3주; 적어도 4주; 적어도 5주; 적어도 6주; 적어도 7주; 적어도 8주; 적어도 9주; 적어도 10주; 적어도 12주; 또는 적어도 14주만큼 떨어져 있다.
다양한 전달 시스템, 예를 들어 리포좀, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 돌연변이 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도사이토시스가 알려져 있으며 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조). 도입 방법은 피내, 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 구강 경로를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어 주입 또는 볼러스 주사, 상피 또는 점막 내벽(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소적일 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 비히클로, 구체적으로 리포좀으로 전달될 수 있다(예를 들어, 문헌[Langer (1990) Science 249:1527-1533] 참조).
본 발명의 항체를 전달하기 위한 나노입자의 사용이 또한 본 명세서에서 고려된다. 항체-접합된 나노입자는 치료 및 진단 적용 둘 다에 사용될 수 있다. 항체-접합 나노입자와 제조 및 사용 방법은, 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Arruebo, M., et al. 2009 ("Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" in J. Nanomat. Volume 2009, Article ID 439389, 24 pages, doi: 10.1155/2009/439389)]에 상세히 기재되어 있다. 나노입자는 표적 세포에 대한 약제학적 조성물에 포함된 항체에 대하여 개발되고 접합될 수 있다. 약물 전달을 위한 나노입자는 또한 예를 들어 미국 특허 제8257740호 또는 미국 특허 제8246995호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.
특정 상황에서, 약제학적 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 일 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 제어 방출 시스템은 조성물의 표적 근처에 배치될 수 있으며, 따라서 전신 용량의 일부만을 필요로 할 수 있다.
주사가능한 제제는 정맥내, 피하, 두개내, 복강내 및 근육내 주사, 점적주입 등을 위한 투약 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사가능한 제제는 공개적으로 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 이용하여 피하 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 추가적으로, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물을 전달함에 있어서 용이하게 적용된다. 이와 같은 펜 전달 장치는 재사용 가능하거나 일회용일 수 있다. 재사용 가능한 펜 전달 장치는 일반적으로 약제학적 조성물을 포함하는 교체 가능한 카트리지를 이용한다. 일단 카트리지 내 모든 약제학적 조성물을 투여하고 카트리지가 비게 되면, 빈 카트리지는 용이하게 폐기되고 약제학적 조성물을 포함하는 새로운 카트리지로 교체될 수 있다. 그 다음 펜 전달 장치는 재사용될 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교체 가능한 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 장치 내 저장소에 보유된 약제학적 조성물로 미리 채워진다. 일단 저장소에서 약제학적 조성물이 비워지면, 전체 장치가 폐기된다.
유리하게는, 상기 기재된 경구 또는 비경구 사용을 위한 약제학적 조성물이 활성 성분의 용량을 맞추기에 적합한 단위 용량의 투약 형태로 제조된다. 이와 같은 단위 용량의 투약 형태는, 예를 들어 정제, 환제, 캡슐, 주사(앰플), 좌제 등을 포함한다. 포함되는 항체의 양은 일반적으로 단위 용량의 투약 형태당 약 5 내지 약 500㎎이고; 특히 주사 형태에서, 항체는 약 5 내지 약 300㎎으로 다른 투약 형태의 경우 약 10 내지 약 300㎎으로 포함되는 것이 바람직하다.
항체의 치료 용도
본 발명의 항체는 응고와 연관된 질환 또는 장애 또는 병태(혈전증 및 색전증을 포함함) 또는 부종과 연관된 질환 또는 장애 또는 병태(예를 들어, 유전성 혈관부종)의 치료, 및/또는 예방에 및/또는 이와 같은 질환, 장애 또는 병태와 연관된 적어도 하나의 증상의 개선에 유용하다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 응고 또는 부종과 연관된 질환 또는 장애 또는 병태가 있는 환자에게 치료 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 출혈 위험을 증가시키지 않으면서 혈전증을 예방하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 장치 혈전증, 혈전색전증, 유전성 혈관부종, 뇌졸중, 혈전성향증, 심허혈, 죽상경화판 파열, 기계식 인공 판막의 사용, 혈액-접촉 의료 장치의 사용, 혈액-접촉 체외 회로의 사용, 정맥 혈전색전증, 폐 색전증, 심부정맥 혈전증, 문맥 혈전증, 버드-키아리 증후군(Budd-Chiari syndrome), 파젯-슈뢰터 질환(Paget-Schroetter disease), 신정맥 혈전증, 대뇌 정맥 부비강 혈전증, 경정맥 혈전증, 해면정맥동 혈전증, 간동맥 혈전증, 하지 허혈 및 심근경색증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 FXII-연관 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 적응증을 치료하거나 예방하는 데 유용하다.
또한 본 발명의 하나 이상의 항체를 체외막 산소공급(심장-폐 기계)을 사용하는 대상체와 같이 혈전증의 위험이 있는 대상체에게 예방적으로 사용하는 것이 본 명세서에서 고려된다. 본 발명의 항체는 체외 회로에서 산소공급기 및 삽관(tubing)의 혈전 폐색을 방지하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 추가 실시형태에서, 본 항체는 본 명세서에 개시된 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물 또는 약제의 제조에 사용된다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 항체는 본 명세서에 개시된 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 개선하는 데 유용한 당업자에게 알려진 임의의 다른 작용제 또는 임의의 다른 요법과 함께 보조 요법으로서 사용된다.
