KR20200092412A - 열안정성이 향상된 케토스 3－에피머라제 - Google Patents

열안정성이 향상된 케토스 3－에피머라제 Download PDF

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Abstract

아스로박터 글로비포미스 유래의 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 중 특정의 아미노산을 치환함으로써, 열안정성이 향상된 변이 효소가 얻어지는 것을 알아내어, 효율적으로 D－프시코스를 생산할 수 있는 것을 알아냈다.

Description

열안정성이 향상된 케토스 3－에피머라제
본 발명은 열안정성이 향상된 신규한 케토스 3－에피머라제 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
D－프시코스는 자연계에 미량으로밖에 존재하지 않는 희소당의 일종으로서 알려져 있고, 그 감미도는 설탕의 약 70%이기 때문에 감미료로서 이용되고 있다. D－프시코스는 칼로리치가 거의 0에 가까워, 혈당치 상승 억제 등 각종 생리 기능을 가지는 것도 알려져 있어, 기능성을 가진 식품 소재로서 주목되고 있다. 이 때문에 식품 산업에 있어서 D－프시코스의 효율적이고 안전한 생산 방법에 대한 필요성이 높아지고 있다.
한편, D－프시코스는 D－프럭토스의 에피머이기 때문에, D－프럭토스에 대해 D－프시코스 3－에피머라제를 작용시키는 생산 방법이 확립되어 있다. 예를 들면, 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis) M30 유래(특허문헌 1)의 케토스 3－에피머라제나 아그로박테리움 투메파시엔스 유래(특허문헌 2)의 D－프시코스 3－에피머라제가 개시되어 있다. 또 생산 효율을 유지하기 위해 온도에 의한 효소의 변성을 억제하여, 열안정성이 향상된 아그로박테리움 투메파시엔스 유래의 사이코스(프시코스) 에피머화 효소 변이체(특허문헌 3)나 버크홀데리아 유래 D－프시코스 3－에피머라제 변이체(특허문헌 4)가 D－프시코스의 생산에 이용되고 있다.
국제공개 2014/109254호 공보 일본국 특허공표 2008－541753호 공보 일본국 특허공표 2016－518135호 공보 CNA106350498호 공보
상술한 바와 같이, D－프시코스 3－에피머라제 등의 효소를 작용시키는 것에 의한 D－프시코스의 생산 방법에 대해 여러 가지 궁리가 이루어지고 있지만, 아스로박터 글로비포미스와 같은 식품의 안전성이 인정된 균종에 유래하는 D－프시코스의 생산 효소로서, 열안정성이 향상된 효소를 제조하는 방법은 아직도 확립되어 있지 않았다. 또 아스로박터 글로비포미스 유래의 케토스 3－에피머라제의 최적 온도는 마그네슘(Mg2+)이 존재하는 조건하에서는 60~80℃이지만, 반응 온도가 50℃를 초과한 상태에서 장시간 반응을 행하면 효소 활성이 서서히 저하하여, D－프시코스의 생산이 감소한다고 하는 과제가 있었다.
본 발명자들은 효소를 작용시켜 D－프시코스를 생산하는 방법에 대해 여러 가지 검토한 바, 아스로박터 글로비포미스 유래의 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 중 특정의 아미노산을 치환함으로써, 열안정성이 향상된 변이 효소가 얻어지는 것을 알아내어, 효율적으로 D－프시코스를 생산할 수 있는 것을 알아냈다. 보다 구체적으로는, 배열 번호 1로 표시되는 아스로박터 글로비포미스 유래의 야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내에 적어도 하나의 아미노산 변이를 가지고, (1) 50℃에 있어서의 효소 활성(T50)에 대한 70℃에 있어서의 효소 활성(T70)의 비： T70/T50, 혹은 (2) 미처리의 효소의 50℃에 있어서의 활성을 100으로 한 경우의, 50mM 인산 버퍼(pH8.0, 2mM 황산마그네슘을 포함한다) 현탁액에서 60℃, 1시간 처리한 동일 효소의 50℃에 있어서의 잔존 효소 활성： A가 야생형 케토스 3－에피머라제의 T70/T50 혹은 A보다 높은 값을 나타내는 케토스 3－에피머라제 변이체가 얻어지는 것을 알아냈다.
즉, 본 발명은 상기 지견(知見)에 기초하여 완성된 것이고, 이하의 (1)~(9)로 구성되는 것이다.
＜1＞ 배열 번호 1로 표시되는 아스로박터 글로비포미스 유래의 야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내에 적어도 하나의 아미노산 변이를 가지고, (1) 50℃에 있어서의 효소 활성(T50)에 대한 70℃에 있어서의 효소 활성(T70)의 비： T70/T50, 혹은 (2) 미처리의 효소의 50℃에 있어서의 활성을 100으로 한 경우의, 50mM 인산 버퍼(pH8.0, 2mM 황산마그네슘을 포함한다) 현탁액에서 60℃, 1시간 처리한 동일 효소의 50℃에 있어서의 잔존 효소 활성： A가, 야생형 케토스 3－에피머라제의 T70/T50 혹은 A보다 높은 값을 나타내는 케토스 3－에피머라제 변이체.
＜2＞ T70/T50이 1.0 이상인 상기 ＜1＞ 기재의 케토스 3－에피머라제 변이체.
