JP4889263B2 - 検体処理方法、***炎の検査方法及び細菌性疾病検査キット - Google Patents
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Description
現在、乳汁中の黄色ブドウ球菌の検出法としては、細菌培養検査法及び免疫抗体法が広く用いられているが、操作が複雑であり、所要時間も長時間になるため、頻回でしかも多頭、多分房単位での定期感染モニタリングとして使用するには現実的でない。
このような問題を解消するために、細菌遺伝子増殖、即ちPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を用いた黄色ブドウ球菌遺伝子の定量的検出方法が開発された(非特許文献1〜3)。この方法では、わずか1ml程度の乳汁を検体とし、黄色ブドウ球菌を遺伝子レベルで検出することができるため、***炎の検出を高い精度で安定して大量に行うことができる。
例えば、特許文献1では、血液中の菌を血球と分離するために、アルカリ金属の水酸化物などを用いて血球を除去している。特許文献2では、微生物を補足可能なフィルターを用いて遠心分離を行い、簡単且つ短時間に微生物を収集可能としている。
従って、本発明は、細菌性疾病の病因細菌(以下、単に「細菌」と称する場合がある)と検体由来の体細胞(以下、単に「細胞」と称する場合がある)とが混在している検体に対して、精度よく短時間で、細菌性疾病、例えば***炎の検査を実施可能にすることを目的とする。
ここで、検体と混合して試料液を調製するための吸着液と、細胞吸着担体に吸着した細菌を分離するための脱着液との少なくとも一方を更に含むことが好ましい。
また、試料液を回収後の細胞吸着担体に、更に、吸着した細菌を分離するための脱着液を接触させることが好ましい。
このとき脱着液を更に使用すれば、細胞吸着担体に吸着した細菌を細胞吸着担体から分離することができるので、検体中の細菌をほぼすべて回収することができる。これにより、より高い精度で細菌を分離することができる。
本発明では、試料液を細胞吸着担体と接触させることによって、表面電荷の差に基づいて細胞と細菌とを分離している。即ち、検体中に混在している細菌と細胞とはその表面電荷に差があり、細胞の方が強く負に帯電している。このため、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有する細胞吸着担体、例えば正に帯電している細胞吸着担体を用いることによって、検体中の細胞と細菌とを分離することができる。
このようなアミノシリカの粒径は、10〜1000μm、好ましくは100〜200μmとすることができる。10μm以上であれば、自然沈降が可能であり、過度の遠心操作を不要にすることができる。また1000μm以下であれば、体積がかさばらず、反応の重さ当りの表面積がより大きく好ましい。
本発明における吸着液としては、細胞及び細菌に対して用いられる通常の緩衝液であればよく、例えばグッドの緩衝液、リン酸緩衝液、生理食塩水などを挙げることができるが、このうち、塩濃度が生理的条件に比較的近く細胞に対して穏和なグッドの緩衝液が好ましい。このようなグッドの緩衝液には、MOPS、TES、HEPES、コラミンクロリド、BES等を挙げることができる。
吸着液と検体との混合は、特に制限はなく、細胞吸着担体との接触の際に細胞及び細菌がフリーの状態を維持できる程度の最終pH(例えば、pH4〜9)及び粘度に調製できる条件であれば、いずれの条件でも適用可能である。
混合によって接触させる場合には、細胞吸着担体と試料液とが充分に混合接触可能であればよく、例えば、細胞吸着担体を10〜50mgに対して試料液1mlとすることができる。また混合は、細胞が吸着可能となる時間、例えば10〜60分間、好ましくは30〜60分程度反応させればよい。
通過によって接触させる場合には、細胞と細胞吸着担体とが反応可能な速度で試料液を流せばよく、流速が一定となるように調整してもよい。
細胞吸着担体を分散状態で細胞と接触させた場合には、細菌を含む試料液を細胞吸着担体から分離すればよい。分離の手段としては、例えば適度な遠心分離を行えばよいが、シリカのように自然沈降するものを細胞吸着担体とした場合には、静置するだけで試料液を分離すること、またはこれらを組み合わせるもできる。
ここで用いられる脱着液としては、pHとイオン強度の観点から細胞に対して穏和な化合物であって、細胞吸着担体と細菌との吸着を相対的に低下させるものであればよく、例えば細胞吸着担体に対して細菌よりも高い親和性を有する化合物や、細胞吸着担体と細菌との結合を弱める化合物をあげることができる。このような脱着液としては、塩化ナトリウム溶液、界面活性剤、キレート剤、クエン酸溶液などを挙げることができ、このうち、細胞吸着担体に対する親和性が細菌よりも高いクエン酸や、細胞吸着担体と細菌との疎水的結合を弱めることができる界面活性剤、又はこれらの双方を含有することが好ましい。
ここで回収された脱着液には、細胞吸着担体に吸着していた細菌が含まれており、先に回収した試料液と混合することによって、検体中で細胞と混在していた細菌のみを高い回収率で分離することができる。
