KR20200006985A - 인간 알파 태아단백-특이적 t 세포 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

인간 알파 태아단백-특이적 t 세포 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

hAFP158을 특이적으로 인지하는 T 세포 수용체 및 이의 용도를 제공한다.

Description

인간 알파 태아단백-특이적 T 세포 수용체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 5월 12일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/505,406호, 2017년 12월 22일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/609,614호 및 2018년 2월 1일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/625,051호에 대한 유익 및 우선권을 주장하고, 이들 기초 출원은 모두, 허용되는 경우, 그들의 전문이 참고로 원용된다.
연방지원 연구 진술
본 발명은 미국국립보건원(NIH)에 의해 허여된 R01CA168912하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명과 관련하여 일부 권리를 가진다.
서열 목록
2018년 5월 1일 제출한 텍스트 파일 "Sequence listing 064466.067_ST25"(2018년 4월 26일 생성, 크기 171,818 바이트)에 수록된 서열목록은 제37 C.F.R. § 1.52(e)(5)항에 따라 참고로 본 명세서에 포함된다.
발명의 기술 분야
본 발명은 일반적으로 면역학, 특히 암을 포함하는 면역질환의 치료에 있어서의 T 세포 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다.
전 세계적으로 매년 80여만건의 새로운 사례가 간세포암종(HCC)으로 진단받고 있으며, 이는 5번째로 가장 흔한 암이다. 미국에서, 미국 암학회(American Cancer Society)에 따르면, 간암 환자 수(이들 중 대다수는 HCC임)는 미국에서 최근 10년 내에 두 배로 증가했는데, 이는 가장 빠른 속도로 증가하는 악성종양 중 하나를 나타내며, 주로 비만 발병으로 인한 것이다. 현재 만성 HBV 및 HCV 환자 수와 비만 유병률의 증가세를 고려하면 HCC 발생률은 높게 유지될 가능성이 있다. 설상가상으로, 효과적인 관리의 부재는 HCC가 성인 남성에서 암 사망의 두 번째의 주된 원인이 되게 하고 있다. 따라서, 새로운 치료법의 개발이 시급하다. 종양-특이적 T 세포의 입양 이식은 중대한 독성을 유발하지 않으면서 종양 성장을 제어하는 커다란 잠재성을 지닌다. 대부분의 고형 종양(흑색종 제외)으로부터 종양-특이적 T 세포를 단리시키기 어렵기 때문에, 종양 항원-특이적 TCR 유전자를 갖는 유전자 조작된 환자의 자가 T 세포는 입양 이식 면역요법에 대한 기능적인 종양-특이적 T 세포를 제공할 가능성이 있다.
HCC는 종종 종양 연관 항원(tumor associated antigen: TAA)으로서 인간 글리피칸 3(human glypican 3: hGPC3)과 인간 알파 태아단백(human alpha fetoprotein: hAFP)을 재발현시킨다. 이들 항원은 생체표지자로서 진단에 사용할 뿐만 아니라, 면역요법에서 표적일 수도 있다. 최근, hGPC3-특이적 인간 TCR 유전자는 클로닝되어, 면역 손상된 마우스에서 이종이식 HCC 모델을 이용해서 항종양 효과를 입증하였다(Dargel et al., 2015). 하지만, TAA는 종종 HCC 전반에 걸쳐 동일한 수준으로 발현되지 않으므로, 항-hGPC3 치료는 hGPC3-음성 세포를 선택해서 재발을 유발할 수도 있다. 이론적으로, 상이한 에피토프 및 상이한 종양 항원에 대한 TCR의 조합은 종양면역도피를 회피할 수 있거나 지연시킬 수 있다. 4개의 HLA-A2 제한 hAFP 에피토프가 확인되었다(Butterfield et al., 2001). 에피토프 hAFP158은 HCC 종양 세포에 의해 종종 제시되고 hAFP158-특이적 면역세포가 HCC 환자에서 발견되지만(Butterfield et al., 2003) 항종양 효과는 미약했으며(Butterfield et al., 2006), 이는 인간 hAFP158-특이적 T 세포가 친화성이 낮기 때문으로 추정된다. 따라서, 친화성이 높은 hAFP158-특이적 TCR을 발굴하면 AFP 항원을 표적화하는 항종양 효능을 높일 수도 있다.
현재까지 2개의 hAFP158-특이적 TCR 유전자가 보고되었다. hAFP158 에피토프에 특이적인 인간 TCR에 관한 하나의 최근의 특허(CN 104087592 A)는, 제한된 항종양 효과를 제시하였다(Sun et al., 2016). Adaptimmune Co사로부터의 또 다른 특허 출원(US 2016/0137715 A1)에 의하면 미약한 항종양 효과가 추가로 확인되었으며, 인간 HCC 종양 세포와 공동 배양하였을 때 hAFP158 에피토프에 특이적인 야생형 인간 TCR은 어떠한 효과기 기능도 생성하지 못하였다. 따라서, 야생형 인간 TCR의 CDR 영역에 돌연변이를 도입해서 HCC 종양 세포의 인식을 증가시킨 AFP158-특이적 고친화성 TCR을 작성하여 특허 출원하였다(US 2016/0137715 A1). 하지만, 이러한 TCR 변형된 인간 T 세포(TCR-T)가 실제로 체내(in vivo)에서 항종양 효과를 발생할 수 있다는 것을 제시하는 임상 데이터는 입수 가능하지 않다. 또한, 고친화성 TCR-T 세포의 입양 이식이 심각한 오프타켓(off-target) 독성과 연관된다는 최근의 보고(Cameron et al., 2013; Linette et al., 2013; Morgan et al., 2013)를 고려하면, 낮은 독성과 높은 항종양 효능을 가진 최적의 TCR을 발굴할 기회를 늘려서 더 많은 TCT을 입수 가능하게 하는 것이 요망된다. 따라서, 면역요법에 대해서 환자의 자가 T 세포를 조작하는데 사용될 수 있는 TAA에 특이적인 추가의 TCR의 동정이 절실히 요구되고 있다.
hAFP158을 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체가 제공된다. 일 실시형태는 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 조작된(engineered) 쥣과 T 세포 수용체(murine T cell receptor: mTCR) Vα 사슬 폴리펩타이드를 제공하되, 여기서 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)을 특이적으로 인식한다.
다른 실시형태는 서열번호 11, 12, 13 또는 14와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR) Vβ 사슬 폴리펩타이드를 제공하되, 여기서 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)을 특이적으로 인식한다.
또 다른 실시형태는 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR) 전장 α 사슬 폴리펩타이드를 제공하되, 여기서 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)을 특이적으로 인식한다.
다른 실시형태는 서열번호 24, 25, 26 또는 27과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR) 전장 β 사슬 폴리펩타이드를 제공하되, 여기서 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)을 특이적으로 인식한다.
일 실시형태는 CDR3 영역이 서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR) α 사슬 폴리펩타이드를 제공하되, 여기서 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)을 특이적으로 인식한다.
다른 실시형태는 CDR3 영역이 서열번호 37, 38, 39 또는 40과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR) β 사슬 폴리펩타이드를 제공하되, 여기서 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)을 특이적으로 인식한다.
개시된 폴리펩타이드 서열 중 어느 하나의 폴리펩타이드 서열의 선도 서열이 제거될 수 있다.
일 실시형태는 서열번호 2와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 28과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐) 및 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐)을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)를 제공한다.
다른 실시형태는 서열번호 3과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 29와 적어도 90% 서열 동일성을 가짐) 및 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐)을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)를 제공한다.
다른 실시형태는 서열번호 4와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 30과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐) 및 서열번호 12와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 38과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐)을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)를 제공한다.
또 다른 실시형태는 서열번호 5와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 31과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐) 및 서열번호 13과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 39와 적어도 90% 서열 동일성을 가짐)을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)를 제공한다.
일 실시형태는 서열번호 6과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 32와 적어도 90% 서열 동일성을 가짐) 및 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐)을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)를 제공한다.
일부 실시형태는 서열번호 7과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 33과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐) 및 서열번호 14와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 40과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐)을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)를 제공한다.
다른 실시형태는 서열번호 8과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 34와 적어도 90% 서열 동일성을 가짐) 및 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐)을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)를 제공한다.
또 다른 실시형태는 서열번호 9와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 35와 적어도 90% 서열 동일성을 가짐) 및 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐)을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)를 제공한다.
일 실시형태는 서열번호 10과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 36과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐) 및 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인(여기서 CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 가짐)을 갖는 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)를 제공한다. 개시된 mTCR 중 임의의 것은 인간화될 수 있다.
일 실시형태는 개시된 mTCR 중 임의의 하나를 발현하도록 조작된 T 세포를 제공한다. T 세포는 인간 세포일 수 있다. T 세포는 또한 자가 T 세포일 수 있다.
다른 실시형태는 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23의 Q21 내지 L242를 포함하는 가용성 mTCR α 사슬을 제공한다.
또 다른 실시형태는 서열번호 50, 51, 52 또는 53, 또는 서열번호 24, 25, 26 또는 27의 E18 내지 Y276을 함유하는 조작된 mTCR β 사슬의 세포 외 도메인을 제공한다.
일 실시형태는 서열번호 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 또는 62와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 융합 단백질을 제공한다.
다른 실시형태는 mTCR 단백질 또는 폴리펩타이드 중 어느 하나를 암호화하는 벡터를 제공한다.
다른 실시형태는 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 또는 71과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산을 제공한다.
다른 실시형태는, 하기를 포함하는, 비천연유래(non-naturally occurring) hAFP158 에피토프-특이적 쥣과 T 세포 수용체를 제공한다:
a). 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 21 내지 132번 아미노산 잔기와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 α 사슬 가변 도메인(Vα); 및
b). 서열번호 11, 12, 13 및 14의 14 내지 131번 아미노산 잔기와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 β 사슬 가변 도메인(Vβ).
다른 실시형태는, 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩타이드가 서열번호 11, 12, 13 또는 14에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩타이드와 연결된 융합 단백질을 제공한다.
다른 실시형태는 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩타이드가 서열번호 24, 25, 26 또는 27에 따른 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩타이드와 연결된 융합 단백질을 제공한다.
다른 실시형태는 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 또는 71에 의해 암호화된 TCR을 발현하도록 조작된 T 세포를 제공한다. T 세포는 인간 세포일 수 있다.
다른 실시형태는 CD8+Tet158+ 세포를 TCR α 및 β사슬이 결여된 기증자 세포(donor cell)와 융합한 하이브리도마를 제공한다. 하이브리도마는 일반적으로 hAFP+ 종양 세포에 반응한다. 일부 실시형태에서 하이브리도마는 IL-2를 분비한다.
다른 실시형태는 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10과 아미노산 서열이 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩타이드가 서열번호 24, 25, 26 또는 27과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩타이드와 연결된 융합 단백질을 제공하되, 여기서 융합 단백질은 단일 사슬 항CD3 항체와 연결된다.
다른 실시형태는 개시된 mTCR을 발현하도록 인간 T 세포를 유전자 조작하고, 조작된 T 세포를 대상체에서 종양 부담을 저감하기에 충분한 용량으로 대상체에게 투여함으로써 치료가 필요한 대상체에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 종양은 간세포 암종이다. T 세포는 자가 T 세포일 수 있다.
다른 실시형태는 개시된 폴리펩타이드 또는 단백질을 세포의 샘플에 접촉시킴으로써 간세포 암종을 검출하는 방법을 제공하되, 여기서 폴리펩타이드 또는 단백질의 세포에 대한 특이적 결합은 간세포 암종 세포인 것을 나타낸다.
다른 실시형태는 개시된 폴리펩타이드 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 것이 있는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
도 1A 내지 도 1D는 Thy1.2+ T 세포를 기준으로 분리(gating)하여 CD8 및 IFN-γ를 분석하기 위해 hAFP158 펩타이드로 자극시킨 마우스 말초 혈액 세포의 점 도표이다. 도 1E는 lv 초회감작(lv-primed)했을 때와 감작하지 않았을 때 총 비장 세포의 CD8 + IFNg+의 백분율(%)을 나타내는 그래프이다. 도 1F 내지 도 1H는 HepG2(AFP-)(도 1F), HepG2(AFP +)(도 1G) 및 hAFP158 펩타이드(도 1H)로 자극시킨 비장 T 세포의 점 도표이다. 도 1I는 HepG2(AFP-), HepG2(AFP+) 및 hAFP158 펩타이드로 자극시킨 총 비장 세포의 CD8 + IFNg+의 백분율을 나타내는 그래프이다. 도 1J 내지 도 1L은 비장 세포와 공동 배양한 HepG2 세포의 현미경 사진이다. 도 1M은 살아남은 HepG2 세포(OD595) 대 E/T 비를 나타내는 그래프로, (●)는 Lv+Pep이고, (■)는 Pep+Pep이다.
도 2A 내지 도 2E는 면역화된 AAD 마우스 비장세포의 입양 이식을 통해 마우스에서 종양 감작이 억제되고 NSG 마우스에서 HepG2 종양 이식물이 제거된 결과를 도시한다. 도 2A는 hAFP158 펩타이드에 대한 반응으로 IFNg를 생산한 대략 10%의 면역화된 마우스 비장세포를 나타내는 점 도표이다. 도 2B는 NSG 마우스에 주입된 후 HepG2 종양 세포로 감작된 미경험 또는 면역화된 마우스의 총 1,500만개의 비장세포(150만개의 hAFP158-특이적 CD8 T 세포)를 예시한다. 도 2C는 종양 크기가 2cm 직경에 도달했을 때 면역화된 마우스의 비장 세포 150만개를 주입한 NSG 마우스를 나타내는 도표이다. 도 2D는 대조군(●) 및 ACT(■)에서 종양 접종 후 일자(day)에 대한 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 도 2E는 마우스 1(●), 마우스 2(■), 마우스 3(▲) 및 마우스 4(▼)에서 종양 접종 후 일자에 대한 종양 부피(㎣)를 나타내는 선 그래프이다.
도 3A는 hAFP158에 특이적인 CD8 T 세포의 순도를 도시한 점 도표이다. 도 3B는 hAFP158에 특이적인 IFNg-생산 세포의 백분율을 도시한 점 도표이다. 도 3C는 Flu M1에 특이적인 CD8 T 세포의 순도를 도시한 점 도표이다. 도 3D는 Flu M1에 특이적인 IFNg-생산 세포의 백분율을 도시한 점 도표이다. 도 3E는 Lv+hAFP158의 CD8(●) 또는 Flu+M1의 CD8로 처리한 마우스에 대해서 종양을 접종한 후의 일자에 대한 종양 부피(㎣)의 선 그래프이다. 도 3F 내지 도 3H는 hAFP 면역화된 마우스에서 채취하여 정제한 후 Tet158 사량체 염색 및 세포 분류기에 의해 Tet158+ 및 Tet158- 세포로 추가 분리한 CD8 T 세포의 점 도표이다. 분류 전후 순도가 제시되어 있다. 도 3I는 Tet158+(●) 또는 Tet158-(■) 세포로 처리한 마우스에 대해서 종양의 접종한 후 일자에 대한 종양 부피(㎣)의 선 그래프이다. 도 3J 내지 도 3O는 도 3I로부터의 마우스 사진이다.
도 4A는 T 세포 하이브리도마 클론으로부터의 IL-2(pg/ml)의 막대 그래프이다. BW-Lyt2.4 융합 상대 세포 및 5개의 상이한 하이브리도마 클론을 hAFP+(□) 또는 hAFP-(
Figure pct00001
) HepG2 종양 세포와 3회 반복하여 공동 배양하고 IL-2 생산을 ELISA로 검출하였다. 도 4B 내지 도 4G는 항-Vβ8.3 항체로 염색한 하이브리도마 클론의 막대그래프이다. 도 4H 내지 도 4M은 Tet158 사량체로 염색한 하이브리도마 클론의 막대그래프이다.
도 5A는 TCR 유전자를 발현하는 재조합 lv의 개략도이다. 쌍을 이룬 TCR α 및 β 사슬 유전자는 EF1α 프로모터의 제어하에 단일 분자로서 발현되었다. 동일한 수의 TCR α 및 β 사슬이 생성되도록 P2A 서열을 사이에 삽입하였다. 도 5B 내지 도 5E는 3개의 상이한 TCR-lv를 형질도입시킨 후 Tet158 사량체로 염색한 인간 T 세포주 주르카트(Jurkat) 세포의 막대그래프이다. 막대그래프와 MFI가 제시되어 있다. 도 5G 내지 도 5J, 도 5L 내지 도 50 및 도 5Q 내지 도 5T는 세 명의 다른 기증자에서 채취하고 TCR-lv를 형질도입시킨 인간 1차 T 세포의 점 도표로, Tet-158+ CD8 및 CD4 T 세포의 백분율과 MFI를 도시한다. 모의 형질도입 세포는 lv를 형질도입하지 않거나 GFP-lv를 형질도입시킨 후 동일한 CD3/CD28 처리를 거쳤다. 도 5F, 도 5K, 도 5P 및 도 5U는 3명의 기증자로부터의 형질도입된 T 세포에 대한 Tet158의 MFI를 도시한 막대 그래프이다. TCR-T 세포가 도시되어 있다. CD8 또는 CD4 T 세포만을 분리하여 대표적인 도표에 나타내었다.
