KR20190125997A - 신규의 펩타이드 기재 pcsk9 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적합한 면역원성 담체 및 적합한 아쥬반트와 접합시 백신으로서 유용할 수 있는 하기 화학식 I의 신규의 단쇄 펩타이드에 관한 것이다. 상기 펩타이드는 PCSK9 매개된 질병의 치료에 유용하다.
[화학식 I]
A-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-B

Description

신규의 펩타이드 기재 PCSK9 백신
본 발명은 화학식 I의 신규의 단쇄 펩타이드, 그의 거울상이성질체, 그의 부분입체이성질체, 그의 입체이성질체, 그의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 하기 화학식 I의 펩타이드는 적합한 면역원성 담체와 접합되며, PCSK9를 통해 매개되는 질병의 치료 또는 예방에 유용하고 생체내에서 PCSK9에 대한 항체의 형성을 유도할 수 있다.
[화학식 I]
A-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-B
본 발명은 또한 상기 약제의 생성 방법, 그의 면역원성 조성물 및 약학 조성물 및 약물에서 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 신규의 단쇄 펩타이드에 관한 것이다. 더욱이, 상기 펩타이드는 적합한 면역원성 담체와 접합되고 저밀도 지단백질(LDL) 수용체(LDLR)의 프로단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 타입 9(PCSK9)-매개된 분해를 억제할 수 있다. 면역원성 담체에 커플링된 상기 신규의 펩타이드는 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 또는 죽상동맥경화증과 같은 PCSK9 관련된 건강 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 백신으로서 제형화된다. 상기 합병증은 질병률과 사망률을 야기하는 심혈관 질병(CVD)에 이른다.
앞서, 스타틴과 같은 작용제가 혈장 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDLc)의 감소를 위한 치료제로서 사용되었다. LDLR의 분해의 증대를 통한 혈장 LDLc의 조절에서 PCSK9 및 그의 역할의 발견은, PCSK9가 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증과 같은 건강 질환의 억제에 가능한 표적인 듯하다는 인식을 도출하였다.
PCSK9는 2003년에 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증(ADH)과 관련된 제3의 유전자좌로서 발견되었다. PCSK9는 또한, 포유동물 PCSK 패밀리의 9번째 구성원으로서 동정된 프로테이나제 k-유사 서브틸라제인 신경성 세포사멸-조절된 전환효소 1(NARC-1)로서 공지되어 있다. 상기 PCSK9는 주로 간, 장, 및 신장에서 발현된다. 상기 PCSK9는 약 72 kDa의 단백질로서 합성되며, 자가촉매적 절단을 겪은 후에 약 65 kDa의 성숙한 단백질로서 분비된다.
순환하는 PCSK9는 LDLR의 EGF-A 도메인에 결합하며 LDLR의 분해를 촉진한다. 간성 LDLR은 혈장으로부터 LDLc의 제거를 위한 주요 경로이다. 순환하는 LDLc는 LDLR에 결합하고 수용체-매개된 엔도사이토시스에 의해 내면화되는 복합체를 형성한다. 후속적으로, LDLc는 분해가 선행되며 LDLR은 세포 표면으로 다시 재순환된다. PCSK9는 LDLR과 상호작용하며 상기 PCSK9-LDLR 상호작용은 LDLR의 분해를 야기하여, 혈장으로부터 LDLc의 제거를 위한 LDLR 유용성을 감소시킨다. 이는 명백히 LDLR의 조절제로서 및 LDLc 대사에서 PCSK9의 중요성을 나타낸다.
다수의 접근법, 예를 들어 단클론 항체(mAb), 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용하는 PCSK9 억제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, PCSK9-결합 애드넥틴, 소분자 억제제 및 자가촉매작용 억제제가, 순환하는 PCSK9의 양을 감소시키거나 LDLR과의 그의 상호작용을 억제하고자 시도되었다. 그러나, PCSK9는 LDLR상에서 세포내적으로 및 세포외적으로 작용하며, 순환하는 PCSK9를 표적화하는 것은 LDLc 수준을 낮추기 위한 귀중한 접근법이다. PCSK9-특이성 mAb에 대한 인간 임상 시험으로부터 고무적인 결과는 PCSK9 표적화가 효율적이고 안전한 LDLc 감소를 허용함을 암시한다. 더욱이, PCSK9 표적화의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 다수의 임상 시험이 최근에 성공적으로 완료되었다. 결론적으로, 스타틴류와 별개로, LDLc 수준을 억제하기 위한 대안의 표적으로서 PCSK9의 식별은 대단히 중요하다.
순환하는 PCSK9를 통해 매개되는 LDLR 분해를 억제하기 위한 다양한 기구에 의한 다수의 접근법 외에, 최근에 화이자(WO 2011027257A2) 및 아피리스(Affiris)(WO 2014033158A2)가 그의 다수의 특허를 통해, 인간 PCSK9에 특이적으로 결합하고 LDLR의 PCSK9-매개된 분해를 억제하는 항체를 유도할 수 있는 항원성 펩타이드를 개시하였다.
PCSK9 유전자 및 콜레스테롤 감소에서 그의 역할의 발견 이래로, LDLR의 PCSK9-매개된 분해를 억제하기 위한 다수의 접근법이 시험되었다. 현재 PCSK9를 표적화하는 단클론 항체(mAb)가 인간에서의 용도에 대해 평가되었다. 최근에, 리제네론/사노피(Regeneron/Sanofi)가 알리로큐맵(mAb)을 개발하였고 공개된 다수의 특허출원, 예를 들어 WO 2015/140079, (EP 2015/055369), WO 2015/142668(US2015/020564), WO 2015/123423(US2015/015633), WO 2014/194111, (US2014/040050), WO 2014/194168(US2014/040163), WO 2013/039969(US2012/054756)(mAb316P와 같은 항-PCSK9 항체를 포함한다)이 인간 용도에 승인되었다. 이 외에도, 사노피 WO 2015/073494(US2014/065149), WO 2015/054619, (US2014/060109), 및 리제네론 파마슈티칼스(Regeneron Pharmaceuticals) WO 2014/197752(US2014/041204)가 또한 항-PCSK9 항체, 또는 항원 결합 단백질인 PCSK9 억제제를 개시한다. 추가로 사노피 WO 2012/101251(EP 2012/051318), WO 2012/101253(EP 2012/051321), WO 2012/101252(EP 2012/051320)는, 바람직하게는 HMG-CoA 리덕타제 억제제의 추가적인 투여에 의해, PCSK9-특이성 항체 또는 항원-결합 단편을 개발하였다.
암젠(Amgen)에 의해 개발된 에볼로큐맵(AMG-145)은 인체용으로 승인된 LDLR에의 PCSK9 결합을 억제할 수 있는 완전한 인간 mAb, 또는 항원 결합 단백질이다[WO 2014/209384(US2013/048714), WO 2014/150983(US2014/024702), WO 2014/144080(US2014/028339), WO 2013/166448(US2013/039561), WO 2012/154999(US2012/037394)]. 화이자에 의해 개발된 인간화된 mAb, 보코시주맵[WO 2013/008185(IB2012/053534)]이 규명 중에 있다. 일라이 릴리[LY3015014]는 현재 II상 시험 중인 또 다른 PCSK9 mAb를 개발하고 있다[WO 2013/039958(US2012/054737)].
다수의 다른 PCSK9 길항물질 항체가 일레븐 바이오쎄라퓨틱스(Eleven Biotherapeutics) WO 2015/200438(US2015/037345), WO 2014/107739(US2014/010536), 제넨테크(Genentech) WO 2013/188855(US2013/046032), WO 2012/088313(US2011/066593); 알더바이오 홀딩스(Alderbio Holdings)WO 2013/169886(US2013/040112); 아다에라타(Adaerata) WO 2013/091103(CA2012/050923); 노바티스(Novartis) WO 2012/168491(EP 2012/061045), WO 2012/170607(US2012/041214); IRM LLC WO 2012/109530(US2012/024633), WO 2011/072263(US2010/059959); 및 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션(Merck Sharp & Dohme Corp) WO 2012/054438(US2011/056649), WO 2011/053759(US2010/054640), WO 2011/053783, (US2010/054714), WO 2011/037791(US2010/048849)에 의해 개발되었으며, 이들 중 다수는 규명 중에 있다.
또 다른 접근법에서, RNA 간섭(RNAi)을 사용하는 PCSK9 발현의 억제가 사용되었다. 로슈 WO 2014/207232(EP 2014/063757); 화이자 WO 2014/170786(IB2014/060407); 알래일람 파마슈티칼스(Alnylam Pharmaceuticals) WO 2014/089313(US2013/073349), WO 2012/058693(US2011/058682) WO 2011/038031(US2010/049868), WO 2011/028938(US2010/047726); 코와 캄파니(Kowa Company) LTD WO 2014/017569(JP2013/070128); 오사카 대학(Osaka University) WO 2014/007305(JP2013/068299), WO 2012/029870(JP2011/069818); 뉴욕 대학(New York University) WO 2013/154766(US2013/032271) 및 산타리스 팔마(Santaris Pharma) WO 2011/009697(EP 2010/059257)를 포함한 다수의 회사가 RNAi를 사용하는 PCSK9 발현 억제제를 개발 중에 있으며, 이들 중 다수는 다양한 임상 개발 단계에 있다.
항-PCSK9 활성 백신접종 전략이 PCSK9를 억제하기 위한 또 다른 전략이다. 화이자 WO 2012/131504(IB2012/050924), 미국 보건복지부 장관 WO 2015/123291(US2015/015408), 및 Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare WO 2011/117401(EP 2011/054646)에 의한 특허 출원은 LDLc 수준을 낮추기 위한 다양한 백신접종 전략을 개시한다.
또 다른 유망한 접근법은 PCSK9 억제를 위한 펩타이드-기재 PCSK9 백신이다. PCSK9 유전자로부터 유래된 단쇄 펩타이드를 상기 PCSK9에 대한 항체를 생산할 수 있는 적합한 면역원성 담체와 접합시킨다. 화이자 (WO 2011/027257(IB2010/053784), US2011/0052621; 아피리스 US2016/0106822, WO 2015/128287(EP 2015/053725), EP 2703483, WO 2014/033158(EP 2013/067797), WO 2013/037889(EP 2012/067950)에 의한 특허 출원은 LDLc 수준의 억제에 있어서 상기와 같은 면역원성 펩타이드를 개시한다.
그러나, 지금까지, 비천연/변형된 아미노산을 함유하는 PCSK9 펩타이드 백신은 보고되지 않았으며, 작용의 지속기간과 함께 그의 효험 및/또는 효능을 개선시키기 위해 적합한 화학적 변형을 사용하여 상기 PCSK9 펩타이드의 대사 안정성을 개선시키려는 시도는 그다지 이루어지지 않았다. 본 발명은 PCSK9 유전자로부터의 PCSK9 펩타이드(상기는 이어서 적합한 면역원성 담체와 접합된다) 중에 통합되는 변형된 아미노산의 역할을 규명하기 위한 첫 번째 시도 중 하나이다. 놀랍게도, 이들 변형된 펩타이드 중 다수는 PCSK9에 대한 항체의 형성을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서 이들 백신은 PCSK9를 통해 매개되는 질병의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.
