KR20200061397A - 암 치료법을 위한 면역 체크포인트 조절을 갖는 단일특이성 및 이중특이성 단백질 - Google Patents

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Abstract

OX40 및/또는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 모노특이성 및 이중특이성 단백질이 제공된다. 예시적 단백질은 PD-L1을 통해 억제하고 OX40을 통해 T 세포를 자극한다. 예시적 다가 단백질은 적어도 하나의 OX40 결합사이트 및 적어도 하나의 PD-L1 결합 사이트를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 결합 사이트는 면역글로블린 불변영역을 통해 연결될 수 있으며 항-PD-L1 항체가 또한 제공된다.

Description

암 치료법을 위한 면역 체크포인트 조절을 갖는 단일특이성 및 이중특이성 단백질
본 출원은 2017년 12월 29일에 출원된 미국 임시출원 제62/611,543호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 전체적으로 참조로서 여기에 통합되어 있다.
본 출원과 관련된 시퀀스 목록은 EFS-Web를 통해 전자 포맷으로 제출되어 있고, 전체적으로 본 명세서에 참조로서 통합되어 있다. 시퀀스 목록을 포함하는 문서 파일 이름은 1808584_ST25.txt이다. 문서 파일의 크기는 125,888byte이고, 이 파일은 2018년 12월 27일에 만들어졌다. 본 발명은 항체에 관한 것이다. 보다 특히 본 발명은 암 치료용 항체에 관한 것이다.
인간에서 2가지 주요 타입의 림프구는 T(가슴샘-유래) 및 B (골수 유래)가 있다. 이들 세포들은 림프 발달 경로에 기여하는 골수 및 태아간의 조혈모세포로부터 유래된다. 이들 줄기 세포의 자손들은 갈라지는 경로들을 따라 B 또는 T 림프구로 성숙한다. 인간 B-림푸구 발달은 전체적으로 골수 내에서 일어난다. 다른 한편, T 세포는 골수를 떠나 가슴샘으로 가는 혈류를 통해 미성숙 전구체로부터 발달하며, 가슴샘에서 이들은 증식하고 성숙한 T 림프구로 분화한다.
T 세포
T-세포는 가장 풍부하고(혈액 림프구의 약 75%), 잠재적 면역 킬러 세포이다. 항종양 면역 반응에서 이펙터 T-세포의 역할은, 몇가지 타입의 종양에서 CD8+T의 높은 침윤(infiltration)이 바람직한 임상적 예후와 관련이 있다는 인비트로 연구 및 관찰에 의해 강력하게 뒷받침된다(Fridman et al., 2012). 이펙터 미접촉(naive) T-세포의 활성화는 적어도 3개의 상보적 신호를 요구한다: (i) 공동 수용체(CD4 또는 CD8)의 도움과 TCR-CD3/Ag-MHC 상호작용; (ii) CD28, CD40/CD40L에 대한 CD80 또는 CD86와 같은 공동 자극 분자의 결합; 및 (iii) 사이토카인과 같은 보조 분자.
T-세포에 대한 2개의 분명한 신호의 공동 자극 또는 제공은, 항원-제시 세포(APCs)에 의한 휴면(resting) T 림프구의 림프구 활성화에 대한 광범위하게 받아들여진 모델이다(Lafferty 및 Cunningham, 1975). 이 모델은 추가로 비자기(non-self) 및 면역 용인성(immune tolerance)의 구별을 가능하게 한다(Bretscher and Cohn, 1970; Bretscher, 1999; Jenkins and Schwartz, 1987). 일차 신호 또는 항원 특이적 신호는 주요 조직적합 유전자 복합체(major histocompatibility-complex, MHC)의 측면에서 제시된 외래 항원 펩티드의 인식 후 T-세포 수용체 (TCR)를 통해 도입된다. 2차 또는 공동 신호는 항원-제시 세포(APCs)에 발현된 공동-자극 분자에 의해 T-세포로 전달되고, T-세포가 클론 확장, 사이토카인 분비 및 이펙터 기능을 촉진하게 유도한다(Lenschow et al., 1996). 공동자극이 없는 경우에, T-세포는 항원 자극에 반응하지 않게 되어, 효과적인 면역 반응을 시작하지 않고, 추가로 외래 항원에 탈진하거나 용인하는 결과를 가져올 수 있다.
면역 체크포인트 단백질: PD-L1 및 OX40
면역 체크포인트는, 면역시스템, 특히 T-세포 매개 면역성을 리간드-수용체 상호작용 배선하는 것으로 대부분 시작되어, 자가면역관용(self-tolerance)를 유지하고 말초 조직 내에서 생리적 반응의 지속기간 및 진폭을 조절하여 부차 조직(collateral tissue) 손상을 정상적으로 최소화하는 억제적 및 자극적 경로의 집단을 의미한다(Pardoll, 2012). 종양 세포는 면역 저항의 주요 메커니즘으로서 특정 체크포인트 경로를 선임한다. 예를 들어, 프로그램화된 세포예정사 단백질 1 리간드(prrogrammed cell death protein, PD-L1)는, 인간 암의 종양 세포 표면에서 공통적으로 상향 조절된다. PD-L1과, 종양 잠입 림프구(TIL)에서 발현된, 특히 T 세포 상에 발현된, 이의 수용체의 상호 조절은 국소적 T 세포 매개 반응이 면역 감시를 도망가는 것을 방지한다(Liang et al., 2006; Sznol 및 Chen, 2013). 그러므로 암 세포 상의 면역억제적 신호의 억제 또는 T 세포의 직접적인 아고니스틱 자극은 강한 지속된 항종양 면역 반응을 가져오거나 및/또는 유도한다. 항체를 통하거나 또는 용해성 리간드 또는 수용체에 의해 조절된 면역 체크포인트 단백질을 차단하는 것을 강하게 제안하고 있는 최근 임상 연구는, 치료적 항종양 면역성을 활성화시키는 가장 전망있는 접근법이다.(Topalian et al., 2014). 현재 항-PD-1 및 항-CTLA-4 (세포독성 T-림프구-관련된 항원-4) 항체는 FDA에 의해 승인되어 그러한 흑색종을 치료한다.
또 다른 공동-자극자 분자는 OX40 수용체(CD134)이고, TNFR 슈퍼패밀리 구성원이며, 활성화된 CD4+ T 세포에 막-결합되고 우선적으로 발현된다(Paterson et al., 1987). OX40 수용체(이후 "OХ40")를 통한 신호 전달은 이펙터 T 세포들을 공동자극하고 T-세포의 증식을 야기한다(Watts, 2005; Weinberg et al., 1994). OX40의 연구는, 이의 주요 역할이, 주요 면역 반응에 축적하는 이펙터 T-세포의 수를 지시하여 결과적으로 연속적으로 발달하고 생존하는 기억 T-세포의 수를 지배한다(Croft, 2003). 수 많은 인비트로 연구는 OX40이 T 세포 증식 및 사이토카인 제조를 증가시키는 공동자극 신호를 제공한다는 것을 나타내었다.
이중특이성/이중기능적(bi-specific/bi-functional) 항체
종양 세포 쪽으로 이펙터 면역 세포를 효율적으로 재조준하는 이중특이성 항체를 사용하는 아이디어는 1980년에 나타났다(Karpovsky et al., 1984; Perez et al., 1985; Staerz et al., 1985). 이중특이성 스캐폴드는 Fc 단편, IgG-유사 분자 및 작은 재조합 이중특이성 포맷의 존재 또는 부존재를 기초로 하여, 다른 약동학적 성질을 갖는 2개의 주요 집단으로 일반적으로 분류되며, 이들 대부분은 대부분이 단쇄가변분절 (single chain variable frgment, scFv)로부터 유래한다. 이들의 콤팩트한 크기를 통해, 항체 단편은 통상 IgG-유사 분자보다 효율적으로 종양을 통과하나, 이 장점은 이들 전체 종양의 흡수 및 잔류 시간을 제한하는 짧은 혈청 반감기(몇 시간)에 의해 줄어든다(Goldenberg et al., 2007). 대조적으로, 신생아의 Fc 수용체에 결합하는 Fc 단편의 존재는, lgG-유사 포맷에 대해 장기간 혈청 반감기(>10일)를 제공하여, 종양 흡수 및 유지를 좋게 하나 종양 투과는 제한한다.
최근 연구는 암 세포를 파괴하는 환자 자신의 면역계를 이용하는 암치료의 일종인 면역 치료법의 치료적 효능을 강조해왔다. 종양 내에서, "체크포인트 억제제"로서 총괄적으로 알려진, 음성적 조절 분자 패밀리의 존재는 T 세포 기능이 항종양 면역성을 억제하는 것을 방지할 수 있다. 체크포인트 억제제, 예를 들어CTLA-4 및 PD-1는, T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 약화시킨다. 안타고니스트 단일클론 항체(mAbs)로 CTLA-4 또는 PD-1의 표적화된 차단은 T 세포에 "브레이크"를 방출하여 항종양 면역성을 부양시킨다. 최적 "킬러" CD8 T 세포 반응을 생성하기 위해서는, T 세포 수용체 활성화와 공동-자극을 요구하며, 이는 OX40 (CD134) 및 4-1 BB (CD137)을 포함하는 종양 괴사 인자 수용체 패밀리 구성원의 결찰(ligation)을 통해 제공될 수 있다. OX40는, 활성화(아고니스트) 항 OX-40으로 치료가 T 세포 분화 및 세포 용해 기능을 증가시켜 다양한 종양에 대한 항종양 면역성의 증가를 유도하기 때문에 흥미롭다. 단일 약제로서 사용될 때, 이들 약물은 전이성 질병을 갖는 환자에서 잠재적 임상적 및 면역성 반응을 유도할 수 있다(Linch et al., 2015).
암, 예를 들어 전립선 암, 폐 암, NSCLC, 흑색종, 림프종, 유방 암, 두부암(head cancer) 및 경부암(neck cancer), RCC, 또는 난소 암을 갖는 환자 치료를 위한 목적으로 면역 조절을 갖는 이중특이성 항체를 조사하도록 디자인된 본 발명의 개시 내용이 시험되었다.
본 개시 내용은 SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 10의 아미노산 126-244, 및 SEQ ID NO. 13의 아미노산 123-240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스와 적어도 약 80% 시퀀스 상동의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변영역; 및 SEQ ID NO. 5의 아미노산 1-108, SEQ ID NO. 7의 아미노산 1-108, SEQ ID NO. 10의 아미노산 1-112, 및 SEQ ID NO. 13의 아미노산 1-108으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스와 적어도 약 80% 시퀀스 상동의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변영역을 포함하는, OX40(CD134)에 결합하는 항체 또는 이들의 항원-결합 부분을 제공한다.
일 실시예에서, 항체 또는 이들의 항원-결합 부분은 SEQ ID NO. 10, 11 , 12, 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 단쇄가변분절(scFv) 시퀀스이다.
일 실시예에서, 항체 또는 이들의 항원-결합 부분은 이중특이성 항체이다.
일 실시예에서, 상기 이중특이성 항체는 면역 체크포인트 단백질 결합 사이트를 포함한다.