도 6A는 TCR 유전자를 형질도입하고 AFP-HepG2(회색 음영), Huh7(짙은 음영) 또는 AFP+HepG2(음영 없음)로 처리한 인간 1차 T 세포로부터의 IFN-g(pg/ml)의 막대 그래프이다. 도 6B 내지 도 6E는 CD8에 의한 IFNg 및 IL-2의 세포 내 염색을 도시한 점 도표이다. 도 6F 내지 도 6I는 CD4에 의한 IFNg 및 IL-2의 세포 내 염색을 도시한 점 도표이다. 도 6J 내지 도 6O는 hAFP+ HepG2 종양 세포에 의한 CD8 및 CD4 TCR-T 세포 증식 유도를 도시한 점 도표와 막대그래프이다. 실험은 2회 반복하였으며 유사한 데이터를 지녔다.
도 7A는 TCR 유전자를 형질도입하고 AFP-HepG2(회색 음영), Huh7(짙은 음영) 또는 AFP+HepG2(음영 없음)로 처리한 HLA-A2+ 인간 1차 T 세포에 의한 사멸 백분율의 막대 그래프이다. 도 7B는 TCR(●) 및 모의(■)에 대한 사멸 백분율 대 E:T 비의 선 도표이다. 도 7C, 도 7D 및 도 7E는 TCR 유전자 형질도입 후 자성 비드로 분리한 기증자 CD8 및 CD4 TCR-T 세포를 도시한 점 도표이다. 도 7F 내지 도 7K는 모의 형질도입된, CD4 또는 CD8 TCR-T 세포와 HepG2 종양 세포를 공동 배양한 현미경 사진이다. 공동 배양 2시간 및 24시간 후에 사진을 촬영하였다. 도 7E는 TCR 또는 모의 형질도입된 인간 T 세포에서 CD4 세포(흑색 막대), CD8 세포(백색 막대) 및 총 T 세포(회색 막대)의 사멸 백분율을 측정하기 위해 수행한 LDH 검정 결과를 도시한 막대그래프이다. 도 7M 내지 도 7O는 도 7L로부터의 대표적인 세포의 현미경 사진이다.
도 8은 TCR-1 발현 렌티벡터인 pCDH-EF1-coTCR-1의 지도이다.
도 9은 TCR-1 발현 렌티벡터인 pCDH-EF1-coTCR-2의 지도이다.
도 10은 TCR-1 발현 렌티벡터인 pCDH-EF1-coTCR-3의 지도이다.
도 11A는 면역화된 마우스로부터의 Tet158+ CD8+ 비장세포의 백분율을 도시한 점 도표이다. 도 11B 내지 도 11P는 상이한 항-V베타 사슬 항체를 사용해서 CD8+, Tet158+ 세포에서 V베타 발현을 도시한 그래프이다.
도 12A 내지 도 12D는 재조합 lv로 인간 1차 T 세포에의 형질도입을 도시한다. 도 12A는 GFP-lv 프로모터의 예시이다. 도 12B 및 도 12C는 GFP를 발현하는 1차 T 세포의 대표적인 사진이다. 도 12D는 GFP+ T 세포의 막대그래프이다.
도 13A는 항-V베타 사슬 항체로 염색된 TCR-T 세포의 백분율을 도시한 막대그래프이다. 도 13B는 Tet158 사량체로 염색된 TCR-T 세포의 백분율을 도시한 막대그래프이다.
도 14A 내지 도 14I는 인간 TCR-T 세포가 AFP158 펩타이드 펄스 처리한 HLA-A2 마우스 비장 세포를 특이적으로 인식하는 것을 도시한다. 도 14A는 AAD 마우스 비장세포로 자극시키고 펩타이드로 펄스 처리하지 않거나(회색 막대), 인플루엔자 M1 펩타이드(흑색 막대) 또는 AFP158 펩타이드(백색 막대)를 펄스 처리한, 모의 T-세포, TCR1 T-세포, TCR2 T-세포, 또는 TCR3 T-세포에서 IFN-g 생산(pg/ml)을 도시한 막대그래프이다. 도 14B 내지 도 14E는 hAFP158 펩타이드 펄스 처리한 HLA-A2 세포로 자극시킨 인간 T 세포 중 IFNg 염색(CD4 및 CD8 둘 다 함유) 백분율을 도시한 막대그래프이다. 도 14F 내지 도 14I는 hAFP158 펩타이드 펄스 처리한 HLA-A2 세포로 자극시킨 인간 T 세포 중 IL-2 염색(CD4 및 CD8 둘 다 함유) 백분율을 도시한 막대그래프이다.
도 15A 내지 도 15T는 인간 TCR-T의 입양 이식이 NSG 마우스에서 HepG2 종양에 대한 항종양 효과를 발생하는 것을 도시한다. 도 15A는 총 인간 TCR-T 세포 중 Tet158+ 세포의 백분율을 도시한 점 도표이다. 도 15B는 대조군 및 TCR-T군에서 종양 접종 후 일자에 대한 종양 증식(무종양 마우스 대비 백분율)을 나타내는 선 그래프이다. 도 15C는 대조군(●) 및 TCR군(■)에서 종양 접종 후 일자에 대한 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 도 15D 내지 도 15K는 모의-T 처리된 마우스(D1-4)와 TCR-T 처리된 마우스(D5-8)에 접종 후 31일째의 HepG2 종양의 사진이다. 도 15L 내지 도 15O는 총 마우스 혈액 세포 중 인간 CD45+ 세포의 백분율을 도시한 대표적인 도표이다. 도 15P는 대조군(●)과 TCR-T군(■)에서 총 마우스 혈액 세포 중 인간 CD45+ 세포의 백분율을 나타내는 선 그래프이다. 도 15Q 내지 도 15R은 NSG 마우스에서 이식된 인간 T 세포 중 Tet158+ 세포의 백분율을 도시한 대표적인 점 도표이다. 도 15S는 ACT 후 일자에 대한 이식된 총 인간 T 세포 중 Tet158 + 세포를 나타내는 선 그래프이다. 도 15T는 ACT 후 일자에 대한 이식된 총 CD8(●) 및 CD4(■) T 세포 중 Tet158+ 세포의 백분율을 나타내는 대표적인 선 그래프이다.
도 16은 9개의 mTCR 서열의 V-영역의 개략적 비교이다.
도 17은 9개의 mTCR α 사슬(도 17A)과 β 사슬(도 17B)의 CDR3의 아미노산 서열의 개략적 비교이다.
1. 정의
본 명세서에서 사용된 바와 같은 어구 "항원 특이성을 갖는"이란, TCR이 암 항원에 특이적으로 결합하여 암 항원을 면역학적으로 인식하여서, 암 항원에 대한 TCR의 결합이 면역 반응을 유발하게 하는 것을 의미한다.
용어 "Tet158"은 HLA-A2/hAFP158 사량체를 지칭한다.
용어 "hAFP158"은 FMNKFIYEI(서열번호 11)의 아미노산 서열을 가진 인간 알파태아단백 폴리펩타이드를 지칭한다.
머리글자 "TCR"은, 주조직적합복합체(MHC)에 의해 제시되는 항원을 식별하는 것을 담당하는, T 세포의 표면 상의 특이적인 수용체인 T 세포 수용체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "항체"는 "가변영역" 항원 인식 부위를 가진 면역글로불린 분자를 나타내도록 의도된다. 가변영역"이라는 용어는 면역글로불린의 도메인을 다른 항체와 광범위하게 공유되는 도메인(예컨대, 항체 Fc 도메인)과 구분하도록 의도된다. 가변 영역은 항원 결합을 담당하는 잔기를 갖는 "초가변 영역(hypervariable region)"을 포함한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(즉, 전형적으로 경쇄 가변 도메인에서의 대략 24~34(L1), 50~56(L2) 및 89~97(L3)번 잔기 및 중쇄 도메인에서의 대략 27~35(H1), 50~65(H2) 및 95~102(H3)번 잔기; [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]), 및/또는 초가변 루프(hypervariable loop)로부터의 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인에서의 26~32(L1), 50~52(L2) 및 91~96(L3) 및 26~32(H1)번 잔기 및 중쇄 가변 도메인에서의 53~55(H2) 및 96~101(H3)번 잔기; [Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917])를 포함한다. "프레임워크 영역"(Framework Region) 또는 FR" 잔기는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기를 제외한 가변 영역 잔기를 지칭한다. 항체라는 용어는 단일클론 항체, 다중-특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체(예컨대, 문헌[Muyldermans et al., 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttall et al., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann and Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25], 국제 특허 공개 번호 WO 94/04678 및 WO 94/25591, 미국 특허 제6,005,079호 참조), 단일 사슬 Fv(scFv)(예컨대, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참조), 단일사슬 항체, 이황화-결합 Fv(sdFv), 세포 내 항체 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예컨대, 특정 항체에 대한 항-Id 항체 및 항-항-Id 항체)를 포함한다. 특히, 이러한 항체는 모든 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 분류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 하위분류의 면역글로불린 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항체의 "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 항체의 상보성 결정 영역("CDR")을 함유하고 선택적으로 항체의 "가변영역" 항원 인식 부위를 포함하고 항원에 면역 특이적으로 결합하는 능력을 나타내는 항체 내 하나 또는 그 이상의 부분을 지칭한다. 이러한 단편은 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 사슬(ScFv) 및 이들의 돌연변이, 자연 발생 변이체, 그리고 항체의 "가변영역" 항원 인식 부위와 이종단백질(예컨대, 독소, 다른 항원에 대한 항원 인식 부위, 효소, 수용체 또는 수용체 리간드 등)을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단편(fragment)"은 적어도 5개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 10개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 15개의 연속된 아미노산 잔기, 20개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 25개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 40개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 50개 이상의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 60개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 70개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 80개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 90개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 100개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 125개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 150개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 175개의 연속된 아미노산 잔기, 적어도 200개의 연속된 아미노산 잔기, 또는 적어도 250개의 연속된 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "조절하다(modulate)"는 효과, 결과 또는 활성(예컨대, 신호 전달)을 변화시키는 성능과 관계된다. 이러한 조절은 작용적(agonistic) 또는 길항적(antagonistic)일 수 있다. 길항적 조절은 그러한 활성을 부분적으로 억제(예컨대, 억제가 아닌 약화)할 수 있거나, 또는 완전히 억제(예컨대, 중화)할 수 있다. 조절은 항체 결합 후 수용체의 내재화 또는 표적 세포에서 수용체의 발현 감소를 포함할 수 있다. 길항적 조절은 활성(예컨대, 신호 전달)을 향상시킬 수 있거나 증가 또는 증대시킬 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 조절은 리간드와 이의 동족 수용체 간 상호작용의 속성을 변화시켜서 유도된 신호전달의 속성을 변화시키게 할 수 있다. 예를 들어, 상기 분자는, 리간드 또는 수용체에 결합함으로써, 이러한 분자가 다른 리간드 또는 수용체와 결합하는 능력을 변화시키고 이에 따라서 전반적인 활성을 변화시킬 수 있다. 이러한 조절은 바람직하게는 측정 가능한 면역계 활성의 적어도 10% 변화, 더 바람직하게는 그러한 활성의 적어도 50%, 또는 그러한 활성의 적어도 2배, 5배, 10배, 또는 더욱더 바람직하게는 적어도 100배 변화를 제공할 것이다.
결합 또는 발휘된 효과의 맥락에서 사용되는 바와 같이 "실질적으로"란 용어는, 관찰된 효과가 생리학적으로 또는 치료적으로 유의하다는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 차단 정도가 생리학적으로 또는 치료적으로 유의하다면(예를 들어, 이러한 정도가 60% 초과로 완전, 70% 초과로 완전, 80% 초과로 완전, 85% 초과로 완전, 90% 초과로 완전, 95% 초과로 완전, 또는 97% 초과로 완전하다면) 분자는 리간드 또는 수용체의 활성을 실질적으로 차단할 수 있다. 마찬가지로, 면역특이성 및 특성이 60% 초과로 동일, 70% 초과로 동일, 75% 초과로 동일, 80% 초과로 동일, 85% 초과로 동일, 90% 초과로 동일, 95% 초과로 동일 또는 97% 초과로 동일하다면, 한 분자가 다른 분자와 실질적으로 동일한 면역특이성 및/또는 특성을 갖는다고 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "키메라 항체"는, 항체의 상이한 부분이 다른 면역글로불린 분자로부터 유래된 분자, 예컨대, 비인간 항체와 인간 면역글로불린 불변영역으로부터 유래된 가변영역으로 이루어진 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인간화 항체"란 용어는, 인간 프레임워크 영역과 비인간(통상 마우스 또는 래트) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린을 지칭한다. CDR을 제공하는 비인간 면역글로불린은 "공여체"라 불리고, 프레임워크 영역을 제공하는 인간면역글로불린은 "수여체(acceptor)"라 불린다. 불변영역은 반드시 존재하지 않지만, 존재한다면 인간면역글로불린 불변영역과 실질적으로 동일, 예컨대, 적어도 약 85 내지 99%, 바람직하게는 약 95% 이상 동일해야 한다. 따라서, 인간화 면역글로불린의 모든 부분(가능하게는 CDR은 제외)은 자연계에 존재하는 인간면역글로불린 서열의 대응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 인간화 항체는 인간화 경쇄 및 인간화 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체이다. 예를 들어, 인간화 항체는 전형적인 키메라 항체를 포함하지 않는데, 그 이유는, 예를 들어, 키메라 항체의 전체 가변영역이 인간 유래가 아니기 때문이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "내인성 농도"는 세포(세포는 정상 세포, 암 세포 또는 감염된 세포일 수 있음)에 의해 분자가 자연적으로(즉, 발현 벡터 또는 재조합 프로모터 없이) 발현되는 수준을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료하는", "치료" 및 "치료 용도"란 용어는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 제거, 감소 또는 개선을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료적 유효량"은 이러한 증상을 임상적으로 유의한 제거, 감소 또는 개선을 매개하는 데 충분한 양의 치료제를 지칭한다. 효과의 정도가 치료를 받은 대상체의 건강이나 예후에 영향을 주기에 충분하다면 그 효과는 임상적으로 유의하다. 치료적 유효량은 질환의 발병을 지연 또는 최소화시키기에, 예컨대, 암의 확산을 지연 또는 최소화시키기에 충분한 치료제의 양을 지칭할 수 있다. 또한 치료적 유효량은 질환의 치료 또는 관리에 치료적 이점을 제공하는 치료제의 양을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "예방제"는 장애 또는 질환의 임의의 증상이 검출되기 전에 이러한 장애 또는 질환의 예방에 사용될 수 있는 제제를 지칭한다. "예방적 유효량"은 이러한 보호를 매개하기에 충분한 예방제의 양이다. 또한, 예방적 유효량은 질환의 예방에 예방적 이점을 제공하는 예방제의 양을 지칭 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "암"은 제어되지 않는 비정상적인 세포의 성장에서 기인된 신생물 또는 종양을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 암은 명시적으로 백혈병과 림프종을 포함한다. "암"이란 용어는, 원위 부위로 전이가 가능하고 연한천(soft agar)과 같은 3차원 기질에서 군집을 형성하거나 3차원 기저막 또는 세외 외 기질체에서 관형 연결망 또는 거미줄 형태의 매트릭스를 형성하는 등, 다른 비암 세포(non-cancer cell)와는 상이한 표현형 특징을 나타내는 세포와 연관된 질환을 지칭한다. 비암 세포는 연한천에서 군집을 형성하지 않으며 삼차원 기저막 또는 세포저막 또는 세포 뚜렷한 구형 구조를 형성한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역세포"는, T 세포, B 세포, 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌, 조혈 기원으로부터의 임의의 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "결합가(valency)"란 분자당 이용 가능한 결합 부위의 수를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역적", "면역학적" 또는 "면역" 반응"은 수용자 환자에서 펩타이드에 대해서 지향된 유익한 체액성(항체 매개) 및/또는 세포성(항원 특이적 T 세포 또는 이들의 분비 생성물에 의한 매개) 반응의 전개이다. 이러한 반응은 면역원의 투여에 의해 유도된 능동반응 또는 항체 혹은 초회감작된 T 세포(primed T-cell)의 투여에 의해 유도된 수동반응일 수 있다. 세포 면역반응은 항원-특이적 CD4+ T 도움 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포를 활성화시키기 위하여 MHC I형 또는 II형형 또는 II형하여 폴리펩타이드 에피토프의 제시에 의해 유도된다. 반응은 또한 단핵구, 대식세포, NK 세포, 호염기구, 수지상 세포, 성상세포, 미세아교세포, 호산구, 중성구 또는 기타 선천면역 구성요소의 활성화 혹은 보충을 수반할 수 있다. 세포-매개 면역반응의 존재는 세포증식 검정법(CD4+ T 세포) 또는 CTL(세포독성 T 림프구) 검정법에 의해 결정될 수 있다. 면역원의 보호나 치료 효과에 대한 체액성 및 세포성 반응의 상대적인 기여도는 면역화된 동계 동물로부터 항체와 T 세포를 개별적으로 분리하고 제2 대상체에서 보호 또는 치료 효과를 측정함으로써 구분될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역원인자" 또는 "면역원"은, 선택적으로 항원보강제와 함께, 포유류에 투여한 면역원 자체에 대한 면역반응을 유도할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "개체", "숙주", "대상체" 및 "환자"란 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며, 인간, 설치류(예컨대, 마우스 및 래트 등) 및 기타 실험실 동물을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 포유류를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩타이드"란 용어는, 변형(예컨대, 인산화 또는 당화)에 관계없이, 임의의 길이의 아미노산 사슬을 지칭한다. 폴리펩타이드란 용어는 단백질 및 이의 단편을 포함한다. 폴리펩타이드는 "외인성"일 수 있으며, 이는 "이종성", 즉, 박테리아 세포에서 생성된 인간 폴리펩타이드와 같이 사용되는 숙주 세포에 대한 이물질인 것을 의미한다. 폴리펩타이드는 본 명세서에서 아미노산 잔기 서열로 개시된다. 잔기 서열은 아미노에서부터 카복시 말단까지의 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 표기한다. 표준 명명법에 따라서, 아미노산 잔기 서열은 하기에 나타낸 바와 같이 3개의 문자 또는 단일 문자 코드로 표시된다: 알라닌(Ala, A), 아르기닌(Arg, R), 아스파라긴(Asn, N), 아스파르트산(Asp, D), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글루탐산(Glu, E), 글리신(Gly, G), 히스티딘(His, H), 아이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 라이신(Lys, K), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y) 및 발린(Val, V).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "변이체"는 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 다르지만 필수적인 특성을 유지하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 전형적인 폴리펩타이드 변이체는 아미노산 서열이 다른 기준 폴리펩타이드와 상이하다. 일반적으로, 참조 폴리펩타이드와 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고 많은 영역에서 동일하도록 차이는 제한된다. 변이체와 참조 폴리펩타이드는 하나 이상의 변형(예컨대, 치환, 부가 또는 결실)에 의해 아미노산 서열이 다를 수 있다. 치환된 또는 삽입된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호화된 것일 수 있거나 또는 그렇지 않은 것을 수 있다. 폴리펩타이드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 천연유래이거나, 천연유래인 것으로 알려지지 않은 변이체일 수 있다.