＜3＞ 잔존 효소 활성： A가 40 이상인 상기 ＜1＞ 또는 ＜2＞ 기재의 케토스 3－에피머라제 변이체.
＜4＞ 야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내의 적어도 하나의 아미노산 변이가 1~10개의 위치에 있어서의 아미노산 치환인 상기 ＜1＞~＜3＞의 어느 하나에 기재된 케토스 3－에피머라제 변이체.
＜5＞ 야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내의 적어도 하나의 아미노산 변이가, 배열 번호 1의 아미노산 배열의 아미노 말단으로부터 세어 하기의 위치：
6, 14, 22, 26, 34, 67, 68, 69, 70, 75, 91, 95, 100, 101, 110, 122, 137, 144, 160, 173, 177, 181, 200, 203, 214, 222, 226, 237, 261, 270, 271, 275, 278, 281 및 289
의 어느 것인가에 존재하는 상기 ＜1＞ 기재의 케토스 3－에피머라제 변이체.
＜6＞ 케토스 3－에피머라제 변이체가, 배열 번호 1의 아미노산 배열의 아미노 말단으로부터 세어 하기의 위치에 변이를 가지는 변이체로부터 선택되는 케토스 3－에피머라제 변이체.
Figure pct00001
＜7＞ 케토스 3－에피머라제 변이체가 하기 변이체로부터 더 선택되는 상기 ＜6＞ 기재의 케토스 3－에피머라제 변이체.
Figure pct00002
＜8＞ 케토스 3－에피머라제 변이체가 하기 변이체로부터 더 선택되는 상기 ＜6＞ 기재의 케토스 3－에피머라제 변이체.
Figure pct00003
＜9＞ 고정화 담체에 고정화한 상기 ＜1＞~＜8＞의 어느 하나에 기재된 케토스 3－에피머라제 변이체.
＜10＞ D－프럭토스에 대해, 상기 ＜1＞~＜8＞의 어느 하나에 기재된 케토스 3－에피머라제 변이체 또는 ＜9＞ 기재의 고정화된 케토스 3－에피머라제 변이체를 작용시키는 것을 특징으로 하는 D－프시코스의 제조 방법.
본 발명은 야생형과 비교하여 열안정성이 향상된, 식품의 안전성이 인정된 아스로박터 글로비포미스에 유래하는 D－프시코스의 생산 효소인 케토스 3－에피머라제 변이체를 제공할 수가 있다.
본 발명의 열안정성이 향상된 아스로박터 글로비포미스 유래의 케토스 3－에피머라제 효소 변이체는, 50℃보다 높은 온도에서 효소 활성을 비교적 장시간 유지할 수가 있기 때문에, 이것을 기질의 D－프럭토스에 작용시킴으로써, 종래의 아스로박터 글로비포미스 유래의 케토스 3－에피머라제(야생형)와 비교하여, D－프시코스를 효율적으로 생산할 수가 있다.
도 1은 반응탑의 운전 개시로부터 42일째에 있어서의 각 고정화 효소의 잔존 활성을 나타낸다.
(아스로박터 글로비포미스)
본 발명에서 이용하는 케토스 3－에피머라제의 야생형 효소는 아스로박터 글로비포미스에 유래하는 것이다. 식품 산업에서는 본 세균의 안전성은 확인되어 있다. 미국에 있어서는 FDA의 EAFUS(Everything Added to Food in the United States): A Food Additive Database에“Glucose isomerase from immobilized arthrobacter globiformis”로서 수록되어 있다. 이 사용법은 균체를 그대로 고정화하는 것이고, 균체 자체의 안전성이 매우 높은 것을 증명하는 것이다.
또 유럽에 있어서는 EFFCA(The European food & feed cultures as sociation)와 IFD(International Federation for the Roofing Trade)에 의한 “Inventory of Microorganisms with a documented history of use in food”에 있어서“Citrus fermentation to remove limonin and reduce bitterness”로서 사용되고 있는 취지가 기재되어 있다. 이것은 효모 등과 마찬가지로 이 균종이 발효에 사용되고 있는 것을 나타내는 것이고, 이 균종이 극히 안전성이 높은 것을 나타내고 있다.
일본에 있어서는 아스로박터속은 “α－아밀라제, 이소말토덱스트라제” 등의 효소 기원 미생물로서 식품 첨가물 리스트에 수록되어 있다.
이와 같이 일·미·유럽에 있어서 오랜 사용 실적이 있어, 아스로박터속은 안전성이 높은 균종이라고 할 수 있다.
(케토스 3－에피머라제)
(1) 본 발명에서 사용하는 야생형의 케토스 3－에피머라제는 아스로박터 글로비포미스 유래의 것이다. 바람직하게는 아스로박터 글로비포미스 M30(기탁 번호 NITE BP－1111) 유래의 것이고, 하기 아미노산 배열(배열 번호 1)을 가진다.
또, 본 발명의 야생형 케토스 3－에피머라제는 바람직하게는 하기 (A), (B)의 기질 특이성을 가지고, 또한 하기 (a)~(f)의 이화학적 성질을 가지는 케토스 3－에피머라제이다.
