KR102278408B1 - 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자는 뇌동맥의 직경을 감소시키며, 두께를 증가시킬 수 있고, 엘라스틴 및 평활근 함량을 증가시킬 수 있으며, 비정상적인 콜라겐의 함량을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자는 염증반응 매개인자의 발현을 억제하는 효과가 있다.

Description

멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating cerebrovascular diseases comprising melittin or magnetic iron oxide nanoparticle loaded with melittin as effective component}
본 발명은 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
뇌동맥류(cerebral aneurysm)는 뇌혈관 벽이 약화되어 비정상적으로 부풀어오른 혈관질환이다. 뇌혈관의 내측을 이루고 있는 내탄력층과 중막이 손상되고 결손되면서 혈관벽이 부풀어올라 새로운 혈관 내 공간을 형성하는 경우를 말한다. 윌리스 고리(circle of Willis)라고 불리는 뇌 바닥 쪽의 굵은 뇌동맥에서 90% 이상이 발견되며, 나머지는 원위부(심장에 가까운 혈관 부위를 근위부, 먼 쪽을 원위부라고 하며, 근위부에서 원위부로 갈수록 혈관이 가늘어지고 뇌에 직접 혈액을 공급함)의 가는 뇌동맥이나 뇌의 후두부나 숨골을 담당하고 있는 동맥에서 발생한다. 대부분 크기는 10mm 이하이지만 간혹 그보다 큰 동맥류가 발생할 수 있으며 25mm 이상인 경우 특별히 거대 동맥류라고 지칭한다. 동맥류의 형태에 따라 낭상동맥류, 방추상동맥류, 해리성 동맥류로 구분된다.
뇌동맥류가 발생하는 정확한 원인은 아직 모르지만, 동맥 가지나 근위부에 주로 발생하는 것을 근거로, 혈역학적으로 높은 압력이 가해지는 부위에 후천적으로 혈관벽 내에 균열이 발생하여 동맥류가 발생하고 성장하는 것으로 추정하고 있다. 주로 40대에서 60대 사이에 흔히 발생하며 약 20%에서는 다발성 동맥류가 발견되고 있다. 드물지만, 혈관에 염증이 있거나 외상으로 혈관벽에 손상이 발생하거나 또는 유전적으로 혈관벽에 문제가 있는 경우 동맥류가 발생하기도 한다. 뇌동정맥기형이나 모야모야병(moyamoya disease)과 같은 뇌혈관 질환이 있는 경우 동맥류가 동반되기도 한다. 흡연, 고혈압 또는 마약류 사용이 뇌동맥류를 발생시킨다는 보고들도 있으나 확실히 밝혀진 바는 없다.
뇌 컴퓨터 단층촬영(CT), 뇌 자기공명영상(MRI), 뇌혈관 조영술로 검사한다. 최근 기술의 발전으로 비침습적인 검사인 뇌 컴퓨터 단층촬영이나 뇌 자기공명영상만으로 뇌동맥류를 진단하고 치료 계획을 세울 수도 있다. 하지만, 아직까지는 침습적인 검사인 뇌혈관 조영술이 가장 중요한 검사로서, 진단하고 치료 계획을 세우는 데 결정적인 역할을 하며, 치료에 직접 이용되기도 하는데 일부에서는 수술보다도 더 많이 이용되는 치료법으로 자리 잡고 있다. 검사상 정상 뇌동맥에서 비정상적으로 튀어나와 있는 혈관 구조물이 발견되면 뇌동맥류로 진단된다. 간혹 출혈을 동반했을 때는 동맥류가 혈종에 눌려서 안 보일 수 있으며, 이러한 경우 약 2주 정도 후에 검사를 재시행하여 확진하게 된다. 지주막하 출혈, 뇌 내 출혈, 뇌실 내 출혈, 혈관 연축 그리고 수두증은 뇌 영상검사로 진단이 가능하며, 간혹 영상검사 상에서는 지주막하 출혈이 안 보이지만 증상에서 뇌동맥류 파열이 강력히 의심되는 경우 뇌척수액 검사를 통해서 미세한 지주막하 출혈을 진단하기도 한다.
