KR20210016585A - Adh 단백질 계열 돌연변이 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

ADH 단백질 돌연변이 및 이의 용도를 제공한다. 야생형 ADH 단백질과 비교하였을 때, 돌연변이는 시험관 내 무세포 합성 시스템에서 외래 단백질의 발현 순도, 효율성 및 수율을 향상시킬 수 있고; 및/또는 Ni 매질에 대한 돌연변이 단백질의 결합 능력을 감소시킬 수 있다.

Description

ADH 단백질 계열 돌연변이 및 이의 용도

본 발명은 생물공학 분야에 관련된 것으로, 더욱 구체적으로, ADH 단백질 계열 돌연변이 및 이의 용도에 관한 것이다.

단백질 분리 및 정제는 표적 단백질을 표적 단백질의 한쪽 끝에 폴리-태크 융합시켜 또는 표적 단백질의 특정 특성을 통해 다른 혼합물, 추출물, 세포 용해액, 반응 산물로부터 정제하거나 크로마토그래피 방법을 이용하여 물질들을 분리하는 과정을 일컫는다. 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography)는 친화성을 갖는 두 분자 중 하나를 불용성 매트릭스에 고정하고, 두 분자 사이의 친화성의 특이성 및 가역성에 따라 다른 분자를 분리 및 정제하는 방법을 일컫는다. 친화성 크로마토그래피에 사용되는 일반적인 폴리-태그는 주로 히스티딘(histidine)(His), 글루타티온 S-전달효소(Glutathione S-transferase)(GST), 말토오스 결합 단백질(Maltose Binding Protein)(MBP) 등을 포함한다. 고정화 금속-킬레이트 친화성 크로마토그래피(immobilized metal-chelating affinity chromatography)(IMAC)의 원리는 주로 단백질 표면의 아미노산 잔기가 금속 이온과 다른 친화성을 형성할 수 있다는 사실에 기반을 두고 있으며, 이는 정전기 인력, 공유 결합 및 배위 결합의 세 가지 타입으로 나눌 수 있다. 단백질 표면에 히스티딘, 시스테인 또는 트립토판이 포함된 경우, 이에 해당하는 이미다졸릴(imidazolyl)기, 티올(thiol)기 또는 인돌일(indolyl)기는 금속 이온과 배위 결합을 형성할 수 있다. 이러한 방법은 편리한 발현, 저비용, 표적 단백질의 특성에 대한 적은 영향 및 기타 장점으로 인해 일반적으로 사용되는 단백질 정제 도구가 되었다.

그러나, 실제로 이 정제 방법에는 몇 가지 문제가 있다. 예를 들어, Ni-NTA 레진을 살펴보면, 몇몇의 비-표적 단백질은 그들의 3차원 구조의 표면에 여러 개의 불연속적인 히스티딘 잔기를 가지고 있어 이러한 비-표적 단백질도 Ni-NTA 레진에 어느 정도 결합하게 되므로, 최종 표적 단백질의 순도를 방해한다.

따라서, 비-표적 단백질의 히스티딘 잔기를 Ni-NTA 레진과 같은 Ni 이온 친화성 매질에 결합할 수 없도록 조작(engineer)하여 표적 단백질의 순도를 향상시킬 수 있는 효과를 달성하는 방법을 발명하는 것이 당업계에서 시급하다.

본 발명의 하나의 목적은 비-표적 단백질의 히스티딘 잔기가 Ni-NTA 레진과 같은 Ni 이온 친화성 매질에 결합을 할 수 없도록 조작하여 표적 단백질의 순도를 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

첫 번째 측면에 따르면, 본 발명은 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)(ADH) 돌연변이 단백질(mutant protein)을 제공한다. 돌연변이 단백질은 비-천연 단백질이고, 돌연변이 단백질은 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 아미노산 45-149 중 적어도 어느 하나의 히스티딘(H)에 돌연변이를 갖는다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 67, 69, 93 및/또는 94 부위에 히스티딘(H)을 포함하지 않는다.

다른 바람직한 실시예에서, 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)와 비교할 때, Ni 매질에 대한 알코올 탈수소효소(ADH) 돌연변이 단백질의 결합 능력은 10%, 바람직하게는 25%, 더 바람직하게는 50%, 더욱 바람직하게는 80%, 가장 바람직하게는 100% 감소된다.

다른 바람직한 실시예에서, 히스티딘은 독립적으로 염기성 아미노산으로 뮤턴트(Mutant)될 수 있다.

다른 바람직한 실시예에서, 히스티딘의 독립적 돌연변이의 타입은 동일하거나 상이할 수 있다.

다른 바람직한 실시예에서, 히스티딘은 라이신(lysine)(K), 아스파라긴(asparagine)(N), 글루타민(glutamine)(Q), 아르기닌(arginine)(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 독립적으로 뮤턴트 될 수 있다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis)로부터 유래한다.

다른 바람직한 실시예에서, 알코올 탈수소효소(ADH)는 ADH1, ADH2, ADH3 및/또는 ADH4 단백질을 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 1에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

47번 위치의 히스티딘(H);

51번 위치의 히스티딘(H); 및

124번 위치의 히스티딘(H).

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 26에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH2)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

45번 위치의 히스티딘(H);

49번 위치의 히스티딘(H); 및

122번 위치의 히스티딘(H).

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 27에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH3)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

71번 위치의 히스티딘(H);

75번 위치의 히스티딘(H); 및

148번 위치의 히스티딘(H).

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 28에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH4)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

72번 위치의 히스티딘(H);

76번 위치의 히스티딘(H); 및

149번 위치의 히스티딘(H).

다른 바람직한 실시예에서, 47번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 라이신(K), 아스파라긴(N) 및/또는 아르기닌(R), 더 바람직하게는 라이신(K) 및/또는 아스파라긴(N)로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 51번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는, 라이신(K) 및/또는 아르기닌(R), 더 바람직하게는 아르기닌(R)으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 124번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 라이신(K)으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 1에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

47번 위치의 히스티딘(H); 및

124번 위치의 히스티딘(H).

다른 바람직한 실시예에서, 45번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 글루타민(Q) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 49번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 122번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 26에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

122번 위치의 히스티딘(H); 및

45번 위치의 히스티딘(H).

다른 바람직한 실시예에서, 71번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 아스파라긴(N), 글루타민(Q) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 75번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 148번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 27에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

148번 위치의 히스티딘(H); 및

71번 위치의 히스티딘(H).

다른 바람직한 실시예에서, 72번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 글루타민(Q) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 76번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 149번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 28에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

149번 위치의 히스티딘(H); 및

72번 위치의 히스티딘(H).

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: H47K; H47N; H47Q; H47R; H51K; H51R; H124K; H124R; H47K 및 H124K; H47N 및 H124K; H47Q 및 H124K; H47R 및 H124K.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: H47K; H47N; H51R; H124R; H47K 및 H124K; H47N 및 H124K.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: H122K; H122R; H45K; H45R; H45N; H45Q; H49K; H49R; H122K 및 H45K; H122K 및 H45R; H122K 및 H45N; H122K 및 H45Q.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: H148K; H148R; H71K; H71R; H71N; H71Q; H75K; H75R; H148K 및 H71K; H148K 및 H71R; H148K 및 H71N; H148K 및 H71Q.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: H149K; H149R; H72K; H72R; H72N; H72Q; H76K; H76R; H149K 및 H72K; H149K 및 H72R; H149K 및 H72N; H149K 및 H72Q.

다른 바람직한 실시예에서, 야생형 알코올 탈수소효소(ADH) 돌연변이 단백질의 아미노산 서열은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

(1) 아미노산 서열이 서열번호 2-13 중 어느 하나인 폴리펩타이드.

(2) 서열번호 2-13에 나타낸 아미노산 서열의 폴리펩타이드로부터 유래되고, (1)에 기재된 폴리펩타이드의 기능을 갖는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2-13 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 여러 개(바람직하게는 1-20, 더 바람직하게는 1-15, 더 바람직하게는 1-10, 더욱 바람직하게는 1-8, 더욱 바람직하게는 1-3, 가장 바람직하게는 1의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 형성된다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2-13 중 어느 하나이다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2-13과 적어도 70% (바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 및 더 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 갖는다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이(예를 들어, 47, 51, 및/또는 124번 위치)를 제외하고, 돌연변이 단백질의 나머지 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이(예를 들어, 45, 49, 및/또는 122번 위치)를 제외하고, 돌연변이 단백질의 나머지 아미노산 서열은 서열번호 26에 나타낸 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이(예를 들어, 71, 75, 및/또는 148번 위치)를 제외하고, 돌연변이 단백질의 나머지 아미노산 서열은 서열번호 27에 나타낸 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이(예를 들어, 72, 76, 및/또는 149번 위치)를 제외하고, 돌연변이 단백질의 나머지 아미노산 서열은 서열번호 28에 나타낸 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다.

다른 바람직한 실시예에서, "잔여 아미노산 서열이 실질적으로 동일하다"는 것은 최대 50개(바람직하게는 1-20개, 더 바람직하게는 1-10 개, 더욱 바람직하게는 1-5 개)의 아미노산이 상이함을 의미하며, 상기 차이는 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 포함하고, 돌연변이 단백질은 여전히 (i)시험관 내 무세포 합성 시스템에서 외인성 단백질의 발현 순도, 효율, 및/또는 수율을 향상시킬 수 있고, 및/또는 (ii) Ni 매질에 대한 돌연변이 단백질의 결합 능력을 감소시킬 수 있다.

다른 바람직한 실시예에서, 서열번호 1, 2, 26, 27 또는 28에 나타낸 서열과의 상동성은 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99%이다.

두 번째 측면에 따르면, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오타이드 본 발명의 첫 번째 측면의 돌연변이 단백질을 암호화한다.

다른 바람직한 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

(a) 서열번호 2-13 중 어느 하나로 나타낸 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

(b) 서열번호 14-25 중 어느 하나의 서열인 폴리펩타이드;

(c) 서열번호 2-13 중 어느 하나로 나타낸 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 야생형 ADH1 단백질의 뉴클레오타이드 서열에 표시된 서열에 대한 폴리 뉴클레오타이드 서열의 상동성은 ≥95% (바람직하게는 ≥98%);

(d) (a) 내지 (c)에 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드.

다른 바람직한 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드는 돌연변이 단백질의 ORF의 플랭크(flank)에 보조(accessory) 요소를 추가적으로 포함하고, 여기서 보조 요소는 신호 펩타이드, 분비 펩타이드, 태그 서열(예를 들어, 6His) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA 서열, RNA 서열 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

세 번째 측면에 따르면, 본 발명은 벡터를 제공하며; 상기 벡터는 본 발명의 두 번째 측면에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함하고; 상기 프로모터는 핵산 서열, 인핸서, 전사 종결 신호, 폴리아데닐화(polyadenylation) 서열, 복제 기점(origin of replication), 선택 가능한 마커, 핵산 제한 부위 및/또는 상동성 재조합 부위에 작동 가능하게(operably) 연결된다.

다른 바람직한 실시예에서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스성 벡터를 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 바이러스성 벡터는 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)(AAV), 아데노바이러스(adenovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 헤르페스바이러스(herpes virus), 원숭이 바이러스(simian virus)40(SV40), 폭스바이러스(poxvirus) 및 이들의 조합으로부터 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 실시예에서, 벡터는 발현 벡터, 셔틀 벡터 및 통합 벡터를 포함한다.

네 번째 측면에 따르면, 본 발명은 숙주 세포를 제공하고; 상기 숙주 세포는 본 발명의 세 번째 측면에 따른 벡터를 포함하거나, 게놈에 통합된 본 발명의 두 번째 측면에 따른 폴리뉴클레오타이드를 갖는다.

다른 바람직한 실시예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포(인간 또는 비인간 포유동물 세포를 포함하는)이다.

다른 바람직한 실시예에서, 숙주 세포는 대장균(E.coli)와 같은 원핵 세포이다.

다른 바람직한 실시예에서, 효모 세포는 피히아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스( Kluyveromyces ) 및 이들의 조합으로 구성된 하나 이상의 효모로부터 선택되고; 바람직하게는, 효모 세포는 클루이베로마이세스, 더 바람직하게는 클루이베로마이세스 마르크시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및/또는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)를 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 숙주 세포는 대장균, 밀 배아 세포, 곤충 세포, SF9 세포, 헬라(Hela) 세포, HEK293 세포, CHO 세포, 효모 세포 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

다섯 번째 측면에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 본 발명의 첫 번째 측면의 알코올 탈수소효소(ADH) 돌연변이 단백질 제조를 위한 방법을 제공한다:

본 발명의 네 번째 측면에 따른 숙주 세포는 알코올 탈수소효소(ADH) 돌연변이 단백질을 발현시키기 위해 발현에 적합한 조건 하에서 배양되고; 및/또는 알코올 탈수소효소(ADH) 돌연변이 단백질이 분리된다.

여섯 번째 측면에 따르면, 본 발명은 효소 제제(enzyme preparation)를 제공하고, 상기 효소 제제는 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 알코올 탈수소효소(ADH) 돌연변이 단백질을 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, 효소 제제는 주사 및/또는 동결건조 제제를 포함한다.

일곱 번째 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 측면에 따른 돌연변이 단백질의 용도를 제공하고; 상기 돌연변이 단백질은 (i) 시험관 내 무세포 합성 시스템에서 외인성 단백질의 발현 순도, 효율 및/또는 수율을 향상시킬 수 있고; 및/또는 (ii) Ni 매질에 대한 돌연변이 단백질의 결합 능력을 감소시킬 수 있는 효소 제제를 제조하는데 사용된다.

다른 바람직한 실시예에서, Ni는 니켈 원소, 니켈 이온, 프리 니켈 이온(free nickel ion), 니켈이 결합된 크로마토그래피 매질, Ni⁺, Ni-비드, Ni-NTA 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 범위 내에서, 상기에서 언급된 기술적 특징과 이하에서 구체적으로 설명되는 기술적 특징(예를 들어, 실시예 또는 예시)이 서로 조합될 수 있으며, 이로서 새로운 또는 바람직한 기술적 해결책을 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 간략화를 위해, 본 명세서에서는 세부 사항이 반복되지 않을 것이다.

