JP2021509258A - 癌治療のために免疫チェックポイントを調節する単一特異性および二重特異性タンパク質 - Google Patents

Abstract

ＯＸ４０および／またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単一特異性および二重特異性タンパク質が提供される。例示的タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１を介して阻害物質を放出し、ＯＸ４０を介してＴ細胞を刺激する。例示的多価タンパク質は、少なくとも１つのＯＸ４０結合部位と少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１結合部位とを含む。ある特定の実施形態において、当該結合部位は、免疫グロブリン定常領域を介して連結され得る。抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体もまた提供される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年１２月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／６１１，５４３号に対する優先権を主張するものであり、当該特許仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

本出願に関連する配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子形式において出願され、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名称は、１８０８５８４＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。当該テキストファイルのサイズは、１２５，８８８バイトであり、当該テキストファイルは、２０１８年１２月２７日に作成された。

（発明の分野）
本発明は、抗体に関する。より詳細には、本発明は、癌治療のための抗体に関する。

（関連分野の説明）
ヒトにおけるリンパ球の２つの主要なタイプは、Ｔ（胸腺由来）およびＢ（骨髄由来）である。これらの細胞は、リンパ球発達経路に運命付けられた骨髄および胎児肝臓の造血幹細胞に由来する。これらの幹細胞の後代は、Ｂリンパ球またはＴリンパ球に成熟するための分岐経路に従う。ヒトＢリンパ球発達は、完全に骨髄内において生じる。その一方で、Ｔ細胞は、骨髄を去って血流によって胸腺まで移動する未成熟前駆体から発達し、そこで、それらは、増殖し、成熟Ｔリンパ球へと分化する。

（Ｔ細胞）
Ｔ細胞は、最も大量で（血液リンパ球の約７５％）、強力な免疫キラー細胞である。抗腫瘍性免疫応答におけるエフェクターＴ細胞の役割は、インビトロ研究および、腫瘍のいくつかのタイプにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の高浸潤が好ましい臨床予後と相関関係を有するという観察によって強く支持される（Ｆｒｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。エフェクターナイーブＴ細胞の活性化は、少なくとも３つの相補シグナル：（ｉ）共受容体（ＣＤ４またはＣＤ８）の支援によるＴＣＲ−ＣＤ３／Ａｇ−ＭＨＣ相互作用；（ｉｉ）ＣＤ８０またはＣＤ８６などの共刺激性分子のＣＤ２８、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌへの結合；および（ｉｉｉ）サイトカインなどのアクセサリ分子を必要とする。

Ｔ細胞への共刺激または２つの異なるシグナルの提供は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による静止Ｔリンパ球のリンパ球活性化の、広く受け入れられたモデルである（Ｌａｆｆｅｒｔｙ ａｎｄ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，１９７５）。このモデルは、さらに、自己と非自己との区別および免疫寛容性を提供する（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｃｏｈｎ，１９７０；Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，１９９９；Ｊｅｎｋｉｎｓ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ，１９８７）。一次シグナル、または抗原特異的シグナルは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）との関連において提示される外来抗原ペプチドの認識に従ってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して変換される。二次または共刺激シグナルが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現した共刺激性分子によってＴ細胞に届けられ、Ｔ細胞に、クローン増殖、サイトカイン分泌、およびエフェクター機能を促進するように仕向ける（Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。共刺激の不在下において、Ｔ細胞は、抗原刺激に対して抵抗性となり得、有効な免疫応答を開始せず、さらに、結果として、外来抗原に対して疲弊または寛容性を生じ得る。

（免疫チェックポイントタンパク質：ＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０）
免疫チェックポイントは、通常、付随的な組織損傷を最小限に抑えるため、自己寛容性を維持し、末梢組織における生理学的応答の持続期間および振幅を調節するために、免疫系、具体的にはＴ細胞媒介性免疫を張り巡らせるリガンド−受容体相互作用によって開始される、阻害性および刺激性経路のグループを意味する（Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２）。腫瘍細胞は、免疫抵抗性の主要メカニズムとして、ある特定のチェックポイント経路を選出する。例えば、プログラム細胞死タンパク質１リガンドのＰＤ−Ｌ１は、一般的に、ヒト癌の腫瘍細胞表面において上方制御される。ＰＤ−Ｌ１と、腫瘍浸透リンパ球（ＴＩＬ）、特にＴ細胞、において発現される、その受容体であるＰＤ−１との相互作用は、局所的Ｔ細胞媒介性応答を阻害することにより、免疫監視から逃れる（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｚｎｏｌ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，２０１３）。したがって、癌細胞での免疫抑制性シグナルの阻害、またはＴ細胞の直接的アゴニスト刺激は、強い持続性の抗腫瘍免疫応答を生じるおよび／または誘起する。最近の臨床研究は、抗体を介した、または可溶性リガンドまたは受容体によって調節される、免疫チェックポイントタンパク質の遮断が、治療的抗腫瘍免疫の達成に対する最も有望なアプローチであることを強く示唆した（Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。現在、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４）抗体が、黒色腫などの疾患を治療するために、ＦＤＡによって承認されている。

別の共刺激性分子は、ＯＸ４０受容体（ＣＤ１３４）であり、これは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバであり、膜結合性で、主に、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞において発現される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。ＯＸ４０受容体（本明細書の以下において、「ＯＸ４０」）によるシグナル伝達は、エフェクターＴ細胞に対して共刺激性であり、Ｔ細胞の増殖を引き起こす（Ｗａｔｔｓ，２００５；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。ＯＸ４０の研究は、その主な役割が、一次免疫応答において蓄積するエフェクターＴ細胞の数を決定すること、およびその結果、続いて増殖し生き残る記憶Ｔ細胞の数を支配することであることを示唆している（Ｃｒｏｆｔ，２００３）。いくつかのインビトロ研究は、ＯＸ４０が、共刺激シグナルを提供し、結果として、増強されたＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を生じることを示していた。

（二重特異性／二官能性抗体）
エフェクター免疫細胞に腫瘍細胞を効率的に再標的化させるために二重特異性抗体を使用するアイデアは、１９８０年代に現れた（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。二重特異性抗体は、一般的に、Ｆｃ断片、ＩｇＧ様分子、および小さい組換え二重特異性形式（それらの大部分は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に由来する）の有無に基づいて、異なる薬物動力学特性を有する２つの主要な群に分類される。抗体断片は、それらのコンパクトなサイズにより、通常、ＩｇＧ様分子よりも効率的に腫瘍に浸透するが、この利点は、それらの全体的腫瘍取り込みおよび滞留時間を制限する短い血清半減期（数時間）によって緩和される（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。対照的に、新生児Ｆｃ受容体に結合するＦｃ断片の存在は、ＩｇＧ様形式に対して長い血清半減期（＞１０日）を提供し、これは、腫瘍取り込みおよび滞留に有利に働くが、腫瘍浸透を制限する。

最近の研究は、癌細胞を破壊するために患者自身の免疫系を利用する癌治療の類である免疫療法の治療有効性を強調している。腫瘍内において、まとめて「チェックポイント阻害因子」として知られるネガティブ調節分子のファミリーの存在は、抗腫瘍免疫を抑制するＴ細胞の機能を阻害することができる。ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１などのチェックポイント阻害因子は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を減少させる。アンタゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の標的化された遮断は、抗腫瘍免疫を高めるために、Ｔ細胞上に「ブレーキ」を放出する。最適な「キラー」ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じさせるには、Ｔ細胞受容体活性化と共刺激も必要とし、それらは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む、腫瘍壊死因子受容体のファミリーメンバのライゲーションによって提供することができる。ＯＸ４０は、様々な腫瘍に対する高められた抗腫瘍免疫を生じるＴ細胞分化およびサイトカイン機能を増加させる賦活性（アゴニスト）抗ＯＸ４０ｍＡｂによる治療として、特に関心が高い。単剤として使用される場合、これらの薬物は、転移性疾患を患う患者において、強力な臨床および免疫性応答を引き起こすことができる（Ｌｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

本開示は、前立腺癌、肺癌、ＮＳＣＬＣ、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、ＲＣＣ、または卵巣癌などの癌を患う患者の治療を目的とする免疫調節する二重特異性抗体を調査するために設定された。

本開示は、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号６、配列番号８、配列番号１０のアミノ酸１２６〜２４４、および配列番号１３のアミノ酸１２３〜２４０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５のアミノ酸１〜１０８、配列番号７のアミノ酸１〜１０８、配列番号１０のアミノ酸１〜１１２、および配列番号１３のアミノ酸１〜１０８からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗体またはその抗原結合性部分を提供する。

一実施形態において、当該抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１０、１１、１２、および１３からなる群より選択される単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）配列である。

一実施形態において、当該抗体またはその抗原結合性部分は、二重特異性抗体である。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、免疫チェックポイントタンパク質結合部位を含む。

一実施形態において、当該免疫チェックポイントタンパク質結合部位は、プログラム細胞死タンパク質１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）結合部位、ＰＤ−１結合部位、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）結合部位、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）結合部位、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）結合部位、またはリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）結合部位を含む。

本開示は、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１のアミノ酸１〜１１１および配列番号３のアミノ酸１〜１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む抗体またはその抗原結合性部分も提供する。

本開示は、少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体も提供し、この場合、当該ポリペプチド鎖は、ＯＸ４０結合部位およびＰＤ−Ｌ１結合部位を含む。当該ＯＸ４０結合部位は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０のアミノ酸１２６〜２４４、および配列番号１３のアミノ酸１２３〜２４０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５のアミノ酸１〜１０８、配列番号７のアミノ酸１〜１０８、配列番号１０のアミノ酸１〜１１０、および配列番号１３のアミノ酸１〜１０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。当該ＰＤ−Ｌ１結合部位は、配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１のアミノ酸１〜１１１および配列番号３のアミノ酸１〜１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。

一実施形態において、当該ポリペプチド鎖は、さらに、Ｆｃドメイン、Ｆａｂ断片、およびｓｃＦｖを含む。当該Ｆａｂ断片は、ＦｃドメインのＮ末端に接続されており、ならびに当該Ｆａｂ断片は、ＰＤ−Ｌ１結合部位を含む。当該ｓｃＦｖは、当該ＦｃドメインのＣ末端に接続されており、ならびに当該ｓｃＦｖは、ＯＸ４０結合部位を含む。

一実施形態において、当該ペプチド鎖は、さらに、ＦｃドメインとｓｃＦｖとの間にリンカーを含む。

一実施形態において、当該ｓｃＦｖは、配列番号１８のアミノ酸４５５〜７０７、配列番号１９のアミノ酸４５５〜７０８、配列番号２０のアミノ酸４５５〜７０１、配列番号２１のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２２のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２３のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２４のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２５のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２６のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２７のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２８のアミノ酸４５５〜７０６、および配列番号２９のアミノ酸４５５〜７０６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、一対のポリペプチド鎖を含む。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ抗体である。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、ＩｇＧ抗体である。

一実施形態において、当該ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。

本開示は、治療薬と、ＰＤ−Ｌ１および／またはＯＸ４０に結合する抗体または抗原結合性部分とを含む抗体−薬物コンジュゲートであって、当該治療薬は、リンカーによって、当該抗体または当該抗原結合性断片に共有結合的にコンジュゲートされている、抗体−薬物コンジュゲートも提供する。

一実施形態において、当該抗体または抗原結合性部分は、上記において言及した抗体または抗原結合性部分から選択される。

本開示は、上記において言及した抗体、その抗原結合性断片、または二重特異性抗体と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。

本開示は、上記において言及した抗体、その抗原結合性断片、または二重特異性抗体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、癌を治療する方法も提供する。

一実施形態において、当該癌は、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、腎細胞腫（ＲＣＣ）、および卵巣癌からなる群より選択される。

本開示は、上記において言及した抗体、その抗原結合性断片、または二重特異性抗体、をコードする核酸分子も提供する。

前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも、一例であり、請求項に係る本発明のさらなる説明を提供することが意図されることは理解されるべきである。

本発明は、以下の添付の図面に対する言及と共に、実施形態についての以下の詳細な説明を読むことによって、より完全に理解することができる。

図１は、Ｔ細胞媒介性免疫を調節する免疫チェックポイントを示す図である。当該チェックポイントに対してアゴニスト的またはアンタゴニスト的である抗体（例えば、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ２８、抗ＯＸ４０、および抗ＣＤ２７、または抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３、抗ＢＴＬＡなど）は、用途に応じて二官能性融合タンパク質を構築するために使用することができた。 図２Ａは、ＰＤ−Ｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞に対する直接的ＥＬＩＳＡによるファージクローンのスクリーニングを示す図である。 図２Ｂは、ＰＤ−Ｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞に対する直接的ＥＬＩＳＡによるファージクローンのスクリーニングを示す図である。 図３Ａは、ＯＸ４０発現ＨＥＫ２９３細胞を用いた細胞ベースでの直接的ＥＬＩＳＡによるファージクローンのスクリーニングを示す図である。 図３Ｂは、ＯＸ４０発現ＨＥＫ２９３細胞を用いた細胞ベースでの直接的ＥＬＩＳＡによるファージクローンのスクリーニングを示す図である。 図４は、完全性および純度を明らかにするための、非還元試薬または還元試薬を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＰＤ−Ｌ１に対して特異的な精製した抗体リードを示す図である。 図５は、完全性および純度を明らかにするための、非還元試薬または還元試薬を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＯＸ４０に対して特異的な精製した抗体リードを示す図である。 図６は、精製した抗免疫チェックポイントタンパク質およびＰＤ−Ｌ１に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードの、直接的リガンド結合活性の実施例を示す図である。最初に、リガンドで予めコーティングされたウェルを、示されるような様々な濃度の抗体リードと共にインキュベートした。次いで、結合したタンパク質を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ特異的抗体で検出し、ＯＤ_４５０の読み取り値をプロットした。 図７は、精製した抗免疫チェックポイントタンパク質およびＯＸ４０に対する抗ＯＸ４０抗体リードの、直接的リガンド結合活性の実施例を示す図である。最初に、リガンドで予めコーティングされたウェルを、示されるような様々な濃度の抗体リードと共にインキュベートした。次いで、結合したタンパク質を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ特異的抗体で検出し、ＯＤ_４５０の読み取り値をプロットした。 図８は、ＰＤ−Ｌ１発現２９３細胞を使用したフロー解析を示す図である。最初に、ＰＤ−Ｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞を、精製した抗体リードと共にインキュベートし、結合した当該抗体を、Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて検出し、その後、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析を行った。 図９は、ＯＸ４０発現２９３細胞を使用したフロー解析を示す図である。最初に、ＯＸ４０発現ＨＥＫ２９３細胞を、精製した抗ＯＸ４０抗体リードと共にインキュベートし、結合した当該抗体を、Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて検出し、続いて、ＦＡＣＳ分析を行った。ＮＳ：染色せず 図１０は、精製した抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断を示す図である。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害活性を評価するために、示された精製した抗体をビオチン化ＰＤ−ｌ−ＦｃおよびＰＤ−Ｌ１−２９３Ｆ細胞と共に適用した。ＰＤ−Ｌ１−２９３Ｆ細胞上に結合している組換えＰＤ−１−Ｆｃをストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ−４８８によって検出し、ＦＡＣＳによって分析した。 図１１Ａは、抗体処理の３日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードが、Ｔ細胞増殖を刺激し、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を誘起することを示す図である。 図１１Ｂは、抗体処理の５日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードが、Ｔ細胞増殖を刺激し、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を誘起することを示す図である。 図１２Ａは、抗ＯＸ４０抗体リードおよび基準抗体が用量応答的にＣＤ３＋Ｔ細胞活性化を高める能力を示す図である。 図１２Ｂは、プレートに結合させた抗ＣＤ３によるヒトＴ細胞の３日間の刺激の後の細胞培養培地中に存在するヒトＩＬ−２およびＩＦＮ−γの濃度、ならびに抗ＯＸ４０抗体リードのいくつかの濃度を示す図である。 図１３Ａは、プレートに結合させた抗ＣＤ３によるヒトＴ細胞の３日間の刺激の後の細胞培養培地中に存在するヒトＩＬ−２の濃度、ならびにＯＸ４０特異的抗体リードのいくつかの濃度を示す図である。 図１３Ｂは、プレート結合抗ＣＤ３によるヒトＴ細胞の３日間の刺激の後の細胞培養培地中に存在するＩＦＮ−γの濃度、ならびにＯＸ４０特異的抗体リードのいくつかの濃度を示す図である。 図１４は、ＯＸ４０特異的ｓｃＦｖドメインと融合した抗体重鎖Ｆｃの構造を示す図である。 図１５は、抗免疫チェックポイント抗体−ヒトアルギナーゼ融合タンパク質のＰＡＧＥ−ゲル分析の例を示す図である。精製した融合タンパク質である抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ融合タンパク質が、分子量約２２０ｋＤａ（非還元）を有することが示されており、両方の抗体融合物において、重鎖融合物は、約８５ｋＤａを有し、軽鎖は約２５ｋＤａ（還元）である。 図１６Ａは、二重特異性抗体が、単一、混合、または抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ二重特異性抗体処理の３日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生に対するＴ細胞活性化を相乗作用的に刺激することを示す図である。 図１６Ｂは、二重特異性抗体が、単一、混合、または抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ二重特異性抗体処理の５日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生に対するＴ細胞活性化を相乗作用的に刺激することを示す図である。 図１７Ａは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖにおける異なるリンカーを有する二重特異性抗体の抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂの凝集および純度測定を示す図である。 図１７Ｂは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖにおける異なるリンカーを有する二重特異性抗体の抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ１の凝集および純度測定を示す図である。 図１７Ｃは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖにおける異なるリンカーを有する二重特異性抗体の抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ２の凝集および純度測定を示す図である。 図１７Ｄは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖにおける異なるリンカーを有する二重特異性抗体の抗抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ３の凝集および純度測定を示す図である。 図１７Ｅは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖにおける異なるリンカーを有する二重特異性抗体の抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ４の凝集および純度測定を示す図である。 図１８は、抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５〜Ｖ１２（配列番号３０〜３８）のＯＸ４０クローンＢ１７ｓｃＦｖにおける配列バリアントを示す図である。 図１９は、抗免疫チェックポイント抗体−ヒトアルギナーゼ融合タンパク質のＰＡＧＥ−ゲル分析の例を示す図である。精製した融合タンパク質である抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５融合タンパク質が、分子量約２２０ｋＤａ（非還元）を有することが示されており、両方の抗体融合物において、重鎖融合物は、約８０ｋＤａを有し、軽鎖は約３０ｋＤａ（還元）である。 図２０は、二重特異性抗体バリアントの結合活性評価のためのＥＬＩＳＡ法を説明するフローチャートを示す図である。 図２１は、二重特異性抗体バリアントのヒトＰＤ−Ｌ１結合活性およびそのＥＣ５０を示す図である。 図２２は、二重特異性抗体バリアントのヒトＯＸ４０結合活性およびそのＥＣ５０を示す図である。 図２３は、二重特異性抗体バリアントである抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５のエクスビボ血清安定性を示す図である。 図２４Ａは、単一、混合、または抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５二重特異性抗体処理によってＴ細胞を調節した３日後のＩＬ−２産生を示す図である。 図２４Ｂは、単一、混合、または抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５二重特異性抗体処理によってＴ細胞を調節した５日後のＩＮＦ−γ産生を示す図である。 図２５は、Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ（登録商標）ＢｅｉｇｅマウスにおけるＰＣ−３腫瘍の増殖に対する抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５二重特異性抗体処理およびモノクローナル抗体処理の効果を示す図である。

