KR20190049866A - 신규한 항-ｐｃｓｋ９ 항체 - Google Patents

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KR20190049866A
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Abstract

LDL 수용체에의 프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9 (PCSK9)의 결합을 차단하고, 따라서 수준 LDL-C를 저하시킬 수 있는, PCSK9에 대한 모노클로날 항체가 제공된다. 본 개시내용의 항체는 다중 CVD의 치료를 위한 매우 강력한 작용제를 제공한다.

Description

신규한 항-ＰＣＳＫ９ 항체
본 개시내용은 일반적으로 신규한 항-PCSK9 항체에 관한 것이다.
심혈관 질환 (CVD)은 전세계적으로 사망의 제1 원인으로 남아 있다 (World Health Organization (WHO), 2011. World Health Organization). 다양한 연구는 저-밀도 지질단백질 콜레스테롤 (LDL-C)을 저하시키는 것이 CVD의 위험을 감소시킴을 보였다. 지질 저하제의 현재 제1 선택인 스타틴으로의 치료에도 불구하고 CVD에 대한 상당한 의학적 필요가 있다. 환자의 상당한 부분은 만족스러운 용량을 내성화할 수 없거나, 스타틴 요법에 대한 지질 제어를 달성하는 데 실패한다 (Baigent, C. et al., Lancet 2000, 376(9753), 1670-1681).
프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9 (PCSK9)는 원래 신경 세포자멸사 조절된 컨버타제-1로서 발견되었다. 이는 주로 소장 및 간에서 합성된다 (Seidah NG et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:928-33). 성숙한 PCSK9는 그의 프로도메인의 세포내 자가촉매적 절단 후에 간 세포로부터 분비된다 (McNutt, M.C.et al., J. Biol. Chem. 2007, 20(282), 20799-20803). 콜레스테롤 대사를 조절하는 데 있어서 PCSK9의 중요한 역할은 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증을 갖는 2개의 프랑스인 가족에서 PCSK9에서의 2개의 기능 돌연변이의 획득의 인식에 의해 최초로 발견되었다 (Abifadel M et al., Nat Genet 2003;34:154-6). PCSK9는 주로 간에서의 분해를 위해 저-밀도 지질단백질 수용체 (LDLR)에 결합함으로써 콜레스테롤 대사를 조절한다. PCSK9의 부재 하에서, 간 LDLR은 분해를 위해 LDL-C를 리소자임으로 전달한 후 세포막으로 다시 재사용된다. PCSK9 및 LDLR의 결합은 LDLR의 정상적인 재사용을 방지하며, 대신 LDLR 분해를 향상시킨다 (Verbeek, R., et al., Eur J Pharmacol 2015; Lo Surdo P et al., EMBO Rep 2011;12:1300-5).
항체 또는 펩티드에 의한 LDLR에의 PCSK9 결합의 직접적 억제; 유전자 침묵제에 의한 PCSK9 합성의 억제 및 소분자에 의한 PCSK9 세포내 생산의 억제를 비롯한 PCSK9를 억제하는 몇몇 치료 접근법이 개발 중에 있다 (MICHEL FARNIER, ARCHIVES OF CARDIOVASCULAR DISEASE, 2014, 107, 58-66). 최근 승인된 모노클로날 항체 알리로쿠맙 (Alirocumab) 및 에볼로쿠맙 (Evolocumab)은 II상 및 III상 임상 시험에서 LDL-C 감소의 유망한 효능을 나타내었다. 현재 증거는 배경 스타틴 요법에 독립적인 LDL-C 수준의 70％까지의 감소를 나타낸다 (Dias, C.S et al., J.Am.Coll.Cardiol. 2012, 60(19), 1888-1898; Giugliano, R.P et al., Lancet, 2012, 380(9858), 2007-2017; McKenney, J.M et al., J. Am. Coll. Cardiol. 2012, 59(25), 2344-2353).
발명의 간단한 요약
본 개시내용은 신규한 모노클로날 항-PCSK9 항체 (특히 완전 인간 항체), 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1, 3, 5, 13, 15, 17, 25, 27, 29, 37, 39, 41, 49, 55, 57, 59, 67 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 7, 9, 11, 19, 21, 23, 31, 33, 35, 43, 45, 47, 51, 53, 61, 63, 65 및 71로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
a) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역;
b) 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15, 및/또는 서열식별번호: 17을 포함하는 중쇄 가변 영역;
c) 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 27, 및/또는 서열식별번호: 29를 포함하는 중쇄 가변 영역;
d) 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 39, 및/또는 서열식별번호: 41을 포함하는 중쇄 가변 영역;
e) 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 49, 및/또는 서열식별번호: 17을 포함하는 중쇄 가변 영역;
f) 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 57, 및/또는 서열식별번호: 59를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
g) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 67, 및/또는 서열식별번호: 69를 포함하는 중쇄 가변 영역
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
a) 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역;
b) 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21, 및/또는 서열식별번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역;
c) 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 33, 및/또는 서열식별번호: 35를 포함하는 경쇄 가변 영역;
d) 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 45, 및/또는 서열식별번호: 47을 포함하는 경쇄 가변 영역;
e) 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 53, 및/또는 서열식별번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역;
f) 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 63, 및/또는 서열식별번호: 65를 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
g) 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 및/또는 서열식별번호: 71을 포함하는 경쇄 가변 영역
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
a) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역;
b) 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15, 및/또는 서열식별번호: 17을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21, 및/또는 서열식별번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역;
c) 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 27, 및/또는 서열식별번호: 29를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 33, 및/또는 서열식별번호: 35를 포함하는 경쇄 가변 영역;
d) 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 39, 및/또는 서열식별번호: 41을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 45, 및/또는 서열식별번호: 47을 포함하는 경쇄 가변 영역;
e) 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 49, 및/또는 서열식별번호: 17을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 53, 및/또는 서열식별번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역;
f) 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 57, 및/또는 서열식별번호: 59를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 63, 및/또는 서열식별번호: 65를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
g) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 67, 및/또는 서열식별번호: 69를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 및/또는 서열식별번호: 71을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 93, 및 서열식별번호: 97로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 그의 적어도 80％ (예를 들어 적어도 85％, 88％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％) 서열 동일성의 상동체 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 95, 및 서열식별번호: 99로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 및 그의 적어도 80％ (예를 들어 적어도 85％, 88％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％) 서열 동일성의 상동체 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은
a) 서열식별번호: 73을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 75를 포함하는 경쇄 가변 영역;
b) 서열식별번호: 77을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 79를 포함하는 경쇄 가변 영역;
c) 서열식별번호: 81을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 83을 포함하는 경쇄 가변 영역;
d) 서열식별번호: 85를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 87을 포함하는 경쇄 가변 영역;
e) 서열식별번호: 89를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 91을 포함하는 경쇄 가변 영역;
f) 서열식별번호: 93을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 95를 포함하는 경쇄 가변 영역;
g) 서열식별번호: 97을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 99를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
h) a), b), c), d), d), f), 또는 g)에 대해 적어도 80％ (예를 들어 적어도 85％, 88％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％) 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 결합 검정에 의해 측정 시, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하의 KD 값으로 인간 PCSK9에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 ELISA 검정에 의해 측정 시, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하의 KD 값으로 인간 PCSK9에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하의 KD 값으로 원숭이 PCSK9에 결합한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 2.1 nM 이하 (예를 들어 3 nM, 2.5 nM, 1.8 nM, 1.7 nM, 1.6 nM, 1.5 nM, 1.4 nM, 1.3 nM, 1.2 nM, 또는 1 nM 이하)의 IC50으로 인간 PCSK9의 그의 리간드에의 결합을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 0.15 nM 이하 (예를 들어 0.14, 0.13, 0.12, 0.11, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03 또는 0.02 nM 이하)의 EC50으로 인간 PCSK9에 결합할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 115 nM 이하, 106 nM 이하, 80 nM 이하, 77 nM 이하, 66 nM 이하 또는 40 nM 이하 (예를 들어 120 nM, 110 nM, 100 nM, 90 nM, 85 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 65 nM, 60 nM, 55 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 또는 1 nM 이하)의 IC50으로 세포 LDL 흡수를 복원할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 적어도 1일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 1주, 적어도 2주, 또는 적어도 1개월 동안 혈청에서 안정하다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 ADCC 또는 CDC 또는 둘 다를 매개하지 않는다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 완전 인간 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 완전 인간 모노클로날 항체는 숙주 세포 또는 트랜스제닉 동물에 의해 생산된다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 동물에서 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 77％, 80％, 84％, 85％, 90％, 95％ 또는 그 초과까지 LDL-콜레스테롤을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 HDL-콜레스테롤의 수준을 유지할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 적어도 165시간, 적어도 250시간, 적어도 360시간, 적어도 390시간, 또는 적어도 450시간 (예를 들어 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 180, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 또는 적어도 500시간)의 혈청 반감기를 갖는다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 낙타화 단일 도메인 항체, 디아바디, scFv, scFv 이량체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F(ab')2, ds 디아바디, 나노바디, 도메인 항체, 또는 2가 도메인 항체이다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 이뮤노글로불린 불변 영역을 더 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 접합체를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 접합체는 검출가능한 표지, 약동학 변형 모이어티, 또는 정제 모이어티일 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 더 제공한다. 본 개시내용은 상기 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 더 제공한다. 본 개시내용은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 더 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드는 벡터에서 프로모터, 예컨대 SV40 프로모터와 작동적으로 회합된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 벡터를 포함하는 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포, 또는 293 세포이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 상기 숙주 세포를 상기 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현시키는 방법을 더 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 더 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 PCSK9에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 더 제공한다. 특정 실시양태에서, 개체는 개체로부터의 시험 생물학적 샘플에서 혈청 LDL 콜레스테롤, 총 콜레스테롤 및/또는 비-HDL 콜레스테롤의 상향조절된 수준 또는 LDL 수용체의 하향조절된 수준으로서 확인되었다. 특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여 시, LDL-C 및/또는 총 콜레스테롤의 수준이 감소된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 더 제공한다. 특정 이들 실시양태에서, 제약 담체는 예를 들어, 희석제, 항산화제, 아주번트, 부형제, 또는 비-독성 보조 물질일 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 면역 반응의 상향조절로부터 이익을 얻을 대상체에게 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 상태를 치료하는 방법을 더 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 혈청 LDL 콜레스테롤, 총 콜레스테롤 및/또는 비-HDL 콜레스테롤의 상향조절된 수준 또는 LDL 수용체의 하향조절된 수준을 갖는다.
한 측면에서, 본 개시내용은 면역 반응의 상향조절로부터 이익을 얻을 상태를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 더 제공한다. 특정 실시양태에서, 상태는 심혈관 질환, 염증성 질환, 및 감염성 질환이다. 특정 실시양태에서, 감염성 질환은 패혈증이다.
도 1은 11.4의 중쇄의 CDR3에서의 선택된 돌연변이를 제시한다.
도 2는 SDS-PAGE 겔에서의 완전 인간 항체 18.156.8 (hIgG4)의 염색을 나타낸다. M: 단백질 마커; 레인5: 18.156.8 (hIgG4), 감소됨; 레인6: 18.156.8 (hIgG4), 비-감소됨.
도 3은 HPLC-SEC에 의해 측정 시 완전 인간 18.156.8 (hIgG4)의 99.6％ 순도를 나타낸다.
도 4는 SDS-PAGE 겔에서의 완전 인간 항체 40409 (hIgG4)의 염색을 나타낸다. M: 단백질 마커; 레인1: 40409 (hIgG4), 감소됨; 레인2: 40409 (hIgG4), 비-감소됨.
도 5는 HPLC-SEC에 의해 측정 시 완전 인간 40409 (hIgG4)의 98％ 순도를 나타낸다.
도 6은 SDS-PAGE 겔에서의 완전 인간 항체 15.14.2-uAb-IgG4L의 염색을 나타낸다. M: 단백질 마커; 레인1: 15.14.2-uAb-IgG4L, 감소됨; 레인2: 15.14.2-uAb-IgG4L, 비-감소됨.
도 7은 HPLC-SEC에 의해 측정 시 완전 인간 15.14.2-uAb-IgG4L의 99.8％ 순도를 나타낸다.
도 8은 SDS-PAGE 겔에서의 완전 인간 항체 17.72.3-uAb2-IgG4K의 염색을 나타낸다. M: 단백질 마커; 레인1: 17.72.3-uAb2-IgG4K, 감소됨; 레인2: 17.72.3-uAb2-IgG4K, 비-감소됨.
도 9는 HPLC-SEC에 의해 측정 시 완전 인간 17.72.3-uAb2-IgG4K의 98.9％ 순도를 나타낸다.
도 10은 SDS-PAGE 겔에서의 완전 인간 항체 18.136.7-IgG4K의 염색을 나타낸다. M: 단백질 마커; 레인1: 18.136.7-IgG4K, 감소됨; 레인2: 18.136.7-IgG4K, 비-감소됨.
도 11은 HPLC-SEC에 의해 측정 시 완전 인간 18.136.7-IgG4K의 99.2％ 순도를 나타낸다.
도 12는 SDS-PAGE 겔에서의 완전 인간 항체 19.3.8-uAb1-IgG4L의 염색을 나타낸다. M: 단백질 마커; 레인1: 19.3.8-uAb1-IgG4L, 감소됨; 레인2: 19.3.8-uAb1-IgG4L, 비-감소됨.
도 13은 HPLC-SEC에 의해 측정 시 완전 인간 19.3.8-uAb1-IgG4L의 99.9％ 순도를 나타낸다.
도 14는 ELISA에 의해 측정 시 인간 PCSK9에의 완전 인간 항-PCSK9 항체의 결합을 제시한다.
도 15는 ELISA에 의해 측정 시 LDL 수용체 (LDL-R)에의 PCSK9의 결합에 대한 완전 인간 항-PCSK9 항체의 차단을 제시한다.
도 16은 각각 야생형 (도 16A 및 16B) 및 돌연변이체 PCSK9 (D374Y) (도 16C 및 16D)에 결합함으로써 간 간세포 암종 (HepG2) 세포에서 및 Huh-7 세포에서 완전 인간 항-PCSK9 항체 18.156.8의 저-밀도 지질단백질 (LDL)-흡수 검정을 복원시키는 것의 결과를 나타낸다.
도 17은 야생형 (도 17A 및 17B) 및 돌연변이체 PCSK9 (D374Y) (도 17C 및 17D) 둘 다를 사용하여 HepG2 세포에서 및 Huh-7 세포에서 완전 인간 항-PCSK9 항체 40409의 저-밀도 지질단백질 (LDL)-흡수 검정을 복원시키는 것의 결과를 나타낸다.
도 18은 HepG2 세포에서 완전 인간 항-PCSK9 항체 15.14.2-uAb1-IgG4L, 17.72.3-uAb1-IgG4K 및 19.3.8-uAb1-IgG4L의 저-밀도 지질단백질 (LDL)-흡수 검정을 복원시키는 것의 결과를 나타낸다.
도 19는 ELISA 결합 검정에 의해 측정된 농도에 의해 지시된 바와 같이, 인간 혈청과 함께 인큐베이션된 완전 인간 PCSK9 항체의 안정성을 예시한다 (도 19A: 18.156.8; 19B: B4G2; 19C: 15.14.2, 19.3.8 및 17.72.3).
도 20은 항체 18, 156.8, 40409 및 BMK.115 처리된 시노몰구스 원숭이의 LDL-C 변화 백분율을 나타낸다. 도 20A는 10 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타내고, 도 20B는 30 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타낸다.
도 21은 항체 18, 156.8, 40409 및 BMK.115 처리된 시노몰구스 원숭이의 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 (HDL-C) 변화 백분율을 나타낸다. 도 21A는 10 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타내고, 도 21B는 30 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타낸다.
도 22는 항체 15.14.2, 19.3.8, 17.72.3, 18.136.7 및 레파타 (Repatha) 처리된 시노몰구스 원숭이의 LDL-C 변화 백분율을 나타낸다. 도 22A는 3 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타내고, 도 22B는 10 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타낸다.