병용 요법
병용 요법은 본 발명의 항체 및 본 발명의 항체, 또는 본 발명의 항체의 생물학적 활성 단편과 유리하게 조합될 수 있는 임의의 추가적인 치료제를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 혈전증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 데, 구체적으로 혈전증을 예방하거나 기저 질환, 장애 또는 병태(본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있음)로 인해 혈전증의 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 사용되는 하나 이상의 약물 또는 요법과 상승적으로 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 제2 치료제와 조합되어 상기 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선시킬 수 있다.
질환, 장애 또는 병태에 따라서, 본 발명의 항체는 항-응고제(예를 들어, 와파린, 헤파린, 페닌다이온, 폰다파리눅스, 이드라파리눅스), 트롬빈 저해제(예를 들어, 아르가트로반, 레피루딘, 비발리루딘, 또는 다비가트란), 혈전용해 약물, 항-혈소판 약물(예를 들어, 아스피린), 항고혈압제(예를 들어, 안지오텐신-전환 효소 저해제, 베타 차단제, 칼슘 채널 차단제), 면역억제제(예를 들어, 빈크리스틴, 사이클로스포린 A, 또는 메토트렉세이트), 섬유소용해제, 콜레스테롤-저하제(예를 들어, 스타틴 또는 PCSK9 저해제, 예컨대 알리로쿠맙), 항-염증 약물(예를 들어, 코르티코스테로이드, 또는 비-스테로이드 항-염증 약물), 제2 항-FXII 항체, 기계적 혈병 회수, 카테터-유도 혈전용해 및 수술을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "~와 조합하여"는 본 발명의 항-FXII 항체의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 추가적인 치료 활성 성분(들)이 투여될 수 있음을 의미한다. 용어 "~와 조합하여"는 또한 항-FXII 항체 및 제2 치료제의 순차적인 또는 동시 투여를 포함한다.
추가적인 치료적 활성 성분(들)은 본 발명의 항-FXII 항체의 투여 전에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분의 투여 1주 전, 72시간 전, 60시간 전, 48시간 전, 36시간 전, 24시간 전, 12시간 전, 6시간 전, 5시간 전, 4시간 전, 3시간 전, 2시간 전, 1시간 전, 30분 전, 또는 30분 미만 전에 투여되는 경우 제1 성분은 제2 성분 "전에" 투여된다고 여겨질 수 있다. 다른 실시형태에서, 추가적인 치료 활성 성분(들)은 본 발명의 항-FXII 항체의 투여 후 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분의 투여 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후, 5시간 후, 6시간 후, 12시간 후, 24시간 후, 36시간 후, 48시간 후, 60시간 후, 72시간 후 또는 그 이상의 시간 후에 투여되는 경우 제1 성분은 제2 성분 "후에" 투여된다고 여겨질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 추가적인 치료적 활성 성분(들)은 본 발명의 항-FXII 항체의 투여와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, "동시" 투여는, 예를 들어 항-FXII 항체 및 추가적인 치료적 활성 성분을 대상체에게 단일 투약 형태로, 또는 서로 약 30분 이하 이내에 대상체에게 투여되는 별개의 투약 형태로 투여하는 것을 포함한다. 별개의 투약 형태로 투여되는 경우, 각각의 투약 형태는 동일한 경로를 통해 투여될 수 있고(예를 들어, 항-FXII 항체 및 추가적인 치료적 활성 성분 둘 다 정맥내 등으로 투여될 수 있음); 대안적으로, 각각의 투약 형태는 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다(예를 들어, 항-FXII 항체는 정맥내로 투여될 수 있고, 추가적인 치료적 활성 성분은 경구로 투여될 수 있음). 아무튼, 단일 투약 형태로, 동일한 경로에 의해 별개의 투약 형태로, 또는 상이한 경로에 의해 별개의 투약 형태로 성분을 투여하는 것은 모두 본 개시내용의 목적을 위해 "동시" 투여인 것으로 간주된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 추가적인 치료적 활성 성분의 투여 "전에", "이와 동시에", 또는 "후에"(이들 용어는 본 명세서에 상기 정의된 바와 같음) 항-FXII 항체의 투여는 추가적인 치료적 활성 성분"과 조합하여" 항-FXII 항체를 투여하는 것으로 간주된다.
본 발명은 본 발명의 항-FXII 항체가 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 추가적인 치료적 활성 성분(들) 중 하나 이상과 공동-제형화된 약제학적 조성물을 포함한다.
항체의 진단 용도
본 발명의 항체는, 예를 들어 진단 목적으로 샘플에서 FXII를 검출하고/하거나 측정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태는 FXII-연관-질환 또는 장애를 검출하기 위한 분석에서 본 발명의 하나 이상의 항체의 사용을 고려한다. FXII에 대한 예시적인 진단 분석은, 예를 들어 환자로부터 수득한 샘플을 본 발명의 항-FXII 항체와 접촉시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 항-FXII 항체는 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지되거나 환자 샘플로부터 FXII를 선택적으로 단리시키는 포획 리간드로서 사용된다. 대안적으로, 표지되지 않은 항-FXII 항체는 그 자체로 검출 가능하게 표지된 제2 항체와 조합하여 진단 적용에서 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자는 방사성동위원소, 예컨대 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I; 형광성 또는 화학발광성 모이어티, 예컨대 플루오레세인 아이소싸이오시아네이트, 또는 로다민; 또는 효소, 예컨대 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 또는 루시페라제일 수 있다. 샘플에서 FXII를 검출하거나 측정하는 데 사용될 수 있는 구체적인 예시적 분석은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역측정법(RIA), 및 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 포함한다.