다음을 포함하는 본 발명의 주요 장점:

(1) 본 발명은 Ni 매질에 결합할 수 있는 세포 내 단백질의 유형을 Ni 매질에 결합하는 세포에서 성분을 질량 분석법 식별을 통해 결정하고;

(2) 본 발명은 처음으로, 세포 게놈에서 ADH 계열 단백질을 체계적으로 분석함으로써 Ni 매질에 결합할 수 있는 ADH 계열 단백질의 일련의 히스티딘 부위를 제공한다.

(3) 본 발명은 처음으로, ADH1 유전자 녹아웃 및 Ni 매질에 결합할 수 있는 ADH1에서 일련의 히스티딘 부위의 위치-지정 돌연변이를 통해 Ni 매질에 대한 ADH1 결합 능력을 현저히 감소시킬 수 있는 여러 균주를 획득하였다.

(4) 상기에서 언급한 다수의 세포주의 무세포 시스템의 전사-번역 활성을 분석하여, ADH1의 위치-지정 돌연변이가 유전자 녹아웃보다 무세포 시스템의 전사-번역 활성에 미치는 영향이 적다는 것을 발견하였으며, 처음으로 무세포 시스템의 전사-번역 활성에 영향을 미치지 않고 ADH1의 Ni 매질에 대한 결합 능력을 현저히 감소시키는 균주를 획득하였다.

(5) 본 발명은 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis)를 예시로 들지만, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 인간 소스 세포, 헬라(Hela) 세포, CHO 세포, HEK29 세포, 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) 등을 포함한 다른 세포에도 동일한 설계, 분석 및 실험 방법을 적용할 수 있다.

(6) 처음으로, 본 발명에서 ADH 계열 단백질의 코어 아미노산의 돌연변이가 (i) 시험관 내 무세포 합성 시스템에서 외인성 단백질의 발현 순도, 효율 및/또는 수율을 현저히 향상시킬 수 있고, 및/또는 (ii) Ni 매질에 대한 돌연변이 단백질의 결합 능력을 현저히 감소시킬 수 있음을 발견하였다.

도 1은 K. lactis 게놈에서 ADH1을 조작하여 Ni 매질에 대한 결합을 제거하는 설계 경로를 나타낸다.
도 2는 KlADH 계열 단백질 ADH1-4의 서열 상동성을 비교한 것이다. 검은색 영역은 높은 상동성을 나타낸다.
도 3은 KlADH1 및 ScADH1 사이의 서열 상동성을 비교한 것으로, 상기 두 사이의 서열 상동성은 84.9%이다.
도 4는 2HCY를 주형으로 하는 KlADH4의 상동성 모델링을 나타낸다. 2HCY 및 KlADH4는 모두 사량체이고, 각 단량체의 6-His 응집 영역은 각각 박스(box)로 표시된다.
도 5는 ScADH1 사량체의 구조 다이어그램을 나타낸다. 두 개의 서브유닛 A 및 B는 NADH/NAD⁺ 결합 도메인을 통해 이량체를 형성하고, 두 개의 AB 이량체는 "백-투-백(back-to-back)" 사량체를 형성한다.
도 6은 ScADH1에서 H66 주변 아미노산 구조의 다이어그램을 나타낸다. H66은 ADH1의의 두 가지 형태에서 촉매 Zn^{2 +}를 킬레이트화 하는데 관여한다. 도 A는 NAD가 결합된 닫힌 형태를 나타내고, 도 B는 NAD가 결합되지 않은 열린 형태를 나타낸다.
도 7은 ScADH1에서 H48 주변 아미노산 구조의 다이어그램을 나타낸다. H48은 삼원 복합체(ternary complex)의 형성에 관여하고, 기질의 양성자 전달 과정에 영향을 미친다.
도 8은 ScADH1에서 H44 주변 아미노산 구조의 다이어그램을 나타낸다. H44의 이미다졸(imidazole) 고리에 있는 ND1은 NAD⁺/NADH 의 결합에 관여할 것이다.
도 9는 pKMCas9_StR_KlADH1의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 플라스미드에는 tRNA-Tyr 프로모터, SNR52 종결자 및 카나(kana) 선별 마커가 있다.
도 10은 pKMD1-ΔKlADH1의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream)에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린(Amp) 선별 마커가 있다.
도 11은 pKMD1-KlADH1-H47K의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1(homologous arm 1) 및 상동성 암 2(homologous arm 2)는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림 및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 12는 pKMD1-KlADH1-H47N의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림 및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 13은 pKMD1-KlADH1-H47Q의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림 및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 14는 pKMD1-KlADH1-H47R의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림 및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 15는 pKMD1-KlADH1-H51K의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림 및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 16은 pKMD1-KlADH1-H51R의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 17은 pKMD1-KlADH1-H124K의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림 및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 18은 pKMD1-KlADH1-H124R의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림 및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 19는 pKMD1-KlADH1-H47KH124K의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림 및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 20은 pKMD1-KlADH1-H47NH124K의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림 및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 21은 pKMD1-KlADH1-H47QH124K의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림 및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 22는 pKMD1-KlADH1-H47RH124K의 플라스미드 프로파일을 나타낸다. 상동성 암 1 및 상동성 암 2는 각각 KlADH1 유전자의 ORF의 업스트림 및 다운스트림에 약 800bp의 유전자 서열이고, 플라스미드에는 암피실린 선별 마커가 있다.
도 23은 Ni-NTA로 정제된 폴리아크릴아마이드 겔 분석(polyacrylamide gel analysis)을 나타낸다. 도면에서 볼 수 있듯이, KlADH1 유전자의 녹아웃과 다른 위치에서의 His 돌연변이는 Ni-NTA에 대한 KlADH1의 친화성을 현저히 감소시킬 수 있다. 표적 밴드의 크기는 약 37KD이고, 왼쪽에서부터 오른쪽으로의 밴드는 각각 마커, K. lactis 야생형 세포주 WT, 녹아웃된 KlADH1 세포주 ΔADH1, KlADH1 단일 돌연변이 세포주 H47K, H47N, H47R, H51K, H124K, H124KH47K 및 H124KH47N이다.
도 24는 야생형 세포주 WT, KlADH1이 녹아웃된 세포주 ΔADH1 및 KlADH1의 단일 돌연변이를 갖는 세포주 H47K의 무세포 전사-번역 활성의 분석을 나타낸다. 도면에서 볼 수 있듯이, 왼쪽에서부터 오른쪽으로의 밴드는 각각 ΔADH1, KlADH1 H47K, K. lactis 야생형 세포주 WT 및 음성 대조군이다.
도 25는 야생형 세포주 WT 및 KlADH1의 단일 돌연변이 세포주 H47K(Mut)의 무세포 전사-번역에 의해 제조된 표적 단백질의 정제 분석을 나타낸다. 도면에서 볼 수 있듯이, 왼쪽에서부터 오른쪽으로의 밴드는 각각 KlADH1의 단일 돌연변이 세포주 H47K(Mut) 및 K. lactis 야생형 세포주 WT이다. 도 A는 외인성 표적 단백질을 추가하지 않은 KlADH1 및 Ni-NTA 사이의 친화도 분석을 나타낸다. 도 B는 표적 단백질 N-His8-eGFP가 KlADH1의 단일 돌연변이를 갖는 세포주 H47K의 무세포 전사-번역 시스템에 추가되었을 때 eGFP의 정제 분석을 나타낸다. 도 C는 표적 단백질 N-His8-Strep-eGFP가 KlADH1의 단일 돌연변이를 갖는 세포주 H47K의 무세포 전사-번역 시스템에 추가되었을 때 Strep-eGFP의 정제 분석을 나타낸다.
도 26은 KlADH1 유전자의 녹아웃 및 KlADH1 유전자에 대한 위치-지정 돌연변이 각각에 의해 표적 단백질의 순도 및 특이성을 개선하기 위해 Ni 매질에 대한 KlADH1의 결합 능력의 제거를 요약한 것이다.

광범위하고 심층적인 연구 끝에, 발명자들은 예기치 않게 ADH 계열 단백질 돌연변이를 얻었다. 야생형 ADH 계열 단백질과 비교하였을 때, 본 발명의 ADH 계열 단백질 돌연변이는 현저히 (i) 시험관 내 무세포 합성 시스템에서 외인성 단백질의 발현 순도, 효율, 및/또는 순도를 향상시킬 수 있고, 및/또는 (ii) Ni 매질에 돌연변이 단백질의 결합 능력을 감소시킬 수 있다. 이를 바탕으로, 발명자들은 본 발명을 완성하게 되었다.

용어

개시된 내용의 이해를 돕기 위하여 특정 용어를 먼저 정의한다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 본 명세서에서 달리 명시하지 않는 한, 다음 용어는 각각 다음과 같은 의미를 가진다. 다른 정의는 출원의 전체에 명시되어 있다.

용어 "약"은 당업자에 의해 결정된 특정 값 또는 조성의 허용 가능한 오차 범위 내의 값 또는 조성을 지칭할 수 있으며, 이는 값 또는 조성이 측정 또는 결정되는 방법에 따라 부분적으로 좌우될 것이다. 예를 들어, 상기에서 사용된 표현 "약 100"은 99 내지 101(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등) 사이의 모든 값을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "포함"은 개방형, 반-폐쇄형 또는 폐쇄형으로 이해될 수 있다. 즉, 용어는 "실질적으로 구성됨" 또는 "구성됨"도 포함한다.

서열 동일성(또는 상동성)은 비교창(comparison window)(이는 참조 뉴클레오타이드 서열 길이 또는 단백질의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%일 수 있음)을 따라 두 개의 정렬된 서열을 비교하여 결정되고, 동일한 잔기가 나타나는 위치의 수를 결정한다. 일반적으로 이는 백분율로 표시한다. 뉴클레오타이드 서열 동일성의 측정은 당업자에게 잘 알려진 방법이다.

본원에서 사용된 용어 "대상" 및 "필요한 대상"은 임의의 포유 동물 또는 비포유 동물을 지칭한다. 포유 동물은 인간, 척추동물(예를 들어, 설치류), 비인간 영장류, 소, 말, 개, 고양이, 돼지, 양, 염소, 기린, 사슴, 낙타, 영양, 멧토끼(hare) 및 토끼(rabbit)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

ADH 계열 단백질

많은 양의 알코올 탈수소효소(ADH) 계열 단백질은 인간과 동물의 간, 식물 및 미생물 세포에서 발견될 수 있다. 유기체에서 단쇄 알코올의 대사를 위한 핵심 효소로서, 많은 생리적 과정에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 인간 및 포유 동물에서, 알코올 탈수소효소 및 아세트알데하이드 탈수소효소(ALDH)는 알코올 탈수소효소 시스템을 구성하고, 이는 신체에서 알코올 대사에 참여한다.

ADH 계열 단백질은 ADH1, ADH2, ADH3 및/또는 ADH4 단백질을 포함한다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 처음으로 ADH2(서열번호: 26, 위치 45-122), ADH3 (서열번호: 27, 위치 71-148) 및 ADH4 (서열번호: 28, 위치 72-149)는 ADH1(서열번호 1, 위치 47-124)과 상동성(약 98.7%)이 높고, 이는 ADH2 (H45, H49, H122), ADH3 (H71, H75, H148) 및 ADH4 (H72, H76, H149)는 각각 ADH1에서 H47, H51, H124에 해당하며, 즉 ADH1, ADH2, ADH3 및 ADH4의 돌연변이 부위 간의 대응 관계는 다음과 같다.

야생헝 ADH 계열 단백질

본 명세서에서 사용된 "야생형 ADH 계열 단백질"은 유전공학 기술(예를 들어, 게놈 서열 분석, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 등)을 통해 얻을 수 있는 인공적으로 조작되지 않은 자연적으로 존재하는 ADH 계열 단백질을 의미하며, 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열로부터 유추될 수 있다. 야생형 ADH 단백질의 소스(source)는 K. lactis 야생형 세포주이다. 야생형 ADH 계열 단백질은 ADH1, ADH2, ADH3 및/또는 ADH4 단백질을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 야생형 ADH 계열 단백질(예; ADH1, ADH2, ADH3, ADH4)의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 26, 27 또는 28에 나타내었다.

ADH 계열 단백질 돌연변이 및 이의 핵산 코딩

본 명세서에서 사용된 용어 "돌연변이 단백질", "본 발명의 돌연변이 단백질", "본 발명의 ADH 돌연변이 단백질", "본 발명의 뮤턴트된 ADH 단백질", "ADH 돌연변이" 및 "ADH 계열 단백질의 돌연변이"는 상호호환적(interchangeably)으로 사용될 수 있으며, 자연적으로 존재하지 않는 돌연변이 ADH 단백질을 지칭하며, 돌연변이 단백질은 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 45-149 위치에 있는 아미노산 중 적어도 어느 하나의 히스티딘(H)의 돌연변이를 갖는다.

또한, 본 발명에서, 돌연변이는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 67, 69, 93 및/또는 94 위치에 히스티딘(H)을 포함하지 않는다.

본 발명에 있어서, 히스티딘은 독립적으로 염기성 아미노산으로 뮤턴트 될 수 있으며, 히스티딘의 독립적인 돌연변이의 종류는 동일하거나 상이할 수 있다.

바람직한 실시예에서, 히스티딘은 라이신(K), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 변이될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 본 발명의 돌연변이 ADH 단백질은 서열번호 1, 26, 27 또는 28로 나타낸 단백질을 인공적으로 조작하여 얻은 단백질이다.

상기에서, 돌연변이 단백질은 활성과 관련된 코어 아미노산을 포함하고, 코어 아미노산 중 적어도 하나는 조작되며; 본 발명의 돌연변이 단백질은 현저하게 (i) 시험관 내 합성 시스템에서 외인성 단백질의 발현 순도, 효율 및/또는 순도를 향상시킬 수 있고; 및/또는 (ii) Ni 매질에 돌연변이 단백질의 결합 능력을 감소시킬 수 있다.

용어 "코어 아미노산"은 서열번호 1, 26, 27 또는 28의 서열에 기초하고, 서열 번호: 1, 26, 27 또는 28과 적어도 80%(예를 들어, 84%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%)의 상동성을 갖고, 상응하는 위치는 본원에 기재된 특정 아미노산이다. 예를 들어, 서열번호 1에 나타낸 서열에 기초하여, 코어 아미노산은 다음과 같다:

47번 위치의 히스티딘(H); 및/또는

51번 위치의 히스티딘(H); 및/또는

124번 위치의 히스티딘(H).