(배열 번호 1)
1 MKIGCHGLVW TGHFDAEGIR YSVQKTREAG FDLVEFPLMD PFSFDVQTAK
51 SALAEHGLAA SASLGLSDAT DVSSEDPAVV KAGEELLNRA VDVLAELGAT
101 DFCGVIYSAM KKYMEPATAA GLANSKAAVG RVADRASDLG INVSLEVVNR
151 YETNVLNTGR QALAYLEELN RPNLGIHLDT YHMNIEESDM FSPILDTAEA
201 LRYVHIGESH RGYLGTGSVD FDTFFKALGR IGYDGPVVFE SFSSSVVAPD
251 LSRMLGIWRN LWADNEELGA HANAFIRDKL TAIKTIELH
야생형 케토스 3－에피머라제의 기질 특이성：
(A) D－ 또는 L－케토스의 3번 위치를 에피머화하여 대응하는 D－ 또는 L－케토스를 생성한다.
(B) D－ 또는 L－케토스 중에서는 D－프럭토스 및 D－프시코스에 대한 기질 특이성이 가장 높다.
야생형 케토스 3－에피머라제의 이화학적 성질：
(a) 분자량
SDS­PAGE에 의한 서브유닛(subunit)의 분자량이 약 32kDa이고, 겔여과법에 의한 분자량이 120kDa인, 서브유닛의 분자량이 32kDa인 호모테트라머 구조이다.
(b) 최적 pH
30℃, 30분간 반응, 20mM의 마그네슘(Mg2 +) 존재하의 조건에서 6 내지 11.
(c) 최적 온도
pH7.5, 30분간 반응, 20mM의 마그네슘(Mg2 +) 존재하의 조건에서 60 내지 80℃.
(d) pH 안정성
4℃, 24시간 유지의 조건하에서, 적어도 pH5 내지 11의 범위에서 안정.
(e) 열안정성
pH7.5, 1시간 유지, 4mM의 마그네슘 이온(Mg2 +) 존재하의 조건에서, 약 50℃ 이하에서 안정. 마그네슘 이온(Mg2 +) 비존재하의 조건에서, 약 40℃ 이하에서 안정.
(f) 금속 이온에 의한 활성화
2가 망간 이온(Mn2 +), 2가 코발트 이온(Co2 +), 칼슘(Ca2 +) 및 마그네슘 이온(Mg2+)에 의해 활성화된다.
(케토스 3－에피머라제 변이체)
본 발명의 케토스 3－에피머라제 변이체는, 배열 번호 1로 표시되는 아스로박터 글로비포미스 유래의 야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내에 적어도 하나의 아미노산 변이를 가지고, (1) 50℃에 있어서의 효소 활성(T50)에 대한 70℃에 있어서의 효소 활성(T70)의 비： T70/T50, 혹은 (2) 미처리의 효소의 50℃에 있어서의 활성을 100으로 한 경우의, 50mM 인산 버퍼(pH8.0, 2mM 황산마그네슘을 포함한다) 현탁액에서 60℃, 1시간 처리한 동일 효소의 50℃에 있어서의 잔존 효소 활성： A가 야생형 케토스 3－에피머라제의 T70/T50 혹은 A보다 높은 값을 나타내는 변이체이다.
본 발명의 변이형의 케토스 3－에피머라제는, 야생형의 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열을 기초로 일부의 아미노산 배열을 특정의 아미노산 배열로 치환함으로써 얻어진 것이다.
표 1에 나타내는 여러 가지 위치의 아미노산을 치환함으로써 효소 변이체를 얻어, 각 변이체에 대해 열안정성이 실제로 향상되었는지 아닌지를 시험하였다.
그 결과 배열 번호 1로 표시되는 아스로박터 글로비포미스 유래의 야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내에 적어도 하나의 아미노산 변이를 가지고, (1) 50℃에 있어서의 효소 활성(T50)에 대한 70℃에 있어서의 효소 활성(T70)의 비： T70/T50이 야생형 케토스 3－에피머라제의 T70/T50보다 높은 값을 나타내거나, 혹은 (2) 미처리 효소의 50℃에 있어서의 활성을 100으로 한 경우의, 50mM 인산 버퍼(pH8.0, 2mM 황산마그네슘을 포함한다) 현탁액에서 60℃, 1시간 처리한 동일 효소의 50℃에 있어서의 잔존 효소 활성： A가, 야생형 케토스 3－에피머라제의 A보다 높은 값을 나타내는 변이체를 얻을 수 있었다.
(1) 50℃에 있어서의 효소 활성(T50)에 대한 70℃에 있어서의 효소 활성(T70)의 비： T70/T50은 예를 들면, D－프시코스(2mM의 Mg2SO4를 함유하는 50mM 인산 버퍼(pH8.0) 용액)를 기질로 하여 케토스 3－에피머라제를 50℃ 또는 70℃에서 10분간 반응시켜, 반응 생성물인 D－프럭토스를 측정함으로써 에피머라제 활성을 구할 수가 있다. 보다 구체적으로는 반응 정지 후, 반응액을 HPLC에 제공하여, 50℃ 및 70℃의 기질인 D－프시코스와 반응 생성물인 D－프럭토스의 피크 면적비로부터 효소 활성을 산출할 수가 있다.
이와 같이 하여 산출된 상기 변이형 케토스 3－에피머라제의 T70/T50이 바람직하게는 0.70 이상이고, 보다 바람직하게는 0.80 이상이고, 더 바람직하게는 1.0 이상이고, 보다 더 바람직하게는 1.5 이상이다.
