KR20190065234A - 면역 관문 억제제인 pd-1 및 pd-l1에 대한 항체 치료를 모니터링하기 위한 면역분석 및 조작된 단백질 - Google Patents

면역 관문 억제제인 pd-1 및 pd-l1에 대한 항체 치료를 모니터링하기 위한 면역분석 및 조작된 단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR20190065234A
KR20190065234A KR1020197001646A KR20197001646A KR20190065234A KR 20190065234 A KR20190065234 A KR 20190065234A KR 1020197001646 A KR1020197001646 A KR 1020197001646A KR 20197001646 A KR20197001646 A KR 20197001646A KR 20190065234 A KR20190065234 A KR 20190065234A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
val
ser
Prior art date
Application number
KR1020197001646A
Other languages
English (en)
Inventor
조디 베리
엘리자베스 부스
조이 안토니 조지
엘리사베트 나스시멘토
다니엘 나고르 카사스
Original Assignee
그리폴스 다이어그노스틱 솔루션즈 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 그리폴스 다이어그노스틱 솔루션즈 인크. filed Critical 그리폴스 다이어그노스틱 솔루션즈 인크.
Publication of KR20190065234A publication Critical patent/KR20190065234A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 면역 관문 억제제인 PD-1 및 PD-L1에 대한 항체 치료를 모니터링하기 위한 면역분석 및 조작된 단백질에 관한 것으로,
PD1 (세포예정사 단백질-1) 단백질의 세포외 도메인 및/또는 PD-L1 (세포예정사-리간드 1 단백질 (CD274 또는 B7-H1)) 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 세포외 도메인의 일부는 특정 형태로 발현되어 단백질로 정제되고, 이러한 단백질로의 생물학적 치료용 항체의 순환 수준을 모니터링하기 위해 면역분석에서 사용된다. 또한, 적어도 1 회 투여량의 면역치료를 받은 환자로부터 얻은 생물학적 시료 내의 생물학적 치료용 항체의 순환 수준의 양을 결정하는 방법이 기재되어 있다.

