CN105802909B - 具有her2特异性tcr的t细胞制备物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含CD8⁺T细胞的细胞制备物。本发明还提供制备包含修饰的CD8⁺T细胞的细胞制备物的方法，以及本发明的细胞制备物在治疗HER2阳性肿瘤的用途。

Description

具有HER2特异性TCR的T细胞制备物及其用途

技术领域

本发明涉及免疫学领域，并具体涉及特异性识别表达HER2的肿瘤的细胞制备物、其制备方法及其用途。

背景技术

T细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。然而，在肿瘤患者体内，局部的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)含量很少，其获取和体外扩增比较困难，且CTL的亲和力低，限制了其在肿瘤的临床治疗中的应用。T细胞过继转移是近年来获得较高关注的特异性、无毒性的抗肿瘤方法，对于血液性和实体肿瘤的治疗具有一定效果。在T细胞过继转移中，T细胞受体(TCR)基因转移是一种发展迅速的免疫治疗方法。TCR基因转移技术是从肿瘤反应性T细胞中克隆TCR的α和β链，通过基因工程技术，以逆转录病毒或慢病毒作为载体，对初始T细胞进行抗原特异性TCR修饰，从而赋予T细胞特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力，并提高T细胞与肿瘤的亲和力。利用TCR基因转移技术对患者自体的来源地T细胞进行TCR基因修饰，经体外扩增，获取大量具有特异高效识别能力的T细胞，再过继回输给肿瘤患者，使之在体内发挥抗肿瘤作用。

在T细胞中，TCR-α和TCR-β链形成异源二聚体，并与CD3结合形成在T细胞表面稳定存在的复合体，从而能够识别主要组织相容性复合体(MHC)和抗原肽。因此，在TCR基因转移技术中存在一个关键性的技术问题，即TCR的α和β链配对问题。

人类表皮生长因子受体2(HER2)是EGFR家族成员，属I型跨膜酪氨酸蛋白激酶。HER2高表达于多种实体肿瘤，因此可作为肿瘤治疗的靶点。研究发现，HER2抗原肽致敏的抗原递呈细胞可在体内诱导出HER2特异性的CTL细胞，发挥杀伤肿瘤的效应。因此，可以克隆和筛选出HER2高反应性的TCR的α和β链基因，制备HER2特异性TCR修饰的T细胞，靶向治疗癌症。

发明内容

本发明提供包含CD8⁺T细胞的细胞制备物，所述CD8⁺T细胞具有由α和β链组成的TCR，所述α链由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成，且所述β链由SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成，或所述α链由SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列组成，且所述β链由SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列组成。优选地，所述α链由SEQ ID NO:1所编码，且所述β链由SEQ IDNO:7所编码；或所述α链由SEQ ID NO:3所编码，且所述β链由SEQ ID NO:18所编码。

本发明还提供制备包含修饰的CD8⁺T细胞的细胞制备物的方法，其包括用至少一种载体转化包含CD8⁺T细胞的分离的细胞群，其中，所述载体包含编码分别由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17所示的TCRα链和β链的氨基酸序列的核苷酸序列，或所述载体包含编码分别由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:18所示的TCRα链和β链的氨基酸序列的核苷酸序列在所述T细胞中表达，并且，所述修饰的CD8⁺T细胞表达由所述α链和β链组成的TCR。优选地，所述α链由SEQ ID NO:1所编码，且所述β链由SEQ ID NO:7所编码；或所述α链由SEQ ID NO:3所编码，且所述β链由SEQ ID NO:8所编码。

在本发明的优选实施方式中，所述细胞群包含富集的CD8⁺T细胞。

在本发明的更优选实施方式中，所述载体是慢病毒载体。

在本发明进一步的优选实施方式中，所述方法进一步包括体外扩增所述修饰的CD8⁺T细胞。

本发明还提供包含修饰的CD8⁺T细胞的细胞制备物，其根据上述本发明的方法制备。

本发明还提供上述本发明的制备物在制备用于治疗患有HER2阳性癌症的患者的药物中的用途。优选地，所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、***癌和高度恶性子宫癌。