예를 들어, 서열번호 26에 나타낸 서열에 기초하여, 코어 아미노산은 다음과 같다:

45번 위치의 히스티딘(H); 및/또는

49번 위치의 히스티딘(H); 및/또는

122번 위치의 히스티딘(H).

예를 들어, 서열번호 27에 나타낸 서열에 기초하여, 코어 아미노산은 다음과 같다:

71번 위치의 히스티딘(H); 및/또는

75번 위치의 히스티딘(H); 및/또는

148번 위치의 히스티딘(H).

예를 들어, 서열번호 28에 나타낸 서열에 기초하여, 코어 아미노산은 다음과 같다:

72번 위치의 히스티딘(H); 및/또는

76번 위치의 히스티딘(H); 및/또는

149번 위치의 히스티딘(H).

또한, 상기에서 언급한 코어 아미노산을 뮤턴트 시켜 얻은 돌연변이 단백질은 현저하게 (i) 시험관 내 합성 시스템에서 외인성 단백질의 발현 순도, 효율 및/또는 순도를 향상시킬 수 있고; 및/또는 (ii) Ni 매질에 돌연변이 단백질의 결합 능력을 감소시킬 수 있는 활성을 갖는다.

다른 바람직한 실시예에서, 47번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아스파라긴(N), 글루타민 (Q), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 라이신(K), 아스파라긴(N) 및/또는 아르기닌(R), 더 바람직하게는 라이신(K) 및/또는 아스파라긴(N)로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 51번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는, 라이신(K) 및/또는 아르기닌(R), 더 바람직하게는 아르기닌(R)으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 124번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 라이신(K)으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 1에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

47번 위치의 히스티딘(H); 및

124번 위치의 히스티딘(H).

다른 바람직한 실시예에서, 45번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 글루타민(Q) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 49번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 122번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 26에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

122번 위치의 히스티딘(H); 및

45번 위치의 히스티딘(H).

다른 바람직한 실시예에서, 71번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 아스파라긴(N), 글루타민(Q) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 75번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 148번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 27에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

148번 위치의 히스티딘(H); 및

71번 위치의 히스티딘(H).

다른 바람직한 실시예에서, 72번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 글루타민(Q) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 76번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 149번 위치의 히스티딘(H)은 라이신(K), 아르기닌(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 뮤턴트 된다.

다른 바람직한 실시예에서, 돌연변이 단백질은 서열번호 28에 상응하는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 하나 이상의 코어 아미노산에 돌연변이를 가지며, 상기에서 하나 이상의 코어 아미노산은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:

149번 위치의 히스티딘(H); 및

72번 위치의 히스티딘(H).

본 발명의 뮤턴트 된 ADH 단백질의 아미노산 일련 번호는 야생형 ADH 단백질의 아미노산 서열(바람직하게는, 서열번호 1, 26, 27 또는 28)에 기초한 것으로 이해되어야 한다. 특정 돌연변이 단백질이 서열번호 1, 26, 27 또는 28로 나타낸 서열과 적어도 80% 상동성을 가질 때, 돌연변이 단백질의 아미노산 일련 번호는 서열번호 1, 26, 27, 또는 28의 아미노산 서열 번호에 비해 아미노산의 N 또는 C 말단을 향한 1-5 전위 위치와 같은 전위가 있을 수 있다. 당업계의 통상적인 서열 분석 기술을 이용하여, 일반적으로 이러한 전위가 합리적인 범위 내에 있고, 80%(예를 들어, 90%, 95%, 98%) 상동성을 갖고, 동일하거나 또는 유사한 활성은 본 발명의 돌연변이 단백질의 범위에서 아미노산 일련 번호의 전위로 인해 배제되어서는 안 된다.

본 발명의 돌연변이 단백질은 합성된 단백질 또는 재조합 단백질이며, 이는 화학적으로 합성된 산물, 또는 재조합 기술을 이용하여 원핵 또는 진핵 숙주 세포(예를 들어, 박테리아, 효모, 식물)로부터 생산될 수 있다. 재조합 생산 방식에 이용되는 숙주에 따라, 본 발명의 돌연변이 단백질은 글리코실화(glycosylated) 또는 비-글리코실화(non-glycosylated )될 수 있다. 본 발명의 돌연변이 단백질은 또한 개시 메티오닌 잔기를 포함하거나 배제할 수 있다.

본 발명은 또한 돌연변이 단백질의 단편, 유도체 및 유사체를 포함한다. 본원에 기재된 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 돌연변이 단백질과 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 단백질을 의미한다.

본 발명의 돌연변이 단백질의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 돌연변이 단백질일 수 있는 반면에, 이러한 결과로 치환된 아미노산 잔기는 유전적 코드로 암호화되거나 암호화되지 않을 수 있으며, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에 치환기를 갖는 돌연변이 단백질, 또는 (iii) 성숙한 돌연변이 단백과 다른 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 돌연변이 단백질의 반감기를 연장시키는 화합물)의 융합에 의해 형성된 돌연변이 단백질, 또는 (iv) 돌연변이 단백질의 서열에 추가 아미노산 서열이 융합되어 형성된 돌연변이 단백질(예를 들어, 선도 서열 또는 분비 서열, 또는 이 돌연변이 단백질의 정제에 이용되는 서열, 또는 프로테오젠(proteogen) 서열, 또는 돌연변이 단백질을 가진 항원 IgG 단편의 융합에 의해 형성된 융합 단백질)일 수 있다. 본 발명의 기재에 따르면, 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에게 잘 알려진 범위 내에 있다. 본 발명에 있어서, 보편적으로 치환된 아미노산은 바람직하게는 표 1에 따른 아미노산 치환에 의해 생산된다.

초기 잔기	대표적인 치환	바람직한 치환
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro; Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe	Leu
Leu (L)	Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Leu
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala	Leu

본 발명의 활성 돌연변이 단백질은 현저히 (i) 시험관 내 무세포 합성 시스템에서 외인성 단백질의 발현 순도, 효율, 및/또는 수율을 향상시키고; 및/또는 (ii) Ni 매질에 돌연변이 단백질의 결합 능력을 감소시키는 활성을 갖는다.

본 발명에 있어서, 돌연변이 단백질은 본 발명의 첫 번째 측면에서 설명한 바와 같다. 바람직하게는, 돌연변이 단백질은 서열번호 2-13 중 어느 하나로 나타낸 아미노산 서열이다.

본 발명의 돌연변이 단백질은 일반적으로 서열번호 2-13 중 어느 하나로 나타낸 서열과 비교하였을 때, 더 높은 상동성(동일성)을 갖는다는 것을 이해해야 한다. 바람직하게는, 돌연변이 단백질은 서열번호 2-13에 나타낸 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%-90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98%의 상동성을 갖는다.

또한, 본 발명의 돌연변이 단백질도 변형될 수 있다. 변형(일반적으로 1차 구조는 변형하지 않는다) 형태는 아세틸화(acetylation) 또는 카르복실화(carboxylation)와 같은 생체 내 또는 시험관 내에서 화학적으로 유도된 돌연변이 단백질 형태를 포함한다. 변형은 또한 돌연변이 단백질의 합성 및 추가 처리 단계에서 수행되는 글리코실화(glycosylation) 변형과 같은 글리코실화를 포함한다. 이러한 변형은 글리코실화를 수행하는 효소(예를 들어, 포유류 글리코신화효소(mammalian glycosylases) 또는 디글리코실화효소(deglycosylases))에 돌연변이 단백질을 노출시켜 달성할 수 있다. 변형 형태에는 인산화된 아미노산 잔기(예를 들어, 포스포티로신(phosphotyrosine), 포스포세린(phosphoserine), 포스포트레오닌(phosphothreonine))이 있는 서열을 추가로 포함한다. 변형 형태는 돌연변이 단백질을 더 포함하여 변형되고, 이는 단백질 가수분해에 대한 저항성을 증가시키거나 용해도를 개선한다.

용어 "돌연변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드"는 본 발명의 돌연변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있고, 또한 추가적인 코팅 및/또는 비코팅 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오타이드 일 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 형태일 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서, 뉴클레오타이드는 DNA이다. DNA 형태는 cDNA, 게노믹 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. DNA는 코딩가닥 또는 비코딩가닥 일 수 있다. 성숙한 펩타이드를 암호화하는 코딩 영역 서열은 서열번호 2-13 중 어느 하나에 나타낸 폴리펩타이드를 암호화하는 서열과 동일할 수 있거나 축퇴성(degenerate) 변이체 일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명에서 "축퇴성 변이체"는 서열번호 2-13 중 어느 하나에 나타낸 폴리펩타이드는 암호화하지만 상응하는 코딩 영역의 서열이 상이한 핵산 서열을 지칭한다.

본 발명은 또한 전술한 폴리펩타이드의 변이체에 관한 것이다. 변이체는 폴리펩타이드의 단편, 유도체 및 유사체, 또는 본 발명과 동일한 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 단백질을 암호화한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 대립형질 변이체(allelic variant)는 폴리뉴클레오타이드의 대체 형태이다. 대립형질 변이체는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있지만, 이에 의해 암호화되는 돌연변이 단백질의 기능은 실질적으로 바뀌지 않는다.

핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA 또는 PNA일 수 있다. 핵산 서열은 게놈, 재조합 또는 합성일 수 있다. 핵산 서열은 분리되거나 정제될 수 있다. 핵산 서열은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 바람직하게는, 핵산 서열은 상술한 바와 같이 감광성(photosensitive) 단백질을 암호화할 것이다. 핵산 서열은 복제 기술, 예를 들어, 제한 효소 분해, 라이게이션(ligation), 및 겔 전기영동을 포함하는 분자 복제 기술, 예를 들어 Sambrook et al. 분자 복제: 실험실 매뉴얼, Cold Spring Harbor Laboratory Press을 통해 유도될 수 있다. 핵산 서열은 예를 들어 PCR 기술을 사용하여 분리될 수 있다. 분리는 임의의 불순물 및 기타 핵산 서열 및/또는 소스에서 핵산 서열과 관련된 자연적으로 발견되는 단백질로부터 핵산 서열을 분리하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 핵산 서열은 또한 정제/생산 공정으로부터 세포 물질 또는 배지 또는 다른 기타 화학물질을 포함하지 않는다. 핵산 서열은 합성될 수 있으며, 예를 들어 다이렉트 화학 합성(direct chemical synthesis)에 의해 생산될 수 있다. 핵산 서열은 네이키드(naked) 핵산으로서 제공될 수 있으며, 또는 단백질 또는 지질과의 복합체의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명은 또한 전술한 서열과 혼성화되고, 전술한 서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 및 더 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건(또는 철저한 조건) 하에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명에서, "엄격한 조건"은 다음을 의미한다: (1) 0.2 Х SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온 강도 및 더 높은 온도에서의 혼성화 및 용리; 또는 50%(v/v) 포름아미드(formamide), 0.1% 송아지 혈청/0.1% 피콜(Ficoll), 42℃ 등과 같은 변성제의 존재 하에서의 혼성화; 또는 (3) 혼성화는 두 서열 사이의 동일성이 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%인 경우에만 발생.

본 발명의 돌연변이 단백질 및 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되며, 더 바람직하게는 균질성(homogeneity)으로 정제된다.

본 발명의 전장 폴리뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 PCR 증폭 방법, 재조합 방법 또는 인공 합성 방법을 통해 수득할 수 있다. PCR 증폭 방법은 본 발명에 개시된 관련 핵산 서열, 특히 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 서열에 따라 프라이머를 설계할 수 있으며, 관련 서열은 상업적으로 cDNA 라이브러리 또는 주형으로서 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 따라 준비된 cDNA 라이브러리를 이용하여 증폭할 수 있다. 염기 서열이 길면, PCR 증폭을 2회 이상 수행해야 하는 경우가 많으며, 각 PCR 증폭에서 수득한 증폭 단편을 올바른 순서대로 접합한다.

관련 서열이 확보되면, 관련된 서열은 재조합 방법을 통해 대량으로 수득할 수 있다. 이는 일반적으로 관련 서열을 벡터로 클로닝하고, 세포로 형질전환시키고, 관련 서열을 수득하기 위한 통상적인 방법을 통해 증식된 숙주 세포로부터 후속 분리하는 것을 의미한다.

또한, 관련 서열은, 특히 단편 길이가 짧은 관련 서열은 인공 합성 방법을 통해 합성할 수 있다. 일반적으로, 많은 작은 단편을 먼저 합성한 다음, 라이게이션(ligation)을 수행하여 긴 서열 조각을 얻는다.

현재, 본 발명의 단백질(또는 이의 단편 또는 유도체)을 암호화하는 DNA 서열은 전적으로 화학적 합성을 통해 수득할 수 있다. DNA 서열은 그 후 다양한 기존 DNA 분자(예를 들어, 벡터) 및 당업계에서 알려진 세포에 도입될 수 있다. 또한, 화학적 합성을 통해 본 발명의 단백질 서열에 돌연변이를 도입할 수도 있다.

PCR 기술을 이용하여 DNA/RNA를 증폭하는 방법은 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해 이용된다. 특히, 라이브러리로부터 전장 cDNA를 수득하기 어려운 경우, RACE 방법(RACE, cDNA 말단의 신속 증폭)을 이용하는 것이 바람직하다. PCR에 이용되는 프라이머는 본 명세서에 기재된 본 발명의 서열 정보에 따라 적절하게 선택할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 합성될 수 있다. 증폭된 DNA/RNA 단편은 겔 전기영동과 같은 통상적인 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명에 있어서, ADH 단백질 돌연변이의 DNA 코팅 서열은 서열번호 14-25 중 어느 하나에 나타낸 뉴클레오타이드 서열이다.

발현 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것으로, 숙주세포는 본 발명의 벡터를 이용하거나 본 발명의 돌연변이 단백질의 코팅 서열을 이용하여 유전적으로 조작함으로써 생산되며, 재조합 기술을 통한 본 발명의 폴리펩타이드의 생산을 위한 방법에 관련된 것이다.

