KR20210082207A - 항-npr1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배설항진 펩타이드 수용체 1 (NPR1) 단백질에 결합하는 모노클로날 항체, 및 이의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 구현예에서, 상기 항체는 NPR1에 결합하는 완전한 사람 항체이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 NPR1 활성을 활성화시키는데 유용하여, 사람에 있어서 NPR1과 연관된 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 수단을 제공한다.

Description

항-NPR1 항체 및 이의 용도

[001] 본 출원은 2019년 10월 18일자로 PCT 국제 특허 출원으로 출원되어 있으며, 2018년 10월 23일자로 출원된 미국 가출원 제62/749,557호; 및 2018년 11월 5일자로 출원된 제62/755,720호에 대한 우선권의 이득을 주장하고, 이들 각각의 개시 내용은 그 내용 전체가 본원에 참조로서 인용된다.

[002] 본 발명은 배설항진 (natriuretic) 펩타이드 수용체 1 (NPR1)에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 항체의 항원 결합 단편, 및 이들 항체를 사용하는 치료 및 진단 방법에 관한 것이다.

[003] 배설항진 펩타이드 수용체 1 (NPR1; 또한 NPR-A로서 공지된)은 GTP의 사이클릭 GMP로의 전환을 촉매하는 효소인 구아닐릴 사이클라제 수용체의 세포-표면 패밀리에 속한다. NPR1은 신장, 폐, 부신, 혈관계, 뇌, 간, 내피 및 지방 조직에서 고도로 발현되고 심장에서는 보다 낮은 수준으로 발현된다. 이것은 심방 배설항진 펩타이드 (ANP) 또는 뇌 배설항진 펩타이드 (BNP)에 결합함에 의해 활성화된다. NPR1 활성화 및 신호전달은 많은 조직을 포함하는 많은 생리학적 반응을 자극한다. ANP-NPR1 시스템은 혈관이완, 배설항진, 이뇨, 내피 투과성에서 및 지질분해 및 면역 세포 기능과 같은 비-심혈관 기능에서의 이의 역할에 대해 널리 연구되었다(문헌참조: Potter 2011, Pharmacol. Ther. 130: 71-82). NPR1의 활성화는 배설항진 (신장에 의한 염의 분비)를 유도하고 혈압을 저하시킨다.

[004] NPR1에 대한 모노클로날 항체는 최초로 문헌(참조: Kitano et al in 1995 in Immunol. Lett. 47: 215-22)에 의해 기재되었다. 활성화 또는 효능제 항-NPR1 항체는 예를 들어, 미국 특허/공개 번호 제9090695호, 및 제20160168251호, 및 WO2010065293에 기재되어 있다.

[005] 고친화성으로 NPR1 단백질에 특이적으로 결합하고 이를 활성화시키는 완전한 사람 항체는 예를 들어, 고혈압, 비만 및 심부전증의 예방 및 치료에 중요할 수 있다.

발명의 간단한 요약

[006] 본 발명은 배설항진 펩타이드 수용체 1 (NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, 항-NPR1 항체는 고친화성으로 NPR1에 결합하고 NPR1을 활성화시키거나 활성화된 형태를 안정화시키는 완전한 사람 항체이다. 본 발명의 항체는 특히 NPR1 단백질을 활성화시키거나 이의 활성을 증가시키기 위해 유용하다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 대상체에서 NPR1-관련 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후를 예방, 치료 또는 개선하는데 있어서 유용하다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 NPR1-관련 질환 또는 장애를 앓거나 이러한 질환 또는 장애에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 고혈압을 앓는 대상체에서 전신 혈압을 감소시키기 위해 사용된다. 상기 항체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 심부전증과 같은 장애에 대한 치료제로서 사용될 수 있다.

[007] 특정 구현예에서, 상기 항체는 심방 배설항진 펩타이드 (ANP) 또는 뇌 배설항진 펩타이드 (BNP)의 존재 또는 부재하에 NPR1에 결합하고, 즉, 항체는 “펩타이드-독립적 결합제”이다. 상기 항체는 이들이 상이한 농도의 내인성 리간드에 상관 없이 NPR1에 결합하고 활성화시키기 위해 사용될 수 있음으로 유리하다. 상기 항체는 이를 필요로 하는 환자에게 투여되는 경우 치료에서 환자-대-환자 가변성 (리간드 농도와 관련하여)을 회피하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 항체는 고친화성으로 NPR1에 결합하고 개선된 약동학적 성질 (표준 치료 약물과 비교하여)을 갖는다. 항체는 25 mg/kg의 용량에서 마우스에서 최대 11일까지의 t ½을 나타냈다. 항체는 혈압을 저하시키고 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 28일 만큼 긴 기간 동안 상기 저하된 압력을 유지하는데 효과적이다. 본 발명의 단일 용량의 항체는 혈압 중에 지속적인 감소를 유도하였다. 상기 항체는 NPR1-관련 질환 또는 장애(예를 들어, 고혈압)가 있는 대상체에서 투약 빈도의 감소와 함께 월등한 효능을 제공하는데 사용될 수 있다.

[008] 본 발명의 항체는 전장 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체)일 수 있거나, 또는 항원 결합 부분 (예를 들어, Fab, F(ab’)₂ 또는 scFv 단편)만을 포함할 수 있으며, 기능성에 영향을 주기 위해, 예를 들어, 숙주 내에서의 지속성을 증가시키기 위해, 또는 잔류 이펙터 기능을 제거하기 위해 변형될 수 있다 (문헌참조: Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). 특정 구현예에서, 상기 항체는 이중특이적일 수 있다.

[009] 제1 양상에서, 본 발명은 NPR1에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 모노틀로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

[010] 일부 구현예에서, 본 발명은 배설항진 펩타이드 수용체 (NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 수소/중수소 교환법으로 측정시 NPR1의 세포외 도메인(서열번호 194의 아미노산 29-347)내 함유된 하나 이상의 아미노산과 상호작용하고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: (i) 심방 배설항진 펩타이드 (ANP)의 존재 또는 부재하에 사람 NPR1을 발현하는 세포에 결합하고/하거나 (ii) NPR1에 결합하고 NPR1을 활성화시킨다.

[011] 일부 구현예에서, 상기 항체는 전장 사람 모노클로날 항체이다.

[012] 본 발명의 예시적인 항-NPR1 항체를 본원의 표 1과 2에 열거한다. 표 1은 예시적인 항체의 중쇄 가변 영역 (HCVR), 경쇄 가변 영역 (LCVR), 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR) (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별기호를 제시하고 있다. 표 2는 예시적인 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 핵산 서열 식별기호를 제시하고 있다.

[013] 본 발명은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중의 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

[014] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중의 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

[015] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열과 쌍을 이루는 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중의 임의의 것을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 쌍 (HCVR/LCVR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에 따르면, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항-NPR1 항체 내에 포함된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현에에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열번호 2/10 (예를 들어, mAb22033), 및 66/74 (예를 들어, mAb22810) 중 하나로부터 선택된다.

[016] 본 발명은 12개 이하의 아미노산 치환을 갖는 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, 및 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 HCVR은 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 예에서, 본 발명은 HCVR 및 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 LCVR은 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 갖는다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 HCVR, 및 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

[017] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 중의 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (HCDR1)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

[018] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 중의 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 (HCDR2)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

[019] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중의 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

[020] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 중의 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (LCDR1)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

[021] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 중의 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 (LCDR2)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

[022] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중의 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

[023] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 임의의 것과 쌍을 이루는 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중의 임의의 것을 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍 (HCDR3/LCDR3)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에 따르면, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항-NPR1 항체 내에 포함된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현에에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열번호 8/16 (예를 들어, mAb22033), 및 72/80 (예를 들어, mAb22810)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

[024] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR, 및 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 HCVR; 및 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 표 1에 열거된 아미노산 서열과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 4와 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 6과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8와 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 HCVR; 및 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 본 발명은 HCVR; 및 서열번호 12의 아미노산 서열 또는 서열번호 12와 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열 또는 서열번호 14와 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16과 1개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

[025] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체 중에 함유된 6개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현에에서, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 서열번호 4-6-8-12-14-16 (예를 들어, mAb22033), 및 68-70-72-76-78-80 (예를 들어, mAb22810)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

[026] 관련 구현예에서, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체에 의해 정의된 바와 같은 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 6개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열번호 2/10 (예컨대, mAb22033), 및 66/74 (예컨대, mAb22810)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 동정하기 위한 방법 및 기술은 당업계에 널리 공지되어 있으며 본원에 개시된 특정 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 동정하는데 사용될 수 있다. CDR의 경계를 확인하는데 사용될 수 있는 예시적인 방법으로는, 예를 들어, 카바트(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, 및 AbM 정의를 포함한다. 일반적으로, 카바트 정의는 서열 변동성을 기반으로 하고, 코티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 하며, AbM 정의는 카바트와 코티아 접근 방법을 절충한 것이다. 예를 들어, 문헌( Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); and Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989))을 참조한다. 공용 데이터베이스도 항체 내의 CDR 서열을 동정하는데 활용될 수 있다.

[027] 특정 구현예에서, 본 발명은 NPR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 (HCVR) 내에 포함된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3); 및 경쇄 가변 영역 (LCVR) 내에 포함된 3개의 경쇄 CDR (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, 상기 HCVR은: (i) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열; (ii) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열; (iii) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는 (iv) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 12개 이하의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 상기 LCVR은: (a) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 및 186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열; (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 및 186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열; (c) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 및 186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는 (d) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 및 186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

[028] 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명은 효능제 방식으로 NPR1에 특이적으로 결합하고, 즉 NPR1 결합 및/또는 활성을 강화하거나 유도하는 항체를 포함한다.

[029] 본 발명은 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항-NPR1 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 바람직하지 않은 글리코실화 부위를 제거하기 위한 변형, 예를 들어, 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위해 올리고사카라이드 쇄 상에 존재하는 푸코스 잔기가 결핍된 항체가 유용할 수 있다(참조; Shield et al. (2002) JBC 277:26733). 또 다른 응용에서, 보체 의존성 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화의 변형이 이루어질 수 있다.

[030] 특정 구현예에서, 본 발명은 NPR1에 대한 pH-의존성 결합을 나타내는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 산성 pH에서 보다 중성 pH에서 더 높은 친화성(즉, 산성 pH에서 감소된 결합)으로 NPR1에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

[031] 또한, 본 발명은 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 NPR1로의 특이적 결합에 대해 경쟁하는 항체 및 이의 항원 결합 단편도 제공하는데, 여기서 상기 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

[032] 또한, 본 발명은 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하는 참조 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 NPR1로의 결합에 대해 교차 경쟁하는 항체 및 이의 항원 결합 단편도 제공하는데, 여기서 상기 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

[033] 또한, 본 발명은 HCVR의 3개의 CDR 및 LCVR의 3개의 CDR을 포함하는 참조 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편도 제공하는데, 여기서 상기 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

[034] 본 발명은 또한 이의 리간드 (예를 들어, ANP 또는 BNP)로의 NPR1 결합을 증가시키거나 안정화시키는 단리된 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, NPR1의 ANP로의 결합을 활성화시키는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NPR1 상에 ANP와 동일한 에피토프에 결합할 수 있거나, NPR1 상에 ANP와 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.

[035] 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 NPR1의 제1 에피토프에 대한 제1 결합 특이성 및 NPR1의 제2 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적이며, 여기서, 상기 제1 및 제2 에피토프는 별개로서 중첩되지 않는다.

[036] 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 하기의 특징을 갖는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다: (a) 완전한 사람 모노클로날 항체이고; (b) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 및/또는 BNP의 부재하에 단량체 사람 NPR1에 결합하고 해리 상수 (K_D)는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 690nM 미만이고; (c) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 또는 BNP의 부재하에 이량체 사람 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 42nM 미만이고; (d) 25℃에서 및 37℃에서 ANP와 복합체화된 사람 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 80nM 미만이고; (e) 25℃에서 및 37℃에서 BNP와 복합체화된 사람 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 20nM 미만이고; (f) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 및/또는 BNP의 부재하에 단량체 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 365nM 미만이고; (g) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 또는 BNP의 부재하에 이량체 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 30nM 미만이고; (h) 25℃에서 및 37℃에서 ANP와 복합체화된 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 10nM 미만이고; (i) 25℃에서 및 37℃에서 BNP와 복합체화된 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 10nM 미만이고; (J) 마우스 NPR1에 결합하지 않고; (k) 사람 NPR1 (ANP 부재) 또는 ANP에 복합체화된 NPR1을 발현하는 세포에 결합하고, EC₅₀은 5nM 미만이고; (l) NPR1을 활성화시키고 칼슘 플럭스 세포 기반 생검정에서 측정시 EC₅₀이 385nM 미만이고; (m) 정상 혈압 및 고혈압 마우스에 투여되는 경우 전신 혈압을 감소시키고, 여기서, 전신 및 평균 동맥 혈압에서의 감소는 단일 용량의 투여 시 최대 28일 동안 지속하고; (n) 식이-유도된 비만 마우스에게 투여되는 경우, 내당성을 개선시키고; (o) 표 1에 열거된 HCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 및 표 1에 열거된 LCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCVR를 포함한다.

[037] 제2 양태에서, 본 발명은 항-NPR1 항체 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 HCVR 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCVR 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

[038] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 LCVR 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCVR 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

[039] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 HCDR1 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCDR1 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

[040] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 HCDR2 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCDR2 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

[041] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 HCDR3 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCDR3 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

[042] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 LCDR1 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCDR1 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

[043] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 LCDR2 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCDR2 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

[044] 또한, 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 LCDR3 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하고; 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCDR3 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

[045] 또한, 본 발명은 HCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는데, 여기서 상기 HCVR은 3개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3)를 포함하고, 상기 HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체에 의해 정의된 바와 같다.

[046] 또한, 본 발명은 LCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는데, 여기서 상기 LCVR은 3개의 CDR의 세트 (즉, LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하고, 상기 LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 임의의 예시적인 항체에 의해 정의된 바와 같다.

[047] 또한, 본 발명은 HCVR 및 LCVR 둘다를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는데, 여기서 상기 HCVR은 표 1에 열거된 임의의 HCVR 아미노산 서열 중의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCVR은 표 1에 열거된 임의의 LCVR 아미노산 서열 중의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCVR 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 표 1에 열거된 임의의 LCVR 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 상기 양상에 따른 특정 구현예에서, 상기 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 암호화하고, 여기서 HCVR 및 LCVR은 둘다 표 1에 열거된 동일한 항-NPR1 항체로부터 유래한다.

[048] 관련 양상에서, 본 발명은 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 상기 언급한 임의의 핵산 분자, 즉, 표 2에 기재된 바와 같은 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 서열 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 발현 벡터를 제공한다: (a) NPR1에 결합하는 항체의 HCVR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 HCVR이 표 1에 열거된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 분자; 및/또는 (b) NPR1에 결합하는 항체의 LCVR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 LCVR이 표 1에 열거된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 분자. 또한, 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포 뿐만 아니라 항체 또는 항체 단편의 생산을 가능케 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하고, 이렇게 하여 생산된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 이의 부분을 제조하는 방법도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포 또는 원핵 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli (이. 콜리(E. Coli)) 세포이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 상기 숙주 세포를 핵산 서열의 발현을 위해 선호될 수 있는 조건하에 배양하는 단계; 및 상기 배양 배지 및/또는 숙주 세포로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함한다. 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 정제될 수 있다.

[049] 제3 양상에서, 본 발명은 NPR1에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 관련 양상에서, 본 발명은 항-NPR1 항체와 제2 치료학적 제제의 조합물인 조성물을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 상기 제2 치료학적 제제는 항-NPR1 항체와 유리하게 조합되는 임의의 제제이다. 항-NPR1 항체와 유리하게 조합될 수 있는 예시적인 제제로는, 제한없이, NPR1과 결합하고/하거나 NPR1 활성을 활성화시키는 기타 제제 (다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 등을 포함) 및/또는 NPR1에 직접적으로는 결합하지 않지만 NPR1-관련 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후(본원의 다른 곳에 기재된)를 치료하거나 개선시키는 제제를 포함한다. 본 발명의 항-NPR1 항체가 관여하는 추가의 조합 치료요법 및 보조 제형들은 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.

[050] 제4 양상에서, 본 발명은 항-NPR1 항체 또는 본 발명의 항체의 항원 결합 부분을 사용하여 대상체에서 NPR1과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료학적 방법을 제공하는데, 여기서 상기 치료학적 방법은 항체 또는 본 발명의 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료되는 장애는 NPR1 활성 (예를 들어, 고혈압)에 의해 개선되거나, 개량되거나, 억제되거나 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 NPR1-관련 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NPR1-관련 질환 또는 장애를 앓거나 이에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이를 필요로 하는 대상체에게 제2 치료제와 병용하여 투여된다. 제2 치료학적 제제는 알도스테론 길항제, 알파-아드레날린성 차단제, 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제, 세동맥 혈관확장제, 자율 신경절 혈관확장제, 베타-아드레날린 차단제, 카테콜라민-고갈 교감신경 차단제, 중추 알파-2 아드레날린 효능제, 칼슘 채널 차단제, 이뇨제, 레닌 억제제, 항-응고제, 항-혈소판 제제, 콜레스테롤 저하제, 혈관확장제, 강심제(digitalis), 수술, 이식가능한 디바이스, 항-종양 치료요법, 인슐린, GLP1 효능제, 메트포르민, 투석, 골수 자극제, 혈액여과, 생활양식 변경, 식이 보충물 및 당업계에 공지된 임의의 다른 약물 또는 치료요법으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 제2 치료학적 제제는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 관련하여 가능한 임의의 부작용(들) (이러한 부작용(들)이 발생하는 경우)을 해소 또는 감소시키는데 도움이 되는 제제일 수 있다. 상기 항체 또는 이의 단편은 피하, 정맥내, 피내, 복막내, 경구, 또는 근육내로 투여할 수 있다. 상기 항체 또는 이의 단편은 대상체의 체중 1 kg당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 용량으로 투여할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 10mg 내지 600 mg을 포함하는 1회 이상의 용량으로 투여할 수 있다.

[051] 또한, 본 발명은 NPR1 결합 및/또는 활성의 활성화로부터 유익할 수 있는 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 포함한다.

[052] 다른 구현예는 계속되는 발명의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.

