KR20200135331A - 고양이 맥도너 육종(fms)-유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(flt3l)에 대한 항체 및 자가면역 및 염증 질환을 치료하기 위한 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 명세서에서 항-FLT3L 항체, 및 자가면역 및 다른 염증 질환을 치료하기 위한 항체의 이용 방법이 제공된다.

Description

고양이 맥도너 육종(FMS)-유사 티로신 키나제 3 수용체 리간드(FLT3L)에 대한 항체 및 자가면역 및 염증 질환을 치료하기 위한 이의 용도

신체의 면역계가 자가항체를 생성할 때 생기는 자가면역 질환은 불행하게도 흔하다. 예를 들어, 2천 3백만명 초과의 미국인이 자가면역질환을 앓는 것으로 추정된다. 현재 80종 초과의 자가면역질환이 인식되어 있다. 자가면역질환의 구체적 예는 전신 홍반 루푸스, 근염, 원발성 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 포도막염, 건선 및 류마티스 관절염을 포함한다.

전신 홍반 루푸스(SLE)는 관절 통증, 림프절 부종 및 볼에 생기는 나비모양 발진을 특징으로 한다. SLE에서, 건강한 조직에 대한 자가항체는 환자의 면역계를 공격하여 염증을 야기한다. 세포 수준에서, SLE 환자는 수지상 세포에 의해 유도되는 자가반응성 T 및 B 세포를 가진다(Palucka A.K. et al. Immunology and Cell Biology (2002) 80: 484-488). 쇼그렌 증후군은 장기 기능장애를 초래하는 외분비 기관의 전신 만성 염증을 특징으로 한다(Holdgate N. and St. Clair E.W., F1000 Research. 1412 10.12688/f1000research.8352.1).

다발성 경화증(multiple sclerosis: MS)은 뇌 및 척수에서 신경 세포의 탈수초 및 중추신경계(central nervous system: CNS) 염증을 특징으로 한다. 건선은 붉고 가려운 피부의 딱지로서 나타나는 자가면역질환이다. 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis: RA)은 지속적 활액막염 및 관절 내 연골 및 뼈의 파괴를 특징으로 하는 관절 윤활 조직의 염증성 장애이다. 손상은 수많은 신체 계통에 영향을 미치도록 진행될 수 있다. 루푸스 신염은 전신 홍반 루프스와 연관되며, 신장 염증을 초래한다. 염증이 있을 때, 신장은 단백질을 누출시키고, 결국은 부전에 이를 수 있다. 포도막염은 눈 조직을 공격하고 파괴하여 시력 상실에 이를 수 있는 염증성 질환의 그룹이다.

추가로, 급성 및 만성 전염증성 상태는 개체에서의 무수한 질환과 연관되며, 원인이 될 수도 있다. 만성 염증과 연관되는 것으로 여겨지는 질환의 구체적 예는 1형 및 2형 당뇨병, 만성 신장 질환(chronic kidney disease: CKD)(예를 들어, 당뇨병, 당뇨병성 신장 질환, 및 고혈압에 의해 야기되는 CKD를 포함); 죽상동맥경화증, 알츠하이머병, 암, 및 이러한 질환의 연관된 합병증, 예를 들어, 심장병, 고혈압, 빈혈증, 심낭염, 신성 골이영양증 및 기타를 포함한다. 자가면역질환과 같이, 만성 염증과 연관된 질환에서, 신체는 쇠약함 및 종종 치명적인 동반이환을 야기할 수 있는 과도한 지속적 전염증 반응이 증가되는 것으로 나타난다.

자가면역질환의 원인은 잘 이해되고 있지 않다. 메커니즘적으로, 근본적인 모든 자가면역질환은 자가반응성 면역 세포를 지속적으로 보충하는 복잡한 조절 계통에 의해 촉진되는(그리고/또는 저해되지 않는) 진행성 자가면역 반응이다. 비-자가면역 만성 염증 질환에서 유사한 메커니즘이 작용하는 것으로 나타난다. 이런 이유로, 자가면역질환에서 그리고 만성 염증에 대한 치료적 개입은 무수한 조절계, 신호전달 캐스케이드 및 이들의 구성성분을 표적으로 하였다.

추정상의 치료적 표적의 하나의 부류는 세포의 항상성을 조절하기 위해 별개의 성장 인자 및 단백질에 결합하는 막관통 수용체인 티로신 키나제 수용체(tyrosine kinase receptor: TKR)를 포함한다. 50종 초과의 공지된 인간 TKR은 이들의 유전적 계통발생에 의해 정해지는 20개의 별개의 부류로 나누어진다(Robins D.R., et al. Oncogene. (2000) 19: 5548-5557; Lemmon M.A., and Schlessinger J. Cell. (2010) 141: 1117-1134). TKR 부류 III은 70 내지 100개의 친수성 잔기를 함유하는 세포외 부문에서 5 내지 7개의 면역글로불린-유사 도메인의 존재를 특징으로 한다. 부류 III TKR 내에서, 고양이 맥도너 육종(Feline McDonough Sarcoma: FMS)-유사 티로신 키나제 3 수용체(FLT3)는 인간 줄기 세포, 조혈세포 전구체, 수지상 세포, 활성화된 T 및 B 세포, 단핵구 및 미세아교세포 상에서 발현되는 막 결합 수용체이다. FLT3은 활성화된 T 세포, 활성화된 내피, 및 골수 기질 세포를 포함하는 다수의 세포 유형에 의해 발현되는 조혈 사이토카인인 FLT3 리간드(FLT3L)에 결합한다. FLT3L은 세포 표면 및 분비된 동종이량체 둘 다로서 발현되고 이의 동족 수용체인 FLT3을 통해 신호를 전달한다. FLT3은 단량체로서 세포 표면 상에서 발현되고, FLT3L과의 결찰 시 활성화된다. FLT3L 결찰 시, FLT3은 이량체화하고, 자가인산화하며, RAS/세포외 신호-조절된 키나제(ERK), 포스파티딜이노시티드 3-키나제(PI3K) 및 신호변환자-전사활성자(signal transducer and activator of transcription: STAT) 3 및 5를 비롯한 신호전달 경로를 활성화시킨다. 자가-인산화 후에, 이량체화된 FLT3은 내재화되고, 분해된다.

FLT3L은 염증 신호, 특히 □-쇄 사이토카인: IL-2, IL-7 및 IL-15에 반응하여 생성되며, FLT3과 이의 상호작용은 주로, DC의 분화, 증식 및 생존에서의 이의 역할을 통해 염증 과정을 유도한다. 또한 활성화 후 T 및 B 세포 생존에서 FLT3 신호전달에 대한 추정적 역할이 있으며, 세포 유형 둘 다 수용체를 일시적으로 상향조절하는 것으로 보고되었다(문헌[Astier AL et al., J. Immunology. 2010 v184: 685-93] 및 문헌[Tobon et al. Arthritis & Rheumatism. 2010; 62(11): 3447-56]). 추가로, NK 세포 생존은 DC로부터 유래된 IL-15에 대한 필요를 통해 FLT3L에 간접적으로 의존하는 것으로 생각되지만, 이런 관찰은 마우스 데이터에 기반하며(Guimond M et al., J. Immunology 2010; 184: 2769-75) 인간에서는 아직 입증되지 않았다.

DC는 염증 부위로부터 림프절로 이동하고, 자가면역질환을 생성하는데 궁즉적으로 필요한 적응 면역 반응을 개시하는 면역계의 보초병이기 때문에, 염증에 있어서 특히 관심의 대상이 된다. 광범위하게, DC의 2가지 하위집단으로서 골수성/고전적 수지상 세포(cDC) 및 형질세포양 수지상 세포(pDC)가 있다. cDC는 염증 사이토카인(예를 들어, IFNI-III, IL-23, IL-12, IL-6 및 IL-1□)을 생성하고, 공자극과 관련하여 항원을 T 세포에 제시하고, 염증 부위에 세포를 보충하는 케모카인을 분비하며, 중요한 세포-세포 상호작용의 필요에 따라 이들이 공동 국소화하는 것을 보장한다. 이들 메커니즘을 통해 cDC는 호중구, B-세포, T-세포 및 NK 세포를 자극하여 NETosis, 자가-항체 생성, IL-17 생성 및 추가적인 염증 사이토카인 생성을 초래한다. pDC는 면역계의 모든 아암의 활성화를 향상시키는 선천적 반응에서 중요한 사이토카인인 I형 IFN의 주요 공급원이다.

쇼그렌 증후군 환자로부터의 침샘은 침윤성 B-세포 상에서 FLT3 및 FLT3L 발현을 나타낸다(Tobon et al. Arthritis & Rheumatism. (2010) 62(11): 3447 - 3456). 추가로, 쇼그렌 증후군 환자는 순환에서 증가된 빈도의 FLT3 발현 B-세포를 나타내고, 이들의 생존은 FLT3L-발현 인간 타액 분비 세포와 함께 공동발현될 때 향상된다. MS를 갖는 개체는 만성 및 활성 병변뿐만 아니라 회색질 및 백질에서 FLT3 단백질을 발현시킨다(DeBoy C.A. et al. Exp Mol Pathol. (2010); 89(2): 109-116). 추가로, FLT3은 혈관주위 뇌에서 미숙한 DC와 함께 공동 국소화되는데, 이는 MS를 갖는 개체의 뇌 내로의 FLT3 양성 DC의 침윤을 나타낸다(Deboy et al.). RA에서, 활액 FLT3L 수준은 건강한 개체에 비해 증가된다. 　추가로, RA 환자로부터의 단핵구, NK 세포 및 DC는 고수준의 FLT3L을 발현시킨다(Ramos M. et al. Arthritis Res Ther. (2013) 15(6): R209).

게다가, SLE, 근염, 원발성 쇼그렌 증후군, MS, 포도막염 및 RA에 대해 증가된 혈청 및 염증 부위 FLT3L 수준이 보고되었다(Andersson et al. PLoS One (2012) 7: e47668; DeBoy et al. Exp and Mol Path (2010) 89: 109-16).

따라서, (예를 들어, pDC 및 mDC를 통한) FLT3-매개 전염증 생존은 건강한 개체에서 유리한 생리학적 반응이지만, 이는 자가면역질환에서 해로운 효과를 가질 가능성이 있다. 따라서, FLT3/FLT3L 신호전달 경로의 붕괴 또는 약화는 자가면역질환 및 다른 염증 질환과 싸울 뿐만 아니라 염증을 감소시키기 위한 중요한 도구가 된다는 것을 증명할 수 있었다.

본 명세서에서 자가면역질환 및 다른 급성 및/또는 만성 염증 질환을 제어하기 위한 신규한 FLT3L 결합 항체가 제공된다.

제1 양상에서, 본 개시내용은 상보성-결정 영역(Complementarity-Determining Region: CDR)의 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, FLT3L에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하되, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 (a) 각각 서열번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34; 또는 (b) 각각 서열번호 29, 30, 31, 35, 33 및 34; 또는 (c) 각각 서열번호 29, 36, 37, 32, 33 및 38의 아미노산 서열을 포함한다.

제1 양상의 일 실시형태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 각각 서열번호 1 및 서열번호 2; 또는 (b) 각각 서열번호 3 및 서열번호 4; 또는 (c) 각각 서열번호 5 및 서열번호 6에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 다른 실시형태에서, VH 및 VL은 (a) 각각 서열번호 1 및 서열번호 2; 또는 (b) 각각 서열번호 3 및 서열번호 4; 또는 (c) 각각 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함한다. 추가 실시형태에서, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 (a) 서열번호 61을 포함하는 중쇄 영역 및 서열번호 62를 포함하는 경쇄 영역; 또는 (b) 서열번호 65를 포함하는 중쇄 영역 및 서열번호 66을 포함하는 경쇄 영역; 또는 (c) 서열번호 69를 포함하는 중쇄 영역 및 서열번호 70을 포함하는 경쇄 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 FLT3의 FLT3L-매개 활성화를 저해한다. 다른 실시형태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 구조적으로 유사한 TKR 리간드 분자와 교차반응하지 않는다. 일 실시형태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 huSCF 및 huCSF1 중 적어도 하나와 교차반응하지 않는다. 추가 실시형태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 huSCF 또는 huCSF1 중 하나와 교차반응하지 않는다. 일 실시형태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단클론성 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체이다. 일 실시형태에서, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은: (a) IgA 불변 도메인; (b) IgD 불변 도메인; (c) IgE 불변 도메인; (d) IgG1 불변 도메인; (e) IgG2 불변 도메인; (f) IgG3 불변 도메인; (g) IgG4 불변 도메인; 및 (h) IgM 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG1 불변 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은: (a) Ig 카파 불변 도메인; 및 (b) Ig 람다 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 항원 결합 단백질은 인간 IgG1 불변 도메인 및 인간 람다 불변 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, IgG1 불변 도메인은 Kabat의 EU 넘버링 색인에 따라 넘버링된 L234F, L235E 및 P331S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다(Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 63:78-85 (1969)).

제2 양상에서, 본 개시내용은 제1 양상 및/또는 이의 실시형태에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 제2 양상의 일 실시형태에서, 핵산 분자는 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다.

제3 양상에서, 본 개시내용은 제2 양상 및/또는 이의 실시형태에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

제4 양상에서, 본 개시내용은 제2 양상 및/또는 이의 실시형태에 따른 분자의 핵산 또는 제3 양상에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 포유류 숙주 세포이다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 HEK293 세포, NS0 뮤린 골수종 세포 또는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포이다.

제5 양상에서, 본 개시내용은 제1 양상 내지 제4 양상 중 어느 하나 또는 이들의 실시형태의 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는 하이브리도마를 제공한다.

제6 양상에서, 본 개시내용은 제1 양상 내지 제5 양상 중 어느 하나 또는 이들의 실시형태의 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.

제7 양상에서, 본 개시내용은 (a) 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 발현시키는 숙주 세포를 배양시키거나 또는 제3 양상 또는 이의 실시형태의 숙주 세포 또는 제4 양상에 따른 하이브리도마를 배양시키는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주 세포로부터 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 단리시키는 단계를 포함하는, 제1 양상 내지 제6 양상 중 어느 하나 또는 이들의 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법을 제공한다.

제8 양상에서, 본 개시내용은 제6 양상의 방법에 따라 생성된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.

제9 양상에서, 본 개시내용은 제1 양상 내지 제8 양상 중 어느 하나 또는 이들의 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 의약으로서 사용하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.

제10 양상에서, 본 개시내용은 약제학적 유효량의 제1 양상 내지 제9 양상 중 어느 하나 또는 이들의 실시형태에 따른 단리된 항체 또는 이의 단편을 급성 또는 만성 염증 질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 급성 또는 만성 염증 질환의 치료 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 염증 질환은, 예를 들어, 당뇨병, 당뇨병성 신장 질환 및 고혈압에 의해 야기되는 만성 신장 질환(CKD)을 비롯한, CKD를 포함한다.

제11 양상에서, 본 개시내용은, 약제학적 유효량의 제1 양상 내지 제10 양상 중 어느 하나 또는 이들의 실시형태에 따른 단리된 항체 또는 이의 단편을 자가면역질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환의 치료 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 자가면역질환은 전신 홍반 루푸스, 근염, 원발성 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 포도막염, 건선 또는 류마티스 관절염을 포함한다.

본 개시내용의 이들 및 다른 특징 및 이점은 수반하는 청구범위와 함께 본 개시내용의 다음의 상세한 설명으로부터 더 완전하게 이해될 것이다. 청구범위의 범주는 그 안의 열거에 의해 정해지며, 본 설명에 제시된 특징 및 이점의 구체적 논의 및 이점에 의해 정해지지 않는다는 것을 주목한다.

