KR20200028108A - 가시박으로부터 분리한 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
가시박으로부터 분리한 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 가시박(Sicyos angulatus)으로부터 분리된 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 플라보노이드 유도체가 간세포에서의 과도한 지방 축적을 방지하고, 알코올에 의한 간세포 독성을 감소시키는 것을 확인함으로써, 본 발명의 가시박으로부터 분리된 플라보노이드 유도체를 과도한 지방 축적 또는 알코올에 의한 간 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 동물 약품, 개선용 건강기능식품 및 동물사료 첨가제 등의 개발에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 가시박(Sicyos angulatus)으로부터 분리된 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현대 사회는 급속한 자동화에 따른 편리한 생활환경, 가공 식품 및 외식의 증가에 따른 과다 영양 섭취 및 신체 활동량의 감소로 인해 비만 인구가 빠르게 증가하고 있다. 비만은 지방간, 고혈압, 당뇨병, 심혈관계 질환 등의 만성 질환을 유발하는 것으로 널리 알려져 있으며, 최근 국가통계 자료를 제공하는 나라지표 결과를 보면 2011년부터 한국 성인의 30.7%가 비만으로 보고되었다. 또한, 전 세계 인구의 약 25%에 해당하는 17억 명이 현재 과체중(BMI(body mass index)〉25)이고, 미국, 유럽, 일본 등 주요 국가들의 1억 2천 명을 포함한 서구지역 3억 명 이상이 비만환자(BMI〉30)로 분류되고 있다. 소아의 경우에도 세계적으로는 어린이 5명 중 1명이 소아비만에 해당되며, 이 수는 급속도로 증가하고 있어 소아비만이 심각한 사회문제로 대두되고 있다.
인구 노령화는 세계적으로 중요한 사회적 이슈 중 하나로, 고령 인구의 급격한 증가와 함께 증가하는 노인성 질환 및 이에 따른 의료비 증가는 해결해야 하는 필수적인 사회 문제로 대두되고 있다.
비만 환자의 증가와 고령화의 증대는 비만에 의하여 유발되는 질환인 비만, 지방간, 당뇨병, 고지혈증, 고혈압 및 심혈관계 질환의 발생 증가 및 이들 질환을 앓게 되는 시간이 증가한다는 것을 의미한다. 따라서 비만 관련 질환의 발생 단계 및 장기적인 증상 악화 과정을 제어할 수 있는 치료제의 개발 필요성이 강조되고 있다.
지방간(fatty liver)이란 지방의 과도한 섭취나 내인적으로 간 내 지방 합성이 증가되거나 배출이 감소되어 간세포 내에 지방이 축적되는 것을 말한다. 지방간의 분류는 크게 알코올성 지방간 질환과 비알코올성 지방간 질환으로 나눌 수 있다(Yoon, S.K., 2009).
알코올성 지방간 질환(alcoholic fatty liver disease)은 과도한 알코올 섭취가 주요 원인으로, 알코올의 종류보다 총 섭취량과 관계가 있고, 같은 양이라도 매일 지속적으로 마시면 알코올 대사의 효율성이 떨어져 지방간 발생이 더 심해진다. 알코올성 지방간은 지방간으로 그치는 것이 아니라 10~35%는 알코올성 간염으로 진행되고, 8~20%는 알코올성 간경변으로 진행되고 결국 간암이나 말기 간부전에 이르게 되어 사망하게 될 수 있다(Yoon, S.K., 2009).
비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 간 내에서 중성지방(triglyceride)이 과다하게 축적되어 있는 상태로, 간에 지방의 과도한 축적만 있는 단순지방증(simple steatosis), 간의 괴사와 염증과 섬유화를 동반하는 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH) 및 더 진행된 상태인 간경변증(liver cirrhosis)을 포함하는 일련의 질환군을 의미한다(Brunt, E.M., 2001). 유병률이 높은 NAFLD 환자의 다수는 의미 있는 섬유화가 없는 단순 지방증으로 임상경과가 양호하다. 하지만 문제의 심각성은 NAFLD 환자 중 약 10~20%에서 NASH가 발생하며, 이 NASH 환자 중 약 9~25%에서 간경변증으로 진행되는 것이다. 간경변증이 되면 간암의 발생 위험이 증가하고, 10년 이후 30~40%는 간질환의 합병증으로 사망한다(Ekstedt, M, et al., 2006; Fassio, E., et al., 2004; Adams, L.A., et al., 2005).
최근 NAFLD는 인슐린 저항성을 근간으로 한 비만, 고혈압, 제2형 당뇨병, 지질대사이상과 같이 간에 나타나는 대사증후군(metabolic syndrome)의 한 모습으로 간주되고 있다(Sohn, J.H., et al, 2010). 간에서의 중성지방의 축적은 NAFLD의 대표적인 지표로 NAFLD의 발병 기전에서 나타나며, 현재까지 간에서 지질 축적과 관련된 여러 기전이 알려지고 있지만, 간에서 지방산 합성 증가와 함께 말초 지방산(peripheral fatty acid)이 NAFLD에서 간에서의 지질 축적에 가장 큰 역할을 하고 있는 것으로 보고되고 있다(Tilg, H., et al., 2010).
NAFLD의 발병 기전은 특히, 비만을 포함하는 대사증후군과 밀접한 관련이 있다. 간은 글리코겐 생성과 분해를 통한 혈당 균형을 담당하기 때문에 탄수화물 대사에 중요한 역할을 수행한다. 간경변증 환자의 약 96%는 당 내성이 있고, 30%는 당뇨병으로 임상적으로 진단되어 간에서 지방 축적을 조절하는 기전의 중요성을 설명한다. 보통 면역세포와 유리 지방산의 용해성 매개체가 인슐린 조절 시스템과 NAFLD 발현에 관여하기 때문에 지방간 질환은 일반적으로 인슐린 저항성과 관련되어 있다. 즉, 유리 지방산에 의해 생성되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 및 IL-6(interleukin-6)를 비롯한 여러 염증성 사이토카인은 NAFLD, NASH 및 간경변증과 같은 일련의 간 질환 발생의 중요한 시발점이다. 따라서, 최근 대사증후군의 확산과 인구 고령화에 따른 NAFLD가 급속히 증가하기 때문에 NAFLD 치료제 개발이 시급한 실정이다.
가시박(Sicyos angulatus L., Elariaium trifoliatum L.)은 가시박속(Sicyos)에 속하며, 40여종으로 이루어진 박과(Cucurbitaceae)에서 가장 다양한 속의 하나로, 습한 지역과 강둑을 따라 자라는 덩굴식물이다. 가시박은 매우 빠른 성장으로 주변 토양을 빠르게 덮고 다른 식물을 밀어내어 성장하는 식물로 악성 잡초로 여겨지고 있다. 우리나라의 경우에도 가시박을 오이 등의 재배를 위하여 접목 식물로 도입하였지만 가시박의 급속한 성장은 우리나라의 습지 환경을 지배할 정도로 왕성하여 환경부 지정 환경 교란종으로 지정되었다. 그러나 개화 전, 이 식물의 어린 잎은 우리나라 식품공전(Korean Food Standard Codex, KFSC)에서 식용 가능한 원료로 등재되어 있어, 이를 원료로 한 새로운 기능성을 찾는다면 기능성 식품의 원료로 사용될 가능성이 있다. 하지만 국내에서 흔히 볼 수 있는 식물로서 생명력이 강하고 풍부한 식물 자원임에도 불구하고 제거 대상으로만 인식되어 있으며, 이와 관련된 연구 또한 미비한 실정이다. 최근에야 가시박의 활성 연구가 시작되어 가시박으로부터 유효 물질 분리가 시도되고 있는 실정이다(Kim, Y.A., et al., 2017).
이에, 본 발명자들은 가시박 추출물을 연구하는 과정에서, 가시박 추출물로부터 플라보노이드 유도체를 분리하였고, 분리한 플라보노이드 유도체가 간 질환 치료 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래 선행기술로서 한국등록특허 제1802970호에는 가시박 추출물을 포함하는 간 질환의 치료용 조성물이 기재되어 있으나, 본 발명의 가시박으로부터 분리한 플라보노이드 유도체 및 이의 간 질환 치료 효과는 기재되어 있지 않다. 또한, 한국등록특허 제1849624호에는 바이플라보노이드 유도체 및 이의 비알코올성 지방간 치료 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 플라보노이드 유도체와는 차이가 있다.
Adams, L.A., et al., The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study, Gastroenterology, 129(1), 113-121, 2005.
Brunt, E.M., Nonalchololic steatohepatitis: definition and pathology, Semin. Liver Dis., 21(1), 3-16, 2001.
Cameron, R.G., et al., Modulation of liver-specific cellular response to ethanol in vitro in hepG2 cells, Toxicol In Vitro., 12(2), 111-122, 1998.
Ekstedt, M., et al., Long-term follow-up patients with NAFLD and elevated liver enzymes, Hepatology, 44(4), 865-873, 2006.
Fassio, E., et al., Natural history of nonalcoholic steatohepatitis: a longitudianl study of repeat liver biopsies, Hepatology, 40(4), 820-826, 2004.
Kim, Y.A., et al., Antioxidant Activity and Anti-inflammatory effects of Sicyos angulatus L. extract, Journal of Oil & Applied Science, 34(3), 536-544, 2017.
Madushani, H.K., et al., Phenolic acid and flavonoid-rich fraction of Sasa quelpaertensis Nakai leaves prevent alcohol induced fatty liver through AMPK activation, J. Ethnopharmacol., 224, 335-348, 2018.
Sohn, J.H., et al., Recent update on pathogenesis of nonalcholic fatty liver disease, The Korean Journal of Medicine, 79(5), 461-474, 2010.