본 개시내용의 폴리펩타이드의 구조는 변형 및 변경될 수 있으며, 또한 해당 폴리펩타이드와 유사한 특성(예컨대, 보존적 아미노산 치환)을 갖는 분자를 얻을 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산은 상당한 활성 손실 없이 서열에 있어서 다른 아미노산 대신 치환될 수 있다. 폴리펩타이드의 생물학적 기능 활성을 정의하는 것은 폴리펩타이드의 상호 작용 능력 및 성질이므로, 특정 아미노산 서열 치환이 폴리펩타이드 서열에서 이루어질 수 있고 그럼에도 불구하고 특성이 유사한 폴리펩타이드를 얻을 수 있다.
이러한 변화를 행함에 있어서, 아미노산의 친수도 지수가 고려될 수 있다. 폴리펩타이드에 생물학적 상호작용 기능을 부여할 때 아미노산의 친수도 지수의 중요성은 당해 기술 분야에서 일반적으로 이해된다. 특정 아미노산은 친수도 지수 또는 점수가 유사한 다른 아미노산 대신 치환되어 생물학적 활성이 유사한 폴리펩타이드를 여전히 생성할 수 있다고 알려져 있다. 각 아미노산은, 그의 소수성 및 전하 특성에 기초하여 친수도 지수가 할당되었다. 친수도 지수는 아이소류신이 +4.5, 발린이 +4.2, 류신이 +3.8, 페닐알라닌이 +2.8, 시스테인/시스틴이 +2.5, 메티오닌이 +1.9, 알라닌이 +1.8, 글리신이 -0.4, 트레오닌이 -0.7, 세린이 -0.8, 트립토판이 -0.9, 티로신이 -1.3, 프롤린이 -1.6, 히스티딘이 -3.2, 글루타메이트가 -3.5, 글루타민이 -3.5, 아스파테이트가 -3.5, 아스파라긴이 -3.5, 라이신이 -3.9, 아르기닌이 -4.5이다.
아미노산의 상대적인 친수성은 그 결과적인 폴리펩타이드의 2차구조를 결정하며, 이어서 이는 폴리펩타이드와 다른 분자, 예컨대, 효소, 기질, 수용체, 항체, 항원 및 보조인자(cofactor)와의 상호 작용을 정의한다. 아미노산은 친수도 지수가 유사한 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며 여전히 기능적으로 동등한 폴리펩타이드를 얻을 수 있다고 당업계에 알려져 있다. 이러한 변화에 있어서, 친수도 지수가 ±2 이내인 아미노산 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특히 바람직하며, 그리고 ±0.5 이내인 것이 더욱 특히 바람직하다.
특히 생물학적 기능이 동등한 작성된 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 면역학적 실시형태에서 사용하고자 하는 경우, 친수성을 토대로 유사한 아미노산의 치환을 수행할 수도 한다. 이하의 친수성 값이 아미노산에 배정된다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 프롤린(-0.5±1); 트레오닌(-0.4); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 친수성 값이 유사한 다른 아미노산 대신 치환되어 여전히 생물학적으로 동등한, 특히 면역학적으로 동등한 폴리펩타이드를 얻을 수 있다고 이해된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특히 바람직하며, 그리고 ±0.5 이내인 것이 더욱 특히 바람직하다.
위에서 개략적으로 기술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 예를 들어 소수성, 친수성, 전하, 크기 등과 같이 아미노산 측쇄 치환체의 상대적인 유사성에 기초한다. 전술한 다양한 특성을 고려하는 예시적인 치환이 당업자에게 잘 알려져 있으며, (원래 잔기:예시적인 치환): (Ala:Gly, Ser), (Arg:Lys), (Asn:Gln, His), (Asp:Glu, Cys, Ser), (Gln:Asn), (Glu:Asp), (Gly:Ala), (His:Asn, Gln), (Ile:Leu, Val), (Leu:Ile, Val), (Lys:Arg), (Met:Leu, Tyr), (Ser:Thr), (Thr:Ser), (Trp:Tyr), (Tyr:Trp, Phe) 및 (Val:Ile, Leu)을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 실시형태는 위에서 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 기능 또는 생물학적 상동성을 고려한다. 특히, 폴리펩타이드의 실시형태는 관심대상 폴리펩타이드와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함할 수 있다.
"백분율(%) 서열 동일성"은, 서열을 정렬하고, 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위하여, 필요한 경우, 공백을 도입한 후, 참조 핵산 서열에서의 뉴클레오타이드 또는 아미노산과 동일한 후보 서열에서의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 백분율로 정의한다. % 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 당해 분야의 기술 능력 이내인 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR)과 같은 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수는, 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
여기서의 목적을 위하여, 주어진 핵산 서열 D에 대해서 주어진 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 C의 % 서열 동일성(대안적으로 주어진 서열 D에 대해서 소정의 % 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 서열 C로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
W/Z 분율의 100배
여기서 W는 서열 정렬 프로그램에 의해 서열 C와 D의 그 프로그램의 정렬에서 동일한 일치로 판정된 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 개수이며, Z는 D인 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 총 수이다. 서열 C의 길이가 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 % 서열 동일성은 C에 대한 D의 % 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "약제학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는 인산완충식염수, 물, 에멀션(예컨대, 수중유형 또는 유중수형 에멀션), 다양한 유형의 습윤제와 같은 표준 의약품 담체 중 어느 것인가를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "항원결정인자"와 "에피토프"란 용어는 호환 가능하게 사용되며 항체가 인식하는 구조를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "입체구조 에피토프(conformational epitope)"는 항원의 아미노산 서열의 불연속 부분을 포함하는 에피토프이다. 항체는 항원의 3차원 표면 특성, 형상 또는 삼차 구조에 기초하여 입체구조 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "선형 에피토프"는 항원으로부터의 연속적인 아미노산 서열에 의해 형성된 에피토프이다. 선형 에피토프는 전형적으로 약 5개 또는 약 10개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 항체는 항원의 1차 서열에 기초하여 선형 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항원결합부위"라고도 불리는 "파라토프(paratope)"는 항원을 인식하고 항원에 결합하는 항체의 일부이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "입양 세포 이식"(adoptive cell transfer) 또는 ACT란 환자 자신의 T 세포를 채취해 체외에서 확장시킨 후 환자에게 다시 주입하는 면역요법의 한 유형이다. ACT의 두 유형은 키메라 항원 수용체(CAR) 및 T 세포 수용체(TCR) T 세포 요법이다. 두 기법 모두 특정 항원을 인식하고 공격하는 T 세포 수용체의 능력을 향상시킨다. CAR T 세포 요법에서는, T 세포를 조작하여 키메라 항원 수용체라고 불리는 수용체를 그 표면에 생성하게 한다. 상기 수용체는 T 세포로 하여금 종양 세포 상의 항원을 인식하고 공격하게 한다. TCR T 세포 요법에서는, 환자로부터 T 세포를 채취해서, 종양 항원에 특이적인 TCR을 발현하도록 변형시키고, 체외에서 확장시키고 나서, 환자에게 다시 주입한다.
II. T 세포 수용체 조성물
hAFP, 바람직하게는 암 세포의 표면에서 발현되는 hAFP158에 특이적으로 결합하는 수용체를 암호화하는 T 세포 수용체 유전자가 제공된다. HLA-A2/hAFP158에 특이적인 쥣과 TCR α 및 β 사슬 유전자 9쌍을 동정하여 합성하였다. TCR 유전자에 대한 아미노산 서열과 핵산 서열이 이하에 제공된다. 하나 이상의 TCR 유전자를 함유하는 벡터가 또한 제공된다.
다른 실시형태는, 시험관 내(in vitro)에서 인간 HepG2 세포를 인식하고 사멸시키며 NSG 마우스에서는 큰 HepG2 종양 이종 이식물을 제거하는 hAFP158-특이적(Tet158) 마우스 CD8 T 세포를 제공한다.
또 다른 실시형태는 Tet158 CD8 T 세포로부터 제조한 T 세포 하이브리도마를 제공한다. T 세포 하이브리도마에 의해 쌍을 이룬 TCR α 및 β 사슬 유전자의 동정이 가능하였다. 일 실시형태는 HLA-A2/hAFP158에 특이적인 쥣과 TCR α 및 β 사슬 유전자가 형질도입된 건강한 기증자 CD8 T 세포를 제공한다. 유전자 조작된 TCR은 기증자 세포가 매우 낮은 E/T비에서 HepG2 종양 세포를 인식하고 효과적으로 사멸할 수 있도록 한다. HLA-A2/hAFP158에 특이적인 이들 쥣과 TCR 유전자는 환자의 자가 T 세포를 변형시키고 재지향시켜서 입양 세포 이식을 통해 HCC 종양을 치료할 가능성을 갖는다.
다른 실시형태는 가용성 T 세포 수용체를 제공한다. 일 실시형태에서 가용성 TCR은 TCR 폴리펩타이드의 세포 외 도메인을 포함한다.
A. 유전자 조작된 T 세포 수용체
개시된 TCR 유전자는 재조합 lv-초회감작되고 펩타이드-부스팅된(peptide-boosted) AAD 마우스로부터 유래된다. 따라서, 엄밀하게 상기 TCR은 "천연유래"가 아니다. 또한, TCR의 Vα 및 Vβ 영역을 얻은 후, hgp100에 특이적인 HLA-A2 마우스 TCR의 α 및 β 사슬의 불변영역(C-영역)과 확인된 α 및 β 사슬의 V-영역을 사용해서 전장 α 및 β 사슬을 설계하였다. 따라서, 전체 TCR과 이들의 유전자는 천연유래가 아니다.
1. mTCR-1, 2, 3, 6, 8, 10, 11, 17 및 38 Vα 도메인의 단백질 서열
일 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 2)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-1 Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01)를 제공한다:
Figure pct00002
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 3)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-2 Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01)를 제공한다:
Figure pct00003
mTCR-1 α 사슬 V-영역을 mTCR-2 α 사슬과 비교하면, 단지 2개의 아미노산이 다르다(밑줄 표시된 굵은 글씨).
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 4)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-3 Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)를 제공한다:
Figure pct00004
mTCR-1 α 사슬과 mTCR-3 α 사슬 간에는 다수의 아미노산이 다르다(밑줄 표시된 굵은 글씨). 사실상, J 단편이 다르다(mTCR-3 Vα에는 TRAJ30 대신 TRAJ12가 사용된다).
일 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 5)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-6 Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01)를 제공한다:
Figure pct00005
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 6)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-8 Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)를 제공한다:
Figure pct00006
mTCR-6 α 사슬과 mTCR-8 α 사슬 간에는 다수의 아미노산이 다르다(밑줄 표시된 굵은 글씨). 사실상, J 단편이 다르다(mTCR-8 Vα에는 TRAJ30 대신 TRAJ12가 사용된다).
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 7)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-10 Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)를 제공한다:
Figure pct00007
mTCR-6 α 사슬 V-영역을 mTCR-8 α 사슬과 비교하면, 단지 1개의 아미노산만이 다르다(밑줄 표시된 굵은 글씨).
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 8)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-11 Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)를 제공한다:
Figure pct00008
mTCR-6 α 사슬 V-영역을 mTCR-8 α 사슬과 비교하면, 단지 2개의 아미노산이 다르다(밑줄 표시된 굵은 글씨).
일 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 9)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-17 Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)를 제공한다:
Figure pct00009
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 10)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-38 Vα(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01)를 제공한다:
Figure pct00010
일부 실시형태에서, 선도 메티오닌 및/또는 신호서열은 번역 후 변형된 단백질에서 절단된다.
2. mTCR-1, 2, 3, 6, 8, 10, 11, 17 및 38 Vβ 도메인의 단백질 서열
일 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 11)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-1, 2, 8, 11, 17 및 38 Vβ 도메인(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01)을 제공한다:
Figure pct00011
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 12)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-3 Vβ 도메인(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01)을 제공한다:
Figure pct00012
TCR-3 Vβ를 가진 mTCR-1과 mTCR-2 간에는 단지 1개의 아미노산이 다르다(밑줄 표시된 굵은 글씨).
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 13)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-6 Vβ 도메인(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01)을 제공한다:
Figure pct00013
mTCR-1, 2, 8 및 11과는 단지 1개의 아미노산, mTCR-3과는 2개의 아미노산, 그리고 mTCR-10과는 3개의 아미노산이 다르다.
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 14)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-10 Vβ 도메인(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01)을 제공한다:
Figure pct00014
TCR-10 Vβ를 가진 mTCR-6 간에는 3개의 아미노산이 다르다(밑줄 표시된 굵은 글씨).
일부 실시형태에서, 선도 메티오닌 및/또는 신호서열은 번역 후 변형된 단백질에서 절단된다.
3. 전장 mTCR-1, 2, 3, 6, 8, 10, 11, 17 및 38 α 사슬의 단백질 서열
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 15)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-1 α 사슬(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01/TRAC)을 제공한다:
Figure pct00015
mTCR-1, 2, 3, 6, 8, 10 및 11 α 사슬의 불변영역(Cα)(굵은 글씨)은 동일하며, 이들은 hgp100에 특이적인 HLA-A2 Tg 마우스 유래 TCR α 사슬 C-영역과 동일하다.
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 16)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-2 α사슬(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01/TRAC)을 제공한다:
Figure pct00016
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 17)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-3 α 사슬(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)을 제공한다:
Figure pct00017
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 18)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-6 α 사슬(TRAV7D-2*01/TRAJ30*01/TRAC)을 제공한다:
Figure pct00018
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 19)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-8 α 사슬(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)을 제공한다:
Figure pct00019
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 20)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-10 α 사슬(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)을 제공한다:
Figure pct00020
또 다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 21)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-11 α 사슬(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)을 제공한다:
Figure pct00021
일 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 22)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-17 α 사슬(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)을 제공한다:
Figure pct00022
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 23)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-38 α 사슬(TRAV7D-2*01/TRAJ12*01/TRAC)을 제공한다:
Figure pct00023
일부 실시형태에서, 선도 메티오닌 및/또는 신호서열은 번역 후 변형된 단백질에서 절단된다.
일 실시형태에서, IMGT 및 Uniprot 웹사이트의 명명법에 기초하여, mTCR α 사슬 특징은 다음과 같은 것으로 여겨진다:
1. M1-S20: 선도 서열은 TCR α 사슬의 성숙단계에서 제거
2. Q21-S268: TCR-1, 2, 3 α 사슬
3. Q21-N132 (또는 D132): α 사슬 V-영역
4. I133-S268: hgp100(DQ452619)에 특이적인 HLA-A2 마우스 TCR과 동일한 TCR α 사슬 C-영역
5. Q21-L242: TCR α 사슬 세포 외 도메인
6. S243-L263: 성숙한 TCR α 사슬의 막관통 영역
7. R264-S268: 성숙한 TCR α 사슬의 세포 내 영역
4. 전장 mTCR-1, 2, 3, 6, 8, 10, 11, 17 및 38 β 사슬의 단백질 서열
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 24)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-1, 2, 8, 11, 17 및 38 β 사슬(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01/TRBC1)을 제공한다:
Figure pct00024
mTCR-1, 2, 3, 6, 8, 10, 11, 17 및 38β 사슬의 불변영역(Cβ)(굵은 글씨)은 동일하며, hgp100에 특이적인 HLA-A2 Tg 마우스 유래 TCR β 사슬 C-영역과 동일하다.
일부 실시형태에서, 선도 메티오닌 및/또는 신호서열은 번역 후 변형된 단백질에서 절단된다.
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 25)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-3 β 사슬(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01/TRBC1)을 제공한다:
Figure pct00025
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 26)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-6 β 사슬(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01/TRBC1)을 제공한다:
Figure pct00026
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 27)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-10 β 사슬(TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01/TRBC1)을 제공한다:
Figure pct00027
일부 실시형태에서, 선도 메티오닌 및/또는 신호서열은 번역 후 변형된 단백질에서 절단된다.