도 23은 항체 15.14.2, 19.3.8, 17.72.3, 18.136.7 및 레파타 처리된 시노몰구스 원숭이의 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 (HDL-C) 변화 백분율을 나타낸다. 도 23A는 3 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타내고, 도 23B는 10 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타낸다.
도 24는 ELISA에 의해 측정 시, 시노몰구스 원숭이 혈청에서의 용량전 및 용량후의 18.156.8, 40409 또는 BMK.115의 항체 농도를 나타낸다. 도 24A는 10 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타내고, 도 24B는 30 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타낸다.
도 25는 ELISA에 의해 측정 시, 시노몰구스 원숭이 혈청에서의 용량전 및 용량후의 15.14.2(hIgG4), 19.3.8(hIgG4), 17.72.3(hIgG4), 18.136.7(hIgG4) 또는 레파타의 항체 농도를 나타낸다. 도 25A는 3 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타내고, 도 25B는 10 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타낸다.
도 26은 용량전 및 용량후의 시노몰구스 원숭이 혈청 샘플에서의 18.156.8(hIgG4), 40409(hIgG4) 또는 BMK.115에 대한 항-약물 항체 (ADA)를 나타낸다. 도 26A, 26C 및 26E는 10 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타내고, 도 26B, 26D 및 26F는 30 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타낸다.
도 27은 용량전 및 용량후의 시노몰구스 원숭이 혈청 샘플에서의 15.14.2, 19.3.8, 17.72.3, 18.136.7 또는 레파타에 대한 ADA를 나타낸다. 도 27A, 27C, 27E, 27G 및 27I는 3 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타내고, 도 27B, 27D, 27F, 27H 및 27J는 10 mg/kg 주사의 단일 용량의 결과를 나타낸다.
도 28A, 28B 및 28C는 참조 항체 12H11.1 및 24B9.1의 생성의 결과를 나타낸다. 도 28A는 12H11.1.uIgG4K 및 24B9.1.uIgG4L의 SDS-PAGE의 결과를 제시한다. M: 단백질 마커; 레인1: 24B9.1.uIgG4L, 감소됨; 레인2: 12H11.1.uIgG4K, 감소됨; 레인3: 24B9.1.uIgG4L, 비-감소됨; 레인4: 12H11.1.uIgG4K, 비-감소됨. 도 28B 및 28C는 24B9.1.uIgG4L 및 12H11.1.uIgG4K의 HPLC-SEC 검출을 밝혀낸다.
도 29는 ELISA에 의해 측정 시, 항체 18.156.8 및 참조 항체 24B9.1, 12H11.1 및 BMK.115의 인간 PCSK9에의 결합의 비교를 지시한다.
도 30은 ELISA에 의해 측정 시, LDLR에의 PCSK9의 결합을 차단하는 데 있어서 항체 18.156.8 및 참조 항체 24B9.1, 12H11.1 및 BMK.115의 비교의 결과를 나타낸다.
도 31은 항체 18.156.8 및 참조 항체 12H11.1 및 BMK.115에 대한 HepG2 세포에서의 LDL-흡수의 복원의 능력을 밝혀낸다.
하기 본 개시내용의 설명은 단지 본 개시내용의 다양한 실시양태를 예시하는 것으로 의도된다. 따라서, 논의된 구체적 변형은 본 개시내용의 범위에 대한 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 다양한 등가물, 변화, 및 변형은 본 개시내용의 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 이러한 등가의 실시양태는 본원에 포함되는 것으로 이해된다. 간행물, 특허 및 특허 출원을 비롯한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정의
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 특이적 항원에 결합하는 임의의 이뮤노글로불린, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 또는 이중특이적 (2가) 항체를 포함한다. 천연 무손상 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 영역 및 제1, 제2, 및 제3 불변 영역으로 이루어지는 반면, 각각의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역으로 이루어진다. 포유동물 중쇄는 α, δ, ε, γ, 및 μ로 분류되고, 포유동물 경쇄는 λ 또는 κ로 분류된다. 항체는 "Y" 형상을 가지며, Y의 줄기는 디술피드 결합을 통해 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역으로 이루어진다. Y의 각각의 아암은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다. 둘 다의 쇄의 가변 영역은 일반적으로 상보성 결정 영역 (CDR) (LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 비롯한 경 (L) 쇄 CDR, HCDR1, HCDR2, HCDR3을 비롯한 중 (H) 쇄 CDR)으로 지칭되는 3개의 고도로 가변성 루프를 함유한다. 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편에 대한 CDR 경계는 카바트 (Kabat), 코티아 (Chothia), 또는 알-라지카니 (Al-Lazikani)의 관례에 의해 정의되거나 확인될 수 있다 (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C. and Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 3개의 CDR은 CDR보다 더 고도로 보존되고, 초가변 루프를 지지하는 스캐폴드를 형성하는, 프레임워크 영역 (FR)으로 공지된 플랭킹 스트레치 사이에 개재된다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 결합에 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 분류에 할당된다. 항체의 5가지 주요 부류 또는 이소형은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이며, 이는 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 중쇄의 존재를 특징으로 한다. 주요 항체 부류의 몇몇은 하위부류, 예컨대 IgG1 (γ1 중쇄), IgG2 (γ2 중쇄), IgG3 (γ3 중쇄), IgG4 (γ4 중쇄), IgA1 (α1 중쇄), 또는 IgA2 (α2 중쇄)로 나누어진다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원-결합 단편"은 1개 이상의 CDR을 포함하는 항체의 부분으로부터 형성된 항체 단편, 또는 항원에 결합하지만 무손상 천연 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편의 예로는 제한 없이, 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디술피드 안정화된 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 디술피드 안정화된 디아바디 (ds 디아바디), 단일-쇄 항체 분자 (scFv), scFv 이량체 (2가 디아바디), 다중특이적 항체, 낙타화 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 및 2가 도메인 항체를 들 수 있다. 항원-결합 단편은 모 항체가 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 1종 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 영역에 그래프팅된 특정 인간 항체로부터의 1개 이상의 CDR을 포함할 수 있다.
항체에 관하여 "Fab"는 디술피드 결합에 의해 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역에 결합된 단일 경쇄 (가변 및 불변 영역 둘 다)로 이루어진 항체의 그 부분을 지칭한다.
"Fab'"는 힌지 영역의 부분을 포함하는 Fab 단편을 지칭한다.
"F(ab')2"는 Fab'의 이량체를 지칭한다.
항체에 관하여 "Fc"는 디술피드 결합을 통해 제2 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역에 결합된 제1 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역으로 이루어진 항체의 그 부분을 지칭한다. 항체의 Fc 부분은 다양한 이펙터 기능, 예컨대 ADCC, 및 CDC를 담당하지만, 항원 결합에서는 기능하지 않는다.
항체에 관하여 "Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 갖는 항체의 최소 단편을 지칭한다. Fv 단편은 단일 중쇄의 가변 영역에 결합된 단일 경쇄의 가변 영역으로 이루어진다.
"단일-쇄 Fv 항체" 또는 "scFv"는 직접적으로 또는 펩티드 링커 서열을 통해 서로에게 연결된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역으로 이루어진 조작된 항체를 지칭한다 (Huston JS et al. Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879(1988)). "단일-쇄 Fv-Fc 항체" 또는 "scFv-Fc"는 항체의 Fc 영역에 연결된 scFv로 이루어진 조작된 항체를 지칭한다.
"낙타화 단일 도메인 항체", "중쇄 항체", 또는 "HCAb"는 2개의 VH 도메인을 함유하고, 경쇄를 함유하지 않는 항체를 지칭한다 (Riechmann L. and Muyldermans S., J Immunol Methods. Dec 10;231(1-2):25-38 (1999); Muyldermans S., J Biotechnol. Jun;74(4):277-302 (2001); WO94/04678; WO94/25591; 미국 특허 제6,005,079호). 중쇄 항체는 원래 카멜리다에 (Camelidae) (낙타, 단봉낙타, 및 라마)로부터 유래되었다. 경쇄가 없지만, 낙타화 항체는 진정한 항원-결합 레퍼토리를 갖는다 (Hamers-Casterman C. et al., Nature. Jun 3;363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK. et al. "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation," Immunogenetics. Apr;54(1):39-47 (2002); Nguyen VK. et al.Immunology. May;109(1):93-101 (2003)). 중쇄 항체의 가변 도메인 (VHH 도메인)은 적응성 면역 반응에 의해 생성된 최소 공지된 항원-결합 단위를 나타낸다 (Koch-Nolte F. et al., FASEB J. Nov;21(13):3490-8. Epub 2007 Jun 15 (2007)).
"나노바디"는 중쇄 항체로부터의 VHH 도메인 및 2개의 불변 도메인, 즉, CH2 및 CH3으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다.
"디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 포함하며, 여기서, 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄에서 VL 도메인에 연결된 VH 도메인을 포함한다 (VH-VL 또는 VL-VH) (예를 들어, 문헌 [Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Jul 15;90(14):6444-8 (1993)]; EP404097; WO93/11161 참조). 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍형성하도록 강제되고, 그에 의해 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 항원-결합 부위는 동일하거나 상이한 항원 (또는 에피토프)을 표적화할 수 있다.
"도메인 항체"는 단지 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역을 함유하는 항체 단편을 지칭한다. 특정 예에서, 2개 이상의 VH 도메인은 펩티드 링커로 공유적으로 연결되어 2가 또는 다가 도메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 2개의 VH 도메인은 동일하거나 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
특정 실시양태에서, "(dsFv)2"는 3개의 펩티드 쇄를 포함한다: 펩티드 링커에 의해 연결되고, 디술피드 가교에 의해 2개의 VL 모이어티에 결합된 2개의 VH 모이어티.
특정 실시양태에서, "이중특이적 ds 디아바디"는 VH1 및 VL1 사이의 디술피드 가교를 통해 VL1-VH2 (또한 펩티드 링커에 의해 연결됨)에 결합된 VH1-VL2 (펩티드 링커에 의해 연결됨)를 포함한다.
특정 실시양태에서, "이중특이적 dsFv" 또는 dsFv-dsFv'"는 3개의 펩티드 쇄: 중쇄가 디술피드 가교를 통해 펩티드 링커 (예를 들어, 긴 가요성 링커)에 의해 연결되고, 각각 VL1 및 VL2 모이어티에 결합된 VH1-VH2 모이어티를 포함하며, 여기서 각각의 디술피드 쌍형성된 중쇄 및 경쇄는 상이한 항원 특이성을 갖는다.
특정 실시양태에서, "scFv 이량체"는 1개의 모이어티의 VH가 다른 모이어티의 VL과 배위하고, 동일한 항원 (또는 에피토프) 또는 상이한 항원 (또는 에피토프)을 표적화할 수 있는 2개의 결합 부위를 형성하도록 또다른 VH-VL 모이어티와 이량체화된 VH-VL (펩티드 링커에 의해 연결됨)을 포함하는 2가 디아바디 또는 2가 ScFv (BsFv)이다. 다른 실시양태에서, "scFv 이량체"는 VH1 및 VL1이 배위하고, VH2 및 VL2가 배위하고, 각각의 배위된 쌍이 상이한 항원 특이성을 갖도록 VL1-VH2 (또한 펩티드 링커에 의해 연결됨)와 회합된 VH1-VL2 (펩티드 링커에 의해 연결됨)를 포함하는 이중특이적 디아바디이다.
항체 또는 항원-결합 단편에 관하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "완전 인간"은 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 또는 인간 면역 세포에 의해 생산되거나, 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하는 비-인간 공급원, 예컨대 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 유래된 항체의 그것에 상응하는 아미노산 서열(들)을 갖거나 이로 이루어진 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 완전 인간 항체는 비-인간 항체로부터 유래된 아미노산 잔기 (특히 항원-결합 잔기)를 포함하지 않는다.
항체 또는 항원-결합 단편에 관하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간화"는 항체 또는 항원-결합 단편이 비-인간 동물로부터 유래된 CDR, 인간으로부터 유래된 FR 영역, 및 적용가능한 경우, 인간으로부터 유래된 불변 영역을 포함하는 것을 의미한다. 인간화 항체 또는 항원-결합 단편은 이것이 인간에서 감소된 면역원성을 갖기 때문에 특정 실시양태에서 인간 치료제로서 유용하다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 기니아 피그, 또는 햄스터이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항원-결합 단편은 비-인간인 CDR 서열을 제외하고 실질적으로 모든 인간 서열로 구성된다. 일부 실시양태에서, 인간으로부터 유래된 FR 영역은 그것이 유래된 인간 항체와 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이는 일부 아미노산 변화, 예를 들어, 아미노산의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 변화를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 아미노산의 변화는 단지 중쇄 FR 영역에, 단지 경쇄 FR 영역에, 또는 둘 다의 쇄에 존재할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 인간화 항체는 인간 FR1-3 및 인간 JH 및 Jκ를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라"는 한 종으로부터 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 부분, 및 상이한 종으로부터 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지를 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 의미한다. 예시적인 예에서, 키메라 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역 및 비-인간 종으로부터의, 예컨대 마우스로부터의 가변 영역을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "PCSK9"는 분비성 서브틸라제 패밀리의 프로테이나제 K 서브패밀리에 속하는 천연-발생 인간 프로단백질 컨버타제인 프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin) 유형 9를 지칭한다. PCSK9는 세포질 세망에서 자가촉매적 분자내 프로세싱을 겪는 가용성 효소원으로서 합성되며, 프로단백질 컨버타제로서 기능하는 것으로 생각된다. PCSK9는 혈액 콜레스테롤 수준을 조절하는 데 있어서 중요한 역할을 갖는다. PCSK9의 기능 돌연변이 (예컨대 S127R, F216L, 및 D374Y)의 획득은 PCSK9 돌연변이체가 LDL 수용체의 수준을 향상시키는 상염색체 우성 가족성 고콜레스테롤혈증의 형태와 연관될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1): 11-26], [Benjannet et al. J. Biol. Chem., (2004) 279(47):48865-48875] 및 [Fasano T et al., Atherosclerosis. (2009) 203(1):166-71]을 참조한다. 인간 PCSK9의 대표적인 아미노산 서열은 진뱅크 (GenBank) 수탁 번호: NP_777596.2 하에 개시되어 있으며, 인간 PCSK9를 코딩하는 대표적인 mRNA 핵산 서열은 진뱅크 수탁 번호: FJ525880.1 하에 나타나 있다. 특정 실시양태에서, 용어 PCSK9는 PCSK9 아미노산 서열의 번역후 변형의 PCSK9 분자, 예컨대 글리코실화, PEG화 PCSK9 서열, 그의 신호 서열이 절단된 PCSK9 서열, 또는 그의 프로 도메인이 촉매 도메인으로부터 절단되지만 촉매 도메인으로부터 분리되지 않은 PCSK9 서열을 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같은 "LDL-C"는 저-밀도 지질단백질 콜레스테롤을 지칭하고, "HDL-C"는 고-밀도 지질단백질 콜레스테롤을 지칭한다. LDL 및 HDL은 지질단백질의 5가지 주요 군 내에 있다: 킬로미크론, 매우 저-밀도 지질단백질 (VLDL), 중간-밀도 지질단백질 (IDL), 저-밀도 지질단백질 및 고-밀도 지질단백질 (HDL) (가장 큰 입자로부터 가장 농밀한 것 (가장 작은 입자)으로의 순서로). LDL ("나쁜" 콜레스테롤 함유 입자)은 지질/스테롤 분자, 예컨대 콜레스테롤 (즉, LDL-C)을 동맥벽 내로 수송하고, 대식세포를 유인하며, 따라서 죽상동맥경화증을 촉발할 수 있다. 대조적으로, HDL ("좋은" 콜레스테롤 함유 입자)은 지질 분자, 예컨대 콜레스테롤 (즉, HDL-C)을 동맥의 벽에서 대식세포로부터 제거할 수 있다. 따라서, 높은 수준의 LDL-C는 심혈관 질환 (CVD), 예컨대 말초 동맥 질환, 심장 동맥 질환 (CAD, 예컨대 협심증 및 심근 경색 (통상적으로 심장 발작으로 공지됨), 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 또는 고중성지질혈증), 죽상동맥경화증, 뇌졸중, 고혈압성 심장 질환, 류마티스성 심장 질환, 심근병증, 심장 부정맥, 선천성 심장 질환, 판막성 심장 질환, 심장염, 대동맥류, 말초 동맥 질환, 비만, 담즙정체성 간 질환, 신장 증후군, 갑상선기능저하증 및 정맥 혈전증, 또는 이들의 조합의 주요 위험이었다.