本发明还提供分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

本发明还提供真核表达载体，其包含本发明的多核苷酸。

附图说明

图1：HER2/neu(689)抗原肽诱导的特异性CTL的流式细胞仪检测结果。

图2：HER2/neu(689)特异性CTL靶向杀伤肿瘤细胞检测。

图中A是HER2/neu(689)特异性CTL与肿瘤细胞共培养后上清中IFN-γ的含量检测，B是HER2/neu(689)特异性CTL对肿瘤杀伤能力检测。

图3：HER2特异性TCR的α和β链的膜表达检测。

图4：HER2-TCR-T细胞结合抗原肽检测结果。

图5：pLenti6.3_MCS-IRES2-EGFP慢病毒载体图谱。

图6：以流式细胞仪检测HER2-TCR慢病毒感染CD8⁺T的效率的结果。

图7：HER2-TCR慢病毒转染的CD8⁺T与肿瘤细胞共培养后，ELISA检测分泌IFN-γ的结果，其中纵坐标轴为细胞培养上清中IFN-γ的浓度。阴性对照组代表未加肿瘤细胞组。

图8：检测HER2-TCR-T细胞对HER2阳性的肿瘤细胞生长的抑制作用。

图中E:T表示CD8⁺T细胞与McF7细胞的细胞数的比；CFSE Low(％)表示CFSE低标记的细胞所占的比例；control表示以未改造的慢病毒转染的PBMC组。

图9：检测HER2-TCR-T细胞对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤。

图中E:T表示CD8⁺T细胞与McF7细胞的细胞数的比；control表示未改造的慢病毒转染的PBMC组。

图10：过继回输HER2-TCR-T细胞对HER2阳性的肿瘤细胞抑制作用。

发明详述

在抗肿瘤免疫中，T细胞发挥重要作用。然而，天然存在的特异性CTL含量很少，并且CTL亲和力低。T细胞受体(TCR)基因转移技术可以赋予T细胞特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力，并提高T细胞与肿瘤的亲和力。

TCR基因转移技术是从肿瘤反应性T细胞中克隆TCR，通过基因工程技术修饰T细胞。TCR分为TCR1和TCR2，TCR1由γ和δ两条链组成，TCR2由α和β两条链组成。外周血中，90％-95％的T细胞表达TCR2；而且任一个T细胞只表达TCR2和TCR1之一。

人类表皮生长因子受体2(HER2)在多种实体肿瘤中高表达，例如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、***癌和高度恶性子宫癌等。靶向HER2可以使T细胞特异性识别HER2阳性的肿瘤，有利于对肿瘤的治疗。

本发明筛选对HER2高反应性的TCR，并对T细胞进行修饰，制备HER2特异性TCR基因修饰T细胞，靶向治疗HER2阳性的肿瘤。

发明人克隆了4种编码TCR的α链的核苷酸，其序列分别如SEQ ID NO:1-4所示；发明人还克隆了4种编码TCR的β链的核苷酸，其序列分别如SEQ ID NO:5-8所示。

在本发明的具体实施方式中，使用TCR基因转移技术修饰CD8⁺T细胞，修饰的CD8⁺T细胞具有由选自SEQ ID NO:1-4的核苷酸序列所编码的α链和由选自SEQ ID NO:5-8的核苷酸序列所编码的β链，并且所述α和β链组成完整的TCR。

发明人发现，其中SEQ ID NO:11所示的α链和SEQ ID NO:17所示的β链配对，以及SEQ ID NO:13所示的α链和SEQ ID NO:18所示的β链配对所形成的TCR对HER2的反应性显著高于其它TCR。在本发明的一个具体实施方式中，提供具有由α和β链组成的TCR的CD8⁺T细胞，其中，所述α和β链分别是SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或者，所述α和β链分别是SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。优选地，所述α链由SEQ IDNO:1所编码，且所述β链由SEQ ID NO:7所编码；或所述α链由SEQ ID NO:3所编码，且所述β链由SEQ ID NO:18所编码。