일 실시형태에서, IMGT 및 Uniprot 웹사이트의 명명법에 기초하여, mTCR α 사슬 특징은 다음과 같다:
1. M1-M17: 선도 서열은 mTCR β 사슬 성숙단계에서 제거
2. E18-S304: mTCR β 사슬
3. E18-L131: mTCR β 사슬 V-영역(D 영역이 S113(TCR-1&2) 또는 A113(TCR-3)-A116인 TRBV13-1*01/TRBJ2-4*01)
4. E132-S304: hgp100(DQ452620)에 특이적인 HLA-A mTCR의 mTCR β 사슬 C1-영역
5. E18-Y276: mTCR β 사슬 세포 외 도메인
6. E277-M298: 성숙한 mTCR β 사슬의 막관통 영역
7. V299-S304: 성숙한 mTCR β 사슬의 세포 내(위상) 영역
5. mTCR-1, 2, 3, 6, 8, 10, 11, 17 및 38 α 사슬의 CDR3 영역의 단백질 서열
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 28)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-1 α 사슬을 제공한다:
Figure pct00028
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 29)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-2 α 사슬을 제공한다:
Figure pct00029
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 30)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-3 α 사슬을 제공한다:
Figure pct00030
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 31)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-6 α 사슬을 제공한다:
Figure pct00031
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 32)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-8 α 사슬을 제공한다:
Figure pct00032
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 33)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-10 α 사슬을 제공한다:
Figure pct00033
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 34)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-11 α 사슬을 제공한다:
Figure pct00034
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 35)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-17 α 사슬을 제공한다.
Figure pct00035
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 36)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-38 α 사슬을 제공한다:
Figure pct00036
6. mTCR-1, 3, 6 및 10 β 사슬의 CDR3 영역의 단백질 서열
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 37)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-1 β 사슬을 제공한다:
Figure pct00037
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 38)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-3 β 사슬을 제공한다:
Figure pct00038
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 39)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-6 β 사슬을 제공한다:
Figure pct00039
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 40)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-10 β 사슬을 제공한다:
Figure pct00040
7. mTCR-1, 2, 3, 6, 8, 10, 11, 17 및 38 α 사슬의 세포 외 도메인(가용성 TCR)(Vα는 밑줄 표시됨)
TCR α 및 β 사슬의 세포 외 도메인은 가용성 TCR을 형성할 수 있다. 이들은, 검출 가능한 표지, 예를 들어, 형광 분자로 표지될 경우, 종양 세포에서 제시되는 HLA-A2/hAFP158을 검출하는 데 사용할 수 있다. 표지된 가용성 TCR은 혈액을 따라 전신을 순환하는 종양 세포를 검출하고 종양 조직에서 제시되는 동족 항체 에피토프를 결정하는 진단 시약으로서의 잠재성이 있으며, 이러한 기능은 입양 세포 이식 요법에서 TCR-T 세포의 성공적인 사용에 중요하다.
일 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 41)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-1 α 사슬(Q21-L242)을 제공한다:
Figure pct00041
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 42)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 mTCR-2 α 사슬(Q21-L242)을 제공한다:
Figure pct00042
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 43)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-3 α 사슬(Q21-L242)을 제공한다:
Figure pct00043
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 44)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-6 α 사슬(Q21-L242)을 제공한다:
Figure pct00044
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 45)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-8 α 사슬(Q21-L242)을 제공한다:
Figure pct00045
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 46)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-10 α 사슬(Q21-L242)을 제공한다:
Figure pct00046
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 47)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-11 α 사슬(Q21-L242)을 제공한다:
Figure pct00047
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 48)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-17 α 사슬(Q21-L242)을 제공한다:
Figure pct00048
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 49)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-38 α 사슬(Q21-L242)을 제공한다:
Figure pct00049
8. TCR-1, 2, 3, 6, 8, 10 및 11 β 사슬의 세포 외 도메인(Vβ는 밑줄 표시됨)
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 50)과 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-1, 2, 8, 11 β 사슬(E18-Y276)을 제공한다:
Figure pct00050
또 다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 51)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-3 β 사슬(E18-Y276)을 제공한다:
Figure pct00051
다른 실시형태는 다음 아미노산 서열(서열번호 52)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-6 β 사슬(E18-Y276)을 제공한다:
Figure pct00052
또 다른 실시형태에서는 다음 아미노산 서열(서열번호 53)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가용성 mTCR-10 β 사슬(E18-Y276)을 제공한다:
Figure pct00053
9. 설계된 mTCR의 융합 단백질 서열
융합 단백질
다른 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 도메인과 제2 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질이 제공된다. 융합 단백질은 융합 단백질에 특이적인 세포 또는 조직, 예를 들어, 종양 세포 또는 종양 세포-연관 신생혈관을 표적화하는 표적화 도메인을 선택적으로 함유할 수 있다.
융합 단백질은 또한 항원-결합 도메인으로부터 제1 폴리펩타이드 도메인을 분리하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커 도메인을 선택적으로 함유한다.
본 명세서에 개시된 융합 단백질은 다음 식 1을 갖는다:
Figure pct00054
상기 식 중, "N"은 융합 단백질의 N-말단을 나타내고, "C"는 융합 단백질의 C-말단을 나타내고, "R1"은 개시된 α mTCR 사슬 또는 이의 단편 중 하나이다. "R2"는 펩타이드/폴리펩타이드 링커 도메인이고, "R3"은 β mTCR 사슬 또는 이의 단편이다. 다른 실시형태에서, R1은 β mTCR 사슬 또는 이의 단편이고 R3은 α mTCR 사슬이다.
선택적으로, 융합 단백질은 두 개 이상의 융합 단백질을 이량체화 또는 다량체화하도록 기능하는 도메인을 추가로 함유한다. 융합 단백질을 이량체화 또는 다량체화하도록 기능하는 도메인은 별도의 도메인이거나, 또는 융합 단백질의 다른 도메인 중 하나 내에 함유될 수 있다.
융합 단백질은 이량체화 또는 다량체화될 수 있다. 이량체화 또는 다량체화는 이량체화 또는 다량체화 도메인을 통해 둘 이상의 융합 단백질 사이에서 일어날 수 있다. 대안적으로, 화학적 가교에 의해 융합 단백질의 이량체화 또는 다량체화가 일어날 수 있다. 형성된 이량체 또는 다량체는 동종이량체/동종다량체 또는 이종이량체/이종다량체일 수 있다.
융합 단백질의 모듈성 및 다른 조합으로 이량체화 또는 다량체화하는 능력은 종양 세포 미세 환경에 대해서 면역 반응을 향상시키도록 기능하는 표적화 분자에 대한 다양한 선택폭을 제공한다.
다른 실시형태는 하기 식 2의 융합 단백질을 제공한다:
Figure pct00055
상기 식 중, "N"은 융합 단백질의 N-말단을 나타내고, "C"는 융합 단백질의 C-말단을 나타내고, "R1"은 개시된 α mTCR 사슬 또는 이의 단편 중 하나이다. "R2"는 펩타이드/폴리펩타이드 링커 도메인이고 "R3"은 β mTCR 사슬 또는 이의 단편이며, "R4"는 항-CD3 단일 사슬 항체이다. 항-CD3 단일 사슬 항체는 관련 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 상업적으로 입수 가능하다.
일 실시형태는 다음 서열(서열 번호 54)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-1의 융합 단백질(α 사슬은 밑줄, P2A는 굵은 글씨, β 사슬은 이중 밑줄 표시됨)을 제공한다:
Figure pct00056
α 사슬은 밑줄 표시되고, β 사슬은 이중 밑줄로 표시되며, P2A와 퓨린 절단 부위(US2016/0137715 A1 참조)는 굵은 글씨로 표시되어 있다.
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 55)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-2(α 사슬, P2A, 및 β 사슬)를 제공한다:
Figure pct00057
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 56)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-3(α 사슬, P2A, β 사슬)을 제공한다:
Figure pct00058
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 57)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-6(α 사슬, P2A, β 사슬)을 제공한다:
Figure pct00059
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 58)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-8(α 사슬, P2A, β 사슬)을 제공한다:
Figure pct00060
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 59)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-10(α 사슬, P2A, β 사슬)을 제공한다:
Figure pct00061
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 60)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-11(α 사슬, P2A, β 사슬)을 제공한다:
Figure pct00062
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 61)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-17(α 사슬, P2A, 및 β 사슬)을 제공한다:
Figure pct00063
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 62)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-38(α 사슬, P2A, 및 β 사슬)을 제공한다:
Figure pct00064
10. 설계된 TCR-1, TCR-2, TCR-3, TCR-6, TCR-8, TCR-10, TCR-11, TCR-17 및 TCR-38의 뉴클레오타이드 서열
하기 서열은 상기 단백질 서열과 인간 세포 내에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 기반으로 한다.
일 실시형태는 다음 서열(서열 번호 63)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-1(α 사슬은 밑줄, P2A는 굵은 글씨로, β 사슬은 이중 밑줄 표시)을 제공한다:
Figure pct00065
Figure pct00066
다른 실시형태는 다음 서열(서열번호 64)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-2(α 사슬 밑줄, P2A는 굵은 글씨, β 사슬은 이중 밑줄 표시)를 제공한다:
Figure pct00067
다른 실시형태는 다음 서열(서열 번호 65)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-3(α 사슬은 밑줄, P2A는 굵은 글씨, β 사슬은 이중 밑줄 표시)을 제공한다:
Figure pct00068
Figure pct00069
다른 실시형태는 다음 서열(서열 번호 66)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-6(α 사슬은 밑줄, P2A는 굵은 글씨, β 사슬은 이중 밑줄 표시)을 제공한다:
Figure pct00070
Figure pct00071
다른 실시형태는 다음 서열(서열 번호 67)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-8(α 사슬은 밑줄, P2A는 굵은 글씨, β 사슬은 이중 밑줄 표시)을 제공한다:
Figure pct00072
다른 실시형태는 다음 서열(서열 번호 68)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-10(α 사슬은 밑줄, P2A는 굵은 글씨, β 사슬은 이중 밑줄 표시)을 제공한다:
Figure pct00073
Figure pct00074
다른 실시형태는 다음 서열(서열 번호 69)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-11(α 사슬은 밑줄, P2A는 굵은 글씨, β 사슬은 이중 밑줄 표시)을 제공한다:
Figure pct00075
Figure pct00076
일 실시형태는 다음 서열(서열번호 70)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-17(α는 밑줄, P2A는 굵은 글씨체, β는 이중 밑줄)을 제공한다:
Figure pct00077
다른 실시형태는 다음 서열(서열 번호 71)과 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 설계된 mTCR-38(α 사슬은 밑줄, P2A는 굵은 글씨, β 사슬은 이중 밑줄 표시)을 제공한다:
Figure pct00078
Figure pct00079
B. 유전자 조작된 T 세포
다른 실시형태는 암세포의 표면에 발현되는 hAFP 또는 이의 단편에 특이적으로 결합되는 TCR을 생산하는 개시된 마우스 TCR 유전자를 발현하는 유전자 조작된 CD8+ 면역세포를 제공한다. 바람직하게는, 면역세포는 인간 T 세포, 예를 들어, 인간 세포독성 T 세포이다. 조작된 인간 세포독성 T 세포는 자가 인간 세포독성 T 세포일 수 있다. TCR 유전자는 코돈 최적화될 수 있다.
다른 실시형태는 개시된 마우스 TCR 유전자를 발현시키기 위해 유전자 조작된 CD4+ 면역세포, 바람직하게는 인간 CD4+ 면역세포를 제공한다. CD4+ 세포는 도움 T 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다. 조작된 인간 CD4+ 면역세포는 자가 인간 도움 T 세포일 수 있다. TCR 유전자는 코돈 최적화될 수 있다.
이 연구에서 식별된 9 hAFP158 특이적 쥣과 TCR은 CD4 T 세포에 Tet158 사량체에 결합할 수 있는 능력을 부여할 수 있는데, 이것은 높은 친화력을 가지고 CD8 도움에 독립적이라는 것을 시사한다. 입양 세포 요법에서 CD4의 역할은 알려지지 않았다. 하지만, HepG2 암세포 자극에 대한 반응으로 CD4 TCR-T 세포에 의한 IL-2의 생산은 T 세포 증식을 유지하기 위해 사이토카인을 제공할 수도 있다. 또한, CD4 TCR-T 세포는 HepG2 암세포에 대해 낮은 세포독성을 입증한다. 따라서, CD8 TCR-T가 hAFP+ 암세포를 사멸하는데 주요한 역할을 할 수 있지만, CD4 TCR-T가 생체내에서 항암 효과를 생성하는데 중요할 수 있는 T 세포 증식에 도움을 줄 수 있다.
인간 TCR과 비교했을 때 쥣과 TCR은 인간 숙주세포의 표면에서 증가된 발현을 제공할 수 있는 것으로 여겨진다. 또한, 쥣과 TCR은 인간 숙주세포의 표면에서 외인성 인간 TCR보다 효과적으로 내인성 TCR을 대체할 수 있다. 하지만, TCR-T 세포의 반복적인 사용으로 인한 항-TCR 반응을 없애기 위해 mTCR의 인간화가 필요할 수도 있다. mTCR을 인간화시키는 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 이에 대해서는, 미국 특허 제5,861,155호 및 제5,859,205호, WO2007/131092, EP0460167, 문헌[Davis, et al., Clin Cancer Res., 16:5852-5861 (2010)]을 참조하며, 이들은 이들의 전문이 참고로 편입된다. 일 실시형태에서, 개시된 mTCR 유전자는 T 세포에 도입되기 전에 또는 대상체에게 투여되기 전에 인간화된다.
C. T 세포 하이브리도마
다른 실시형태는 개시된 mTCR 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포 하이브리도마를 제공한다. 예를 들어, 하이브리도마는, 분류된 마우스 CD8+Tet158+ 세포를 TCR α 및 β 사슬이 결여되고, 문헌[He., Y. et al., J Immunol, 174:3808-3817 (2005)]에 기술된 바와 같이 선택된 BW-Lyt2.4 세포와 융합하는 융합 결과일 수 있다. 하이브리도마를 만드는 방법은 실시예에 제공되어 있다.
D. 항체
일 실시형태는, 예를 들어, 서열번호 2 내지 62와 같이, 개시된 mTCR 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 적합한 항체는 당업자에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 항체 또는 항원 결합 단편은 mTCR의 작용제 또는 길항제일 수 있거나, 단순히 TCR 또는 이의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 개시된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 mTCR 또는 이의 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 2 내지 62 중 임의로 하나)에 면역특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 mTCR의 세포외 도메인(서열번호 41 내지 53)에 결합한다.
예를 들어,
(I) 세포(특히 살아있는 세포)의 표면에 배열되거나; 또는
(II) 내인성 농도로 세포(특히 살아있는 세포)의 표면에 배열된
개시된 mTCR 폴리펩타이드에 면역특이적으로 결합할 수 있는 분자가 제공된다.
또한, 가용성의 내인성 mTCR 폴리펩타이드에 면역특이적으로 결합할 수 있는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 분자는 가용성 mTCR 폴리펩타이드가 이의 리간드에 결합하거나 또는 달리 상호 작용하는 것을 감소시키거나 방지한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아래에 더욱 상세하게 논의된 것과 같이 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용해서 제조될 수 있다.
1. 인간 및 인간화된 항체
개시된 mTCR 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 인간 또는 인간화될 수 있다. 많은 비인간 항체(예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼에서 유래된 것들)는 인간에서 자연적인 항원성이기 때문에, 인간에게 투여하면 원치 않는 면역반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 이 방법에서 인간 또는 인간화된 항체의 사용은, 인간에게 투여된 항체가 원치 않는 면역반응을 일으키게 될 기회를 감소시키는 역할을 한다.
면역화 시에, 내인성 면역글로불린 생산없이 인간 항체의 완전한 전체를 생산할 수 있는 형질전환동물(예를 들어, 마우스)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 접합 영역(J(H)) 유전자의 동형접합 결실(homozygous deletion)로 내인성 항체 생산의 완전히 저해를 초래하는 것이 설명되었다. 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이의 이식은 항원 시험감염 시에 인간 항체의 생산을 초래할 것이다.
선택적으로, 항체를 다른 종에서 생산하고, 인간에게 투여하기 위하여 인간화시킨다. 비인간(예컨대, 쥣과) 항체의 인간화 형태는, 비인간 면역글로불린에서 기원된 최소의 서열을 함유하는, 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 부분 서열)이다. 인간화 항체는 수용자 항체(recipient antibody)의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(기증자 항체(donor antibody))의 CDR로부터의 잔기로 교체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)를 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 발견되지 않거나 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 없는 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 한 개, 전형적으로 두 개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 함유할 것인데, 이때 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FT 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 최적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 함유할 것이다.
비인간 항체를 인간화시키는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간인 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 전형적으로 "수입"(import) 가변 도메인에서 가져온 "수입" 잔기라고 부른다. 일반적으로 항체 인간화 기술은 항체 분자의 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 DNA 서열을 조작하기 위해 재조합 DNA 기술의 사용을 수반한다. 인간화는 인간 항체에 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 수행될 수 있다. 따라서, 비인간 항체(또는 이의 단편)의 인간화 형태는, 실질적으로 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환되어 있는 키메라 항체 또는 단편이다. 실제로, 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 전형적으로 인간 항체이다.