종래의 재조합 DNA 기술을 통해, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 재조합 돌연변이 단백질을 발현하거나 생산하는데 이용될 수 있다. 일반적으로 이 방법은 다음 단계로 구성된다:

(1) 본 발명의 돌연변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(또는 변이체) 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 적절한 숙주세포를 형질 변형 또는 형질 도입하는 단계;

(2) 적절한 배지에서 숙주세포를 배양하는 단계; 및

(3) 배지 또는 세포로부터 단백질을 분리 및 정제하는 단계.

본 발명에 있어서, 돌연변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 재조합 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 아데노바이러스 및 레트로 바이러스와 같은 포유동물 세포 바이러스, 또는 당업계에서 잘 알려진 다른 벡터를 의미한다. 모든 플라스미드 및 벡터는 숙주에서 복제 및 안정화될 수 있으면 사용할 수 있다. 발현 벡터의 중요한 특징은 일반적으로 복제 기점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 제어 요소를 포함하는 것이다.

당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 본 발명의 돌연변이 단백질을 암호화하는 DNA 서열 및 적절한 전사/번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술, 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. DNA 서열은 mRNA 합성을 가이드 하기 위한 발현 벡터의 적절한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 이러한 프로모터의 대표적인 예로는 대장균의 lac 또는 trp 프로모터; 감마 파지의 PL 프로모터; CMV 즉시 초기 프로모터(CMV immediate-early promoter), HSV 티미딘 키나아제 프로모터(HSV thymidine kinase promoter), SV40 얼리 및 레이트 프로모터(SV40 early late promoters), 레트로바이러스의 LTP를 포함하는 진핵생물의 프로모터, 및 상기 원핵 또는 진핵세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 제어할 수 있는 일부 다른 공지된 프로모터가 있다. 발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결자를 포함한다.

또한, 발현 벡터는 바람직하게는 진핵 세포 배양을 위한 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항성(neomycin resistance) 및 녹색 형광 단백질(GFP), 또는 대장균에 대한 테트라사이클린 저항성(tetracycline resistance) 또는 암피실린 저항성(ampicillin resistance)과 같이 형질전환된 숙주 세포를 선택하기 위한 표현형 특성을 제공하는 하나 이상의 선택적 마커 유전자를 포함한다.

상기 언급한 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 제어 서열을 포함하는 벡터는 단백질을 발현할 수 있도록 적절한 숙주세포를 형질전환 시키기 위하여 이용될 수 있다.

숙주세포는 원핵 세포(예를 들어, 대장균), 또는 하등 진핵 세포, 또는 효모 세포, 식물 세포, 또는 포유동물 세포(인간 또는 비인간 포유동물 세포를 포함하는)와 같은 고등 진핵세포 일 수 있다. 대표적인 예로는 대장균, 밀 배아 세포, 곤충 세포, SF9 세포, 헬라(Hela) 세포, HEK293 세포, CHO 세포, 효모 세포 등을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 효모 세포(예를 들어, 피히아 파스토리스, 클루이베로마이세스 또는 이들의 조합; 바람직하게는 효모세포는 클루이베로마이세스, 더 바람직하게는 클루이베로마이세스 마르크시아누스 및/또는 클루이베로마이세스 락티스를 포함한다.)는 숙주 세포로서 선택된다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 고등 진핵 세포에서 발현되는 경우, 벡터에 인핸서(enhancer) 서열을 삽입하면 전사가 강화된다. 인핸서는 유전자 전사를 강화시키기 위하여 프로모터에 작동하는, 일반적으로 약 10 내지 300개의 염기쌍으로 구성된 DNA의 시스-작동 요소이다. 예를 들면, 복제 기점의 하류 쪽(late side)에 있는 100 내지 270개 염기쌍의 SV40 인핸서, 복제 지점의 하류 쪽에 있는 폴리오마(polyoma) 인핸서, 아데노바이러스 인핸서 등이 있다.

당업자는 적절한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 숙주 세포를 선택하는 방법을 알고 있다.

재조합 DNA를 이용한 숙주 세포의 형질전환은 당업계에서 잘 알려진 통상적인 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 숙주가 대장균과 같은 원핵 생물인 경우, DNA를 받아들일 수 있는(absorb) 컴피턴트 세포(competent cell)는 지수 성장기(exponential growth phase) 후에 수확(harvested)하고 CaCl₂ 방법으로 처리할 수 있으며, 이용하는 단계는 당업계에 잘 알려져 있다. 다른 방법은 MgCl₂를 이용한다. 필요한 경우, 전기천공법으로 형질전환을 수행할 수도 있다. 숙주가 진핵 생물인 경우, 다음과 같은 DNA 트렌스펙션(transfection) 방법을 선택할 수 있다: 인산 칼슘 공침법 및 미세주입, 전기천공, 리포솜 패키징 등과 같은 일반적인 기계적 방법.

수득된 형질전환체는 본 발명의 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 발현을 위해 통상적인 방법으로 배양될 수 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 배양에 사용되는 배지는 다양한 통상적인 배지 중에서 선택할 수 있다. 배양은 숙주 세포를 성장시키기 위한 적합한 조건 하에서 수행된다. 숙주 세포가 적절한 세포 농도로 성장된 후에, 선택된 프로모터는 적절한 방법(예: 온도 스위치 또는 화학적 주입)에 의해 주입되고, 세포는 다른 시간 동안 배양된다.

상기 방법에서 언급한 재조합 폴리펩타이드는 세포 내부 또는 세포막에서 발현되거나, 세포 외부로 분비될 수 있다. 필요한 경우, 재조합 단백질은 물리적, 화학적 및 기타 특성으로 인해 다양한 분리 방법을 통해 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법의 예는 통상적인 원형회복(renaturation)처리, 단백질-침전제 처리(염분법), 원심분리, 박테리아의 삼투용해, 울트라트리트먼트(ultra-treatment), 초원심분리, 분자크로마토그래피(겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 기타 다양한 액체 크로마토그래피 기술 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 특정예(또는 실시예)와 조합하여 이하에 더 설명될 것이다. 이들의 예(또는 실시예)는 단지 설명의 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주 되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 하기의 예(또는 실시예)에서 구체적으로 기술된 조건이 제외된 실험 방법과 관련하여, 일반적으로 Sambrook et.al, Molecular Cloning에 기술된 조건과 같은 통상적인 조건을 따를 수 있다: 실험실 매뉴얼(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), 또는 제조업체가 권장하는 조건을 따른다. 달리 언급되지 않는 한, 백분율 및 부분은 중량 백분율 및 중량 부를 지칭한다.

달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 예에서 이용된 재료 및 시약은 모두 통상적으로 이용하는 제품이다.

본 발명은 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis)를 예시로 들지만, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 인간 소스 세포, 헬라(Hela) 세포, CHO 세포, HEK29 세포, 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) 및 다른 세포에도 동일한 설계, 분석 및 실험 방법을 적용할 수 있다.

일반적인 방법

본 발명은 다음과 같은 설계 및 방법을 제공한다: Ni-결합 단백질을 Ni 정제 및 질량 분석 방법을 통해 확인한 다음, 이를 기반으로 게놈 내의 ADH 계열 단백질을 점 돌연변이 시킴으로써 Ni 매질에 대한 결합 능력을 감소시키고, 이를 통해 Ni로 정제된 단백질의 효율, 수율 및 순도를 향상시킨다. 다음의 단계를 포함한다:

(1) 다음 방법으로 ADH 계열 단백질의 확인 및 분석:

A. Ni로 정제된 단백질의 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis) 분석;

B. 비-특이적 밴드(35-50 kDa)의 질량 분석법(mass spectrometry) 분석; 및

C. ADH 단백질로 확인된 주요 비특이적 밴드를 확인하기 위한 질량 분석법 분석 결과의 펩타이드 비교;

(2) 다음 방법에 의해 Ni 매질에 대한 K. lactis ADH 계열 단백질의 잠재적 결합 부위 분석:

A. K. lactis에서 ADH1 단백질 및 사카로마이세스 세레비제에서 ADH1 단백질의 서열 정렬;

B. ScADH를 상동성 모델링을 위한 주형으로 사용하고, ADH1에서 H47, H51 및 H124; ADH2에서 H45, H49 및 H122; ADH3에서 H71, H75 및 H148와 같은 KlADH에서 His-리치(rich) 영역을 찾고; 및

C. 조작이 ADH의 촉매 활성에 영향을 미치는지에 대한 여부와 같은 이 영역에서 His 부위에 대한 조작적 분석을 수행하고, 및 마지막으로 다음 그룹으로 구성된 군으로부터 선택되는 ADH1의 위치-지정 돌연변이와 같은 대체 아미노산을 선택한다: H124K, H124R, H47K, H47R, H47N, H47Q, H51K, H51R, H124KH47K, H124KH47R, H124KH47N, H124KH47Q 및 이들의 조합; 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 ADH2의 위치-지정 돌연변이; H122K, H122R, H45K, H45R, H45N, H45Q, H49K, H49R, H122KH45K, H122KH45R, H122KH45N, H122KH45Q 및 이들의 조합; 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 ADH3의 위치-지정 돌연변이; H148K, H148R, H71K, H71R, H71N, H71Q, H75K, H75R, H148KH71K, H148KH71R, H148KH71N, H148KH71Q 및 이들의 조합; 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 ADH4의 위치-지정 돌연변이; H149K, H149R, H72K, H72R, H72N, H72Q, H76K, H76R, H149KH72K, H149KH72R, H149KH72N, H149KH72Q 및 이들의 조합;

(3) Cas9-gRNA 클로닝 벡터의 구축 및 구축 방법은 다음과 같다:

A. 특정 유전자의 서열에 대해 각각 유전자 스플라이싱(splicing)을 가이드하는 gRNA 서열을 구축하고; 및

B. 상기 gRNA 서열을 Cas9를 포함하는 벡터로 재조합하여 gRNA 및 Cas9가 공동 발현되는 제1 벡터를 수득하는 단계;

(4) 다음과 같은 방법으로 특정 유전자의 녹아웃을 위해 사용되는 공여체 DNA(donor DNA)의 설계:

A. 유전자 데이터베이스로부터 특정 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 다운로드 하고, 유전자의 업스트림 및 다운스트림 각각의 800bp 에 위치한 서열을 이용하여 제2 벡터를 설계하는 단계; 및

B. 제2 벡터를 프라이머 M13F 및 M13R로 증폭하고, 수득한 PCR 산물을 알코올 침전으로 농축하여 공여체 DNA를 수득하는 단계;

(5) 다음 방법에 의해 히스티딘 잔기의 특정 점 돌연변이를 가진 공여체 DNA의 구축:

A. 유전자 데이터베이스로부터 특정 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 다운로드 하고, 표적 유전자 및 표적 유전자의 업스트림 및 다운스트림 각각 800bp에 위치한 서열을 각각 이용하여 제2 벡터를 구축하고, 아미노산 잔기의 일부에 점 돌연변이를 만들고, gRNA에 대한 동의 돌연변이(synonymous mutations)를 만들고; 및

B. 제2 벡터를 프라이머 M13F 및 M13R로 증폭하고, 수득한 PCR 산물을 알코올 침전으로 농축하여 공여체 DNA를 얻는 단계;

(6) 다음과 같은 방법으로 특정 유전자의 녹아웃 또는 점 돌연변이를 갖는 세포주를 수득한다:

A. 제1 벡터 및 공여체 DNA를 동시에 컴피턴트 세포로 형질전환시키는 단계; 및

B. 확대 배양(enlargement culture)을 위해 단클론(monoclonal) 세포를 스크리닝하고, 게놈을 추출하고, ADH 유전자 및 상동성 암을 증폭하기 위한 프라이머를 설계하고, 증폭된 PCR 산물을 시퀀싱을 통해 확인한다.

(7) 유전자 녹아웃 또는 점 돌연변이가 된 균주의 Ni 매질에 대한 결합 능력을 다음과 같은 방법으로 확인한다:

A. 유전자 녹아웃 또는 점 돌연변이가 되어 수득한 균주를 확대 배양하고, 세포 용해를 수행하여 세포 용해물을 수득하는 단계;

B. Ni 매질을 통해 용해물을 정제하고, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 정제된 산물을 분석하는 단계;

(8) 무세포 시험관 내 단백질 합성 시스템

유전자 조작된 세포주를 이용하여 효모 세포 용해물을 제조하고, 시험관 내 단백질 번역 시스템에 첨가한다. 반응 시스템을 20~20℃에서 2~12시간 동안 방치하고, 다기능 마이크로플레이트 리더(multifunctional microplate reader)(Perkin Elmer)를 이용하여 흡광도 값을 측정하고, 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)의 활성을 검출한다.

실시예 1: K. lactis 에서 ADH 계열 유전자의 분석 및 특정 조작

1.1 K. lactis 에서 ADH 계열 유전자의 분석

K. lactis에서 발현되는 His-태그 표지된 표적 단백질을 Ni 매질을 이용하여 친화성-정제를 하였을 때, 35-50kDa에서 명백한 비-특이적 밴드가 존재하였다. 질량 분석 결과 비-특이적 단백질은 주로 K. lactis의 ADH 계열 단백질에서 유래한다(표 1). ADH는 NAD(P)-의존성 산화환원효소로 거의 모든 유기체에 존재하고, 1차 및 2차 알코올을 각각 알데하이드(aldehyde) 및 케톤(ketone)으로 가역적으로 산화하는 촉매를 한다. K. lactis의 ADH 계열 단백질은 KlADH1, KlADH2, KlADH3 및 KlADH4의 네 가지 타입을 포함하고, 모두 염색체 DAN에 의해 암호화된다. 이 중, KlLA0F21010g의 KEGG 데이터베이스 코드(code)를 갖는 ADH1 유전자 서열(서열 번호 32)은 염색체 F에 위치하고; KlLA0F18260g의 KEGG 데이터베이스 코드를 갖는 ADH2 유전자 서열(서열 번호 29)은 염색체 F에 위치하며; KlLA0B09064g의 KEGG 데이터베이스 코드를 갖는 ADH3 유전자 서열(서열 번호 30)은 염색체 B에 위치하고; KlLA0F13530g의 KEGG 데이터베이스 코드를 갖는 ADH4 유전자 서열(서열 번호 31)은 염색체 F에 위치한다. 그 중에서, ADH1 및 ADH2는 세포질에서 기능을 수행하고, ADH3 및 ADH4는 각각 미토콘드리아에서 기능을 수행하며, 각각 37.3kDa, 37.1kDa, 39.6kDa 및 40.2kDa의 상대 분자량을 갖는다. 4개의 ADH 단백질의 아미노산 서열은 높은 상동성이 있고, 그들의 3차 구조 또한 매우 유사하다.