도 1의 A 내지 C. 리드 항체(Lead antibody) 선택. 도 1의 A는 huFLT3L 및 muFLT3L에 의한 교번의 패닝(panning) 과정 및 그 결과로 인한 BMV, CS, DP47 및 Dyax 파지 라이브러리의 농축을 도시한다. 도 1의 B는 패닝 결과물이 하류의 경쟁 HTRF에 대한 벡터 내로 클로닝된 과정을 도시한다. 도 1의 C는 리드 후보에 대한 경쟁 HTRF(균질 시간-분해 형광법(homogeneous time-resolved fluorescence)) 결과를 도시한다.
도 2의 A 내지 C. 세포주에서의 FLT3L 발현. 도 2의 A는 EOL-1, MOLM13 및 MV4-11 세포주에 비해 RS4;11 세포주에서 FLT3의 발현이 증가된 것을 입증한다. 도 2의 B는 재조합 FLT3L이 RS4;11 세포 상의 FLT3에 용량 의존적 방식으로 결합한다는 것을 확인해 준다. 도 2의 C는 RS4;11 세포 표면 상의 FLT3 하향조절이 유세포 분석을 이용하여 상업적으로 입수 가능한 항-FLT3 항체로 용이하게 검출할 수 있으며, 이런 하향조절은 용량 의존적 방식으로 FLT3L과의 결찰에 반응하여 일어난다는 것을 보여준다.
도 3의 A 내지 B. EC80 및 후속적 검사의 도출. 도 3의 A는 세포 표면 FLT3의 80%가 RS4;11 세포(EC80) 상에서 하향조절되는 농도를 도출하기 위해 사용되는 FLT3L 적정 곡선을 보여준다. 도 3의 B는 상업적으로 입수 가능한 항-FLT3L 항체, 및 RS4;11 세포 상의 세포 표면 FLT3의 80%의 하향조절을 초래하는 96 pM의 재조합 FLT3L에 대한 FLT3 수용체(FLT3-Fc)의 재조합 작제물의 저해 프로파일을 보여준다.
도 4의 A 내지 C. 인간 및 사이노(cyno) sFLT3의 리드 항체 후보 저해. 도 4의 A는 96 pM 인간 FLT3L에 대한 5종의 리드 후보의 저해 프로파일을 보여준다. 도 4의 B는 96 pM의 사이노몰거스 FLT3L에 대한 5종의 리드 후보의 저해 프로파일을 보여준다. 도 4의 C는 뮤린 FLT3L에 대한 5종의 리드 후보의 저해 프로파일을 보여준다.
도 5의 A 내지 C. 세포 표면 FLT3의 리드 후보 저해. 도 5A는 형질도입된 CHO 세포주의 표면 상에서 발현된 인간 FLT3L에 결합하는 리드 항체의 능력을 보여준다. 도 5B는 세포 표면 사이노 FLT3L에 결합하는 리드 항체를 보여준다. 도 5C는 세포 표면 마우스 FLT3L에 결합하는 리드 항체를 보여준다.
도 6의 A 내지 C. 내인성 인간 FLT3L에 결합하는 리드 후보. 도 6의 A는 IL-2에 의한 자극 7일 후 인간 1차 T-세포 상의 FLT3L 발현을 보여준다. 도 6의 B는 클론 5D9를 제외하고 인간 1차 T-세포 상의 내인성 FLT3L에 결합하는 모든 리드 후보의 능력을 보여준다. 도 6의 C는 1차 T 세포와 함께 인큐베이션 전에 이량체화에 의해 CAT5D9의 결합활성을 개선시키는 것이 T 세포 표면 상의 내인성 FLT3L에 대한 클론의 용량-의존적 결합 검출을 가능하게 한다는 것을 보여준다.
도 7의 A 및 B. 리드 후보에 의한 세포 표면 신호전달의 저해. 도 7의 A는 RS4;11 세포 표면 상에서 FLT3의 80% 하향조절을 유도하기 위한 최적의 수로서 웰당 1000개의 CHO를 결정하는, FLT3L-발현 CHO 세포에 대한 RS4;11 세포의 용량 반응 곡선을 보여준다. 도 7의 B는 모든 리드 후보가 CHO 세포 상의 세포 표면 FLT3L을 어느 정도로 저해하는 능력을 가진다는 것을 보여준다.
도 8의 A 및 B. ERK 신호전달 경로의 활성화 및 중화. 도 8A는 FLT3L에 의한 RS4;11 세포에서의 ERK 신호전달 활성화를 나타내는 개념검증(proof-of-concept) 연구를 보여준다. 도 8의 B는 상업적으로 입수 가능한 항체에 의한 FLT3L-유도 ERK 활성화의 저해를 보여준다.
도 9의 A 및 B. MEK 1/2 및 ERK 하류 신호전달의 리드 후보 차단. 도 9A는 1차 CD133+ 인간 줄기 세포에서 인간 FLT3L 유도된 MEK 1/2 인산화에 대한 리드 클론 후보의 기능적 활성을 보여준다. 도 9의 B는 판독으로서 ERK 인산화를 이용하는 1차 CD133+ 인간 줄기 세포에서의 FLT3L-유도 신호전달에 대한 리드 클론 기능적 활성의 추가적인 확인을 제공한다.
도 10의 A 및 B. 리드 후보의 표적 특이성 및 결합 역학. 도 10의 A는 클론 5D9에 대한 리드 클론 후보 및 FLT3-Fc의 III 단계 비닝(binning)을 나타낸다. 도 10의 B는 CAT5D9 이외의 모든 클론을 나타내는 바와 같은, CAT8에 대한 모든 리드 클론 및 FLT3-Fc의 III 단계 비닝을 나타낸다.
도 11의 A 및 B. huSCF 및 huCSF에 대한 리드 후보의 교차 반응성. 도 11의 A는 리드 후보가 구조적 상동체 huSCF에 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 도 11의 B는 리드 후보가 구조적 상동체 huCSF에 결합하지 않는다는 것을 보여준다.
도 12의 A 및 B. 클론 최적화. 도 12의 A는 판독으로서 RS4;11 FLT3 하향조절 분석을 이용하여 모 CAT5D9를 클론 6(C06)과 비교하는 클론 최적화의 제1 라운드 결과를 보여준다. 도 12B는 모 CAT5D9를 클론 6(C06) 및 최종 리드 후보: AM40 및 SC4017과 비교하는 클론 최적화의 제2 라운드 결과를 보여준다.
도 13의 A 및 B. 내인성 세포 표면 FLT3L의 효과적인 중화. 도 13의 A는 FLT3L-발현 CD4+ T 세포의 연속 희석에 반응한 RS4:11 FLT3 하향조절을 나타낸다. 도 13의 B는 리드 클론이 CD4+ T 세포 상의 활성 세포-표면 FLT3L을 완전히 중화시킨다는 것을 나타낸다.
도 14. 건강한 사이노몰거스 원숭이에서 중화 FLT3L의 연구 개요. 수컷 사이노몰거스 원숭이의 3개 그룹(그룹당 n=4)에 표시한 바와 같이 1개월에 걸쳐 5회의 매주 용량으로 0.03, 1 또는 30 ㎎/㎏의 AM40(MEDI1116)을 투여하였다. 투여된 항체의 지속성 및 순환 DC 집단에 대한 이의 효과를 결정하기 위해 최종 용량 후 8주의 후속 기간이 사용되었다.
도 15의 A 및 B. 항-FLT3L 항체(AM40/MEDI1116)의 투여 후 혈청 FLT3L 단백질 및 순환 DC 빈도. 도 15의 A는 0.03, 1.0 및 30 ㎎/㎏으로 투여 후 유리 혈청 FLT3L 수준을 측정하는, MEDI1116에 의한 표적 맞물림을 나타낸다. 제1일 내지 제8일에 매일 혈청을 측정하고, 이후에 제85일까지 매주 측정하였다. 도 15의 B는 MEDI1116에 의한 치료 후 기준 백분율로서 측정한 순환 CD1c+(고전적 DC) 빈도(좌) 및 형질세포양 DC 빈도(우)의 감소 및 회복을 도시한다.
도 16의 A 내지 D. 혈청 측정 및 T 세포의 유세포 분석을 비교하는 SLE 환자에서의 FLT3L-발현과 SLEDAI 스코어 상관관계의 측정. 도 16의 A는 건강한 공여자(HD) 및 SLE 환자 혈청 중의 FLT3L 수준을 도시한다. 도 16의 B는 혈청 FLT3L SLEDAI 스코어 사이의 상관관계를 도시한다. 도 16의 C는 건강한 공여자(HD) 및 SLE 환자에서의 순환 FLT3L+T 세포 빈도를 도시한다. 도 16의 D는 FLT3L+ CD4+ T 세포와 SLEDAI 스코어 사이의 상관관계를 도시한다.
도 17의 A 내지 C. CD4+ T 세포 하위집단에서의 FLT3L 발현 및 SLEDAI 스코어. 도 17의 A는 HD 및 SLE 환자에서 FLT3L을 발현시키는 CD4 T_naive 세포의 백분율을 도시한다. 하부 패널은 SLEDAI 스코어에 대한 SLE 환자에서 FLT3L을 발현시키는 CD4 T_naive 세포의 상관관계를 도시한다. 도 17의 B는 HD 및 SLE 환자에서 FLT3L을 발현시키는 CD4 T_MEM 세포의 백분율을 도시한다. 하부 패널은 SLEDAI 스코어에 대한 SLE 환자에서 FLT3L을 발현시키는 CD4 T_MEM 세포의 상관관계를 도시한다. 도 17의 C는 HD 및 SLE 환자에서 FLT3L을 발현시키는 CD4 T_CM 세포의 백분율을 도시한다. 하부 패널은 SLEDAI 스코어에 대한 SLE 환자에서 FLT3L을 발현시키는 CD4 T_naive 세포의 상관관계를 도시한다.
도 18의 A 내지 C. 근염을 갖는 개체로부터의 PBMC CD4 하위집단에서의 FLT3L 발현. 도 18의 A는 HD 및 근염 환자에서 FLT3L을 발현시키는 CD4 T_naive 세포의 백분율을 도시한다. 도 18의 B는 HD 및 근염 환자에서 FLT3L을 발현시키는 CD4 T_MEM 세포의 백분율을 도시한다. 도 18의 C는 HD 및 근염 환자에서 FLT3L을 발현시키는 CD4 T_CM 세포의 백분율을 도시한다.
도 19의 A 및 B. MRL 마우스에서의 단백뇨 및 신장염 스코어. 도 19A는 항-FLT3L 투여 후 17주에 단백뇨의 감소를 도시한다. 도 19B는 항-FLT3L 투여 후 18주에 신장염 스코어를 도시한다.
도 20의 A 내지 C. MRL 마우스에서의 비장 수지상 집단. 도 20의 A는 항-FLT3L 항체 투여 후 CD11+ siglec-H+pDC 빈도의 변화를 도시한다. 도 20의 B는 항-FLT3L 항체 투여 후 CD11 c+CD11b+mDC 빈도를 도시한다. 도 20의 C는 항-FLT3L 항체 투여 후 CD11c+CD8+mDC 빈도를 도시한다.
도 21의 A 및 B. NOD.H2h4 쇼그렌 증후군 마우스 모델에서의 침샘 병리 스코어. 도 21의 A는 아이소타입 대조군에 대한 항-FLT3L 항체의 치료적 투약 후 NOD.H2h4 쇼그렌 증후군 마우스 모델의 침샘 병리 변화를 나타낸다. 도 21의 B는 아이소타입 대조군에 대한 항-FLT3L 항체의 예방적 투약 후 NOD.H2h4 쇼그렌 증후군 마우스 모델의 침샘 병리 변화를 나타낸다.
도 22의 A 내지 D. 항-FLT3L 항체 투여 후 수지상 세포 존재의 변화. 도 22의 A 및 도 22의 B는 유세포 분석(A) 및 정량화(B)에 의해 나타낸, 항-FLT3L 항체 투여 후 형질세포양 DC 빈도(B220+CD11c+Siglec-H+) 변화를 도시한다. 도 22의 C 및 도 22의 D는 유세포 분석(C) 및 정량화(D)에 의해 나타낸, 항-FLT3L 항체 후 고전적 DC 빈도(B220^negCD11c^HI) 변화를 도시한다.
도 23의 A 내지 C. 사이노몰거스 원숭이에서 항-FLT3L 항체(MEDI1116) PK는 pDC의 억제 및 회복에 의해 확인되는 FLT3L의 기능적 중화와 상관관계가 있다. 화살표로 나타내는 바와 같이, 항-FLT3L 항체(MEDI1116)는 제1일, 제8일, 제15일, 제22일, 제29일에 1주 1회로 사이노몰거스 원숭이에 투여되었다. 도 23A는 항-FLT3L 항체(MEDI1116) PK를 도시한다. 도 23B는 0.03 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏, 및 30 ㎎/㎏의 항-FLT3L 항체(MEDI1116) 용량에서의 가용성 FLT3L 수준을 도시한다. 도 23C는 0.03 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏의 항-FLT3L 항체(MEDI1116) 용량에서의 기준의 백분율로서 측정된 pDC 빈도를 도시한다.
도 24의 A 내지 C. 항-FLT3L 항체(MEDI1116)에 대한 인간 투약 모델은 Q4W 투약으로 계획한다. 도 24의 A는 사이노몰거스 원숭이에서의 항-FLT3L 항체(MEDI1116) PK를 도시한다. 도 24의 B는 사이노몰거스 원숭이에서의 항-FLT3L 항체(MEDI1116) PD를 도시한다. 도 24의 C는 인간에서의 예측된 항-FLT3L 항체(MEDI1116) PD를 도시한다.
도 25의 A 및 B. 항-FLT3L 단클론성 항체(LFC-1)는 치료 과정 내내 FLT3L을 효과적으로 중화시키고, 순환 약물/리간드 복합체의 축적을 야기한다. 도 25A는 항-FLT3L 항체 및 아이소타입 대조군 항체를 투여한 후 유리 혈청 FLT3L 수준을 도시한다. 유리 FLT3L 수준은 포획으로서 FT3L-IgG 및 검출 시약으로서 설포-태그된 항-마우스 FLT3L 다클론성 항체를 이용하여 측정되었다. 도 25의 B는 항-FLT3L 항체 및 아이소타입 대조군 항체를 투여한 후 총(유리 및 결합) 혈청 FLT3L 수준을 도시한다. 포획 및 검출을 위해 다클론성 항-마우스 FLT3L 항체를 이용하여 총 FLT3L 수준을 측정하였다.
도 26의 A 내지 D. FLT3L의 차단은 고령의 NOD-H2 ^h4 마우스의 비장 및 SG-배수 림프절(lymph node: LN)에서 T 세포 활성화를 억제한다. 항-FLT3L 단클론성 항체(LFC-1)에 의한 FLT3L 차단은 (24 내지 26주령의 연구 마지막에) 비장 및 침샘-배수 LN에서의 항원 경험 CD44^HI CD4+ 및 CD8+ T 세포 빈도의 감소를 야기한다. 막대 그래프는 비장 및 배수 LN의 유세포분석으로부터 유래된다. 각각의 막대는 n = 4 내지 5마리 마우스의 평균 +/- 평균의 표준 오차(standard error of the mean: SEM)를 나타낸다. 도 26의 A는 항-FLT3L 항체 및 아이소타입 대조군 항체를 투여한 후 비장에서의 CD44^HI CD4+ T 세포 집단을 도시한다. 도 26의 B는 항-FLT3L 항체 및 아이소타입 대조군 항체를 투여한 후 LN에서의 CD44^HI CD4+ T 세포 집단을 도시한다. 도 26의 C는 항-FLT3L 항체 및 아이소타입 대조군 항체를 투여한 후 비장에서의 CD44^HI CD8+ T 세포 집단을 도시한다. 도 26의 D는 항-FLT3L 항체 및 아이소타입 대조군 항체를 투여한 후 LN에서의 CD44^HI CD8+ T 세포 집단을 도시한다.
도 27. 치료적 항-FLT3L 차단은 2개의 혈청 IgG 자가항체 특이성을 선택적으로 감소시킨다. 대응하는 혈청 샘플은 UTSW IgG 자가항체 분석에 의해 측정되었다.

본 발명은 FLT3L에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 양상에서, 이러한 분자는 FLT3L에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편이다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체는 염증 신호전달 경로의 활성화를 저해하는 FLT3/FLT3L 결합을 저해하거나 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 접근은 신호전달 공급원에서 염증을 공격하여 더 강력한 항-염증 치료 효과를 가능하게 하기 때문에 유리하다. 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 관련된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 또한 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 및 항원-결합 단편의 제조 방법뿐만 아니라 이용 방법, 예를 들어, 대상체에서 (직접 요법, 아주반트 요법 또는 병용 요법으로서) 자가면역 및/또는 만성 염증 질환을 치료하는 방법이 상정된다.

본 개시내용을 더 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 우선 특정 용어를 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체적으로 제시된다.

정의

본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한되지 않으며, 이에 따라 달라질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 당업자에게 본 개시내용에서 사용되는 용어 중 다수의 일반적 정의를 제공한다: 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)]; 문헌[The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)]; 문헌[The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 문헌[Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 다음의 용어는 달리 구체화되지 않는 한, 이하에 속하는 의미를 가진다.

본 개시내용에서 사용되는 용어 "항체"(또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체)는 항원에 결합할 수 있는 항체의 적어도 최소의 부분, 예를 들어, B 세포에 의해 생성된 전형적인 항체와 관련하여 적어도 중쇄(VH)의 가변 도메인 및 경쇄(VL)의 가변 도메인을 지칭한다. 척추동물계에서의 기본적 항체 구조는 상대적으로 잘 이해되고 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nd ed., 1988)] 참조. 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 다클론성, 단클론성, 인간, 인간화된 또는 키메라 항체, 에피토프-결합 단편(예를 들어, Fab, F(ab')₂, Fv, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, 이황화물-연결된 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인 중 하나를 포함하는 단편(Fd), Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 항원-결합 기능, 즉, 예를 들어, FLT3L에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 다른 항체 단편 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

전형적인 항체는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH 또는 V_H로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CHI, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL 또는 V_L로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, 즉, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 칭해지는 초가변 영역으로 추가로 나누어질 수 있으며, 그 사이에 프레임워크 영역(FW)으로 칭해지는 더 보존된 영역이 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FW로 구성된다: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(Clq)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 항체는 항-FLT3L 항체(본래 및 생식세포계열), 친화도 최적화된 클론, ADCC를 결여하는 최적화된 항체, 접합된 항체(예를 들어, ADC), 및 다른 최적화된 항체를 포함한다(예를 들어, YTE 돌연변이를 포함하는, 예를 들어, 혈청 반감기-최적화된 항체, 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 문헌[Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-24 (2006)] 및 미국 특허 제7,083,784호 참조).

특정 실시형태에서, VH의 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 VL의 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)은 (a) 각각 서열번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34; 또는 (b) 각각 서열번호 29, 30, 31, 35, 33 및 34; 또는 (c) 각각 서열번호 29, 36, 37, 32, 33 및 38의 아미노산 서열로 이루어진다.

항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로서 지칭되는 이들의 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기반하여, 임의의 5가지 주요 부류 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 이들의 하위부류(아이소타입)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 면역글로불린을 가질 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린은 상이하고 잘 알려진 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치를 가진다. 항체는 네이키드(naked)이거나, 다른 분자, 예컨대 독소, 방사성동위원소 등에 접합되어 ADC를 형성할 수 있다.

"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는, 이것이 결합하는 항원, 예컨대 FLT3L의 생물학적 활성을 저해하거나 감소시키는 것이다. 특정 양상에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 저해한다. 예를 들어, FLT3의 FLT3L-매개 활성화는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 심지어 100%만큼 감소될 수 있다.

용어 "FLT3L 항체", "FLT3L에 결합하는 항체" 또는 "항-FLT3L 항체"는 분자가 FLT3L을 표적화함에 있어서 치료제 또는 진단 시약으로서 유용하도록 충분한 친화도로 FLT3L에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 용어 "항-FLT3L"은 또한, 예를 들어, 스캐폴드에 혼입된 본 명세서에 개시된 항체의 CDR을 포함하는 분자를 광범위하게 포함한다.

용어 "생식세포계열화"는 항체의 특정 위치에서 아미노산이 생식세포계열에서 아미노산으로 다시 돌연변이되는 것을 의미한다.

항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 조합하여 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 3개의 CDR 영역에 의해 연결된 4개의 FW 영역으로 이루어진다. 각각의 쇄에서 CDR은 FW 영역에 의해 매우 근접하게 함께 보유되고, 다른 쇄로부터의 CDR에 의해, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2가지의 기법이 있다: (1) 교차-종 서열 가변성에 기반한 접근(즉, 문헌[Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기반한 접근(Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). 추가로, 이들 두 접근의 조합은 CDR을 결정하기 위해 당업계에서 때때로 사용된다.

Kabat 넘버링 체계는 가변 도메인 내 잔기(대략 경쇄의 잔기 1 내지 107 및 중쇄의 잔기 1 내지 113)를 언급할 때 일반적으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조).

어구 "Kabat에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 또는 "Kabat 위치" 등은 문헌[Kabat et al., 1991] 내 항체 모음집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용되는 넘버링 체계를 지칭한다.

용어 "항원-결합 도메인", "항원-결합 단편", 및 "결합 단편"은 항체와 항원 사이에 특정 결합을 초래하는 아미노산을 포함하는 항체 분자의 부분을 지칭한다. 가변 영역은 항체 또는 항원-결합 단편이 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 것을 가능하게 한다. 즉, 3차원 항원 결합 부위를 정하는 가변 영역을 형성을 형성하기 위해 항체의 VH 및 VL 도메인, 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 하위집단이 조합된다. 더 구체적으로는, 항원-결합 도메인은 VH 및 VL 쇄 각각에서 3개의 CDR에 의해 정해진다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 항원-결합 도메인과의 특정 상호작용을 초래하는 항원 분자의 일부는 "에피토프"로서 지칭된다. 항원-결합 도메인은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역 및 항체 중쇄 가변 영역을 포함하지만, 반드시 둘 다를 포함하지는 않는다. 예를 들어, 소위 "Fd" 항체 단편은 VH 도메인만으로 이루어지지만, 여전히 무손상 항체의 일부 항원-결합 기능을 보유한다.

항체의 결합 단편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성된다. 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 단일쇄 항체를 포함한다. 효소 파파인에 의한 항체의 분해는 항원-결합 활성을 갖지 않지만 결정화하는 능력을 갖는, "Fab" 단편 및 "Fc" 단편으로도 알려진 2개의 동일한 항원-결합 단편을 초래한다. 효소 펩신에 의한 항체의 분해는 항체 분자의 두 아암(arm)이 연결된 채로 남아있고, 2개의 항원-결합 부위를 포함하는 F(ab')2 단편을 초래한다. F(ab')2 단편은 항원을 가교하는 능력을 가진다. "Fv"는 본 명세서에서 사용될 때 항원-인식 부위와 항원-결합 부위를 둘 다 보유하는 항체의 최소 단편을 지칭한다. "Fab"는 본 명세서에서 사용될 때, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.

본 명세서에서 사용될 때, Fc 영역은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대한 N-말단의 가요성 힌지를 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우 Fc는 J 쇄를 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc는 면역글로불린 도메인 C감마2 및 C감마3(Cy2 및 Cy3) 및 C감마l(Cyl)과 C감마2(Cy2) 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 이의 카복실-말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 정의되되, 넘버링은 문헌[Kabat et al., 1991]에 제시된 바와 같은 EU 색인에 따른다.

"단클론성 항체"는 단일 항원 결정소 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관련된 동질 항체 집단을 지칭한다. 이는 상이한 항원성 결정소로 향하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론성 항체와 대조적이다.

용어 "단클론성 항체"는 무손상(intact)과 전장 단클론성 항체뿐만 아니라 항체 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일쇄 가변 단편(scFv), 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 더 나아가, "단클론성 항체"는, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 및 유전자이식 동물(예를 들어, 유전자이식 마우스에서 인간 항체의 발현)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다수의 방법으로 생성된 이러한 항체를 지칭한다.

용어 "인간화된 항체"는 인간에서 생성된 항체 변이체에 대한 유사성을 증가시키도록 조작된 비인간(예를 들어, 뮤린) 면역글로불린으로부터 유래된 항체를 지칭한다.

용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체, 또는 당업계에 공지된 임의의 기법(예를 들어, 배양 세포에서의 재조합 발현, 또는 유전자이식 동물에서의 발현)을 이용하여 만들어진 인간에 의해 생성된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다. 따라서, 용어 “인간 항체”는 또한 인간(또는 조작된 변이체 또는 이의 유도체)에 의해 본래 생성되지만 비인간 시스템에서 발현되는(예를 들어, 화학적 합성에 의해 생성되거나; 미생물, 포유류 또는 곤충 세포에서 재조합적으로 발현되거나; 또는 동물 대상체에서 발현되는) 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 따라서, 인간 대상체로부터 또는 인간 세포(예를 들어, 재조합 항체 또는 이의 단편을 발현시키는 하이브리도마 또는 세포주)로부터 얻고, 후속적으로 동물, 예를 들어, 마우스에서 발현된 항체는 인간 항체로 간주된다. 인간 항체의 이런 정의는 무손상 또는 전장 항체, 이의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체, 예를 들어, 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.