인간화 항체 제작에 사용될, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위하여 매우 중요하다. "최적 적합성" 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 영역의 서열을 알려진 인간 가변 도메인 서열 전체 라이브러리에서 선별한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크(FR)로서 인정된다. 다른 방법은, 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위 그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 여러 가지 상이한 인간화 항체에 사용될 수도 있다.
항원에 대한 높은 친화력과 기타 이로운 생물학적 특성을 유지하면서 항체를 인간화시키는 것이 더욱 중요하다. 이 목표를 달성하기 위하여, 부모 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용한 다양한 개념적 인간화 제품 및 부모 서열의 분석 과정에 의해 인간화 항체를 제작할 수 있다. 3차원 면역 글로불린 모델은 통상적으로 입수 가능하고, 당업자에게는 친숙하다. 선택된 후보 글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램은 입수 가능하다. 이러한 디스플레이의 검사는, 후보 면역글로불린 서열의 기능화 시에 잔기의 유사한 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이런 방식으로, 목적하는 항원 특성, 즉, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화력이 달성되도록 공통 서열 및 수입 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적으로 그리고 거의 실질적으로 항원 결합에 대한 영향에 연루된다.
항체는 기질에 결합될 수 있거나 또는 검출 가능한 모어어티로 표지될 수 있거나, 또는 결합 및 표지 둘 다가 가능할 수 있다. 본 조성물에 상정 가능한 검출 가능한 모이어티는 형광, 효소 및 방사능 마커를 포함한다.
2 단쇄 항체
개시된 mTCR 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 단쇄 항체일 수 있다. 단쇄 항체의 생산 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 단쇄 항체는 짧은 펩타이드 연결기를 사용해서 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 함께 융합시켜서, 하나의 분자 상에 항원 결합 부위를 재구성함으로써 제작된다. 하나의 가변 도메인의 C-말단이 다른 가변 도메인의 N-말단에 15 내지 25개의 아미노산 펩타이드 또는 연결기를 통해서 테더링된 단쇄 항체 가변 단편(scFv)이 항원 결합 또는 결합 특이성을 크게 붕괴시키는 일 없이 개발되었다. 중쇄 및 경쇄가 이들의 적절한 입체형태 배향으로 함께 결합할 수 있도록 연결기가 선택된다. 이들 Fv는 자연상태의 항체의 중쇄와 경쇄에 존재하는 불변 영역(Fc)을 결여한다.
3 1가 항체
개시된 mTCR 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체 제조 시 체내 방법이 사용될 수 있다. 특히, 단편, 특히 Fab 단편을 생산하기 위해 항체의 소화는 당업계에 공지된 일반적인 기술을 이용해서 달성될 수 있다. 예를 들어, 소화는 파파인을 사용해서 수행될 수 있다. 항체의 파파인 소화는, 전형적으로, 각각 단일의 항원 결합 부위를 갖는, Fab 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 잔여 Fc 단편을 생산한다. 펩신 처리는 2개의 항원 조합 부위를 갖는 F(ab')2 단편이라 불리는 단편을 수득하고 여전히 가교결합 항원을 가능하게 한다.
또한, 항체 소화로 생산된 Fab 단편은 경쇄의 불변 부위와 중쇄의 첫 번째 불변 부위를 가지고 있다. Fab' 단편은 항체 경첩 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 도메인의 카복시 말단에 몇 개의 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과는 상이하다. F(ab')2 단편은 경첩 영역에서 이황화 가교로 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편이다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 본 명세서에서의 명칭이다. 원래 항체 단편은 둘 사이에 경첩 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 또한, 항체 단편의 다른 화학적인 커플링도 공지되어 있다.
4 하이브리드 항체
가 개시된 mTCR 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 하이브리드 항체일 수 있다. 하이브리드 항체에서, 하나의 중쇄 및 경쇄 쌍은 하나의 에피토프에 대해 생성된 항체에서 발견되는 것과 상동성인 한편, 다른 하나의 중쇄 및 경쇄 쌍은 또 다른 에피토프에 대해 생성된 항체에서 발견되는 쌍과 상동성이다. 이것은 다기능 결합가의 특성, 즉, 적어도 2개의 상이한 에피토프에 동시에 결합하는 능력을 초래한다. 이러한 하이브리드는 각 성분 항체를 생산하는 하이브리도마의 융합에 의해 또는 재조합 기술에 의해 형성될 수 있다. 물론, 이러한 하이브리드는 또한 키메라 사슬을 사용해서 형성될 수 있다.
5 항체 단편의 접합체 또는 융합
항체의 표적 기능은 항체 또는 이의 단편을 치료제와 커플링시킴으로써 치료용으로 사용될 수 있다. 항체 또는 단편(예컨대, 면역글로불린 불변 부위(Fc)의 적어도 일부분)의 치료제와의 이러한 커플링은, 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 포함하는, 면역접합체를 제조함으로써 또는 융합 단백질을 제조함으로써 달성될 수 있다.
항체 또는 단편의 치료제와의 이러한 커플링은, 항체 또는 항체 단편 및 치료제를 포함하는, 면역접합체를 제조함으로써 또는 융합 단백질을 제조함으로써, 또는 항체 또는 단편을 siRNA와 같은 핵산에 연결함으로써 달성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 반감기를 변화시키기 위하여 변형된다. 몇몇 실시형태에서, 순환에서 또는 치료 부위에 항체가 더 오랜 기간 동안 존재하도록 항체의 반감기를 증가시키는 것이 요구된다. 예를 들어, 순환에서 또는 치료될 위치에 연장된 시간 기간 동안 항체의 역가를 유지시키는 것이 요망될 수도 있다. 항체는 Xtend™ 항체 반감기 연장 기술(Xencor, 캘리포니아주 몬로비아 소재)을 사용해서 반감기를 연장시키는 Fc 변이체로 조작될 수 있다. 다른 실시형태에서는, 잠재적 부작용을 줄이기 위해 항-DNA 항체의 반감기가 감소된다. 개시된 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변형시키기 위하여 사용될 수 있다. 약물 모어어티는 고전적인 화학 치료제에 국한된 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 아브린(abrin), 리신 A(ricin A), 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소와 같은 독소를 포함할 수 있다.
개시된 항체 및 mTCR 폴리펩타이드는 하나 이상의 검출 가능한 표지에 접합 또는 연결될 수 있다. 개시된 항체 및 mTCR 폴리펩타이드는 검출 접합체를 형성하기 위해 적어도 하나의 제제에 연결될 수 있다. 진단용으로서 분자의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 하나의 원하는 분자 또는 모이어티에 연결, 공유결합 또는 복합화시키는 것이 통상적이다. 그러한 분자 또는 모이어티는 국한되지는 않지만 적어도 하나의 리포터 분자이다. 리포터 분자는 검정을 이용해서 검출될 수 있는 임의의 모이어티로서 정의된다. 항체 또는 폴리펩타이드에 접합된 리포터 분자의 예는 효소, 방사성 표지, 합텐, 형광 표지, 형광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 발광 분자, 광친화성 분자, 착색입자 및/또는 바이오틴과 같은 리간드를 포함한다.
E. 제형
개시된 항체, 융합 단백질 및 mTCR 폴리펩타이드는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 항체, 융합 단백질 또는 mTCR 폴리펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물은 비경구(근육내, 복강내, 정맥내(IV) 또는 피하주사), 경피(수동으로, 또는 이온 도입법 또는 전기 천공법을 이용해서) 또는 점막경유(코, 질, 직장 또는 설하) 투여 경로에 의한 또는 생분해 삽입물을 이용한 투여용일 수 있고, 각 투여 경로별로 적절한 용량 형태로 제형화될 수 있다.
일부 체내 접근법에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 대상체에게 치료적 유효량으로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유효량" 또는 "치료적 유효량"이란 용어는 치료중인 장애의 하나 이상의 징후를 치료, 억제 또는 경감시키거나 또는 원하는 약리학 및/또는 생리적 효과를 제공하는데 충분한 용량을 의미한다. 정확한 용량은 대상체 의존 변수(예를 들어, 연령, 면역체계 건강 등), 질환, 시행 중인 치료법 등과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.
개시된 조성물에 대해서, 추가 연구가 진행됨에 따라, 다양한 환자에서 다양한 조건으로 치료에 대한 적합한 용량 수준에 관한 정보를 얻고, 치료 맥락, 연령, 수용자의 일반적인 건강 등을 고려해서, 보통 숙련된 의료 관계자는 적절한 용량을 알 수 있을 것이다. 선택 용량은 원하는 치료 효과, 투여 경로 및 원하는 치료 기간에 따라 달라진다. 개시된 면역조절제에 대해서, 일반적으로 매일 0.001 내지 20mg/kg 체중의 용량 수준이 포유류에게 투여된다. 일반적으로 정맥주사 또는 주입의 경우, 용량은 더 낮아질 수 있다.
특정 실시형태에서, 개시된 조성물은 치료될 부위에 국소적으로, 예를 들어, 직접 주사에 의해 투여된다. 전형적으로, 주사는 전신 투여에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 많은 조성물의 증가된 국부적 농도를 초래한다. 조성물은, 치료될 부위 밖으로 폴리펩타이드가 수동 확산되는 것을 줄임으로써, 폴리펩타이드 조성물의 증가된 국소 농도를 생성시키는 것을 높기 위하여 위에서 설명한 대로 매트릭스와 조합될 수 있다.
1. 비경구 투여용 제형
일부 실시형태에서, 펩타이드와 폴리펩타이드를 함유하는 것을 포함하는 본 명세서에 개시된 조성물이 비경구 주사에 의해 수성 용액으로 투여된다. 또한 제형은 현탁액 또는 유탁액의 형태일 수 있다. 일반적으로, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물이 제공되며, 선택적으로, 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체를 포함한다. 이러한 조성물은 선택적으로 희석제, 멸균수, 다양한 완충제 함량의 완충식염수(예컨대, Tris-HCl, 아세트산염, 인산염), pH 및 이온 강도; 및 세제 및 용해제와 같은 첨가제(예컨대, TWEEN 20(폴리소르베이트-20) TWEEN 80(폴리소르베이트-80)), 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨) 및 방부제(예컨대, 티머솔, 벤질 알코올) 및 증량 물질(예컨대, 유당, 만니톨) 중 하나 이상을 포함한다. 비수성 용매 또는 비히클의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유 및 옥수수유와 같은 식물성 오일, 젤라틴, 및 에틸 올레산염과 같은 주사 가능한 유기 에스테르 중 1종 이상을 포함한다. 제형은 동결 건조되어 사용 직전에 재용해/재현탁될 수 있다. 제형은, 예를 들어, 세균 보유 필터를 통한 여과에 의해, 조성물에 멸균제를 혼입시킴으로써, 조성물을 방사선 조사함으로써, 또는 조성물을 가열함으로써 멸균될 수 있다.
2. 경구 투여용 제제
실시형태에서, 조성물은 경구 전달용으로 제형화된다. 경구 고형 용량 형태는 일반적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042) at Chapter 89]에 설명되어 있다. 고형 용량 형태는 정제, 캡슐, 알약, 트로키 또는 로젠지, 카세제, 펠릿, 파우더 또는 과립, 또는 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 고분자 화합물의 미립자 제제에 또는 리포솜에 넣는 물질을 포함된다. 이러한 조성물은 물리적 상태, 안정성, 체내 방출 속도 및 개시된 체내 청소율에 영향을 미칠 수 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) pages 1435-1712]을 참조하며, 이는 참고로 본 명세서에 편입된다. 조성물은 액체 형태로 제조될 수 있거나 또는 건조 파우더(예를 들어, 동결 건조된) 형태일 수 있다. 리포좀 또는 유단백질 캡슐화가 조성물을 제형화하기 위해 사용될 수 있다. 리포좀 캡슐화가 사용될 수 있으며 리포좀은 다양한 중합체로 유도체화될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,013,556호). 또한 문헌[Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics Edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes Chapter 10, 1979] 참조. 일반적으로, 제형은 펩타이드(또는 이의 화학적으로 변형된 형태) 및 위장 환경에서 펩타이드를 보호하고 장에서 생물학적 활성 물질을 방출하는 불활성 성분을 포함할 것이다.
제제는 유도체를 효과적으로 경구 전달하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 일반적으로, 상정되는 화학적 변형은 성분 분자 자체에의 적어도 하나의 모이어티의 부착인데, 이 모이어티는 위장 또는 장에서 혈류로 흡수되거나 장 점막에서 직접 흡수될 수 있다. 또한, 구성 성분 또는 구성 성분들의 전반적인 안정성 증가 및 신체내 순환 시간의 증가가 요구된다. 페길화는 약제학적 용법에 대한 예시적인 화학적 변형이다. 사용될 수 있는 다른 모이어티는 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리프롤린, 폴리-1,3-다이옥솔란 및 폴리-1,3,6-티옥소케인을 포함한다(예컨대, 문헌[Abuchowski and Davis (1981) "Soluble Polymer-Enzyme Adducts," in Enzymes as Drugs. Hocenberg and Roberts, eds. (Wiley-Interscience: New York, N.Y.) pp. 367-383; and Newmark, et al. (1982) J. Appl. Biochem. 4:185-189] 참조).
다른 실시형태는 약제학적으로 허용 가능한 에멀션, 용액, 현탁액 및 시럽을 포함하는 경구 투여용 액체 투여 형태를 제공하며, 이는 불활성 희석제; 습윤제, 유화제 및 현탁제와 같은 보조제; 및 감미제, 향미제 및 방향제를 포함하는 다른 성분을 함유할 수 있다.
방출 제어형 경구 제형이 바람직할 수 있다. 확산 또는 침출 기전으로 방출을 허용하는 불활성 매트릭스, 예컨대, 검(gum)에 작용제가 혼입될 수 있다. 천천히 분해되는 매트릭스가 제형에 혼입될 수 있다. 방출 제어의 또 다른 형태는 Oros 치료 시스템(Alza Corp.)에 기반하는데, 즉, 약물은 반투과성 막으로 둘러싸여 물이 유입되면 삼투 효과로 인해 작은 구멍을 통해 약물이 밖으로 나오는 것이다.
경구 제형의 경우, 방출 개소는, 위장, 소장(십이지장, 공장 또는 회장) 또는 대장일 수 있다. 일부 실시형태에서, 위장 환경을 넘어, 예컨대, 장에서 작용제(또는 유도체) 보호 또는 작용제(또는 유도체) 방출에 의해 방출은 위장 환경의 유해 효과를 회피할 것이다. 최대 위장 내성을 보장하기 위해, 적어도 pH 5.0까지 불침투성인 코팅이 필수적이다. 장내 코팅으로서 사용되는 더욱 통상의 불활성 성분의 예는 셀룰로스 아세테이트 트라이멜리테이트(CAT), 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트(HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), Eudragit L30D™, Aquateric™, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트(CAP), Eudragit L™, Eudragit S™, Shellac™ 등을 포함한다. 이러한 코팅은 혼합 필름으로 사용될 수 있다.
3. 국소 투여용 제형
개시된 면역조절제가 국소로 도포될 수 있다. 대부분의 펩타이드 제제는, 특히, 폐, 비강, 구강(설하, 협측), 질 또는 직장 점막에 바르면 효과적일 수 있지만, 국소 투여는 잘 듣지 않는다.
조성물은 약 5미크론 미만의 공기역학적 직경을 가진 에어로졸 또는 스프레이 건조 입자로서 전달될 때 폐 상피 라이닝을 가로질러 혈류로 유입되고 흡입되면서 폐로 전달될 수 있다.
치료용 제품을 폐로 전달하기 위해 설계된 광범위한 기계 장치가 사용될 수 있는데, 여기에는 제한 없이, 네뷸라이저, 계량 흡입기(metered dose inhaler) 및 분말 흡입기를 포함하며, 이들은 모두 당업자에게 친숙하다. 상업적으로 입수 가능한 장치의 몇몇 구체적인 예는 Ultravent 네뷸라이저(Mallinckrodt Inc., 미주리주 세인트루이스 소재); Acorn II 네뷸라이저(Marquest Medical Products, 콜로라도 주 엥글우드 소재); Ventolin 계량 흡입기(Glaxo Inc., 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글파크 소재); 및 Spinhaler 파우더 흡입기(Fisons Corp., 매사추세츠주 베드포드 소재)가 있다. Nektar, Alkermes, Mannkind는 모두 흡입성 인슐린 파우더 제제가 승인되었거나 여기에 기재된 제형에 적용할 수 있는 기술이 임상시험 중에 있다.
점막에 투여하기 위한 제형은 전형적으로 분무 건조 약물 입자일 것이고, 이 입자는 정제, 젤, 캡슐, 현탁액 또는 에멀션에 혼입될 수 있다. 표준 약제학적 부형제는 임의의 배합기에서 이용 가능하다.
또한, 경피 제형이 제조될 수도 있다. 이것은 전형적으로 연고, 로션, 스프레이 또는 패치이며, 이들은 모두 표준 기술을 사용해서 제조될 수 있다. 경피 제제는 침투 증강제의 봉입을 필요로 할 수 있다.