(2) 미처리 효소의 50℃에 있어서의 활성을 100으로 한 경우의, 50mM 인산 버퍼(pH8.0, 2mM 황산마그네슘을 포함한다) 현탁액에서 60℃, 1시간 처리한 동일 효소의 50℃에 있어서의 잔존 효소 활성： A는 예를 들면, 효소를 50mM 인산 버퍼(pH8.0, 2mM 황산마그네슘을 포함한다) 현탁액으로 하여 60℃에서 1시간 처리하고, 그 후 D－프시코스를 기질로 하여 50℃에서 10분간 반응시키고, 그 에피머라제 활성을 측정하여 구할 수가 있다. 보다 구체적으로는 반응 정지 후, 반응액을 HPLC에 제공하여, 기질인 D－프시코스와 반응 생성물인 D－프럭토스의 피크 면적비로부터, 미처리 효소와 60℃ 1시간 처리 효소의 효소 활성을 산출할 수가 있다.
바람직하게는 상기 변이형 케토스 3－에피머라제의 잔존 효소 활성： A는, 배열 번호 1의 야생형 케토스 3－에피머라제의 효소 활성을 100으로 한 경우에 40 이상이고, 보다 바람직하게는 50 이상이고, 더 바람직하게는 60 이상이고, 보다 더 바람직하게는 70 이상이다.
배열 번호 1로 표시되는 아스로박터 글로비포미스 유래의 야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내의 적어도 하나의 아미노산 변이는, 상기 활성을 나타내는 한 적어도 하나의 변이이면 좋지만, 또한 1~10개의 위치에 있어서의 아미노산의 치환인 것이 바람직하고, 1~8개의 위치에 있어서의 아미노산의 치환인 것이 보다 바람직하다.
또한, 야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내의 적어도 하나의 아미노산 변이는, 배열 번호 1의 아미노산 배열의 아미노 말단으로부터 세어 하기의 위치의 어느 것인가에 존재하는 것이 바람직하다.
위치： 6, 14, 22, 26, 34, 67, 68, 69, 70, 75, 91, 95, 100, 101, 110, 122, 137, 144, 160, 173, 177, 181, 200, 203, 214, 222, 226, 237, 261, 270, 271, 275, 278, 281 및 289
또한, 야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내의 적어도 하나의 아미노산 변이는, 배열 번호 1의 아미노산 배열의 아미노 말단으로부터 세어 하기의 위치의 어느 것인가에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
위치： 6, 14, 22, 26, 34, 67, 68, 69, 70, 75, 91, 95, 100, 101, 110, 122, 137, 144, 160, 173, 177, 200, 214, 222, 237, 261, 270, 271, 275, 278, 281 및 289
각 위치에 있어서 치환에 의해 삽입되는 아미노산의 종류는 상술한 T70/T50 혹은 잔존 효소 활성： A를 만족시키는 한에 있어서 어떠한 아미노산이라도 좋다. 통상 1의 아미노산을 1의 다른 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하지만, 카복시 말단에 있어서는 1의 아미노산을 1~10의 연속하는 아미노산으로 치환해도 좋다.
케토스 3－에피머라제 변이체는 하기의 위치에 있어서 아미노산 치환을 가지는 변이체로부터 선택되는 것이 보다 바람직하다.
Figure pct00004
케토스 3－에피머라제 변이체는 하기의 위치에 있어서 아미노산 치환을 가지는 변이체로부터 선택되는 것이 보다 더 바람직하다.
Figure pct00005
보다 더 바람직하게는 야생형보다 향상된 열안정성을 나타낸 변이체는 하기에 나타내는 아미노산 치환을 가진다. 본 명세서에 있어서, 예를 들면, R160A란 배열 번호 1의 아미노 말단으로부터 160번째의 아르기닌(R)을 알라닌(A)으로 치환한 것을 나타낸다. H289VSARHKP는 배열 번호 1의 아미노 말단으로부터 289번째의 히스티딘(H)을 VSARHKP의 배열로 치환한 것을 나타낸다.
Figure pct00006
상기 변이체 중 더 바람직한 케토스 3－에피머라제 변이체로서는 PM3, PM4, PM5, PM9, PM12, PM14, PM17, PM18, PM19, PM23, PM26, PM28, PM29, PM31, PM32, PM33, PM38, PM39, PM41, PM43, PM44, PM45, PM46, PM48, PM51, PM55, PM56, PM57, PM58, PM59, PM60, PM61, PM62, PM63, PM64 및 PM65를 들 수 있다.
상기 변이체 중 보다 더 바람직한 케토스 3－에피머라제 변이체로서는 PM4, PM17, PM18, PM23, PM26, PM29, PM32, PM33, PM38, PM39, PM41, PM43, PM44, PM45, PM48, PM51, PM55, PM57, PM58, PM60, PM61, PM63 및 PM65를 들 수 있다.
상기 변이체 중 PM17, PM23, PM26, PM29, PM32, PM38, PM39, PM41, PM43, PM51, PM57, PM60, PM61 및 PM65가 특히 바람직하다.