[053] 도 1은 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 수축기 혈압에 대한 선택된 항 -NPR1 효능제 항체의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 체중에 따라 무작위로 그룹으로 분류되었다. 동물에 표 30에 기재된 바와 같은 NPR1 효능제 항체 또는 PBS 대조군을 단일 25mg/kg의 피하 주사로 투여하였다. 모든 값은 3 내지 7일 동안 기준선으로부터 평균 변화 ± SEM, 그룹 당 n=3-9이다. 통계 - 듀네트(Dunnett)의 일원 ANOVA; * p <.05 vs. PBS 대조군.
[054] 도 2는 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 수축기 혈압에 대한 항-NPR1 항체 mAb22033의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 체중을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 표 32에 열거된 용량으로 mAb22033의 단일 피하 주사가 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-6이다. 통계-듀네트의 이원-ANOVA.
[055] 도 3은 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 확장기 혈압에 대한 항-NPR1 항체 mAb22033의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 체중을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 표 32에 열거된 용량으로 mAb22033의 단일 피하 주사가 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-6이다. 통계-듀네트의 이원-ANOVA.
[056] 도 4는 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 심박수에 대한 항-NPR1 항체 mAb22033의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 체중을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 표 32에 열거된 용량으로 mAb22033의 단일 피하 주사가 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-6이다. 통계-듀네트의 이원-ANOVA.
[057] 도 5는 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 평균 동맥 혈압에 대한 항-NPR1 항체 mAb22033의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 체중을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 표 32에 열거된 용량으로 mAb22033의 단일 피하 주사가 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-6이다. 통계-듀네트의 이원-ANOVA.
[058] 도 6a 및 6b는 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 좌심실 기능에 대한 항-NPR1 항체 mAb22033의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1 ^hu/hu 마우스에서 (도 6a) 최종 수축기 용적 (%); 및 (도 6b) 최종 확장기 용적 (%)는 균등한 체중을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 표 32에 열거된 용량으로 mAb22033의 단일 피하 주사가 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 고주파 초음파 시스템 및 프로브를 사용하여 투여 후 28 일에 단축에 마취된 마우스에 대한 심장 초음파 검사를 수행하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=6-7이다. 통계 - 듀네트의 일원 ANOVA; * p <.05 vs. IgG4 이소타입 대조군.
[059] 도 7a 및 7b는 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 좌심실 기능에 대한 항-NPR1 항체 mAb22033의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1 ^hu/hu 마우스에서 (도 7a) 분획 단축화 (%); 및 (도 7b) 배출 분획 (%)은 균등한 체중을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 표 32에 열거된 용량으로 mAb22033의 단일 피하 주사가 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 고주파 초음파 시스템 및 프로브를 사용하여 투여 후 28 일에 단축에 마취된 마우스에 대한 심장 초음파 검사를 수행하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=6-7이다. 통계-듀네트의 일원-ANOVA.
[060] 도 8은 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 수축기 혈압에 대한 2개 항-NPR1 항체의 단일 용량의 효과를 보여준다. 원격 측정된 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 수축기 혈압을 기준으로 무작위로 6개 그룹으로 분류되었고 표 36에 열거된 용량으로 mAb22033 또는 mAb22810의 단일 피하 용량이 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=4-6이다. 통계 - 듀네트의 이원 ANOVA; *p<.05 mAb22033 25 mg/kg vs. 대조군; #p<.05 mAb22033 5 mg/kg vs. 대조군; !p<.05 mAb22810 19 mg/kg vs. 대조군.
[061] 도 9는 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 확장기 혈압에 대한 2개 항-NPR1 항체의 단일 용량의 효과를 보여준다. 원격 측정된 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 수축기 혈압을 기준으로 무작위로 6개 그룹으로 분류되었고 표 36에 열거된 용량으로 mAb22033 또는 mAb22810의 단일 피하 용량이 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=3-6이다. 통계 - 듀네트의 이원 ANOVA; *p<.05 mAb22033.25 mg/kg vs. 대조군; #p<.05 mAb22033.5 mg/kg vs. 대조군; !p<.05 mAb22810.19 mg/kg vs. 대조군; %p<.05 mAb22810 5 mg/kg vs. 대조군
[062] 도 10은 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 심박수에 대한 2개 항-NPR1 항체의 단일 용량의 효과를 보여준다. 원격 측정된 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 수축기 혈압을 기준으로 무작위로 6개 그룹으로 분류되었고 표 36에 열거된 용량으로 mAb22033 또는 mAb22810의 단일 피하 용량이 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=3-6이다. 통계 - 듀네트의 이원 ANOVA; *p<.05 mAb22033 25 mg/kg vs. 대조군; #p<.05 mAb22033 5 mg/kg vs. 대조군.
[063] 도 11은 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 평균 동맥 혈압에 대한 2개 항-NPR1 항체의 단일 용량의 효과를 보여준다. 원격 측정된 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 수축기 혈압을 기준으로 무작위로 6개 그룹으로 분류되었고 표 36에 열거된 용량으로 mAb22033 또는 mAb22810의 단일 피하 용량이 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=3-6이다. 통계 - 듀네트의 이원 ANOVA; *p<.05 mAb22033 25 mg/kg vs. 대조군; #p<.05 mAb22033 5 mg/kg vs. 대조군; !p<.05 mAb22810 19 mg/kg vs. 대조군.
[064] 도 12는 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 수축기 혈압에 대한 항-NPR1 항체의 단일 및 반복적 용량의 효과를 보여준다. 원격 측정된 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 수축기 혈압을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 3주 동안 표 40에 열거된 용량으로 mAb22033이 매주 단일 피하 용량 또는 2회 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=3-6이다. 화살표는 마우스에 투여된 용량을 나타낸다. 통계 - 듀네트의 이원 ANOVA; *p<.05 mAb22033 25 mg/kg vs. 대조군; #p<.05 mAb22033 5 mg/kg vs. 대조군; !p<.05 mAb22033 50 mg/kg vs. 대조군.
[065] 도 13은 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 확장기 혈압에 대한 항-NPR1 항체의 단일 및 반복적 용량의 효과를 보여준다. 원격 측정된 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 수축기 혈압을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 3주 동안 표 40에 열거된 용량으로 mAb22033이 매주 단일 피하 용량 또는 2회 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=3-6이다. 화살표는 마우스에 투여된 용량을 나타낸다. 통계-듀네트의 이원-ANOVA.
[066] 도 14는 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 심박수에 대한 항-NPR1 항체의 단일 및 반복적 용량의 효과를 보여준다. 원격 측정된 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 수축기 혈압을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 3주 동안 표 40에 열거된 용량으로 mAb22033이 매주 단일 피하 용량 또는 2회 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=3-6이다. 화살표는 마우스에 투여된 용량을 나타낸다. 통계-듀네트의 이원-ANOVA.
[067] 도 15는 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 평균 동맥 혈압에 대한 항-NPR1 항체의 단일 및 반복적 용량의 효과를 보여준다. 원격 측정된 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스는 균등한 수축기 혈압을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 3주 동안 표 40에 열거된 용량으로 mAb22033이 매주 단일 피하 용량 또는 2회 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=3-6이다. 화살표는 마우스에 투여된 용량을 나타낸다. 통계 - 듀네트의 이원 ANOVA; *p<.05 mAb22033 25 mg/kg vs. 대조군; #p<.05 mAb22033 5 mg/kg vs. 대조군; !p<.05 mAb22033 50 mg/kg vs. 대조군.
[068] 도 16a 및 16b는 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 심장 기능에 대한 항-NPR1 항체의 단일 및 반복적 용량의 효과를 보여준다. 원격 측정된 정상 혈압 NPR1 ^hu/hu 마우스에서 (도 16a) 최종 수축기 용적 (%); 및 (도 16b) 최종 확장기 용적 (%)은 균등한 수축기 혈압을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 표 40에 열거된 용량으로 3주 동안 mAb22033이 매주 단일 피하 용량 또는 2회 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 고주파 초음파 시스템 및 프로브를 사용하여 투여 후 21 일에 단축에 마취된 마우스에 대한 심장 초음파 검사를 수행하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=5-6이다. 통계-듀네트의 일원-ANOVA.
[069] 도 17a 및 17b는 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 심장 기능에 대한 항-NPR1 항체의 단일 및 반복적 용량의 효과를 보여준다. 원격 측정된 고혈압 NPR1 ^hu/hu 마우스에서 (도 17a) 분획 단축화 (%); 및 (도 17b) 배출 분획 (%)은 균등한 수축기 혈압을 기준으로 무작위로 5개 그룹으로 분류되었고 표 40에 열거된 용량으로 3주 동안 mAb22033이 매주 단일 피하 용량 또는 2회 투여되었다. IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 고주파 초음파 시스템 및 프로브를 사용하여 투여 후 21 일에 단축에 마취된 마우스에 대한 심장 초음파 검사를 수행하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=5-6이다. 통계-듀네트의 일원-ANOVA.
[070] 도 18a는 mAb22810 NPR1 효능제 mAb, hFc.FGF21 또는 이소타입 대조군 mAb의 투여 후 체중에서 변화를 보여준다. 도 18b 및 도 18c는 각각 EchoMRI에 의한 측정시 치료 6 주 후의 총 지방량 및 총 제지방량을 보여준다. NPR1 사람화된 마우스는 이들을 10주 동안 60% 고지방 식이에 부과함에 의해 비만이 되게 하였다. 상기 기간 후, 마우스는 균등한 체중을 기준으로 무작위로 3개 그룹으로 분류되었고 표 44에 열거된 용량 및 빈도로 치료제의 피하 주사가 투여되었다. 사람 IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=10이다. * = P < 0.05 vs 이소타입 대조군; ** = P < 0.01 vs 이소타입 대조군. 체중에 대한 이원 ANOVA + 터키, 지방량 및 제지방량에 대한 일원 ANOVA + 본페로니(Bonferonni)에 의한 통계.
[071] 도 19a 및 19b 및 19c는 mAb22810 NPR1 효능제 mAb, hFc.FGF21 또는 이소타입 대조군 mAb를 사용한 치료 1주 후 각각 낮/밤(day/night) 사이클의 평균으로서 분류된 VO₂ (도 19a), VCO₂ (도 19b) 또는 에너지 소비 (도 19c)에서의 변화를 보여준다. 치료 1주 후, 각각의 그룹 기원의 마우스는 1주 동안 콜럼비아 장비 대사 케이지 시스템 (CLAMS)에 넣어 대사 파라미터를 기록하였다. 마우스는 측정 전 1주 동안 케이지에 적응시켜 스트레스를 최소화하였다. 사람 IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=5-6이다. **= P < 0.01 vs 이소타입 대조군; *** = P < 0.001 vs 이소타입 대조군. 일원 ANOVA + 본페로니에 의한 통계.
[072] 도 20a는 mAb22810 NPR1 효능제 mAb, hFc.FGF21 또는 이소타입 대조군 mAb을 사용한 치료의 2주 후 경구 내당성 시험 (2g/kg 글루코스)에 의해 측정된 바와 같은 내당성에서의 변화를 보여준다. 도 20b는 A에서의 연구 개시에서 기록된 바와 같이 밤새 단식 후 글루코스 수준을 보여준다. 치료 2주 후, 각각의 그룹으로부터의 마우스는 청결한 케이지에서 밤새 단식시키고 다음날 아침에 2g/kg의 경구 글루코스 부하량을 투여하였다. 이어서 글루코스는 T0, T15, T30, T60, T90 및 T120에서 휴대용 당 측정기를 사용하여 꼬리 정맥에 의해 기록하였다. 사람 IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=10이다. hFc.FGF21 그룹: ** = P < 0.01 vs 이소타입 대조군, *** = P < 0.001 vs 이소타입 대조군, **** = P < 0.0001 vs 이소타입 대조군. mAb22810 그룹: ++ = P < 0.01 vs 이소타입 대조군. oGTT에 대한 이원 ANOVA + 본페로니, 공복 글루코스에 대한 일원 ANOVA + 본페로니에 의한 통계.
[073] 도 21a는 mAb22033 NPR1 효능제 mAb, hFc.FGF21 또는 이소타입 대조군 mAb의 투여 후 체중에서의 변화를 보여준다. 도 21b 및 도 21c는 각각 EchoMRI에 의한 측정시 치료 6 주 후의 총 지방량 및 총 제지방량을 보여준다. NPR1 사람화된 마우스는 이들을 10주 동안 60% 고지방 식이에 부과함에 의해 비만이 되게 하였다. 상기 기간 후, 마우스는 균등한 체중을 기준으로 무작위로 3개 그룹으로 분류되었고 표 45에 열거된 용량 및 빈도로 치료제의 피하 주사가 투여되었다. 사람 IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=10이다. * = P < 0.05 vs 이소타입 대조군; **** = P < 0.0001 vs 이소타입 대조군. 체중에 대한 이원 ANOVA + 터키, 지방량 및 제지방량에 대한 일원 ANOVA + 본페로니(Bonferonni)에 의한 통계.
[074] 도 22a, 22b 및 22c는 mAb22033 NPR1 효능제 mAb, hFc.FGF21 또는 이소타입 대조군 mAb를 사용한 치료 1주 후 각각 낮/밤(day/night) 사이클의 평균으로서 분류된 VO₂ (도 22a), VCO₂ (도 22b) 또는 에너지 소비 (도 22c)에서의 변화를 보여준다. 치료 1주 후, 각각의 그룹 기원의 마우스는 1주 동안 콜럼비아 장비 대사 케이지 시스템 (CLAMS)에 넣어 대사 파라미터를 기록하였다. 마우스는 측정 전 1주 동안 케이지에 적응시켜 스트레스를 최소화하였다. 사람 IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=5-6이다. **** = P < 0.0001 vs 이소타입 대조군. 일원 ANOVA + 본페로니에 의한 통계.
[075] 도 23a 및 23b는 혈당 (도 23a) 및 공복 글루코스(도 23b) 수준에 의해 보여진 바와 같이 내당성에 대한 항-NPR1 항체 mAb22033의 효과를 보여준다. 치료 4주 후, 각각의 그룹으로부터의 마우스는 청결한 케이지에서 밤새 단식시키고 다음날 아침 2g/kg의 경구 글루코스 부하량이 투여되었다. 이어서 글루코스는 T0, T15, T30, T60, T90 및 T120에서 휴대용 당 측정기를 사용한 꼬리 정맥에 의해 기록하였다. 사람 IgG4 항체는 이소타입 대조군으로서 사용하였다. 모든 값은 평균 ± SEM, 그룹 당 n=10이다. hFc.FGF21 그룹: *** = P < 0.001 vs 이소타입 대조군, **** = P < 0.0001 vs 이소타입 대조군. mAb22033 그룹: + = P < 0.05 vs 이소타입 대조군; ++ = P < 0.01 vs 이소타입 대조군. oGTT에 대한 이원 ANOVA + 본페로니, 공복 글루코스에 대한 일원 ANOVA + 본페로니에 의한 통계.

[076] 본 발명을 기재하기 전에, 방법과 조건들은 다양할 수 있기 때문에, 본 발명은 여기에 기술된 특정한 방법과 실험 조건들에 한정되지 않는다는 점을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 것이기 때문에, 본원에서 사용된 용어들은 다만 특정한 구현예들을 설명하기 위한 목적일 뿐이지 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.

[077] 달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법과 재료들을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있으나, 바람직한 방법과 재료들을 이제 기술할 것이다. 본원에서 언급한 모든 간행물들은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

정의

[078] 또한 “NPRA”로 불리우는 용어 “NPR1”은 배설항진 펩타이드 수용체 1 (또한 배설항진 펩타이드 수용체 A로서 공지된)을 언급한다. NPR1은 cGMP 합성을 촉매하는 효소인 동종이량체 막관통 구아닐레이트 사이클라제이다. NPR1은 심방 (ANP) 및 뇌 (BNP) 배설항진 펩타이드 둘다에 대한 수용체이고 리간드 결합 시, 세포외 도메인에서의 형태적 변화를 진행한다(문헌참조: Ogawa et al 2004, J. Biol. Chem. 279: 28625-31). 단백질은 세포외 리간드 결합 도메인, 단일 막관통 스패닝 영역, 세포내 단백질 키나제 유사 상동성 도메인 및 구아닐릴 사이클라제 촉매 도메인을 포함하는 4개의 특유한 영역을 갖는다. 전장 NPR1 단백질의 아미노산 서열은 승인 번호 P16066.1로서 UniProtKB/Swiss-Prot에 제공된 아미노산 서열(서열번호 193)에 의해 예시된다. “NPR1”라는 용어는 재조합 NPR1 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 히스티딘 태그, 마우스 또는 사람 Fc, 또는 신호 서열, 예를 들어, ROR1(예를 들어, 서열번호 194-199)에 커플링된 NPR1 단백질 또는 이의 단편도 포함한다.

[079] 본원에 사용된 "항체"라는 용어는 디설파이드 결합에 의해 서로연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 면역글로불린 분자 (즉, "전장 항체 분자") 뿐만 아니라 이의 다량체 (예컨대, IgM) 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (“HCVR” 또는 “V_H”) 및 중쇄 불변 영역 (도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3으로 이루어짐)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (“LCVR 또는 “V_L”) 및 경쇄 불변 영역 (C_L)으로 구성된다. 상기 V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역과 교차배치된 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 항체 (또는 이의 항원 결합 단편)의 FR은 사람 생식세포 계열의 서열과 동일할 수 있거나, 또는 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스 서열(consensus sequence)은 2개 이상의 CDR의 병행 분석을 기반으로 정의될 수 있다.

[080] 하나 이상의 CDR 잔기의 치환 또는 하나 이상의 CDR의 누락도 가능하다. 1개 또는 2개의 CDR이 결합을 위해 생략될 수 있는 항체가 과학 문헌에 기술된 바 있다. 패들란(Padlan) 등 (1995 FASEB J. 9:133-139)은 공개된 결정 구조를 기초로 항체와 이들의 항원 사이의 접촉 영역을 분석하여 CDR 잔기의 약 1/5 내지 1/3만이 실제로 항원과 접촉하고 있는 것으로 결론내었다. 또한, 패들란은 1개 또는 2개의 CDR이 항원과 접촉하고 있는 아미노산이 없는 다수의 항체도 확인하였다 (하기 문헌도 참고: Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428). 　　

[081] 항원과 접촉하고 있지 않는 CDR 잔기는, 선행 연구들 (예를 들어, CDRH2 중의 잔기 H60-H65는 필요치 않은 경우가 많음)을 기초로 분자 모델링 및/또는 실험적으로 코티아 CDR 외측에 존재하는 카바트 CDR의 영역으로부터 확인될 수 있다. 　CDR 또는 이의 잔기(들)이 누락되는 경우, 이는 통상적으로 또 다른 사람 항체 서열 또는 이러한 서열의 컨센서스 중의 해당 위치를 차지하고 있는 아미노산으로 치환된다. 　치환할 CDR 및 아미노산 내의 치환 위치는 실험적으로 선택될 수도 있다. 실험적 치환은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다. 　

[082] 본원에 개시된 전장 사람 항-NPR1 모노클로날 항체는, 상응하는 생식세포 계열의 서열과 비교하여, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열을 예를 들어, 공공 항체 서열 데이터베이스로부터 이용가능한 생식세포 계열의 서열과 비교함으로써 용이하게 확인할 수 있다. 본 발명은 임의의 본원에 개시된 아미노산 서열로부터 유래되는 항체 및 이의 항원 결합 단편으로서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산이 항체가 유래되는 생식세포 계열의 서열 중의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 또는 또 다른 사람 생식세포 계열의 서열 중의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 또는 상응하는 생식세포 계열의 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이되는 (이러한 서열 변화들은 본원에서 총괄적으로 "생식세포 계열의 돌연변이"로 지칭함), 상기 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 당업계의 숙련자라면 누구나, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로부터 출발하여, 하나 이상의 개별 생식세포 계열의 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원 결합 단편을 쉽게 제조할 수 있다. 특정 구현예에서, V _H 및/또는 V _L 도메인 내의 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기들은 항체가 이로부터 유래되는 본래의 생식계열의 서열에서 발견되는 잔기들로 복귀 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 오직 특정 잔기들만 본래의 생식계열의 서열로 복귀 돌연변이되는데, 예를 들어, FR1의 처음 8개의 아미노산 내 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기들만, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기들만이 본래의 생식계열의 서열로 복귀 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들)은 상이한 생식계열의 서열 (즉, 항체가 본래 유래된 생식계열의 서열과는 다른 생식계열의 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 또한, 본 발명의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 2 이상의 생식세포 계열의 돌연변이의 임의의 조합, 예컨대, 특정 개별 잔기들은 특정 생식세포 계열의 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 한편, 본래의 생식세포 계열의 서열과는 다른 특정한 다른 잔기들은 유지되거나 상이한 생식세포 계열의 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 임의의 상기 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 생식세포 계열의 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원 결합 단편은, 일단 수득되면, 하나 이상의 목적하는 성질, 예를 들어, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화성, 개선된 또는 증진된 길항성 생물학적 성질, 감소된 면역원성 등에 대하여 용이하게 시험할 수 있다. 상기 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원 결합 단편은 본 발명에 포함된다.

[083] 또한, 본 발명은 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 전장 사람 항-NPR1 모노클로날 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열에 대하여, 예를 들어, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-NPR1 항체를 포함한다.

[084] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “사람 항체” 또는 “완전한 사람 항체”는 사람 생식세포 계열의 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 사람 mAb는, 예를 들어, CDR에서 및 특히 CDR3에서, 사람 생식세포 계열의 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같은 "사람 항체” 또는 “완전한 사람 항체”라는 용어는 또 다른 포유동물 종 (예를 들어, 마우스)의 생식세포 계열로부터 유래된 CDR 서열이 사람 FR 서열로 이식된 mAb를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 상기 용어는 비-사람 포유동물, 또는 비-사람 포유동물의 세포에서 재조합에 의해 제조된 항체를 포함한다. 상기 용어는 사람 대상체로부터 단리되거나 사람 대상체에서 생성된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.

[085] 본원에서 사용된 "재조합"이라는 용어는 예를 들어, DNA 스플라이싱(splicing) 및 유전자전이(transgenic) 발현을 포함하는 재조합 DNA 기법으로 당업계에 공지된 기법 또는 방법들에 의해 생성되거나, 발현되거나, 분리되거나 또는 수득된 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 상기 용어는 사람이 아닌 포유동물 (사람이 아닌 유전자전이 포유동물, 예를 들어, 유전자전이 마우스 포함), 또는 세포 (예를 들어, CHO 세포) 발현 시스템에서 발현되거나 또는 재조합 조합형 사람 항체 라이브러리로부터 단리된 항체를 지칭한다.

[086] "특이적으로 결합한다" 또는 "~에 특이적으로 결합한다" 등의 용어는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 생리학적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1x10^-8 M 이하의 평형 해리 상수를 특징으로 할 수 있다 (예를 들어, 더 작은 K_D는 더 단단한 결합을 나타냄). 두 분자가 특이적으로 결합하는지의 여부를 측정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 본원에서 기술된 바와 같이, NPR1에 특이적으로 결합하는 항체는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어, BIACORE™에 의해 동정되었다. 또한, NPR1에서 하나의 도메인, 및 하나 이상의 추가의 항원에 결합하는 다중 특이적 항체, 또는 NPR1의 2개의 상이한 영역에 결합하는 이중 특이적 항체는 이렇더라도 본원에서 사용된 "특이적으로 결합하는" 항체로 간주된다.

[087] “높은 친화도"의 항체라는 용어는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어, BIACORE™ 또는 용액-친화도 ELISA에 의한 측정시, 적어도 10^-8 M; 바람직하게는 10^-9 M; 보다 바람직하게는 10^-10M, 보다 더 바람직하게는 10^-11 M의 K_D로 나타낸 NPR1에 대한 결합 친화도를 갖는 상기 mAb를 언급한다.

[088] 용어 “느린 오프(slow off) 속도", "Koff" 또는 "kd"라는 용어는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어, BIACORE™으로 측정시, 1x10^-3 s^-1 이하, 바람직하게는 1x10^-4 s^-1 이하의 속도 상수로 NPR1로부터 해리하는 항체를 의미한다.

[089] 본원에 사용된 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등의 용어는, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생하거나, 효소에 의해 수득할 수 있거나, 합성 또는 유전학적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 본원에 사용된 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"이라는 용어는, NPR1 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다.

[090] 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 리간드 또는 치료학적 잔기 ("면역접합체(immunoconjugate)")와 같은 잔기, 제2 항-NPR1 항체, NPR1-연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 유용한 임의의 기타 치료학적 잔기에 접합될 수도 있다.

[091] 본원에 사용된 "단리된 항체"는, 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체 (Ab)가 실질적으로 없는 항체를 지칭하려는 것이다 (예를 들어, NPR1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 단편은 NPR1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 Ab가 실질적으로 없음).

[092] 본원에 사용된 바와 같은 “활성화 항체” 또는 "효능제 항체"(또는, “NPR1 활성을 증가시키거나 강화하는 항체” 또는 “활성화된 형태를 안정화시키는 항체”)는 항체로서 이의 NPR1으로의 결합이 NPR1의 적어도 하나의 생물학적 활성을 활성화시키는 항체를 언급하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여시 전신 혈압을 감소시킬 수 있다.

[093] 본원에 사용된 "표면 플라스몬 공명"이라는 용어는, 예를 들어, BIACORE™ 시스템 [스웨덴 웁살라 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 파마시아 바이오센서 AB (Pharmacia Biosensor AB) 제조]을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내 단백질 농도 변화의 검출에 의해 실시간 생체분자 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학적 현상을 지칭한다.

[094] 본원에 사용된 "K_D"라는 용어는, 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭하려는 것이다.

[095] "에피토프"라는 용어는 파라토프(paratope)로 알려져 있는 항체 분자의 가변 영역 내에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 지칭한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수도 있다. 따라서, 상이한 항체들은 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수도 있고 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. "에피토프"라는 용어는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭하기도 한다. 이는 항체에 의해 결합된 항원의 영역을 지칭하기도 한다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 한정될 수도 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 하위세트이고 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 잔기들를 가진다. 에피토프는 입체적 구조일 수도 있는데, 즉, 비선형 아미노산으로 구성될 수도 있다. 특정 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 기, 또는 설포닐 기와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹인 결정기를 포함할 수도 있고, 특정 구현예에서는, 특이적인 3차원 구조적 특성 및/또는 특이적인 전하 특성을 가질 수도 있다.

[096] 본원에 사용된 "교차-경쟁한다(cross-compete)"라는 용어는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항원에 결합하여 또 다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합을 억제하거나 차단하는 것을 의미한다. 상기 용어는 양 방향, 즉 제2 항체에 결합하여 그의 결합을 차단하거나 이의 반대를 포함하는 방향으로의 두 항체 간의 경쟁을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 항체와 제2 항체는 동일한 에피토프에 결합할 수도 있다. 다르게는, 제1 및 제2 항체는 하나의 결합이, 예를 들어, 입체 장애를 통해 제2 항체의 결합을 억제하거나 차단하도록, 서로 다르지만 중첩된 에피토프에 결합할 수도 있다. 항체들 간의 교차-경쟁은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 실시간 무표지 바이오-층 간섭굴절측정법(interferometry) 분석에 의해 측정될 수도 있다. 두 항체 간의 교차-경쟁은 자가-자가 결합으로 인해 백그라운드 신호보다 더 적은 제2 항체의 결합으로 나타낼 수 있다 (여기서 제1 및 제2 항체는 동일한 항체임). 두 항체 간의 교차-경쟁은 예를 들어, 베이스라인 자가-자가 백그라운드 결합보다 더 적은 제2 항체의 % 결합으로 나타낼 수 있다 (여기서 제1 및 제2 항체는 동일한 항체임).

[097] 핵산 이의 단편을 언급하는 경우에 "실질적 동일성(substantial identity)" 또는 "실질적으로 동일한(substantially identical)"이라는 용어는, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)과 최적으로 정렬할 때, 아래에 논의된 바와 같이 FASTA, BLAST 또는 GAP과 같은 널리 알려진 서열 동일성에 대한 임의의 알고리즘으로 측정시, 뉴클레오티드 염기 중 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 존재하는 것을 의미한다. 기준 핵산 분자에 대하여 실질적 동일성을 갖는 핵산 분자는, 어떤 경우에는, 기준 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 수도 있다.

[098] 폴리펩타이드에 적용되는 것과 같이, "실질적 유사성(substantial similarity)" 또는 "실질적으로 유사한(substantially similar)"이라는 용어는, 디폴트 갭 가중치(default gap weight)를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 두 펩타이드 서열을 최적으로 정렬하는 경우, 적어도 90%의 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환이 다르다. "보존적 아미노산 치환"은 한 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2 이상의 아미노산 서열이 서로 보존적 치환이 다른 경우, 유사성의 % 또는 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수도 있다. 상기 조정을 수행하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]을 참조하며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 보유하는 아미노산의 기의 예로는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 기로는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트 및 아스파라긴-글루타민이다. 다르게는, 보존적 치환은 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445]에 개시된 PAM250 로그-우도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양의 수치를 갖는 임의의 변화이다. “적당히 보존적인" 대체는 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.

[099] 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 통상적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정한다. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 보존적 아미노산 치환을 포함한 기타 변형에 지정된 유사성의 측정치를 사용하여 유사한 서열을 매칭시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는, 기본 파라미터를 사용하여 서로 다른 유기체 종의 상동성 폴리펩타이드와 같이 밀접하게 연관된 폴리펩타이드들 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성, 또는 야생형 단백질 및 이의 돌연변이 단백질 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 판정하는데 사용될 수 있는, GAP 및 BESTFIT과 같은 프로그램을 포함하고 있다. 예를 들어, GCG 버전 6.1을 참고한다. 폴리펩타이드 서열은 GCG 버전 6.1 내의 프로그램인 기본 또는 권장 파라미터들을 갖는 FASTA를 사용하여 비교할 수도 있다. FASTA (예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)은 질의 서열 및 검색된 공지 서열 간의 최상의 중복 영역에 대한 정렬 및 % 서열 동일성을 제공한다(Pearson (2000) 상기 참조). 본 발명의 서열을 상이한 유기체로의 다수의 서열들을 포함하고 있는 데이터베이스와 비교하는 경우에 있어서의 또 다른 바람직한 알고리즘은 기본 매개변수를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들어, 알트쉴(Altschul) 등의 [(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 [(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]를 참조하며, 이들은 각각 본원에 참조로 포함된다.

[0100] "치료학적 유효량"이라는 말은 투여되는 대상에 대하여 원하는 효과를 나타내는 양을 의미한다. 그 정확한 양은 치료의 목적에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 공지된 기법을 사용하여 확인할 수 있을 것이다 (예를 들어, 문헌 [Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding] 참조).

[0101] 본원에 사용된 바와 같은 "대상체"라는 용어는 NPR1-연관된 질환 또는 장애, 예를 들어, 고혈압의 개선, 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람을 언급한다. 상기 용어는 질환 또는 장애에 걸려있거나 걸릴 위험이 있는 사람 대상체를 포함한다.