용어 "키메라 항체"는, 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 둘 이상의 동일 종으로부터 유래된, 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄와 중쇄 둘 다의 가변 영역은 목적하는 특이성, 및/또는 친화도, 및/또는 능력을 갖는 포유류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)의 하나의 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 대응하는 한편, 불변 영역은 해당 종에서 면역 반응의 유발을 피하기 위해 다른 종(보통 인간)으로부터 유래된 항체에서의 서열에 상동성이다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 핵산뿐만 아니라 복수의 핵산을 포함하는 것으로 의도되며, 단리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들어, 전령 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비통상적 결합(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 하나 이상의 핵산 세그먼트, 예를 들어, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA로 의도된다. 예를 들어, 벡터에 함유된 폴리펩티드 서브유닛을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 바와 같이 단리되는 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가적인 예는 이종성 숙주 세포에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오티드 포함한다. 단리된 RNA 분자는 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성에 의해 생성된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 추가로, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자이거나, 이들을 포함할 수 있다.

특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우에, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 정상적으로는 하나 이상의 암호화 영역과 작동 가능하게 연관된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소를 포함할 수 있다. 작동 가능한 연관 또는 연결은, 유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현을 배치시키는 것과 같은 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연관되는 것이다. 두 DNA 단편(예컨대 폴리펩티드 암호화 영역 및 이와 연관된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 초래한다면 그리고 두 DNA 단편 사이의 연결 특성이 발현 조절 서열이 유전자 산물의 발현을 지시하는 능력을 방해하지 않거나 또는 DNA 주형이 전사되는 능력을 방해하지 않는다면, "작동 가능하게 연관되거나" 또는 "작동 가능하게 연결된다". 따라서, 프로모터가 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 전사를 달성할 수 있었다면, 프로모터 영역은 해당 핵산과 작동 가능하게 연관된다. 프로모터는 사전결정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 제어 요소, 예를 들어, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사종결 신호는 세포-특이적 전사를 지시하기 위해 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연관될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역은 본 명세서에 개시된다.

다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 전령 RNA(mRNA)의 형태의 RNA일 수 있다.

"벡터"는 숙주 세포 내로 도입되어, 형질전환된 숙주 세포를 생성하는 핵산 분자이다. 벡터는 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제기점을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전자 요소를 포함할 수 있다.

"형질전환된" 세포 또는 "숙주" 세포는 핵산 분자가 분자 생물학 기법에 의해 도입된 세포이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “형질전환”은 바이러스 벡터에 의한 형질감염, 플라스미드 벡터에 의한 형질전환, 및 전기천공법, 리포펙션 및 유전자총 가속화에 의한 네이키드 DNA의 도입을 포함하는, 핵산 분자가 이러한 세포에 도입될 수 있는 모든 기법을 포함한다. 형질전환 세포 또는 숙주 세포는 박테리아 세포 또는 진핵 세포일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "FLT3L"은 고양이 맥도너 육종(FMS)-유사 티로신 키나제 3 수용체(FLT3) 수용체에 결합하는 조혈 사이토카인인 폴리펩티드, 즉, FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드를 지칭한다. FLT3L은 가용성 형태로 효소적으로 절단되기 전에, 막-결합 단백질로서 초기에 발현된다. 막 결합(mFLT3L)과 분비(sFLT3L)는 둘 다 FLT3L의 정의에 포함된다.

본 개시내용에서, "포함한다(comprises)", "포함하는(comprising)", "함유하는(containing)" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 이들에 부여하는 의미를 가질 수 있고, "포함한다(includes)", "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어지다"는 마찬가지로 미국 특허법에서 부여하는 의미를 갖고, 상기 용어는 제약을 두지 않아서, 열거된 것의 기본적 또는 신규한 특징이 열거된 것 이상의 존재에 의해 변화되지 않으며, 선행 기술의 실시형태를 제외한다면, 열거된 것 이상의 존재를 가능하게 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "결정하는", "평가하는", "분석하는", "측정하는" 및 "검출하는"은 정량적 결정과 정성적 결정을 둘 다 지칭하고, 이렇게 해서, 용어 "결정하는"은 본 명세서에서 "분석하는", "측정하는" 등과 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 정량적 결정이 의도되는 경우에, 분석물 등의 "양을 결정하는"이라는 어구가 사용될 수 있다. 정성적 및/또는 정량적 결정이 의도되는 경우에, 분석물의 "수준을 결정하는" 또는 분석물을 "검출하는"이라는 어구가 사용된다.

둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성 백분율"은, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않는 최대 대응도를 비교하고 정렬할 때(필요하다면, 갭을 도입할 때), 동일한 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭하거나, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 구체화된 백분율을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 동일성 백분율은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용하여 또는 외관 검사에 의해 측정될 수 있다. 문헌[Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877]에서 변형된 바와 같고, NBLAST 및 XBLAST 프로그램(Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402)에 포함되는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268] 참조). 특정 실시형태에서, 갭핑된 BLAST는 문헌[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. BLAST-2, WU-BLAST-2(Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2(캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재한 제넨테크(Genentech)) 또는 Megalign(DNASTAR).

용어 "단리된"은 천연 환경에 있지 않은 분자를 지칭한다. 특별한 정제 수준이 요구되지는 않는다. 예를 들어, 단리된 항체는 천연 또는 자연적 환경에서 생성 또는 위치되지 않는 항체이다. 재조합적으로 생성된 생물학적 물질은 비천연 세포, 예컨대 하이브리도마에서 생성된 물질과 같이, 본 명세서에 개시된 대로 단리된 것으로 간주된다. 물질, 예를 들어, 단리된 단백질, 예컨대 항체는 또한 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획화되거나 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된다면 "단리된" 것으로 고려된다. 예를 들어, 항체는, 세포 물질 또는 이것이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 다른 단백질이 실질적으로 없다면, "단리된"으로 간주된다.

용어 "특이적으로 결합하다"는 분자(예를 들어, 수용체 또는 에피토프)를 인식하고, 이에 결합하며, 결합이 제제(예를 들어, 항체)와 분자(예를 들어, 리간드) 사이의 일부 상보성을 수반하는 제제(예를 들어, 리간드 또는 항체)를 지칭한다. 본 정의에 의해, 항체는 이것이 무작위의 관련 없는 분자에 결합할 때보다 더 용이하게 리간드에 결합할 때에 해당 리간드에 "특이적으로 결합하는" 것으로 언급된다. 용어 "특이성"은 특정 항체가 특정 리간드에 결합하는 상대적 친화도의 자격을 부여하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"보다 주어진 리간드(예를 들어, FLT3L)에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 여겨질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "친화도"는 항체의 CDR과 개개 에피토프의 결합 강도의 척도를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nd ed. 1988)]의 27 내지 28페이지 참조. 본 명세서에서 사용되는 용어 "결합활성"은 항체 집단과 항원 간의 복합체의 전반적 안정성, 즉, 항원과 항체 혼합물의 기능적 조합 강도를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Harlow]의 39 내지 34 페이지 참조. 결합활성은 특정 에피토프를 갖는 집단에서 개개 항체의 친화도와 또한 항체와 항원의 결합가 둘 다에 관한 것이다.

용어 "저해하다" 또는 "차단하다"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되며, 활성의 완전한 차단을 포함하는 생물학적 활성의 임의의 통계학적으로 유의한 감소를 지칭한다. 예를 들어, "저해"는 생물학적 활성의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 감소를 지칭한다.

용어 "효과기 기능"은 항체의 Fc 성분과 Fc 수용체 또는 보체의 성분의 상호작용으로부터 초래되는 항체의 활성을 지칭한다. 이들 활성은, 예를 들어, 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC), 보체-의존적 세포독성(CDC) 및 항체-의존적 세포 식세포작용(ADCP)을 포함한다. 따라서, 변경된 효과기 기능을 갖는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 적어도 하나의 효과기 기능(예를 들어, ADCC, CDC 및/또는 ADCP)의 활성을 변화시키는 Fc 영역의 변경(예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가 또는 올리고당의 변화)을 함유하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 지칭한다. 개선된 효과기 기능을 갖는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 적어도 하나의 효과기 기능(예를 들어, ADCC, CDC 및/또는 ADCP)의 활성을 증가시키는 Fc 영역의 변경(예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가 또는 올리고당의 변화)을 함유하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 지칭한다.

용어 "대상체"는, 특정 치료의 수용자가 되는 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 동물(예를 들어, 포유류)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자" 및 "개체"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다. 대상체의 추가적인 예는 비인간 포유류, 예컨대 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함한다.

용어 "약제학적 조성물"은, 조성물이 투여되는 대상체에 허용할 수 없는 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않으면서, 활성 성분(예를 들어, 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체)의 생물학적 활성을 효과적이게 만드는 형태의 제제를 지칭한다. 이러한 조성물은 멸균 상태일 수 있다.

본 명세서에 개시된 바와 같은 항-FLT3L 항체의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하는 데 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적에 관해 경험적으로 그리고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다.

용어 "치료적 유효량" 및 "약제학적 유효량"은 대상체에서 질환 또는 장애를 "치료하는" 데 효과적인 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 다른 약물의 양이다.

"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위해" 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키기 위해"와 같은 용어는 (1) 진단된 병리학적 병태 또는 장애를 치유하고/하거나, 늦추고/늦추거나, 이의 증상을 줄이고/줄이거나, 이의 진행을 중단시키는 치료적 조치, 및 (2) 표적화된 병리학적 병태 또는 장애의 발달을 예방하고/하거나 늦추는 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료가 필요한 대상은 이미 장애가 있는 대상; 장애를 갖기 쉬운 대상; 및 장애가 예방될 대상을 포함한다. 특정 양상에서, 환자가, 예를 들어, 자가면역 또는 염증 질환과 연관된 증상의 전체적, 부분적 또는 일시적인 감소를 나타낸다면, 대상체는 본 개시내용의 방법에 따른 자가면역 또는 염증 질환에 대해 성공적으로 "치료된다".

본 명세서에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 장애 및/또는 이와 연관된 증상을 감소시키고/시키거나 개선시키는 것을 지칭한다. 불가능하지 않다고 하더라도, 장애 또는 병태를 치료하는 것은 장애, 병태 또는 이와 연관된 증상이 완전히 제거되는 것을 필요로 하지는 않는다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 상정된 바와 같이, 장애의 치료는 장애 증상의 악화를 방지하는 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 구체적으로 언급되거나 문맥상 명백히 반대의 의미가 아니라면, 포괄적인 것으로 이해된다. 본 명세서에서 사용되는 단수의 용어는 문맥으로부터 대조적인 것이 구체적으로 언급되지 않거나 또는 분명하지 않다면, 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.

더 나아가, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 둘 이상의 명시된 특징 또는 성분 각각을 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 구체적으로 개시하는 것으로서 쓰일 것이다. 따라서, 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은, "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 "및/또는"은 다음의 실시형태 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; 및 A(단독); B(단독); 및 C(단독).

구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 분명하지 않다면, 본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은, 예를 들어, 평균의 표준 편차 2 이내에서 당업계의 정상적인 허용오차 범위 내인 것으로 이해된다. "약"은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 초과 또는 미만 이내인 것으로 이해될 수 있다. 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에 제공된 모든 수치적 값은 암묵적으로 용어 "약"에 의해 한정되는 것으로 간주된다.

FLT3L은 가용성 형태로 효소적으로 절단되기 전에, 막-결합 단백질로서 초기에 발현된다. 막 결합(mFLT3L)과 분비(sFLT3L)는 둘 다 기능적으로 활성이다. FLT3L 결합 영역은 종에 걸쳐 고도로 보존되기 때문에, 인간, 설치류 및 사이노몰거스 리간드/수용체 조합 간에 종간 반응성이 관찰된다. 그러나, 결합 부위 주변의 중요한 돌연변이는 FLT3L에 대해 생성된 중화 항체의 종간 반응성의 결여를 설명하는 것으로 생각된다. FLT3L에 대한 중화 항체는 고전적 및 형질세포양 DC 집단에 영향을 미쳐서, 면역계가 장기적인 염증 반응을 유도하고 지속하는 능력을 감소시킬 수 있다. 2차 효과는 순환 NK 세포의 감소 및 감소된 T 및 B-세포 활성화를 포함하여, 세포 유형 둘 다의 감소된 생존을 야기할 수 있다. 총괄적으로, 이들 경로의 하향 조절은 자가면역 염증을 감소시킬 수 있다.

일 실시형태에서, 중화 항-FLT3L 항체는 FLT3L이 FLT3에 결합하는 것을 저해함으로써 면역 항상성을 촉진시킨다는 것이 상정된다. 항-FLT3L 항체 전략은 예상치 못한 수용체 이량체화 또는 신호전달의 위험을 피하기 위해 수용체 위의 리간드를 표적화한다. 이의 수용체와 달리, 막-결합된 FLT3L과 연관된 신호전달 도메인은 없다.

항-FLT3L 항체

본 개시내용은 바람직한 실시형태에서, 단리된 FLT3L 결합 분자, 예를 들어, FLT3L, 예를 들어, 인간 FLT3L에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. FLT3L에 대한 전장 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 인간 FLT3L에 대한 UniProt 수탁 번호 P36888, 또는 마우스 FLT3L에 대한 UniProt 수탁 번호 Q00342). 본 개시내용의 항-FLT3L 항체는 FLT3의 FLT3L-매개 활성화를 저해하고, 이에 의해 전염증 신호전달을 감소시키고, 대상체에서의 염증을 감소시킨다.

바람직한 실시형태에서, 항-FLT3L 항체는 구조적으로 유사한 TKR 상동체 인간 줄기 세포 인자(huSCF) 또는 인간 집락 자극 인자(huCSF1)와 교차 반응하지 않는다. 당업자는 SCF 및 CSF가 또한 티로신 키나제 수용체에 결합하는 리간드라는 것을 인식할 것이다. 추가적인 티로신 키나제 패밀리 구성원에 결합하는 비특이적 FLT3 저해제는 티로신 키나제 신호전달의 전반적 저해로부터 독성을 야기한다. 따라서, 항-FLT3L 항체가 FLT3L에만 결합하고, 구조적으로 유사한 상동체에는 결합하지 않는다는 것은 중요하다. 다수의 항-FLT3L 항체 및 저해제는 특이성을 결여하며, 다양한 티로신 키나제 수용체에 결합한다. 따라서, 항-FLT3L 항체는 바람직한 실시형태에서, FLT3L에 대한 높은 친화도 및 특이적 결합을 입증하여야 한다.

일 실시형태에서, 본 개시내용의 항-FLT3L 항체는 단클론성 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 및/또는 키메라 항체이다.

일부 양상에서, FLT3L 결합 분자는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, 단일쇄 Fv 또는 scFv, 이황화물 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgG CH2, 미니바디, F(ab')₃ 테트라바디, 트리어바디(triabody), 디어바디(diabody), 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb², (scFv)₂, 또는 scFv-Fc를 포함한다. 일부 양상에서, 항-FLT3L 항체는, 예를 들어, IgG1 유형(IgG1 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함함)의 IgG 유형을 가진다. 다른 실시형태에서, 항-FLT3L 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 가진다.

일부 실시형태에서, IgG 불변 영역은 Ig 카파 불변 도메인(영역) 및 Ig 람다 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 일 특정 실시형태에서, 항-FLT3L 항체는 인간 IgG1 불변 도메인 및 인간 람다 불변 도메인을 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, 항-FLT3L 항체는, Fc 영역 내 표적화된 돌연변이가 243번의 류신을 페닐알라닌(L243F)으로, 235번의 류신을 글루탐산(L235E)으로, 그리고 331번의 프롤린을 세린(P331S)으로 바꾸도록, IgG1-TM 형식을 가지며; 아미노산 넘버링은 EU 색인에 따른다. 표적화된 돌연변이는 FcR 결합 및 ADCC 효과기 기능을 감소시킨다(참고로 포함된 문헌[Organesyan et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr . 2008 Jun 1; 64(Pt 6): 700-4]; 및 WO 2009100309 A2 참조).

일부 양상에서, 항-FLT3L 항체는 인간 항체이다(예를 들어, CAT5D9, SC4017, AM40, CAT8, CAT26, DTAX3 및 DYAX5 항체).

CAT5D9 항체

일 실시형태에서, CAT5D9 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 상보성-결정 영역(CDR): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체를 지칭한다. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열번호 29, 36, 37, 32, 33 및 38의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시형태에서, CAT5D9 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 서열번호 6의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

추가 실시형태에서, CAT5D9 항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, CAT5D9 항체는 서열번호 20의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VL 도메인 및 서열번호 19의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

일 실시형태에서, CAT5D9 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 IgG1 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, CAT5D9 항체는 서열번호 72의 핵산 서열에 의해 암호화된 경쇄 및 서열번호 71의 핵산 서열에 의해 암호화된 중쇄를 포함하는 항체를 지칭한다.

SC4017 항체

일 실시형태에서, SC4017 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 상보성-결정 영역(CDR): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체를 지칭한다. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열번호 29, 30, 31, 35, 33 및 34의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시형태에서, SC4017 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 서열번호 4의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

추가 실시형태에서, SC4017 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, SC4017 항체는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VL 도메인 및 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

일 실시형태에서, SC4017 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 IgG1 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, SC4017 항체는 서열번호 68의 핵산 서열에 의해 암호화된 경쇄 및 서열번호 67의 핵산 서열에 의해 암호화된 중쇄를 포함하는 항체를 지칭한다.

AM40(MEDI1116) 항체

일 실시형태에서, AM40 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 상보성-결정 영역(CDR): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체를 지칭한다. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시형태에서, AM40 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

추가 실시형태에서, AM40 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, AM40 항체는 서열번호 16의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VL 도메인 및 서열번호 15의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

일 실시형태에서, AM40 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 IgG1 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, AM40 항체는 서열번호 64의 핵산 서열에 의해 암호화된 경쇄 및 서열번호 63의 핵산 서열에 의해 암호화된 중쇄를 포함하는 항체를 지칭한다.

CAT8 항체

일 실시형태에서, CAT8 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 상보성-결정 영역(CDR): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체를 지칭한다. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 및 44의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시형태에서, CAT8 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 서열번호 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

추가 실시형태에서, CAT8 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, CAT8 항체는 서열번호 22의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VL 도메인 및 서열번호 21의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

일 실시형태에서, CAT8 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 IgG1 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, CAT8 항체는 서열번호 76의 핵산 서열에 의해 암호화된 경쇄 및 서열번호 75의 핵산 서열에 의해 암호화된 중쇄를 포함하는 항체를 지칭한다.

CAT26 항체

일 실시형태에서, CAT26 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 상보성-결정 영역(CDR): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체를 지칭한다. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열번호 45, 40, 46, 47, 48 및 49의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시형태에서, CAT26 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 서열번호 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

추가 실시형태에서, CAT26 항체는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, CAT26 항체는 서열번호 24의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VL 도메인 및 서열번호 23의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

일 실시형태에서, CAT26 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 IgG1 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, CAT26 항체는 서열번호 80의 핵산 서열에 의해 암호화된 경쇄 및 서열번호 79의 핵산 서열에 의해 암호화된 중쇄를 포함하는 항체를 지칭한다.

DYAX3 항체

일 실시형태에서, Dyax3 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 상보성-결정 영역(CDR): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체를 지칭한다. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열번호 50, 51, 52, 53, 54 및 55의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시형태에서, Dyax3 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 서열번호 82의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 81의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

추가 실시형태에서, Dyax3 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, Dyax3 항체는 서열번호 26의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VL 도메인 및 서열번호 25의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

일 실시형태에서, Dyax3 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 IgG1 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, Dyax3 항체는 서열번호 84의 핵산 서열에 의해 암호화된 경쇄 및 서열번호 83의 핵산 서열에 의해 암호화된 중쇄를 포함하는 항체를 지칭한다.

DYAX5 항체

일 실시형태에서, Dyax5 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 상보성-결정 영역(CDR): HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체를 지칭한다. HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열번호 56, 57, 52, 58, 59 및 60의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시형태에서, Dyax5 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고, 서열번호 86의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 85의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

추가 실시형태에서, Dyax5 항체는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VL 도메인 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, Dyax5 항체는 서열번호 28의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VL 도메인 및 서열번호 27의 핵산 서열에 의해 암호화된 2개의 VH 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.

일 실시형태에서, Dyax5 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하고 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 IgG1 항체를 지칭한다.

다른 실시형태에서, Dyax5 항체는 서열번호 88의 핵산 서열에 의해 암호화된 경쇄 및 서열번호 87의 핵산 서열에 의해 암호화된 중쇄를 포함하는 항체를 지칭한다.

특정 실시형태에서, 상보성-결합 영역(CDR)의 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, FLT3L에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되되, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 (a) 각각 서열번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34; 또는 (b) 각각 서열번호 29, 30, 31, 35, 33 및 34; 또는 (c) 서열번호 29, 36, 37, 32, 33 및 38의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 다음의 순서로 배열되는 3개의 CDR 및 4개의 프레임워크 영역(FW)을 포함한다: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3 및 FW4.