（詳細な説明）
参照は、以下において、本発明の本実施形態に対して詳細になされ、その例は、添付の図面に示される。同じまたは同様の部分を参照するために、図面および説明において、可能な限り、同じ参照番号が使用される。

本発明は、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体のＦｃドメインのＣ末端に融合された単離された機能性アゴニストＯＸ４０ ｓｃＦｖを用いた二官能性タンパク質の発現、精製、および特徴付けについて説明する。これらのタンパク質は、Ｔ細胞関与免疫を調節するために阻害性または刺激性シグナルを伝達するその対応するチェックポイント標的と相互作用する。本発明におけるＦｃ融合タンパク質の成分は、全てヒト起源であり、したがって、非免疫原性であることが期待され、ならびにヒトの治療に使用することができる。

二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）などの二重特異性分子は、単一の治療薬によって、同じ分子標的または異なる標的上の複数のエピトープを同時に標的化する手段を提供する。癌治療として、それらは、２種のｍＡｂの混合物とは対照的に、新規のまたはより強力な活性を付与し、商品コストを下げ、新規の治療計画の開発を促進する、可能性を有する（Ｃｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｂａｔｙ，２００９；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２００９；Ｔｈａｋｕｒ ａｎｄ Ｌｕｍ，２０１０）。最近、ヒト上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）およびＣＤ３を標的とする三官能性二重特異性抗体であるカツマキソマブが、上皮癌の腹膜癌症を患う患者において明確な臨床的有益性を示し（Ｈｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ＣＤ１９およびＣＤ３に対する二重特異性を有する二重特性Ｔ細胞誘導（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ：ＢｉＴＥ）抗体も、ＣＤ１９を発現する血液悪性腫瘍を患う患者において、臨床的活性を高めることを実証した（Ｂａｒｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）。癌治療としての二重特異性分子の開発に対する強い関心にもかかわらず、安定で活性な二重特異性分子の製造における技術的課題は、過去において、ほとんどの二重特異性形式の臨床評価を妨げてきた。ＩｇＧ様二重特異性抗体を含む多くの遺伝子改変抗体形式は、安定性または溶解性を妥協してきた（Ｂａｒｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｄｅｍａｒｅｓｔ ａｎｄ Ｇｌａｓｅｒ，２００８；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）。その上、二重特異性分子の製造物品質およびインビボ安定性を増加させるために、ペグ化、ヒト血清アルブミンとのコンジュゲート化、およびＦｃ遺伝子改変を含む、いくつかの戦略が取られてきた（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。上記において説明される一般的な形式の二重特異性単鎖抗体は、４つのＶドメインをコードするヌクレオチド配列、２つのリンカー、および１つのスペーサーを、単一のプロモータの制御下において、好適な宿主発現生物に組み込むことができるという利点を有する。このことは、作製の際の実験者による制御の度合いと同様に、これらの構築物を設計する際のフレキシビリティーを増加させる。さらに、ＩｇＧのＦｃは、結合能力を除く全ての抗体の機能を含むため、新規の治療法を設計するための非常に魅力的な別の足場である。Ｆｃ遺伝子改変は、当該二重特異性抗体の有効性を向上させるために重要である。したがって、本発明では、免疫療法における免疫細胞または標的細胞上の２つの非依存性標的に対して、ＩｇＧベースの立体配座を使用している。

免疫チェックポイントタンパク質の標的化は、抗腫瘍免疫を活性化するための、将来有望なアプローチである。抗チェックポイントタンパク質（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３など）は、現在、臨床的に評価されている（図１）。免疫チェックポイントタンパク質の遮断剤による予備的データは、持続性の臨床反応を生じさせる可能性を有する抗腫瘍免疫を増加させることができることが分かっている。しかしながら、多くの悪性腫瘍におけるこれらの薬剤の顕著な臨床有効性にもかかわらず、それらが、多くの患者にとって十分に有効ではないことが明らかになった。多数の追加の免疫調節経路ならび、腫瘍内微小環境において骨髄細胞または間質細胞によって発現または分泌される阻害因子は、免疫チェックポイント遮断との相乗作用のための潜在的標的である。したがって、抗癌療法または二重特異性抗体療法を組み合わせることは、癌を患う患者に対して完全な寛解および回復を達成するために不可欠であった。

本発明は、異なる免疫チェックポイントタンパク質特異的ｓｃＦｖタンパク質と融合した抗免疫チェックポイントタンパク質抗体Ｆｃの構築、発現、およびキャラクタリゼーションについて説明する。例えば、融合の相手方が、免疫系増強剤（例えば、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２、または抗ＣＴＬＡ−４抗体など）である場合、融合構築物においてＣ末端に位置されたＯＸ４０ ｓｃＦｖは、ＯＸ４０活性化アプローチを超える融合タンパク質の力の拡張を可能にする。

（ＯｍｎｉＭａｂライブラリからの抗体生成）
ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に対する治療抗体の生成のために、ＯｍｎｉＭａｂファージミドライブラリによる選択を実施した。当該ファージミドライブラリは、百を超える健康なドナーＢ細胞のコレクションからＡＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（ＡＰＢｉｏ Ｉｎｃ．）によって生成される。パンニングの第一ラウンドのためのファージを、Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ（Μ１３Κ０７ΔρΙΙΙ、Ｐｒｏｇｅｎ，ハイデルベルク，ドイツ）によって調製した。ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０特異的バインダー選択およびＯｍｎｉＭａｂライブラリからの単離に対して、ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に対する固相パンニングおよび細胞パンニングを適用した。固相パンニングは、第一ラウンド選択において組換えヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（ＡＰＢｉｏ Ｉｎｃ．）を使用して実施し、次いで、第二および第三ラウンドの濃縮に対して、ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０を発現したＨＥＫ２９３細胞を使用した。３つのラウンド選択の後、当該特異的ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０バインダーをスクリーニングし、対応する組換えタンパク質による直接的ＥＬＩＳＡによって単離した（図２Ａ、２Ｂ、３Ａ、および３Ｂ）。予めコーティングしたＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ組換えタンパク質を、レスキューされたファージを含有する上清を用いて１時間ブロットし、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージを、ＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体（Ｒｏｃｈｅ）によって検出し、シグナル発生のために、ＴＭＢ基質を使用した。ＯＤ４５０の読み取り値を記録した。ポジティブバインダーを単離し、重鎖および軽鎖の配列および多様性を確認するために配列決定を行った。ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に対して特異的な重鎖および軽鎖の可変領域は、配列番号１から配列番号８で記述され：この場合、配列番号１は、ＰＤ−Ｌ１クローン６の軽鎖であり、配列番号２は、ＰＤ−Ｌ１クローン６の重鎖の可変領域であり、配列番号３は、ＰＤ−Ｌ１クローン３２の軽鎖であり、配列番号４は、ＰＤ−Ｌ１クローン３２の重鎖の可変領域であり、配列番号５は、ＯＸ４０クローンＢ１７の軽鎖であり、配列番号６は、ＯＸ４０クローンＢ１７の重鎖の可変領域であり、配列番号７は、ＯＸ４０クローンＢ１９の軽鎖であり、配列番号８は、ＯＸ４０クローンＢ１９の重鎖の可変領域である。図２Ａ、２Ｂ、３Ａ、および３Ｂに示されるように、いくつかのクローンを単離し、それらは、ネガティブコントロールと比較して、対応する抗原に対して特異的に認識されることが分かった。

（ＩｇＧ形式としての選択されたＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０特異的バインダーのサブクローニングおよび発現／精製）
Ｔ細胞活性化における機能性を有する特異的バインダーの迅速なスクリーニングを容易にするために、ＥＬＩＳＡによるＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に対するポジティブバインダーの重鎖および軽鎖を増幅し、消化し、ＩｇＧ４定常領域（配列番号９）を保持するＡＰＢｉｏ専用ＩｇＧ発現ベクター中へサブクローニングした。配列検証後、プラスミドを調製し、抗体発現のために、２９３フェクチントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＨＥＫ２９３細胞中へとトランスフェクトした。４日間の培養後、無血清培地中に分泌された抗体を、タンパク質Ｇクロマトグラフィによって、培養上清から親和性により精製した。次いで、精製された抗体を濃縮し、その後、ＰＢＳ緩衝液において透析した。透析したタンパク質の最終濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計によって特定し、図４および５に示されるように、還元試薬を用いてまたは用いずに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度および完全性を特定した。精製された様々な抗体リード、ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０特異的のどちらか、の完全性は、基準抗体、ＰＤ−Ｌ１に対してはＭＰＤＬ３２８０ＡまたはＯＸ４０に対してはＧＳＫ３１７４９９８、と同様に、ＨＥＫ２９３細胞において正常である。

一実施形態において、本開示は、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性部分を提供する。当該重鎖可変領域は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０のアミノ酸１２６〜２４４、および配列番号１３のアミノ酸１２３〜２４０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該重鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、または９５％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。当該軽鎖可変領域は、配列番号５のアミノ酸１〜１０８、配列番号７のアミノ酸１〜１０８、配列番号１０のアミノ酸１〜１１０、および配列番号１３のアミノ酸１〜１０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該軽鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、または９５％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、本開示は、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合性部分を提供する。当該重鎖可変ドメインは、配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該重鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、または９５％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。当該軽鎖可変ドメインは、配列番号１のアミノ酸１〜１１１および配列番号３のアミノ酸１〜１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該軽鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、または９５％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。

（直接的ＥＬＩＳＡによるＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０特異的ＩｇＧリードの結合活性の特定）
直接的コーティングされた設定において、ヒトＰＤ−Ｌ１−ＦｃまたはＯＸ４０−Ｆｃに対するＥＬＩＳＡ結合キャラクタリゼーションのために、ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に対する精製された抗体リード（抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードまたは抗ＯＸ４０抗体リード）を適用した。図６および７は、それぞれ、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＯＸ４０抗体に対するＥＬＩＳＡ結合結果を示した。ＰＤ−Ｌ１特異的抗体の場合、ほとんどのリードは、基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ，ＭＰＤＬ３２８０Ａ，Ｒｏｃｈｅ）に対して、同様のまたはより良い結合活性を示した。

精製されたヒトＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０ＩｇＧ１Ｆｃキメラ（ＰＤ−Ｌ１−ＦｃまたはＯＸ４０−Ｆｃ、ＡＰＢｉｏ）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において透析し、１ｍｇ／ｍＬに調節して、次いで、ＰＢＳによって１μｇ／ｍＬの最終濃度へと希釈した。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートを、ウェルあたり０．１ｍＬにおいて組換えＰＤ−Ｌ１−ＦｃまたはＯＸ４０−Ｆｃキメラでコーティングし、非特異的結合コントロールに対しては空のウェルのままにして、４℃で一晩インキュベートした。当該ＰＤ−Ｌ１−ＦｃまたはＯＸ４０−Ｆｃキメラ溶液を除去し、当該プレートを０．４ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中における０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。０．４ｍＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中における５％の低脂肪ミルク粉末）を全てのウェルに加え、撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。当該ブロッキング緩衝液を除去し、プレートを０．４ｍＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＰＢＳにおいて当該ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０試験抗体の段階希釈を調製し、０．１ｍＬの希釈されたＡｂを各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。抗体溶液を除去し、当該プレートを、ウェルあたり０．４ｍＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧであるＦ（ａｂ’）_２特異的Ｆ（ａｂ’）_２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−０３６−０９７）を、ＰＢＳで１：２０００に希釈し、各ウェルに０．１ｍＬを加えた。当該プレートを室温で１時間インキュベートし、ウェルあたり０．４ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄した。０．１ｍＬのＴＭＢ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、室温で１〜５分間インキュベートした。０．０５ｍＬの１ＮのＨＣｌを加えることによって反応を止め、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｓｐｅｃｔｒａにおいて、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。ＰＤ−Ｌ１に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードの計算されたＥＣ５０は、ほとんどのリードが、直接的ＥＬＩＳＡにより、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｅｆ Ａｂ）と同様に、良好な結合活性を有することを示した（図６）。対照的に、ほとんどの抗ＯＸ４０抗体リードは、基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ、ＧＳＫ３１７４９９８）と比較して、著しく低い結合活性を示した（図７）。

（ＦＡＣＳによるＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０特異的ＩｇＧリードに対する結合活性の特定）
ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０を発現したＨＥＫ２９３細胞を用いて結合活性を特定して結合活性を比較するために、フローサイトメトリに対しても、精製された抗体リード（抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードまたは抗ＯＸ４０抗体リード）を適用した。図８および９は、安定発現されたＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０のＨＥＫ２９３細胞を用いたＦＡＣＳによって示されるように、対応する抗体リードの結合活性を示している。

ＰＤ−Ｌ１結合活性を調べるために抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードで染色したＰＤ−Ｌ１安定発現２９３細胞のＦＡＣＳ分析のために、安定発現細胞を、１μｇ／ｍＬの精製した抗ＰＤ−Ｌ１抗体リード、基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ ＭＰＤＬ３２８０Ａ）と共に、またはネガティブコントロールとしてのアイソタイプ抗体と共に、氷上で１時間インキュベートした。当該細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）と共に、氷上でさらに１時間インキュベートした。染色後、当該細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁させ、その後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ，ＬＬＣ）によって分析した。同じシナリオにおいて、図９において安定発現したＯＸ４０のＨＥＫ２９３細胞に対する抗ＯＸ４０抗体リードの結合活性も、同じ戦略で実行し、上記において説明したように分析した。図８に示されるように、ほとんどの抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードは、基準抗体と同様に、良好な結合活性を有する。このことは、ＯｍｎｉＭａｂライブラリから選択されたファージクローンが、実際に、当該細胞におけるネガティブＰＤ−Ｌ１を認識することを示した。

この現象は、図９に示されるように、抗ＯＸ４０抗体リードに対しても観察される。ＯＸ４０結合活性を調べるために、精製された抗ＯＸ４０抗体リードで染色したＯＸ４０安定発現２９３細胞クローン２Ｄ５のＦＡＣＳ分析のために、安定発現細胞を、コントロール抗体として２μｇ／ｍＬの抗ＯＸ４０基準Ａｂ（ＯＸ４０ ｒｅｆ．）または抗ＣＤ１３７基準Ａｂ（ＣＤ１３７ ｒｅｆ．）と共に、氷上で１時間インキュベートした。当該細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）と共に、氷上でさらに１時間インキュベートした。染色後、当該細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁させ、その後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）およびＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ、ＬＬＣ）によって分析した。

（リガンド競合結合（ＥＬＩＳＡアッセイ））
抗体リードは、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断する能力について本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードを評価するために使用される結合選択性および親和性アッセイを示した。