[0102] 본원에서 사용된 "치료한다", “치료하는” 또는 "치료"라는 용어는 NPR1-연관된 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 항체와 같은 치료제의 투여로 인한 NPR1-연관된 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후의 중증도의 감소 또는 개선을 지칭한다. 상기 용어는 질병의 진행 또는 증상/징후의 악화에 대한 억제를 포함한다. 또한, 상기 용어는 질병에 대한 긍정적인 예후도 포함하는데, 즉, 대상체는 본 발명의 항체와 같은 치료제의 투여시 질병으로부터 해방될 수 있거나, 또는 질병이 감소될 수 있다. 상기 치료제는 치료학적 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다.

[0103] “예방한다", “예방하는” 또는 "예방"이라는 용어는, 본원 발명의 항체의 투여 시 NPR1-연관된 질환 또는 장애의 징후 또는 이러한 질환 또는 장애의 임의의 증상 또는 징후의 억제를 지칭한다.

항체의 항원 결합 단편

[0104] 특별히 달리 지시하지 않는 한, 본원에 사용된 "항체"라는 용어는, 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 네 개의 폴리펩타이드 쇄, 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체 분자 (즉, "전장 항체 분자") 뿐만 아니라 이의 항원 결합 단편을 망라하려는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등의 용어는, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생하거나, 효소에 의해 수득할 수 있거나, 합성 또는 유전학적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 본원에 사용된 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"이라는 용어는, NPR1 단백질에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체 단편은 Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, dAb 단편, CDR을 포함하는 단편, 또는 분리된 CDR을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, "항원 결합 단편"이라는 용어는 다중 특이적 항원 결합 분자의 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 단편은, 단백질 가수분해와 같은 임의의 적합한 표준 기법 또는 DNA 암호화 항체 가변 및 (임의로는) 불변 도메인의 조작 및 발현을 수반하는 재조합 유전자 조작 기법을 사용하여, 예를 들어, 전장 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 상기 DNA는 공지되어 있고/있거나 예를 들어, 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들어, 파아지-항체 라이브러리를 포함하는)로부터 용이하게 가용하거나, 합성될 수 있다. DNA는 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용함에 의해 서열 분석되고 조작되어, 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 구성으로 정렬하거나 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성시키거나, 아미노산을 변형시키거나, 첨가하거나 결실시키는 것등을 할 수 있다.

[0105] 항원 결합 단편의 비제한적 예로는 하기를 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')₂ 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 쇄 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역 (예를 들어, 분리된 상보성 결정 영역 (CDR), 예컨대 CDR3 펩타이드), 또는 제한된(constrained) FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인지 단위. 　다른 가공된 분자, 예를 들어, 도메인-특이적 항체, 단일쇄 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-접목 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디 (예를 들어. 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈러 면역약제(SMIP), 및 샤크 가변 IgNAR 도메인은 또한 본원에 사용된 바와 같은 표현 “항원 결합 단편”에 포함된다.

[0106] 항체의 항원 결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함한다. 상기 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성의 도메인일 수 있으며, 일반적으로 적어도 하나의 프레임워크 서열에 인접하고 있거나 이와 함께 프레임워크를 이루는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. V_L 도메인과 결합된 V_H 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, V_H 및 V_L 도메인은 서로에 대해 임의의 적합한 배열로 위치할 수 있다. 예를 들어, 상기 가변 영역은 이량체여서 V_H - V_H, V_H - V_L 또는 V_L - V_L 이량체를 포함할 수 있다. 다르게는, 항체의 항원 결합 단편은 단량체성 V_H 또는 V_L 도메인을 포함할 수 있다.

[0107] 특정 구현예에서, 항체의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원 결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적 구성은 다음을 포함한다: (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (v) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; 및 (xiv) V_L-C_L. 상기 나열한 임의의 예시적 구성 형태를 비롯한 임의의 가변 및 불변 도메인의 구성 형태에 있어서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접적으로 결합될 수도 있거나, 또는 전체 또는 일부 경첩 또는 링커 영역에 의해 결합될 수도 있다. 힌지 영역은 적어도 2개 (예를 들어, 5개, 10개, 15개, 20개, 40개, 60개 또는 그 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 이는 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에서 가요성 또는 반가요성 결합을 유도한다. 더욱이, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 서로 및/또는 하나 이상의 단량체성 V_H 또는 V_L 도메인과 (예를 들어, 디설파이드 결합(들)에 의해) 비공유 연합된, 상기 나열된 임의의 가변 및 불변 도메인 구성의 동종 이량체 또는 이종 이량체 (또는 기타 다량체)를 포함할 수 있다.

[0108] 전장 항체 분자에서와 같이, 항원 결합 단편은 단일 특이적 또는 다중 특이적 (예를 들어, 이중-특이적)일 수 있다. 항체의 다중 특이적 항원 결합 단편은 통상적으로 적어도 2개의 서로 다른 가변 도메인을 포함할 것이고, 이 경우 각각의 가변 도메인은 별도의 항원 또는 동일한 항원 상의 서로 다른 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에서 개시된 예시적인 이중 특이적 항체 포맷을 비롯한 임의의 다중 특이적 항체 포맷은 당업계에서 이용가능한 일상적인 기법을 사용하여 본 발명의 항체의 항원 결합 단편과 관련된 사용을 위해 조정될 수도 있다.

사람 항체의 제조

[0109] 유전자전이 마우스에서 사람 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 상기 공지된 방법은 본 발명과 관련하여 NPR1에 특이적으로 결합하는 사람 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

[0110] 하기 중 임의의 하나를 포함하는 면역원을 사용하여 NPR1 단백질에 대한 항체를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 전장의 고유 NPR1 단백질 (예를 들어, UniProtKB/Swiss-Prot승인 번호 P16066.1 참고), 또는 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA로 면역화된 마우스로부터 수득된다. 다르게는, 상기 단백질 또는 이의 단편은 표준 생화학 기법들을 사용하여 제조되어, 면역원으로 변형 및 사용될 수 있다.

[0111] 일부 구현예에서, 상기 면역원은 이. 콜라이(E. coli ) 또는 임의의 기타 진핵 또는 포유동물 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현시킨 재조합 NPR1 단백질 또는 이의 단편 (예를 들어, 서열번호 194 내지 199)일 수 있다.

[0112] VELOCIMMUNE® 기법 [예를 들어, US 6,596,541호, 리제네론 파마슈티컬즈(Regeneron Pharmaceuticals), VELOCIMMUNE® 참조] 또는 모노클로날 항체를 생성하기 위한 임의의 기타 공지된 방법을 사용하여, 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는, NPR1에 대한 높은 친화도의 키메라 항체를 먼저 분리시킨다. VELOCIMMUNE® 기법은 마우스가 항원의 자극에 반응하여 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생성하도록 내인성 마우스 불변 영역 유전자좌에 작동가능하게 연결된 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 유전자전이 마우스의 생성을 수반한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 분리시켜 사람 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결시킨다. 다음으로, 상기 DNA를 전장 사람 항체를 발현할 수 있는 세포 중에서 발현시킨다.

[0113] 일반적으로, VELOCIMMUNE® 마우스를 관심대상 항원으로 면역유발시키고, 항체를 발현하는 마우스로부터 림프성 세포 (예컨대, B-세포)를 회수한다. 상기 림프성 세포를 골수종 세포주와 융합시켜 불멸성 하이브리도마 세포주를 제조할 수 있으며, 이러한 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여 관심대상 항원에 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 동정한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 단리하여 중쇄 및 경쇄의 목적하는 이소타입 불변 영역에 연결시킬 수 있다. 이러한 항체 단백질은 CHO 세포와 같은 세포에서 생성할 수 있다. 다르게는, 항원 특이적 키메라 항체 또는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 DNA를 항원 특이 림프구로부터 직접 단리할 수도 있다.

[0114] 처음에, 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 높은 친화도 키메라 항체를 분리한다. 하기 실험 부분에 기재된 바와 같이, 상기 항체를 특성에 따라 분류하여 친화도, 선택성, 에피토프 등을 비롯한 원하는 특성들에 대해 선별한다. 상기 마우스 불변 영역들을 목적하는 사람 불변 영역으로 대체하여 본 발명의 전장 사람 항체, 예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4를 제조한다. 선택된 불변 영역이 특정 용도에 따라 다양할 수 있지만, 높은 친화도의 항원 결합 및 표적 특이성 특징들은 가변 영역에 남아 있다.

생등가물

[0115] 본 발명의 항-NPR1 항체 및 항체 단편은, 본원에 기술된 항체와는 다르지만 NPR1 단백질에 결합할 수 있는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 단백질도 포함한다. 이러한 변이체 항체 및 항체 단편은 모체 서열(parent sequence)과 비교했을 때 아미노산의 하나 이상의 부가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 본원에 기술된 항체와 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본 발명의 DNA 서열을 암호화하는 항체는 개시된 서열과 비교했을 때 뉴클레오티드의 하나 이상의 부가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 본 발명의 항체 또는 항체 단편과 본질적으로 생물학적으로 동등한 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 망라한다.

[0116] 2개의 항원 결합 단백질 또는 항체는, 예를 들어, 이들을 유사한 실험 조건 하에 단일 용량으로든 다중 용량으로든 간에 동일한 몰 용량으로 투여했을 때, 흡수율 및 흡수 정도가 유의적인 차이를 보이지 않는 약제학적 동등물 또는 약제학적 대체물인 경우에 생물학적으로 동등한 것으로 간주된다. 일부 항체는, 이들이 흡수 정도에서는 동등하지만 흡수율에서 동등하지 않다면 동등물 또는 약제학적 대체물로 간주될 것이고, 그럼에도 생물학적으로 동등한 것으로 간주될 수 있는데, 그 이유는 흡수율에 있어서의 이러한 차이가 의도적인 것이고, 표지에 반영되며, 예를 들어 만성 사용시 유효 체내 약물 농도의 달성에 필수적인 것이 아니고, 연구되는 특정 약물 제품에 대해 의학적으로 무의미한 것으로 간주되기 때문이다.

[0117] 한 구현예에서, 두 항원 결합 단백질은 이들의 안전성, 순도 및 효능에 있어서 임상적으로 의미있는 차이가 없는 경우에 생물학적으로 동등하다.

[0118] 한 구현예에서, 두 항원 결합 단백질은 환자가 기준 제품과 생물학적 제품 간에 1회 이상 전환하는 경우라도 이러한 전환이 없는 연속 치료법에 비해 면역원성에 있어서의 임상적으로 유의적인 변화 또는 감소된 효능을 비롯한 부작용 위험의 증가가 예상되지 않는다면 생물학적으로 동등하다.

[0119] 하나의 구현예에서, 두 항원-결합 단백질은 이들이 둘다 사용 조건 또는 조건들에 대한 공통의 작용 기전들에 의해 이러한 기전이 알려져 있는 정도로 작용하는 경우라면 생등가성이다.

[0120] 생물학적 동등성은 생체내 및 시험관내 방법으로 입증될 수 있다. 생물학적 동등성 판단의 척도로는, 예를 들어, (a) 항체 또는 이의 대사산물의 농도를 시간의 함수로서 혈액, 혈장, 혈청 또는 기타 생물학적 체액 내에서 측정하는, 사람 또는 기타 포유동물에서의 생체내 시험; (b) 사람 생체내 생체이용률 데이터와 상관성이 있고 이를 합리적으로 예측하는 시험관내 시험; (c) 항체 (또는 이의 표적)의 적절한 단시간의 약리학적 효과를 시간의 함수로서 측정하는 사람 또는 다른 포유동물에서의 생체내 시험; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용률 또는 생물학적 동등성을 확립하는 잘 비교된 임상 시험을 포함한다.

[0121] 본 발명의 항체의 생물학적으로 동등한 변이체는 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 수행하거나 생물학적 활성에 필요치 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 작제될 수 있다. 　예를 들어, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 복원시 불필요하거나 부정확한 분자내 디설파이드 결합의 형성을 방지하기 위해 결실시키거나 다른 아미노산으로 대체할 수 있다. 다른 경우에서, 생물학적으로 동등한 항체들은 해당 항체의 글리코실화 특성을 변형시키는 아미노산 변화, 예를 들어 글리코실화를 없애거나 제거하는 돌연변이를 포함하는 항체 변이체를 포함할 수도 있다.

Fc 변이체를 포함하는 항-NPR1 항체

[0122] 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 예를 들어 중성 pH에 비하여, 산성 pH에서 FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 향상시키거나 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-NPR1 항체가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 Fc 도메인의 C_H2 또는 C_H3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항-NPR1 항체를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이(들)은 산성 환경 (예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위에 있는 엔도솜) 내에서 FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는 동물에게 투여되는 경우 항체의 혈청 반감기의 증가를 초래할 수도 있다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예로는, 예를 들어, 위치 250 (예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428 (예를 들어, L 또는 F); 252 (예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254 (예를 들어, S 또는 T) 및 256 (예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433 (예를 들어, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (예를 들어, A, W, H, F 또는 Y [N434A, N434W, N434H, N434F 또는 N434Y])에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 307 또는 308 및 434에서의 변형 (예를 들어, 308F, V308F)을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 변형은 428L (예를 들어, M428L) 및 434S (예를 들어, N434S) 변형; 428L, 259I (예를 들어, V259I), 및 308F (예를 들어, V308F) 변형; 433K (예를 들어, H433K) 및 434 (예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (예를 들어, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형 (예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 변형은 265A (예를 들어, D265A) 및/또는 297A (예를 들어, N297A) 변형을 포함한다.

[0123] 예를 들어, 본 발명은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 그룹을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-NPR1 항체를 포함한다: 250Q 및 248L (예를 들어, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E (예를 들어, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S (예를 들어, M428L 및 N434S); 257I 및 311I (예를 들어, P257I 및 Q311I); 257I 및 434H (예를 들어, P257I 및 N434H); 376V 및 434H (예를 들어, D376V 및 N434H); 307A, 380A 및 434A (예를 들어, T307A, E380A 및 N434A); 및 433K 및 434F (예를 들어, H433K 및 N434F). 상술한 Fc 도메인 돌연변이, 및 본원에 개시된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이의 가능한 모든 조합물들이 본 발명의 범위 내에서 고려된다.

[0124] 또한, 본 발명은 키메라 중쇄 불변 (CH) 영역을 포함하는 항-NPR1 항체를 포함하는데, 여기서 상기 키메라 CH 영역은 하나 이상의 면역글로불린 이소타입의 CH 영역으로부터 유래된 세그먼트를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 분자로부터 유래된 C_H3 도메인의 일부 또는 전부와 조합된, 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 분자로부터 유래된 C_H2 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 키메라 C_H 영역을 포함할 수도 있다. 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 키메라 힌지 영역을 갖는 키메라 C_H 영역을 포함한다. 예를 들어, 키메라 힌지는 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "하부 힌지" 서열 [EU 넘버링(numbering)에 따르면 위치 228 내지 236의 아미노산 잔기)과 조합된, 사람 IgG1, 사람 IgG2 또는 사람 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "상부 힌지" 아미노산 서열 (EU 넘버링에 따르면 위치 216 내지 227의 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 상기 키메라 힌지 영역은 사람 IgG1 또는 사람 IgG4 상부 힌지로부터 유래된 아미노산 잔기 및 사람 IgG2 하부 힌지로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다. 본원에서 기술된 바와 같이 키메라 C_H 영역을 포함하는 항체는, 특정 구현예에서, 항체의 치료학적 특성 또는 약동학적 특성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 변형된 Fc 효과기 기능을 나타낼 수도 있다. (예를 들어, 미국 특허 출원 공호 2014/0243504호를 참조하며, 이 문헌의 전문은 본원에 참조로 포함된다).

항체의 생물학적 특성

[0125] 일반적으로, 본 발명의 항체는 NPR1 단백질에 결합하여 이의 활성을 증가시키는 기능을 한다. 예를 들어, 본 발명은 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 규정된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 690 nM 미만의 K_D로 ANP 또는 BNP 부재하에 (예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서) 사람 NPR1 단백질에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 약 650nM 미만, 약 500 nM 미만, 약 400 nM 미만, 약 300nM 미만, 약 200nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50nM 미만, 또는 약 25 nM 미만의 K_D로 NPR1에 결합한다.

[0126] 또한, 본 발명은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 42 nM 미만의 K_D로 ANP 또는 BNP의 부재하에 (예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서) 이량체 사람 NPR1 단백질에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 약 40nM 미만, 약 30nM 미만, 약 20nM 미만, 약 10nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM 미만 또는 약 0.5nM 미만의 K_D로 NPR1에 결합한다.

[0127] 또한, 본 발명은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 80 nM 미만의 K_D로 (예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서) ANP에 복합체화된 사람 NPR1 단백질에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 약 70nM 미만, 약 50nM 미만, 약 25nM 미만, 약 10nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM 미만 또는 약 0.5nM 미만의 K_D로 NPR1에 결합한다.

[0128] 또한, 본 발명은 예를 들어 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 20 nM 미만의 K_D로 (예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서) BNP에 복합체화된 사람 NPR1 단백질에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 약 15nM 미만, 약 10nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM 미만 또는 약 0.5nM 미만의 K_D로 NPR1에 결합한다.

[0129] 또한, 본 발명은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 365 nM 미만의 K_D로 ANP 또는 BNP의 부재하에 (예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서) 단량체 몽키 NPR1 단백질에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 약 360nM 미만, 약 300 nM 미만, 약 150 nM 미만, 약 100nM 미만, 약 50nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10nM 미만, 약 5nM 미만, 약 1nM 미만, 또는 약 0.5nM 미만의 K_D로 NPR1에 결합한다.

[0130] 또한, 본 발명은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 30 nM 미만의 K_D로 ANP 또는 BNP의 부재하에 (예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서) 이량체 몽키 NPR1 단백질에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 약 20nM 미만, 약 10nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM 미만 또는 약 0.5nM 미만의 K_D로 NPR1에 결합한다.

[0131] 또한, 본 발명은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 80 nM 미만의 K_D로 (예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서) ANP에 복합체화된 몽키 NPR1 단백질에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 약 9nM 미만, 약 8nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM 미만 또는 약 0.5nM 미만의 K_D로 NPR1에 결합한다.

[0132] 또한, 본 발명은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 10 nM 미만의 K_D로 (예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서) BNP에 복합체화된 이량체 몽키 NPR1 단백질에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 3에 규정된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 측정시 약 9nM 미만, 약 8nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM 미만 또는 약 0.5nM 미만의 K_D로 NPR1에 결합한다.

[0133] 본 발명은 또한 예를 들어, 본원의 실시예 5에 규정된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 측정시 약 5nM 미만, 약 4nM 미만, 약 3nM 미만, 약 2nM 미만, 약 1nM 미만 또는 0.5nM 미만의 EC₅₀에서 ANP의 존재 또는 부재하에 사람 NPR1을 발현하는 세포에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

[0134] 본 발명은 또한 예를 들어, 본원의 실시예 6에 규정된 검정 포맷을 사용하여 칼슘 플럭스 세포-기반 생검정에 의한 측정시 385nM 미만의 EC₅₀으로 NPR1을 활성화시키는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, 본원의 실시예 6에 규정된 검정 포맷, 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 칼슘 플럭스 세포 기반 생검정으로 측정시 약 300nM 미만, 약 200nM 미만, 약 100nM 미만, 약 50nM 미만, 약 10nM 미만 또는 약 1nM 미만의 EC₅₀으로 NPR1을 활성화시킨다.

[0135] 본 발명은 또한 예를 들어, 본원의 실시예 8에 나타낸 바와 같이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 28일 초과 동안 NPR1에 결합하고 대상체의 전신 혈압을 감소시키는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.

[0136] 본 발명은 또한 예를 들어, 본원의 실시예 11에 나타낸 바와 같이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 NPR1에 결합하고 단식 혈당 수준을 감소시키는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.

[0137] 하나의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 하기의 특징을 나타내는, ANP 또는 BNP의 존재 또는 부재하에 NPR1 단백질에 특이적으로 결합하고 NPR1의 활성을 증가시키는 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다: (a) 완전한 사람 모노클로날 항체이고; (b) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 및/또는 BNP의 부재하에 단량체 사람 NPR1에 결합하고 해리 상수 (K_D)는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 690nM 미만이고; (c) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 또는 BNP의 부재하에 이량체 사람 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 42nM 미만이고; (d) 25℃에서 및 37℃에서 ANP와 복합체화된 사람 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 80nM 미만이고; (e) 25℃에서 및 37℃에서 BNP와 복합체화된 사람 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 20nM 미만이고; (f) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 및/또는 BNP의 부재하에 단량체 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 365nM 미만이고; (g) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 또는 BNP의 부재하에 이량체 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 30nM 미만이고; (h) 25℃에서 및 37℃에서 ANP와 복합체화된 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 10nM 미만이고; (i) 25℃에서 및 37℃에서 BNP와 복합체화된 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 10nM 미만이고; (j) 마우스 NPR1에 결합하지 않고; (k) 사람 NPR1 (ANP 부재) 또는 ANP에 복합체화된 NPR1을 발현하는 세포에 결합하고, EC₅₀은 5nM 미만이고; (l) NPR1을 활성화시키고 칼슘 플럭스 세포 기반 생검정에서 측정시 EC₅₀이385nM 미만이고; (m) 정상 혈압 및 고혈압 마우스에 투여되는 경우 전신 혈압을 감소시키고, 여기서, 전신 및 평균 동맥 혈압에서의 감소는 단일 용량의 투여 시 최대 28일 동안 지속하고; (n) 식이-유도된 비만 마우스에게 투여되는 경우, 내당성을 개선시키고; (O) 표 1에 열거된 HCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 및 표 1에 열거된 LCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 LCVR를 포함한다.

[0138] 본 발명의 항체는 상기 언급된 생물학적 특성들 중 하나 이상의 특성, 또는 이들의 임의의 조합을 보유할 수 있다. 본 발명의 항체의 다른 생물학적 특성들은 본원의 실시예를 비롯한 본 명세서의 검토로부터 당업자에게 분명해질 것이다.

에피토프 맵핑 및 관련 기법들

[0139] 본 발명은 NPR1 단백질 분자의 하나 이상의 영역 내에서 발견되는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 항-NPR1 항체를 포함한다. 항체가 결합하는 에피토프는 NPR1 단백질 분자의 상기 언급한 도메인들 중 어느 한 도메인 내에 위치한 3개 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상)의 아미노산의 단일 연속 서열 (예를 들어, 도메인의 선형 에피토프)로 이루어질 수 있다. 다르게는, 상기 에피토프는 상기 단백질 분자의 상기 언급한 도메인들 중 하나 또는 양자 모두의 내에 위치하는 다수의 비연속 아미노산 (또는 아미노산 서열) (예를 들어, 입체구조형 에피토프)로 이루어질 수 있다.

[0140] 당업계의 숙련자에게 공지된 다양한 기법들을 사용하여 항체가 폴리펩타이드 또는 단백질 내에서 "하나 이상의 아미노산과 상호작용하는지”의 여부를 결정할 수 있다. 예시적 기법으로는, 예를 들어, 문헌 [Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)]에 기술된 것과 같은, 일반적인 교차-차단 분석법을 포함한다. 다른 방법으로는 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석 (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), 펩타이드 절단 분석, 결정학 연구 및 NMR 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법도 사용될 수 있다 (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내에서 아미노산을 동정하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법으로 검출되는 수소/중수소 교환법이다. 일반적으로, 상기 수소/중수소 교환법은 관심대상 단백질을 중수소-표지화한 후, 항체를 중수소-표지된 단백질에 결합시키는 단계를 포함한다. 다음으로, 상기 단백질/항체 복합체를 물로 옮기고 상기 항체 복합체에 의해 보호되는 아미노산 내에서 교환가능한 양성자는 계면의 일부가 아닌 아미노산 내에서 교환가능한 양성자보다 더 느린 속도로 중수소에서 수소로의 역교환을 겪게 된다. 그 결과, 상기 단백질/항체 계면의 일부를 형성하는 아미노산은 중수소를 보유할 수 있기 때문에, 상기 계면에 포함되지 않은 아미노산에 비해 비교적 더 높은 질량을 나타낸다. 항체의 해리 후, 표적 단백질을 프로테아제 절단 및 질량 분광측정 분석에 적용함으로써, 상기 항체가 상호작용하는 특이적 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 밝혀낸다. 예를 들어, 문헌 [Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259]; [Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A]를 참조한다.

[0141] “에피토프"라는 용어는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. B-세포 에피토프는 단백질의 3차 폴딩(folding)에 의해 병치된 연속 아미노산 및 비연속 아미노산들 모두로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면에, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매로 처리시 손실된다. 에피토프는 일반적으로 독특한 입체구조를 갖는 적어도 3개 및 그 이상, 통상 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.