본 발명의 케토스 3－에피머라제 변이체는 야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내의 적어도 하나의 아미노산(보다 구체적으로는 배열 번호 1의 아미노산 배열 내의 적어도 하나의 아미노산)의 어느 것인가의 위치에 있어서, 공지의 방법을 적당히 사용함으로써 치환할 수가 있다. 예를 들면, 공지의 유전자 공학적 수법에 의해 목적 위치의 아미노산 치환을 행한 변이체를 얻을 수가 있다.
또, 본 발명의 케토스 3－에피머라제 변이체는, 예를 들면 각 변이체의 아미노산 배열을 코드하는 핵산 배열을 이용하여, 혹은 케토스 3－에피머라제의 변이 도입한 DNA 단편을 끼워넣은 플라스미드 벡터를 대장균(숙주) 등에 도입하여 목적의 형질 전환체를 얻어, 제조할 수가 있다. 사용하는 재조합 벡터의 종류는 특히 제한되지 않고, 당해 기술 분야에서 통상 사용되는 벡터라도 좋다. 또 케토스 3－에피머라제를 생산하는 재조합체는 대장균, 바실루스, 효모, 또는 아그로박테리움을 이용해도 좋다.
본 발명의 케토스 3－에피머라제 변이체는 조(粗)효소 또는 정제 효소를 액상 효소로서 이용해도 좋지만, 공지의 고정화 수단, 예를 들면, 담체 결합법, 가교법, 겔포괄법 등을 이용하여 고정화 효소로서 이용해도 좋다.
담체 결합법을 이용하는 경우는 공지의 고정화 담체, 예를 들면 이온교환수지, 합성 흡착제, 활성탄, 다공성 유리, 혹은 실리카겔을 이용할 수가 있다. 고정화 담체에 이온교환수지를 이용하는 경우, 예를 들면, 페놀계 겔형 약염기성 이온교환수지 혹은 스티렌계 매크로포러스(macroporous)형 약염기성 이온교환수지를 사용할 수가 있다. 본 발명에서는 이들 이온교환수지의 시판품을 이용해도 좋고, 페놀계 겔형 약염기성 이온교환수지의 시판품으로서 듀올라이트 A561, 듀올라이트 A568, 듀올라이트 PWA7(이상 다우·듀퐁사제) 등을 들 수 있다. 또, 스티렌계 매크로포러스형 약염기성 이온교환수지의 시판품으로서 앰벌라이트 FPA95, 앰벌라이트 IRA904, 앰벌라이트 XE583(이상 다우·듀퐁사제), 퓨롤라이트 A111S, 퓨롤라이트 A103S(이상 퓨롤라이트사제), 다이아이온 WA20, 다이아이온 WA30(이상 미츠비시화학사제) 등을 들 수 있다.
본 발명의 케토스 3－에피머라제 변이체 혹은 고정화된 본 발명의 케토스 3－에피머라제 변이체를 이용하여 D－프시코스를 효율적으로 생산하는 것이 가능하다.
보다 구체적으로는 예를 들면, 고정화된 본 발명의 케토스 3－에피머라제 변이체를 이용하는 경우, 그것이 충전된 반응탑에 D－프럭토스 수용액을 연속적으로 통과시킴으로써, D－프럭토스의 일부가 D－프시코스로 변환된 D－프럭토스 및 D－프시코스의 혼합 수용액을 얻고, 그 후 공지의 방법에 의해 탈색·탈염·크로마토 분획을 함으로써 고순도의 D－프시코스 수용액을 생산할 수가 있다. 그 후 또한 공지의 방법에 의해 결정 D－프시코스를 생산할 수도 있다.
반응탑에 D－프럭토스 수용액을 통과시킬 때, D－프럭토스 수용액은 50~80℃로 가온되어 있는 것이 바람직하고, 그 농도는 30~70wt%인 것이 바람직하고, 가성 소다 등의 pH 조절제로 pH6~9으로 조정되어 있는 것이 바람직하다. 또, 반응탑에 D－프럭토스 수용액을 통과시킬 때의 유속은 D－프럭토스로부터 D－프시코스로의 변환율이 효소의 반응 평형에 가까운 20% 이상으로 되도록 조절되어 있는 것이 바람직하다. 또, 효소의 활성화제 및 안정제로서 각종의 이온, 예를 들면 10~100ppm의 마그네슘 이온이나 50~500ppm의 아황산 이온을 포함하고 있어도 좋다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명의 내용은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예)
＜케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내의 치환 부위의 선정＞
우선, 케토스 3－에피머라제의 활성 및 열안정성에 관련된 아미노산 배열을 선정하기 위해, 본 균주에 유래하는 케토스 3－에피머라제와 상동성이 높은 1차 구조(아미노산 배열)를 블래스트(Blast)에 의해 검색하였다. 그 결과 케토스 3－에피머라제와 상동성이 높은 12종류의 효소의 1차 구조 정보를 얻을 수 있었다. 본 균주에 유래하는 효소의 입체 구조는 결정되어 있지 않기 때문에 그 정보를 이용할 수가 없다. 그래서, 상기 12종류 중에서 입체 구조가 해명되어 있는 효소종을 선정하고, 스위스 모델 및 에너지 최소화 계산을 이용하여 목적 효소의 추정 입체 구조의 모델을 구축하였다. 본 모델 구조와 유사 효소의 구조를 비교함으로써, 본 효소에 있어서의 구조 안정성에 기여하는 부위를 검색·추출하여, 물리화학적으로 효소의 입체 구조를 열안정화할 수 있다고 생각되는 아미노산의 개변을 행하였다.