한편, 멜리틴은 봉독에 40~50%를 차지하는 주요성분으로, 26개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 항암 활성을 비롯하여 세균의 성장억제, 상균, 항염증, 진동 및 면역증강 작용 등 여러 가지 효능들이 보고된 바 있다. 일례로, 한국공개특허 제2019-0127609호에 멜리틴-기반 세포사멸 유발 펩티드로 M2 유사 종양관련 대식세포 표적화가 개시되어 있고, 한국등록특허 제2042059호에 멜리틴 나노입자를 포함하는 암 예방, 치료 및 개선용 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 하는 뇌혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 본 발명의 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자가 뇌동맥의 직경을 감소시키며, 두께를 증가시킬 수 있고, 엘라스틴 및 평활근 함량을 증가시킬 수 있으며, 비정상적인 콜라겐의 함량을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자는 염증반응을 매개하는 MMP-9, MCP-1, CD68, TNF-α 및 NFκB의 발현을 억제하는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자는 뇌동맥의 직경을 감소시키며, 두께를 증가시킬 수 있고, 엘라스틴 및 평활근 함량을 증가시킬 수 있으며, 비정상적인 콜라겐의 함량을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자는 염증반응을 매개하는 MMP-9, MCP-1, CD68, TNF-α및 NFκB의 발현을 억제하는 효과가 있다.
도 1A는 산화철 나노입자(iron oxide nanoparticle), L-아르기닌 및 멜리틴의 결합을 통해 형성된 멜리틴을 탑재한 산화철 나노입자(MeLioN)의 구조를 나타낸 것이고, 도 1B는 산화철 나노입자(ION), L-아르기닌이 결합된 나노입자(LION) 및 멜리틴을 탑재한 나노입자(MelLioN)의 투과전자현미경(Transmission electron microscope; TEM)과, 주사전자현미경(Scanning electron microscope; SEM) 사진이다.
도 2는 뇌동맥류를 유도하는 과정을 나타낸 것으로, 고염식이하면서, 1주일째, 우측 콩팥절제; 2주일째, 엘라스테아제 주입 및 안지오텐신(angiotensin) II 지속 피하주입; 2주일째 이후, 산화철 나노입자(ION), 멜리틴(MEL) 및 멜리틴이 탑재된 자성나노입자(MeLioN) 2.5mg/kg/dose를 3일 동안 5회 투여하고, 4주일째 뇌조직을 획득하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 멜리틴 및 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 투여한 실험동물군의 뇌혈관 조직 상태를 H&E 염색으로 뇌동맥의 형태를 확인한 것으로, (A)는 H&E 염색 사진이고, (B)는 뇌동맥의 직경을 확인한 결과이며, (C)는 뇌동맥 두께를 확인한 결과이다. H는 일반식이한 정상군, D는 고염식이-좌측콩팥절제-엘라스타아제 뇌조 주입을 시행한 뇌동맥류 유발군, ION는 뇌동맥류 유발과 동시에 산화철 나노입자 단독투여군, MEL은 뇌동맥류 유발과 동시에 멜리틴 단독투여군, MeLioN은 뇌동맥류 유발과 동시에 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군이다. ###은 일반식이한 정상군 대비 고염식-좌측콩팥절제-엘라스타아제 뇌조 주입을 실시한 뇌동맥류 유발군의 뇌동맥의 직경이 통계적으로 유의미하게 증가하였거나, 뇌동맥의 두께가 감소하였다는 것으로, p<0.001이고, ***은 뇌동맥류군 대비 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군의 뇌동맥 직경이 통계적으로 유의미하게 감소하였거나, 산화철 나노입자 단독투여군, 멜리틴 단독투여군 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군의 뇌동맥 두께가 증가하였다는 것으로, p<0.001이며, ns는 통계적으로 무의미한 변화를 의미한다.
도 4는 동물모델을 이용하여 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자의 투여에 따른 뇌혈관 조직 상태를 Verhoff Van Gieson 염색하여 엘라스틴 분률을 확인한 결과이다. H는 일반식이의 정상군, D는 고염식이-좌측콩팥절제-엘라스타아제 뇌조주입을 시행한 뇌동맥류 유발군, ION는 뇌동맥류 유발과 동시 산화철 나노입자 단독투여군, MEL은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴 단독투여군, MeLioN은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군이다. ***은 정상군 대비 뇌동맥류 유발군, 산화철 나노입자 단독투여군 및 멜리틴 단독투여군의 엘라스틴 분률이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001이다. ns는 통계적으로 무의미한 변화를 의미한다.
도 5는 동물모델을 이용하여 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자의 투여에 따른 뇌혈관 조직 상태를 Trichrome 염색하여 콜라겐 분률을 확인한 결과이다. H는 일반식이의 정상군, D는 고염식이-좌측콩팥절제-엘라스타아제 뇌조주입을 시행한 뇌동맥류 유발군, ION는 뇌동맥류 유발과 동시 산화철 나노입자 단독투여군, MEL은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴 단독투여군, MeLioN은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군이다. ###은 정상군 대비 대조군의 콜라겐 분률이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.001이고, ***은 대조군 대비 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군의 콜라겐 분률이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001이다. ns는 통계적으로 무의미한 변화를 의미한다.