[0142] 항원 구조 기반의 항체 프로파일링(Antigen Structure-based Antibody Profiling; ASAP)으로도 알려져 있는 변형 보조 프로파일링(Modification-Assisted Profiling; MAP)은 화학적으로 변형되거나 또는 효소에 의해 변형된 항원 표면에 대한 각 항체의 결합 프로파일의 유사성에 따라 동일한 항원을 겨냥하는 다수의 단일 클론 항체 (mAb)를 분류하는 방법이다 (US 2004/0101920호를 참조하며, 본원에 그 전문이 구체적으로 포함됨). 각각의 범주는 또 다른 범주로 나타낸 에피토프와 확연히 다르거나 또는 이와 부분적으로 중첩되는 독특한 에피토프를 반영할 수도 있다. 이 기법은 유전적으로 동일한 항체의 신속한 필터링을 가능하게 하기 때문에 유전적으로 구별되는 항체에 특성화의 초점을 맞출 수 있다. MAP를 하이브리도마 스크리닝에 적용하는 경우, 원하는 특성을 갖는 mAb를 생산하는 희귀 하이브리도마 클론을 용이하게 식별할 수 있다. MAP를 사용하여 본 발명의 항체를 서로 다른 에피토프에 결합하는 항체의 그룹으로 분류할 수도 있다.

[0143] 특정 구현예에서, 본 발명은 NPR1의 세포외 도메인내에서 발견되는 하나 이상의 에피토프와 상호작용하는 항-NPR1 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 에피토프(들)은 NPR1의 세포외 도메인 내 위치한 3개 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상)의 아미노산의 하나 이상의 연속 서열로 이루어질 수 있다. 다르게는, 에피토프는 NPR1 내에 위치한 다수의 비연속 아미노산 (또는 아미노산 서열)로 이루어질 수 있다.

[0144] 본 발명은 표 1에 열거된 임의의 특정한 예시적 항체와 동일한 에피토프, 또는 상기 에피토프의 일부에 결합하는 항-NPR1 항체를 포함한다. 이와 마찬가지로, 본 발명은 NPR1 단백질 또는 이의 단편에 대한 결합에 대하여 표 1에 열거된 임의의 특정한 예시적 항체와 경쟁하는 항-NPR1 항체도 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 NPR1 단백질에 대한 결합에 대하여 표 1에 열거된 하나 이상의 항체와 교차-경쟁하는 항-NPR1 항체를 포함한다.

[0145] 당업자라면 누구나, 당업계에 공지된 일반적인 방법을 사용하여 항체가 기준 항-NPR1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 기준 항-C5 항체와 결합에 대하여 경쟁하는지의 여부를 쉽게 판단할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 발명의 기준 항-NPR1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 판단하기 위해서, 기준 항체를 포화 조건 하에 NPR1 단백질 또는 펩타이드에 결합시킬 수 있다. 다음으로, NPR1 단백질 분자에 결합하는 시험 항체의 능력을 평가한다. 시험 항체가 참조 항-NPR1 항체와 포화 결합한 후에 NPR1에 결합할 수 있는 경우라면, 상기 시험 항체는 표준 항-NPR1 항체와 다른 에피토프에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다. 반면에, 시험 항체가 참조 항-NPR1 항체와 포화 결합한 후에 NPR1에 결합할 수 없는 경우라면, 상기 시험 항체는 본 발명의 참조 항-NPR1 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.

[0146] 항체가 기준 항-NPR1 항체와 결합에 대하여 경쟁하는지의 여부를 판단하기 위해, 상기 기술된 결합 방법론은 두 가지 방향으로 수행된다: 첫 번째 방법에서는, 상기 기준 항체를 포화 조건 하에 NPR1 단백질에 결합시킨 후, NPR1 분자에 대한 시험 항체의 결합에 대하여 평가한다. 　두 번째 방법에서는, 상기 시험 항체를 포화 조건 하에 NPR1 단백질에 결합시킨 후, NPR1 분자에 대한 기준 항체의 결합에 대하여 평가한다. 양 방법의 경우는 모두, 첫 번째 (포화) 항체만이 NPR1 분자에 결합할 수 있는 경우라면, 상기 시험 항체 및 기준 항체는 NPR1에 대한 결합에 대하여 경쟁하고 있는 것으로 결론을 내린다. 　당업계의 숙련자라면 알 수 있듯이, 기준 항체와 결합에 대하여 경쟁하는 항체는 반드시 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않을 수도 있으며, 중첩되거나 인접하는 에피토프에 결합하여 기준 항체의 결합을 입체 구조적으로 차단할 수 있다.

[0147] 두 항체가 각각 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제 (차단)하는 경우에는 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다. 즉, 하나의 항체의 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 초과량은 경쟁적 결합 분석으로 측정시 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 다른 항체의 결합을 억제한다 (예를 들어, 문헌 [Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502] 참조). 다르게는, 두 항체에서, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원에서의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우라면, 두 항체는 동일한 에피토프를 가진다. 두 항체에 있어서, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우라면, 두 항체는 중첩 에피토프를 가진다.

[0148] 이후에, 추가의 일반적인 실험 (예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여 시험 항체에서 관찰된 결합의 결여 문제가 실제로 기준 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인한 것인지 또는 입체 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여 문제의 원인인지를 확인할 수 있다. 　이러한 종류 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명, 유세포분석법 또는 당업계에서 이용하는 임의의 기타 정량적 또는 정성적 항체 결합 분석법을 사용하여 수행될 수 있다.

[0149] 특정 구현예에서, 본 발명은 배설항진 펩타이드 수용체 (NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 수소/중수소 교환법으로 측정시 NPR1 (서열번호 194의 아미노산 29-347의 세포외 도메인내 함유된 하나 이상의 아미노산과 상호작용하고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: (i) 심방 배설항진 펩타이드 (ANP)의 존재 또는 부재하에 사람 NPR1을 발현하는 세포에 결합하고/하거나 (ii) NPR1에 결합하고 NPR1을 활성화시킨다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 194의 아미노산 29 내지 45; (b) 서열번호 194의 아미노산 331 내지 347; (c) 서열번호 194의 아미노산 336 내지 347; (d) 서열번호 194의 아미노산 331 내지 335; 및 (e) 서열번호 194의 아미노산 70 내지 81로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 상호작용한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (a) 서열번호 194의 아미노산 29 내지 45; 및 (b) 서열번호 194의 아미노산 336 내지 347로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 상호작용한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ANP의 존재하에 (a) 서열번호 194의 아미노산 29 내지 45; 및 (b) 서열번호 194의 아미노산 331 내지 347로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 상호작용한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ANP의 존재하에 (a) 서열번호 194의 아미노산 29 내지 45; (b) 서열번호 194의 아미노산 70 내지 81; 및 (c) 서열번호 194의 아미노산 331 내지 335로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 상호작용한다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 ANP의 존재하에 NPR1 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 수소/중수소 교환법에 의한 측정시 (a) 서열번호 194의 아미노산 29 내지 45; 및 (b) 서열번호 94의 아미노산 331 내지 347로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 상호작용하지만 서열번호 194의 아미노산 70 내지 81과 상호작용하지 않고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: (i) ANP의 존재 또는 부재하에 사람 NPR1을 발현하는 세포에 결합하고/하거나; (ii) NPR1에 결합하고 NPR1을 활성화시킨다.

면역접합체

[0150] 본 발명은 NPR1-연관 질환 또는 장애 (예를 들어, 고혈압)을 치료하기 위해, 치료학적 잔기("면역접합체")에 접합된 사람 항-NPR1 모노클로날 항체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "면역접합체"라는 용어는 방사능 제제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 펩타이드 또는 단백질 또는 치료제에 화학적 또는 생물학적으로 결합되는 항체를 지칭한다. 항체는 그의 표적에 결합할 수 있는 한, 해당 분자의 어느 위치에서든 방사능 제제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 펩타이드 또는 치료제에 결합될 수 있다. 면역접합체의 예로는 항체 약물 컨쥬게이트 및 항체-독소 융합 단백질을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 제제는 NPR1 단백질에 대한 제2의 상이한 항체일 수 있다. 항-NPR1 항체에 접합될 수 있는 치료학적 모이어티의 유형에 대해서는, 치료될 조건 및 달성코자 하는 원하는 치료학적 효과를 고려할 것이다. 면역접합체를 형성하기에 적합한 제제의 예는 당업계에 공지되어 있으며;. 예를 들어, WO 05/103081호를 참조한다.

다중 특이적 항체

[0151] 본 발명의 항체는 단일 특이적, 이중 특이적 또는 다중 특이적일 수 있다. 다중 특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 서로 다른 에피토프에 특이적일 수 있거나, 또는 하나 이상의 표적 폴리펩타이드에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 문헌 [Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69]; [Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244]를 참조한다.

[0152] 본 발명의 임의의 다중 특이적 항원 결합 분자, 또는 이의 변이체는, 당업계의 숙련자에게 공지되어 있는 바와 같이, 표준 분자생물학 기법 (예를 들어, 재조합 DNA 및 단백질 발현 기법)을 이용하여 작제될 수 있다.

[0153] 일부 구현예에서, NPR1-특이적 항체는, NPR1 단백질의 별개의 도메인에 결합하는 가변 영역이 함께 연결되어 단일 결합 분자 내에서 이중 도메인 특이성을 부여하는 이중특이적 포맷 ("이중 특이성")으로 제조된다. 적절하게 디자인된 이중 특이성은 특이성과 결합 결합가 둘다를 증가시킴을 통해 전반적인 NPR1-단백질의 억제 효능을 증진시킬 수 있다. 개별 도메인 (예를 들어, N-말단 도메인의 세그먼트)에 대한 특이성을 가지거나, 또는 하나의 도메인 내의 서로 다른 영역들에 결합할 수 있는 가변 영역은, 각 영역이 별도의 에피토프, 또는 하나의 도메인 내의 서로 다른 영역들에 동시에 결합할 수 있도록 해주는 구조 스캐폴드 상에서 쌍을 형성한다. 이중 특이적 물질에 대한 한 예에서, 하나의 도메인에 대해 특이성을 갖는 결합제의 중쇄 가변 영역 (V_H)을, 상기 V_H에 대한 본래의 특이성을 방해하지 않으면서 본래의 V_H와 쌍을 형성할 수 있는 비동족성 V_L 파트너를 식별하기 위해, 제2 도메인에 대해 특이성을 갖는 일련의 결합제의 경쇄 가변 영역 (V_L)과 재조합시킨다. 이러한 방식으로, 단일 V_L 세그먼트 (예를 들어, V_L1)는 서로 다른 2개의 V_H 도메인 (예를 들어, V_H1 및 V_H2)과 조합되어 2개의 결합 "아암(arm)" (V_H1-V_L1 및 V_H2-V_L1)으로 이루어진 이중 특이적 물질을 생성할 수 있다. 단일 V_L 세그먼트의 사용은 시스템의 복잡성을 감소시킴으로써 이중 특이성을 생성하는데 사용되는 클로닝, 발현 및 정제 프로세스를 단순화시켜 해당 프로세스에서의 효율성을 증가시킨다 (예를 들어, US2011/0195454호 및 US2010/0331527호를 참조한다).

[0154] 다르게는, 하나 이상의 도메인 및 제2 표적, 예컨대 이제 제한되지는 않지만, 제2의 상이한 항-NPR1 항체에 결합하는 항체는 본원에 기술된 기법들, 또는 당업자에게 공지된 기타 기법들을 사용하여 이중 특이적 포맷으로 제조할 수도 있다. 별개의 영역에 결합하는 항체 가변 영역은, 예를 들어, NPR1의 세포외 도메인 상에서 관련 부위에 결합하는 가변 영역과 함께 결합시켜 단일 결합 분자 내에서 이중 항원 특이성을 부여할 수 있다. 적절하게 설계된 상기 특성을 갖는 이중 특이적 물질은 이중적인 기능을 수행한다. 세포외 도메인에 대해 특이성을 갖는 가변 영역을, 세포외 도메인 외부에 대해 특이성을 갖는 가변 영역과 조합시키고, 각각의 가변 영역이 별도의 항원에 결합할 수 있도록 해주는 구조 스캐폴드 상에서 쌍을 형성시킨다.

[0155] 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 예시적인 이중 특이적 항체 포맷은 제1 면역글로불린 (Ig) C_H3 도메인 및 제2 Ig C_H3 도메인의 사용을 수반하는데, 이 경우, 상기 제1 및 제2 Ig C_H3 도메인은 서로 적어도 하나의 아미노산이 다르고, 이러한 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산의 차이가 없는 이중 특이적 항체에 비해 단백질 A에 대한 이중 특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 하나의 구현예에서, 제1 Ig C_H3 도메인은 단백질 A에 결합하고 제2 Ig C_H3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의한; EU 넘버링에 따르면 H435R)과 같은 단백질 A 결합을 감소시키거나 폐지시키는 돌연변이를 함유한다. 제2 C_H3은 Y96F 변형 (IMGT에 의한; EU에 따르면 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 제2 C_H3 내에서 발견될 수 있는 추가의 변형은 다음을 포함한다: IgG1 항체의 경우에 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I (IMGT에 의한; EU에 따르면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I); IgG2 항체의 경우에 N44S, K52N, 및 V82I (IMGT; EU에 따르면 N384S, K392N, 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우에 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, 및 V82I (IMGT에 의한; EU에 따르면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I). 상기 기술된 이중 특이적 항체 포맷 상의 변화는 본 발명의 범위 내인 것으로 고려된다.

[0156] 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 기타 예시적인 이중 특이적 포맷으로는, 제한 없이, 예를 들어, scFv-기반 또는 이원항체 이중 특이적 포맷, IgG-scFv 융합체, 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig, 콰드로마(Quadroma), 놉-인투-홀(knob-into-hole), 공통 경쇄 (예를 들어, 놉-인투-홀을 갖는 공통 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼(zipper), 듀오바디(Duobody), IgG1/IgG2, 이작용성 Fab (DAF)-IgG 및 Mab² 이중 특이적 포맷을 포함한다 (상술한 포맷들에 대해 살펴보려면, 예를 들어, 문헌 [Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11] 및 해당 문헌에 인용된 참고문헌들을 참조한다). 이특이적 항체는 또한 펩타이드/핵산 구성을 사용하여 작제될 수 있고, 예를 들어, 여기서, 직교 화학적 반응성을 갖는 비천연 아미노산을 사용하여 부위-특이적 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 생성하고 이는 이어서 한정된 조성, 결합가 및 기하학적 구조를 갖는 다량체성 복합체로 자가 어셈블리한다. (문헌참조, 예를 들어, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).

치료학적 투여 및 제형

[0157] 본 발명은 상기 본 발명의 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 치료 조성물은 개선된 수송, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제제 내에 포함되는 적절한 담체, 부형제 및 기타 작용제들과 함께 투여될 것이다. 모든 약사들에게 알려진 처방집(formulary)에서 다수의 적절한 제제들을 찾아볼 수 있다: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.] 이들 제형은 예를 들어, 산제, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포(예를 들어 LIPOFECTIN™), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 ), 반-고체 겔, 및 카보 왁스를 함유하는 반-고체 혼합물을 포함한다. 또한 문헌(Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311)을 참조한다.

[0158] 항체의 용량은 투여하고자 하는 대상체의 나이 및 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 항체를 사용하여 성인 환자에서 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 이러한 질환을 예방하기 위해 사용되는 경우, 정상적으로 체중 1 kg당 약 0.1 내지 약 100 mg의 단일 용량으로 본 발명의 항체를 투여하는 것이 유리하다. 질환의 중증도에 따라, 치료의 빈도 및 지속시간을 조절할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 약 0.1 mg 내지 약 800 mg, 약 1 내지 약 600 mg, 약 5 내지 약 500 mg, 또는 약 10 내지 약 400 mg의 초기 용량으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 초기 용량을 투여한 후, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제2 용량 또는 복수의 후속 용량을 상기 초기 용량과 대략 동일하거나 더 적을 수 있는 양으로 투여할 수 있는데, 이 경우, 상기 후속 용량들은 적어도 1일 내지 3일; 적어도 1주, 적어도 2주; 적어도 3주; 적어도 4주; 적어도 5주; 적어도 6주; 적어도 7주; 적어도 8주; 적어도 9주; 적어도 10주; 적어도 12주; 또는 적어도 14주로 나눈다.

[0159] 다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜 내 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 돌연변이 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 세포 내 이입(endocytosis)이 공지되어 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조). 도입 방법으로는, 진피내, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 조성물은 임의의 통상적인 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들면, 구강 점막, 직장 점막 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적으로 활성인 제제들과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 약학적 조성물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Langer (1990) Science 249:1527-1533] 참조).

[0160] 본 발명의 항체를 전달하기 위해 나노입자의 사용도 본원에서 고려된다. 항체 접합된 나노입자는 치료 및 진단 용도로 모두 사용될 수 있다. 항체 접합된 나노입자 및 이의 제조 및 사용 방법은 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Arruebo, M., et al. 2009 ("Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" in J. Nanomat. Volume 2009, Article ID 439389, 24 pages, doi: 10.1155/2009/439389)]에 의해 상세히 기술되어 있다. 나노입자를 개발하여 약제학적 조성물에 함유된 항체에 접합시켜 세포를 표적화할 수도 있다. 약물 전달을 위한 나노입자도, 예를 들어, US 8257740호 또는 US 8246995호에 기술된 바 있으며, 이들은 각각 그 전문이 본원에 포함된다.

[0161] 특정한 상황에서는, 약제학적 조성물은 제어 방출형 시스템으로 전달될 수 있다. 한 구현예에서, 펌프를 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 중합체 물질을 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제어 방출형 시스템은 조성물의 표적 근방에 배치될 수 있기 때문에, 전체 용량의 일부만을 필요로 한다.

[0162] 주사가능한 제제들은 정맥내, 피하, 두개내, 복막내 및 근육내 주사, 점적 주입 등을 위한 투여 형태를 포함할 수 있다. 이러한 주사가능한 제제들은 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있다.

[0163] 본 발명의 약제학적 조성물은 표준 바늘 및 시린지로 피하 또는 정맥내 전달될 수 있다. 추가로, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물을 전달하는데 적용된다. 그러한 펜 전달 장치는 재사용가능하거나 1회용일 수 있다. 재사용가능한 펜 전달 장치는 일반적으로 약제학적 조성물을 함유하는 대체가능한 카트릿지를 사용한다. 일단 카트릿지 내 모든 약제학적 조성물이 투여되고 카트릿지가 속 빈 상태가 되면, 속 빈 카트릿지는 용이하게 처분될 수 있고 약제학적 조성물을 함유하는 새로운 카트릿지로 대체될 수 있다. 그렇게 한 후, 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다. 1회용 펜 전달 장치에서는 대체가능한 카트릿지가 없다. 차라리, 1회용 펜 전달 장치는 장치내 저장소에 유지되는 약제학적 조성물로 미리 채워진다. 일단 저장소에 약제학적 조성물이 비워지면 전체 장치를 버린다.

[0164] 유리하게, 상기된 경구 또는 비경구 사용을 위한 약제학적 조성물은 활성 성분의 용량에 맞도록 적합화된 유닛 용량 중 투여형으로 제조된다. 이러한 유닛 용량의 투여형으로는, 예를 들어, 정제, 환제, 캡슐, 주사제 (앰푸울), 좌제 등을 포함한다. 함유된 항체의 양은 일반적으로 단위 용량의 제형당 약 5 내지 약 500 mg이고; 특히 주사제 형태에 있어서는, 약 5 내지 약 300 mg으로, 다른 제형에 있어서는 약 10 내지 약 300 mg으로 항체를 함유하는 것이 바람직하다.

항체의 치료학적 용도

[0165] 본 발명의 항체는 NPR1과 관련된 질환 또는 장애 또는 병태의 치료 및/또는 예방하고/하거나, 이러한 질환, 장애 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 증상을 개선하는데 유용하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 NPR1과 연관된 질환 또는 장애 또는 병태가 있는 환자에게 치료학적 용량으로 투여될 수 있다.

[0166] 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 고혈압, 심부전증, 비만, 신부전증, 만성 신장 질환, 황반 부종, 녹내장, 뇌졸중, 폐 장애, 폐 섬유증, 염증, 천식, 골격 성장 장애, 골절, 당뇨병 및 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 NPR1-연관된 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후를 치료하거나 예방하기 위해 유용하다.

[0167] 또한 본원에서 a NPR1-연관된 질환 또는 장애를 앓을 위험에 있는 대상체에게 예방학적으로 본 발명의 하나 이상의 항체를 사용하는 것이 고려된다.

[0168] 본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 질환, 장애 또는 병태를 앓는 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물 또는 약물의 제조를 위해 사용된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 본원의 항체는 본원에 기재된 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 개선하는데 유용한 당업자에게 공지된 임의의 다른 제제 또는 임의의 다른 치료요법과 함께 보조 치료요법으로서 사용된다.

조합 치료요법

[0169] 조합 치료요법은 본 발명의 항체, 및 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체의 생물학적 활성 단편과 유리하게 조합될 수 있는 임의의 추가의 치료학적 제제를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 NPR1-연관된 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용되는 하나 이상의 약물 또는 치료요법과 상승작용적으로 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 상기 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선하기 위해 제2 치료학적 제제와 조합할 수 있다.

[0170] 질환, 장애 또는 병태에 의존하여, 본 발명의 항체는 알도스테론 길항제 (예를 들어, 에플레레논, 스피로놀락톤), 알파-아드레날린성 차단제 (예를 들어, 독사조신, 페녹시벤즈아민, 펜톨라민, 프라조신, 테트라조신), 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제 (예를 들어, 베나제프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 모엑시프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴, 라미프릴, 트란돌라프릴), 세동맥 혈관확장제 (예를 들어, 하이드랄라진, 미녹시딜), 자율 신경절 혈관확장제 (예를 들어, 메카밀라민), 베타-아드레날린성 차단제(아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 카베디롤, 카테올롤, 에스몰롤, 라베톨롤, 메토프롤롤, 나돌롤, 펜부테롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤, 티몰롤), 카테콜라민-고갈 교감 신경 (예를 들어, 데세르피딘, 레세르핀), 중추 알파-2 아드레날린성 효능제(예를 들어, 클로니딘, 구아나벤즈, 구안파신, 메틸도파), 칼슘 채널 차단제(딜티아젬, 베라파밀, 아믈로디핀, 펠로디핀, 이스라디핀, 니카디핀, 니페디핀, 니솔디핀), 이뇨제 (예를 들어, 부메타니드, 에타크린산, 푸로세아미드, 토르세미드, 클로로티아지드, 하이드로클로로티아지드, 하이드로플루메티아지드, 메티클로티아지드, 폴리티아지드, 클로르탈리돈, 인다파미드, 메톨라존), 레닌 억제제 (예를 들어, 알리스키렌), 항-응고제 (예를 들어, 쿠마딘, 다비가트란, 아픽사반), 항-혈소판 제제(예를 들어, 아스피린, 클로피도그렐), 콜레스테롤 저하제 (예를 들어, 스타틴, PCSK9 억제제, 예를 들어, 알리로쿠맙), 혈관확장제(예를 들어, 미녹시딜, 하이드랄라진, 니트레이트), 디지탈리스, 수술 (예를 들어, 혈관성형술, 관상 동맥 우회, 심장 이식), 이식가능한 디바이스(예를 들어, 밸브 대체, 제세동기 디바이스, 좌심실 원조 디바이스, 심박조율기), 항-종양 치료요법(예를 들어, 화학치료학적 제제, 수술, 방사선, PD-1 억제제), 인슐린, GLP1 효능제 (예를 들어, 엑세나티드, 리라글루티드, 릭시세나티드, 알비글루티드, 둘라글루티드, 세마글루티드), 메트포르민, 투석, 골수 자극제, 혈액여과, 생활양식 변형, 및 식이 보충물을 포함하지만 이에 제하되지 않는 하나 이상의 추가의 치료학적 제제와 조합하여 사용될 수 있다.

[0171] 본원에 사용된 “~와 조합된”이라는 용어는, 본 발명의 항-NPR1 항체의 투여 전에, 그의 투여와 동시에 또는 그의 투여 후에 추가의 치료학적 활성 성분(들)을 투여할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, “~와 조합된”이라는 용어는 항-NPR1 항체 및 제2 치료제의 연속적 투여 또는 동시적 투여도 포함한다.