열안정성을 향상시키는 것이 예상되는 특정의 아미노산 배열 위치로서 표 1에 나타내는 각 위치를 선정하여, 특정의 아미노산 배열로 치환하는 것으로 하였다.
특정의 아미노산 배열에의 변환이란 예를 들면, 소수성 상호 작용의 향상, 펩티드 주쇄의 루프 구조의 안정화, 디술피드 결합에 의한 아미노산 간의 공유 결합 도입, 공간 밀도 향상, 단백질 C 말단의 신장에 의한 회합체의 안정화 등에 있어서 효과가 있다고 예측되는 아미노산 배열에의 치환으로 하였다(표 1).
Figure pct00007
＜발현 벡터의 제조 및 대장균의 형질 전환＞
우선, 표 1에 기재된 1 또는 2 이상 치환한 아미노산 배열을 포함하는 케토스 3－에피머라제의 DNA에 기초하여 PCR법 또는 유전자 합성 서비스(Thermo Fisher Scientific사)에 의해 변이 도입을 행하였다. 변이 도입한 DNA 단편을 대장균 발현용의 pQE60(Qiagen사) 벡터에 끼워넣어 대장균(숙주)을 형질 전환하였다. 변이 도입 부위는 시퀀스 해석에 의해 확인하였다.
＜조(粗)효소액의 조제＞
우선, 케토스 3－에피머라제 변이 효소를 발현하는 형질 전환체(대장균)를 암피실린 100μg/ml 및 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 배지(배양액)에 식균(植菌)하여, 37℃에서 16시간, 전(前)배양하였다. 이 전배양액을 0.1mM IPTG를 포함하는 10~100배량의 본배양액에 첨가하고, 20℃에서 24시간 배양하여, 목적의 효소 발현을 유도하였다. 다음에 원심분리기로 본배양액을 4℃, 5,500×g로 20분간 원심하였다. 원심 후 상청(上淸)을 제거하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 적당량의 50mM 인산 버퍼(pH8.0, 2mM 황산마그네슘을 포함한다)에 현탁시키고, 45초 간격으로 15초간 초음파 파쇄를 6사이클 행하였다. 그 후 4℃, 5,500×g로 20분간 원심하고 상청을 취하여 조효소액을 얻었다. 표 1의 각 변이 효소의 조효소액을 상술의 방법에 의해 얻어 효소 활성의 평가에 이용하였다.
＜조효소액의 활성 평가＞
(i) 50℃에 있어서의 효소 활성(T50)에 대한 70℃에 있어서의 효소 활성(T70)의 비： T70/T50의 비교
케토스 3－에피머라제의 효소 반응은 평형 반응이고, 평형 상태에서는 대체로 D－프시코스：D－프럭토스=30：70으로 되기 때문에, D－프시코스를 기질로 한 경우의 D－프럭토스의 생성량은 측정하기 쉽다. 따라서, 케토스 3－에피머라제 활성의 평가는 D－프시코스를 기질로 하여 효소 반응시킨 경우에 생기는 D－프럭토스의 생성량을 측정함으로써 행하는 것으로 하였다.
구체적으로는 상술의 방법에 의해 얻어진 각 조효소액을 이용하여 표 2에 나타내는 반응 조건하에서 효소 반응을 행하였다. 반응 정지 후, 반응액을 이온교환수지에 의한 탈염에 의해 정제하고, 필터 처리하여, HPLC(HPLC 시스템(토소사제), MCIGEL CK08EC(미츠비시화학사제))에 로드(load)하였다. HPLC에 의해 측정된 D－프럭토스의 피크 면적을 산출하여, 50℃ 및 70℃의 피크 면적비로부터 각 효소 활성을 산출하였다. 효소 활성 1단위는 각 조건하에 있어서 D－프시코스를 에피머화하여 1분간에 1μmol의 D－프럭토스를 생성하는 효소량으로 정의한다. 얻어진 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00008
측정의 결과 표 4로부터 T70/T50이 야생형의 활성치(0.7±0.1)보다 높은 변이 효소를 인지하였다. 이들 변이 효소는 열안정성의 향상이 시사되었다.
앞에 기술하였듯이, 열안정성을 향상시키는 것이 예상되는 특정의 아미노산 배열 위치로서 표 1에 나타내는 각 위치를 선정하여 아미노산 배열의 치환을 행했지만, 제조한 변이체 중에는 열안정성이 그다지 변화하지 않거나, 저하마저 하는 경우도 있어 예상에 반하는 결과로 되었다.
(ii) 미처리 효소의 50℃에 있어서의 활성을 100으로 한 경우의, 50mM 인산 버퍼(pH8.0, 2mM 황산마그네슘을 포함한다) 현탁액에서 60℃, 1시간 처리한 동일 효소의 50℃에 있어서의 잔존 효소 활성： A의 비교
다음에, 60℃, 1시간 정치(靜置)한 열처리 후의 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 상술에 의해 얻어진 조효소액을 이용하여 이하의 표 3에 나타내는 조건하에서 D－프시코스를 기질로 하여 열처리 후의 효소를 반응시켰다. 효소 반응 정지 후, 빙수 중에서 10분간 냉각한 반응액을 이온교환수지에 의한 탈염에 의해 정제하여, HPLC에 로드하였다. HPLC에 의해 측정된 D－프시코스의 피크 면적을 산출하여, 열처리 후 및 미처리 효소의 50℃에 있어서의 효소 활성을 산출하였다. 열처리 후의 잔존 효소 활성은 미처리 효소 활성을 100으로 한 경우의 상대 활성으로서 산출하였다. 얻어진 결과는 표 4에 나타낸다.