Tilg, H., et al., Evolutin of Inflammation in Nonalcoholic Fatty Liver Disease:L The Multiple Parallel Hits Hypothesis, Hepatology, 52(5), 1836-1846, 2010.
Yoon, S.K., Diagnosis and treatment of fatty liver, The Korean Journal of Medicine, 76(6), 677-679, 2009.
본 발명의 목적은 가시박(Sicyos angulatus)으로부터 분리된 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
또 다른 본 발명의 목적은 가시박으로부터 분리된 신규한 플라보노이드 유도체 및 이의 분리방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 하기 화학식 1의 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 아피게닌-7-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노시드(화합물 7), 캠퍼롤-3-O-β-D-아피오푸라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 8), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 9), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 10), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 개선용 건강기능식품, 예방 또는 치료용 동물 약품 및 개선용 동물사료 첨가제에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기 플라보노이드 유도체 화합물은 바람직하게는 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물일 수 있다.
상기 플라보노이드 유도체 화합물은 가시박(Sicyos angulatus) 추출물로부터 분리될 수 있다.
상기 가시박 추출물은 가시박을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르(acetic ester), 아세톤(acetone), 메틸에틸케톤(methylethylketone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물일 수 있다.
상기 간 질환은 지방간(fatty liver) 질환일 수 있다.
상기 지방간 질환은 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 알코올성 지방간 질환(alcoholic fatty liver disease)일 수 있다.
또한, 본 발명은 가시박을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르(acetic ester), 아세톤(acetone), 메틸에틸케톤(methylethylketone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 용매로 하여 가시박 추출물을 제조하는 단계; 상기 가시박 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 분획물을 얻는 단계; 및 상기 각 분획물을 크로마토그래피하여 상기 화학식 1의 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 아피게닌-7-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노시드(화합물 7), 캠퍼롤-3-O-β-D-아피오푸라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 8), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 9), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 10), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 하기 화학식 2의 화학 구조를 갖는 신규 화합물, 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-β-D-아피오푸라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 8), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 9), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)에 관한 것이다.
[화학식 2]
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 가시박(Sicyos angulatus) 추출물로부터 분리된 플라보노이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 플라보노이드 유도체 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.
상기 플라보노이드 유도체 화합물은 상기 화학식 1의 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 아피게닌-7-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노시드(화합물 7), 캠퍼롤-3-O-β-D-아피오푸라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 8), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 9), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 10), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물일 수 있다. 바람직하게는 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물이다.
상기 가시박 추출물은 가시박을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르(acetic ester), 아세톤(acetone), 메틸에틸케톤(methylethylketone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물일 수 있다. 상기 C1~4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등을 이용할 수 있고, 상기 C1~4의 초산에스테르로는 초산메틸(methyl acetate), 초산에틸(ethyl acetate), 초산프로필(propyl acetate), 초산이소프로필(isopropyl acetate), 초산부틸(butyl acetate), 초산이소부틸(isobutyl acetate) 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 에탄올이고, 더 바람직하게는 70%[v/v] 에탄올이다.
상기 용매는 가시박 중량의 5~100배의 중량을 가할 수 있다. 바람직하게는 5~40배의 중량을 가한다.
또한, 상기 가시박 추출물은 유기용매로 재분획한 분획물일 수 있다. 상기 유기용매로는 C1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 헥산 및 아세톤 등을 이용할 수 있고, 상기 C1~4의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프란올, 부탄올 등일 수 있다. 바람직하게는 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 가하여 분획한 분획물 일 수 있고, 더 바람직하게는 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 분획한 분획물이다.
상기 플라보노이드 유도체인 화합물 1~13은 상기 가시박 추출물을 크로마토그래피를 이용하여 분리할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 역상-18 컬럼 크로마토그래피(reverse phage-18(RP-18) column chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC), 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(sephadex LH-20 column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 이온 교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chrmatography) 등에서 선택하여 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 플라보노이드 유도체 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 합성될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 1~13으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 상기 화학식 1의 화합물 1~13으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 화합물 1~13으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01~2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1~500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 쥐, 반려동물, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 점막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1의 화합물 1~13으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 상기 화학식 1의 화합물 1~13으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물 1~13으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 1~13으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 개선용 동물사료 첨가제를 제공한다.
상기 동물사료 첨가제는 상기 화학식 1의 화합물 1~13으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물이 동물용 사료에 0.001~30중량%, 바람직하게는 0.001~10중량%, 가장 바람직하게는 0.001~5중량%로 첨가될 수 있다.
상기 간 질환은 지방간(fatty liver)일 수 있다.
상기 지방간은 지방의 과도한 섭취나 내인적 요인으로 인해 간 조직 내 지방 합성이 증가되거나 배출이 감소되어 간세포 내 지방이 축적되어 나타나는 질환으로, 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 알코올성 지방간 질환(alcoholic fatty liver disease)일 수 있다. 바람직하게는 비알코올성 지방간 질환이다.
상기 비알코올성 지방간 질환은 간 내에서 중성지방(triglyceride)이 과다하게 축적되어 있는 상태를 일컫는 것으로, 상기 비알코올성 지방간 질환은 단순 지방증(simple steatosis), 간의 괴사와 염증과 섬유화를 동반하는 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH) 및 더 진행된 상태인 간경변증(liver cirrhosis)에서 선택될 수 있다.
상기 알코올성 지방간 질환은 과다한 알코올로 인해 발생하는 간 질환으로, 알코올을 과다 섭취하게 되면 간에서 지방 합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생한다.
본 발명은 가시박(Sicyos angulatus)으로부터 분리된 플라보노이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 플라보노이드 유도체 화합물이 간세포에서의 과도한 지방 축적을 방지하고, 알코올에 의한 간세포 독성을 억제하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가시박으로부터 분리된 플라보노이드 유도체 화합물을 과도한 지방 축적 또는 알코올에 의한 간 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 개선용 건강기능식품 및 동물사료 첨가제 등의 개발에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 가시박으로부터 분리한 신규 화합물인 화합물 1, 8, 9, 11~13의 화학적 구조를 확인하기 위한 HMBC 관계를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 가시박으로부터 분리한 화합물 1~13의 간세포 독성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 간세포의 지방 축적 세포 모델 제조를 위한 팔미트산, 글루코스 또는 인슐린 처리에 따른 간세포 내 중성지방 함량 변화를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 가시박으로부터 분리한 화합물 1~13의 간세포 내 지방 축적 방지 효과를 확인한 것으로, 4(A)는 화합물 1~13을 동일한 농도로 처리하여 각각의 화합물에 따른 지방 축적 방지 효과를 비교한 결과이고, 4(B)는 화합물 1, 3, 4, 13의 처리 농도에 따른 지방 축적 방지 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 가시박으로부터 분리한 화합물 중, 화합물 1, 3, 4, 11, 13의 처리에 의한 간세포 내 지방 축적 방지 효과를 오일 레드 오 염색을 통해 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 가시박으로부터 분리한 화합물 1~13의 간세포 독성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 간세포의 지방 축적 세포 모델 제조를 위한 팔미트산, 글루코스 또는 인슐린 처리에 따른 간세포 내 중성지방 함량 변화를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 가시박으로부터 분리한 화합물 1~13의 간세포 내 지방 축적 방지 효과를 확인한 것으로, 4(A)는 화합물 1~13을 동일한 농도로 처리하여 각각의 화합물에 따른 지방 축적 방지 효과를 비교한 결과이고, 4(B)는 화합물 1, 3, 4, 13의 처리 농도에 따른 지방 축적 방지 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 가시박으로부터 분리한 화합물 중, 화합물 1, 3, 4, 11, 13의 처리에 의한 간세포 내 지방 축적 방지 효과를 오일 레드 오 염색을 통해 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 가시박으로부터 플라보노이드 유도체 화합물의 분리>
가시박(Sicyos angulatus) 1㎏에 70%[v/v] 에탄올 10ℓ을 넣고 실온에서 초음파 추출하는 것을 3회 반복하여 추출물을 얻었다. 수득한 추출액을 감압 농축하여 115g의 70%[v/v] 에탄올 추출물을 확보하였다.
확보한 70%[v/v] 에탄올 추출물에 증류수 3ℓ를 넣어 현탁한 후, n-헥산 3ℓ와 혼합하고 5분간 진탕한 후, n-헥산 층을 분리하는 과정을 2회 반복하였다. 이후, n-헥산 층을 제거한 잔사(물층)에 에틸아세테이트 2ℓ를 혼합한 후, 5분간 진탕하고 에틸아세테이트 층을 분리하는 과정을 2회 반복하였고, 에틸아세테이트 층을 제거한 잔사(물층)에 부탄올 2ℓ를 혼합하여 5분간 진탕한 후 부탄올 층을 분리하는 과정을 2회 반복하였다. 상기에서 분리한 n-헥산 층, 에틸아세테이트 층, 부탄올 층을 각각 감압 농축하여 n-헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물을 확보하였다.
상기 에틸아세테이트 분획물 중 일부(12.2g)를 헥산:에틸아세테이트:메탄올(10:1:0→0:0:1[v/v/v])의 농도구배 용출 조건으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)(컬럼크기: 7×50㎝, 입자크기: 63~200㎛)를 수행한 후, 박층 크로마토그래피 프로파일(thin-layer chromatography profile)을 기반으로 5개의 분획물을 얻었다(SA.1~SA.5).
상기 SA.4 분획물을 메탄올:증류수(4:6→1:0[v/v])의 농도구배 용출 조건으로 역상 18(reverse phase 18, RP-18) 컬럼 크로마토그래피(컬럼크기: 3.5×30㎝, 입자크기: 40~63㎛)를 수행하여 8개의 소분획물을 얻었다(SA.4.1~SA.4.8).