본 발명에 따른 FXII 진단 분석에 사용될 수 있는 샘플은 환자로부터 수득 가능한 임의의 조직 또는 유체 샘플을 포함하며, 상기 샘플은 정상적 또는 병리학적 조건 하에서 검출 가능한 양의 FXII 단백질, 또는 이의 단편을 포함한다. 일반적으로, 건강한 환자(예를 들어, FXII와 연관된 질환에 걸리지 않은 환자)로부터 수득한 특정 샘플 중 FXII 단백질의 수준을 측정하여 처음에 FXII의 기준, 또는 표준 수준을 설정할 것이다. 그 다음 이러한 FXII의 기준 수준을 FXII-연관 병태, 또는 이와 같은 병태와 연관된 증상이 있는 것으로 의심되는 개체로부터 수득한 샘플에서 측정된 FXII 수준에 대하여 비교할 수 있다.
FXII 단백질에 특이적인 항체는 추가적인 표지 또는 모이어티를 포함하지 않을 수 있거나, N-말단 또는 C-말단 표지 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 표지 또는 모이어티는 비오틴이다. 결합 분석에서, (존재하는 경우) 표지의 위치는 펩타이드가 결합된 표면에 대한 펩타이드의 방향을 결정할 수 있다. 예를 들어, 표면이 아비딘으로 코팅된 경우, N-말단 비오틴을 포함하는 펩타이드는 펩타이드의 C-말단 부분이 표면에서 원위에 있도록 배향될 것이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위하여 제시된 것으로, 발명자가 자신의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였으나, 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 단위이고, 실온은 약 25℃이며, 압력은 대기압 또는 그 근처이다.
실시예 1: 인자 XII/활성화 인자 XII( FXII / FXIIa ) 단백질에 대한 인간 항체의 생성
FXII/FXIIa 단백질에 대한 인간 항체를 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스에서 생성하였다. 마우스를 혈장 정제된 인간 FXII 및 FXIIa 단백질(Enzyme Research Laboratories사)로 면역화시켰다.
항-FXII 항체를, 본 명세서에 구체적으로 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제7582298호에 기재된 바와 같이, 골수종 세포로의 융합없이 항원-양성 마우스 B 세포로부터 직접 단리하였다. 이 방법을 사용하여, 몇 가지 완전한 인간 항-FXII 항체(즉, 인간 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 갖는 항체)를 수득하였고; 이러한 방식으로 생성된 예시적인 항체를 mAb26036, mAb26048, mAb26049 및 mAb26076으로 지정하였다.
이 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항체의 생물학적 특정은 하기 제시된 실시예에 상세히 기재되어 있다.
실시예 2: 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열
표 1은 본 발명의 선택된 항-FXII 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
본 명세서에 언급된 항체는 전형적으로 완전한 인간 가변 영역을 가지지만, 인간 또는 마우스 불변 영역을 가질 수 있다. 당업자가 이해할 바와 같이, 특정 Fc 아이소타입을 갖는 항체는 상이한 Fc 아이소타입을 갖는 항체로 전환될 수 있지만(예를 들어, 마우스 IgG1 Fc를 갖는 항체는 인간 IgG4 등을 갖는 항체로 전환될 수 있음), 아무튼 표 2에 나타낸 숫자 식별자로 표시되는 가변 도메인(CDR을 포함함)은 동일하게 유지될 것이며, 항원에 대한 결합 특성은 Fc 도메인의 특성에 관계없이 동일하거나 실질적으로 유사할 것으로 예측된다. 특정 실시형태에서, 마우스 IgG1 Fc를 갖는 선택된 항체는 인간 IgG4 Fc를 갖는 항체로 전환된다. 일 실시형태에서, IgG4 Fc 도메인은 미국 특허 공개 제20100331527호에 개시된 바와 같은 2가지 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 일 실시형태에서, 인간 IgG4 Fc는 힌지 영역에서 세린에서 프롤린으로의 돌연변이(S108P)를 포함하여 이량체 안정화를 촉진시킨다.
다음 실시예에서 사용되는 대조군 작제물
하기 대조군 작제물(항-FXII 항체)을 비교 목적으로 본 명세서에 개시된 실험에 포함하였다: "비교 1", US 특허 9,518,127(CSL Behring GmbH사)에 따른 항체 "3F7"의 VH/VL 서열을 갖는 인간 FXII/FXIIa에 대한 단클론성 항체; 및 "비교 2", 미국 특허 제9,574,013호(Vanderbilt Univ./Aronora사)에 따른 항체 "15H8"의 VH/VL 서열을 갖는 인간 FXII에 대한 인간 단클론성 항체.
실시예 3: 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정한 FXII에 대한 항체 결합
정제된 항-FXII 단클론성 항체에 대한 상이한 FXII 시약에 대한 평형 해리 상수(KD)를 실시간 표면 플라즈몬 공명을 기반으로 하는 Biacore 4000 바이오센서를 사용하여 결정하였다. 모든 결합 연구를 25℃ 및 37℃에서 10mM HEPES, 300mM NaCl, 및 0.05% v/v 계면활성제 트윈-20, pH 7.4(HBS-P) 실행 완충액 중에서 수행하였다. Biacore CM5 센서 칩 표면을 먼저 항-FXII 단클론성 항체를 포획하기 위해 마우스 항-인간 Fc 특이적 단클론성 항체(GE Healthcare사 Cat# BR100839)와 커플링한 아민에 의해 유도체화하였다. 인간 FXII 및 FXIIa(각각, Enzyme Research Laboratories사, Cat # 1212 및 1212a)에 대해 결합 연구를 수행하였다. hFXII 및 hFXIIa의 다양한 농도(50nM 내지 3.125nM; 2배 연속 희석)를 먼저 HBS-P 실행 완충액 중에서 제조하고, 항-인간 Fc 포획된 항-FXII 단클론성 항체 표면에 3분 동안 30㎕/분의 유속으로 주입하는 한편, 단클론성 항체 결합 FXII 시약의 해리를 HBS-P 실행 완충액 중에서 5분 동안 모니터링하였다. Scrubber 2.0c 곡선-피팅 소프트웨어를 사용하여 질량 수송 제한이 있는 1:1 결합 모델에 실시간 결합 센서그램을 피팅함으로써 결합 속도(k a ) 및 해리 속도(k d )를 결정하였다. 결합 해리 평형 상수(KD) 및 해리 반감기(t½)를 다음과 같이 운동 속도로부터 계산하였다:
K D (M) =
Figure pct00003
Figure pct00004
, 및 t ½ (분) =
Figure pct00005
Figure pct00006
25℃ 및 37℃에서 본 발명의 다양한 항-FXII 단클론성 항체에 대한 hFXII 또는 hFXIIa 결합에 대한 결합 동역학 매개변수는 표 3 내지 6에 나타내어져 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
25℃에서, 항체는 표 3에 나타낸 바와 같이 0.88nM 내지 3.12nM 범위의 KD 값으로 hFXII에 결합하였다. 37℃에서, 항체는 표 4에 나타낸 바와 같이 2.53nM 내지 16.8nM 범위의 KD 값으로 hFXII에 결합하였다.