도 6은 동물모델을 이용하여 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자의 투여에 따른 뇌혈관 조직을 염색하여 평활근 세포(Smooth Muscle Cells) 분률을 확인한 결과이다. H는 일반식이의 정상군, D는 고염식이-좌측콩팥절제-엘라스타아제 뇌조주입을 시행한 뇌동맥류 유발군, ION는 뇌동맥류 유발과 동시 산화철 나노입자 단독투여군, MEL은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴 단독투여군, MeLioN은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군이다.
도 7은 본 발명의 멜리틴(MEL) 및 멜리틴이 탑재된 자성나노입자(MeLioN)의 투여에 따른 대동맥 벽에서 MMP-9의 발현량 억제 효과를 확인한 것으로, 면역화학염색(immunohistochemistry)(A) 및 이의 통계적 그래프(B), 실시간 중합연쇄반응(real time PCR)(C) 및 웨스턴 블랏(D) 결과를 나타낸 것이다. H는 일반식이의 정상군, D는 고염식이-좌측콩팥절제-엘라스타아제 뇌조주입을 시행한 뇌동맥류 유발군, ION는 뇌동맥류 유발과 동시 산화철 나노입자 단독투여군, MEL은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴 단독투여군, MeLioN은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군이다. 1, 0등급(분포 발견되지 않음); 1, 1등급(동맥 둘레의 절반 이하 분포); 2, 2등급(동맥 둘레의 절반 이상 분포가 있을 때). #은 정상군 대비 뇌동맥류 유발군의 MMP-9의 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05이고, *은 뇌동맥류 유발군 대비 멜리틴이 탑재된 산화철 자성나노입자 투여군의 MMP-9의 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 8은 본 발명의 멜리틴(MEL) 및 멜리틴이 탑재된 자성나노입자(MeLioN)의 투여에 따른 대동맥 벽에서 MCP-1 및 대식세포(CD68)의 발현량 억제 효과를 확인한 것으로, MCP-1(A)의 면역화학염색(immunohistochemistry) 및 이의 통계적 그래프(C), 대식세포(CD68)(B)의 면역화학염색(immunohistochemistry) 및 이의 통계적 그래프(D), MCP-1 유전자의 실시간 중합연쇄반응(real time PCR)(E) 및 MCP-1 단백질의 웨스턴 블랏(F) 결과를 나타낸 것이다. H는 일반식이의 정상군, D는 고염식이-좌측콩팥절제-엘라스타아제 뇌조주입을 시행한 뇌동맥류 유발군, ION는 뇌동맥류 유발과 동시 산화철 나노입자 단독투여군, MEL은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴 단독투여군, MeLioN은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군이다. 1, 0등급(분포 발견되지 않음); 1, 1등급(동맥 둘레의 절반 이하 분포); 2, 2등급(동맥 둘레의 절반 이상 분포가 있을 때). #은 정상군 대비 뇌동맥류 유발군의 MCP-1의 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05이고, *은 뇌동맥류 유발군 대비 멜리틴이 탑재된 산화철 자성나노입자 투여군의 MCP-1의 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 9는 본 발명의 멜리틴(MEL) 및 멜리틴이 탑재된 자성나노입자(MeLioN)의 투여에 따른 대동맥 벽에서 TNF-α의 발현량 억제 효과를 확인한 것으로, TNF-α(A)의 면역화학염색(immunohistochemistry) 및 이의 통계적 그래프(B); TNF-α(C) 및 NFκB(D) 유전자의 실시간 중합연쇄반응(real time PCR); TNF-α 및 NFκB 단백질의 웨스턴 블랏(E) 결과를 나타낸 것이다. H는 일반식이의 정상군, D는 고염식이-좌측콩팥절제-엘라스타아제 뇌조주입을 시행한 뇌동맥류 유발군, ION는 뇌동맥류 유발과 동시 산화철 나노입자 단독투여군, MEL은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴 단독투여군, MeLioN은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군이다. 1, 0등급(분포 발견되지 않음); 1, 1등급(동맥 둘레의 절반 이하 분포); 2, 2등급(동맥 둘레의 절반 이상 분포가 있을 때). #은 정상군 대비 뇌동맥류 유발군의 TNF-α 및 NFκB의 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05이고, *은 뇌동맥류 유발군 대비 멜리틴이 탑재된 산화철 자성나노입자 투여군의 MCP-1의 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 9는 TNF-α의 염색을 이용한 뇌동맥류의 조직학적 분석(A), 통계적 그래프(B), TNF-α 및 NFkB의 정량 실시간 PCR(C, D) 및 TNF-α 및 NFkB의 웨스턴 블랏 분석(D) 결과를 나타낸 것이다. H는 일반식이의 정상군, D는 고염식이-좌측콩팥절제-엘라스타아제 뇌조주입을 시행한 뇌동맥류 유발군, ION는 뇌동맥류 유발과 동시 산화철 나노입자 단독투여군, MEL은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴 단독투여군, MeLioN은 뇌동맥류 유발과 동시 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군이다. 1, 0등급(분포 발견되지 않음); 1, 1등급(동맥 둘레의 절반 이하 분포); 2, 2등급(동맥 둘레의 절반 이상 분포가 있을 때). #은 정상군 대비 뇌동맥류 유발군의 TNF-α 또는 NFkB의 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05이고, *은 뇌동맥류 유발군 대비 멜리틴 단독 투여군 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성나노입자 투여군의 TNF-α 및 NFkB의 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 10은 RAW263.7의 대식세포에 대한, MEL 및 MeLioN의 세포독성을 확인한 MTT 어세이 결과이다. *, ***은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 세포 생존률이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05이고, ***은 p<0.001이다.