상기 소분획물 SA.4.2를 에틸아세테이트:메탄올(9:1→0:1[v/v])의 농도구배 용출 조건으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(컬럼크기: 4×40㎝, 입자크기: 63~200㎛)를 실시하여 6개의 소분획물을 얻었다(SA.4.2.1~SA.4.2.6).
상기 SA.4.2.2 소분획물(120㎎)을 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)(Optima-pack ODS-H80 column 20×150㎜; 10㎛ 입자 크기; 2㎖/분 유속; UV detection: 254㎚; 이동상: MeCN in H2O containing 0.1% HCO2H (0-45 min: 18% MeCN)를 수행하여 화합물 3(7㎎, 머무름 시간(t R)=33.4분), 화합물 4(3㎎, t R=37분), 화합물 5(2㎎, t R=43.4분), 화합물 6(1.2㎎, t R=38분), 화합물 8(2.2㎎, t R=31.5분), 화합물 11(2.3㎎, t R=32.3분), 화합물 12(2.2㎎, t R=36.3분) 및 화합물 13(1.7㎎, t R=38.3분)을 분리하였다.
또한, 상기 SA.4.2.3 소분획물(220㎎)을 메탄올:증류수(7:3[v/v]) 등용매 조건으로 세파덱스 LH-20(sephadex LH-20)(컬럼 크기: 2×30㎝) 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 4개의 분획물을 얻었다(SA.4.2.3.1~SA.4.2.3.4).
상기 SA.4.2.3.2 분획물(150㎎)을 HPLC(Optima-pack ODS-H80 column 20×150㎜; 10㎛ 입자 크기; 2㎖/분 유속; UV detection: 254㎚; 이동상: MeCN in H2O containing 0.1% HCO2H (0-45 min: 20% MeCN) (0-60분))를 수행하여 화합물 1(5㎎, t R=55분), 화합물 2(5㎎, t R=37분), 화합물 9(1.9㎎, t R=50분) 및 화합물 10(1.7㎎, t R=48분)을 분리하였다.
상기 SA.4.2.6 소분획물(80㎎)을 HPLC(Optima-pack ODS-H80 column 20×150㎜; 10㎛ 입자 크기; 2㎖/분 유속; UV detection: 254㎚; 이동상: MeCN in H2O containing 0.1% HCO2H (0-45 min: 16% MeCN) (0-35분))를 수행하여 화합물 7(1㎎, t R=32.5분)을 분리하였다.
<실시예 2. 플라보노이드 유도체 화합물의 물리 화학적 구조 확인>
실시예 2-1. 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1).
Kaempferol-3-O-(6-O-E-feruroyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside;
노란색 분말;
[a]D -92.2 (c 0.5, 메탄올);
UV (메탄올) λmax (log ε) 201 (4.19), 265 (3.75), 328 (3.41) ㎚;
IR (KBr) νmax 3299, 1656, 1588, 1291, 1181, 1085 ㎝-1;
HRESIMS m/z 769.2006 [M - H]- (calcd for C37H37O18, 769.1985);
1H NMR (DMSO-d 6 , 500 MHz) : δH 8.02 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2', 6'), 7.35 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-7'''), 7.20 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-2'''), 6.95 (1H, dd, J = 8.0, 1.2 Hz, H-6'''), 6.86 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3', 5'), 6.78 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'''), 6.73 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.33 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.25 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-8'''), 5.47 (1H, br s, H-1''''), 5.45 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1''), 4.24 (1H, dd, J = 11.5, 2.0 Hz, H-6''a), 4.12 (1H, m, H-6''b), 3.84 (1H, br s, H-2''''), 3.81 (3H, s, OMe-9'''), 3.62 (1H, dd, J = 9.0, 2.6 Hz, H-3''''), 3.40 (1H, m, H-4''''), 3.30 (1H, m, H-5''), 3.28 (1H, m, H-3''), 3.25 (1H, m, H-2''), 3.24 (1H, m, H-5''''), 3.23 (1H, m, H-4''), 1.09 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6'''');
13C NMR (DMSO-d 6 , 125 MHz) : 표 1 참조.
화합물 1은 노란색의 분말로서 분리되었으며, 20℃에서 측정한 [α]D 값은 -92.2(c 0.5, 메탄올)이며, 분자식은 C37H38O18로 HRESIMS 769.2006(calcd. 769.1985)로부터 결정되었다. 화합물 1은 νmax OH(3299 ㎝-1), C=O(1656 ㎝-1)에서의 강한 IR 흡수치를 나타내어 α, β-불포화 케톤(unsaturated ketone)기의 존재를 제시하였으며 λ max 328 nm에서 강한 UV 흡수밴드를 나타내어 페룰산(ferulic acid)의 존재를 제시하였다. 화합물 1의 1H NMR 분석 결과, 아노머(anomer) 프로톤(proton)을 5.45 (d, J = 7.5 Hz), 5.47 (br s)에서 관찰하여 글루코스와 람노스 잔기가 부착되어 있는 화합물로 확인하였다. 1H NMR과 13C NMR 분석결과(표 1 참조), A2B2 타입의 방향족환 (δH 8.02, 2H, d, J = 8.0 Hz; δC 130.9), (δH 6.86, 2H, d, J = 8.0 Hz; δC 115.1), 트랜스 이중결합 (δH 7.35, 1H, d, J = 15.5 Hz; δC 144.9), (δH 6.25, 1H, d, J = 15.5 Hz; δC 113.9), ABX 타입의 방향족환 (δH 7.20, 1H, d, J = 1.2 Hz; δC 110.9), (δH 6.95, 1H, dd, J = 8.0, 1.2 Hz; δC 123.2), (δH 6.78, 1H, d, J = 8.0 Hz; δC 115.4), 두 개의 카보닐 탄소 (δC 177.6, 166.3)와 2개의 메타 커플링 프로톤 (δH 6.73, 1H, d, J = 2.0 Hz), (δH 6.33, 1H, d, J = 2.0 Hz)의 관찰로부터 화합물 1이 페룰산이 중합된 캠퍼롤 배당체 화합물임을 확인하였다. 화합물 1의 HSQC와 HMBC 실험(도 1 참조)으로부터 C-3 위치에 β-D-글루코피라노실(β-D-glucopyranosyl) 모획이 있는 것을 δH 5.45 (1H, d, J = 7.5 Hz)로부터 C-3 (δC 133.4)로의 HMBC 연결로부터 확인하였으며 C-7 위치에 α-L-람노피라노실(α-L-rhamnopyranosyl) 모획이 있는 것을 δH 5.47 (1H, br s)로부터 C-7 (δC 161.5)로의 HMBC 연결로부터 확인하였다. 또한 β-D-글루코피라노실(β-D-glucopyranosyl)의 H-6''(δH 4.24, 1H, dd, J = 11.5, 2.0 Hz)로부터 페룰산의 C-9''' (δC 166.3)으로의 HMBC 연결을 확인하였다. 이를 통해 신규 화합물 1이 Kaempferol-3-O-(6-O-E-feruroyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside임을 확인하였다.
실시예 2-2. 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2).
Kaempferol-3-O-(6-O-E-coumaroyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside;
노란색 분말;
ESIMS m/z 739.1 [M - H]-;
1H NMR (DMSO-d 6 , 500 MHz) : δH 8.02 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2', 6'), 7.38 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2'', 6''), 7.32 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-7'''), 6.95 (1H, dd, J = 8.0, 1.2 Hz, H-6'''), 6.85 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3', 5'), 6.77 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3''', 5'''), 6.32 (1H, br s, H-6), 6.12 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-8'''), 5.48 (1H, br s, H-1''''), 5.45 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1''), 4.24 (1H, d, J = 11.6 Hz, H-6''a), 4.10 (1H, dd, J = 11.6, 6.0 Hz, H-6''b), 3.84 (1H, br s, H-2''''), 3.62 (1H, dd, J = 9.0, 2.6 Hz, H-3''''), 3.40 (1H, m, H-4''''), 3.32 (1H, m, H-5''), 3.29 (1H, m, H-3''), 3.25 (1H, m, H-2''), 3.22 (1H, m, H-5''''), 3.19 (1H, m, H-4''), 1.10 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6'''');
13C NMR (methanol-d 4, 125 MHz): δC 155.9 (C-2), 133.3 (C-3), 177.6 (C-4), 160.7 (C-5), 99.3 (C-6), 161.5 (C-7), 94.6 (C-8), 156.9 (C-9), 105.5 (C-10), 120.6 (C-1'), 130.2 (C-2'), 115.1 (C-3'), 160.2 (C-4'), 115.1 (C-5'), 130.2 (C-6'), 100.9 (C-1''), 74.3 (C-2''), 76.2 (C-3''), 70.0 (C-4''), 74.1 (C-5''), 62.8 (C-6''), 124.9 (C-1'''), 130.9 (C-2'''), 115.7 (C-3'''), 159.9 (C-4'''), 115.7 (C-5'''), 130.9 (C-6'''), 144.6 (C-7'''), 113.6 (C-8'''), 166.2 (C-9'''), 98.3 (C-1''''), 69.8 (C-2''''), 70.2 (C-3''''), 71.6 (C-4''''), 69.7 (C-5''''), 17.9 (C-6'''').
실시예 2-3. 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3).