"LDL-R" 또는 "LDL 수용체"는 LDL-C의 세포내이입을 매개하고, 혈액으로부터 LDL-C를 제거하는 839개의 아미노산 (21-아미노산 신호 펩티드의 제거 후)의 모자이크 세포-표면 단백질이다. 인간 LDL-R의 대표적인 아미노산 서열은 진뱅크 수탁 번호: P01130.1 하에 개시되어 있으며, 인간 LDL-R을 코딩하는 대표적인 mRNA 핵산 서열은 진뱅크 수탁 번호: NM_000527.4 하에 나타나 있다. PCSK9가 LDL 수용체에 결합하는 경우, 수용체는 파괴되고, 혈액으로부터 LDL-C를 제거할 수 없다. 대조적으로, PCSK9가 차단되는 경우, 보다 많은 LDL 수용체가 간의 표면 상에 존재할 것이고, 혈액으로부터 보다 많은 LDL 콜레스테롤을 제거할 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 "항-PCSK9 항체"는 진단 및/또는 치료 용도를 제공하기에 충분한 친화도로 PCSK9 (예를 들어 인간 또는 원숭이 PCSK9)에 특이적 결합이 가능한 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 2개의 분자 사이의, 예컨대 예를 들어 항체 및 항원 사이의 비-무작위 결합 반응을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 ≤10-6 M (예를 들어, ≤5x10-7 M, ≤2x10-7 M, ≤10-7 M, ≤5x10-8 M, ≤2x10-8 M, ≤10-8 M, ≤5x10-9 M, ≤2x10-9 M, ≤10-9 M, 10-10 M)의 결합 친화도 (KD)로 인간 및/또는 PCSK9에 특이적으로 결합한다. 본원에 사용된 바와 같은 KD는 해리 속도 대 회합 속도의 비 (koff/kon)를 지칭하며, 표면 표면 플라스몬 공명 방법을 사용하여, 예를 들어 비아코어 (Biacore)와 같은 기기를 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "결합을 차단하는" 또는 "동일한 에피토프에 대해 경쟁하는" 능력은 2개의 분자 (예를 들어 인간 PCSK9 및 항-PCSK9 항체) 사이의 결합 상호작용을 임의의 검출가능한 정도로 억제하는 항체 또는 항원-결합 단편의 능력을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 2개의 분자 사이의 결합을 차단하는 항체 또는 항원-결합 단편은 2개의 분자 사이의 결합 상호작용을 적어도 50％ 억제한다. 특정 실시양태에서, 이 억제는 60％ 초과, 70％ 초과, 80％ 초과, 또는 90％ 초과일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 원자 또는 아미노산의 특이적 기를 지칭한다. 2개의 항체는 이들이 항원에 대해 경쟁적 결합을 나타내는 경우, 항원 내의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편이 예시적인 항체, 예컨대 11.4, 18.156.8, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7, 19.3.8, 40409의 인간 PCSK9에의 결합을 차단하는 경우, 항체 또는 항원-결합 단편은 그러한 예시적인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
본원에서 제공된 바와 같은 항체 명칭에 사용된 다양한 기호는 상이한 표시의 것이다: "hIgG4"는 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 항체를 지칭하고; "uAb"는 인간 항체를 지칭하고, uAb1, uAb2 등은 인간 항체의 상이한 버전을 지칭하고; "K" 또는 "L"은 카파 또는 람다 경쇄를 사용하는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "11.4"는 서열식별번호: 73의 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 75의 경쇄 가변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다. 항체 "11.4.1"은 11.4의 서브클론이다.
본원에 사용된 바와 같은 "18.156.8"은 서열식별번호: 77의 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 79의 경쇄 가변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "18.156.8 (hIgG4)"은 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 18.156.8의 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "15.14.2"는 서열식별번호: 81의 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 83의 경쇄 가변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "15.14.2-uAb-IgG4L"은 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 15.14.2의 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "17.72.3"은 서열식별번호: 85의 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 87의 경쇄 가변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "17.72.3-uAb1-IgG4K" 및 "17.72.3-uAb2-IgG4K"는 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 17.72.3의 완전 인간 모노클로날의 상이한 버전을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "18.136.7"은 서열식별번호: 89의 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 91의 경쇄 가변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "18.136.7-IgG4K"는 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 18.136.7의 완전 인간 모노클로날을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "19.3.8"은 서열식별번호: 93의 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 95의 경쇄 가변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "19.3.8-uAb1-IgG4L"은 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 19.3.8의 완전 인간 모노클로날을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "40409"는 서열식별번호: 97의 중쇄 가변 영역, 및 서열식별번호: 99의 경쇄 가변 영역을 포함하는 11.4에 기초한 조작된 항체를 지칭한다. 40409는 그의 모 항체 11.4에 비해 개선된 친화도를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은 "40409 (hIgG4)" 및 "40409 (hIgG2)"는 각각 IgG4 이소형 및 IgG2 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 40409의 완전 인간 모노클로날을 지칭한다.
아미노산 서열에 관하여 "보존적 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어 Met, Ala, Val, Leu, 및 Ile) 중에서, 중성 친수성 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어 Cys, Ser, Thr, Asn 및 Gln) 중에서, 산성 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어 Asp, Glu) 중에서, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어 His, Lys, 및 Arg) 중에서, 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어 Trp, Tyr, 및 Phe) 중에서 이루어질 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 보존적 치환은 통상적으로 단백질 형태적 구조의 상당한 변화를 유발하지 않으며, 따라서, 단백질의 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 관하여 "퍼센트 (％) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요할 경우, 갭을 도입하여 동일한 아미노산 (또는 핵산)의 최대 수를 달성한 후, 참조 서열에서의 아미노산 (또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 (또는 핵산) 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 잔기의 보존적 치환은 동일한 잔기로 간주될 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 퍼센트 아미노산 (또는 핵산) 서열 동일성을 측정하는 목적을 위한 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용가능한 도구, 예컨대 BLASTN, BLASTp (미국 국립 생명공학 정보 센터 (U.S. National Center for Biotechnology Information) (NCBI)의 웹사이트 상에서 이용가능함, 또한 문헌 [Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)]; [Stephen F. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)] 참조), 클러스탈 (Clustal)W2 (유럽 생물정보학 연구소 (European Bioinformatics Institute)의 웹사이트 상에서 이용가능함, 또한, 문헌 [Higgins D.G. et al., Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996)]; [Larkin M.A. et al., Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)] 참조), 및 ALIGN 또는 멕얼라인 (Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 도구에 의해 제공된 디폴트 파라미터를 사용할 수 있거나, 예컨대 예를 들어, 적합한 알고리듬을 선택함으로써, 정렬에 적절한 바와 같은 파라미터를 주문제작할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역의 그의 이펙터, 예컨대 C1 복합체 및 Fc 수용체에의 결합에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 예시적인 이펙터 기능으로는 C1 복합체 상의 항체 및 C1q의 상호작용에 의해 유도되는 보체 의존적 세포독성 (CDC); 항체의 Fc 영역의 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에의 결합에 의해 유도되는 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 및 포식작용을 들 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 상태의 "치료하는 것" 또는 "치료"는 상태를 예방하거나 경감시키는 것, 상태의 발달의 개시 또는 속도를 감속시키는 것, 상태를 발달시킬 위험을 감소시키는 것, 상태와 연관된 증상의 발달을 예방하거나 지연시키는 것, 상태와 연관된 증상을 감소시키거나 종료시키는 것, 상태의 완전한 또는 부분적 퇴행을 생성하는 것, 상태를 치유하는 것, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
"단리된" 물질은 천연 상태로부터 사람의 손에 의해 변경되었다. "단리된" 조성물 또는 물질이 자연에서 발생하는 경우, 이는 그의 원래 환경으로부터 변화되었거나 제거되었거나, 또는 둘 다이다. 예를 들어, 살아 있는 동물에 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 그것이 실질적으로 순수한 상태로 존재하도록 그의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 충분히 분리된 경우 "단리된" 것이다. 특정 실시양태에서, 항체 및 항원-결합 단편은 전기영동적 방법 (예컨대 SDS-PAGE, 등전위 포커싱, 모세관 전기영동), 또는 크로마토그래피적 방법 (예컨대 이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 HPLC)에 의해 측정 시 적어도 90％, 93％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％의 순도를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 그 단백질의 발현을 야기하도록 작동적으로 삽입될 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터는 그것이 숙주 세포 내에서 운반하는 유전 요소의 발현을 야기하도록 숙주 세포를 형질전환시키거나, 형질도입하거나, 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 벡터의 예로는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 P1-유래된 인공 염색체 (PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스를 들 수 있다. 벡터로서 사용되는 동물 바이러스의 범주는 레트로바이러스 (렌티바이러스를 포함함), 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 포진바이러스 (예를 들어, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 바쿨로바이러스, 유두종바이러스, 및 파보바바이러스 (예를 들어, SV40)를 포함한다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선별가능한 요소, 및 리포터 유전자를 비롯한, 발현을 제어하기 위한 다양한 요소를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 원점을 함유할 수 있다. 벡터는 또한 바이러스 입자, 리포솜, 또는 단백질 코팅을 포함하나 이에 제한되지 않는, 세포 내로 그의 진입을 돕는 물질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "PCSK9에 의해 매개되는 질환 또는 상태"는 PCSK9의 변화, 예를 들어 발현 수준, 활성의 변화, 및/또는 PCSK9의 변이체 또는 돌연변이의 존재에 의해 유발되거나 이를 특징으로 하는 질환 또는 상태를 지칭한다. PCSK9에 의해 매개되는 질환 또는 상태의 예로는 지질 장애, 고지질단백혈증, 고지질혈증; 이상지질혈증; 고콜레스테롤혈증, 심장 발작, 뇌졸중, 관상 심장 질환, 죽상동맥경화증, 말초 혈관 질환, 파행, 제II형 당뇨병, 고혈압, 심혈관 질환 또는 상태, 염증성 또는 자가면역 질환 또는 상태를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 질환 또는 상태의 확인/진단의 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. CVD (예컨대 급성 심근 경색 (AMI), 급성 심장 증후군 (ACS), 뇌졸중, 및 CV 사망)를 치료하기 위한 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 용도에 관하여, 본원에 사용된 바와 같은 "치료 유효량"은 혈장 또는 혈청에서 지질 (예컨대 콜레스테롤)을 저하시키거나, CVD 상태와 연관된 임의의 증상 또는 마커를 개선시키거나, CVD 상태의 발달을 예방하거나 지연시키거나, 또는 이들의 일부 조합이 가능한 항체 또는 항원-결합 단편의 투여량 또는 농도를 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는"은 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제(들), 및/또는 염이 일반적으로 제형을 포함하는 다른 성분과 화학적으로 및/또는 물리적으로 혼화성이고, 그의 수용자와 생리학적으로 혼화성인 것을 지시한다.
항-PCSK9 항체
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 예시적인 완전 인간 모노클로날 항체 11.4, 18.156.8, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7, 19.3.8, 40409를 제공하며, 그의 CDR 서열을 하기 표 1에 나타내고, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열을 또한 하기에 나타낸다.
<표 1>
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
11.4-VH:
아미노산 서열 (서열식별번호: 73):
Figure pct00005
핵산 서열 (서열식별번호: 74)
Figure pct00006
11.4-VL:
아미노산 서열 (서열식별번호: 75):
Figure pct00007
핵산 서열 (서열식별번호: 76)
Figure pct00008
18.156.8-VH
아미노산 서열 (서열식별번호: 77):
Figure pct00009
핵산 서열 (서열식별번호: 78)
Figure pct00010
18.156.8-VL
아미노산 서열 (서열식별번호: 79):
Figure pct00011
핵산 서열 (서열식별번호: 80)
Figure pct00012
15.14.2-VH
아미노산 서열 (서열식별번호: 81):
Figure pct00013
핵산 서열 (서열식별번호: 82)
Figure pct00014
15.14.2-VL
아미노산 서열 (서열식별번호: 83):
Figure pct00015
핵산 서열 (서열식별번호: 84)
Figure pct00016
17.72.3-VH
아미노산 서열 (서열식별번호: 85):
Figure pct00017
핵산 서열 (서열식별번호: 86)
Figure pct00018
17.72.3-VL
아미노산 서열 (서열식별번호: 87):
Figure pct00019
핵산 서열 (서열식별번호: 88)
Figure pct00020
18.136.7-VH
아미노산 서열 (서열식별번호: 89):
Figure pct00021
핵산 서열 (서열식별번호: 90)
Figure pct00022
18.136.7-VL
아미노산 서열 (서열식별번호: 91):
Figure pct00023
핵산 서열 (서열식별번호: 92)
Figure pct00024
19.3.8-VH
아미노산 서열 (서열식별번호: 93):
Figure pct00025
핵산 서열 (서열식별번호: 94)
Figure pct00026
19.3.8-VL
아미노산 서열 (서열식별번호: 95):
Figure pct00027
핵산 서열 (서열식별번호: 96)
Figure pct00028
40409-VH
아미노산 서열 (서열식별번호: 97):
Figure pct00029
핵산 서열 (서열식별번호: 98)
Figure pct00030
40409-VL
아미노산 서열 (서열식별번호: 99):
Figure pct00031
핵산 서열 (서열식별번호: 100)
Figure pct00032
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 1개 이상의 CDR 서열은 생성된 항체가 모 항체에 비해 1개 이상의 특성 (예컨대 개선된 항원-결합, 개선된 글리코실화 패턴, CDR 잔기 상의 글리코실화의 감소된 위험, CDR 잔기 상의 감소된 탈아미노화, 증가된 약동학 반감기, pH 민감도, 및 접합에 대한 혼화성)에서 개선되고, 그렇지 않다면 모 항체 (즉, 상기-언급된 변형 또는 변화를 제외하고는 그렇지 않다면 CDR 서열의 동일한 세트를 갖는 항체)와 필적하거나, 적어도 실질적으로 모 항체의 항원-결합 특성을 보유하도록 변형되거나 변화될 수 있다.
통상의 기술자는 표 1에서 제공된 CDR 서열이 개선된 생물학적 활성, 예컨대 인간 PCSK9에 대한 개선된 결합 친화도를 제공하도록, 아미노산의 1개 이상의 치환을 함유하도록 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 항체 변이체 (예컨대 Fab 또는 scFv 변이체)의 라이브러리는 파지 제시 기술로 생성되고 발현된 후, 인간 PCSK9에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝될 수 있다. 또다른 예를 들어, 컴퓨터 소프트웨어는 인간 PCSK9에의 항체의 결합을 가상으로 시뮬레이션하고, 결합 계면을 형성하는 항체 상의 아미노산 잔기를 확인하는 데 사용될 수 있다. 이러한 잔기는 결합 친화도의 감소를 방지하도록 치환에서 회피되거나, 보다 강한 결합을 제공하는 치환을 위해 표적화될 수 있다. 특정 실시양태에서, CDR 서열에서 치환(들) 중 적어도 1개 (또는 모두)는 보존적 치환이다.