Figure pct00009
그 결과 표 4로부터 잔존 효소 활성： A가 야생형 효소의 잔존 효소 활성치를 초과한 변이 효소를 인지하였다. 이들 효소는 열안정성이 높은 것이 시사되었다.
Figure pct00010
상기 변이체 중 특히 PM3, PM4, PM5, PM9, PM12, PM14, PM17, PM18, PM19, PM23, PM26, PM28, PM29, PM31, PM32, PM33, PM38, PM39, PM41, PM43, PM44, PM45, PM46, PM48, PM51, PM55, PM56, PM57, PM58, PM59, PM60, PM61, PM62, PM63, PM64 및 PM65에 대해서는 야생형에 비교하여 T70/T50 또는 잔존 효소 활성： A가 우수하였다.
또 이들 중에서 특히 PM4, PM17, PM18, PM23, PM26, PM29, PM32, PM33, PM38, PM39, PM41, PM43, PM44, PM45, PM48, PM51, PM55, PM57, PM58, PM60, PM61, PM63 및 PM65는 야생형에 비교하여 T70/T50이 1.0 이상 혹은 잔존 효소 활성： A가 40 이상으로 우수하였다.
또한, PM17, PM23, PM26, PM29, PM32, PM38, PM39, PM41, PM43, PM51, PM57, PM60, PM61 및 PM65는 야생형 T70/T50 혹은 잔존 효소 활성： A의 수치에 대해 2배 이상의 활성을 나타내고 있어 특히 우수하였다.
＜고정화 효소의 제작＞
1. 전술의 ＜조효소액의 조제＞에 기재한 방법과 동일한 방법으로 PM38/41/43/51/야생형(이하 WT)의 조효소액을 얻었다.
각각의 조효소액의 효소 활성을 전술의 ＜조효소액의 활성 평가＞ 및 ＜표 2＞에 기재한 방법 및 조건으로 측정하였다.
2. 2mM 황산마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정하고, 평형화시킨 고정화 담체(이온교환수지 Amberlite FPA95 또는 Duolite A568(모두 다우·듀퐁사제))와 조효소액을 고정화 담체 1mL에 대해 조효소액의 효소 활성 630U의 비율로 바이알병 중에서 혼합하고, 24시간 이상 전도(轉倒) 혼화하였다.
3. 이상의 방법에 의해 제작한 고정화 효소는 2mM 황산마그네슘을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정한 후, 사용 시까지 4℃의 냉장고 중에서 보관하였다.
＜연속 반응＞
이하의 실험 조작은 JIS K 7002：1988(공업용 글루코스 이소머라제)에 준하여 실시하였다.
1. 55℃로 가온된 반응탑(φ18mm×L400mm)에 고정화 효소 29mL를 충전하고, 반응 원료(50wt% 과당, 240ppm의 MgSO4 및 150ppm의 Na2SO3를 포함한다)를 반응탑에 공급하였다.
2. 반응탑으로부터의 유출액은 1일마다 저류(貯留)하고, HPLC 분석(＜조효소액의 활성 평가＞와 마찬가지의 방법)을 실시하여 HPLC 크로마토그램에 있어서의 프시코스 및 과당의 면적 APsi 및 AFru를 산출하였다.
3. 반응 원료의 유속은 식 (1)로 표시하는 이성화율 x가 20% 이상으로 되도록 적당히 조절하였다.
x=APsi/(APsi＋AFru) (1)
4. 고정화 효소의 효소 활성 a는 식 (2)에 의해 산출하였다.
a=F/VCSxeln(xe/(xe-x)) (2)
식 중 F는 기질의 유속, CS는 기질 농도, xe는 외관의 평형 반응률(0.29), V는 고정화 효소의 베드 체적이다.
반응탑의 운전 개시로부터 42일째의 효소 활성 a42와 운전 개시 1일째의 효소 활성 a1의 비(이하 42일째의 잔존 활성)를 도 1에 나타낸다. WT의 42일째의 잔존 활성은 60% 정도였지만, PM38/41/43/51의 42일째의 잔존 활성은 80% 정도로, 42일간의 운전에 의한 효소 활성의 저하폭이 작았다. 이것은 활성 저하가 늦은 것을 나타낸다.
프시코스의 실생산에서는 반응탑은 50℃ 이상의 온도에서 장시간(수개월~수년 정도) 운전되는 경우가 많다. 이 경우 효소 활성이 서서히 저하하여 프시코스의 생산량이 저하한다. 본 실시예에서 채택한 변이체는 활성 저하가 늦기 때문에, 프시코스 생산량도 저하하기 어려워 산업상 유용하다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 변이 효소는 종래의 야생형 효소와 비교하여, 열안정성을 향상시킴으로써 최적 온도에서의 효소 활성을 유지하여, D－프시코스를 효율적으로 생산하는 것이 가능하게 된다.