4. 제어된 전달 중합체 매트릭스
또한, 본 명세서에 개시된 융합 단백질, mTCR 폴리펩타이드 및 항체는 방출 제어 제형으로 투여될 수 있다. 방출 제어 중합체 장치는 중합체 장치(로드(rod), 실린더, 필름, 디스크) 또는 주사(미립자)의 이식 후에 전신으로 장기간 방출을 위하여 제조될 수 있다. 매트릭스는 마이크로스피어와 같은 마이크로입자 형태일 수 있는데, 작용제는 고형 중합체 매트릭스 또는 마이크로캡슐 내로 분산되며, 코어는 중합체 껍질과는 상이한 재료로 되어 있고, 펩타이드는 코어에 분산 또는 현탁되는데, 이것은 속성상 액체 또는 고체일 수 있다. 본 명세서에 구체적으로 정의되지 않는 한, 마이크로입자, 마이크로스피어 및 마이크로캡슐은 호환 가능하게 사용된다. 대안적으로, 중합체는 나노미터에서 4 센티미터에 이르는 범위의 얇은 슬랩 또는 필름, 분쇄 또는 다른 표준 기술에 의해 생성된 파우더, 또는 심지어 하이드로겔과 같은 겔로 주조될 수 있다.
일부 실시형태에서는 생분해성 매트릭스를 선호하지만, 비생분해성 또는 생분해성 매트릭스가 융합 폴리펩타이드, 항체 또는 mTCR 폴리펩타이드, 또는 이들을 암호화하는 핵산의 전달에 사용될 수 있다. 이들은 천연 또는 합성 폴리머일 수 도 있지만, 분해 및 방출 프로파일의 보다 양호한 특성으로 인해 일부 실시형태에서는 합성 폴리머를 선호한다. 방출이 요구되는 기간에 기초해서 중합체가 선택된다. 펄스 방출 또는 "벌크 방출"이 보다 효과적인 결과를 제공할 수도 있지만, 일부 경우에는 선형 방출이 가장 유용할 수도 있다. 중합체는 하이드로겔 형태(전형적으로 물을 최대 90 중량%까지 흡수)일 수 있고, 선택적으로 다가 이온 또는 중합체와 가교결합될 수 있다.
매트릭스는 용매 증발, 분무 건조, 용매 추출 및 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 형성될 수 있다. 생분해성 마이크로스피어는, 예를 들어, 문헌[Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987); Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987); and Mathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci., 35:755-774 (1988)]에 기술된 바와 같이, 약물 전달용으로 마이크로스피어를 만들기 위해 개발된 방법의 어느 것이라도 이용해서 제작할 수 있다.
장치는 이식 또는 주사 영역을 치료하기 위해 국소 방출용으로 제형화될 수 있는데, 이는 전형적으로 전신 치료- 또는 전신 전달용 용량보다 훨씬 적은 용량을 전달한다. 이것은 이식될 수 있거나, 근육, 지방으로 피하 주입될 수 있거나, 또는 연하될 수 있다.
III. 사용 방법
특정 실시형태에서, 개시된 항체, mTCR 폴리펩타이드 및 조작된 면역세포를 암 검출 또는 치료에 사용할 수 있다. 검출, 진단 또는 치료될 바람직한 암은 간세포 암종 또는 hAFP를 발현하는 임의의 다른 암을 포함한다.
A. 입양 이식
하나의 실시형태에서, 면역세포가 개시된 mTCR를 발현하도록 조작되어 있다. 면역세포는 T 세포, 바람직하게는, 인간 T 세포이다. 세포는 자가 유래 또는 이종 기원이다. 세포는 전형적으로 시험관내에서 형질도입된다. 형질도입된 세포는 대상체에 필요에 따라서 투여될 수 있는 대량의 형질도입된 세포를 얻기 위해 선택적으로 시험관내에서 증식된다. 이러한 대상체는 전형적으로 hAFP를 발현하는 암 또는 종양을 가지고 있거나 가지고 있다고 여겨진다. T 세포는 CD8+ 또는 Cd4+일 수 있다. 형질도입된 세포는 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
입양 이식은 암 치료를 위해 다른 요법과 조합될 수 있다. 이러한 추가의 요법은 화학요법, 방사선 요법 및 수술, 또는 이들의 조합을 포함한다. TCR-T의 입양 이식은 암 백신과 조합될 수 있어 전이된 TCR-T 세포의 수 및 관련 독성을 감소시키기 위해 TCR-T를 체내에서 더 확장시킬 것이다.
일 실시형태는 개시된 mTCR 중 하나를 발현하는 조작된 T 세포를 투여함으로써 종양 부담의 감소를 필요로 하는 대상체에서 종양의 부담을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 조작된 mTCR 세포는 hAFP를 발현하는 종양을 억제 또는 감소시킨다. 대상체는 선택적으로 암에 대한 보조요법으로 치료될 수 있다. 치료될 바람직한 암은 간세포 암종이다.
B. 검출 또는 진단
개시된 항체 또는 mTCR 폴리펩타이드는 위에서 논의된 바와 같이 표지될 수 있다. 표지된 폴리펩타이드는 암세포의 샘플에 적용될 수 있으며, 여기서 표지된 폴리펩타이드의 암세포의 샘플에 대한 특이적 결합은 간세포 암종을 포함하는 hAFP 특이적 암을 나타낸다.
샘플에서 암세포 수를 결정하기 위해 표지 검출이 선택적으로 정량될 수 있다. 샘플은 전형적으로 간 조직 샘플이지만 혈액 또는 형청 샘플를 포함할 수 있다.
IV. 조성물 및 키트
조성물 및 키트가 또한 제공된다. 이러한 키트는 방법에 사용되는 하나 이상의 다양한 시약(일반적으로 농축된 형태)이 각각 있는 용기를 포함할 수 있는데, 상기 시약은, 예를 들어, 마커에 이미 부착되었거나 또는 선택적으로 결합 작용제를 (마커 자체뿐만 아니라) 항체에 커플링시키기 위한 시약과 함께 하나 이상의 결합 작용제(항체), 완충제 및/또는 본 발명의 시행을 지원하기 위하여 (선택적으로 미세절제에 의해) 분리하기 위한 시약 및 기구를 포함한다. 본 발명의 리간드 검출 방법에서 키트 구성품을 설명하는 표지 또는 표시기, 또는 키트 구성품의 사용을 위한 일련의 설명서의 세트가 또한 전형적으로 포함될 것이며, 여기서 설명서는 패키지 삽입물 및/또는 키트 혹은 키트 구성품의 포장과 관련될 수 있다.
추가의 실시형태는 본 명세서에 기재된 면역검출 방법과 함께 사용하기 위한 면역검출 키트를 제공한다. 항체 또는 mTCR 폴리펩타이드가 일반적으로 hAFP를 검출하는데 사용되기 때문에, 항체 및 mTCR 폴리펩타이드가 일반적으로 이 키트에 포함될 것이다. 따라서, 면역검출 키트는 적절한 용기 수단에 mTCR 폴리펩타이드 및/또는 선택적으로 면역검출 시약에 결합되는 첫 번째 항체를 포함할 것이다.
키트의 면역검출 시약은 주어진 항체와 연관되고/되거나 연결되는 검출 가능한 표지를 포함하는 다양한 형태 중 어느 하나를 취할 수 있다. 2차 결합 리간드에 연관되고/되거나 부착되는 검출 가능한 표지가 또한 고려된다. 예시적인 2차 리간드는 첫 번째 항체에 대해 결합 친화력을 갖는 2차 항체이다.
본 키트에서 사용하기에 적합한 추가적인 면역검출 시약은, 2차 항체에 대해서 결합 친화력을 갖는 제3 항체와 함께, 첫 번째 항체에 대해 결합 친화력을 갖는 2차 항체를 포함하는 2-성분 시약을 포함하며, 상기 제3 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다. 여기에 언급된 바와 같이, 다수의 예시적인 표지는 당업계에 공지되어 있고/있거나 이러한 모든 표지는 본 발명과 관련하여 적절하게 사용될 수 있다.
키트는 개시된 mTCR 폴리펩타이드를 발현하는 조작된 면역세포와 같은 암의 치료를 위한 치료제를 더 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: lv-초회감작 및 펩타이드-부스팅에 의한 AAD 마우스의 면역화는 인간 HepG2 종양세포를 인식하고 죽일 수 있는 높은 수준의 hAFP158-특이적 CD8 T 세포를 유도한다.
재료 및 방법
마우스 : HLA-A2 형질전환 AAD 마우스(Pichard, V., et al, J Immunother, 31:246-253 (2008)) 및 NSG 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하여 특정 병원체가 없는 동물 시설에서 사육되었다. 동물 프로토콜은 Augusta University의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
면역화 : 기술(Morgan, RA. et al., J Immunother, 36:133-151 (2013))된 바와 같이 hAFP 또는 인플루엔자 바이러스 M1 단백질을 발현하는 재조합 렌티벡터(lv)로 마우스를 피하로 면역화시켰다. 12일 후에, 기술(Linette, G.P., et al., Blood, 122:863-871 (2013))된 바와 같이 PolyI:C 및 항-CD40 항체와 함께 hAFP158(FMNKFIYEI)(서열번호 1) 또는 M158(GILGFVFTL)(서열번호 72) 펩타이드로 마우스를 부스팅시켰다.
결과
hAFP 에피토프에 존재하는 인간 HLA-A2를 인식할 수 있는 마우스 CD8 T 세포를 유도하기 위해 재조합 hAFP-lv로 HLA-A2 형질전환 AAD 마우스를 면역화하였다. AAD 마우스는 면역 초기감작을 돕기 위해 마우스 CD8 분자에 결합하는 인간 HLA-A2 α1-α2 및 마우스 H-2d α3 도메인의 키메라 MHC I 분자를 발현한다(Pichard, V., et al, J Immunother, 31:246-253 (2008)). hAFP-lv 면역화가 AAD 마우스에서 적절한 수준의 hAFP158 에피토프-특이적 CD8 반응을 재생 가능하게 유도한 것이 밝혀졌다(도 1A). 하지만, CD8 반응 검출은 이전에 인간에서 동정된(Vora, S.R., et al., Oncologist, 14:717-725 (2009)) 다른 3개의 hAFP 에피토프(hAFP137, hAFP325 및 hAFP542)에 대해서는 검출되지 않았다(데이터가 표시되지 않음). hAFP158 펩타이드 단독에 의한 면역화는 측정 가능한 CD8 반응을 유도하지 못했다. 하지만, hAFP158 에피토프에 의한 부스팅 면역화는 hAFP-lv 초회감작에서 hAFP158-특이적 CD8 반응의 크기를 현저하게 증가시켰지만, hAFP158 펩타이드 초회감작된 마우스에서는 그렇지 않았다(도 1A). 중요하게는, 면역화된 마우스로부터의 마우스 CD8 T 세포는 hAFP+와 공동 배양 후 IFNγ를 생산할 수 있었지만, hAFP-, HepG2 종양 세포는 생산하지 않았다(도 1B). 이 데이터는 hAFP 백신-활성화 마우스 CD8 T 세포가 hAFP+ HepG2 종양세포를 인식하고 반응할 수 있었다는 것을 시사한다. 또한, 면역화된 마우스로부터의 비장세포와 하룻밤 공동배양 후에, hAFP+ HepG2 종양세포는 용량 의존 방식으로 사멸되었다(도 1C). 종합하면, 이들 데이터는, hAFP-lv 초회감작 및 hAFP158 펩타이드 부스팅에 의한 AAD 마우스의 면역화는 hAFP+ 인간 HepG2 종양세포를 인식하고 사멸할 수 있는 높은 수준의 hAFP158-특이적 CD8 T 세포를 유도할 수 있음을 시사한다.
실시예 2: hAFP-lv와 hAFP158로 면역화된 AAD 마우스의 비장세포의 입양 이식은 NSG 마우스에서 대량의 HepG2 종양 이종이식을 억제할 뿐만 아니라 제거한다.
재료 및 방법
미경험 또는 면역화된 마우스의 총 천오백만개의 비장세포(백오십만개의 hAFP158-특이적 CD8 T 세포)를 NSG 마우스에 주입한 다음, HepG2 종양세포에 노출시켰다. 이 치료 모델에서, 종양 크기가 2센치미터 직경에 도달할 때 NSG 마우스에게 면역화된 마우스의 총 천오백만개의 비장세포를 주사했다. 실험은 2회 행하였으며 유사한 데이터를 지녔다.
결과
입양 이식 실험에서, 미경험 마우스로부터가 아니라 hAFP-lv와 hAFP158 펩타이드로 면역화된 AAD 마우스로부터의 비장세포는 NSG 마우스에서 HepG2 종양세포 노출을 완전히 억제할 수 있었다(도 2A 및 도 2B). 대략 10%의 면역화된 마우스 비장세포가 hAFP158 펩타이드에 반응하여 IFNγ를 생산하였다. 놀랍게도, 면역화된 AAD 마우스로부터의 비장세포의 입양 이식은 20㎜ 직경 크기의 HepG2 종양을 완전히 제거할 수 있었다(도 2C).
실시예 3: hAFP158-특이적 마우스 CD8 T 세포의 입양 이식은 NSG 마우스에서 인간 HepG2 종양을 제거한다.
재료 및 방법
면역세포가 확립된 HepG2 종양의 제거를 담당하는 것을 추가로 동정하기 위하여, hAFP-lv와 hAFP158 펩타이드로 면역화된 AAD 마우스로부터의 CD8 T 세포를 자성 CD8 비드로 단리시켰다(도 3A). lv 발현 인플루엔자 바이러스 M1 항원 및 M158 펩타이드로 면역화된 AAD 마우스로부터의 CD8 T 세포를 또한 단리시켜 대조군으로 사용하였다.
세포주 : HEK293T 세포 및 인간 간암 세포주 HepG2는 ATCC에서 구매하였다. Huh7(HLA-A11)의 HCC 세포주는 Georgia Cancer Center의 Dr. Ande가 기증하였고 AFP- HepG2 세포는 Augusta University의 Dr. Jingxiong She가 제공하였다. hAFP 발현 및 HLA 유형은 웨스턴 블롯 및 면역학적 염색으로 검증되었다. 세포는 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다.
면역화 : 기술(Morgan, RA. et al., J Immunother, 36:133-151 (2013))된 바와 같이 hAFP 또는 인플루엔자 바이러스 M1 단백질을 발현하는 재조합 렌티벡터(lv)로 마우스를 피하로 면역화시켰다. 12일 후에, 기술(Linette, G.P., et al., Blood, 122:863-871 (2013))된 바와 같이 PolyI:C 및 항-CD40 항체와 함께 hAFP158(FMNKFIYEI)(서열번호 1) 또는 M158(GILGFVFTL)(서열번호 72) 펩타이드로 마우스를 부스팅하였다.
종양 접종 : 오백만개의 HepG2 종양세포를 NSG 마우스의 옆구리에 접종하였다. 이틀마다 종양 성장을 모니터링하였다.
결과
hAFP 면역화된 마우스로부터의 CD8 T 세포의 입양 이식으로 NSG 마우스에서 HepG2 종양을 제거할 수 있었음이 확인되었다(도 3B). 이와 대조적으로, 인플루엔자 바이러스 M1 항원으로 면역화된 마우스로부터의 CD8 T 세포를 공급받은 NSG 마우스에서 HepG2 종양은 지속적으로 성장하였다. 그 다음에, hAFP158-특이적 CD8 T 세포를 Tet158 사량체 염색 및 세포 분류를 사용하여 추가로 단리시켰다(도 3C). 입양 이식 후에, Tet158- CD8 T 세포가 HepG2 종양 성장을 억제하지 못하는 반면에, NSG 마우스에서 Tet158+ CD8 T 세포가 HepG2 종양을 제거할 수 있었다(도 3D). 결과적으로, 시험관내 및 체내 데이터는, hAFP158 에피토프를 나타내는 HLA-A2에 특이적인 마우스 CD8 T 세포는 인간 HCC 종양세포를 인식하고 사멸할 수 있음을 검증하고 있다.
실시예 4: Tet158+ CD8 T 세포로부터 만들어진 T 세포 하이브리도마는 HLA-A2/hAFP158 사량체에 결합하고, 일부는 hAFP+ HepG2 종양세포에 반응하여 IL-2를 생산한다.
재료 및 방법
T 세포 하이브리도마 : T 세포 하이브리도마는 분류된 마우스 CD8+Tet158+ 세포와 TCR α 및 β 사슬이 결여되고 기술(He., Y. et al., J Immunol, 174:3808-3817 (2005))된 바와 같이 선택된 BW-Lyt2.4 세포를 융합하여 제작되었다.
면역학적 및 사량체 염색 : 표면 마커와 항-Vβ 항체 패널(BD Biosciences, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)로 비장세포를 염색하였다. HLA-A2/hAFP158 사량체(Tet158)는 Emory University의 NIH Tetramer Core Facility에서 친절하게 제공하였다.
결과
단일 T 세포로부터 TCR α 및 β 사슬 유전자 쌍을 동정하고 클로닝하기 위해, T 세포 하이브리도마 세포주를 확립시켰다. T 세포 하이브리도마를 생성하기 전에, 항-Vβ 패널 항체를 사용해서 TCR Vβ 사슬을 특성규명하였다. 데이터는, Tet158+ CD8 T 세포의 90% 초과량이 항-Vβ8.3 항체로 염색될 수 있었음을 나타내었다(도 11A 내지 도 11B). Tet158+ CD8 T 세포의 또 다른 10% 미만은 Vβ2, Vβ5.1/5.2, Vβ4, Vβ11에 대한 항체로 염색될 수 있었다. 그 다음에, 분류된 Tet158+ CD8 T 세포를 이용한 2회의 세포 융합 실험에서 Tet158 사량체로 염색될 수 있었던 T 세포 하이브리도마 총 39개를 얻었다(데이터가 표시되지 않음). 그 중에서, 5개의 클론은 hAFP+ HepG2 종양 세포의 자극에 반응하여 IL-2를 생산할 수 있었지만(도 4A), 다른 34개의 하이브리도마는 IL-2를 생산하지 않거나 매우 낮은 수준으로 생산했다(데이터가 표시되지 않음). 5개 하이브리도마 모두 항-Vβ8.3 항체로 염색되었다(도 4B). 추가 분석에서 5개의 T 세포 하이브리도마는 Tet158 사량체에 결합할 수 있었지만, 서로 다른 평균 형광강도를 보였는데(도 4C), 이것은 TCR이 HLA-A2/hAFP158 복합체에 대해 서로 다른 친화력을 가질 수 있다는 것을 시사한다. 다른 한편, Vβ 사슬로 구성된 남아있는 34개의 T 세포 하이브리도마 중 4개는 항-Vβ8.3 항체로 염색될 수 없었다(데이터가 표시되지 않음).