25℃에서, 항체는 표 5에 나타낸 바와 같이 0.61nM 내지 5.07nM 범위의 KD 값으로 hFXIIa에 결합하였다. 37℃에서, 항체는 표 6에 나타낸 바와 같이 1.79nM 내지 8.25nM 범위의 KD 값으로 hFXIIa에 결합하였다.
실시예 4: 옥텟 교차-경쟁 분석
OctetHTX 바이오센서(Pall ForteBio Corp.) 상에서 실시간 무표지 생체층 간섭측정 분석을 사용하여 항-FXII 단클론성 항체 사이의 결합 경쟁을 결정하였다. 플레이트를 1000 rpm의 속도로 진탕시키면서 25℃에서 0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.05% v/v 계면활성제 트윈-20, 0.1㎎/㎖ BSA(Octet HBS-P 완충액) 중에서 전체 실험을 수행하였다. 2개의 항체가 인간 FXII(ERL) 상의 각각의 에피토프에 결합하기 위해 서로 경쟁할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 먼저 항-인간 FXII 단클론성 항체의 50 ㎍/㎖ 용액이 들어있는 웰에 항-hFC 항체로 코팅된 Octet 바이오센서 팁(Pall ForteBio Corp.사, # 18-5060)을 3분 동안 담금으로써 상기 팁 상으로 약 0.42 내지 0.53 ㎚의 항-인간 FXII 단클론성 항체(이후 mAb-1이라 지칭함)를 포획하였다. 그 다음 차단 mAb 아이소타입 대조군 단클론성 항체(이후 차단 mAb라 지칭함)의 200 ㎍/㎖ 용액이 들어있는 웰에 4분 동안 침지시킴으로써 항체가 포획된 바이오센서 팁을 차단 mAb로 포화시켰다. 그 다음 이어서 바이오센서 팁을, 2시간 동안 사전 인큐베이션시킨 25nM hFXII 및 1μM의 제2 항-인간 FXII 단클론성 항체(이후 mAb-2라 지칭함)의 공동-복합화 용액이 들어있는 웰에 침지시켰다. 바이오센서 팁을 모든 실험 단계 사이에 Octet HBS-P 완충액 중에서 세척하였다. 실험 과정 동안 실시간 결합 반응을 모니터링하였고 모든 단계 종료시 결합 반응을 기록하였다. mAb-1에 대한 인간 FXII 사전-복합화 mAb-2 결합의 반응을 배경 결합에 대해 보정하고, 비교하여 상이한 항-FXII 단클론성 항체의 경쟁적/비-경쟁적 거동을 결정하였다.
Figure pct00011
표 7은 결합 순서에 관계없이 양방향으로 경쟁하는 항체의 관계를 명시적으로 정의한다.
실시예 5: 항- FXII / FXIIa 항체의 저해 활성을 결정하기 위한 기능성 혈장 분석
이 실시예는 4가지 기능성 혈장 분석, 즉 1) 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 2) 프로트롬빈 시간(PT), 3) 엘라그산(ellagic acid)에 의해 촉발된 트롬빈 생성 분석(TGA) 및 4) 조직 인자에 의해 촉발된 TGA에 의해 결정된 바와 같은 선택된 항체의 저해 활성을 기재한다. aPTT는 칼슘과 엘라그산의 첨가 후 혈병이 형성되는 시간을 측정함으로써 응고 캐스케이드의 내인성 및 공통 경로의 모든 응고 인자를 평가하는 반면, PT 테스트는 칼슘 및 조직 인자의 첨가 후 응고 캐스케이드의 외인성 및 공통 경로의 모든 응고 인자를 평가한다. 엘라그산에 의해 촉발된 TGA는 내인성 및 공통 경로를 통해 생성된 트롬빈의 속도 및 양을 측정하는 반면, 조직 인자에 의해 촉발된 TGA는 외인성 및 공통 경로를 통해 생성된 트롬빈의 속도 및 양을 측정한다.
aPTT의 결정
aPTT는 다음과 같은 방식으로 Diagnostica Stago STart4 Hemostasis Analyzer에서 결정하였다: 총 50㎕의 풀링된 정상 인간 혈장을 37℃에서 큐벳에 첨가하였다. 1분 후, PBS 중 5㎕의 2× 연속 희석된 테스트 물품(항체 또는 소분자 저해제)을 큐벳에 첨가하고 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 50㎕의 APPT-XL 엘라그산(Thermo Scientific사)을 첨가하고 300초 동안 인큐베이션시킨 후 50㎕의 20mM 염화칼슘(Thermo Scientific사)을 첨가하여 반응을 시작하였다. 테스트 물품 농도에 대해 측정된 응고 시간을 기준(약물 없음) 혈장 응고 시간으로 정규화하고 테스트 물품의 로그(log) 몰 농도에 대해 플롯팅하였다. Prism 5 소프트웨어(GraphPad사)로 비선형 회귀(4-매개변수 로지스틱)를 사용하여 결과를 분석하여 2배의 시간대 농도를 얻었다.