본 발명의 목적은, 적합한 면역원성 담체와 접합될 수 있고 인간 PCSK9에 특이적으로 결합하고 LDLR의 PCSK9-매개된 분해를 억제하는 항체를 생성시킬 수 있는 몇몇 신규의 화학식 I의 단쇄 펩타이드를 제공하는 것이다. 상기 목적은 천연 아미노산을, 적합한 면역원성 담체와 임의로 접합되고 특이적으로 PCSK9 유전자에 대한 항체의 생성에 대해 평가된 비천연 아미노산에 의해 교체시켜 일부 변형된 펩타이드를 개발하고 이에 의해 LDLc의 수준을 감소시킴으로써 성취되었으며, 상기 펩타이드는 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 또는 죽상동맥경화증과 같은 심혈관 합병증의 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 적합한 면역원성 담체와 임의로 접합된, 화학식 I의 신규의 단쇄 펩타이드에 관한 것이다. 상기와 같은 조성물을 백신 또는 백신 조성물로서 사용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 펩타이드는 하기 화학식 I의 12개의 아미노산 잔기로 구성되었다,
[화학식 I]
A-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-B
상기 식에서,
A는 -NH-R1, R2-CO-NH- 기를 나타내고, 여기에서 R1은 수소 또는 임의로 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄를 나타내고; R2는 임의로 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄, (C1-6)알콕시, (C3-6)사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 아릴알킬기 중에서 선택되고;
바람직한 실시양태에서, 상기 아릴기는 페닐, 나프틸, 인다닐, 플루오레닐 또는 바이페닐기 중에서 선택되고; 상기 헤테로아릴기는 피리딜, 티에닐, 퓨릴, 이미다졸릴, 벤조퓨라닐기 중에서 선택되고;
B는 R3, -COOR3, -CONHR3 또는 CH2OR3을 나타내고, 여기에서 R3은 H 또는 적합한 아미노산, 예를 들어 세린, 시스테인, 발린, 알파-메틸-발린, Lys(비오틴), Lys(알킬), Lys(아세틸) 등을 나타내고;
Z1은 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 세린, 트레오닌, 발린 및 알라닌 및 그의 유도체, 예를 들어 호모세린, O-메틸-트레오닌, O-메틸-세린, O-메틸-호모세린 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z2는 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌, Aib 및 그의 유도체, 예를 들어 N-메틸-아이소류신, N-메틸-류신 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z3은 프롤린, 1-아미노 카보사이클릭 산 및 그의 유도체, 예를 들어 하이드록시프롤린, 티아프롤린, 아미노프롤린, 알파-메틸-프롤린, 3-플루오로프롤린, 4-플루오로프롤린, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 1-아미노-사이클로펜탄카복실산, 1-아미노-사이클로헥산카복실산 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z4는 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z5는 글루타민, 히스티딘, 바람직하게는 아스파라진 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z6은 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 아이소류신, 류신, 알라닌, 트레오닌, 아스파트산, Aib 및 그의 유도체, 예를 들어 노르아이소류신, N-메틸-류신 호모류신, 알파-메틸-아스파트산 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z7은 친수성의 음으로 하전된 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기, 바람직하게는 글루탐산, 아스파트산 및 그의 유도체, 예를 들어 알파-메틸-아스파트산, 알파-메틸-글루탐산, 호모글루탐산 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z8은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 아르기닌, 호모아르기닌, 시트룰린, 글루타민, 아스파라진, 리신 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
Z9는 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌 또는 Aib 및 그의 유도체, 예를 들어 N-메틸 아이소류신 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z10은 극성이고 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 세린, 트레오닌, 발린, 알라닌 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z11은 임의의 아미노산 잔기, 바람직하게는 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 프롤린 및 그의 유도체, 예를 들어 하이드록시프롤린, 티아프롤린, 알파-메틸-프롤린, 3-플루오로프롤린, 4-플루오로프롤린, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 1-아미노-사이클로펜탄카복실산, 1-아미노-사이클로헥산카복실산 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z12는 임의의 아미노산 잔기, 바람직하게는 시스테인, 호모시스테인 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 극성이고 하전되지 않은 아미노산 잔기이나; 단 Z1 내지 Z12 중 적어도 하나는 항상 비천연 아미노산을 나타낸다.
본 발명에 사용된 아미노산에 대한 단-문자 약어를 문헌[Zubay, G., Biochemistry 2nd ed., 1988, MacMillan Publishing, New York, p. 33]에서 찾을 수 있다.
일련의 PCSK9 펩타이드는 본 명세서에서 화학식 I A-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-B를 갖는 것으로 보고되며, 여기에서 각각의 Z1-Z12는 존재하는 경우, 천연 아미노산 또는 비천연/변형된 아미노산 서열을 나타내나, 단 Z1 내지 Z12 중 적어도 하나는 항상 비천연/변형된 아미노산을 나타낼 것이다.
발명의 요약
본 발명은 적합한 면역원성 담체와 임의로 접합되고 LDLR의 PCSK9 매개된 분해를 억제할 수 있는 신규의 단쇄 PCSK9 펩타이드 서열을 제공한다. 상기 펩타이드를 그의 면역원성 효능을 개선시키고 이에 의해 항체 생성을 증가시키기 위해 비천연 아미노산으로 적합하게 변형시키고 적합한 면역원성 담체와 접합시킨다. 상기 단쇄 펩타이드(본 명세서에서 이후부터 PCSK9 펩타이드 유도체/유사체라 칭한다)는 주로 인간 PCSK9 유전자의 활성 펩타이드 서열로부터 유래된다. 상기 신규의 면역원성 단쇄 PCSK9 펩타이드 유사체 기재 백신은 혈장 LDL-c 수준의 조절과 관련된 병리의 치료 또는 예방에 유용하다. 상기 백신에 의해 생성된 항체는 LDLR의 PCSK9 매개된 분해를 예방하며, 이에 의해 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증과 같은 건강 질환을 억제한다.
바람직한 실시양태
본 발명의 하나의 실시양태는 PCSK9 유전자에 대한 백신으로서 적합한 화학식 I의 신규의 단쇄 펩타이드, 그의 합성에 관련된 신규의 중간체, 그의 약학적으로 허용 가능한 염 및 이들 또는 이들의 혼합물을 함유하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 화학식 I의 단쇄 펩타이드를, 살아있는 시스템에서 PCSK9에 특이적으로 결합하는 항체의 형성을 유도할 수 있는 백신으로서 작용하도록 적합한 면역원성 담체와 접합시킨다. 상기 항체와 PCSK9와의 상호작용은 LDLR 분해를 억제하며 혈장 LDLc 수준의 감소를 야기한다. 상기 백신은 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증과 같은 건강 질환의 치료에 적합할 수 있다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 화학식 I의 단쇄 펩타이드, 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 및 그의 혼합물을 약학적으로 허용 가능한 아쥬반트(adjuvant), 면역원성 담체, 용매, 희석제, 부형제 및 그의 제조에 통상적으로 사용되는 다른 매질과 함께 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
더욱 또 다른 바람직한 실시양태에서, 적합한 면역원성 담체와 접합된 화학식 I의 단쇄 펩타이드를 적합한 용매, 희석제, 다른 부형제 및 그의 제조에 통상적으로 사용되는 다른 매질과 함께 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
더욱 추가의 바람직한 실시양태에서, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증 및 다른 심혈관 질병과 같은 건강 질환의 치료를 위한 단독의 또는 적합한 면역원성 담체와 접합된 화학식 I의 신규의 단쇄 펩타이드의 용도를 제공한다.
특히 바람직한 실시양태에 따라 본 발명의 백신 중의 신규의 단쇄 펩타이드는 그의 N- 및/또는 C-말단에 직접 또는 이격자 서열을 통해 결합된 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유한다. 상기 시스테인 잔기는 상기 펩타이드를 또 다른 분자 또는 담체 단백질에 결합시키기 위한 반응기로서 작용한다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서 상기 면역원성 담체는 디프테리아 독소(DT), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), CRM(바람직하게는 CRM197), 파상풍 톡소이드(TT), 단백질 D 또는 헬퍼 T-세포 에피토프를 함유하는 임의의 다른 단백질 또는 펩타이드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 아쥬반트는 알룸, MF-59와 병용된 알룸, TLR3 작용물질, 예를 들어 폴리(I:C), TLR4 작용물질, 예를 들어 모노포스포릴 지질 A 또는 GLA 등, TLR5 작용물질, 예를 들어 플라젤린, TLR7 작용물질, 예를 들어 가르디퀴모드 및 이미퀴모드 TLR7/8 작용물질, 예를 들어 R848, NOD2 작용물질, 예를 들어 N-글리콜릴-MDP.CpG-함유 핵산(여기에서 시토신은 메틸화되지 않는다), QS21(사포닌 아쥬반트), 인터류킨, 베타-시토스테롤 등 중에서 선택된다.
추가의 바람직한 실시양태에서 상기 아쥬반트는 알룸, MF-59와 같은 다른 아쥬반트와 병용된 알룸, GLA, 모노포스포릴 지질 A, CpG-함유 핵산(여기에서 시토신은 메틸화되지 않는다), QS21(사포닌 아쥬반트), 인터류킨, 베타-시토스테롤 중에서 선택된다.
