KR20200135768A - 유전자 치료를 위한 변형된 rAAV 캡시드 단백질 - Google Patents

유전자 치료를 위한 변형된 rAAV 캡시드 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 요법을 위한 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 비리온에 관한 것으로, 여기서 상기 rAAV 비리온은 신규한 캡시드 단백질을 포함한다. 특히, 본 발명은 바람직하게는 관절내 투여에 의한 관절염 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 또는 그의 증상의 치료를 위한 유전자 요법에서 이러한 비리온의 용도에 관한 것이다.

Description

유전자 치료를 위한 변형된 rAAV 캡시드 단백질
발명의 분야
본 발명은 유전자 요법 기반된 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)의 분야, 특히 관절염 질환의 치료 또는 예방에서 돌연변이체 캡시드 rAAV의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 벡터는 생체내 인간에서 유전자의 전달을 위한 우수한 안전성 및 효능 프로파일을 입증하였다. 따라서, rAAV 벡터는 생체내 유전자 요법에 광범위하게 사용되어 왔으며, 임상 시험 뿐만 아니라 전임상 모델에서 안전하고 효과적인 것으로 밝혀졌다. rAAV 벡터는 혈우병 B, 혈우병 A, 낭포성 섬유증, 알파-1 항-트립신 결핍, 척수 근위축증 (SMA), 파킨슨병, 듀시엔형 근이영양증 및 레버 선천성 흑암시를 포함하는 다양한 질병에 대한 다수의 유전자 요법 임상 시험에서 성공적이었다 (Selot 등, Current Pharmaceutical Biotechnology, 2013, 14, 1072-1082). 알리포젠 티파르보벡(Alipogene tiparvovec) (Glybera®, uniQure)는 유럽에서 지단백질 리파제 결핍 (LPLD)의 치료를 위한 유전자 요법으로서 마케팅 승인을 받았다. 그 후, 유전자 요법 약물 승인은 피부암 (T-Vec, Imlygic®, Amgen)의 치료를 위한 헤르페스-바이러스 기반의 탈리모젠 라헤르파레프벡(Talimogene laherparepvec)에 대하여 그리고 ADA-SCID (GSK)의 치료를 위한 생체외 줄기 세포 레트로바이러스-기반 유전자 요법 스트림벨리스(Strimvelis)에 대하여 인정되었다.
rAAV 벡터-기반 유전자 요법은 또한, 인구의 ~1%에 영향을 미치는 만성 염증성 질환인, 류마티스성 관절염 (RA)에 적용되었다. RA의 병리는 활막 관절 전체에 걸쳐 있다. 관절의 국소화된 특성은 생체내 유전자 요법을 매우 매력적으로 만든다. RA의 균형을 항-염증성 상태로 이동시키기 위한 항-염증성 단백질을 제공하는 요법이 적용되어 왔다.
많은 연구가 원하는 특성을 가진 AAV 캡시드 단백질의 개발에 집중하였다. 이러한 특성은 더 높은 형질도입 효율, 조직/기관 친화성, 원치 않는 조직/기관의 탈-표적화, 또는 기존 중화 항체의 회피를 포함할 수 있다.
그러나, rAAV 유전자 요법 벡터를 추가로 개선하는 것이 종래 기술에서 여전히 필요하다. 특히, 관절염 질환에서 rAAV 유전자 요법 벡터의 용도를 개선하기 위한 그리고, 보다 정확하게는, 활막 관절 또는 활막 관절 내의 특정 세포 유형과 같은 표적 조직에, 바람직하게는 섬유아세포-유사 활막 세포 (FLS)에 유전 물질을 전달하는 효율을 개선하는 것이 필요하다.
제 1 양태에서, 본 발명은 관절염 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 또는 관절염 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 비리온에 관한 것으로, 여기서 상기 변형된 캡시드 단백질이 단백질의 C-말단부에서 아미노산 서열 Z를 포함하며, 이의 잔기가 캡시드 단백질의 표면에 노출된다. 바람직하게는, 아미노산 서열 Z는:
a. 하기 식 I의 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 상기로 이루어지고:
y - G - Q - x - G - (x)3 - R - (x)3 - y - A - Q - A - A
식중 x는 단일 아미노산 잔기를 나타내고 y는 0, 1 또는 2 개의 아미노산 잔기를 나타냄;
b. 야생형 AAV 캡시드 단백질의 C 말단으로부터 위치 100 - 200, 바람직하게는 120 - 180, 더욱 바람직하게는 130 - 170, 더욱 바람직하게는 140 - 160 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 존재한다.
바람직하게는, 식 I의 아미노산 잔기는 캡시드 단백질의 표면에 노출된다. 바람직한 구현예에서, 서열 Z는 하기 식 II로 표시되는 위치에서 변형된 캡시드 단백질에 포함된다:
EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy - Z - (x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG
식중 Z, x 및 y는 상기 정의된 바와 같고; n은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15임.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 관절염 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 또는 관절염 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온에 관한 것으로, 여기서 상기 캡시드 단백질은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고: i) 서열번호: 1을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 1의 위치 588 - 602에서 아미노산이 서열번호: 11과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열; ii) 서열번호: 2를 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 2의 위치 585 - 599에서 아미노산이 서열번호: 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열; iii) 서열번호: 3을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 3의 위치 587 - 601에서 아미노산이 서열번호: 9와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열; iv) 서열번호: 4를 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 4의 위치 586 - 600에서 아미노산이 서열번호: 8과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열; v) 서열번호: 5를 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 5의 위치 588 - 602에서 아미노산이 서열번호: 9와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열; vi) 서열번호: 6을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 6의 위치 588 - 602에서 아미노산이 서열번호: 8과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열; 및 vii) 서열번호: 7을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 7의 위치 587 - 601에서 아미노산이 서열번호: 12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열; 여기서 상기 변형된 캡시드 단백질은, 동일한 조건 하에서 시험될 때, 서열번호: 13 - 19로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 미변형된 캡시드 단백질과 비교하여 적어도 2-배 증가를 제공하고, 여기서 바람직하게는 상기 미변형된 캡시드 단백질은 서열번호: 19를 갖는 아미노산 서열을 갖거나 변형된 캡시드 단백질과 동일한 혈청형을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 변형된 캡시드 단백질은, 동일한 조건 하에서 시험될 때, 서열번호: 13 - 19로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 미변형된 캡시드 단백질과 비교하여 인간 FLS 세포에서 적어도 2 배의 발현 증가를 제공하고, 여기서 바람직하게는 상기 미변형된 캡시드 단백질은 서열번호: 19를 갖는 아미노산 서열을 갖거나 변형된 캡시드 단백질과 동일한 혈청형을 갖는다.
대안적으로, 또는 전술한 구현예들 중 어느 하나와 조합하여, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호:1 - 7로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 상기로 이루어진다.
대안적으로, 또는 전술한 구현예들 중 어느 하나와 조합하여, 본 발명의 바람직한 구현예에서, rAAV 비리온은 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복 (ITR) 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 비리온은 관심의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 더더욱 바람직하게는, 관심의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 2 개의 AAV ITR 서열 사이에 위치한다.
바람직한 구현예에서, 관심의 유전자 산물은 관절염 질환과 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나 억압하며, 여기서 바람직하게는 관심의 유전자 산물은 인터류킨, 면역-조절제, 항체, shRNA, miRNA, 가이드 RNA, lncRNA, 성장 인자, 프로테아제, 뉴클레오티다제/뉴클레오시다제, 펩티드, 프로테아제 억제제, 억제제, 효소 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기서 더욱 바람직하게는 관심의 유전자 산물은 CD39, CD73 및 IFN-β 중 적어도 하나이다.
대안적으로, 또는 전술한 구현예들 중 어느 하나와 조합하여, 본 발명의 바람직한 구현예에서, rAAV 비리온은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: (i) 적어도 하나의 가이드 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 여기서 상기 또는 각각의 가이드 RNA는 게놈에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열(들)에 실질적으로 상보적임; 및 (ii) 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 여기서 뉴클레아제는 가이드 RNA와 리보뉴클레아제 복합체를 형성하고, 여기서 리보뉴클레아제 복합체는 게놈에서 부위-특이적 이중 가닥 DNA 파괴 (DSDB)를 만듬.
또 다른 양태에서, 본 발명은 관절염 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 또는 관절염 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 rAAV 조성물에 관한 것으로, 여기서 상기 rAAV 조성물은 본 발명에 따른 rAAV 비리온 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 일 구현예에서, rAAV 조성물은 적어도 1:1, 적어도 5:1 또는 적어도 10:1의 비어있는 캡시드 대 rAAV 비리온의 비로 비어있는 캡시드를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 관절염 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 또는 관절염 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 rAAV 조성물 및 면역억압제에 관한 것으로, 여기서 상기 rAAV 조성물은 본 발명에 따른 rAAV 조성물이고 바람직하게는 여기서 상기 치료 또는 예방은 개체에게 rAAV 조성물의 투여 및 면역억압제의 투여를 포함한다.
대안적으로, 또는 전술한 구현예들 중 어느 하나와 조합하여, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 관절염 질환은 류마티스성 관절염 (RA), 소아 류마티스성 관절염, 골관절염 (OA), 통풍, 가성통풍, 척추 관절염 (SpA), 건선성 관절염, 강직성 척추염, 패혈성 관절염, 관절염, 소아 특발성 관절염, 둔기 외상, 관절 대체 및 스틸병으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
대안적으로, 또는 전술한 구현예들 중 어느 하나와 조합하여, 본 발명의 바람직한 구현예에서, rAAV 비리온 또는 rAAV 조성물은 전신으로 및/또는 국소적으로 투여된다. 바람직한 구현예에서, rAAV 조성물 및 면역억압제 중 적어도 하나는 국소적으로 투여된다. 바람직하게는, 국소 투여는 관절내 투여이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 관절염 질환과 관련된 증상의 치료, 예방 또는 억제 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 본 발명에 따른 rAAV 비리온 또는 rAAV 조성물의 유효량을 포함하는 약제의 관절내 투여의 단계를 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 비리온이 세포 형질도입에 놀랍게도 효과적이고, 특히 활막 관절의 세포 형질도입에 효과적임을 알아내었다. 섬유아세포-유사 활막세포 (FLS)가 전형적으로 예를 들어 류마티스성 관절염과 같은 관절염 질환의 치료에서 관절의 1차 표적 세포이므로, 본 발명의 목적은 종래 기술에서 공지된 캡시드 단백질과 비교하여 하기 특성들 중 하나 이상에서 개선되는 캡시드 단백질을 제공하는 것이다: i) 활막 조직, 특히 FLS에서 더 높은 발현 수준; ii) 개선된 활막 조직 친화성, 특히 FLS에 대하여 개선된 친화성; 및/또는 iii) rAAV 투여시 원치 않는 조직/기관에 대해 개선된 탈-표적화. 특히, 본 발명의 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온의 이들 특성은 미변형된 캡시드 단백질, 바람직하게는 변형된 캡시드 단백질 및/또는 AAV5 캡시드 단백질과 동일한 혈청형의 야생형 캡시드 단백질과 비교하여 개선된다. AAV5 캡시드가 다른 AAV 혈청형과 비교할 때 가장 높은 FLS 발현 수준을 일으킨다는 것이 이전에 확립되었다 (Adriaansen 등 (2005) Ann Rheum Dis 64:1677-1684; Apparailly 등 (2005) Hum. Gene Ther. 16:426-434). 조직/세포 친화성 특성을 부여하는 캡시드이므로, 본 발명에 기재된 변형된 캡시드는 바람직하게는 미변형된 AAV5와 비교할 때 향상된 FLS 형질도입 잠재력의 특성을 갖는다. 특히, 본 발명의 캡시드 단백질이, 미변형된 캡시드 단백질 (즉, 시험되어야 하는 변형이 없는, 바람직하게는 변형된 캡시드 단백질과 동일한 혈청형의 동일한 캡시드 단백질), (바람직하게는 변형된 캡시드 단백질과 동일한 혈청형의) 바람직하게는 야생형 미변형된 캡시드 단백질, 더욱 바람직하게는 미변형된 AAV5 또는 wtAAV5 캡시드 단백질과 비교하여, 활막 조직에서, 특히 FLS에서, 바람직하게는 관절내 투여시 더 높은 발현 수준을 제공하는 것이 바람직하다.
따라서, 제 1 양태에서, 본 발명은 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온에 관한 것이다. 본원에 정의된 바와 같이 rAAV 비리온은 유전자 요법에 사용하기에 특히 유용하다.
본원에 사용된 바와 같이, "유전자 요법"은 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 또는 질환 또는 장애의 증상을 치료 또는 예방하기 위해 개체의 세포 및/또는 조직에 (예를 들어 아래 본원에 정의된 바와 같이 (관심의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로서도 지칭된) 이식유전자와 같은) 핵산 서열의 삽입이다.
AAV는 분열 및 정지 세포 둘 모두를 감염시킬 수 있고 감염은 캡시드 단백질을 세포-막 수용체와 상호작용, 이어서 AAV 비리온의 세포내이입에 의해 발생한다. AAV는 디펜도바이러스(Dependovirus) 속에 속하며, 이는 차례로, 척추동물을 감염시킬 수 있는, 파보바이러스로서도 지칭된, 파보비리나애(Parvovirinae)의 아과에 속한다. 파보비리나애는 작은 DNA 동물 바이러스의 과, 즉 파보비리다애(Parvoviridae) 과에 속한다. 그들의 속명에서 추론될 수 있듯이, 디펜도바이러스의 구성원은 이들이 일반적으로 세포 배양에서 생산적 감염을 위하여 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 동시감염이 필요하다는 점에서 독특하다. 디펜도바이러스 속은, 인간을 정상적으로 감염시키는, AAV 그리고 다른 온혈 동물을 감염시키는 관련 바이러스 (예를 들면, 소과, 갯과, 말과, 및 양과 아데노-관련 바이러스)를 포함한다. 파보바이러스 및 파보비리다에의 다른 구성원에 대한 추가 정보는 Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)에서 기재된다. 편의상, 본 발명은 AAV를 참조하여 본원에 추가로 예시되고 기재된다. 그러나 본 발명이 AAV로 제한되지 않고 다른 파보바이러스에 동일하게 적용될 수 있음이 이해된다.
모든 공지된 AAV 혈청형의 게놈 조직화는 매우 유사하다. AAV의 게놈은 길이가 약 5,000 뉴클레오티드 (nt) 미만인 선형, 단일 가닥 DNA 분자이다. 역 말단 반복부 (ITR)은 비-구조적 복제화 (Rep) 단백질 및 구조적 (VP) 단백질에 대하여 고유한 코딩 뉴클레오티드 서열을 측접한다. VP 단백질 (VP1, -2 및 -3)은 (일부 혈청형의 경우) 어셈블리-활성화 단백질 (AAP)의 도움으로 캡시드 또는 단백질 쉘을 형성하며, 이는 VP2/VP3의 것과 중첩하는 대안적 개방형 해독틀에서 인코딩된다. 말단 뉴클레오티드는 자기-상보적이고 T-형 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정한 분자내 이중체가 형성될 수 있도록 구성된다. 말단 뉴클레오티드의 크기는 혈청형-의존적이다. 예를 들어, AAV2의 경우, 말단 145 nt 중, 125 nt는 자기-상보적이며 나머지 20 nt는 단일 가닥으로 유지된다. 이들 헤어핀 구조는 바이러스 DNA 복제화용 기원으로서 기능하며, 세포 DNA 폴리머라제 복합체용 프라이머로서 작용한다. 포유동물 세포에서 야생형 AAV (wtAAV) 감염 이후 Rep 단백질 (즉, Rep78 및 Rep52)는 각각 p5 프로모터 및 p19 프로모터에 의해 전사된 mRNA로부터 발현된다. 두 Rep 단백질은 바이러스 게놈의 복제화에서 기능을 갖는다. Rep ORF에서 스플라이싱 이벤트는 실제로 4개의 Rep 단백질 (즉, Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)의 발현을 초래한다. 그러나, 포유동물 세포에서, 스플라이싱되지 않은 mRNA에 의해 인코딩된, Rep78 및 Rep52 단백질이 AAV 벡터 생산에 충분하다는 것이 밝혀졌다. 포유동물 세포에서 wtAAV 또는 rAAV의 생산은 또한 2개의 스플라이스 수용 부위의 대안적 사용 그리고 VP2에 대한 ACG 개시 코돈의 차선적 활용의 조합에 의존하여, 대략 1:1:10 비율 (VP1:VP2:VP3)으로 3개의 캡시드 단백질 모두의 적절한 발현을 보장한다.