본 발명은 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 뇌혈관 질환은 뇌동맥류, 뇌동맥류에 의한 뇌출혈, 뇌내출혈, 지주막하 출혈 및 뇌경색 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 멜리틴은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 서열번호 1의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 삽입되고, 뇌혈관 질환을 예방 또는 치료할 수 있으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 멜리틴으로부터 유도된 것이라면, 얼마든지 사용할 수 있다.
상기 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자는
(1) 1:1~3의 몰비로 혼합된 염화제일철(ferrous chloride) 및 염화제이철(ferric chloride)을 L-아르기닌 용액에 첨가한 후, 70~90℃에서 800~1200rpm으로 회전하면서 수산화암모늄 용액을 1시간 동안 서서히 첨가하여 침전시킨 상자성 산화철 나노입자를 제조하는 단계; 및
(2) 상기 단계 (1)에서 제조한 상자성 산화철 나노입자의 표면에 멜리틴을 결합시키는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자는 염증반응을 매개하는 MMP-9, MCP-1, CD68, TNF-α 및 NFκB 중에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 환제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량의 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합 양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합체 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 조성물을 건강 음료로 사용할 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 텍스트린, 사이클로텐스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마린, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린 또는 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100g당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g이다. 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물은 100중량부 당 0.01~0.1중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 멜리틴이 탑재된 철 나노입자의 합성
(1) 봉독으로부터 멜리틴의 분리 정제
본 발명에서 사용한 멜리틴은 하기와 같은 서열로 이루어진 것이다.
[서열번호 1]
COOH-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2
건조된 1g의 벌독을 100㎖의 증류수에 녹인 후, 0.45㎛(Sartosius, USA) 주사기 필터를 이용하여 여과하였다. 이후, 30kDa 및 10kDa 한외 여과막으로 연속적으로 통과시켜 포스포리파아제 A2를 제거하고, 봉독으로부터 멜리틴을 분리정제하였다.
(2) 멜리틴 용액 제조
25℃에서, 5mg의 멜리틴 분말을 1.0㎖의 PBS(pH 7.4)에 첨가하여 5.0mg/㎖의 멜리틴 용액을 제조하였다. 상기 5.0mg/㎖ 멜리틴 용액으로부터, 0.125mg/㎖의 멜리틴 용액을 제조하여 멜리틴 단독 치료군에 사용하였다.
또한, 산화철 나노입자의 표면에 탑재하기 위한 0.36mM(=1.0mg/㎖) 멜리틴 용액을 준비하였고, 상기 멜리틴 용액은 4℃에서 8주 동안 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다.
(3) 멜리틴을 탑재한 L-아르기닌이 코팅된 자성 나노입자의 합성
염화제일철(Ferrous chloride, FeCl2·4H2O) 및 염화제이철(Ferric chloride; FeCl3·6H2O)을 1:2의 몰비로 혼합하고, 탈기된 초순수의 0.07%(w/v) L-아르기닌 용액 20㎖에 용해시켰다. 이후, 80℃에서 1000rpm으로 격렬하게 교반하면서 25%(w/v) NH4OH 7㎖을 1시간 동안 서서히 첨가하여 완전히 침전시켰다. 상기 반응 후, 자석을 이용하여 물과 에탄올로 아르기닌이 코팅된 나노입자를 3번 세척하고, 60℃에서 24시간 동안 오븐에서 건조시켰다.
상기 상자성 산화철 나노입자 표면에 2.5mg/kg의 멜리틴을 탑재하였다. 0.5㎖의 0.36mM 멜리틴 용액 및 0.5㎖의 2.5mg/㎖ 자성 나노입자 현탁액을 4㎖의 원심 분리 튜브에 첨가하였다. 상기 혼합물을 4℃에서 48시간 동안 연속적으로 교반하여 멜리틴을 자성 나노입자에 탑재하였다.