특정 양상에서, VH 및 VL 영역은 (a) 각각 서열번호 1 및 서열번호 2; 또는 (b) 각각 서열번호 3 및 서열번호 4; 또는 (c) 각각 서열번호 5 및 서열번호 6에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다.

특정 양상에서, VH의 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 VL의 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)은: (a) 각각 서열번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34; 또는 (b) 각각 서열번호 29, 30, 31, 35, 33 및 34; 또는 (c) 각각 서열번호 29, 36, 37, 32, 33 및 38의 아미노산 서열로 이루어진다.

항-FLT3L 항체 서열의 요약 표를 이하의 표 1에 제시한다.

유도체

본 개시내용의 항-FLT3L 항체는 FLT3L에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 제공된 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 당업계에 잘 공지된 기법을 이용하여 당업자에 의해 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가는 항-FLT3L 항체가 이들의 에피토프에 결합하는 것을 방지하는 항체의 FR 영역에서 그리고/또는 CDR에서 만들어질 수 있다. FR에서의 변화는 보통 항원 결합 도메인의 안정성 및 면역원성을 개선시키도록 설계되지만, CDR에서의 변화는 전형적으로 항원 결합 도메인의 표적에 대한 친화도를 증가시키도록 설계된다. FR의 변이체는 또한 자연 발생적 면역글로불린 알로타이프(allotype)를 포함한다. 이러한 친화도-증가 변화는 CDR 변경 및 항원 결합 도메인의 표적에 대한 친화도 시험을 수반하는 일상적인 기법에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 개시된 CDR 중 어느 하나 내에서 생성될 수 있다. 문헌[Antibody Engineering, 2nd ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995]에 기재된 방법에 따라 다양한 변경이 만들어질 수 있다. 이들 변경은 서열 내의 기능적으로 동등한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되어, "침묵" 변화를 생성하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 비극성 아미노산은 알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

본 개시내용의 항체의 유도체 및 유사체는 재조합 및 합성 방법을 비롯하여 당업계에 잘 공지된 다양한 기법에 의해 생성될 수 있다(문헌[Maniatis (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.] 및 문헌[Bodansky et al. (1995) The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed., Spring Verlag, Berlin, Germany]).

일 실시형태에서, 본 개시내용의 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인의 제조 방법은 본 발명에 개시된 VH 도메인의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산을 첨가, 결실, 치환 또는 삽입하는 단계, 선택적으로 이렇게 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계, 및 항원에의 특이적 결합을 위한 VH 도메인 또는 VH/VL 조합 또는 조합들을 시험하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체가 하나 이상의 VH 도메인과 조합되는 유사한 방법이 사용될 수 있다.

β-락타마제 유전자에 관한 기법을 기재하지만, 접근이 항체 생성에 대해 사용될 수 있다는 것을 관찰한 Stemmer(Nature (1994) 370: 389-391)에 의해 유사한 셔플링 또는 조합 기법이 또한 개시된다.

추가 실시형태에서, 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이유발을 이용하여 본 명세서에 개시된 서열로부터 유래된 하나 이상의 서열을 운반하는 신규한 VH 또는 VL 영역을 생성할 수 있다. 한 가지 이러한 기법인, 실수 유발 PCR은 문헌[Gram et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 3576-3580)]에 의해 기재되어 있다.

사용될 수 있는 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR에 대한 돌연변이유발을 지시하는 것이다. 이러한 기법은 문헌[Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91: 3809-3813)] 및 문헌[Schier et al. (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551-567)]에 의해 개시되어 있다.

유사하게, 항원 결합 도메인의 1개, 2개 또는 3개의 CDR 모두 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리에 접합될 수 있고, 이는 이어서, FLT3L에 특이적인 항원-결합 단편에 대해 선별된다.

본 명세서에서 유용한 면역글로불린 가변 도메인의 일부는 본 명세서에 실질적으로 제시된 바와 같은 CDR 중 적어도 하나 및, 선택적으로 본 명세서에 제시된 바와 같은 scFv 단편으로부터의 개재 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 상기 부분은 FR1 및 FR4 중 하나 또는 둘 다의 적어도 약 50%를 포함할 수 있으며, 상기 50%는 FR1의 C-말단의 50% 및 FR4의 N-말단의 50%이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N-말단 또는 C-말단에서 추가적인 잔기는 자연 발생적 가변 도메인 영역과 정상적으로 연관되지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의한 항체의 작제는 클로닝 또는 다른 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입된 링커에 의해 암호화된 N-말단 또는 C-말단의 잔기의 도입을 초래할 수 있다. 다른 조작 단계는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 추가적인 단백질 서열에 가변 도메인을 결합시키기 위한 링커, 다른 가변 도메인(예를 들어, 디아바디(diabody)의 생성에서), 또는 이하에 더욱 상세히 논의되는 바와 같은 단백성 표지의 도입을 포함한다.

본 명세서에 기재된 개시내용의 항원 결합 도메인은 다른 기능적 분자, 예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질(알부민, 다른 항체 등)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 화학적 가교에 의해 또는 재조합 방법에 의해 연결될 수 있다. 항원 결합 도메인은 또한 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 연결될 수 있다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어, 이들의 순환 반감기를 증가시키기 위해, 중합체에 대한 공유적 접합에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 예시적인 중합체 및 이들을 부착하는 방법은 또한 미국 특허 제4,766,106호; 제4,179,337호; 제4,495,285호 및 제4,609,546호에 나타나 있다.

개시된 항체는 또한 천연 패턴과 상이한 글리코실화 패턴을 갖도록 변경될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 탄수화물 모이어티는 결실될 수 있고/있거나 하나 이상의 글리코실화 부위가 첨가될 수 있다. 본 명세서에 개시된 항체 단편에 대한 글리코실화 부위의 첨가는 당업계에 공지된 글리코실화 부위 공통 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 항체 단편 상의 탄수화물 모이어티 수를 증가시키는 다른 수단은 항체의 아미노산 잔기에 글리코사이드의 화학적 또는 효소적 결합에 의한다. 이러한 방법은 WO 87/05330, 및 문헌[Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306]에 기재되어 있다. 항체로부터의 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는, 예를 들어, 문헌[Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52]; 및 문헌[Edge et al. (1981) Anal. Biochem., 118: 131] 및 문헌[Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350]에 의해 기재된 바와 같이, 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 항체 단편은 또한 검출 가능한 표지 또는 기능성 표지로 태그될 수 있다. 검출 가능한 표지는 또한 통상적인 화학을 이용하여 항체 단편에 부착될 수 있는 방사성표지, 예컨대 131I 또는 99Tc를 포함한다. 검출 가능한 표지는 또한 효소 표지, 예컨대 겨자무과산화효소 또는 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 검출 가능한 표지는 구체적 동족 검출 가능 모이어티, 예를 들어, 표지된 아비딘에 대한 결합을 통해 검출될 수 있는 화학적 모이어티, 예컨대 바이오틴을 추가로 포함한다.

CDR 서열이 본 명세서에 제시된 것과 상당하지 않게만 상이한 항원 결합 도메인은 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 전형적으로, 아미노산은 유사한 전하, 소수성 또는 입체화학적 특징을 갖는 관련된 아미노산으로 치환된다. 이러한 치환은 당업자의 보통의 기술 내에 있을 것이다. CDR에서와 달리, 항체의 결합 특성에 유해하게 영향을 미치는 일 없이 FR에 더 실질적인 변화가 만들어질 수 있다. FR에 대한 변화는 비인간 유래의 인간화 또는 항원 접촉에 또는 결합 부위 안정화에 중요한 특정 프레임워크 잔기의 조작, 예를 들어, 불변 영역의 부류 또는 하위부류 변화, 예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호 및 문헌[Lund et al. (1991) J. Immun. 147: 2657-2662] 및 문헌[Morgan et al. (1995) Immunology 86: 319-324]에 기재된 바와 같은 효과기 기능, 예컨대 Fc 수용체 결합을 변경시킬 수 있는 특정 아미노산 잔기의 변화, 또는 불변 영역이 유래된 종의 변화를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

당업자는 상기 기재한 변형이 모두 완전하지는 않으며, 본 명세서에 기재된 단백질 서브유닛에 적용될 수 있고, 본 개시내용의 교시에 비추어 다수의 다른 변형이 당업자에게 가능하다는 것을 인식할 것이다.

항-FLT3L 항체 친화도 및 특이성

당업자는 자가면역질환에서 사용하기 위한 항-FLT3L 항체가 고친화도 결합을 필요로 하며, 또한 인간에서의 이들의 사용을 막는 독성이 없어야 한다는 것을 인식할 것이다. FLT3L의 구조적으로 유사한 상동체는 줄기-세포 인자(SCF, 또한 KIT-리간드로서 알려짐) 및 집락 자극 인자 1(CSF1, 또한 대식세포 집락-자극 인자 "M-CSF"로서 알려짐)을 포함한다. FLT3L에 결합하고 또한 SCF 및 CSF1에 결합하는 비-특이적 항-FLT3L 항체는 비표적(off-target) 독성을 초래할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 항-FLT3L 항체는 FLT3L에만 결합 특이성을 보유하지만, 구조적으로 유사한 사이토카인, 예컨대 SCF 및 CSF1에는 결합 특이성을 보유하지 않는다. 당업자는 결합 특이성의 척도로서 K_on, K_off 및 K_D를 포함하는 결합 역학을 사용하지만, 이것으로 제한되지 않는다는 것을 알 것이다.

혈청 FLT3L 및 순환 pDC는 항-FLT3L 항체 리드 클론과 연관된 독성의 지표로서 사용될 수 있는 바이오마커이다. FLT3L이 중화될 때 pDC의 빠른 하락은 면역 반응을 향상시키는 FLT3L-매개 세포 신호전달의 억제를 나타낸다. 유리 FLT3L의 존재 하에 pDC 빈도의 빠른 회복은 항-FLT3L 항체에서의 독성의 결여를 반영할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항-FLT3L 항체는 FLT3L을 중화시키고, 유리 FLT3L이 복귀될 때 cDC 및 pDC의 가역적 고갈을 가능하게 한다. 당업자는 FLT3L의 중화 시 수지상 세포의 하락, 다음에 기준으로의 복귀가 리드 클론의 낮은 독성을 나타낸다는 것을 인식할 것이다.

항-FLT3L 항체 생성

본 개시내용의 실행은, 달리 표시되지 않는 한, 당업자가 이해하는 범위 내에서 용이한 분자 생물학 기법(재조합 기법을 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학을 사용한다. 이러한 기법은, 예컨대 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)]; 문헌["Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)]; 문헌["Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996)]; 문헌["Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)]; 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)]; 문헌["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)]; 문헌["Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)]에서 충분히 설명된다. 이들 기법은 본 개시내용의 폴리펩티드의 생성에 적용 가능하며, 이렇게 해서, 본 개시내용의 제조 및 실행에서 고려될 수 있다. 특정 실시형태를 위한 특히 유용한 기법은 실시예에서 논의될 것이다.

일 실시형태에서, 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산 분자는 숙주 세포에서 발현을 위한 하나 이상의 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 단리된 핵산은 벡터 내로 재조합적으로 혼입될 수 있고, 이는 결국 공지된 기법을 이용하여 숙주 세포 내로 형질감염된다.

일 실시형태에서, 하나 이상의 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산 분자로 형질전환된 숙주 세포가 본 명세서에 상정된다. 상정된 숙주 세포의 예는 포유류 세포, 예컨대 HEK293 세포, NS0 뮤린 골수종 세포 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다.

일 실시형태에서, 단클론성 항-FLT3L 항체(예를 들어, CAT5D9, SC4017 또는 AM40) 및 이의 항원-결합 단편은 문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]에 기재된 것과 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법을 이용하여, 마우스, 햄스터, 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 림프구에 의한 생성을 유발하기 위해 상기 기재한 바와 같이 면역화된다.

다른 실시형태에서, 림프구는 또한 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후에, 림프구는 단리되고, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 적합한 골수종 세포주와 융합되어, 그 다음에 비융합 림프구 및 골수종 세포로부터 떨어져서 선택될 수 있는 하이브리도마 세포를 형성한다. 면역 침강법, 면역블롯팅에 의해, 또는 시험관내 결합 분석(예를 들어, 방사면역측정법(RIA); 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA))에 의해 결정되는 바와 같이 선택 항원에 대해 특이적으로 향하는 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마는 이어서, 표준 방법을 이용하여 시험관내 배양물에서(문헌[Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986]) 또는 동물에서 복수종양으로서 생체내에서 증식될 수 있다. 이어서, 단클론성 항체는 상기 다클론성 항체에 대해 기재한 바와 같은 배양 배지 또는 복수액으로부터 정제될 수 있다.

대안적으로, 항-FLT3L 단클론성 항체(예를 들어, CAT5D9, SC4017 또는 AM40) 및 이의 항원-결합 단편은 또한, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 단클론성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 성숙 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터, 예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 RT-PCR에 의해 단리되고, 이들의 서열은 통상적인 절차를 이용하여 결정된다. 이어서, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 벡터 내로 클로닝되고, 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대 대장균(E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염될 때, 단클론성 항체는 숙주 세포에 의해 생성된다. 또한, 목적하는 종의 재조합 항-FLT3L 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 문헌에 기재된 바와 같이 목적하는 종의 CDR을 발현시키는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다(문헌[McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554]; 문헌[Clarkson et al., 1991, Nature, 352:624-628]; 및 문헌[Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597]).

항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)는 대안의 항체를 생성하기 위해 재조합 DNA 기술을 이용하여 다수의 상이한 방식으로 추가로 변형될 수 있다. 일부 양상에서, 예를 들어, 마우스 단클론성 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인은 (1) 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해 인간 항체의 해당 영역을 치환하거나 또는 (2) 융합 항체를 생성하기 위해 비-면역글로불린 폴리펩티드를 치환할 수 있다. 일부 양상에서, 불변 영역은 단클론성 항체의 목적하는 항체 단편을 생성하기 위해 절단되거나 제거된다. 가변 영역의 부위지정 또는 고밀도 돌연변이유발은 단클론성 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화하는 데 사용될 수 있다.

특정 양상에서, 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 직접적으로 제조될 수 있다. 시험관내에서 면역화되거나 표적 항원으로 향하는 항체를 생성하는 면역화된 개체로부터 단리된 불멸 인간 B 림프구가 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; 문헌[Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (l):86-95]; 및 미국 특허 제5,750,373호 참조).

또한, 예를 들어, 문헌[Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314], 문헌[Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162], 문헌[Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381] 및 문헌[Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581]에 기재된 바와 같이, 파지 라이브러리가 인간 항체를 발현시키는 경우에, 항-FLT3L 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 파지 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 사용을 위한 기법은 또한 미국 특허 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,885,793호, 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호; 제6,593,081호; 제6,300,064호; 제6,653,068호; 제6,706,484호; 및 제7,264,963호; 및 문헌[Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018](이들 각각은 본 명세서에 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.

친화도 성숙 전략 및 쇄 셔플링 전략(전문이 참고로 포함된 문헌[Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783])은 당업계에 공지되어 있으며, 고친화도 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 데 사용될 수 있다.

일부 양상에서, 항-FLT3L 단클론성 항체는 인간화된 항체일 수 있다. 비-인간 또는 인간 항체를 조작하거나, 인간화하거나, 리서페이싱하는(resurfacing) 방법이 또한 사용될 수 있고, 당업계에 잘 공지되어 있다. 인간화되거나, 리서페이싱되거나 또는 유사하게 조작된 항체는, 비인간, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류 또는 다른 포유류(이로 제한되지 않음)인 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 전형적으로 공지된 인간 서열의 "이입(import)" 가변, 불변 또는 다른 도메인으로부터 취해진, 종종 "이입" 잔기로서 지칭되는 잔기로 대체된다. 이러한 이입 서열은 면역원성을 감소시키기 위해, 또는 당업계에 공지된 바와 같은 결합, 친화도, 온-속도(on-rate), 오프-속도(off-rate), 결합활성, 특이성, 반감기 또는 임의의 다른 적합한 특징을 감소시키거나, 향상시키거나 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 FLT3L 결합에 영향을 미치는 데 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 연관된다. 따라서, 비인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 모두는 유지되지만, 가변 및 불변 영역의 비-인간 서열은 인간 또는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.

항체는 또한 선택적으로 인간화되거나, 리서페이싱되거나, 조작될 수 있고, 또는 FLT3L 항원 및 다른 바람직한 생물학적 특성에 대해 고친화도를 보유하도록 조작된 인간 항체일 수 있다. 이 목표를 달성하기 위해, 인간화된(또는 인간) 또는 조작된 항-FLT3L 항체 및 리서페이싱된 항체는 모 서열의 분석 과정 및 모 서열, 조작된 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 및 조작된 산물에 의해 선택적으로 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용 가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능성 있는 3차원 입체배좌 구조를 보여주고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열 기능화에서 잔기의 가능한 역할 분석, 즉, FLT3L과 같은 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이런 방식으로, 프레임워크(FW) 잔기는 공통 및 이입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있고, 따라서 목적하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대해 증가된 친화도가 달성된다.

항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 인간화, 리서페이싱 또는 조작은, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 문헌[Jones et al., Nature 321 :522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al, J. Immunol. 151 : 2296 (1993)]; 문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)], 문헌[Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992)]; 문헌[Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)], 미국 특허 제5,639,641호, 제5,723,323호; 제5,976,862호; 제5,824,514호; 제5,817,483호; 제5,814,476호; 제5,763,192호; 제5,723,323호; 제5,766,886호; 제5,714,352호; 제5,955,358호; 제6,204,023호; 제6,180,370호; 제6,331,431호; 제5,693,762호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,225,539호; 제4,816,567호; 제5,969,108호; 제7,635,666호; 제7,723,270호; 제7,557,189호; 제7,538,195호; 및 제7,342,110호; 국제 특허 출원 PCT/US98/16280; PCT/US91/05939; PCT/US94/01234; PCT/GB92/01755; 국제 특허 출원 공개 WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; 및 유럽 특허 공개 제229246호에 기재된 것과 같은 임의의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며; 이들 각각은 거기에 인용된 참고문헌을 포함하여, 본 명세서에 전체가 참고로 포함된다.

항-FLT3L 인간화된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성하는 면역화 시 가능한 인간 면역글로불린 좌위를 함유하는 유전자이식 마우스에서 생성될 수 있다. 이 접근은 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 기재되어 있다.

특정 양상에서 항-FLT3L 항체 단편이 제공된다. 항체 단편 생성을 위한 다양한 기법이 공지되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질 분해를 통해 유도된다(예를 들어, 문헌[Morimoto et al, 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117]; 문헌[Brennan et al, 1985, Science, 229:81] 참조). 특정 양상에서, 항-FLT3L 항체 단편은 재조합적으로 생성된다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 대장균 또는 다른 숙주 세포에서 발현되고 이들로부터 분비될 수 있으며, 따라서 다량의 이들 단편의 생성을 가능하게 한다. 이러한 항-FLT3L 항체 단편은 또한 상기 논의한 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항-FLT3L 항체 단편은 또한 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 선형 항체일 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기법, 예를 들어, 화학적 합성은 당업자에게 분명할 것이다.

본 개시내용에 따르면, FLT3L에 특이적인 단일쇄 항체의 생성에 맞게 기법을 조정할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호 참조). 추가로, FLT3L, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대해 목적하는 특이성을 갖는 단클론성 Fab 단편의 빠르고 효과적인 확인을 가능하게 하도록 Fab 발현 라이브러리의 작제에 맞게 방법을 조정할 수 있다(예를 들어, 문헌[Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)] 참조). 항체 단편은: (a) 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성된 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 이황화 브릿지를 환원시킴으로써 생성된 Fab 단편, (c) 파파인 및 환원제에 의한 항체 분자의 처리에 의해 생성된 Fab 단편, 및 (d) Fv 단편을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계의 기법에 의해 생성될 수 있다.

본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 혈청 반감기를 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 이는, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편 내 적절한 영역의 돌연변이에 의한 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프의 항체 또는 항체 단편 내로의 혼입에 의해, 또는 말단 또는 중간에서(예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의해) 항체 또는 항체 단편에 융합되는 펩티드 태그 내로 에피토프의 혼입에 의해, 또는 YTE 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 혈청 반감기를 증가시키는 다른 방법, 예를 들어, PEG와 같은 이종성 분자에 대한 접합은 당업계에 공지되어 있다.

약제학적 조성물

본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.

유효량의 본 개시내용의 약제학적 조성물이 투여될 것이며, 이때 "유효량"은 대상체에서 목적하는 예방적, 치료적 또는 개선적 반응을 생성하는 데 충분한 양으로서 정의된다. 유효량은 투여될 대상체의 종 및 체중에 따라 다를 수 있지만, 표준 기법을 이용하여 확인될 수 있다.