특정 실시양태에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 것 (또는 것들)에 대해 적어도 80％ (예를 들어 적어도 85％, 88％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％) 서열 동일성을 갖는 1개 이상의 CDR 서열을 포함하며, 그 동안에 상응하는 CDR 서열이 표 1에 열거된 것 (또는 것들)에 대해 100％ 서열 동일성에 있는 것을 제외하고는 실질적으로 동일한 서열을 갖는 그의 모 항체보다 유사하거나 훨씬 더 높은 수준으로 인간 PCSK9에 대한 결합 친화도를 보유한다.
특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체 및 그의 항원-결합 단편은 완전 인간이다. 이들 완전 인간 항체는 바람직하게는 예시적인 항체: 11.4, 18.156.8, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7, 19.3.8, 40409의 것과 유사한 수준으로 인간 PCSK9에 대한 결합 친화도를 보유한다.
또한, 본원에서 제공된 항-PCSK9 항체 및 그의 항원-결합 단편과 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항체 및 항원-결합 단편이 본원에서 고려된다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 또는 원숭이 PCSK9에의 11.4, 18.156.8, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7, 19.3.8, 40409의 결합을 예를 들어, 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-7.5 M 미만, 10-8 M 미만, 10-8.5 M 미만, 10-9 M 미만, 또는 10-10 M 미만, 10-11 M 미만 또는 10-12 M 미만의 IC50 값 (즉, 50％ 억제 농도)으로 차단한다. IC50 값은 경쟁 검정, 예컨대 ELISA 검정 및 방사성리간드 경쟁 결합 검정에 기초하여 측정된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항-PCSK9 항체 및 그의 항원-결합 단편은 표면 플라스몬 공명 결합 검정 또는 ELISA에 의해 측정 시 10-8 M 이하, 10-9 M 이하 또는 10-10 M 이하 (예를 들어, ≤2.5x10-8 M, ≤2x10-8 M, ≤7.5x10-9 M, ≤3.5x10-9 M, ≤7x10-10 M, ≤6x10-10 M, ≤5x10-10 M, ≤2.5x10-10 M, ≤2x10-10 M, ≤1.5x10-10 M, ≤7.5x10-11 M, ≤6.5x10-11 M, 또는 ≤5.5x10-11 M)의 결합 친화도 (Kd)로 인간 PCSK9 및/또는 원숭이에 특이적으로 결합할 수 있다. 결합 친화도는 KD 값으로 나타내어질 수 있으며, 이는 항원 및 항원-결합 분자 사이의 결합이 평형에 도달할 때의 해리 속도 대 회합 속도의 비 (koff/kon)로서 계산된다. 항원-결합 친화도 (예를 들어 KD)는 예를 들어, 비아코어와 같은 기기를 사용한 표면 플라스몬 공명 결합 검정을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 적합한 방법을 사용하여 적절하게 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Murphy, M. et al., Current protocols in protein science, Chapter 19, unit 19.14, 2006] 참조).
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체 및 그의 단편은 0.01 nM 내지 0.2 nM (예를 들어 0.02 nM 내지 0.2 nM, 0.02 nM 내지 0.15 nM, 0.02 nM 내지 0.05 nM, 0.01 nM 내지 0.05 nM, 또는 0.02 nM 내지 0.3 nM)의 EC50 (즉, 50％ 결합 농도)으로 인간 PCSK9에 결합한다. 인간 PCSK9에의 항체의 결합은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어, 샌드위치 검정, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯, 다른 결합 검정에 의해 측정될 수 있다. 예시적인 예에서, 시험 항체 (즉, 제1 항체)는 고정화 인간 PCSK9에 결합하도록 허용되고, 비결합된 항체를 세척 제거한 후, 결합된 제1 항체에 결합하고, 따라서 그의 검출을 허용할 수 있는 표지된 2차 항체가 도입된다. 검출은 고정화 PCSK9가 사용되는 경우 마이크로플레이트 판독기로 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체 및 그의 단편은 경쟁 검정에서 측정 시, 0.5 nM 내지 3 nM (예를 들어 0.5 nM 내지 2.5 nM, 1 nM 내지 2.5 nM, 1 nM 내지 2 nM, 또는 1 nM 내지 1.5 nM)의 IC50으로 인간 LDL 수용체에의 인간 PCSK9의 결합을 억제한다.
특정 실시양태에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 인간 PCSK9의 그것과 유사한 결합 친화도로 원숭이 PCSK9에 결합한다. 예를 들어, 원숭이 PCSK9에의 예시적인 항체 11.4, 18.156.8, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7, 19.3.8, 40409의 결합은 인간 PCSK9의 그것과 유사한 친화도 또는 EC50 값으로이다.
일부 실시양태에서, 항-PCSK9 항체 및 그의 항원-결합 단편은 이뮤노글로불린 불변 영역을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 불변 영역은 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH1-CH2, 또는 CH1-CH3 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 바람직한 특성을 부여하는 1개 이상의 변형을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은 1개 이상의 이펙터 기능을 감소시키거나 고갈시키도록, FcRn 수용체 결합을 개선시키도록, 또는 1개 이상의 시스테인 잔기를 도입하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PCSK9 항체 및 그의 항원-결합 단편은 감소되거나 고갈된 이펙터 기능을 갖는, IgG4 이소형의 불변 영역을 갖는다. ADCC 또는 CDC 활성을 평가하는 다양한 검정, 예를 들어, Fc 수용체 결합 검정, C1q 결합 검정, 및 세포 용해 검정이 공지되어 있으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 항체-약물 접합체, 이중특이적 또는 다가 항체의 베이스로서 사용될 수 있다.
본원에서 제공된 항-PCSK9 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 이중특이적 항체, 표지된 항체, 2가 항체, 또는 항-이디오타입 항체일 수 있다. 재조합 항체는 동물에서라기 보다는 재조합 방법을 사용하여 시험관내에서 제조된 항체이다. 이중특이적 또는 2가 항체는 2개의 상이한 모노클로날 항체의 단편을 갖는 인공 항체이며, 2개의 상이한 항원에 결합할 수 있다. "2가"인 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 2개의 항원-결합 부위를 포함한다. 2개의 항원 결합 부위는 동일한 항원에 결합할 수 있거나, 이들은 각각 상이한 항원에 결합할 수 있으며, 이 경우, 항체 또는 항원-결합 단편은 "이중특이적"으로서 특징화된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항-PCSK9 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 완전 인간 항체는 재조합 방법을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 트랜스제닉 동물, 예컨대 마우스는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 트랜스진 또는 트랜스염색체를 운반하도록 제조될 수 있으며, 따라서, 적절한 항원, 예컨대 인간 PCSK9의 면역화 후 완전 인간 항체를 생산할 수 있다. 완전 인간 항체는 이러한 트랜스제닉 동물로부터 단리될 수 있거나, 대안적으로, 트랜스제닉 동물의 비장 세포를 불멸 세포주와 융합시켜 완전 인간 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 생성함으로써 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있다. 예시적인 트랜스제닉 동물로는 제한 없이, 그의 래트 이뮤노글로불린 유전자의 내인성 발현이 불활성화되고, 동시에 기능적 재조합 인간 이뮤노글로불린 좌위를 함유하도록 조작된 옴니래트 (OmniRat); 그의 마우스 이뮤노글로불린 유전자의 내인성 발현이 불활성화되고, 동시에 J-좌위 결실 및 C-카파 돌연변이를 갖는 재조합 인간 이뮤노글로불린 좌위를 함유하도록 조작된 옴니마우스 (OmniMouse); 그의 래트 이뮤노글로불린 유전자의 내인성 발현이 불활성화되고, 동시에 단일 공통적인, 재배열된 VkJk 경쇄 및 기능적 중쇄를 갖는 재조합 인간 이뮤노글로불린 좌위를 함유하도록 조작된 트랜스제닉 래트인 옴니플릭 (OmniFlic)을 들 수 있다. 상세한 정보는 문헌 [Osborn M. et al., Journal of Immunology, 2013, 190: 1481-90]; [Ma B. et al., Journal of Immunological Methods 400-401 (2013) 78-86]; [Geurts A. et al., Science, 2009, 325:433]; 미국 특허 8,907,157; EP 특허 2152880B1; EP 특허 2336329B1에서 추가로 발견될 수 있으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다른 적합한 트랜스제닉 동물, 예를 들어, HuMab 마우스 (상세사항에 대해서는, 문헌 [Lonberg, N. et al. Nature 368(6474): 856 859 (1994)] 참조), 제노-마우스 (Xeno-Mouse) (Mendez et al. Nat Genet., 1997, 15:146-156), 트랜스크로모 마우스 (TransChromo Mouse) (Ishida et al. Cloning Stem Cells, 2002, 4:91-102) 및 벨록이뮨 마우스 (VelocImmune Mouse) (Murphy et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111:5153-5158), 키마우스 (Kymouse) (Lee et al. Nat Biotechnol, 2014, 32:356-363), 및 트랜스제닉 토끼 (Flisikowska et al. PLoS One, 2011, 6:e21045)가 또한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-PCSK9 항체 및 그의 항원-결합 단편은 낙타화 단일 도메인 항체, 디아바디, scFv, scFv 이량체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F(ab')2, ds 디아바디, 나노바디, 도메인 항체, 또는 2가 도메인 항체이다.
일부 실시양태에서, 항-PCSK9 항체 및 그의 항원-결합 단편은 접합체를 더 포함한다. 다양한 접합체는 본원에서 제공된 항체 또는 항원-결합 단편에 연결될 수 있음이 고려된다 (예를 들어, 문헌 ["Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989)] 참조). 이들 접합체는 다른 방법 중에서도 공유 결합, 친화성 결합, 개재, 배위 결합, 복합체화, 회합, 블렌딩, 또는 첨가에 의해 항체 또는 항원-결합 단편에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 1개 이상의 접합체에 결합하는 데 이용될 수 있는 에피토프 결합 부분 외부의 특이적 부위를 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이러한 부위는 접합체에의 공유 연결을 용이하게 하는 1개 이상의 반응성 아미노산 잔기, 예컨대 예를 들어 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 접합체에 간접적으로, 또는 또다른 접합체를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 비오틴에 접합된 후, 아비딘에 접합된 제2 접합체에 간접적으로 접합될 수 있다. 접합체는 검출가능한 표지, 약동학 변형 모이어티, 정제 모이어티, 또는 세포독성 모이어티일 수 있다. 검출가능한 표지의 예로는 형광 표지 (예를 들어 플루오레세인, 로다민, 단실, 피코에리트린, 또는 텍사스 레드 (Texas Red)), 효소-기질 표지 (예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 루시페라제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제 또는 β-D-갈락토시다제), 방사성동위원소 (예를 들어 123I, 124I, 125I, 131I, 35S, 3H, 111In, 112In, 14C, 64Cu, 67Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 177Lu, 211At, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 및 32P, 다른 란타나이드, 발광 표지), 발색단 모이어티, 디곡시게닌, 비오틴/아비딘, DNA 분자 또는 검출용 금을 들 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체는 항체의 반감기를 증가시키는 것을 돕는 약동학 변형 모이어티, 예컨대 PEG일 수 있다. 다른 적합한 중합체로는 예컨대, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체 등을 들 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체는 정제 모이어티, 예컨대 자성 비드일 수 있다. "세포독성 모이어티"는 세포에 유해하거나, 세포를 손상시키거나 살해할 수 있는 임의의 작용제일 수 있다. 세포독성 모이어티의 예로는 제한 없이, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에테민, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로파놀롤, 푸로마이신 및 그의 유사체, 항대사물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오테파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플래니넘 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이슨 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 들 수 있다.
폴리뉴클레오티드 및 재조합 방법
본 개시내용은 항-PCSK9 항체 및 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 표 1에 제공된 CDR 서열을 코딩하는, 표 1에 나타낸 바와 같은 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 중쇄 가변 영역을 코딩하며, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 34, 및 적어도 80％ (예를 들어 적어도 85％, 88％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％) 서열 동일성을 갖는 그의 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 경쇄 가변 영역을 코딩하며, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 36, 및 적어도 80％ (예를 들어 적어도 85％, 88％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％) 서열 동일성을 갖는 그의 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 백분율 동일성은 유전 암호 축퇴성에 기인하는 반면, 코딩된 단백질 서열은 변화되지 않고 남아 있다.
항-PCSK9 항체 및 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어 표 1에서의 서열을 포함함)는 관련 기술분야에 공지된 재조합 기법을 사용하여 추가의 클로닝 (DNA의 증폭)을 위해 또는 발현을 위해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 항체는 관련 기술분야에 공지된 상동성 재조합에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고, 시퀀싱된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분으로는 일반적으로 하기 중 1종 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 원점, 1개 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 (예를 들어 SV40, CMV, EF-1α), 및 전사 종결 서열.
일부 실시양태에서, 벡터 시스템은 포유동물, 박테리아, 효모 시스템 등을 포함하며, 플라스미드, 예컨대, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO,pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 등 (그러나 이에 제한되지는 않음), 및 다른 실험실 및 시판되는 벡터를 포함한다. 적합한 벡터로는 플라스미드, 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관된 바이러스)를 들 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 클로닝 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본원의 벡터에서 클로닝 또는 DNA를 발현시키는 데 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이 목적을 위해 적합한 원핵생물로는 진정세균, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아 (Escherichia), 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 시겔라 (Shigella), 뿐만 아니라 바실리 (Bacilli), 예컨대 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa), 및 스트렙토미세스 (Streptomyces)를 들 수 있다.
원핵생물 외에도, 진핵생물 미생물, 예컨대 필라멘트성 진균 또는 효모는 항-PCSK9 항체-코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상적인 제빵사의 효모는 하등 진핵생물 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종, 및 균주, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예컨대, 예를 들어, 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스 (K. thermotolerans), 및 케이. 마르크시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코더마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬와니오미세스 (Schwanniomyces), 예컨대 쉬와니오미세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예컨대, 예를 들어, 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium), 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니게르 (A. niger)는 본원에서 통상적으로 이용가능하며 유용하다.
본원에서 제공된 글리코실화 항체 또는 항원-단편의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포를 들 수 있다. 숙주, 예컨대 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (유충), 아에데스 아에기프티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (초파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 다수의 바쿨로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어, 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주는 공개적으로 이용가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원의 바이러스로서 사용될 수 있다. 면, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 이용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포에 관심이 가장 컸으며, 배양 (조직 배양)에서의 척추동물 세포의 전파는 통상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 주 (현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 주 (Hep G2)이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 293F 세포이다.
숙주 세포는 항-PCSK9 항체 생산을 위해 상기-기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 적절하게는 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 바람직한 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
본원에서 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지, 예컨대 햄 (Ham's) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (Minimal Essential Medium) (MEM), (시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM), 시그마)는 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 배지 중 임의의 것은 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 임의의 것은 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 겐타마이신 (GENTAMYCIN)TM 약물), 추적량 요소 (통상적으로 마이크로몰 범위에서의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택되는 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
재조합 기법을 사용하는 경우, 항체는 세포내로, 주변세포질 공간에서 생산되거나, 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포내로 생산되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 데브리스는 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비된 항체를 단리하기 위한 절차가 기재되어 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에서 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 데브리스는 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 일반적으로 먼저 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF는 단백질분해를 억제하기 위해 상기 단계 중 임의의 것에 포함될 수 있으며, 항생제는 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체는 예를 들어, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로스 이온 교환 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 염석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기법이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A는 인간 .감마.1, .감마.2, 또는 .감마.4 중쇄에 기초한 항체를 정제하는 데 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형에 대해 및 인간 .감마.3에 대해 권고된다 (Guss et al., EMBO J. 5:1567 1575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 빈번히 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 적합한 매트릭스, 예컨대 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 공정 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX.TM. 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기법, 예컨대 이온-교환 컬럼 상 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상 헤파린 세파로스 (SEPHAROSE)™ 크로마토그래피 상 크로마토그래피 (예컨대 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전은 또한 회수되는 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 관심의 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 바람직하게는 저 염 농도 (예를 들어, 약 0 내지 0.25M 염)에서 수행된 약 2.5 내지 4.5의 pH의 용리 완충제를 사용한 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피로 처리될 수 있다.