멜리틴이 탑재가 완료된 후, 시료를 10분 동안 방치한 후 원심분리(150g, 10 분)하여 상등액 및 펠렛(침전)을 분리하였다. 상등액에 있는 결합되지 않은 멜리틴을 조심스럽게 제거하고, 탑재의 효율성을 측정하기 위해 다른 용기에 보관하였다. 이후, 연질 펠렛을 3회 세척하고 1㎖의 PBS(pH 7.4)에 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 재분산시켰다(도 1).
실시예 2. 뇌동맥류 유도 동물모델 구축
본 발명의 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자의 효능을 확인하기 위하여, 뇌동맥류 유도 동물모델을 제작하였다. 실험동물은 8주령의 C57BL/6J 수컷 마우스를 샘타코(주)에서 구입하였으며, 약 1주 동안 순화시킨 후, 건강한 동물을 무작위로 폴리카보네이트 용기(Polycarbonate cage)에 각 시험구당 배치하여 실험하였다. 사육 환경조건은 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 조명시간은 12시간, 조도 150~300 lux를 유지하였으며 사료와 음수를 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다. 고염식이, 신장 적출(nephrectomy) 및 안지오텐신 II(angiotensin II)의 피하 펌프 주입으로 고혈압을 유도하였다.
상세하게는 수컷 C57BL/6J 마우스를 이소플루란 가스로 마취시킨 후, 수술을 통해 왼쪽 신장을 제거하고 일주일 후, 마우스를 노즈콘에 고정시켜 이소플루란 가스로 흡입 마취시키고 정위 장치에 고정시켰다. 10㎕의 해밀턴 주사기를 사용하여 오른쪽 뇌조로 1.0U 엘라스타아제 용액 10㎕를 주입함으로써 뇌동맥류를 유도하였다. 엘라스타아제의 주입은 이소플로란 흡입 마취하에 뇌정위기구 유도로 오른쪽 두개골의 구멍을 통해 1.0U 엘라스타아제를 우측 기저 뇌척수액 공간에 브레그마(정수리점) 후방 2.5mm, 정중앙 선에서 오른쪽으로 1.0mm 지점에서 주사기를 진입시키고, 두개골 표면에서 5.0mm 깊이로 주입하였다.
이후, 안지오텐신 II를 지속적으로 주입하기 위하여 삼투 펌프를 피하 삽입(1000ng/kg/min)하였고, 고 나트륨(8% NaCl, Enbigo) 식이를 14일 동안 실시하여 뇌동맥류를 유도하였다(도 2).
실험동물군은 정상군(H), 뇌동맥류 유도군(D), 산화철 나노입자 투여군(ION), 멜리틴 투여군(MEL) 및 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 투여군(MeLioN)으로 나누어 실시하였다.
멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자(MeLioN) 투여군은 뇌동맥류 유도 직후부터 3일마다 5회 용량으로 2.5mg/kg의 MeLioN을 꼬리정맥을 통해 주사하였고, 멜리틴 투여군(MEL)은 1.0mg/kg의 멜리틴 펩티드를 꼬리 정맥을 통해 주사하였으며, 산화철 나노입자 투여군(ION)은 1.25mg/㎖의 산화철 나노입자 현탁액을 5회 꼬리정맥을 통해 주사하였다. 모든 실험군에 0.1㎖의 약물을 투여하였고, 도 2에 개시한 바와 같이 4주일째에 뇌를 적출하여, 하기 실시예 3~5의 분석에서 시료로 사용하였다.
실시예 3. 본 발명의 멜리틴 및 멜리틴이 탑재된 자성나노입자의 투여에 따른 뇌동맥 조직 분석
상기 실시예 2에서 구축한 동물모델을 이용하여 뇌동맥 조직 분석을 실시하기 위하여, 기본적인 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색, 엘라스틴 함량 분석을 위한 Verhoff van Gieson 염색, 콜라겐 함량 분석을 위한 Trichrome 염색, 평활근 세포 염색을 실시하였다.
4㎖의 PBS와 4%의 파라포름알데히드(PFA) 4㎖을 심장 관류하여 마우스를 희생시켰다. 고정제를 관류시킨 후, 10% 젤라틴/PBS 용액에 용해된 브로모페놀 블루 염료를 좌심실을 통해 즉시 관류하였다. 마우스 뇌조직을 적출하고 추가적인 조직 병리검사를 위해 24시간 동안 냉장고에서 4% PFA에 침지(immersion)시켰다. 마우스 뇌를 윌리스환 뇌동맥의 위치에 기초하여 5개의 평면으로 분할되었다. 병리 조직학적 시각화 및 검사를 위한 마우스 뇌 절편을 제작하였다.