PT의 결정
PT는 다음과 같은 방식으로 Diagnostica Stago STart4 Hemostasis Analyzer에서 결정하였다. 총 50㎕의 풀링된 정상 인간 혈장을 37℃에서 큐벳에 첨가하였다. 1분 후, PBS 중 5㎕의 2× 연속 희석된 테스트 물품(항체 또는 소분자 저해제)을 큐벳에 첨가하고 5분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 100㎕의 조직 인자(TriniCLOT PT 엑셀, Diagnostica Stago사)를 첨가하여 반응을 시작하였다. 테스트 물품 농도에 대해 측정된 응고 시간을 기준(약물 없음) 혈장 응고 시간으로 정규화하고 테스트 물품의 로그(log) 몰 농도에 대해 플롯팅하였다. Prism 5 소프트웨어(GraphPad사)로 비선형 회귀(4-매개변수 로지스틱)를 사용하여 결과를 분석하여 2배의 시간대 농도를 얻었다.
엘라그산을 이용한 TGA의 결정
트롬빈 생성 프로파일을 다음과 같은 방식으로 Thermo Scientific Hemker Thrombinoscope에서 결정하였다: 총 55㎕의 풀링된 정상 인간 혈장을 37℃에서 마이크로플레이트 웰에 첨가하였다. 그 다음 PBS 중 5㎕의 2× 연속 희석된 테스트 물품(항체 또는 소분자 저해제)을 마이크로플레이트의 웰에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션시켰다. 15㎕의 APPT-XL 엘라그산(Thermo Scientific사)을 MP 시약 중에 희석시킨 다음 웰에 첨가하고 45분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 15㎕의 Fluo Flu Cal 기질(Diagnostica Stago사)을 첨가한 직후 연속 90분 동안 마이크로플레이트를 판독하였다. 측정된 실시간 트롬빈 농도 값을 시간에 대해 플롯팅하여 사용된 테스트 물품의 각각의 농도에 대한 트롬보그램 프로파일(thrombogram profile)을 산출하였다.
조직 인자를 이용한 TGA의 결정
트롬빈 생성 프로파일을 다음과 같은 방식으로 Thermo Scientific Hemker Thrombinoscope에서 결정하였다: 총 55㎕의 풀링된 정상 인간 혈장을 37℃에서 마이크로플레이트 웰에 첨가하였다. 그 다음 PBS 중 5㎕의 2× 연속 희석된 테스트 물품(항체 또는 소분자 저해제)을 마이크로플레이트의 웰에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션시켰다. 15㎕의 조직 인자 PPP 시약(Diagnostica Stago사)을 웰에 첨가하고 45분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 15㎕의 Fluo Flu Cal 기질(Diagnostica Stago사)을 첨가한 직후 연속 90분 동안 마이크로플레이트를 판독하였다. 측정된 실시간 트롬빈 농도 값을 시간에 대해 플롯팅하여 사용된 테스트 물품의 각각의 농도에 대한 트롬보그램 프로파일을 산출하였다.
결과
용량 반응 곡선을 생성하여 혈장 aPTT 및 PT에 대한 각각의 약물의 효과를 결정하였다. IgG4 아이소타입 대조군 항체는 aPTT 또는 PT에 대하여 어떠한 영향도 미치지 않았다. 항-FXII/FXIIa 항체(mAb26036, mAb26048, mAb26049 및 mAb26076)는 PT를 증가시키지 않으면서 aPTT를 연장시켰다. 임상적으로 승인된 항응고 FXa 저해제인 아픽사반(Apixaban)은 uM 농도로 aPTT 및 PT를 둘 다 연장시켰다. 비교 1은 PT를 증가시키지 않으면서 aPTT를 연장시켰다. 응고 활성을 저해하는 약물의 효능은 임의의 "배가 시간" 농도 또는 C2xt(이는 응고 시간을 기준 값보다 2배 연장시키는 데 필요한 약물의 농도임)에 의해 연동된다. 약물에 대해 이러한 외삽된 C2xt 값(즉, "배가 시간 선"을 교차하는 곡선)은 표 8에 열거되어 있다.
Figure pct00012
항체 mAb26036, mAb26048 및 mAb26049는 200nM 이하로 C2xt에 도달한 반면, mAb26076은 250nM을 필요로 하였다. 모든 항체는 테스트된 최대 4 uM에서 PT 응고 시간을 2배로 늘리는 것으로 관찰되지 않았다. 아픽사반은 7 uM로 aPTT C2xt에 도달하였으며, 이는 PT C2xt를 달성하는 데 필요한 3.5 uM의 농도보다 큰 것이었다. 비교 1은 aPTT C2xt에 도달하는 데 250nM을 필요로 하였지만, 4 uM로 PT C2xt에 도달하지 않았다.