本発明における検体は、特定の細菌性疾病の検査を行うために生体から単離されたものであって、疾病の検査に有効であり且つ原因菌と体細胞とが混在しやすい検体であればよく、例えば、乳汁、尿、血液、リンパ液、唾液、糞便、髄液、腹水等の生体試料に由来する検体を挙げることができる。これらは液体状に限らず、ゲル状、固体、粉体であってもよい。ゲル状、固体、粉体の場合には、上述した吸着液によって適当な形態に調製すればよい。
ここで、各種の生体試料に由来する検体には、生体から分離した生体試料そのものであってもよく、また、本発明の処理が可能な程度にまで特定の処理を施した試料も含まれる。
本発明によって効率よく分離することができる細菌は、混在する細胞の種類にもよるが、大腸菌、ミクロコッカス、ブドウ球菌、連鎖球菌等を挙げることができ、特に***炎の原因菌であるブドウ球菌については高い効率で効果的に細胞と分離することができる。
本***炎の検査方法は、乳汁由来の検体と吸着液とを混合して、試料液を調製すること(調製工程)、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有する細胞吸着担体と前記試料液とを接触させること(吸着工程)、前記細胞吸着担体との接触後の試料液を回収すること(回収工程)、回収後の試料液に対して、黄色ブドウ球菌検出用プローブを用いたPCRを実施すること(PCR工程)、を含むものである。
本***炎の検査方法によれば、乳汁中の細菌を、混入細胞と効率よく分離することができるので、その後の黄色ブドウ球菌検出用プローブを用いたPCRを正確且つ定量的に行うことができ、精度よく***炎の検査を行うことができる。
PCR工程では、回収工程及び場合によって脱着工程において得られた各溶液中の細菌に対して、PCRを実施する。PCRを実施するための条件は、通常の細菌に対して実施する条件をそのまま適用することができる。
このような検査キットは、表面電荷に基づいて細菌よりも細胞に親和性を有する細胞吸着担体を含むものである。このキットを用いることによって、簡便に且つ精度よく***炎の検査を行うことができる。
本キットには、より簡便に使用可能とするために、検体と混合して試料液を調製するための吸着液と、細胞吸着担体に吸着した細菌を分離するための脱着液との少なくとも一方を更に含むものであることが好ましい。
キットに含まれる各溶液は適当な容器に収容されていてもよく、また濃度を調整できるように原液として含まれていてもよい。
細胞吸着担体は、粉末の形態で含まれていてもよく、細胞吸着担体をすでに充填した容器、例えばチューブ、カラムなどの形態で含まれていてもよい。
黄色ブドウ球菌と体細胞の吸着
(1)細胞の調整
黄色ブドウ球菌(ATCC19095、ゼータ電位:−1.09±3.45)は、乾燥ブイヨン(ニッスイ)いわゆるNutrient Brothにて16時間培養したものを使用した。体細胞(ゼータ電位:−9.29±6.72)は、血液由来細胞を精製し、細胞表面抗原に基づいて細胞分画した。即ち、ヘパリン採決されたウシ血液(東京芝浦臓器社製)を得て、血液を遠心(2,500rpm、30分)し、中間層の白色のバッフィーコート(単球、白血球、好中球を含む)を駒込ピペットにて回収した。回収されたバフィーコート層に、等量のACK溶解バッファ(8.29g/lのNH4Cl、1.00g/lのKHCO3、0.037g/lのEDTA、pH7.3)を加え1〜3分放置することで赤血球を溶解させた。その後、大量のPBS-を加えて懸濁し、遠心(1,400rpm、5〜7分)した。このPBS-による洗いを2回繰り返した。10mM MOPS,150mM NaClに懸濁(pH7.0)し、実験に応じた濃度に調整した。
6×106個/mlにてPBSに懸濁されたGM細胞を遠心(1,500rpm,5分)し上清を除いた後、一次抗体(マウス抗GM1(SWC3)IgG(No.M35001、VMRD社製))を10μlずつ加え、30分インキュベートした。FACSバッファを2ml加え、遠心(1,500rpm,5分)し各種二次抗体(FITC結合ヤギF(ab’)2抗マウスIgG(H+L)抗体(No,M35001、CALTAG社製)を10μlずつ加え、30分インキュベートした。FACSバッファを2ml加え、洗浄、遠心を行なった。得られた細胞をフローサイトメトリー(FACS Calibur)にて解析した。
その結果、ほとんどが白血球細胞であることが確認できた。これにより得られた細胞を体細胞として以下の処理に用いた。
なお、ゼータ電位は、150mM NaCl、10mM MOPS(pH7.0)、室温の条件下で、NICOMP380ZLS(Particle Sizing System Co.社製)を用いて測定した。
黄色ブドウ球菌と体細胞との表面電気の差に基づいてこれらを分離するために、黄色ブドウ球菌と体細胞に対するアミノシリカ及びピュアシリカの吸着量を確認した。
黄色ブドウ球菌と体細胞とは、それぞれ表示された細胞数になるように吸着液と混合して、試料液を調製した。吸着液は、150mM NaCl、10mM MOPSを含む水溶液であり、pHは7であった。