특정 양상에서, 본 개시내용은 전신 홍반 루푸스, 근염, 원발성 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 포도막염, 건선 또는 류마티스 관절염을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 자가면역질환의 치료 또는 예방(가능성을 감소시킴)에서 이러한 치료 또는 예방이 필요한 대상체에서 사용하기 위한 치료적 및 예방적 조성물을 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 이와 관련하여, "약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 또는 가축에서의 사용이 허용되는 미국식품의약국(United States Food and Drug Administration)에 의해 승인되었을 수도 있고 승인되지 않았을 수도 있는, 임의의 아주반트, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장제, 용매 또는 유화제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 적절한 담체는 당업자에게 공지되어 있으며, 안정제, 희석제 및 완충제를 포함한다. 적합한 안정제는 탄수화물, 예컨대 솔비톨, 락토스, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트란 및 글루코스, 및 단백질, 예컨대 알부민 또는 카세인을 포함한다. 적합한 희석제는 식염수, 행크스 평형 염류(Hanks Balanced Salts) 및 링거 용액을 포함한다. 적합한 완충제는 알칼리 금속 인산염, 알칼리 금속 탄산염 또는 알칼리 토금속 탄산염을 포함한다.

특정 양상에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 1종 이상의 보조 물질, 예컨대 1종 이상의 지질, 인지질, 탄수화물 및 지질다당류를 추가로 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 선택적으로 1종 이상의 추가적인 활성 물질을 포함한다.

특정 경우에, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 당업자에게 공지된 기법에 의해 제조될 수 있다. 약제학적 조성물의 제형 및/또는 제조에서의 일반적 고려사항은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005(본 명세서에 전문이 참고로 포함됨)]에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용의 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 담체와 혼합되어 용액, 현탁액 또는 에멀션을 형성한다다. 본 명세서에 논의된 첨가제 중 1종 이상이 담체에서 첨가될 수 있거나 후속적으로 첨가될 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 수용액, 에멀션 또는 현탁액일 수 있거나 건조된 제제일 수 있다. 특정 양상에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 저장 또는 제형 목적을 위해 냉동 건조 또는 분무 건조에 의해 건조되거나 동결건조될 수 있다. 이들은 후속적으로 적절한 액체 담체의 첨가에 의해 액체 조성물로 재구성되거나 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 건조 제형으로 투여될 수 있다.

본 개시내용의 약제학적 조성물은 당업계에 공지되어 있는 다양한 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물을 투여하는 예시적인 경로는 경구, 점막, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질 및 비강내를 포함한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질 및 비강내 경로로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여되도록 제형화된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “비경구”는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기법을 포함한다. 특정 양상에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 이에 함유된 본 개시내용의 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 대상체에게 투여 시 생체 이용 가능하게 되도록 제형화된다.

약제학적 조성물의 투여의 선택은 선택되는 제형에 따를 것이다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 투약 제형에 적합한 방식으로, 그리고 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 특정 양상에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 주사제, 흡입제, 겔, 마이크로스피어 및 에어로졸을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태로 제제에 제형화된다.

특정 예에서, 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 고체 또는 액체의 형태일 수 있다. 일부 양상에서, 담체(들)는 미립자이고, 따라서 조성물은, 예를 들어, 정제 또는 분말 형태이다. 다른 양상에서, 담체(들)는 액체이며, 조성물은, 예를 들어, 경구 시럽, 주사용 액체 또는, 예를 들어, 흡입 투여에서 유용한 에어로졸이다. 경구 투여용으로 의도될 때, 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 고체 또는 액체 형태이며, 여기서 반고체, 반액체, 현탁액 및 겔 형태는 고체 또는 액체로서 본 명세서에서 고려되는 형태 내에 포함된다.

특정 양상에서, 경구 투여용 고체 조성물로서, 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 알약, 캡슐, 츄잉검, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 일부 예에서, 이러한 고체 조성물은 전형적으로 하나 이상의 비활성 희석제 또는 식용 담체를 함유할 것이다. 특정 실시형태에서, 다음 중 하나 이상이 추가적으로 제공될 수 있다: 결합제, 예컨대 카복시메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 트래거캔스검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분, 락토스 또는 덱스트린, 붕해제, 예컨대 알긴산, 알긴산나트륨, 프리모겔(Primogel), 옥수수 전분 등; 윤활제, 예컨대 스테아르산 마그네슘 또는 스테로텍스(Sterotex); 활택제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지향; 및 착색제.

이들 조성물은 마이크로스피어, 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 지속 방출 제형 또는 분말 형태를 취할 수 있고, 약 0.001 내지 95%의 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 함유한다. 일부 투약 형태는 50 ㎍ 내지 250 ㎍의 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 함유할 수 있다.

일부 양상에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 캡슐 형태, 예를 들어, 젤라틴 캡슐의 형태이고, 본 명세서에 개시된 물질에 추가로, 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 경구 제형은 또한 일반적으로 사용되는 성분, 예를 들어, 의약품 등급의 사카린, 셀룰로스 및 탄산마그네슘을 포함할 수 있다.

다른 양상에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 액체 형태, 예를 들어, 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀션 또는 좌약의 형태이다. 특정 실시형태에서, 액체는 경구 투여 또는 주사에 의한 전달을 위한 것일 수 있다. 특정 실시형태에서, 경구 투여용으로 의도될 때, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 추가로, 감미제, 보존제, 염료/착색제 및 향미 증진제 중 1종 이상을 함유한다. 특정 양상에서, 주사에 의해 투여될 것으로 의도되는 약제학적 조성물에서, 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정제 및 등장제 중 1종 이상이 포함될 수 있다.

특정 경우에, 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 액체 약제학적 조성물은, 이들이 용액이든, 현탁액이든 또는 기타 형태이든, 다음의 성분 중 한 가지 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 예를 들어, 생리 식염수, 링거 용액, 등장 염화나트륨, 고정유, 예컨대 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염 및 등장성 조절을 위한 제제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 일부 경우에, 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 용량 바이알에 밀봉될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주사용 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균된 상태이다.

다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 국소 투여용으로 의도될 수 있으며, 이 경우 담체는 용액, 에멀션, 연고 또는 겔 베이스를 적합하게 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 염기는, 예를 들어, 다음 중 한 가지 이상을 포함할 수 있다: 페트롤라툼, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 광유, 희석제, 예컨대 물 및 알코올, 및 유화제 및 안정제. 다른 양상에서, 농후제는 국소 투여를 위한 약제학적 조성물에 제공될 수 있다. 특정 실시형태에서, 경피 투여용으로 의도된다면, 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 약제학적 조성물은 경피 패치 또는 이온도입법 장치에 포함될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물은, 예를 들어, 좌약의 형태로 직장 투여용으로 의도된다. 좌약에 대해, 결합제 및 담체는, 예를 들어, 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 직장 투여용 조성물은 적합한 비자극성 부형제로서 유지성(oleaginous) 베이스를 함유한다. 이러한 베이스는 라놀린, 코코아 버터 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

다른 양상에서, 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 에어로졸로서 투여될 수 있는 투약 단위를 포함한다. 용어 에어로졸은 콜로이드 특성의 시스템으로부터 가압 패키지로 이루어진 시스템 범위의 다양한 시스템을 나타내기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, 전달은 액화된 또는 가압된 기체에 의해 또는 활성 성분을 제공하는 적합한 펌프 시스템에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 에어로졸은 활성 성분(들)을 전달하기 위해 단일 상, 2상, 또는 3상 시스템에서 전달될 수 있다. 다른 실시형태에서, 에어로졸의 전달은 함께 키트를 형성할 수 있는 필요한 용기, 활성체, 밸브, 서브용기 등을 포함한다. 당업자는 특정 에어로졸 제형 및 전달 방식을 용이하게 결정할 수 있다.

본 개시내용의 약제학적 조성물은 적합한 비독성 약제학적 담체에서 투여될 수 있고/있거나, 마이크로캡슐, 마이크로비드에 포함될 수 있고/있거나, 지속 방출 이식물에 포함될 수 있다.

다른 양상에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 활성 성분 주변의 코팅 껍질을 형성하는 물질을 포함한다. 일부 예에서, 코팅 껍질을 형성하는 물질은 전형적으로 비활성이며, 예를 들어, 당, 셸락 및 기타 장용 코팅제로부터 선택될 수 있다.

또 다른 양상에서, 고체 또는 액체 형태의 본 개시내용의 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 제제를 포함하고, 이에 의해 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 전달을 돕는다. 특정 경우에, 이 능력에서 작용하는 적합한 제제는 단백질 또는 리포좀을 포함한다.

특정 양상에서, 대상체에 투여될 약제학적 조성물은 하나 이상의 투약 단위 형태를 취하며, 여기서, 예를 들어, 정제는 단일 투약 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용기는 복수의 투약 단위를 보유할 수 있다. 이러한 투약 형태를 제조하기 위한 실제 방법은 공지되어 있거나, 또는 본 기술분야의 당업자에게 명백할 것이다; 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)] 참조. 투여될 조성물은, 아무튼, 본 명세서의 교시에 따라 관심 대상의 질환 또는 병태의 치료를 돕기 위해 치료적 유효량의 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 함유할 것이다.

특정 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 1종 이상의 추가적인 치료적으로 활성인 물질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 개시내용의 약제학적 조성물은 1종 이상의 추가적인 치료적으로 활성인 물질과 병용하여 치료가 필요한 대상체에게 투여된다. 본 명세서에서 사용되는, "조합물"은 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 1종 이상의 추가적인 치료적으로 활성인 물질을 포함하는 조합물을 지칭하며, 이들 각각은 연속적으로(순차적으로), 병행하여 또는 동시에 투여될 수 있다.

본 개시내용의 약제학적 조성물은 치료적 수준을 지속하기 위해 몇몇 간격으로 바람직하게 투여될 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 다른 살균 또는 정균 방법과 함께 사용될 수 있다.

본 명세서에 제공된 약제학적 조성물의 설명은 원칙적으로 인간에 대한 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 일반적으로 모든 부류의 대상체에 대한 투여에 적합하다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 특정 양상에서, 대상체는 포유류이다. 특정 양상에서, 포유류는 영장류, 예컨대 인간, 원숭이 및 유인원, 및 비영장류, 예컨대 실험실 동물 및 반려동물 및 농장 동물을 포함하는 가축(예를 들어, 고양이, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 토끼) 및 비가축 동물, 예컨대 야생동물, 조류 등을 포함한다.

자가면역/항-염증 요법

본 개시내용은 또한 항-FLT3L 항체, 예컨대 상기 기재한 것을 포함하는 자가면역 및/또는 다른 염증 질환(즉, 과반응성 및/또는 기능부전성 면역계와 연관된 질환)을 치료하는 데 유용한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 다양한 실시형태에서, 항-FLT3L 항체는 특정 항원 또는 항원의 세트에 대한 대상체의 면역계 또는 특정 면역 반응을 저해하거나 약화시키도록 설계된 다른 면역조절 약물과 병용하여 투여될 수 있고, 이에 의해 자가면역 또는 다른 염증 질환을 감소시키거나 예방할 수 있다.

추가로 본 명세서에서 1종 이상의 항-FLT3L 항체의 투여를 포함하는 자가면역 및/또는 다른 염증질환을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 항-FLT3L 항체의 투여는 면역 반응의 감소, 하나 이상의 면역학적 신호전달 캐스케이드의 발현 또는 면역 세포 집단의 감소 중 적어도 하나를 초래할 수 있다. 특정 양상에서, 자가면역질환 또는 다른 염증 질환이 존재하는 환자 또는 대상체는 항-FLT3L 항체가 투여된다.

항-FLT3L 항체를 포함하는 자가면역 및/또는 다른 염증 질환 요법에 의한 치료는, 예를 들어, 자가면역질환 또는 염증 질환의 진행 속도 감소, 면역 세포 증식의 지연 또는 안정화, 병변 수축(예를 들어, MS 환자), 및/또는 질환 퇴행을 야기한다. 일부 양상에서, 자가면역질환 또는 염증 질환의 감소 또는 지연을 측정하는 측정 기준(예를 들어, 감소된 염증, 염증 사이토카인의 수준, 면역 세포 집단, 및/또는 연관된 손상, 예컨대 조직 병변)은 통계학적으로 유의할 수 있다. 자가면역질환 또는 염증 질환의 측정 기준 감소는 개체의 질환 진행의 예상된 수준에 대한, 거대 환자집단에 기반한 질환 진행의 예상된 수준에 대한, 또는 대조군 집단의 질환 진행의 예상된 수준에 대한 기준(치료전)에서의 환자의 측정 기준 수준과의 비교에 의해 측정될 수 있다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 상정된 바와 같은 치료 방법은 대상체 또는 환자에 대한 본 개시내용의 항-FLT3L 결합 분자, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 적용 또는 투여, 또는 대상체 또는 환자로부터의 단리된 조직 또는 세포주에 대한 항-FLT3L 결합 분자의 적용 또는 투여를 포함하며, 여기서 대상체 또는 환자는 질환, 질환 증상 또는 질환에 대한 소인을 가진다.

상정된 질환은 1형 및 2형 당뇨병, CKD(예를 들어, 당뇨병, 당뇨병성 신장 질환, 및 고혈압에 의해 야기되는 CKD를 포함)를 포함하는 급성 또는 만성 염증성 질환, 죽상동맥경화증, 알츠하이머병, 암, 및 이러한 질환의 연관된 합병증, 예를 들어, 심장병, 고혈압, 빈혈증, 심낭염, 신성 골이영양증 및 기타를 포함한다. 추가적인 상정된 질환은 전신 홍반 루푸스, 근염, 원발성 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 포도막염, 건선 및 류마티스 관절염을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 자가면역질환을 포함한다.

다른 실시형태에서, 치료는 또한 질환, 질환의 증상, 또는 질환에 대한 소인을 갖는 대상체 또는 환자에 대한 항-FLT3L 결합 분자, 예를 들어, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제학적 조성물의 적용 또는 투여, 또는 대상체 또는 환자로부터의 단리된 조직 또는 세포주에 대한 항-FLT3L 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 적용 또는 투여를 포함하는 것으로 의도된다.

본 개시내용의 방법에 따르면, 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 항-FLT3L 항체는 자가면역 또는 염증 질환에 대해 긍정적 치료 반응을 촉진시키기 위해 사용된다. 용어 "긍정적 치료 반응"은 자가면역 또는 염증 질환과 연관된 증상의 감소를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 질환의 개선은 완전한 반응을 특징으로 할 수 있다. "완전한 반응"은 임의의 이전의 시험 결과의 정상화와 함께 임상적으로 검출 가능한 질환의 부재로 의도된다. 대안적으로, 질환의 개선은 부분적 반응으로서 범주화될 수 있다. "긍정적 치료 반응"은 자가면역 또는 염증 질환의 진행 및/또는 지속기간의 감소 또는 저해, 자가면역 또는 염증 질환의 중증도 감소 또는 개선, 및/또는 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 결합 분자의 투여로부터 초래된 이의 하나 이상의 증상의 개선을 포함한다.

특정 실시형태에서 약제학적 유효량의 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 원발성 쇼그렌 증후군의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 원발성 쇼그렌 증후군의 치료 방법이 제공된다.

다른 실시형태에서 약제학적 유효량의 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 근염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 근염의 치료 방법이 제공된다.

특정 실시형태에서 약제학적 유효량의 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 전신 홍반 루푸스(SLE)의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 전신 홍반 루푸스의 치료 방법이 제공된다. 일부 양상에서, 대상체는 FLT3L-발현 CD4+ T 세포의 빈도에 의해 측정했을 때, 건강한 대상체에 비해 증가된 혈청 수준의 FLT3L을 가진다.

일부 실시형태에서, (a) FLT3L의 혈청 수준을 측정하는 단계, 또는 (b) FLT3L-발현 CD4+ T 세포의 빈도를 측정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 전신 홍반 루푸스(SLE)를 진단하는 방법이 제공되되, 건강한 공여자에 비해 대상체에서의 FLT3L의 증가된 혈청 수준 또는 FLT3L-발현 CD4+ T 세포의 증가된 빈도는 대상체가 SLE를 가진다는 것을 나타낸다. 특정 양상에서, CD4+ T 세포는 효과기 기억 세포(T_EM)이다.

일부 실시형태에서, 막 결합된 FLT3L의 중화가 필요한 대상체에서 막 결합된 FLT3L을 중화시키는 방법이 제공되되, 상기 방법은 약제학적 유효량의 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, 막-결합된 FLT3L의 활성이 "투여 전" 수준으로 회복될 수 있도록, FLT3L은 가역적으로 중화된다.

다른 실시형태에서, 가용성 FLT3L의 중화가 필요한 대상체에서 가용성 FLT3L을 중화시키는 방법이 제공되되, 상기 방법은 약제학적 유효량의 본 명세서에 개시된 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, 가용성 FLT3L의 수준이 투여 전 수준으로 회복될 수 있도록, FLT3L은 가역적으로 중화된다.

구체적 실시형태에서, 가용성 FLT3L을 중화시키는 방법은 대상체에게 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 피하로, 1주 1회, 약 0.03 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏의 범위로 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에게 항-FLT3L 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 피하로, 4주마다 1회, 약 150 ㎎/㎏의 용량으로 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 실시형태에서, 순환성 고전적 수지상 세포(cDC) 및 형질세포양 수지상 세포(pDC) 집단의 감소가 필요한 대상체에서 순환성 고전적 수지상 세포 및 형질세포양 수지상 세포 집단을 감소시키는 방법이 제공되되, 상기 방법은 대상체에게 약제학적 유효량의 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, cDC 및 pDC의 집단이 투여 전 수준으로 회복될 수 있도록 cDC 및 pDC의 집단은 가역적으로 감소된다.

특정 실시형태에서, 약제학적 유효량의 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 CD4+ T 세포 상의 FLT3L 발현 감소가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, CD4+ T 세포 상의 FLT3L 발현을 감소시키는 방법이 제공된다.

다른 실시형태에서, 약제학적 유효량의 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 CD4+ T 세포의 백분율 감소가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, FLT3L을 발현시키는 CD4+ T 세포의 백분율을 감소시키는 방법이 제공된다.

다른 실시형태에서, 림프아구를 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 림프아구에서 ERK 신호전달을 감소시키는 방법이 제공된다.

특정 실시형태에서 줄기 세포를 본 명세서에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 1차 CD133+ 인간 줄기 세포에서 MEK 1/2 인산화를 감소시키는 방법이 제공된다.

다음의 실시예는 제조 방법 및 분석을 사용하는 방법, 선별 및 본 개시내용의 치료 방법의 완전한 개시내용 및 설명과 함께 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 그들의 개시내용으로서 간주하는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

다음의 실시예를 참조로 하여 본 개시내용을 기재한다. 실시예는 단지 예시적이며, 개시내용은 결코 이들 실시예로 제한되는 것으로 해석되지 않고, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 분명하게 되는 모든 변형을 포함하는 것으로 해석될 것이다.

실시예 번호 1. 항-FLT3L 항체 생성

개요:

FLT3L은 65 kDa의 비-이황화물 연결된 동종이량체 당단백질이다. 인간, 비인간 영장류 및 마우스에 대한 리간드 및 수용체 서열 상동성은 이하의 표 2에 나타낸다.

완전한 마우스 FLT3L 단백질의 상동성은 단지 73%이지만, FLT3과 이의 결합 부위는 종 간에 고도로 보존되어 있다. 사실, 인간 FLT3L은 마우스 FLT3에 결합하고 활성화시키며, 그 반대인 경우도 있다. FLT3L은 줄기 세포 인자(SCF 또는 KIT-리간드) 및 집락 자극 인자 1(CSF1)에 대해 구조적 상동성을 갖지만, 다른 인간 사이토카인에 대해 유의한 서열 상동성은 갖지 않는다. 이들 두 리간드, 즉, c-KIT 및 CSF1R 각각에 대한 수용체는 또한 임상 용도에서 원치 않는 비표적 독성을 야기하는 FLT3의 저해제와 통상적으로 상호작용하는 클래스 III TKR이다. 이러한 것을 고려하여, SCF 또는 CSF1과 교차반응하지 않음으로써 FLT3/FLT3L 경로의 고도로 특이적인 저해를 제공하는 FLT3L이 추구된다.