在本发明的一些具体实施方式中，提供制备包含修饰的CD8⁺T细胞的细胞制备物的方法，用至少一个载体转化分离的包含CD8⁺T细胞的细胞群，其中，所述载体包含编码分别由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17所示的TCRα链和β链的氨基酸序列的核苷酸序列，或所述载体包含编码分别由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:18所示的TCRα链和β链的氨基酸序列的核苷酸序列在所述T细胞中表达，并且，所述修饰的CD8⁺T细胞表达由所述α链和β链组成的TCR。优选地，所述α链由SEQ ID NO:1所编码，且所述β链由SEQ ID NO:7所编码；或所述α链由SEQ ID NO:3所编码，且所述β链由SEQ ID NO:8所编码。优选地，所述细胞群包含富集的CD8⁺T细胞。更优选地，所述载体是慢病毒载体。进一步优选地，体外扩增修饰的CD8⁺T细胞。在本发明的一些具体实施方式中，用上述方法制备包含修饰的CD8⁺T细胞的细胞制备物。

在本发明的一些具体实施方式中，使用本发明的细胞制备物治疗患有HER2阳性的癌症的患者。优选地，使用本发明的细胞制备物治疗HER2阳性的乳腺癌、卵巢癌、胃癌、***癌和高度恶性子宫癌。

本发明以HER2特异性CTL细胞的cDNA为模板，利用5^，RACE-PCR技术克隆HER2抗原肽特异性TCR的α和β链基因，得到TCRα和β链基因各4种。以上述克隆的TCR的四种α链基因分别和四种β链基因配对，并从中筛选出对HER2具有较高反应性的两种TCR(即α和β链配对)。修饰CD8⁺T细胞，使其分别表达这两种TCR。本发明还通过体内和体外实验证明，本发明的修饰的CD8⁺T细胞对HER2阳性的肿瘤具有杀伤作用。

实施例

实施例1.诱导识别HER2/neu的特异性CTL

分离和体外培养HLA-A2.1小鼠(Jackson Lab)(A2小鼠)的树突状细胞(DC)，利用人HER2/neu(689)表位肽(RLLQETELV(SEQ ID NO:11)，称为RLL肽)及无关对照肽MP-5866对DC进行致敏。然后用细菌脂多糖(Sigma公司)(LPS)诱导，得到成熟的DC。取1×10⁶DC经尾静脉注射免疫A2小鼠。重复免疫3-4次(每周一次)后，取小鼠的脾脏和***，分离T细胞，利用表位肽特异性四聚体(ProImmune公司)和CD8荧光抗体(Invitrogen)共同标记淋巴细胞，并以FACSCalibur流式细胞仪(购自Becton Dickinson公司，型号：BD LSRII)检测双阳性的细胞，结果显示，成功诱导出具有RLL特异性的CTL，其中，RLL特异性的CTL在***中的比例高于脾脏(图1)。

用流式细胞仪分选出上述RLL特异性CTL，并进行体外功能实验。结果显示这群CTL细胞可靶向杀伤A2阳性的结肠癌细胞SW620细胞，对预先吸附RLL的SW620细胞显示出更强的杀伤活性；但对A2阴性的肺癌细胞MDA-MB-231无杀伤能力(图2)。

实施例2.克隆HER2/neu特异性TCR基因

以实施例1中分选出的HER2特异性的CTL细胞cDNA为模板，利用5’RACE-PCR技术克隆HER2抗原肽特异性TCRα和β链基因。基因特异性引物(GSP)：TCRα链GSP:aggagaagccccgcccctgccgt(SEQ ID NO:9，TM79.2℃)；TCRβ链GSP:cccaggcctctgcactgatgttc(SEQ ID NO:10，TM 73.7℃)。cDNA第一链和第二链的合成按照试剂盒(Clontec)说明书进行。

以如下方法合成第一链DNA(5’-RACE-Ready cDNA)：

1.将2μL 5×first Strand Buffer、1μL DTT(20μm)和1μL dNTP Mix(10μm)混合，得到总体积4μL的混合物A；

2.将1.0-2.75μL从HER2特异性CTL抽提的RNA和1μL 5，-CDSprimer A混合并加水至总体积3.75μL，混匀并离心，得到混合物B；

3.将混合物B置于72℃，3分钟，再置于42℃，2分钟，然后14000g离心10秒；

4.向混合物B中加1μL SMARTer IIA oligo，得到总体积为4.75μL的混合物C；

5.将4μL混合物A、4.75μL混合物C、0.25μL Rnase Inhibitor和1μL SMARTScriberReverse Transcriptase混合，置于42℃，90分钟，再置于70℃，10分钟，然后加入20μLTricine-EDTA-Buffer。