일 실시예에서, 면역 체크포인트 단백질 결합 사이트는 세포예정사 단백질 1 리간드(PD-L1) 결합 사이트, PD-1 결합 사이트, 상피세포 증식인자수용체(EGFR) 결합 사이트, 인간 상피세포 증식인자수용체 2(HER2) 결합 사이트, 세포독성 T-림프구-관련된 항원 4(CTLA-4) 결합 사이트, 또는 림프구 활성 유전자 3(LAG3) 결합 사이트를 포함한다.
본 개시 내용에서는 또한 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이들의 항원-결합 부분을 제공하며, 이는 SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 4으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 도메인; 및 SEQ ID NO. 1의 아미노산 1-111 및 SEQ ID NO. 3의 아미노산 1-110으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스의 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 도메인을 포함한다.
본 개시는 또한 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이중특이성 항체를 제공하며, 상기 폴리펩티드 사슬은 OX40 결합 사이트 및 PD-L1 결합 사이트를 포함한다. 상기 OX40 결합 사이트는 SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 10의 아미노산 126-244, 및 123-240 SEQ ID NO. 13의 아미노산 123-240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 약 80% 시퀀스 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 SEQ ID NO. 5의 아미노산 1-108, SEQ ID NO. 7의 아미노산 1-108, SEQ ID NO. 10의 아미노산 1-110 및 SEQ ID NO. 13의 아미노산 1-107으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함한다. 상기 PD-L1 결합 사이트는 SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 4으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 도메인; 및 SEQ ID NO. 1의 아미노산 1-111 및 SEQ ID NO. 3의 아미노산 1-110으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스의 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 도메인을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 폴리펩티드 사슬은 Fc 도메인, Fab 단편, 및 scFv을 더 포함한다. Fab 단편은 Fc 도메인의 N-말단에 연결되고, Fab 단편은 PD-L1 결합 사이트을 포함한다. scFv는 Fc 도메인의 C-말단에 연결되고, scFv은 OX40 결합 사이트을 포함한다.
일 실시예에서, 폴리펩티드 사슬은 Fc 도메인 및 scFv 사이에 링크를 더 포함한다.
일 실시예에서, 상기 scFv는 SEQ ID NO. 18의 아미노산 455-707, SEQ ID NO. 19의 아미노산 455-708, SEQ ID NO. 20의 아미노산 455-701, SEQ ID NO. 21의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 22의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 23의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 24의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 25의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 26의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 27의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 28의 아미노산 455-706, 및 SEQ ID NO. 29의 아미노산 455-706으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 이중특이성 항체는 한 쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 이중특이성 항체는 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY 항체이다.
일 실시예에서, 상기 이중특이성 항체는 IgG 항체이다.
일 실시예에서, 상기 IgG 항체는 lgG1 , lgG2, lgG3, 또는 lgG4 항체이다.
본 개시는 또한 치료제, 및 PD-L1 및/또는 OX40을 결합하는 항체 또는 항원-결합 부분을 포함하는 항체-약물 콘쥬게이트를 제공하며, 상기 치료제는 링커에 의해 항체 또는 항원-결합 단편에 공유적으로 콘쥬게이트된다.
일 실시예에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 상기 언급된 항체 또는 항원-결합 부분으로부터 선택된다.
본 개시는 또한 상기 언급된 것처럼 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 이중특이성 항체, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시는 또한 치료가 필요한 대상에게 효과적인 함량의 상기 언급된 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 이중특이성 항체를 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 암은 전립선 암, 폐 암, 비소세포폐암 (NSCLC), 흑색종, 림프종, 유방암, 두부암 및 경부암, 콩팥세포암종(CC), 및 난소 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시는 또한 상기 언급된 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 이중특이성 항체을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
앞선 일반적인 설명과 이하 상세한 설명 모두 예시적인 것이며 청구된 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하는 것으로 이해된다.
본 발명은 다음 첨부된 도면을 참조로, 실시예의 상세한 설명에 의해 완전히 이해될 수 있다.
도 1은 T-세포 매개 면역성을 조절하는 면역 체크포인트를 나타낸다. 체크포인트에 대한 아고니스틱 또는 안타고니스틱 항체, 예를 들어 항-ICOS, 항-CD28, 항-OX40, 및 항-CD27, 또는 항-PD-1 , 항-CTLA4, 항-LAG3, 항-BTLA는 분야에 따라서 이중-기능성 융합 단백질을 구성하는데 사용될 수 있다.
도 2A 및 2B는 PD-L1 발현된 HEK293 세포에 대한 직접적인 ELISA에 의한 파지 클론의 스크린을 나타낸다.
도 3A 및 3B는 OX40 발현된 HEK293 세포를 기초로 한 세포에 대한 직접적인 ELSA에 의한 파지 클론의 스크린을 나타낸다.
도 4는 온전성 및 순도를 밝히기 위하여 비환원제 또는 환원제로 SDS-PAGE를 하여 PD-L1에 대해 특이적인 정제된 선도 항체(antibody lead)를 나타낸다.
도 5는 온전성 및 순도를 밝히기 위하여 비환원제 또는 환원제로 SDS-PAGE를 하여 OX40에 대해 특이적인 정제된 선도 항체를 나타낸다.
도 6은 정제된 항-면역 체크포인트 단백질 및 PD-L1에 대한 항-PD-L1 선도 항체의 직접적인 리간드 결합의 예를 나타낸다. 리간드 사전 코팅된 웰은 1차적으로 지정된 다양한 농도의 선도 항체로 배양되었다. 결합된 단백질은 이후 HRP 콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG Fab 특이적 항체로 검출되고 OD450 판독이 플로트되었다.
도 7은 정제된 항-면역 체크포인트 단백질 및 OX40에 대한 항-OX40 선도 항체의 직접적인 리간드 결합 활성의 예시를 나타낸다. 리간드 사전-코팅된 웰은 1차적으로 지정된 다양한 농도의 항체로 배양되었다. 결합된 단백질들은 HRP 콘쥬게이트된 염소 항-인강 IgG Fab 특이적 항체로 검출되고 OD450 판독은 플로트되었다.
도 8은 PD-L1 발현 293 세포들을 사용하는 플로우 분석을 나타낸다. PD-L1 발현 HEK293 세포는 1차적으로 정제된 선도 항체로 배양되고, 결합된 항체는 Alexa-488 콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG (H+L)으로 검출되고, 이어서 형광-활성화된 세포 분류기 (FACS) 분석을 하였다.
도 9는 OX40 발현 293 세포을 사용한 플로우 분석을 나타낸다. OX40 발현 HEK293 세포는 정제된 항-OX40 선도 항체로 일차적으로 배양되고, 결합된 항체는 Alexa-488 콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG (H+L)으로 검출되고, 이어서 FACS 분석을 하였다. NS: 염색 없음.
도10은 정제된 항 PD-L1와 PD-1/PD-L1의 상호작용의 장애를 나타낸다. 지정된 것처럼 정제된 항체는 비오티닐화된-PD-l-Fc 및 PD-L1-293F 세포로 적용하여 PD-1/PD-L1 상호작용의 저해 활성을 평가하였다. PD-L1-293F 세포에 대한 결합 재조합 PD-1-Fc는 스트렙트아비딘-Alexa-488에 의해 검출되고 FACS에 의해 분석되었다.
도 11A 및 11B는 3일(도11A) 또는 5일(도11B) 항체 처리 후 혼합된 림프구 반응(MLR) 분석에서 T-세포 증식을 자극하고, IL-2 및/또는 IFN-γ 생성을 유도하는 1 또는 10 μg/mL의 항-PD-L1 선도 항체를 나타낸다.
도 12A는 복용 반응으로 CD3+T 세포 활성화를 증가시키는 항-OC40 선도 항체뿐만 아니라 참조 항체의 능력을 나타낸다. 도 12B는 플레이트 결합된 항-CD3 및 몇가지 농도의 항-OX40 선도 항체로 인간 T 세포의 자극 3일 후 세포 배양 배지 내에 존재하는 인간 IL-2 및 IFN-γ의 농도를 나타낸다.
도 13A 및 13B는 플레이트 결합된 항-CD3 및 몇가지 농도의 OX40 특이적 선도 항체로 인간 T 세포를 자극한 3일 후 세포 배양 배지 내에 존재하는 인간 IL-2(도 13A) 및 IFN-γ (도 13B)의 농도를 나타낸다.
도 14는 OX40 특이적 scFv 도메인으로 융합된 항체 중사슬 Fc의 구조를 나타낸다.
도 15는 항-면역 체크포인트 항체-인간 아르기나아제 융합 단백질의 PAGE-겔 분석의 예를 나타낸다. 정제된 융합 단백질, 항-PD-L1-OX40 scFv 융합 단백질은 분자량 약 220 kDa (non-reducing)을 갖는 것으로 나타나고, 및 양 항체 융합에서 중사슬 융합은 약 85 kDa이고 경사슬은 약 약 25 kDa (reduced)이다.
도 16A 및 16B는, 모노-, 조합된 또는 항-PD-L1-OX40 scFv 이중특이성 항체 처리 3일(도 16A) 또는 5일(도 16B) 후 혼합된 림프구 반응(MLR) 분석에서 IL-2 및 IFN-y 생성을 위한 T-세포 활성화를 자극하는 이중특이성 항체 시너지를 나타낸다.
도 17A 내지 17E는 OX40 scFv에서 5개 다른 링커로 이중-특이적 항체, 항-PD-L1-OX40 Ab 및 항-PD-L1-OX40 Ab-V1 내지 V4의 응집 및 순도 결정을 각각 나타낸다.
도 18는 항-PD-L1-OX40 Ab-V5 내지 V12의 OX40 클론 B17 중 시퀀스 변이체들을 나타낸다(SEQ ID NOS: 30-38).
도 19는 항-면역 체크포인트 항체-인간 아르기나아제 융합 단백질의 PAGE-겔 분석의 예를 나타낸다. 정제된 융합 단백질, 항-PD-L1-OX40 Ab-V5 융합 단백질은 분자량 약 220 kDa (non-reducing)을 갖는 것으로 나타나고, 및 양 항체 융합에서 중사슬 융합은 약 80 kDa 및 경사슬은 약 30 kDa (reduced)이다.
도 20은 이중특이성 항체 변이체의 결합 활성 평가를 위한 ELISA 방법을 나타내는 플로우 챠트를 나타낸다.
도 21은 이중특이성 항체 변이체 및 이의 EC50의 인간 PD-L1 결합 활성을 나타낸다.
도 22는 이중특이성 항체 변이체 및 이의 EC50의 인간 OX40 결합 활성을 나타낸다.
도 23는 이중특이성 항체 변이체, 항-PD-L1-OX40 Ab-V5의 엑소비보 혈청 안정성을 나타낸다.
도 24A 및 24B는 모노-, 조합된 또는 항-PD-L1-OX40 Ab-V5 이중특이성 항체 처리로 T 세포를 조절한 3 일 후 IL-2생성 (도 24A) 및 5일 후 INF-γ 생성을 나타낸다.