<110> MATSUTANI CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD. <120> ketose-3-epimerase with increased heat stability <130> OP18170 <160> 1 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> Wild-type psicose epimerase derived from Arthrobacter globiformis <400> 1 Met Lys Ile Gly Cys His Gly Leu Val Trp Thr Gly His Phe Asp Ala 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Tyr Ser Val Gln Lys Thr Arg Glu Ala Gly Phe Asp 20 25 30 Leu Val Glu Phe Pro Leu Met Asp Pro Phe Ser Phe Asp Val Gln Thr 35 40 45 Ala Lys Ser Ala Leu Ala Glu His Gly Leu Ala Ala Ser Ala Ser Leu 50 55 60 Gly Leu Ser Asp Ala Thr Asp Val Ser Ser Glu Asp Pro Ala Val Val 65 70 75 80 Lys Ala Gly Glu Glu Leu Leu Asn Arg Ala Val Asp Val Leu Ala Glu 85 90 95 Leu Gly Ala Thr Asp Phe Cys Gly Val Ile Tyr Ser Ala Met Lys Lys 100 105 110 Tyr Met Glu Pro Ala Thr Ala Ala Gly Leu Ala Asn Ser Lys Ala Ala 115 120 125 Val Gly Arg Val Ala Asp Arg Ala Ser Asp Leu Gly Ile Asn Val Ser 130 135 140 Leu Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Thr Asn Val Leu Asn Thr Gly Arg 145 150 155 160 Gln Ala Leu Ala Tyr Leu Glu Glu Leu Asn Arg Pro Asn Leu Gly Ile 165 170 175 His Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Ser Asp Met Phe Ser 180 185 190 Pro Ile Leu Asp Thr Ala Glu Ala Leu Arg Tyr Val His Ile Gly Glu 195 200 205 Ser His Arg Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Ser Val Asp Phe Asp Thr Phe 210 215 220 Phe Lys Ala Leu Gly Arg Ile Gly Tyr Asp Gly Pro Val Val Phe Glu 225 230 235 240 Ser Phe Ser Ser Ser Val Val Ala Pro Asp Leu Ser Arg Met Leu Gly 245 250 255 Ile Trp Arg Asn Leu Trp Ala Asp Asn Glu Glu Leu Gly Ala His Ala 260 265 270 Asn Ala Phe Ile Arg Asp Lys Leu Thr Ala Ile Lys Thr Ile Glu Leu 275 280 285 His

Claims (10)

  1. 배열 번호 1로 표시되는 아스로박터 글로비포미스 유래의 야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내에 적어도 하나의 아미노산 변이를 가지고, (1) 50℃에 있어서의 효소 활성(T50)에 대한 70℃에 있어서의 효소 활성(T70)의 비： T70/T50, 혹은 (2) 미처리의 효소의 50℃에 있어서의 활성을 100으로 한 경우의, 50mM 인산 버퍼(pH8.0, 2mM 황산마그네슘을 포함한다) 현탁액에서 60℃, 1시간 처리한 동일 효소의 50℃에 있어서의 잔존 효소 활성： A가, 야생형 케토스 3－에피머라제의 T70/T50 혹은 A보다 높은 값을 나타내는 케토스 3－에피머라제 변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    T70/T50이 1.0 이상인 것을 특징으로 하는 케토스 3－에피머라제 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    잔존 효소 활성： A가 40 이상인 것을 특징으로 하는 케토스 3－에피머라제 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내의 적어도 하나의 아미노산 변이가, 1~10개의 위치에 있어서의 아미노산 치환인 것을 특징으로 하는 케토스 3－에피머라제 변이체.
  5. 제1항에 있어서,
    야생형 케토스 3－에피머라제의 아미노산 배열 내의 적어도 하나의 아미노산 변이가, 배열 번호 1의 아미노산 배열의 아미노 말단으로부터 세어 하기의 위치：
    6, 14, 22, 26, 34, 67, 68, 69, 70, 75, 91, 95, 100, 101, 110, 122, 137, 144, 160, 173, 177, 200, 214, 222, 237, 261, 270, 271, 275, 278, 281 및 289
    의 어느 것인가에 존재하는 것을 특징으로 하는 케토스 3－에피머라제 변이체.
  6. 케토스 3－에피머라제 변이체가, 배열 번호 1의 아미노산 배열의 아미노 말단으로부터 세어 하기의 위치에 있어서 아미노산 치환을 가지는 변이체로부터 선택되는 케토스 3－에피머라제 변이체.
    Figure pct00011
  7. 제6항에 있어서,
    케토스 3－에피머라제 변이체가 하기 변이체로부터 더 선택되는 것을 특징으로 하는 케토스 3－에피머라제 변이체.
    Figure pct00012
  8. 제6항에 있어서,
    케토스 3－에피머라제 변이체가 하기 변이체로부터 더 선택되는 것을 특징으로 하는 케토스 3－에피머라제 변이체.
    Figure pct00013
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    고정화 담체에 고정화한 것을 특징으로 하는 케토스 3－에피머라제 변이체.
  10. D－프럭토스에 대해, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 케토스 3－에피머라제 변이체 또는 제9항에 기재된 고정화된 케토스 3－에피머라제 변이체를 작용시키는 것을 특징으로 하는 D－케토스의 제조 방법.
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