組換えヒトＰＤ−１／Ｈｉｓ（ｈＰＤ−１／Ｈｉｓ）へのヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃキメラ（ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ）の結合を遮断する能力について、ＥＬＩＳＡによって抗体を試験した。精製された組換えｈＰＤ−１／Ｈｉｓ（ＡＰＢｉｏ）を、ＰＢＳ中における１ｍｇ／ｍｌへと透析し、次いで、ＰＢＳ中における５μｇ／ｍＬへと希釈した。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートを、ウェルあたりＰＢＳ中における２５０ｎｇのｈＰＤ−１／Ｈｉｓで一晩かけてコーティングした。当該ｈＰＤ−１／Ｈｉｓ溶液を除去し、当該プレートを０．４ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中における０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。０．４ｍＬブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中における５％の低脂肪ミルク粉末）を全てのウェルに加え、撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。ブロッキングステップの際、当該抗体ストックを、２倍の段階希釈によって、ＰＢＳ中における２００ｎＭから０ｎＭの範囲で希釈した。精製した組換えＰＤ−Ｌ１−Ｆｃキメラを、ＰＢＳ中における４μｇ／ｍＬに希釈した。ＰＤ−１／Ｈｉｓでコーティングしたプレートを、０．２ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中における０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。６０μＬの抗体希釈物（抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードまたはＲｅｆ Ａｂ ＭＰＤＬ３２８０Ａ）を６０μＬのＰＤ−Ｌ１−Ｆｃキメラと一緒に加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを、前に説明したように洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼヒトＩｇＧであるＦｃ特異的抗体を、ＰＢＳ中において１：２０００に希釈し、結果として得られる溶液の１００μＬを、洗浄したプレートのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを、前に説明したように洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質溶液を各ウェルに加え、１０分間インキュベートした。５０μＬの１ＮのＨＣｌによって反応を止め、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ読み取り機を使用して４５０ｎｍの吸光度を読み取り、図１０に示した。部分抗体リードは、競合ＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−ＰＤ−Ｌ１の間の相互作用を阻害することが示された。ほとんどの抗体リードは、基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ ＭＰＤＬ３２８０Ａ）と比較した場合、同様のブロッキング活性を示した。

（抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対するＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１リガンド相互作用の阻害によるＴ細胞活性化の刺激増強）
当該ＰＤ−１シグナル伝達経路は、中程度のＴＣＲ／ＣＤ２８共刺激シグナルを阻害し、その場合、最初に、Ｔ細胞増殖を減少することなく、サイトカイン産生が減少する。当該ＴＣＲ／ＣＤ２８共刺激シグナルが弱まると、当該ＰＤ−１経路が支配的となり、サイトカイン産生の著しい減少は、増殖の減少を伴う。したがって、本発明のヒト抗体のＰＤ−Ｌ１との相互作用の阻害を介した当該ＰＤ−１の阻害がＴ細胞活性化を高めることを検証するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を実施する。

ヒト全血液由来の単球を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５０６８）によって濃縮し、１０％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬ（１０００Ｕ／ｍＬ）のＧＭ−ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍＬ（５００Ｕ／ｍＬ）を伴う分化培地ＲＰＭＩ １６４０において６日間培養した。分化を検証するために、単球由来の当該分化樹状細胞（ＤＣ）を、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＰＥ、ＦＩＴＣ Ａｂとコンジュゲートした抗ＣＤ１４、ＰＥ Ａｂとコンジュゲートした抗ＣＤ８３、またはＦＩＴＣ Ａｂとコンジュゲートした抗ＣＤ８０によって点検し、ＭＬＲにおいてＡＰＣとして使用した。

ヒト全血由来の同種異系ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｃａｔ．ＮＯ． １５０６２）によって単離した。純度が９５％超であることを確実にするために、ＣＤ４＋Ｔ細胞の純度を抗ＣＤ４コンジュゲート化ＡＰＣ Ａｂによって確認し、Ｔ細胞増殖アッセイのために、１ｕＭのＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．ＮＯ． Ｃ３４５５４）によって標識した。当該抗体リードが、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を遮断することによってＴ細胞活性化を回復できるかどうかを見るため、３日間および５日間において、示されるような異なる抗体リードを伴う未成熟ＤＣと共に共培養するために、標識したＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した。３日間および５日間のインキュベート後、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−２およびＩＮＦ−γ定量化など、サイトカインのために上清を収集した。未成熟樹状細胞と同種異系Ｔ細胞とによる培養物への抗ＰＤ−Ｌ１抗体リード（クローン６、３２、２８、５１、６４、２７、および３７）の添加は、結果として、アイソタイプＩｇＧ（イソ＃１、＃２）で処理された培養物と比較して、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生における増加を生じることが予想され、図１１Ａおよび１１Ｂに示した。当該ＩＬ−２およびＩＮＦ−γ産生は、特に抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローン６の場合、抗体処理の３日（図１１Ａ）または５日（図１１Ｂ）後において、アイソタイプの抗体処理と比較して、ＭＬＲにおいて著しく増加する。サイトカインの増分は、抗体処理の５日後においても、依然として明らかであり、基準抗体（ｒｅｆ）であるＭＰＤＬ３２８０Ａと同様である。このことは、当該抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローン６が、二重特異性抗体複合物のための潜在的リードの１つであることを示した。

（抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性アッセイ）
Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生のＯＸ４０共刺激を活性化するために、精製された抗体リードを、サイトカイン産生、増殖を高めるそれらの能力、およびヒトＣＤ３＋Ｔ細胞における増殖を誘起する能力について、機能的にスクリーニングした。当該抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｃａｔ．Ｎｏ．３１７３０４）および抗ＯＸ４０抗体リード（クローンＢ６、Ｂ７０、Ｂ１２０、Ａ４、Ｂ１７、Ｂ１９、およびＢ３０）、基準抗体（ＧＳＫ３１７４９９８）またはアイソタイプの抗体（アイソ＃１、＃２）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートにコーティングした。その一方で、ナイーブヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、製造元の説明に従って市販のＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｃａｔ．Ｎｏ．１５０６１）を使用して、健康な成人のボランティア由来のヒト血液から単離した。次いで、当該単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．ＮＯ． Ｃ３４５５４）によって標識し、細胞増殖およびサイトカイン産生を特定するために、ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％のウシ胎仔血清、および２．５ｍＭのＬ−グルタミンの入った、抗体で予めコーティングしたウェルに、１×１０^６細胞／ｍＬにおいて播種した。３日間の培養後、フローサイトメトリによる増幅アッセイのために当該細胞を収集し、次いで、定量ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２およびＩＮＦ−γ産生について培地を分析した。

Ｔ細胞活性においてアンタゴニスト活性を有する抗ＯＸ４０抗体リードのスクリーニングを、図１２Ａに示した。全ての抗ＯＸ４０抗体リードは、基準抗体と同様の用量応答において当該ＣＤ３＋Ｔ細胞活性化を高める能力を示した。より高い用量の抗体処理は、明確により高いＴ細胞活性化活性を示した。その一方で、ＩＬ−２およびＩＮＦ−γなど、サイトカイン産生（図１２Ｂ）も、とりわけ、抗ＯＸ４０抗体リードクローンＢ１７の場合、同様のＴ細胞活性化反応が明らかとなった。サイトカインは、抗ＯＸ４０抗体リードＢ１７による３日間の処理後、非常に誘起される。増進は、基準抗体処理よりもはるかに高く、このことは、クローンＢ１７が、二重特異性抗体構築のための候補の１つであることを意味した。

図１３Ａおよび図１３Ｂに示されたデータのように、抗ＯＸ４０抗体リードであるクローンＢ１７およびＢ１９の両方は、抗ＯＸ４０抗体リード（Ｂ１７またはＢ１９）による３日間の処理の後のアッセイにおいて、より良好なアゴニスト活性を示した。ＩＬ−２産生またはＩＦＮ−γ産生のいずれかは、抗体処理において明確な増進を示し、用量依存性相関関係を示した。より高い用量での抗体処理において、より高いサイトカイン産生が記録された。

ＯＸ４０抗体リードＢ１７およびＢ１９のアゴニスト活性を評価するために、アゴニスト活性アッセイと同様に、ＥＣ５０も特定し、比較のためにサイトカイン産生を記録した。

（抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体の構築、発現、および精製）
二重特異性が、ｓｃＦｖ形式と融合されたＩｇＧベースとして設計されるため、抗免疫チェックポイント抗体の構造に、ＯＸ４０ ｓｃＦｖをＦｃ末端において融合させた。抗体は、阻害性抗免疫チェックポイント抗体（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３など）、または刺激性抗体（例えば、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２７、抗ＩＣＯＳなど）であり得る。図１４に表されるように、二重特異性抗体を生成するために、リンカーが、抗体ＦｃとＯＸ４０ ｓｃＦｖとの間に位置される。

いくつかの実施形態において、当該抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードクローン６が、ＩｇＧ形式であるように割り当てられ、その一方で、当該抗ＯＸ４０抗体リードは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードクローン６におけるＦｃ領域のＣ末端において融合させるために、ｓｃＦｖ形式として転換されるであろう。抗体からｓｃＦｖ形式への転換は、結果として、結合活性または特異性の減少を生じることができ、したがって、いくつかの抗ＯＸ４０抗体リードを、ｓｃＦｖ転換に使用した。二官能性抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｆｃの構築物を、完全長ＯＸ４０ ｓｃＦｖ（クローンＡ４としての配列番号１０、クローンＢ１７としての配列番号１１、クローンＢ１９としての配列番号１２、またはクローンＢ１２０としての配列番号１３）と融合させた。正確な折り畳みを確実にし、立体障害を最小にするために、短いフレキシブルなペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）_２（配列番号１４）を、例えば、Ｆｃ領域の抗ＰＤ−Ｌ１抗体重鎖Ｃ末端と、ＯＸ４０ ｓｃＦｖのＮ末端モジュールとの間に位置した。抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体のコード配列を、配列番号１６（抗ＰＤ−Ｌ１−クローン６重鎖−ＯＸ４０クローンＢ１７ｓｃＦｖ）および配列番号１７（抗ＰＤ−Ｌ１−クローン６重鎖−ＯＸ４０クローンＢ１９ｓｃＦｖ）に示した。構築された抗体Ｆｃ融合タンパク質を、シグナルペプチド（配列番号１５）によってリードし、哺乳動物細胞によって発現させ、ならびにトランスフェクトされた細胞培養上清から一段階タンパク質Ｇクロマトグラフィによって精製した。図１５に示されるように、一段階精製プロセスにおいて９０％を超える純度を得ることができ、それは、精製された融合タンパク質が正しい分子量（Ｍｗ＝２２０ｋＤ）を有することを示す。

（ＭＬＲにおける抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ二重特異性抗体リードに対するＴ細胞活性化の刺激の増強）
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用およびＯＸ４０シグナル伝達のアゴニスト活性化の阻害によってＴ細胞活性化を高めることにおける二重特異性抗体の相乗的協力を特定するために、二重特異性抗体リードの抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖを、上記において説明したようにＭＬＲに適用した。次いで、抗体処理の３日後または５日後に、ＩＬ−２およびＩＮＦ−γ産生を記録した。Ｔ細胞活性化増進における相乗効果を比較するために、単一、併用、または二重特異性抗体を等しい量または等しいモルにおいて適用し、アイソタイプＩｇＧをネガティブコントロールとして使用した。図１６Ａおよび１６Ｂに示されたデータのように、当該抗ＰＤ−Ｌ１抗体リード単独は、基準抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａと同様に、処理の３日後に著しいＩＬ−２誘導を示したが、対照的に、当該抗ＯＸ４０抗体リードは、抗体処理の３日後または５日後のいずれかにおいて、サイトカイン産生の明確な上方調節を増加することができない。このことは、基準抗体ＧＳＫ３１７４９９８と一致している。しかしながら、当該抗ＯＸ４０抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体との併用は、抗体処理の３日後および５日後におけるサイトカイン産生の著しい上方調節を示した。当該相乗効果は、二重特異性抗体リード処理においても観察され、サイトカイン産生の増分は、併用処理と同様である。このことは、抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ二重特異性抗体リードも、当該ｓｃＦｖ転換において結合活性の損失なしに、抗体併用処理と同様に機能することを示した。

（二重特異性抗体の凝集および純度の特定）
精製された抗ＰＤ−Ｌ１−クローン６−ＯＸ４０クローンＢ１７ｓｃＦｖＡｂは、単一カラムタンパク質Ａクロマトグラフィ精製の後のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析によって、低い純度（７４．０７％）であることが明らかとなり、したがって、純度を向上させるため、および本発明の二重特異性抗体の凝集を低減するために、いくつかの抗体バリアントを作製した。二重特異性抗体抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ（配列番号１６）において、ＯＸ４０Ｂ１７ｓｃＦｖにおけるリンカーの代わりに、上記において説明したリンカーを使用し、ＣＨＯ細胞において抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ１からＶ４（配列番号１８から配列番号２１）として作製した。これらのバリアントを精製し、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６００７６４０）によって分析した。当該データを下記の表１にまとめ、二重特異性抗体バリアントの１つである抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ４は、抗体純度を著しく向上させることが明らかとなった。純度は、７４．０７％から９２．２７％に高められる。したがって、当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ４を、当該抗体純度を向上させるために、さらなる遺伝子改変に使用した。

二重特異性抗体のサイズ分布のキャラクタリゼーションのために、試料をＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅを使用してＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６００７６４０）にロードした。Ｗａｔｅｒ ２９９６ ＰＤＡ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを使用して、２８０ｎｍにおいてタンパク質ピークを検出した。移動相は、０．４ｍＬ／分の流量の、２００ｍＭのＮａＣｌ（ＡＭＲＥＳＣＯ、Ｃａｔ．Ｎｏ．０２４１）を含む均一濃度の２５ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．０４２７２およびＣａｔ．Ｎｏ．０４２６９）、ｐＨ６．８であった。図１７Ａから１７Ｅに示されるように、ピークエリアの一部分によってピークのパーセンテージを特定した。

抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ４は、著しい純度向上が明らかとなった（図１７Ｅ）。純度を向上させるために、再び、当該二重特異性抗体をさらに、ＯＸ４０Ｂ１７ｓｃＦｖ断片において遺伝子改変した。いくつかの二重特異性抗体バリアント、抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５からＶ１２（配列番号２２から配列番号２９）を作製するために、図１８に示したＯＸ４０Ｂ１７ｓｃＦｖにおけるいくつかの残基を異なるアミノ酸で置換し、重鎖バリアントを抗ＰＤ−Ｌ１クローン６軽鎖と対合させ、発現させ、上記において言及したように精製した。二重特異性抗体バリアントの純度を下記の表２にまとめ、当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ−Ｖ５は、これらの抗体バリアントの中で最も純度が高いことが明らかとなった。純度は、最高で９６．４６％まで高まった。これは、遺伝子改変二重特異性抗体において優れた純度を示し、将来におけるこれらの二重特異性抗体の良好な開発能力も明らかとなった。図１９に示されるように、抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５の完全性についてもＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、還元条件下および非還元条件下において良好な完全性を示した。

その一方で、遺伝子改変二重特異性抗体バリアントも、図２０に示されるように直接的ＥＬＩＳＡによるヒトＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０の結合活性評価のために適用した。示される全ての二重特異性抗体バリアントは、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する同じ結合活性を示し（図２１）、この結合活性は、抗ＰＤ−Ｌ１６抗体と同様である。この現象は、ヒトＯＸ４０結合アッセイにおいても観察された（図２２）。抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ１０のみが、ヒトＯＸ４０に対して、他のバリアントと比較して弱い結合活性を示した。それは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖの遺伝子改変が、ＯＸ４０結合活性に影響を及ぼさないことを示した。当該結合活性は、ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０のいずれかに対して保持される。抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５は、優れた抗体純度ならびにＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０に対する結合活性が明らかとなったため、血清安定性に対して、当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５を選択した。

（エクスビボ血清安定性）
当該安定性は、ヒト血清（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＭＳＲＭ）ならびに関連前臨床種：赤毛ザル（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＨＳＳＲＭ）およびＣＤ１マウス（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＳＥＳＲＭ）由来の血清において評価した。１５μｇ／ｍＬの最終濃度となるように、試料を異なる種の血清に加え、３７℃の水浴においてインキュベートした。０日間、１日間、２日間、３日間、７日間、１０日間、および１４日間のインキュベート時間の後で、血清試料を収集し、分析まで−８０℃において冷凍して貯蔵した。

（定量サンドイッチＥＬＩＳＡ）
ＰＢＳ中における１μｇ／ｍＬのＯＸ４０−Ｆｃの１００μＬでＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４４２４０４）をコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ２２８７−５００ｍＬ）を含むＰＢＳとして洗浄緩衝液を調製し、洗浄緩衝液中における１％のＢＳＡ（ＵｎｉＲｅｇｉｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＵＲ−ＢＳＡ００１−１００Ｇ）として、ブロッキング緩衝液を調製した。ブロッキング緩衝液における３×段階希釈による１０倍希釈によって血清試料を調製し、ブロッキング緩衝液における３×段階希釈によって標準物を１０ｎＭにおいて調製した。ビオチン化ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを、標準的プロトコルを使用してＢｉｏｔｉｎ Ｆａｓｔコンジュゲート化キット（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ２０１７９６）によって標識し、ブロッキング緩衝液における３０ｎＭにおいて調製した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ７４０３）を、ブロッキング緩衝液における１μｇ／ｍＬにて調製した。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した後に、全ての試料を１００μＬにおいて各ウェルに加え、周囲温度において１時間インキュベートした。１００μＬのＴＭＢ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．００−２０２３）による２分間のＴＭＢ現像を、１００μＬの１ＮのＨＣｌ溶液（Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１．００３１７．１０００）によって止めた。４５０ｎｍ吸収を、ＥＬＩＳＡ読み取り機（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ＸＳ）によって読み取った。