표 1 질량 분석법에 의해 Ni 매질로 정제된 비-특이적 단백질을 확인하여 수득한 펩타이드 단편 및 펩타이드 단편으로 표시된 K. lactis 내인성 단백질

K. lactis에서 ADH 계열 단백질의 결정 구조는 아직 알려지지 않았기 때문에, 본 발명자는 공간적 3차 구조를 예측하기 위하여 상동성 모델링을 이용하였다. K. lactis의 KlADH1과 사카로마이세스 세레비제(PDB No. 4W6Z)의 ScADH1 사이의 1차 서열 정렬은 두 가지가 84.9% 서열 상동성을 갖는 사량체임을 보여준다. ScADH1을 주형으로 이용한 상동성 모델링은 K. lactis에서 KlADH1의 각 단량체는 각각 47, 51, 69, 124, 243 및 321 부위에 위치한 총 6개의 His를 포함함을 보여준다. 전체 사량체에는 총 4개의 His-리치 영역이 있다. 각 단량체의 다섯 번째 His가 상대적으로 독립되어 있다는 점을 제외하고, 각 단량체의 나머지 다섯 개의 His는 공간적으로 가깝고, 상기 다른 다섯 개의 His 중에서 공간에서 가장 가까운(및 서열에서도) 것은 각 모노머 앞에 세 개 내지 내 개의 His이다.

K. lactis에 있는 네 개의 ADH는 매우 상동적이고, 다섯 개의 His는 보존이 잘 되어 있기 때문에 KlADH2, KlADH3 및 KlADH4의 공간 구조도 KlADH1의 공간 구조와 유사하며, 즉, 각 ADH 단백질의 처음 네 개의 His는 공간에 클러스터(cluster)되어 Ni 매질에 대한 친화성을 생성할 수 있다.

1.2 K. lactis 에서 ADH 계열 유전자의 특정 조작

Ni 매질에 대한 ADH의 친화성을 제거할 때 ADH 활성에 대한 영향을 가능한 한 최소화해야 한다는 관점에서, KlADH에서 His의 기능의 분석인 핵심이 된다. 많은 비교 및 스크리닝을 통해, ScADH1 단백질, H44, H48, H66 및 H121와 상동성인 KlADH1 단백질에서 여섯 개의 His중, KlADH1에 클러스터된 4개의 His와의 상동성 때문에 본 발명의 분석의 핵심 포인트가 되는 것을 발견하였다. H66은 도 6에 나타낸 바와 같이, ScADH1의 두 가지 형태에서 촉매 Zn^{2 +}를 킬레이트화 하는데 관여하기 때문에, ADH의 촉매 활성에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로, 본 발명의 조작 표적으로 간주되지 않는다. H48은 코엔자임에 결합하지 않지만, 도 7에 나타낸 바와 같이, 3차 구조의 형성에 참여하고, 기질의 양성자 전달 과정에 영향을 미친다. 본 발명은 H44 이미다졸 고리의 ND1이 NAD⁺의 O2A와 수소 결합을 형성하여 NAD⁺/NADH의 결합에 참여할 수 있음을 발견하였다. H44R은 NAD⁺ 및 NADH의 해리 상수를 2-4배 감소시키고, 전환 상수를 4-6배 줄일 수 있다. 또한, H121의 측쇄사슬(side chain)은 T130과 수소 결합을 형성할 수 있다.

상기와 같은 연구에 기초하여, 본 발명에서는, ScADH1에서 ADH1의 기능에 거의 영향을 미치지 않는 3개의 His 부위(각각 H44, H48, H121)를 유사한 기능을 갖는 아미노산으로 뮤턴트시키고, 마지막으로 KlADH1를 위해 설계된 점 돌연변이 스킴(scheme)은 H124K, H124R, H47K, H47R, H47N, H47Q, H51K, H51R, H124KH47K, H124KH47R, H124KH47N 및 H124KH47Q이다.

K. lactis의 ADH2, ADH3 및 ADH4는 ADH1과 매우 상동성이 있기 때문에 (도 2), ADH2의 H45, H49 및 H122, ADH3의 H71, H75 및 H148, ADH4의 H72, H76 및 H149는 각각 ADH1의 H47, H51 및 H124에 해당한다.

따라서, 본 발명에서는, ADH1 유전자의 녹아웃 및 H47, H51 및 H124의 부위-점 돌연변이에 표시된 대로, ADH1는 Ni 매질에 대한 ADH1의 결합을 감소시키기 위한 예로 사용된다. ADH2, ADH3 및 ADH4는 ADH1과 유사한 방법을 이용하여 해당 부위에 조작할 수도 있다.

실시예 2: CRISPR / Cas9를 통한 ADH1 유전자의 표적 녹아웃

2.1 Kl ADH1 CRISPR gRNA 서열의 결정

KlADH1에서 설계된 점 돌연변이에 따라, PAM 서열(NGG)을 선택하고, 해당 gRNA 서열을 결정하였다. 이 실시예에서 gRNA를 선택하는 원리는 다음 같다: GC 함량은 보통(40%-60%)이어야 하며, poly T 구조의 존재는 피해야 한다. 이 실시예에서 KlADH1 gRNA1 서열은 TGGGTGAAAACGTCAAGGGC이다.

플라스미드 구축 및 형질전환 방법은 다음과 같다: 프라이머 pKMCas9-KlADH1-gRNA1-PF: TGGGTGAAAACGTCAAGGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 및 pCas9-KlADH1-gRNA1-PR: GCCCTTGACGTTTTCACCCAAAAGTCCCATTCGCCACCCG를 사용하고, 주형으로서 pCAS 플라스미드를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭된 산물 17 μL을 취하여 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10Х 분해 버퍼(digestion buffer)를 첨가하고; 혼합한 다음, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포(competent cells) 50 μL에 첨가하여다. 혼합물은 30분 동안 얼음상에 놓고, 42℃에서 45초 동안 열-충격한 다음 LB 액체 배지 1 mL를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 진탕(shaking) 배양 한다. 이후, 카나마이신(Kan-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 2개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMCas9_StR_KlADH1로 명명하였다.

2.2. 공여체 DNA 플라스미드의 구축 및 증폭

본 실시예에서, 선형 공여체 DNA의 저장 및 증폭을 용이하게 하기 위하여, 공여체 DNA를 먼저 pKMD1 플라스미드에 삽입한 다음, PCR로 증폭시켜 선형 공여체 DNA 서열을 수득하였다.

PCR 증폭 과정은 pKMD1 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 pKMD1-PF: ATCGTCGACCTGCAGGCATG 및 pKMD1-PR: ATCTCTAGAGGATCCCCGGG을 이용하여 수행하였다. 17 μL 증폭 산물을 취하여 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10Х 분해 버퍼를 첨가하고; 혼합한 후, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고; 플라스미드 골격의 선형 단편 pKMD1-T를 수득하였다.

2.2.1 공여체 플라스미드 pKMD1 -Δ KlADH1 의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-HR1-PR: GAAGAGATTTCATTTATCTTTTTTTAGTATAGAGTTTGTGTGTTTAAAGCTTG을 이용하여 수행하였으며, 생성물은 ΔKlADH1-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR2-PF: CAAACTCTATACTAAAAAAAGATAAATGAAATCTCTTCCGCATTCAAGTCATGAC 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 ΔKlADH1-F2로 명명되었다.

증폭된 산물 ΔKlADH1-F1, ΔKlADH1-F2, 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix (아래 TransGen Biotech Company의 Transgene pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit라는 이름의 키트)와 2 μL의 물을 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포(TransGen Biotech Company, 아래 동일)에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린(Amp-resistant)-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMD1-ΔKlADH1로 명명하였다.

2.3 K. lactis 의 전기충격 형질전환

컴피턴트 세포를 -80℃ 냉장고에서 꺼내어 얼음 상에서 녹인 후, 400ng gRNA & Cas9 플라스미드(또는 gRNA/cas9 단편) 및 1000ng 공여체 DNA를 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 전기천공 큐벳(cuvette)으로 옮기고, 얼음 상에서 2분 동안 담궈(bath)두었다. 전기천공 큐벳을 전기 충격을 위해 전기천공기에 넣었다(매개 변수 1.5kV, 200Ω 및 25μF). 전기 충격을 완료한 다음, 혼합물을 즉시 700 μL YPD에 첨가한 다음, 30℃의 200 rpm 속도의 진탕기에서 1-3시간 동안 배양하였다. 2-200 μL의 혼합물을 취하여 YPD(G418 저항성) 플레이트에 접종하고 단클론 콜로니가 나타날 때까지 30℃에서 2-3일 동안 배양하였다.

2.4 양성 선별

형질전환된 세포가 있는 플레이트에서 12 내지 24 단클론 콜로니를 골라냈다. 샘플은 세포를 주형으로 하고, 식별 프라이머 ADH1-CF : GTGATGGAACACGGGAATAG 및 ADH1-CR : CACATATACCTTGGCAGTAG를 이용한 PCR에 의해 검출하였다. PCR에 의해 양성으로 테스트되고 시퀀싱으로 확인된 균주를 양성 균주로 결정하였으며, ΔADH1로 명명하였다.

실시예 3 CRISPR / Cas9에 의한 ADH1 H47 부위의 위치-지정 돌연변이

3.1 Kl ADH1 CRISPR gRNA 서열의 결정

KlADH1에서 설계된 점 돌연변이에 따라, PAM 서열(NGG)을 선택하고 해당 gRNA 서열을 결정하였다. 이 실시예에서 gRNA를 선택하는 원리는 다음 같다: gRNA는 설계된 돌연변이 부위에 가까워야 하고; GC 함량은 보통(40%-60%)이어야 하며, poly T 구조의 존재는 피해야 한다. 이 실시예에서 KlADH1 gRNA1 서열은 TGGGTGAAAACGTCAAGGGC이다.

플라스미드 구축 및 형질전환 방법은 다음과 같다: 프라이머 pCas9-KlADH1-gRNA1-PF: TGGGTGAAAACGTCAAGGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 및 pCas9-KlADH1-gRNA1-PR: GCCCTTGACGTTTTCACCCAAAAGTCCCATTCGCCACCCG를 사용하고, 주형으로서 pCAS 플라스미드를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭된 산물 17 μL을 취하여 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10 x 분해 버퍼를 첨가하였다. 혼합한 다음, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 50 μL에 첨가하여다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42℃에서 45초 동안 열-충격한 다음 LB 액체 배지 1 mL를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양 한다. 이후, 카나마이신-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 2개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMCas9_StR_KlADH1로 명명하였다.

3.2 공여체 DNA 플라스미드의 구축 및 증폭

본 실시예에서, 선형 공여체 DNA의 저장 및 증폭을 용이하게 하기 위하여, 공여체 DNA를 먼저 pKMD1 플라스미드에 삽입한 다음, PCR로 증폭시켜 선형 공여체 DNA 서열을 수득하였다.

PCR 증폭 과정은 pKMD1 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 pKMD1-PF: ATCGTCGACCTGCAGGCATG 및 pKMD1-PR: ATCTCTAGAGGATCCCCGGG를 이용하여 수행하였다. 17 μL 증폭 산물을 취하여 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10Х 분해 버퍼를 첨가하고; 혼합한 후, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고; 플라스미드 골격의 선형 단편 pKMD1-T를 수득하였다.

3.2.1 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H47K의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-H47K-PR: AGCATGAAGGTCAGTTTTACAGACACCGGAGTACTTGACG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47K-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H47K-PF: GTAAAACTGACCTTCATGCTTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR: CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47K-F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF：GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-HR2-PR：TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47N-F3로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H47K-F1, KlADH1-H47K-F2, KlADH1-H47K-F3 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix와 1 μL의 물을 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드는 pKMD1-KlADH1-H47K로 명명하였다.

3.2.2 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H47N의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-H47N-PR: AGCATGAAGGTCAGTATTACAGACACCGGAGTACTTGACG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47N-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H47N-PF: GTAATACTGACCTTCATGCTTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR: CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47N-F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF: GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47N-F3로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H47N-F1, KlADH1-H47N-F2, KlADH1-H47N-F3 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix와 1 μL의 물을 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMD1-KlADH1-H47N이라고 명명하였다.

3.2.3 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H47Q의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-H47Q-PR: AGCATGAAGGTCAGTTTGACAGACACCGGAGTACTTGACG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47Q-F1로 명명하고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H47Q-PF: GTCAAACTGACCTTCATGCTTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR: CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47Q-F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF: GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47Q-F3로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H47Q-F1, KlADH1-H47Q-F2, KlADH1-H47Q-F3 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix와 1 μL의 물을 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMD1-KlADH1-H47Q로 명명하였다.

3.2.4 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H47R의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-H47R-PR: AGCATGAAGGTCAGTTCTACAGACACCGGAGTACTTGACG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47R-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H47R-PF: GTAGAACTGACCTTCATGCTTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR: CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47R-F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF: GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47R-F3로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H47R-F1, KlADH1-H47R-F2, KlADH1-H47R-F3 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix와 1 μL의 물을 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMD1-KlADH1-H47R로 명명하였다.

3.3 K. lactis 의 전기충격 형질전환( 실시예 2.3과 동일)

3.4 양성 선별

형질전환된 세포가 있는 플레이트에서 12 내지 24 단클론 콜로니를 골라냈다. 샘플은 식별 프라이머 ADH1-m-CF: TGGGAGAGAATGTTAAAGGT 및 ADH1-m-CR: TGACGGTCGTTAACTAAGAT 및 세포를 주형으로 이용한 PCR에 의해 검출하였다. PCR에 의해 양성으로 테스트되고 시퀀싱으로 확인된 균주를 양성 균주로 결정하였으며, 각각 ADH1 H47K, ADH1 H47N, ADH1 H47Q 및 ADH1 H47R로 명명하였다.