사용된 약어
하기의 약어들이 실시예 및 본 명세서의 다른 어딘가에 사용된다:
Ac = 아세틸,
Aib = α-아미노-아이소부티르산,
Abu(CN) = 2-아미노-4-시아노부탄산,
A-Me-APPA = 알파-메틸-2-아미노페닐 펜탄산,
α-Me-Asp = 알파-메틸-아스파트산,
α-Me-D = 알파-메틸-아스파트산,
α-Me-E 또는 αMe-Glu = 알파-메틸-글루탐산,
α-Me-L = 알파-메틸-류신,
α-Me-Phe = 알파-메틸-페닐알라닌,
α-Me-2F-Phe = 알파-메틸-2-플루오로페닐알라닌,
α-Me-2,6-diF-Phe = 알파-메틸-2,6-다이플루오로페닐알라닌,
α-Me-Pro = 알파-메틸-프롤린,
AC3C= 1-아미노-사이클로프로판카복실산,
AC5C= 1-아미노-사이클로펜탄카복실산,
AC6C= 1-아미노-사이클로헥산카복실산,
ACN = 아세토나이트릴,
APPA = 2-아미노페닐 펜탄산,
Amp = 4-아미노프롤린,
3-Amp = 3-아미노프롤린,
B-Ala = 베타 알라닌,
Boc = 3급-부톡시카보닐,
But= O-3급-부틸기,
Cit = 시트룰린,
DCM = 다이클로로메탄,
DMF = N,N-다이메틸폼아미드,
DIPCDI= 다이-아이소프로필카보다이이미드,
DIPEA= 다이아이소프로필에틸아민,
Et = 에틸,
Et2O = 다이에틸 에테르,
2F-Phe = 2-플루오로페닐알라닌,
3F-Pro = 3-플루오로프롤린,
4F-Pro = 4-플루오로프롤린,
Fmoc = 플루오레닐메톡시카보닐,
g = 그램,
h = 시간,
Har = 호모아르기닌,
HoGlu 또는 Homo-Glu = 호모글루탐산,
HoLeu = 호모류신,
HoSer = 호모세린,
Hyp = 4-하이드록시프롤린,
3-Hyp = 3-하이드록시프롤린,
HOBt = 1-하이드록시벤조트라이아졸,
HOAt= 7-아자-하이드록시벤조트라이아졸,
HBTU = 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 아미늄 헥사플루오로포스페이트,
HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피,
K(비오틴) = 리신(비오틴),
L = 리터,
LC /MS = 액체 크로마토그래피/질량 분광분석,
Me = 메틸,
Min = 분,
㎖ = 밀리리터,
㎕ = 마이크로리터,
㎎ = 밀리그램,
mmol = 밀리몰,
MS= 질량 분광분석,
Nle = 노르류신,
NMe-Ile = N-메틸-아이소류신,
NMe-Leu = N-메틸-류신,
NMe-Nle = N-메틸-노르류신,
OMe-Thr 또는 Thr(OMe) = O-메틸-트레오닌,
OMe-Ser 또는 Ser(OMe) = O-메틸-세린,
OMe-HoSer 또는 HoSer(OMe) = O-메틸-호모세린,
PyBOP = 벤조트라이아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트,
2-Pal = 2-피리딜알라닌,
Pal = 3-피리딜알라닌,
4-Pal = 4-피리딜알라닌,
Sar = 사르코신,
SPPS = 고상 펩타이드 합성,
2-Thi = (2-티에닐)-알라닌,
Tha = (4-티아졸릴)-알라닌,
Thz = 4-티아프롤린,
2-Thz = 2-티아프롤린,
TMS = 트라이메틸실릴,
TIPS = 트라이아이소프로필실란,
TFA = 트라이플루오로아세트산,
TBTU = 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 테트라플루오로보레이트,
Trt= 트리틸기.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따라, 화학식 I을 갖는 다양한 신규의 단쇄 펩타이드를 합성하고, 이어서 적합한 면역원성 담체와 접합시켰다. 상기 백신을 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증과 같은 건강 질환의 치료에 사용할 수 있다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 PCSK9 펩타이드 유도체를 개시한다
[화학식 I]
A-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-B
상기 식에서,
A는 -NH-R1, R2-CO-NH- 기를 나타내고, 여기에서 R1은 수소 또는 임의로 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄를 나타내고; R2는 임의로 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄, (C1-6)알콕시, (C3-6)사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 아릴알킬기 중에서 선택되고; 여기에서
상기 아릴기는 페닐, 나프틸, 인다닐, 플루오레닐 또는 바이페닐기 중에서 선택되고; 상기 헤테로아릴기는 피리딜, 티에닐, 퓨릴, 이미다졸릴, 벤조퓨라닐기 중에서 선택되고;
B는 R3, -COOR3, -CONHR3 또는 CH2OR3을 나타내고, 여기에서 R3은 H 또는 적합한 아미노산, 예를 들어 세린, 시스테인, 발린, 알파-메틸-발린, Lys(비오틴), Lys(알킬), Lys(아세틸) 등을 나타내고;
Z1은 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 세린, 트레오닌, 발린 및 알라닌 및 그의 유도체, 예를 들어 호모세린, O-메틸-트레오닌, O-메틸-세린, O-메틸-호모세린 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z2는 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌, Aib 및 그의 유도체, 예를 들어 N-메틸-아이소류신 및 N-메틸-류신 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z3은 프롤린, 1-아미노 카보사이클릭 산 및 그의 유도체, 예를 들어 하이드록시프롤린, 티아프롤린, 아미노프롤린, 알파-메틸-프롤린, 3-플루오로프롤린, 4-플루오로프롤린, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 1-아미노-사이클로펜타카복실산, 1-아미노-사이클로헥산카복실산 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z4는 바람직하게는 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z5는 글루타민, 히스티딘, 바람직하게는 아스파라진 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z6은 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 아이소류신, 류신, 알라닌, 트레오닌, 아스파트산, Aib 및 그의 유도체, 예를 들어 노르아이소류신, N-메틸-류신 호모류신, 알파-메틸-아스파트산 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z7은 친수성의 음으로 하전된 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기, 바람직하게는 글루탐산, 아스파트산 및 그의 유도체, 예를 들어 알파-메틸-아스파트산, 알파-메틸-글루탐산, 호모글루탐산 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z8은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 아르기닌, 호모아르기닌, 시트룰린, 글루타민, 아스파라진, 리신 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
Z9는 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌, Aib 및 그의 유도체, 예를 들어 N-메틸 아이소류신 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z10은 극성이고 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 세린, 트레오닌, 발린, 알라닌 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
Z11은 임의의 아미노산 잔기, 바람직하게는 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 바람직하게는 프롤린 및 그의 유도체, 예를 들어 하이드록시프롤린, 티아프롤린, 또는 알파-메틸-프롤린, 3-플루오로프롤린, 4-플루오로프롤린, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 1-아미노-사이클로펜탄카복실산, 1-아미노-사이클로헥산카복실산 등의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
Z12는 임의의 아미노산 잔기, 바람직하게는 시스테인, 호모시스테인 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 극성이고 하전되지 않은 아미노산 잔기이나; 단 Z1 내지 Z12 중 적어도 하나는 항상 비천연 아미노산을 나타낸다.
바람직한 실시양태 중 하나에서, 'A'는 -NH-R1, R2-CO-NH- 기를 나타내고, 여기에서 'R1'은 수소 또는 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄를 나타내고; 'R2'는 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄, (C1-6)알콕시, (C3-6)사이클로알킬, 아릴, 및 아릴알킬기 중에서 선택되고; 여기에서 상기 아릴기는 페닐, 나프틸, 인다닐, 플루오레닐 또는 바이페닐기 중에서 선택되고; 'B'는 R3, -COOR3, -CONHR3 또는 CH2OR3을 나타내고, 여기에서 R3은 H, 세린, 시스테인, 발린, 알파-메틸-발린, Lys(비오틴), Lys(알킬), Lys(아세틸) 중에서 선택되고, Z1은 세린, 트레오닌, 발린, 알라닌, Aib, 호모세린, O-메틸-트레오닌, O-메틸-세린 또는 O-메틸-호모세린 중에서 선택되고, Z2는 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌, Aib, N-메틸-아이소류신 또는 N-메틸-류신 중에서 선택되고, Z3은 프롤린, 하이드록시프롤린, 티아프롤린, 아미노프롤린, 2-티아프롤린, 3-하이드록시프롤린, 3-아미노프롤린, 알파-메틸-프롤린, 3-플루오로프롤린, 4-플루오로프롤린, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 1-아미노-사이클로펜탄카복실산 또는 1-아미노-사이클로헥산카복실산 중에서 선택되고, Z4는 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신, 2-플루오로페닐알라닌, 알파-메틸 페닐알라닌, 알파-메틸-2-플루오로페닐알라닌, 알파-메틸-2,6-다이플루오로페닐알라닌, 2-아미노-5-페닐-펜탄산, 알파-메틸-2-아미노-5-페닐펜탄산, 또는 2'-에틸-4'-메톡시-바이페닐알라닌 중에서 선택되고, Z5는 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라진 중에서 선택되고, Z6은 아이소류신, 류신, 알라닌, 트레오닌, 아스파트산, Aib, 노르아이소류신, N-메틸-류신, 호모류신, 베타-알라닌 또는 알파-메틸-아스파트산 중에서 선택되고, Z7은 글루탐산, 아스파트산, 알파-메틸-아스파트산, 알파-메틸-글루탐산, 2-아미노-4-시아노부탄산 또는 호모글루탐산이고, Z8은 아르기닌, 호모아르기닌, 시트룰린, 글루타민, 아스파라진 또는 리신 중에서 선택되고, Z9는 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌, Aib 또는 N-메틸 아이소류신 중에서 선택되고, Z10은 세린, 트레오닌, 발린, Aib 또는 알라닌 중에서 선택되고, Z11은 프롤린, 하이드록시프롤린, 티아프롤린, 아미노프롤린, 알파-메틸-프롤린, 3-플루오로프롤린, 4-플루오로프롤린, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 1-아미노-사이클로펜탄카복실산 또는 1-아미노-사이클로헥산카복실산 중에서 선택되고, Z12는 시스테인 또는 호모시스테인 중에서 선택된다.
정의
'천연 아미노산'이란 용어는 자연 중에 존재하는 20개의 아미노산 모두를 가리킨다. '비천연 아미노산' 또는 "비-천연 아미노산'이란 용어는 바람직하게는 L-아미노산의, 상응하는 D-아미노산에 의한 교체, 예를 들어 L-Ala의 D-Ala에 의한 교체 등을 나타내거나 또는 L 또는 D 아미노산, 아미노 알킬산의,
- α-알킬화, 예를 들어 Ala의 α-메틸 Ala(Aib)에 의한 치환, Leu의 α-메틸 Leu에 의한 교체;
- 아미노산의 측쇄상의 치환, 예를 들어 방향족 아미노산 측쇄의, 할로겐, (C1-C3)알킬, 아릴기에 의한 치환, 보다 구체적으로 Phe의 할로 Phe에 의한 교체;
- β 아미노산, 예를 들어 β알라닌
에 의한 적합한 변형을 나타낸다.
본 명세서의 어디에든 사용된 다양한 기, 라디칼 및 치환체를 하기의 단락에 기재한다.
본 명세서에 사용된 "알킬"이란 용어는 단독으로 또는 다른 라디칼과 함께, 1 내지 18개의 탄소를 함유하는 선형 또는 분지된 라디칼, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 아밀, t-아밀, n-펜틸, n-헥실, 아이소-헥실, 헵틸, 옥틸, 데실, 테트라데실, 옥타데실 등을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 "사이클로알킬"이란 용어는 단독으로 또는 다른 라디칼과 함께, 3 내지 7개의 탄소를 함유하는 라디칼, 예를 들어 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 등을 나타낸다.
달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에 사용된 바와 같은 '아미노산'이란 용어는 단독으로 또는 또 다른 기의 부분으로서 비제한적으로, 동일한 탄소('α' 탄소라 지칭된다)에 연결된 아미노기 및 카복실기를 포함한다.
'α' 탄소에서 절대 'S' 배열은 통상적으로 'L' 또는 천연 배열이라 지칭된다. 'α' 탄소에서 'R' 배열은 통상적으로 'D' 아미노산이라 지칭된다. 2개의 'α-치환체'가 모두 동일한 경우에, 예를 들어 수소 또는 메틸인 경우에, 아미노산은 Gly 또는 Aib이며 키랄이 아니다.
문서의 어디에든 언급된 '유도체'란 용어는 특정 아미노산의 임의의 치환된 또는 상동성인 비-천연 아미노산을 가리킨다.
본 발명을 주로 단쇄 펩타이드와 관련하여 예시하였지만, 치료학적 가능성이 유지되는 한, 잔기들간의 펩타이드 결합을 비-펩타이드 결합에 의해 교체시킬 수 있음을 또한 이해할 것이다. 당해 분야의 숙련가는 적합한 변형, 예를 들어 티오아미드 결합 형성, 아미드 결합의 N-메틸화 등을 알 것이다.
아미노산의 보존적 치환을 포함하는 서열이 또한, 생물학적 활성을 유지하는 한, 본 발명의 범위내에 있다.