실시예 5: 14개의 T 세포 하이브리도마로부터 9세트의 TCR α 및 β 사슬 유전자 쌍이 동정된다.
재료 및 방법
TCRα 및 β 사슬 유전자의 동정 : T 세포 하이브리도마에서 총 RNA를 단리시켰다. TCR α 및 β 사슬 유전자를 증폭시키기 위해 5- RACE 기술(Hong, Y., et al., Hepatology, 59:1448-1458 (2014))을 실행하였다. 올리고 dT 프라이머를 사용해 cDNA를 제작한 다음, cDNA의 5 말단에 PolyC를 부가하였다. 5' pGI 프라이머(CACCGGGIIGGGIIGGGIIGG)(서열번호 73)와 α 사슬(GGCATCACAGGGAACG)(서열번호 74) 또는 β 사슬 (CCAGAAGGTAGCAGAGACCC)(서열번호 75)의 불변(C) 영역에 상응하는 3' 프라이머를 사용해서 PCR을 수행하였다. 얻어진 TCR α 및 β 가변(V) 영역의 부분 서열을 기반으로, α (ATGAAATCCTTTAGTATTTCCC)(서열번호 76) 또는 β (ATGGGCTCCAGGCTCTTTCTG)(서열번호 77) 사슬의 V-영역에 상응하는 특이적 프라이머를 α C-영역(GCACATTGATTTGGGAGTC)(서열번호 78) 또는 β C-영역: (GGGTAGCCTTTTGTTTGTTTG)(서열번호 79)의 내부 프라이머와 V-영역을 증폭 및 검증하기 위해 함께 사용하였다. 최종적으로, TCR α 및 β 사슬의 서열을 획득하여 검증하였다.
결과
본 실험에서, HepG2 종양세포와 공동 배양 후 IL-2를 생산할 수 있는 14개의 하이브리도마로부터 TCRα 및 β 사슬 유전자 쌍을 증폭시켜 염기서열을 결정하였다. 표 1에 결과가 요약되었다. 14개의 하이브리도마 중에서, 9개의 고유한 TCR 유전자 세트를 동정하였다. TCR2(클론 1G8)와 TCR4(클론 2F6)의 서열이 일치하였고, 따라서 TCR3(클론 10A3)과 TCR5(클론 6D9) 서열이 일치했다. TCR6(클론 5B3), TCR7(클론 5B10) 및 TCR13(클론 11B10)이 일치하였고, 따라서 TCR38(클론 2C3)과 TCR39(클론 3E4)가 일치했다. 이어서, TCR1-3, 6, 8, 10, 11, 17 및 38의 α 및 β 사슬의 아미노산 서열을 NCBI 및 IMGT 데이터뱅크에서 비교하였다. 서열 데이터는, 9개의 TCR α 사슬 모두가 동일한 가변 영역(TRAV7D-2)을 가졌고 TCR β 사슬 또한 동일한 가변 영역(TRBV13-1)을 공유한 것을 나타내었는데, 이는 항-Vβ8.3 항체 염색 데이터와 일치한다(도 16). 세부 분석으로 TCR1과 TCR2 서열이 매우 유사하다는 것이 밝혀졌다. TCR1과 TCR2의 β 사슬은 동일하고 TCR1과 TCR2의 α 사슬은 V-J 접합부에서 2개의 아미노산만 달랐다. 다른 한편, TCR3은 TCR1 및 TCR2보다 더 일치하지 않는다. TCR3의 β 사슬이 TCR1 및 TCR2와는 단지 하나의 아미노산이 다르지만, α 사슬의 J 영역은 상이한 J 유전자에 의해 암호화된다. TCR1과 TCR2 α 사슬의 J 유전자는 TRAJ30이지만, TCR3 α 사슬 J 유전자는 TRAJ12이다.
여기서 동정된 9개의 TCR 유전자에서의 모든 아미노산 차이는 CDR3 영역의 α 사슬(도 17A) 및 β 사슬(도 17B)에서도 발견된다.
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표 1. 14개의 TCR 알파 및 베타 사슬 쌍이 요약되어 있다. TCR4와 TCR2는 일치한다. TCR5와 TCR3은 일치한다. TCR6, TCR7 및 TCR13은 일치한다. TCR38과 TCR39는 일치한다.
1. TCRA-1과 TCRA-2의 단백질 서열은 V-J 접합부에서 2개의 아미노산 차이를 갖는다.
2. TCRA-3는 TCRA-1 및 TCRA-2와 유의하게 상이하다. 실제로, TCRA-3의 J 영역은 TCRA-1 및 TCRA-2와는 전체적으로 상이하다.
3. TCRB-1과 TCRB-2의 단백질 서열은 일치한다.
4. TCRB-3과 TCRB-1의 단백질 서열은, V-D 접합부 사이에 세린(116S)이 알라닌(116A)으로 치환된 하나의 아미노산을 제외하고 일치한다.
5. TCRB V-J 사이의 D 영역은 데이터뱅크에 있는 임의의 서열에 대해 명백한 상동성을 보이지 않는 9개의 뉴클레오타이드이다.
실시예 6: 인간 1차 T 세포에서 TCR α 및 β 사슬 유전자 쌍의 발현은 Tet158 사량체에 결합하는 기능적인 TCR을 형성한다.
재료 및 방법
TCR 유전자 및 재조합 lv : TCR α 및 β 사슬 유전자를 설계하고 위에서 동정된 V-D-J 영역 및 C-영역을 이용해서 합성하였다. α 사슬과 β 사슬 사이에서 α 사슬과 β 사슬을 분리하기 위해 P2A 서열(Cho, H.I., et al., Cancer Res, 69:9012-9019 (2009))이 삽입된다. 전체 유전자는 코돈 최적화한 다음 lv에 클로닝하였다.
인간 T 세포의 형질도입 : 인간 T 세포를 음성 선택으로 백혈구 연층으로부터 단리시켰다. 그 다음에, 재조합 lv로 형질도입하기 전에 세포를 활성화시키기 위해 CD3/CD28 사량체 항체 복합체(Stemcell Technologies, 밴쿠버 소재)를 2일 동안 첨가했다.
결과
이 실험에서 hAFP-특이적 TCR 유전자가 TCR 전용 T 세포(TCR-T)를 제작하기 위해 인간 T 세포를 조작할 수 있었는지와 그러한 TCR-T 세포가 hAFP+ 종양세포를 특이적으로 인지하고 사멸할 수 있는 능력을 획득했는지를 조사하였다. 이를 위해, 3개의 TCR 유전자(TCR1, TCR2 및 TCR3)를 합성하고 lv에 클로닝하였다. 표적 T 세포에서 TCR α 및 β 유전자 사이에 동일한 수의 TCR α 및 β 사슬을 생성하기 위해 P2A 서열을 삽입하였다(도 5A). 발현 후에 TCR α 및 β 사슬 유전자가 기능적인 TCR을 형성하는지 연구하기 위해, TCR-lv를 주르카트 세포에 형질 도입시키고, TCR 유전자 3세트 중 임의의 것의 유전자 전이시키면 주르카트 세포가 Tet158 사량체에 효과적으로 결합할 수 있는 능력을 부여할 수 있었었는데, 이것은 주르카트 세포에 TCR 유전자를 발현시키면 기능적인 TCR을 형성할 수 있다는 것을 의미한다(도 5B). 그 다음에, TCR 유전자가 HLA-A2/hAFP158 복합체를 인지하기 위해 전용해서 인간 1차 T 세포를 조작할 수 있었는지를 연구하였다. 첫째, 건강한 기증자의 인간 T 세포는 CD3/CD28 활성화 후에 재조합 lv에 의해 효과적으로 형질도입되었다. GFP를 리포터 단백질로서 사용하여, 대략 60%의 인간 T 세포가 10 MOI에서 GFP-lv로 형질 도입되었다(도 12). 그 다음에, 인간 1차 T 세포에 TCR 유전자를 형질 도입시키면 이들 중 대략 20 내지 30%가 Tet158 사량체에 효과적으로 결합할 수 있었다(도 5C). 서로 다른 기증자의 T 세포는 서로 다른 효능으로 형질 도입될 수 있지만, 3세트의 TCR 유전자 사이에 유의한 형질도입 차이는 없었다. 하지만, Tet158 사량체의 평균 형광강도(MFI)는 CR1 및 TCR2 형질도입된 세포보다 TCR3 유전자 형질도입된 CD8 및 CD4 T 세포에서 일정하게 높았는데, 이것은 TCR3이 HLA-A2/hAFP158에 대해서 더 높은 친화도를 가질 수 있음을 시사하며, 이는 하이브리도마 세포에 대한 Tet158 사량체 염색 데이터와 일치한다(도 4C). CD8 및 CD4 TCR-T 세포는 둘 다 Tet158 사량체에 결합할 수 있었는데, 이것은 HLA-A2/hAFP158에 대한 TCR 결합이 CD8과는 독립적이라는 것을 의미한다. 하지만, CD8 TCR-T에 대한 Tet158 염색 MFI는 언제나 CD4 TCR-T 세포에 대한 것보다 높았는데(도 5D), 이것은 CD8 도움이 HLA-A2/hAFP158 복합체에 대한 TCR 결합을 강화시킴을 의미한다. 또한, TCR-T 세포는 항-TCR Vβ 8.3 또는 Tet158 사량체로 염색되었다. Tet158 사량체+ 세포의 백분율은 항-TCR Vβ8.3+ 세포의 백분율과 거의 일치했다(도 13).
실시예 7: hAFP158 펩타이드를 제시하는 HLA-A2가 인간 TCR-T 세포를 특이적으로 활성화시켰다.
재료 및 방법
TCR 유전자가 형질도입된 인간 T 세포를 HLA-A2+hAFP+ HepG2세포, HLA-A2+hAFP- HepG2 세포 또는 HLA-A2-hAFP+ 종양세포와 하룻밤 공동배양 후에 ELISA로 IFNγ를 검출하였다.
결과
hAFP158 펩타이드를 제시하는 HLA-A2가 인간 TCR-T 세포를 활성화시킬 수 있었는지 연구하기 위하여, hAFP158 펩타이드로 펄스화된 HLA-A2 마우스 비장세포로 자극시킨 후에 인간 TCR-T의 사이토카인 생산을 측정하였다. hAFP158 펩타이드로 펄스화된 HLA-A2 세포가 IFNγ를 생산하도록 인간 TCR-T 세포를 특이적으로 자극시킬 수 있었다. 이와 대조적으로, 인플루엔자 바이러스 M1 펩타이드로 자극시킨 후에 인간 TCR-T 배양에서 IFNγ가 검출되지 않았다. 모의 형질도입된 인간 T 세포는 hAFP158 펩타이드 자극에 반응하지 않았다(도 14A). IFNγ 생산은 주로 CD8 T 세포로부터였던 반면(도 14B), IL2는 또한 CD4 T 세포에 의해 생산되었다(도 14C). 그 다음에, 본 발명자들은 HLA-A2+ hAFP+ HepG2 종양세포가 IFNγ를 생산하도록 인간 TCR-T 세포를 활성화시킨 것을 확인하였다. 이와 대조적으로, HLA-A2+ hAFP- 또는 HLA-A2- hAFP+ 인간 종양세포는 TCR-T 세포를 활성화시킬 수 없었다(도 6A). 다시, IFNγ 생산은 주로 CD8 TCR-T 세포에서 생산되었다(도 6B). CD4(도 6C) 및 CD8(도 6B) TCR-T 세포 둘 다 IL-2를 생산할 수 있다. 재차, 3개의 TCR 사이에 유의한 차이는 없다. 또한, HepG2 종양세포에 의한 TCR- T 증식의 유도도 연구되었다. 본 발명자들은, HepG2 종양세포와 공동배양 후, 인간 TCR-T 세포, 특히 CD8 T 세포가 유의한 증식을 수행했음을 확인하였다(도 6D).
실시예 8: 인간 CD8 TCR-T 세포는 HLA-A2+ hAFP+ 종양세포에 대해 강하고 특이적인 세포독성을 갖는다.
재료 및 방법
사이토카인의 ELISA : IFNγ 및 IL-2의 ELISA를 제조업체(Biolegend, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)의 지침대로 실행하였다.
세포독성 검정 : 성장하는 HepG2 종양세포에 TCR-T 세포를 첨가하였다. LDH 검정을 사용하여 지침대로(Promega, 위스콘신주 매디슨 소재) 세포독성 검정을 실행하였다.
요오드화 프로디듐(PI) 염색 : 죽은 세포는 지침대로(BD Biosciences, 캘리포니아주 샌디에이고 소재) PI로 염색되었다.
결과
이 실험에서, 인간 TCR-T 세포의 세포독성 활성이 연구되었다. LDH 검정을 이용해서, 본 발명자들은, 우선 인간 TCR-T 세포가 5의 E/T비로 공동배양했을 때 24시간 내에 HepG2 종양세포의 80%를 효과적으로 사멸할 수 있었음을 밝혔다. 이와 대조적으로, TCR-T 세포는 AFP- 또는 HLA-A2 종양세포에 대해서 유의한 부작용을 생성하지 않았다(도 7A). HepG2 종양세포에 대한 세포독성은 용량 의존적이었다(도 7B). 0.5의 E/T비(Tet158+ 세포는 대략 30%이므로, 표적 세포에 대한 Tet158 사량체+ T 세포의 비는 단지 0.15였음)에서도, 24시간 공동배양 후에 50% 초과의 사멸이 있었다. 세포독성 검정을 수행하기 위해 정제된 CD8 및 CD4 T 세포를 사용해서, 본 발명자들은 HepG2 종양세포 사멸 활성이 주로 CD8 T 세포에서 유래된 것을 제시하였다(도 7C 내지 도 7E). 하지만, CD4 TCR-T 세포는 또한 세포독성 수준이 낮았으며, 1.5/1의 비에서 HepG2 종양세포의 15%의 특이적 사멸을 초래하였다(도 7E). 공동배양 24시간 후에, CD8 TCR-T 세포는 HepG2 종양세포를 둘러싸(유인될 수 있음) 클러스터를 형성하였다(도 7D). 다른 한편, CD4 TCR-T 및 모의-형질도입된 T 세포는 분명한 클러스터를 형성하지 않았다. 또한, PI 염색으로 클러스터 내의 대부분의 종양세포가 죽은 세포인 것으로 드러났다(도 7F). LDH 검정과 일치하여, 대부분의 세포독성 활성은 CD8 TCR-T 세포로부터 유래되었다. PI 염색으로 CD4 TCR-T 세포가 hepG2 종양세포에 대해 더 낮은 사멸 활성(15%)을 가졌던 것을 나타내었으며, 이는 LDH 검정과 일치한다. 모의-형질도입된 인간 T 세포는 HepG2 종양세포의 세포 사멸을 유도하지 않았다.
실시예 9: 인간 TCR-T의 입양 이식은 NSG 마우스에서 HepG2 종양에 대해 항종양 효과를 발생시킨다.
재료 및 방법
인간 TCR-T의 생체 내 항종양 효과를 연구하기 위해, 4일 동안 HepG2 종양을 보유하고 있는 NSG 마우스에 2천만개의 인간 TCR-T 세포를 입양 이식하였다. 길이, 폭 및 높이를 측정함으로써 종양 성장을 모니터링하였다. 종양 부피는 ½(길이×폭×높이)로 계산되었다.
결과:
이 실험에서, 인간 TCR-T 세포의 체내 항암 효과가 연구되었다. 인간 1차 T 세포는 lv로 형질 도입되었고, 전체 T 세포의 대략 40%(CD8 T 세포의 25% 및 CD4 T 세포의 54%)는 입양 이식 전에 Tet158 + TCR-T 세포였다(도 11A). 본 발명자들은, 인간 TCR-T 세포의 입양 이식이 NSG 마우스에서 HpeG2 종양 성장을 억제할 수 있었던 것을 발견하였다(도 11B). TCR-T 처리된 마우스 중 한 마리에서 종양이 발생했지만, 종양은 입양 이식 후 3주 후에 제거되었다(도 11C 내지 도 11D). 이식된 인간 T 세포의 동역학은 모의-T 및 TCR-T 세포 둘 다 인간 IL-2가 없을 때 대략 3 내지 4주 동안 생존한 것으로 나타내었다(도 11E). 하지만, 모의-T 세포와 비교해서, TCR-T 중 Tet158+ 세포, 특히 이식 후 8일째 CD4 TCR-T 세포의 백분율의 유의한 증가가 있었는데(도 11F), 이것은 항원-유도 TCR-T 확장일 수도 있음을 시사한다.