본원에 사용된 바와 같이 (본원에서 "rAAV 벡터" 또는 "rAAV 이식유전자 벡터"로서도 지칭된) "rAAV 비리온"은 비-천연 핵산 서열을 포함하는 AAV 캡시드를 의미한다. rAAV에서의 이러한 서열은 일반적으로 ITR 서열에 의해, 바람직하게는 wtAAV로부터 측접되고, 바람직하게는 관심의 유전자 산물, 예컨대 예를 들어 이식유전자 또는 상동성 아암을 인코딩한다. 다르게 말하면, rAAV 비리온은, (i) 관심의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 (ii) 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 적어도 하나의 AAV ITR 서열을 포함하는, rAAV 게놈을 의미한다. rAAV 게놈은 하나 또는 바람직하게는 모든 wtAAV 유전자를 결실시킬 수 있지만, 여전히 기능성 ITR 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, rAAV 비리온은 바이러스 단백질을 인코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 AAV의 rep (복제화) 또는 cap (캡시드) 유전자를 포함하지 않는다. 따라서, 바이러스 게놈의 전부 또는 일부가, 본원에 추가로 정의된 바와 같은 AAV 핵산 서열에 관하여 비-천연 핵산인, 관심의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체되었기 때문에, rAAV 비리온은 wtAAV 비리온과 구별된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 관절염 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 또는 관절염 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것이다. 본원에 기재된 의학적 용도 (예를 들면, 관절염 질환(과 관련된 증상)의 치료 또는 예방을 위한 유전자 요법)은 본원에 정의된 질환(들) 및/또는 장애(들)의 예방 또는 치료를 위한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 rAAV 비리온으로서 제형화되지만, (i) 본 발명에 따른 rAAV 비리온의 충분량 또는 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 본원에 정의된 질환(들) 및/또는 장애(들) 또는 이들의 증상의 예방 또는 치료 방법으로서, (ii) 본원에 정의된 질환(들) 및/또는 장애(들)을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 rAAV 비리온으로서, 또는 (iii) 본원에 정의된 질환(들) 및/또는 장애(들)의 예방 또는 치료를 위한 본 발명에 따른 rAAV 비리온의 용도로서 동등하게 제제화될 수 있다. 이러한 의학적 용도는 모두 본 발명에 의해 예상된다. 바람직하게는, 변형된 캡시드 단백질은 단백질의 C-말단부에서 아미노산 서열 Z를 포함하고, 이의 잔기는 캡시드 단백질의 표면에 노출된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 관절염 질환을 갖는 대상체에게 본 발명의 rAAV 비리온의 적용 또는 투여를 지칭하며, 여기서 목적은 관절염 질환 또는 관절염 질환과 관련된 증상의 진행 또는 심각성을 치료, 부분적으로 또는 완전히 역전, 완화, 개선, 억제, 지연, 억압, 둔화 또는 중단시키는 것이다. 용어 "치료하는"은 관절염 질환의 적어도 하나의 역효과 또는 증상을 감소시키거나 완화하는 것을 포함한다. 만약 하나 이상의 증상 또는 임상 지표가 감소되면 치료는 일반적으로 "효과적"이다. 대안적으로, 만약 관절염 질환의 진행이 감소되거나 정지되면 치료는 "효과적"이다. 즉, "치료"는 증상 또는 지표의 개선 뿐만 아니라 치료의 부재시 예상될 증상의 진행 또는 악화의 중지 또는 적어도 늦춤을 포함한다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 검출가능한 또는 검출불가능한지에 따라, 하나 이상의 증상(들)의 완화, 질환 정도의 약화, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 완화 또는 일시적 처방, 및 (부분적 또는 전체적) 차도. 관절염 질환의 "치료"라는 용어는 또한 관절염 질환의 증상 또는 부작용으로부터의 완화 (완화 치료 포함)을 제공하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하다", "예방", 또는 (예방용으로도 지칭된) "예방적"은, 미래의 관절염 질환의 하나 이상의 증상 또는 특징의 개시 지연 또는 예방, 완화, 호전, 경감, 진행 억제, 중증도 감소, 및/또는 발생률 감소의 목적으로, 관절염 질환에 대한 경향이 있는 대상체에게 본 발명에 따른 rAAV 비리온을 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따른 rAAV 비리온은, 바람직하게는 관절염 질환과 관련된 병리 발생 위험을 감소시키기 위해, 관절염 질환의 징후를 나타내지 않는 대상체에게 및/또는 관절염 질환의 초기 징후만을 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치유하다" 또는 "치유하는"은 관절염 질환의 적어도 하나의, 바람직하게는 모든 증상 또는 특성을 완전히 완화시키는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "지연시키다" 또는 "지연시키는"은 관절염 질환의 적어도 하나의 증상 또는 특성의 개시를 지연시키고/거나 이의 진행을 억제시키고/거나 이의 심각성을 감소시키는 것을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 변형된 캡시드 단백질은, 동일한 조건 하에서 시험될 때, 미변형된 캡시드 단백질과 비교하여 발현에서 적어도 2 배 증가를 제공한다. 바람직하게는, 미변형된 캡시드 단백질은, 시험되어야 하는 변형 없이, 변형된 캡시드 단백질과 동일한 혈청형의 캡시드 단백질이다. 더욱 바람직하게는, 미변형된 캡시드 단백질은 변형된 캡시드 단백질과 동일한 혈청형의 야생형 (wt) 캡시드 단백질이며, 여기서 wt 캡시드 단백질은 바람직하게는 서열번호: 13 - 19로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로, 미변형된 캡시드 단백질이 서열번호: 13 - 19로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 미변형된 캡시드 단백질은 서열번호: 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 미변형된 캡시드 단백질은 rAAV 비리온에 의해 표적화되어야 하는 조직에 의존할 수 있다. 예를 들어, AAV5 캡시드 단백질을 가진 rAAV는 FLS 세포용으로 선택된 비리온인 것으로 보이고 (Apparailly 등 (2005) Human Gene Therapy 16(4):426-434; Adriaansen 등 (2005) Ann. Rheum. Dis. 64(12):1677-1684) 그러므로 - rAAV 돌연변이체 비리온의 원래 혈청형에 관계없이 - rAAV 대조군 비리온은 바람직하게는 AAV5 캡시드 단백질, 더욱 바람직하게는 야생형 AAV5 (wtAAV5) 캡시드 단백질을 포함하고, 더욱 바람직하게는 AAV5 캡시드 단백질은 서열번호:19에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 더더욱 바람직하게는 rAAV 대조군 비리온은 rAAV5 비리온이다. rAAV 대조군 비리온은 변형된 캡시드 단백질 대신 본원에 정의된 바와 같은 미변형된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온이다. 바람직한 구현예에서, (변형된 캡시드 단백질을 포함하는) rAAV 비리온은, 실시예에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여, 변형된 캡시드 단백질 대신 본원에 정의된 바와 같은 미변형된 캡시드 단백질을 가진 동일한 rAAV 비리온과 비교하여 류마티스성 관절염 환자 (RA-FLS)로부터의 섬유아세포 유사 활막 및/또는 HEK 293, 바람직하게는 HEK293T, 세포에서 시험관내 형질도입시 더 높은 발현을 제공한다. 다시 말해서, 캡시드 단백질 이외에, rAAV 비리온 및 rAAV 대조군 비리온은 바람직하게는 동일하다. 바람직하게는, 형질도입 효율은 GFP, YFP 및/또는 루시퍼라제와 같은, 이식유전자에 의해 인코딩된 리포터 유전자의 발현 수준을 측정함으로써: 시험관내 형질도입 검정에서 검출된다. 바람직한 구현예에서, 발현을 측정하기 위한 시험은 실시예 2/3에 기술된 바와 같은 시험관내 형질도입 검정이다. 간략하게, (van de Sande MG 등, (2011) Ann Rheum Dis 70: 423-427에 기재된 바와 같이 단리된) RA-FLS는 2500 세포/웰로 플레이팅되거나 HEK293T 세포 (인간 배아 신장 세포)는 96-웰 플레이트 (DMEM-GlutaMAX-I (Gibco, 레퍼런스 31966-021)), 10 % FBS (열 불활성화 (HI) Bovine Serum Gold, Gibco 레퍼런스 A15-151), 100 μg/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich, 레퍼런스 P0781; 37℃ / 5% CO2)에서 40,000 세포/웰로 플레이팅된다. 24 시간 후, 상청액은 제거되고 10,000, 20,000 및 100,000의 다중 감염도 (MOI)에서 - 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터의 제어 하에서 황색 형광 단백질 (yFP) 및/또는 루시퍼라제를 모두 발현시키는 - rAAV 돌연변이체 비리온 또는 rAAV 대조군 비리온을 함유하는 배지 (DMEM-glutaMAX-I (Gibco, 레퍼런스 31966-021), 0.001 % 플루로닉 F68 (Sigma, 레퍼런스 p5559))로 대체된다. 미정제 용해물 (즉, rAAV 생산에 필요하고 리포터-발현 비리온을 함유하는 모든 플라스미드로 형질감염된 세포의 비-정제된 상청액) 또는 (바람직하게는 요오딕사놀 정제 또는 염화세슘 (CsCl) 밀도 구배 정제에 기반된) 정제된 AAV는 사용될 수 있다. 형질도입 4 시간 후, 독소루비신 (Sigma, 레퍼런스 D1515; 최종 농도 0.4 μM), FBS (최종 농도 1%)를 함유하는 배지 (DMEM-GlutaMAX-I, 10 % FBS 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신)은 첨가된다. 48 시간 (HEK293T) 또는 4-6 일 (RA-FLS) 후, 세포는 형광현미경법 또는 FLOW 세포측정법에 의해 YFP 또는 루시퍼라제를 발현하는 세포의 백분율에 대하여 검정된다. 바람직하게는, 시험관내 형질도입 검정은 상이한 환자로부터 단리된 FLS, 예컨대 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 명 이상의 환자로부터 단리된 FLS로 여러 번 수행된다.
"혈청형"은 전통적으로 또 다른 바이러스와 비교하여 하나의 바이러스에 대한 항체 간의 교차-반응성의 부족에 근거하여 정의된다. 이러한 교차-반응성 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원성 결정요인의 차이에 기인한다 (예를 들면, AAV 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열 차이에 기인한다). 전통적인 정의에 따르면, 혈청형은 관심의 바이러스가 중화 활성에 대하여 기존의 특성화된 모든 혈청형에 특이적인 혈청에 대해 시험되었으며 관심의 바이러스를 중화시키는 항체가 발견되지 않았음을 의미한다. 보다 자연적으로 발생하는 바이러스 단리물이 발견되고 캡시드 돌연변이체가 생성됨에 따라, 현재 존재하는 임의의 혈청형과 혈청학적 차이가 있을 수 있고 없을 수도 있다. 따라서, 새로운 AAV가 혈청학적 차이가 없는 경우, 이 새로운 AAV는 상응하는 혈청형의 하위군 또는 변이체일 것이다. 많은 경우에, 중화 활성에 대한 혈청학 시험은 이들이 혈청형의 전통적인 정의에 따라 또 다른 혈청형인지를 결정하기 위해 캡시드 서열 변형을 가진 돌연변이체 바이러스에 대해 아직 수행되지 않았다. 따라서, 편의를 위해 그리고 반복을 피하기 위해, 용어 "혈청형"은 혈청학적으로 구별되는 바이러스 (예를 들어, AAV) 뿐만 아니라 주어진 혈청형의 하위군 또는 변이체 내일 수 있는 혈청학적으로 구별되지 않는 바이러스 (예를 들어, AAV) 둘 모두를 지칭한다.
"형질도입"은 바이러스 벡터에 의한 수령체 숙주 세포 내로의 이식유전자의 전이를 지칭한다. 본 발명의 rAAV 비리온에 의한 표적 세포의 형질도입은 상기 rAAV 비리온에 함유된 이식유전자를 형질도입된 세포 내로 전이시킨다. "숙주 세포" 또는 "표적 세포"는, DNA 전달이 일어나는 세포, 예컨대 개체의 활막세포 또는 활막 세포, 또는 예컨대 시험관내 형질도입 검정의 경우 환자로부터 단리된 FLS 세포 또는 HEK293T 세포를 지칭한다. AAV 벡터는 분열 세포 및 비-분열 세포 둘 모두를 형질도입할 수 있다. 관심의 유전자 산물, 예컨대 예를 들어 GFP를 포함하는 세포에서, 관심의 유전자 산물은 세포의 rAAV "전이"에 의해 도입/전이/형질도입되었다. 이식유전자가 도입된 세포는 "형질도입된" 세포로서 지칭된다.
이식유전자가 형질도입되는 수령체 숙주 세포는 바람직하게는 치료되어야 하는 질환에 의해 이환되는 세포, 예컨대 예를 들어 관절염 질환의 경우 활막 세포, 더욱 구체적으로 FLS, 대식세포, 단핵구, 호중구, 조골세포, 파골세포, 연골세포, T-림프구, 수지상 세포, 형질 세포, 비만 세포, B 림프구이다. 본원에 사용된 바와 같이 "활막" 또는 "활막 조직" 또는 "활막 세포"는, Tak (2000, Examination of the synovium and synovial fluid. In: Firestein GS, Panyani GS, Wollheim FA editors. Rheumatoid Arthritis. New York: Oxford Univ. Press, Inc. 55-68)에 추가로 기재된 바와 같이, 활막 관절의 비-연골성 표면을 포함하는 세포 라이닝을 지칭하고 본원에 참고로 편입된다. 활막은 내막 라이닝 층 (또는 활막 라이닝 층)과 활막 서브라이닝 (서브시노비움(subsynovium))으로 이루어지며, 관절낭과 합쳐진다. 내막 라이닝 층은 내막 대식세포 (또는 대식세포-유사 활막세포 또는 A형 활막세포) 및 FLS (또는 B형 활막세포)를 포함한다. "활막"은 그러므로 "활막 조직"으로 대체될 수 있거나, 이와 동의어일 수 있다. 활막 세포는 FLS 및 대식세포-유사 활막세포를 포함하여 활막에 존재하는 임의의 세포를 포함할 수 있다. 활막 세포는 또한, 모두 활막에 존재할 수 있는, 호중구, T, B 세포 및/또는 결합 조직 세포일 수 있다.
"섬유아세포-유사 활막 세포" (FLS)는 섬유아세포와 공통인 많은 특성, 예컨대 특정 단백질, 예컨대 예를 들어 몇몇 유형의 콜라겐의 발현을 나타내는 중간엽 기원의 세포이다. 그러나, FLS는 또한 다른 섬유아세포 계통, 예컨대 예를 들어 루 브리신에 정상적으로 존재하지 않는 단백질을 분비한다. 또한, FLS는, 카드헤린(cadherin)-11, VCAM-1, 몇몇 인테그린 및 이들의 수용체와 같은, 세포 부착의 매개에 중요한 분자를 발현한다. FLS에 대해 특이적인 것은 CD55의 발현이며 따라서 이 단백질은 전형적으로 면역조직화학에 의해 활막에서 FLS를 확인하는데 사용된다. FLS는, 세포가 류마티스성 관절염 (RA)와 같은 만성 염증성 질환의 발병에 중요한 역할을 하는, 활막에서 관절 내부에 위치한 특수한 세포 유형을 나타낸다. 용어 "류마티스성 활막" 또는 "류마티스성 활막 세포" 또는 "류마티스성 활막 조직"은 RA를 앓고 있는 개체의 관절의 염증성 활막을 지칭한다. 류마티스성 활막은 내막 라이닝 과형성 및 활막 서브라이닝에서 FLS, T-세포, 형질 세포, 대식세포, B-세포, 자연 살해 세포 및 수지상 세포의 축적을 특징으로 한다. 이들 축적된 세포는 류마티스성 활막 세포의 정의에 포함된다. RA의 진행 동안, 활막 조직은 지속적인 염증 과정이 일어나는 곳이 되어, 결국 연골 손상과 관절 파괴 및 변형으로 이어질 수 있다. RA 동안 활막에 존재하는 FLS는 정상 조직에 존재하는 FLS와 비교하여 변경된 표현형을 나타내는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 류마티스성 활막에서 FLS는 "접촉 억제"를 상실한다, 즉, 이들은 더 많은 세포가 서로 접촉할 때 이들은 이들의 성장을 정지시키는 특성을 상실한다. 또한, 이들은 접착성 표면에서 성장하기 위한 의존성을 상실한다. 결과적으로 이환된 활막에서 FLS의 수는 증가한다. 염증은 몇몇 전-염증성 신호전달 분자, 특히 인터류킨 IL-6 및 IL-8, 프로스타노이드 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)의 생산에 의해 추가로 향상된다.
대안적으로, 또는 또 다른 구현예와 조합하여, 본 발명의 추가 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은, 동일한 조건 하에서 시험될 때, 본원에 정의된 바와 같이 미변형된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온과, 바람직하게는 서열번호: 13 - 19로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 미변형된 캡시드 단백질과 비교하여 인간 FLS에서 이식유전자의 발현에서 적어도 2 배 증가를 제공하고, 여기서 바람직하게는 상기 미변형된 캡시드 단백질은 상기 변형된 캡시드 단백질과 동일한 혈청형을 갖거나 서열번호: 19에서 나타난 아미노산 서열을 갖는다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 rAAV 비리온은 rAAV 대조군 비리온과 비교하여 인간 FLS 세포에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 배 증가된 발현 수준만큼 상기 기재된 바와 같이 시험관내 형질도입시 이식유전자의 증가된 발현 수준을 초래한다.
또한 바람직하거나 상기에 추가하여, rAAV 비리온은, rAAV가 (이의 캡시드 단백질(들)과는 별개로) 달리 동일하다면, rAAV 대조군 비리온과 비교하여, 바람직하게는 wtAAV5 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온과 비교하여 (실시예 4에 기재된 바와 같이 Edwards 등 (1981) J Pathol 134: 147-156으로부터 적응된) 에어 파우치 시노비움 (air pouch synovium; APS) 마우스 모델에 생체내 투여시 이식유전자의 증가된 발현을 제공한다. 바람직하게는, 이식유전자의 발현은 본 발명의 방법의 돌연변이체 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV를 사용하여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35 배 증가된다. 예시적인 방법은 실시예에서 제공된다.
또한 바람직하거나 상기에 추가하여, 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온은 동일한 혈청형의 미변형된, 바람직하게는 야생형, AAV 캡시드 단백질을 포함하는 동일한 rAAV 비리온과 비교하여 유사하거나 낮은 중화 항체 (nAb) 역가를 제공한다. wtAAV5 캡시드는 매력적인 nAb 프로파일을 갖는 것으로 알려져 있으므로, wtAAV5와 비교하여 본 발명에 따른 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV의 유사하거나 더 낮은 nAb 역가는 바람직하다.