혈장이 엘라그산 또는 조직 인자에 의해 촉발될 때 트롬빈 생성을 저해하는 항체의 능력(즉, 트롬빈 검출까지의 연장된 시간 = 지연 시간, 트롬빈 피크의 감소 및 생성된 트롬빈 총량의 감소 = 내인성 트롬빈 잠재력)에 대하여 항체를 평가하였다. 아이소타입 대조군은 트롬빈 생성에 대하여 어떠한 영향도 미치지 않았다. 항체는 125nM에서 트롬빈 생성이 약간 감소하였지만 250nM 이상의 농도에서 트롬빈 생성을 상당히 또는 완전히 저해함을 나타내었으며, 이는 항체가 결국 트롬빈 생성을 방지하는 내인성 경로 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다. 아픽사반은 트롬빈 생성에서 용량 의존적 감소를 나타내었지만 사용된 최고 용량(500nM)에서 2× 지연 시간 또는 ETP의 ½ 또는 피크에 도달할 수 없었다. 비교 1은 500nM에서 거의 완전한 저해와 함께 트롬빈 생성에 대한 용량 의존적 효과를 나타내었다. 조직 인자에 의해 촉발된 트롬빈 생성은 대조군 아이소타입 항체에 의해 영향을 받지 않았다. 항체는 조직 인자에 의해 촉발된 트롬빈 생성을 저해하지 않았다. 아픽사반 용량은 조직 인자에 의해 촉발될 때 트롬빈 생성을 의존적으로 저해하였다. 비교 1은 조직 인자에 의해 촉발된 트롬빈 생성에 대해 어떠한 영향도 미치지 않았다. 응고가 엘라그산 또는 조직 인자에 의해 활성화될 때 지연 시간을 2배로 늘리고, 트롬핀 피크 및 트롬빈 생성의 총량을 절반으로 감소시키는 데 필요한 테스트 물품의 농도는 표 9에 요약되어 있다.
Figure pct00013
상기 결과는 예시된 항체가 외인성 경로를 저해하지 않으면서 내인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 저해함을 나타낸다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 구체적인 실시형태에 의해 범주가 제한되어서는 안된다. 실제로, 본 명세서에 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이와 같은 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> ANTI-FACTOR XII/XIIa ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> WO2019/246176 <140> PCT/US2019/037865 <141> 2019-06-19 <150> US 62/687,144 <151> 2018-06-19 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgacggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactatt tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gacttgagtg gatgggaata atcaacccca gtggtggtag cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggcgtg 300 actacagtga ctacttacta ccactactac aatatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 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tgactacagt gactacttac taccactact acaatatgga cgtc 54 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 8 Ala Arg Gly Val Thr Thr Val Thr Thr Tyr Tyr His Tyr Tyr Asn Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 9 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaaaag tataatactt accctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 11 cagggcatta gcaattat 18 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 12 Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 13 gctgcatcc 9 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 14 Ala Ala Ser 1 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 15 caaaagtata atacttaccc tctcact 27 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 16 Gln Lys Tyr Asn Thr Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 17 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 17 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctcgggggtc cctgagactc 60 tcctgtgtgg cctctggatt cacctttagc gactatggca tgagttgggt ccgacaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attggtggtg ctggtcatgg cacatattac 180 gctgactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaggaa cacgttgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acggccgtat attattgtgc gaaaaaatat 300 tactggaact acgtcggcgg tatggacgtc tggggccgag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Gly Gly Ala Gly His Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Lys Tyr Tyr Trp Asn Tyr Val Gly Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 19 ggattcacct ttagcgacta tggc 24 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 20 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly 1 5 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 21 attggtggtg ctggtcatgg caca 24 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 22 Ile Gly Gly Ala Gly His Gly Thr 1 5 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 23 gcgaaaaaat attactggaa ctacgtcggc ggtatggacg tc 42 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 24 Ala Lys Lys Tyr Tyr Trp Asn Tyr Val Gly Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 25 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 25 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca ggatattaac aactggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctctact gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcagtag cctacagcct 240 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtc tcccattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa a 321 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 27 caggatatta acaactgg 18 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 28 Gln Asp Ile Asn Asn Trp 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 29 actgcatcc 9 <210> 30 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 30 Thr Ala Ser 1 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 31 caacaggcta acagtctccc attcact 27 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 32 Gln Gln Ala Asn Ser Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 33 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 33 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcaat acctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gactggaata tatttcagct attgatacca aagggggttc cacatattat 180 gcagactctg tgaagggcag attcaccatt tccagagaca attccaagaa cgcgcagtat 240 cttcaaatgg acagcctgag agttgaagac atggctgttt attattgtgc gagagggttc 300 ggtctggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345 <210> 34 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 35 40 45 Ser Ala Ile Asp Thr Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala Gln Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Val Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Phe Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 35 ggattcacct tcaataccta tgct 24 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 36 Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala 1 5 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 37 attgatacca aagggggttc caca 24 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 38 Ile Asp Thr Lys Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 39 gcgagagggt tcggtctgga cgtc 24 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 40 Ala Arg Gly Phe Gly Leu Asp Val 1 5 <210> 41 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 41 gatgttgtga tgacccagtc tccactctcc ctggccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgga tacagtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120 tttcaacaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgacttcac actgaaaatc 240 aatagggtgg agactgtgga tgttggggtt tactactgca tgcaagctac acactggccg 300 tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336 <210> 42 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 42 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Gly Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Asn Arg Val Glu Thr Val Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 43 caaagcctcg gatacagtga tggaaacacc tac 33 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 44 Gln Ser Leu Gly Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 45 aaggtttct 9 <210> 46 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 46 Lys Val Ser 1 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 47 atgcaagcta cacactggcc gtacact 27 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 48 Met Gln Ala Thr His Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 49 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 49 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaatagtg ctgcttggaa ttggatcagg 120 cagtccccct cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggttt 180 aatgattatg cagtgtctgt gaaaagtcga ataatcatca acccagacac aaccaagaac 240 cagttctccc tgcaggtgaa ctctgtgact cccgaagaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agaggagagc cagctcgtcg gggtgaatac ttccaccact ggggccaggg caccctggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 50 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 50 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Phe Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Ile Ile Asn Pro Asp Thr Thr Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Val Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Pro Ala Arg Arg Gly Glu Tyr Phe His 100 105 110 His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 51 ggggacagtg tctctagcaa tagtgctgct 30 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 52 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala 1 5 10 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 53 acatactaca ggtccaagtg gtttaat 27 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 54 Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Phe Asn 1 5 <210> 55 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 55 gcaagaggag agccagctcg tcggggtgaa tacttccacc ac 42 <210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 56 Ala Arg Gly Glu Pro Ala Arg Arg Gly Glu Tyr Phe His His 1 5 10 <210> 57 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 57 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaa 324 <210> 58 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 58 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 59 cagagtgtta gcagcagcta c 21 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 60 Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 61 ggtgcatcc 9 <210> 62 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 62 Gly Ala Ser 1 <210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 63 cagcagtatg gtagctcacc ttggacg 27 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 64 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 65 <211> 615 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Met Arg Ala Leu Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Val Ser Leu Glu Ser 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Pro Pro Trp Glu Ala Pro Lys Glu His Lys Tyr Lys 20 25 30 Ala Glu Glu His Thr Val Val Leu Thr Val Thr Gly Glu Pro Cys His 35 40 45 Phe Pro Phe Gln Tyr His Arg Gln Leu Tyr His Lys Cys Thr His Lys 50 55 60 Gly Arg Pro Gly Pro Gln Pro Trp Cys Ala Thr Thr Pro Asn Phe Asp 65 70 75 80 Gln Asp Gln Arg Trp Gly Tyr Cys Leu Glu Pro Lys Lys Val Lys Asp 85 90 95 His Cys Ser Lys His Ser Pro Cys Gln Lys Gly Gly Thr Cys Val Asn 100 105 110 Met Pro Ser Gly Pro His Cys Leu Cys Pro Gln His Leu Thr Gly Asn 115 120 125 His Cys Gln Lys Glu Lys Cys Phe Glu Pro Gln Leu Leu Arg Phe Phe 130 135 140 His Lys Asn Glu Ile Trp Tyr Arg Thr Glu Gln Ala Ala Val Ala Arg 145 150 155 160 Cys Gln Cys Lys Gly Pro Asp Ala His Cys Gln Arg Leu Ala Ser Gln 165 170 175 Ala Cys Arg Thr Asn Pro Cys Leu His Gly Gly Arg Cys Leu Glu Val 180 185 190 Glu Gly His Arg Leu Cys His Cys Pro Val Gly Tyr Thr Gly Ala Phe 195 200 205 Cys Asp Val Asp Thr Lys Ala Ser Cys Tyr Asp Gly Arg Gly Leu Ser 210 215 220 Tyr Arg Gly Leu Ala Arg Thr Thr Leu Ser Gly Ala Pro Cys Gln Pro 225 230 235 240 Trp Ala Ser Glu Ala Thr Tyr Arg Asn Val Thr Ala Glu Gln Ala Arg 245 250 255 Asn Trp Gly Leu Gly Gly His Ala Phe Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp 260 265 270 Ile Arg Pro Trp Cys Phe Val Leu Asn Arg Asp Arg Leu Ser Trp Glu 275 280 285 Tyr Cys Asp Leu Ala Gln Cys Gln Thr Pro Thr Gln Ala Ala Pro Pro 290 295 300 Thr Pro Val Ser Pro Arg Leu His Val Pro Leu Met Pro Ala Gln Pro 305 310 315 320 Ala Pro Pro Lys Pro Gln Pro Thr Thr Arg Thr Pro Pro Gln Ser Gln 325 330 335 Thr Pro Gly Ala Leu Pro Ala Lys Arg Glu Gln Pro Pro Ser Leu Thr 340 345 350 Arg Asn Gly Pro Leu Ser Cys Gly Gln Arg Leu Arg Lys Ser Leu Ser 355 360 365 Ser Met Thr Arg Val Val Gly Gly Leu Val Ala Leu Arg Gly Ala His 370 375 380 Pro Tyr Ile Ala Ala Leu Tyr Trp Gly His Ser Phe Cys Ala Gly Ser 385 390 395 400 Leu Ile Ala Pro Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Gln Asp 405 410 415 Arg Pro Ala Pro Glu Asp Leu Thr Val Val Leu Gly Gln Glu Arg Arg 420 425 430 Asn His Ser Cys Glu Pro Cys Gln Thr Leu Ala Val Arg Ser Tyr Arg 435 440 445 Leu His Glu Ala Phe Ser Pro Val Ser Tyr Gln His Asp Leu Ala Leu 450 455 460 Leu Arg Leu Gln Glu Asp Ala Asp Gly Ser Cys Ala Leu Leu Ser Pro 465 470 475 480 Tyr Val Gln Pro Val Cys Leu Pro Ser Gly Ala Ala Arg Pro Ser Glu 485 490 495 Thr Thr Leu Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly His Gln Phe Glu Gly Ala 500 505 510 Glu Glu Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Glu Ala Gln Val Pro Phe Leu Ser 515 520 525 Leu Glu Arg Cys Ser Ala Pro Asp Val His Gly Ser Ser Ile Leu Pro 530 535 540 Gly Met Leu Cys Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Thr Asp Ala Cys Gln 545 550 555 560 Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Asp Gln Ala Ala Glu Arg 565 570 575 Arg Leu Thr Leu Gln Gly Ile Ile Ser Trp Gly Ser Gly Cys Gly Asp 580 585 590 Arg Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Asp Val Ala Tyr Tyr Leu Ala Trp 595 600 605 Ile Arg Glu His Thr Val Ser 610 615