도 25는 Fox Chase SCID®Beige 마우스에서 PC-종양의 성장에 대한 항-PD-L1-OX40 Ab-V5 이중특이성 항체 처리 및 단일클론 항체 처리의 효과를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 실시예에 대하여 보다 상세히 설명하며, 이의 예들은 도면을 참조로 설명된다. 가능하다면, 동일한 참조 번호가 도면에 사용되고 상세한 설명은 동일 또는 유사한 부품을 참조한다.
본 발명은 항-면역 체크포인트 단백질 항체의 Fc 도메인의 C-말단에 융합된 분리된 기능성 아고니스틱 OX40 scFv로 이중기능적 단백질을 발현, 정제 및 특성화하는 것을 설명한다. 이들 단백질은 이에 대응하는 체크포인트 표적과 상호작용하여 억제성 또는 자극성 신호를 전달하여 T-세포 관련 면역성을 조절할 것이다. 본 발명에서 Fc 융합 단백질의 구성 성분은 모두 인간 기관의 것이므로, 비면역원성인 것으로 예상되며 인간에서 치료제로서 사용될 수 있다.
이중특이성 분자, 예를 들어 이중특이성 항체(BsAbs)는, 동일한 치료제로 동일한 분자 표적 또는 다른 표적에 동시에 다중 에피토프를 표적으로 하는 수단을 제공한다. 암 치료제로서, 이들은 2개 mAbs의 혼합물과 대조적으로 새롭거나 또는 보다 잠재적 활성을 주고, 제품 단가를 낮추고 새로운 치료제 용법 개발을 용이하게 하는 잠재성을 갖는다(Chames and Baty, 2009; Hollander, 2009; Thakur and Lum, 2010). 최근에, 카투막소맙(Catumaxomab), 인간 상피세포접착분자(EpCAM) 및 CD3을 표적으로 하는 삼기능적 이중특이성 항체는 상피암의 복막암종증(peritoneal carcinomatosis)을 갖는 환자에게서 분명한 임상적 장점을 나타냈고(Heiss et al., 2010), CD19 및 CD3에 대해 이중 특이성을 갖는 이중특이성 T-세포 관여(BiTE) 항체는 혈액암(hematological malignancies)을 발현하는 CD19를 갖는 환자에게서 임상 활성을 조장하는 것으로 또한 나타났다(Bargou et al., 2008). 암 치료제로서 이중특이성 분자의 개발에 강한 관심에도 불구하고, 안정하고 활성적인 이중특이성 분자의 제조에서 기술적 도전 과제들은, 과거에는 대부분의 이중특이성 포맷의 임상 평가를 방해하는 것이었다. 많은 가공된 항체 포맷은 IgG-유사 이중특이성 항체를 포함하여 많은 가공된 항체는 안정성 또는 용해성을 절충하였다(Bargou et al., 2008; Demarest and Glaser, 2008; Lu et al., 2005). 게다가, 몇 가지 전략들은, 인간 헐청 알부민 및 Fc 가공으로 페길레이션(PEGylation), 콘쥬게이션을 포함하는, 이중특이성 분자의 제품 품질 및 인비보 안정성을 증가시켰다(Muller et al., 2007; Ridgway et al., 1996). 상술된 일반적인 형태의 이중특이성 단일 사슬 항체는, 4개 V-도메인, 2개 링커 및 1개 스페이서를 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스는 단일 프로모터의 제어 하에서 적당한 숙주 발현 기관 내로 통합될 수 있다. 이는 유연성을 증가시키며, 이들 구조는 이들 제조 동안 실험자의 제어의 정도뿐만 아니라 유연성을 갖도록 고안될 수 있다. 게다가, IgG의 Fc는 결합 안정성을 제외하고는 모든 항체 기능을 포함하고 있기 때문에 새로운 치료제를 디자인하기 위한 또 다른 매우 매력적인 스캐폴드이다. Fc 가공은 이중특이성 항체의 효과를 개선하는데 중요하다. 그러므로, IgG-기반 컨포메이션은 면역 세포 상에 2개의 종속된 표적 또는 면역 치료법에서 표적 세포에 대하여 본 발명에서 사용한다.
면역-체크포인트 단백질을 표적화하는 것은 항 종양 면역성을 활성화하는 전망있는 접근법이다. 항-체크포인트 단백질은, 예를 들어PD-1 , PD-L1 , CTLA-4, LAG3, 등은, 현재 임상적으로 평가된다(도 1). 면역 체크포인트 단백질의 차단제로 한 예비 데이터는 오래가는 임상 반응을 제조하는 잠재력을 갖는 항종양 면역성을 증가시킬 수 있다는 것을 보였다. 그러나, 수 많은 종양에서 이들 약제의 놀라운 임상 효과에도 불구하고, 많은 환자들에 대해 충분히 활성적이지 않다는 것이 분명해졌다. 수 많은 추가적인 면역요법 경로뿐만 아니라 종양 미세환경에서 골수 및 기질 세포(stromal cell)에 의해 발현되거나 분비된 억제 인자들은 면역 체크포인트 봉쇄와 함께 시너지를 내는 잠재적 표적이다. 그러므로, 항암 또는 이중특이성 항체 치료법을 결합하는 것은 암 환자에 대한 완전한 차도 및 치료를 얻는데 필수적이다.
본 발명은 다른 면역 체크포인트 단백질 특이적 scFv 단백질과 융합된 항-면역 체크포인트 단백질 항체의 구성, 발현 및 특성화를 설명한다. 융합 카운터파트가 면역 시스템 강화제(potentiating agent), 예를 들어 항-EGFR, 항-HER2, 또는 항-CTLA-4 항체라면, 융합 구조에서 C-말단에 위치한 OX40 scFv는 융합 단백질의 힘을 OX40 활성화 접근법 이상으로 확장하게 한다.
OmniMab 라이브러리로부터 항체 생성
PD-L1 또는 OX40에 대한 치료 항체의 생성을 위해, OmniMab 파스미드(phagemid) 라이브러리에서 선택했다. 파스미드 라이브러리는 수백 이상의 헬스 도너 B 세포의 수집으로부터 AP Biosciences Inc. (APBio Inc.)에 의해 발생된다. 첫번째 패닝(panning)에 대한 파지는 Hyperphage (M13K07△ρIII, Progen, Heidelberg, Germany)에 의해 제조되었다. PD-L1 또는 OX40에 대한 고체상 패닝 및 세포 패닝이 OmniMab 라이브러리로부터 PD-L1 또는 OX40 특이적 결합제 선택 및 분리를 위해 적용되었다. 고체 상 패닝은 첫번째 라운드 선택에서 재조합 인간 PD-L1-Fc (APBio Inc.)을 사용하여 수행되었고 이후 HEK293 세포 발현된 PD-L1 또는 OX40가 2 또는 3 회 강화를 위해 사용되었다. 3회 선택 후, 특이적 PD-L1 또는 OX40 결합제가 스크린되고 대응하는 재조합 단백질로 직접적인 ELISA로 분리되었다(도 2A, 2B, 3A, 및 3B). 사전 코팅된 PD-L1-Fc 재조합 단백질을 1시간 동안 구조된 파지를 포함하는 상청액으로 블롯팅하고, 0.1 % Tween-20을 포함하는 PBS로 3번 세척되었다. 결합된 파지는 HRP 콘쥬게이트된 항-M13항체(Roche)로 검출되었고, TMB 기판이 신호 발달을 위해 사용되었다. OD450 판독이 기록되었다. 양성 결합제가 분리되고 시퀀스싱하여, 중사슬 및 경사슬의 시퀀스와 분화를 확인하였다. PD-L1 또는 OX40에 특이적인 중사슬 및 경사슬의 가변영역은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 8으로 설명되었다. SEQ ID NO. 1는 PD-L1 클론 6의 경사슬이고, SEQ ID NO. 2는 PD-L1 클론 6의 중사슬의 가변영역이고, SEQ ID NO. 3는 PD-L1 클론 32의 경사슬이고, SEQ ID NO. 4는 PD-L1 클론 32의 중사슬의 가변영역이고, SEQ ID NO. 5는 OX40 클론 B17의 경사슬이고, SEQ ID NO. 6는 OX40 클론 B17의 중사슬의 가변영역이고, SEQ ID NO. 7는 OX40 클론 B19의 경사슬이고, SEQ ID NO. 8는 OX40 클론 B19의 중사슬의 가변영역이다. 도 2A, 2B, 3A 및 3B에 보여진 것처럼, 몇 가지 클론이 분리되고 음성 대조군과 비교로서 대응하는 항원에 대해 특이적으로 인식되는 것으로 알려져 있다.
IgG 포맷으로서 선택된 PD-L1 또는 OX40 특이적 결합제의 하부클로닝 및 발현/정제
T 세포 활성화에서 기능성을 갖는 특이적 결합제를 빠르게 스크리닝하는 것을 용이하게 하기 위하여, ELISA에 의하여 PD-L1 또는 OX40에 대한 양성 결합제의 중사슬 및 경사슬은 이후 증폭되고, 소화되어 IgG4 불변영역(SEQ ID No. 9)을 갖는 APBio 특성화된 IgG 발현 벡터로 서브클론되었다. 시퀀스 검증 후, 플라스미드를 이후 제조하고 HEK293 세포 내로 감염시켜 293 펙틴 형질주입 시약(Invitrogen)으로 항체 발현하였다. 4 일 배양 후, 무혈청 배지 내로 분비된 항체는 단백질 G 크로마토그래피로 배양 상청액으로부터 친화도 정제되었다. 정제된 항체는 이후 농축되고, 이어서 PBS 완충액에 투석된다. 투석된 단백질의 최종 농도는 NanoDrop2000 분광광도계로 결정되고, 순도 및 온전성은 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이 환원제와 함께 또는 환원제 없이 SDS-PAGE로 결정된다. 다양한 정제된 PD-L1 특이적 또는 OX40 특이적 선도 항체의 온전성은, HEK293 세포뿐만 아니라 참조 항체, PD-L1에 대해서는 MPDL3280A 또는 OX40에 대해서는 GSK3174998에서 정상이다.
일 실시예에서, 본 개시 내용은 항체 또는 OX40(CD134)에 결합한 이들의 항원-결합 부분을 제공하며, 이들은 중사슬 가변영역 및 경사슬 가변영역을 포함한다. 중사슬 가변영역은 SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 10의 아미노산 126-244, 및 아미노산 123-240 SEQ ID NO. 13로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스와 적어도 약 80% 시퀀스 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함한다.