Kaempferol-3-O-(6-O-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside;
노란색 분말;
HRESIMS m/z 739.1 [M - H]-;
1H NMR (DMSO-d 6 , 500 MHz) : δH 8.01 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-2', 6'), 6.88 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-3', 5'), 6.77 (1H, br s, H-8), 6.44 (1H, br s, H-6), 5.54 (1H, s, H-1''''), 5.35 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-1''), 4.38 (1H, br s, H-1'''), 3.84 (1H, br s, H-2''''), 3.67 (1H, d, J = 10.6 Hz, H-6''a), 3.64 (1H, dd, J = 9.6, 2.4, H-3''''), 3.48 (1H, m, H-4''), 3.47 (1H, m, H-3'''), 3.46 (1H, m, H-2''), 3.45 (1H, m, H-5''''), 3.44 (1H, m, H-5'''), 3.40 (1H, m, H-2'''), 3.34 (1H, m, H-3''), 3.22 (1H, m, H-6''b), 3.20 (1H, m, H-4''), 3.19 (1H, m, H-4''''), 3.11 (1H, m, H-4'''), 3.10 (1H, m, H-5''), 1.11 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6''''), 0.97 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6''');
13C NMR (DMSO-d 6 , 125 MHz) : δC 156.0 (C-2), 133.5 (C-3), 177.6 (C-4), 160.8 (C-5), 99.3 (C-6), 161.6 (C-7), 94.6 (C-8), 157.2 (C-9), 105.6 (C-10), 120.6 (C-1'), 130.9 (C-2'), 115.1 (C-3'), 160.2 (C-4'), 115.1 (C-5'), 130.9 (C-6'), 101.2 (C-1''), 74.1 (C-2''), 76.3 (C-3''), 70.3 (C-4''), 75.8 (C-5''), 66.7 (C-6''), 100.7 (C-1'''), 70.2 (C-2'''), 70.5 (C-3'''), 71.8 (C-4'''), 68.2 (C-5'''), 17.7 (C-6'''), 98.3 (C-1''''), 69.8 (C-2''''), 70.0 (C-3''''), 71.6 (C-4''''), 69.8 (C-5''''), 17.9 (C-6'''').
실시예 2-4. 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4).
Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside;
노란색 분말;
ESIMS m/z 593.1 [M - H]-;
1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) : δH 8.07 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2', 6'), 6.88 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3', 5'), 6.82 (1H, br s, H-8), 6.44 (1H, br s, H-6), 5.54 (1H, s, H-1'''), 5.47 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-1''), 3.83 (1H, br s, H-2'''), 3.64 (1H, dd, J = 9.3, 2.4 Hz, H-3'''), 3.53 (1H, d, J = 11.6 Hz, H-6''a), 3.48 (1H, m, H-5''), 3.45 (1H, m, H-5'''), 3.34 (1H, m, H-3''), 3.32 (1H, m, H-6''b), 3.27 (1H, m, H-2''), 3.46 (1H, m, H-3''), 3.19 (1H, m, H-4''''), 1.11 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6'''');
13C NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) : δC 156.0 (C-2), 133.4 (C-3), 177.5 (C-4), 160.9 (C-5), 99.4 (C-6), 161.5 (C-7), 94.9 (C-8), 156.6 (C-9), 105.6 (C-10), 120.6 (C-1'), 130.9 (C-2'), 115.1 (C-3'), 160.2 (C-4'), 115.1 (C-5'), 130.9 (C-6'), 100.6 (C-1''), 74.1 (C-2''), 76.4 (C-3''), 70.2 (C-4''), 74.5 (C-5''), 60.8 (C-6''), 98.3 (C-1'''), 69.9 (C-2'''), 70.5 (C-3'''), 71.5 (C-4'''), 69.8 (C-5'''), 17.9 (C-6''').
실시예 2-5. 아피게닌-7-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 5).
Apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside;
노란색 분말;
ESIMS m/z 433.1 [M + H]+;
1H NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz): δH 7.95 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2', 6'), 6.94 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3', 5'), 6.87 (1H, s, H-3), 6.82 (1H, br s, H-8), 6.44 (1H, br s, H-6), 5.06 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-1''), 3.70 (1H, d, J = 11.3 Hz, H-6''a), 3.48 (1H, dd, J = 11.0, 5.6 Hz, H-6''b), 3.46 (1H, m, H-5''), 3.31 (1H, m, H-3''), 3.28 (1H, m, H-2''), 3.19 (1H, m, H-4'');
13C NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) : δC 164.2 (C-2), 103.0 (C-3), 182.0 (C-4), 161.4 (C-5), 99.5 (C-6), 162.9 (C-7), 94.8 (C-8), 156.9 (C-9), 105.3 (C-10), 120.9 (C-1'), 128.6 (C-2'), 116.0 (C-3'), 161.1 (C-4'), 116.0 (C-5'), 128.6 (C-6'), 99.8 (C-1''), 73.0 (C-2''), 76.4 (C-3''), 69.5 (C-4''), 77.1 (C-5''), 60.5 (C-6'').
실시예 2-6. 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6).
Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside;
노란색 분말;
ESIMS m/z 447.1 [M - H]-;
1H NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz) : δH 8.10 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2', 6'), 6.90 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3', 5'), 6.90 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-6), 5.40 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1''), 3.56 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-6''a), 3.34 (1H, m, H-3''), 3.23 (1H, m, H-4''), 3.22 (1H, m, H-6''b), 3.15 (1H, m, H-5''), 3.11 (1H, m , H-2'');
13C NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) : δC 156.0 (C-2), 133.4 (C-3), 177.5 (C-4), 160.9 (C-5), 99.4 (C-6), 161.5 (C-7), 94.9 (C-8), 156.6 (C-9), 105.6 (C-10), 120.6 (C-1'), 130.9 (C-2'), 115.1 (C-3'), 160.2 (C-4'), 115.1 (C-5'), 130.9 (C-6'), 100.6 (C-1''), 74.1 (C-2''), 76.4 (C-3''), 70.2 (C-4''), 74.5 (C-5''), 60.8 (C-6''), 98.3 (C-1'''), 69.9 (C-2'''), 70.5 (C-3'''), 71.5 (C-4'''), 69.8 (C-5'''), 17.9 (C-6''').
실시예 2-7. 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노시드(화합물 7).
Kaempferol-3-O-(6-O-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside;
노란색 분말;
ESIMS m/z 594.1 [M - H]-;
1H NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz): δH 7.97 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2', 6'), 6.87 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3', 5'), 6.34 (1H, br s, H-8), 6.14 (1H, br s, H-6), 5.28 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1''), 4.37 (1H, s, H-1'''), 3.64 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-6''a), 3.40 (1H, br s, H-2'''), 3.24 (1H, m, H-3'''), 3.48 (1H, m, H-5''), 3.45 (1H, m, H-5'''), 3.34 (1H, m, H-3''), 3.32 (1H, m, H-6''b), 3.27 (1H, m, H-2''), 3.46 (1H, m, H-3''), 3.19 (1H, m, H-4''''), 0.98 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6'''');
13C NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) : δC 156.9 (C-2), 133.2 (C-3), 177.4 (C-4), 161.2 (C-5), 98.8 (C-6), 164.2 (C-7), 93.8 (C-8), 159.9 (C-9), 103.9 (C-10), 120.9 (C-1'), 130.9 (C-2'), 115.1 (C-3'), 159.9 (C-4'), 115.1 (C-5'), 130.9 (C-6'), 101.3 (C-1''), 74.2 (C-2''), 76.3 (C-3''), 69.9 (C-4''), 75.7 (C-5''), 66.9 (C-6''), 100.8 (C-1'''), 70.3 (C-2'''), 70.6 (C-3'''), 71.8 (C-4'''), 68.2 (C-5'''), 17.7 (C-6''').
실시예 2-8. 캠퍼롤-3-O-β-D-아피오푸라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 8).
Kaempferol-3-O-β-D-apiofuranosyl-7-O-β-D-glucopyranosyl-(1-3)-α-L-rhamnopyranoside;
붉은색 검;
[a]D -60.3 (c 0.5, 메탄올);
UV (메탄올) λmax (log ε) 201 (4.40), 271 (3.80), 358 (3.30) ㎚;
IR (KBr) νmax 3345, 1657, 1603, 1348, 1175, 1077 ㎝-1;
HRESIMS m/z 725.1961 [M - H]- (calcd for C32H37O19, 725.1935);
1H NMR (DMSO-d 6 , 800 MHz) : δH 7.98 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2', 6'), 6.91 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3', 5'), 6.86 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.44 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 5.74 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-1''''), 5.59 (1H, br s, H-1'''), 4.48 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1'''), 4.19 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-2''), 4.10 (1H, br s, H-2'''), 3.70 (1H, dd, J = 8.7, 3.2 Hz, H-3'''), 3.68 (1H, dd, J = 11.7, 1.9 Hz, H-6''''a), 3.60 (1H, d, J = 9.3 Hz, H-4''a), 3.52 (1H, m, H-4'''), 3.51 (1H, m, H-5'''), 3.49 (1H, d, J = 9.3 Hz, H-4''b), 3.43 (1H, dd, J = 11.7, 5.7 Hz, H-6''''b), 3.31 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-5''a), 3.30 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-5''b), 3.18 (1H, m, H-3''''), 3.16 (1H, m, H-5''''), 3.09 (1H, m, H-2''''), 3.09 (1H, m, H-4''''), 1.14 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6''');
13C NMR (DMSO-d 6 , 200 MHz) : 표 1 참조.