키트
본 개시내용은 항-PCSK9 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 생물학적 샘플에서의 PCSK9의 존재 또는 수준을 검출하는 데 유용하다. 생물학적 샘플은 혈청을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 검출가능한 표지와 접합된 항-PCSK9 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 다른 실시양태에서, 키트는 비표지된 항-PCSK9 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하고, 비표지된 항-PCSK9 항체에 결합할 수 있는 2차 표지된 항체를 더 포함한다. 키트는 사용의 지시서, 및 키트 중의 성분의 각각을 분리하는 패키지를 더 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 PCSK9에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하거나, 예방하거나, 지연시키는 데 유용하다. 특정 실시양태에서, 항-PCSK9 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 샌드위치 검정, 예컨대 ELISA에, 또는 이뮤노그래픽 검정에 유용한 기질 또는 장치와 회합된다. 유용한 기질 또는 장치는 예를 들어, 미세역가 플레이트 및 시험 스트립일 수 있다.
특정 실시양태에서, 키트는 콜레스테롤을 감소시키는 데 유익한 것으로 공지된 1종 이상의 작용제를 더 포함한다. 예시적인 작용제로는 스타틴, 스타틴 이외의 HMG-CoA 리덕타제 억제제, 니아신 (니코틴산), 콜레스테롤 흡수 억제제, 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질 (CETP), 담즙산 격리제, 피브레이트, 피토스테롤; 또는 소분자, 펩티드모방체, 안티센스 RNA, 작은 간섭 RNA (siRNA), 및 천연 또는 변형된 지질로부터 선택되는 지질/지질 농도 비의 조정제를 들 수 있다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 흡수 억제제는 에제티미브 또는 SCH-48461이고; CETP는 에바세트라핍, 아나세트라핍 또는 달세트라핍이고; 담즙산 격리제는 바람직하게는 콜레세벨람, 콜레스티라민 또는 콜레스티폴이고; 피브레이트는 바람직하게는 페노피브레이트, 겜피브로질, 클로피브레이트, 또는 벤자피브레이트; 또는 이들의 조합이다.
제약 조성물 및 치료 방법
본 개시내용은 항-PCSK9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 더 제공한다.
본원에 개시된 제약 조성물에 사용하기 위한 제약 허용되는 담체로는 예를 들어, 제약상 허용되는 액체, 겔, 또는 고체 담체, 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장성제, 완충제, 항산화제, 마취제, 현탁/분산제, 격리제 또는 킬레이트화제, 희석제, 아주번트, 부형제, 또는 비-독성 보조 물질, 관련 기술분야에 공지된 다른 성분, 또는 이들의 다양한 조합을 들 수 있다.
적합한 성분으로는 예를 들어, 항산화제, 충전제, 결합제, 붕괴제, 완충제, 보존제, 윤활제, 향미제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정화제, 예컨대 당 및 시클로덱스트린을 들 수 있다. 적합한 항산화제로는 예를 들어, 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 티오황산나트륨, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸화 히드록스아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 및/또는 프로필 갈레이트를 들 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 본원에서 제공된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편 및 접합체를 포함하는 조성물에서 1종 이상의 항산화제, 예컨대 메티오닌의 포함은 항체 또는 항원-결합 단편의 산화를 감소시킨다. 이 산화의 감소는 결합 친화도의 소실을 방지하거나 감소시킴으로써, 항체 안정성을 개선시키고, 저장-수명을 최대화한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 1종 이상의 항체 또는 항원-결합 단편 및 1종 이상의 항산화제, 예컨대 메티오닌을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 항체 또는 항원-결합 단편을 1종 이상의 항산화제, 예컨대 메티오닌과 혼합함으로써, 본원에서 제공된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편의 산화를 방지하고/거나, 그의 저장-수명을 연장시키고/거나, 그의 효능을 개선시키는 방법이 제공된다.
추가로 예시하기 위해, 제약 허용되는 담체로는 예를 들어, 수성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 또는 덱스트로스 및 락테이트화 링거 주사, 비수성 비히클, 예컨대 식물 기원의 고정유, 면실유, 옥수수유, 참깨유, 또는 땅콩유, 정균 또는 정진균 농도의 항미생물제, 등장성제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스, 완충제, 예컨대 포스페이트 또는 시트레이트 완충제, 항산화제, 예컨대 중황산나트륨, 국소 마취제, 예컨대 프로카인 염산염, 현탁 및 분산제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필 미틸셀룰로스, 또는 폴리비닐피롤리돈, 유화제, 예컨대 폴리소르베이트 (Polysorbate) 80 (트윈 (TWEEN)-80), 격리 또는 킬레이트화제, 예컨대 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA (에틸렌 글리콜 테트라아세트산), 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화나트륨, 염산, 시트르산, 또는 락트산을 들 수 있다. 담체로서 이용되는 항미생물제는 페놀 또는 크레솔, 수은화합물, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함하는 다중-용량 용기 중의 제약 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 부형제로는 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 또는 에탄올을 들 수 있다. 적합한 비-독성 보조 물질로는 예를 들어, 습윤 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 향상제, 또는 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 또는 시클로덱스트린과 같은 작용제를 들 수 있다.
제약 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 환제, 캡슐, 정제, 서방형 제형, 또는 분말일 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 주사가능한 조성물로 제형화된다. 주사가능한 제약 조성물은 임의의 통상적인 형태, 예컨대 예를 들어 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 또는 액체 용액, 현탁액, 또는 에멀젼을 생성하기에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 주사용 제제는 주사에 용이한 멸균 및/또는 비-발열성 용액, 멸균 건조 가용성 생성물, 예컨대 사용 직전에 용매와 배합하기에 용이한 동결건조된 분말, 예컨대 피하 정제, 주사에 용이한 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 배합되기에 용이한 멸균 건조 불용성 생성물, 및 멸균 및/또는 비-발열성 에멀젼을 포함할 수 있다. 용액은 수성 또는 비수성 중 어느 하나일 수 있다.
특정 실시양태에서, 단위-용량 비경구 제제는 앰풀, 바이알 또는 바늘을 갖는 주사기에 패키징된다. 비경구 투여를 위한 모든 제제는 관련 기술분야에 공지되고 실시되는 바와 같이 멸균성이며, 발열성이 아니어야 한다.
특정 실시양태에서, 멸균, 동결건조된 분말은 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편을 적합한 용매에 용해시킴으로써 제조된다. 용매는 안정성을 개선시키는 부형제 또는 분말 또는 분말로부터 제조된 재구성된 용액의 다른 약리학적 성분을 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제로는 물, 덱스트로스, 소르비탈, 프룩토스, 옥수수 시럽, 크실리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스 또는 다른 적합한 작용제를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 용매는 완충제, 예컨대 시트레이트, 인산나트륨 또는 칼륨 또는 한 실시양태에서, 약 중성 pH의 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 이러한 완충제를 함유할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 공지된 표준 조건 하에서의 용액의 후속의 멸균 여과, 이어서 동결건조는 바람직한 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 생성된 용액은 동결건조를 위해 바이알로 배분될 것이다. 각각의 바이알은 항-PCSK9 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 조성물의 단일 투여량 또는 다중 투여량을 함유할 수 있다. 바이알을 용량 또는 용량의 세트에 필요한 것 초과의 소량 (예를 들어, 약 10％)으로 과도충전하는 것은 정확한 샘플 휴약 및 정확한 투약을 용이하게 하기 위해 허용된다. 동결건조된 분말은 적절한 조건 하에서, 예컨대 약 4 ℃ 내지 실온에서 저장될 수 있다.
주사용수로의 동결건조된 분말의 재구성은 비경구 투여에 사용하기 위한 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 재구성을 위해 멸균수 및/또는 비-발열수 또는 다른 액체 적합한 담체는 동결건조된 분말에 첨가된다. 정확한 양은 주어지는 선택된 요법에 의존하며, 경험적으로 결정될 수 있다.
PCSK9와 관련된 연관된 상태 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에서 제공된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여함으로써, 상기 상태 또는 장애를 치료하거나 예방하는 치료 방법이 또한 제공된다. 또다른 측면에서, 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에서 제공된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응의 상향조절로부터 이익을 얻을 대상체에서 상태를 치료하는 방법이 제공된다.
본원에서 제공된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편의 치료 유효량은 관련 기술분야에 공지된 다양한 인자, 예컨대 예를 들어 대상체의 체중, 연령, 과거 의학적 병력, 현재의 의약, 건강의 상태, 및 교차-반응, 알러지, 민감성 및 유해한 부작용의 잠재성, 뿐만 아니라 투여 경로 및 CVD 발달의 정도에 의존할 것이다. 투여량은 이들 및 다른 상황 또는 요건에 의해 지시된 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자 (예를 들어, 의사 또는 수의사)에 의해 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg (예를 들어, 약 0.01 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 85 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 95 mg/kg, 또는 약 100 mg/kg)의 치료 유효 투여량으로 투여될 수 있다. 특정 이들 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 약 50 mg/kg 이하의 투여량으로 투여되고, 특정 이들 실시양태에서, 투여량은 10 mg/kg 이하, 5 mg/kg 이하, 3 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 0.5 mg/kg 이하, 또는 0.1 mg/kg 이하이다. 특정 실시양태에서, 투여 투여량은 치료의 과정에 걸쳐 변화될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 초기 투여 투여량은 후속 투여 투여량보다 더 높을 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 투여량은 대상체의 반응에 따라 치료의 과정에 걸쳐 다양할 수 있다.
투여량 처방은 최적 바람직한 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 용량이 투여될 수 있거나, 몇몇 분할된 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있다.
본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 관련 기술분야에 공지된 임의의 경로, 예컨대 예를 들어 비경구 (예를 들어, 피하, 복강내, 정맥내 주입을 비롯한 정맥내, 근육내, 또는 진피내 주사) 또는 비-비경구 (예를 들어, 경구, 비내, 안내, 설하, 직장, 또는 국소) 경로에 의해 투여될 수 있다.
사용 방법
본 개시내용은 항-PCSK9 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 방법을 더 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항-PCSK9 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 PCSK9에 의해 매개되거나 그와 연관된 상태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 개체는 PCSK9 억제제에 반응할 가능성이 있는 장애 또는 상태를 갖는 것으로 확인되었다. 특정 실시양태에서, 개체는 상기 질환 또는 상태의 1종 이상의 증상을 나타내는, 예컨대 과체중이거나, 상승된 콜레스테롤 수준을 갖거나, LDL-R 또는 APOB를 코딩하는 유전자에서의 유전적 돌연변이를 갖거나, 이러한 질환 또는 상태의 가족력을 갖는, PCSK9에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 갖거나 발달시킬 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 개체는 콜레스테롤의 수준이 이러한 요법에서 허용되는 수준으로 효과적으로 저하될 수 없도록, 요법에서 또다른 콜레스테롤 저하제, 예를 들어, 스타틴에 저항성이거나 이에 불내성이다. 특정 실시양태에서, PCSK9에 의해 매개되는 질환 또는 상태로는 감염성 질환, 예컨대 중증 연조직염, 위장염, 패혈증, 폐렴, 피부 및 연조직 감염, 신우신염, 바이러스 감염, 예를 들어, B형 간염, C형 간염, 포진 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, HIV, 시토메갈로바이러스, 단순 포진 바이러스 유형 I, 단순 포진 바이러스 유형 2, 인간 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 카포시 웨스트 육종 연관된 포진 바이러스 유행, 얇은 고리 바이러스 (토르퀘테노바이러스), JC 바이러스 또는 BK 바이러스의 바이러스 감염을 들 수 있거나, 염증성 질환, 예컨대 알츠하이머, 강직 척추염, 관절염 (골관절염, 류마티스성 관절염 (RA), 건선성 관절염), 천식, 죽상동맥경화증, 크론병, 결장염, 피부염, 게실염, 섬유근통, 간염, 과민성 장 증후군 (IBS), 전신 홍반 루프스 (SLE), 신장염, 파킨슨병 및 궤양성 결장염을 들 수 있다.
관심의 생물학적 샘플 상의 LDL-C의 존재 또는 수준은 생물학적 샘플이 유래된 개체가 PCSK9 억제제에 반응성일 가능성이 있을 수 있는지 여부의 지표일 수 있다. 다양한 방법은 개체로부터의 시험 생물학적 샘플에서의 LDL-C의 존재 또는 수준을 측정하는 데 사용될 수 있다. 혈액의 데시리터 (dL) 당 밀리그램 (mg)의 콜레스테롤 수준은 미국에서 측정되는 반면, 혈액의 리터 (L) 당 밀리몰 (mmol)은 캐나다 및 많은 유럽 국가에서 사용된다.
특정 실시양태에서, 시험 생물학적 샘플에서의 LDL-C, 총 콜레스테롤 또는 비-HDL-C의 존재 또는 상향조절된 수준은 반응성의 가능성을 지시한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "상향조절된"은 동일한 항체를 사용하여 검출된 바와 같은 참조 샘플에서의 콜레스테롤 수준에 비해, 본원에서 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 사용하여 검출된 바와 같은 시험 샘플에서의 콜레스테롤 수준의 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％ 이상 또는 그 초과의 전체적인 감소를 지칭한다. 참조 샘플은 건강하거나 비-질환에 걸린 개체로부터 얻어진 대조 샘플, 또는 시험 샘플이 얻어진 동일한 개체로부터 얻어진 건강하거나 비-질환에 걸린 샘플일 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료 수단 또는 작용제와 조합으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 스타틴, 스타틴 이외의 HMG-CoA 리덕타제 억제제, 니아신 (니코틴산), 콜레스테롤 흡수 억제제, 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질 (CETP), 담즙산 격리제, 피브레이트, 피토스테롤; 또는 소분자, 펩티드모방체, 안티센스 RNA, 작은 간섭 RNA (siRNA), 및 천연 또는 변형된 지질로부터 선택되는 지질/지질 농도 비의 조정제와 조합으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 콜레스테롤 흡수 억제제는 에제티미브 또는 SCH-48461이고; CETP는 에바세트라핍, 아나세트라핍 또는 달세트라핍이고; 담즙산 격리제는 바람직하게는 콜레세벨람, 콜레스티라민 또는 콜레스티폴이고; 피브레이트는 바람직하게는 페노피브레이트, 겜피브로질, 클로피브레이트, 또는 반자피브레이트이다.
특정 이들 실시양태에서, 1종 이상의 상기 추가의 치료제와 조합으로 투여되는 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편은 1종 이상의 추가의 치료제와 동시에 투여될 수 있으며, 특정 이들 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편 및 추가의 치료제(들)는 동일한 제약 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 그러나, 또다른 치료제와 "조합으로" 투여되는 항체 또는 항원-결합 단편은 작용제와 동시에 또는 작용제와 동일한 조성물에서 투여될 필요는 없다. 또다른 작용제 전에 또는 후에 투여되는 항체 또는 항원-결합 단편은 항체 또는 항원-결합 단편 및 제2 작용제가 상이한 경로를 통해 투여되는 경우에도, 어구가 본원에 사용된 바와 같이, 그 작용제와 "조합으로" 투여되는 것으로 간주된다. 가능한 경우, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편과 조합으로 투여되는 추가의 치료제는 추가의 치료제의 제품 정보 시트에 열거된 스케줄에 따라, 또는 문헌 [Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57th Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002))] 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 프로토콜에 따라 투여된다.
하기 실시예는 청구된 발명을 보다 잘 예시하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 전체적으로 또는 부분적으로 하기 기재된 모든 구체적인 조성물, 물질, 및 방법은 본 발명의 범위 내에 해당된다. 이들 구체적인 조성물, 물질, 및 방법은 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않지만, 단지 본 발명의 범위 내에 해당되는 구체적인 실시양태를 예시하는 것으로 의도된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 발명적 능력의 훈련 없이 및 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 등가의 조성물, 물질, 및 방법을 개발할 수 있다. 많은 변형은 여전히 본 발명의 경계 내에 남아 있으면서 본원에 기재된 절차에 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함됨이 본 발명자들의 의도이다.