Claims (32)

  1. 인자 XII(FXII)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 다음 특징 중 하나 이상을 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (a) 완전한 인간 단클론성 항체임;
    (b) 활성화된 인자 XII(FXIIa)에 결합함;
    (c) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 25℃에서 3.5nM 미만의 해리 상수(KD)로 FXII에 결합함;
    (d) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 37℃에서 17nM 미만의 KD로 FXII에 결합함;
    (e) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 25℃에서 5nM 미만, 바람직하게는 2.5nM 미만의 KD로 FXIIa에 결합함;
    (f) 표면 플라즈몬 공명 분석에서 측정할 때, 37℃에서 6.5nM 미만, 바람직하게는 2.5nM 미만의 KD로 FXIIa에 결합함;
    (g) 기능성 혈장 분석에 의해 측정할 때, 250nM 미만의 농도에서 내인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 차단함; 및
    (h) 기능성 혈장 분석에 의해 측정할 때, 외인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 차단하지 않으면서 내인성 경로에 의해 트롬빈 생성을 차단함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(HCVR) 내에 포함되는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3); 및 경쇄 가변 영역(LCVR) 내에 포함되는 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하되, 상기 HCVR은 표 1에 열거된 HCVR 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 표 1에 열거된 LCVR 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    (a) 서열번호 4, 20, 36 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 도메인;
    (b) 서열번호 6, 22, 38 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 도메인;
    (c) 서열번호 8, 24, 40 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR3 도메인;
    (d) 서열번호 12, 28, 44 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 도메인;
    (e) 서열번호 14, 30, 46 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 도메인; 및
    (f) 서열번호 16, 32, 48 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR3 도메인
    을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, (a) 서열번호 4, 6, 8, 12, 14 및 16; (b) 서열번호 20, 22, 24, 28, 30 및 32; (c) 서열번호 36, 38, 40, 44, 46 및 48; 및 (d) 서열번호 52, 54, 56, 60, 62 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42 및 50/58로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. FXII/FXIIa에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 HCVR 내에 포함되는 3개의 중쇄 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 LCVR 내에 포함되는 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고; 상기 HCVR은,
    (i) 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열.
    (ii) 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열,
    (iii) 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iv) 12개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열
    을 포함하고;
    상기 LCVR은,
    (i) 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열,
    (ii) 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열,
    (iii) 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iv) 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열
    을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제7항에 있어서, 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 내에 포함되는 3개의 CDR; 및 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 LCVR 내에 포함되는 3개의 CDR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42 및 50/58로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  12. 제7항에 있어서,
    (a) 서열번호 4, 20, 36 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 도메인;
    (b) 서열번호 6, 22, 38 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 도메인;
    (c) 서열번호 8, 24, 40 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR3 도메인;
    (d) 서열번호 12, 28, 44 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 도메인;
    (e) 서열번호 14, 30, 46 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 도메인; 및
    (f) 서열번호 16, 32, 48 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR3 도메인
    을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, (a) 서열번호 4, 6, 8, 12, 14 및 16; (b) 서열번호 20, 22, 24, 28, 30 및 32; (c) 서열번호 36, 38, 40, 44, 46 및 48; 및 (d) 서열번호 52, 54, 56, 60, 62 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제13항에 있어서, 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42 및 50/58로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 인자 XII에 대한 결합에 대해 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 서열번호 2, 18, 34 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCVR의 3개의 CDR; 및 서열번호 10, 26, 42 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR의 3개의 CDR을 포함하는 FXIIa 및 FXIIb로의 인자 XII 절단을 차단하는, 단리된 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 인자 XII/XIIa에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 제시된 바와 같은 항체의 HCVR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 제시된 바와 같은 항체의 LCVR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  23. 제21항 또는 제22항의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 벡터.
  24. 제23항의 벡터를 발현하는, 세포.
  25. 항-FXII/FXIIa 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법으로서, 항체 또는 단편의 생성을 허용하는 조건 하에서 제24항의 숙주 세포를 성장시키는 단계, 및 이와 같이 생성된 항체 또는 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 제형화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  27. 혈전의 형성을 예방하거나 혈전 형성의 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 치료적 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 대상체는 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 장치 혈전증, 혈전색전증, 유전성 혈관부종, 뇌졸중, 혈전성향증, 심허혈, 죽상경화판 파열, 기계식 인공 판막의 사용, 혈액-접촉 의료 장치의 사용, 혈액-접촉 체외 회로의 사용, 정맥 혈전색전증, 폐 색전증, 심부정맥 혈전증, 문맥 혈전증, 버드-키아리 증후군(Budd-Chiari syndrome), 파젯-슈뢰터 질환(Paget-Schroetter disease), 신정맥 혈전증, 대뇌 정맥 부비강 혈전증, 경정맥 혈전증, 해면정맥동 혈전증, 간동맥 혈전증, 하지 허혈 및 심근경색증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환, 장애 또는 병태를 갖는, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여되는, 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 제2 치료제와 조합하여 투여되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제2 치료제는 항응고제, 직접 트롬빈 저해제, 혈전용해 약물, 섬유소용해 약물, 항-혈소판 약물, 항-염증 약물, 항-고혈압 약물, 제2 항-FXII 항체, 지질-저하 약물, 기계적 혈병 회수, 카테터-유도 혈전용해, 압박 스타킹 및 수술로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 피하, 정맥내, 피내, 복강내, 근육내로 투여되는, 방법.
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