가용성 인간 및 마우스 FLT3-L 상에서의 교번의 선택을 이용하여 리드 항체를 선택하고 시험한다. 1차 생화학적 고속대량(high throughput) 선별은 인간 FLT3/FLT3L 경쟁 균질 시간 분해 형광(Homogenous Time Resolved Fluorescence: HTRF) 분석법을 이용하여 수행하였다. 모든 단일쇄 가변 단편-단편 결정질 영역(scFv-Fc) 히트는 IgG1 TM 형식으로 전환되며, 이어서, 표적 세포 표면 상에서 FLT3 하향조절을 이용하는 기능성 선별 분석을 사용하여 리드 항체의 저해 활성을 확인하였다. ELISA 및 기능성 분석을 이용하여 FLT3L에 대한 마우스 및 사이노몰거스 원숭이　교차 반응성 및 선택성 및 다른 패밀리 구성원, 예컨대 줄기 세포 인자(stem cell factor: scf)의 제외를 확인하였다.

리드 화합물을 RS4;11 세포주 및 1차 인간 CD133+ 줄기 세포에서의 FLT3 신호전달 분석을 이용하여 추가로 평가하였다. 1차 인간 T 세포를 이용하여 내인성 FLT3L에 대한 결합을 확인하였다. Octet 및 BIAcore를 통해 각각 특이적 결합 부위 및 결합 친화도를 결정하였다. 이하에 기재하는 바와 같은 추가적인 최적화를 위해 얻어진 리드 항체 클론을 선택하였다.

리드 항체 후보 확인 캠페인(C5, B10-11)

도 1에 나타낸 바와 같은 제1 선별 파지 라이브러리에 의해 항-FLT3L 결합 연구에 대한 리드 항체를 생성하였다. 파지 디스플레이 라이브러리 골수 보건(Bone Marrow Vaughan: BMV), 조합된 비장(combined spleen: CS), DP47 라이브러리(DP47) 및 Dyax 인간 항체 라이브러리를 인간 FLT3L(huFLT3L) 및/또는 마우스 FLT3L(muFLT3L)에 대해 패닝(panning)(교번의 패닝 또는 경쟁적 패닝)하였다. 간략하게, 내부에서 생성된 FLT3L은 패닝 항원으로서 EZ-링크 설포-NHS-LC-비오틴 표지 키트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 이용하여 비오틴으로 표지하였다. 문헌[Xiao X et al., 2017 mAbs 542 9, 996-1006 (2017)]에 기재된 바와 같은 내부 scFv 라이브러를 이용하여 2 내지 3 라운드 동안 패닝을 수행하였다. 인간/사이노 교차 반응성을 향상시키기 위해, 인간 및 사이노 재조합 FLT3L을 일부 선택 과정에서 교번적 방식으로 패닝 항원으로서 사용하였다. FLT3L/FLT3 상호작용을 저해하는 항체를 선택하기 위해, 일부 실험에 대해 경쟁 패닝을 사용하였다. 경쟁 패닝에 대해, 인간 FLT3L을 패닝 항원으로서 사용한 한편, 통상적인 트립신 대신에 파지용리제로서 과량의(>100X) FLT3-Fc를 사용하였다(Xiao X et al. mAbs 542 9, 996-1006 (2017)).

BMV 라이브러리는 100배, CS 라이브러리는 350배, DP47 라이브러리는 250배 농축시키고; Dyax 라이브러리는 농축시키지 않았다. BMV 및 Dyax 파지 라이브러리만을 세 번째로 패닝시켜, 패닝의 제2 라운드에 비해 BMV 파지 라이브러리의 100배 농축 및 Dyax 라이브러리의 50배 농축을 초래하였다(도 1의 A).

단클론성 파지 ELISA를 수행하여 각각의 선택 라운드 후에 항원 특이적 파지의 백분율을 추정하였다. 고속대량 선별을 위해 적어도 20%의 양성률을 달성한 선택만을 처리하였다. 이런 기준 세트에 의해, 제2 결과물 CS 및 DP47 패닝과 함께 제3 결과물 BMV 패닝을 pSplice V4 및 pdLG 또는 pmLG 벡터에 클로닝시키고, 경쟁 HTRF에 의한 기능성 선별을 위해 scFv-Fc(Xiao X, et al., PLoS One, 2015 Oct 15;10(10):e0140691. doi: 10.1371/ journal.pone.0140691) 또는 IgG 형식(Xiao X, et al. mAbs 542 9, 996-1006 (2017))중 하나로 전환시켰다.

기능성 선별을 위해, 293 프리스타일 세포(써모 사이언티픽)는 패닝 결과물로부터 전환된 scFv-Fc 또는 IgG 작제물 중 하나로 처음 형질감염시켰다. 얻어진 상청액을 HTRF 기반 FLT3L/FLT3 상호작용 저해 분석에서 직접 사용하였다. HTRF 분석을 위해, 10 nM 비오틴-표지된 FLT3L, 20 nM 스트렙타비딘-유로퓸 크립테이트(시스바이오(Cisbio)), 10 nM FLT3-mFc 및 20 nM 항-mFc-A647(시스바이오)을 384-웰 그레이너(Greiner) 플레이트에서 20 ㎕/웰의 총 용적으로 10 ㎕의 형질감염 상청액과 혼합하였다. 665 ㎚ 및 620 ㎚ 판독을 혼합 5분 후에, 그 다음에, 판독이 안정하게 될 때까지, 1시간 간격으로 취하였다. 이어서, 665 ㎚/620 ㎚ 비를 계산하였다. 비의 감소는 FLT3L/FLT3 상호작용의 저해를 나타냈다.

직접 또는 교번의 항원 패닝으로부터의 패닝 결과물을 scFv-Fc로 전환시켰고, HTRF FLT3L/FLT3-Fc 상호작용 저해 분석에서 고속대량 선별(HTS)을 위해 4,000개 초과의 콜로니를 선택하였다. 10개의 리드 항체를 확인하였고, IgG TM을 전환시키고, 발현시켰다. 항체는 제2 HTRF 상호작용 저해 분석에서 재시험하였고, 10개의 리드를 확인하였다. 동시에, 경쟁 패닝으로부터 700개 초과의 히트는 PmIgG 전환되고, 포유류 세포에서 발현되었다. 전환된 클론에 동일한 HTRF FLT3L/FLT3-Fc 상호작용 저해 분석을 수행하였고, 2개의 리드를 확인하였다(도 1의 B).

교번의 항원 패닝으로부터의 10개의 리드 및 경쟁 패닝으로부터의 2개의 리드를 발현시키고, 추가 시험을 위해 밀리그램 양으로 정제하였다. 추가적인 시험은 HTRF FLT3L/FLT3-Fc 상호작용 저해, 수용체 하향조절 및 신호 전달 저해 분석을 포함하였다. 리드는 또한 에피토프 결합 및 친화도 결정을 거쳤다. 선별 캠페인은 추가로 연구하는 5가지의 리드 항체를 확인하였다: Dyax3, Dyax5, CAT8, CAT26 및 CAT5D9. 경쟁 HTRF 분석으로부터의 결과를 도 1의 C의 리드 항체에 대해 나타낸다.

실시예 번호 2. FLT3 하향 조절 선별 분석

FLT3L 결찰 시, FLT3 수용체는 이량체화되며, 자기인산화되고, 하류의 신호전달 경로를 활성화시킨다. 과정에서, 표면 FLT3은 내재화되고, 분해된다. 이런 내재화 특징은 리드 항-FLT3L 후보 클론을 선별하기 위한 분석을 개발하는 데 이용하였다. 세포 표면 FLT3 발현은 유세포 분석에 의해 측정할 수 있고, 수용체-리간드 결합의 저해는 세포 표면 FLT3 발현 수준에 대한 변화를 정량화함으로써 결정할 수 있다.

세포주 RS4;11, EOL-1, MOLM13 및 MV4-11은 FLT3을 구성적으로 발현시킨다. 세포를 정상 조건 하에 배양시키고, 2 내지 24시간의 배양 후에 FLT3의 상대적 발현을 위해 선별하였다. 유세포분석을 사용하여 FLT3 발현을 측정하였다. 간략하게, 상업적으로 입수 가능한 항-CD135(항-FLT3) 클론 BV10A4H2(바이오레전드(Biolegend))를 유세포분석 실험에서 사용하였고, 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity: MFI)를 FLT3 발현의 척도로서 보고하였다. 모든 분석에서, 상업적으로 입수 가능한 마우스 항-인간 FLT3L 단클론성 항체(R&D) 또는 내부 huFLT3-Fc 작제물을, FLT3L 활성의 효과적인 중화를 위해 양성 대조군으로서 사용하였다.

RS4;11, 급성 백혈병(프로-B) 계통은 FLT3을 발현시키는 것으로 보고된 다른 상업적으로 입수 가능한 계통에 비해 배양물에서 FLT3의 지속적이고 높은 발현을 나타냈다(도 2의 A). 세포 표면 FLT3에 대한 FLT3L의 직접 결합은 RS4;11 세포와 함께 4℃에서 30분의 인큐베이션 후에, 검출될 수 있는 비오티닐화된 재조합 huFLT3L(rhuFLT3L)의 연속 희석을 이용하여 BV421-스트렙타비딘, 다음에 평균 형광 강도를 결정하는 유세포분석을 이용하여 세포 표면에 물리적으로 결합되었다는 것을 확인하였다(도 2의 B).

최종적으로, RS4;11 세포 상의 세포-표면 FLT3의 검출 가능한 하향조절을 유도하는 rhuFLT3L의 능력을 37℃에서 2시간 동안 FLT3L의 연속 희석과 함께 RS4;11 세포의 인큐베이션에 의해 확인하였다. 조건의 안정성은 2가지 상이한 농도의 RS4;11 세포(50,000(50K) 및 100,000(100K) 세포)를 이용함으로써 평가하였다. 세포-표면 FLT3의 하향조절은 형광 표지된 항-CD135 항체(클론 BV10A4H2)를 이용하여 결정하였다. 세포 밀도는 둘 다 huFLT3L과 함께 인큐베이션한 지 2시간 후에 세포-표면 FLT3의 용량 의존적 하향조절을 나타냈다. FLT3 발현의 지표인 알로피코사이아닌(Allophycocyanin: APC) MFI는 분석에서 사용되는 huFLT3L의 범위에 대해 25배 감소되었다(도 2의 C). 이들 결과는 선별 분석이 생체 이용 가능한 FLT3L의 용량 의존적 반응을 측정함에 있어서 효과적이고, FLT3L을 기능적으로 중화시키는 후보 클론의 능력을 시험하는 데 적합하다는 것을 나타냈다. 50,000 또는 100,000개의 세포가 웰마다 사용되든 아니든, 반응은 유의하게 다르지 않았다.

선별 분석의 최적화

항-FLT3L 후보 클론을 평가하기 위한 이상적인 세포 배양 조건을 결정하기 위해 선별 분석 조건을 추가로 개선시켰다. 최종 조건은 다음과 같았다: 웰마다 50,000개의 RS4;11 세포를 37℃, 5% CO₂로 설정한 습윤화된 인큐베이터에서 2시간 동안 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 있는 완전 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute: RPMI) 배지에서 항-FLT3L mAb 후보 클론과 함께 또는 이것 없이 96 pM rhuFLT3L과 함께 인큐베이션하였다. FLT3 발현의 후속적 하향조절은 원 MFI 또는 하향조절%로서 측정된 바와 같은 유세포분석에 의해 결정하였다. 96 pM rhuFLT3L(EC80)은 용량 반응 곡선의 지수기가 시작되고 이렇게 해서 rhuFLT3L의 임의의 기능성 저해가 세포 RS4;11 세포 표면의 FLT3 하향조절 수준에 대한 변화에 의해 즉시 반영된다는 것을 보장하는 지점으로서 선택하였다(도 3의 A). 상업적으로 입수 가능한 마우스 항-huFLT3L 항체 대조군(MAB608, 알앤디 시스템즈(R&D Systems))를 이용하여 분석 효능을 확인하였다(도 3의 B). FLT3과 리간드의 종간 반응성 때문에, 이 분석은 인간 세포주임에도 불구하고, 인간, 사이노 및 설치류 FLT3L에 대한 클론을 시험하는 데 효과적이었다. 마우스 FLT3L에 대해, EC80은 36 pM이었다.

실시예 번호 3. 가용성 FLT3L에 대한 리드 항체 후보의 중화 활성

FLT3L의 FLT3에 대한 결찰 시, 수용체는 이량체화하고, 자기인산화하며, 일단 내재화되면 신호 전달 캐스케이드를 증식시킨다. FLT3 하향조절에 의해 측정된 이 과정은 FLT3L에 결합하는 항체에 의해 저해될 수 있다. 따라서, 인간, 마우스 또는 사이노몰거스 원숭이(사이노) 가용성 FLT3L(sFLT3L)에 결합함으로써 RS4;11 세포에 대한 FLT3 하향조절을 저해하는 리드 후보의 능력을 시험하였다. 최적화된 선별 분석을 사용하여 리드 후보의 중화 능력을 시험하였다. 기재한 바와 같이, RS4;11 세포(웰당 50,000개의 세포)를 인간 또는 사이노 FLT3L(96 pM), 또는 마우스 sFLT3L(36 pM)의 존재 하에 1%의 BSA와 함께 완전 RPMI에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 클론의 연속 희석물을 첨가하였고, 가용성 FLT3-Fc 작제물 또는 상업적으로 입수 가능한 인간 항-FLT3L 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다. RS4;11 세포 상의 FLT3 발현은 유세포분석을 이용하여 결정하였고, MFI로서 보고하였다.

도 4의 A 및B에 나타낸 바와 같이, 모든 리드 클론 항체는 인간과 사이노 sFLT3L을 둘 다 일정한 정도로 저해하는 능력을 입증하였다. CAT8, CAT26, Dyax3 및 Dyax5는 모두 인간 sFLT3L 및 사이노 sFLT3L의 유사한 저해를 나타냈다. 이하의 표 3에 나타내지만, CAT8, CAT26, Dyax3 및 Dyax5에 대한 IC50 값은, IC_MAX에 결코 도달되지 않았기 때문에 타당성을 결여하였다.

대조적으로, CAT5D9는 IC_MAX를 달성하였고, FLT3L 저해로부터 예상되는 S-형 곡선을 만들었다(도 4의 A 및 B). 표 3에 제시된 CAT5D9에 대한 IC50 값은 인간 및 사이노와 교차 반응성을 나타내지만, 뮤린 FLT3L과는 나타내지 않는다(도 4의 C).

실시예 번호 4. 세포 표면 FLT3L에 대한 리드 항체 후보의 결합 활성

FLT3L은 세포막 단백질로서 발현되고, 절단될 때 가용성 단백질로서 순환한다. 막 결합된 형태와 가용성 형태는 둘 다 생물학적으로 활성이다. FLT3-매개된 신호전달 경로를 효과적으로 차단하기 위해, 리드 항체 후보는 FLT3L의 가용성 형태와 막 결합된 형태 둘 다에 결합하여야 한다.

이와 일치되게, 인간, 사이노 및 마우스 FLT3L에 대한 세포 표면 결합은 각각의 종에 대한 각각의 전장 단백질로 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 형질감염시킴으로써 평가하였다. 후보 클론은 1시간 동안 4℃에서 FLT3L-발현 세포주와 함께 인큐베이션시킨 후에 2회 세척하여 비결합 항체를 제거하였다. 이어서, 세포를 PE-표지된 염소 항-hu IgG 2차 검출 pAb와 함께 인큐베이션시켜, 결합된 항체를 정량화하고, PE 신호의 유세포분석에 의해 측정하였다. hu IgG 골격 상의 huFLT3-Fc 작제물은, 인간 리간드에 추가로 사이노 및 마우스와 교차 반응하기 때문에, FLT3L 발현을 위한 양성 대조군 시약으로서 사용하였다.

모든 리드 후보는 인간 FLT3L에 결합되었고(도 5의 A), DYAX5를 제외한 모두는 사이노 FLT3L에 결합되었다(도 5의 B). 대조적으로, Dyax5 및 더 적은 정도의 Dyax3만이 마우스 FLT3L과의 교차 반응성을 나타냈다(도 5의 C).

따라서, 모든 리드 후보는, 효능이 다르기는 하지만, 교차 종 FLT3L에 결합하는 능력을 나타냈다. 각각의 클론에 대한 수용체 점유 정도에서 차이가 분명하지만, EC50과 최대 점유를 둘 다 주목하였고(FLT3-Fc에 대한 백분율로서 표현함), 최종 평가를 고려하였다. CHO 세포에서 발현된 인간, 사이노 및 마우스 FLT3L에 대한 결과를 표 4에 나타낸다.

실시예 번호 5. 내인성 인간 FLT3L에 대한 리드 항체 후보의 결합

FLT3L은 TCR 맞물림과 상관없이 □-쇄 사이토카인, 즉, IL-2, IL-7 또는 IL-15에 의한 자극 시 1차 T-세포의 표면 상에서 발현시킨다. 실시예 번호 4에서, 리드 항체 후보는 인간 FLT3L 단백질로 형질감염된 CHO 세포에 결합하는 능력을 입증하였다. 다음 단계는 1차 인간 세포주로부터의 내인성 FLT3L에 결합할 수 있다는 것을 보장하는 것이었다. 따라서, 인간 공여자로부터 획득된 IL-2 자극 1차 T-세포 상에서 huFLT3L에 결합하는 리드 항체 후보의 능력을 시험하였다.

세포 표면 상에서 FLT3L 발현을 유도하기 위해, 새로 단리된 인간 T 세포를 5일 동안 항-CD3(항-CD3에 의한 T 세포의 활성화는 세포 표면으로부터의 FLT3L의 셰딩(shedding)을 야기함)의 부재 하에 50 ng/㎖ IL-2로 자극하였다. 이 시간 후에, 인간 FLT3-Fc 작제물을 이용하여 T-세포 상의 발현을 확인하였다(도 6의 A). 이어서, 각각의 클론의 연속 희석물을 30분 동안 4℃에서 IL-2 자극된 T 세포(100K/웰)와 함께 인큐베이션시켰다. 완충제로 세척함으로써 과량의 항체를 제거하였고, APC-표지된 항-인간 IgG로 표면-결합된 항체를 검출하였다. CAT5D9를 제외하고 모든 리드 클론은 인간 1차 T-세포 상의 내인성 FLT3L에 결합하였다(도 6의 B). 내인성 FLT3L에 대한 CAT5D9 결합은 이의 낮은 결합 친화도 때문에 초기에 검출 가능하지 않았다. 그러나, T 세포와 함께 인큐베이션 전에 CAT5D9가 항-IgG(APC-표지)와 이량체화되었을 때, 이의 결합활성은 충분히 향상되어 내인성 FLT3L에 대한 용량-의존적 결합을 확인하였다(도 6의 C).

실시예 번호 6. 세포 표면 FLT3L의 리드 항체 후보 저해

세포-표면 FLT3L에 결합하는 리드 후보의 능력은 리간드의 기능성 저해에 관한 제한된 통찰을 제공하였다. 이상적으로, 세포-표면 FLT3L에 대한 리드 후보의 결합은 리간드-수용체 복합체의 신호전달 활성을 감소시킬 것이다.

이를 시험하기 위하여, 1,000개의 huFLT3L-발현 CHO 세포/웰을 접착을 위해 밤새 플레이팅시켰다. 다음 날, CHO 배양 배지를 제거하고 나서, 세포를 RPMI로 부드럽게 세척하고, FLT3+ RS4;11(100K/웰)의 첨가 전에, 항체의 연속 희석물을 30분 동안 첨가하였다. 36℃에서 2시간 인큐베이션시킨 후에, FLT3 하향조절을 검출하기 위한 염색을 위해 RS4;11 세포를 얼음 상의 신선한 96-웰 플레이트에 옮겼다. 본 발명자들의 표준 RS4;11 FLT3 하향조절 분석에 대해 사용한 염색에 추가로, 임의의 오염 CHO 세포를 제외한 항-CD19를 포함시켰다. 유세포분석으로 FLT3 하향조절을 측정하였다.

리드 항체 후보 차단 분석은, 모든 후보가 상업적 대조군 항체에 비해 상대적으로 낮은 활성을 나타내지만(저친화도의 반영임), 모든 리드 후보는 세포-표면 FLT3L을 일정한 정도로 저해하는 능력을 가진다는 것을 입증하였다(도 7).

실시예 번호 7. FLT3L-유도된 FLT3 신호전달의 리드 클론 저해

FLT3의 자기 인산화는 주로 PI3K 및 RAS 캐스케이드를 통한 신호전달 네트워크의 활성화를 야기하는데, 이는 결국 AKT(단백질 키나제 B, PKB), MEK 및 ERK를 활성화시킨다. 신호전달 캐스케이드는 세포 생존 및 증식을 촉진시키는 유전자의 전사를 궁극적으로 야기한다. 리드 항체 후보를 확인하는 것은 1차 인간 세포에서 FLT3L에 의한 FLT3의 하류 신호전달의 차단이며, CD133+ 줄기 세포에서 ERK 및 MEK의 인산화는 메조스케일 MSD 포스포-ERK1/2 및 포스포 MEK1/2 전세포 용해물에 의해 측정하였다.