試料液1mlをそれぞれのチューブに添加して混合し、1時間室温で攪拌させて反応させた。1時間後に、上清をピペットで回収した。上清中の細菌数をバクテリア計算盤により計測した。結果を図1に示す。図1において横軸は、添加した細胞数を表し、縦軸は反応後の上清又は担体中の細胞数を示す。
脱着試験
次に、種々の脱着液を用いた場合の細菌の回収について調べた。
細菌細胞混合液を細胞吸着担体(実施例1のアミノシリカ)に吸着させた後、黄色ブドウ球菌の回収を行った(図2)。細胞混合液には、黄色ブドウ球菌(IAM12544)4.3×108個/ml(OD600=0.5)と、実施例1で得られた体細胞7×105個/mlの各濃度となるように吸着液を用いて調整した。吸着は実施例1と同様に行った。上清を回収後、下記表1中の組成の各脱着液を添加して混合した。そのまま15分間反応させた後、上清中に含まれる細菌数及び細胞数を600nmでの吸光度により計測した。結果を表1に示す。なおPEGは平均分子量6000のものを使用した。
種々の細菌に対する吸着・脱着試験
次にアミノシリカの細胞吸着担体に対する吸着及び脱着効果を、種々の細菌に対して試験した。使用した菌は、表中に記載の通りである。
吸着及び脱着は、実施例1及び2と同様に行った。結果を表2及び3に示す。表中、吸着(Adsorption)、上清(Supernatant)、脱着(Desorption)、回収(Recovery)は、それぞれ以下のようにして算出した。
吸着(%)=(細胞懸濁液中の数−上清中の数)/細胞懸濁液中の数×100
上清(%)=上清中の数/細胞懸濁液中の数×100
脱着(%)=脱着上清中の数/吸着量×100
カッコ内=脱着上清中の数/細胞懸濁液中の数×100
回収(%)=上清(%)+脱着(%)
このように、アミノシリカを用いた体細胞の吸着を行うことによって、細胞と細菌の混合液から短時間で精度よく細菌のみを分離できることは明らかである。
乳汁を用いたPCR法による黄色ブドウ球菌の検出
図3には***炎検査のためのDNA抽出工程までを示した工程図である。乳汁中の細菌と細胞の分離は以下の通りに行った。
重度の***炎のウシ2頭及び軽度の***炎のウシ1頭からの各乳汁を、5000rpm15分間の遠心分離にかけて、乳汁成分(上清)を除去した。得られた沈殿物に、溶解バッファ(0.05%のN−ラウリルサルコシン、5mMのTris−HCl(pH7.6)、2.5mMのEDTA)を1ml加え、ボルテックスにかけて洗浄した。更に遠心(5000rpm、15分)を行って、上清をコントロールAとし、沈殿物と分けた。
上清Bと上清Cの混合液を遠心(5000rpm、15分)し、上清を除き、沈殿を得た(菌画分)。なお乳汁中の細胞は、アミノシリカと共に分離された。
結果を図4に示す。
なお、図4において(a)は軽度の***炎サンプル、(b)及び(c)はそれぞれ異なる重度の***炎サンプルの場合を示している。
これに対して、本願発明のアミノシリカを用いた処理を行うことによって、このようなサンプルであっても明瞭なバンドを示すことができる(図4上段(b)及び(c)参照)。このような明確なバンドが示されれば、菌の同定及び定量的な検査を精度よく実施できることは明らかである。
更に、***炎の重篤の度合いに応じてアミノシリカの量を変えることによって、より効率よく菌の検出及び同定を行うことができる。
Claims (8)
- 細菌性疾病の病因細菌と検体由来の体細胞とが混在している検体を処理する検体処理方法であって、
検体と吸着液とを混合して、試料液を調製すること
アミノシリカである細胞吸着担体と前記試料液とを接触させること
前記細胞吸着担体との接触後の試料液を回収すること、
を含み、
前記細菌性疾病が***炎であり、前記検体が乳汁由来の検体である当該検体処理方法。 - 試料液を回収した後に、細胞吸着担体に吸着した前記病因細菌を分離するための脱着液を細胞吸着担体に接触させ、接触後の脱着液を回収することを更に含む請求項1記載の検体処理方法。
- 前記吸着液が、グッドの緩衝液、リン酸緩衝液又は生理食塩水である請求項1又は請求項2記載の検体処理方法。
- ***炎の検査方法であって、
乳汁由来の検体と吸着液とを混合して、試料液を調製すること、
アミノシリカである細胞吸着担体と前記試料液とを接触させること
前記細胞吸着担体との接触後の試料液を回収すること、
回収後の試料液に対して、黄色ブドウ球菌検出用プローブを用いたPCRを実施すること、
を含む***炎の検査方法。 - 前記吸着液が、グッドの緩衝液、リン酸緩衝液又は生理食塩水である請求項4記載の検体処理方法。
- ***炎の検査キットであって、
アミノシリカである細胞吸着担体
を含む当該検査キット。 - 検体と混合して試料液を調製するための吸着液と、細胞吸着担体に吸着した***炎の病因細菌を分離するための脱着液との少なくとも一方を更に含む請求項6記載の検査キット。
- 前記吸着液が、グッドの緩衝液、リン酸緩衝液又は生理食塩水である請求項7記載の検体キット。
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