(1) 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
뇌동맥 조직을 H&E 염색하여 세포핵, 세포질 및 세포외 매트릭스를 가시화시킴으로써 뇌동맥의 구조 및 형태 변화를 분석하였다. 뇌동맥 벽의 변화를 관찰하기 위해, 면역조직화학 현미경 영상을 스캔하고 Case Viewer 소프트웨어를 사용하여 직경과 두께를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 뇌동맥의 직경은 정상군 대비 뇌동맥 유도군의 뇌동맥 직경이 통계적으로 유의미하게 증가하였고, 뇌동맥 두께가 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 뇌동맥 유발군 대비 멜리틴이 탑재된 자성나노입자(MeLioN) 투여군의 뇌동맥 직경은 통계적으로 유의미하게 감소하였고, 두께는 통계적으로 유의미하게 증가하였다.
(2) Verhoff van Gieson 염색
Verhoff van Gieson 염색기법으로, 엘라스틴 함량을 분석하였다.
그 결과 도 4에 개시한 바와 같이, 정상군의 엘라스틴 함량은 37.6±8.8 %로 확인되었으며, 이에 대비하여 뇌동맥류 유도군의 5.9±3.7%로 나타나 통계적으로 유의미하게 감소한 것으로 확인하였다(p<0.001). 또한, 뇌동맥류 유도군 대비 산화철 나노입자 단독치료군 및 멜리틴 단독치료군의 엘라스틴 함량은 8.9±3.1 % 및 19.7±7.8%로 나타나 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았으나, 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 치료군의 엘라스틴 함량은 34.9±6.2%로 나타나 뇌동맥류 유도군과 통계적으로 유의미한 차이를 보였다.
(3) Trichrome 염색
Trichrome 염색기법으로, 뇌동맥 벽의 비정상적인 콜라겐 함량을 분석하기 위하여, 뇌 부분의 조직 병리학적 슬라이드와 뇌하부에 위치한 뇌동맥을 확인하고, Case Viewer 소프트웨어로 처리하였다.
그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이, 정상군의 콜라겐 함량은 8.7±3.8%로 5개 군에서 가장 낮은 값을 보였으며, 이에 대비되는 뇌동맥류 유도군은 32.0±5.5%로 통계적으로 유의미하게 증가하였다(p<0.001).
뇌동맥류 유도군에 대비한 산화철 나노입자 단독치료군 및 멜리틴 단독 치료군의 콜라겐 함량은 통계적으로 무의미한 차이를 보였으나, 본 발명의 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자 처리군의 콜라겐 함량은 12.6±5.1%로 나타나, 뇌동맥류 유도군에 대비하여 통계적으로 유의미하게 감소한 것을 확인하였다.
(4) 평활근 세포 분율 분석
평활근 분률은 정상군(H) 70.0±9.5%, 뇌동맥류 유도군(D) 52.5±8.8%, 멜리틴 단독 투여군(MEL) 56.9±10.8%, 산화철 나노입자 처리군 ION (42.9±7.9%), MeLioN (63.0±8.4%)로 측정되었다. 따라서 본 발명의 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 투여할 경우, 평활근의 함량을 증가시키는 효과가 있다는 것을 확인하였다.
실시예 4. 본 발명의 멜리틴(MEL) 및 멜리틴이 탑재된 자성나노입자(MeLioN)의 투여에 따른 대동맥 벽에서 MMP-9의 발현량 억제 효과 확인
상기 실시예 2에서 적출한 뇌조직을 이용하여, 뇌동맥 벽에서 발현한 MMP-9의 발현량 변화를 면역화학조직(immunohistochemistry: IHC) 염색으로 확인하였고, 이에 대한 0~2등급 구간으로 나누어 통계 분석하였으며, 실시간 중합연쇄반응(real time PCR) 및 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
그 결과 도 7에 개시한 바와 같이, MEL 또는 MelioN의 투여에 의해 뇌동맥 벽에서의 MMP-9의 발현량이 억제되었다. 정상군(H)에서는 0등급(MMP-9의 발현 분포 발견되지 않음)으로 나타났으며, 이에 대비 뇌동맥류 유도군(D)에서 MMP-9의 발현된 세포의 분포가 증가하였다. 뇌동맥류 유도군 대비 본 발명의 MEL 또는 MelioN의 투여군은 2등급(동맥 둘레의 절반 이상 MMP-9의 발현 분포가 있을 때) 또는 1등급(동맥 둘레의 절반 이하 MMP-9의 발현 분포)이 감소한 것으로 나타났다.