대안적으로, 시험관내 형질도입 검정은 상기 기재된 바와 유사하게, 그러나 표적화되어야 하는 세포 유형에 따라, FLS와 상이한 세포 유형/세포주에서, 예컨대 예를 들어, 1 차 간세포, 간 세포주, 예를 들면 HuH, HepG2, HepA1-6, 심장 세포, 골격근 세포, 폐 세포 예컨대 세포주 A549, CNS 세포, 안구 세포, 위장관 세포, 골수 세포 및 혈액 세포, 예컨대 세포주 THP-1로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포에서 수행될 수 있다. 이것은 또한 야생형 캡시드 단백질의 친화성에 따라 바람직한 대조군으로서 상이한 AAV 혈청형을 요구할 수 있다. 일반적으로, 대조군 벡터는 바람직하게는 선택된 조직에 자연적으로 표적화하는 야생형 캡시드 단백질을 포함한다. 당업자라면 이해할 바와 같이, 이것은 또한 국소적으로 또는 전신으로 투여 방식에 의존할 수 있다. 예를 들어, 가장 광범위하게 검사된 AAV인, AAV2는 골격근 세포, 뉴런, 혈관 평활근 세포 및 간세포에 대한 친화성을 나타내고; AAV6은 기도 상피 세포에 대한 친화성을 나타내고; AAV7은 골격근 세포에 대한 친화성을 나타내고; AAV8은 간세포에 대한 친화성을 나타내고; AAV1 및 AAV5는 혈관 내피 세포에 대한 친화성을 나타낸다. 전신 투여시, AAV 1-3 및 5-9는, AAV9, 8, 7, 6, 1에 대해 관찰된 높은 단백질 수준 그리고 5 및 2에 대해 더 낮은 정도로, 간에 대한 친화성을 갖고; 심장은 AAV4, 6, 7, 8 및 9에 의해 형질도입되며; 흉부 발현은 AAV4 및 6에 대해 나타난다 (Zincarelli 등 (2008) Molecular Therapy 16(6): 1073-1080).
임의의 이론에 구속됨의 바램 없이, rAAV 대조군 비리온과 비교하여 본 발명의 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온에 의해 달성된 발현 증가가 rAAV의 세포 내로의 형질도입 개선에 의해, 아마도 변경된 친화성에 의해 야기되어, (i) 형질도입되는 세포 모집단 내에서 세포의 증가된 수, 및/또는 (ii) 예를 들어, 더 나은 비리온 흡수 및/또는 세포내 처리로 인한, 세포 당 발현의 증가된 수준을 초래하는 것으로 믿는다.
본 발명에 따른 변형된 캡시드 단백질을 가진 rAAV 비리온의 또 다른 이점은 바람직하게는 기존의 중화 항체의 가능한 회피와 같은 다른 개선일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 변형된 캡시드 단백질은 아미노산 서열 Z를 포함하고, 바람직하게는 아미노산 서열 Z는 단백질의 C-말단부에 포함된다. 바람직하게는, 서열 Z는 길이 12 - 18 개의 아미노산 잔기이다 (여기서는 "루프 영역" 및 "삽입물"이라고도 함). 바람직한 구현예에서, 서열 Z는 캡시드 단백질의 C-말단부에서, 예를 들어 서열번호: 13 - 19에 나타낸 바와 같이, 야생형 캡시드 단백질의 C-말단으로부터 100 - 200, 바람직하게는 120 - 180, 더욱 바람직하게는 130 - 170, 더욱 바람직하게는 140 - 160, 가장 바람직하게는 약 150 개 아미노산의 위치에 상응하는 위치에 바람직하게는 위치한다. 아미노산 서열 Z의 잔기는 바람직하게는 캡시드 단백질의 표면에 노출되고, 예컨대 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 개의 잔기는 캡시드 단백질의 표면 (소위 "루프")에 노출된다. 바람직한 구현예에서, 서열 Z는 길이 14 - 18 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 길이 15, 16, 17 또는 18 개의 잔기, 가장 바람직하게는 길이 15, 17 또는 18 개의 아미노산 잔기이다. 서열 Z는 미변형된, 예컨대 야생형 캡시드 단백질 서열과 비교하여 일부 아미노산 잔기를 대체할 수 있다. 바람직하게는, 삽입물은, 바람직하게는 미변형된, 더욱 바람직하게는 야생형 서열의 삽입물 없이 동일한 서열의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 6 또는 7 개의 아미노산 잔기를 대체한다. 서열 Z/삽입물과 별도로, 따라서 프레임워크에서, 캡시드 단백질은 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환)과 같은 추가 변형을 포함할 수 있거나 프레임워크 캡시드 단백질은 야생형 아미노산 서열일 수 있다. 삽입물이 포함되는 프레임워크 AAV는 임의의 혈청형, 예컨대 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAVrh10 또는 AAVDJ일 수 있다. 바람직하게는, 서열 Z가 포함되는 프레임워크 AAV는 AAV1, AAV2, AAV7, AAV9, AAVrh10, AAVDJ로 이루어지는 군으로부터, 더욱 바람직하게는 서열번호: 13 - 19 중 어느 하나에 나타난 아미노산 서열을 갖는 미변형된 캡시드 단백질로부터 선택된다. 본 발명에 따른 삽입물은 캡시드 단백질의 C-말단부에서 바람직하게는 예를 들어 서열번호: 13 - 19에 나타난 바와 같이, 야생형 캡시드 단백질의 C-말단으로부터 100 - 200, 바람직하게는 120 - 180, 더욱 바람직하게는 130 - 170, 더욱 바람직하게는 140 - 160, 가장 바람직하게는 대략 150 개의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 바람직하게는 포함되고, 여기서 관심의 위치는 하기 식 II로 나타내거나:
EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy - Z - (x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG
식중 x는 단일 아미노산 잔기를 나타내고, y는 (따라서 부재일 수 있는) 0, 1 또는 2 개의 아미노산 잔기를 나타내고, n은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15, 바람직하게는 8, 9 또는 10임 또는 여기서 상기 삽입물의 위치는 식 II와 적어도 90, 93, 95, 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열로 나타난다. 바람직하게는, 본 발명의 서열 Z의 N-말단 단부에 선행하는 마지막 3개의 아미노산 잔기는 NLQ, NHQ 또는 NFQ이다. 바람직하게는, y는 0 또는 2개의 아미노산 잔기를 나타낸다. 일부 경우에, y는 2개의 아미노산 잔기를 나타내므로, 2개의 추가 아미노산 잔기, 바람직하게는 2개의 세린 잔기는 NxQ 모티프와 본 발명의 삽입물 사이에 존재할 수 있다. 이것은 바람직하게는 NxQ 모티프가 NFQ인 경우, 예를 들어 AAV 캡시드가 서열번호:1로 나타낸 때 AAV1 캡시드 서열인 경우이다. 당업자는 이들 모티프 및 삽입물이 위치하는 이 영역을 결정할 수 있을 것이며, 또한 본 발명의 범위에 포함되는, 아미노산 치환 또는 결실과 같은 일부 변이가 존재하는 경우에도 마찬가지이다.
바람직한 구현예에서, 도 4 및 5에 도시된 정렬에 근거하여, 삽입물 (서열 Z)는 하기 식의 서열을 포함하거나 상기로 이루어진다: x1-G-Q-x2-Gx3-x4-x5-R-x6-x7-x8-x9-x10-x11-x12-x13-x14-x15, 식중 x1은 Q 또는 없음이고, x2는 S 또는 R이고, x3은 N 또는 C이고, x4는 D, Y 또는 E이고, x5는 C, V, S 또는 A이고, x6은 G, S 또는 V이고, x7은 없음, A, V 또는 R이고, x8은 D, N 또는 E이고, x9는 C 또는 A이고, x10은 F 또는 Q이고, x11은 없음, C 또는 A이고, x12는 없음 또는 A이고, x13은 없음 또는 Q이고, x14는 없음 또는 A이고 X15는 없음 또는 A이다. 대안적으로, 삽입물 (서열 Z)는 하기 식의 서열을 포함하거나 상기로 이루어진다: y1-G-Q-y2-G-y3-y4-y5-R-y6-y7-y8-y9-y10-A-y11-y12-y13, 식중 y1은 Q 또는 없음이고, y2는 S 또는 R이고, y3은 N 또는 C이고, y4는 D, Y 또는 E이고, y5는 C, V, S 또는 A이고, y6은 G, S 또는 V이고, y7은 없음 또는 D이고, y8은 없음 또는 C이고, y9는 A, V, R 또는 F이고, y10은 N, D, E 또는 C이고, y11은 없음 또는 Q이고, y12는 없음 또는 A이고, y13은 없음 또는 A이다. 더욱 또 다른 대안에서, 가장 바람직한 구현예에서, 도 6 및 7에 도시된 정렬에 근거하여, 삽입물 (서열 Z)는 하기 식 I의 서열을 포함하거나 상기로 이루어진다:
y - G - Q - x - G - (x)3 - R - (x)3 - y - A - Q - A - A
식중 x는 단일 아미노산 잔기를 나타내고 y는 (따라서 부재일 수 있는) 0, 1 또는 2 개의 아미노산 잔기를 나타낸다. 바람직하게는, (i) N-말단에서 y가 0 개의 아미노산을 나타내면, 식 I 내의 다른 y는 0 개의 아미노산 잔기를 나타내거나 또는 (ii) N-말단에서 y가 1 개의 아미노산 잔기를 나타내면, 식 I 내의 다른 y는 2 개의 아미노산 잔기를 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 삽입물 (서열 Z)는 하기 더욱 구체적인 식의 서열을 포함하거나 상기로 이루어진다:
z0 - G - Q- z1 - G - z2 - z3 - z4 - R - z5 - z6 - z7 - z8 - z9 - A - Q - A - A
식중 z0은 없음 또는 Q이고, z1은 R 또는 S이고, z2는 C 또는 N이고, Z3은 D, E 또는 Y이고, z4는 C, A, S 또는 V이고, z5는 G, V 또는 S이고, z6은 d 또는 없음이고, z7은 C 또는 없음이고, z8은 F, R, V 또는 A이고, z9는 C, D, N 또는 E이다. 더욱 바람직하게는, z0이 없음이면, 또한 z6 및 z7 둘 모두가 없음을 나타낸다.
더욱 바람직하게는, 서열 Z/삽입물은 서열번호: 8 - 12로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%, 가장 바람직하게는 100 % 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기로 이루어진다. 서열 Z/삽입물이 상기 식들 중 어느 하나로 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 상기로 이루어지고 서열번호: 8 - 12로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다.
포유동물 세포에서, 정확한 화학량론에서 3개의 AAV 캡시드 단백질 (VP1, VP2 및 VP3)의 발현은 2개의 스플라이스 수용체 부위의 대안적 이용 그리고 곤충 세포에 의해 정확하게 재생산되지 않는 VP2에 대한 ACG 개시 코돈의 차선적 이용의 조합에 의존한다. 올바른 화학량론은 AAV 입자의 감염성에 중요하다. 올바른 화학량론으로 곤충 세포에서 3개의 AAV 캡시드 단백질을 생산하기 위해, 스플라이싱 요구 없이 모두 3개의 VP 단백질을 발현할 수 있는 단일 폴리시스트론성 메신저로 전사되는 작제물을 사용하는 것이 당업계에 공통이다. 이를 달성하기 위해, VP1 단백질은 ATG 대신에 차선적 번역 개시 코돈의 제어 하에 있을 수 있다. 이러한 차선적 번역 개시 코돈의 예는 ACG, TTG, CTG 및 GTG이다 (Urabe 등 (2002) Human Gene Therapy 13: 1935-1943; US 20030148506; US 20040197895; WO 2007/046703). 대안적으로, 곤충 세포내 rAAV의 생산에서 핵산 카세트는 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있으며, 여기에서 이들 단백질은 유럽 특허 번호 2,061,891 B1에 기재된 바와 같이 중첩 개방형 해독틀 (ORF)를 포함하는 핵산 서열에 의해 인코딩되고, 여기에서 VP2 ACG 개시 코돈에 앞서 프로모터를 포함하는 인트론을 포함하는 VP 발현 카세트가 개시된다. 본 발명의 변형된 캡시드 단백질은 VP1 캡시드 단백질의 단백질 서열과 관련하여 정의된다. 그러나, 서열 Z/삽입물이 VP1 단백질의 C-말단부에 위치하므로, 또한 VP2 및 VP3 단백질이 서열 Z/삽입물을 포함하고 따라서 (예를 들어 곤충 세포 또는 포유동물 세포에서와 같은, rAAV의 생산 방법에 관계 없이) 변형되는 것이 본 발명에서 포함된다.
대안적으로, 또는 또 다른 구현예와 조합하여, 본 발명의 추가 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 변형된 캡시드 단백질은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 상기로 이루어진다: i) 서열번호: 1을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 1의 위치 588 - 602에서 아미노산이 서열번호: 11과 적어도 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열, ii) 서열번호: 2를 갖는 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 2의 위치 585 - 599에서 아미노산이 서열번호: 10과 적어도 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열, iii) 서열번호: 3을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 3의 위치 587 - 601에서 아미노산이 서열번호: 9와 적어도 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열, iv) 서열번호: 4를 갖는 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 4의 위치 586 - 600에서 아미노산이 서열번호: 8과 적어도 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열, v) 서열번호: 5를 갖는 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 5의 위치 588 - 602에서 아미노산이 서열번호: 9와 적어도 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열, vi) 서열번호: 6을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 6의 위치 588 - 602에서 아미노산이 서열번호: 8과 적어도 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열, 그리고 vii) 서열번호: 7을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 7의 위치 587 - 601에서 아미노산이 서열번호: 12와 적어도 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열. 바람직하게는, 삽입물이 포함되는 프레임워크 AAV 캡시드 단백질은 야생형 AAV 캡시드의 아미노산 서열, 예컨대 예를 들어 AAV5, AAV1, AAV2, AAV7, AAV9, AAVrh10 또는 AAVDJ의 아미노산 서열, 또는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 삽입물이 포함되는 프레임워크 AAV 캡시드 단백질은 wtAAV5 캡시드의 아미노산 서열 또는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
"서열 동일성"은, 서열을 비교함으로써 결정된 때, 2개 이상의 아미노산 (폴리펩티드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산 (폴리뉴클레오티드) 서열 사이의 관계로서 본원에 정의된다. 바람직한 구현예에서, 서열 동일성은 2개의 주어진 서열번호의 전장 또는 그의 일부에 근거하여 계산된다. 그의 일부는 바람직하게는 두 서열번호의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 이상, 90%, 또는 100%를 의미한다. 당해 분야에서, "동일성"은 또한, 이러한 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정된 바와 같이, 경우일 수 있는 것처럼, 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 주어진 서열번호와의 동일성 또는 유사성은 상기 서열의 전장에 근거하여 (즉, 그것의 전장에 걸쳐 또는 전체적으로) 동일성 또는 유사성을 의미한다.
2개의 아미노산 서열 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 대체물을 제 2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성" 또는 "유사성"은, 비제한적으로, (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo H. and Lipman, D., SIAM, J. Applied Math., 48:1073 (1988))에 기재된 것을 포함하는, 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다.
동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 공적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에서 법제화된다. 2개의 서열 간의 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은, 예를 들면, GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., 등, Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Atschul, S. F. 등, J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990))을 포함한다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원 (BLAST Manual, Altschul, S., 등, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. 등, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))으로부터 공적으로 이용가능하다. 잘 알려진 스미스 워터만 (Smith Waterman) 알고리즘은 동일성을 결정하는데 이용될 수도 있다.
폴리펩티드 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음 알고리즘을 포함한다: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Comparison matrix: BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992); 갭 패널티: 12; 및 갭 길이 패널티: 4. 이러한 프로그램은 위스콘신주 매디슨에 위치한 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group)으로부터 "Ogap" 프로그램으로서 공적으로 이용가능하다. 상기언급된 파라미터는 (단부 갭에 대한 불이익 없이) 아미노산 비교에 대한 디폴트 파라미터이다.
핵산 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음 알고리즘을 포함한다: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); 비교 매트릭스: 매치=+10, 미스매치=0; 갭 페널티: 50; 갭 길이 페널티: 3. 위스콘신주 매디슨에 위치한, 제네틱스 컴퓨터 그룹에서 Gap 프로그램으로서 이용가능 (www.biology.wustl.edu/gcg/gap). 핵산 비교를 위한 디폴트 파라미터는 상기 주어진다.
임의로, 아미노산 유사성의 정도를 결정할 때, 당업자는, 당업자에게 명백할 바와 같이, 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수도 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 호환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 하기이다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는 개시된 서열 중 적어도 하나의 잔기가 제거되고 상이한 잔기가 그 자리에 삽입된 것들이다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 보존적이다. 자연 발생 아미노산의 각각에 대한 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 Ser로; Arg에서 Lys로; Asn에서 Gln 또는 His로; Asp에서 Glu로; Cys에서 Ser 또는 Ala로; Gln에서 Asn으로; Glu에서 Asp로; Gly에서 Pro로; His에서 Asn 또는 Gln으로; Ile에서 Leu 또는 Val로; Leu에서 Ile 또는 Val로; Lys에서 Arg로; Gln 또는 Glu; Met에서 Leu 또는 Ile로; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr로; Ser에서 Thr로; Thr에서 Ser로; Trp에서 Tyr로; Tyr에서 Trp 또는 Phe로; 그리고, Val에서 Ile 또는 Leu로.
대안적으로, 또는 또 다른 구현예와 조합하여, 본 발명의 추가 바람직한 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열 번호:1 -7로 이루어지는 군으로부터, 더욱 바람직하게는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 6 및 7로 이루어지는 군으로부터, 더더욱 바람직하게는 서열번호: 3, 4 및 6으로 이루어지는 군으로부터, 더욱더 바람직하게는 서열번호: 4 및 6으로 이루어진 군으로부터, 가장 바람직하게는 서열번호:4로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 상기로 이루어진다.