その優れた純度およびＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０に対する結合活性により、エクスビボ血清安定性のために抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５を選択した。精製された二重特異性抗体を、異なる種（例えば、ヒト、マウス、またはサルなど）に由来する血清と混合した。数日間の培養後、当該試料を取り出し、抗体量を特定するためにサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。図２３に示されるように、当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５は、３７℃での１４日間の培養後において、依然として、良好な血清安定性を示した。抗体の濃度は、依然として、ヒト、マウス、またはサルのいずれかにおいて、７０％超である。そのことは、当該抗体が良好な血清安定性も有することを示した。

Ｔ細胞反応性を調節する当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５の能力を測定するために、精製されたＴ細胞が、数日間かけてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４において単球を培養することによって調製した同種異系樹状細胞と共に培養されるであろう。市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、それぞれ、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを測定するために、３日目および５日目での上清の収集を可能にするように、平行プレートを準備した。図２４Ａおよび２４Ｂに示されるデータのように、ＩＬ−２およびＩＮＦ−γ産生は、抗体処理の３日後および５日後に、二重特異性抗体処理（Ｖ５）ならびに併用処理において非常に上方調節される。さらに、増進は、単独での当該抗ＰＤ−Ｌ１Ａｂまたは抗ＯＸ４０ Ａｂ処理よりも、明らかに優れている。このことは、遺伝子改変二重特異性抗体Ｖ５が、依然として、機能性損失なしに、併用処理と同様にアゴニスト活性を有すること、ならびに、将来において、様々な固形腫瘍または癌のための治療抗体として開発され得ることを意味した。

（二重特異性抗体の抗腫瘍活性（インビボモデル））
二重特異性抗体における当該ＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０の齧歯動物交差反応性の欠如は、当該抗体の抗ヒト腫瘍有効性の評価に対する標準的なマウス同系またはヒト異種移植腫瘍モデルの使用を妨げた。したがって、ベージュ（Ｂｇ）変異欠如マウスのＴおよびＢリンパ球および機能性ＮＫ細胞を有するＳＣＩＤ−Ｂｇマウス（ＣＢ．１７／Ｉｃｒ．Ｃｇ Ｐｋｒｄｃ^ｓｃｉｄＬｙｓｔ^ｂｇ／ＣｒＩ）を使用して、新規のｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ−Ｂｇ異種腫瘍マウスモデルを作製した。当該二重特異性抗体の抗ヒト腫瘍有効性を、下記において説明するようにこのモデルを使用して評価した。

ＰＣ−３ヒト前立腺をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得て、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．ＮＯ． １０４３７）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。細胞を、Ｔ−１５０ファルコンフラスコにおいて培養密度に増殖させた。続いて、細胞を、トリプシン処理し（トリプシン ０．２５％−ＥＤＴＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、インキュベートにとって十分な細胞数に増殖をスケールアップした。製造元のプロトコル（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に従って、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）を使用して、末梢血液リンパ球（ＰＢＭＣ）をヘパリン処理した血液から単離した。各マウスが、ＰＢＳ中における０．１ｍＬの単一ボーラス注入において０．７５×１０^６のＰＢＭＣおよび３×１０^６腫瘍細胞の注入を受けるように、カウントした細胞懸濁液を組み合わせた。当該マウスにおける腫瘍細胞の増殖を促進するために、別の０．１ｍＬのマトリゲルを、当該組み合わせた細胞懸濁液と混合し、すぐに調製マウスに注入した。

各マウスに対して、０．２ｍＬ量の当該組み合わせた細胞懸濁液を、当該動物の右脇腹の皮下に注入した。１４日のインキュベーション後、固形腫瘍が形成され、約２５０ｍｍ^３から３００ｍｍ^３に達し、当該二重特異性抗体（３ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５）、ＰＤ−Ｌ１基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、またはコントロール抗体（アイソタイプ）を、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって３週間にわたり毎週２回与えた。毎週２回、Ｐｒｅｓｓｉｅｒキャリパによる腫瘍測定ならびに実験期間における試験試料投与を行い、ならびに体重も記録した。以下の計算：長さ×幅^２×０．４４＝体積（ｍｍ^３）を用いて腫瘍体積を計算し、図２５にプロットした。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３に達するか、実験の終了前に体重が２０％減少したマウスを研究から除去した。インキュベーションの７日後に腫瘍を測定したところ、同様の結果が観察され、腫瘍体積に従って動物を無作為化した。動物研究のため、各グループは、６匹のマウスを含んでいた。図２５に示されたデータのように、当該二重特異性抗体は、ＰＣ−３異種移植マウスモデルにおいて、著しい抗腫瘍有効性を示した。ＰＤ−Ｌ１基準抗体と同様に、腫瘍サイズは、腫瘍インキュベーションの１８日後に減少に転じ、１００ｍｍ^３未満に減少し続けた。当該ＰＣ−３異種移植マウスモデルは、二重特異性抗体の抗腫瘍について事前実証され、将来における治療薬リードである可能性が明らかとなる。

一括して、これらの結果は、二重特異性抗体が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達におけるその免疫チェックポイント遮断性およびＯＸ４０シグナル伝達のためのアゴニスト活性を維持することを示した。適切な動物モデル（例えば、ヒト化ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍＩｗｊＩ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）モデルにおけるＰＣ−３腫瘍など）を使用してこれらのタンパク質の生物学的活性をさらに調査するために、研究を進める。

本発明におけるＦｃ領域は、任意の免疫グロブリンのアイソタイプ、サブクラス、アロタイプ、遺伝子改変変異体（例えば、ノブおよびホール（ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ）Ｆｃ断片など）に由来し得る。

（実施例）
下記の実施例は、ヒトＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０を標的とする治療目的にとって好適なモノクローナル抗体の作製について説明している。複合体、ヒト抗ヒトＰＤ−Ｌ１および抗ＯＸ４０抗体は、それぞれ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローン６および抗ＯＸ４０抗体クローンＢ１７から作製した。ヒトＶ領域配列のセグメントは、無関係のヒト抗体（生殖系列および非生殖系列）配列データベースを供給源とした。

実施例１ ＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０に結合するＩｇＧ抗体の作製
本発明によって提供されるある特定の抗体を、ヒトＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に結合するＦａｂから独自に作製した。当該Ｆａｂは、対応するＦｃ融合タンパク質（ＰＤ−Ｌ１−ＦｃまたはＯＸ４０−Ｆｃ）および対応するヒトタンパク質（ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０）を発現する細胞における交互パンニング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｐａｎｎｉｎｇ）に従って、ファージディスプレイライブラリであるＯｍｎｉＭａｂファージミドライブラリから選択した。直接的ＥＬＩＳＡまたは細胞ベースのＥＬＩＳＡスクリーニング後、当該ポジティブクローンを、重鎖および軽鎖に対して配列決定した。これらのＦａｂは、ＰＤ−Ｌ１に対して「ＯＭ−ＰＤ−Ｌ１−６」および「ＯＭ−ＰＤＬ１−３２」など、ＯＸ４０に対して「ＯＭ−ＯＸ４０−Ａ４」、「ＯＭ−ＯＸ４０−Ｂ１７」、および「ＯＭ−ＯＸ４０−Ｂ１９」など、として指定されたものを含む。本出願において開示されるＰＤ−Ｌ１抗体ＰＤ−Ｌ１−クローン３、ＰＤ−Ｌ１−クローン６、およびＰＤ−Ｌ１−クローン３２を、「ＯＭ−ＰＤ−Ｌ１−６」および「ＯＭ−ＰＤＬ１−３２」から作製した。その一方で、本出願において開示されるＯＸ４０抗体ＯＸ４０−Ａ４、ＯＸ４０−Ｂ１７、およびＯＸ４０−Ｂ１９は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞において「ＯＭ−ＯＸ４０−Ａ４」、「ＯＭ−ＯＸ４０−Ｂ１７」、および「ＯＭ−ＯＸ４０−Ｂ１９」から作製した。ならびに、ＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０を同時に標的化する二重特異性抗体を、抗ＰＤ−Ｌ１ ６−ＯＸ４０ ｓｃＦｖＢ１７抗体および抗ＰＤ−Ｌ１ ６−ＯＸ４０ ｓｃＦｖＢ１９抗体として設計した。所定のＦａｂの軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、当該軽鎖可変領域および重鎖可変領域の当該アミノ酸配列と同一である。

実施例２ 抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖのその対応する標的へのインビトロ結合
抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０二重特異性抗体を、図１３に示されるように構築し、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞において発現させた。二重特異性抗体を含む培地を、タンパク質Ｇクロマトグラフィによって、培養上清から親和性により精製した。精製された抗体を濃縮し、その後、ＰＢＳ緩衝液において透析し、図１４に示されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０への精製された融合タンパク質の直接結合をＥＬＩＳＡにおいて試験するために、１００ｎｇ／ウェルの組換えＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０で、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。様々な濃度の精製された抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖを各ウェルに加え、１時間インキュベートした。洗浄後、抗ＦａｂＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の１：５０００希釈を各ウェルに加え、さらに１時間インキュベートした。最終洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）を加え、４５０ｎｍにおけるＯＤ吸光度を測定した。当該データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用してＳ字形曲線近似によって解析し、ＥＣ５０を計算した。

実施例３ ＦＡＣＳ分析による抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖの抗原結合特異性
抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体結合特異性を試験するために、安定ＰＤ−Ｌ１発現２９３細胞であるＩＦＮ−γ刺激Ａ５４９またはＷｉＤｒを、氷上で１時間かけて１μｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体で染色し、その後、１×ＰＢＳで３回洗浄した。結合した抗体融合タンパク質を、Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で検出し、その後、ＦＡＣＳ分析を行った。当該試験のネガティブコントロールとして、アイソタイプ抗体を使用した。結果は、抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖが、抗ＰＤ−Ｌ１単独と比較して、その抗原結合特性を維持していることを示した。抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体の結合特異性も、安定ＯＸ４０発現２９３細胞を使用して試験した。

実施例４ 二官能性タンパク質のインビトロ免疫調節効果
Ｔ細胞反応性を調節する当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体の能力を測定するため、精製したＴ細胞を、数日かけてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４において単球を培養することによって調製した同種異系樹状細胞と共に培養する。市販のＥＬＩＳＡキットを使用してそれぞれＩＬ−２およびＩＦＮ−γを測定するために３日目および５日目での上清の収集を可能にするために、平行プレートを準備した。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅのヒト化抗ＰＤ−Ｌ１であるＭＰＤＬ３２８０Ａを、自前で作製し、ポジティブコントロールとして使用した。図１５に示される当該データのように、当該ＩＬ−２およびＩＮＦ−γ産生は、抗体処理の３日または５日後に、二重特異性抗体処理ならびに併用処理において非常に上方調節される。とりわけ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローン６および抗ＯＸ４０抗体クローンＢ１７（抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖＢ１７Ａｂ）によって複合化された当該二重特異性抗体、または組み合わせ物（抗ＰＤ−Ｌ１クローン６Ａｂ＋抗ＯＸ４０クローンＢ１７Ａｂ）は、ＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０基準抗体の組み合わせ物（ＰＤ−Ｌ１ ＲｅｆＡｂ＋ＯＸ４０ ＲｅｆＡｂ）よりも高いＴ細胞活性化の増進を示した。このことは、当該抗ＯＸ４０Ｂ１７抗体が、基準ＯＸ４０抗体ＧＳＫ３１７４９９８と比較してより良好なアゴニスト活性を結果として生じる特殊なエピトープ結合性を有し得ることを示していた。

実施例５ インビボでの二重特異性抗体によって誘起されるヒト白血球増殖
マウスＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０とのＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０抗体における検出可能な交差反応の欠如ならびにヒト免疫細胞の存在に対する要件は、当該二重特異性抗体のインビボ機能性評価のためのモデルの開発を必要とした。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）変異およびＩＬ−２受容体共通ガンマ鎖（一般的に、ＮＳＧと呼ばれる）における欠損を有するＮＯＤ遺伝的背景のマウスは、多くのヒト末梢血白血球（ｈｕＰＢＬ）の移植を支援することができ、少なくとも３０日間、移植を維持することができる（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ｈｕＰＢＬ−ＮＳＧモデルとしても知られるこのマウスモデルを、ヒト免疫細胞に対する当該抗体のインビボ全身性投与の機能効果を評価するために使用した。

詳細には、新たに単離した６００万のヒトＰＢＭＣを、静脈内注入によってｈｕＰＢＬ−ＮＳＧマウスへと養子移入した。ＰＢＭＣ注入の９日間後、当該動物に、腹腔内注入によって、単回１ｍｇ／ｋｇ用量の単一抗体、二重特異性抗体、またはＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体を投与した。ＰＢＭＣ移植の２４日から２８日後に、フローサイトメトリによって評価したヒトおよびマウスＣＤ４５に対する抗体でＰＢＭＣを染色した。リンパ球ゲートを特定するために、前方および側方散乱プロファイルを使用した。移植されたマウスの末梢血におけるヒトＣＤ４５＋細胞の割合の増加によって証明されるように、二重特異性抗体は、ヒト白血球の増殖を高めることができた。各群に対して、ｎ≧６匹のマウス。

実施例６ 抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体によるｈｕＰＢＬ−ＮＳＧにおけるＰＣ−３またはＡ４９８腫瘍細胞増殖の阻害
ｈｕＰＢＬ−ＮＳＧマウスにおいて異種移植モデルを確立するために、ＰＤ−Ｌ１ポジティブヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４３５）または腎癌細胞Ａ４９８（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−４４（商標））を使用することができる。腫瘍形成のために、３×１０^６ＰＣ−３細胞（またはＡ４９８細胞）／マウスが、上記において説明したｈｕＰＢＬ−ＮＳＧマウスに、皮下において注入されるであろう。腫瘍成長に対する阻害効果を評価するために、腫瘍細胞移植の１４日後に、０．１〜３ｍｇ／ｋｇの異なる濃度の抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体、基準抗体、またはアイソタイプの抗体が、毎週２回、４週間にわたってマウスに静脈内投与されるであろう。腫瘍成長は、ＦｏｘＣｈａｓｅＳＣＩＤ（登録商標）Ｂｅｉｇｅマウスモデルにおいて説明したように、最長５週間にわたって毎週２回測定されるであろう。

実施例７ マウスおよびサルにおける抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖの薬物動態評価
１０〜４０ｍｇ／ｋｇの二官能性タンパク質抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖが、皮下注入または静脈内注入によってマウスまたはサルに投与されるであろう。注入後、最長１５日間まで、異なる時点において、血清試料が採取されるであろう。当該血清試料中のＦｃ融合タンパク質の濃度が、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して特定されるであろう。

本発明について、そのある特定の実施形態を参照しながらかなり詳細に説明してきたが、他の実施形態も可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲は、本明細書に含まれる実施形態の説明に限定されるものではない。

本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく本発明の構造に様々な改変および変更を為すことができることは、当業者に明らかであろう。先述の観点から、本発明の改変および変更が以下の特許請求の範囲の範囲内である限り、本発明は、それらを網羅することが意図される。

（発明の分野）
本発明は、抗体に関する。より詳細には、本発明は、癌治療のための抗体に関する。

（関連分野の説明）
ヒトにおけるリンパ球の２つの主要なタイプは、Ｔ（胸腺由来）およびＢ（骨髄由来）である。これらの細胞は、リンパ球発達経路に運命付けられた骨髄および胎児肝臓の造血幹細胞に由来する。これらの幹細胞の後代は、Ｂリンパ球またはＴリンパ球に成熟するための分岐経路に従う。ヒトＢリンパ球発達は、完全に骨髄内において生じる。その一方で、Ｔ細胞は、骨髄を去って血流によって胸腺まで移動する未成熟前駆体から発達し、そこで、それらは、増殖し、成熟Ｔリンパ球へと分化する。

（Ｔ細胞）
Ｔ細胞は、最も大量で（血液リンパ球の約７５％）、強力な免疫キラー細胞である。抗腫瘍性免疫応答におけるエフェクターＴ細胞の役割は、インビトロ研究および、腫瘍のいくつかのタイプにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の高浸潤が好ましい臨床予後と相関関係を有するという観察によって強く支持される（Ｆｒｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。エフェクターナイーブＴ細胞の活性化は、少なくとも３つの相補シグナル：（ｉ）共受容体（ＣＤ４またはＣＤ８）の支援によるＴＣＲ−ＣＤ３／Ａｇ−ＭＨＣ相互作用；（ｉｉ）ＣＤ８０またはＣＤ８６などの共刺激性分子のＣＤ２８、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌへの結合；および（ｉｉｉ）サイトカインなどのアクセサリ分子を必要とする。

Ｔ細胞への共刺激または２つの異なるシグナルの提供は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による静止Ｔリンパ球のリンパ球活性化の、広く受け入れられたモデルである（Ｌａｆｆｅｒｔｙ ａｎｄ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，１９７５）。このモデルは、さらに、自己と非自己との区別および免疫寛容性を提供する（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｃｏｈｎ，１９７０；Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，１９９９；Ｊｅｎｋｉｎｓ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ，１９８７）。一次シグナル、または抗原特異的シグナルは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）との関連において提示される外来抗原ペプチドの認識に従ってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して変換される。二次または共刺激シグナルが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現した共刺激性分子によってＴ細胞に届けられ、Ｔ細胞に、クローン増殖、サイトカイン分泌、およびエフェクター機能を促進するように仕向ける（Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。共刺激の不在下において、Ｔ細胞は、抗原刺激に対して抵抗性となり得、有効な免疫応答を開始せず、さらに、結果として、外来抗原に対して疲弊または寛容性を生じ得る。