본 발명의 화합물이 펩타이드 아미드 및 비-아미드 및 펩타이드 유사체, 예를 들어 비제한적으로 하기를 포함함을 분명히 이해해야 한다:
a) 하나 이상의 아미노산이 그의 상응하는 D-아미노산에 의해 교체된 화합물. 숙련가는 레트로-인버스(retro-inverso) 아미노산 서열을 표준 방법에 의해 합성할 수 있음을 알 것이다; 예를 들어 문헌[Chorev M., Acc. Chem. Res., 26, 1993, 266-273] 참조;
b) 펩타이드 결합이 대사적 분해에 보다 내성인 구조에 의해 교체된 화합물. 예를 들어 문헌[Olson G. L., et al., J. Med. Chem., 36(21), 1993, 3039-3049] 참조; 및
c) 개별적인 아미노산이 유사한 구조에 의해, 예를 들어 Ala가 Aib에 의해; Arg가 Cit에 의해 교체된 화합물.
기재 전체를 통해, 천연 아미노산에 대한 통상적인 단-문자 및 3-문자 암호뿐만 아니라 다른 비천연 아미노산에 대한 일반적으로 허용될 수 있는 3-문자 암호, 예를 들어 Hyp(하이드록시프롤린), Thz(티아프롤린), Aib(α-아미노 아이소부탄산)가 사용된다.
단쇄 펩타이드의 제조
다수의 합성 경로를 사용하여 펩타이드 합성 분야의 숙련가에게 주지된 본 발명의 단쇄 펩타이드를 제조할 수 있다. 화학식 I(여기에서 모든 기호는 앞서 정의된 바와 같다)의 단쇄 펩타이드를, 펩타이드 합성 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 기법 또는 당해 분야의 숙련가들에 의해 인식된 바와 같은 상기에 대한 변화와 함께 하기에 기재된 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 언급된 방법은 비제한적으로 하기에 기재된 방법을 포함한다.
본 명세서에 기재된 단쇄 펩타이드를 용액상(바람직하게는 Boc-화학을 사용하여; 문헌[M. Bodansky, A. Bodansky, "The practice of peptide synthesis", Springer-Verlag, Berlim, 1984]; 문헌[E. Gross, J. Meinhofer, "The peptide synthesis, analysis, biology", Vol. 1, Academic Press, London, 1979]) 및 또는 고상 기법, 예를 들어 문헌[G. Barany & R. B. Merrifield, "The peptides: Analysis, synthesis, Biology"; Volume 2- "Special methods in peptide synthesis, Part A", pp. 3-284, E. Gross & J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1980]; 및 문헌[J. M. Stewart and J. D. Young, "Solid-phase peptide synthesis" 2nd Ed., Pierce chemical Co., Rockford, Il, 1984]에 기재된 것들 모두의 적합한 변화를 사용하여 화학 합성에 의해 생성시킬 수 있다.
본 발명의 단쇄 펩타이드의 바람직한 제조 전략은 Fmoc-기재 SPPS 접근법[여기에서 Fmoc(9-플루오레닐메톡시카보닐)기는 α-아미노기의 일시적인 보호에 사용된다]을, 아미노산 측쇄(존재하는 경우)의 일시적인 보호를 위한 산 불안정성 보호기, 예를 들어 3급-부톡시카보닐(Boc), 3급-부틸(But), 트리틸(Trt) 기(도식 1)와 함께 사용함을 기본으로 한다(예를 들어 문헌[E. Atherton & R.C. Sheppard, "The Fluorenylmethoxycarbonyl amino protecting group", in "The peptides: Analysis, synthesis, Biology"; Volume 9 - "Special methods in peptide synthesis, Part C", pp. 1-38, S. Undenfriend & J. Meienhofer, Eds., Academic Press, San Diego, 1987] 참조).
상기 단쇄 펩타이드를, 상기 펩타이드의 C-말단에서 시작하여 불용성 중합체 지지체(수지)상에서 단계적인 방식으로 합성할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 합성을, 상기 펩타이드의 C-말단 아미노산을 아미드, 에스터 또는 에테르 결합의 형성을 통해 상기 수지에 부가함으로써 개시시킨다. 이는 상기 생성되는 펩타이드가 각각 C-말단 아미드, 카복실산 또는 알콜로서 최종적으로 방출되게 한다.
Fmoc-기재 SPPS에서, 상기 합성에 사용되는 C-말단 아미노산 및 다른 모든 아미노산은 합성 중에 그의 α-아미노 보호기가, 수지로부터 펩타이드가 임의로 조기 절단되거나 또는 측쇄 보호기(대개는 산 불안정성 보호기로 보호된다)의 탈보호 없이 적합한 염기, 예를 들어 20% 피페리딘 용액을 사용하여 선택적으로 제거될 수 있도록 차별적으로 보호된(직교 보호) 그의 α-아미노기 및 측쇄 작용기(존재하는 경우)를 가질것이 요구된다.
아미노산의 커플링을, 활성 에스터로서 그의 카복실기의 활성화 및 수지에 부가된 N-말단 아미노산의 차단되지 않은 α-아미노기와의 반응에 의해 수행한다. 모든 커플링 및 탈보호 후에, 펩티딜-수지를 과잉의 용매, 예를 들어 DMF, DCM 및 다이에틸 에테르로 세척하였다. α-아미노기 탈보호 및 커플링의 시퀀스를 목적하는 펩타이드 서열이 조립될 때까지(반응식 1) 반복한다. 이어서 펩타이드를 대개는 부반응을 제한하는 적합한 스캐빈저의 존재하에서 적합한 절단 혼합물을 사용하여 측쇄 반응기의 동반 탈보호와 함께 수지로부터 절단시킨다. 생성되는 펩타이드를 최종적으로 역상 HPLC에 의해 정제한다.
최종 펩타이드에 대한 전구체로서 요구되는 펩티딜-수지의 합성은 상업적으로 입수할 수 있는 가교결합된 폴리스타이렌 중합체 수지(노바바이오켐(Novabiochem), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 사용한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 것은 Fmoc-PAL-PEG-PS 수지, 4-(2',4'-다이메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세틸-p-메틸 벤즈하이드릴아민 수지(Fmoc-링크 아미드 MBHA 수지), 2-클로로-트리틸-클로라이드 수지 또는 p-벤질옥시벤질 알콜 수지(HMP 수지)(여기에 C-말단 아미노산이 이미 부착될 수도 또는 부착되지 않을 수도 있다)이다. C-말단 아미노산이 부착되지 않은 경우, DIPCDI와의 반응에 의해 형성된 Fmoc-보호된 아미노산의 HOBt 활성 에스터에 의해 그의 부착을 성취할 수 있다. 2-클로로-트리틸 수지의 경우에, 첫 번째 Fmoc-보호된 아미노산의 커플링을 DIPEA를 사용하여 성취하였다. 다음 아미노산의 조립을 위해서, 펩티딜 수지의 N-말단 보호를 10 내지 20% 피페리딘 용액을 사용하여 선택적으로 탈보호하였다. 모든 커플링 및 탈보호 후에, 과잉의 아미노산 및 커플링 시약을 DMF, DCM 및 에테르에 의한 세척에 의해 제거하였다. 후속 아미노산의 커플링을, 각각 DIPCDI/HOBt 또는 DIPCDI/HOAT로부터 생성된 HOBt 또는 HOAT 활성 에스터를 사용하여 수행할 수 있다. 일부 어려운 커플링의 경우에, 특히 소수성인 아미노산 또는 벌키한 측쇄 보호를 갖는 아미노산의 커플링의 경우에; 완전한 커플링을 매우 효율적인 커플링제, 예를 들어 HBTU, PyBOP 또는 TBTU와 첨가제, 예를 들어 DIPEA와의 조합을 사용하여 성취할 수 있다.
본 명세서에 기재된 단쇄 펩타이드의 합성을, Fmoc/t-부틸 보호 전략을 사용하여, 배치식 또는 연속 유동식 펩타이드 합성 장치, 예를 들어 CS-Bio 또는 AAPPTEC 펩타이드 합성기를 사용함으로써 수행할 수 있다. 상이한 위치에 존재하는 비-천연 비-상업적 아미노산을 당해 분야에 공지된 하나 이상의 방법을 사용하여 상기 펩타이드쇄에 통합시켰다. 하나의 접근법에서, Fmoc-보호된 비-천연 아미노산을 적합한 문헌 과정을 사용하여 용액 중에서 제조하였다. 예를 들어, 상술한 Fmoc-보호된 APPA 유사체를 변형된 문헌 과정(문헌[Betsbrugge J.V., et al., Tetrahedron, 54, 1988, 1753-1762])을 사용하여, 양호한 거울상이성질체성 순도로 L-피로글루탐산으로부터 제조하였다.
[도식 1]
단쇄 펩타이드의 Fmoc 기재-고상 펩타이드 합성(SPPS)에 사용되는 보호된 아미노산 중 일부의 예
Figure pct00001
Fmoc-보호된 α-메틸화된 아미노산을 비대칭 스트레커(Strecker) 합성을 사용하여 제조하였다(문헌[Boesten, W.H.J., et al., Org. Lett., 3(8), 2001, 1121-1124]; 문헌[Cativiela C., Diaz-de-villegas M. D., Tetrahedran Asymmetry, 9, 1988, 3517-3599]). 이어서 생성되는 유도체를 상기 펩타이드의 단계식 합성에 사용하였다. 한편으로, 필요한 비-천연 아미노산을 합성 유기 화학 과정을 사용하여 직접 수지상에 형성시켰으며 선형 펩타이드 쇄를 제조하였다.
각각의 단쇄 펩타이드에 대한 펩타이드-수지 전구체를 문헌[King D.S., et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1990, 36, 255-266]에 기재된 표준 절단 과정 중 어느 하나의 적합한 변형을 사용하여 절단하고 탈보호시킬 수 있다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 방법은 스캐빈저로서 TIPS 및 수의 존재하에서 TFA 절단 혼합물의 사용이다. 전형적으로, 펩티딜-수지를 실온에서 1.5 내지 4시간 동안 TFA/수/TIPS(95:2.5:2.5) 중에서 배양하였다. 이어서 절단된 수지를 여과하고 TFA 용액을 감압하에서 농축시키거나 건조시킨다. 생성되는 조 펩타이드를 침전시키거나 또는 Et2O로 세척하거나 또는 예비 HPLC에 의한 정제를 위해 DMF 또는 50% 수성 아세트산에 직접 재-용해시킨다.
목적하는 순도를 갖는 단쇄 펩타이드를 예비 HPLC를 사용하는 정제에 의해 수득할 수 있다. 조 펩타이드의 용액을 250 X 50 ㎜ 치수의 세미-프렙(Prep) 컬럼(루나(Luna) 10 μ; C18; 100 Å)에 주입하고 220 ㎚에서 PDA 검출기에 의해 유출물을 모니터하면서 40 ㎖/분의 유량을 사용하여 선형 구배의 수 중 ACN(둘 다 0.1% TFA로 완충됨)으로 용출시킨다. 정제된 단쇄 펩타이드의 구조를 전기분무 질량 분광(ES-MS) 분석에 의해 확인할 수 있다.