일부 실시예에서, 중사슬 가변영역은 상기 언급된 아미노산 시퀀스의 적어도 약 85%, 90% 또는 95% 시퀀스 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함한다. 경사슬 가변영역은, SEQ ID NO. 5의 아미노산 1-108, SEQ ID NO. 7의 1-108, SEQ ID NO. 10의 1-110, 및 SEQ ID NO. 13의 1-107으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함한다. 일부 실시예에서, 경사슬 가변영역은 상기 언급된 아미노산 시퀀스에 대하여 적어도 약 85%, 90%, 또는 95% 시퀀스 상동의 아미노산 시퀀스를 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명은 항체 또는 PD-L1에 결합하는 이들의 항원-결합 부분을 제공하며, 중사슬 가변 도메인 및 경사슬 가변 도메인을 포함한다. 중사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 4으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 약 80% 시퀀스 상동의 아미노산 시퀀스를 포함한다. 일부 실시예에서, 중사슬 가변영역은 상기 언급된 아미노산 시퀀스의 적어도 약 85%, 90%, 또는 95% 상동의 아미노산 시퀀스를 포함한다. 경사슬 가변 도메인은 SEQ ID NO. 1의 아미노산 1-111 및 SEQ ID NO. 3의 1-110 으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스의 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함한다. 일부 실시예에서, 경사슬 가변 영역은 상기 언급된 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 85%, 90%, 또는 95% 시퀀스 상동의 아미노산 시퀀스를 포함한다.
직접적인 ELISA에 의한 PD-L1, OX40 특이적 IgG 선도 항체에 대한 결합 활성 결정
PD-L1 또는 OX40에 대한 정제된 선도 항체(항-PD-L1 선도 항체 또는 항-OX40 선도 항체)가 직접적인 코팅된 셋업에서 인간 PD-L1-Fc 또는 OX40-Fc에 대한 ELISA 결합 특성화에 대해 적용되었다. 도 6 및 7은 항-PD-L1 및 항-OX40 항체 각각에 대한 ELISA 결합 결과를 나타내었다. PD-L1 특이적 항체에 대해, 대부분 선도 항체는 참조 항체와 유사하거나 더 나은 결합 활성을 나타내었다(Ref Ab, MPDL3280A, Roche).
정제된 인간 PD-L1 또는 OX40 lgG1 Fc 키메라(PD-L1-Fc 또는 OX40-Fc, APBio)는 PBS(Phosphate Buffered Saline)으로 투석되고, 1mg/mL로 조절되고 이후 PBS로 희석되어 최종 1 μg/mL 농도로 하였다. Nunc-lmmuno Maxisorp 96웰 플레이트는 재조합 PD-L-1-Fc 또는 OX40-Fc 키메라로 웰 당 0.1mL로 코팅되고 비특이적 결합 대조군을 위해 웰을 비워두고, 4℃에서 밤새 배양하였다. PD-L1-Fc 또는 OX40-Fc 키메라 용액을 제거하고 플레이트를 3번 0.4mL 세척 완충액(PBS 중 0.1 % Tween-20)으로 세척하였다. 0.4 mL 차단 완충제(PBS 중 5% 저지방 우유 분말)를 모든 웰에 첨가하고, 실온에서 혼합하면서 1시간 동안 배양하였다. 차단 완충제가 제거되고, 플레이트는 0.4mL 세척 완충제로 3번 세척하였다. PD-L1 또는 OX40 시험 항체를 PBS에서 연속희석법하여 제조하고, 0.1mL 희석된 Ab를 웰 당 첨가하였다. 플레이트는 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 항체 용액을 제거하고 플레이트를 웰 당 0.4mL 세척 완충제로 3번 세척하였다. 호스래디시 퍼옥시다아제 표지된 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 특이적 F(ab')2 항체(Jackson Immunoresearch #109-036-097)를 PBS로 1:2000으로 희석하고 웰당 0.1mL를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 배양하였고, 웰당 0.4mL 세척 완충제로 세척하였다. 0.1mL TMB 시약(Invitrogen)를 첨가하고 실온에서 1 내지 5분 배양하였다. 반응은 0.05 mL 1 N HCI을 첨가하여 종결시키고, 흡광도는 Bio-Tek Spectra으로 450nm에서 판독하였다. PD-L1에 대한 항-PD-L1 선도 항체에 대하여 계산된 EC50은 직접적인 ELISA에 의해 대부분 선도 항체가 우수한 결합 활성뿐만 아니라 MPDL3280A (Ref Ab)을 갖는 것을 나타내었다(도 6). 대조적으로, 대부분의 항-OX40 선도 항체는 참조 항체(Ref Ab, GSK3174998)(도 7)에 비하여 매우 낮은 결합 활성을 나타냈다.
FACS에 의한 PD-L1 및 OX40 특이적 IgG 선도 항체에 대한 결합 활성 결정
정제된 선도 항체(항-PD-L1 선도 항체 또는 항-OX40 선도 항체)는 또한 유세포 분석을 하여 PD-L1 또는 OX40 발현된 HEK293 세포와의 결합 활성을 결정하고 비교하였다. 도 8 및 9는 안정한 발현된 PD-L1 또는 OX40 HEK293 세포로 FACS로 지정된 것으로서 대응하는 선도 항체의 결합 활성을 나타낸다.
PD-L1 결합 활성을 시험하기 위하여 항-PD-L1 선도 항체로 염색된 PD-L1 안정한 발현 293 세포의 FACS 분석을 위하여, 안정한 발현 세포는 1μg/mL 정제된 항-PD-L1 선도 항체, 참조 항체(Ref Ab MPDL3280A) 또는 음성 대조군으로서 아이소타입 항체를 얼음 위에서 1시간 배양하였다. 세포를 3번 1xPBS로 세척하고 이후 추가 1 시간 동안 얼음 위에서 Alexa-488-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG (H+L) (Invitrogen Inc.)으로 배양하였다. 염색 후, 세포를 1x PBS으로 3번 세척하고, 1x PBS/2%FBS에서 재현탁하고 FACS Calibur (BD Biosciences, Inc.) 및 FlowJo (TreeStar, LLC)으로 분석하였다. 동일한 시나리오로, 도 9에서 안정한 발현된 OX40 HEK293 세포에 대해 항-OX40 선도 항체의 결합 활성은 유사한 전략으로 수행되고 상술한 것과 같이 분석되었다. 도 8에 도시된 바와 같이 대부분 항-PD-L1 선도 항체는 우수한 결합 활성뿐만 아니라 참조 항체를 갖는다. 이것은 OmniMab 라이브러리로부터 선택된 파지 클론이 세포 내에서 원래의 PD-L1를 인식한다는 것을 나타낸다.
이 현상은 또한 도 9에 도시된 바와 같이 항-OX40 선도 항체에 대해 관찰되었다. OX40 결합 활성을 시험하기 위하여 정제된 항-OX40 선도 항체로 염색된 OX40 안정한 발현 293 세포 클론 2D5의 FACS 분석, 안정한 발현 세포는 2μg/mL 항-OX40 참조 Abs (OX40 ref.) 또는 항-CD137 참조 Abs(CD137 ref.)가 대조군 항체로서 얼음 위에서 1시간 동안 배양되었다. 세포는 1xPBS로 3번 세척하고 이후 Alexa-488-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG(H+L)(Invitrogen Inc.)으로 얼음 위에서 추가 1시간 동안 배양하였다. 염색 후, 세포를 1xPBS로 3번 세척하고, 1x PBS/2% FBS에서 재현탁하고, FACS Calibur (BD Biosciences, Inc.) 및 FlowJo (TreeStar, LLC)으로 분석하였다.
리간드 경쟁 결합 (ELISA Assay)
선도 항체는 PD-1에 대한 PD-L1 의 결합을 차단하는 이들의 능력에 대한 본 발명의 항-PD-L1선도 항체를 평가하기 위하여 사용된 결합 선택성 및 친화도 분석을 나타냈다.
ELISA로 재조합 인간 PD-1 /His (hPD-1/His)에 대한 인간 PD-L1-Fc 키메라 (PD-L1-Fc)의 결합을 차단하는 항체의 능력에 대하여 시험하였다. 정제된 재조합 hPD-1/His (APBio)를 PBS 중 1mg/mL로 투석하고, PBS로 5 μg/mL까지 희석하였다.
Nunc Maxisorp 96 웰 플레이트는 PBS 중 웰 당 250 ng hPD-1/His으로 밤새 코팅되었다. hPD-1/His 용액을 제거하고, 플레이트는 0.4 mL 세척 완충제 (PBS 중 0.1 % Tween-20)로 3번 세척하였다. 0.4 mL 차단 완충제 (PBS 중 5% 저지방 우유 분말)를 모든 웰에 첨가하고 혼합하면서 1시간동안 실온에서 배양하였다. 차단 단계 동안, 항체 스톡을 PBS 중 200 nM 내지 0 nM의 범위로 2번 연속희석법으로 희석하였다. 정제된 재조합 PD-L1-Fc 키메라는 PBS 중 4 μg/mL까지 희석하였다. PD-1/His 코팅된 플레이트는 0.2 mL 세척 완충제 (PBS 중 0.1% Tween 20)으로 3번 세척하였다.
60μL 항체 희석액(항-PD-L1 선도 항체 또는 Ref Ab MPDL3280A)에 60 μL PD-L1-Fc 키메라를 단독으로 첨가하고 실온에서 1시간 배양되었다. 플레이트를 이전에 상술한 것처럼 세척하였다. 호스래디시 퍼옥시다아제 인간 IgG, Fc 특이적 항체를 PBS 중 1:2000으로 희석하고 얻어진 용액 100 μL을 상기 세척된 플레이트의 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 플레이트는 이전에 상술한 것처럼 세척하고, 100 μL TMB 기판 용액을 각 웰에 첨가하고 10분 동안 배양하였다. 반응은 50 μL 1 N HCI으로 종결되고, Bio-Tek reader을 사용하여 450nm에서 흡광도를 판독하고 이는 도 10에 보여졌다. 부분적인 선도 항체는 경쟁 ELISA로 PD-PD-L1 사이의 상호작용을 억제하는 것으로 나타났다. 대부분 선도 항체는 참조 항체(Ref Ab MPDL3280A)와 비교하여 유사한 차단 활성을 나타냈다.
항-PD-L1 항체에 대한 PD-1: PD-L1 리간드 상호작용의 억제에 의한 T 세포 활성화의 자극 증가.
PD-1 신호전달 경로는 중간 TCR/CD28 공동자극(moderate) 신호를 억제하고, 사이토카인 생성은 T세포 증식에서 감소없이 1차적으로 감소되었다. TCR/CD28 공동자극 신호가 약해짐에 따라, PD-1 경로가, 증식의 감소와 함께 사이토카인 생성의 큰 감소가 지배적이다. PD-L1과 상호작용의 억제를 통해 PD-1의 억제를 확인하기 위하여, 본 발명의 인간 항체는 T 세포 활성화를 증가시키고, 혼합된 림프구 반응(MLRs)가 수행되었다.
인강 전체 혈액의 단핵구는 RosetteSepTM Human Monocyte Enrichment Cocktail (Cat. No.15068)로 풍부해지고 분화 배지(differentiation medium), RPMI 1640와 10%FBS, 100 ng/mL (1000 U/mL) GM-CSF, 100 ng/mL (500 U/mL)에서 6일 동안 배양하였다. 단핵구의 차별적 수지상 세포(CD)는 DC-SIGN-PE으로 체크되고, FITC Ab으로 콘쥬게이트된 항-CD14, PE Ab로 콘쥬게이트된 항-CD83, 또는 FITC로 콘쥬게이트된 항-CD80에 의해 체크되어 분화를 입증하고 사용되어 MLR에서 APC가 되었다.