（免疫チェックポイントタンパク質：ＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０）
免疫チェックポイントは、通常、付随的な組織損傷を最小限に抑えるため、自己寛容性を維持し、末梢組織における生理学的応答の持続期間および振幅を調節するために、免疫系、具体的にはＴ細胞媒介性免疫を張り巡らせるリガンド−受容体相互作用によって開始される、阻害性および刺激性経路のグループを意味する（Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２）。腫瘍細胞は、免疫抵抗性の主要メカニズムとして、ある特定のチェックポイント経路を選出する。例えば、プログラム細胞死タンパク質１リガンドのＰＤ−Ｌ１は、一般的に、ヒト癌の腫瘍細胞表面において上方制御される。ＰＤ−Ｌ１と、腫瘍浸透リンパ球（ＴＩＬ）、特にＴ細胞、において発現される、その受容体であるＰＤ−１との相互作用は、局所的Ｔ細胞媒介性応答を阻害することにより、免疫監視から逃れる（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｚｎｏｌ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，２０１３）。したがって、癌細胞での免疫抑制性シグナルの阻害、またはＴ細胞の直接的アゴニスト刺激は、強い持続性の抗腫瘍免疫応答を生じるおよび／または誘起する。最近の臨床研究は、抗体を介した、または可溶性リガンドまたは受容体によって調節される、免疫チェックポイントタンパク質の遮断が、治療的抗腫瘍免疫の達成に対する最も有望なアプローチであることを強く示唆した（Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。現在、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４）抗体が、黒色腫などの疾患を治療するために、ＦＤＡによって承認されている。

別の共刺激性分子は、ＯＸ４０受容体（ＣＤ１３４）であり、これは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバであり、膜結合性で、主に、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞において発現される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。ＯＸ４０受容体（本明細書の以下において、「ＯＸ４０」）によるシグナル伝達は、エフェクターＴ細胞に対して共刺激性であり、Ｔ細胞の増殖を引き起こす（Ｗａｔｔｓ，２００５；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。ＯＸ４０の研究は、その主な役割が、一次免疫応答において蓄積するエフェクターＴ細胞の数を決定すること、およびその結果、続いて増殖し生き残る記憶Ｔ細胞の数を支配することであることを示唆している（Ｃｒｏｆｔ，２００３）。いくつかのインビトロ研究は、ＯＸ４０が、共刺激シグナルを提供し、結果として、増強されたＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を生じることを示していた。

（二重特異性／二官能性抗体）
エフェクター免疫細胞に腫瘍細胞を効率的に再標的化させるために二重特異性抗体を使用するアイデアは、１９８０年代に現れた（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。二重特異性抗体は、一般的に、Ｆｃ断片、ＩｇＧ様分子、および小さい組換え二重特異性形式（それらの大部分は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に由来する）の有無に基づいて、異なる薬物動力学特性を有する２つの主要な群に分類される。抗体断片は、それらのコンパクトなサイズにより、通常、ＩｇＧ様分子よりも効率的に腫瘍に浸透するが、この利点は、それらの全体的腫瘍取り込みおよび滞留時間を制限する短い血清半減期（数時間）によって緩和される（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。対照的に、新生児Ｆｃ受容体に結合するＦｃ断片の存在は、ＩｇＧ様形式に対して長い血清半減期（＞１０日）を提供し、これは、腫瘍取り込みおよび滞留に有利に働くが、腫瘍浸透を制限する。

最近の研究は、癌細胞を破壊するために患者自身の免疫系を利用する癌治療の類である免疫療法の治療有効性を強調している。腫瘍内において、まとめて「チェックポイント阻害因子」として知られるネガティブ調節分子のファミリーの存在は、抗腫瘍免疫を抑制するＴ細胞の機能を阻害することができる。ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１などのチェックポイント阻害因子は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を減少させる。アンタゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の標的化された遮断は、抗腫瘍免疫を高めるために、Ｔ細胞上に「ブレーキ」を放出する。最適な「キラー」ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じさせるには、Ｔ細胞受容体活性化と共刺激も必要とし、それらは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む、腫瘍壊死因子受容体のファミリーメンバのライゲーションによって提供することができる。ＯＸ４０は、様々な腫瘍に対する高められた抗腫瘍免疫を生じるＴ細胞分化およびサイトカイン機能を増加させる賦活性（アゴニスト）抗ＯＸ４０ｍＡｂによる治療として、特に関心が高い。単剤として使用される場合、これらの薬物は、転移性疾患を患う患者において、強力な臨床および免疫性応答を引き起こすことができる（Ｌｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

本開示は、前立腺癌、肺癌、ＮＳＣＬＣ、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、ＲＣＣ、または卵巣癌などの癌を患う患者の治療を目的とする免疫調節する二重特異性抗体を調査するために設定された。

本開示は、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号６、配列番号８、配列番号１０のアミノ酸１２８〜２４６、および配列番号１３のアミノ酸１２４〜２４１からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５のアミノ酸１〜１０８、配列番号７のアミノ酸１〜１０８、配列番号１０のアミノ酸１〜１１２、および配列番号１３のアミノ酸１〜１０８からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗体またはその抗原結合性部分を提供する。

一実施形態において、当該抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１０、１１、１２、および１３からなる群より選択される単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）配列である。

一実施形態において、当該抗体またはその抗原結合性部分は、二重特異性抗体である。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、免疫チェックポイントタンパク質結合部位を含む。

一実施形態において、当該免疫チェックポイントタンパク質結合部位は、プログラム細胞死タンパク質１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）結合部位、ＰＤ−１結合部位、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）結合部位、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）結合部位、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）結合部位、またはリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）結合部位を含む。

本開示は、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１のアミノ酸１〜１１１および配列番号３のアミノ酸１〜１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む抗体またはその抗原結合性部分も提供する。

本開示は、少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体も提供し、この場合、当該ポリペプチド鎖は、ＯＸ４０結合部位およびＰＤ−Ｌ１結合部位を含む。当該ＯＸ４０結合部位は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０のアミノ酸１２８〜２４６、および配列番号１３のアミノ酸１２４〜２４１からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５のアミノ酸１〜１０８、配列番号７のアミノ酸１〜１０８、配列番号１０のアミノ酸１〜１１２、および配列番号１３のアミノ酸１〜１０８からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。当該ＰＤ−Ｌ１結合部位は、配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１のアミノ酸１〜１１１および配列番号３のアミノ酸１〜１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。

一実施形態において、当該ポリペプチド鎖は、さらに、Ｆｃドメイン、Ｆａｂ断片、およびｓｃＦｖを含む。当該Ｆａｂ断片は、ＦｃドメインのＮ末端に接続されており、ならびに当該Ｆａｂ断片は、ＰＤ−Ｌ１結合部位を含む。当該ｓｃＦｖは、当該ＦｃドメインのＣ末端に接続されており、ならびに当該ｓｃＦｖは、ＯＸ４０結合部位を含む。

一実施形態において、当該ペプチド鎖は、さらに、ＦｃドメインとｓｃＦｖとの間にリンカーを含む。

一実施形態において、当該ｓｃＦｖは、配列番号１８のアミノ酸４５５〜７０７、配列番号１９のアミノ酸４５５〜７０８、配列番号２０のアミノ酸４５５〜７０１、配列番号２１のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２２のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２３のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２４のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２５のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２６のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２７のアミノ酸４５５〜７０６、配列番号２８のアミノ酸４５５〜７０６、および配列番号２９のアミノ酸４５５〜７０６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、一対のポリペプチド鎖を含む。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ抗体である。

一実施形態において、当該二重特異性抗体は、ＩｇＧ抗体である。

一実施形態において、当該ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。

本開示は、治療薬と、ＰＤ−Ｌ１および／またはＯＸ４０に結合する抗体または抗原結合性部分とを含む抗体−薬物コンジュゲートであって、当該治療薬は、リンカーによって、当該抗体または当該抗原結合性部分に共有結合的にコンジュゲートされている、抗体−薬物コンジュゲートも提供する。

一実施形態において、当該抗体または抗原結合性部分は、上記において言及した抗体または抗原結合性部分から選択される。

本開示は、上記において言及した抗体、その抗原結合性部分、または二重特異性抗体と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。

本開示は、上記において言及した抗体、その抗原結合性部分、または二重特異性抗体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、癌を治療する方法も提供する。

一実施形態において、当該癌は、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、腎細胞腫（ＲＣＣ）、および卵巣癌からなる群より選択される。

本開示は、上記において言及した抗体、その抗原結合性断片、または二重特異性抗体、をコードする核酸分子も提供する。

前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも、一例であり、請求項に係る本発明のさらなる説明を提供することが意図されることは理解されるべきである。

本発明は、以下の添付の図面に対する言及と共に、実施形態についての以下の詳細な説明を読むことによって、より完全に理解することができる。

図１は、Ｔ細胞媒介性免疫を調節する免疫チェックポイントを示す図である。当該チェックポイントに対してアゴニスト的またはアンタゴニスト的である抗体（例えば、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ２８、抗ＯＸ４０、および抗ＣＤ２７、または抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３、抗ＢＴＬＡなど）は、用途に応じて二官能性融合タンパク質を構築するために使用することができた。 図２Ａは、ＰＤ−Ｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞に対する直接的ＥＬＩＳＡによるファージクローンのスクリーニングを示す図である。 図２Ｂは、ＰＤ−Ｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞に対する直接的ＥＬＩＳＡによるファージクローンのスクリーニングを示す図である。 図３Ａは、ＯＸ４０発現ＨＥＫ２９３細胞を用いた細胞ベースＥＬＩＳＡによるファージクローンのスクリーニングを示す図である。 図３Ｂは、ＯＸ４０発現ＨＥＫ２９３細胞を用いた細胞ベースＥＬＩＳＡによるファージクローンのスクリーニングを示す図である。 図４は、完全性および純度を明らかにするための、非還元試薬を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＰＤ−Ｌ１に対して特異的な精製した抗体リードを示す図である。 図５は、完全性および純度を明らかにするための、非還元試薬または還元試薬を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＯＸ４０に対して特異的な精製した抗体リードを示す図である。 図６は、精製した抗免疫チェックポイントタンパク質およびＰＤ−Ｌ１に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードの、直接的リガンド結合活性の実施例を示す図である。最初に、リガンドで予めコーティングされたウェルを、示されるような様々な濃度の抗体リードと共にインキュベートした。次いで、結合したタンパク質を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ特異的抗体で検出し、ＯＤ_４５０の読み取り値をプロットした。 図７は、精製した抗免疫チェックポイントタンパク質およびＯＸ４０に対する抗ＯＸ４０抗体リードの、直接的リガンド結合活性の実施例を示す図である。最初に、リガンドで予めコーティングされたウェルを、示されるような様々な濃度の抗体リードと共にインキュベートした。次いで、結合したタンパク質を、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ特異的抗体で検出し、ＯＤ_４５０の読み取り値をプロットした。 図８は、ＰＤ−Ｌ１発現２９３細胞を使用したフロー解析を示す図である。最初に、ＰＤ−Ｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞を、精製した抗体リードと共にインキュベートし、結合した当該抗体を、Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて検出し、その後、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析を行った。 図９は、ＯＸ４０発現２９３細胞を使用したフロー解析を示す図である。最初に、ＯＸ４０発現ＨＥＫ２９３細胞を、精製した抗ＯＸ４０抗体リードと共にインキュベートし、結合した当該抗体を、Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて検出し、続いて、ＦＡＣＳ分析を行った。ＮＳ：染色せず 図１０は、精製した抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断を示す図である。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害活性を評価するために、示された精製した抗体をビオチン化ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃおよび組換えヒトＰＤ−１／Ｈｉｓ（ｈＰＤ−１／Ｈｉｓ）と共に適用した。結合している組換えＰＤ−Ｌ１−ＦｃおよびｈＰＤ−１／Ｈｉｓをストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ−４８８によって検出し、ＥＬＩＳＡによって分析した。 図１１Ａは、抗体処理の３日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードが、Ｔ細胞増殖を刺激し、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を誘起することを示す図である。 図１１Ｂは、抗体処理の５日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードが、Ｔ細胞増殖を刺激し、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を誘起することを示す図である。 図１２Ａは、抗ＯＸ４０抗体リードおよび基準抗体が用量応答的にＣＤ３＋Ｔ細胞活性化を高める能力を示す図である。 図１２Ｂは、プレートに結合させた抗ＣＤ３によるヒトＴ細胞の３日間の刺激の後の細胞培養培地中に存在するヒトＩＬ−２およびＩＦＮ−γの濃度、ならびに抗ＯＸ４０抗体リードのいくつかの濃度を示す図である。 図１３Ａは、プレートに結合させた抗ＣＤ３によるヒトＴ細胞の３日間の刺激の後の細胞培養培地中に存在するヒトＩＬ−２の濃度、ならびにＯＸ４０特異的抗体リードのいくつかの濃度を示す図である。 図１３Ｂは、プレート結合抗ＣＤ３によるヒトＴ細胞の３日間の刺激の後の細胞培養培地中に存在するＩＦＮ−γの濃度、ならびにＯＸ４０特異的抗体リードのいくつかの濃度を示す図である。 図１４は、ＯＸ４０特異的ｓｃＦｖドメインと融合した抗体重鎖Ｆｃの構造を示す図である。 図１５は、抗免疫チェックポイント抗体−ヒトＯＸ４０融合タンパク質のＰＡＧＥ−ゲル分析の例を示す図である。精製した融合タンパク質である抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ融合タンパク質が、分子量約２２０ｋＤａ（非還元）を有することが示されており、両方の抗体融合物において、重鎖融合物は、約８５ｋＤａを有し、軽鎖は約２５ｋＤａ（還元）である。 図１６Ａは、二重特異性抗体が、単一、混合、または抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ二重特異性抗体処理の３日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生に対するＴ細胞活性化を相乗作用的に刺激することを示す図である。 図１６Ｂは、二重特異性抗体が、単一、混合、または抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ二重特異性抗体処理の５日後の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生に対するＴ細胞活性化を相乗作用的に刺激することを示す図である。 図１７Ａは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖにおける異なるリンカーを有する二重特異性抗体の抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂの凝集および純度測定を示す図である。 図１７Ｂは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖにおける異なるリンカーを有する二重特異性抗体の抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ１の凝集および純度測定を示す図である。 図１７Ｃは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖにおける異なるリンカーを有する二重特異性抗体の抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ２の凝集および純度測定を示す図である。 図１７Ｄは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖにおける異なるリンカーを有する二重特異性抗体の抗抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ３の凝集および純度測定を示す図である。 図１７Ｅは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖにおける異なるリンカーを有する二重特異性抗体の抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ４の凝集および純度測定を示す図である。 図１８は、抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ４〜Ｖ１２（配列番号３０〜３８）のＯＸ４０クローンＢ１７ｓｃＦｖにおける配列バリアントを示す図である。 図１９は、抗免疫チェックポイント抗体−ヒトＯＸ４０融合タンパク質のＰＡＧＥ−ゲル分析の例を示す図である。精製した融合タンパク質である抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５融合タンパク質が、分子量約２２０ｋＤａ（非還元）を有することが示されており、両方の抗体融合物において、重鎖融合物は、約８０ｋＤａを有し、軽鎖は約３０ｋＤａ（還元）である。 図２０は、二重特異性抗体バリアントの結合活性評価のためのＥＬＩＳＡ法を説明するフローチャートを示す図である。 図２１は、二重特異性抗体バリアントのヒトＰＤ−Ｌ１結合活性およびそのＥＣ５０を示す図である。 図２２は、二重特異性抗体バリアントのヒトＯＸ４０結合活性およびそのＥＣ５０を示す図である。 図２３は、二重特異性抗体バリアントである抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５のエクスビボ血清安定性を示す図である。 図２４Ａは、単一、混合、または抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５二重特異性抗体処理によってＴ細胞を調節した３日後のＩＬ−２産生を示す図である。 図２４Ｂは、単一、混合、または抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５二重特異性抗体処理によってＴ細胞を調節した５日後のＩＦＮ−γ産生を示す図である。 図２５は、Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ（登録商標）ＢｅｉｇｅマウスにおけるＰＣ−３腫瘍の増殖に対する抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５二重特異性抗体処理およびモノクローナル抗体処理の効果を示す図である。

（詳細な説明）
参照は、以下において、本発明の本実施形態に対して詳細になされ、その例は、添付の図面に示される。同じまたは同様の部分を参照するために、図面および説明において、可能な限り、同じ参照番号が使用される。

本発明は、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体のＦｃドメインのＣ末端に融合された単離された機能性アゴニストＯＸ４０ ｓｃＦｖを用いた二官能性タンパク質の発現、精製、および特徴付けについて説明する。これらのタンパク質は、Ｔ細胞関与免疫を調節するために阻害性または刺激性シグナルを伝達するその対応するチェックポイント標的と相互作用する。本発明におけるＦｃ融合タンパク質の成分は、全てヒト起源であり、したがって、非免疫原性であることが期待され、ならびにヒトの治療に使用することができる。