기능성 ITR 서열은 rAAV 비리온의 복제화, 구조 및 패키징에 필요하다. ITR 서열은 야생형 서열일 수 있거나 또는 야생형 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있거나, 또는 이들이 기능적으로 유지되는 한, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 돌연변이, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 이 맥락에서, 기능성은 게놈을 캡시드 쉘에 직접 패키징한 다음 숙주 세포에서의 발현이 형질도입되거나 표적 세포로 되는 능력을 의미한다. 전형적으로, 야생형 AAV 게놈의 ITR은 rAAV-벡터에서 유지된다. ITR은 AAV 바이러스 게놈으로부터 클로닝될 수 있거나 AAV ITR을 포함하는 벡터로부터 절제될 수 있다. ITR 뉴클레오티드 서열은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 본원에 정의된 바와 같이 이식유전자의 어느 한쪽 단부에 결찰될 수 있거나, ITR 사이의 야생형 AAV 서열은 원하는 뉴클레오티드 서열로 대체될 수 있다. rAAV-벡터는 바람직하게는 AAV 혈청형들 중 하나의 ITR 영역의 적어도 뉴클레오티드 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열, 그리고 두 ITR 사이에 삽입된 (적당한 조절 요소의 제어 하에서) 치료 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 현재 사용된 rAAV-벡터의 대부분은 AAV 혈청형 2로부터의 ITR 서열을 사용한다. rAAV-벡터에 존재하는 가장 바람직한 ITR은 AAV2 혈청형이다. 다른 바람직한 ITR은 AAV1, AAV3, AAV5 또는 AAV6 혈청형이다 (Grimm 등 (2006) J Virol) 80(1):426-439). rAAV 게놈은 단일 가닥 또는 이중 가닥 (자기-상보적) DNA를 포함할 수 있다. 단일 가닥 핵산 분자는, 두 극성 모두가 AAV 캡시드로 동일하게 패키징할 수 있기 때문에, 센스 또는 안티센스 가닥이다. 단일 가닥 rAAV-벡터는 야생형 AAV 혈청형 2 (AAV2) ITR 서열을 이용할 수 있고, 이중 가닥 (자기-상보적) rAAV-벡터는 변형된 버전의 ITR을 이용할 수 있다. 대안적으로, 일 구현예에서, 이중 가닥 벡터는 하나의 ITR을 포함하고, ITR은 AAV4로부터 유래된다. rAAV-벡터는 예를 들어 항생제 내성 유전자를 인코딩하는 유전자, 형광 단백질 (예를 들어, gfp) 또는 당 업계에서 공지된 화학적으로, 효소적으로 또는 달리 검출가능한 및/또는 선택가능한 산물 (예를 들면, lacZ, 알칼리성 포스파타제 (AP), SEAP, Luc, Neo, Bla 등)을 인코딩하는 유전자와 같은, 마커 또는 리포터 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
AAV 혈청형 캡시드 및 AAV 게놈 ITR의 임의의 가능한 조합을 포함하는, rAAV-벡터는, 당 업계에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 포유동물 rAAV 생산 시스템 또는 곤충 세포 rAAV 생산 시스템을 사용하여 생산된다. 당 업계에 공지된 방법은 예를 들어 Pan 등 (J. of Virology (1999) 73: 3410-3417), Clark 등 (Human Gene Therapy (1999) 10: 1031-1039), Wang 등 (Methods Mol. Biol. (2011) 807: 361-404), Grimm (Methods (2002) 28(2): 146-157), 그리고 Urabe 등 (Human Gene Therapy (2002) 13:1935-1943)에 근거한 곤충 세포 시스템, Kohlbrenner 등 (Molecular Therapy (2005) 12(6):1217-1225), 국제 특허 공개 WO 2007/046703, 국제 특허 공개 WO 2007/148971, 국제 특허 공개 WO 2009/014445, 국제 특허 공개 WO 2009/104964, 국제 특허 공개 WO 2009/154452, 국제 특허 공개 WO 2011/112089, 국제 특허 공개 WO 2013/036118, 미국 특허 번호 6,723,551 B에서 기재되고, 이들은 본원에 참고로 편입된다. 요컨대, 본 방법은 일반적으로 (a) rAAV 게놈 작제물을 숙주 세포 내로 도입하는 단계, (b) AAV 헬퍼 작제물을 숙주 세포 내로 도입하는 단계로서, 상기 헬퍼 작제물이 야생형 rAAV 게놈에서 빠진 바이러스 기능을 포함하는, 단계 및 (c) 헬퍼 바이러스 작제물을 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. rAAV 게놈의 rAAV 벡터로의 복제화 및 패키징을 달성하기 위해, rAAV 벡터 복제화 및 패키징을 위한 모든 기능은 존재해야 한다. 숙주 세포로의 도입은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수행될 수 있으며 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 마지막으로, 숙주 세포는 배양되어 rAAV 벡터를 생산한 다음, CsCl 구배 (Xiao 등 1996, J. Virol. 70: 8098-8108) 또는 요오딕사놀 정제와 같은 표준 기술을 사용하여 정제된다. 이어서, 정제된 rAAV 벡터는 전형적으로 본 방법에 사용할 준비가 된다. 1012 초과 입자/ml의 높은 역가 및 고순도 (검출가능한 헬퍼 및 야생형 바이러스가 없음)은 달성될 수 있다 (참고 예를 들어 Clark 등 상기 및 Flotte 등 1995, Gene Ther. 2: 29-37). ITR 영역 사이의 rAAV 벡터에 삽입된 이식유전자의 총 크기는 일반적으로 크기가 5 킬로베이스 (kb)보다 작다.
본 발명의 맥락에서 캡시드 단백질 쉘은, (i) 관심의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 (ii) 적어도 하나의 AAV ITR 서열을 포함하는, rAAV 게놈과 상이한 혈청형일 수 있다. 따라서 본 발명의 rAAV-게놈은 본 발명의 캡시드 단백질 쉘에 의해 캡시드화될 수 있는, 즉 본 발명에 따른 캡시드 단백질 (VP1, VP2, 및/또는 VP3)을 포함하는 20면체 캡시드, 예를 들면, 본 발명에 따른 AAV 캡시드 단백질의 돌연변이체가 될 수 있는 반면, 그 rAAV-벡터에 함유된 ITR 서열은, 예를 들어 AAV2 또는 AAV5를 포함하는, 상기 기재된 AAV 혈청형 중 임의의 것일 수 있다. 일 구현예에서, rAAV 비리온에 존재하는 rAAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 2 또는 AAV 혈청형 5 또는 AAV 혈청형 8로부터 유래된다. AAV5 및 다른 AAV 혈청형의 완전한 게놈은 서열분석되었고 (Chiorini 등 1999, J. Virology Vol. 73, No.2, p1309-1319) AAV5의 뉴클레오티드 서열은 GenBank (수탁 번호 AF085716)에서 이용가능하다. AAV2 및 AAV5의 ITR 뉴클레오티드 서열은 따라서 당업자에게 쉽게 이용가능하다. AAV2의 완전한 게놈은 NCBI (NCBI Reference Sequence NC_001401.2)에서 이용가능하다. 이들은, 예를 들면 Applied Biosystems Inc. (Fosters, CA, USA)에 의해 또는 표준 분자 생물학 기술에 의해 제공된 경우 예를 들어 올리고뉴클레오티드 신디사이저를 사용하여, 당 업계에 알려진 바와 같이 화학 합성에 의해 만들어질 수 있거나 클로닝될 수 있다.
대안적으로, 또는 또 다른 구현예와 조합하여, 본 발명의 추가 바람직한 구현예에서, rAAV 벡터는 관심의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "이식유전자" 또는 "관심의 유전자 산물"은 본원에서 호환적으로 사용되며 AAV 핵산 서열과 관련하여 비-천연 핵산을 지칭한다. 이들은 세포 또는 유기체에 도입될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는데 사용된다. 관심의 유전자 산물은 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자, 억제성 폴리뉴클레오티드로 전사되는 폴리뉴클레오티드, 또는 전사되지 않는 (예를 들면, 발현 조절 요소, 예컨대 전사를 구동시키는 프로모터가 없는) 폴리뉴클레오티드와 같은, 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 관심의 유전자 산물은 각각 상이하거나 상이한 치료 분자를 인코딩하는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 적어도 2개의 상이한 뉴클레오티드 서열은 IRES (내부 리보솜 진입 부위) 요소에 의해 연결되어, 단일 프로모터의 제어 하에서 바이시스트론성 전사체를 제공할 수 있다. 적합한 IRES 요소는 예를 들면 Hsieh 등 (1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 214:910-917)에서 기재된다. 또한, 상이한 (치료적) 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 적어도 2개의 상이한 뉴클레오티드 서열은 바이러스 2A 서열에 의해 연결되어 단일 프로모터로부터 두 이식유전자의 효율적인 발현을 허용할 수 있다. 2A 서열의 예는 구제역 질환 바이러스, 말 비염 A 바이러스, 토세아 아시그나 (Thosea asigna) 바이러스 및 돼지 테스코바이러스 (teschovirus)-1 (Kim 등, PLoS One (2011) 6(4): e18556)로부터의 것들을 포함한다. 관심의 유전자 산물은 바람직하게는 rAAV 게놈 내에 또는 ITR 서열 사이에 삽입된다. 관심의 유전자 산물은 또한 코딩 서열 및 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 또는 전사 조절 서열과 같은 발현 조절 요소를 포함하는 발현 작제물일 수 있다. 관심의 유전자 산물은 결함이 있는 것을 대체하거나 보충하는 기능성 돌연변이체 대립유전자일 수 있다. 유전자 요법은 또한 사실상 억제성인, 즉 바람직하지 않거나 비정상적인 (예를 들면, 병원성) 유전자 또는 단백질과 같은, 내인성 또는 외인성 유전자 또는 단백질의 발현, 활성 또는 기능을 억제, 감소 또는 축소시키는 이식유전자의 삽입을 포함한다. 이러한 이식유전자는 외인성일 수 있다. 외인성 분자 또는 서열은 치료받아야 하는 세포, 조직 및/또는 개체에서 정상적으로 발생하지 않는 분자 또는 서열인 것으로 이해된다. 후천성 및 선천성 질환 모두는 유전자 요법이 가능하다.
"유전자" 또는 "코딩 서열"은 특정 단백질을 "인코딩하는" DNA 또는 RNA 영역을 지칭한다. 코딩 서열은 프로모터와 같은 적절한 조절 영역의 제어 하에 놓일 때 폴리펩티드로 전사되고 (DNA) 번역된다 (RNA). 유전자는, 폴리아데닐화 부위 또는 신호 서열을 포함하는, 프로모터, 5' 리더 서열, 인트론, 코딩 서열 및 3' 비-번역 서열과 같은 여러 작동가능하게 연결된 단편을 포함할 수 있다. 키메라 또는 재조합 유전자는 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 유전자, 예컨대 예를 들어 프로모터가 전사된 DNA 영역의 일부 또는 전부와 사실상 관련되지 않는 유전자이다. "유전자의 발현"은 유전자가 RNA로 전사되고/거나 활성 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터" 또는 "전사 조절 서열"은 하나 이상의 코딩 서열의 전사를 제어하는 기능을 하며, 코딩 서열의 전사 개시 부위의 전사 방향과 관련하여 상류에 위치하고, 전사 인자 결합 부위, 억제자 및 활성화제 단백질 결합 부위, 그리고 프로모터로부터의 전사량을 조절하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 것으로 당업자에게 공지된 뉴클레오티드의 임의의 다른 서열을, 비제한적으로 포함하는, DNA-의존적 RNA 폴리머라제용 결합 부위, 전사 개시 부위 및 임의의 다른 DNA 서열의 존재에 의해 구조적으로 확인되는 핵산 단편을 지칭한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발달 조건 하에 대부분의 조직에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 예를 들면 화학 유도제의 적용에 의해 생리학적으로 또는 발달적으로 조절되는 프로모터이다. 바람직한 유도성 프로모터는 염증시 유도성인 NF-κB 반응성 프로모터이다. "조직 특이적" 프로모터는 특정 유형의 조직 또는 세포에서 우선적으로 활성이다. 적절한 프로모터 서열의 선택은 일반적으로 DNA 세그먼트의 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 의존한다. 본 발명의 rAAV 및/또는 이식유전자 내에서 바람직한 프로모터 서열은 내막 대식세포에서와 같은 류마티스성 활막의 세포에서 및/또는 비제한적으로 T-세포와 같은 FLS 및/또는 다른 활막 세포에서 발현을 제공하는 프로모터이다. 바람직한 프로모터는 예를 들어 CMV 프로모터, IL-6 유전자의 프로모터, SV40 프로모터와 같은 활막 세포에서 발현되는 것으로 알려진 유전자의 프로모터, 또는 당업자에 의해 용이하게 결정된 경우, 본원에서 또는 다른 곳에서 앞서 확인된 바와 같은 NF-κB 유도성 프로모터이다. 대안적으로, 이식유전자는 효율적인 전신 발현을 허용하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 적합한 프로모터 서열은 CMV 프로모터, CBA (치킨 베타-액틴), 또는 간-특이적 프로모터 예컨대 인간 알파-1 항-트립신 (hAAT) 또는 TBG (티록신-결합 글로불린)이다. 바람직하게는, rAAV 및/또는 이식유전자 내의 프로모터는 스테로이드-유도성 프로모터가 아니다. 더욱 바람직하게는, rAAV 및/또는 이식유전자 내의 프로모터는 덱사메타손-유도성 프로모터가 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 기능적 관계에서 폴리뉴클레오티드 (또는 폴리펩티드) 요소의 연결을 지칭한다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들면, 코딩 서열의 전사에 영향을 주면, 전사 조절 서열은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 전형적으로 인접하고, 필요한 경우 2 개의 단백질-인코딩 영역을 연결하기 위해, 인접하고 해독틀에 있음을 의미한다.
"관심의 유전자 산물"은 개체에게 유익한 효과를 가질 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질로서 본원에서 이해되는 "치료 폴리펩티드" 또는 "치료 단백질"일 수 있으며, 바람직하게는 상기 개체는 인간이고, 더욱 바람직하게는 상기 인간은 질환을 앓고 있다. 이러한 치료 폴리펩티드는, 비제한적으로, 효소, 보조-인자, 사이토카인, 항체, 성장 인자, 호르몬 및 항-염증성 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 또는 또 다른 구현예와 조합하여, 본 발명의 추가 바람직한 구현예에서, 관심의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 2개의 AAV ITR 서열 사이에 위치한다. 대안적으로 말하면, 관심의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 2개의 AAV ITR 서열, 즉 관심의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 어느 한쪽 단부에 하나의 ITR에 의해 측접된다.
대안적으로, 또는 또 다른 구현예와 조합하여, 본 발명의 추가 바람직한 구현예에서, 관심의 유전자 산물은 관절염 질환과 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나 억제하고, 여기서 바람직하게는 상기 관심의 유전자 산물은 인터류킨, 면역-조절제, 항체, shRNA, miRNA, 성장 인자, 프로테아제, 뉴클레오티다제/뉴클레오시다제, 펩티드, 프로테아제 억제제, 억제제, 효소 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 상기 관심의 유전자 산물은 CD39, CD73 및 IFN-β 중 적어도 하나이다. 이들의 예는 하기이다: 인터류킨1 (IL-1) 억제제 (예를 들면 아나킨라(anakinra), 카나키누맙(canakinumab), 릴로나셉트(rilonacept)), 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 억제제 (예를 들면 에타너셉트(etanercept), 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab), 세틸리주맙 페골(certilizumab pegol), 골리무맙(golimumab)), IL-1 수용체 길항제, 가용성 IL-1 수용체, IL-17 억제제 (예를 들면 세쿠키누맙(secukinumab), 브로달루맙(brodalumab), 익세키주맙(ixekizumab), IL-12/IL-23 억제제 (우스테키누맙(ustekinumab), 리산키주맙(risankizumab), 구셀쿠맙(guselkumab), 틸드라키주맙(tildrakizumab)), T- 세포 공자극 억제제 (예를 들면 아바타셉트(abatacept)), B 세포 고갈제 및 억제제 (예를 들면 리툭시맙(rituximab), 벨리무맙(belimumab), 이아날루맙(ianalumab), 타발루맙(tabalumab)), IL-15 억제제 (예를 들면 AMG-714), IL-22 억제제 (예를 들면 페자쿠니맙(Fezakunimab)), GM-CSF 억제제 (렌질루맙(lenzilumab), 나밀루맙(namilumab)) 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-1), 섬유아세포-성장 인자 (FGF) (예를 들면 rhFGF-18/스프리퍼민(sprifermin)), 핵 인자 카파-B 리간드 (RANKL) 억제제의 수용체 활성화제 (예를 들면 데노수맙(denosumab)), 보체 5a 억제제 (예를 들면 C5aR-151), 골 형성 단백질 계열 구성원 (BMP), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β), 성장 분화 인자 계열 (GDF), 인터류킨-18 억제제 (예를 들면 타데키니그(Tadekinig) 알파/IL-18 결합 단백질), IL-2 억제제 (예를 들면 바실릭시맙(basiliximab), 다클리주맙(daclizumab)), 가용성 TNFα (sTNFα) 수용체 p55 또는 sTNFα 수용체 p75, IgG와 융합된 sTNFα 수용체, TNFα 수용체 p55의 억제제, sTNFα 수용체 p75의 억제제, 우성 음성 IκB-키나제 (dn-IKK-β), 인터류킨-4 (IL-4), 인터류킨-10 (IL-10) (F8IL10/데카빌(Dekavil)), 인터류킨-13 (IL-13), 인터페론 베타 (IFN-β), MMP 계열의 조직 억제제 (TIMP), 플라스미노겐-활성화제 억제제 (PAI), 세린 프로테아제 억제제 (세르핀), 신호 분자/전사 인자 (예를 들면 SMAD, Sox9, IkB), 세포외 매트릭스 성분 (예를 들면 콜라겐, 연골 올리고머 매트릭스 단백질 (COMP), 프로테오글리칸, 엘라스틴), 혈관활성 장 펩티드 (VIP), 분화 클러스터 39 (CD39) 및 분화 클러스터 73 (CD73), 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (SOD) 및 이들의 조합.