[0172] 상기 추가의 치료학적 활성 성분(들)은 본 발명의 항-NPR1 항체를 투여하기 전에 대상체에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분의 투여 1주 전, 72시간 전, 60시간 전, 48시간 전, 36시간 전, 24시간 전, 12시간 전, 6시간 전, 5시간 전, 4시간 전, 3시간 전, 2시간 전, 1시간 전, 30분 전, 30분 미만 전에 투여되었다면, 제1 성분은 제2 성분의 투여 “전에” 투여된 것으로 간주될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 추가의 치료학적 활성 성분(들)은 본 발명의 항-NPR1 항체를 투여한 후에 대상체에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분의 투여 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 3시간 후, 4 시간 후, 5시간 후, 6시간 후, 12시간 후, 24시간 후, 36시간 후, 48시간 후, 60시간 후, 72시간 후, 72시간 후에 투여되었다면, 제1 성분은 제2 성분의 투여 “후에” 투여된 것으로 간주될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 추가의 치료학적 활성 성분(들)은 본 발명의 항-NPR1 항체의 투여와 동시에 대상체에게 투여할 수 있다. 본 발명의 목적을 위한 "동시적" 투여는, 예를 들어, 단일 제형으로, 또는 30분 이하 이내로 대상체에 서로 각각 투여되는 별도의 제형으로, 대상체에 대한 항-NPR1 항체 및 추가적의 치료학적 활성 성분의 투여를 포함한다. 별도의 제형으로 투여되는 경우, 각각의 제형은 동일한 경로를 통해 투여될 수 있으며 (예를 들어, 항-NPR1 항체 및 추가의 치료학적 활성 성분은 모두 정맥 내 등으로 투여될 수 있음); 다르게는, 각각의 제형은 서로 다른 경로를 통해 투여될 수 있다 (예를 들어, 항-NPR1 항체는 정맥 내로 투여될 수 있고, 추가의 치료학적 활성 성분은 경구 투여될 수 있음). 어떤 경우라도, 단일 제형으로, 동일한 경로에 의한 별도의 제형으로, 또는 서로 다른 경로에 의한 별도의 제형으로 상기 성분들을 투여하는 것은 본 명세서의 목적상 모두 "동시 투여"로 간주된다. 본 명세서의 목적상, 추가의 치료학적 활성 성분의 투여 "전에", 투여와 "동시에", 또는 투여 "후에" (이들 용어는 상기 본원에서 정의한 바와 같음) 항-NPR1 항체의 투여는 추가의 치료학적 활성 성분과 "조합된" 항-NPR1 항체의 투여로 간주된다.

[0173] 본 발명은, 본 발명의 항-NPR1 항체가 본원의 다른 부분에 기술된 바와 같이 추가의 치료학적 활성 성분(들) 중 하나 이상과 함께 제제화된 약제학적 조성물을 포함한다.

항체의 진단적 용도

[0174] 본 발명의 항체는 예를 들어, 진단 목적으로 샘플에서 NPR1을 검출하고/하거나 측정하는데 사용할 수 있다. 일부 구현예는 NPR1-연관 질환 또는 장애를 검출하기 위한 검정에서 본 발명의 하나 이상의 항체의 사용을 고려한다. NPR1에 대한 예시적인 진단 검정은, 예를 들어, 환자로부터 수득한 샘플을 본 발명의 항-NPR1 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 이 경우 상기 항-NPR1 항체를 검출가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지하거나 또는 포획 리간드로 사용하여, 환자 샘플로부터 NPR1 단백질을 선택적으로 분리한다. 다르게는, 비표지된 항-NPR1 항체를 자체적으로 검출 가능하게 표지된 2차 항체와 함께 진단적 용도로 사용할 수 있다. 상기 검출가능한 표지 또는 리포터 분자는, 예컨대 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S 또는 ¹²⁵I와 같은 방사성 동위원소; 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 로다민과 같은 형광성 또는 화학발광성 모이어티; 또는 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제 또는 루시퍼라제와 같은 효소일 수 있다. 샘플 중에서 NPR1를 검출 또는 측정하는데 사용될 수 있는 특정 예시적인 검정은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함한다.

[0175] 본 발명에 따른 NPR1 진단 분석법에 사용될 수 있는 샘플로는 정상적인 상태 또는 병리적 상태 하에서 검출가능한 양의 NPR1 단백질 또는 이의 단편을 함유하는, 환자로부터 수득가능한 임의의 조직 또는 체액 샘플을 포함한다. 일반적으로, 건강한 환자(NPR1과 연관된 질환에 걸리지 않은 환자)로부터 수득된 특정 샘플 중의 NPR1 수준을 측정하여 NPR1의 기본 또는 표준 수준을 먼저 확립할 것이다. 이후, 이러한 NPR1의 기본 수준을 NPR1 관련 질환, 또는 이러한 질환과 관련된 증상을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 샘플 중에서 측정한 NPR1의 수준과 비교할 수 있다.

[0176] NPR1에 특이적인 항체들은 추가의 표지 또는 모이어티를 함유하지 않을 수도 있거나, 또는 이들은 N-말단 또는 C-말단 표지 또는 모이어티를 포함할 수도 있다. 한 구현예에서, 상기 표지 또는 모이어티는 비오틴이다. 결합 분석에서, 표지가 (존재하는 경우) 그 위치는 펩타이드가 결합되는 표면에 대하여 펩타이드의 배향을 결정할 수 있다. 예를 들어, 표면을 아비딘으로 코팅하는 경우, N-말단 비오틴을 포함하는 펩타이드는 펩타이드의 C-말단 부분이 상기 표면에서 멀어지도록 배향될 것이다.

실시예

[0177] 하기의 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 기재 및 기술을 제공하기 위해 제시된 것이고 발명자가 이들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수치 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 관하여 정확성을 기하기 위해 노력하였으나, 일부 실험적 오차와 편차들은 고려되어야 한다. 달리 지시하지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 실온은 약 25℃이며, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.

실시예 1: 배설항진 펩타이드 수용체 1 (NPR1)에 대한 사람 항체의 생성

[0178] 사람 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 VELOCIMMUNE^® 마우스에서 NPR1 단백질에 대한 사람 항체를 생성하였다. 마우스는 사람 NPR1 및 마우스 ANP DNA로 수력학적 (hydrodynamic) DNA 전달에 의해 면역화시고 마우스 ANP에 복합체화된 사람 NPR1 단백질의 세포외 도메인에 의해 부스팅하였다.

[0179] 항체 면역 반응은 NPR1-특이적 면역검정에 의해 모니터링하였다. 목적하는 면역 반응이 달성된 경우, 비장 세포를 수거하고 마우스 골수종 세포와 융합시켜 생존력을 보존하고 하이브리도마 세포주를 형성하였다. 상기 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여 NPR1-특이적 항체를 생성하는 세포주를 동정하였다. 상기 세포주를 사용하여 수개의 항-NPR1 키메라 항체 (즉, 사람 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 갖는 항체)를 수득하였다.

[0180] 또한, 항-NPR1 항체는 미국 특허 7,582,298호 (전문이 본원에 참조로 인용됨)에서 기술된 바와 같이, 골수종 세포에 융합하지 않고 항원-양성 마우스 B 세포로부터 직접 분리하였다. 상기 방법을 사용하여 수개의 완전한 사람 항-NPR1 항체 (즉, 사람 가변 도메인 및 사람 불변 도메인을 갖는 항체)를 수득하였다.

[0181] 상기된 바와 같이 생성된 예시적인 항체는 mAb22033, mAb22035, mAb22805, mAb22809, mAb22810, mAb25479, mAb25491, mAb25497, mAb25498, mAb25502, mAb25508, 및 mAb25545로서 지정하였다.

[0182] 본 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항체들의 생물학적 특성에 대해서는 하기 제시된 실시예들에서 상세히 기술한다.

실시예 2: 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열

[0183] 표 1은 선택된 본 발명의 항-NPR1 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR에 대한 아미노산 서열 식별기호(identifier)를 제시한다.

[표 1]

[0184] 상응하는 핵산 서열 식별기호를 표 2에 기재하였다.

[표 2]

[0185] 본원에 언급된 항체는 전형적으로 완전한 사람 가변 영역을 갖지만 사람 또는 마우스 불변 영역을 가질 수 있다. 당업계의 숙련자라면 누구나 알 수 있는 바와 같이, 특정 Fc 이소타입을 갖는 항체는 상이한 Fc 이소타입을 가진 항체 (예를 들어, 마우스 IgG1 Fc를 갖는 항체는 사람 IgG4를 갖는 항체 등으로 전환될 수 있음)로 전환될 수 있지만, 어떠한 경우가 됐던, (CDR을 포함하는) 가변 도메인 - 표 2에서 나타낸 수치 식별기호로 표시됨 - 은 동일하게 유지될 것이고, 항원에 대한 결합 특성은 Fc 도메인의 성질에 관계없이 동일하거나 실질적으로 유사할 것으로 기대된다. 특정 구현예에서, 마우스 IgG1 Fc를 갖는 선택된 항체를 사람 IgG4 Fc를 갖는 항체로 전환시켰다. 한 구현예에서, 상기 IgG4 Fc 도메인은 US20100331527호에 개시된 바와 같은 2 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 하나의 구현예에서, 사람 IgG4 Fc는 이량체 안정화를 촉진시키기 위해 힌지 영역 (S108P)에서 세린의 프롤린으로의 돌연변이를 포함한다. 달리 지정되지 않는 경우, 하기의 실시예에 사용된 모든 항체는 사람 IgG4 이소타입을 포함한다.

하기 실시예에서 사용된 대조군 작제물

[0186] 비교의 목적을 위해, 하기의 대조군 작제물 (항-NPR1 항체)을 본원에 개시된 실험에 포함시켰다: "비교인자 1," 미국 특허 제20120114659호 (Morphosys)에 따라 항체 “mAb5591”의 V_H/V_L 서열을 갖는 사람 NPR1에 대한 모노클로날 항체.

실시예 3: 표면 플라스몬 공명으로 측정시 NPR1에 대한 항체 결합

실험 과정

[0187] 정제된 항-NPR1 모노클로날 항체(mAb)로의 상이한 NPR1 시약 결합에 대한 평형 해리 상수 (K_D)는 실시간 표면 플라스몬 공명 기반 Biacore 4000 바이오센서를 사용하여 결정하였다. 모든 결합 연구는 25°C 및 37°C에서 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA 및 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, pH 7.4 (HBS-ET) 전개 완충액중에서 수행하였다. 바이아코어 CM5 센서 칩 표면은 먼저 마우스 항-사람 Fc 특이적 mAb (GE Healthcare, # BR100839) 또는 염소 항-사람 Fcγ 특이적 폴리클로날 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, # BR-1008-39) 중 어느 하나와 아민 커플링시켜 유도체화하여 항-NPR1 mAb를 포획하였다. 결합 연구는 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘과 함께 발현되는 사람 NPR1 세포외 도메인 (hNPR1-MMH)(서열번호 194), C-말단 myc-myc-헥사히스티딘과 함께 발현되는 몽키 NPR1 세포외 도메인 (mfNPR1-MMH)(서열번호 195), C-말단 myc-myc-헥사히스티딘과 함께 발현되는 마우스 NPR1 세포외 도메인(mNPR1-MMH) (서열번호 196), C-말단 마우스 IgG2a와 함께 발현되는 사람 NPR1 세포외 도메인 (hNPR1-mFc)(서열번호 197), C-말단 마우스 IgG2a와 함께 발현되는 몽키 NPR1 세포외 도메인 (mfNPR1-mFc)(서열번호 198), C-말단 마우스 IgG2a와 함께 발현되는 마우스 NPR1 세포외 도메인(mNPR1-mFc) (서열번호 199), hNPR1-mFc + hANP, hNPR1-mFc + hBNP, mfNPR1-mFc + hANP, mfNPR1-mFc + hBNP, mNPR1-mFc + mANP, mNPR1-mFc + mBNP에 대해 수행하였다. 상이한 농도의 hNPR1-MMH, mfNPR1-MMH(100nM - 3.7nM, 3-배 연속 희석 또는 100nM - 6.25nM, 4-배 연속 희석); hNPR1-mFc, mfNPR1.mFc (100nM - 1.56nM, 4-배 연속 희석 또는 100nM - 3.7nM, 3-배 연속 희석); 10-배 농도의 hANP 또는 hBNP (100nM, 25nM, 6.25nM 또는 100nM - 3.7nM, 3-배 연속 희석)와 복합체화된, mNPR1.mmh (100nM), hNPR1-mFc 또는 mfNPR1-mFc; 10-배 농도의 mANP 또는 mBNP (100nM, 25nM 또는 100nM - 3.7nM, 3-배 연속 희석)와 복합체화된 mNPR1.mFc 또는 HBS-ET 전개 완충액 중에서 제조된 10-배 농도의 hANP (100nM - 6.25nM, 4-배 연속 희석)에 복합체화된 hNPR1-hFc 또는 hNPR1-hFc는 4분 동안 30μL/min의 유속으로 주사하였고, mAb 결합된 상이한 NPR1 시약의 해리는 HBS-ET 전개 완충액에서 10분동안 모니터링하였다. 각각의 사이클 말기에, NPR1 mAb 포획 표면은 마우스 항-사람 Fc 특이적 mAb 표면에 대해 20mM 인산의 10초 주사 또는 염소 항-사람 Fcγ 특이적 폴리클로날 항체에 대해 10mM 글라이신, HCl,pH1.5의 40초 주사 또는 10mM Gly pH 1.5의 2개의 1분 주사를 사용하여 재생하였다. 결합 속도 (ka) 및 해리 속도(kd)는 스크러버(Scrubber) 2.0c 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 매쓰 수송이 제한된 1:1 결합 모델에 실시간 결합 센서그램을 피팅함으로써 결정하였다. 결합 해리 평형 상수 (K_D) 및 해리 반감기 (t½)는 하기와 같이 동력학 속도로부터 계산하였다:

K _D (M) =

, 및 t½ (min) =

결과

[0188] 25°C 및 37°C에서 본 발명의 선별된 항-NPR1 항체로의 상이한 NPR1 단백질 결합에 대한 결합 동력학 파라미터는 표 3 내지 26에 나타낸다.

[0189] [표 3]

[0190] [표 4]

[0191] [표 5]

[0192] [표 6]

[0193] [표 7]

[0194] [표 8]

[0195] [표 9]

[0196] [표 10]

[0197] [표 11]

[0198] [표 12]

[0199] [표 13]

[0200] [표 14]

[0201] [표 15]

[0202] [표 16]

[0203] [표 17]

[0204] [표 18]

[0205] [표 19]

[0206] [표 20]

[0207] [표 21]

[0208] [표 22]

[0209] [표 23]

[0210] [표 24]

[0211] [표 25]

[0212] [표 26]

[0213] 표 3 내지 6에 나타낸 바와 같이, 선별된 항-NPR1 항체는 단량체 사람 및 몽키 NPR1에 결합하였다.

[0214] 표 9 내지 20에 나타낸 바와 같이, 상기 항체는 ANP 또는 BNP의 존재 및 부재 둘다에서 사람 및 몽키 NPR1 이량체에 결합하였다.

[0215] 상기 항체는 mAb25502가 ANP/BNP의 존재하에 mNPR1에 결합한 것을 제외하고는 마우스 NPR1에 결합하지 않았다(표 21 내지 26).

실시예 4: 선별된 항-NPR1 효능제 모노클로날 항체 간의 교차-경쟁

실험 과정

[0216] 옥텟(Octet) HTX 바이오센서 플랫폼(Pall ForteBio Corp.) 상에서 실시간 무표지 바이오-층 간섭굴절측정법 검정을 이용하여 항-NPR1 모노클로날 항체 (mAb)들의 패널내 결합 경쟁을 결정하였다. 전체 실험은 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 및 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, 1mg/mL BSA, pH 7.4 (HBS-EBT) 완충액중에서 플레이트를 1000 rpm의 속도로 진탕시키면서 25℃에서 수행하였다. 2개의 항체가 서로 이들 각각의 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있는지를 평가하기 위해, C-말단 마우스 IgG2a (hNPR1-mFc; 서열번호 453)와 함께 발현되는 100nM 재조합 사람 NPR1은 먼저 적어도 2시간 동안 사람 ANP 2μM으로 항온처리하였다. 약 0.3-0.5nm의 재조합 hNPR1-mFc/hANP 복합체는 먼저 hNPR1-mFc/hANP 복합체를 함유하는 웰 중에서 45초동안 바이오센서 팁을 잠수시킴에 의해 항-마우스 Fc 항체 피복된 옥텟 바이오센서 팁 (Fortebio Inc, # 18-5090)을 침지시켜 포획하였다. 항원 포획된 바이오센서 팁을 이어서 5분동안 mAb-1의 50μg/mL 용액을 함유하는 웰에 침지시켜 제1의 항-NPR1 모노클로날 항체 (mAb-1으로서 언급됨)로 포화시켰다. 바이오센서 팁을 이어서 3분 동안 제2 항-NPR1 모노클로날 항체 (mAb-2로서 언급됨)의 50μg/mL 용액을 함유하는 웰에 침지시켰다. 바이오센서 팁은 실험 단계 마다 HBS-EBT 완충액 중에서 세척하였다. 실시간 결합 반응을 전체 실험 과정 동안 모니터링하였고, 매 단계의 종료시에 결합 반응을 기록하였다. mAb-1와 예비-복합체화된 hNPR1-mFc/hANP로의 mAb-2 결합 반응을 비교하고 상이한 항-NPR1 모노클로날 항체의 경쟁/비-경쟁 거동을 결정하였다.

결과

[0217] [표 27]

[0218] 표 27은 선별된 항-NPR1 항체 간의 교차-경쟁을 보여준다.

실시예 5: NPR1을 발현하는 세포로의 항체 결합

실험 과정

[0219] 리간드-사람 ANP (hANP) 중 하나의 존재 또는 부재하에 사람 NPR1 (hNPR1) 발현 세포에 결합하는 항-사람 (h) NPR1 모노클로날 항체의 능력은 전기화학발광 (ECL) 기반 검출을 사용하여 결정하였다.

[0220] 간략하게, HEK293/hNPR1.myc.DKK 발현 세포는 사람 배아 신장(HEK) 293 세포를 사람 NPR1 (아미노산 M1-G1061-P16066)을 암호화하는 네오마이신 내성 pLVX.hNPR1.myc.DDK 발현 플라스미드로 형질감염시킴에 의해 가공하였다. 비-형질감염된 HEK293 세포는 시판되는 a-hNRP1 항체를 사용한 형광성 활성화된 세포 분류 (FACS)에 의한 NPR1의 어떠한 검출가능한 발현을 갖지 않았고 비-특이적 결합 대조군으로서 포함시켰다.

[0221] 실험은 하기의 과정에 따라 수행하였다. 상기된 세포주로부터의 세포는 Ca²⁺/Mg²⁺ 부재하에 1x PBS 완충액중에서 1회 세정하고 효소 부재 세포 해리 용액과 37°C에서 10분동안 항온처리하여 세포를 플라스크로부터 탈착시켰다. 모든 세포는 Ca²⁺/Mg²⁺을 갖는 1 x PBS로 1회 세척하고 Cellometer^TM 자동 T4 세포 계수기 (Nexcelom Bioscience)를 사용하여 계수하였다. 대략적으로 2.0x10⁴ HEK293/hNPR1.myc.DDK 또는 HEK293 세포는 96-웰 탄소 전극 플레이트(MULTI- ARRAY 높은 결합 플레이트, Meso 스케일 발견(MSD, Rockville, MD)) 상으로 별도로 씨딩하고 37^℃에서 1시간 (h) 동안 항온처리하였다. 비특이적 결합 부위는 실온(RT)에서 1시간 동안 Ca²⁺/Mg²⁺을 갖는 1x PBS 중에서 2% BSA (w/v)에 의해 차단시켰다. HEK293/hNPR1.myc.DDK 세포는 10nM 사람 ANP (Tocris, Minneapolis, Mn)의 존재 또는 부재하에 샘플 희석 완충액에서 RT에서 0.5시간동안 항온처리하였고, HEK293 세포는 동일한 조건에서만 샘플 희석 완충액 중에서 항온처리하였다. 세척 없이, 1.7 pM 내지 100 nM 범위의 항-NPR1, COMP1 또는 이소타입 대조군 항체의 연속 희석물 또는 어떠한 항체를 함유하지 않는 완충액을 1시간동안 RT에서 플레이트-결합된 세포에 첨가하였다. 이어서 플레이트는 세포 세척 헤드를 갖는 AquaMax2000 플레이트 세척기(MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA)를 사용하여 세척하여 결합되지 않은 항체 및/또는 hANP를 제거하였다. 플레이트-결합된 항체는 RT에서 1시간 동안 중쇄 및 경쇄에 특이적인 SULFO-TAG^TM-접합된 염소 폴리클로날 항-사람 IgG 항체를 사용하여 검출하였다(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA).

[0222] 세척 후, 플레이트는 제조업자의 추천된 과정에 따라 판독(Read) 완충액 (MSD, Rockville, MD)으로 전개하였고, 발광 신호는 SECTOR Imager 600 (MSD, Rockville, Md)를 사용하여 기록하였다. 상대적 광 유닛 (RLU)으로 측정된 발광 강도를 기록하여 농도 범위에서 각각의 항체의 결합 강도를 나타내었다. 어떠한 hANP의 첨가 없이 모세포로의 동일한 농도의 항체 결합과 비교하여, 10nM hANP의 존재 또는 부재하에 NPR1 가공된 세포로의 3.7nM 항체로 검출된 신호의 비율은 NPR1 결합 특이성을 나타내기 위해 보고하였다. 3 이상의 결합 비율을 갖는 항체는 특이적 결합제로서 분류되었고 3 미만의 결합 비율을 갖는 항체는 비-결합제로서 분류되었다.

[0223] 추가로, 직접적인 결합 신호(RLU)는 항체 농도의 함수로서 분석하였고 데이터는 R 통계학적 팩키지 (개방 소스)를 사용한 S자 (4-파라미터 로지스틱) 용량-반응 모델로 피팅하였다. 최대 결합 신호의 50%가 검출되는 항체 농도로서 정의되는 EC₅₀ 값은 10nM hANP의 존재 또는 부재하에 NPR1 가공된 세포에 대한 결합 효능을 지적하기 위해 결정하였다. EC₅₀ 값은 특이적 결합제에 대해서만 보고되고 표 28에서 3미만의 비율을 갖는 항체에 대해 (-)로 표시하였다.

결과

[0224] 표 28은 사람 NPR1 또는 NPR1-ANP 복합체를 발현하도록 가공된 세포로의 선별된 항-NPR1 항체의 결합을 보여준다.

[0225] [표 28]

[0226] 표 28에서의 결과가 보여주는 바와 같이, 모든 항-NPR1 항체는 ≥2의 비율로 10nM hANP의 존재하에 hNPR1 가공된 세포에 특이적으로 결합하였다. 10nM hANP를 갖는 HEK293/hNPR1.myc.DDK 세포에 대한 이들 항체의 효능은 0.15nM 내지 3.7nM의 EC₅₀ 값 범위이다. 5개 항체 및 비교인자1은 10nM hANP의 존재하에서만 NPR1 가공된 세포에 특이적으로 결합하였고 펩타이드 의존성 NPR1 결합제로서 분류되었다. 다른 7개의 항체는 10nM hANP의 존재 및 부재하에 hNPR1 가공된 세포에 특이적으로 결합하였고 이들 항체는 펩타이드 독립적 NPR1 결합제로서 분류되었다. 어떠한 hANP의 첨가 없이 HEK293/hNPR1.myc.DDK 세포에 대한 이들 항체의 효능은 0.49nM 내지 4.6nM의 EC₅₀ 값 범위이다.

실시예 6: 효능제 항-NPR1 모노클로날 항체에 의한 NPR1의 활성화

실험 과정

[0227] 사람 배설항진 펩타이드 수용체 1 (hNPR1)의 전사 활성화를 평가하기 위해, 안정한 세포주는 HEK293에서 사이클릭 뉴클레오타이드 게이팅된 채널 알파 2 (CNGA2) 및 hNPR1을 안정적으로 발현시킴에 의해 발육되었다. CNGA2는 cGMP에 의해 활성화될 수 있는 칼슘 채널이고 따라서, 이것은 cGMP 생성에 대한 센서로서 사용될 수 있다(문헌참조: Wunder et al. 2005, PMID: 15766716). NPR1은 리간드에 의해 활성화되고 cGMP(Zois et al., 2014, PMID: 24820868)을 생성함으로써, CNGA2는 활성화되고 칼슘 유입은 형광성 Ca⁺⁺ 지시기를 사용하여 측정될 수 있다. 세포주는 hNPR1, HEK293/hNPR1.MycDDK/CNGA2.Myc HS의 높은 발현에 대해 분류되거나 HEK293/CNGA2/hNPR1로의 약어로 나타내고, 10% FBS, NEAA, pen/strep/glut, 100μg/mL 하이그로마이신, 및 500μg/mL G418 설페이트를 함유하는 DMEM에 유지시켰다.