실시예 4 CRISPR / Cas9에 의한 ADH1 H51 부위의 위치-지정 돌연변이

4.1 Kl ADH1 CRISPR gRNA 서열의 결정

KlADH1에서 설계된 점 돌연변이에 따라, PAM 서열(NGG)을 선택하고 해당 gRNA 서열을 결정하였다. 이 실시예에서 gRNA를 선택하는 원리는 다음 같다: gRNA는 설계된 돌연변이 부위에 가까워야 하고; GC 함량은 보통(40%-60%)이어야 하며, poly T 구조의 존재는 피해야 한다. 이 실시예에서 KlADH1 gRNA1 서열은 TGGGTGAAAACGTCAAGGGC이다.

플라스미드 구축 및 형질전환 방법은 다음과 같다: 프라이머 pCas9-KlADH1-gRNA1-PF: TGGGTGAAAACGTCAAGGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 및 pCas9-KlADH1-gRNA1-PR: GCCCTTGACGTTTTCACCCAAAAGTCCCATTCGCCACCCG를 사용하고, 주형으로서 pCAS 플라스미드를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭된 산물 17 μL을 취하여 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가하였다. 혼합한 다음, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 50 μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42℃에서 45초 동안 열-충격한 다음 LB 액체 배지 1 mL를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 진탕(shaking) 배양 한다. 이후, 카나마이신-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양(inverted culture)을 수행하였다. 2개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMCas9_StR_KlADH1로 명명하였다.

4.2 공여체 DNA 플라스미드의 구축 및 증폭

본 실시예에서, 선형 공여체 DNA의 저장 및 증폭을 용이하게 하기 위하여, 공여체 DNA를 먼저 pKMD1 플라스미드에 삽입한 다음, PCR로 증폭시켜 선형 공여체 DNA 서열을 수득하였다.

PCR 증폭 과정은 pKMD1 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 pKMD1-PF: ATCGTCGACCTGCAGGCATG 및 pKMD1-PR: ATCTCTAGAGGATCCCCGGG를 이용하여 수행하였다. 17 μL 증폭 산물을 취하여 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10Х 분해 버퍼를 첨가하고; 혼합한 후, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고; 플라스미드 골격의 선형 단편 pKMD1-T를 수득하였다.

4.2.1 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H51K의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-H51K-PR: CCAAGCTTTAAGGTCAGTATGACAGACACCGGAGTACTTGACG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H51K-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H51K-PF: GTCATACTGACCTTAAAGCTTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR: CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H51K-F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF: GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H51K-F3로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H51K-F1, KlADH1-H51K-F2, KlADH1-H51K-F3 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix와 1 μL의 물을 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMD1-KlADH1-H51K로 명명하였다.

4.2.2 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H51R의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-H51R-PR: CCAAGCTCTAAGGTCAGTATGACAGACACCGGAGTACTTGACG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H51R-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H51R-PF: GTCATACTGACCTTAGAGCTTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR: CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1- H51R -F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF: GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H51R-F3로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H51R-F1, KlADH1-H51R-F2, KlADH1-H51R-F3 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix와 1 μL의 물을 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양 하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양 하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, 플라스미드 pKMD1-KlADH1-H51R로 명명하였다.

4.3 K. lactis 의 전기충격 형질전환( 실시예 2.3과 동일)

4.4 양성 선별

형질전환된 세포가 있는 플레이트에서 12 내지 24 단클론 콜로니를 골라냈다. 샘플은 식별 프라이머 ADH1-m-CF: TGGGAGAGAATGTTAAAGGT 및 ADH1-m-CR: TGACGGTCGTTAACTAAGAT와 세포를 주형으로 이용한 PCR에 의해 검출하였다. PCR에 의해 양성으로 테스트되고 시퀀싱으로 확인된 균주를 양성 균주로 결정하였으며, 각각 ADH1 H51K 및 ADH1 H51R로 명명하였다.

실시예 5 CRISPR / Cas9에 의한 ADH1 H124 부위의 위치-지정 돌연변이

5.1 Kl ADH1 CRISPR gRNA 서열의 결정

KlADH1에서 설계된 점 돌연변이에 따라, PAM 서열(NGG)을 선택하고 해당 gRNA 서열을 결정하였다. 이 실시예에서 gRNA를 선택하는 원리는 다음 같다: gRNA는 설계된 돌연변이 부위에 가까워야 하고; GC 함량은 보통(40%-60%)이어야 하며, poly T 구조의 존재는 피해야 한다. 이 실시예에서 KlADH1 gRNA1 서열은 TGGGTGAAAACGTCAAGGGC이다.

플라스미드 구축 및 형질전환 방법은 다음과 같다: 프라이머 pCas9-KlADH1-gRNA1-PF: TGGGTGAAAACGTCAAGGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 및 pCas9-KlADH1-gRNA1-PR: GCCCTTGACGTTTTCACCCAAAAGTCCCATTCGCCACCCG를 사용하고, 주형으로서 pCAS 플라스미드를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭된 산물 17 μL을 취하여 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가하였다. 혼합한 다음, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 50 μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42℃에서 45초 동안 열-충격한 다음 LB 액체 배지 1 mL를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 진탕(shaking) 배양한다. 이후, 카나마이신-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 2개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMCas9_StR_KlADH1로 명명하였다.

5.2 공여체 DNA 플라스미드의 구축 및 증폭

본 실시예에서, 선형 공여체 DNA의 저장 및 증폭을 용이하게 하기 위하여, 공여체 DNA를 먼저 pKMD1 플라스미드에 삽입한 다음, PCR로 증폭시켜 선형 공여체 DNA 서열을 수득하였다.

PCR 증폭 과정은 pKMD1 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 pKMD1-PF: ATCGTCGACCTGCAGGCATG 및 pKMD1-PR: ATCTCTAGAGGATCCCCGGG를 이용하여 수행하였다. 17 μL 증폭 산물을 취하여 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10Х 분해 버퍼를 첨가하고; 혼합한 후, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고; 플라스미드 골격의 선형 단편 pKMD1-T를 수득하였다.

5.2.1 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H124K의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR: CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H124K-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF: GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-H124K-PR: CCATCTTTTGTATATCCACTCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H124K-F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H124K-PF: CTTGAGTGGATATACAAAAGATGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H124K-F3로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H124K-F1, KlADH1-H124K-F2, KlADH1-H124K-F3 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix와 1 μL의 물을 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMD1-KlADH1-H124K로 명명하였다.

5.2.2 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H124R의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR: CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H124K-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF: GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-H124R-PR: CCATCTCTTGTATATCCACTCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H124R-F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H124R-PF: CTTGAGTGGATATACAAGAGATGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H124R-F3로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H124R-F1, KlADH1-H124R-F2, KlADH1-H124R-F3 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix와 1 μL의 물을 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMD1-KlADH1- H124R로 명명하였다.

5.3 K. lactis 의 전기충격 형질전환( 실시예 2.3과 동일)

5.4 양성 선별

형질전환된 세포가 있는 플레이트에서 12 내지 24 단클론 콜로니를 골라냈다. 샘플은 식별 프라이머 ADH1-m-CF: TGGGAGAGAATGTTAAAGGT 및 ADH1-m-CR: TGACGGTCGTTAACTAAGAT와 세포를 주형으로 이용한 PCR에 의해 검출하였다. PCR에 의해 양성으로 테스트되고 시퀀싱으로 확인된 균주를 양성 균주로 결정하였으며, 각각 ADH1 H124K 및 ADH1 H124R 로 명명하였다.

실시예 6 CRISPR / Cas9에 의한 ADH1 H47 및 H124 부위의 동시 위치-지정 돌연변이

6.1 Kl ADH1 CRISPR gRNA 서열의 결정

KlADH1에서 설계된 점 돌연변이에 따라, PAM 서열(NGG)을 선택하고 해당 gRNA 서열을 결정하였다. 이 실시예에서 gRNA를 선택하는 원리는 다음 같다: gRNA는 설계된 돌연변이 부위에 가까워야 하고; GC 함량은 보통(40%-60%)이어야 하며, poly T 구조의 존재는 피해야 한다. 이 실시예에서 KlADH1 gRNA1 서열은 TGGGTGAAAACGTCAAGGGC이다.

플라스미드 구축 및 형질전환 방법은 다음과 같다: 프라이머 pCas9-KlADH1-gRNA1-PF: TGGGTGAAAACGTCAAGGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 및 pCas9-KlADH1-gRNA1-PR: GCCCTTGACGTTTTCACCCAAAAGTCCCATTCGCCACCCG를 사용하고, 주형으로서 pCAS 플라스미드를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭된 산물 17 μL을 취하여 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10× 분해 버퍼를 첨가하였다; 혼합한 다음, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. DpnI 처리된 혼합물 10 μL를 DH5α 컴피턴트 세포 50 μL에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 놓고, 42℃에서 45초 동안 열-충격한 다음 LB 액체 배지 1 mL를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양한다. 이후, 카나마이신-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 2개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMCas9_StR_KlADH1로 명명하였다.

6.2 공여체 DNA 플라스미드의 구축 및 증폭

본 실시예에서, 선형 공여체 DNA의 저장 및 증폭을 용이하게 하기 위하여, 공여체 DNA를 먼저 pKMD1 플라스미드에 삽입한 다음, PCR로 증폭시켜 선형 공여체 DNA 서열을 수득하였다.

PCR 증폭 과정은 pKMD1 플라스미드를 주형으로 하고, 프라이머 pKMD1-PF: ATCGTCGACCTGCAGGCATG 및 pKMD1-PR: ATCTCTAGAGGATCCCCGGG를 이용하여 수행하였다. 17 μL 증폭 산물을 취하여 1 μL의 Dpn I 및 2 μL의 10Х 분해 버퍼를 첨가하고; 혼합한 후, 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고; 플라스미드 골격의 선형 단편 pKMD1-T를 수득하였다.

6.2.1 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H47KH124K의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-H47K-PR: AGCATGAAGGTCAGTTTTACAGACACCGGAGTACTTGACG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47KH124K-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H47K-PF: GTAAAACTGACCTTCATGCTTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR: CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47KH124K-F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF: GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-H124K-PR: CCATCTTTTGTATATCCACTCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47KH124K-F3로 명명하였고, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H124K-PF: CTTGAGTGGATATACAAAAGATGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1- H47KH124K-F4로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H47KH124K-F1, KlADH1-H47KH124K-F2, KlADH1-H47KH124K-F3, KlADH1-H47KH124K-F4 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix를 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMD1-KlADH1- H47KH124K로 명명하였다.

6.2.2 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H47NH124K의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-H47N-PR: AGCATGAAGGTCAGTATTACAGACACCGGAGTACTTGACG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47NH124K-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H47N-PF: GTAATACTGACCTTCATGCTTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR: CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47NH124K-F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF: GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-H124K-PR: CCATCTTTTGTATATCCACTCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1- H47NH124K-F3로 명명하였고, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H124K-PF: CTTGAGTGGATATACAAAAGATGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47NH124K-F4로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H47NH124K-F1, KlADH1-H47NH124K-F2, KlADH1-H47NH124K-F3, KlADH1-H47NH124K-F4 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix를 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMD1-KlADH1-H47NH124K로 명명하였다.

6.2.3 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H47QH124K의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-H47Q-PR: AGCATGAAGGTCAGTTTGACAGACACCGGAGTACTTGACG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47QH124K-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H47Q-PF: GTCAAACTGACCTTCATGCTTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR: CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47QH124K-F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF: GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-H124K-PR: CCATCTTTTGTATATCCACTCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47QH124K-F3로 명명하였고, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H124K-PF: CTTGAGTGGATATACAAAAGATGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47QH124K-F4로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H47QH124K-F1, KlADH1-H47QH124K-F2, KlADH1-H47QH124K-F3, KlADH1-H47QH124K-F4 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix를 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMD1-KlADH1-H47QH124K로 명명하였다.

6.2.4 공여체 플라스미드 pKMD1 - KlADH1 - H47RH124K의 구축

하나의 PCR 증폭 과정은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-HR1-PF: TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATCATGGACAATACGTTACCGAGATGAGG 및 KlADH1-H47R-PR: AGCATGAAGGTCAGTTCTACAGACACCGGAGTACTTGACG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47RH124K-F1로 명명하였고; 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H47R-PF: GTAGAACTGACCTTCATGCTTGGAAGGGTGACTGGCCTTTG 및 KlADH1-gRNA1-m-PR：CCAACCTTTAACATTCTCTCCCATAGCAACAACGACACCAG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47RH124K-F2로 명명하였으며, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-gRNA1-m-PF: GGGAGAGAATGTTAAAGGTTGGAAGATTGGTGACTTCGCTGG 및 KlADH1-H124K-PR: CCATCTTTTGTATATCCACTCAAGTCAGCTTCTGGACAGTTGG를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47RH124K-F3로 명명하였고, 다른 PCR 증폭은 클루이베로마이세스 락티스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 KlADH1-H124K-PF: CTTGAGTGGATATACAAAAGATGGTTCTTTCCAACAATACGCTACTGC 및 KlADH1-HR2-PR: TGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATCTTATACTGGGTAGATTTCAAACGGGAC를 이용하여 수행하였으며, 생성물은 KlADH1-H47RH124K-F4로 명명하였다.

증폭된 산물 KlADH1-H47RH124K-F1, KlADH1-H47RH124K-F2, KlADH1-H47RH124K-F3, KlADH1-H47RH124K-F4 및 pKMD1-T 각 1 μL을 혼합하고, 5 μL의 Cloning Mix를 첨가하였다. 혼합한 후, 혼합물을 50℃ 물이 담긴 수조에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 혼합물을 2분 동안 얼음상에 두었다. 10 μL 반응 혼합물을 50 μL Trans-T1 컴피턴트 세포에 모두 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음상에 두고, 42℃에서 30초 동안 열-충격한 후, 1 mL의 LB 액체 배지를 첨가 한 다음, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 혼합물을 암피실린-내성 LB 고체 배지에 코팅한 후, 단클론 콜로니가 성장할 때까지 37℃에서 역배양을 수행하였다. 6개의 단클론 콜로니를 골라낸 다음 LB 액체 배지에서 진탕 배양하였다. PCR-양성 검출 및 시퀀싱으로 확인하고, 플라스미드를 추출 및 저장하였으며, pKMD1-KlADH1-H47RH124K로 명명하였다.