화합물 8은 붉은색의 검(reddish gum)으로서 분리되었으며, 20℃에서 측정한 [α]D 값은 -60.3(c 0.5, 메탄올)이며, 분자식은 C32H38O19로 HRESIMS 725.1961(calcd. 725.1935)로부터 결정되었다. 화합물 8의 1H NMR 분석결과 아노머 프로톤을 5.74 (d, J = 2.1 Hz), 5.59 (br s), 4.48 (d, J = 7.7 Hz) 에서 관찰하여 아피오푸라노스, 람노스, 글루코스 잔기가 부착되어 있는 화합물로 확인하였다. 1H NMR과 13C NMR 분석결과(표 1 참조), A2B2 타입의 방향족환 (δH 7.98, 2H, d, J = 8.0 Hz; δC 130.7), (δH 6.91, 2H, d, J = 8.0 Hz; δC 115.5), 한 개의 카보닐 탄소 (δC 177.0)와 2개의 메타 커플링 프로톤 (δH 6.86, 1H, d, J = 2.0 Hz), (δH 6.48, 1H, d, J = 2.0 Hz)의 관찰로부터 화합물 8이 캠퍼롤 배당체 화합물임을 확인하였다. 화합물 8의 HSQC와 HMBC 실험(도 1 참조)으로부터 C-3 위치에 β-D-아피오푸라노실(β-D-apiofuranosyl) 모획이 있는 것을 δH 5.74 (1H, d, J = 2.1 Hz)로부터 C-3 (δC 133.7)로의 HMBC 연결로부터 확인하였으며 C-7 위치에 α-L-람노피라노실(α-L-rhamnopyranosyl) 모획이 있는 것을 δH 5.59 (1H, br s)로부터 C-7 (δC 161.4)로의 HMBC 연결로부터 확인하였다. 또한 α-L-람노피라노실(α-L-rhamnopyranosyl)의 H-3'''(δH 3.70, 1H, dd, J = 8.7, 3.2 Hz)로부터 β-D-글루코피라노실(β-D-glucopyranosyl)의 C-1'''' (δC 104.6) 으로의 HMBC 연결을 확인하였다. 이를 통해 신규 화합물 8이 Kaempferol-3-O-β-D-apiofuranosyl-7-O-β-D-glucopyranosyl-(1-3)-α-L-rhamnopyranoside임을 확인하였다.
실시예 2-9. 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 9).
Quercetin-3-O-(6-O-E-feruroyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside;
노란색 분말;
[a]D -115.0 (c 0.5, 메탄올);
UV (메탄올) λmax (log ε) 201 (4.12), 265 (3.71), 326 (3.40) ㎚;
IR (KBr) νmax 3304, 1656, 1598, 1446, 1286, 1181, 1085 ㎝-1;
HRESIMS m/z 785.1964 [M - H]- (calcd for C37H37O19, 785.1935);
1H NMR (DMSO-d 6 , 800 MHz) : δH 7.58 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2'), 7.56 (1H, dd, J = 8.4, 2.1 Hz, H-6'), 7.34 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-7'''), 7.20 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2'''), 6.94 (1H, dd, J = 8.2, 1.8 Hz, H-6'''), 6.93 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 6.77 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5'''), 6.69 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.30 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 6.24 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8'''), 5.49 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1''), 5.46 (1H, br s, H-1''''), 4.24 (1H, d, J = 10.1 Hz, H-6''a), 4.13 (1H, dd, J = 11.9, 6.2 Hz, H-6''b), 3.84 (1H, br s, H-2''''), 3.81 (3H, s, OMe-9'''), 3.61 (1H, dd, J = 8.2, 3.2 Hz, H-3''''), 3.39 (1H, m, H-2''), 3.30 (1H, m, H-5''), 3.28 (1H, m, H-4''''), 3.27 (1H, m, H-3''), 3.23 (1H, m, H-5''''), 1.09 (3H, d, J = 6.2 Hz, H-6'''');
13C NMR (DMSO-d 6 , 200 MHz) : 표 1 참조.
화합물 9는 노란색의 분말로서 분리되었으며, 20℃에서 측정한 [α]D 값은 -115.0(c 0.5, 메탄올)이며, 분자식은 C37H38O19로 HRESIMS 785.1964(calcd. 785.1935)로부터 결정되었다. 화합물 9는 화합물 1의 비당체 B링에 히드록시기가 추가된 구조로써 분자량 16이 증가하였다. 화합물 9의 1H NMR과 13C NMR 분석결과(표 1 참조), B링의 ABX 타입의 방향족환 (δH 7.58, 1H, d, J = 2.1 Hz; δC 116.3), (δH 6.93, 1H, d, J = 8.4 Hz; δC 115.2), (δH 7.56, 1H, dd, J = 8.4, 2.1 Hz; δC 121.7)을 확인하였다. 아노머 프로톤의 짝지움 상수(coupling constant)는 글루코피라노실(glucopyranosyl)(J= 7.6 Hz), 람노피라노실(rhamsnopyranosyl)(br s)기의 각각 β, α 위치로의 연결을 확인하였다. 화합물 9의 HSQC와 HMBC 실험결과(도 1 참조)로부터 당의 연결 순서를 확인하였으며, 따라서 신규 화합물 9는 Quercetin-3-O-(6-O-E-feruroyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside임을 확인하였다.
실시예 2-10. 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 10).
Quercetin-3-O-(6-O-E-coumaroyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside;
노란색 분말;
ESIMS m/z 755.1 [M - H]-;
1H NMR (DMSO-d 6 , 600 MHz) : δH 7.59 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 7.56 (1H, dd, J = 8.4, 2.1 Hz, H-6'), 7.38 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2''', 6'''), 6.83 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 6.77 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3''', 5'''), 6.69 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.30 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 5.49 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1''), 5.48 (1H, br s, H-1''''), 4.23 (1H, d, J = 10.3 Hz, H-6''a), 4.11 (1H, dd, J = 11.0, 6.2 Hz, H-6''b), 3.84 (1H, br s, H-2''''), 3.61 (1H, m, H-3''''), 3.40 (1H, m, H-2''), 3.38 (1H, m, H-4''), 3.30 (1H, m, H-5''), 3.28 (1H, m, H-3''), 3.28 (1H, m, H-4''''), 3.28 (1H, m, H-3''), 3.22 (1H, m, H-5''''), 1.10 (3H, d, J = 6.1 Hz, H-6'''');
13C NMR (DMSO-d 6 , 150 MHz) : δC 156.7 (C-2), 133.3 (C-3), 177.5 (C-4), 160.7 (C-5), 99.2 (C-6), 161.5 (C-7), 94.3 (C-8), 155.8 (C-9), 105.4 (C-10), 120.8 (C-1'), 116.2 (C-2'), 144.5 (C-3'), 148.7 (C-4'), 115.1 (C-5'), 121.6 (C-6'), 100.7 (C-1''), 74.3 (C-2''), 76.2 (C-3''), 70.0 (C-4''), 73.9 (C-5''), 62.8 (C-6''), 124.9 (C-1'''), 130.1 (C-2'''), 115.6 (C-3'''), 159.7 (C-4'''), 115.6 (C-5'''), 130.1 (C-6'''), 144.8 (C-7'''), 113.6 (C-8'''), 166.2 (C-9'''), 98.3 (C-1''''), 70.0 (C-2''''), 70.2 (C-3''''), 71.5 (C-4''''), 69.8 (C-5''''), 17.8 (C-6'''').
실시예 2-11. 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11).
Kaempferol-3-O-(6-O-E-feruroyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranosyl-(1-3)-α-L-rhamnopyranoside;
노란색 검;
[a]D -78.5 (c 0.5, 메탄올);
UV (메탄올) λmax (log ε) 201 (3.76), 265 (3.50), 326 (3.40) ㎚;
IR (KBr) νmax 3304, 1656, 1598, 1446, 1286, 1181, 1085 ㎝-1;
HRESIMS m/z 1077.3108 [M - H]- (calcd for C49H57O27, 1077.3093);
1H NMR (DMSO-d 6 , 800 MHz) : δH 8.14 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2', 6'), 7.49 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-7'''), 7.10 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2'''), 6.92 (1H, dd, J = 8.1, 1.8 Hz, H-6'''), 6.87 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3', 5'), 6.77 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5'''), 6.59 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.32 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.39 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8'''), 5.44 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-1''''), 5.33 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1''), 4.48 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1'''''), 4.41 (1H, dd, J = 11.8, 1.8 Hz, H-6''a), 4.38 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-1''''''), 4.23 (1H, dd, J = 11.9, 7.0 Hz, H-6''b), 4.08 (1H, br s, H-2''''), 3.72 (1H, dd, J = 9.0, 2.5 Hz, H-3''''), 3.71 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-6'''''a), 3.68 (3H, s, OMe-9'''), 3.51 (1H, m, H-4''''), 3.50 (1H, m, H-5''), 3.45 (1H, br s, H-5''''), 3.41 (1H, m, H-3''''''), 3.26 (1H, m, H-2''), 3.26 (1H, br s, H-4'''''), 3.25 (1H, m, H-6'''''b), 3.25 (1H, br s, H-2''''''), 3.23 (1H, m, H-3''), 3.17 (1H, m, H-5'''''), 3.15 (1H, m, H-4'') 3.14 (1H, m, H-2'''''), 3.09 (1H, m, H-5''''''), 3.06 (1H, m, H-4''''''), 1.10 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6''''), 0.97 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6'''''');
13C NMR (DMSO-d 6 , 200 MHz) : 표 1 참조.
화합물 11은 노란색의 검으로서 분리되었으며, 20℃에서 측정한 [α]D 값은 -78.5(c 0.5, 메탄올)이며, 분자식은 C49H58O27로 HRESIMS 1077.3108(calcd. 1077.3093)로부터 결정되었다. 화합물 11은 화합물 1에 β-D-글루코피라노실과 α-L-람노피라노실이 추가된 구조이다. A링의 C-7에 연결된 α-L-람노피라노실의 H-3''''에 β-D-글루코피라노실이 연결되어 있음을, β-D-글루코피라노실의 H-6''''' 에 α-L-람노피라노실 모획이 추가적으로 연결되어 있음을 각각 H-3'''' (δH 3.72)로부터 C-1''''' (δC 105.0), H-6''''' (δH 3.71)으로부터 C-1'''''' (δC 100.6)으로의 HMBC 연결을 통하여 확인하였다. 화합물 11의 아노머 프로톤의 짝지움 상수(coupling constant)는 글루코피라노실(J = 7.6 Hz) (J = 7.7 Hz), 람노피라노실(J = 1.2 Hz)기의 각각 β, α 위치로의 연결을 확인하였다. 따라서 신규 화합물 11은 Kaempferol-3-O-(6-O-E-feruroyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhampyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranosyl-(1-3)-α-L-rhamnopyranoside임을 확인하였다.