[0228] 생검정을 수행하여 ANP의 부재하에 사람 NPR1 신호 전달에 대한 항-hNPR1 항체의 효과를 측정하였다. 생검정을 위해, HEK293/CNGA2/hNPR1 세포는 10% FBS, NEAA, pen/strep/glut를 함유하는 DMEM 중에서 30,000 세포/웰로 검정 투명한 바닥의 PDL 플레이트에 씨딩하고 37°C 및 5% CO₂에서 밤새 항온처리하였다. 다음날 아침에, 배지를 제거하고 세포에는 37ºC에서 30분동안 프로베네시드 (Thermo Scientific)를 갖는, 80μl의 FLUO4-NW 검정 완충액을 부하하였다. 정제된 hNPR1 항체 또는 이소타입 대조군 항체는 ~0.4nM-1μM (8-포인트)의 1:3으로 연속으로 희석시키거나 ~0.3pM 내지 2nM (10-포인트)의 1:3에서의 ANP는 FLIPR TETRA® (Molecular Devices)를 사용하여 검정 플레이트에 전달하였다. 기준선 및 반응 이미지를 캡쳐하였다. 용량 반응 곡선은 Max-Min 또는 곡선 이하 면적(여기에 나타냄)을 기준으로 결정하였고, 상기 결과는 Prism™6 소프트웨어(GraphPad)와 함께 비선형 회귀(4-파라미터 로지스틱)를 사용하여 분석하여 EC₅₀ 값을 수득하였다. 항체의 % 활성화는 ANP에 의해 성취된 RFU의 최대 범위 상에서 항체에 의해 성취된 RFU의 최대 범위를 사용하여 계산하였다.

결과

[0229] 표 29는 항-NPR1 항체에 의한 사람 NPR1의 활성화를 보여준다.

[0230] [표 29]

[0231] 본 발명의 선별된 항-NPR1 항체에 의한 hNPR1 항체의 활성화는 2개의 실험(Expt I 및 II) (표 29)에서 HEK293/CNGA2/hNPR1에서의 칼슘 플럭스 활성을 측정함에 의해 시험되었다(표 29). 표 29에 나타낸 바와 같이(Expt I에서), 11개 정제된 NPR1 항체는 Ca2+ 플럭스에서 활성화를 보여주었고 이의 범위는 55-130% 최대 활성화이고 EC₅₀은 83.7 - 383.9nM이다. 19개 항체는 약한 활성을 보여주었고 최대 활성화는 31% 미만 (데이터는 나타내지 않음)이다. Expt II에서, 9개 항-NPR1 항체는 57 내지 129% 최대 활성화 범위의 Ca2+플럭스에서의 활성화를 보여주었고, EC₅₀은 41.6 - >200nM이다(표 29). ANP를 활성화시키고 EC₅₀은 60.5-98.8pM이다. 어떠한 활성화도 대조군 hIgG4 이소타입 항체를 사용하여 관찰되지 않았다.

실시예 7: 정상 혈압 NPR1 ^hu/hu 마우스에서 전신 혈압에 대한 단일 용량의 효능제 항-NPR1 모노클로날 항체의 효과

실험 과정

[0232] 상기 연구의 목적은 원격 측정된 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 기준선 전신 혈압에 대한 선별된 NPR1 효능제 항체의 효과를 평가하는 것이다. ~10-20주령의 수컷 NPR1^hu/hu (n=50) 마우스에는 PA-C10 원격 측정기를 이식하고(DSI, St. Paul, MN) 그룹 (그룹 1 내지 12)에 할당하기 전에 7일 동안 회복하도록 방치하였다(표 30).

[0233] [표 30]

[0234] 동물은 개별적으로 표준 조건 (64°F 내지 84°F(18°C 내지 29°C)의 온도; 30% 내지 70%의 상대 습도)하에 거주시키고 12-시간 광/12-시간 암 사이클을 유지하였다. 음식물(연구 식이 표준 펠렛 저작물) 및 물을 자유롭게 제공하였다.

[0235] 시험 단백질 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)는 0일째에 단일 피하 주사로 적당한 동물에 투여하였다. 각각의 동물에 대한 용량 용적은 가장 최근의 체중 측정을 기준으로 하였다.

[0236] 수축기 혈압, 확장기 혈압, 평균 동맥 혈압 및 심박수는 시험 기간의 지속 기간 동안 매분 10초 동안 수집하였다. 효능의 급성 평가는 연구 3일째 내지 연구 7일째에 컴파일링된 데이터와 함께 수행하였다. NPR1 효능제 항체의 만성 효과는 28일동안 수집되고 평균화된 매일 24시간 데이터로 평가하였다. 모든 데이터는 평균 ±SEM으로서 제공된다.

결과

[0237] NPR1 효능제 항체의 초기 생체내 스크린은 투여 후 3 내지 7일에 PBS 투여된 대조군 동물과 비교하는 경우, 9개 항체(mAb22033, mAb25479, mAb25497, mAb22805, mAb25545, mAb22809, mAb25491, mAb25502 및 mAb22810)가 유의적으로 감소되고 1개의 항체 (mAb22035)가 전신 혈압에 대해 효과를 갖지 않음을 입증하였다(도 1). 기준선으로 부터 평균(투여 후 3일 내지 7일의) 수축기 혈압 변화에 의한 평가시 혈압 감소의 정도는 -3.2±0.2 (mAb25497N) 내지 -11.5±0.8 (mAb22810) mmHg 범위이다.

[0238] NPR1 효능제 항체의 만성 효과는 28일동안 평가하였다(표 31).

[0239] [표 31]

[0240] 0일째에 단일 피하 주사 후, 하나의 항체(mAb22035)는 ~4-7 mmHg로 혈압을 유의적으로 증가시켰고, 나머지 항체는 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 2 내지 11 mmHg로 전신 혈압을 감소시켰다. 증가되고 감소된 전신 혈압 둘다에 대한 심박수 반응은 다양할 수 있고, 일부 그룹은 증가하고 다른 그룹은 감소한다.

실시예 8: 정상 혈압 NPR1 ^hu/hu 마우스에서 전신 혈압에 대한 효능제 항-NPR1 모노클로날 항체의 용량 효과

실험 과정

[0241] 상기 연구의 목적은 원격 측정된 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 전신 혈압에 대한 NPR1 효능제 항체 mAb22033의 용량 반응을 평가하는 것이다. ~20주령의 수컷 NPR1^hu/hu (n=30) 마우스에는 PA-C10 원격 측정기를 이식하고(DSI, St. Paul, MN) 그룹 (그룹 1 내지 5)에 할당하기 전에 7일 동안 회복하도록 방치하였다(표 32).

[0242] [표 32]

[0243] 동물은 개별적으로 표준 조건 (64°F 내지 84°F(18°C 내지 29°C)의 온도; 30% 내지 70%의 상대 습도)하에 거주시키고 12-시간 광/12-시간 암 사이클을 유지하였다. 음식물(연구 식이 표준 펠렛 저작물) 및 물을 자유롭게 제공하였다.

[0244] 시험 단백질은 피하 주사를 통해 0일째 1회 적당한 동물에게 투여하였다. 각각의 동물에 대한 용량 용적은 가장 최근의 체중 측정을 기준으로 하였다. 뇨 및 혈청 바이오마커 평가를 위해, 뇨는 28일째에 수거하고 혈액 샘플은 연구 14일째 및 종료시에 수거하였다. 초음파 심장 진단은 이뇨전에 28일째에 수행하였다.

[0245] 수축기 혈압, 확장기 혈압, 평균 동맥 혈압 및 심박수는 시험 기간의 지속 기간 동안 매분 10초 동안 수집하였다. 그래프로 나타낸 원격 측정 데이터는 연구의 생애 기간 동안 실행가능한 신호를 가진 동물로부터 수득하였다.

결과

[0246] 혈압(도 2, 3 및 5)은 단일 용량의 mAb22033를 정상 혈압 NPR1^hu/hu 마우스에 투여한 후 최대 4주 동안 10 내지 15 mmHg로 감소하였다. 모든 용량에 대한 피크 혈압 감소는 유사하였고, 혈압 효과의 지속기간은 대략 1 mg/kg에서 대략 10일이고 50mg/kg에 대해서는 28일 이상이다.

[0247] [표 33]

[0248] 뇨 cGMP 농도 (표 34)는 50 mg/kg 그룹에서 28일째 유의적으로 증가하였고, 모든 다른 용량은 대조군과 유사한 수준이다.

[0249] [표 34]

[0250] 상대적 심장 중량 (표 35)은 50 mg/kg 그룹에서 보다 낮았고, 1, 5 및 25 mg/kg 그룹에서 감소하는 경향이 있다. 체중 (표 35), 절대 심장 중량 (표 35), 표준 혈청 (ALT, AMYLAS, AST, CHOL, CKNAC, CREA, DHDL, IP, TRIG, TP, UA, UN, MG, NEFA) 또는 뇨 (ALB, GLUH, CREA, PRO, CA, IP, MG, UN, AMYLAS, UA, NA, K, CL) 화학물질에 대한 어떠한 유의적 효과가 관찰되지 않았다.

[0251] [표 35]

[0252] 심근 기능(도 6 및 7a)은 mAb22033의 투여 후 증진되었고, 최종 수축기 용적의 통계학적으로 유의적인 감소는 25mg/kg 용량 그룹에서 주지되었고 (도 7a), 분획 단축화 (도 7c) 및 배출 분획 (도 7b) 둘다에서 증가하는 경향이 있고, 대부분은 25 및 50 mg/kg 그룹에서 자명하다.

[0253] 주요 발견은 NPR1 효능제 mAb인 mAb22033이 최대 28일 동안 지속적인 수축기 및 평균 동맥 혈압이 유의적으로 감소하하였다는 것이다. 심박수에서 보상적 증가는 처음에 모든 그룹에서 관찰되었고, 이소타입 대조군 mAb와 비교하여 50 mg/kg mAb22033 용량 그룹에서 지속적인 최소 증가를 갖는다.

실시예 9: 고혈압 NPR1 ^hu/hu 마우스에서 전신 혈압에 대한 단일 용량의 효능제 항-NPR1 모노클로날 항체의 효과

실험 과정

[0254] 상기 연구의 목적은 원격 측정된 안지오텐신 II-(Ang II)-유도된 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 전신 혈압에 대한 NPR1 효능제 항체(mAb22033 또는 mAb22810)의 단일 용량의 효과를 평가하는 것이다. ~13주령의 수컷 NPR1^hu/hu (n=36) 마우스에는 PA-C10 원격 측정기를 이식하고(DSI, St. Paul, MN) 그룹 (그룹 1 내지 12)에 할당하기 전에 7일 동안 회복하도록 방치하였다(표 36).

[0255] [표 36]

[0256] 동물에는 이어서 삼투압 소형 펌프 (Alzet Micro-Osmotic Pump; Model 1004; Lot 10335-14)를 이식하였다. 소형 펌프에는 안지오텐신 II 아세테이트 염(Bachem; Lot #1066804)을 채우고 1.5 mg/kg/일 Ang II의 전달을 위해 0.11 μL/hr의 평균 펌핑 속도로 설정하였다. 소형 펌프는 투여 개시 3일 전에 견갑부에 피하로 이식하였다. 동물은 개별적으로 표준 조건 (64°F 내지 84°F(18°C 내지 29°C)의 온도; 30% 내지 70%의 상대 습도)하에 거주시키고 12-시간 광/12-시간 암 사이클을 유지하였다. 음식물(연구 식이 표준 펠렛 저작물) 및 물을 자유롭게 제공하였다.

[0257] 시험 단백질은 피하 주사를 통해 3일째 1회 적당한 동물에게 피하 투여하였다. 각각의 동물에 대한 용량 용적은 가장 최근의 체중 측정을 기준으로 하였다.

[0258] 수축기 혈압, 확장기 혈압, 평균 동맥 혈압 및 심박수는 시험 기간의 지속 기간 동안 매분 10초 동안 수집하였다. 뇨는 14일 및 20일째에 수거하였다.

결과

[0259] 단일 용량의 NPR1 효능제 mAb (mAb22033 또는 mAb22810)는 안지오텐신-II-유도된 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에 투여되는 경우 전신 혈압 (도 8, 9 및 11)을 유의적으로 감소시켰다. 평균 23-일 혈압 (표 37)은 모두 IgG4 이소타입 대조군과 비교하여 mAb22033 또는 mAb22810을 투여받은 동물에서 유의적으로 낮았다.

[0260] [표 37]

[0261] [표 38]

[0262] [표 39]

[0263] 심박수 효과 (도 10)는 급성적으로 유의적으로 증가하였고 보다 온건하게 만성적으로 증가하였다. 평균 23-일 심박수(표 37)는 이소타입 대조군 동물과 비교하여 모든 시험 제품-투여받은 그룹에 걸쳐 유의적으로 보다 높았다. 뇨 cGMP 수준은 mAb22033 또는 mAb22810을 투여받은 대부분의 그룹에서 보다 높은 경향이 있고, 25 mg/kg mAb22033에서의 동물은 14일 및 20일에 IgG 이소타입 대조군 동물과 비교하여 유의적으로 증가된 뇨 cGMP 수준을 갖는다(표 38). 체중 또는 절대 또는 상대적 기관 중량에 대해 어떠한 효과도 관찰되지 않았다(표 39).

실시예 10: 고혈압 NPR1 ^hu/hu 마우스에서 전신 혈압에 대한 반복 용량의 효능제 항-NPR1 모노클로날 항체의 효과

실험 과정

[0264] 상기 연구의 목적은 원격 측정된 안지오텐신 II-(Ang II)-유도된 고혈압 NPR1^hu/hu 마우스에서 전신 혈압에 대한 NPR1 효능제 항체 mAb22033의 반복 용량의 효과를 평가하는 것이다. ~26주령의 수컷 NPR1^hu/hu (n=30) 마우스에는 PA-C10 원격 측정기를 이식하고(DSI, St. Paul, MN) 그룹 (그룹 1 내지 5)에 할당하기 전에 7일 동안 회복하도록 방치하였다(표 40).

[0265] [표 40]

[0266] 동물에는 이어서 삼투압 소형 펌프 (Alzet Micro-Osmotic Pump; Model 1004; Lot 10335-14)를 이식하였다. 소형 펌프에는 안지오텐신 II 아세테이트 염(Bachem; Lot #1066804)을 채우고 1.5 mg/kg/일 Ang II의 전달을 위해 0.11 μL/hr의 평균 펌핑 속도로 설정하였다. 소형 펌프는 투여 개시 7일 전에 견갑부에 피하로 이식하였다. 동물은 개별적으로 표준 조건 (64°F 내지 84°F(18°C 내지 29°C)의 온도; 30% 내지 70%의 상대 습도)하에 거주시키고 12-시간 광/12-시간 암 사이클을 유지하였다. 음식물(연구 식이 표준 펠렛 저작물) 및 물을 자유롭게 제공하였다.

[0267] 동물은 수축기 혈압을 기준으로 하는 그룹으로 분류하였다. 시험 단백질은 0일째 1회(그룹 5) 또는 피하 주사를 통해 6일째에 개시하여 3주 동안 주 2회 (그룹 1-4)로 적당한 동물에 투여하였다. 각각의 동물에 대한 용량 용적은 가장 최근의 체중 측정을 기준으로 하였다.

[0268] 수축기 혈압, 확장기 혈압, 평균 동맥 혈압 및 심박수는 시험 기간의 지속 기간 동안 매분 10초 동안 수집하였다.

결과

[0269] 단일 또는 반복 용량의 NPR1 효능제 mAb mAb22033는 안지오텐신- II-유도된 NPR1^hu/hu 마우스에서 고혈압 전신 혈압을 감소시켜 (도 12, 13 및 15) 거의 정상 혈압 수준으로 복귀시킨다. 반복 용량의 1, 5 또는 25 mg/kg의 mAb22033은 주당 2회 투여의 3주 후 각각 용량 의존적으로 수축기 혈압을 감소시켰고, 개별 그룹 기준선에 상대적인 최대 감소는 11, 19 및 39mmHg이다. 단일 용량의 50 mg/kg은 7일까지 수축기 혈압을 31 mmHg로 감소시키고 이후 점진적으로 보다 고혈압 수준으로 복귀한다. 평균 21-일 혈압 (표 41)은 모두 IgG4 이소타입 대조군과 비교하여 mAb22033을 단일 또는 반복 용량으로 투여받은 동물에서 유의적으로 낮았다.

[0270] [표 41]

[0271] [표 42]

[0272] [표 43]

[0273] mAb22033의 급성 효과를 분석하였고, 혈압은 제1 용량의 24시간 이내에 10-20 mmHg 감소하였다. 심박수 효과(도 14)는 다양하고 보다 높거나 낮은 값이 21일 투여 기간 동안 관찰된다. 평균 21-일 심박수 (표 41)은 5 및 25 mg/kg의 반복 용량 그룹에서 유의적으로 보다 낮았고 단일 50mg/kg 용량 그룹에서 보다 높은 경향이 있다. 뇨 cGMP 수준은 25 mg/kg 반복 용량 그룹에서 유의적으로 증가되었고, 모든 다른 그룹은 IgG4 이소타입 대조군 mAb 투여받은 동물과 비교하여 통계학적으로 유의적이지 않은 증가를 보이는 경향이 있다(표 43). 체중, 절대 또는 상대적 기관 중량, 표준 혈청 또는 뇨 화학물질 또는 심장 기능에 대한 어떠한 효과도 관찰되지 않았다(표 42 및 도 16-17).

실시예 11: 식이 유도된 비만 (DIO) 마우스에서 체중, 대사율 및 글루코스 항상성에 대한 항-NPR1 효능제 항체의 효과

실험 1

[0274] 본 실험에서, 식이-유도된 비만 (DIO) 마우스에서 체중, 대사율 및 글루코스 항상성에 대한 mAb22810 NPR1 효능제 mAb의 효과를 시험하였다.

[0275] 30마리 수컷 NPR1^hu/hu 마우스는 10주동안 60% 고지방 식이에 위치시키고 이어서 무작위로 3개의 그룹 (n = 그룹 당 10)으로 분류하였다: 이소타입 대조군 (사람 IgG4) 항체, NPR1 효능제 항체 mAb22810 또는 hFc.FGF21. FGF21은 비만 마우스 모델에서 내당성을 개선시키고, 에너지 소비를 증가시키고 체중을 저하시키는 것으로 입증된 분자이다(문헌참조: Veniant MM, Endocrinology, 2012, PMID: 22798348). 이것은 평가변수를 위한 상기 연구에서 양성 대조군으로서 사용되었다. 치료제는 매주 (대조군 항체 및 mAb22810에 대해) 또는 매주 2회(hFc.FGF21에 대해) 식염수 비히클 중에서 피하 주사 (S.C.)에 의해 투여하였다. 표 44는 연구에서 그룹, 동물 수 및 용량을 열거한다.

[0276] [표 44]

[0277] 개체 체중은 투여 전에 기록하고 이후 주당 2회 기록하였다. 연구의 제2 주 동안에, 마우스는 대사 케이지에 넣고 에너지 소비를 평가하였다. 경구 내당성은 연구 3주 동안에 평가하였고 신체 조성은 EchoMRI에 의한 6주 치료 후 측정하였다.

[0278] 도 18a는 mAb22810 NPR1 효능제 mAb, hFc.FGF21 또는 이소타입 대조군 mAb의 투여 후 체중에서의 변화를 보여준다. 도 18b 및 도 18c는 각각 EchoMRI에 의해 측정된 치료 6주 후의 총 지방량 및 총 제지방량을 보여준다. 주요 발견은 hFc.FGF21 분자가 치료 기간 동안 체중 및 지방증에서 유의적 감소를 생성하지만, mAb22810 NPR1 효능제 항체는 그렇지 않았다는 것이다.

[0279] 도 19a-c는 mAb22810 NPR1 효능제 mAb, hFc.FGF21 또는 이소타입 대조군 mAb를 사용한 치료 1주 후 각각 낮/밤(day/night) 사이클의 평균으로서 분류된 VO₂ (A), VCO₂ (B) 또는 에너지 소비 (C)에서의 변화를 보여준다. 주요 발견은 hFc.FGF21 분자가 치료 기간 동안 VO₂, VCO₂ 및 에너지 소비에서의 유의적 증가를 생성하지만, mAb22810 NPR1 효능제 항체는 그렇지 않았다는 것이다.

[0280] 도 20a는 mAb22810 NPR1 효능제 mAb, hFc.FGF21 또는 이소타입 대조군 mAb을 사용한 치료의 2주 후 경구 내당성 시험 (2g/kg 글루코스)에 의해 측정된 바와 같은 내당성에서의 변화를 보여준다. 도 20b는 A에서 연구의 개시에 기록된 바와 같이 밤새 단식 후 글루코스 수준을 보여준다. 주요 발견은 mAb22810 및 hFc.FGF21 분자가 2주 후 내당성에서 유의적 개선을 생성시킨다는 것이다. 추가로, mAb22810에 의한 내당성에서의 개선은 체중 또는 에너지 소비에서의 변화와는 무관하다(도 18 및 19에 나타낸 바와 같이).

실험 2

[0281] 본 실험은 식이-유도된 비만 (DIO) 마우스에서 체중, 대사율 및 글루코스 항상성에 대한 mAb22033 NPR1 효능제 mAb의 효과를 시험하였다.

[0282] 30마리 수컷 NPR1^hu/hu 마우스는 10주동안 60% 고지방 식이에 위치시키고 이어서 무작위로 3개의 그룹 (n = 그룹 당 10)으로 분류하였다: 이소타입 대조군 (사람 IgG4) 항체, NPR1 효능제 항체 mAb22033 또는 양성 대조군으로서 hFc.FGF21. 치료제는 매주 (대조군 항체 및 mAb22033에 대해) 또는 매주 2회(hFc.FGF21에 대해) 식염수 비히클 중에서 피하 주사 (S.C.)에 의해 투여하였다. 표 45는 연구에서 그룹, 동물 수 및 용량을 열거한다.

[0283] [표 45]

[0284] 개체 체중은 투여 전에 기록하고 이후 주당 2회 기록하였다. 연구의 제2 주 동안에, 마우스는 대사 케이지에 넣고 에너지 소비를 평가하였다. 경구 내당성은 연구 4주 동안에 평가하였고 신체 조성은 EchoMRI에 의한 6주 치료 후 측정하였다.

[0285] 도 21a는 mAb22033 NPR1 효능제 mAb, hFc.FGF21 또는 이소타입 대조군 mAb의 투여 후 체중에서의 변화를 보여준다. 도 21b 및 도 21c는 각각 EchoMRI에 의해 측정된 치료 6주 후의 총 지방량 및 총 제지방량을 보여준다. 주요 발견은 hFc.FGF21 분자가 치료 기간 동안 체중 및 지방증에서 유의적 감소를 생성하지만, mAb22033 NPR1 효능제 항체는 그렇지 않았다는 것이다.

[0286] 도 22a-c는 mAb22033 NPR1 효능제 mAb, hFc.FGF21 또는 이소타입 대조군 mAb를 사용한 치료 1주 후 각각 낮/밤(day/night) 사이클의 평균으로서 분류된 VO₂ (A), VCO₂ (B) 또는 에너지 소비 (C)에서의 변화를 보여준다. 주요 발견은 hFc.FGF21 분자가 치료 기간 동안 VO₂, VCO₂ 및 에너지 소비에서의 유의적 증가를 생성하지만, mAb22033 NPR1 효능제 항체는 그렇지 않았다는 것이다.

[0287] 도 23a는 mAb22033 NPR1 효능제 mAb, hFc.FGF21 또는 이소타입 대조군 mAb을 사용한 치료의 4주 후 경구 내당성 시험 (2g/kg 글루코스)에 의해 측정된 바와 같은 내당성에서의 변화를 보여준다. 도 23b는 A에서 연구의 개시에 기록된 바와 같이 밤새 단식 후 글루코스 수준을 보여준다. 주요 발견은 mAb22033 및 hFc.FGF21 분자 둘다가 2주 후 내당성에서 유의적 개선을 생성시킨다는 것이다. 추가로, mAb22033에 의한 내당성에서의 개선은 체중 또는 에너지 소비에서의 변화와는 무관하다(도 21 및 22에 나타낸 바와 같이).

실시예 12: HDX 에피토프 맵핑

[0288] 항-NPR1 항체에 의해 인지되는 사람 NPR1의 에피토프를 결정하기 위해, 수소-중수소 교환 (HDX) 연구는 각각 mAb22033 및 mAb22810에 대해 수행되었다. 이전 인-하우스(in-house) 실험은 NPR1의 mAb22810로의 결합이 ANP 펩타이드의 존재를 필요로 함을 보여준다. 따라서, NPR1/mAb22033 복합체를 사용한 통상적인 HDX 실험에 추가로, HDX 실험은 또한 NPR1/ANP/mAb22033 및 NPR1/ANP/mAb22810 복합체에 대해 수행되었다.