6.3 K. lactis 의 전기충격 형질전환 ( 실시예 2.3과 동일)

6.4 양성 선별

형질전환된 세포가 있는 플레이트에서 12 내지 24 단클론 콜로니를 골라냈다. 샘플은 식별 프라이머 ADH1-m-CF: TGGGAGAGAATGTTAAAGGT 및 ADH1-m-CR: TGACGGTCGTTAACTAAGAT와 세포를 주형으로 이용한 PCR에 의해 검출하였다. PCR에 의해 양성으로 테스트되고 시퀀싱으로 확인된 균주를 양성 균주로 결정하였으며, 각각 ADH1 H47KH124K, ADH1 H47NH124K, ADH1 H47QH124K 및 ADH1 H47RH124K로 명명하였다.

실시예 7 Ni 매질에 대한 Kl ADH1 -조작된 세포주의 내인성 단백질의 결합능력 분석

7.1 단백질 정제 시스템을 위한 시약 준비

바인딩(binding buffer) 버퍼: 0.5 M 염화나트륨(NaCl), 20 mM Tris-HCl, 5 mM 이미다졸(imidazole), pH 7.9.

워시 버퍼(wash buffer): 0.5 M 염화나트륨(NaCl), 20 mM Tris-HCl, 60 mM 이미다졸(imidazole), pH 7.9.

7.2 Kl ADH1 -조작된 세포주에서 내인성 단백질의 정제 및 Ni 매질에 대한 이들의 결합 능력 분석

Ni-NTA 비드는 결합 버퍼로 벨런스를 맞추었고; 적절한 양의 KlADH1-조작 세포 균주(KlADH1-engineered cell strain)의 세포 용해물을 첨가하고 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하고; 비드를 워시 버퍼로 세척하고; 워시 버퍼를 제거한 다음에 적은 양의 로딩 버퍼를 첨가하고 96℃에서 5분 동안 처리하였다. 상기 샘플을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분석하였다.

실시예 8 시험관 내 단백질 합성 시스템

8.1 시험관 내 단백질 합성 시스템을 저장 용액의 준비

최종 농도: 22mM 4-하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid)(pH7.4), 30-150mM 아세트산 칼륨(potassium acetate), 1.0-5.0mM 아세트산 마그네슘(magnesium acetate), 1.5-4mM 뉴클레오시드 삼인산(nucleoside triphosphates)의 혼합물(아데노신 삼인산(adenosine triphosphate)(ATP), 구아노신 삼인산(guanosine triphosphate)(GTP), 시스티딘 삼인삼(cytidine triphosphate)(CTP) 및 우리딘 삼인삼(uridine triphosphate)(UTP)), 0.08-0.24mM 아미노산 혼합물(글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 세린, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 25mM 포스포크레아틴, 1.7mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 0.27mg/ml 크레아틴 포스포키나아제, 0.027-0.054mg/mL T7 RNA 중합효소, 1%-4% PEG, 0.5%-2% 소스 및 최종적으로 세포 추출물을 부피의 50% 첨가.

8.2 시험관 내 단백질 합성 반응

상기 언급된 반응 시스템을 20~30℃ 환경에 두고, 혼합물을 2 내지 12시간 동안 반응을 위해 유지시켰다.

향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)의 활성 분석: 반응 몇 시간 후, 10 μL 반응 용액을 96-웰-화이트 플레이트 또는 384-웰 화이트 플레이트에 첨가하고; 그 후 혼합물을 즉시 Envision 2120 다기능 마이크로플레이트리더기(multifunctional microplate reader)(Perkin Elmer)에 놓고, 흡광도는 향상된 녹색 형광 단백질의 활성을 감지하기 위해 판독하였으며, 여기서 활성 단위는 상대적 발광 수치(RLU) 값으로, 도 24에 나타내었다.

실시예 9 시험관 내 단백질 합성 및 정제

9.1 시험관 내 단백질 합성

결과를 볼 때, 야생형 세포주에 비해 ΔADH1 세포주는 무세포 시스템에서 전사-번역의 활성이 현저히 감소한 반면에 ADH1 H47K 세포주는 뚜렷한 변화가 없었으며, 따라서 ADH1 H47K는 본 발명의 시험관 내 단백질 합성 연구를 위한 재료가 되었다. ADH1 H47K 세포주의 무세포 전사-번역 시스템에 N-His8-eGFP 및 N-His8-Strep-GFP의 주형을 추가하였다. 상기에서 언급한 반응 시스템을 20-30℃의 환경에 두고, 혼합물을 2-12시간 동안 방치하였다.

9.2 시험관 내 단백질 정제

Ni-NTA 비드는 결합 버퍼(binding buffer)로 밸런스를 맞추었고; 적절한 양의 상기 언급한 반응 시스템을 첨가하고 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하고; 비드를 워시 버퍼(wash buffer)로 세척하고; 워시 버퍼를 제거한 다음에 적은 양의 로딩 버퍼(loading buffer)를 첨가하고 96℃에서 5분 동안 처리 하였다. 상기 샘플을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 결과는 도 25에 나타내었다.

본 발명의 실시예의 결과는 다음을 나타낸다:

본 발명의 실시예 7의 결과는, 야생형 세포주와 비교하였을 때 본 발명의 조작된 세포주에 의해 생성된 Ni 매질에 대한 친화성이 모두 현저하게 감소되었음을 나타낸다.

그 중에서, ΔADH1, ADH1 H47K, ADH1 H47N, ADH1 H51R, ADH1 H124K, ADH1 H47KH124K 및 ADH1 H47NH124K와 같은 세포주는 Ni 매질에 대해 가장 낮은 친화력을 가졌다.

ΔADH1, ADH1 H47K, ADH1 H47N, ADH1 H51R, ADH1 H124K, ADH1 H47KH124K 및 ADH1 H47NH124K는 Ni 매질에 대해 유사한 친화성을 가졌고, 본 발명은 무세포 시스템의 전사-번역 활성을 분석하기 위하여 ΔADH1 및 ADH1 H47K를 선택하였다.

결과를 도 24에 나타내었다. 야생형 무세포 시스템의 전사-번역 활성의 상대적 발광 수치(RFU) 값은 442이고, ΔADH1 무세포 시스템의 RFU 값은 12이며, 이는 야생형 무세포 시스템보다 현저히 감소하여 ADH1 유전자의 녹아웃이 무세포 시스템의 전사-번역 활성에 큰 부정적인 영향을 미쳤다는 것을 나타낸다. ADH1 H47K의 무세포 시스템의 상대적 발광 수치(RFU) 값은 419이며, 이는 야생형 세포주와 비교하였을 때 현저한 변화가 없었다.

동일한 방법을 이용하여 다른 돌연변이 세포주의 무세포 시스템 전사-번역 활성을 분석하였다. 결과는 다른 돌연변이 세포주의 무세포 시스템 전사-번역 활성의 시스템의 상대적 발광 수치(RFU) 값은 300-400으로, 이는 야생형 세포주와 실질적으로 동일함을 나타낸다.

또한, 본 발명의 KlADH1 H47K 무세포 전사-번역 시스템에서 외인성 단백질 N-His8-eGFP 및 N-His8-Strep-eGFP의 발현 순도를 분석하였다. 그 결과를 도 25에 나타내었다. 야생형 세포주(WT)와 비교하였을 때, KlADH1 H47K 세포주는 37kD에서 매우 약하게 ADH1 단백질 밴드가 나타났으며, 이는 외인성 단백질 N-His8-eGFP 및 N-His8-Strep-eGFP의 순도가 KlADH1 H47K의 무세포 전사-번역 시스템에서 현저히 개선됨을 나타낸다.

다른 돌연변이 세포주의 순도를 같은 방법을 이용하여 분석하였다. 그 결과 야생형 세포주(WT)와 비교하였을 때, 다른 돌연변이 세포주의 무세포 전사-번역 시스템에서 외인성 단백질 N-His8-eGFP 및 N-His8-Strep-eGFP의 순도도 현저히 향상됨을 나타내었다.

상기 모든 결과는 본 발명에서 ADH 계열 단백질의 위치-지정 돌연변이는 Ni 매질에 대한 ADH 계열 단백질의 결합 친화성을 감소시킬 뿐만 아니라 세포주의 무세포 시스템 전사-번역에 영향을 미치지 않으며, 세포주의 무세포 시스템 전사-번역 활성에서 외인성 단백질의 발현 순도를 더욱 향상시킬 수 있음을 나타낸다.

본 발명에서 언급된 모든 문서는 각각 문서가 개별적으로 참고로 포함되는 것처럼, 본 발명은 본 출원에서 참조로 포함된다. 또한, 당업자는 전술한 본 발명을 다양하게 변경 또는 수정할 수 있으며, 이러한 유사한 형태는 본 출원에 첨부된 청구항에 의해 정의된 범위 내에 속한다는 것을 이해해야 한다.