인간 전체 혈액의 타생 CD4+ T 세포가 RosetteSepTM Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail(Cat. NO. 15062)으로 분리되었다. CD4+T 세포의 순도는 항-CD4 콘쥬게이트된 APC Ab으로 체크되어 순도가 95% 이상이 되게 하였고 이후 T 세포 증식 분석을 위해 1uM CFSE (CellTraceTM CFSE 세포 증식 kit, Life technologies, Cat. NO. C34554)로 표지되었다. 표지된 CD4+ T 세포를 사용하여 3 및 5일 동안 표시된 것처럼 다른 선도 항체로 미숙한 DC와 공동 배양하여 선도 항체가 PD-1 및 PD-L1 사이의 상호 작용을 차단하는 것으로 T 세포 활성화를 부활시킬 수 있는 여부를 판단하였다. 3일 및 5일 배양 후, 상청액을 수집하여 ELISA로 사이토카인, 예를 들어 IL-2 및 INF-γ를 정량화하였다. 항-PD-L1 선도 항체(클론 6, 32, 28, 51 , 64, 27, 및 37)를 미숙한 수지상 세포 및 타생 T 세포의 배양액에 첨가하여, 아이소타입 IgG (iso#1 , #2) 처리 배양액에 비하여 T 세포 증식 및 사이토카인 생성의 증가 결과를 예측하고, 도 11A 및 11B에 보였다. IL-2 및 INF-γ 생성은 3일(도 11 A) 또는 5일(도 11 B) 항체 처리 후, 특히 항-PD-L1 항체클론 6에 대해 아이소타입 항체 처리에 비하여 MLR에서 크게 증가한다. 사이토카인 증가는 5일 항체 처리 후 명백하고 참조 항체 (ref), MPDL3280A와 유사하다. 이는 항-PD-L1 항체 클론 6은 이중특이성 항체 복합재에 대하여 잠재적 선도 항체들 중 하나이어야만 한다는 것을 나타낸다.
항-OX40 항체의 아고니스틱 활성 분석
T-세포 증식 및 사이토카인 생성의 OX40 공동자극을 활성화시키기 위하여, 정제된 선도 항체는 기능적으로 사이토카인 생성, 증식 및 인간 CD3+T-세포에서 증식을 유도하는 이들의 능력에 대하여 기능적으로 스크린되었다. 항-CD3 항체 (OKT3, BioLegend Cat. No.317304) 및 항-OX40 선도 항체(클론 B6, B70, B120, A4, B17, B19, 및 B30), 참조 항체 (GSK3174998) 또는 아이소타입 항체 (iso#1 , #2)는 Maxisorp 96-웰 플레이트으로 코팅되었다. 한편, 원래의 인간 CD3+T-세포는, 제조자의 설명에 따라 상업적으로 이용가능한 RosetteSepTM Human T Cell Enrichment Cocktail(STEMCELL Cat. No.15061)를 사용하여 건강한 성인 자원자들의 인간 혈액으로부터 분리되었다. 분리된 CD3+ T 세포는 CFSE (CellTraceTM CFSE 세포 증식 kit, Life technologies, Cat. NO. C34554)으로 표지되었고, RPMI 1640 배지, 10% 소태아혈청 및 2.5 mM L-글루타민을 포함하는 항체 사전-코팅된 웰 내로 1 X 106 세포/mL로 파종하여 세포 증식 및 사이토카인 생성을 결정하였다. 3일 배양 후, 세포를 수집하여 유세포 분석으로 증식 분석을 하고 배지를 이후 정량화 ELISA로 IL-2 및 INF-y 생성을 분석하였다.
T 세포 활성화에서 아고니스틱 활성을 갖는 항-OX40 선도 항체의 스크리닝은 도 12A에 보여진다. 모든 항-OX40 선도 항체는 복용량 반응뿐만 아니라 참조 항체로 CD3+T 세포 활성화를 증가시키는 능력을 나타내었다. 보다 높은 복용량 항체 처리는 명백하게 보다 높은 T 세포 활성화 활성을 나타내었다. 한편, 사이토카인 생성(도 12B), 예를 들어IL-2 및 INF-y는 또한 유사한 T 세포 활성화 반응을 밝혔으며, 특히 항-OX40 선도 항체 클론 B17에 대한 유사한 T 세포 활성화 반응을 밝혔다. 사이토카인은 항-OX40 선도 항체 B17 3일 처리 후 높게 유도되었다. 참조 항체 보다 더 매우 높게 증가하고, 이 관련된 클론 B17는 이중특이성 항체 구성에 대한 후보자들 중 하나이어야만 한다.
도 13A 및 13B에서 보여진 데이터로서, 항-OX40 선도 항체, 클론 B17 및 B19 모두는 항-OX40 선도 항체(B17 또는 B19) 3 일 처리 후 분석에서 보다 나은 아고니스틱 활성을 나타내었다. IL-2 생성 또는 IFN-γ 생성은 항체 처리시 명백한 증가를 나타내고 용량-연관 관련성을 나타내었다. 보다 높은 사이토카인 생성은 보다 높은 용량 항체 처리로 기록되었다.
OX40 선도 항체, B17 및 B19의 아고니스틱 활성을 평가하기 위하여, EC50가 또한 결정되었을 뿐만 아니라 아고니스틱 활성 분석 및 사이토카인 생성은 비교를 위하여 기록되었다.
항-PD-L1-OX40 scFv 항체의 구조, 발현 및 정제
이중특이성은 scFv 포맷으로 융합된 IgG 기반으로서 고안되었기 때문에, 항-면역 체크포인트 항체 Fc 말단의 구조는 OX40 scFv와 융합된다. 항체는 억제적 항-면역 체크포인트 항체, 예를 들어 항-PD-L1, 항-PD-1, 항-CTLA4, 항-LAG3 등, 또는 자극적 항체, 예를 들어 항-CD28, 항-CD137, 항-CD27, 항-ICOS 등일 수 있다. 링커는 항체 Fc 및 OX40 scFv 사이에 놓여 도 14에 도시된 이중특이성 항체를 생성한다.
일부 실시예에서, 항-PD-L1 선도 항체 클론 6은 IgG 형태로 할당되고, 다른 한편 항-OX40 선도 항체는 scFv 포맷으로 변형되어 항-PD-L1 선도 항체 클론 6에서 Fc 영역의 C-말단에서 융착할 것이다. 항체에서 scFv 포맷으로 형질전환의 결과는 결합 활성 또는 특이성의 감소가 될 것이므로; 몇 가지 항-OX40 선도 항체가 scFv 형질전환에 사용되었다. 이중기능적 항-PD-L1 항체 Fc의 구조는 완전한 길이 OX40 scFv와 융합되었다(클론 A4로서 SEQ ID NO. 10, 클론 B17로서 SEQ ID NO. 11, 클론 B19로서 SEQ ID NO. 12, 또는 클론 B 120으로서 SEQ ID NO. 13). 짧고 유연한 펩타이드 링커, (GGGGS)2 (SEQ ID NO. 14)를, 예를 들어 Fc 영역의 항-PD-L1 항체 중사슬 C-말단들 및 OX40 scFv의 N-말단 모듈 사이에 놓아 정확한 폴딩을 확보하고 입체 장애를 최소화하였다. 항-PD-L1-OX40 scFv 항체의 코딩 시퀀스는 SEQ ID NO. 16(항-PD-L1 -클론 6 중사슬-OX40 클론 B17 scFv) 및 NO. 17 (항-PD-L1 -클론 6 중사슬-OX40 클론 B19 scFv)에 보여진다. 구성된 항체 Fc 융합 단백질은 신호 펩타이드 (SEQ ID NO. 15)에 의해 인도되고, 포유류 세포에 의해 발현되고, 감염된 세포 배양 상청액으로부터 1-단계 단백질 G 크로마토그래피를 통해 정제되었다. 도 15에 보여진 것처럼 90% 이상의 순도가 단일 단계 정제 공정으로 얻어지며, 정제된 융합 단백질이 정확한 분자량(Mw=220kD)를 갖는다는 것을 나타낸다.
MLR 중 항-PD-L1-OX40 scFv 이중특이성 선도 항체에 대한 T 세포 활성화의 자극 증가
PD-1 및 PD-L1 사이 상호작용의 방지를 통한 T 세포 활성화 및 OX40 신호 전달의 아고니스틱 활성화를 증가시키는 이중특이성 항체의 시너지 협력을 결정하기 위하여, 이중특이성 선도 항체, 항-PD-L1-OX40 scFv는, 상술한 바와 같이 MLR 내로 도입되었다. IL-2 및 INF-γ 생성은 3 또는 5일 항체 처리 후 기록되었다. 모노-, 조합 또는 이중특이성 항체는 동일 또는 동등 몰로 적용되어 T 세포 활성화 증가에서 시너지 효과를 비교하고 아이소타입 IgG가 음성 대조군으로 사용되었다. 도 16A 및 16B에 보여진 데이터로서, 참조 항체, MPDL3280A뿐만 아니라 항-PD-L1 선도 항체 단독을 3일 처리 후 중요한 IL-2 유도를 나타냈고, 대조적으로 항-OX40 선도 항체는 항체 처리 3일 또는 5일 후 사이토카인 생성의 상향 조절이 명백하게 증가할 수 없었다. 이는 참조 항체, GSK3174998와 일치한다. 그러나, 항-OX40 항체 및 항-PD-L1 항체의 조합은, 항체 처리 3일 및 5일 후 사이토카인 생성에 큰 상향 조절을 나타냈다. 시너지 효과는 또한 이중특이성 선도 항체 처리에서 관찰되었고 사이토카인 생성의 증가는 조합 처리와 마찬가지로 유사하다. 이는 항-PD-L1-OX40 scFv 이중특이성 선도 항체가 또한 scFv 형질 전환에서 어떠한 결합 활성의 손실도 없이 항체 조합 처리와 같이 기능한다는 것을 나타냈다.
이중특이적 항체의 응집 및 순도 결정
정제된 항-PD-L1 -클론 6-OX40 클론 B17 scFv Ab는 단일 컬럼 단백질 A 크로마토그래피 정제 후 SEC-HPLC 분석에 의하면 낮은 순도(74.07%)을 나타내기 때문에, 몇가지 항체 변이체가 발생하여 순도를 개선하고 이중 특이성 항체를 위한 응집을 본 발명에서는 줄인다. 상기 링커는 상술한 것처럼 상기 이중특이성 항체, 항-PD-L1-OX40 Ab (SEQ ID NO. 16)의 OX40 B17 scFv에서 링커를 교체하는데 사용되고, CHO 세포에서 항-PD-L1-OX40 Ab-V1 내지 V4 (SEQ ID NO. 18 내지 SEQ ID NO. 21)로서 제조되었다. 이들 변이체는 이후 정제되고 XBridge 단백질 BEH SEC-HPLC column (Waters, Cat. No.186007640)으로 분석되었다. 상기 데이터는 이하 표 1에서처럼 요약되고, 이중특이성 항체 변이체들 중 하나인 항-PD-L1-OX40 Ab-V4는 항체 순도를 크게 개선한 것으로 밝혀졌다. 순도는 74.07 내지 92.27%으로 증가되었다. 그러므로, 항-PD-L1-OX40 Ab-V4가 가공에 사용되어 항체 순도를 더 개선하였다.