[0289] 본 연구를 위해, 항-NPR1 항체 (mAb22033 및 mAb22810)는 제조업자의 프로토콜에 따라 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 아가로스 비드 (GE Lifescience, cat #17-0906-01)에 공유적으로 부착시켰다. C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그를 갖는 사람 NPR1 단백질의 엑토 도메인(Uniprot accession #P16066)을 포함하는 CHO 세포-발현된 재조합 사람 NPR1 단백질(서열번호 194). ANP 펩타이드는 제조사(TOCRIS) (cat #1906)로부터 구입하였다.

[0290] 중수소화 완충액은 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄, 및 2 mM KH₂PO₄ (pD=7.4)을 함유하는 D₂O에서 제조하였다. “항원-온” 또는 “복합체-온” 실험을 위해, 30μL의 항체 비드 슬러리(equiv. 15 μL 비드)는 hNPR1.mmh 또는 hNPR1.mmh/ANP 복합체와 혼합하였다. 혼합물은 약간의 회전과 함께 실온에서 항온처리하였다. 중수소화는 0.075% 빙냉 TFA를 사용하여 항체 비드로부터 hNPR1.mmh의 용출과 함께 켄칭하였다. 켄칭된 샘플은 온라인 펩신 분해를 위해 워터스 HDX 매니저(Waters HDX Manager)(Waters Enzymate BEH 펩신 컬럼, 2.1 x 30 mm)에 바로 주사하였다. 상기 분해된 펩타이드를 0°C에서 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7-μm, 2.1 × 5 mm VanGuard 예비 컬럼상에 포집하고 1%-30% B의 8분 구배 분리를 사용한 ACQUITY UPLC BEH C18　1.7-μm, 2.1 × 50 mm 컬럼(이동상 A: 물 중의 0.1% 포름산, 이동상 B: 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산)으로 용출시켰다. 질량 분광측정기를 37V의 콘(cone) 전압, 0.5초의 스캔 시간, 및 50-1700 Th의 질량/전하 범위로 설정하였다.

[0291] mAb22033에 의해 인지된 hNPR.mmh 결합 에피토프를 맵핑하기 위해, 2개 세트의 H/D 교환 실험을 수행하였다. 제1 실험은 “항원-온” 포맷(항원 단독의 HDX에 이어서 항체 비드로의 결합)을 사용하였다. “항원-온” 실험을 위해, hNPR1.mmh는 실온에서 D₂O (PBS-D, pD=7.4)에서 제조된 포스페이트 완충액에서 3 및 8분 (2개의 별도의 서브-실험) 동안 중수소화하였다. 중수소화된 hNPR1.mmh는 이어서 실온에서 2분 항온처리를 위해 PBS-D-세척된 mAb22033 비드에 첨가하여 각각 5분 및 10분의 총 중수소화 시간을 유도한다. 결합된 hNPR.mmh는 이어서 빙냉 0.075% 수성 트리플루오로아세트산 (TFA) 용액을 사용하여 비드로부터 용출시켰다. 용출된 hNPR.mmh는 온라인 펩신 분해에 이어서 펩신 펩타이드 질량 측정을 위한 워터스 HDX 매니저 시스템에 바로 주사하였다.

[0292] 제2 실험은 “복합체-온” 포맷 (복합체화된 항원/항체 비드의 HDX)으로서 언급된다. 상기 실험을 위해, hNPR.mmh는 먼저 2분동안 정규 PBS (pH = 7.4) 중에서 mAb22033 비드에 결합시켰다. 복합체는 이어서 중수소화를 위해 5 또는 10분 동안 (별도의 서브-실험에서) PBS-D (pD= 7.4)에서 항온처리하였다. 하기의 단계(용출, 주사, 펩신 분해, 및 MS 분석)는 이전의 “항원-온” 과정에 기재된 바와 같이 수행하였다.

[0293] 펩타이드 동정 및 중수소 흡수 측정을 위해, 비-중수소화된 hNPR1.mmh로부터의 LC-MS^E 데이터를 먼저 프로세싱하고 Waters ProteinLynx 글로벌 서버 (PLGS) 소프트웨어를 통한 hNPR1.mmh를 포함하는 데이터베이스에 대해 검색하였다. 상기 동정된 펩타이드를 DynamX 소프트웨어로 전송하여 하기의 2가지 기준에 의해 필터링하였다: 1) 아미노산 당 최소 생성물: 0.3 및 2) 복제 파일 임계치(replication file threshold): 2. 이어서 DynamX 소프트웨어는 각각의 펩타이드 체류 시간 및 2개 시점에 걸친 질량 정확도 (<30ppm)를 기준으로 하는 “항원-온”, “복합체-온” 실험으로부터 각각의 펩타이드의 중수소 흡수를 결정할 수 있다. 모든 동정된 펩타이드를 수동으로 조사하고 스크리닝하여 가양성(false positive) 히트를 최소화하였다.

[0294] 모든 검출된 펩타이드의 센트로이드 값 또는 평균 질량 대 전하 비율 (m/z)을 계산하고 2개 시점에서 “항원-온”과 “복합체-온” 실험을 비교하였다. “복합체-온” 중수소화와 비교하여 “항원-온” 중수소화 후 증가된 질량을 나타내는 펩타이드는 항체 결합 결과로서 중수소 교환으로부터 보호된 아미노산을 포함하고 따라서 결합 에피토프 영역을 밝힌다.

[0295] NPR1/mAb22033 HDX 실험을 위해, hNPR1.mmh로부터 총 101개 펩타이드를 동정하였고, 이는 74% 서열 범위를 나타낸다. 이들 펩타이드 중에, 29-50 및 328-347에 걸친 아미노산을 포괄하는 10개의 펩타이드는 표 46에 열거된 바와 같은 “복합체-온” 중수소화와 비교하여 “항원-온” 중수소화 후 유의적으로 증가된 질량을 가졌다.

[0296] [표 46]

[0297] 2개 펩타이드, 아미노산 46-54 및 328-335는 “항원-온”과 “복합체-온” 과정 사이에 중수소 흡수 차이를 보여주지 않았기 때문에, 29-50 및 328-347 펩타이드에서 중수소 교환으로부터의 보호 영역은 잔기 29-45 및 336-347로 감소하였다. 따라서, 아미노산 29-45 및 336-347를 포함하는 2개 분절은 항체 mAb22033의 hNPR1.mmh 단백질로의 결합을 위한 에피토프로서 동정된다.

[0298] NPR1/ANP/mAb22033 HDX 실험을 위해, hNPR.mmh로부터 총 95개 펩타이드를 동정하였고 68% 서열 범위를 나타낸다. 이들 펩타이드 중에, 29-50 및 331-347에 걸친 아미노산을 포괄하는 9개의 펩타이드는 표 47에 열거된 바와 같은 “복합체-온” 중수소화와 비교하여 “항원-온” 중수소화 후 유의적으로 증가된 질량을 가졌다.

[0299] [표 47]]

[0300] 또 다른 펩타이드, 아미노산 46-54는 “항원-온”과 “복합체-온” 과정 간의 중수소 흡수 차이를 보여주지 않았기 때문에, 29-50개 펩타이드에서 중수소 교환으로부터 보호 영역은 잔기 29-45로 감소된다. 따라서, 아미노산 29-45 및 331-347를 포함하는 2개 분절은 항체 mAb22033의 hNPR1.mmh/ANP 단백질 복합체로의 결합을 위한 에피토프로서 동정된다.

[0301] NPR1/ANP/mAb22810 HDX 실험을 위해, hNPR.mmh로부터 총 93개 펩타이드를 동정하였고 70% 서열 범위를 나타낸다. 이들 펩타이드 중에, 29-50, 70-81 및 331-347에 걸친 아미노산을 포괄하는 10개의 펩타이드는 표 48에 열거된 바와 같은 “복합체-온” 중수소화와 비교하여 “항원-온” 중수소화 후 유의적으로 증가된 질량을 가졌다.

[0302] [표 48]

[0303] 3개 펩타이드, 아미노산 46-54, 336-347, 337-347은 “항원-온”과 “복합체-온” 과정간의 중수소 흡수 차이를 보여주지 않았기 때문에, 29-50 및 331-347 펩타이드에서 중수소 교환으로부터의 보호 영역은 잔기 29-45 및 331-335로 감소하였다. 따라서, 아미노산 29-45, 70-81 및 331-335를 포함하는 3개 분절은 항체 mAb22810의 hNPR1.mmh/ANP 단백질 복합체로의 결합을 위한 에피토프로서 동정된다.

실시예 13: 사람화된 NPR1 마우스에서 NPR1 항체의 유리체내 주사는 안내압을 저하시킨다

[0304] 본 실시예는 사람화된 NPR1 마우스에서 안내압 (IOP)에 대한 예시적 사람 NPR1 항체 mAb22033의 유리체내 주사 (IVT)의 효과를 시험한다.

[0305] 방법: 사람화된 NPR1 마우스 (NPR1^hu/hu)는 VelociGene 기술 (Regeneron)을 사용하여 생성하였다. 40 μg mAb22033 또는 대조군 Ab의 단일 IVT 주사는 사람화된 NPR1 또는 야생형 (WT) 마우스에서 수행하였다. IOP는 주사 후 4일 동안 매일 측정하였다. 제2 실험에서, 용량 반응을 조사하기 위해, 40, 12.6, 또는 4μg mAb22033 또는 40 μg 대조군 Ab는 유리체내 주사하고 IOP는 매일 모니터링하였다. 또 다른 실험에서, 장기 전달 Ab의 효과를 시험하기 위해, NPR1 항체 또는 eGFP를 발현하는 AAV2 벡터를 주사하고, 이어서 IOP를 7주 동안 수행하였다.

[0306] 결과: 40 μg mAb22033의 NPR1^hu/hu 마우스로의 IVT는 대조군 항체와 비교하여 1 내지 3일에서 IOP를 유의적으로 감소시켰다. 평균 IOP 변화는 5 mmHg이었다. 그러나, WT 마우스에서 어떠한 IOP 저하 효과가 없었다. 용량 반응 연구는 mAb22033의 40 또는 12.6 μg IVT가 유사한 IOP 저하 효과를 가짐을 보여주었고, 40 μg mAb22033의 효과는 12.6 μg 보다 길게 지속하였다. 4 μg NPR1 항체의 IVT는 IOP를 감소시키지 않았다. IOP 효과는 모든 실험 시점에서 IVT AAV2-GFP 또는 AAV2- NPR1 항체 후 밝혀지지 않았다. 이것은 NPR1 항체의 낮은 발현으로 인한 것일 수 있고, 즉, 전체 눈 용해물에서 10ng만이 검출되었다.

[0307] 결론: 사람화된 NPR1 마우스에서 사람 NPR1 항체 (mAb22033)의 IVT 투여는 IOP를 유의적으로 감소시켰고, 따라서 녹내장 질환에서 IOP를 저하시키기 위한 효능제 항-NPR1 항체의 잠재력을 입증한다.

[0308] 실시예 14: 전자 현미경에 의한 항체-NPR1 복합체의 구조적 분석

방법

다중 각도 광 산란을 사용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS) 적정

[0309] 상이한 몰비로 다양한 항체와 복합체화된 C-말단 myc-myc-6xHis 태그 (hNPR1-mmh; 서열번호 194)를 사용한 여러 적정 계열의 사람 NPR1 세포외 도메인을 제조하였다. 시험된 항체는 다음과 같다: mAb22033, REGN5308 (mAb22033의 Fab 단편), mAb22810, 및 REGN5314 (mAb22810의 Fab 단편). 모든 적정 계열은 hNPR1-mmh에 상대적으로 2-배 몰 과량에서 심방 배설항진 인자 (ANP, Tocris)의 존재 및 부재하의 둘다에서 수행하였다. 4 °C에서 PBS 중에서 밤새 항온처리 후, 복합체는 SEC-MALS 시스템에 주사하였고, 상기 시스템은 AKTA 마이크로 시스템(GE Healthcare Life Sciences) 상의 Superdex 200 Increase 10/300 Gl 컬럼에 이어서 miniDAWN Treos 및 Optilab T-rEX (Wyatt Technology Corporation)로 이루어진다. 포스페이트 완충액은 전자 현미경 음성 염색에 부적합할 수 있기 때문에, SEC 컬럼은 50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl 전개 완충액 중에서 평형화시키고, 하기 제조된 모든 보다 큰 스케일의 복합체는 본 완충액 중에 있다. 크기 배제 크로마토그래피 데이터는 Unicorn (Version 5.20 General Electric Company)을 사용하여 평가하였고, MALS 데이터는 ASTRA (Version 7.0.0.69 Wyatt Technology)를 사용하여 평가하였다.

음성 염색 전자 현미경 샘플 제조

[0310] hNPR1의 복합체는 음성-염색 전자 현미경에 사용하기 위해 보다 큰 스케일로 제조하였다. 5개 샘플은 하기와 같이 제조하였다: 샘플 1 = hNPR1-mmh (서열번호 194) 단독; 샘플 2 = hNPR1-Fc (서열번호 197) 단독; 샘플 3 = hNPR1-mmh + ANP, 1:2 몰비; 샘플 4 = hNPR1-mmh + REGN5308, 1:1.5 몰비; 샘플 5 = hNPR1-mmh + ANP + REGN5308, 1:2:1.5 몰비. 샘플 1, 3, 4, 및 5는 SEC-MALS 실험과 동일한 방식으로 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 피크 분획물을 수거하고, -80 C에서 동결시키고, EM 분석을 위해 기관(NanoImaging Services, Inc.)에 보냈다. 샘플 2는 PBS 중에 2.62 mg/ml 스톡 용액으로 직접 취득하고, 완충액은 50 mM Tris, pH 7.5 + 150 mM NaCl로 교환하고, 1.5 mg/ml로 희석시키고, -80 C에서 동결시키고 다른 샘플과 함께 보냈다.

음성 염색 전자 현미경 데이터 수거 및 프로세싱

[0311] 5개 단백질 샘플은 우라닐 포메이트 (NanoImaging Services)를 사용하여 표준 방식으로 음성 염색 EM 격자판에 제조하였다. 격자판은 C-편평한 다공성 탄소 격자판 상에 위치된 연속 탄소의 박층을 함유하였다. TEM 이미지는 FEI Eagle 4k x 4k CCD 카메라를 사용하여 120 keV에서 작동하는 Tecnai T12 전자 현미경 (FEI/Thermo Fisher) 상에서 실온에서 수거하였다. 이미지는 주로 다양한 공칭 배율, 주로 67,000x 및 110,000x에서 수거하였다. 수거된 이미지는 추가로 인-하우스 프로세싱하였다.

[0312] 육안에 의한 나노이미지화 마이크로그래프는 육안에 의해 조사하였고 불량한 염색 대비를 갖는 이미지는 총 이미지의 약 5분의 1로 제거하였다. 나머지 이미지는 배율에 의해 분리하였고; 110,000x 이미지는 이들이 이미지당 보다 적은 입자를 갖기 때문에 추가의 분석을 위해 유용하지 않았다. 따라서, 모든 후속적 프로세싱 단계는 67,000x 이미지를 사용하여 수행하였다. 모든 이미지는 CTFFIND4를 사용하여 CTF-보정하였다.

EM 입자 선택 및 2D 부류 평균화

[0313] 모든 5개의 음성 염색 샘플에 대한 입자 분포는 매우 양호하였고 입자 크기는 균일하고 클럼핑이 매우 적었고 입자 밀도가 양호하였다. 샘플 4 및 5에서, 입자는 Relion을 사용하여 선택하였고, 자동 선택 주형은 초기 라운드의 수동 선택 및 2D 부류 평균화로부터 유래하였다. 샘플 4 (hNPR1 + REGN5308)에 대해, 19184개의 양호한 입자가 총 75개 현미경사진으로부터 선택되었다. 샘플 5 (hNPR1 + ANP + REGN5308)에 대해, 20318개의 양호한 입자가 초기에 총 88개 현미경 사진으로부터 선택되었다. Relion을 사용한 초기 2D 부류 평균화는 데이터세트 둘다에서 실질적 이종성을 밝혔고, 상당한 수의 부류는 REGN5308 Fab만 또는 NPR1만을 보여준다.

[0314] 샘플 5에 대한 2D 부류 평균화는 추가로 Fab 단독 또는 NPR1 단독에 상응하는 입자를 제거함에 의해 추가로 개량하였다. 나머지 9219개 입자를 사용하여 새로운 2D 부류 평균을 계산하였고, 이는 NPR1+REGN5308 복합체에 대한 보다 양호한 시야 분포를 보여주었고 이는 소수의 복합체가 NPR1 이량체에 결합된 단지 하나의 Fab를 함유고 다수의 복합체가 2개의 Fab를 함유함을 밝혔다. 하나의-Fab 복합체의 제거는 입자 세트를 추가로 6728개 입자로 감소시켰다.

음성 염색 EM 데이터로부터 3D 이미지 재구성

[0315] NPR1-ANP-REGN5308 복합체의 초기 3D 모델은 Relion에서 작제되었고, 해상도가 40

로 제한된 확률적 구배 하강 “3D 초기 모델”과정을 사용한다. 이어서 상기 모델은 추가로 60

로 낮은 통과 여과시키고 Relion에서 상기 언급된 6728개 입자의 3D 분류를 위한 참조로서 사용되고 예상 단계 해상도는 25

로 제한된다. 최상의 3D 부류는 이어서 Relion에서 컨버전스때까지 Relion에서 추가로 개량하였고, 최종 해상도는 "골드 표준" FSC에 의한 측정시 22

이다. 본원 발명자들은 3D 분류 또는 개량 동안에 2-배 대칭을 부과하지 않았다. 3D 재구성으로부터 비롯된 밀도 맵은 2개의 Fab가 정사각형 입자의 하나의 측면에 결합되어 있고 이는 ANP-결합된 NPR1 (PDB 코드 1T34)의 결정 구조와 일치함을 보여주었다.

냉동-전자 현미경 샘플 제조 및 데이터 수거

[0316] NPR1-ANP-REGN5308 복합체의 샘플은 상기된 음성 염색 EM 샘플과 동일한 방식으로 냉동-전자 현미경 (cryoEM)을 위해 제조하였다. 최종 복합체 농도는 50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl에서 0.8 mg/ml이다. CryoEM 샘플은 표준 기술과 함께 제조하였고 이는 UltrAuFoil 격자판(Quantifoil Micro Tools GmbH) 및 비트로보트(Vitrobot) (FEI/Thermo Fisher)를 사용한다. 데이터 수거는 계수 방식에서 K2 직접 전자 검출기, 및 GIF 에너지 여과기 (Gatan, Inc.)를 사용하여 300 kV(Thermo Fisher)에서 작동하는 타이탄 크리오스(Titan Krios) 전자 현미경 상애서 수행하였다. 1409 영상은 130,000x (1.04

/픽셀)의 배율로 수거하였고, 디포커스 범위는 -0.5 내지 -1.5 마이크론이고 총 용량은 45.44 e^-/

²이다. 데이터 수거는 Leginon 소프트웨어로 제어하였다.

CryoEM 데이터 프로세싱 및 구조 결정

[0317] 모든 cryoEM 영상은 cisTEM 패키지를 사용하여 모션 보정, 용량 가중 및 CTF 보정되었다. 이어서 이미지를 수동으로 검사하여 두꺼운 얼음, 불량한 CTF 파라미터 (6

보다 낮은 피트 해상도), 입자 부재, 오염물을 갖는 것 등을 제거하였다. 1172 개의 이미지가 필터 뒤에 잔류하였고, 상기 이미지는 cisTEM에서 주형화되지 않은 입자 선택을 위해 사용되어 872915 입자 위치를 생성한다. 불량한 입자를 제거하기 위한 2D 분류 후, 686709개의 입자들은 cisTEM을 사용한 3D 자동-개량에 포함되었고 애초에 생성된 출발 3D 참조 용적을 갖는다. 해상도가 2.8

인 단일 용액에 수렴된 3D 개량은 푸리어 쉘 보정 곡선(Fourier Shell Correlation curve)으로부터 평가하였다.

[0318] 이어서 상기 3D 맵은 구조 개량을 위해 사용되었고 상기 언급된 음성 염색 EM 3D 맵으로 만들어진 모델로부터 개시된다. NPR1 분자 둘다의 N- 및 C-말단 도메인은 EM 맵으로의 강성체로서 실제 공간 개량되었고, 이어서 수동으로 소수 위치에서 재구축되었고 여기서, 상기 모델은 EM 밀도와 일치하지 않았다. REGN5308 상동성 모델은 수동으로 EM 밀도에 위치시키고; CDR 영역의 주의깊은 조사는 본원 발명자들이 중쇄 vs. 경쇄의 배향을 결정할 수 있게 하였다. 모델의 CDR 영역은 EM 밀도와 일치시키기 위해 광범위한 리빌딩을 필요로 하였다. 최종적으로, 페닉스(Phenix)를 사용한 실제-공간 위치적 개량은 현재 복합체의 구조적 모델을 생성하였다.

결과/논의

다중 각도 광 산란을 사용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS) 적정

[0319] hNPR1-mmh와 mAb22033의 상호작용에서, hNPR1-mmh 자체는 이량체로서 거동하고 분자량은 ANP의 존재 및 부재하에 대략 110kDa이고, NPR1으로의 ANP 결합시 분자량은 약간 증가한다. 어떠한 유리된 단량체 피크가 hNPR1-mmh 자체에 대해 관찰되지 않았다. ANP의 부재하에 mAb22033을 사용한 적정은 복합체의 2개 주요 종을 밝혔다: 하나의 NPR1 이량체에 결합된 하나의 IgG와 동일한 분자량을 갖는 종, 및 2개의 NPR1 이량체에 결합된 하나의 IgG와 동일한 분자량을 갖는 종. 그러나 ANP의 존재하에 NPR1 + mAb22033은 NPR1 및 IgG의 “종이-인형 (paper-doll)" 중합체를 나타낼 수 있는 보다 고분자량의 종을 형성하였다.

[0320] 상기 시스템은 후속적으로 mAb22033의 Fab 단편인 REGN5308을 고려함에 의해 단순화시켰다. hNPR1-mmh와 REGN5308의 복합체는 ANP가 부재인 동일한 복합체와 비교하여 매우 상이한 SEC 프로필을 보여준다.　 NPR1-REGN5308 복합체는 대략 155kDa의 분자량을 갖고, 이는 NPR1 이량체 당 결합된 하나의 Fab와 일치한다. ANP의 존재하에, NPR1-ANP-REGN5308 복합체 분자량은 ~50kDa로 증가하고, 이는 NPR1 이량체 당 결합된 2개의 Fab와 일치한다. 본원 발명자들은 ANP 결합 시 NPR1에서 이전에 기재된 형태적 변화(Ogawa, H et. al, 2004)가 제2 Fab가 결합하도록 하고, 2개 Fab + 2 NPR1 + ANP 복합체가 완전한 IgG mAb22033을 사용하여 관찰된 종이-인형 중합체의 성장을 필요로 함을 제안한다(추가의 논의를 위해 하기 참조).

[0321] hNPR1-mmh 및 mAb22810을 사용한 적정을 또한 수행하였다. SEC-MALS 분석은 mAb22810 샘플의 소분획이 이량체성이고, 분자량이 150kDa의 표준 IgG 분자량과 비교하여 대략 315kDa의 분자량을 가짐을 보여주었다. NPR1- mAb22810-ANP 복합체를 사용한 SEC-MALS 적정은 430 - 700 kDa 범위에서 종의 이종 혼합물을 보여주고; 이러한 프로필은 아마도 mAb22810 단백질에서 IgG 이량체 불순물로 인해 너무 복잡하여 신뢰할만하게 해석되지 않았다. mAb22810의 Fab 단편인 REGN5314를 사용한 SEC-MALS 적정은 ANP의 부재하에 REGN5314의 NPR1로의 결합이 너무 약하거나 일시적이어서 SEC에 의해 단리될 수 있는 복합체 종을 생성하지 못함을 보여주었다. ANP가 존재하는 경우, 단일 NPR1-REGN5314-ANP 복합체가 형성되고, 분자량은 대략 170kDa이고, 이는 NPR1 이량체 당 결합된 하나의 Fab와 일치하였다.

음성 염색 2D 부류 평균

[0322] hNPR1+REGN5308 및 hNPR1+ANP+REGN5308 복합체는 추가로 음성 염색 전자 현미경에 의해 분석하였다. 복합체 입자의 2D 분류 및 평균화는 샘플 중에서 상당한 불균일성을 밝혔다. EM 격자판 상에 입자의 대분획은 단지 hNPR1으로서 또는 단지 REGN5308 Fab로서 분류될 수 있다. 이미지를 위해 제출된 단백질 샘플은 정제된 동종의 복합체이기 때문에, 이들 복합체는 음성 염색 격자판 제조의 프로세스 동안에 이들의 성분으로 해리되는 것으로 나타난다. 그러나, 복합체의 양호한 부분은 온전한 상태로 남아있고 분석을 위해 사용될 수 있다.