RS4;11 세포주를 이용하여 분석 검증을 확립하였고, ERK의 활성화는 용량-의존적 방식으로 FLT3L에 의해 유도되었다(도 8의 A). FLT3L의 연속 희석물을 8분 동안 36℃에서 웰당 300,000개의 RS4;11 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 채취하고 나서, 용해시키고, 제조업자의 설명서에 따라 인산화된 ERK에 대해 분석하였다. 더 조기의 분석에 의해, ERK의 FLT3L 활성화에 대한 EC80을 결정하였고(476 pM), 후보 항-FLT3L 항체 클론의 저해 활성을 시험하는 데 사용하였다. 효과적인 중화를 위한 양성 대조군으로서 상업적으로 입수 가능한 마우스 항-인간 FLT3L 항체를 이용하여 분석 효용을 확인하였다(도 8의 B).

이들 확립된 파라미터를 이용하여, 리드 클론은, 사용 전에 FLT3 발현에 대해 검증한 시험관내 확장된 1차 CD133+ 줄기 세포를 이용하여 시험하였다. 리드 클론은 30분 동안 476 pM FLT3L과 함께 사전 인큐베이션시키고, 이어서, CD133+ 줄기 세포에 첨가하였다. 36℃에서 8분의 인큐베이션 후에, 세포를 채취하고, 용해시키고, 제조업자의 설명서에 따라 MSD 분석을 이용하여 인산화된 ERK 및 MEK에 대해 분석하였다. 상업적으로 입수 가능한 마우스 항 인간 FLT3L을 양성 대조군으로서 사용하였다.

모든 후보 클론은 FLT3L에 의해 MEK(도 9의 A) 및 ERK(도 9의 B)의 유도를 저해하는 것으로 나타났다. 그러나, CAT5D9만이 IC_MAX에 도달되었고, 예상된 S-형 용량-반응 곡선을 나타냈다(표 5). 종합하면, 실시예에 제시한 결과는 CAT5D9가 리드 후보의 가장 양호한 클론이며, 친화도 및 에피토프 결합부위의 생물리학적 평가에 조건적인 최적화를 위해 처리될 것임을 시사하였다.

실시예 번호 8. 표적 특이성의 확인

CAT5D9는 생물학적 분석에서 기능성 평가에 의해 최고의 리드 후보인 것으로 나타났다. Octet 에피토프 비닝을 사용하여 수용체 FLT3에 대한 CAT5D9 결합 영역을 결정하였다.

에피토프 비닝을 사용하여 FLT3L 상의 FLT3 수용체와 동일한 결합 영역을 공유하는 리드 항체를 결정하였다. 비닝을 3단계로 수행하였다. I 단계에서, 아비딘 프로브에 대한 비오틴-FLT3L 결합을 수행하였다. II 단계에서, 개개 항체는 비오틴-FLT3L에 결합되었다. III 단계에서, 각각의 시험 항체를 II 단계 항체에 첨가하였다. 검출된 임의의 추가적인 결합은 표적 FLT3L에 대한 비경쟁적 결합 부위를 갖는 2개의 항체를 나타낸다. III 단계에서 첨가한 항체 없이 완충제 단독 및 FLT3-Fc를 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 완충제 단독을 III 단계에서 첨가한다면, FLT3L에 대한 항체의 얻어진 해리 역학은 표적에 대한 클론의 고유한 친화도를 반영한다.

1x 및 2x 농도로 첨가한 CAT5D9만이 FLT3-Fc에 의한 결합을 저해하였는데, 이는 CAT5D9가 FLT3L 상의 목적하는 표적 부위와 부딪힌다는 것을 시사하였다(즉, 이는 FLT3-Fc와 동일하거나 중복되는 에피토프를 공유한다)(도 10의 A). 중요하게는, 대조적으로, 남아있는 4개의 후보 클론은 CAT5D9에 의해 저해되지 않는데, 이는 이들이 상이한 FLT3 에피토프에 결합하였다는 것을 시사한다(도 10의 A). 추가로, 완충제 단독을 첨가하였을 때 빠른 오프 속도는 CAT5D9의 친화도가 낮다는 것을 시사하는 이전의 실험을 뒷받침한다(최적화와 함께 개선된 성능에 대한 이의 잠재력이 높다는 것을 의미함). 이와 일치되게, 4개의 남아있는 클론 각각이 II 단계에서 결합될 때(도 10의 B에 제시한 대표적인 차트로서 나타낸 CAT8), CAT5D9 및 FLT3-Fc의 추가적인 결합은 III 단계에서 검출될 수 없는데, 이는 이들의 상이한 결합 부위를 반영한다. 또한 다른 4개의 클론 각각이 함께 비닝되고 완충제를 단독으로 첨가하였을 때, 이들의 해리 속도는 상대적으로 느리다는 것이 관찰되었다.

종합하며, 이들 데이터는 CAT5D9만이 FLT3L 결합 영역에서 FLT3과 직접적으로 경쟁하고, 낮은 친화도 결합으로 경쟁하는 것으로 나타난 것을 확인하는데, 이는 최적화에 대한 이의 잠재력을 시사한다. 반면에, 남아있는 클론은 모두, 기능성 데이터에 기반하여, FLT3과 직접적으로 경쟁하지 않는 부위와 부딪혔다. 느린 해리 속도는 이들이 FLT3L에 대해 합리적인 친화도로 이미 결합하고 있고, 최적화에 대한 잠재력은 거의 갖지 않는다는 것을 시사하였다. 초기 선별 분석에 본래 존재하는 저해는 입체 장애 또는 수용체 결합 부위의 부분적 차단에 기인할 가능성이 있었다.

실시예 번호 9. 비아코어 결합 역학(C9)

항체 리드의 결합 역학을 결정하기 위해, 그리고 CAT5D9가 FLT3L에 대해 불량한 친화도를 가진다는 것을 시사한 Octet 데이터를 확인하기 위해, 비아코어 분석을 사용하였다. 인간 CAT8, CAT26, Dyax3 및 Dyax5에서 항-FLT3L 단편 항원 결합 및 인간 및 사이노몰거스 원숭이 FLTL3의 역학을 결정하였다. 추가로, 인간과 사이노몰거스 원숭이 FLT3L 둘 다에 대해 CAT5D9 단편 항원의 결합 역학을 결정하였다.

결과를 표 6에 제시한다. 평형 해리 상수(K_D)는 남아있는 리드 항체에 비해 CAT5D9 인간 및 사이노몰거스 원숭이에서 50배 초과로 더 컸다. CAT5D9는 저품질의 빠른 오프 역학을 나타냈다(hu = 70.72, cyno = 70.66). 결과로서, 역학 데이터 K_D에 대한 확인점으로서 정상 상태 결합 데이터를 얻었다. 정상-상태 결합은 유사한 값을 나타내는 역학 결합의 결과를 뒷받침하였다(표 3). 이들 데이터는 저친화도의 CAT5D9, 및 최적화와 함께 개선된 성능에 대한 이의 잠재력을 확인한다.

실시예 번호 10. CAT5D9 교차 반응성의 부재

정확한 FLT3L 에피토프에 결합된 CAT5D9를 확인하는 것에 추가로, FLT3L의 밀접한 구조적 상동체, 즉, 줄기-세포 인자(SCF) 및 집락 자극 인자(CSF1)에 결합하지 않는다는 것을 확인하는 것이 또한 중요하다. 인자는 둘 다 구성적으로 활성화된 FLT3-IT9D 돌연변이로부터 생기는 악성 종양을 관리하기 위한 종양학 상황에서 현재 사용되는 소분자 FLT3 저해제에 대한 1차 비표적 히트인 단백질 티로신 키나제 수용체(각각 c-Kit 및 CSFR1)에 대한 리간드이다.

이를 위하여, ELISA 플레이트를 2 □g의 재조합 인간 SCF 또는 CSF1로 코팅하였다. 세척 후에, 플레이트를 트리스-인산염 완충 식염수(TPBS)에서 3% 유즙으로 차단시키고, 리드 항체를 50 □□g/㎖에서 시작해서 연속(×2) 희석물에 첨가하였다. 인큐베이션 후에, 비결합 항체를 세척에 의해 제거하였고, 발색현상을 위한 TMB 기질과 조합한 항-인간 IgG-HRP를 이용하여 결합된 항체를 검출하였다. 상업적으로 입수 가능한 염소 항-SCF pAb 및 마우스 항-CSF1 mAb를 양성 결합 대조군으로서 사용하였다.

리드 후보 중 어떤 것도 huSCF(도 11의 A) 또는 huCSF1(도 11의 B)과 교차 반응되지 않았다. 중요하게는, 이들 결과는 FLT3L에만 결합하지만 구조적으로 유사한 TKR 리간드 분자에는 결합하지 않는 CAT5D9의 선택성을 입증한다.

실시예 번호 11. CAT5D9의 친화도 최적화

상기 논의한 바와 같이, CAT5D9는 낮은 친화도로 FLT3L에 결합하였고, 따라서 친화도 최적화와 함께 개선된 성능을 위한 잠재력을 입증하였다. PK 모델링에 기반하여 300 pM의 바람직한 KD를 설정하였다. KD의 최대 10,000배의 개선을 달성하기 위해 최적화 캠페인을 설계하였다.

프레임워크의 생식세포계열화 후에, 2개의 병행 전략(인색한 돌연변이유발(parsimonious mutagenesis) 및 블록 돌연변이유발)을 사용하였다. 인색한 돌연변이유발은 모두 20가지의 아미노산에 대해 모두 6개의 CDR 내 모든 위치를 차례로 돌연변이시킨다. 고속대량 방법을 이용하여 클론을 선별하였고, 개개의 유리한 돌연변이를 함께 조합한다. 블록 돌연변이유발은 중복 패턴에서 CDR 내 5 내지 6개 위치의 연속적 신장(stretch)을 돌연변이시키고, 약 1E6 내지 1E7 클론의 얻어진 라이브러리는 먼저 파지 디스플레이 패닝 기법을 이용하여 농축되고, 이후에 고속대량 방법을 이용하여 선별한다.

제1 최적화 라운드 후에, 인색한 돌연변이유발로부터의 30개의 클론 및 블록 돌연변이유발로부터의 24개의 클론을 IgG 형식에서 시험하였다. 분자 모델링 기법을 이용하여, 본 발명자들은 클론 5D9클론 6을 초래하는 최상의 돌연변이를 확인하고 조합하였는데, 이는 1610 nM의 KD(비아코어에 의해 측정), 모체 5D9 초과의 700x 친화도 개선을 달성하였다(표 7 참조). 리드 클론 SC4017 및 AM40의 친화도는 CDTP 기준을 초과하였다(300 pM 미만). 추가로 최적화된 클론은 둘 다 내인성 세포-표면 FLTL에 결합하고, 중화시키며, 인간 혈청에서 내인성의 가용성 FLT3L에 결합하고, 사이노 FLT3L에 결합하고, 이를 중화시킨다.

친화도의 이런 증가는 더 조기의 클론 선택에 대해 기재한 방법을 이용하여 RS4;11 세포 상의 FLT3 하향조절에 의해 측정한 바와 같은 기능적 활성의 1000배 초과의 개선으로 해석한다(도 12의 A).

300 pM의 친화도를 달성하기 위해, 친화도 최적화의 제2 라운드를 수행하였다. 클론 6(C06)을 돌연변이시키고, 얻어진 돌연변이체는 제1 최적화 라운드에서와 유사한 방식으로 선별하였다. 블록 돌연변이유발에서 파지 패닝의 부분으로서, 클론 6은 실질적으로 더 높은 친화도를 갖는 클론을 농축시키기 위한 경쟁자로서 IgG 형식에서 사용하였다. 블록 돌연변이유발로부터의 최상의 클론은 KD=170 pM인 클론 AM40이었다. AM40의 몇몇 조합적 클론 및 인색한 돌연변이유발의 제2 라운드로부터의 돌연변이를 조합하고, KD=37 pM인, 하나의 우수한 클론인 SC4017을 생성하였다. 이런 더 높은 친화도는 또한 RS4;11 세포 상의 FLT3 하향조절에 의해 입증되는 바와 같은 FLT3L의 개선된 기능적 저해에 반영되었다(도 12의 B). 그러나, 추가적인 분석은 SC4017의 우수한 성능을 결합 영역에 인접하여 혼입된 단일의 추가적인 트립토판에 따른 결과로 본다. 이는 노출된 트립토판 잔기의 산화에 대한 취약성을 고려할 때 연구 상의 위험을 나타냈다. 이런 이유로, AM40을 리드 IgG 클론으로서 선택하였다. SC4017(37 pM)에 비해 이의 약간 더 낮은 친화도(170 pM)에도 불구하고, AM40은 여전히 300 pM의 본래의 표적을 초과하였고, 연구에 대한 더 낮은 위험을 갖는 것으로 결정하였다.

최종적으로, 본 발명자들은 두 클론 다 FLT3+ RS4;11과의 공동 배양물에서 7일 동안 20 ng/㎖의 IL-7로 자극한 1차 T 세포를 이용하는 분석을 개발함으로써 세포 표면상에서 내인성 FLT3L을 중화시킬 수 있었다는 것을 확인하였다(1차 T 세포 상의 세포-표면 FLT3L 발현을 유도하기 위한 가장 효과적인 프로토콜인 것을 발견함). 간략하게, IL-7 자극된 CD4+T 세포를 RS4;11 세포와 함께 밤새 15:1의 비로(도 13의 A에 나타낸 용량 비 반응), 단독으로 또는 후보 클론인 SC4017 및 AM40의 연속 희석물의 존재 하에 인큐베이션시켰다. 앞서 기재한 바와 같은 유세포분석 방법에 의해 FLT3 하향조절을 측정하였다. 두 클론 다 유사한 효능으로 1 nM 초과의 농도에서 RS4;11 세포 상의 FLT3 하향조절을 완전히 방지하는 것으로 나타났다(도 13의 B).

실시예 번호 12. 건강한 비-인간 영장류에서의 중화 FLT3L

중화 FLT3L에서 AM40의 안전성 및 지속성을 결정하기 위해, 1주 1회 반복 투약을 이용하여 1개월의 기간에 걸쳐 독성 연구를 수행하였다. 동물 진행을 지켜보기 위해 8주 치료 후속 기간을 포함시켰다. 연구 개요를 도 14에 도시한다. 도 15의 A에 나타낸 바와 같이, 유리 가용성 FLT3L 수준은 모든 용량에서 AM40의 제1 투여 후 가파르게 하락되었지만, 0.3 ㎎/㎏에서 1주일 내내 표적 맞물림을 유지하는 데 불충분하였다. 더 높은 투약량 그룹(1 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏)은, 가용성 FLT3L 수준이 1.0 ㎎/㎏ 그룹에서 기준으로 회복되는 시점인 57일을 지나 지속적으로 완전한 표적 맞물림(BLQ 미만의 유리 가용성 FLT3L로서 반영됨)을 나타냈다.

유사하게, 순환 DC 빈도의 측정(유세포 분석을 통해 검출하고, 연구전 기준 수준의 백분율로서 표현한 총 CD45+ 세포%)은 1.0 및 30 ㎎/㎏ 그룹에서 22일을 지나 CD1c+(고전적) DC 및 형질세포양 DC 빈도의 정적 감소를 나타냈다(도 15의 B). 순환 CD1c+ DC 빈도는 각각 1 ㎎/㎏ 그룹 및 30 ㎎/㎏ 그룹에 대해 50일 및 85일을 지나서 억제된 채로 남아있었다. 순환 pDC 빈도는 각각 1 ㎎/㎏ 그룹 및 30 ㎎/㎏ 그룹에 대해 71일 및 85일을 지나서 감소된 채로 남아있었다. 1.0 ㎎/㎏ 그룹에서 DC 집단의 회복은 57일과 85일 사이의 일정 시점에 생긴 유리 혈청 FLT3L의 회복과 상관관계가 있었다. 이들 결과는 FLT3L이 AM40에 의해 중화될 때 DC 집단이 하락하지만, 유리 FLT3L이 이용 가능하게 될 때 기준으로 빠르게 복귀된다는 것을 나타낸다.

실시예 번호 13. FLT3L 발현은 전신 홍반 루푸스(SLE)의 중증도와 상관관계가 있다

SLE는 만성 염증을 특징으로 하는 자가면역질환이며, 신체의 거의 모든 기관 및 모든 연령 그룹에 영향을 미칠 수 있다. SLE는 통상적으로 관절, 피부, 신장, 폐, 심장 및 뇌에 영향을 미친다. 전염증 신호전달에서의 역할을 고려하면, FLT3L 수준과 질환 중증도 간의 상관관계를 찾기 위해 SLE를 갖는 개체에서 FLT3L의 발현을 연구하였다. 지금까지 공개된 연구는 질환과의 상관관계를 유도할 때 혈청 FLT3L 수준에 크게 의존한 한편, 이는 임상 상황에서 가장 유용한 측정이며, 생성으로부터 DC 및 다른 활성화된 FLT3L-소모 세포가 차지하는 것을 뺀 것을 반영한다는 고유한 단점을 가진다. 염증 상황에서, FLT3-발현 세포의 수 및 이들의 FLT3L의 소모는 크게 달라지며, 이는 연구 간 발견점의 변화 및 아무도 혈청 FLT3L과 질환 진행의 임상 스코어 간의 직접적인 상관관계를 보여주지 못한 이유를 설명할 가능성이 있다. T 세포는 염증 상황에서 FLT3L의 우세한 공급원 중 하나라는 것이 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용하여 T 세포 표면 상에서 직접적으로 FLT3L 발현을 측정하는 분석을 개발하였다.

혈청 및 PBMC는 SLE를 갖는 개체(n=24) 및 건강한 공여자(HD; n=15)로부터 단리시켰다. 혈청 FLT3L은 제조업자의 설명서에 따라 ELISA(R&D Systems)를 이용하여 측정하였고, FLT3L-발현 CD4+ T 세포의 빈도를 내부에서 개발한 유세포 측정 분석을 이용하여 결정하고, FLT3L은 형광 표지된 항-FLT3L 클론인 MAB608(R&D Systems)로 검출하였다. SLE 질환 활성 지수(Disease Activity Index: SLEDAI)를 사용하여 동일한 개체에서의 루푸스 활성을 결정하였다. 질환 코호트에 대한 건강체의 비교를 위해 맨 휘트니 및 스피어만 상관관계(Mann Whitney and Spearman Correlation) 및 SLEDAI와의 상관관계를 각각 이용하여 유의도를 결정하였다.

이전의 문헌과 일치되게, 혈청 FLT3L 수준은 HD에 비해 SLE 공여자에서 상승되었지만(p<0.05; 도 16의 A), 질환 활성(SLEDAI)과의 유의한 상관관계는 발견되지 않았다(p<0.07; 도 16의 B). 대조적으로, CD4+ T 세포를 발현시키는 FLT3L의 빈도에 의해 FLT3L 생성을 측정하였을 때, HD에 비해 SLE 공여자에서 매우 유의한 증가(p<0.0001; 도 16의 C) 및 SLEDAI 스코어와의 강한 상관관계(r = 0.7045; p<0.0001; 도 16의 D)가 있었다. 이 데이터는 T 세포 상의 FLT3L 발현 측정이 질환 상황에서 특히 적절할 수 있다는 것을 시사한다.

SLEDAI 스코어와 FLT3L 발현 CD4+ T 세포와의 상관관계의 발견 시, CD4+ 세포의 하위집단을 (1) SLE 환자로부터의 CD4+ T 세포 하위집단에 걸친 FLT3L 발현이 공지된 생물학과 일치되는지 여부, 및 (2) 하위집단 발현이 SLEDAI 스코어와 상관관계가 있는지 여부를 결정하기 위해 시험하였다. 연구한 CD4+ 하위집단은 미경험(

) T 세포(T_naive), 효과기 기억 세포(T_EM), 및 중심 기억(T_CM) 세포였다. 상기 기재한 바와 동일한 프로토콜 및 유의도 수준을 사용하여 발현 및 상관관계를 연구하였다.

