CN110950934B

CN110950934B - 一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN110950934B
Application number: CN201911419650.9A
Authority: CN
Inventors: 凌晨; 郑青云
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN110950934A

Abstract

本发明公开了一种腺相关病毒衣壳蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；公开了一种分离的核酸分子，其编码上述腺相关病毒衣壳蛋白；公开了一种腺相关病毒载体，其编码上述腺相关病毒衣壳蛋白；还公开了上述腺相关病毒载体的构建方法及其在制备基因治疗药物中的应用。本发明在AAV‑DJ衣壳蛋白上进行了改造，使得其在HEK293、各种肝癌细胞、小鼠成纤维细胞等细胞系以及小鼠肝脏中与野生型AAV相比转导效率都得到了显著的提升，避免了高剂量注射病毒载体会引发受体的免疫反应，优化了AAV病毒的生产工艺，降低生产成本，促进了AAV基因治疗产品推进临床的进程。

Description

一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用。

背景技术

当前，基因治疗成为生物医药领域的研究热点，基因治疗中最常用的载体包括腺病毒、慢病毒以及腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV，下同)。野生型腺相关病毒(wtAAV，下同)隶属于细小病毒科，是一个直径为20nm的单链DNA病毒，呈一个二十面体，衣壳蛋白里包被着一个两端含有倒置末端重复序列(ITR，下同)的病毒基因组，ITR之间是一个开放阅读框ORF，包含衣壳蛋白Cap、复制蛋白Rep、包装激活蛋白AAP。已知野生型腺相关病毒会整合到人染色体AAVS1位点。重组型腺相关病毒(rAAV，下同)基因组序列只保留了包装病毒所必需的两端的ITR，中间全部替换为目的基因序列，这就保证了病毒基因组不整合进宿主基因组。

与腺病毒、慢病毒相比，重组型腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus，rAAV，下同)在人体中诱发免疫应答的几率较低，这有助于提高载体递送目的基因的效率，同时使用rAAV可以降低来自免疫相关的毒性风险；此外，rAAV可在体内外长期有效介导外源基因的持续稳定表达，已成为最有前景的基因治疗载体之一。但是，rAAV的转导效率受目的基因序列的长度影响，所转导的细胞、组织脏器种类不同选用的血清型也不同，加之AAV生产包装成本相对高昂，且高剂量注射会激发人体的免疫反应。故而，如何对AAV进行改造,使其在原代培养的细胞、胆管类器官、哺乳动物细胞和动物脏器等体内外实验中与wtAAV相比转导效率都得到显著的提升；如何让滴度较低的病毒载体和以wtAAV包装得到的高剂量的病毒载体相比，转导细胞的效率都能达到近似水平，以此减少传统基因治疗对所需要的病毒载体量的需求，避免高剂量注射病毒载体诱发受体的免疫反应；如何通过对AAV衣壳蛋白进行优化，提高病毒载体的靶向性，为实现精准医疗提供有效技术支撑；如何通过对AAV衣壳蛋白的优化改造，优化AAV病毒的生产工艺，降低生产成本，生产出更加稳定的病毒载体，促进AAV基因治疗的产品推进临床的进程显得至关重要。

发明内容

有鉴于现有技术转导效率低等缺陷，本发明提供了一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用。

本发明的技术方案如下：

本发明在第一方面提供了一种腺相关病毒衣壳蛋白，其在DJ血清型衣壳蛋白的第269位氨基酸上由丝氨酸突变为苏氨酸(S269T)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明在第二方面提供了一种分离的核酸分子，其编码上述腺相关病毒衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)。

本发明在第三方面提供了一种腺相关病毒载体，其编码上述腺相关病毒衣壳蛋白(SEQ ID NO：1)。

本发明在第四方面提供了一种腺相关病毒载体，其包含上述分离的核酸分子。

本发明在第五方面提供了上述腺相关病毒载体的构建方法，其包括以下步骤：

步骤1：选择表达腺相关病毒DJ血清型衣壳蛋白的质粒作为PCR扩增的DNA模板；

步骤2：设计定点突变的引物，所述定点突变在wtAAVDJ衣壳蛋白VP1上将其第269位氨基酸由原来的丝氨酸突变为苏氨酸(S269T)；

步骤3：通过PCR扩增引入所述定点突变，PCR结束后酶切DNA模板；

步骤4：纯化、筛选，得到腺相关病毒衣壳突变质粒。

在优选实施例中，上述引物的引物序列如SEQ ID NO：2所示，其反向引物的序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明在第六方面提供了一种腺相关病毒突变体的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1：将通过上述方法得到的腺相关病毒衣壳突变质粒与辅助质粒和目的质粒混合加入到包装细胞中以包装腺相关病毒；