실시예 2-12. 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12).
Kaempferol-3-O-(6-O-E-feruroyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosyl-(1-3)-α-L-rhamnopyranoside;
노란색 분말;
[a]D -64.9 (c 0.5, 메탄올);
UV (메탄올) λmax (log ε) 311 (4.10) ㎚;
IR (KBr) νmax 342, 2910, 1702, 1645, 1643, 1142, 606 ㎝-1;
HRESIMS m/z 931.2523 [M - H]- (calcd for C43H47O23, 931.2514);
1H NMR (DMSO-d 6 , 800 MHz) : δH 8.09 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2', 6'), 7.35 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-7'''), 7.18 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2'''), 6.95 (1H, dd, J = 8.2, 1.8 Hz, H-6'''), 6.86 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-3', 5'), 6.77 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5'''), 6.76 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.32 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.24 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8'''), 5.48 (1H, br s, H-1''''), 5.41 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1''), 4.48 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1'''''), 4.18 (1H, dd, J = 11.2, 3.7 Hz, H-6''a), 4.11 (1H, br s, H-2''''), 4.07 (1H, dd, J = 11.3, 7.5 Hz, H-6''b), 3.79 (3H, s, OMe-9'''), 3.75 (1H, dd, J = 9.1, 3.1 Hz, H-3''''), 3.70 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-6'''''a), 3.52 (1H, m, H-4''''), 3.51 (1H, m, H-5''''), 3.45 (1H, m, H-6'''''b), 3.30 (1H, br s, H-5''), 3.28 (1H, m, H-3''), 3.26 (1H, m, H-2''), 3.23 (1H, br s, H-4''), 3.18 (1H, br s, H-3'''''), 3.16 (1H, m, H-5'''''), 3.09 (1H, m, H-2'''''), 3.09 (1H, m, H-4'''''), 1.11 (3H, d, J = 6.1 Hz, H-6'''');
13C NMR (DMSO-d 6 , 200 MHz) : 표 1 참조.
화합물 12는 노란색의 분말로서 분리되었으며, 20℃에서 측정한 [α]D 값은 -64.9(c 0.5, 메탄올)을 나타내었다. 화합물 12는 화합물 11의 람노피라노실 1개가 제거된 구조로써 HRESIMS에서 분자량이 146 감소하였으며 분자식은 C43H48O23로 결정되었다. 아노머 프로톤의 짝지움 상수(coupling constant)는 글루코피라노실(J = 7.6 Hz), 람노피라노실(br s)기의 각각 β, α 위치로의 연결을 확인하였다. 화합물 12의 HSQC와 HMBC 실험결과(도 1 참조)로부터 당의 연결 순서를 확인하였으며, 따라서 신규 화합물 12는 Kaempferol-3-O-(6-O-E-feruroyl)-β-D-glucopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosyl-(1-3)-α-L-rhamnopyranoside임을 확인하였다.
실시예 2-13. 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13).
Tricin 4′-O-(7″R,8″R-guaiacylglyceryl)ether 7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside;
붉은색의 무정형 분말;
[a]D -39.8 (c 0.5, 메탄올);
IR (KBr) νmax 3410, 1658, 1613, 1495, 1459, 1352, 1256, 1133 ㎝-1;
HRESIMS m/z 833.2513 [M - H]- (calcd for C39H45O20, 833.2510);
1H NMR (DMSO-d 6 , 800 MHz) : δH 7.32 (2H, s, H-2', 6'), 6.93 (1H, br s, H-2''), 6.90 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.39 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.75 (1H, dd, J = 8.0, 1.6 Hz, H-6''), 6.69 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5''), 5.21 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1'''), 5.12 (1H, br s, H-1''''), 4.79 (1H, br s, H-7''), 4.37 (1H, m, H-8''), 3.87 (6H, s, OMe-3', 5'), 3.74 (3H, s, OMe-4''), 3.70 (1H, m, H-9''a), 3.49 (1H, m, H-9''b), 3.69 (1H, br s, H-2''''), 3.77 (1H, br s, H-5''''), 3.51 (1H, m, H-4'''), 3.48 (1H, m, H-2'''), 3.48 (1H, m, H-3'''), 3.47 (1H, m, H-6'''a), 3.46 (1H, m, H-6'''b), 3.34 (1H, m, H-3''''), 3.21 (1H, m, H-4''''), 3.18 (1H, m, H-5'''), 1.18 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-6'''');
13C NMR (DMSO-d 6 , 200 MHz): 표 1 참조.
화합물 13은 붉은색의 무정형 분말로서 분리되었으며, 20℃에서 측정한 [α]D 값은 -39.8 (c 0.5, 메탄올)이며, 분자식은 HRESIMS 측정치로부터 계산하여 C39H46O20임이 확인되었다. 화합물 13의 1H NMR분석 결과 아노머 프로톤을 5.21 (1H, d, J = 7.7 Hz), 5.12 (1H, br s)에서 확인하여 글루코스와 람노스 잔기가 부착되어있는 화합물로 확인하였다. 1H NMR, 13C NMR 분석결과(표 1 참조), A2 타입의 방향족환 (δH 7.32, 2H, s, δC 104.3)과 ABX 타입의 방향족환 (δH 6.93, br s; δC 104.3), (δH 6.75, 1H, dd, J = 8.0, 1.6 Hz; δC 119.7), (δH 6.69, 1H, d, J = 8.1 Hz; δC 114.7), 세 개의 메톡시기 (δH 3.87, 6H, s) (δH 3.74, 3H, s)를 관찰하였으며 두 개의 메톡시기 (δH 3.87, 6H, s)가 A2 타입의 방향족환 C-3', 5' (δC 152.9)에 존재함을 HMBC 연결을 통하여 확인하였다. 또한 구아이아실글리세롤 모획의 H-8 (δH 4.37, 1H, m)로부터 A2 타입의 방향족환의 C-4' (δC 139.7)으로의 HMBC 연결을 확인함으로써 화합물 13이 구아이아실글리세롤이 중합된 트리신 배당체 화합물임을 확인하였다. 화합물 13의 HSQC와 HMBC 실험(도 1 참조)으로부터 C-7 위치에 β-D-글루코피라노실 모획이 있는 것을 δH 5.21 (1H, d, J = 7.7 Hz)로부터 C-7 (δC 162.8)로의 HMBC 연결로부터 확인하였으며 글루코스의 C-4''' 위치에 α-L-람노피라노실 모획이 있는 것을 δH 5.12 (1H, br s)로부터 C-4''' (δC 76.4)로의 HMBC 연결로부터 확인하였다. 또한 구아이아실글리세롤 모획의 두 개의 옥시메싸인 프로톤 (δH 4.37, 4.79)의 ROESY 연결을 통하여 상대배열을 확인하였고, 원편광 이색성 측정 실험치와 계산치의 비교를 통하여 프로톤의 절대배열을 β 위치로 결정하였다. TDDFT(time dependent density functional theory) 함수를 사용하였으며 에너지가 가장 낮은 하위 5개 이형태의 볼츠만 분포는 99%를 나타내었다. 이를 통해 신규 화합물 13이 Tricin 4'-O-(7''R,8''R-guaiacylglyceryl)ether 7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside임을 확인하였다.