二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）などの二重特異性分子は、単一の治療薬によって、同じ分子標的または異なる標的上の複数のエピトープを同時に標的化する手段を提供する。癌治療として、それらは、２種のｍＡｂの混合物とは対照的に、新規のまたはより強力な活性を付与し、商品コストを下げ、新規の治療計画の開発を促進する、可能性を有する（Ｃｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｂａｔｙ，２００９；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２００９；Ｔｈａｋｕｒ ａｎｄ Ｌｕｍ，２０１０）。最近、ヒト上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）およびＣＤ３を標的とする三官能性二重特異性抗体であるカツマキソマブが、上皮癌の腹膜癌症を患う患者において明確な臨床的有益性を示し（Ｈｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ＣＤ１９およびＣＤ３に対する二重特異性を有する二重特性Ｔ細胞誘導（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ：ＢｉＴＥ）抗体も、ＣＤ１９を発現する血液悪性腫瘍を患う患者において、臨床的活性を高めることを実証した（Ｂａｒｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）。癌治療としての二重特異性分子の開発に対する強い関心にもかかわらず、安定で活性な二重特異性分子の製造における技術的課題は、過去において、ほとんどの二重特異性形式の臨床評価を妨げてきた。ＩｇＧ様二重特異性抗体を含む多くの遺伝子改変抗体形式は、安定性または溶解性を妥協してきた（Ｂａｒｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｄｅｍａｒｅｓｔ ａｎｄ Ｇｌａｓｅｒ，２００８；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）。その上、二重特異性分子の製造物品質およびインビボ安定性を増加させるために、ペグ化、ヒト血清アルブミンとのコンジュゲート化、およびＦｃ遺伝子改変を含む、いくつかの戦略が取られてきた（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。上記において説明される一般的な形式の二重特異性単鎖抗体は、４つのＶドメインをコードするヌクレオチド配列、２つのリンカー、および１つのスペーサーを、単一のプロモータの制御下において、好適な宿主発現生物に組み込むことができるという利点を有する。このことは、作製の際の実験者による制御の度合いと同様に、これらの構築物を設計する際のフレキシビリティーを増加させる。さらに、ＩｇＧのＦｃは、結合能力を除く全ての抗体の機能を含むため、新規の治療法を設計するための非常に魅力的な別の足場である。Ｆｃ遺伝子改変は、当該二重特異性抗体の有効性を向上させるために重要である。したがって、本発明では、免疫療法における免疫細胞または標的細胞上の２つの非依存性標的に対して、ＩｇＧベースの立体配座を使用している。

免疫チェックポイントタンパク質の標的化は、抗腫瘍免疫を活性化するための、将来有望なアプローチである。抗チェックポイントタンパク質（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３など）は、現在、臨床的に評価されている（図１）。免疫チェックポイントタンパク質の遮断剤による予備的データは、持続性の臨床反応を生じさせる可能性を有する抗腫瘍免疫を増加させることができることが分かっている。しかしながら、多くの悪性腫瘍におけるこれらの薬剤の顕著な臨床有効性にもかかわらず、それらが、多くの患者にとって十分に有効ではないことが明らかになった。多数の追加の免疫調節経路ならび、腫瘍内微小環境において骨髄細胞または間質細胞によって発現または分泌される阻害因子は、免疫チェックポイント遮断との相乗作用のための潜在的標的である。したがって、抗癌療法または二重特異性抗体療法を組み合わせることは、癌を患う患者に対して完全な寛解および回復を達成するために不可欠であった。

本発明は、異なる免疫チェックポイントタンパク質特異的ｓｃＦｖタンパク質と融合した抗免疫チェックポイントタンパク質抗体Ｆｃの構築、発現、およびキャラクタリゼーションについて説明する。例えば、融合の相手方が、免疫系増強剤（例えば、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２、または抗ＣＴＬＡ−４抗体など）である場合、融合構築物においてＣ末端に位置されたＯＸ４０ ｓｃＦｖは、ＯＸ４０活性化アプローチを超える融合タンパク質の力の拡張を可能にする。

（ＯｍｎｉＭａｂライブラリからの抗体生成）
ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に対する治療抗体の生成のために、ＯｍｎｉＭａｂファージミドライブラリによる選択を実施した。当該ファージミドライブラリは、百を超える健康なドナーＢ細胞のコレクションからＡＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（ＡＰＢｉｏ Ｉｎｃ．）によって生成される。パンニングの第一ラウンドのためのファージを、Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ（Μ１３Κ０７ΔρΙΙΙ、Ｐｒｏｇｅｎ，ハイデルベルク，ドイツ）によって調製した。ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０特異的バインダー選択およびＯｍｎｉＭａｂライブラリからの単離に対して、ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に対する固相パンニングおよび細胞パンニングを適用した。固相パンニングは、第一ラウンド選択において組換えヒトＰＤ−Ｌ１−ＦｃまたはＯＸ４０−Ｆｃ（ＡＰＢｉｏ Ｉｎｃ．）を使用して実施し、次いで、第二および第三ラウンドの濃縮に対して、ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０を発現したＨＥＫ２９３細胞を使用した。３つのラウンド選択の後、当該特異的ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０バインダーをスクリーニングし、対応する組換えタンパク質による直接的ＥＬＩＳＡまたは細胞ベースＥＬＩＳＡによって単離した（図２Ａ、２Ｂ、３Ａ、および３Ｂ）。予めコーティングしたＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ組換えタンパク質またはＯＸ４０発現２９３細胞を、レスキューされたファージを含有する上清を用いて１時間ブロットし、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージを、ＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体（Ｒｏｃｈｅ）によって検出し、シグナル発生のために、ＴＭＢ基質を使用した。ＯＤ４５０の読み取り値を記録した。ポジティブバインダーを単離し、重鎖および軽鎖の配列および多様性を確認するために配列決定を行った。ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に対して特異的な重鎖および軽鎖の可変領域は、配列番号１から配列番号８で記述され：この場合、配列番号１は、ＰＤ−Ｌ１クローン６の軽鎖であり、配列番号２は、ＰＤ−Ｌ１クローン６の重鎖の可変領域であり、配列番号３は、ＰＤ−Ｌ１クローン３２の軽鎖であり、配列番号４は、ＰＤ−Ｌ１クローン３２の重鎖の可変領域であり、配列番号５は、ＯＸ４０クローンＢ１７の軽鎖であり、配列番号６は、ＯＸ４０クローンＢ１７の重鎖の可変領域であり、配列番号７は、ＯＸ４０クローンＢ１９の軽鎖であり、配列番号８は、ＯＸ４０クローンＢ１９の重鎖の可変領域である。図２Ａ、２Ｂ、３Ａ、および３Ｂに示されるように、いくつかのクローンを単離し、それらは、ネガティブコントロールと比較して、対応する抗原に対して特異的に認識されることが分かった。

（ＩｇＧ形式としての選択されたＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０特異的バインダーのサブクローニングおよび発現／精製）
Ｔ細胞活性化における機能性を有する特異的バインダーの迅速なスクリーニングを容易にするために、ＥＬＩＳＡによるＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に対するポジティブバインダーの重鎖および軽鎖を増幅し、消化し、ＩｇＧ４定常領域（配列番号９）を保持するＡＰＢｉｏ専用ＩｇＧ発現ベクター中へサブクローニングした。配列検証後、プラスミドを調製し、抗体発現のために、２９３フェクチントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってＨＥＫ２９３細胞中へとトランスフェクトした。４日間の培養後、無血清培地中に分泌された抗体を、タンパク質Ｇクロマトグラフィによって、培養上清から親和性により精製した。次いで、精製された抗体を濃縮し、その後、ＰＢＳ緩衝液において透析した。透析したタンパク質の最終濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計によって特定し、図４および５に示されるように、還元試薬を用いてまたは用いずに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度および完全性を特定した。精製された様々な抗体リード、ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０特異的のどちらか、の完全性は、基準抗体、ＰＤ−Ｌ１に対してはＭＰＤＬ３２８０ＡまたはＯＸ４０に対してはＧＳＫ３１７４９９８、と同様に、ＨＥＫ２９３細胞において正常である。

一実施形態において、本開示は、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性部分を提供する。当該重鎖可変領域は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０のアミノ酸１２８〜２４６、および配列番号１３のアミノ酸１２４〜２４１からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該重鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、または９５％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。当該軽鎖可変領域は、配列番号５のアミノ酸１〜１０８、配列番号７のアミノ酸１〜１０８、配列番号１０のアミノ酸１〜１１２、および配列番号１３のアミノ酸１〜１０８からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該軽鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、または９５％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、本開示は、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合性部分を提供する。当該重鎖可変ドメインは、配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該重鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、または９５％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。当該軽鎖可変ドメインは、配列番号１のアミノ酸１〜１１１および配列番号３のアミノ酸１〜１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該軽鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、または９５％の配列相同性のアミノ酸配列を含む。

（直接的ＥＬＩＳＡによるＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０特異的ＩｇＧリードの結合活性の特定）
直接的コーティングされた設定において、ヒトＰＤ−Ｌ１−ＦｃまたはＯＸ４０−Ｆｃに対するＥＬＩＳＡ結合キャラクタリゼーションのために、ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に対する精製された抗体リード（抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードまたは抗ＯＸ４０抗体リード）を適用した。図６および７は、それぞれ、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＯＸ４０抗体に対するＥＬＩＳＡ結合結果を示した。ＰＤ−Ｌ１特異的抗体の場合、ほとんどのリードは、基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ，ＭＰＤＬ３２８０Ａ，Ｒｏｃｈｅ）に対して、同様のまたはより良い結合活性を示した。

精製されたヒトＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０ＩｇＧ１Ｆｃキメラ（ＰＤ−Ｌ１−ＦｃまたはＯＸ４０−Ｆｃ、ＡＰＢｉｏ）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において透析し、１ｍｇ／ｍＬに調節して、次いで、ＰＢＳによって１μｇ／ｍＬの最終濃度へと希釈した。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートを、ウェルあたり０．１ｍＬにおいて組換えＰＤ−Ｌ１−ＦｃまたはＯＸ４０−Ｆｃキメラでコーティングし、非特異的結合コントロールに対しては空のウェルのままにして、４℃で一晩インキュベートした。当該ＰＤ−Ｌ１−ＦｃまたはＯＸ４０−Ｆｃキメラ溶液を除去し、当該プレートを０．４ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中における０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。０．４ｍＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中における５％の低脂肪ミルク粉末）を全てのウェルに加え、撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。当該ブロッキング緩衝液を除去し、プレートを０．４ｍＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＰＢＳにおいて当該ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０試験抗体の段階希釈を調製し、０．１ｍＬの希釈されたＡｂを各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。抗体溶液を除去し、当該プレートを、ウェルあたり０．４ｍＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧであるＦ（ａｂ’）_２特異的Ｆ（ａｂ’）_２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９−０３６−０９７）を、ＰＢＳで１：２０００に希釈し、各ウェルに０．１ｍＬを加えた。当該プレートを室温で１時間インキュベートし、ウェルあたり０．４ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄した。０．１ｍＬのＴＭＢ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、室温で１〜５分間インキュベートした。０．０５ｍＬの１ＮのＨＣｌを加えることによって反応を止め、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｓｐｅｃｔｒａにおいて、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。ＰＤ−Ｌ１に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードの計算されたＥＣ５０は、ほとんどのリードが、直接的ＥＬＩＳＡにより、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｅｆ Ａｂ）と同様に、良好な結合活性を有することを示した（図６）。対照的に、ほとんどの抗ＯＸ４０抗体リードは、基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ、ＧＳＫ３１７４９９８）と比較して、著しく低い結合活性を示した（図７）。

（ＦＡＣＳによるＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０特異的ＩｇＧリードに対する結合活性の特定）
ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０を発現したＨＥＫ２９３細胞を用いて結合活性を特定して結合活性を比較するために、フローサイトメトリに対しても、精製された抗体リード（抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードまたは抗ＯＸ４０抗体リード）を適用した。図８および９は、安定発現されたＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０のＨＥＫ２９３細胞を用いたＦＡＣＳによって示されるように、対応する抗体リードの結合活性を示している。

ＰＤ−Ｌ１結合活性を調べるために抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードで染色したＰＤ−Ｌ１安定発現２９３細胞のＦＡＣＳ分析のために、安定発現細胞を、１μｇ／ｍＬの精製した抗ＰＤ−Ｌ１抗体リード、基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ ＭＰＤＬ３２８０Ａ）と共に、またはネガティブコントロールとしてのアイソタイプ抗体と共に、氷上で１時間インキュベートした。当該細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）と共に、氷上でさらに１時間インキュベートした。染色後、当該細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁させ、その後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ，ＬＬＣ）によって分析した。同じシナリオにおいて、図９において安定発現したＯＸ４０のＨＥＫ２９３細胞に対する抗ＯＸ４０抗体リードの結合活性も、同じ戦略で実行し、上記において説明したように分析した。図８に示されるように、ほとんどの抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードは、基準抗体と同様に、良好な結合活性を有する。このことは、ＯｍｎｉＭａｂライブラリから選択されたファージクローンが、実際に、当該細胞におけるネガティブＰＤ−Ｌ１を認識することを示した。

この現象は、図９に示されるように、抗ＯＸ４０抗体リードに対しても観察される。ＯＸ４０結合活性を調べるために、精製された抗ＯＸ４０抗体リードで染色したＯＸ４０安定発現２９３細胞クローン２Ｄ５のＦＡＣＳ分析のために、安定発現細胞を、コントロール抗体として２μｇ／ｍＬの抗ＯＸ４０基準Ａｂ（ＯＸ４０ ｒｅｆ．）または抗ＣＤ１３７基準Ａｂ（ＣＤ１３７ ｒｅｆ．）と共に、氷上で１時間インキュベートした。当該細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）と共に、氷上でさらに１時間インキュベートした。染色後、当該細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁させ、その後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）およびＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ、ＬＬＣ）によって分析した。

（リガンド競合結合（ＥＬＩＳＡアッセイ））
抗体リードは、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断する能力について本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードを評価するために使用される結合選択性および親和性アッセイを示した。

組換えヒトＰＤ−１／Ｈｉｓ（ｈＰＤ−１／Ｈｉｓ）へのヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃキメラ（ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ）の結合を遮断する能力について、ＥＬＩＳＡによって抗体を試験した。精製された組換えｈＰＤ−１／Ｈｉｓ（ＡＰＢｉｏ）を、ＰＢＳ中における１ｍｇ／ｍｌへと透析し、次いで、ビオチン（Ａｂｃａｍ）とコンジュゲートさせた。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートを、ウェルあたりＰＢＳ中における２５０ｎｇのｈＰＤ−１／Ｈｉｓで一晩かけてコーティングした。当該ｈＰＤ−１／Ｈｉｓ溶液を除去し、当該プレートを０．４ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中における０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。０．４ｍＬブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中における５％の低脂肪ミルク粉末）を全てのウェルに加え、撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。ブロッキングステップの際、当該抗体ストックを、２倍の段階希釈によって、ＰＢＳ中における２００ｎＭから０ｎＭの範囲で希釈した。精製した組換えビオチン化ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃキメラを、ＰＢＳ中における４μｇ／ｍＬに希釈した。ＰＤ−１／Ｈｉｓでコーティングしたプレートを、０．２ｍＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中における０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。６０μＬの抗体希釈物（抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードまたはＲｅｆ Ａｂ ＭＰＤＬ３２８０Ａ）を６０μＬのビオチン化ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃキメラと一緒に加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを、前に説明したように洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰを、ＰＢＳ中において１：２０００に希釈し、結果として得られる溶液の１００μＬを、洗浄したプレートのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを、前に説明したように洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質溶液を各ウェルに加え、１０分間インキュベートした。５０μＬの１ＮのＨＣｌによって反応を止め、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ読み取り機を使用して４５０ｎｍの吸光度を読み取り、図１０に示した。部分抗体リードは、競合ＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−ＰＤ−Ｌ１の間の相互作用を阻害することが示された。ほとんどの抗体リードは、基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ ＭＰＤＬ３２８０Ａ）と比較した場合、同様のブロッキング活性を示した。

（抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対するＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１リガンド相互作用の阻害によるＴ細胞活性化の刺激増強）
当該ＰＤ−１シグナル伝達経路は、中程度のＴＣＲ／ＣＤ２８共刺激シグナルを阻害し、その場合、最初に、Ｔ細胞増殖を減少することなく、サイトカイン産生が減少する。当該ＴＣＲ／ＣＤ２８共刺激シグナルが弱まると、当該ＰＤ−１経路が支配的となり、サイトカイン産生の著しい減少は、増殖の減少を伴う。したがって、本発明のヒト抗体のＰＤ−Ｌ１との相互作用の阻害を介した当該ＰＤ−１の阻害がＴ細胞活性化を高めることを検証するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を実施する。

ヒト全血液由来の単球を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５０６８）によって濃縮し、１０％のＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬ（１０００Ｕ／ｍＬ）のＧＭ−ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍＬ（５００Ｕ／ｍＬ）を伴う分化培地ＲＰＭＩ １６４０において６日間培養した。分化を検証するために、単球由来の当該分化樹状細胞（ＤＣ）を、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＰＥ、ＦＩＴＣ Ａｂとコンジュゲートした抗ＣＤ１４、ＰＥ Ａｂとコンジュゲートした抗ＣＤ８３、またはＦＩＴＣ Ａｂとコンジュゲートした抗ＣＤ８０によって点検し、ＭＬＲにおいてＡＰＣとして使用した。