실시예 1: 항체 및 다른 단백질 생성
1.1 인간 및 뮤린 PCSK9
인간 및 뮤린 PCSK9 유전자를 C-말단에 융합된 6-His 태그 또는 뮤린 Fc (mFc)를 갖는 발현 벡터 pcDNA 3.3 내로 삽입하였다. 그 후, 플라스미드를 플라스펙트 (PlasFect) (바이오라인 USA (Bioline USA), BIO-46026)를 사용하여 HEK293 세포에 형질감염시켰다. His-태그 단백질을 Ni-컬럼 (퀴아젠 인코포레이티드)을 사용하여 수확된 상청액으로부터 정제하였다. mFc-융합된 단백질을 단백질 A 컬럼 (맙셀렉트 (MabSelect) SuRe, GE)을 사용하여 정제하였다.
1.2 인간 LDL-R
LDL 수용체 세포외 도메인의 유전자를 C-말단 6-His 태그를 갖는 벡터 pcDNA 3.3 내로 삽입하였다. 플라스미드를 플라스펙트 (바이오라인 USA, BIO-46026)를 사용하여 HEK293 세포에 형질감염시켰다. LDL-R 단백질을 먼저 Ni 컬럼 (퀴아젠 인코포레이티드)을 사용하여 수확된 상청액으로부터 정제하고, 이어서 이온-교환 컬럼을 사용하여 정제하였다.
1.3 참조 항체
참조 항체 BMK.115를 미국 특허 제8889834B2호에서의 21B12의 서열에 기초하여 생성하였다. VH 및 VL 유전자를 함유하는 플라스미드를 HEK293 세포 내로 공동-형질감염시켰다. 항체를 단백질 A 컬럼 (맙셀렉트 SuRe, GE)을 사용하여 수확된 상청액으로부터 정제하였다.
실시예 2: 항체 생성
2.1 면역화
인간 이뮤노글로불린 가변 도메인 유전자를 함유하는 옴니래트® (OMT)를 사용하여 완전 인간 VH 및 VL을 갖는 항체를 생성하였다. 옴니래트®를 대략 3일마다 발바닥을 통해 인간 PCSK9 단백질로 주사하였다. 제1 역가 시험을 6회의 주사 후에 수행하였다. 그 후, 래트를 2주마다 주사하였다.
2.2 혈청 역가 검출
효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 래트 혈청에서 항체의 역가를 측정하였다. ELISA 플레이트 (눈크 (Nunc))를 인간 PCSK9로 1 μg/ml로 4 ℃에서 밤새 코팅한 후, 차단 완충제 (1XPBS/ 2％BSA)로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 래트 혈청을 차단 완충제에서 1:100 희석에서 시작하여 1:3 적정하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 세척하고, 이어서 2차 항체 염소 항 래트 IgG1 HRP (베틸 (Bethyl)) 및 염소 항 래트 IgG2b HRP (베틸)와 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고, 상호작용을 2M HCl에 의해 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (몰리큘라 디바이스 (Molecular Device))를 사용하여 판독하였다.
2.3 면역화 및 하이브리도마 생성
림프절 및 비장을 멸균 조건 하에서 면역화된 마우스로부터 수집하고, 림프구를 피콜-파크 플러스 (Ficoll-Paque PLUS) 구배 원심분리를 사용하여 제조하였다. 그 후, 단리된 세포를 골수종 세포 P3과 1:1의 비로 전기융합 장치 (BTX ECM2001)를 사용하여 융합시켰다. 세포를 융합 후 ½ HA 배지로 옮겼다. 5x105개의 세포를 96-웰 플레이트 당 시딩하였다.
혈청에서의 항원-특이적 항체의 역가를 ELISA 검정에 의해 측정하였다. 312500 이상의 혈청 역가를 갖는 래트를 하이브리도마 융합을 위해 선택하였다.
2.4 하이브리도마 스크리닝
ELISA에 의한 결합 검정: 플레이트 (눈크)를 스트렙타비딘으로 1 μg/ml로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 250 ng/ml PCSK9-비오틴을 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 하이브리도마 상청액을 플레이트로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 세척하고, 이어서 2차 항체 염소 항 래트 IgG1 HRP (베틸) 및 염소 항 래트 IgG2b HRP (베틸)와 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고, 상호작용을 2M HCl에 의해 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (몰리큘라 디바이스)를 사용하여 판독하였다.
ELISA에 의한 차단 검정: 플레이트 (눈크)를 LDL-R로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 하이브리도마 상청액을 250 ng/ml PCSK9-mFc-비오틴과 혼합하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 차단 및 세척 후, 혼합물을 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 세척하고, 이어서 스트렙타비딘-HRP와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고, 상호작용을 2M HCl에 의해 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (몰리큘라 디바이스)를 사용하여 판독하였다.
하이브리도마 상청액을 1차 스크린에 사용하였다. 1차 결합 스크린은 4개의 융합물로부터 총 13000개의 항원-특이적 하이브리도마를 확인하였다. 그 후, 항원 특이적 하이브리도마를 ELISA 차단 검정에 의해 스크리닝하였다. 차단 검정은 인간 LDL-R에의 인간 PCSK9의 결합을 차단할 수 있는 104개의 하이브리도마를 발생시켰다. 결합 및 차단 활성 둘 다를 갖는 선별된 항체를 하이브리도마 상청액으로부터 정제하였다. 그 동안, 선별된 하이브리도마 주를 제한 희석에 의해 서브클로닝하였다. 하이브리도마 서브클론을 결합 및 차단 ELISA 검정에 의해 확인하고, 그들의 이소형을 또한 검출하였다.
세포 LDL 흡수 검정을 정제된 항체를 사용하여 수행하였다. 결합 및 차단 활성을 또한 ELISA를 사용하여 추가로 평가하였다. 최종 리드 클론의 선별은 결합 친화도, LDL-R에의 PCSK9 결합의 차단 IC50, 및 세포 LDL-흡수의 복원 활성에 기초하였다.
2.5 서브클로닝
각각의 선별된 주의 하이브리도마 세포를 96-웰 플레이트에 0.5, 1 및 5 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 단일 클론을 피킹하고, 결합 ELISA에서 시험하였다. 각각의 하이브리도마 주의 3개의 서브클론을 선별하고, 동결시켰다.
2.6 이소형
항체 이소형을 ELISA에 의해 확인하였다 (표 2 참조). 플레이트 (눈크)를 염소 항 래트 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgM 항체 (베틸)로 1 μg/ml로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 하이브리도마 상청액을 코팅된 플레이트로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 2차 항체 염소 항-인간 카파 HRP 또는 염소 항 인간 람다 HRP (서던 바이오텍 (Southern Biotech))와 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고, 상호작용을 2M HCl에 의해 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (몰리큘라 디바이스)를 사용하여 판독하였다.
<표 2>
항체 이소형
Figure pct00033
2.7 항체 정제
수확된 하이브리도마 상청액을 pH를 7.0으로 조정한 후 단백질 A 컬럼 (맙셀렉트 SuRe, GE)에 로딩하였다. 항체를 글리신에 의해 용리하고, 이어서 즉시 1 M 트리스 (Tris)를 사용하여 중화시켰다. 항체 농도를 나노 드롭 (Nano Drop) (써멀-피셔 (Thermal-Fisher))에 의해 시험하였다. 단백질의 순도를 SDS-PAGE (인비트로젠 (Invitrogen), NuPAGE 4％ 내지 12％ 비스-트리스 겔 (Bis-Tris Gel)) 및 HPLC-SEC (애질런트 (Agilent))에 의해 평가하였다.
실시예 3: 완전 인간 항체의 생성
3.1 하이브리도마 시퀀싱
RNA를 트리졸 (Trizol) 시약 (인비트로젠-15596018)을 사용하여 하이브리도마 세포로부터 추출하였다. cDNA를 5'-RACE 키트 (다카라 (Takara)-28001488)를 사용하여 증폭시키고, 이어서 3'-축퇴된 프라이머 및 3'-어댑터 프라이머 (ExTaq: 다카라-RR001B)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 단편을 pMD18-T 벡터 (다카라-D101C) 내로 삽입하고, 시퀀싱 (상하이 바이오순 (Shanghai Biosune))을 위해 보내었다. 선택된 항체 11.4, 18.156.8, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7, 19.3.8 및 40409의 가변 영역 서열 (아미노산 서열 및 핵산 서열)을 서열식별번호: 73 내지 100으로서 나타낸다.
3.2 재조합 완전 인간 항체의 생성
각각의 항체 (인간-래트 키메라 항체)의 V-영역 DNA를 인간 불변 영역 유전자를 함유하는 pcDNA3.3 벡터 내로 클로닝하였다. HEK293 세포를 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포로부터의 상청액을 세포를 제거하고 여과함으로써 수확하였다. 항체를 단백질 A 컬럼 (맙셀렉트 SuRe, GE)에 의해 정제하고, PBS로 완충제 교환하였다. 항체 농도를 나노드롭에 의해 검출하였다. 순도를 SDS-PAGE (인비트로젠, NuPAGE4％ 내지 12％ 비스-트리스 겔) 및 HPLC-SEC (애질런트)에 의해 평가하였다.
3.3 친화성 성숙
11.4 중쇄 (HC)-CDR3 라이브러리의 포화 돌연변이유발을 생성하고, 결합 ELISA 검정에 의해 스크리닝하고, 모 클론에 비해 PCSK9 결합이 증가한 단일 돌연변이를 선택하였다. 그 후, 선택된 돌연변이의 조합 라이브러리를 생성하였다. 특정 돌연변이 조합을 갖는 클론을 ELISA 결합 및 SPR koff 랭킹 결과에 기초하여 선별하였다.
2개의 무작위 돌연변이체 라이브러리를 11.4를 주형으로서 사용하여 생성하였다. 라이브러리를 2라운드의 패닝 및 스크리닝에 의해 선별하였다. 결합 친화도를 개선시키는 돌연변이를 선택하고, 포화 라이브러리와 함께 선택된 돌연변이와 조합하였다.
11.4 HC-CDR3의 포화 돌연변이유발 라이브러리를 생성하고, 결합 ELISA 검정에 의해 스크리닝하고, 모 클론에 비해 PCSK9 결합이 증가한 단일 돌연변이를 선택하였다 (도 1). 그 후, 선택된 돌연변이의 조합 라이브러리를 생성하였다. 특정 돌연변이 조합을 갖는 클론을 ELISA 결합 및 SPR koff 랭킹 결과에 기초하여 선별하였다. 1개의 CDR에서의 3개의 돌연변이의 조합은 IgG-전환된 클론 B4G2 및 C1B4에서 10배 친화도 개선을 생성하였다 (표 3).
<표 3>
친화성 성숙된 항체의 결합 친화도
Figure pct00034
2개의 무작위 돌연변이체 라이브러리를 또한 11.4를 주형으로서 사용하여 생성하였다. 2라운드의 패닝에 의한 라이브러리 선별은 친화도-개선 돌연변이를 갖는 5개의 클론을 생성하였다. 이들 돌연변이의 3개의 조합을 선택하고, B4G2 내로 도입하여 클론 40408, 40409 및 40410을 얻었다. 추가의 돌연변이는 2배 추가의 친화도 개선을 발생시켰다. 최종 친화성 성숙된 리드 Ab는 BMK.115에 비해 2배 더 높은 친화도를 갖는다 (표 4).
<표 4>
친화성 성숙된 항체의 결합 친화도
Figure pct00035
3.4 일시적 형질감염된 세포주로부터의 완전 인간 항체의 생산
3.4.1 18.156.8 (hIgG4)
완전 인간 항체 18.156.8 (hIgG4)은 경쇄 및 중쇄에 상응하는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에서 25 kDa 및 55 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다 (도 2 참조). 비-환원 조건 하에서의 주 밴드는 약 150 KD의 분자량을 갖는 전체 IgG이다. 순도는 HPLC-SEC에 의해 측정 시 99.6％이다 (도 3). 내독소는 < 0.5 EU/mg이다.
3.4.2 40409 (hIgG4)
완전 인간 항체 18.156.8 (hIgG4)은 경쇄 및 중쇄에 상응하는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에서 25 kDa 및 55 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다 (도 4 참조). 비-환원 조건 하에서의 주 밴드는 약 150 KD의 분자량을 갖는 전체 IgG이다. 순도는 HPLC-SEC에 의해 측정 시 98％이다 (도 5 참조). 내독소는 < 0.5 EU/mg이다.
3.4.3 15.14.2-uAb-IgG4L
완전 인간 항체 15.14.2-uAb-IgG4L은 경쇄 및 중쇄에 상응하는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에서 25 kDa 및 55 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다 (도 6 참조). 비-환원 조건 하에서의 주 밴드는 약 150 KD의 분자량을 갖는 전체 IgG이다. 순도는 HPLC-SEC에 의해 측정 시 99.8％이다 (도 7 참조). 내독소는 < 0.5 EU/mg이다.
3.4.4 17.72.3-uAb2-IgG4K
완전 인간 항체 17.72.3-uAb2-IgG4K는 경쇄 및 중쇄에 상응하는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에서 25 kDa 및 55 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다 (도 8 참조). 비-환원 조건 하에서의 주 밴드는 약 150 KD의 분자량을 갖는 전체 IgG이다. 순도는 HPLC-SEC에 의해 측정 시 98.9％이다 (도 9 참조). 내독소는 < 0.5 EU/mg이다.
3.4.5 18.136.7-IgG4K
완전 인간 항체 18.136.7-IgG4K는 경쇄 및 중쇄에 상응하는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에서 25 kDa 및 55 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다 (도 10 참조). 비-환원 조건 하에서의 주 밴드는 약 150 KD의 분자량을 갖는 전체 IgG이다. 순도는 HPLC-SEC에 의해 측정 시 99.2％이다 (도 11 참조). 내독소는 < 0.5 EU/mg이다.
3.4.6 19.3.8-uAb1-IgG4L
완전 인간 항체 19.3.8-uAb1-IgG4L은 경쇄 및 중쇄에 상응하는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에서 25 kDa 및 55 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다 (도 12 참조). 비-환원 조건 하에서의 주 밴드는 약 150 KD의 분자량을 갖는 전체 IgG이다. 순도는 HPLC-SEC에 의해 측정 시 99.9％이다 (도 13 참조). 내독소는 < 0.5 EU/mg이다.
실시예 4: 리드 항체 특징화
4.1 완전 인간 항체의 결합 및 차단 활성
PCSK9에 결합하는 완전 인간 항체의 활성을 ELISA에 의해 확인하였다 (도 14). LDL-R에의 PCSK9의 결합을 차단하는 완전 인간 항체의 활성을 경쟁적 ELISA에 의해 확인하였다 (도 15). 결합 EC50 및 차단 IC50 값을 표 5 및 6에 요약한다. 리드 항체 18.156.8(hIgG4), 40409 (hIgG4), 15.14.2-uAb-IgG4L 및 17.72.3-uAb2-IgG4K는 BMK.115 및 레파타와 필적하는 결합 및 차단 활성을 나타내었다.
<표 5>
결합 활성의 요약
Figure pct00036
<표 6>
차단 활성의 요약
Figure pct00037
4.2 완전 인간 항체의 LDL 흡수 검정
HepG2 또는 Huh-7 세포를 96-웰 플레이트에 10％ FBS를 함유하는 DMEM 배지 중 1x105 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 플레이트를 37 ℃ 인큐베이터에서 밤새 유지하였다. 배지를 FBS가 없는 DMEM으로 대체하였다. 인간 PCSK9 및 다양한 농도의 항체의 혼합물을 세포에 첨가하였다. 야생형 PCSK9 및 돌연변이체 PCSK9 (D374Y)의 최종 농도는 각각 20 μg/ml 및 1.3 μg/ml였다. 1시간 후, 보디피 (Bodipy) FL-표지된 LDL (인비트로젠 L-3483)을 세포에 첨가하여 1.5 μg/ml의 최종 농도를 만들었다. 37 ℃ 인큐베이터에서 3시간 동안의 인큐베이션 후, 플레이트에 LDL을 함유하는 배지를 버렸다. 세포를 트립신화하고, 2회 세척하였다. LDL-흡수를 FACS에 의해 측정된 세포에서의 보디피 FL-표지된 LDL의 형광에 의해 특징화하였다. LDL-흡수 복원율을 하기 식에 따라 계산하였다: LDL-흡수 복원 (％) = (MFI샘플 - MFILDL+Ag1H)/ (MFILDL 단독 - MFILDL+Ag1H) x100％.