| No. | 화합물 1a | 화합물 8b | 화합물 9b | 화합물 11b | 화합물 12b | No. | 화합물 13b |
| 2 | 156.9, C | 157.3, C | 156.8, C | 155.8, C | 155.8, C | 2 | 163.9, C |
| 3 | 133.4, C | 133.7, C | 133.4, C | 133.6, C | 133.5, C | 3 | 105.1, CH |
| 4 | 177.6, C | 177.0, C | 177.5, C | 177.5, C | 177.6, C | 4 | 182.2, C |
| 5 | 160.8, C | 160.9, C | 160.8, C | 160.7, C | 160.7, C | 5 | 161.0, C |
| 6 | 99.2, CH | 99.5, CH | 99.2, CH | 99.1, CH | 99.2, CH | 6 | 99.6, CH |
| 7 | 161.5, C | 161.4, C | 161.5, C | 161.1, C | 161.2, C | 7 | 162.8, C |
| 8 | 94.6, CH | 94.8, CH | 94.4, CH | 94.6, CH | 94.8, CH | 8 | 95.0, CH |
| 9 | 155.9, C | 155.9, C | 155.8, C | 157.3, C | 156.9, C | 9 | 157.0, C |
| 10 | 105.5, C | 105.7, C | 105.5, C | 105.5, C | 105.5, C | 10 | 105.6, C |
| 1' | 120.8, C | 120.5, C | 120.8, C | 120.8, C | 120.6, C | 1' | 124.9, C |
| 2' | 130.9, CH | 130.7, CH | 116.3, CH | 131.0, CH | 131.1, CH | 2' | 104.3, CH |
| 3' | 115.1, CH | 115.5, CH | 144.5, C | 115.0, CH | 115.0, CH | 3' | 152.9, C |
| 4' | 160.2, C | 160.1, C | 148.8, C | 160.0, C | 160.1, C | 4' | 139.7, C |
| 5' | 115.1, CH | 115.5, CH | 115.2, CH | 115.0, CH | 115.0, CH | 5' | 152.9, C |
| 6' | 130.9, CH | 130.7, CH | 121.7, CH | 131.0, CH | 131.1, CH | 6' | 104.3, CH |
| 1'' | 101.0, CH | 109.2, CH | 100.8, CH | 101.5, CH | 101.6, CH | OMe | 56.3, CH3 |
| 2'' | 74.3, CH | 77.1, CH | 74.4, CH | 75.6, CH | 74.0, CH | 1'' | 133.2, C |
| 3'' | 76.2, CH | 79.4, C | 76.3, CH | 76.0, CH | 76.2, CH | 2'' | 110.9, CH |
| 4'' | 70.1, CH | 75.1, CH2 | 70.0, CH | 70.2, CH | 69.8, CH | 3'' | 146.9, C |
| 5'' | 74.1, CH | 62.7, CH2 | 74.0, CH | 74.1, CH | 74.1, CH | 4'' | 145.4, C |
| 6'' | 62.8, CH2 | 62.9, CH2 | 63.4, CH2 | 62.9, CH2 | 5'' | 114.7, CH | |
| 1''' | 125.5, C | 98.2, CH | 125.5, C | 125.3, C | 125.5, C | 6'' | 119.7, CH |
| 2''' | 110.9, CH | 68.9, CH | 110.9, CH | 110.5, CH | 110.9, CH | 7'' | 72.1, CH |
| 3''' | 147.8, C | 80.7, CH | 147.8, C | 147.6, C | 147.8, C | 8'' | 86.5, CH |
| 4''' | 149.3, C | 70.5, CH | 149.3, C | 149.2, C | 149.3, C | 9'' | 60.3, CH2 |
| 5''' | 115.4, CH | 69.6, CH | 115.4, CH | 115.1, CH | 115.4, CH | OMe | 55.5, CH3 |
| 6''' | 123.2, CH | 17.8, CH3 | 123.1, CH | 123.0, CH | 123.1, CH | 1''' | 98.2, CH |
| 7''' | 144.9, CH | 144.9, CH | 145.2, CH | 145.0, CH | 2''' | 77.3, CH | |
| 8''' | 113.9, CH | 113.9, CH | 113.9, CH | 113.9, CH | 3''' | 77.2, CH | |
| 9''' | 166.3, C | 166.3, C | 166.6, C | 166.2, C | 4''' | 76.4, CH | |
| OMe | 55.6, CH3 | 55.6, CH3 | 55.4, CH3 | 55.6, CH3 | 5''' | 69.8, CH | |
| 1'''' | 98.3, CH | 104.6, CH | 98.4, CH | 97.9, CH | 98.1, CH | 6''' | 60.5, CH2 |
| 2'''' | 69.8, CH | 73.9, CH | 69.8, CH | 69.2, CH | 68.2, CH | 1'''' | 100.5, CH |
| 3'''' | 70.2, CH | 76.2, CH | 70.2, CH | 81.2, CH | 80.7, CH | 2'''' | 70.4, CH |
| 4'''' | 71.6, CH | 69.9, CH | 71.6, CH | 70.1, CH | 70.5, CH | 3'''' | 70.5, CH |
| 5'''' | 69.8, CH | 76.7, CH | 69.8, CH | 69.6, CH | 68.9, CH | 4'''' | 71.8, CH |
| 6'''' | 17.8, CH3 | 60.9, CH2 | 17.8, CH3 | 17.8, CH3 | 17.8, CH3 | 5'''' | 68.4, CH |
| 1''''' | 105.0, CH | 104.6, CH | 6'''' | 18.0, CH3 | |||
| 2''''' | 73.8, CH | 72.9, CH | |||||
| 3''''' | 76.4, CH | 76.2, CH | |||||
| 4''''' | 70.5, CH | 69.5, CH | |||||
| 5''''' | 74.2, CH | 76.7, CH | |||||
| 6''''' | 66.7, CH2 | 60.9, CH2 | |||||
| a : Recorded in DMSO-d6 at 125 MHz. b : Recorded in DMSO-d6 at 200 MHz. |
|||||||
<실시예 3. 간세포에 대한 세포 독성 평가>
상기 실시예 1에서 가시박으로부터 분리한 플라보노이드 유도체 화합물의 세포 독성 여부를 확인하기 위해 간세포주인 HepG2 세포를 이용하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 수행하였다.
HepG2 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 1% PS(penicillin+streptomycin) 및 L-글루타민(L-glutamine; 500㎖ 배지 기준 2㎖ 첨가)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 배양하였다. 배양한 HepG2 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 5×103 개의 세포가 되도록 넣고 HepG2 세포가 플레이트 면적의 75% 정도가 차도록 배양하였다. 상기 실시예 1에서 분리한 화합물 1~13을 각각 농도가 100uM이 되도록 웰에 처리하고 24시간 동안 반응시켰다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 HepG2 세포를 정상 대조군으로 이용하였다. 24시간 후에 2㎎/㎖의 MTT 용액을 각 웰에 20㎕씩 처리하고, 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 4시간 동안 배양한 후, 배양액을 제거하고 각 웰에 DMSO(dimethylsulfoxide) 100㎕씩을 처리한 뒤 550㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때, 정상 대조군의 세포 생존율을 100% 기준으로 하고 각 화합물 처리에 의한 세포 생존율을 계산하였다.
도 2에서 보듯이, 가시박으로부터 분리한 화합물 1~13은 간세포에 세포 독성이 없으며, 간세포 성장에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
<실시예 4. 간세포 내 지방 축적 방지 효과 확인>
실시예 4-1. 지방 축적 유도 세포 모델 제조
지방간은 지방의 과도한 섭취나 내인적 요인으로 인해 간 조직 내 지방 합성이 증가되거나 배출이 감소되어 간세포 내 지방이 축적되어 나타나는 질환으로, 비알코올성 지방간 질환과 알코올성 지방간 질환으로 나뉠 수 있다. 알코올성 지방간 질환은 과도한 알코올 섭취로 인해 알코올 대사의 효율이 떨어져 지방간 발생이 심해지며, 비알코올성 지방간 질환은 알코올 섭취의 병력이 없어도 발병하며, 간 내에 중성 지방이 과다하게 축적되어 있다.
따라서 알코올성 지방간 질환 및 비알코올성 지방간 질환에서의 지방 과다 축적이 보고됨으로 간세포주에 지방 과다 축적을 유도하는 세포 모델을 만들어 본 발명의 화합물 1~13의 지방간과 같은 지방 축적에 의한 간 질환에 대한 치료 효과를 확인하였다.
간세포주에 지방 과다 축적을 유도하는 세포 모델을 제조하기 하기 위해, 비만 및 인슐린 내성 상태를 모방하여 탄수화물(글루코스), 지방산(팔미트산, palmitic acid) 또는 인슐린을 각각 또는 동시에 처리하여 간세포 내 중성지방(triglyceride)의 축적 정도를 확인하였다. 보다 자세하게, 간세포주인 HepG2 세포를 12웰 플레이트에 배양하고 0.1% BSA(bovine serum albumin)와 0.2mM 팔미트산, 고농도의 글루코스(30mM) 또는 고농도의 인슐린(50nM)을 세포에 24시간 동안 처리하여 인슐린 내성(insulin tolerance)을 가진 지방 축적을 유도하였다. 이후, 배양된 세포를 차가운 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고 1% 트리톤 X-100(triton X-100)을 처리하여 분석 샘플을 확보하였다. 확보한 분석 샘플을 중성지방 정량 키트(Fluorometric Serum Triglyceride Quantification, Cell Biolabs사, USA) 및 이의 제조사로부터 제공받은 실험방법을 이용하여 샘플 내 중성지방의 양을 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보듯이, 글루코스만 처리한 HepG2 세포에 비해 글루코스와 팔미트산을 동시에 처리한 HepG2 세포에서의 중성지방의 축적이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 글루코스와 팔미트산에 인슐린을 추가로 처리한 경우에 HepG2 세포의 중성지방 축적이 글루코스와 팔미트산을 처리한 경우보다 더 많이 증가하는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 화합물 1~13의 지방 축적 방지 효과를 확인하기 위해 HepG2 세포에 글루코스, 팔미트산 및 인슐린을 동시에 처리하는 방법을 이용하였다.
실시예 4-2. 플라보노이드 유도체 화합물의 간세포 내 지방 축적 감소 효과 확인
간세포주인 HepG2 세포를 12웰 플레이트에 배양하고 상기 실시예 1에서 분리한 화합물 1~13을 40uM 농도로 각각 처리하고, 0.1% BSA, 0.2mM 팔미트산, 50nM 인슐린 및 30mM 글루코스를 24시간 동안 처리하였다. 이후, 배양된 세포를 차가운 PBS로 세척하고 1% 트리톤 X-100을 처리하여 분석 샘플을 확보하였다. 확보한 분석 샘플을 상기 실시예 4-1의 중성지방 분석 방법과 동일하게 중성지방 정량 키트 및 이의 제조사로부터 제공받은 실험방법을 이용하여 각 화합물을 처리한 HepG2 세포 내의 중성지방의 양을 분석하였고, 그 결과를 도 4(A)에 나타내었다.
도 4(A)에서 보듯이, 팔미트산, 글루코스 및 인슐린을 처리한 간세포의 중성지방 함량에 비해 상기 실시예 1에서 분리한 화합물 1~13을 처리한 간세포에서의 중성지방 함량이 감소함을 확인하였다. 특히나, 화합물 1~4, 6, 11~13을 처리한 간세포에서의 중성지방 함량 감소가 크게 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 상기 중성지방 축적 방지 효과를 확인한 방법과 동일한 방법으로 일부 화합물(화합물 1, 3, 4, 13)을 이용하여 화합물 농도에 따른 중성지방 감소 효과를 확인하였고, 그 결과를 도 4(B)에 나타내었다. 이때, 화합물은 농도가 10, 20, 40uM이 되도록 처리하였고, 비알코올성 지방간 질환의 치료제로 사용되고 있는 페노피브레이트(fenofibrate, Sigma 사, USA) 80uM을 처리한 것을 양성 대조군으로 이용하였다.