OX40 B17 scFv에서 다른 링커
약어 중사슬/경사슬 OX40 B17 scFv의 링커 참조문헌
항-PD-L1-OX40 Ab 항-PD-L1-6-OX40 B17 scFv-L1 HC/항-PD-L16LC GGGGSGGGGSGGGGS
(SEQ ID NO: 39)		 Int. J. Mol. Sci.2014, 15(12)23658-23671
항-PD-L1-OX40 Ab-V1 항-PD-L1-6-OX40 B17 scFv-L2 HC/항-PD-L16 LC SSGGGGSGGGGGGSS
RSSL(SEQ ID NO:40)		 없음
항-PD-L1-OX40-Ab-V2 항-PD-L1-6-OX40 B17 scFv-L3 LC/항-PD-L16 LC GGKGSGGKGTGGKGSGGKGS(SEQ ID NO: 41) Virol J. 2008; 5:21
항-PD-L1-OX40 Ab-V3 항-PD-L1-6-OX40 B17 scFv-L4 HC/항-PD-L16 LC GSASAPTLFPLVS(EQ ID NO: 42) DOI:
10.3892/mmr. 2013.1502
항-PD-L1-OX40 Ab-V4 항-PD-L1-6-OX40 B17 scFv-L5 HC/항-PD-L1 6LC GSTSGSGKPGSGEGSTK
(SEQ ID NO: 43)		 PMID:
8309948
이중특이성 항체의 크기 분포의 특성화를 위하여, 샘플들을 Waters Alliance 2695 Separations Module을 사용하는 XBridge Protein BEH SEC-HPLC column (Waters , Cat. No.186007640)에 부하시켰다. 단백질 피크를 Water 2996 PDA Detector을 사용하여 280nm에서 검출하였다. 이동상은 등용매 25 mM 소듐 포스페이트 (Sigma, Cat. No.04272 및 Cat. No.04269)와 200 mM NaCI (AMRESCO, Cat. No.0241 )이고, pH 6.8, 0.4 mL/min의 흐름 속도이었다. 피크 퍼센트는 도 17A 내지 17E에 보여진 피크 면적의 일부에 의해 결정되었다.
항-PD-L1-OX40 Ab-V4는 순도가 크게 개선된 것을 나타냈다(도 17E). 이중특이성 항체는 OX40 B17 scFv 단편에서 더 가공되어 순도를 다시 개선하였다. 도 18에 보여진 OX40 B17 scFv에서 몇가지 잔기는 다른 아미노산으로 치환되고, 중사슬 변이체가 항-PD-L1 클론 6 경사슬과 쌍을 이루어 몇가지 이중특이성 항체 변이체, 항-PD-L1-OX40 Ab-V5 내지 V12 (SEQ ID NO. 22 to SEQ ID NO. 29)를 생성하고, 이후 상술한 것처럼 발현되고 정제되었다. 이중특이성 항체 변이체의 순도는 이하 표 2에 요약되었고, 항-PD-L1-OX40 scFv-V5는 이들 항체 변이체내에서 가장 우수한 순도를 나타냈다. 상기 순도는 96.46%까지 올라갔다. 이것은 가공된 이중특이성 항체에 대해 매우 우수한 순도를 나타내고, 또한 미래에 이중특이성 항체에 대하여 우수한 개발능력을 나타내었다. 도 19에 보여진 것처럼, 항-PD-L1-OX40 Ab-V5의 온전성은 또한 SDS-PAGE에 의해 분석되었고 환원 및 비환원 조건하에서 우수한 온전성을 나타내었다.
항체의 순도
항체 SEC-HPLC(%)에 의한 순도
항-PD-L1-OX40 Ab-V4 92.27
항-PD-L1-OX40 Ab-V5 96.46
항-PD-L1-OX40 Ab-V6 86.36
항-PD-L1-OX40 Ab-V7 88.04
항-PD-L1-OX40 Ab-V8 90.00
항-PD-L1-OX40 Ab-V9 87.89
항-PD-L1-OX40 Ab-V10 86.56
항-PD-L1-OX40 Ab-V11 86.61
항-PD-L1-OX40 Ab-V12 84.78
한편, 가공된 이중특이성 항체 변이체는 또한 도 20에 도시된 것처럼 직접적인 ELISA에 의해 인간 PD-L1 및 OX40에 대해 결합 활성 평가를 위해 적용되었다. 지정된 것처럼 모든 이중특이성 항체 변이체는 인간 PD-L1에 대하여 동일한 결합 활성을 나타냈고(도21), 이 결합 활성은 항-PD-L16 항체와 유사하다. 이 현상은 또한 인간 OX40 결합 분석(도 22)에서 관찰되었다. 단지 항-PD-Ll -OX40 Ab-VIO은 다른 변이체에 비하여 인간 OX40에 대하여 약한 결합 활성을 나타내었다. OX40 scFv의 가공은 OX40 결합 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냈다. 결합 활성은 PD-L1 또는 OX40에 대하여 유지된다. 항-PD-Ll-OX40 Ab-V5이 PD-L1 및 OX40에 대한 우수한 항체 순도 및 결합 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌기 때문에 항-PD-L1-OX40 Ab-V5가 혈청 안정성을 위하여 선택되었다.
Ex vivo 혈청 안정성
안정성은 다음 관련된 임상 전 종들의 혈청뿐만 아니라 인간 혈청(BioreclamationlVT, Cat. No.HMSRM)에서도 평가되었다: 레소스 원숭이 (BioreclamationlVT, Cat. No.RHSSRM), 및 CD1 마우스(BioreclamationlVT, Cat. No.MSESRM). 샘플들을 15g/mL의 최종 농도로 다른 종 혈청들 내로 첨가하고 37℃ 수조에서 배양시켰다. 혈청 샘플들은 0, 1, 2, 3, 7, 10 및 14일의 배양 시간 후 수집되고 분석까지 -80℃에서 냉동저장되었다.
정량화 샌드위치 ELISA
OX40-Fc는 PBS 중 1μg/mL의 농도로 100μL으로 ELISA 플레이트(NUNC, Cat. No.442404) 내로 코팅되고 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척 완충제는 0.1% Tween-20 (Sigma, Cat. No.P2287-500mL)으로 PBS로 제조되었고, 차단 완충제는 세척 완충제 중 1% BSA (UniRegion, Cat. NO.UR-BSA001-100G)으로서 제조되었다. 혈청 샘플을 차단 완충제 중 3x연속 희석법으로 10-배 희석액으로 제조되고, 표준은 차단 완충제 중 3x 연속 희석법으로 10nM으로 제조되었다. 비오티닐화된 PD-L1-Fc는 표준 프로토콜을 사용하여 Biotin Fast conjugation Kit (abeam, Cat. No.ab201796)으로 표지되었고 차단 완충제 중에서 30nM로 제조되었다. 스트렙트아비딘-HRP (abeam, Cat. No.ab7403)가 차단 완충제 중 1 μg/mL으로 제조되었다. 모든 샘플들을 플레이트를 세척 완충제로 3번 세척한 후 각 웰에 100 μL로 첨가되고, 주위 온도에서 1 시간 동안 배양되었다. 100 μL TMB 용액 (Invitrogen, Cat. No.00-2023)으로 2min 동안 TMB 개발 및 100μL 1 N HCI 용액(Merck, Cat. No.1.00317.1000)으로 종결하였다. O.D. 450 nm 흡광은 ELISA 리더(Biotek, Powerwave XS)으로 판독하였다.
항-PD-L1-OX40 Ab-V5는 PD-L1 및 OX40에 대한 우수한 순도 및 결합 활성 때문에 ex vivo 혈청 안정성을 위해 선택되었다. 정제된 이중특이성 항체를 다른 종들, 예를 들어 인간 마우스, 또는 원숭이의 혈청과 혼합하였다. 몇 일 배양 후, 샘플을 가지고 샌드위치 ELISA로 분석하여 항체 함량을 결정하였다. 도 23에 보여진 바와 같이, 항-PD-L1-OX40 Ab-V5는 37℃에서 14일 후 우수한 혈청 안정성을 나타냈다. 항체 농도는 여전히 인간, 마우스 또는 원숭이에서 70% 이상이다. 항체는 또한 우수한 혈청 안정성을 갖는다는 것을 나타낸다.
T 세포 민감성을 조절하는 항-PD-L1-OX40 Ab-V5의 능력을 측정하기 위하여, 정제된 T 세포를 타생 수지상 세포로 배양하고, 몇 일 동안 GM-CSF 및 IL-4에서 단핵구를 배양하여 제조될 것이다. 평행 플레이트를 설정하여 3일 및 5일에서 상청액의 수집으로 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 각각 IL-2 및 IFN-γ을 측정하였다. 도 24A 및 24B에서 보여진 데이터로서, IL-2 및 INF-γ 생성은 3일 또는 5일 항체 처리 후 이중특이성 항체 처리(V5)뿐만 아니라 조합 처리에서 높게 상향조절된다.
또한, 항-PD-L1 Ab 또는 항-OX40 Ab 처리 단독보다 매우 우수한 증가가 나타났다. 이것은 가공된 이중특이성 항체, V5는 기능성 손실없이 조합 처리와 마찬가지로 아고니트틱 활성을 갖고 미래에 다양한 고형 종양 또는 암에 대한 치료적 항체로서 개발될 수 있다는 것을 암시한다.
이중특이성 항체 (In vivo 모델)의 항종양 활성
이중특이성 항체에서 PD-L1 및 OX40의 설치류 교차 반응성의 결핍은, 표준 쥐과 시너지 또는 인간 이종이식 종양 모델을 항체의 항-인간 종양 효능의 평가를 하는데 사용하는 것을 방지하였다. 따라서, 새로운 huPBL-SCID-Bg 이종이식 종양 마우스 모델은 SCID-Bg 마우스 (CB.17/lcr.Cg Pkrdc^Lyst^/Crl)을 사용하여 제조되고, 이는 베이지색(Bg) 돌연변이 결핍 쥐과 T 및 B 림프구 및 기능적 NK 세포를 고정한다. 이중특이성 항체의 항-인간 종양 효능은 이하 설명된 것과 같이 이 모델을 사용하여 평가되었다.