ヒト全血由来の同種異系ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｃａｔ．ＮＯ． １５０６２）によって単離した。純度が９５％超であることを確実にするために、ＣＤ４＋Ｔ細胞の純度を抗ＣＤ４コンジュゲート化ＡＰＣ Ａｂによって確認し、Ｔ細胞増殖アッセイのために、１ｕＭのＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．ＮＯ． Ｃ３４５５４）によって標識した。当該抗体リードが、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を遮断することによってＴ細胞活性化を回復できるかどうかを見るため、３日間および５日間において、示されるような異なる抗体リードを伴う未成熟ＤＣと共に共培養するために、標識したＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した。３日間および５日間のインキュベート後、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−２およびＩＦＮ−γ定量化など、サイトカインのために上清を収集した。未成熟樹状細胞と同種異系Ｔ細胞とによる培養物への抗ＰＤ−Ｌ１抗体リード（クローン６、３２、２８、５１、６４、２７、および３７）の添加は、結果として、アイソタイプＩｇＧ（イソ＃１、＃２）で処理された培養物と比較して、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生における増加を生じることが予想され、図１１Ａおよび１１Ｂに示した。当該ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生は、特に抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローン６の場合、抗体処理の３日（図１１Ａ）または５日（図１１Ｂ）後において、アイソタイプの抗体処理と比較して、ＭＬＲにおいて著しく増加する。サイトカインの増分は、抗体処理の５日後においても、依然として明らかであり、基準抗体（ｒｅｆ）であるＭＰＤＬ３２８０Ａと同様である。このことは、当該抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローン６が、二重特異性抗体複合物のための潜在的リードの１つであることを示した。

（抗ＯＸ４０抗体のアゴニスト活性アッセイ）
Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生のＯＸ４０共刺激を活性化するために、精製された抗体リードを、サイトカイン産生、増殖を高めるそれらの能力、およびヒトＣＤ３＋Ｔ細胞における増殖を誘起する能力について、機能的にスクリーニングした。当該抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｃａｔ．Ｎｏ．３１７３０４）および抗ＯＸ４０抗体リード（クローンＢ６、Ｂ７０、Ｂ１２０、Ａ４、Ｂ１７、Ｂ１９、およびＢ３０）、基準抗体（ＧＳＫ３１７４９９８）またはアイソタイプの抗体（アイソ＃１、＃２）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレートにコーティングした。その一方で、ナイーブヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、製造元の説明に従って市販のＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｃａｔ．Ｎｏ．１５０６１）を使用して、健康な成人のボランティア由来のヒト血液から単離した。次いで、当該単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．ＮＯ． Ｃ３４５５４）によって標識し、細胞増殖およびサイトカイン産生を特定するために、ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％のウシ胎仔血清、および２．５ｍＭのＬ−グルタミンの入った、抗体で予めコーティングしたウェルに、１×１０^６細胞／ｍＬにおいて播種した。３日間の培養後、フローサイトメトリによる増幅アッセイのために当該細胞を収集し、次いで、定量ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生について培地を分析した。

Ｔ細胞活性においてアンタゴニスト活性を有する抗ＯＸ４０抗体リードのスクリーニングを、図１２Ａに示した。全ての抗ＯＸ４０抗体リードは、基準抗体と同様の用量応答において当該ＣＤ３＋Ｔ細胞活性化を高める能力を示した。より高い用量の抗体処理は、明確により高いＴ細胞活性化活性を示した。その一方で、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなど、サイトカイン産生（図１２Ｂ）も、とりわけ、抗ＯＸ４０抗体リードクローンＢ１７の場合、同様のＴ細胞活性化反応が明らかとなった。サイトカインは、抗ＯＸ４０抗体リードＢ１７による３日間の処理後、非常に誘起される。増進は、基準抗体処理よりもはるかに高く、このことは、クローンＢ１７が、二重特異性抗体構築のための候補の１つであることを意味した。

図１３Ａおよび図１３Ｂに示されたデータのように、抗ＯＸ４０抗体リードであるクローンＢ１７およびＢ１９の両方は、抗ＯＸ４０抗体リード（Ｂ１７またはＢ１９）による３日間の処理の後のアッセイにおいて、より良好なアゴニスト活性を示した。ＩＬ−２産生またはＩＦＮ−γ産生のいずれかは、抗体処理において明確な増進を示し、用量依存性相関関係を示した。より高い用量での抗体処理において、より高いサイトカイン産生が記録された。

ＯＸ４０抗体リードＢ１７およびＢ１９のアゴニスト活性を評価するために、アゴニスト活性アッセイと同様に、ＥＣ５０も特定し、比較のためにサイトカイン産生を記録した。

（抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体の構築、発現、および精製）
二重特異性が、ｓｃＦｖ形式と融合されたＩｇＧベースとして設計されるため、抗免疫チェックポイント抗体の構造に、ＯＸ４０ ｓｃＦｖをＦｃ末端において融合させた。抗体は、阻害性抗免疫チェックポイント抗体（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３など）、または刺激性抗体（例えば、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２７、抗ＩＣＯＳなど）であり得る。図１４に表されるように、二重特異性抗体を生成するために、リンカーが、抗体ＦｃとＯＸ４０ ｓｃＦｖとの間に位置される。

いくつかの実施形態において、当該抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードクローン６が、ＩｇＧ形式であるように割り当てられ、その一方で、当該抗ＯＸ４０抗体リードは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体リードクローン６におけるＦｃ領域のＣ末端において融合させるために、ｓｃＦｖ形式として転換されるであろう。抗体からｓｃＦｖ形式への転換は、結果として、結合活性または特異性の減少を生じることができ、したがって、いくつかの抗ＯＸ４０抗体リードを、ｓｃＦｖ転換に使用した。二官能性抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｆｃの構築物を、完全長ＯＸ４０ ｓｃＦｖ（クローンＡ４としての配列番号１０、クローンＢ１７としての配列番号１１、クローンＢ１９としての配列番号１２、またはクローンＢ１２０としての配列番号１３）と融合させた。正確な折り畳みを確実にし、立体障害を最小にするために、短いフレキシブルなペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）_２（配列番号１４）を、例えば、Ｆｃ領域の抗ＰＤ−Ｌ１抗体重鎖Ｃ末端と、ＯＸ４０ ｓｃＦｖのＮ末端モジュールとの間に位置した。抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体のコード配列を、配列番号１６（抗ＰＤ−Ｌ１−クローン６重鎖−ＯＸ４０クローンＢ１７ｓｃＦｖ）および配列番号１７（抗ＰＤ−Ｌ１−クローン６重鎖−ＯＸ４０クローンＢ１９ｓｃＦｖ）に示した。構築された抗体Ｆｃ融合タンパク質を、シグナルペプチド（配列番号１５）によってリードし、哺乳動物細胞によって発現させ、ならびにトランスフェクトされた細胞培養上清から一段階タンパク質Ｇクロマトグラフィによって精製した。図１５に示されるように、一段階精製プロセスにおいて９０％を超える純度を得ることができ、それは、精製された融合タンパク質が正しい分子量（Ｍｗ＝２２０ｋＤ）を有することを示す。

（ＭＬＲにおける抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ二重特異性抗体リードに対するＴ細胞活性化の刺激の増強）
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用およびＯＸ４０シグナル伝達のアゴニスト活性化の阻害によってＴ細胞活性化を高めることにおける二重特異性抗体の相乗的協力を特定するために、二重特異性抗体リードの抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖを、上記において説明したようにＭＬＲに適用した。次いで、抗体処理の３日後または５日後に、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生を記録した。Ｔ細胞活性化増進における相乗効果を比較するために、単一、併用、または二重特異性抗体を等しい量または等しいモルにおいて適用し、アイソタイプＩｇＧをネガティブコントロールとして使用した。図１６Ａおよび１６Ｂに示されたデータのように、当該抗ＰＤ−Ｌ１抗体リード単独は、基準抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａと同様に、処理の３日後に著しいＩＬ−２誘導を示したが、対照的に、当該抗ＯＸ４０抗体リードは、抗体処理の３日後または５日後のいずれかにおいて、サイトカイン産生の明確な上方調節を増加することができない。このことは、基準抗体ＧＳＫ３１７４９９８と一致している。しかしながら、当該抗ＯＸ４０抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体との併用は、抗体処理の３日後および５日後におけるサイトカイン産生の著しい上方調節を示した。当該相乗効果は、二重特異性抗体リード処理においても観察され、サイトカイン産生の増分は、併用処理と同様である。このことは、抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ二重特異性抗体リードも、当該ｓｃＦｖ転換において結合活性の損失なしに、抗体併用処理と同様に機能することを示した。

（二重特異性抗体の凝集および純度の特定）
精製された抗ＰＤ−Ｌ１−クローン６−ＯＸ４０クローンＢ１７ｓｃＦｖＡｂは、単一カラムタンパク質Ａクロマトグラフィ精製の後のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析によって、低い純度（７４．０７％）であることが明らかとなり、したがって、純度を向上させるため、および本発明の二重特異性抗体の凝集を低減するために、いくつかの抗体バリアントを作製した。二重特異性抗体抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ（配列番号１６）において、ＯＸ４０Ｂ１７ｓｃＦｖにおけるリンカーの代わりに、上記において説明したリンカーを使用し、ＣＨＯ細胞において抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ１からＶ４（配列番号１８から配列番号２１）として作製した。これらのバリアントを精製し、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６００７６４０）によって分析した。当該データを下記の表１にまとめ、二重特異性抗体バリアントの１つである抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ４は、抗体純度を著しく向上させることが明らかとなった。純度は、７４．０７％から９２．２７％に高められる。したがって、当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ４を、当該抗体純度を向上させるために、さらなる遺伝子改変に使用した。

二重特異性抗体のサイズ分布のキャラクタリゼーションのために、試料をＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅを使用してＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１８６００７６４０）にロードした。Ｗａｔｅｒ ２９９６ ＰＤＡ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを使用して、２８０ｎｍにおいてタンパク質ピークを検出した。移動相は、０．４ｍＬ／分の流量の、２００ｍＭのＮａＣｌ（ＡＭＲＥＳＣＯ、Ｃａｔ．Ｎｏ．０２４１）を含む均一濃度の２５ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．０４２７２およびＣａｔ．Ｎｏ．０４２６９）、ｐＨ６．８であった。図１７Ａから１７Ｅに示されるように、ピークエリアの一部分によってピークのパーセンテージを特定した。

抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ４は、著しい純度向上が明らかとなった（図１７Ｅ）。純度を向上させるために、再び、当該二重特異性抗体をさらに、ＯＸ４０Ｂ１７ｓｃＦｖ断片において遺伝子改変した。いくつかの二重特異性抗体バリアント、抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５からＶ１２（配列番号２２から配列番号２９）を作製するために、図１８に示したＯＸ４０Ｂ１７ｓｃＦｖにおけるいくつかの残基を異なるアミノ酸で置換し、重鎖バリアントを抗ＰＤ−Ｌ１クローン６軽鎖と対合させ、発現させ、上記において言及したように精製した。二重特異性抗体バリアントの純度を下記の表２にまとめ、当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ−Ｖ５は、これらの抗体バリアントの中で最も純度が高いことが明らかとなった。純度は、最高で９６．４６％まで高まった。これは、遺伝子改変二重特異性抗体において優れた純度を示し、将来におけるこれらの二重特異性抗体の良好な開発能力も明らかとなった。図１９に示されるように、抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５の完全性についてもＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、還元条件下および非還元条件下において良好な完全性を示した。

その一方で、遺伝子改変二重特異性抗体バリアントも、図２０に示されるように直接的ＥＬＩＳＡによるヒトＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０の結合活性評価のために適用した。示される全ての二重特異性抗体バリアントは、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する同じ結合活性を示し（図２１）、この結合活性は、抗ＰＤ−Ｌ１６抗体と同様である。この現象は、ヒトＯＸ４０結合アッセイにおいても観察された（図２２）。抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ１０のみが、ヒトＯＸ４０に対して、他のバリアントと比較して弱い結合活性を示した。それは、ＯＸ４０ ｓｃＦｖの遺伝子改変が、ＯＸ４０結合活性に影響を及ぼさないことを示した。当該結合活性は、ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０のいずれかに対して保持される。抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５は、優れた抗体純度ならびにＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０に対する結合活性が明らかとなったため、血清安定性に対して、当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５を選択した。

（エクスビボ血清安定性）
当該安定性は、ヒト血清（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＭＳＲＭ）ならびに関連前臨床種：赤毛ザル（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＨＳＳＲＭ）およびＣＤ１マウス（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＳＥＳＲＭ）由来の血清において評価した。１５μｇ／ｍＬの最終濃度となるように、試料を異なる種の血清に加え、３７℃の水浴においてインキュベートした。０日間、１日間、２日間、３日間、７日間、１０日間、および１４日間のインキュベート時間の後で、血清試料を収集し、分析まで−８０℃において冷凍して貯蔵した。

（定量サンドイッチＥＬＩＳＡ）
ＰＢＳ中における１μｇ／ｍＬのＯＸ４０−Ｆｃの１００μＬでＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４４２４０４）をコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ２２８７−５００ｍＬ）を含むＰＢＳとして洗浄緩衝液を調製し、洗浄緩衝液中における１％のＢＳＡ（ＵｎｉＲｅｇｉｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＵＲ−ＢＳＡ００１−１００Ｇ）として、ブロッキング緩衝液を調製した。ブロッキング緩衝液における３×段階希釈による１０倍希釈によって血清試料を調製し、ブロッキング緩衝液における３×段階希釈によって標準物を１０ｎＭにおいて調製した。ビオチン化ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを、標準的プロトコルを使用してＢｉｏｔｉｎ Ｆａｓｔコンジュゲート化キット（ａｂｃａｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ２０１７９６）によって標識し、ブロッキング緩衝液における３０ｎＭにおいて調製した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ７４０３）を、ブロッキング緩衝液における１μｇ／ｍＬにて調製した。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した後に、全ての試料を１００μＬにおいて各ウェルに加え、周囲温度において１時間インキュベートした。１００μＬのＴＭＢ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．００−２０２３）による２分間のＴＭＢ現像を、１００μＬの１ＮのＨＣｌ溶液（Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１．００３１７．１０００）によって止めた。４５０ｎｍ吸収を、ＥＬＩＳＡ読み取り機（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ＸＳ）によって読み取った。

その優れた純度およびＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０に対する結合活性により、エクスビボ血清安定性のために抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５を選択した。精製された二重特異性抗体を、異なる種（例えば、ヒト、マウス、またはサルなど）に由来する血清と混合した。数日間の培養後、当該試料を取り出し、抗体量を特定するためにサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。図２３に示されるように、当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５は、３７℃での１４日間の培養後において、依然として、良好な血清安定性を示した。抗体の濃度は、依然として、ヒト、マウス、またはサルのいずれかにおいて、７０％超である。そのことは、当該抗体が良好な血清安定性も有することを示した。

Ｔ細胞反応性を調節する当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５の能力を測定するために、精製されたＴ細胞が、数日間かけてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４において単球を培養することによって調製した同種異系樹状細胞と共に培養されるであろう。市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、それぞれ、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを測定するために、３日目および５日目での上清の収集を可能にするように、平行プレートを準備した。図２４Ａおよび２４Ｂに示されるデータのように、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生は、抗体処理の３日後および５日後に、二重特異性抗体処理（Ｖ５）ならびに併用処理において非常に上方調節される。さらに、増進は、単独での当該抗ＰＤ−Ｌ１Ａｂまたは抗ＯＸ４０ Ａｂ処理よりも、明らかに優れている。このことは、遺伝子改変二重特異性抗体Ｖ５が、依然として、機能性損失なしに、併用処理と同様にアゴニスト活性を有すること、ならびに、将来において、様々な固形腫瘍または癌のための治療抗体として開発され得ることを意味した。

（二重特異性抗体の抗腫瘍活性（インビボモデル））
二重特異性抗体における当該ＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０の齧歯動物交差反応性の欠如は、当該抗体の抗ヒト腫瘍有効性の評価に対する標準的なマウス同系またはヒト異種移植腫瘍モデルの使用を妨げた。したがって、ベージュ（Ｂｇ）変異欠如マウスのＴおよびＢリンパ球および機能性ＮＫ細胞を有するＳＣＩＤ−Ｂｇマウス（ＣＢ．１７／Ｉｃｒ．Ｃｇ Ｐｋｒｄｃ^ｓｃｉｄＬｙｓｔ^ｂｇ／ＣｒＩ）を使用して、新規のｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ−Ｂｇ異種腫瘍マウスモデルを作製した。当該二重特異性抗体の抗ヒト腫瘍有効性を、下記において説明するようにこのモデルを使用して評価した。