본 발명의 모든 구현예에서 사용하기 위한 기능성 게놈 편집 시스템은 당업자에게 공지되어 있고 하기를 포함한다: 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALENs, GAj 등 (2013) Trends Biotechnol.. 31(7):397-405), 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFNs, Gaj 등 (2013) 상기), 메가뉴클레아제 예컨대 I-SceI (Arnould 등 (2007) J Mol Biol 371(1):49-65; Takeuchi 등 (2011) PNAS USA 108(32):13077-13082), RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 시스템 예컨대 CRISPR/Cas (Mali 등 (2013) Nat methods 10(10):957-963; Mali 등 (2013) Nat Biotechnol 31(9):833-838; Cong 등 (2013) Science 339(6121):819-823) 및 CRISPR/Cpf1 (Zetsche 등 (2015) Cell 163(3):759-771), 삼중체-형성 분자, 합성 폴리아미드 및 디자이너 아연-핑거 단백질 (Uil 등 (2003) Nucleic Acids Res 31(21):6064-6078). 기능성 게놈 편집 시스템은 게놈의 원하는 위치에서 부위-특이적 이중 가닥 절단을 창출하는 뉴클레아제를 사용한다. 유도된 이중 가닥 절단은 비상동성 단부-결합 또는 상동성 재조합을 통해 복구된다. 결과적으로, 표적화된 돌연변이는 수득된다. (질환 또는 장애를 유발하는) 결함이 있는 유전자를 임의의 이들 방법에 의해 자연 위치에서 정상 대립유전자로 대체하는 것이 유리한 것은, 유전자의 작은 부분만을 변경해야 하는 경우 전체 코딩 서열 및 조절 서열이 rAAV 비리온에 포함되는 것이 요구되지 않기 때문이다. 부분적으로 대체된 유전자의 발현은 또한 비리온에 의해 운반되는 전체 유전자보다 정상 세포 생물학과 더 일치하는 것으로 생각된다. 선호하는 유전자 편집 시스템이 (CRISPR/Cpf1 및 CRISPR-Cas를 포함하는) CRISPR인 것은, 다른 방법보다 더 빠르고 더 저렴하기 때문이다. 주요 장점은 또한 CRISPR가 CRISPR 단일 가이드 RNA를 사용하여 상이한 DNA 서열을 표적으로 하기 위해 쉽게 용도변경될 수 있다는 것이다. 따라서, 대안적으로, 또는 또 다른 구현예와 조합하여, 본 발명의 추가 바람직한 구현예에서, rAAV 게놈은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: (i) 적어도 하나의 가이드 RNA (gRNA)를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 여기서 상기 가이드 RNA는 게놈에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열(들)에 실질적으로 상보성 - 바람직하게는 상보성 - 임; 및 (ii) 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 여기서 상기 뉴클레아제는 상기 가이드 RNA와 리보뉴클레아제 복합체를 형성하고, 여기서 상기 리보뉴클레아제 복합체는 게놈에서 부위-특이적 이중 가닥 DNA 절단을 만듬.
제 2 양태에서, 본 발명은 관절염 질환과 관련된 증상의 치료, 예방 또는 억제에서 사용하기 위한 rAAV 조성물에 관한 것으로, 여기서 상기 rAAV 조성물은 본 발명의 rAAV 비리온 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 가용화제, 충전제, 보존제 및/또는 부형제, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 가용화제, 충전제, 보존제 및/또는 부형제는 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000에서 찾아질 수 있다. 임의의 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 가용화제, 충전제, 보존제 및/또는 부형제는 본 조성물에 사용될 수 있다 (참고 예를 들면, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, 1997 년 4 월). 바람직한 약제학적 형태는 멸균 식염수, 덱스트로스 용액, 또는 완충 용액 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 멸균 유체와 조합될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 마이크로캐리어 비드와 같은 고체 담체는 사용될 수 있다.
약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균성이고 안정하다. 약제학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도를 수용하는데 적합한 다른 차원 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 그리고 액체 폴리에틸렌 글리콜, 기타 등등), 그리고 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅물, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 상기 조성물 중에 등장성 제제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함함으로써 발생될 수 있다. 파보바이러스 비리온은, 예를 들어, 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하여, 급속 방출로부터 화합물을 보호할 다른 담체 또는 서방형 중합체를 포함하는 조성물에서 볼루스로서 또는 제어 방출 제형으로 투여될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스테르, 폴리락트산 및 폴리락틱, 폴리글리콜산 공중합체(PLG)는 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체" 또는 "부형제"는 바람직하게는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제, 기타 등등을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약제학적으로 활성 물질을 위한 이러한 매체 및 제제의 사용은 당 업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매체 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 한, 본 발명의 약제학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
비경구 조성물을 투여의 용이함 및 투약량의 균일성을 위하여 투약량 단위 형태로 제형화하는 것이 유리할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "투약량 단위 형태"는 치료될 대상체를 위하여 일원화된 투약량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생산하도록 계산된 활성 화합물의 소정량을 함유한다. 본 발명의 투약량 단위 형태에 대한 명세는 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성되어야 할 특정 치료 효과에 의해, 그리고 개체의 병태 치료를 위하여 상기 활성 화합물의 배합 분야에 내재된 한계에 의해 지시될 수 있다.
보충적 활성 화합물은 또한 본 발명의 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 추가 치료제의 공동-투여에 대한 지침은 예를 들어 캐나다 약사 협회의 제약 및 전문 분야의 제요 (CPS)에서 찾을 수 있다.
일 구현예에서, rAAV 조성물은 비어있는 입자 (즉, 그렇게 rAAV 게놈을 포함하지 않는, 캡시드 단독 입자)를 추가로 포함한다. 따라서, 대안적으로, 또는 또 다른 구현예와 조합하여, 본 발명의 추가 구현예에서, 본 발명의 rAAV 조성물은 적어도 1:1, 더욱 바람직하게는 적어도 5:1, 더더욱 바람직하게는 적어도 10:1의 비어있는 캡시드 대 rAAV 비리온의 비로 비어있는 캡시드를 추가로 포함한다. rAAV 조성물은 상기 정의된 바와 같은 rAAV 비리온 및 예를 들어 본원에 참고로 편입되는 WO 2016/055437에 정의된, 그리고 Aalbers 등 (2017) Hum. Gene Ther. 28(2):168-178에 기재된 바와 같이 비어있는 캡시드를 포함할 수 있다. 비어있는 캡시드는 본 발명의 조성물의 rAAV-이식유전자 벡터와 비교하여 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형일 수 있다. 바람직하게는, 비어있는 캡시드는 rAAV 비리온과 동일한 혈청형이다. 이러한 rAAV 조성물 내에서, 비어있는 캡시드 및 rAAV 비리온의 캡시드는 본 발명의 변형된 캡시드 단백질, 바람직하게는 동일한 유형의 변형된 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 그러나, 비어있는 캡시드가 rAAV 비리온의 변형된 캡시드 단백질과 비교하여 상이한 혈청형을 갖거나 상이하게 변형된 캡시드 단백질 인 rAAV 조성물이 또한 포함된다. 비어있는 캡시드가 혈청형의 혼합물, 예컨대, 비제한적으로, AAV2 및 AAV5 캡시드의 혼합물을 갖는 rAAV 조성물이 추가로 포함된다. 본 발명자들은 상당한 양의 비어있는 캡시드와 혼합된 rAAV-비리온의 관절내 투여 후 관절에서 이식유전자 발현의 증가 효과를 보고한다. 바람직하게는 rAAV-비리온 및 비어있는 캡시드는 적어도 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 50:1, 100:1, 또는 1000:1, 바람직하게는 적어도 5:1 (즉, rAAV-이식유전자 벡터 양의 적어도 5 배인 비어있는 캡시드의 양)의 비어있는 캡시드 대 rAAV-비리온의 비로 조성물 내에 존재한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 최대 10000:1, 5000:1, 4000:1, 3000:1, 2000:1, 1000:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 15:1, 10:1 또는 5:1, 바람직하게는 최대 1000:1의 비어있는 캡시드 대 rAAV-이식유전자 벡터의 비로 rAAV-비리온 및 비어있는 캡시드를 포함한다. 바람직하게는 상기 조성물은 1:1 내지 100:1, 2:1 내지 100:1, 5:1 내지 100:1, 1:1 내지 20:1, 2:1 내지 20:1 또는 바람직하게는 5:1 내지 20:1의 비어 캡시드 대 rAAV-비리온의 비로 rAAV-비리온 및 비어있는 캡시드를 포함한다.
rAAV-비리온 및 비어있는 캡시드가 단일 조성물로 존재하는 구현예가 상기 본원에 제공된다. rAAV-비리온 및 비어있는 캡시드가 (적어도 2 개 이상) 별도의, 구별되는 조성물로 존재하는 대안적 구현예가 또한 본 발명 내에 포함된다. 이 대안적 구현예에서, rAAV-비리온 및 비어있는 캡시드는 별도로 시간에 따라 (예를 들면, 순차적으로) 및/또는 국소화 투여될 수 있고, 여기서 국소화는 투여 부위로 이해되어야 한다. 또한, rAAV-비리온 및 비어있는 캡시드는, 예를 들면, 실질적으로 동일한 시점에서, 임의로 별도의 위치에서 동시에 투여될 수 있다.
제 3 양태에서, 본 발명은 관절염 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 또는 관절염 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 rAAV 조성물 및 면역억압제에 관한 것이고, 여기서 상기 rAAV 조성물은 상기 정의된 바와 같고 여기서 상기 치료 또는 예방은 개체에게 rAAV 조성물의 투여 및 면역억압제의 투여를 포함한다. 본원에 참고로 편입된, WO 2016/055437은 대상체가 면역억압제 및 rAAV-비리온 둘 모두로 치료받는 경우 AAV 이식유전자 발현에 대한 면역억압제의 증가 효과를 개시한다. 또한, WO 2016/055437은 rAAV 이식유전자 발현에 대한 비어있는 벡터와 함께 면역억압제의 놀라운 상승 효과를 개시한다. 일 구현예에서, 면역억압제는 rAAV 조성물과 별도로 적용되며, 별도는 위치 및/또는 시각에서 별도를 의미한다. 이와 같은 구현예에서, 면역억압제 및 rAAV 조성물은 별도의 및 구별되는 조성물로 존재할 수 있다. 면역억압제, rAAV-비리온 및 임의로 비어있는 벡터는 각각 별도의, 구별되는 조성물로 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 면역억압제 및 rAAV 조성물은 단일 조성물로 존재할 수 있다. 추가 구현예에서, rAAV-비리온 및 면역억압제는 단일 조성물로 존재하며, 바람직하게는 이 조성물은 비어있는 캡시드를 포함하는 별도의 조성물과 함께 치료에 사용된다. 더욱 추가 구현예에서, 면역억압제 및 비어있는 캡시드는 단일 조성물로 존재하고, 바람직하게는 이 조성물은 rAAV-비리온을 포함하는 별도의 조성물과 함께 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 비어있는 캡시드 및 면역억압제를 포함하는 조성물, 본원에 정의된 바와 같은 rAAV-비리온 및 면역억압제를 포함하는 조성물, 그리고 본원에 정의된 바와 같은 rAAV 조성물 및 면역억압제를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 면역억압제는 선천성 면역 세포 억제제, 바람직하게는 대식세포 억제제이다. 선천성 면역 세포는 이물질에 대한 염증 반응에 참여할 가능성이 있는 호중구, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호염기구 또는 수지상 세포로서 본원에 정의된다. 선천성 면역 세포 억제제는 선천성 면역 세포 활성 및/또는 선천적 면역 세포 수에서 감소를 초래하는 제제로서 본원에 정의된다. 대식세포 억제제는 대식세포 활성 및/또는 대식세포 수에서 감소를 초래하는 제제로서 본원에 정의된다. "대식세포"는 식세포작용이라 불리는 과정에서 세포 파편, 이물질, 미생물 및 암 세포를 삼키고 소화하는 선천성 면역 세포로서 본원에서 이해된다. 바람직하게는, 본 발명의 선천성 면역 세포 또는 대식세포 억제제는, 치료 전의 선천성 면역 세포 또는 대식세포의 초기 수 또는 활성과 비교하여 선천적 면역 세포 또는 대식세포의 수 또는 활성의 적어도 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95 %의 또는 100 %의 감소를 초래한다. 선천적 면역 세포 또는 대식세포 활성 및/또는 수는, Ferrari 등 (Journal of Immunological Methods, 131 (1990) 165-172)에 의해, 사이토카인 수준 (예를 들면, CCL2, TNF)의 측정에 의해, 조직학적 및 조직화학적 검출 방법에 의해, 예를 들어, CD68 표지화에 의해 또는 대식세포에 의한 초상자성 산화철 (SPIO) 흡수의 생체내 자기 공명 이미지화 (MRI) 검출에 의해 기재된 바와 같이, 바람직하게는 Yi-Xiang J. Wang (Quant. Imaging Med Surg (2011)1:35-40)에 의해 검토된 바와 같이 SPIO의 정맥내 투여 후, 비제한적으로, 시험관내 대식세포 세포독성 활성 시험용 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드) 비색 검정과 같은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 검정에 의해 검출될 수 있다. 검출은 어느 한쪽 시험관내 또는 생체내일 수 있다. 바람직하게는, 생체내 검출은 동물 모델, 바람직하게는 래트 또는 쥣과 모델에서 이루어진다.
바람직하게는, 면역억압제는 글루코코르티코이드 및/또는 비스포스포네이트, 바람직하게는 리포좀 비스포스포네이트이다. 글루코코르티코이드의 특정한 비-제한 예는 코르티솔, 코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 베타메타손, 트리암시놀론, 베클로메타손, 플루드로코르티손 아세테이트, 데옥시코르티코스테론 아세테이트 및 알도스테론이다. 바람직하게는, 면역억압제는 트리암시놀론이다. 비스포스포네이트의 특정한 비-제한 예는 에티드로네이트, 클로드론테, 틸루드로네이트, 파미드로네이트, 네리드로네이트, 올파드로네이트, 알렌드로네이트, 이반드로네이트, 리세드로네이트 및 졸레드로네이트이다. 바람직하게는, 비스포스포네이트는 리포좀-캡슐화된 비스포스포네이트 또는 리포좀 비스포스포네이트, 바람직하게는 리포좀 클로드로네이트이다. 바람직하게는, 글루코코르티코이드는 덱사메타손이 아니다. 본 발명의 염증성 또는 대식세포 억제제가 글루코코르티코이드 및/또는 비스포스포네이트에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 예를 들어, 본 발명의 염증성 또는 대식세포 억제제는 또한 염증성 또는 대식세포-고갈 항체 예컨대 항-F4/80 항체일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 항체는 인간 또는 인간화 된 항체이다. 본 발명에 사용되는 추가 관련 면역억압제는 세포증식억제 약물 (예 를 들면 알킬화제 및/또는 항대사 물질 예컨대 메토트렉세이트), 푸린성 신호전달 경로를 변형시키는 약물 (예를 들면 메토트렉세이트, 아데노신 유사체, 아데노신 수용체 길항제 또는 작용제), 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAIDS, 예를 들면 이부프로펜, 디클로페낙, 멜록시캄, 나프록센, 아세틸살리실산), 생물학적 제제 예컨대 TNF 차단제 (예를 들면 인플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙, 골리무맙), IL-6 차단제 (예를 들면 토실리주맙), IL-2 차단제 (예를 들면 바실릭시맙, 다클리주맙), IL-1β 차단제 (예를 들면 아나킨라, 릴로나셉트, 카나키누맙) IL-17 (세쿠키누맙, 브로달루맙, 익세키누맙), 항-IL-12/IL-23 (우스테키누맙), PDE4-억제제 (아프레밀라스트) 무로모납, 아바타셉트, 및/또는 리툭시맙, 및/또는 다른 화합물 예컨대 히드록시클로로퀸, 클로로퀸, 레플루노미드, 설파살라진, 아자 티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 금염, mTOR 억제제 (예를 들면 라파마이신/시롤리무스, 에베롤리무스) 및 페니실라민이다.
바람직하게는, rAAV 조성물 및/또는 비어있는 캡시드를 포함하는 조성물 및/또는 면역억압제를 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 가용화제, 충전제, 보존제 및/또는 본원의 다른 곳에 정의된 바와 같은 부형제를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 유전자 요법은, rAAV 조성물 내에 존재하거나, 별도의, 구별되는 조성물, 즉 rAAV 조성물과 별도이고 구별되는 조성물 내에 포함된, 본원에 정의된 바와 같은 면역억압제의 투여를 추가로 포함한다. 투여시, 본 발명의 rAAV 조성물 및/또는 비어있는 캡시드 및/또는 면역억압제는 개체, 상기 개체의 세포, 조직 또는 기관, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 병태 또는 질환을 앓고 있는 개체에게 전달된다. 바람직하게는, rAAV 조성물 및 면역억압제는 동시에 투여된다. 동시 투여는 본원에서 거의 동시에, 바람직하게는 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 12 시간 또는 24 시간 이상 분리되지 않는 시간에, 바람직하게는 15 분 이상 분리되지 않는 시간에 투여하는 것으로 이해되어야 한다. 또 다른 구현예에서, rAAV 조성물 및 면역억압제는 순차적으로 투여되며, 여기서 바람직하게는 면역억압제는 rAAV 조성물에 앞서 투여된다. 바람직하게는, 면역억압제는 rAAV 조성물의 투여의 적어도 1 시간, 3 시간, 12 시간, 24 시간, 2 일, 4 일 또는 1 주일 전에 투여된다. rAAV-비리온 및 비어있는 캡시드가 별도의 조성물로 존재하는 경우, 면역억압제는 동시에 또는 비어있는 캡시드에 앞서 적어도 15 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 1 일, 2 일 또는 1 주 내에 투여될 수 있고 비어있는 캡시드는 차례로 동시에 또는 rAAV-비리온에 앞서 적어도 15 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 1 일, 2 일 또는 3 일 내에 투여된다.