제조된 모든 펩타이드를 프렙-HPLC 정제 후에, 대이온으로서 TFA와 함께 트라이플루오로-아세테이트 염으로서 단리하였다. 그러나, 일부 펩타이드는 적합한 이온 교환 수지층에 통과시킴으로써, 바람직하게는 다우엑스(Dowex) SBR P(Cl) 또는 균등한 염기성 음이온-교환 수지에 통과시킴으로써 탈염시켰다. 일부의 경우에, TFA 대이온을, 희석된 아세트산 완충제로 용출되는 적합한 이온-교환 수지에 통과시킴으로써 아세테이트 이온으로 교체시켰다. 펩타이드의 하이드로클로라이드 염의 제조를 위해서, 아세테이트 염을 갖는 선택된 펩타이드를 최종 제조 단계에서 4 M HCl로 처리하였다. 생성되는 용액을 멤브레인 필터(0.2 ㎛)를 통해 여과하고 후속적으로 동결건조시켜 백색 내지 회색 HCl 염을 생성시켰다. 유사한 기법 및/또는 상기와 같은 적합한 변형(이들은 당해 분야의 숙련가의 범위내에 충분히 있다)에 이어서, 본 발명의 단쇄 펩타이드의 다른 적합한 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하였다.
[반응식 1]
Fmoc-기재 SPPS의 일반적인 반응식
Figure pct00002
SPPS 접근법을 사용하는, 단쇄 펩타이드의 일반적인 제조 방법:
수지상의 단쇄 펩타이드의 조립
충분량(50 내지 100 ㎎)의 Fmoc-PAL-PEG-PS 수지 또는 Fmoc-링크 아미드 MBHA 수지(로딩: 0.5 내지 0.6 mmol/g)를 2 내지 10분간 DMF(1 내지 10 ㎖/100 ㎎의 수지) 중에서 팽윤시켰다. 수지상의 Fmoc-기를, DMF 중 10 내지 30% 피페리딘(10 내지 30 ㎖/100 ㎎의 수지)과 수지를 10 내지 30분 동안 배양시킴으로써 제거하였다. 탈보호된 수지를 여과하고 과잉의 DMF, DCM 및 에테르(50 ㎖ x 4)로 세척하였다. 세척된 수지를 질소 분위기하에서 5분간 새로 증류된 DMF(1 ㎖/100 ㎎의 수지) 중에서 배양하였다. DMF 중의 HOBt(1 내지 3 당량) 및 DIPCDI(1 내지 2 당량)에 의해 예비-활성화된, 첫 번째 Fmoc-보호된 아미노산(1 내지 3 당량)의 0.5 M 용액을 상기 수지에 가하고, 이어서 상기 수지를 질소 분위기하에서 1 내지 3시간 동안 진탕시켰다. 정성적인 닌하이드린 시험을 사용하여 커플링 완료를 모니터하였다. 첫 번째 아미노산의 커플링 후에, 상기 수지를 DMF, DCM 및 다이에틸 에테르(50 ㎖ X 4)로 세척하였다. 다음 아미노산의 커플링을 위해서, 먼저 수지와 커플링된 첫 번째 아미노산상의 Fmoc-보호를 10 내지 20% 피페리딘 용액을 사용하여 탈보호시킨 다음 상술한 바와 같이 적합한 커플링제를 사용하여 Fmoc-보호된 두 번째 아미노산을 커플링시켰다. 탈보호, 세척, 커플링 및 세척의 반복된 주기를 목적하는 펩타이드 쇄가 수지상에 조립될 때까지, 상기 일반적인 (반응식 1)에 따라 수행하였다. 최종적으로, 상기 제조된 Fmoc-보호된 펩티딜-수지를 상술한 바와 같이 20% 피페리딘 처리에 의해 탈보호시키고 펩티딜-수지를 DMF, DCM 및 다이에틸 에테르로 세척하였다. 목적하는 펩타이드를 함유하는 수지를 10 내지 15분간 질소압하에서 건조시키고 절단/탈보호를 가하였다.
당해 분야의 숙련가의 범위내에 있는 상기 프로토콜 및 그의 적합한 변화를 사용하여, 본 발명에서 설계된 단쇄 펩타이드를 Fmoc-SPPS 접근법을 사용하여 제조하였다. 더욱 또한, 수지 결합된 단쇄 펩타이드를 하기의 프로토콜을 사용하여 절단하고 탈보호하고, 정제하고 특성규명하였다.
절단 및 탈보호
목적하는 단쇄 펩타이드를 하기와 같이 TFA 절단 혼합물로 처리함으로써 그의 각각의 펩티딜-수지로부터 절단하고 탈보호하였다. TFA/수/트라이아이소프로필실란(95:2.5:2.5)(10 ㎖/100 ㎎의 펩티딜-수지)의 용액을 펩티딜-수지에 가하고 상기 혼합물을 가끔 교반하면서 실온에서 유지시켰다. 상기 수지를 여과하고, 절단 혼합물로 세척하고 합한 여액을 증발 건조시켰다. 수득된 잔사를 10 ㎖의 수에 용해시키고 수성층을 에테르로 3회 추출하고 최종적으로 수성층을 동결-건조시켰다. 동결-건조 후에 수득된 조 펩타이드를 하기와 같이 예비 HPLC에 의해 정제하였다:
조 단쇄 펩타이드의 예비 HPLC 정제
예비 HPLC를 시마츠(Shimadzu) LC-8A 액체 크로마토그래피상에서 수행하였다. DMF 또는 수 중에 용해된 조 펩타이드의 용액을 250 X 50 ㎜ 치수의 세미-프렙 컬럼(루나 10 μ; C18; 100 Å)에 주입하고 220 ㎚에서 PDA 검출기에 의해 유출물을 모니터하면서 15 내지 50 ㎖/분의 유량을 사용하여 선형 구배의 수 중 ACN(둘 다 0.1% TFA로 완충됨)으로 용출시켰다. 0.1% TFA로 완충된, 수-ACN 혼합물의 20% 내지 70%의 전형적인 구배를 50분의 기간에 걸쳐 분당 1% 구배 변화로 사용하였다. 용출된 목적하는 생성물을 단일의 10 내지 20 ㎖ 분획으로 수집하고 순수한 단쇄 펩타이드를 각각의 HPLC 분획의 동결건조에 의해 비결정성 백색 분말로서 수득하였다.
정제된 단쇄 펩타이드의 HPLC 분석
상술한 바와 같이 예비 HPLC에 의해 정제 후에, 각각의 펩타이드를 시마츠 LC-10AD 분석 HPLC 시스템상에서 분석학적 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 단쇄 펩타이드의 분석학적 HPLC 분석을 위해서, 루나 5 μ; C18; 100 Å, 치수 250 X 4.6 ㎜ 컬럼을 0.1% TFA 및 ACN 완충제의 선형 구배와 함께 사용하였으며 크로마토그램의 포착을 PDA 검출기를 사용하여, 220 ㎚에서 수행하였다.
질량 분광분석에 의한 특성규명
각각의 펩타이드를 플로우 인젝션 또는 LC/MS 모드로 전기분무 이온화 질량 분광분석(ESI-MS)에 의해 특성규명하였다. 3중 사중극자 질량 분광계(API-3000(MDS-SCIES, 캐나다 소재)를 모든 분석에 양이온 및 음이온 전기분무 모드로 사용하였다. 전체 스캔 데이터를 단위 분별로 작동하는 사중극자의 질량 범위에 걸쳐 획득하였다. 모든 경우에, 실험에 의해 측정된 분자량은 계산된 단일동위원소 분자량의 0.5 달톤 내에 있었다. 질량 크로마토그램의 정량분석을 애널리스트(Analyst) 1.4.1 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
하기의 표 1(i)는 상술한 바와 같은 SPPS 접근법을 사용하여 합성된 단쇄 펩타이드의 목록이다. 목록에서 언급된 서열번호 1은 WO 2011027257로부터의 참조로서 간주되었다.
[표 1(i)]
Figure pct00003
Figure pct00004
또 다른 바람직한 실시양태에서 본 발명의 펩타이드를 당해 분야에 주지된 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. 재조합 방법을 사용하여 본 발명의 펩타이드를 생성시키는 것도 또한 가능하다. 상기 펩타이드를 미생물, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스와 같은 세균, 또는 상기와 같은 펩타이드의 발현이 가능한 임의의 다른 세균, 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에, 스키조사카로마이세스 폼베, 칸디다, 피키아 파스토리스 또는 펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 다른 효모 또는 진균에서, 진핵생물 세포, 예를 들어 포유동물 또는 곤충 세포에서, 또는 재조합 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 심리키 포레스트 바이러스, 바큘로바이러스, 박테리오파지, 신드비스 바이러스 또는 센다이 바이러스에서 생성시킬 수 있다. 또한, 재조합적으로 생성된 펩타이드의 단리 및 정제 방법이 당해 분야에 주지되어 있으며, 상기 방법은 예를 들어 젤 여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등을 포함한다.
DT 접합을 위한 과정
디프테리아 독소는 다이설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 서브유닛을 함유하는, 535개의 아미노산으로 이루어지는 단일 폴리펩타이드 쇄이다. 상기 서브유닛 중 하나는 세포 표면에 결합하여, 보다 안정한 서브유닛이 숙주 세포를 침투할 수 있게 한다. 접합을 위해서, 디프테리아 톡소이드 및 펩타이드는 동몰 농도일 것이 필요하다. DT 및 펩타이드의 농도는 2 내지 50 ㎎/㎖이다. 첫 번째 단계에서 상기 디프테리아 톡소이드를 포스페이트 완충된 염수에 용해시킴으로써 용액으로 만든다. 이어서, 카복실산 가교결합에서 첫 번째 단계를 제공하는 EDAC(1-에틸 3,3 다이메틸아미노프로필 카보다이이미드)를 가하였다. EDAC는 아미드 결합 형성을 통한 1차 아민과의 직접적인 반응을 위해 카복실기를 활성화시키며, 따라서 상기 디프테리아 톡소이드를 펩타이드와의 접합을 위해 초회 항원자극한다. 더욱이, EDAC-매개된 가교결합은 산성 pH에서 더 유효하다. 따라서, 상기 반응은 DT를 EDAC와 pH 6.0에서 MES 완충제(40-모폴리노에탄 설폰산)의 존재하에 1분간 배양함으로써 일어나게 된다. 더욱이, 상기 MES 존재하에서의 EDAC 커플링 방법은 중간체를 형성시킴으로써 접합 효율을 개선시킨다. 이어서, ADH(아디프산 다이하이드라지드)를 가하였으며, 상기는 DT 및 펩타이드에 비교적 안정한 하이드로존 결합을 생성시키는 동종이작용성 가교결합 시약이다. 결합을 부위-특이적인 방식으로, 먼저 산화 및 이어서 가교결합(상기 하이드라지드의 낮은 pKa로 인해 pH 5.0에서 수행한다)에 의해 수행한다. 이는 1차 아민에 의한 경쟁을 피한다. EDAC를 다시 가하고, 상기 혼합물을 2 내지 8 ℃에서 3시간 동안 배양하여 접합을 개시시킨다. 상기 제조된 DT 접합된 펩타이드를 10 kD 컬럼을 통해 투석시키고 불순물의 제거를 위해 멸균 여과하고(0.2 μ 필터), 순수한 펩타이드-DT 접합체를 적어도 1주일간 2 내지 8 ℃에서 보관한다.