<110> KangMa-Healthcode (Shanghai) Biotech Co., Ltd <120> ADH Protein Family Mutant and Use thereof <130> IP2009IPW <150> CN 201810554584.5 <151> 2018-05-31 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 350 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 1 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr 35 40 45 Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 2 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 2 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Lys Thr 35 40 45 Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 3 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 3 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Asn Thr 35 40 45 Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 4 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 4 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Gln Thr 35 40 45 Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 5 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 5 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Arg Thr 35 40 45 Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 6 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 6 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr 35 40 45 Asp Leu Lys Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 7 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 7 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr 35 40 45 Asp Leu Arg Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 8 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 8 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr 35 40 45 Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 9 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 9 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr 35 40 45 Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Arg Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 10 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 10 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Lys Thr 35 40 45 Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 11 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 11 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Asn Thr 35 40 45 Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 12 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 12 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Gln Thr 35 40 45 Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 13 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 13 Met Ala Ala Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Asn Gly Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys Arg Thr 35 40 45 Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro 50 55 60 Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu 65 70 75 80 Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser 100 105 110 Asn Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Gly Ser Phe 115 120 125 Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Val 130 135 140 Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Val Thr 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val 165 170 175 Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr 180 185 190 Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Glu Glu 195 200 205 Lys Ala Lys Leu Phe Lys Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe 210 215 220 Thr Lys Ser Lys Asn Ile Pro Glu Glu Val Ile Glu Ala Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ala His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu 245 250 255 Gln Ser Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Pro Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val 275 280 285 Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr 290 295 300 Arg Glu Ala Ile Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile 305 310 315 320 His Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Ile Tyr Glu Lys Met Glu 325 330 335 Lys Gly Ala Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 14 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 14 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtaa aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360 ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 15 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 15 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtaa tactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360 ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 16 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 16 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtca aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360 ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 17 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 17 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtag aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360 ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 18 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 18 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtca tactgacctt aaagcttgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360 ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 19 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 19 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtca tactgacctt agagcttgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360 ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 20 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 20 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtca caccgatttg cacgcatgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360 ggatatacaa aagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 21 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 21 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtca caccgatttg cacgcatgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360 ggatatacaa gagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 22 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 22 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtaa aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360 ggatatacaa aagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 23 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 23 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtaa tactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360 ggatatacaa aagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 24 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 24 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtca aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360 ggatatacaa aagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 25 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 25 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtag aactgacctt catgcttgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggagag 240 aatgttaaag gttggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgagt 360 ggatatacaa aagatggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053 <210> 26 <211> 348 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 26 Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Asn Gly 1 5 10 15 Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn 20 25 30 Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu 35 40 45 His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro Leu Val 50 55 60 Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu Asn Val 65 70 75 80 Lys Gly Trp Asn Ile Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Ser Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser Asn Cys 100 105 110 Pro Asp Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln 115 120 125 Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Arg Ile Pro Lys Gly Thr 130 135 140 Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asp Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val Ala Ile 165 170 175 Ser Gly Ala Cys Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Ile Gln Tyr Ala Lys 180 185 190 Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Thr Gly Ala Glu Lys Ala 195 200 205 Lys Leu Phe Lys Glu Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Val Asp Tyr Ala Val 210 215 220 Ser Lys Asp Leu Ile Lys Glu Ile Val Asp Ala Thr Asn Gly Gly Ala 225 230 235 240 His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Phe Ala Ile Glu Gln Ser 245 250 255 Thr Asn Tyr Val Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly Leu Pro 260 265 270 Arg Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Thr Gln Val Val Lys Ser 275 280 285 Val Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu 290 295 300 Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val His Ala Pro Ile Lys Ile 305 310 315 320 Val Gly Leu Ser Glu Leu Ala Asp Val Tyr Asp Lys Met Val Lys Gly 325 330 335 Glu Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 <210> 27 <211> 374 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 27 Met Leu Arg Leu Thr Ser Ala Arg Ser Ile Val Ser Pro Leu Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ala Phe Gly Ser Ile Arg Thr Leu Ala Thr Ser Val Pro Glu Thr 20 25 30 Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Asn Gly Gly Lys Leu Glu Tyr Lys 35 40 45 Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Pro Asn Glu Ile Leu Ile Asn Val 50 55 60 Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Trp Lys Gly Asp 65 70 75 80 Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro Leu Val Gly Gly His Glu Gly Ala 85 90 95 Gly Val Val Val Ala Met Gly Glu Asn Val Lys Gly Trp Asn Ile Gly 100 105 110 Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys Glu 115 120 125 Tyr Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser Asn Cys Pro Asp Ala Asp Leu Ser 130 135 140 Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala 145 150 155 160 Val Gln Ala Ala Arg Ile Pro Lys Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val Ala 165 170 175 Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Lys Ala Leu Lys Ser Ala 180 185 190 Asn Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly Gly 195 200 205 Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met Gly Tyr Arg Val 210 215 220 Val Gly Ile Asp Gly Gly Glu Glu Lys Gly Lys Leu Val Lys Gln Leu 225 230 235 240 Gly Gly Glu Ala Phe Val Asp Phe Thr Lys Thr Lys Asp Met Val Ala 245 250 255 Glu Ile Gln Glu Ile Thr Asn Gly Gly Pro His Gly Val Ile Asn Val 260 265 270 Ser Val Ser Glu Ala Ala Met Asn Ala Ser Thr Gln Phe Val Arg Pro 275 280 285 Thr Gly Thr Val Val Leu Val Gly Leu Pro Ala Gly Ala Val Ile Lys 290 295 300 Ser Glu Val Phe Ser His Val Val Lys Ser Ile Asn Ile Lys Gly Ser 305 310 315 320 Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu Ala Ile Asn Phe Phe Ala 325 330 335 Asn Gly His Val His Ser Pro Ile Lys Val Val Gly Leu Ser Glu Leu 340 345 350 Pro Lys Val Tyr Glu Leu Met Glu Gln Gly Lys Ile Leu Gly Arg Tyr 355 360 365 Val Val Asp Thr Ser Asn 370 <210> 28 <211> 375 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 28 Met Phe Arg Leu Ala Arg Ala Gln Thr Ala Leu Ala Asn Lys Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Arg Ser Phe Leu Arg Leu Asn Ser Ser Phe Ala Ile Pro Glu 20 25 30 Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Asn Gly Gly Lys Leu Glu Tyr 35 40 45 Lys Asp Leu Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn Glu Ile Leu Ile Asn 50 55 60 Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Trp Lys Gly 65 70 75 80 Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val Gly Gly His Glu Gly 85 90 95 Ala Gly Ile Val Val Ala Lys Gly Glu Asn Val Lys Asn Phe Glu Ile 100 105 110 Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly Ser Cys Met Ser Cys 115 120 125 Glu Leu Cys Glu Gln Gly Tyr Glu Ser Asn Cys Leu Gln Ala Asp Leu 130 135 140 Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln Tyr Ala Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ala Val Gln Ala Ala Gln Ile Pro Lys Gly Thr Asp Leu Ala Glu Ile 165 170 175 Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Lys Ala Leu Lys Thr 180 185 190 Ala Asp Leu Lys Pro Gly Gln Trp Val Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly 195 200 205 Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met Gly Leu Arg 210 215 220 Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Asp Gly Lys Glu Glu Leu Phe Lys Gln 225 230 235 240 Cys Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Arg Lys Ser Lys Asp Met Val 245 250 255 Ala Asp Ile Gln Glu Ala Thr Asn Gly Gly Pro His Gly Val Ile Asn 260 265 270 Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Ser Met Ser Thr Glu Tyr Val Arg 275 280 285 Pro Thr Gly Val Val Val Leu Val Gly Leu Pro Ala Asp Ala Tyr Val 290 295 300 Lys Ser Glu Val Phe Ser His Val Val Lys Ser Ile Ser Ile Lys Gly 305 310 315 320 Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu Ala Thr Asp Phe Phe 325 330 335 Thr Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Ile Ile Gly Leu Ser Glu 340 345 350 Leu Pro Glu Ala Tyr Glu Leu Met Glu Gln Gly Lys Ile Leu Gly Arg 355 360 365 Phe Val Val Asp Thr Tyr Lys 370 375 <210> 29 <211> 1047 <212> DNA <213> Kluyveromyces lactis <400> 29 atgtccattc ctgaaactca aaagggtgtt atcttttacg aaaacggtgg tgaattgcaa 60 tacaaggaca ttccagttcc aaagccaaag gccaacgaac ttttgatcaa cgtcaagtac 120 tccggtgtct gtcacaccga tttgcacgca tggaagggtg actggccttt gccaaccaaa 180 ttgccattag ttggtggtca cgaaggtgct ggtgtcgttg ttgctatggg tgaaaatgtc 240 aagggctgga acattggtga ctttgctggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatgtcc 300 tgtgaatact gtgaattgtc caatgaatcc aactgtcccg atgctgactt gtctggttac 360 acccacgatg gttctttcca acaatatgct accgctgatg ccgttcaagc tgctagaatt 420 ccaaagggta ccgatttggc tgaagttgct ccaattctat gtgccggtgt taccgtttac 480 aaggctctaa aatctgctga cttgaaggcc ggtgactggg ttgccatttc cggtgcctgt 540 ggtggtctag gttctttggc tatccaatac gccaaggcta tgggttacag agtcttgggt 600 attgataccg gtgctgaaaa ggctaagttg ttcaaggagc taggtggtga atacttcgtc 660 gattatgccg tctctaagga tttgattaaa gaaattgttg acgctactaa cggtggtgcc 720 cacggtgtca ttaacgtctc tgtctccgaa tttgctatag aacaatccac caattacgtt 780 agatcaaacg gtaccgttgt attggtcggt ctaccaaggg acgccaaatg taagtctgat 840 gtctttacac aagttgtcaa atcggtctcc attgttggtt cttacgtcgg taacagagct 900 gacaccagag aagctctaga tttcttcgca agaggtttag tgcatgctcc aattaagata 960 gtcggattat ctgaattggc agatgtttat gacaagatgg tcaagggtga aatcgttggt 1020 agatacgttg tcgacacctc aaaataa 1047 <210> 30 <211> 1125 <212> DNA <213> Kluyveromyces lactis <400> 30 atgttgagat tgacttccgc cagatccatt gtttccccat tgcgtaaggg tgcttttggt 60 tccatcagaa ccttagctac ctctgtgcca gaaacccaaa agggtgttat tttctatgag 120 aatggtggta aattggaata caaggacatt ccagttccaa agccaaagcc aaatgaaatc 180 ttgatcaacg tcaagtactc cggtgtgtgt cataccgatt tgcacgcatg gaagggtgac 240 tggccattgc caaccaagtt gccattggtc ggtggtcacg aaggtgctgg tgtcgttgtt 300 gctatgggtg aaaacgtcaa gggctggaac attggtgact ttgcgggtat caaatggttg 360 aacggttctt gtatgtcctg tgaatactgt gaattgtcca atgaatccaa ctgtccagat 420 gctgacttgt ctggttacac ccacgatggt tctttccaac aatacgctac cgcagatgct 480 gttcaagctg ccagaattcc aaagggtacc gatttggctg aagttgctcc aattctatgt 540 gccggtgtta ctgtttacaa ggctttgaaa agtgctaact tgaaggctgg tgactgggtt 600 gccatctctg gtgctgctgg tggtctaggt tctctagctg tccaatacgc caaggccatg 660 ggttacagag tcgttggtat cgacggtggt gaagaaaagg gtaagttggt caagcaattg 720 ggtggtgaag cctttgttga tttcaccaaa accaaggaca tggttgctga aatccaagaa 780 atcaccaacg gtggtccaca cggtgtcatt aacgtctctg tttctgaagc tgccatgaac 840 gcttccactc aattcgtcag accaactggt actgtcgtat tggtcggttt gccagctggt 900 gccgtcatca agtccgaagt cttctcccac gtcgttaagt ctattaacat caagggttct 960 tacgtcggta acagagctga caccagagaa gctatcaact tcttcgctaa cggtcacgtc 1020 cactctccaa tcaaggttgt tggtttgtcc gaactaccaa aggtttacga attgatggaa 1080 caaggtaaga ttttgggtag atacgttgtt gacacctcca actag 1125 <210> 31 <211> 1128 <212> DNA <213> Kluyveromyces lactis <400> 31 atgttcagat tagcccgtgc ccaaactgct ctagcgaaca aagcttctgt ttccagaagc 60 tttttgagat taaactcttc tttcgctatc ccagaaactc aaaagggtgt tatcttctac 120 gaaaatggtg gtaagttgga atacaaggat ttgccagttc caaagccaaa ggctaacgaa 180 attttgatta acgttaagta ctccggtgtt tgtcacaccg atttgcacgc ctggaagggt 240 gactggccat tgccagttaa attgccatta gtcggtggtc acgaaggtgc tggtatcgtt 300 gttgccaagg gtgaaaacgt taagaacttc gaaattggtg attacgctgg tatcaagtgg 360 ttgaacggtt cttgtatgtc ttgtgaattg tgtgaacaag gttacgaatc taactgtttg 420 caagctgact tgtctggtta cacccatgac ggttctttcc aacaatacgc taccgctgat 480 gccgttcaag ctgctcaaat tccaaagggt accgatttgg ctgaaatcgc cccaatcttg 540 tgtgccggtg ttaccgttta caaggctttg aagaccgctg acttgaaacc aggccaatgg 600 gttgctatct ccggtgctgc cggtggttta ggttcccttg ctgtgcaata cgccaaggcc 660 atgggtttga gagtcctagg tattgacggt ggtgatggta aggaagaatt gttcaagcaa 720 tgtggtggtg aagtcttcat cgacttcaga aagtctaagg acatggtcgc cgatatccaa 780 gaagctacca acggtggtcc tcacggtgtc attaacgtct ccgtctccga ggctgctatc 840 tccatgtcta ccgaatacgt tagaccaacc ggtgttgttg tcttggtcgg tttgccagct 900 gacgcttacg tcaagtccga agtcttctcc cacgtcgtta agtccatctc catcaagggt 960 tcttacgtcg gtaacagagc tgacaccaga gaagccaccg acttcttcac cagaggtttg 1020 gtcaagtctc caatcaagat catcggtcta tctgaattgc cagaagctta tgaactaatg 1080 gaacaaggta agatcttggg tagattcgtc gttgacactt acaaataa 1128 <210> 32 <211> 1053 <212> DNA <213> Kluyveromyces lactis <400> 32 atggccgcat ctatcccaga aactcaaaag ggtgttatct tctacgaaaa cggtggtgaa 60 ttgcaataca aggacatccc agttccaaag ccaaaggcta acgaactttt gatcaacgtc 120 aagtactccg gtgtctgtca caccgatttg cacgcatgga agggtgactg gcctttgcca 180 accaaattgc cattagttgg tggtcacgaa ggtgctggtg tcgttgttgc tatgggtgaa 240 aacgtcaagg gctggaagat tggtgacttc gctggtatca aatggttgaa cggttcttgt 300 atgtcctgtg aatactgtga attgtccaac gaatccaact gtccagaagc tgacttgtcc 360 ggttacactc acgacggttc tttccaacaa tacgctactg ctgatgccgt tcaagctgcc 420 aagatcccag tcggtactga cttggctgaa gttgctccag tgctatgtgc tggtgtcacc 480 gtttacaagg ccctaaaatc cgccaacttg aaggccggtg actgggtcgc catctctggt 540 gctgctggtg gtctaggttc tctagctgtc caatacgcca aggccatggg ttacagagtg 600 ttgggtatcg atgctggtga agaaaaggct aagttgttca aggacttggg tggtgaatac 660 ttcattgatt tcaccaagtc caagaacatc ccagaagaag tcatcgaagc taccaagggt 720 ggtgctcacg gtgtcatcaa cgtctctgtc tccgaattcg ctatcgaaca atctaccaac 780 tacgtcagat ctaacggtac cgtcgtattg gtcggtctac caagagacgc caagtgtaag 840 tccgatgtct ttaaccaagt tgtgaagtcc atctccattg tcggttctta cgtcggtaac 900 agagctgaca ccagagaagc cattgacttc ttctccagag gtctagtcaa ggctccaatc 960 cacgtcgttg gtttgtccga actaccatcc atctacgaaa agatggaaaa gggtgctatc 1020 gtcggtagat acgtcgtcga cacttcaaaa taa 1053

Claims (12)

1. 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)(ADH) 돌연변이 단백질로서, 상기 돌연변이 단백질은 비-천연 단백질이고, 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 아미노산 45-149 중 적어도 하나의 히스티딘(H)에 돌연변이를 갖는 것인, 돌연변이 단백질.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이(mutation)는 야생형 알코올 탈수소효소(ADH)의 67, 69, 93 및/또는 94 부위에 히스티딘(H)을 포함하지 않는 것인, 돌연변이 단백질.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 히스티딘은 독립적으로 염기성 아미노산으로 뮤턴트(mutant)될 수 있는 것인, 돌연변이 단백질.
   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 히스티딘은 라이신(lysine)(K), 아스파라긴(asparagine)(N), 글루타민(glutamine)(Q), 아르기닌(arginine)(R) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산으로 독립적으로 뮤턴트될 수 있는 것인, 돌연변이 단백질.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 단백질은 효모 소스(source)의 알코올 탈수소효소에 기초하여 조작함으로써 수득되고, 효모는 바람직하게는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces ), 더 바람직하게는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)인 것인, 돌연변이 단백질.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알코올 탈수소효소(ADH) 돌연변이 단백질의 아미노산 서열은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다:
   (a) 아미노산 서열이 서열번호 2-13 중 어느 하나인 폴리펩타이드(polypeptide);
   (b) 서열번호 2-13에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 하나로부터 유래되고, 알코올 탈수소효소(ADH) 활성 및 Ni 매질에 대해 돌연변이 단백질의 감소된 결합 활성을 갖는 폴리펩타이드; 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2-13로 나타낸 아미노산의 서열 중 어느 하나에서 하나 또는 여러 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 형성되고, 상기에서 치환, 결실 또는 첨가된 아미노산 잔기의 수는 바람직하게는 1-20, 더 바람직하게는 1-15, 더 바람직하게는 1-10, 더욱 바람직하게는 1-8, 더욱 바람직하게는 1-3, 가장 바람직하게는 1이다;
   (c) 서열번호 2-13에 나타낸 서열의 어느 하나와 적어도 적어도 70%의 서열 상동성을 갖고, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 및 더 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드; 상기 폴리펩타이드는 알코올 탈수소효소(ADH) 활성 및 Ni 매질에 대한 돌연변이 단백질의 감소된 결합 활성을 갖는다; 및
   (d) 서열번호 1, 2, 26, 27 또는 28에 나타낸 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖고, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드; 상기 폴리펩타이드는 알코올 탈수소효소(ADH) 활성 및 Ni 매질에 대한 돌연변이 단백질의 감소된 결합 활성을 갖는다.
   
7. 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 단백질을 암호화하거나 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드.
   
8. 청구항 제7항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
   
9. 청구항 제8항에 따른 벡터를 포함하거나, 또는 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드가 게놈에 통합된 숙주세포.
   
10. 다음 단계를 포함하는 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 알코올 탈수소효소(ADH) 돌연변이 단백질을 생산하기 위한 방법:
    청구항 제9항에 따른 숙주 세포를 알코올 탈수소효소(ADH) 돌연변이 단백질을 발현시키기 위해 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및/또는
    알코올 탈수소효소(ADH) 돌연변이 단백질을 분리하는 단계.
    
11. 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 알코올 탈수소효소(ADH) 돌연변이 단백질을 포함하는 효소 제제(enzyme preparation).
    
12. 효소 제제를 제조하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 단백질의 용도로서, 상기 효소 제제는 (i) 시험관 내 무세포 합성 시스템에서 외인성 단백질의 발현 순도, 효율, 및/또는 수율을 향상시키고; 및/또는 (ii) Ni 매질에 대한 돌연변이 단백질의 결합 능력을 감소시키는 것인, 용도.
    

Images