SEQUENCE LISTING <110> Augusta University Research Institute, Inc <120> Human Alpha Fetoprotein-Specific T Cell Receptors and Uses Thereof <130> WO/2018/208553 <140> PCT/US2018/030637 <141> 2018-05-02 <150> US 62/505,406 <151> 2017-05-12 <150> US 62/609,614 <151> 2017-12-22 <150> US 62/625,051 <151> 2018-02-01 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Met Asn Lys Phe Ile Tyr Glu Ile 1 5 <210> 2 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Met Lys Ser Phe Ser Ile Ser Leu Val Val Leu Trp Leu Gln Leu Asn 1 5 10 15 Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile 20 25 30 Val Pro Glu Gly Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg 35 40 45 Asn Val Asp Tyr Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Lys Met Leu Met Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg 65 70 75 80 Phe Thr Val His Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile 85 90 95 Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser 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ttctggcaca atcctcgaaa ccacttccgc 1560 tgccaagtgc agttccatgg gctttcagag gaggacaagt ggccagaggg ctcacccaaa 1620 cctgtcacac agaacatcag tgcagaggcc tggggccgag cagactgtgg gattacctca 1680 gcatcctatc aacaaggggt cttgtctgcc accatcctct atgagatcct gctagggaaa 1740 gccaccctgt atgctgtgct tgtcagtaca ctggtggtga tggctatggt caaaagaaag 1800 aattcatga 1809 <210> 71 <211> 1809 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 71 atgaaatcct ttagtatttc cctagtggtc ctgtggcttc agctaaactg ggtgaacagc 60 caacagaagg tgcagcagag cccagaatcc ctcattgttc cagagggagg catggcctct 120 ctcaactgca cttccagtga tcgtaatgtt gactacttct ggtggtacag acagcactct 180 gggaaaagcc ccaagatgct gatgtctatc ttctccaatg gtgaaaagga agaaggcaga 240 ttcacagttc acctcaataa agccagcctg catacttccc tgcacatcag agactcccag 300 cccagtgact ctgctctcta cctctgtgca gcaaccctga ctggaggcta taaagtggtc 360 tttggaagtg ggactcgatt gctggtaagc cctgacatcc agaacccaga acctgctgtg 420 taccagttaa aagatcctcg gtctcaggac agcaccctct gcctgttcac cgactttgac 480 tcccaaatca atgtgccgaa aaccatggaa tctggaacgt tcatcactga caaaactgtg 540 ctggacatga aagctatgga ttccaagagc aatggggcca ttgcctggag caaccagaca 600 agcttcacct gccaagatat cttcaaagag accaacgcca cctaccccag ttcagacgtt 660 ccctgtgatg ccacgttgac tgagaaaagc tttgaaacag atatgaacct aaactttcaa 720 aacctgtcag ttatgggact ccgaatcctc ctgctgaaag tagccggatt taacctgctc 780 atgacgctga ggctgtggtc cagtggcagc agagccaaga gaagcggatc cggcgccacc 840 aacttcagcc tgctgaagca ggccggcgac gtggaggaaa accctggccc taggatgggc 900 tccaggctct ttctggtctt gagcctcctg tgtacaaaac acatggaggc tgcagtcacc 960 caaagcccta gaaacaaggt gacagtaaca ggaggaaacg tgacattgag ctgtcgccag 1020 actaatagcc acaactacat gtactggtat cggcaggaca ctgggcatgg gctgaggctg 1080 atccattact catatggtgc tggcaacctt caaataggag atgtccctga tgggtacaag 1140 gccaccagaa caacgcaaga agacttcttc ctcctgctgg aattggcttc tccctctcag 1200 acatctttgt acttctgtgc cagcagtgat gctgggacta gtcaaaacac cttgtacttt 1260 ggtgcgggca cccgactatc ggtgctagag gatctgagaa atgtgactcc acccaaggtc 1320 tccttgtttg agccatcaaa agcagagatt gcaaacaaac gaaaggctac cctcgtgtgc 1380 ttggccaggg gcttcttccc tgaccacgtg gagctgagct ggtgggtgaa tggcaaggag 1440 gtccacagtg gggtcagcac ggaccctcag gcctacaagg agagcaatta tagctactgc 1500 ctgagcagcc gcctgagggt ctctgctacc ttctggcaca atcctcgaaa ccacttccgc 1560 tgccaagtgc agttccatgg gctttcagag gaggacaagt ggccagaggg ctcacccaaa 1620 cctgtcacac agaacatcag tgcagaggcc tggggccgag cagactgtgg gattacctca 1680 gcatcctatc aacaaggggt cttgtctgcc accatcctct atgagatcct gctagggaaa 1740 gccaccctgt atgctgtgct tgtcagtaca ctggtggtga tggctatggt caaaagaaag 1800 aattcatga 1809 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 72 Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> n= I <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n= I <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n= I <400> 73 caccgggnng ggnngggnng g 21 <210> 74 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 74 ggcatcacag ggaacg 16 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 75 ccagaaggta gcagagaccc 20 <210> 76 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 76 atgaaatcct ttagtatttc cc 22 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 77 atgggctcca ggctctttct g 21 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 78 gcacattgat ttgggagtc 19 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 79 gggtagcctt ttgtttgttt g 21 <210> 80 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 80 Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met 35 40 45 Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg Phe Thr Val His 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Ile Thr Asn Ala 85 90 95 Tyr Lys Val Ile Phe Gly Lys Gly Thr His Leu His Val Leu Pro Asn 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Glu 115 <210> 81 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 81 Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met 35 40 45 Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg Phe Thr Val His 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Thr Val Asn Ala 85 90 95 Tyr Lys Val Ile Phe Gly Lys Gly Thr His Leu His Val Leu Pro Asn 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Glu 115 <210> 82 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 82 Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met 35 40 45 Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg Phe Thr Val His 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Met Ile Asn Ala 85 90 95 Tyr Lys Val Ile Phe Gly Lys Gly Thr His Leu His Val Leu Pro Asn 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Glu 115 <210> 83 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 83 Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met 35 40 45 Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg Phe Thr Val His 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Met Ala Gly Gly 85 90 95 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Glu 115 <210> 84 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 84 Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met 35 40 45 Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg Phe Thr Val His 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Ile Ser Gly Gly 85 90 95 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Glu 115 <210> 85 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 85 Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met 35 40 45 Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg Phe Thr Val His 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Ile Val Gly Gly 85 90 95 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Glu 115 <210> 86 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 86 Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met 35 40 45 Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg Phe Thr Val His 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Lys Thr Gly Gly 85 90 95 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Glu 115 <210> 87 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 87 Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met 35 40 45 Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg Phe Thr Val His 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Met Thr Gly Gly 85 90 95 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Glu 115 <210> 88 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 88 Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu Met 35 40 45 Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg Phe Thr Val His 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Thr Leu Thr Gly Gly 85 90 95 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Glu 115 <210> 89 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 89 Glu Ala Ala Val Thr Gln Ser Pro Arg Asn Lys Val Thr Val Thr Gly 1 5 10 15 Gly Asn Val Thr Leu Ser Cys Arg Gln Thr Asn Ser His Asn Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Thr Gly His Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr 35 40 45 Ser Tyr Gly Ala Gly Asn Leu Gln Ile Gly Asp Val Pro Asp Gly Tyr 50 55 60 Lys Ala Thr Arg Thr Thr Gln Glu Asp Phe Phe Leu Leu Leu Glu Leu 65 70 75 80 Ala Ser Pro Ser Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala 85 90 95 Gly Thr Ser Gln Asn Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Ser 100 105 110 Val Leu <210> 90 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 90 Glu Ala Ala Val Thr Gln Ser Pro Arg Asn Lys Val Thr Val Thr Gly 1 5 10 15 Gly Asn Val Thr Leu Ser Cys Arg Gln Thr Asn Ser His Asn Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Thr Gly His Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr 35 40 45 Ser Tyr Gly Ala Gly Asn Leu Gln Ile Gly Asp Val Pro Asp Gly Tyr 50 55 60 Lys Ala Thr Arg Thr Thr Gln Glu Asp Phe Phe Leu Leu Leu Glu Leu 65 70 75 80 Ala Ser Pro Ser Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala 85 90 95 Gly Val Ser Gln Asn Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Ser 100 105 110 Val Leu <210> 91 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 91 Glu Ala Ala Val Thr Gln Ser Pro Arg Asn Lys Val Thr Val Thr Gly 1 5 10 15 Gly Asn Val Thr Leu Ser Cys Arg Gln Thr Asn Ser His Asn Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Thr Gly His Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr 35 40 45 Ser Tyr Gly Ala Gly Asn Leu Gln Ile Gly Asp Val Pro Asp Gly Tyr 50 55 60 Lys Ala Thr Arg Thr Thr Gln Glu Asp Phe Phe Leu Leu Leu Glu Leu 65 70 75 80 Ala Ser Pro Ser Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala 85 90 95 Gly Thr Ala Gln Asn Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Ser 100 105 110 Val Leu <210> 92 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 92 Glu Ala Ala Val Thr Gln Ser Pro Arg Asn Lys Val Thr Val Thr Gly 1 5 10 15 Gly Asn Val Thr Leu Ser Cys Arg Gln Thr Asn Ser His Asn Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Thr Gly His Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr 35 40 45 Ser Tyr Gly Ala Gly Asn Leu Gln Ile Gly Asp Val Pro Asp Gly Tyr 50 55 60 Lys Ala Thr Arg Thr Thr Gln Glu Asp Phe Phe Leu Leu Leu Glu Leu 65 70 75 80 Ala Ser Pro Ser Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp His 85 90 95 Gly Thr Gly Gln Asn Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Ser 100 105 110 Val Leu <210> 93 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 93 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Ile Thr Asn Ala 1 5 10 15 Tyr Lys Val Ile Phe Gly Lys Gly Thr His Leu His Val Leu Pro Asn 20 25 30 Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val 35 40 <210> 94 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 94 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Thr Val Asn Ala 1 5 10 15 Tyr Lys Val Ile Phe Gly Lys Gly Thr His Leu His Val Leu Pro Asn 20 25 30 Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val 35 40 <210> 95 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 95 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Met Ile Asn Ala 1 5 10 15 Tyr Lys Val Ile Phe Gly Lys Gly Thr His Leu His Val Leu Pro Asn 20 25 30 Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val 35 40 <210> 96 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 96 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Met Ala Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 20 25 30 Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val 35 40 <210> 97 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 97 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Ile Ser Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 20 25 30 Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val 35 40 <210> 98 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 98 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Ile Val Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 20 25 30 Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val 35 40 <210> 99 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 99 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Lys Thr Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 20 25 30 Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val 35 40 <210> 100 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 100 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Met Thr Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 20 25 30 Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val 35 40 <210> 101 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 101 Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Thr Leu Thr Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Lys Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asp 20 25 30 Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val 35 40 <210> 102 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 102 Ser Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala Gly Thr Ser 1 5 10 15 Gln Asn Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Ser Val Leu Glu 20 25 30 Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro 35 40 <210> 103 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 103 Ser Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala Gly Val Ser 1 5 10 15 Gln Asn Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Ser Val Leu Glu 20 25 30 Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro 35 40 <210> 104 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 104 Ser Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala Gly Thr Ala 1 5 10 15 Gln Asn Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Ser Val Leu Glu 20 25 30 Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro 35 40 <210> 105 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 105 Ser Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp His Gly Thr Gly 1 5 10 15 Gln Asn Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Ser Val Leu Glu 20 25 30 Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro 35 40

Claims (38)

  1. 조작된(engineered) 쥣과 T 세포 수용체(murine T cell receptor: mTCR) Vα 사슬 폴리펩타이드로서,
    서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하되, 상기 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는, 조작된 mTCR Vα 사슬 폴리펩타이드.
  2. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR) Vβ 사슬 폴리펩타이드로서,
    서열번호 11, 12, 13 또는 14와 적어도 90% 서열 동일성을 포함하되, 상기 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는, 조작된 mTCR Vβ 사슬 폴리펩타이드.
  3. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR) 전장 α 사슬 폴리펩타이드로서,
    서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하되, 상기 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는, 조작된 mTCR 전장 α 사슬 폴리펩타이드.
  4. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR) 전장 β 사슬 폴리펩타이드로서,
    서열번호 24, 25, 26 또는 27과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하되, 상기 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는, 조작된 mTCR 전장 β 사슬 폴리펩타이드.
  5. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR) α 사슬 폴리펩타이드로서,
    서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 CDR3 영역을 포함하되, 상기 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는, 조작된 mTCR 전장 α 사슬 폴리펩타이드.
  6. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR) β 사슬 폴리펩타이드로서,
    서열번호 37, 38, 39 또는 40과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 CDR3 영역을 포함하되, 상기 mTCR은 hAFP158(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는, 조작된 mTCR 전장 β 사슬 폴리펩타이드.
  7. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)로서,
    a) 서열번호 2와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 28과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vα 도메인; 및
    b) 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vβ 도메인
    을 포함하는, 조작된 mTCR.
  8. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)로서,
    a) 서열번호 3과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 29와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vα 도메인; 및
    b) 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vβ 도메인
    을 포함하는, 조작된 mTCR.
  9. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)로서,
    a) 서열번호 4와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 30과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vα 도메인; 및
    b) 서열번호 12와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 38과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vβ 도메인
    을 포함하는, 조작된 mTCR.
  10. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)로서,
    a) 서열번호 5와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 31과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vα 도메인; 및
    b) 서열번호 13과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 39와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vβ 도메인
    을 포함하는, 조작된 mTCR.
  11. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)로서,
    a) 서열번호 6과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 32와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vα 도메인; 및
    b) 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vβ 도메인
    을 포함하는, 조작된 mTCR.
  12. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)로서,
    a) 서열번호 7과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 33과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vα 도메인; 및
    b) 서열번호 14와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 40과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vβ 도메인
    을 포함하는, 조작된 mTCR.
  13. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)로서,
    a) 서열번호 8과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 34와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vα 도메인; 및
    b) 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vβ 도메인
    을 포함하는, 조작된 mTCR.
  14. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)로서,
    a) 서열번호 9와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 35와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vα 도메인; 및
    b) 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vβ 도메인
    을 포함하는, 조작된 mTCR.
  15. 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)로서,
    a) 서열번호 10과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vα 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 36과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vα 도메인; 및
    b) 서열번호 11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 Vβ 도메인으로서, CDR3 영역은 서열번호 37과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 Vβ 도메인
    을 포함하는, 조작된 mTCR.
  16. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항의 조작된 쥣과 T 세포 수용체(mTCR)로서, 상기 mTCR은 인간화되는, 조작된 mTCR.
  17. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항의 mTCR을 발현하도록 조작된 T 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 T 세포는 인간 세포인, T 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 T 세포는 자가세포인, T 세포.
  20. 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23의 Q21 내지 L242를 포함하는 가용성 mTCR α 사슬.
  21. 서열번호 50, 51, 52 또는 53, 또는 서열번호 24, 25, 26 또는 27의 E18 내지 Y276을 포함하는, 조작된 mTCR β 사슬의 세포외 도메인.
  22. 서열번호 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 또는 62와 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 융합 단백질.
  23. 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 또는 71과 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 핵산.
  24. 비천연유래(non-naturally occurring) hAFP158 에피토프-특이적 쥣과 T 세포 수용체로서,
    a). 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 21 내지 132번 아미노산 잔기와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 α 사슬 가변 도메인(Vα)
    b). 서열번호 11, 12, 13 및 14의 14 내지 131번 아미노산 잔기와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 β 사슬 가변 도메인(Vβ)
    을 포함하는, 비천연유래 hAFP158 에피토프-특이적 쥣과 T 세포 수용체.
  25. 융합 단백질로서,
    서열번호 11, 12, 13 또는 14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩타이드에 연결된 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 단백질.
  26. 융합 단백질로서,
    서열번호 24, 25, 26 또는 27로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩타이드에 연결된 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 단백질.
  27. 서열번호 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 또는 71로 암호화된 mTCR을 발현하도록 조작된 T 세포.
  28. 제27항에 있어서, 상기 T 세포는 인간 세포인, T 세포.
  29. 하이브리도마로서,
    TCR α 사슬 및 β 사슬이 결여된 기증자 세포(donor cell)에 융합된 CD8+Tet158+ 세포를 포함하는, 하이브리도마.
  30. 제29항에 있어서, 상기 하이브리도마는 hAFP+ 종양세포에 반응하는, 하이브리도마.
  31. 제29항에 있어서, 상기 하이브리도마는 IL-2를 분비하는, 하이브리도마.
  32. 융합 단백질로서,
    서열번호 11, 12, 13 또는 27로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제2 폴리펩타이드에 연결된 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 제1 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 융합 단백질은 단일 사슬 항-CD3 항체에 연결되어 있는, 융합 단백질.
  33. 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서,
    제7항 내지 제16항 중 어느 한 항의 mTCR을 발현하도록 인간 T 세포를 유전자 조작하는 단계 및 조작된 상기 T 세포를 상기 대상체에서 종양 부담을 저감시키는데 유효한 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 종양은 간세포 암종인, 종양을 치료하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 T 세포는 자가 T 세포인, 종양을 치료하는 방법.
  36. 제1항 내지 제15항 및 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지를 더 포함하는, 폴리펩타이드 또는 단백질.
  37. 간세포 암종을 검출하는 방법으로서,
    제36항의 폴리펩타이드 또는 단백질을 세포의 샘플에 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 상기 세포에 대한 특이적 결합은 간세포 암종 세포를 나타내는, 간세포 암종을 검출하는 방법.
  38. 제1항 내지 제6항 및 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 것이 있는 항체 또는 항원 결합 단편.
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