PC-3 인간 전립선은 American Type Culture Collection에서 얻어졌고, L-글루타민, 소듐 피루베이트, 페니실린/스트렙토마이신, 및 10% 열 불활성화된 소태아혈청(FBS, Gibco Cat. NO. 10437)으로 RPMI-1640 (Invitrogen)에서 배양되었다. 세포는 T-150 Falcon flask에서 합류지점으로 성장되었다. 연속적으로, 세포를 트립신화하고(Trypsin 0.25%-EDTA; Invitrogen), 접종에 충분한 세포 수의 규모까지 성장되었다. 말초 혈액 림프구(PBMCs)는 제조자의 프로토콜(SETMCELL Technologies Inc.)에 따라 LymphoprepTM을 사용하여 헤파린화한 혈액으로부터 분리되었다. 계수된 세포 현탁액은 각 마우스에 0.1mL의 PBS중 1 볼루스 주사에 0.75 x 106 PBMCs 및 3 x 106 종양 세포 주사를 받도록 조합되었다. 마우스에서 종양 세포 성장이 용이하게 하기 위하여, 또 다른 0.1mL 매트리젤이 조합된 세포 현탁액과 혼합되고 이후 바로 제조 마우스에 주사되었다.
각 마우스에 대하여, 0.2mL 부피의 조합된 세포 현탁액이 동물의 오른쪽 옆구리 내로 피하 주사되었다. 14일 접종 후, 고형 종양이 형성되고 약 250 내지 300 mm3에 도달하였고, 이중특이성 항체(3 mg/kg의 항-PD-L1-OX40 Ab-V5), PD-L1 참조 항체 (Ref Ab, MPDL3280A) 또는 대조군 항체 (아이소타입)는 주당 2번 3주 동안 복강내 주사(i.p.)로 접종하였다. 종양 측정은 주당 2번 Pressier caliper을 통해 만들어졌고, 실험 동안 시험 샘플 투여하고 체중이 또한 기록되었다. 종양 부피는 다음 계산법을 사용하여 계산되었다: 길이 x 폭2 x 0.44= 부피 (mm3) 및 도 25에 플로팅하였다. 마우스는 실험 종결 전에 종양 부피가 2000 mm3에 도달하거나 또는 체중의 20%가 손실되면 실험을 중단하고 연구에서 제거하였다. 유사 결과는 종양이 접종 7일 후 측정될 때 관찰되었고, 동물들을 종양 부피에 따라 부작위화하였다. 동물 연구에서, 각 집단은 6 마우스를 포함한다. 도 25에 보여진 데이터로서, 이중특이성 항체는 PC-3 이종이식된 마우스 모델에서 커다란 항종양 효율을 나타냈다. 종양 크기는 PD-L1 참조 항체와 마찬가지로 종양 접종 후 18일에 줄어들었고, 계속해서 100mm3 이하로 줄었다. PC-3 이종이식 마우스 모델은 일차적으로 이중특이성 항체의 항종양을 나타내고 미래에 치료적 선도 약물이라는 잠재성을 밝혔다.
수집적으로, 이들 결과는 이중특이성 항체는 PD-1/PD-L1 신호 전달에서 면역 체크포인트 및 OX40 신호전달에 대한 아고니스틱 활성을 지속시킨다는 것을 나타냈다. 적당한 동물 모델, 예를 들어 인간화된 NOD.Cg-Prkdcscid ll2rgtmlwjl/SzJ (NSG) 모델에서 PC-3 종양을 사용하여 이들 단백질의 생물학적 활성을 더 조사하는 연구가 진행중이다. 본 발명에서 Fc 영역은 임의의 면역글로불린 아이소타입, 서브클라스, 알로타입, 또는 가공된 돌연변이, 예를 들어 노브(knob) 및 홀(hole) Fc 단편(들)의 것일 수 있다.
실시예
이하 실시예는 인간 PD-L1 및 OX40을 표적하는 치료 목적에 적당한 단일클론 항체의 제조를 설명한다. 복합재, 인간 항- 인간 PD-L1 및 항-OX40 항체는 항-PD-L1 항체 클론 6 및 항-OX40 항체 클론 B17으로부터 각각 발생되었다. 인간 V 영역 시퀀스의 세그먼트는, 관련없는 인간 항체(생식계열 및 비생식계열)시퀀스 데이터베이스의 원료이다.
실시예 1 PD-L1 및 OX40에 결합하는 IgG 항체의 제조
본 발명에 의해 제공된 특정 항체는 인간 PD-L1 또는 OX40에 결합하는 Fabs에서 원래 발생되었다. 인간 대응하는 단백질을 발현하는 세포(PD-L1 또는 OX40) 및 대응하는 Fc 융합 단백질(PD-L1-Fc 또는 OX40-Fc)에 대한 교차 패닝(alternating panning)을 따라, 파지 디스플레이 라이브러리, OmniMab 파스미드 라이브러리로부터 Fabs가 선택된다. 직접적인 ELISA 또는 세포-기반 ELISA 스크리닝 후, 양성 클론은 중사슬 및 경사슬에 대해 시퀀싱되었다. 이들 Fabs는 PD-L1에 대해 "OM-PD-L1-6", 및 "OM-PDL1-32" 등; OX40에 대해 "OM-OX40-A4", "OM-OX40-B17"," 및 "OM-OX40-B19" 등으로 지정된 것들을 포함하였다. 본 출원에 개시된 PD-L1 항체 PD-L1-클론 3, PD-L1-클론 6, 및 PD-L1 -클론 32는 "OM-PD-L1-6" 및 "OM-PDL1-32"로부터 생성되었다. 한편, 본 출원에 개시된 OX40 항체 OX40-A4, OX40-B17, 및 OX40-B19는 HEK293 세포 또는 CHO-S 세포에서 "OM-OX40-A4", "OM-OX40-B17", 및 "OM-OX40-B19"로부터 생성되었다. PD-L1 및 OX40을 동시에 표적하는 이중특이성 항체는 항-PD-L1 6-OX40 scFv B17 항체 및 항-PD-L1 6-OX40 scFv B19 항체으로 고안되었다. 주어진 Fab의 경사슬 가변영역 및 중사슬 가변영역의 아미노산 시퀀스는 경사슬 가변영역 및 중사슬 가변영역 각각의 아미노산 시퀀스와 동일하다.
실시예 2 대응하는 표적에 대한 항-PD-L1-OX40 scFv의 인비트로 결합
항-PD-L1-OX40 이중특이성 항체는 도 13에 보여진 바와 같이 구성되고 HEK293 세포 또는 CHO-S 세포에서 발현되었다. 이중특이성 항체를 포함하는 배지는 단백질 G 크로마토그래피로 배양 상청액으로부터 친화도 정제되었다. 정제된 항체는 이후 농축되고, PBS 완충제로 투석하고 도 14에서 보여진 SDS-PAGE로 분석되었다. ELISA의 PD-L1 또는 OX40에 대한 정제된 융합 단백질의 직접적인 결합을 시험하기 위하여, 100ng/웰 재조합 PD-L1 또는 OX40는 96-웰 ELISA 플레이트 내에 코팅되었다. 다양한 농도의 정제된 항-PD-L1-OX40 scFv를 각 웰에 첨가하고 1hr 동안 배양하였다. 세척 후, 1:5000 희석으로 항-Fab HRP 콘쥬게이트 (Jackson Immunochemicals)를 각 웰에 첨가하고 추가 1 시간 동안 배양하였다. 최종 세척 후, TMB 기판(Invitrogen Inc.)을 첨가하고, 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 데이터는 GraphPad Prism 5를 사용하여 S자 곡선 핏팅으로 분석되었고, EC50이 계산되었다.
실시예 3 FACS 분석으로 항-PD-L1-OX40 scFv의 항원 결합 특이성
항-PD-L1-OX40 scFv 항체 결합 특이성을 시험하기 위하여, 안정한 PD-L1 발현 293 세포, IFN-γ 자극된 A549 또는 WiDr를 얼음 위에서 1hr 동안 1μg/mL 항-PD-L1-OX40 scFv 항체로 염색하고 1 x PBS로 3번 세척했다. 결합된 항체 융합 단백질은 Alexa-488 콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG (H+L)으로 검출되고, FACS 분석을 하였다. 아이소타입 항체는 시험을 위해 음성 대조군으로서 사용되었다. 결과들은 항-PD-L1-OX40 scFv가 항-PD-L1 단독인 경우에 비하여 이의 항원 결합 특이성을 유지하는 것을 나타냈다. 항-PD-L1-OX40 scFv 항체의 결합 특이성은 또한 안정한 OX40 발현 293 세포를 사용하여 또한 시험되었다.
실시예 4 2기능성 단백질의 인비트로 면역조절 효과
T 세포 민감성을 조절하기 위한 항-PD-L1-OX40 scFv 항체의 안정성을 측정하기 위하여, 정제된 T 세포는 타생 수치상 세포로 배양될 것이며, 이는 몇 일 동안 GM-CSF 및 IL-4에서 단핵구를 배양하는 것으로 제조되었다. 평행 플레이트를 3일 및 5일에 상청액을 수집할 수 있게 세팅하고 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 IL-2 및 IFN-Γfmf 각각 측정하였다. Genentech/Roche's 인간화된 항-PD-L1, MPDL3280A는 내부에서 제조되고 양성 대조군으로 사용될 것이다. 도 15에 도시된 데이터로서, 3 또는 5일 항체 처리 후 조합 처리와 같이 이중특이성 항체 처리로 매우 높게 상향조절된다. 특히, 항-PD-L1 항체 클론 6 및 항-OX40 항체 클론 B17(항-PD-L1-OX40 scFv B17 Ab) 또는 조합(항-PD-L1 클론 6 Ab 및 항-OX40 클론 B17 Ab)에 의해 복합체화된 이중특이성 항체는, T 세포 활성화의 증가가 PD-L1 및 OX40 참조(PD-L1 Ref Ab 및 OX40 Ref Ab)의 조합보다 높다는 것을 보여줬다. 이는 항-OX40 B17 항체는 특정 에피토프 결합을 가져 그 결과 참조 OX40 항체, GSK3174998에 비하여 보다 우수한 아고니스틱 활성을 가져올 것이다.
실시예 5 이중특이성 항체 인비보로 유도된 인간 백혈구 팽창
쥐과 PD-L1 또는 OX40과 PD-L1 또는 OX40 항체의 검출가능한 교차 반응성의 결핍 및 인간 면역 세포의 존재에 대한 필요성은 이중특이성 항체의 인비보 기능성 평가에 대한 모델의 개발을 필요로 한다. IL-2 수용체 공통 감마 사슬(보통 NSG 말단)에서 결핍성 및 심각한 조합된 면역결핍성(SCID) 돌연변이를 수반하는 NOD 유전적 배경을 갖는 마우스는, 수 많은 인간 말초 혈액 백혈구(huPBL)의 생착을 지지하고 적어도 30일 동안 생착을 유지시킬 수 있다(King et al., 2008). 이 마우스 모델은, 또한 huPBL-NSG 모델로서 알려져 있고, 인간 면역 세포의 항체의 인비보 시스템적 투여의 기능적 효과를 평가하기 위하여 사용되었다.