본원에 정의된 구현예 내에서, 면역억압제는 반복적으로, 즉 rAAV 조성물에 앞서 및/또는 이와 동시에 투여될 수 있다. 상기 본원에 나타낸 바와 같이, 바람직하게는 rAAV 조성물은 상당한 양의 비어있는 캡시드를 포함한다. 또한, 본 발명은 rAAV-이식유전자 벡터 및 비어있는 캡시드를 별도의, 구별되는 조성물로 투여하는 것을 포함하며, 이는 본 발명의 방법 또는 용도에서 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 별도의 조성물로 포함되는 경우, rAAV-이식유전자 벡터 및 비어있는 캡시드는 바람직하게 동시에 투여된다. 추가 구현예에서, 비어있는 캡시드는 rAAV-이식유전자 벡터 투여에 앞서 최대 3 일, 2 일, 1 일, 24 시간, 12 시간, 3 시간, 2 시간, 1 시간, 30 분, 15 분 또는 5 분, 바람직하게는 최대 24 시간 투여된다. 또한, 별도의 조성물로 포함되는 경우, rAAV-이식유전자 벡터 및 비어있는 캡시드는 바람직하게는 동일한 부위에 투여된다.
면역억압제 용량은 면역억압제의 유형에 의존한다. 효과적 투약량은 당업자에게 공지되어 있다. 트리암시놀론의 바람직한 치료 효과적 투약량은 상기에 표시되어 있다. 리포좀 클로드로네이트의 바람직한 치료 효과적 투약량은 바람직하게는 당업자에게 공지된 바와 같이 치료적 유효 용량, 예를 들면 바람직하게는 80-320 mg/관절내 용량, 더욱 바람직하게는 160 mg/관절내 용량이다 (Barrera 등 2000, Arthritis & Rheumatism Vol 43(9), p1951-1959).
일반적으로, 관절 장애는 관절증으로 지칭되고, 하나 이상의 관절의 염증을 수반할 때 장애는 관절염으로 지칭된다. 대부분의 관절 장애는 관절염을 수반하지만 외부 신체 외상으로 인한 관절 손상은 전형적으로 관절염이라고 하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, "관절염"으로도 지칭된, 용어 "관절염 질환"은 하나 이상의 관절의 염증을 수반하는 관절 장애의 한 형태로서 정의된다. 현재, 백 가지가 넘는 관절염의 상이한 형태가 있다고 추정된다. 관절염 질환은 "관절 통증" 또는 "관절 질환"을 지칭하는 것으로서 본원에서 이해된다. 바람직한 구현예에서, 관절염 질환은 성인형 스틸병, 강직성 척추염, 관절염, 요통, 베체트병, 둔기 외상, 활막낭염, 칼슘 피로포스페이트 침착 질환 (CPPD), 수근관 증후군, 슬개골 연골연화증, 만성 피로 증후군, 복합 국부 통증 증후군, 크리오피린-관련 주기성 증후군 (CAPS), 퇴행성 디스크 질환, 발달성 고관절 이형성증, 엘러스-단로스 (Ehlers-Danlos), 가족성 지중해 열, 섬유근육통, 전염성 홍반, 거대 세포 동맥염, 통풍, 혈색소 침착, 전염성 관절염, 염증성 관절염, 염증성 장 질환, 관절 대체, 소아 관절염, 소아 피부염 (JD), 소아 특발성 관절염 (JIA), 소아 류마티스성 관절염, 소아 공막염, 가와사키병, 루푸스, 어린이 & 십대에서 루푸스, 라임병, 혼합 결합 조직 질환, 근육염 (다발성 근염, 피부 근염 포함), 골관절염 (OA), 골다공증, 파제트병, 재발성 류마티즘, 슬개대퇴 통증 증후군, 소아 류마티스 질환, 소아 SLE, 다발성 근육통 류마티스, 가성통풍, 건선성 관절염, 레이노병, 반응성 관절염, 반사성 교감성 이영양증, 라이터 증후군, 류마티스 열, 류머티즘, 류마티스성 관절염, 경피증, 패혈성 관절염, 쇼그렌병, 척추 협착증, 척추 관절염, 스틸병, 전신 소아 특발성 관절염, 전신 홍반 루프스, 어린이 & 십대에서 전신 홍반 루프스, 전신 경화증, 측두 동맥염, 건염, 혈관염 및 베게너 육아 종증으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가 바람직한 구현예에서 관절염 질환은 류마티스성 관절염 (RA), 소아 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염 (OA), 통풍, 가성통풍, 척추관절염 (SpA), 건선성 관절염, 강직성 척추염, 패혈성 관절염, 관절염, 소아 특발성 관절염, 둔기 외상, 관절 대체 및 스틸병으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 관절염 질환은 하나 이상의 관절의 염증을 수반하는 관절 장애이다. 바람직하게는, 관절염 질환은 류마티스성 관절염 (RA), 소아 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염 (OA), 통풍, 가성통풍, 척추관절염 (SpA), 건선성 관절염, 강직성 척추염, 패혈성 관절염, 관절염, 소아 특발성 관절염 및 스틸병으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
대안적으로, 또는 또 다른 구현예와 조합하여, 본 발명의 추가 바람직한 구현예에서, rAAV 비리온 또는 rAAV 조성물은 전신으로 및/또는 국소적으로 투여된다. 본 발명의 rAAV 조성물 및/또는 비어있는 캡시드 및/또는 면역억압제는 당 업계에 공지된 적합한 수단을 사용하여 직접적으로 또는 간접적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법 및 용도는 전신, 국부 또는 국소적으로, 또는 임의의 경로, 예를 들어 주사, 주입, 경구 (예를 들어, 섭취 또는 흡입), 또는 국소 (예를 들어, 경피)로 rAAV 조성물 및/또는 비어있는 벡터 및/또는 면역억압제의 전달 및 투여를 포함한다. 예시적인 투여 및 전달 경로는 정맥내 (i.v.), 관절내, 복강내 (i.p.), 동맥내, 근육내, 비경구, 피하, 흉부내, 국소, 경피, 피내, 경피, 비경구로, 예를 들면 경점막, 두개내, 척추내, 경구(영양), 점막, 호흡, 비강내, 삽관, 폐내, 폐내 주입, 협측, 설하, 혈관내, 척수강내, 공동내, 이온영동, 안내, 안과, 광학, 선내, 기관내, 림프내를 포함한다. 개체 또는 상기 개체의 세포, 조직, 기관에 본 발명의 rAAV 조성물 및/또는 비어있는 캡시드 및/또는 면역억압제를 제공하기 위한 수단의 개선은 이미 달성된 진행을 고려하여 예상된다. 이러한 미래의 개선은 물론 본 발명의 언급된 효과를 달성하기 위해 포함될 수 있다. 본 발명의 rAAV 조성물 및/또는 비어있는 캡시드 및/또는 면역억압제를 투여할 때, 이러한 조합 및/또는 조성물이 전달 방법에 적합한 용액에 용해되는 것이 바람직하다. 정맥내, 피하, 근육내, 척수강내, 관절내 및/또는 뇌실내 투여를 위하여 용액이 생리학적 염 용액인 것이 바람직하다. 면역억압제가 본 발명의 rAAV 조성물 내에 존재하는 경우, 면역억압제는 rAAV 조성물과 동일한 부위에, 즉 바람직하게는 상기 지시된 바와 같이 국소적으로 투여된다. 면역억압제가 rAAV 조성물과 구별되는 별도의 조성물 내에 포함되는 구현예에서, 면역억압제는 전신으로, 바람직하게는 근육내로 또는 정맥내로 투여될 수 있다. rAAV 조성물은 또한 국소적으로, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같이 실질적인 수의 대식세포를 포함하는 신체의 부위에 투여될 수 있고, 면역억압제는 전신으로, 바람직하게는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 면역억압제 및 rAAV 조성물이, 비록 구별되는 조성물로 존재하더라도, 동일한 부위에, 바람직하게는 국소적으로, 더욱 바람직하게는 관절내로 투여되는 구현예도 본 발명에 포함된다. 본원에 추가로 나타낸 바와 같이, 이러한 구별되는 조성물의 투여는 동시 또는 순차적일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, rAAV 조성물 및 면역억압제 중 적어도 하나는 국소적으로 투여된다. 더욱 바람직하게는, 국소 투여는 관절내 투여이다. ("관절 주사" 또는 "관절내 주사"로서도 공지된) "관절내 주사"는 본원에서 관절로의 주사 또는 주입으로서 정의된다. 관절내 주사는 전형적으로 염증에 의해 영향을 받는 관절에 항염증성 제제의 투여에 사용된다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 rAAV 비리온 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 가용화제, 충전제, 보존제 및/또는 부형제, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 rAAV 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 본원에 정의된 바와 같은 비어있는 캡시드 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 면역억압제를 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 관절염 질환과 관련된 증상의 치료, 예방, 또는 억제 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 방법은 청구범위 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 rAAV 비리온의 또는 상기 정의된 바와 같은 rAAV 조성물의 유효량을 포함하는 약제의 관절내 투여의 단계를 포함한다.
"치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 및 그러한 투약량에서 효과적인 양을 지칭한다. 핵산, 핵산 작제물, rAAV 비리온 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량은 치료될 대상체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 그리고 대상체에서 원하는 반응을 유도하기 위한 핵산, 핵산 작제물, rAAV 비리온 또는 약제학적 조성물의 능력에 따라 다양할 수 있다. 복용 계획은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 치료적 유효량은 또한 전형적으로 핵산, 핵산 작제물, rAAV 비리온 또는 약제학적 조성물의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료적으로 유익 효과보다 뛰어난 것이다. "예방용 유효량"은 원하는 예방 결과, 예컨대 다양한 병태의 예방 또는 억제를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 그러한 투약량에서, 유효한 양을 지칭한다. 예방용 용량은 질환 전에 또는 질환의 조기 상태에 대상체에서 사용될 수 있고, 예방용 유효량은 일부 경우에 치료적 유효량보다 더 많거나 더 적을 수 있다. 투여되는 투약량은 치료되는 대상체의 병태 및 크기 뿐만 아니라 치료 제형, 치료의 빈도 및 투여의 경로에 따라 크게 좌우될 수 있다. 용량, 제형 및 빈도를 포함하는, 지속적 요법을 위한 계획은 초기 반응 및 임상적 판단에 의해 안내될 수 있다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 본원에 호환적으로 사용되고, 본 발명의 조성물 및/또는 rAAV로 치료될 수 있는, 인간 종을 포함하는, 동물을 지칭한다. 따라서, 용어 "대상체" 또는 "환자"는, 비제한적으로, 인간, 비인간 영장류 예컨대 침팬지, 및 다른 유인원 및 원숭이 종, 또는 임의의 포유동물 예컨대 개, 고양이, 말, 양, 돼지, 소 등을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 rAAV로 치료된 대상체는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간, 개, 고양이 또는 말, 가장 바람직하게는 인간이다.
본 문서 및 청구범위에서, 동사 "포함하기 위한" 및 그 활용은 단어를 따르는 항목이 포함되지만, 구체적으로 언급되지 않은 항목은 배제되지 않는 것을 의미하는 이들의 비-제한적 의미로 사용된다. 또한, 부정 관사 "한" 또는 "하나"에 의한 요소에 대한 언급은, 문맥상 하나의 요소만 존재하도록 명백하게 요구하지 않는 한, 하나 초과의 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다. 부정 관사 "한" 또는 "하나"는 따라서 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
숫자 값 (약 10, 약 10)과 관련하여 사용될 때 "대략" 또는 "약"이라는 단어는 바람직하게는 상기 값의 10 % 내외를 더한 10의 주어진 값일 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고문헌은 본원에 그들의 전문이 참고로 포함된다.
하기 실시예는 오직 예시 목적을 위한 것이고, 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
도면의 설명
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 아래에서 더욱 상세히 논의될 것이다:
도 1: HEK293T 및 FLS 세포에서 캡시드 혈청형의 스크리닝. 황색 형광 단백질 (YFP)를 발현하는 7 개의 돌연변이체 캡시드 혈청형 (플러스 AAV5)를 함유하는 미정제 용해물은 (각각 상이한 RA 환자로부터) HEK293T 세포 또는 3 개의 상이한 FLS 세포주를 형질도입하는데 사용되었다. 72 시간 (HEK293T) 또는 6 일 (FLS) 후, 세포는 FLOW 세포측정에 의해 YFP를 발현시키는 세포의 백분율로 검정되었다. 패널 A는 YFP를 발현하는 HEK 293T 세포의 %를 나타내고; 패널 B는 3 개의 상이한 FLS 세포주에서 YFP-발현 세포의 %를 나타내고; 패널 C는 HEK293T 세포에서 평균 형광 강도 (MFI)를 나타내고; 패널 D는 3 개의 상이한 FLS 세포주 (모든 세포)에서 MFI를 나타내고; 패널 E는 3 개의 상이한 FLS 세포주 (양성 모집단만)에서 MFI를 보여준다. 샘플 범례는 표 2에 묘사된다.
도 2: 캡시드 돌연변이체는 FLS 세포에서 wt-AAV5에 비해 증가된 루시퍼라제 발현을 나타낸다. YFP-Luc 융합 단백질을 발현하는 정제된 AAV (4 개의 돌연변이체 혈청형 또는 AAV5)는 2 개의 MOI (세포 당 20000 또는 100000 rAAV 입자)를 사용하여 상이한 RA 환자로부터 3 개의 상이한 FLS 세포주: BB5498 (FLS 1), BB5540 (FLS 2) 및 BB7144 (FLS 3)을 형질도입하는데 사용되었다. 4 일 후, 세포는 용해되었고 루시퍼라제 발현은 측정되었다. 데이터는 절대 루시퍼라제 발현 수준 (RLU; 흰색 막대) 또는 AAV5에 대해 배수 증가 (검은 색 막대)로 제시된다. 패널 A는 MOI 20K에서 FLS 1을 나타내고; 패널 B는 MOI 100K에서 FLS 1을 나타내고; 패널 C는 MOI 20K에서 FLS 2를 나타내고; 패널 D는 MOI 100K에서 FLS 2를 나타내고; 패널 E는 MOI 20K에서 FLS 3을 나타내고; 패널 F는 MOI 100K에서 FLS 3을 나타낸다. 개방형 막대는 루시퍼라제 (RLU)를 나타내고 채워진 막대는 AAV5에 대해 "배수 증가"를 나타낸다. 다른 실험에서, RA 환자로부터의 3 개의 추가 FLS 세포주는 2 개의 MOI (세포 당 10K 또는 100K rAAV 입자)를 사용하여 루시퍼라제를 발현하는 AAV (7 개의 돌연변이체 혈청형 또는 AAV5)로 형질도입되었다: BB4308 (FLS 4), BX 1592 (FLS 5), BB4426 (FLS 6). 패널 G는 MOI 10K에서 FLS 4를 나타내고; 패널 H는 MOI 100K에서 FLS 4를 나타내고; 패널 I는 MOI 10K에서 FLS 5를 나타내고; 패널 J는 MOI 100K에서 FLS 5를 나타내고; 패널 K는 MOI 10K에서 FLS 6을 나타내고; 패널 L은 MOI 100K에서 FLS 3을 나타낸다.
7 개의 돌연변이체 혈청형 또는 AAV5 (MOI 100K)의 형질도입 효능은 또한 HEK293T 세포 (패널 M)에서 평가되었다. 개방형 막대는 루시퍼라제 발현 (RLU)를 나타내고 채워진 막대는 AAV5에 대해 "배수 증가"를 나타낸다.
도 3a: 캡시드 돌연변이체는 생체내 증가된 유전자 발현을 나타낸다. 2 개의 캡시드 돌연변이체 (AAV9-A2 및 AAV7-A6)은 에어 파우치 시노비움 모델을 사용하여 wtAAV5와 비교되었다. 루시퍼라제-발현 벡터는 에어 파우치 형성 이후 0 일째에 투여되었고 루시퍼라제 발현은 형질도입 이후 3 일째에 살아있는 동물 이미지화 (IVIS)에 의해 측정되었다. 표시된 데이터는 에어 파우치에 평균+SEM으로 발광 (광자/2번째/제곱 센티미터 m2/스테라디안)이다.
도 3b: 제 2 실험에서, 5 개의 선택된 캡시드 돌연변이체 (AAV1-P4, AAV7-A6, AAV9-A2, AAVrh10-A2, AAVrh10-A6) 및 wtAAV5는 마우스의 무릎 관절에 주사되었다. 루시퍼라제 발현 벡터는 0 일째에 주사되었고 투여 후 지시된 시점에 생 이미지화 (IVIS)에 의해 발현은 측정되었다. 표시된 데이터는 평균+SEM으로 발광 (광자/2번째/제곱 센티미터 m2/스테라디안)(좌측 패널)이다. 14 일째에 wtAAV5에 대해 **P<0.05, ***P<0.01, ****P<0.00001. 도 3c: wtAAV5에 대해 배수 증가.