[0323] hNPR1+REGN5308의 음성 염색 2D 부류 평균은 "하나의 아암" 복합체를 보여주고, 여기서, 단일 Fab만이 hNPR1 이량체에 결합함을 알 수 있고 이는 SEC-MALS 결과와 일치한다. 대조적으로, hNPR1+ANP+REGN5308의 음성 염색 2D 부류 평균은 “2개의 아암” 복합체를 보여주고, 2개의 Fab는 이량체에 결합되어 있다. 상이한 평균은 실제 3차원 복합체의 상이한 투영도를 나타낸다. 하나의 부류 평균에서, hNPR1 이량체는 2개의 밀도 로브(lobe)를 갖는 측면도로 나타낸다: 서로 겹쳐진 2개의 단량체의 N-말단 도메인에 상응하는 하나의 로브, 및 2개의 겹쳐진 C-말단 도메인에 상응하는 다른 로브. 상기 배향에서, 2개의 결합된 Fab는 NPR1 밀도의 상부 상에 앉아 있는 “토끼 귀(rabbit ears)” 처럼 보인다. 상이한 투시에서, hNPR1의 모든 4개의 도메인은 정사각형을 형성하는 밀도의 4개의 로브로서 나타낼 수 있고, 상기 2개의 REGN5308 Fab는 정사각형 위에서 서로 교차하여 역위된 V를 만든다. hNPR1+ANP+REGN5308 부류 평균은 또한 “하나의 아암” 복합체를 보여주었지만, 이들은 유리된 Fab 및 유리된 NPR1을 생성하는 동일한 복합체 해리로 인한 것이다.

[0324] hNPR1+ANP+REGN5308 cryoEM 데이터로부터 계산된 2D 부류 평균은 음성 염색 데이터와 비교하여 상이한 측면의 복합체를 보여주고; 특히, "토끼 귀" 배향은 존재하지 않는다. 그러나, 다른 cryoEM 2D 부류 평균은 음성 염색 데이터에서 상응하는 평균과 밀접하게 일치할 수 있다. 본원 발명자들은 아마도 상기 출발 샘플이 보다 균일하고 또한 냉동-동결 조건이 용액 중 복합체의 고유 형태를 보다 양호하게 보존하기 때문에 cryoEM 데이터에서 복합체 해리의 많은 증거로서 알지 못한다.

3D 이미지 재구성

[0325] hNPR1+ANP+REGN5308에 대한 cryoEM 밀도의 3차원 맵은 출발점으로서 2D 부류 평균을 사용하여 작성되었다. 상기 재구성 과정은 복합체 직경의 대략적인 평가 이상으로 복합체의 예상된 형태 또는 크기에 대한 임의의 사전 정보를 필요로 하지 않아, 수득한 cryoEM 맵은 항체 표적 복합체가 어떻게 형성되어야만 하는지의 본원 발명자의 예상에 의해 편향되지 않는다. hNPR1+ANP의 공지된 결정 구조는 이어서 공지된 Fab 구조와의 상동성에 의해 생성된 REGN5308 Fab의 모델과 함께 상기 EM 밀도 맵에 위치시키고 개량하였다. NPR1 및 Fab 구조는 수동으로 이들의 대략적인 부위에 위치시키고 이어서 페닉스 (Phenix)를 사용하여 올바른 위치로 강성체로서 개량한다. cryoEM 맵의 해상도는 NPR1:항체 접촉 계면에서 잔기들, 특히 상동성에 의해 정확하게 모델링될 수 없는 REGN5308 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기들의 수동 리빌딩을 가능하게 하기에 충분하다. 현재 구조적 모델은 모든 항체 CDR 잔기들 및 이들과 접촉된 상태의 NPR1 잔기들을 위치시켰다. 모델의 보다 원거리 영역(NPR1 C-말단 도메인, 및 항체 Fab의 불변 도메인)은 현재 cryoEM 맵과 NPR1에 대해 사전에 결정된 X-선 결정 구조 정보 (PDB 코드 1T34) 및 단리된 항체 구조의 조합을 통해 모델링하였다.

[0326] NPR1 상에 mAb22033 에피토프: hNPR1+ANP+REGN5308 구조의 조사는 NPR1의 어느 구조가 REGN5308 Fab에 의해(및 연장에 의해, 모 IgG mAb22033)접촉되어 있는지를 밝힌다. 상기 에피토프는 3차원에서 연속 표면을 형성하도록 조합된 NPR1에서 아미노산의 4개의 별도의 스트레치로 구성된다: 잔기 2-4, 41-45, 47, 73-79, 332, 336-344, 및 347 (서열번호 194에 따라 넘버링됨). 보다 조기의 수소/중수소 교환법 (HDX) 질량 분광측정 실험은 중요한 것으로서 이들 잔기의 일부를 동정하였지만 (실시예 12 참조) cryoEM 구조는 에피토프의 보다 세밀한 세부 사항을 제공한다.

mAb22033에 대한 구조적 작용 기전

[0327] NPR1-항체 복합체의 상기 모델에서 2개의 Fab는 Fab 가변 도메인과 Fab 불변 도메인 사이의 “엘보우” 근처의 지점에서 서로 ~10

이내에 있다. 이들 2개의 Fab의 C 말단은 훨씬 멀리 이격, 대략 100

으로 이격되어 있고, 따라서 단일 IgG 분자의 2개의 아암일 수 없다. Fab는 특히 모델링된 ANP 펩타이드에 인접(대략적으로 가장 인접한 부근에서 대략 30

거리)해 있지 않고, 이것은 Fab와 ANP 간에 임의의 직접적인 상호작용이 있는 것으로 보이지 않는다.

[0328] 본원 발명자들이 NPR1의 N-말단 도메인 상에 이의 결합 부위에 상대적으로 Fab의 고정된 위치 및 상대적 배향을 추정한 경우, REGN5308 Fab의 ANP-의존성 결합을 설명할 실마리가 보인다. NPR1은 ANP 결합 시 형태적 변화를 진행하는 것으로 나타났고, 여기서, 하나의 NPR1 단량체는 이량체화된 상태를 유지하면서 다른 것에 상대적으로 회전한다. 2 NPR1 + 2 Fab 복합체의 절반에 상기 회전을 적용하면 NPR1 이량체가 ANP-유리된 NPR1의 결정 구조와 유사한 모델을 생성한다. 그러나, REGN5308 Fab의 하나는 현재 이것이 입체적으로 다른 Fab와 충돌하게 되는 물리적으로 불가능한 상황의 위치로 회전하였다. 이러한 입체적 간섭은 REGN5308 Fab의 하나만이 ANP의 부재하에 NPR1 이량체에 결합할 수 있는 이유이다: 2개의 단량체 상에 항체 결합 부위 둘다가 균등하게 접근가능하지만 제1 Fab 결합이 제2 Fab의 결합을 차단한다.

[0329] 본원 발명자들이 다른 측면으로부터 상기 효과를 고려하면, 2개의 Fab의 ANP-함유 NPR1 이량체로의 결합은 상기 복합체가 Fab 둘다가 결합되어 있는 한 ANP-유리된 형태로 다시 이완되는 것을 차단한다. 본원 발명자들이 여기서 관찰한 효과가 세포의 표면 상에 보존되어 있다고 추정하면, 평형화 상태에서, 이것은 NPR1 분자의 보다 큰 분획이 다운스트림 신호전달을 할 수 있는 활성 상태에 있도록 한다. 항체 결합의 또 다른 가능한 효과는 상기된 바와 같은 NPR1+ANP와 항체의 올리고머 클러스터의 형성이다. 이러한 효과는 단지 각각의 NPR1 이량체가 2개의 별도의 IgG 분자로부터 2개의 Fab 아암과 결합할 수 있고, ANP의 부재하에 단지 하나의 Fab 아암이 각각의 NPR1 이량체에 결합할 수 있고, 상기 복합체 형성이 최대 하나의 IgG를 함유하는 종이 훨씬 작고 NPR1 이량체가 각각의 Fab 아암에 결합되어 중단된 경우에 가능하다. 이들 효과인 수용체 클러스터링 및 수용체 활성 상태의 연장 둘다는 NPR1 수용체에 대한 mAb22033의 활성화 효과를 설명할 수 있다.

[0330] 본 발명은 본원에 기재된 구체적 구현예에 의한 범위로 제한되지 말아야 한다. 정확히 말하자면, 본원에 기술된 것들 이외의 이에 대한 다양한 변형들은 상기 상세한 설명과 첨부한 도면으로부터 당업계의 숙련자들에게는 명백해질 것이다. 상기 변형은 첨부된 청구항의 범위내에 있는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> Anti-NPR1 Antibodies and Uses thereof <130> 10471WO01 <150> 62/749,557 <151> 2018-10-23 <150> 62/755,720 <151> 2018-11-05 <160> 199 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgacggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaaaccta acagtggtgg cacaaactct 180 gcacagaggt ttcagggcag aatcaccatg acctgggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggaactga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgttc gagagggggc 300 ccagtcatga attactacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Lys Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Ser Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Trp Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Gly Gly Pro Val Met Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 ggatacacct tcaccgacta ctat 24 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 atcaaaccta acagtggtgg caca 24 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 6 Ile Lys Pro Asn Ser Gly Gly Thr 1 5 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 tcgagagggg gcccagtcat gaattactac tactactacg 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Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 11 cagagcattg acagttat 18 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 12 Gln Ser Ile Asp Ser Tyr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 13 gttgcatcc 9 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 14 Val Ala Ser 1 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 15 caacagagtt acagtatccc cacc 24 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 16 Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Thr 1 5 <210> 17 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 17 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtac cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag acctgaagac acggccttgt attattgtgc aaaagatatg 300 ggcgtatcac tggcactatg gggggctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttca 369 <210> 18 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Met Gly Val Ser Leu Ala Leu Trp Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly 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Gly Leu Cys Gly Glu Asp Tyr Val Phe Phe His 225 230 235 240 Leu Asp Ile Phe Gly Gln Ser Leu Gln Gly Gly Gln Gly Pro Ala Pro 245 250 255 Arg Arg Pro Trp Glu Arg Gly Asp Gly Gln Asp Val Ser Ala Arg Gln 260 265 270 Ala Phe Gln Ala Ala Lys Ile Ile Thr Tyr Lys Asp Pro Asp Asn Pro 275 280 285 Glu Tyr Leu Glu Phe Leu Lys Gln Leu Lys His Leu Ala Tyr Glu Gln 290 295 300 Phe Asn Phe Thr Met Glu Asp Gly Leu Val Asn Thr Ile Pro Ala Ser 305 310 315 320 Phe His Asp Gly Leu Leu Leu Tyr Ile Gln Ala Val Thr Glu Thr Leu 325 330 335 Ala His Gly Gly Thr Val Thr Asp Gly Glu Asn Ile Thr Gln Arg Met 340 345 350 Trp Asn Arg Ser Phe Gln Gly Val Thr Gly Tyr Leu Lys Ile Asp Ser 355 360 365 Ser Gly Asp Arg Glu Thr Asp Phe Ser Leu Trp Asp Met Asp Pro Glu 370 375 380 Asn Gly Ala Phe Arg Val Val Leu Asn Tyr Asn Gly Thr Ser Gln Glu 385 390 395 400 Leu Val Ala Val Ser Gly Arg Lys Leu Asn Trp Pro Leu Gly Tyr Pro 405 410 415 Pro Pro Asp Ile Pro Lys Cys Gly Phe Asp Asn Glu Asp Pro Ala Cys 420 425 430 Asn Gln Asp His Leu 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Gly Trp Glu Arg Gln Ala Leu Met Leu Tyr Ala Tyr Arg Pro Gly Asp 145 150 155 160 Glu Glu His Cys Phe Phe Leu Val Glu Gly Leu Phe Met Arg Val Arg 165 170 175 Asp Arg Leu Asn Ile Thr Val Asp His Leu Glu Phe Ala Glu Asp Asp 180 185 190 Leu Ser His Tyr Thr Arg Leu Leu Arg Thr Met Pro Arg Lys Gly Arg 195 200 205 Val Ile Tyr Ile Cys Ser Ser Pro Asp Ala Phe Arg Thr Leu Met Leu 210 215 220 Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Cys Gly Glu Asp Tyr Val Phe Phe His 225 230 235 240 Leu Asp Ile Phe Gly Gln Ser Leu Gln Gly Gly Gln Gly Pro Ala Pro 245 250 255 Arg Arg Pro Trp Glu Arg Gly Asp Gly Gln Asp Val Ser Ala Arg Gln 260 265 270 Ala Phe Gln Ala Ala Lys Ile Ile Thr Tyr Lys Glu Pro Asp Asn Pro 275 280 285 Glu Tyr Leu Glu Phe Leu Lys Gln Leu Lys His Leu Ala Arg Glu Gln 290 295 300 Phe Asn Phe Thr Met Glu Asp Gly Leu Val Asn Thr Ile Pro Ala Ser 305 310 315 320 Phe His Asp Gly Leu Leu Leu Tyr Ile Gln Ala Val Thr Glu Thr Leu 325 330 335 Ala His Gly Gly Thr Val Thr Asp Gly Glu Asn Ile Thr Gln Arg Met 340 345 350 Trp Asn Arg Ser Phe Gln Gly Val Thr Gly Tyr Leu Lys Ile Asp Ser 355 360 365 Ser Gly Asp Arg Glu Thr Asp Phe Ser Leu Trp Asp Met Asp Pro Glu 370 375 380 Thr Gly Ala Phe Arg Val Val Leu Asn Tyr Asn Gly Thr Ser Gln Glu 385 390 395 400 Leu Val Ala Val Ser Gly Arg Lys Leu Asn Trp Pro Leu Gly Tyr Pro 405 410 415 Pro Pro Asp Ile Pro Lys Cys Gly Phe Asp Asn Glu Asp Pro Ala Cys 420 425 430 Asn Gln Asp His Leu Ser Thr Leu Glu Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile 435 440 445 Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly 450 455 460 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile 465 470 475 480 Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp 485 490 495 Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His 500 505 510 Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 515 520 525 Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys 530 535 540 Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu 545 550 555 560 Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr 565 570 575 Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu 580 585 590 Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp 595 600 605 Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val 610 615 620 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu 625 630 635 640 Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His 645 650 655 Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro 660 665 670 Gly Lys <210> 199 <211> 674 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mNPR1-mFc aa 1-441: mouse NPR1 aa S29-E469 from NM_008727.5; aa 442-674: Mouse IgG2a Fc tag <400> 199 Ser Asp Leu Thr Val Ala Val Val Leu Pro Leu Thr Asn Thr Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Trp Ser Trp Ala Arg Val Gly Pro Ala Val Glu Leu Ala Leu Gly 20 25 30 Arg Val Lys Ala Arg Pro Asp Leu Leu Pro Gly Trp Thr Val Arg Met 35 40 45 Val Leu Gly Ser Ser Glu Asn Ala Ala Gly Val Cys Ser Asp Thr Ala 50 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Ala Phe Gln Ala Ala Lys Ile Ile Thr Tyr Lys Glu Pro Asp Asn Pro 275 280 285 Glu Tyr Leu Glu Phe Leu Lys Gln Leu Lys Leu Leu Ala Asp Lys Lys 290 295 300 Phe Asn Phe Thr Met Glu Asp Gly Leu Lys Asn Ile Ile Pro Ala Ser 305 310 315 320 Phe His Asp Gly Leu Leu Leu Tyr Val Gln Ala Val Thr Glu Thr Leu 325 330 335 Ala Gln Gly Gly Thr Val Thr Asp Gly Glu Asn Ile Thr Gln Arg Met 340 345 350 Trp Asn Arg Ser Phe Gln Gly Val Thr Gly Tyr Leu Lys Ile Asp Arg 355 360 365 Asn Gly Asp Arg Asp Thr Asp Phe Ser Leu Trp Asp Met Asp Pro Glu 370 375 380 Thr Gly Ala Phe Arg Val Val Leu Asn Phe Asn Gly Thr Ser Gln Glu 385 390 395 400 Leu Met Ala Val Ser Glu His Arg Leu Tyr Trp Pro Leu Gly Tyr Pro 405 410 415 Pro Pro Asp Ile Pro Lys Cys Gly Phe Asp Asn Glu Asp Pro Ala Cys 420 425 430 Asn Gln Asp His Phe Ser Thr Leu Glu Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile 435 440 445 Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly 450 455 460 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile 465 470 475 480 Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp 485 490 495 Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His 500 505 510 Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 515 520 525 Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys 530 535 540 Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu 545 550 555 560 Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr 565 570 575 Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu 580 585 590 Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp 595 600 605 Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val 610 615 620 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu 625 630 635 640 Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His 645 650 655 Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro 660 665 670 Gly Lys

Claims (38)

1. 배설항진(natriuretic) 펩타이드 수용체 (NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 수소/중수소 교환법으로 측정시 NPR1의 세포외 도메인(서열번호 194의 아미노산 29-347)내 함유된 하나 이상의 아미노산과 상호작용하고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이: (i) 심방 배설항진 펩타이드 (ANP)의 존재 또는 부재하에 사람 NPR1을 발현하는 세포에 결합하고/하거나, (ii) NPR1에 결합하고 NPR1을 활성화시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 (a) 서열번호 194의 아미노산 29 내지 45; (b) 서열번호 194의 아미노산 331 내지 347; (c) 서열번호 194의 아미노산 336 내지 347; (d) 서열번호 194의 아미노산 331 내지 335; 및 (e) 서열번호 194의 아미노산 70 내지 81로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 상호작용하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
3. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 (a) 서열번호 194의 아미노산 29 내지 45; 및 (b) 서열번호 194의 아미노산 336 내지 347로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 상호작용하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
4. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 ANP의 존재하에 (a) 서열번호 194의 아미노산 29 내지 45; 및 (b) 서열번호 194의 아미노산 331 내지 347로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 상호작용하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
5. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 ANP의 존재하에 (a) 서열번호 194의 아미노산 29 내지 45; (b) 서열번호 194의 아미노산 70 내지 81; 및 (c) 서열번호 194의 아미노산 331 내지 335로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 상호작용하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
6. 심방 배설항진 펩타이드(ANP)의 존재하에 배설항진 펩타이드 수용체 1(NPR1) 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 수소/중수소 교환법에 의한 측정시 (a) 서열번호 194의 아미노산 29 내지 45; 및 (b) 서열번호 94의 아미노산 331 내지 347로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 상호작용하지만 서열번호 194의 아미노산 70 내지 81과 상호작용하지 않고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이: (i) ANP의 존재 또는 부재하에 사람 NPR1을 발현하는 세포에 결합하고/하거나; (ii) NPR1에 결합하고 NPR1을 활성화시키는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 완전한 사람 모노클로날 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성질을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편: (a) 완전한 사람 모노클로날 항체이고; (b) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 및/또는 뇌 배설항진 펩타이드(BNP)의 부재하에 단량체 사람 NPR1에 결합하고 해리 상수 (K_D)는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 690nM 미만이고; (c) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 또는 BNP의 부재하에 이량체 사람 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 42nM 미만이고; (d) 25℃에서 및 37℃에서 ANP와 복합체화된 사람 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 80nM 미만이고; (e) 25℃에서 및 37℃에서 BNP와 복합체화된 사람 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 20nM 미만이고; (f) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 및/또는 BNP의 부재하에 단량체 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 365nM 미만이고; (g) 25℃에서 및 37℃에서 ANP 또는 BNP의 부재하에 이량체 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 30nM 미만이고; (h) 25℃에서 및 37℃에서 ANP와 복합체화된 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 10nM 미만이고; (i) 25℃에서 및 37℃에서 BNP와 복합체화된 몽키 NPR1에 결합하고 K_D는 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정시 10nM 미만이고; (j) 마우스 NPR1에 결합하지 않고; (k) 사람 NPR1 (ANP 부재) 또는 ANP에 복합체화된 NPR1을 발현하는 세포에 결합하고, EC₅₀은 5nM 미만이고; (l) NPR1을 활성화시키고 칼슘 플럭스 세포 기반 생검정에서 측정시 EC₅₀은 385nM 미만이고; (m) 정상 혈압 및 고혈압 마우스에 투여되는 경우 전신 혈압을 감소시키고, 여기서, 전신 및 평균 동맥 혈압에서의 감소는 단일 용량의 투여 시 최대 28일 동안 지속하고; (n) 식이-유도된 비만 마우스에게 투여되는 경우, 내당성을 개선시킨다.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 중쇄 가변 영역 (HCVR) 내에 포함된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3); 및 경쇄 가변 영역 (LCVR) 내에 포함된 3개의 경쇄 CDR (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, 여기서, 상기 HCVR이 표 1에 열거된 HCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
10. 제9항에 있어서, 표 1에 열거된 LCVR 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 하기를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 서열번호 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 및 180으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 도메인;
    (b) 서열번호 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 도메인;
    (c) 서열번호 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 및 184로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR3 도메인;
    (d) 서열번호 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 및 188로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 도메인;
    (e) 서열번호 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 및 190으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 도메인; 및
    (f) 서열번호 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 및 192로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR3 도메인.
12. 제11항에 있어서, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 및 178/186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
13. 제12항에 있어서, (a) 서열번호 4, 6, 8, 12, 14, 및 16; 및 (b) 서열번호 68, 70, 72, 76, 78, 및 80으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 CDR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
14. 제13항에 있어서, 서열번호 2/10 및 66/74로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
15. 배설항진 펩타이드 수용체 1 (NPR1) 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 HCVR 내에 포함된 3개의 중쇄 CDR (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 LCVR 내에 포함된 3개의 경쇄 CDR (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, 여기서, 상기 HCVR이
    (i) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (ii) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (iii) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iv) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 12개 이하의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 LCVR이
    (a) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 및 186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열;
    (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 및 186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (c) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 및 186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (d) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 및 186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 10개 이하의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
16. 제15항에 있어서, 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
17. 제15항에 있어서, 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 및 186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR 내에 포함된 3개의 CDR; 및 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 및 186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 LCVR 내에 포함된 3개의 CDR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 및 178/186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
20. 제15항에 있어서, 하기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 서열번호 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 및 180으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 도메인;
    (b) 서열번호 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 및 182로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 도메인;
    (c) 서열번호 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 및 184로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR3 도메인;
    (d) 서열번호 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 및 188로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 도메인;
    (e) 서열번호 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 및 190으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 도메인; 및
    (f) 서열번호 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 및 192로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR3 도메인.
21. 제20항에 있어서, (a) 서열번호 4, 6, 8, 12, 14, 및 16; 및 (b) 서열번호 68, 70, 72, 76, 78, 및 80으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 CDR을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
22. 제21항에 있어서, 서열번호 2/10 및 66/74로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
23. HCVR의 3개의 CDR 및 LCVR의 3개의 CDR을 포함하는, 배설항진 펩타이드 수용체 1 (NPR1) 단백질을 활성화시키는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 HCVR이 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162 및 178로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고; 상기 LCVR이 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170 및 186으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 배설항진 펩타이드 수용체 1 (NPR1) 단백질에 결합하는 것에 대해 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 배설항진 펩타이드 수용체 1 (NPR1) 단백질에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 HCVR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 LCVR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
29. 제27항의 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 제28항의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
30. 제29항의 벡터를 발현하는 숙주 세포.
31. 제30항의 숙주 세포를 상기 항-NPR1 항체 또는 단편의 생성을 허용하는 조건하에서 성장시키는 단계 및 상기 생성된 항체 또는 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항-NPR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
33. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NPR1-연관된 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 징후를 치료, 예방 또는 개선하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 NPR1-연관된 질환 또는 장애가 고혈압, 심부전증, 비만, 신부전증, 만성 신장 질환, 황반 부종, 녹내장, 뇌졸중, 폐 장애, 폐 섬유증, 염증, 천식, 골격 성장 장애, 골절, 당뇨병 및 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 이를 필요로 하는 대상체에게 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여되는, 방법.
36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물을 제2 치료제와 병용하여 투여하는 것인, 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 제2 치료학적 제제가 알도스테론 길항제, 알파-아드레날린성 차단제, 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제, 세동맥 혈관확장제, 자율 신경절 혈관확장제, 베타-아드레날린 차단제, 카테콜라민-고갈 교감신경 차단제, 중추 알파-2 아드레날린 효능제, 칼슘 채널 차단제, 이뇨제, 레닌 억제제, 항-응고제, 항-혈소판 제제, 콜레스테롤 저하제, 혈관확장제, 강심제(digitalis), 수술, 이식가능한 디바이스, 항-종양 치료요법, 인슐린, GLP1 효능제, 메트포르민, 투석, 골수 자극제, 혈액여과, 생활양식 변경 및 식이 보충물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법 .
38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 피하, 정맥내, 진피내, 복막내, 또는 근육내 투여되는, 방법.
    

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