步骤2：纯化包装成的腺相关病毒，获得腺相关病毒突变体。

在优选实施例中，采用的包装细胞为HEK293。

本发明在第六方面提供了上述腺相关病毒载体在制备基因治疗药物中的应用，尤其是在基因治疗肝癌方面的应用。

本发明在第七方面提供了通过上述制备方法获得的腺相关病毒突变体在制备基因治疗药物中的应用，尤其是在基因治疗肝癌方面的应用。

本发明的优点在于：在AAV-DJ衣壳蛋白上进行了改造，使得其在HEK293及肝癌细胞、小鼠成纤维细胞等细胞系以及小鼠肝脏中与wtAAV相比转导效率都得到了显著的提升。另一方面，在较低的滴度条件下的转导效率与wtAAV包装的高剂量的载体相比都能达到近似的转导效率，极大的减少了传统基因治疗所需要的病毒载体的用量，避免了高剂量注射病毒载体会引发受体的免疫反应；此外，通过对AAV衣壳蛋白进行优化，提高了病毒载体对组织的靶向性，为实现精准治疗提供有效技术支撑；最后，通过对AAV衣壳蛋白的优化改造，可以优化AAV病毒的生产工艺，降低生产成本，生产的病毒载体更加稳定，促进了AAV基因治疗产品推进临床的进程。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1示出了本发明较优实施例中突变衣壳蛋白质粒包装的病毒感染细胞后的GFP表达荧光图；

图2示出了本发明较优实施例中纯化病毒载体尾静脉注射小鼠30天后的GFP表达荧光图；

图3示出了本发明较优实施例中纯化病毒载体尾静脉注射小鼠取肝脏检测目的基因表达的Western Blot检测结果，其中图3a为scAAV-CMV-eGFP中GFP的表达，图3b为ssAAV-CMV-SOX9中SOX9的表达；

图4示出了本发明较优实施例中小鼠活体成像检测fluc表达的结果。

具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

实施例1、腺相关病毒载体的构建

1、在腺相关病毒衣壳蛋白上进行定点突变

1.1、确定定点突变所用的质粒为包装腺相关病毒所必须的衣壳蛋白，在本实施例中选用的是腺相关病毒DJ血清型衣壳蛋白；

1.2、在腺相关病毒VP1上进行定点突变，将其第269位氨基酸由原来的丝氨酸突变为苏氨酸(S269T)，针对该位点设计突变引物，在突变位点前后各选取20bp左右读长，并将原来位置的氨基酸密码子三联体替换为目的氨基酸的密码子三联体序列在引物设计软件上进行验证，根据GC比例、Tm值、引物二聚体或者发夹结构等要求稍作删减，在本实施例中，最优选的引物序列为：

正向引物-agcacatctggaggatctacaaatgacaacgcctacttcg(SEQ ID NO：2)；

反向引物-cgaagtaggcgttgtcatttgtagatcctccagatgtgct(SEQ ID NO：3)；

1.3、用ddH₂O稀释模板质粒DJ血清型外壳蛋白质粒和引物，选取模板质粒50ng，引物125ng；

1.4、选用定点突变试剂，向PCR管中加入5μl的10x reaction buffer，dNTPmix，模板质粒，引物，用ddH₂O补齐到50μl，最后加入1μl的Pfu polymerase，冰上操作；

1.5、涡旋振荡PCR管，设定PCR程序：95℃，3min预变性；10个循个；95℃30s变性，60℃1min退火，68℃2min/kb延伸，18个循环进行PCR，在扩增过程中引入所需氨基酸的突变；

1.6、PCR结束后，加入定点突变试剂盒中的DpnI酶，37摄氏度温育1h，以切除模板DNA链；

1.7、将消化产物用DNA纯化试剂盒进行纯化，获得高纯度的浓缩产物。

2、筛选目的突变产物

将纯化浓缩后的产物转化大肠杆菌，摇床涂相应抗性的平板，过夜培养，挑单克隆测序验证，筛选得到目的衣壳蛋白突变质粒。

实施例2、腺相关病毒突变体的制备

1、小规模包装病毒

1.1、将测序正确的腺相关病毒衣壳突变质粒和包装腺相关病毒所必须的辅助质粒、目的质粒(本实施例中选用pAAV-CMV-EGFP)三质粒按1:1:2的比例混合包装腺相关病毒，本实施例中包装所用的细胞为HEK293，72h后用荧光显微镜观察三质粒转染情况并收获病毒粗提物，对比野生型腺相关病毒衣壳蛋白包装的病毒GFP荧光蛋白表达，评价其包装效率；

1.2、用0.22μm生工针头式过滤器过滤纯化包装成的病毒载体，初步除去杂质；

1.3、将小包纯化的腺相关病毒定量分别感染HEK293、Huh7、HepG2、NIH3T3细胞进行筛选，72h通过检测GFP表达，观察其是否可以高效感染HEK293和肝癌细胞系；