또 다른 실시양태에서, 접합을 WO 2011027257 및 종래 기술에 제공된 일반적인 과정에 따라 디프테리아 독소의 유전자 해독된 형태인 CRM197을 사용하여 수행하였다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 백신을 피하, 근육내, 피내, 정맥내로 투여할 수 있다(예를 들어 문헌["Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004] 참조). 상기 제형은 투여 경로에 따라 각각의 담체, 아쥬반트, 및/또는 부형제로 이루어질 수 있다.
백신 제형
보다 큰 면역효능 및 보호성 백신의 설계를 위해서, 최종 백신 제형은 아쥬반트의 유형에 따라 면역 반응을 체액 또는 세포-매개된 면역성으로 유도할 수 있는 면역강화 성질을 갖는 아쥬반트를 함유할 수 있다. 전통적인 아쥬반트, 예를 들어 알루미늄 염, 유화액, 리포솜 및 비로솜은 백신 항원을 효율적인 방식으로 면역계에 제공하고 항원의 방출 및 보관을 조절하여 특이적인 면역 반응을 증가시킨다. 아쥬반트의 두 번째 부류는 면역자극제로, 면역계에 영향을 미치고 항원에 대한 면역 반응을 증가시킨다. 예를 들어, 상기 아쥬반트는 MHC 분자, 보조-자극 신호의 활성화를 통해, 또는 관련된 세포내 신호전달 경로를 통해 사이토킨 생산에 영향을 미친다.
현재 승인된 백신 아쥬반트 중 다수는 특히 면역학적으로 저반응성 집단, 예를 들어 노인 및 면역손상된 집단(이 경우 손상된 T-세포 기능으로 인해 감소된 T-세포 의존성 항체 반응이 존재한다)에서 상이한 표적 병원체에 대한 효율적인 보호 면역 반응을 유도하기에 항상 충분히 효능이 있지는 않음을 발견하였다. 면역강화 성질을 갖는 아쥬반트의 사용은 C형 간염 바이러스(HCV), HIV, HBV, HPV, 인플루엔자 및 암과 같은 다수의 백신에서 보다 유효한 반응을 생성시킨다. 따라서 백신 설계에 보다 합리적인 접근법은 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 조절 및 증대시키고/시키거나 TLR 활용을 통해 수지상 세포(DC)에 영향을 미칠 수 있는 면역자극성 아쥬반트의 사용이다. T 세포는 면역 반응에 가장 유효한 부문이며 백신접종에 대한 면역 반응의 조절에서 T 세포의 인지된 중요성을 고려하면, 백신접종 전략에서 이러한 신규 아쥬반트의 사용은 어울리는 것 같다.
제형에 사용될 수 있는 다른 아쥬반트
DT-접합된 펩타이드로부터 보다 강한 면역 반응을 이끌어내기 위해서, 제형에 첨가되는 추가적인 아쥬반트는 하기와 같다.
1) 알룸(수산화 알루미늄 젤, 2% 습윤 젤 현탁액)
알룸은, 항원이 장시간 신체 중에 남아있는 불용성 알루미늄 염에 의해 항원보강되므로 유효한 아쥬반트이다. 항원은 상기 불용성 염 입자로부터 서서히 방출되어, 면역계의 연장되고 유효한 자극을 허용한다('데포 효과')[1]. 상기 데포 효과 외에 또는 상기 효과와 대조적으로, 불용성 알루미늄 염은 최종적으로 T 헬퍼2(Th2)-타입 면역 반응을 생성시키는 방식으로 선천적인 면역 세포를 활성화시킨다. 알룸은 항원-제공 세포(APC)에 의한 항원의 항원 흡수를 개선시킴으로써 Th2 반응을 유도한다[2].
2) MF-59와 알룸
아다백스(AddaVax)(또한 MF59로서 공지됨)는 스쿠알렌-기재 수중 유적형 나노-유화액이다. 스쿠알렌은 프로인트 아쥬반트에 사용되는 파라핀 오일보다 더 쉽게 대사되는 오일이다[3]. 스쿠알렌 수중 유적형 유화액은 세포(Th1) 및 체액(Th2) 면역 반응을 모두 이끌어낸다[4,5]. 상기 아쥬반트 부류는 대식세포 및 과립구에 의한 사이토킨 및 케모킨 생성의 자극과 함께 항원 제공 세포의 모집 및 활성화를 통해 작용한다[3].
3) Poly(I:C)와 같은 TLR3 작용물질, 모노포스포릴 지질 A 또는 GLA-SE와 같은 TLR4 작용물질, 플라젤린과 같은 TLR5 작용물질, 가르디퀴모드 및 이미퀴모드와 같은 TLR7 작용물질 R848과 같은 TLR7/8 작용물질, N-글리콜릴-MDP.CpG-함유 핵산(여기에서 시토신은 메틸화되지 않는다)과 같은 NOD2 작용물질, QS21(사포닌 아쥬반트), 인터류킨, 베타-시토스테롤 등과 같은 다른 아쥬반트와 알룸.
상기 모든 실험에 사용된 아쥬반트는 알룸 및 모노포스포릴 지질 A의 안정한 제형의 조합이다.
신규 펩타이드의 친화성 측정
재조합 인간 PCSK9에 대한 신규 펩타이드의 친화성 매개변수를 비아코어(Biacore) 장비(비아코어 T200, GE 헬쓰케어(Healthcare))를 사용하여, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 분석하였다. SPR 실험을 25 ℃에서 비아코어 T200 장치(GE 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)로 수행하였다.
표면 준비(단백질 고정화를 위한 과정)
10 mM 아세테이트 완충제, pH 5.0 중에서 100 내지 150 ㎍/㎖로 희석된 정제된 재조합 인간 PCSK9(His-태그된, BPS 바이오사이언시즈(Biosciences))를 시리즈 S 센서 칩 CM5의 4개의 유동 셀 중 하나상에 아민-커플링 화학을 사용하여 대략 6000 내지 8000 RU(공명 단위)의 수준으로 고정화시켰다. 상기 표면을 1 M 에탄올아민, pH 8.5으로 차단하였다. 하나의 유동 셀을 참조 공제용 블랭크(PCSK9 없음)로서 고정화시켰다. 150 mM NaCl을 갖는 10 mM Hepes(pH 7.4)를 실행 완충제로서 사용하였다. 나머지 2개의 유동 셀을 추후의 사용을 위해 남겨두었다.
결합 및 동역학/친화성 실험
NCE(신규 펩타이드)의 100X 모액을 100% DMSO 중에서 제조하였으며, DMSO의 최종 농도가 1%로 유지되게 하는 농도 범위로 10 mM Hepes, pH 7.4 + 150 mM NaCl 중에서 희석시켰다. 블랭크뿐만 아니라 리간드(단백질) 고정화된 표면위로 다양한 농도의 NCE를 통과시킴으로써 결합/동역학 연구를 수행하였다. 각각의 주기는 5 내지 30 ㎕/분의 유량으로 60s 또는 120s 분석물(희석된 소분자 약물) 주입(결합 단계)에 이어서, 60 또는 180s의 해리 단계로 이루어졌다. 경우에 따라, 10 mM 글리신/HCl(pH 1.5)의 30s(15 ㎕) 주입 및 10 mM NaOH의 20s 또는 30s(10 또는 15 ㎕) 주입을 사용하여 재생을 수행하였다. 데이터를 비아코어 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 곡선은 참조-공제되었다. 기준선을 모든 곡선에 대해 0으로 조절하였으며 데이터를 샘플 주입 종료 5s 전에 결합 RU(5s 창의 평균)로서 나타내었다.
Kd(평형 해리 상수) 측정을 위해서 분석물 곡선을 완충제 블랭크로부터 공제하고 샘플 1:1 상호작용을 가정하여 모델링하여 동역학 데이터를 생성시켰다.
BALB/C 마우스에서 면역원성 연구
동물 농장에서 나온 12 내지 15주령의 암컷 BALB/c 마우스를 2 내지 3주간 계속 적응시켰다. 마우스에게 먹이와 물을 마음껏 제공하였으며 상기 마우스를 12시간 명/암 주기하에서 유지시켰다. 0일째(처리-전)에, 총 콜레스테롤 측정을 위해 동물을 채혈하고 혈청을 수확하였다. 동물을 그의 총 콜레스테롤 및 체중을 기준으로 다양한 처리에 따라 무작위 분류하였다. 채혈 0일째(처리-전) 다음날 동물을 표 1에 언급한 바와 같이 0.3 ㎖의 백신 제형으로 피하 또는 근육내 경로에 의해 면역시켰다. 다음 추가 주사를 첫 번째 주사 후 2주 및 4주째에 제공하였으며 면역원성 측정을 위해 동물을 2주째에, 그 후 7주까지 및 이어서 32주까지 4주마다 채혈하였고, 채혈의 상세한 스케줄은 0일째(처리-전)부터 첫 번째 백신 투여후 5주째, 7주째, 20주째, 24주째, 28주째, 32주째, 45주째 및 57주째였다. 혈청을 분리시키고 혈청 총 콜레스테롤을 측정하고 면역원성 또는 항체 확인을 PCSK9 항체 역가에 대해 ELISA를 사용하여 수행하였으며, 혈청 항체와 인간 PCSK9와의 결합을 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석 및 LDLR-PCSK9 상호작용 억제 분석을 사용하여 수행하였다.
[표 1]
Figure pct00005
hApoB100/hCETP 이중-트랜스제닉 마우스(dTg)에서 면역원성 연구
동물 농장에서 나온 8주령이 넘은 수컷 또는 암컷 hApoB100/hCETP dTg 마우스를 2 내지 3회 계속 적응시켰다. 마우스에게 먹이와 물을 마음껏 제공하였으며 상기 마우스를 12시간 명/암 주기하에서 유지시켰다. 0일째(처리-전)에, LDL-콜레스테롤(LDL-C), 총 콜레스테롤, HDL-C 및 트라이글리세라이드 측정을 위해 동물을 채혈하고 혈청을 수확하였다. 동물을 그의 LDL-C 및 체중을 기준으로 다양한 처리에 따라 무작위 분류하였다. 채혈 다음날 동물을 0.3 ㎖의 백신 제형으로 피하 또는 근육내 경로에 의해 면역시켰다. 다음 추가 주사를 첫 번째 주사 후 2주 및 4주째에 제공하였으며 동물을 세 번째 주사 후 2주째에 면역원성 측정을 위해 채혈하였다. 혈청을 분리시키고 혈청 LDL-C, 총 콜레스테롤, HDL-C 및 트라이글리세라이드 수준을 측정하고 면역원성 또는 항체 확인을 PCSK9 항체 역가에 대해 ELISA를 사용하여 수행하였으며, 혈청 항체와 인간 PCSK9와의 결합을 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석 및 LDLR-PCSK9 상호작용 억제 분석을 사용하여 수행하였다.
혈청 LDL-C, HDL-C, 총 콜레스테롤 및 트라이글리세라이드 수준을 코바스(Cobas) c311 자동분석기(로슈, 독일 소재)상에서 상업적인 키트(로슈 다이아그노스틱스, 독일 소재)를 사용하여 측정하였다.