도 4(B)에서 보듯이, 화합물 1, 3, 4, 13을 농도별로 처리한 경우, 화합물 처리 농도 의존적으로 간세포 내 중성지방의 함량이 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 4-3. 중성지방 염색을 통한 간세포 내 지방 축적 방지 효과 확인
상기 실시예 1에서 분리한 화합물 중, 화합물 1, 3, 4, 11 및 13을 처리하여 간세포 내 중성지방의 변화를 오일 레드 오(Oil Red O) 염색법을 이용하여 확인하였다.
상기 실시예 4-2와 동일한 방법으로 HepG2 세포에 각각의 화합물과 팔미트산, 글루코스 및 인슐린을 처리하고, 화합물 대신 페노피브레이트를 화합물과 동일한 농도로 처리하여 양성대조군으로 이용하였다. 이후, 배양된 세포에 5% 포르말린(formalin)을 30분 동안 처리하여 세포를 고정시킨 후, 중성지방을 염색하기 위해 오일 레드 오 시약(Sigman사, USA)를 15분 동안 처리하였다. 이후, 60% 이소프로판올 용액으로 세포를 세척하고 증류수로 3회 세척하였다. 세포핵의 염색을 위하여 추가로 헤마톡실린(hematoxylin) 용액(Sigma 사, USA)을 처리하여 실온에서 2분 동안 반응시켰다. 형광현미경(Olympus ix70 Fluorescence Microscope, Olympus Corporation, JPN)을 이용해 염색된 붉은 오일 방울을 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보듯이, 팔미트산, 글루코스 및 인슐린을 처리한 간세포의 경우, 오일 레드 오 시약에 의해 붉은색으로 염색된 부분이 현저히 많은 반면에, 양성대조군으로 사용한 페노피브레이트 및 상기 실시예 1에서 분리한 화합물 1, 3, 4, 11 및 13을 처리한 간세포에서는 붉은색으로 염색된 부분이 감소된 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 명세서에서는 보여주지 않았으나, Cameron, R.G., et al., 1998. 및 Madushani, H.K., et al, 2018.에 기재된 알코올로 유도된 지방간 유발 동물세포 모델을 이용하여 상기 실시예 1에서 분리한 화합물 1~13을 처리하여 알코올에 의한 간세포 독성 억제 효과를 확인한 결과, 화합물 1~13을 투여한 간세포 모두에서 알코올에 의해 간세포의 생존율이 감소되는 것이 억제되는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통해, 본 발명의 가시박으로부터 분리한 플라보노이드 유도체인 화합물 1~13이 간 조직 내 지방이 과다 축적을 방지하고, 알코올에 의한 간세포의 독성을 억제함으로써 알코올성 지방간 및 비알코올성 지방간에 치료 효과가 있음을 알 수 있었다.
하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명고하자 한다.
<제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 화합물 4 20g을 각각 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 화합물 4 100㎎, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
<제제예 2. 건강기능식품의 제조>
제제예 2-1. 건강기능식품의 제조
본 발명의 화합물 4 20g, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산 마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 섞어 과립으로 제조하였으나, 용도에 따라 다양한 제형으로 변형시켜 제조할 수 있다. 또한, 상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 제조할 수 있다.
제제예 2-2. 건강기능성 음료의 제조
본 발명의 화합물 4 1g, 구연산 0.1g, 프락토올리고당 100g, 정제수 900g을 섞어 통상의 음료 제조방법에 따라 교반, 가열, 여과, 살균, 냉장하여 음료를 제조하였다.
Claims (24)
- 하기 화학식 1의 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 아피게닌-7-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노시드(화합물 7), 캠퍼롤-3-O-β-D-아피오푸라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 8), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 9), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 10), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
- 제1항에 있어서,
상기 플라보노이드 유도체 화합물은 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물인 것을 특징으로 하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 플라보노이드 유도체 화합물은 가시박(Sicyos angulatus) 추출물로부터 분리된 화합물인 것을 특징으로 하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 가시박 추출물은 가시박을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르(acetic ester), 아세톤(acetone), 메틸에틸케톤(methylethylketone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간 질환은 지방간(fatty liver) 질환인 것을 특징으로 하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 지방간 질환은 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 알코올성 지방간 질환(alcoholic fatty liver disease)인 것을 특징으로 하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 하기 화학식 1의 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 아피게닌-7-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노시드(화합물 7), 캠퍼롤-3-O-β-D-아피오푸라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 8), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 9), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 10), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]
- 제7항에 있어서,
상기 플라보노이드 유도체 화합물은 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물인 것을 특징으로 하는 간 질환 개선용 건강기능식품. - 제7항에 있어서,
상기 플라보노이드 유도체 화합물은 가시박(Sicyos angulatus) 추출물로부터 분리된 화합물인 것을 특징으로 하는 간 질환 개선용 건강기능식품. - 제9항에 있어서,
상기 가시박 추출물은 가시박을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르(acetic ester), 아세톤(acetone), 메틸에틸케톤(methylethylketone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 간 질환 개선용 건강기능식품. - 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간 질환은 지방간(fatty liver) 질환인 것을 특징으로 하는 간 질환 개선용 건강기능식품. - 제11항에 있어서,
상기 지방간 질환은 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 또는 알코올성 지방간 질환(alcoholic fatty liver disease)인 것을 특징으로 하는 간 질환 개선용 건강기능식품. - 하기 화학식 1의 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 아피게닌-7-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노시드(화합물 7), 캠퍼롤-3-O-β-D-아피오푸라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 8), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 9), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 10), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 동물 약품.
[화학식 1]
- 제13항에 있어서,
상기 플라보노이드 유도체 화합물은 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물인 것을 특징으로 하는 간 질환 예방 또는 치료용 동물 약품. - 제13항에 있어서,
상기 플라보노이드 유도체 화합물은 가시박 추출물로부터 분리된 화합물인 것을 특징으로 하는 간 질환 예방 또는 치료용 동물 약품. - 제15항에 있어서,
상기 가시박 추출물은 가시박을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르(acetic ester), 아세톤(acetone), 메틸에틸케톤(methylethylketone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 간 질환 예방 또는 치료용 동물 약품. - 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간 질환은 지방간(fatty liver) 질환인 것을 특징으로 하는 간 질환 예방 또는 치료용 동물 약품. - 하기 화학식 1의 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 아피게닌-7-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노시드(화합물 7), 캠퍼롤-3-O-β-D-아피오푸라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 8), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 9), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 10), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 개선용 동물사료 첨가제.
[화학식 1]
- 제18항에 있어서,
상기 플라보노이드 유도체 화합물은 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물인 것을 특징으로 하는 간 질환 개선용 동물사료 첨가제. - 제18항에 있어서,
상기 플라보노이드 유도체 화합물은 가시박 추출물로부터 분리된 화합물인 것을 특징으로 하는 간 질환 개선용 동물사료 첨가제. - 제20항에 있어서,
상기 가시박 추출물은 가시박을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르(acetic ester), 아세톤(acetone), 메틸에틸케톤(methylethylketone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 간 질환 개선용 동물사료 첨가제. - 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간 질환은 지방간(fatty liver) 질환인 것을 특징으로 하는 간 질환 개선용 동물사료 첨가제. - 가시박을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르(acetic ester), 아세톤(acetone), 메틸에틸케톤(methylethylketone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 용매로 하여 가시박 추출물을 제조하는 단계;
상기 가시박 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 분획물을 얻는 단계; 및
상기 각 분획물을 크로마토그래피하여 상기 화학식 1의 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 2), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 3), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 4), 아피게닌-7-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 캠퍼롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 6), 캠퍼롤-3-O-(6-O-α-L-람노피라노실)-β-D-글루코피라노시드(화합물 7), 캠퍼롤-3-O-β-D-아피오푸라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 8), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 9), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-쿠마로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 10), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 플라보노이드 유도체 화합물을 분리하는 방법. - 하기 화학식 2의 화학구조를 갖는 신규 화합물 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 1), 캠퍼롤-3-O-β-D-아피오푸라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 8), 퀘르세틴-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노시드(화합물 9), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-α-L-람노피라노실-(1-6)-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 11), 캠퍼롤-3-O-(6-O-E-페룰로일)-β-D-글루코피라노실-7-O-β-D-글루코피라노실-(1-3)-α-L-람노피라노시드(화합물 12) 및 트리신 4′-O-(7″R,8″R-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-α-L-람노피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노시드(화합물 13).
[화학식 2]
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| KR101802970B1 (ko) | 2015-12-10 | 2017-12-01 | 한국생명공학연구원 | 가시박 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 질환의 치료 또는 예방용 조성물 |
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| KR20180058795A (ko) * | 2015-09-24 | 2018-06-01 | 시뉴 파마 인크. | 간독성 및 지방간 질병을 치료하는 데 효과적인 화합물 및 이의 용도 |
-
2018
- 2018-09-06 KR KR1020180106344A patent/KR102136326B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
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| KR20180058795A (ko) * | 2015-09-24 | 2018-06-01 | 시뉴 파마 인크. | 간독성 및 지방간 질병을 치료하는 데 효과적인 화합물 및 이의 용도 |
| KR101802970B1 (ko) | 2015-12-10 | 2017-12-01 | 한국생명공학연구원 | 가시박 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 질환의 치료 또는 예방용 조성물 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR102136326B1 (ko) | 2020-07-22 |
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