CD4+ T 세포 하위집단에 걸친 FLT3L 발현은 FLT3L 발현의 공지된 생물학과 일치되었다. 구체적으로, SLE 공여자에서 작지만 유의한 상승이 있었음에도 불구하고, HD에서 T_naive 세포 상의 FLT3L 발현은 일반적으로 관찰되지 않았다(도 17의 A, 상부). SLE 공여자로부터의 T_naive 세포 상의 FLT3L 발현은 SLEDAI 스코어와 유의하게 상관관계가 있었다(도 17의 A, 하부; r = 0.6629; p=0.0004). 중요하게는, FLT3L 발현을 유도하는 것으로 알려진 □-쇄 사이토카인에 노출된 최근에 활성화된 T 세포를 포획하는 이 집단에서 예상된 바와 같이, FLT3L 발현은 HD와 SLE CD4+ T_EM 둘 다에 대해 관찰되었다. 이 반응은 HD와 SLE 공여자 둘 다에서 보이지만, 후자에서 유의하게 상승되었고, 또한 SLE 공여자에서의 발현은 SLEDAI와 상관관계가 있었다(도 17의 B, 하부; r=0.6201; p=0.0012). 최종적으로, FLT3L 발현은 T_EM으로부터 T_CM까지 분화됨에 따라 건강한 CD4+ T 세포에서 감소되지만, SLE 공여자의 PBMC에서 유지된다(도 17의 C, 상부; p<0.0001). 또한, FLT3L+ T 세포의 빈도와 SLEDAI 간에 유의한 상관관계가 존재하는데, 이는 이 그룹 내 발현이 만성 염증 상태의 반영이라는 것을 시사한다.

총괄적으로, 이들 연구는 SLE 환자의 CD4+ T 세포 상의 FLT3L 발현이 HD의 발현에 비해 유의하게 증가된다는 것을 입증한다. 게다가, 증가된 FLT3L 발현은 SLEDAI 스코어와 매우 상관관계가 있다. 따라서, SLE 환자에 대한 항-FLT3L 항체의 투여는 SLE 환자에서 염증을 감소시키기 위해 FLT3L-발현 T 세포 집단을 감소시키기 위한 합리적인 치료적 전략이다.

상기 사용한 방법은 IC FLT3L RNA의 PrimeFlow 인시추 검출을 이용하여 검증하였고, APC-접합 AM40을 이용하여 확인하였다.

실시예 번호 14. 근염에서의 FLT3L 발현

근염은 쇠약, 부종 및 근육 통증을 특징으로 하는 만성 근육 염증이다. 세포 수준에서, 근염은 인터페론 1형 단백질 및 pDC의 상승된 수준을 특징으로 한다. 근염은 SLE 및 다른 전염증 병태와 연관될 수 있다. 따라서, FLT3L 수준과 질환 중증도 사이의 상관관계를 찾기 위해 근염을 갖는 개체에서의 FLT3L의 발현을 연구하였다.

FACS를 이용하여 FLT3L 발현 CD4+ T 세포에 대해 근염 및 HD를 갖는 개체로부터의 PBMC를 연구하였다. CD4+ T 세포를 T_naive, T_EM 및 T_CM 하위집단으로 나누었다. 맨 휘트니 분석을 이용하여 근염과 HD 샘플 간의 유의도를 결정하였다.

도 18의 A 및 B에서 알 수 있는 바와 같이, 근염을 갖는 개체로부터의 PBMC에서 FLT3L의 발현은 SLE 환자로부터의 소견에 부합하는데, 그들이 FLT3L에 대해 양성인 CD4+ T 세포의 백분율의 유의한 증가를 특징으로 하기 때문이다(T_naive (p<0.05; 도 18의 A), T_EM (p<0.0001; 도 18의 B) 및 T_CM (p<0.0001; 도 18의 C)). 이들 결과에 비추어, 근염 환자에 대한 항-FLT3L 항체의 투여는 근염 환자에서 염증을 감소시키기 위해 FLT3L-발현 T 세포 집단을 감소시키기 위한 합리적인 치료적 전략이다.

실시예 번호 15. 신장염에서의 FLT3L 발현

신장염은 신장 및 연관된 신장 구조에 영향을 미치는 면역 장애이다. 병태는 SLE, 특정 독소 또는 특정 감염으로부터 유래될 수 있다. 신장염은 치명적일 수 있는 신장 기능의 영구적인 상실을 초래할 수 있다. 수지상 세포는 루푸스 신장염에서 신장을 침윤하는 것으로 나타났고(Fiore et al., (2008) Mol Immunology v45: 259-265) 신장에서 염증을 유도하는데 어떤 역할을 하는 것으로 생각되고, 따라서, FLT3L 차단이 DC를 억제하고, 신장 기능의 점진적 상실을 방지한다는 가설을 세웠다.

머피 로스 라지(Murphy Roths Large)/림프구 증식성(MRL.lpr) 신장염 마우스 모델 및 마우스 대용 항-FLT3L 항체(LFC-1)를 사용하여 단백뇨 수준 및 신장염 스코어에 대한 FLT3L 차단 효과를 연구하였다. 아이소타입 대조군뿐만 아니라 항-IFNAR 항체 처리군을 포함시켰다. 항-FLT3L 항체를 투여한 마우스는 투여 후 17주에 단백뇨의 유의한 감소를 나타냈다(도 19의 A). 추가로, 18주에 신장염 스코어는 아이소타입 대조군에 비해 항-FLT3L 항체를 투여한 마우스에서 감소되었다(도 19의 B). 중요하게는, 항-FLT3L 항체를 투여한 마우스에서의 단백뇨 및 신장염 스코어는 투여한 마우스에 비해 감소되었다. 이들 결과는 신장염에서 FLT3L-매개 염증에 대한 역할을 뒷받침한다. 이들 결과에 비추어, 신장염 환자에 대한 항-FLT3L 항체의 투여는 신장염 환자에서 염증을 감소시키기 위해 FLT3L-발현 T 세포 집단을 감소시키기 위한 합리적인 치료적 전략이다.

신장염에서 백혈구 집단의 FLT3L-연관 변화에 대한 통찰을 제공하기 위해 비장 DC 집단을 또한 시험하였다. 18주에 MRL 마우스로부터 비장을 채취하고 나서, 비장 DC 집단의 변화를 시험하였다. 항-FLT3L 항체 치료는 MRL 마우스에서 순환 DC를 유의하게 감소시켰다(도 20의 A 내지 C). 구체적으로 Siglec-H+-pDC는 항-FLT3L 항체 투여 후에 아이소타입 대조군에 비해 유의하게 감소되었다(도 20의 A). 유사하게, CD11b+ cDC(인간 CD1c+ DC와 동일) 및 CD8+ cDC(인간 CD141+ DC와 동일)에서 유의한 감소가 관찰되었다(도 20의 B 및 C). 추가로, 치료가 없는 마우스에서의 보통 30 내지 40%의 발생률에 비해 항-FLT3L 치료 마우스에서 피부염의 이환수는 관찰되지 않았다. 따라서, 항-FLT3L 항체 치료는 순환 DC 집단을 감소시켰고, 신장염 모델에서 2차 병리(피부염)를 개선시켰다. 이들 결과에 비추어, 신장염 환자에 대한 항-FLT3L 항체의 투여는 DC 집단을 억제함으로써 염증 및 조직 손상을 감소시킬 수 있다.

실시예 번호 16. 쇼그렌 증후군에서의 FLT3L 발현

1차 쇼그렌 증후군(pSS)은 눈 및 침샘의 광범위한 건조를 특징으로 하는 자가면역 병태이다. 추가로, 병태는 다기관 기능장애를 야기할 수 있다. 증후군은 단독으로 또는 추가적인 자가면역질환, 예컨대 루푸스 또는 류마티스 관절염의 존재 하에 생긴다. FLT3L의 혈청 수준은 pSS를 갖는 개체에서 증가되며, 염증있는 침샘에서 FLT3L과 이의 수용체 둘 다의 국소 발현의 증거가 있다(Tobon et al., (2010) Arthritis and Rheumatism v62: 344).

NOD.H2h4 쇼그렌 마우스 모델을 사용하여 장기간의 항-FLT3L 항체(LFC-1) 치료 후 침샘 병리를 연구하였다. 16주령까지, 이들 마우스는 인간에서 보이는 병리학적 변화와 매우 비슷한 방식으로 DC, B220+ B 세포 및 CD3+ T 세포의 대부분을 포함하는 침샘(SG)에서의 3차 림프성 구조(TLS)를 발달시킨다. 이런 조직 손상은 자가항체의 발생 및 비장에서 자발적 배중심의 형성에 의해 진행된다(Mahmoud et al., 2016 Science Translational Medicine, v8 361ra137). 마우스는 아이소타입 IgG 대조군(5 ㎎/㎏), 항-FLT3L 항체(5 ㎎/㎏)에 의한 예방적(5주령에 시작) 또는 치료적(17주령에 시작) 프로토콜을 이용하여 치료하였다. 프로토콜 둘 다에 대해, 치료는 연구 종료(26주)까지 매주 2회 투약을 계속하였다. 항-FLT3L 단클론성 항체(LFC-1)는 치료 과정 내내 FLT3L을 효과적으로 중화시키고(도 25의 A), 순환 약물/리간드 복합체의 축적을 초래하였다(도 25의 B).

말초 면역 세포 집단에 대한 변화를 평가하기 위해 림프 모양 세포를 수집하고, 침샘(SG)을 채취하고 나서, 조직 병리(TLS 빈도)에 대해 평가하였다. 예방적 치료가 질환 개시를 방지할 수 있다는 것은 이전에 보고되었지만, 조직 손상은 질환 개시 후 치료적 개입에 의해 지연되거나 예방될 수 있다는 이전의 보고로 제한되었다. 항-FLT3L 단클론성 항체(LFC-1)는 비장 및 침샘-배수 LN에서 항원 경험 CD44^HI CD4+ 및 CD8+ T 세포 빈도를 감소시킬 뿐만 아니라(24 내지 26주령의 연구 마지막에)(도 26의 A 내지 D), 콜라겐 IV 및 혈소판 추출물에 대한 특이적 자가항체를 선택적으로 감소시켰다(도 27).

예상한 바와 같이, 아이소타입 대조군 IgG로 치료한 동물은 26주령까지 침샘(㎟ 조직당 빈도로서 측정함)의 TLS 형성을 증가시켰는데, 이는 침샘 손상을 나타낸다. 치료적으로 투약할 때조차 항-FLT3L로 치료한 마우스는 조직 SG 손상의 유의한 감소가 있었고(도 21의 A), 예방적으로 투약하였을 때 질환은 완전히 예방되었다(도 21의 B). 비장에서 측정한 바와 같이 DC 집단은 완전히 결실되지는 않았지만, 유의하게 억제되었다(도 22의 A 내지 D). 그럼에도 불구하고, 이는 침샘 내로의 염증성 침윤을 감소시킴으로써 질환 개시 및 진행에 유의한 영향을 미치는 데 충분하였다. 이들 결과는 pSS에서의 염증이 FLT3L-매개 메커니즘에 의해 유도된다는 것을 뒷받침한다. 이들 결과에 비추어, 항-FLT3L 항체의 투여는 인간 대상체에서 pSS를 치료하기 위한 합리적인 치료적 전략이다.

앞서 언급한 설명으로부터, 본 명세서에 기재된 개시내용을 변화 및 변형시켜 이를 다양한 용법 및 조건에 채택할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 이러한 실시형태는 또한 다음의 청구범위의 범주 내에 있다. 본 명세서의 변수의 임의의 정의에서 요소들의 목록의 열거는 임의의 단일 요소 또는 열거된 요소의 조합(또는 하위조합)으로서 해당 변수의 정의를 포함한다. 본 명세서의 실시형태의 열거는 임의의 단일 실시형태로서 또는 임의의 다른 실시형태 또는 이의 일부와의 조합으로 해당 실시형태를 포함한다. 본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 각각의 독립적 특허 및 간행물이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 나타내는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Viela Bio, Inc. <120> ANTIBODIES TO FELINE MCDONOUGH SARCOMA (FMS)-LIKE TYROSINE KINASE 3 RECEPTOR LIGAND (FLT3L) AND USES THEREOF FOR TREATING AUTOIMMUNE AND INFLAMMATORY DISEASES <130> 054493-502001WO <150> US 62/630,571 <151> 2018-02-14 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "AM40_VH" <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Arg Pro Pro Thr Ser Arg Thr Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Gly Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Asn Asp Phe Val Tyr Gly Ser Tyr Arg Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp Lys Tyr Arg Pro Ser Gly Val Ala Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 11 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "DYAX3_VH" <400> 11 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr 20 25 30 Glu Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Pro Ser Gly Gly Lys Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 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17 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "SC4017_VH" <400> 17 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agttatgctc ttagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaacg cggccgccga cctcccggac agcaagctac 180 gcacagaaat ttcagggcag agtcacgatt accgtggacg aatccacgag cacaggctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gtcaaacgac 300 ttcgtgtacg ggagttatcg tttctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 18 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "SC4017_VL" <400> 18 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcaccagtgg gtggattgcc ggctactttg tgcagtggta ccagcagcgc 120 ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggattacc aacgaccctc tggggtccct 180 gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactat tgtcagtctt atgatgacta ccggcgggcg 300 gcgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 19 <211> 357 <212> 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ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcctccat 1140 cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtct acaccctgcc 1200 cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt 1260 ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa 1320 gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt 1380 ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct 1440 gcacaaccac tacacgcaga agagcttaag cctgtctccg ggtaaa 1486 <210> 68 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "SC4017_LC" <400> 68 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60 tcctgcaccc gcaccagtgg gtggattgcc ggctactttg tgcagtggta ccagcagcgc 120 ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggattacc aacgaccctc tggggtccct 180 gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 ctgaagactg aggacgaggc tgactactat tgtcagtctt atgatgacta ccggcgggcg 300 gcgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggcggc gccctcggtc 360 actctgttcc cgccctcctc 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atccacgagc acaggctaca 240 tggagctgag cagcctgaga tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg tcaaacgact 300 tcgtgtacgg gagttatcgt ttctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcagcgt 360 cgaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca 420 cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcctgga 480 actcaggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac 540 tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca 600 tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat 660 cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaattcgag gggggaccgt 720 cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg 780 tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg 840 tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca 900 cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt 960 acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcctccat cgagaaaacc atctccaaag 1020 ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtct acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga 1080 ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg 1140 tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg 1200 actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc 1260 aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga 1320 agagcttaag cctgtctccg ggtaaa 1346 <210> 72 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "CAT5D9_LC" <400> 72 aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtcaccatc 60 tcctgcaccc gcaccagtgg gaacattgcc ggctactttg tgcagtggta ccagcagcgc 120 ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggattacc aacgaccctc tggggtccct 180 gatcggttct ctggctccat cgacaggtcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240 ctgaagcctg acgacgaggc tgactactat tgtcagtctt atgatgacac ctctcaaggt 300 gtgttcggcg cagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtcagc ccaaggcggc gccctcggtc 360 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480 aaggcgggag 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Claims (39)

1. FLT3L에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상보성-결정 영역(Complementarity-Determining Region: CDR)의 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하되, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은,
   (a) 각각 서열번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34; 또는
   (b) 각각 서열번호 29, 30, 31, 35, 33 및 34; 또는
   (c) 각각 서열번호 29, 36, 37, 32, 33 및 38
   의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하되, 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3 및 FW4의 순서로 배열되는 3개의 CDR 및 4개의 프레임워크 영역(framework region: FW)을 포함하고, 상기 VH 및 VL 영역은,
   (a) 각각 서열번호 1 및 서열번호 2; 또는
   (b) 각각 서열번호 3 및 서열번호 4; 또는
   (c) 각각 서열번호 5 및 서열번호 6
   에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
3. 제2항에 있어서, 상기 VH의 상기 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 상기 VL의 상기 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)은,
   (a) 각각 서열번호 29, 30, 31, 32, 33 및 34; 또는
   (b) 각각 서열번호 29, 30, 31, 35, 33 및 34; 또는
   (c) 각각 서열번호 29, 36, 37, 32, 33 및 38
   의 아미노산 서열로 이루어진, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
4. 제2항에 있어서, 상기 VH 및 VL은,
   (a) 각각 서열번호 1 및 서열번호 2; 또는
   (b) 각각 서열번호 3 및 서열번호 4; 또는
   (c) 각각 서열번호 5 및 서열번호 6
   의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
5. 제4항에 있어서,
   (a) 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 영역 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 영역; 또는
   (b) 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 영역 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 영역; 또는
   (c) 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 영역 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 영역
   을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 줄기 세포, 조혈세포 전구체, 수지상 세포, 활성화된 T 및 B 세포, 단핵구 또는 미세아교세포 상의 막 결합된 FLT3의 FLT3L-매개 활성화를 저해하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
7. 제6항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 줄기 세포 인자(huSCF) 및 인간 집락 자극 인자(huCSF1) 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하지 않는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
8. 제6항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 huSCF 또는 huCSF1 중 어느 하나에 특이적으로 결합하지 않는, 항체 또는 단편.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론성 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은,
    (a) IgA 불변 도메인;
    (b) IgD 불변 도메인;
    (c) IgE 불변 도메인;
    (d) IgG1 불변 도메인;
    (e) IgG2 불변 도메인;
    (f) IgG3 불변 도메인;
    (g) IgG4 불변 도메인; 및
    (h) IgM 불변 도메인
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 더 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
11. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG1 불변 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은,
    (a) Ig 카파 불변 도메인; 및
    (b) Ig 람다 불변 도메인
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 면역글로불린 불변 도메인을 더 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 및 인간 람다 경쇄 불변 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
14. 제11항에 있어서, 상기 IgG1 불변 도메인은 Kabat의 EU 넘버링 색인에 따라 넘버링된 L234F, L235E 및 P331S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는, 단리된 핵산 분자.
16. 제15항에 있어서, 상기 핵산 분자는 제어 서열에 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
17. 제15항 또는 제16항에 따른 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
18. 제15항 또는 제16항의 핵산 분자 또는 제17항의 벡터로 형질전환된, 숙주 세포.
19. 제18항에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유류 숙주 세포인, 숙주 세포.
20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는, 하이브리도마.
21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는, 단리된 숙주 세포.
22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서, (a) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현시키는 숙주 세포를 배양시키는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주 세포로부터 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 단리시키는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법.
23. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
24. 의약으로서 사용하기 위한 제23항에 따른, 약제학적 조성물.
25. 신장염의 치료 방법으로서,
    약제학적 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 신장염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신장염의 치료 방법.
26. 원발성 쇼그렌 증후군의 치료 방법으로서,
    약제학적 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 원발성 쇼그렌 증후군의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 원발성 쇼그렌 증후군의 치료 방법.
27. 근염의 치료 방법으로서,
    약제학적 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 근염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 근염의 치료 방법.
28. 전신 홍반 루푸스(SLE)의 치료 방법으로서,
    약제학적 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 전신 홍반 루푸스의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 전신 홍반 루푸스의 치료 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 대상체는 FLT3L-발현 CD4+ T 세포의 빈도에 의해 측정했을 때, 건강한 대상체에 비해 증가된 혈청 수준의 FLT3L을 갖는, 방법.
30. 대상체에서의 전신 홍반 루푸스(SLE)의 진단 방법으로서,
    a. FLT3L의 혈청 수준을 측정하는 단계; 또는
    b. FLT3L-발현 CD4+ T 세포의 빈도를 측정하는 단계를 포함하되,
    건강한 공여자에 비해 상기 대상체에서의 FLT3L의 증가된 혈청 수준 또는 FLT3L-발현 CD4+ T 세포의 증가된 빈도는 상기 대상체가 SLE를 가진다는 것을 나타내는, 전신 홍반 루푸스의 진단 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 CD4+ T 세포는 효과기 기억 세포(T_EM)인, 방법.
32. 막 결합된 FLT3L의 중화가 필요한 대상체에서 막 결합된 FLT3L을 중화시키는 방법으로서, 약제학적 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 FLT3L은 가역적으로 중화되는, 방법.
34. 순환성 고전적 수지상 세포(cDC) 및 형질세포양 수지상 세포(pDC) 집단의 감소가 필요한 대상체에서 순환성 고전적 수지상 세포 및 형질세포양 수지상 세포 집단을 감소시키는 방법으로서, 약제학적 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 cDC 및 pDC의 집단이 투여 전 수준으로 회복될 수 있도록 상기 cDC 및 pDC의 집단은 가역적으로 감소되는, 방법.
36. CD4+ T 세포 상의 FLT3L 발현을 감소시키는 방법으로서, 약제학적 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 CD4+ T 세포 상의 FLT3L 발현의 감소가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
37. FLT3L을 발현시키는 CD4+ T 세포의 백분율을 감소시키는 방법으로서, 약제학적 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 CD4+ T 세포의 백분율 감소가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
38. 림프아구에서 ERK 신호전달을 감소시키는 방법으로서, 상기 림프아구를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
39. 1차 CD133+ 인간 줄기 세포에서 MEK 1/2 인산화를 감소시키는 방법으로서, 상기 줄기 세포를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.

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