특이적으로, 6 백만의 새롭게 분리된 인간 PBMCs는 huPBL-NSG 마우스에 정맥주사를 통해 이동되었다. PBMC 주사 9일 후, 동물들에게 복강내주사를 통해 한번 1 mg/kg 용량의 모노-항체, 이중특이성 항체 또는 lgG4 아이소타입 대조군 항체를 투여하였다. PBMC 생착 후 24 내지 28일에, PBMC를 유세포분석을 통해 평가된 인간 및 쥐과 CD45에 대한 항체로 염색하였다. 전방 및 측면 산란 프로파일을 사용하여 림프구 게이트를 결정하였다. 이중특이성 항체는 인간 백혈구의 팽창을 증가시킬 수 있었으며, 이는 생착된 마우스의 말초 혈액에서 인간 CD45+ 세포 부분의 증가로 증거되었다. 각 집단에 대해, n ≥ 6 마우스.
실시예 6 항-PD-L1-OX40 scFv 항체에 의해 huPBL-NSG에서 PC-3 또는 A498 종양 세포 성장의 억제
PD-L1 양성 인간 전립선 암 세포주, PC-3 (ATCC# CRL-1435) 또는 신장암 세포주, A498 (ATCC® HTB-44TM)를 사용하여 huPBL-NSG 마우스에서 이종이식 모델을 설립하였다. 종양 형성에 대해, 3 x 106 PC-3 세포(또는 A498 세포) /마우스는 상술된 것처럼 huPBL-NSG 마우스에서 피하로 주사될 것이다. 종양 성장에 대한 억제 효과를 평가하기 위하여, 다른 농도의 항-PD-L1-OX40 scFv 항체, 참조 항체, 또는 아이소타입 항체를 0.1-3 mg/kg으로, 종양 세포 이식 14일 후 마우스에 4주 동안 주당 2번 정맥 주사로 투여할 것이다. 종양 성장은 Fox Chase SCID®Beige 마우스 모델에서 설명된 것처럼 5주까지 주당 2번 측정될 것이다.
실시예 7 마우스 및 원숭이에서 항-PD-L1-OX40 scFv의 약동학적 평가
10~40mg/kg의 이중기능성 단백질, 항-PD-L1-OX40 scFv은 피하주사 또는 정맥주사를 통해 마우스 또는 원숭이 내로 투여될 것이다. 혈청 샘플은 15일까지 주사 후 다른 시간점에서 취해질 것이다. 혈청 샘플 내 Fc 융합 단백질의 농도는 샌드위치된 ELISA 분석을 사용하여 결정될 것이다.
본 발명이 이의 특정 실시예를 참조로 보다 상세히 설명되었지만, 다른 실시예들도 가능하다. 그러므로 첨부된 청구범위의 기술적 사상 및 범위는 여기 포함된 실시예의 설명으로 제한되어서는 안 된다. 다양한 변형 및 수정은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 구조에 따라 만들어질 수 있다는 것이 통상의 기술자들에게 명백하다. 상술한 관점에서 본 발명은 다음 청구범위이 범위 내에 들어가도록 본 발명의 변형 및 수정을 포함하고자 하는 것이다.
<110> HER, JENG-HORNG <120> MONOSPECIFIC AND BISPECIFIC PROTEINS WITH IMMUNE CHECKPOINT REGULATION FOR CANCER THERAPY <130> IP2074TW <150> US 62/611,543 <151> 2017-12-29 <160> 43 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Trp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 145 150 155 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Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Thr Met His Trp Val 165 170 175 <210> 35 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-PD-L1-OX40 Ab-V9 <400> 35 Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Val 1 5 10 15 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg 20 25 30 Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Leu Glu Ser Lys Ile Val Ser Trp Tyr 35 40 45 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Phe Tyr Asp Thr 50 55 60 Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly 65 70 75 80 Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala 85 90 95 Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Asn Ser Asp His Val Val Phe 100 105 110 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly 115 120 125 Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val 130 135 140 Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 145 150 155 160 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Thr Met His Trp Val 165 170 175 <210> 36 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-PD-L1-OX40 Ab-V10 <400> 36 Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Val 1 5 10 15 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg 20 25 30 Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Leu Glu Ser Lys Ile Val Ser Trp Tyr 35 40 45 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Phe Tyr Asp Thr 50 55 60 Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly 65 70 75 80 Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala 85 90 95 Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Asn Ser Asp His Val Val Phe 100 105 110 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly 115 120 125 Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val 130 135 140 Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 145 150 155 160 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Thr Met His Trp Val 165 170 175 <210> 37 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-PD-L1-OX40 Ab-V11 <400> 37 Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Val 1 5 10 15 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Thr Pro Gly Glu Thr Ala Arg 20 25 30 Ile Ala Cys Gly Gly Asn Asn Leu Glu Ser Lys Ile Val Ser Trp Tyr 35 40 45 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Phe Tyr Asp Thr 50 55 60 Asp Arg Pro Ser Gly Ile Ser Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly 65 70 75 80 Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala 85 90 95 Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Asn Ser Asp His Val Ile Phe 100 105 110 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly 115 120 125 Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val 130 135 140 Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 145 150 155 160 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Thr Met His Trp Val 165 170 175 <210> 38 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-PD-L1-OX40 Ab-V12 <400> 38 Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Val 1 5 10 15 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Thr Pro Gly Gln Thr Ala Arg 20 25 30 Ile Ala Cys Gly Gly Asn Asn Leu Glu Ser Lys Ile Val Ser Trp Tyr 35 40 45 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Phe Tyr Asp Thr 50 55 60 Asp Arg Pro Ser Gly Ile Ser Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly 65 70 75 80 Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala 85 90 95 Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Asn Ser Asp His Val Ile Phe 100 105 110 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly 115 120 125 Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val 130 135 140 Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 145 150 155 160 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Thr Met His Trp Val 165 170 175 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 39 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 40 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 40 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg 1 5 10 15 Ser Ser Leu <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 41 Gly Gly Lys Gly Ser Gly Gly Lys Gly Thr Gly Gly Lys Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Lys Gly Ser 20 <210> 42 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 42 Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 43 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly

Claims (28)

  1. 다음을 포함하는 OX40(CD134)에 대한 항체 또는 이들의 항원-결합 부분:
    SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 10의 아미노산 126-244, 및 SEQ ID NO. 13의 아미노산 123-240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 약 80% 시퀀스 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO. 5의 아미노산 1-108, SEQ ID NO. 7의 아미노산 1-108, SEQ ID NO. 10의 아미노산 1-112, 및 SEQ ID NO. 13의 아미노산 1-103으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 항원-결합 부분은 SEQ ID NOs. 10, 11, 12, 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 단쇄가변분절(scFv) 시퀀스인, 항체 또는 이들의 항원-결합 부분.
  3. 제1항에 있어서, 항체 또는 이들의 항원-결합 부분이 이중특이성 항체인 항체 또는 이들의 항원-결합 부분.
  4. 제3항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 면역 체크포인트 단백질 결합 사이트를 포함하는 항체 또는 이들의 항원-결합 부분.
  5. 제4항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 단백질 결합 사이트는 세포예정사 단백질 1 리간드(PD-L1) 결합 사이트, PD-1 결합 사이트, 상피세포 증식인자수용체 (EGFR) 결합 사이트, 인간 상피세포 증식인자수용체 2(HER2) 결합 사이트, 세포독성 T-림프구-관련된 항원 4(CTLA-4) 결합 사이트, 또는 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3) 결합 사이트를 포함하는 항체 또는 이들의 항원-결합 부분.
  6. 다음을 포함하는 PD-L1에 대한 항체 또는 이에 결합하는 이들의 항원-결합 부분:
    SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 4으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 도메인; 및
    SEQ ID NO. 1의 아미노산 1-111 및 SEQ ID NO. 3의 아미노산 1-110으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스의 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 도메인.
  7. 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이중특이성 항체로서, 상기 폴리펩티드 사슬이 다음을 포함하는 이중특이성 항체:
    다음을 포함하는 OX40 결합 사이트:
    SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, 아미노산 SEQ ID NO. 10의 아미노산 126-244, 및 SEQ ID NO. 13의 아미노산 123-240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 약 80% 시퀀스 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO. 5의 아미노산 1-108, SEQ ID NO. 7의 아미노산 1-108, SEQ ID NO. 10의 아미노산 1-110 및 SEQ ID NO. 13의 아미노산 1-107으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 대해 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 영역; 및
    다음을 포함하는 PD-L1 결합 사이트:
    SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 4으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스에 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 중사슬 가변 도메인; 및
    SEQ ID NO. 1의 아미노산 1 -111 및 SEQ ID NO. 3의 아미노산 1 -110으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스의 적어도 약 80% 상동성의 아미노산 시퀀스를 포함하는 경사슬 가변 도메인.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬이 다음을 더 포함하는 이중특이성 항체:
    Fc 도메인;
    상기 Fc 도메인의 N-말단에 연결된 Fab 단편으로서, 상기 PD-L1 결합 사이트를 포함하는 Fab 단편; 및
    Fc 도메인의 C-말단에 연결된 scFv으로서, OX40 결합사이트를 포함하는 scFV.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리펩티드 사슬이 Fc 도메인 및 scFv 사이에 링커를 더 포함하는, 이중특이성 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 scFv는 SEQ ID NO. 18의 아미노산 455-707, SEQ ID NO. 19의 아미노산 455-708, SEQ ID NO. 20의 아미노산 455-701, SEQ ID NO. 21의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 22의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 23의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 24의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 25의 아미노산 455-706, SEQ ID, NO. 26의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 27의 아미노산 455-706, SEQ ID NO. 28의 아미노산 455-706, 및 SEQ ID NO. 29의 아미노산 455-706로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 이중특이성 항체.
  11. 제7항에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 한쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이중특이성 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY 항체인 이중특이성 항체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 IgG 항체인 이중특이성 항체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 IgG 항체는 lgG1 , lgG2, lgG3, 또는 lgG4 항체인 이중특이성 항체.
  15. 다음을 포함하는 항체-약물 콘쥬게이트:
    치료제; 및
    PD-L1 및/또는 OX40에 대한 항체 또는 이에 결합하는 항원-결합 부분,
    여기서 상기 치료제는 링커에 의하여 항체 또는 항원-결합 단편에 공유적으로 콘쥬게이트된다.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 부분은 제1항, 제6항 또는 제7항으로부터 선택되는 항체-약물 콘쥬게이트.
  17. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 항원 결합 단편 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 제6항에서 청구된 항체 또는 이들의 항원-결합 단편 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 부분의 효과적 함량을 이것을 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 암이 전립선 암, 폐암, 비소세포폐암(NSCLC), 흑색종, 림프종, 유방 암, 두부암 및 경부암, 콩팥세포암종(RCC), 및 난소 암으로 이루어진 군으로부터 선택된, 암 치료 방법.
  22. 제6항에 청구된 항체 또는 항원-결합 부분의 효과적인 함량을 이것을 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 암이 전립선 암, 폐 암, 비소세포폐암 (NSCLC), 흑색종, 림프종, 유방 암, 두부암 및 경부암, 콩팥세포암종 (RCC), 및 난소 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암 치료 방법.
  24. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체의 효과적인 함량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암은 전립선 암, 폐 암, 비소세포폐암(NSCLC), 흑색종, 림프종, 유방 암, 두부암 및 경부암, 콩팥세포암종(RCC), 및 난소 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암 치료 방법.
  26. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 분자.
  27. 제6항에 따른 항체 또는 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 분자.
  28. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산 분자.
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