도 4: MAFFT FFT-NS-I (v7.215)에 의한 CLUSTAL 형식 정렬. 정렬 아래에는 보존된 잔기 (*); 및 비-보존적 돌연변이 ()를 나타내는 핵심이 있다.
도 5: MUSCLE (3.8)에 의한 CLUSTAL 다중 서열 정렬. 정렬 아래에는 보존된 잔기 (*); 보존적 돌연변이 (:); 반-보존적 돌연변이 (.); 및 비-보존적 돌연변이 ( )를 나타내는 핵심이 있다.
도 6: MAFFT FFT-NS-I (v7.215)에 의한 삽입물 P4, A2, A6, P2 및 QR-P2 (서열 번호 8 - 12)의 CLUSTAL 형식 정렬. 정렬 아래에는 보존된 잔기 (*); 및 비-보존적 돌연변이 ()를 나타내는 핵심이 있다.
도 7: MUSCLE (3.8)에 의한 삽입물 P4, A2, A6, P2 및 QR-P2 (서열 번호 8-12)의 CLUSTAL 다중 서열 정렬. 정렬 아래에는 보존된 잔기 (*); 및 비-보존적 돌연변이 ()를 나타내는 핵심이 있다.
서열 목록
표 1은 서열 번호와 상관된 서열 참조의 설명을 제공한다.
Figure pct00001
실시예
실시예 1
캡시드 라이브러리의 초기 스크리닝
1.1. 물질 및 방법
91 개의 상이한 AAV 캡시드 혈청형으로부터 AAV를 함유하는 미정제 용해물로 스팟팅된 (그리고 이어서 건조된) 96-웰 플레이트는 하이델베르크 대학의 디르크 그림 (Dirk Grimm) 및 카틀린 뵈르너 (Kathleen Boerner)로부터 수득되었다. 각각의 벡터는 CMV 프로모터에 의해 구동된 YFP 이식유전자을 인코딩하였다. FLS가 관절에서 주요 표적 세포이므로, AAV 캡시드 돌연변이체 라이브러리는 (van de Sande MG 등, (2011) Ann Rheum Dis 70: 423-427에서 기재된 바와 같이) 류마티스성 관절염 환자 (RA-FLS)의 관절로부터 단리된 인간 FLS에서의 발현 증가를 나타내는 혈청형에 대하여 스크리닝되었다. RA-FLS는 직접적으로 스팟팅된 플레이트 (DMEM-GlutaMAX-I (Gibco, 레퍼런스31966-021), 10 % FBS (열 불활성화 (HI) Bovine Serum Gold, Gibco, 레퍼런스 A15-151)), 10mM HEPES (Gibco, 레퍼런스 15630-056), 50 μg/ml 젠타마이신 (Gibco, 레퍼런스15710-049), 100U/ml 페니실린/100μg/ml 스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich, 레퍼런스 P0781)에 플레이팅되었고 (2500/웰, 37 ℃/5% CO2) 모든 웰들은 6 일 후 형광 현미경법에 의해 YFP 발현에 대하여 시각화되었다.
1.2. 결과
RA 환자로부터 FLS에서 WT-AAV5에 대한 캡시드 돌연변이체의 형질도입 효능.
91 개의 캡시드 돌연변이체의 스크리닝에서, 전체 발현 수준은 낮았지만, 본 발명자들은 wtAAV5보다 더 높은 발현을 나타내는 하기 7 개의 상이한 혈청형을 확인하였다: AAV9-A2, AAV7-A6, AAV1-P4, AAVDJ-QR-P2, AAVrh10-A6, AAVrh10-A2 및 AAV2-P2 (아미노산 서열 서열번호: 1 - 7; wtAAV5 서열번호: 19).
7 개의 모든 벡터의 미정제 용해물은 3 개의 상이한 환자 FLS 세포주에서 그리고 HEK293T 세포에서 시험관내 형질도입 검정에 사용되었다 (실시예 2).
Figure pct00002
실시예 2
7 개의 선택된 돌연변이체의 미정제 용해물의 발현
2.1. 물질 및 방법
AAV 생산
미정제 AAV 용해물의 생산에 대한 세부사항은 Grosse 등 (J. Virol, 2017, doi: 10.1128/JVI.01198-17)에서 찾아질 수 있다.
선택된 7 개의 캡시드 돌연변이체 (플러스 대조군으로서 wtAAV5) 각각에 대한 미정제 용해물의 분취량은 세포 (RA 환자로부터 단리된 HEK293T 또는 3 개의 상이한 FLS 세포주)를 형질도입하는데 사용되었고 YFP 발현은 형질 도입 이후 3 (HEK293T) - 5 일 (FLS) 유세포측정법에 의해 측정되었다. 상세하게, HEK293T는 96-웰 플레이트 (Greiner Bio-One, 레퍼런스655180)에 45000 세포/웰로 씨딩되었다. RA-FLS는 96-웰 플레이트에 2500 세포/웰로 씨딩되었다. 밤새 인큐베이션 후, 세포 상청액은 0.001 % 플루로닉 F68 용액 (Sigma P5556)을 함유하는 40㎕의 DMEM-glutaMAX-1 (Gibco 31966-021)로 대체되었다. 바이러스 용해물은 2배로, 10 ㎕/웰 첨가되었다. 4 시간 후, FBS (열 불활성화 (HI) Bovine Serum Gold, Gibco, 레퍼런스 A15-151), 최종 농도 1%)를 함유하는 DMEM-glutaMAX-I에서 독소루비신 (최종 농도 0.4 μM) (Sigma D1515)는 웰에 첨가되었다 (50 ㎕/웰). 그 다음날, FLS의 배지는 제거되었고 DMEM-glutaMAX-I (10 % FBS (열 불활성화 (HI) Bovine Serum Gold, Gibco, 레퍼런스 A15-151), 10mM HEPES (Gibco, 레퍼런스 15630), 50 μg/ml 젠타마이신 (Gibco 레퍼런스 15710-049), 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich, 레퍼런스 P0781))은 첨가되었다 (200 ㎕/웰). HEK293T 세포의 배지는 변하지 않았다. 형질도입 3 일 (HEK293T 세포) 또는 6 일 (FLS) 후 세포는 PBS (Gibco, 레퍼런스 10010)에서 0.5 % 트립신/EDTA (Gibco 레퍼런스15400-054)를 사용하여 트립신처리되었고 FLOW 세포측정법 (FACSCanto II, BD Biosciences)에 의한 YFP 발현에 대하여 분석되었다. 모든 세포에 대한 평균 형광 강도 (MFI) 및 세포 발현의 백분율 모두는 결정되었다.
2.2. 결과
7 개의 모든 벡터의 미정제 용해물은 3 개의 상이한 환자 FLS 세포주에서 그리고 HEK293T 세포에서 시험관내 형질도입 검정에 사용되었다. 세포는 형광 현미경법 (데이터 미도시) 또는 FLOW 세포측정법 (도 1 패널 A-E)에 의해 YFP를 발현하는 세포의 백분율로 검정되었다. 세포 유형간에 약간의 가변성이 있었지만, 모든 돌연변이체 캡시드는 AAV5-WT보다 FLS 및 HEK293T 세포 둘 모두에서 더 높은 발현을 제공하였다 (도 1). 표 2는 도 1의 샘플 범례를 제공한다. 이들 결과에 기초하여, 4 개의 캡시드 돌연변이체는 추가 조사를 위하여 선택되었다 (실시예 3 참조).
실시예 3
HEK293T 및 FLS에서 캡시드 변이체의 시험관내 시험
3.1 물질 및 방법
3.1.1 4 개의 돌연변이체 캡시드 단백질인 AAV9-A2, AAV7-A6, AAV1-P4 및 AAVDJ-QR-P2는 추가로 조사되었다. (루시퍼라제 검정에 의한 정량화 뿐만 아니라 시각화 (YFP)를 가능하게 하기 위해) YFP-루시퍼라제 융합 단백질을 발현하는 정제된 벡터 (요오딕사놀 구배)는 생성되었다. (van de Sande MG 등, (2011) Ann Rheum Dis 70: 423-427에 기재된 바와 같이) 류마티스성 관절염 환자로부터 단리된 3 개의 상이한 1차 FLS 라인은 2 개의 벡터 용량 (MOI 20,000 또는 100,000)에서 각 혈청형으로 형질도입되었고 4 일 후, 세포는 수확되었고 유전자 발현은 루시퍼라제 검정 (프로메가 (Promega) 루시퍼라제 검정 키트)에 의해 정량화되었다.
상세하게, RA-FLS는 배지 (DMEM-GlutaMAX (Gibco 레퍼런스31966-021), 10 % FBS (열 불활성화 (HI) Bovine Serum Gold, 레퍼런스 A15-151), 10 mM HEPES (Gibco 레퍼런스 15630-056), 50 μg/ml 젠타마이신 (Gibco, 레퍼런스 15710-049), 100u/ml 페니실린/100μg/ml 스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich Merck 레퍼런스 P0781)내 96-웰 플레이트 (Greiner Bio-One, 레퍼런스655207)에서 2500 세포/웰로 플레이팅되었다. 48 시간 후, 배지는 제거되었고 (0.001 % 플루로닉-68을 함유하는 DMEM-Glutamax (Sigma, 레퍼런스 p5556)에서) 바이러스는 20,000 또는 100,000의 MOI로 첨가되었다. 4 시간 후, 독소루비신 (Sigma, 레퍼런스D1515, 최종 농도 0.4 μM) 및 FBS (최종 농도 1%)를 함유하는 배지는 첨가되었다.
24 시간 후, 배지는 DMEM-GlutaMAX (10 % FBS, 10 mM HEPES, 50 μg/ml 젠타마이신, 100u/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신)으로 대체되었다. 형질도입 4 일 후, 세포는 100 ㎕ PBS (Gibco, 레퍼런스 10010)으로 1 회 세정되었고 루시퍼라제 활성은 ONE GloTM 루시퍼라제 검정 시스템 (Promega, 레퍼런스E6110)을 사용하여 결정되었다: 100 ㎕ 용해 완충액은 첨가되었고 세포는 실온에서 10 ', 900 rpm 동안 진탕기에 배치되었다. 이어서, 20 ㎕의 용해물은 백색 96-웰 플레이트로 이동되었고, 80 ㎕의 기질은 3'(어둠) 동안 (첨가되었고 루시퍼라제 활성은 루미노미터 (1 초/웰, 시너지 HT, Biotek)에서 결정되었다.
3.1.2. 유사한 실험에서, 류마티스성 관절염 환자로부터 단리된 3 개의 추가 FLS 세포주는 루시퍼라제 유전자 (MOI 10,000 및 100,000)를 함유하는 3.1.1에서 기재된 것과 상이한 AAV 제제로부터 AAV5 및 7 개의 캡시드 돌연변이체 (AAV9-A2, AAV1-P4, AAV7-A6, AAVDJ-QR-P2, AAVrh10-A6, AAVrh10-A2, AAV2-P2)로 형질도입되었다. 비어있는 입자의 수는 AAV 제제간에 상이하였다. 형질도입 효능에 관한 가능한 효과를 배제하기 위해, 비어있는 캡시드 보정은 AAV5 비어있는 입자를 첨가하여 제제 당 비어있는 입자의 백분율을 균등화함으로써 수행되었다.
3.1.3. 3.1.2에 기재된 바와 동일한 제제로부터 7 개의 캡시드 돌연변이체는 HEK293T 세포에서 또한 시험되었다. 상세하게, HEK293T는 96-웰 플레이트 (Greiner Bio-One, 레퍼런스655180)에서 50000 개의 세포/웰로 씨딩되었다. 밤새 인큐베이션 후, 세포 상청액은 0.001% 플루로닉 F68 용액 (Sigma P5556)을 함유하는 DMEM-glutaMAX-I (Gibco 31966-021)로 대체되었다. 상이한 벡터는 100,000의 MOI에서 2중으로 첨가되었다. 이 프로토콜에서, 비어있는 캡시드 보정은 3.1.2로 기재된 바와 같이 실시되었다. 4 시간 후, DMEM-glutaMAX-I-함유 FBS (열 불활성화 (HI) Bovine Serum Gold, Gibco, 레퍼런스 A15-151), 최종 농도 1%에서 독소루비신 (최종 농도 0.4 μM) (Sigma D1515)는 웰에 첨가되었다. 형질도입 3 일 후, 세포는 수확되었고 유전자 발현은 루미노미터 (BMG Labtech Fluostar Omega)에서 루시퍼라제 검정 (프로메가 루시퍼라제 검정 키트)에 의해 정량화되었다.
3.2. 결과
3.2.1 3 개의 상이한 FLS 세포주의 시험관내 형질도입은 3.1.1에 기재된 프로토콜에 따라 4 개의 돌연변이체 캡시드들 중 하나 (뿐만 아니라 동일한 방식으로 제조된, 대조군으로서 AAV5)를 포함하는 재조합 AAV를 사용하여 수행되었다. 4 개의 혈청형 모두는 AAV5와 비교할 때 사용된 혈청형 및 세포주에 따라 2 배 내지 35 배 증가 범위에서 증가된 발현 수준을 나타냈다 (도 2a-f).
3.2.2 또 다른 일련의 실험에서, 7 개의 돌연변이체 캡시드 (뿐만 아니라 동일한 방식으로 제조된, AAV5 대조군)의 시험관내 형질도입 효능은 3 개의 FLS 세포주에서 평가되었다. 7 개의 혈청형 모두는 AAV5와 비교할 때 사용된 혈청형 및 세포주에 따라 6 배 내지 55 배 증가 범위에서 증가된 루시퍼라제 발현 수준을 나타냈다 (도 2g-l)
3.2.3 유사한 실험은 HEK293T 세포에서 수행되었다. 7 개의 혈청형 모두에 의한 형질도입은 wtAAV5와 비교하여 2 배 내지 12 배 증가된 범위의 루시퍼라제 발현을 향상시켰다 (도 2m).
실시예 4
에어 파우치 시노비움 모델의 생체내 연구
4. 1. 물질 및 방법
동물
암컷 Balb/c 마우스 (8-10 주령 및 체중 20-25 g; (Harlan, Boxmeer, 네덜란드))는 암스테르담 아카데믹 메디컬 센터 (Academic Medical Center)의 동물 시설의 개별 환기 케이지에 수용되었다. 음식 및 물은 마음대로 이용가능하였다. 모든 동물 실험은 암스테르담 대학교 동물 연구 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었다.
에어 파우치 시노비움 (APS) 모델
2 개의 혈청형, AAV9-A2 및 AAV7-A6은 wtAAV5에 대해 비교되었다. 에어 파우치 시노비움 모델은 Edwards 등 (1981; J Pathol 134: 147-156)으로부터 채택되었다. 0 일째에, 3 ml의 공기가 7-9 주령 암컷 Balb/cOlaHsd 마우스 (Harlan)의 등 피부에 피하 주사되었다 (0 일째). 에어 파우치의 형성 직후, 1 ml의 공기가 제거되었고 1 ml의 AAV (PBS (0.001 % 플루로닉 F68 (Sigma, 레퍼런스p5556)을 함유하는 Gibco, 레퍼런스10010 내 2e10 벡터 게놈/마우스는 에어 파우치에 직접 첨가되었다. 형질도입 3 일 후, 유전자 발현은 생체내 동물 이미지화에 의해 측정되었다.
루시퍼라제 발현의 이미지화
루시퍼라제 발현은 3 일째에 측정되었다. 벡터 투여 이후 최대 3 개월 동안 발현을 계속 모니터링하는 것이 초기에 계획되었지만, 동물 시설의 파보바이러스 감염은 진행중인 모든 실험의 조기 종결을 초래하였다. D-루시페린 칼륨-염 기질 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA)는 복강내 주사되었다 (대략 200 μl의 부피로, 150 mg/kg 체중). 광자 합계는 냉각된 전하-결합 장치 (CCD) 카메라 시스템 (Photon Imager, Biospace Lab, Paris, France) 및 이미지 처리를 사용하여 5 분 동안 기질 투여 후 10 분 획득되었고 신호 강도 정량화 및 분석은 M3 Vision (Biospace Lab)을 사용하여 수행되었다. 스테라디안 당 평방 센티미터 당 초당 방출된 광자의 수는 루시퍼라제 활성의 척도로서 계산되었다.
일반 동물 상태 및 윤리 성명
에어 파우치 형성, 벡터 투여 및 생체내 이미지화는 이소플루란 마취 (3 % 이소플루란 및 산소) 하에서 수행되었다. 실험 종료시, 동물은 이소플루란 마취 하에 심장 천자에 의해 희생된 다음, 자궁 경부 탈구되었다. 이 연구는 암스테르담 대학교의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 검토 및 승인되었으며 네덜란드 동물 복지법 (네덜란드어: "Wet op Dierproeven")의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행되었다. 동물은 암스테르담 대학교의 동물 시설에서 병원체가 없는 조건 하에서 유지되었다.
4.2. 결과
이들 유망한 결과에 근거하여, 2 개의 혈청형, AAV9-A2 및 AAV7-A6이 wtAAV5와 비교된 경우, 에어 파우치 시노비움 (APS) 모델을 사용하여 예비 생체내 연구는 수행되었다. 본 연구의 조기 종결을 필요로 하는 동물 시설에서의 불행한 감염으로 인해, 벡터 투여 3 일 후 단일 시점으로부터 데이터를 얻을 수만 있었다. 이 시점에서, 캡시드 돌연변이체가 AAV5와 비교할 때 증가된 유전자 발현을 일으키는 중이고, AAV7-A6이 ~6-배 증가된 발현을 나타내고 AAV9-A2가 ~22-배 증가를 나타내고 있다는 것이 분명했다 (도 3a).