然后，扩增目的片段。扩增反应的体系为34.5μL PCR-Grade Water、5μL10×Advantage 2PCR Buffer、1μL dNTP Mix、1μL 50×Advantage 2Polymerase Mix、2.5μL5’-RACE-Ready cDNA、5μL UPM(10×)和1μL GSP(10μm)。扩增反应程序为：94℃30s，72℃3min，进行5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，进行5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，进行27个循环。

PCR产物经胶回收纯化后直接以T/A连接***pMD18-T载体(购自Takara，)，进行测序、同源比对并以IMGT软件分析出TCR的α和β链基因序列。共克隆了HER2/neu(689)特异性的TCR的四种α链基因(TCRα1-4)和四种β链基因(TCRβ1-4)。

实施例3.克隆的HER2/neu特异性TCR的α和β链基因表达模式分析

首先使用pcDNA3.1表达载体(Invitrogen公司)构建TCRα真核表达载体(Flag标签)和TCRβ真核表达载体(HA标签)，并以如下方法分别转染293T细胞：将293T细胞接种于6孔细胞培养板，在37℃，5％CO₂的条件下在细胞培养箱中培养过夜；将1μg TCRα-Flag质粒或1μg TCRβ-HA质粒溶于100μL的50nM NaCl溶液中，得到溶液I；将5-10μL JetPEI转染试剂(购自Polyplus公司)溶于100μL的50nM NaCl，得到溶液II，静置5分钟；将溶液I和II混合，在室温作用15分钟，随即将混合物加入待转染的细胞中，转染细胞48小时。

然后，用Focus^TMGlobal Fraction Kit(G-Biosciencesiosciences公司)分离转染的细胞的膜蛋白，并用BCA法定量蛋白质样品。取50μg蛋白质进行SDS-PAGE电泳并进行Western Blot检测，其中使用抗Flag、HA和GAPDH的抗体(Cell Signaling Technology，货号依次为#8146、#2367和#2118，来源依次为鼠源、鼠源和兔源)作为一抗，HRP抗鼠(Santacruz，货号sc-2748)和HRP抗兔(Santacruz，货号sc-2749)作为二抗。以Syngene BioImaging Systems(Frederick，MD)观察Western Blot检测的结果，发现四种TCRα基因和四种TCRβ基因均定位在细胞膜(如图3所示)。

实施例4.抗原肽结合分析

将TCRα真核表达载体之一和TCRβ真核表达载体之一共转染293T细胞，转染方法如实施例3中所述。转染的293T细胞与FITC标记的RLL肽(委托生工公司进行)共同温育4小时，用流式细胞仪检测与RLL肽的结合。结果发现表达TCRα1-TCRβ3及TCRα3-TCRβ4的293T细胞均显示出较强的与RLL肽结合的能力(如图4所示，其它组合的数据未显示)，说明TCRα1-TCRβ3及TCRα3-TCRβ4这两种组合显示出对RLL肽的高亲和力。实施例5.制备HER2特异性TCR修饰的T细胞

将HER2特异性的TCRα1或TCRα3基因***携带GFP编码基因的穿梭质粒pLenti6.3_MCS-IRES2-EGFP载体(图5)，将HER2特异性TCRβ3或TCRβ4的基因***携带DSRED编码基因的穿梭质粒pLenti6.3_MCS-IRES2-DSRED载体(其结构与图5的载体相似，只是DSRED替换EGFP)，构建相应的慢病毒载体，序列***在限制性酶切位点BamHI和AscI之间。

将293T细胞接种入10cm培养皿，过夜培养；用质粒包装***(Invitrogen)与病毒载体共转染，换液，继续培养2-3天，并收集病毒液；2000g离心10min以除去细胞及其碎片，并以0.45μm滤膜过滤上清液，获得病毒原液；将病毒超速离心浓缩100倍，测定病毒活性滴度为10⁹。所得病毒分别命名为TCRα1β3-lentvirus和TCRα3β4-lentivirus。上述工作是Invitrogen公司提供的商业化服务。

将这两种病毒分别转染从A2小鼠分离的CD8⁺T细胞，并用FACSCalibur流式细胞仪检测转染的细胞。结果显示，两种慢病毒转染CD8⁺T细胞各获得了HER2/neu-TCR-T细胞，转染中的病毒感染率高于50％(图6)。