항-PCSK-9 ELISA에 의한 체액 반응의 평가
특정한 시간 간격(각각의 추가접종으로 면역화 후 15일째)으로, 혈청 샘플을 모든 마우스 그룹으로부터 수집하였다. 96-웰 ELISA 플레이트(#442402)를 PCSK-9 단백질 50 ng/웰로 예비-코팅하고 플레이트를 밤새 2 내지 8℃에서 배양하였다. 다음날, 웰을 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거하고 2% 탈지 우유-PBST 중에서 2시간 동안 차단시키고, PBST로 세척하였다. 혈청 샘플을 PBST 중에서 제조된 0.2% 탈지 우유로 1:20 희석시켰다. 적합한 부피의 샘플 및 표준을 각 웰에 가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 항-마우스 IgG 2차 HRP-표지된 항체를 각 웰에 가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 이어서 세척하였다. OPD-기질을 각 웰에 가하고 암실에서 실온에서 20분간 배양하였다. 플레이트를 스펙트라맥스(Spectramax) 미세플레이트 판독기상에서 492 ㎚에서 판독하였다. 시험된 모든 DT-접합된 PCSK-9 펩타이드 중에서, 최고 반응을 제공한 것을 표준으로 처리하였으며, 그의 위약을 사용하여 보정된 OD를 계산하였다. PBS를 주사한 마우스의 혈청을 음성 대조용으로서 사용하였다. 상기 음성 대조용 값을 사용함으로써, 컷-오프값을 계산하였으며, 상기 컷 오프값을 초과하는 보정된 OD를 표준으로서 처리하였다. 모든 시험 샘플은 표준 곡선으로부터 외삽된 PCSK-9에 대한 절대 항체 역가를 제공하였으며, 값을 로그 10으로 나타내었다.
LDLR-PCSK9 상호작용 억제 분석
백신 처리된 동물의 혈청에서 항체(Ab)에 의한 LDLR-PCSK9 상호작용의 억제를 약간 변형시킨 PBS 바이오사이언스 시험관내 PCSK9[비오틴화된]-LDLR 결합 분석 키트(BPS 바이오사이언스, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 사용하여 분석하였다. 먼저, LDLR 엑토도메인을 96-웰 플레이트상에 코팅하고 플레이트를 밤새 배양하였다. 이어서, PCSK9-비오틴을 1x PCSK9 분석 완충제 중에서 희석시켜 2.5 ng/㎕(50 ng/20 ㎕) 농도를 획득하고 상기 마스터 믹스, 시험 억제제(동물 연구로부터의 혈청 샘플), 억제제 완충제를 LDL-R 코팅된 플레이트에 가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 최종적으로, 상기 플레이트를 스트렙트아비딘-HRP로 처리한 다음 HRP 기질을 가하여 화학발광을 생성시키며, 이어서 제조사의 설명에 따라 화학발광 판독기를 사용하여 측정하였다. 상대 억제를, 백신 처리된 동물로부터의 혈청 샘플 중 PCSK9-LDLR 결합의 강도와 100%로서 간주된 위약 처리된 경우간의 억제 백분율의 차이로서 나타내었다.
결과
I) 표 2. 비아코어(비아코어 T200, GE 헬쓰케어)를 사용하는, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 분석된 재조합 인간 PCSK9에 대한 신규 펩타이드의 친화성
[표 2]
Figure pct00006
II) 하기 표 3에 제공된 ELISA 분석에 의해 측정된, 처리된 동물의 혈청 샘플 중 PCSK9에 대한 평균 항체 역가
[표 3]
Figure pct00007
모든 펩타이드 제형은 인간 PCSK9에 대해 매우 높은 수준의 항체 역가를 나타내었으며 역가는 서열번호 1에 비해 서열번호 7, 8, 12의 펩타이드의 경우에 더 높았다. 매우 높은 항체 반응은 백신 투여후 57주째까지 유지되었으며, 이는 몇 개의 펩타이드 제형의 경우 1년이 넘는 동안 면역원성 반응의 가능성을 입증하였다.
III) 백신 처리된 동물의 혈청에서 항체(Ab)에 의한 LDLR-PCSK9 상호작용의 억제를 기능 분석의 척도로서 시험관내 PCSK9[비오틴화된]-LDLR 결합 분석 키트를 사용하여 분석하였다. 항체(Ab)에 의한 LDLR-PCSK9 상호작용 억제 퍼센트를 5주째에 1회 측정하였으며, 표 4에 제공하였다.
[표 4]
Figure pct00008
거의 모든 펩타이드 제형은 5주째에 LDLR-PCSK9 상호작용의 40 내지 70% 억제를 나타내었다. 서열번호 7, 8, 12에 의해 나타난 상호작용 억제는 서열번호 1의 경우보다 현저하게 더 컸다.
IV) 처리된 동물의 혈청 샘플에서 항체 검출을 또한 하기 표 5에 제공된 SPR 분석을 사용하여 인간 PCSK9에 대한 친화성 측정에 의해 확인하였다.
[표 5]
Figure pct00009
펩타이드 제형으로 처리된 동물 샘플의 혈청은 위약에 비해 반응 단위의 증가를 나타내었다. 5주 및 57주째에, 서열번호 1에 비해, 서열번호 12는 현저하게 더 높은 항체 반응을 나타내었고 서열번호 8은 5주째에 현저하게 더 높은 항체 반응을 나타내었다. 백신 투여후 57주째까지 매우 높은 항체 반응이 유지되었으며; 이는 펩타이드 제형의 경우 1년이 넘는 동안 면역원성 반응의 가능성을 명백히 입증한다.
본 발명의 펩타이드를 포유동물 또는 개인에게 면역당 0.1 ng 내지 10 ㎎, 바람직하게는 0.5 내지 500 ㎍의 양으로 투여한다. 바람직한 실시양태에서 상기 량은 백신 중에 존재하는 모든 펩타이드(하나 초과의 펩타이드가 백신 중에 사용되는 경우)를 지칭한다.
단일 투여형을 생성시키기 위해 담체 물질과 병용될 수 있는 펩타이드의 양은 치료되는 숙주 및 특정한 투여 방식에 따라 변할 것이다.
백신의 용량은 포유동물 또는 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 상기 개인에서 목적하는 반응을 끌어내는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 투여량 섭생을 최적의 치료학적 반응을 제공하도록 조절할 수 있다. 예를 들어, 다수의 분할 용량을 매일 투여하거나 또는 상기 용량을 치료 상황의 긴급사태에 의해 지시되는 바와 비례하여 감소시킬 수 있다. 백신의 용량을 또한 상황에 따라 최적의 예방학적 용량 반응을 제공하도록 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드 및 백신을 개인에게, 항상 PCSK9에 대한 항체의 수준에 따라 수일, 1 또는 2주 또는 심지어 수개월 또는 수년의 간격으로 투여할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 적합한 면역원성 담체와 접합시 백신으로서 작용할 수 있다. 이들 백신은 투여시 PCSK9에 결합하는 항체를 형성할 수 있다. 이들 백신은 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증과 같은 질환의 예방/치료에 적합할 수 있다.
참고문헌
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SEQUENCE LISTING-Rule 13ter <110> Cadila Healthcare Limited <120> Novel peptide based PCSK9 vaccine <130> CHL-PCT0769 <140> PCT/IB2018/052555 <141> 2018-04-12 <150> IN 201721013281 <151> 2017-04-13 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <400> 1 Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Norleucine <400> 2 Ser Xaa Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> Xaa is alpha-Amino-isobutyric acid <400> 3 Ser Xaa Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> PEPTIDE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Norleucine <400> 4 Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Xaa Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> 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<220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 24 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (6)..(6) <223> Xaa is alpha-Amino-isobutyric acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 25 Ser Ile Xaa Trp Asn Xaa Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <220> <221> Xaa <222> (9)..(9) <223> Xaa is alpha-Amino-isobutyric acid <400> 26 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Xaa Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <400> 27 Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Xaa Cys 1 5 10 <210> 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is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <400> 31 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Xaa Cys 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is alpha-methyl-proline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 32 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1-amino-cyclopropanecarboxylic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 33 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1-amino-cyclopentanecarboxylic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 34 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 1-amino-cyclohexanecarboxylic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 35 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (6)..(6) <223> Xaa is beta alanine <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 36 Ser Ile Xaa Trp Asn Xaa Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is alpha-methyl-glutamic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 37 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Xaa Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is homoglutamic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 38 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Xaa Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is alpha-methyl-aspartic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 39 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Xaa Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (6)..(6) <223> Xaa is Homoleucine <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 40 Ser Ile Xaa Trp Asn Xaa Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (6)..(6) <223> Xaa is alpha-methyl-aspartic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 41 Ser Ile Xaa Trp Asn Xaa Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Thiaproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 42 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 2-Thiaproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 43 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 3-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 44 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Aminoproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 45 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 3-Aminoproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 46 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is3-fluoroproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 47 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-fluoroproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 48 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is O-methyl-serine <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 49 Xaa Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is homoserine <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 50 Xaa Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is O-methyl-threonine <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 51 Xaa Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (1)..(1) <223> Xaa is O-methyl-homoserine <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 52 Xaa Ile Xaa Trp Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is 2-fluorophenylalanine <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 53 Ser Ile Xaa Xaa Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is alpha-methyl-phenylalanine <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 54 Ser Ile Xaa Xaa Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is alpha-methyl-2-fluorophenylalanine <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 55 Ser Ile Xaa Xaa Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is alpha-methyl-2,6-diflurophenylalanine <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 56 Ser Ile Xaa Xaa Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> Xaa is alpha-methyl- 2-aminophenyl pentanoic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 57 Ser Ile Xaa Xaa Asn Leu Glu Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PCSK9 <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is 4-Hydroxyproline <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa is 2-amino-4-cyanobutanoic acid <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> Xaa is Citrulline <400> 58 Ser Ile Xaa Trp Asn Leu Xaa Xaa Ile Thr Pro Cys 1 5 10

Claims (25)

  1. 하기 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드:
    [화학식 I]
    A-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-B
    상기 식에서,
    A는 -NH-R1, R2-CO-NH- 기를 나타내고, 여기에서 R1은 수소 또는 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄를 나타내고; R2는 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄, (C1-6)알콕시, (C3-6)사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 아릴알킬기 중에서 선택되고;
    B는 R3, -COOR3, -CONHR3 또는 CH2OR3을 나타내고, 여기에서 R3은 H 또는 적합한 아미노산을 나타내고;