실시예 5:
생체내 연구: 건강한 동물의 관절내 주사
5.1. 물질 및 방법
동물
숫컷 DBA1/J 마우스 (12 주령, Envigo)는 암스테르담 아카데믹 메디컬 센터의 동물 시설의 개별 환기 케이지에 수용되었다. 음식 및 물은 마음대로 이용가능하였다. 모든 동물 실험은 네덜란드 암스테르담 대학교의 중앙위원회 동물 실험 (CCD) 및 동물 연구 윤리위원회의 승인 후에 수행되었다.
발현 연구
캡시드 돌연변이체를 포함하는 5 개의 rAAV, 즉 AAV9-A2, AAV1-P4, AAV7-A6, AAVrh10-A6 및 AAVrh10-A2는 wtAAV5와 비교되었다. 캡시드 부하가 발현에 영향을 미칠수 있으므로 (Aalbers CJ 등, Hum Gene Ther 2017;28 (2):168-178), rAAV 제제는 wtAAV5 비어있는 입자를 첨가함으로써 캡시드 부하에 대해 보정되었다. 건강한 마우스 (n=9/그룹)는 양쪽 무릎에서 루시퍼라제 유전자를 운반하는 AAV 벡터의 관절내 주사를 받았다 (7.5x10 9 바이러스 게놈/무릎). 유전자 발현은 벡터 투여 후 여러 시점에서 생체내 이미지화에 의해 결정되었다.
루시퍼라제 발현의 이미지화
루시퍼라제 발현은 지시된 시점에서 결정되었다 (도 3b). 각각의 시점에, D-루시페린 칼륨-염 기질 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA)는 복막내로 주사되었다 (대략 200 ㎕의 부피로, 150 mg/kg 체중). 광자 합계는 냉각된 전하-결합 장치 (CCD) 카메라 시스템 (Photon Imager, Biospace Lab, Paris, France)를 사용하여 5 분 동안 기질 투여 후 15 분 획득되었다. 이미지 처리 및 신호 강도 정량화 및 분석은 M3 Vision (Biospace Lab)을 사용하여 수행되었다. 스테라디안 당 평방 센티미터 당 초당 방출된 광자의 수는 루시퍼라제 활성의 척도로서 계산되었다.
일반 동물 상태 및 윤리 성명
벡터 투여 및 생체내 이미지화는 이소플루란 마취 (4 % 이소플루란 및 산소) 하에서 수행되었다. 연구는 네덜란드 동물 복지법 (네덜란드어: "Wet op Dierproeven")의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행되었다. 동물은 암스테르담 대학교의 동물 시설에서 병원체가 없는 조건 하에서 유지되었다.
5.2. 결과
3 일째의 첫 시점에서, 무릎에서의 AAV-매개 발현은 모든 그룹에서 검출되고 시간에 따라 증가한다 (도 3b). AAV1-P4를 제외한 모든 캡시드 돌연변이체는 wtAAV5에 비해 발현이 증가하였고 AAV9-A2는 가장 높은 발현을 나타냈다 (14 일째에 wtAAV5에 비해 ~5 배 증가됨) (도 3c). 높음에서 낮음까지 14 일째의 발현 수준: AAV9-A2 > AAVrh10-A2 > AAVrh10-A6 > AAV7-A6 > wtAAV5 > AAV1-P4. 7 일째에, AAVrh10-A2, AAV9-A2 및 AAVrh10-A6은 wtAAV5에 비해 발현이 상당히 증가된 것으로 나타났다 (14 일째에 wtAAV5에 비해 **P < 0.05, ***P < 0.01, ****P < 0.00001. (도 3b).
실시예 6 :
인간 혈청에서 캡시드 돌연변이체에 대한 중화 항체 역가의 결정
6.1 물질 및 방법.
HEK293T 세포는 96-웰 투명 바닥 플레이트내 9% FBS, 0.9% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에 플레이팅되었다. 세포는 형질도입 전 24 시간 동안 (37 ℃, 5% CO2에서) 휴식하게 되었다. 다음과 같이 희석된 (프랑스 혈액 연구소에서 수득된) 인간 혈청 샘플: 순수 미희석된 혈청 - 1:4 - 1:16 - 1:64 - 1:256 - 1:1,024 (순수 혈청은 1 부피의 혈청에 대하여 1 부피의 바이러스를 의미함). (AAV5-벡터의 관절내 주사 후 42 일째 채취된, 10 마리의 DBA/1 마우스로부터) 풀링된 마우스 혈장 샘플은 다음과 같이 FBS에 연속해서 희석되었다: 1:10 - 1:50 - 1:250 - 1:6,250 - 1:31,250. 인간 정맥내 면역글로불린 (IVig, Sanquin, lot 15D30H4560A)의 용액은 1:10부터 1:10,000 아래로 연속해서 반대수 희석되었다. 샘플 및 대조군은 30' ± 5 분 동안 35-38 ℃에서 (이전에 결정된 바와 같이) 2,500의 MOI에서 적절한 캡시드 돌연변이체 또는 wtAAV5 벡터와 함께 인큐베이션되었다. 48 ± 2 시간 후, 루시퍼라제 시약은 첨가되었고 발광 방출은 VictorX 마이크로플레이트 판독기로 측정되었다. 형질도입 억제 역가는 검출가능한 중화 활성, 즉 중화 활성 >50%와 여전히 관련된 혈청의 최고 희석으로서 결정되었다.
6.2 결과
표 3에 제시된 바와 같이, 시료 중 70%-85%는 wtAAV5 또는 7 개의 캡시드 돌연변이체에 대한 중화 항체를 함유하지 않았다. 대부분의 샘플은 7 개의 캡시드 돌연변이체에 대한 반응성을 공유하였고, 따라서 야생형 AAV5 캡시드에 대한 반응성을 갖는 혈청 샘플은 다른 캡시드에 대해서도 반응하였다. 반응 수준의 관점에서, 이들은 또한 캡시드 돌연변이체들 사이에서 유사하였다. 반응하지 않은 샘플 수 (ND = 검출되지 않음)이 각 캡시드 돌연변이체에 대해 명시된다. 이들 데이터는 역가를 상이한 벡터와 비교하기가 매우 어렵기 때문에 정보로서만 제공된다. 관절내 주사된 관절로부터 풀링된 마우스 혈청 샘플과 관련하여, 동물을 면역화하는데 사용된 WT AAV5 캡시드에 대해서만 반응하는 반면, 돌연변이 캡시드에 대해서는 반응이 관찰되지 않았다 (표 3). 모든 캡시드 돌연변이체 및 WT AAV5는 IVIg (역가 >100)에 의해 중화되었다 (데이터는 표시되지 않음).
Figure pct00003
Figure pct00004
본 발명은 상기 도면에서 도시된 바와 같이 다수의 예시적 구현예를 참조하여 기재되었다. 일부 부품 또는 요소의 수정 및 대안적 구현예가 가능하며, 첨부 된 청구범위에 한정된 바와 같이 보호 범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Arthrogen B.V. Universit? Heidelberg <120> A modified rAAV capsid protein for gene therapy <130> P6057598PCT <150> EP 18152133.7 <151> 2018-01-17 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 745 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1 with insert P4 <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His 260 265 270 Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe 275 280 285 His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn 290 295 300 Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln 305 310 315 320 Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn 325 330 335 Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro 340 345 350 Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala 355 360 365 Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly 370 375 380 Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro 385 390 395 400 Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe 405 410 415 Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp 420 425 430 Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg 435 440 445 Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg 565 570 575 Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Gly Gln Ser Gly Asn 580 585 590 Asp Val Arg Ser Ala Asn Ala Gln Ala Ala Gly Asp Val His Ala Met 595 600 605 Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln 610 615 620 Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro 625 630 635 640 Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile 645 650 655 Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser 660 665 670 Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val 675 680 685 Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp 690 695 700 Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val 705 710 715 720 Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile 725 730 735 Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 740 745 <210> 2 <211> 746 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2 with insert P2 <400> 2 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met 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Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr Thr 405 410 415 Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Thr Asn Thr Gln Thr Leu Gly Phe 450 455 460 Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu 465 470 475 480 Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp 485 490 495 Asn Asn Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu 500 505 510 Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His 515 520 525 Lys Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe 530 535 540 Gly Lys Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met 545 550 555 560 Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu 565 570 575 Gln Tyr Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala 580 585 590 Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp 595 600 605 Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro 610 615 620 His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly 625 630 635 640 Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro 645 650 655 Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe Ile 660 665 670 Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu 675 680 685 Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser 690 695 700 Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly 705 710 715 720 Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn 725 730 735 Leu <210> 19 <211> 724 <212> PRT <213> adeno-associated virus 5 <400> 19 Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu 1 5 10 15 Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val 50 55 60 Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp 85 90 95 Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn 100 105 110 Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe 115 120 125 Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile 130 135 140 Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser 145 150 155 160 Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln 165 170 175 Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr 180 185 190 Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala 195 200 205 Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp 210 215 220 Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro 225 230 235 240 Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp 245 250 255 Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr 260 265 270 Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln 275 280 285 Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val 290 295 300 Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr 305 310 315 320 Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp 325 330 335 Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys 340 345 350 Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr 355 360 365 Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser 370 375 380 Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn 385 390 395 400 Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser 405 410 415 Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp 420 425 430 Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln 435 440 445 Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp 450 455 460 Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly 465 470 475 480 Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu 485 490 495 Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr 500 505 510 Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile 515 520 525 Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu 530 535 540 Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg 545 550 555 560 Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser 565 570 575 Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro 580 585 590 Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp 595 600 605 Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met 610 615 620 Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn 625 630 635 640 Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser 645 650 655 Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu 660 665 670 Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln 675 680 685 Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp 690 695 700 Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu 705 710 715 720 Thr Arg Pro Leu <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insertAAV7A6 <400> 20 Gly Gln Arg Gly Asn Glu Ala Arg Val Arg Glu Ala Gln 1 5 10 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insertAAV2P2 <400> 21 Gln Gly Gln Ser Gly Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Ala 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insertAAVDJQRP2 <400> 22 Gln Gly Gln Arg Gly Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Ala 1 5 10 15 <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> general formula I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa represents 0, 1 or 2 amino acid residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa represents a single amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa represents a single amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa represents a single amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa represents a single amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa represents a single amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa represents a single amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa represents a single amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa represents 0, 1 or 2 amino acid residues <400> 23 Xaa Gly Gln Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Gln Ala 1 5 10 15 Ala <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alternative formula for sequence Z <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Q or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is S or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is D, Y or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is C, V, S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is G, S or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is none, A, V or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is D, N or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is C or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is F or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is none, C or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is none or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is none or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is none or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa is none or A <400> 24 Xaa Gly Gln Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alternative formula for sequence Z <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Q or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is S or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is D, Y or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is C, V, S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is G, S or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is none or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is none or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is A, V, R or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is N, D, E or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is none or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is none or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa is none or A <400> 25 Xaa Gly Gln Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> preferred embodiment of formula I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is none or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is R or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is C or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is D, E or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is C, A, S or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is G, V or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is D or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is C or none <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is F, R, V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is C, D, N or E <400> 26 Xaa Gly Gln Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 27 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> formula II <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(8) <223> Xaa represents a single amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(15) <223> Xaa represents a single amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(20) <223> Xaa represents a single amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa represents a single amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa represents 0, 1 or 2 amino acid residue(s) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa represents sequence Z <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa represents 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acid residues <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa represents a single amino acid residue <400> 27 Glu Glu Glu Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Val Ala Thr Glu Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Leu Pro Gly Met Val Trp 20 25 30 Gln Xaa Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro 35 40 45 His Thr Asp Gly 50

Claims (15)

  1. 관절염 질환의 치료 또는 예방에서의 용도를 위한 또는 관절염 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에서의 용도를 위한 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 비리온으로서, 상기 변형된 캡시드 단백질이 상기 단백질의 C-말단부에서 아미노산 서열 Z를 포함하고, 이의 잔기가 상기 캡시드 단백질의 표면에 노출되는, rAAV 비리온.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 서열 Z가:
    a. 하기 식 I의 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 상기로 이루어지고:
    y - G - Q - x - G - (x)3 - R - (x)3 - y - A - Q - A - A
    식중 x는 단일 아미노산 잔기를 나타내고 y는 0, 1 또는 2개의 아미노산 잔기를 나타냄; 그리고
    b. 야생형 AAV 캡시드 단백질의 C 말단으로부터 위치 100 - 200, 바람직하게는 120 - 180, 더욱 바람직하게는 130 - 170, 더욱 바람직하게는 140 - 160 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 존재하는,
    rAAV 비리온.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 서열 Z가 하기 식 II로 표시되는 위치에서 상기 변형된 캡시드 단백질에 포함되는, 용도를 위한 rAAV 비리온:
    EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy - Z - (x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG
    a. 식중 Z, x 및 y는 제 1 항에 정의된 바와 같고; 그리고
    b. 식중 n은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15임.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡시드 단백질이 하기:
    i) 서열번호: 1을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 1의 위치 588 내지 602에서 아미노산이 서열 번호: 11과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열,
    ii) 서열번호: 2를 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 2의 위치 585 - 599에서 아미노산이 서열번호: 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열,
    iii) 서열번호: 3을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 3의 위치 587 - 601에서 아미노산이 서열번호: 9와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열,
    iv) 서열번호: 4를 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 4의 위치 586 - 600에서 아미노산이 서열번호: 9과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열,
    v) 서열번호: 5를 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 5의 위치 588 - 602에서 아미노산이 서열번호: 9와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열,
    vi) 서열번호: 6을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 6의 위치 588 - 602에서 아미노산이 서열번호: 8과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열, 및
    vii) 서열번호: 7을 갖는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 서열번호: 7의 위치 587 - 601에서 아미노산이 서열번호: 12와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 변형된 캡시드 단백질이, 동일한 조건 하에서 시험될 때, 서열번호: 13 - 19로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 미변형된 캡시드 단백질과 비교하여, 바람직하게는 인간 FLS 세포에서, 적어도 2-배의 발현 증가를 제공하고, 바람직하게는 상기 미변형된 캡시드 단백질이 아미노산 서열 서열번호: 19를 갖거나 상기 변형된 캡시드 단백질과 동일한 혈청형을 갖는,
    용도를 위한 rAAV 비리온.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호:1 - 7로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 상기로 이루어지는, 용도를 위한 rAAV 비리온.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 비리온이 하기:
    i) 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복 (ITR) 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 및
    ii) 관심의 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 바람직하게는 관심의 유전자 산물을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열이 2개의 AAV ITR 서열 사이 위치하는, 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는, 용도를 위한 rAAV 비리온.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 관심의 유전자 산물이 관절염 질환과 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 억압하고, 바람직하게는 상기 관심의 유전자 산물이 인터류킨, 면역-조절제, 항체, shRNA, miRNA, 가이드 RNA, 성장 인자, 프로테아제, 뉴클레오티다제/뉴클레오시다제, 펩티드, 프로테아제 억제제, 억제제, 효소 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 상기 관심의 유전자 산물이 CD39, CD73 및 IFN-β 중 적어도 하나인, 용도를 위한 rAAV 비리온.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 비리온이 하기:
    (i) 적어도 하나의 가이드 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로; 여기서 상기 또는 각각의 가이드 RNA는 게놈에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열(들)에 실질적으로 상보적인, 폴리뉴클레오티드; 및
    (ii) 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로; 여기서 상기 뉴클레아제는 상기 가이드 RNA와 리보뉴클레아제 복합체를 형성하고, 여기서 상기 리보뉴클레아제 복합체는 상기 게놈에서 부위-특이적 이중 가닥 DNA 파괴 (DSDB)를 만드는, 폴리뉴클레오티드
    중 적어도 하나를 포함하는, 용도를 위한 rAAV 비리온.
  9. 관절염 질환의 치료 또는 예방에서의 용도를 위한 또는 관절염 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에서의 용도를 위한 rAAV 조성물로서, 상기 rAAV 조성물이 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 rAAV 비리온 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, rAAV 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 rAAV 조성물이 적어도 1:1의 비어있는 캡시드 대 rAAV 비리온의 비로 비어있는 캡시드를 추가로 포함하는, rAAV 조성물.
  11. 관절염 질환의 치료 또는 예방에서의 용도를 위한 또는 관절염 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에서의 용도를 위한 rAAV 조성물 및 면역억압제로서, 상기 rAAV 조성물이 제 9 항 또는 제 10 항에서 정의된 바와 같고 상기 치료 또는 예방이 개체에게 상기 rAAV 조성물의 투여 그리고 상기 면역억압제의 투여를 포함하는, rAAV 조성물 및 면역억압제.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 또는 제 11 항에 있어서, 상기 관절염 질환이 류마티스성 관절염 (RA), 소아 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염 (OA), 통풍, 가성통풍, 척추관절염 (SpA), 건선성 관절염, 강직성 척추염, 패혈성 관절염, 관절염, 소아 특발성 관절염, 둔기 외상, 관절 대체 및 스틸병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 용도를 위한 rAAV 비리온, 용도를 위한 rAAV 조성물, 또는 용도를 위한 rAAV 조성물 및 면역억압제.
  13. 제 1 항 내지 제 8 항 및 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서 또는 제 9 항, 제 10 항 및 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 비리온 또는 상기 rAAV 조성물이 전신으로 및/또는 국소적으로 투여되는, 용도를 위한 rAAV 비리온 또는 용도를 위한 rAAV 조성물.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 rAAV 조성물 및 상기 면역억압제 중 적어도 하나가 국소적으로 투여되는, 용도를 위한 rAAV 조성물 및 면역억압제.
  15. 제 13 항에 있어서 또는 제 14 항에 있어서, 상기 국소 투여가 관절내 투여인, 용도를 위한 rAAV 비리온 또는 rAAV 조성물 또는 용도를 위한 rAAV 조성물 및 면역억압제.
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