이와 더불어 실시간 연쇄중합반응에서는 MelioN의 투여군의 MMP-9 유전자 발현량이 뇌동맥류 유도군에 대비하여 감소하였고, 웨스턴 블랏 분석 결과에서는 MEL 및 MelioN의 투여군 모두에서 뇌동맥류 유도군에 대비하여 MMP-9 단백질의 발현량이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 본 발명의 멜리틴(MEL) 및 멜리틴이 탑재된 자성나노입자(MeLioN)의 투여에 따른 대동맥 벽에서 MCP-1 및 대식세포 마커인 CD68의 발현량 억제 효과 확인
상기 실시예 2에서 적출한 뇌조직을 이용하여, 뇌동맥 벽에서 발현한 MCP-1 및 CD68의 발현량 변화를 면역화학조직(immunohistochemistry: IHC) 염색으로 확인하였고, 이에 대한 0~2등급 구간으로 나누어 통계 분석하였으며, 실시간 중합연쇄반응(real time PCR) 및 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
그 결과 도 8에 개시한 바와 같이, MEL 또는 MelioN의 투여에 의해 뇌동맥 벽에서의 MCP-1 및 CD68의 발현량이 억제되었다. 정상군(H)에서는 주로, 0등급(MCP-1 및 CD68의 발현 분포 발견되지 않음)으로 나타났으며, 이에 대비 뇌동맥류 유도군(D)에서 MCP-1 및 CD68의 발현된 세포의 분포가 증가하였다. 뇌동맥류 유도군 대비 본 발명의 MEL 또는 MelioN의 투여군은 2등급(동맥 둘레의 절반 이상 MCP-1 및 CD68의 발현 분포가 있을 때) 또는 1등급(동맥 둘레의 절반 이하 MCP-1 및 CD68의 발현 분포)이 감소한 것으로 나타났다.
이와 더불어 실시간 연쇄중합반응에서는 MelioN의 투여군의 MCP-1 유전자 발현량이 뇌동맥류 유도군에 대비하여 감소하였고, 웨스턴 블랏 분석 결과에서는 MEL 및 MelioN의 투여군 모두에서 뇌동맥류 유도군에 대비하여 MCP-1 단백질의 발현량이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 본 발명의 멜리틴(MEL) 및 멜리틴이 탑재된 자성나노입자(MeLioN)의 투여에 따른 대동맥 벽에서 TNF-α 및 NFκB의 발현량 억제 효과 확인
상기 실시예 2에서 적출한 뇌조직을 이용하여, 뇌동맥 벽에서 발현한 TNF-α의 발현량 변화를, 면역화학조직(immunohistochemistry: IHC) 염색으로 확인하였고, 이에 대한 0~2등급 구간으로 나누어 통계 분석하였으며, 실시간 중합연쇄반응(real time PCR) 및 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
그 결과 도 9에 개시한 바와 같이, MEL 또는 MelioN의 투여에 의해 뇌동맥 벽에서의 TNF-α의 발현량이 억제되었다. 정상군(H)에서는 주로, 0등급(TNF-α 및 NFκB의 발현 분포 발견되지 않음)으로 나타났으며, 이에 대비 뇌동맥류 유도군(D)에서 TNF-α 및 NFκB의 발현된 세포의 분포가 증가하였다. 뇌동맥류 유도군 대비 본 발명의 MEL 또는 MelioN의 투여군은 2등급(동맥 둘레의 절반 이상 TNF-α 및 NFκB의 발현 분포가 있을 때) 또는 1등급(동맥 둘레의 절반 이하 TNF-α 및 NFκB의 발현 분포)이 감소한 것으로 나타났다.
이와 더불어 실시간 연쇄중합반응에서는 MEL 또는 MelioN의 투여군의 TNF-α 및 NFκB 유전자 발현량이 뇌동맥류 유도군에 대비하여 감소하였고, 웨스턴 블랏 분석 결과에서는 MEL 및 MelioN의 투여군 모두에서 뇌동맥류 유도군에 대비하여 TNF-α 및 NFκB 단백질의 발현량이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 4~6에서 수행한 실시간 연쇄중합반응은 하기 표 1에 개시한 프라이머를 이용하였다.