ＰＣ−３ヒト前立腺をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得て、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．ＮＯ． １０４３７）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養した。細胞を、Ｔ−１５０ファルコンフラスコにおいて培養密度に増殖させた。続いて、細胞を、トリプシン処理し（トリプシン ０．２５％−ＥＤＴＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、インキュベートにとって十分な細胞数に増殖をスケールアップした。製造元のプロトコル（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に従って、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）を使用して、末梢血液リンパ球（ＰＢＭＣ）をヘパリン処理した血液から単離した。各マウスが、ＰＢＳ中における０．１ｍＬの単一ボーラス注入において０．７５×１０^６のＰＢＭＣおよび３×１０^６腫瘍細胞の注入を受けるように、カウントした細胞懸濁液を組み合わせた。当該マウスにおける腫瘍細胞の増殖を促進するために、別の０．１ｍＬのマトリゲルを、当該組み合わせた細胞懸濁液と混合し、すぐに調製マウスに注入した。

各マウスに対して、０．２ｍＬ量の当該組み合わせた細胞懸濁液を、当該動物の右脇腹の皮下に注入した。１４日のインキュベーション後、固形腫瘍が形成され、約２５０ｍｍ^３から３００ｍｍ^３に達し、当該二重特異性抗体（３ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ Ａｂ−Ｖ５）、ＰＤ−Ｌ１基準抗体（Ｒｅｆ Ａｂ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、またはコントロール抗体（アイソタイプ）を、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって３週間にわたり毎週２回与えた。毎週２回、Ｐｒｅｓｓｉｅｒキャリパによる腫瘍測定ならびに実験期間における試験試料投与を行い、ならびに体重も記録した。以下の計算：長さ×幅^２×０．４４＝体積（ｍｍ^３）を用いて腫瘍体積を計算し、図２５にプロットした。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３に達するか、実験の終了前に体重が２０％減少したマウスを研究から除去した。インキュベーションの７日後に腫瘍を測定したところ、同様の結果が観察され、腫瘍体積に従って動物を無作為化した。動物研究のため、各グループは、６匹のマウスを含んでいた。図２５に示されたデータのように、当該二重特異性抗体は、ＰＣ−３異種移植マウスモデルにおいて、著しい抗腫瘍有効性を示した。ＰＤ−Ｌ１基準抗体と同様に、腫瘍サイズは、腫瘍インキュベーションの１８日後に減少に転じ、１００ｍｍ^３未満に減少し続けた。当該ＰＣ−３異種移植マウスモデルは、二重特異性抗体の抗腫瘍について事前実証され、将来における治療薬リードである可能性が明らかとなる。

一括して、これらの結果は、二重特異性抗体が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達におけるその免疫チェックポイント遮断性およびＯＸ４０シグナル伝達のためのアゴニスト活性を維持することを示した。適切な動物モデル（例えば、ヒト化ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍＩｗｊＩ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）モデルにおけるＰＣ−３腫瘍など）を使用してこれらのタンパク質の生物学的活性をさらに調査するために、研究を進める。

本発明におけるＦｃ領域は、任意の免疫グロブリンのアイソタイプ、サブクラス、アロタイプ、遺伝子改変変異体（例えば、ノブおよびホール（ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ）Ｆｃ断片など）に由来し得る。

（実施例）
下記の実施例は、ヒトＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０を標的とする治療目的にとって好適なモノクローナル抗体の作製について説明している。複合体、ヒト抗ヒトＰＤ−Ｌ１および抗ＯＸ４０抗体は、それぞれ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローン６および抗ＯＸ４０抗体クローンＢ１７から作製した。ヒトＶ領域配列のセグメントは、無関係のヒト抗体（生殖系列および非生殖系列）配列データベースを供給源とした。

実施例１ ＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０に結合するＩｇＧ抗体の作製
本発明によって提供されるある特定の抗体を、ヒトＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０に結合するＦａｂから独自に作製した。当該Ｆａｂは、対応するＦｃ融合タンパク質（ＰＤ−Ｌ１−ＦｃまたはＯＸ４０−Ｆｃ）および対応するヒトタンパク質（ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０）を発現する細胞における交互パンニング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｐａｎｎｉｎｇ）に従って、ファージディスプレイライブラリであるＯｍｎｉＭａｂファージミドライブラリから選択した。直接的ＥＬＩＳＡまたは細胞ベースのＥＬＩＳＡスクリーニング後、当該ポジティブクローンを、重鎖および軽鎖に対して配列決定した。これらのＦａｂは、ＰＤ−Ｌ１に対して「ＯＭ−ＰＤ−Ｌ１−６」および「ＯＭ−ＰＤＬ１−３２」など、ＯＸ４０に対して「ＯＭ−ＯＸ４０−Ａ４」、「ＯＭ−ＯＸ４０−Ｂ１７」、および「ＯＭ−ＯＸ４０−Ｂ１９」など、として指定されたものを含む。本出願において開示されるＰＤ−Ｌ１抗体ＰＤ−Ｌ１−クローン３、ＰＤ−Ｌ１−クローン６、およびＰＤ−Ｌ１−クローン３２を、「ＯＭ−ＰＤ−Ｌ１−６」および「ＯＭ−ＰＤＬ１−３２」から作製した。その一方で、本出願において開示されるＯＸ４０抗体ＯＸ４０−Ａ４、ＯＸ４０−Ｂ１７、およびＯＸ４０−Ｂ１９は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞において「ＯＭ−ＯＸ４０−Ａ４」、「ＯＭ−ＯＸ４０−Ｂ１７」、および「ＯＭ−ＯＸ４０−Ｂ１９」から作製した。ならびに、ＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０を同時に標的化する二重特異性抗体を、抗ＰＤ−Ｌ１ ６−ＯＸ４０ ｓｃＦｖＢ１７抗体および抗ＰＤ−Ｌ１ ６−ＯＸ４０ ｓｃＦｖＢ１９抗体として設計した。所定のＦａｂの軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、当該軽鎖可変領域および重鎖可変領域の当該アミノ酸配列と同一である。

実施例２ 抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖのその対応する標的へのインビトロ結合
抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０二重特異性抗体を、図１４に示されるように構築し、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞において発現させた。二重特異性抗体を含む培地を、タンパク質Ｇクロマトグラフィによって、培養上清から親和性により精製した。精製された抗体を濃縮し、その後、ＰＢＳ緩衝液において透析し、図１５に示されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０への精製された融合タンパク質の直接結合をＥＬＩＳＡにおいて試験するために、１００ｎｇ／ウェルの組換えＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０で、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。様々な濃度の精製された抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖを各ウェルに加え、１時間インキュベートした。洗浄後、抗ＦａｂＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の１：５０００希釈を各ウェルに加え、さらに１時間インキュベートした。最終洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）を加え、４５０ｎｍにおけるＯＤ吸光度を測定した。当該データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用してＳ字形曲線近似によって解析し、ＥＣ５０を計算した。

実施例３ ＦＡＣＳ分析による抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖの抗原結合特異性
抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体結合特異性を試験するために、安定ＰＤ−Ｌ１発現２９３細胞であるＩＦＮ−γ刺激Ａ５４９またはＷｉＤｒを、氷上で１時間かけて１μｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体で染色し、その後、１×ＰＢＳで３回洗浄した。結合した抗体融合タンパク質を、Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で検出し、その後、ＦＡＣＳ分析を行った。当該試験のネガティブコントロールとして、アイソタイプ抗体を使用した。結果は、抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖが、抗ＰＤ−Ｌ１単独と比較して、その抗原結合特性を維持していることを示した。抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体の結合特異性も、安定ＯＸ４０発現２９３細胞を使用して試験した。

実施例４ 二官能性タンパク質のインビトロ免疫調節効果
Ｔ細胞反応性を調節する当該抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体の能力を測定するため、精製したＴ細胞を、数日かけてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４において単球を培養することによって調製した同種異系樹状細胞と共に培養する。市販のＥＬＩＳＡキットを使用してそれぞれＩＬ−２およびＩＦＮ−γを測定するために３日目および５日目での上清の収集を可能にするために、平行プレートを準備した。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅのヒト化抗ＰＤ−Ｌ１であるＭＰＤＬ３２８０Ａを、自前で作製し、ポジティブコントロールとして使用した。図１６Ａおよび１６Ｂに示される当該データのように、当該ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生は、抗体処理の３日または５日後に、二重特異性抗体処理ならびに併用処理において非常に上方調節される。とりわけ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローン６および抗ＯＸ４０抗体クローンＢ１７（抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖＢ１７Ａｂ）によって複合化された当該二重特異性抗体、または組み合わせ物（抗ＰＤ−Ｌ１クローン６Ａｂ＋抗ＯＸ４０クローンＢ１７Ａｂ）は、ＰＤ−Ｌ１およびＯＸ４０基準抗体の組み合わせ物（ＰＤ−Ｌ１ ＲｅｆＡｂ＋ＯＸ４０ ＲｅｆＡｂ）よりも高いＴ細胞活性化の増進を示した。このことは、当該抗ＯＸ４０Ｂ１７抗体が、基準ＯＸ４０抗体ＧＳＫ３１７４９９８と比較してより良好なアゴニスト活性を結果として生じる特殊なエピトープ結合性を有し得ることを示していた。

実施例５ インビボでの二重特異性抗体によって誘起されるヒト白血球増殖
マウスＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０とのＰＤ−Ｌ１またはＯＸ４０抗体における検出可能な交差反応の欠如ならびにヒト免疫細胞の存在に対する要件は、当該二重特異性抗体のインビボ機能性評価のためのモデルの開発を必要とした。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）変異およびＩＬ−２受容体共通ガンマ鎖（一般的に、ＮＳＧと呼ばれる）における欠損を有するＮＯＤ遺伝的背景のマウスは、多くのヒト末梢血白血球（ｈｕＰＢＬ）の移植を支援することができ、少なくとも３０日間、移植を維持することができる（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ｈｕＰＢＬ−ＮＳＧモデルとしても知られるこのマウスモデルを、ヒト免疫細胞に対する当該抗体のインビボ全身性投与の機能効果を評価するために使用した。

詳細には、新たに単離した６００万のヒトＰＢＭＣを、静脈内注入によってｈｕＰＢＬ−ＮＳＧマウスへと養子移入した。ＰＢＭＣ注入の９日間後、当該動物に、腹腔内注入によって、単回１ｍｇ／ｋｇ用量の単一抗体、二重特異性抗体、またはＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体を投与した。ＰＢＭＣ移植の２４日から２８日後に、フローサイトメトリによって評価したヒトおよびマウスＣＤ４５に対する抗体でＰＢＭＣを染色した。リンパ球ゲートを特定するために、前方および側方散乱プロファイルを使用した。移植されたマウスの末梢血におけるヒトＣＤ４５＋細胞の割合の増加によって証明されるように、二重特異性抗体は、ヒト白血球の増殖を高めることができた。各群に対して、ｎ≧６匹のマウス。

実施例６ 抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体によるｈｕＰＢＬ−ＮＳＧにおけるＰＣ−３またはＡ４９８腫瘍細胞増殖の阻害
ｈｕＰＢＬ−ＮＳＧマウスにおいて異種移植モデルを確立するために、ＰＤ−Ｌ１ポジティブヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４３５）または腎癌細胞Ａ４９８（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−４４（商標））を使用することができる。腫瘍形成のために、３×１０^６ＰＣ−３細胞（またはＡ４９８細胞）／マウスが、上記において説明したｈｕＰＢＬ−ＮＳＧマウスに、皮下において注入されるであろう。腫瘍成長に対する阻害効果を評価するために、腫瘍細胞移植の１４日後に、０．１〜３ｍｇ／ｋｇの異なる濃度の抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖ抗体、基準抗体、またはアイソタイプの抗体が、毎週２回、４週間にわたってマウスに静脈内投与されるであろう。腫瘍成長は、ＦｏｘＣｈａｓｅＳＣＩＤ（登録商標）Ｂｅｉｇｅマウスモデルにおいて説明したように、最長５週間にわたって毎週２回測定されるであろう。

実施例７ マウスおよびサルにおける抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖの薬物動態評価
１０〜４０ｍｇ／ｋｇの二官能性タンパク質抗ＰＤ−Ｌ１−ＯＸ４０ ｓｃＦｖが、皮下注入または静脈内注入によってマウスまたはサルに投与されるであろう。注入後、最長１５日間まで、異なる時点において、血清試料が採取されるであろう。当該血清試料中のＦｃ融合タンパク質の濃度が、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して特定されるであろう。

本発明について、そのある特定の実施形態を参照しながらかなり詳細に説明してきたが、他の実施形態も可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲は、本明細書に含まれる実施形態の説明に限定されるものではない。

本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく本発明の構造に様々な改変および変更を為すことができることは、当業者に明らかであろう。先述の観点から、本発明の改変および変更が以下の特許請求の範囲の範囲内である限り、本発明は、それらを網羅することが意図される。

Claims (28)

1. ＯＸ４０（ＣＤ１３４）に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、
   配列番号６、配列番号８、配列番号１０のアミノ酸１２６〜２４４、および配列番号１３のアミノ酸１２３〜２４０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
   配列番号５のアミノ酸１〜１０８、配列番号７のアミノ酸１〜１０８、配列番号１０のアミノ酸１〜１１２、および配列番号１３のアミノ酸１〜１０８からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
   を含む抗体またはその抗原結合性部分。
2. 前記抗体またはその抗原結合性部分が、配列番号１０、１１、１２、および１３からなる群より選択される単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）配列である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
3. 前記抗体またはその抗原結合性部分が、二重特異性抗体である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
4. 前記二重特異性抗体は、免疫チェックポイントタンパク質結合部位を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
5. 前記免疫チェックポイントタンパク質結合部位は、プログラム細胞死タンパク質１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）結合部位、ＰＤ−１結合部位、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）結合部位、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）結合部位、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）結合部位、またはリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）結合部位を含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
6. ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、
   配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、
   配列番号１のアミノ酸１〜１１１および配列番号３のアミノ酸１〜１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、
   を含む抗体またはその抗原結合性部分。
7. 少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体であって、前記ポリペプチド鎖は、
   ＯＸ４０結合部位であって、
   配列番号６、配列番号８、配列番号１０のアミノ酸１２６〜２４４、および配列番号１３のアミノ酸１２３〜２４０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
   配列番号５のアミノ酸１〜１０８、配列番号７のアミノ酸１〜１０８、配列番号１０のアミノ酸１〜１１０、および配列番号１３のアミノ酸１〜１０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
   を含むＯＸ４０結合部位と、
   ＰＤ−Ｌ１結合部位であって、
   配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、
   配列番号１のアミノ酸１〜１１１および配列番号３のアミノ酸１〜１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと
   を含む、ＰＤ−Ｌ１結合部位と、
   を含む、二重特異性抗体。
8. 前記ポリペプチド鎖は、さらに、
   Ｆｃドメインと、
   当該ＦｃドメインのＮ末端に接続されたＦａｂ断片であって、前記ＰＤ−Ｌ１結合部位を含むＦａｂ断片と、
   当該ＦｃドメインのＣ末端に接続されたｓｃＦｖであって、前記ＯＸ４０結合部位を含むｓｃＦｖと、
   を含む、請求項７に記載の二重特異性抗体。
9. 前記ポリペプチド鎖は、さらに、前記Ｆｃドメインと前記ｓｃＦｖとの間にリンカーを含む、請求項８に記載の二重特異性抗体。
10. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１８のアミノ酸４５５〜７０７，配列番号１９のアミノ酸４５５〜７０８，配列番号２０のアミノ酸４５５〜７０１，配列番号２１のアミノ酸４５５〜７０６，配列番号２２のアミノ酸４５５〜７０６，配列番号２３のアミノ酸４５５〜７０６，配列番号２４のアミノ酸４５５〜７０６，配列番号２５のアミノ酸４５５〜７０６，配列番号２６のアミノ酸４５５〜７０６，配列番号２７のアミノ酸４５５〜７０６，配列番号２８のアミノ酸４５５〜７０６，および配列番号２９のアミノ酸４５５〜７０６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の二重特異性抗体。
11. 前記二重特異性抗体が、一対のポリペプチド鎖を含む、請求項７に記載の二重特異性抗体。
12. 前記二重特異性抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ抗体である、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
13. 前記二重特異性抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項１２に記載の二重特異性抗体。
14. 前記ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，またはＩｇＧ４抗体である、請求項１３に記載の二重特異性抗体。
15. 治療薬と、
    ＰＤ−Ｌ１および／またはＯＸ４０に結合する抗体または抗原結合性部分と、
    を含む抗体−薬物コンジュゲートであって、当該治療薬は、リンカーによって、当該抗体または当該抗原結合性断片に共有結合的にコンジュゲートされている、抗体−薬物コンジュゲート。
16. 前記抗体または抗原結合性部分は、請求項１、６、または７から選択される、請求項１５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
17. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
18. 請求項６に記載の前記抗体または前記その抗原結合性断片と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
19. 請求項７から１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
20. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性部分の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、癌を治療する方法。
21. 前記癌は、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、腎細胞腫（ＲＣＣ）、および卵巣癌からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 請求項６に記載の前記抗体または抗原結合性部分の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、癌を治療する方法。
23. 前記癌は、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、腎細胞腫（ＲＣＣ）、および卵巣癌からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 請求項７から１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、癌を治療する方法。
25. 前記癌は、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、腎細胞腫（ＲＣＣ）、および卵巣癌からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
26. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性部分をコードする核酸分子。
27. 請求項６に記載の前記抗体または前記抗原結合性部分をコードする核酸分子。
28. 請求項７から１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする核酸分子。

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