최종 리드 항체 18.156.8 및 40409를 야생형 및 돌연변이체 PCSK9 둘 다를 사용하여 HepG2 및 Huh-7 세포에서의 LDL-흡수 검정에서 평가하였다 (도 16 및 17 참조). 결과는 18.156.8 및 40409가 WT PCSK9 또는 돌연변이체 PCSK9가 존재하는 경우 세포 LDL-흡수를 효율적으로 복원할 수 있음을 입증한다. 세포 LDL-흡수를 복원하는 항체 15.14.2, 17.72.3 및 19.3.8의 능력을 야생형 PCSK9를 갖는 HepG2 세포를 사용하여 평가하였다 (도 18 참조). 결과는 15.14.2, 17.72.3 및 19.3.8이 WT PCSK9가 존재하는 경우 세포 LDL-흡수를 효율적으로 복원할 수 있음을 입증한다. 각각의 항체의 IC50 값을 표 7 및 8에 요약하였다.
<표 7>
LDL-흡수 복원 검정에서의 항체의 IC50
Figure pct00038
Figure pct00039
<표 8>
HepG2에서의 LDL-흡수 검정
Figure pct00040
4.3 동역학적 친화도
4.3.1 SPR에 의한 결합 동역학
인간 및 레수스 PCSK9에 대한 항체 결합 친화도를 비아코어 T200을 사용하여 SPR 검정에 의해 검출하였다. 각각의 항체를 단백질 A 또는 항-인간 IgG Fc 항체 고정화 CM5 센서 칩 (GE) 상에 포획하였다. 상이한 농도의 인간 또는 레수스 PCSK9를 센서 칩 상으로 30 μL/분의 유속으로 180초의 회합 상 동안, 이어서 1200초 해리로 주사하였다. 칩을 각각의 결합 사이클 후 2 M MgCl2에 의해 재생하였다.
블랭크 표면 및 완충제 채널에 대한 센서그램을 시험 센서그램으로부터 빼었다. 실험 데이터를 랭뮤어 분석을 사용하여 1:1 모델에 의해 피팅하였다. 85 KDa의 분자량을 사용하여 분석물의 몰 농도를 계산하였다.
4.3.2 ELISA에 의한 레수스 PCSK9에 대한 교차-반응성
ELISA 플레이트 (눈크)를 항-His Ab (젠스크립트 (Genscript))로 1 μg/ml로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 1 μg/ml 레수스 PCSK9-His (시노 바이올로지컬 (Sino Biological))를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 항체 샘플을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 세척하고, 이어서 2차 항체 염소 항 래트 IgG1 HRP (베틸) 및 염소 항 래트 IgG2b HRP (베틸)와 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고, 상호작용을 2M HCl에 의해 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (몰리큘라 디바이스)를 사용하여 판독하였다.
항체 리드의 동역학적 친화도를 SPR 검정에 의해 측정하였다. 인간 및 원숭이 PCSK9에 대한 친화도를 표 9에 요약한다.
<표 9>
인간 및 원숭이 PCSK9에 대한 동역학적 친화도
Figure pct00041
Figure pct00042
4.4 혈청 안정성
항체를 신선하게 단리된 인간 혈청 (혈청 함량>95％)에서 37 ℃에서 각각 0, 1, 3, 7, 14일 동안 인큐베이션하였다. 37 ℃에서의 인큐베이션 후, 샘플을 드라이-아이스-에탄올 조에서 급속하게 동결시키고, -80 ℃에서 유지하였다. 샘플을 안정성 시험 전에 급속하게 해동시켰다. 플레이트를 Na2CO3/NaHCO3 (pH 9.2) 완충제 중 스트렙타비딘으로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 0.1％ 트윈-PBS로 1회 세척한 후, 2％ BSA/PBS로 차단하였다. 비오틴-표지된 PCSK9를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 희석된 혈청 샘플을 플레이트로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 염소 항-인간-HRP 항체를 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고, 상호작용을 2 M HCl에 의해 정지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (몰리큘라 디바이스)를 사용하여 판독하였다.
인간 PCSK9에의 항체 결합을 37 ℃에서 인간 혈청에서의 인큐베이션 후에 ELISA에 의해 시험하였다 (도 19). 1, 3, 7 및 14일의 인큐베이션 후의 항체 18.156.8 및 B4G2의 결합은 인큐베이션전 샘플과 유의한 차이를 나타내지 않았다. 따라서, 항체 18.156.8 및 B4G2는 둘 다 37 ℃에서 14일 동안 인간 혈청에서 안정하다. 3일의 인큐베이션 후의 항체 15.14.2, 17.72.3 및 19.3.8의 결합은 인큐베이션전 샘플과 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 5: 동물 연구
5.1 비-인간 영장류에서의 단일-용량 효능
원숭이 혈청 중의 LDL-C 및 HDL-C 농도를 LDLC 및 HDLC3 키트 (로슈 (Roche))를 사용하여 로슈/히다치 (Hitachi) 코바스 c 시스템 상에서 시험하였다. 총 콜레스테롤 (TCHO)을 콜레스테롤 FS 키트 (디아시스 (DiaSys))에 의해 시험하였다.
5.1.1 연구 1: 투약 개시 시, 대략 3 내지 4세 및 중량이 2.6 내지 2.9 kg인 총 6마리의 암컷 시노몰구스 원숭이. 6마리의 암컷 원숭이를 1마리 암컷/군의 6개의 군으로 무작위로 할당하였다. 1마리 암컷 원숭이의 6개의 군은 각각 10 또는 30 mg/kg의 BMK.115, 18.156.8 (hIgG4) 또는 40409 (hIgG4)를 단일 용량 정맥내 주사에 의해 받았다. 제1 투약일은 제1일로서 정의되었다. 각각의 군의 동물을 투약 후 36일 동안 관찰하였다:
Figure pct00043
주: 이 보고에서, "용량 수준" 및 "투여량"은 상호교환가능하게 사용된다.
a 용량은 활성 성분을 나타낸다.
시노몰구스 원숭이에서의 항체 18.156.8 및 40409의 LDL-C 저하 효과. BMK.115 및 18.156.8 (hIgG4)의 투여는 시노몰구스 원숭이에서 10 mg/kg 및 30 mg/kg에서 LDL-C 및 총 콜레스테롤 (TCHO)의 급속하고 지속적인 감소를 발생시켰다.
LDL의 백분율 감소는 BMK.115 10 mg/kg 및 30 mg/kg 용량 군에서 용량전 값에 비해 각각 83.4％ 및 89.6％까지였다. 18.156.8 (hIgG4)은 10 mg/kg 및 30 mg/kg 용량 군에서 각각 79.5％ 및 83.5％까지의 LDL-C의 유의한 감소를 생성하였다. 최대 감소는 제8일에 도달되었다. LDL-C의 감소는 10 mg/kg 및 30 mg/kg 용량 군 둘 다에서 18.156.8 (hIgG4) 처리된 동물에 대해 생전 상 전반에 걸쳐 지속되었다. LDL-C의 감소는 30 mg/kg 용량 군에서 BMK.115 처리된 동물에 대해 생전 상 전반에 걸쳐 지속되었지만, 10 mg/kg 군의 LDL-C는 제24일로부터 회복되기 시작하여, 제28일에 용량전 수준으로 복귀하였다 (도 20A 및 20B). 따라서, LDL-C의 감소는 레파타 처리된 군에 비해 10 mg/kg 용량으로 18.156.8 처리된 동물에서 보다 긴 기간 지속되었다.
40409 (hIgG4)는 10 mg/kg 및 30 mg/kg 용량 군에서 LDL-C를 각각 32.2％ 및 38.1％까지 감소시켰다 (도 20A 및 20B 참조).
고밀도 지질단백질 콜레스테롤 (HDL-C)은 일반적으로 10 mg/kg 및 30 mg/kg으로 18.156.8 (hIgG4) 또는 40409 (hIgG4)가 주어진 원숭이에서 잘 유지되었다. HDL-C는 일반적으로 10 mg/kg 용량으로 BMK.115가 주어진 원숭이에서 유지되었지만, HDL-C의 감소 (30.4％까지)는 용량전 값에 비해 BMK.115 30 mg/kg 군에서 주목되었다 (도 21 A 및 21B).
5.1.2 연구 2: 투약 개시 시, 대략 3 내지 4세 및 중량이 2.5 내지 3.5 kg인 총 10마리의 암컷 시노몰구스 원숭이. 10마리의 암컷 원숭이를 1마리 암컷/군의 8개의 군으로 무작위로 할당하였다. 1마리 암컷 원숭이의 10개의 군은 각각 3 mg/kg 또는 10 mg/kg의 레파타, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7 또는 19.3.8을 단일 용량 정맥내 주사에 의해 받았다. 제1 투약일은 제1일로서 정의되었다. 각각의 군의 동물을 투약 후 36일 동안 관찰하였다:
Figure pct00044
주: 이 보고에서, "용량 수준" 및 "투여량"은 상호교환가능하게 사용된다.
a 용량은 활성 성분을 나타낸다.
시노몰구스 원숭이에서의 항체 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7 및 19.3.8의 LDL-C 저하 효과.
레파타 및 15.14.2의 투여는 시노몰구스 원숭이에서 3 mg/kg 및 10 mg/kg에서 LDL-C 및 총 콜레스테롤 (TCHO)의 급속하고 지속적인 감소를 발생시켰다 (도 22A 및 22B). 18.136.7은 또한 3 mg/kg 및 10 mg/kg에서 약 50％까지의 LDL-C의 유의한 감소를 나타내었다. 17.72.3 및 19.3.8은 10 mg/kg에서 LDL-C의 중간 정도 감소를 나타내었다.
LDL의 백분율 감소는 용량전 값에 비해 레파타 3 mg/kg 및 10 mg/kg 용량 군에서 각각 80％ 및 77％까지였다. 15.14.2에서 3 mg/kg 및 10 mg/kg 용량 군 둘 다에서 각각 77％까지의 LDL-C의 유의한 감소를 생성하였다. 최대 감소는 제8일 내지 제16일에 도달되었다. 10 mg/kg 용량 군에서, LDL-C의 감소는 15.14.2 처리된 동물에 대해 생전 상 전반에 걸쳐 지속되었지만, LDL-C 수준은 레파타 처리된 동물에 대해 제24일로부터 복원되기 시작하여 제36일까지 용량전 수준으로 복귀하였다 (도 22A 및 22B). 10 mg/kg 용량 군에서, 레파타 처리된 원숭이의 LDL-C 수준은 제12일에 용량전 수준의 80％로 복귀하였으며, 제20일에 용량전 수준으로 완전 복귀하였다. 3 mg/kg 15.14.2 처리된 원숭이에 대해 LDL-C의 감소는 제28일까지 50％보다 낮게 유지하였다. 따라서, LDL-C의 감소는 레파타 처리된 군에 비해 3 mg/kg 및 10 mg/kg 용량 군 둘 다에서 15.14.2 처리된 동물에서 보다 긴 기간 지속되었다.
고밀도 지질단백질 콜레스테롤 (HDL-C)은 일반적으로 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 모든 시험된 항체로 처리된 원숭이에서 잘 유지되었다 (도 23A 및 23B).
5.2 약동학 (PK) 연구
전신 노출 (TK)을 측정하기 위해, BMK.115, 18.156.8-hIgG4, 40409-hIgG4, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7 및 19.3.8의 혈청 농도를 측정하였다. 혈액 샘플을 용량후 0 (용량전), 0.5, 1, 2, 4, 24, 48, 96, 168, 336, 504, 672, 744, 및 840시간에서 모든 이용가능한 원숭이로부터 수집하였다.
대략 2 mL의 혈액을 두부 또는 대퇴 정맥을 통해 동물로부터 수집하였다. 혈액을 항응고제가 없는 적절하게 표지된 튜브 내로 수집하였다. 튜브를 실온에서 적어도 30분 동안 정치하고, 혈청을 2000xg 및 약 4 ℃에서 10분 동안의 원심분리에 의해 수집의 2시간 내에 얻었다. 혈청을 고유하게 표지된 폴리프로필렌 튜브 내로 옮기고, 드라이 아이스 바로 위에서 수직으로 세운 위치에서 동결시키고, -60℃ 이하에서 유지하도록 설정된 동결기에서 저장하였다.
혈청 샘플을 PK 시험 전에 급속하게 해동시켰다. 플레이트를 Na2CO3/NaHCO3 완충제 중 폴리클로날 염소 항-인간 항체로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 0.1％ 트윈-PBS로 1회 세척한 후, 2％ BSA/PBS로 차단하였다. 희석된 시노몰구스 혈청 샘플을 플레이트로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비오틴-표지된 염소 항-인간 IgG 항체 및 스트렙타비딘-HRP를 웰에 첨가하고, 각각 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰의 450 nm에서의 OD 값을 기질 및 정지 용액의 첨가 후 판독하였다. 혈청 샘플 중의 항체의 농도를 표준 곡선에 의해 측정하였다.
초기 혈청 농도 (C0), 및 용량후 제0시간 내지 840시간의 혈청 농도 대 시간 곡선하 면적 (AUC) AUC0-840h를 포함하나 (데이터가 허용하는 경우) 반드시 이에 제한되지는 않는 TK 파라미터 값을 입증된 윈논린 (WinNonlin) 프로그램 (파르사이트 (Pharsight), 버전 6.2.1)을 사용하여 측정하였다. AUC0-840h를 단지 약물 처리된 동물로부터 비구획 방법에 의해 선형 업/로그 다운 사다리꼴 규칙을 사용하여 계산하였다. 정량화의 하한 미만 (BLQ)의 혈청 농도를 TK 파라미터 계산을 위해 0으로 설정하였다.
원숭이 혈청 중의 항체 농도를 ELISA에 의해 시험하였다 (도 24 및 25). 암컷 원숭이에게 10 또는 30 mg/kg의 BMK.115, 18.156.8 (hIgG4), 40409 (hIgG4)의 1회 단일 IV 주사 후의 BMK.115, 18.156.8 (hIgG4), 40409 (hIgG4)에 대한 C0 및 AUC0-840h를 하기에 제시한다. 각각의 항체의 반감기를 또한 표 10에 열거하였다.
투여량이 10 mg/kg으로부터 30 mg/kg으로 증가함에 따라, 18.156.8 및 40409에 대한 전신 노출 (AUC0-840h 및/또는 C0)은 용량-비례적으로 증가하였지만, BMK.115에 대해서는 용량-비례적으로보다 많이 증가하였다.
<표 10>
PK 데이터 I의 요약
Figure pct00045
암컷 원숭이에게 3 또는 10 mg/kg의 1회 단일 IV 주사 후의 레파타, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7 및 19.3.8에 대한 C0 및 AUC0-840h를 하기에 제시한다 (표 11 참조). 각각의 항체의 반감기를 또한 표 11에 열거하였다. 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7 및 19.3.8은 모두 둘 다의 용량에서 레파타보다 더 긴 것을 나타내었다.
투여량이 3 mg/kg으로부터 10 mg/kg으로 증가함에 따라, 레파타, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7 및 19.3.8에 대한 전신 노출 (AUC0-840h 및/또는 C0)은 용량-비례적으로 증가하였다.
<표 11>
PK 데이터 II의 요약
Figure pct00046
5.3 면역원성
혈액을 용량후 0 (용량전), 336, 672 및 840시간에서 두부 또는 대퇴 정맥을 통해 동물로부터 수집하였다.