실시간 연쇄중합반응(real-time PCR)을 위한 프라이머 서열
유전자 서열(5'->3') 서열번호
TNF-α F: CATCCGTTCTCTACCCAGCC 2
R: AATTCTGAGCCCGGAGTTGG 3
NF-κB F: CCTTGAAGGGATTTCCCTCC 4
R: GGAGGGAAATCCCTTCAAGG 5
MCP-1 F: TGATCCCAATGAGTAGGCTGGAG 6
R: ATGTCTGGACCCATTCCTTCTTG 7
MMP-9 F: GCCACTACTGTGCCTTTGAGTC 8
R: CCCTCAGAGAATCGCCAGTACT 9
GAPDH F: AGTGCCAGCCTCGTCTCATA 10
R: GGTAACCAGGCGTCCGATAC 11
실시예 7. MEL 및 MeLioN의 세포독성 확인
RAW263.7 세포에서 MEL 및 MeLioN의 세포독성을 확인하고자 MTT 어세이를 실시하였다. 그 결과, 도 10에 개시한 바와 같이, MeLioN은 4㎍/㎖의 농도까지 세포 생존률이 아무것도 처리하지 않는 것과 유사한 수준으로 나타났으며, 이에 비해, 멜리틴 단독처리군(MEL)은 0.5㎍/㎖ 이상의 농도에서는 세포 독성으로 인해 세포 생존률이 감소한 것을 확인하였다. 따라서 멜리틴은 0.5㎍/㎖ 미만으로 처리하는 것이 바람직할 것으로 판단하였다.
[통계 분석]
통계 분석은 Medcalc 소프트웨어(버전 18.2.1)를 사용하여 수행하였다. 실험결과에 대한 통계처리는 각 실험 군별로 표준차이가 있는가를 검증하기 위해, 두 그룹 비교를 위해 스튜던트 t-검정과 분산분석을 수행하였으며, 다양성 분석은 던칸 분석(Duncan's test)에 의해 분석하였다. 통계처리 후 p값이 0.05 미만일 경우 통계적인 유의성이 있다고 판정하였다. 모든 데이터는 평균±표준 편차로 표현되었고, 스튜던트 t-검정은 평균 비교를 위해 사용되었다.
<110> DAEGU CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing, ameliorating or treating cerebrovascular diseases comprising melittin or magnetic iron oxide nanoparticle loaded with melittin as effective component <130> PN20196 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Apis mellifera <400> 1 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFaF <400> 2 catccgttct ctacccagcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFaR <400> 3 aattctgagc ccggagttgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFkBF <400> 4 ccttgaaggg atttccctcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFkBR <400> 5 ggagggaaat cccttcaagg 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP1F <400> 6 tgatcccaat gagtaggctg gag 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP1R <400> 7 atgtctggac ccattccttc ttg 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9F <400> 8 gccactactg tgcctttgag tc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9R <400> 9 ccctcagaga atcgccagta ct 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDHF <400> 10 agtgccagcc tcgtctcata 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDHR <400> 11 ggtaaccagg cgtccgatac 20

Claims (8)

  1. 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌동맥류, 뇌동맥류에 의한 뇌출혈, 뇌내출혈, 지주막하 출혈 및 뇌경색 중에서 선택된 어느 하나의 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 멜리틴은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 뇌동맥류, 뇌동맥류에 의한 뇌출혈, 뇌내출혈, 지주막하 출혈 및 뇌경색 중에서 선택된 어느 하나의 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자는
    (1) 1:1~3의 몰비로 혼합된 염화제일철(ferrous chloride) 및 염화제이철(ferric chloride)을 L-아르기닌 용액에 첨가한 후, 교반하면서 수산화암모늄 용액을 1시간 동안 서서히 첨가하여 침전시킨 상자성 산화철 나노입자를 제조하는 단계; 및
    (2) 상기 단계 (1)에서 제조한 상자성 산화철 나노입자의 표면에 멜리틴을 결합시키는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 뇌동맥류, 뇌동맥류에 의한 뇌출혈, 뇌내출혈, 지주막하 출혈 및 뇌경색 중에서 선택된 어느 하나의 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자는 염증반응을 매개하는 MMP-9, MCP-1, CD68, TNF-α 및 NFκB 중에서 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 뇌동맥류, 뇌동맥류에 의한 뇌출혈, 뇌내출혈, 지주막하 출혈 및 뇌경색 중에서 선택된 어느 하나의 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함는 것을 특징으로 하는 뇌동맥류, 뇌동맥류에 의한 뇌출혈, 뇌내출혈, 지주막하 출혈 및 뇌경색 중에서 선택된 어느 하나의 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 멜리틴 또는 멜리틴이 탑재된 산화철 자성 나노입자를 유효성분으로 함유하는 뇌동맥류, 뇌동맥류에 의한 뇌출혈, 뇌내출혈, 지주막하 출혈 및 뇌경색 중에서 선택된 어느 하나의 뇌혈관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 뇌동맥류, 뇌동맥류에 의한 뇌출혈, 뇌내출혈, 지주막하 출혈 및 뇌경색 중에서 선택된 어느 하나의 뇌혈관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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KR20200116054A (ko) * 2019-03-28 2020-10-08 이니스트에스티 주식회사 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물

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