实施例6.HER2/neu-TCR T细胞抗肿瘤功能的体外鉴定

首先，检测了HER2/neu-TCR-T细胞分泌杀伤性细胞因子的情况，发现实施例5中获得的两种HER2/neu-TCR-T细胞与HER2阳性的、A2阳性的乳腺癌细胞系McF7或卵巢癌细胞CAOV-3共同温育时，上清中可检测到较高水平IFN-γ；而与HER2阴性且A2阴性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞共同温育时，分泌的IFN-γ水平很低(图7)。

进一步，检测了HER2/neu-TCR-T细胞的肿瘤杀伤能力。用CFSE(sigma公司)标记McF7或MDA-MB-231细胞24小时；分别与两种HER2/neu-TCR-T细胞共孵育48小时；然后用流式细胞仪检测肿瘤细胞的增殖情况。结果显示两种HER2/neu-TCR-T细胞均可明显抑制McF7细胞的增殖(图8)，但对MDA-MB-231没有影响(数据未显示)。此外，体外杀伤功能实验显示两种HER2/neu2-TCR-T细胞均具有较强的杀伤HER2/neu2阳性的、A2阳性肿瘤的能力(图9)。

实施例7.HER2/neu-TCR-T细胞抗肿瘤功能的体内鉴定

首先，制备具有HER2阳性、A2阳性肿瘤的荷瘤小鼠膜型：培养McF7细胞，制备浓度2×10⁷细胞/ml的细胞悬液，将100μL细胞悬液(即2×10⁶个细胞)皮下接种于裸鼠右后腿外侧。每隔两日观测所述裸鼠，例如，接种部位有无感染、接种的肿瘤有无消退现象。用游标卡尺测量肿瘤的长径a和短径b，利用公式V＝a×b²/2计算肿瘤的体积。制备荷瘤小鼠的成功率高于70％。

当肿瘤长至3mm³后，尾静脉或腹腔注射体外扩增的两种HER2/neu-TCR-T细胞和对照T细胞(用未***TCR的慢病毒载体转染的CD8⁺T细胞)，其中，每只小鼠注射4×10⁶T细胞，每实验组5只小鼠。每周测量肿瘤大小和小鼠体重，并观察小鼠的存活情况；在过继回输第35天处死小鼠，剥离肿瘤，观测肿瘤大小。结果如图10所示，发现过继回输两种HER2/neu-TCR-T细胞均可显著抑制肿瘤的生长。从图10可以看出，HER2-TCRα3/β4-T细胞具有较强的抑瘤效应。这提示，过继回输HER2-TCR-T细胞具有抑制HER2阳性肿瘤生长的效果。以上结果说明HER2/neu-TCR-T细胞对HER2/neu2阳性的肿瘤具有杀伤功能，能够抑制肿瘤细胞的生长。

Claims (10)

1.一种包含CD8⁺T细胞的细胞制备物，所述CD8⁺T细胞具有由α和β链组成的TCR，其中

所述α链由SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成，且所述β链由SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成。

2.权利要求1的细胞制备物，其中

所述α链由SEQ ID NO:1所编码，且所述β链由SEQ ID NO:7所编码。

3.一种制备包含修饰的CD8⁺T细胞的细胞制备物的方法，其包括用至少一种载体转化包含CD8⁺T细胞的分离的细胞群，其中

所述载体包含编码分别由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17所示的TCRα链和β链的氨基酸序列的核苷酸序列，

并且，所述修饰的CD8⁺T细胞表达由所述α链和β链组成的TCR。

4.权利要求3的方法，其中

所述α链由SEQ ID NO:1所编码，且所述β链由SEQ ID NO:7所编码。

5.权利要求3或4的方法，其中所述细胞群包含富集的CD8⁺T细胞。

6.权利要求3或4的方法，其进一步包括体外扩增所述修饰的CD8⁺T细胞。

7.一种包含修饰的CD8⁺T细胞的细胞制备物，其根据权利要求3-6中任一项的方法制备。

8.权利要求1、2或7的细胞制备物在制备用于治疗患有表皮生长因子受体2阳性的癌症的患者的药物中的用途。

9.一种组合物，其包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

10.一种组合物，其包含真核表达载体中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

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