플레이트를 Na2CO3/NaHCO3 완충제 중 BMK.115, 18.156.8, 40409, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7 또는 19.3.8로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 0.1％ 트윈-PBS로 1회 세척한 후, 2％ BSA/PBS로 차단하였다. PBS-희석된 시노몰구스 혈청 샘플을 플레이트로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 염소 항-시노몰구스 IgG-HRP 항체 (인간 IgG와 교차-상호작용 없음)를 첨가하였다. 각각의 웰의 450 nm에서의 OD 값을 기질 및 정지 용액의 첨가 후 판독하였다.
BMK.115, 18.156.8 (hIgG4), 40409 (hIgG4)의 면역원성 시험 결과를 도 26에 나타낸다. 용량후 336, 672, 840시간에서의 원숭이 혈청에서의 BMK.115, 18.156.8 (hIgG4), 40409 (hIgG4)에 대한 항-약물 항체 (ADA)의 역가는 용량전과 유의한 차이를 갖지 않았다. 따라서, 암컷 원숭이에게 10 또는 30 mg/kg의 BMK.115, 18.156.8 (hIgG4), 40409 (hIgG4)의 단일 IV 주사 후, 결과는 BMK.115, 18.156.8 (hIgG4), 40409 (hIgG4)가 혈청에서 낮은 면역원성을 유도하였음을 나타낸다.
레파타, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7 및 19.3.8의 면역원성 시험 결과를 도 27에 나타낸다. 용량후 336, 672, 840시간에서의 원숭이 혈청에서의 레파타, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7 및 19.3.8에 대한 항-약물 항체 (ADA)의 역가는 용량전과 유의한 차이를 갖지 않는다. 따라서, 암컷 원숭이에게 3 또는 10 mg/kg의 항체의 단일 IV 주사 후, 결과는 레파타, 15.14.2, 17.72.3, 18.136.7 및 19.3.8이 혈청에서 낮은 면역원성을 유도하였음을 나타낸다.
5.4 독성
사망률/빈사율: 각각의 동물의 건강 상태를 동물 방출 시 및 동물이 1회 조사된 경우 생전 완료의 일을 제외하고, 연구 동안 1일 2회, 즉, 아침에 1회 및 오후에 1회 보고하였다.
연구의 과정 동안 비스케줄화된 사망은 없었다.
상세한 관찰: 상세한 관찰을 모든 동물 (예비 동물을 포함함)에 대해 시험전 동안 1회, 투약일에 1회 (용량후 2±0.5시간), 및 모든 연구 동물에 대한 연구 동안 그 후 매주 1회 수행하였다.
생전 상 동안 관찰된 시험 물품-관련된 임상적 징후는 없었다.
우리측 관찰: 우리측 관찰을 모든 동물 (예비 동물을 포함함)에 대해 제-2일로부터 시험전 동안 매일, 제1일에 용량전 1회, 및 투약일 동안 매일 2회 (용량후 30분 내, 및 대략 6±0.5시간에), 및 회복 상 동안 매일 1회 수행하였다. 우리측 관찰은 상세한 관찰이 동시 슬롯에서 스케줄화된 경우 수행하지 않았다.
체중: 각각의 동물을 모든 동물에 대해 시험전 동안 1회, 투약 전 제1일에 1회, 및 연구 동물에 대해 그 후 매주 1회 칭량하였다.
시험 물품-관련된 발견은 체중에 대해 관찰되지 않았으며, 모든 변화는 생물학적 변이 내인 것으로 간주되었다.
사료 소비: 사료 소비를 용량 개시 전 2일에 모든 동물에 대해 및 투약일 및 관찰 기간 전반에 걸쳐 매일 추정하였다. 매일 사료 평가를 전체적인 식욕에 대해 육안 점검에 의해 평가하였다 (문서화는 동물이 먹고 있는지 아닌지 여부로 이루어졌음).
사료 소비에 있어서 시험 물품-관련된 변화는 없었다.
실시예 6: 항체 18.156.8 및 참조 항체 사이의 활성 비교
1. 참조 항체 생성
참조 항체 12H11.1.uIgG4K 및 24B9.1.uIgG4L을 특허 CN101932607에서 12H11.1 및 24B9.1의 서열에 기초하여 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 생성하였다.
항체 12H11.1.uIgG4K 및 24B9.1.uIgG4L은 경쇄 및 중쇄에 상응하는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에서 25 kDa 및 55 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다 (도 28A). 비-환원 조건 하에서의 주 밴드는 약 150 KD의 분자량을 갖는 전체 IgG이다. 24B9.1.uIgG4L의 순도는 HPLC-SEC에 의해 측정 시 96.8％이다 (도 28B). 12H11.1.uIgG4K의 순도는 HPLC-SEC에 의해 측정 시 95.3％이다 (도 28C).
2. ELISA에 의한 인간 PCSK9에의 결합
인간 PCSK9에 결합하는 참조 항체 12H11.1.uIgG4K 및 24B9.1.uIgG4L의 활성을 실시예 2의 섹션 2.4 하이브리도마 스크리닝에 기재된 방법에 따라 ELISA에 의해 확인하였다 (도 29). 결합 EC50 값을 표 12에 요약하였다. 참조 항체 12H11.1.uIgG4K는 18.156.8 및 BMK.115보다 더 낮은 결합 활성을 나타내었다. 참조 항체 24B9.1.uIgG4L은 인간 PCSK9에 결합하지 않는다.
<표 12>
결합 활성
Figure pct00047
3. ELISA에 의한 차단 검정
LDLR에의 PCSK9의 결합을 차단하는 참조 항체 12H11.1.uIgG4K 및 24B9.1.uIgG4L의 활성을 실시예 2의 섹션 2.4 하이브리도마 스크리닝에 기재된 방법에 따라 경쟁적 ELISA에 의해 평가하였다 (도 30). IC50 값을 표 13에 요약하였다. 항체 24B9.1.uIgG4L은 차단 활성을 나타내지 않았다. 항체 12H11.1.uIgG4K는 18.156.8과 유사한 IC50을 나타내었지만, 이는 PCSK9 및 LDLR의 결합을 완전 차단할 수 없다.
<표 13>
차단 활성
Figure pct00048
4. SPR에 의한 친화도
항체 12H11.1.uIgG4K의 동역학적 친화도는 실시예 4의 섹션 4.3.1 SPR에 의한 결합 동역학에 기재된 동일한 방법을 사용하여 시험 시, 18.156.8보다 훨씬 더 낮다. 결과를 표 14에 나타낸다.
<표 14>
인간 PCSK9에 대한 동역학적 친화도
Figure pct00049
5. LDL-흡수 검정
항체 18.156.8 및 12H11.1.uIgG4K를 실시예 4의 섹션 4.2 완전 인간 항체의 LDL 흡수 검정에 기재된 방법에 따라 HepG2 세포에서 LDL-흡수 검정에서 평가하였다 (표 15 및 도 31 참조). 12H11.1.uIgG4K는 HepG2 세포에서 세포 LDL-흡수를 복원하는 약간 더 낮은 활성을 나타내었다.
<표 15>
LDL-흡수 검정
Figure pct00050
본 개시내용을 특히 구체적인 실시양태 (그의 일부는 바람직한 실시양태임)를 참고로 나타내고 설명하였지만, 형태 및 상세사항의 다양한 변화가 본원에 개시된 바와 같은 본 개시내용의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 그에 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> WuXi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. <120> NOVEL ANTI-PCSK9 ANTIBODIES <130> 053674-8009WO02 <160> 100 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn 1 5 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agcaacagtg ctgcttggaa c 21 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Thr Tyr Ser Arg Ser Lys Trp Tyr His Asp Tyr Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aggacatact ccaggtccaa gtggtatcat gattatgcag tatctgtgaa aggt 54 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Trp Glu Thr Ser Ile Trp Asn Asp Asp Gly Pro Asn Tyr Tyr Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Met Asp Val 20 <210> 6 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gattgggaga cctctatctg gaacgacgac ggtcccaact actacaacta cggtatggac 60 gtc 63 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cgggcaagtc agggcattag aaatgattta ggc 33 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ggtgcatcca gtttgcaaag t 21 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu Gln His Asn Asn Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ctacagcata ataattaccc gtggacg 27 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 agctatggca tgcac 15 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gttatatggt atgatggaac taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Lys Gly Leu Asp 1 5 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gagaaggggc tggac 15 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr 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ccaggtccaa gtggtatcat gattatgcag tatctgtgaa aggt 54 <210> 69 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Asp Trp Glu Thr Ile Ile Trp Gly Asp Asp Gly Pro Asn Tyr Tyr Asn 1 5 10 15 Tyr Gly Leu Asp Val 20 <210> 70 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 gattgggaga ccattatctg gggcgacgac ggtcccaact actacaacta cggtttggac 60 gtc 63 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Leu Gln His Asn Asn Tyr Leu Trp Thr 1 5 <210> 72 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 ctacagcata ataattacct gtggacg 27 <210> 73 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Gln Leu Asn Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Ser Arg Ser Lys Trp Tyr His Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp 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Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Asn Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 76 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatggt gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataataatt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 77 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Lys Gly Leu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 78 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg gatggcagtt atatggtatg atggaactaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagaag 300 gggctggact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct ca 342 <210> 79 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Thr Asn Lys Asn Tyr Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys 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<213> Homo sapiens <400> 87 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Gly Asn Trp Met Ser 85 90 95 Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 88 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 gaggttgtgt tgacacagtc tcccgccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca ggaccagtca gagtctaagc agctacgtag cctggtccca gcagaagcct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaaa gggccactgg cgtcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcaa cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcaccag cgtggcaact ggatgtctag ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 89 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Glu Lys Gly Leu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 90 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctgggtt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaatt atatggtatg atggaagtaa caaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt gagagagaag 300 gggctggact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct ca 342 <210> 91 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 92 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagtt 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactggac atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300 ccgtggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339 <210> 93 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Trp Glu Gly Thr Val Thr Thr Trp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 94 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 caggtgcagt tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttccggata caccttcacc ggctactata taaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggacgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcaa cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt atttctgtgc gagttgggag 300 ggaacggtga ctacgtggga tttctactat tactacggta tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc a 381 <210> 95 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Asp Thr Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Ile Ile Phe Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 96 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctggatctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttgat acttataact atgtctcctg gtaccaacat 120 cacccaggca aagcccccaa gctcataatt tttgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caaatctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cactctcgtg 300 gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 97 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Gln Leu Asn Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Ser Arg Ser Lys Trp Tyr His Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Trp Glu Thr Ile Ile Trp Gly Asp Asp Gly 100 105 110 Pro Asn Tyr Tyr Asn Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 98 <211> 399 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 cagctaaacc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaacc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccggggg cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccgt cgagaggcct tgagtggctg ggaaggatat actccaggtc caagtggtat 180 catgattatg cagtatctgt gaaaggtcgg ataaccatca acccagacac atccaagaac 240 cagttcttcc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaagaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agagattggg agaccattat ctggggcgac gacggtccca actactacaa ctacggtttg 360 gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctca 399 <210> 99 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Asn Tyr Leu Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 100 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatggt gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataataatt acctgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321

Claims (37)

  1. 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1, 3, 5, 13, 15, 17, 25, 27, 29, 37, 39, 41, 49, 55, 57, 59, 67 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 7, 9, 11, 19, 21, 23, 31, 33, 35, 43, 45, 47, 51, 53, 61, 63, 65 및 71로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역;
    b) 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15, 및/또는 서열식별번호: 17을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    c) 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 27, 및/또는 서열식별번호: 29를 포함하는 중쇄 가변 영역;
    d) 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 39, 및/또는 서열식별번호: 41을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    e) 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 49, 및/또는 서열식별번호: 17을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    f) 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 57, 및/또는 서열식별번호: 59를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    g) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 67, 및/또는 서열식별번호: 69를 포함하는 중쇄 가변 영역
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    b) 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21, 및/또는 서열식별번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    c) 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 33, 및/또는 서열식별번호: 35를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    d) 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 45, 및/또는 서열식별번호: 47을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    e) 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 53, 및/또는 서열식별번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    f) 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 63, 및/또는 서열식별번호: 65를 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    g) 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 및/또는 서열식별번호: 71을 포함하는 경쇄 가변 영역
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    b) 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15, 및/또는 서열식별번호: 17을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21, 및/또는 서열식별번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    c) 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 27, 및/또는 서열식별번호: 29를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 33, 및/또는 서열식별번호: 35를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    d) 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 39, 및/또는 서열식별번호: 41을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 45, 및/또는 서열식별번호: 47을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    e) 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 49, 및/또는 서열식별번호: 17을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 53, 및/또는 서열식별번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    f) 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 57, 및/또는 서열식별번호: 59를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 63, 및/또는 서열식별번호: 65를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    g) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 67, 및/또는 서열식별번호: 69를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9, 및/또는 서열식별번호: 71을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 93, 및 서열식별번호: 97로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역, 및 그의 적어도 80％ 서열 동일성의 상동체 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 95, 및 서열식별번호: 99로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 및 그의 적어도 80％ 서열 동일성의 상동체 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열식별번호: 73을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 75를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    b) 서열식별번호: 77을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 79를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    c) 서열식별번호: 81을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 83을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    d) 서열식별번호: 85를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 87을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    e) 서열식별번호: 89를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 91을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    f) 서열식별번호: 93을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 95를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    g) 서열식별번호: 97을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 99를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    h) a), b), c), d), d), f), 또는 g)에 대해 적어도 80％ 서열 동일성의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라스몬 공명 결합 검정에 의해 측정 시 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 이하의 KD 값으로 인간 PCSK9에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 이하의 KD 값으로 원숭이 PCSK9에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 2.1 nM 이하의 IC50으로 인간 PCSK9의 그의 리간드에의 결합을 억제할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 0.15 nM 이하의 EC50으로 인간 PCSK9에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 115 nM 이하, 106 nM 이하, 80 nM 이하, 77 nM 이하, 66 nM 이하 또는 40 nM 이하의 IC50으로 세포 LDL 흡수를 복원할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1일, 또는 적어도 14일 동안 혈청에서 안정한 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, ADCC 또는 CDC 또는 둘 다를 매개하지 않는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 완전 인간 모노클로날 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 완전 인간 모노클로날 항체가 트랜스제닉 동물에 의해 생산되는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 동물에서 LDL-콜레스테롤을 84％까지 감소시킬 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 165시간, 적어도 250시간, 적어도 360시간, 적어도 390시간, 또는 적어도 450시간의 혈청 반감기를 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 낙타화 단일 도메인 항체, 디아바디, scFv, scFv 이량체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F(ab')2, ds 디아바디, 나노바디, 도메인 항체, 또는 2가 도메인 항체인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 이뮤노글로불린 불변 영역을 더 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체를 더 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  25. 제24항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  26. 제25항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  27. 제26항의 숙주 세포를 제24항의 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현시키는 방법.
  28. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키트.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 PCSK9에 의해 매개되는 질환 또는 상태를 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 개체가 PCSK9 억제제에 반응할 가능성이 있는 장애 또는 상태를 갖는 것으로 확인된 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 개체가 개체로부터의 시험 생물학적 샘플에서 혈청 LDL 콜레스테롤, 총 콜레스테롤 및/또는 비-HDL 콜레스테롤의 상향조절된 수준으로서 확인된 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  33. 면역 반응의 상향조절로부터 이익을 얻을 대상체에게 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 상태를 치료하는 방법.
  34. 제29항에 있어서, 대상체가 혈청 LDL 콜레스테롤, 총 콜레스테롤 및/또는 비-HDL 콜레스테롤의 상향조절된 수준을 갖는 것인 방법.
  35. 면역 반응의 상향조절로부터 이익을 얻을 상태를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도.
  36. 제35항에 있어서, 상태가 심혈관 질환, 염증성 질환, 및 감염성 질환인 용도.
  37. 제36항에 있어서, 감염성 질환이 패혈증인 용도.
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