    Z1은 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 세린, 트레오닌, 발린, 알라닌, Aib 및 그의 적합한 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
    Z2는 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌, Aib 및 그의 적합한 유도체 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
    Z3은 프롤린, 1-아미노 카보사이클릭 산 및 그의 적합한 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
    Z4는 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신 및 그의 적합한 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
    Z5는 글루타민, 히스티딘, 아스파라진 및 그의 적합한 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
    Z6은 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 아이소류신, 류신, 알라닌, 트레오닌, 아스파트산, Aib 및 그의 적합한 유도체 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
    Z7은 친수성의 음으로 하전된 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
    Z8은 아르기닌, 호모아르기닌, 시트룰린, 글루타민, 아스파라진, 리신 및 그의 적합한 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
    Z9는 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌, Aib 및 그의 적합한 유도체 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
    Z10은 극성이고 하전되지 않은 아미노산 잔기의 그룹 중에서 선택된, 세린, 트레오닌, 발린, 알라닌, Aib 및 그의 유도체 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
    Z11은 프롤린, 1-아미노 카보사이클릭 산 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이고;
    Z12는 극성이고 하전되지 않은 아미노산 잔기 중에서 선택된, 시스테인, 호모시스테인 및 그의 유도체의 그룹 중에서 선택된 아미노산 잔기이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    A가 -NH-R1, R2-CO-NH- 기를 나타내고, 여기에서
    R1이 수소 또는 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄이고;
    R2가 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄, (C1-6)알콕시, (C3-6)사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 아릴알킬기 중에서 선택되고; 여기에서
    상기 아릴기가 페닐, 나프틸, 인다닐, 플루오레닐 또는 바이페닐기 중에서 선택되고; 상기 헤테로아릴기가 피리딜, 티에닐, 퓨릴, 이미다졸릴, 벤조퓨라닐기 중에서 선택되고;
    B가 R3, -COOR3, -CONHR3 또는 CH2OR3을 나타내고, 여기에서 R3이 H 및 세린, 시스테인, 발린, 알파-메틸-발린, Lys(비오틴), Lys(알킬), Lys(아세틸)과 같은 아미노산 중에서 선택되는
    화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    Z1이 세린, 트레오닌, 발린, 알라닌, Aib, 호모세린, O-메틸-트레오닌, O-메틸-세린 또는 O-메틸-호모세린 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  4. 제 1 항에 있어서,
    Z2가 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌 또는 Aib, N-메틸-아이소류신 또는 N-메틸-류신 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  5. 제 1 항에 있어서,
    Z3이 프롤린, 하이드록시프롤린, 티아프롤린, 아미노프롤린, 2-티아프롤린, 3-하이드록시프롤린, 3-아미노프롤린, 알파-메틸-프롤린, 3-플루오로프롤린, 4-플루오로프롤린, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 1-아미노-사이클로펜탄카복실산 또는 1-아미노-사이클로헥산카복실산 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  6. 제 1 항에 있어서,
    Z4가 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신, 2-플루오로페닐알라닌, 알파-메틸 페닐알라닌, 알파-메틸-2-플루오로페닐알라닌, 알파-메틸-2,6-다이플루오로페닐알라닌, 2-아미노-5-페닐-펜탄산, 알파-메틸-2-아미노-5-페닐펜탄산, 또는 2'-에틸-4'-메톡시-바이페닐알라닌 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  7. 제 1 항에 있어서,
    Z5가 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라진 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  8. 제 1 항에 있어서,
    Z6이 아이소류신, 류신, 알라닌, 트레오닌, 아스파트산, Aib, 노르아이소류신, N-메틸-류신, 호모류신, 베타-알라닌 또는 알파-메틸-아스파트산 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  9. 제 1 항에 있어서,
    Z7이 글루탐산, 아스파트산, 알파-메틸-아스파트산, 알파-메틸-글루탐산, 2-아미노-4-시아노부탄산 또는 호모글루탐산인 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  10. 제 1 항에 있어서,
    Z8이 아르기닌, 호모아르기닌, 시트룰린, 글루타민, 아스파라진 또는 리신 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  11. 제 1 항에 있어서,
    Z9가 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌, Aib 또는 N-메틸 아이소류신 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  12. 제 1 항에 있어서,
    Z10이 세린, 트레오닌, 발린, Aib 또는 알라닌 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  13. 제 1 항에 있어서,
    Z11이 프롤린, 하이드록시프롤린, 티아프롤린, 아미노프롤린, 알파-메틸-프롤린, 3-플루오로프롤린, 4-플루오로프롤린, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 1-아미노-사이클로펜탄카복실산 또는 1-아미노-사이클로헥산카복실산 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  14. 제 1 항에 있어서,
    Z12가 시스테인 또는 호모시스테인 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  15. 제 1 항에 있어서,
    A가 -NH-R1, R2-CO-NH- 기를 나타내고, 여기에서 R1이 수소 또는 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄를 나타내고; R2가 치환된 선형 또는 분지된 (C1-18)알킬쇄, (C1-6)알콕시, (C3-6)사이클로알킬, 아릴, 및 아릴알킬기 중에서 선택되고; 여기에서 상기 아릴기가 페닐, 나프틸, 인다닐, 플루오레닐 또는 바이페닐기 중에서 선택되고; B가 R3, -COOR3, -CONHR3 또는 CH2OR3을 나타내고, 여기에서 R3이 H, 세린, 시스테인, 발린, 알파-메틸-발린, Lys(비오틴), Lys(알킬), Lys(아세틸) 중에서 선택되고, Z1이 세린, 트레오닌, 발린, 알라닌, Aib, 호모세린, O-메틸-트레오닌, O-메틸-세린 또는 O-메틸-호모세린 중에서 선택되고, Z2가 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌, Aib, N-메틸-아이소류신 또는 N-메틸-류신 중에서 선택되고, Z3이 프롤린, 하이드록시프롤린, 티아프롤린, 아미노프롤린, 2-티아프롤린, 3-하이드록시프롤린, 3-아미노프롤린, 알파-메틸-프롤린, 3-플루오로프롤린, 4-플루오로프롤린, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 1-아미노-사이클로펜탄카복실산 또는 1-아미노-사이클로헥산카복실산 중에서 선택되고, Z4가 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신, 2-플루오로페닐알라닌, 알파-메틸 페닐알라닌, 알파-메틸-2-플루오로페닐알라닌, 알파-메틸-2,6-다이플루오로페닐알라닌, 2-아미노-5-페닐-펜탄산, 알파-메틸-2-아미노-5-페닐펜탄산, 또는 2'-에틸-4'-메톡시-바이페닐알라닌 중에서 선택되고, Z5가 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라진 중에서 선택되고, Z6이 아이소류신, 류신, 알라닌, 트레오닌, 아스파트산, Aib, 노르아이소류신, N-메틸-류신, 호모류신, 베타-알라닌 또는 알파-메틸-아스파트산 중에서 선택되고, Z7이 글루탐산, 아스파트산, 알파-메틸-아스파트산, 알파-메틸-글루탐산, 2-아미노-4-시아노부탄산 또는 호모글루탐산이고, Z8이 아르기닌, 호모아르기닌, 시트룰린, 글루타민, 아스파라진 또는 리신 중에서 선택되고, Z9가 아이소류신, 류신, 노르류신, 글리신, 알라닌, Aib 또는 N-메틸 아이소류신 중에서 선택되고, Z10이 세린, 트레오닌, 발린, Aib 또는 알라닌 중에서 선택되고, Z11이 프롤린, 하이드록시프롤린, 티아프롤린, 아미노프롤린, 알파-메틸-프롤린, 3-플루오로프롤린, 4-플루오로프롤린, 1-아미노-사이클로프로판카복실산, 1-아미노-사이클로펜탄카복실산 또는 1-아미노-사이클로헥산카복실산 중에서 선택되고, Z12가 시스테인 또는 호모시스테인 중에서 선택되는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  16. 하기의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드:
    SIPWNLERITPC;
    S-Nle-PWNLERITPC;
    S-Aib-PWNLERITPC;
    SIPWNLER-Nle-TPC;
    SIPWNLER-Aib-TPC;
    SIPWNLE-Har-ITPC;
    SIPWN-Nle-ERITPC;
    SI-Hyp-WNLERITPC;
    SIPWNLERIT-Hyp-C;
    SIPWN-Aib-ERITPC;
    Ac-SIPWNLERITPC;
    SIPWNLE-Cit-ITPC;
    SIPWNLERI-Aib-PC;
    Aib-IPWNLERITPC;
    S-(N-Me-Ile)-IPWNLERITPC;
    SIPWN-(N-Me-Leu)-ERITPC;
    SIPWNLER-(N-Me-Ile)-TPC;
    SIP-APPA-NLERITPC;
    SIP-Bip(OMe)-NLERITPC;
    SI-Hyp-WNLER-Aib-TPC;
    SI-Hyp-WN-Aib-ERITPC;
    SIPWNLE-Cit-Aib-TPC;
    SIPWN-Aib-E-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-WN-Aib-E-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-WNLE-Cit-Aib-TPC;
    SIPWNLE-Cit-IT-Hyp-C;
    SIPWN-Aib-ERIT-Hyp-C;
    SI-Hyp-WN-Aib-ERIT-Hyp-C;
    SIPWN-Aib-E-Cit-IT-Hyp-C;
    SI-Hyp-WNLE-Cit-IT-Hyp-C;
    SI-(αMe-Pro)-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-AC3C-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-AC5C-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-AC6C-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-WN-βAla-E-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-WNL-(αMe-Glu)-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-WNL-(Homo-Glu)-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-WNL-(αMe-Asp)-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-WN-HoLeu-E-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-WN-(αMe-Asp)-E-Cit-ITPC;
    SI-Thz-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-(2-Thz)-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-(3-Hyp)-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-Amp-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-(3-Amp)-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-(3-F-Pro)-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-(4-F-Pro)-WNLE-Cit-ITPC;
    Ser(OMe)-I-Hyp-WNLE-Cit-ITPC;
    HoSer-I-Hyp-WNLE-Cit-ITPC;
    Thr(OMe)-I-Hyp-WNLE-Cit-ITPC;
    HoSer(OMe)-I-Hyp-WNLE-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-(2F-Phe)-NLE-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-(αMe-Phe)-NLE-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-(αMe-2F-Phe)-NLE-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-(αMe-2,6-diF-Phe)-NLE-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-(αMe-APPA)-NLE-Cit-ITPC;
    SI-Hyp-WNL-Abu(CN)-Cit-ITPC.
  17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적합한 면역원성 담체와 접합된 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  18. A, B 및 Z1-Z12의 정의가 제 15 항에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  19. 제 17 항에 있어서,
    면역원성 담체가 디프테리아 독소(DT), 변형된 DT, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 파상풍 톡소이드(TT), 단백질 D 또는 헬퍼 T-세포 에피토프를 함유하는 임의의 다른 적합한 단백질 또는 펩타이드의 그룹 중에서 선택되는 적합한 면역원성 담체와 접합된 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  20. 제 19 항에 있어서,
    면역원성 담체가 디프테리아 독소(DT) 및 CRM(CRM197)인 적합한 면역원성 담체와 접합된 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  21. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 아쥬반트 및 다른 약학 부형제와 함께, 적합한 면역원성 담체와 접합된 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  22. A, B 및 Z1-Z12의 정의가 제 15 항에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  23. 제 21 항에 있어서,
    약학적으로 허용 가능한 아쥬반트가 알룸, TLR3 작용물질, 바람직하게는 폴리(I:C), TLR4 작용물질, 바람직하게는 모노포스포릴 지질 A 또는 GLA, TLR5 작용물질, 바람직하게는 플라젤린, TLR7 작용물질, 바람직하게는 가르디퀴모드 및 이미퀴모드, TLR7/8 작용물질, 바람직하게는 R848, NOD2 작용물질, 바람직하게는 N-글리콜릴-MDP, CpG-함유 핵산(여기에서 시토신은 메틸화되지 않는다), QS21(사포닌 아쥬반트), 인터류킨, 베타-시토스테롤의 그룹 중에서 선택되는, 적합한 면역원성 담체 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 아쥬반트와 접합된 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  24. 제 23 항에 있어서,
    하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 아쥬반트가 알룸 및/또는 GLA 및/또는 모노포스포릴 지질 A 중에서 선택되는, 적합한 면역원성 담체 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 아쥬반트와 접합된 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
  25. 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 또는 죽상동맥경화증 및 다른 심혈관 질병 중에서 선택된 건강 질환의 치료에 적합한 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
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