2、大规模包装病毒

2.1、将小规模包装验证的能高效转导细胞的腺相关病毒衣壳突变质粒和包装腺相关病毒所必须的辅助质粒、目的质粒(本实施例中选用pAAV-CMV-eGFP、pAAV-CMV-SOX9、pAAV-CMV-fluc)三质粒按一定比例混合包装腺相关病毒，此处包装所用的细胞为HEK293，各20盘(15cm盘)，72h后用荧光显微镜观察三质粒转染情况并收获病毒；

2.2、碘克沙醇梯度离心，过离子交换层析柱得到纯化的病毒突变体，超滤浓缩得到0.5ml的纯化病毒突变体；

2.3、将纯化的病毒突变体分别以10^11vgs尾静脉注射C57小鼠，一个月后处死取肝脏做切片检测GFP表达；

2.4、将纯化的病毒载体分别以10^11vgs尾静脉注射C57小鼠，一个月后处死取肝脏用Western检测SOX9表达；

2.5、将纯化的病毒载体分别以10^11vgs尾静脉注射C57小鼠，一个月后小动物活体成像仪观察fluc表达。

3、实验结果

突变衣壳蛋白质粒包装病毒的GFP表达

下表示出了无突变和S269T突变衣壳蛋白质粒包装病毒在HEK293细胞中的转导效率比较结果，可见后者具有比野生型更高的转导效率。

图1示出了突变衣壳蛋白质粒包装的病毒感染细胞后的GFP表达荧光图，由图可知S269T突变衣壳蛋白质粒包装病毒在HEK293、NIH3T3、HepG2和Huh7细胞中均具有最强的GFP表达。

图2示出了纯化病毒载体尾静脉注射小鼠30天后的GFP表达荧光图，由图可知S269T突变衣壳蛋白质粒包装病毒具有最强的GFP表达。

图3示出了纯化病毒载体目的基因表达的Western Blot检测结果，其中图3a为scAAV-CMV-eGFP中GFP的表达，图3b为ssAAV-CMV-SOX9中SOX9的表达；由图可知S269T突变衣壳蛋白质粒包装病毒对于这两种目的基因都具有最强的表达。

图4示出了小鼠活体成像检测fluc表达的结果。从图中可以看到，S269T突变衣壳蛋白质粒包装病毒具有最强的荧光表达，并且对肝部显示出较强的靶向性，可应用于制备肝靶向基因治疗药物，为实现精准医疗提供了有效的技术支撑。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种腺相关病毒衣壳蛋白、载体及其构建方法与应用

<130> 2019

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 738

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly

145 150 155 160

Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Thr Ser Asn Asp

260 265 270

Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn

275 280 285

Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn

290 295 300

Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala

325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

340 345 350

Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe

355 360 365

Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn

370 375 380

Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr

405 410 415

Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu

435 440 445

Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Thr Asn Thr Gln Thr Leu Gly

450 455 460

Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp

465 470 475 480

Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala

485 490 495

Asp Asn Asn Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His

500 505 510

Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser

515 520 525

His Lys Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile

530 535 540

Phe Gly Lys Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val

545 550 555 560

Met Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

Glu Gln Tyr Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln

580 585 590

Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val

595 600 605

Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile

610 615 620

Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe

625 630 635 640

Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val

645 650 655

Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe

660 665 670

Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu

675 680 685

Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr

690 695 700

Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu

705 710 715 720

Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

725 730 735

Asn Leu

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

agcacatctg gaggatctac aaatgacaac gcctacttcg 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cgaagtaggc gttgtcattt gtagatcctc cagatgtgct 40

Claims

1.一种腺相关病毒衣壳蛋白，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白在DJ血清型衣壳蛋白的第269位氨基酸上由丝氨酸突变为苏氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码根据权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白。

3.一种腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体编码根据权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白。

4.一种腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体包含根据权利要求2所述的分离的核酸分子。

5.根据权利要求3或4所述的腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

步骤2：设计定点突变的引物，所述定点突变在wtAAVDJ衣壳蛋白VP1上将其第269位氨基酸由丝氨酸突变为苏氨酸；

步骤4：纯化、筛选，得到腺相关病毒衣壳突变质粒。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述引物的正向引物序列如SEQ IDNO：2所示，其反向引物的序列如SEQ ID NO：3所示。

7.一种腺相关病毒突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1：将权利要求5中得到的所述腺相关病毒衣壳突变质粒与辅助质粒和目的质粒混合加入到包装细胞中以包装腺相关病毒；

步骤2：纯化包装成的腺相关病毒，获得腺相关病毒突变体。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述包装细胞为HEK293。

9.根据权利要求3或4所述的腺相关病毒载体在制备基因治疗药物中的应用。

10.根据权利要求7所述的制备方法获得的所述腺相关病毒突变体在制备基因治疗药物中的应用。