Description

면역 관문 억제제인 PD-1 및 PD-L1에 대한 항체 치료를 모니터링하기 위한 면역분석 및 조작된 단백질
본 출원은 PD-1 (세포예정사-1 단백질; programmed cell death-1 protein)의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질(Fusion proteins) 및/또는 PD-L1 (세포예정사-리간드 1 단백질; programmed cell death-ligand 1 protein) (CD274 또는 B7-H1)의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 이러한 세포외 도메인의 일부는 특정 형태로 발현되어 단백질로 정제되고, 이들 단백질로의 생물학적 치료용(biotherapeutic) 항체의 순환 수준을 모니터링하기 위해 면역분석에 사용된다. 또한, 적어도 1 회 투여량의 면역치료를 받은 환자로부터 얻은 생물학적 시료에서 치료용 항체를 검출 및 모니터링하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
배경
가장 많이 연구된 면역 관문(immune checkpoint) 표적들 중 하나인 세포예정사 1 (PD-1) 수용체는 T 세포, B 세포, 자연 살해 (natural killer; NK)/자연 살해 T (natural killer T; NKT) 세포 등을 포함한 활성화된 면역 세포 타입들의 표면에서 발현된다1. PD-1 및 PD-L1을 표적하는 여러 치료용 모노클로날 항체(monoclonal antibodies; mAb)들이 시판되고 있으며, FDA와 EMA에서는 12 종 이상의 전통적이고 이중특이적인 mAb들이 검토되고 있다.
PD-1은 T 세포 활성의 음성 조절인자이고, 종양 표면에서 PD-1과 이의 리간드들 중 하나인 PD-L1의 상호작용은 효과적인 면역 반응을 생성하는 활성화된 T 세포의 능력을 감소시키는 면역관문 차단을 나타낸다. 종양 세포 표면에서 높은 수준의 PD-L1의 발현은 세포독성 활성을 비롯한 T 세포 기능들을 억제함으로써 항-종양 반응으로부터 벗어나는 것을 가능하게 한다. PD-1 또는 PD-L1을 표적하는 치료용 항체는 리간드-수용체 상호작용을 차단하고 종양 미세 환경으로 면역 기능을 호회복시킨다. 이러한 mAb들의 사용은 많은 암 타입들에 대하여 흥미진진한 임상 반응을 나타내었고, 점점 더 많은 수의 mAb들이 임상 개발에 진입하여 왔다.
암세포에 의해 활성화된 면역 관문 차단을 목표로 하는 신규성으로 인해, 이러한 mAb들을 투여하기 위한 최적의 투여량 및 스케줄 및 이들 파라미터들을 결정하는데 필요한 도구는 충분히 개발되지 않았다. 현재의 항-PD-1 mAb 치료 요법은 유망한 결과를 보여주었지만, 효능을 높이고 비용을 줄이기 위해서는 더욱 정확하고 개별화된 투여 요법을 한정할 필요가 있다. 정상 상태 항체 수준은 동일한 항체 요법의 경우 최대 10 배까지 다양할 수 있고, 서브-치료 투여(sub-therapeutic dosing)가 사용되는 경우에는 더욱 그러하다2-4. 이러한 연구들은 비용 부담과 부작용 발생을 줄이면서 치료를 최적화할 수 있었다. 많은 수의 면역조절 mAb들이 FDA 및 EU에 의해 검토되고 있는데, 많은 것들은 빠른 트랙(fast track)을 기준으로 하고, PD-1 및 PD-L1 표적 mAb들의 순환 수준을 측정하는 검사의 필요성을 더욱 강조하고 있다. 개발중인 면역분석법은 특히 (1) 질병 적응증(disease indication)내에서 및 교차하여 정상 상태 mAb 수준에서 관찰된 전체 변화2,4 및 (2) 이러한 치료를 받고 있는 환자들에서 관찰되는 다양한 진행 상태1,3,5를 고려하여 치료 요법의 효과적인 가이드를 제공할 것이다.
항-PD-1 및 항-PD-L1 수준을 측정하는 것은 여러 종양 또는 분자 병리에 대한 최적 투여량을 결정할 뿐만 아니라 순환 수준이 완화 후에 발생하는 것으로 알려진 부작용(adverse event)을 설명하거나 예측할 수 있는지의 여부를 판단하는데에도 잠재적인 중요성이 있다. 모니터링 프로그램이 현재 존재하지 않고 투여 스케줄을 평가 및 결정하고 불필요한 면역독성 및 비용을 배제하기 위해 더욱 많은 데이터가 필요하기 때문에 충족되지 않은 필요성이 있다.
니볼루맙(Nivolumab)은 인간화 IgG4 항-PD-1 mAb이다. 니볼루맙은 관문 억제제(checkpoint inhibitor)로 작용하여, 활성화된 T 세포가 암을 공격하는 것을 막는 음성 조절인자를 차단함으로써 면역계가 암을 제거한다. 이는 Medarex 사 및 Ono Pharmaceutical 사에 의해 개발된 Medarex에서 확인되고, Bristol-Myers Squibb 사 (2009 년에 Medarex를 인수함) 및 Ono 사에 의해 시장에 출시되었다.
니볼루맙 (Opdivo®)은 암을 치료하고 2014 년에 일본 당국6 및 2014 년에 FDA7에 의해 승인된 생물학적 치료용 mAb이다. 이는 수술로 치료할 수 없거나 전이성인 피부 흑색종(metastatic skin melanoma)에 대한 1차 치료제(front-line treatment)로 사용된다. 이는, 암이 BRAF에서 돌연변이를 갖거나 갖지 않는 경우 이필리무맙(ipilimumab) (세포독성 T-림프구 관련 단백질-4인 CTLA-4에 대한 mAb)과 병용하여 차별적으로 사용된다. 이는 편평 비소세포 폐암 (squamous non-small cell lung cancer; NSCLC)에 대한 2차 치료제(second-line treatment)8 및 신장 세포 암종에 대한 2차 치료제9로 사용되고, 2016 년 5 월에 난치성의 고전적 호지킨 림프종(recalcitrant classical Hodgkin Lymphoma)에 대한 사용을 위해 승인되었다.9 이는 많은 다른 암들에 대하여 테스트되고 있으며, 크게 확장된 용도를 가질 가능성이 있다.
Merck 사는 2014 년에 승인된, PD-1에 대한 IgG4 류 mAb인 유사한 mAb 치료용 펨브롤리주맙(pembrolizumab) (Keytruda)을 제조하고 있다. 2017 년 현재, 펨브롤리주맙은 두경부 편평 세포 암, 난치성의 고전적인 호지킨 림프종에 대한 2차 치료제로서, 특정 상황에서 수술로 치료할 수 없거나 전이성인 흑색종, 전이성 NSCLC을 치료하기 위해 정맥내 주입을 통해 사용된다. NSCLC의 경우, 펨브롤리주맙은, 암이 PD-L1을 과발현하고 EGFR 또는 ALK에서 돌연변이가 없는 경우의 1차 치료제이고; PD-L1의 평가는 검증되고 승인된 동반 진단을 통해 수행되어야 한다. 또한, 펨브롤리주맙은 표적 조직 대신에 바이오마커 (PD-1)의 존재에 근거하여 FDA에 의해 승인된 최초의 약물이다.10 다른 많은 항-PD-1 및 항-PD-L1 생물학적 치료용 항체가 현재 임상 중에 있고, 이에는 이중특이적 항체, DART들 (Dual Anti-CTLA-4 & Anti-PD-1-blockade in rare tumors; 희귀 종양에서 이중 항-CTLA-4 및 항-PD-1 차단) 및 BiTe들 (Bispecific T cell engagers; 이중특이적 T 세포 관여항체)와 같은 대안의 형태(alternative format)들이 있다.
반대로, PD-L1의 상향 조절은 암이 숙주 면역계를 벗어나는 것을 가능하게 하고 PD-L1의 높은 종양 발현은 종양의 증가된 공격성 및 사망의 4.5 배 증가와 관련이 있다.11 이미 치료 용도로 승인된 PD-L1 억제제 외에도, 많은 PD-L1이 면역 종양 치료제로서 개발 중에 있고, 아테졸리주맙(Atezolizumab) 및 아벨루맙(Avelumab)을 비롯한 화합물들이 임상 시험에서 유망한 결과를 보여주고 있다.
이러한 약물들은 암세포를 공격적으로 공격하고 죽일 수 있는 T 세포의 효능을 증가시킨다. 니볼루맙의 경우, 일부의 경우에는 폐, 결장, 간, 신장 및 갑상선의 면역-관련 염증을 포함하는 심각한 부작용, 및 피부, 중추 신경계, 심장 및 소화기계에 부작용이 있다.12 펨브롤리주맙의 경우, 환자들은 폐 염증(치명적일 수 있음) 및 염증을 유발하는 내분비 기관 (뇌하수체, 갑상선 (여러 환자에서 갑상선 기능 저하 및 갑상선 기능 항진을 일으킴)의 염증, 및 일부 환자가 평생 호르몬 요법 (예를 들어, 인슐린 요법 또는 갑상선 호르몬)을 받게 하는 제 1 형 당뇨병 및 당뇨병성 케톤산증을 유발하는 췌장염과 같은) 심한 주입-관련 반응 및 부작용을 발생했다. 또한, 환자들은 mAb 약물로 인해 결장, 간 및 신장 염증을 발생했다.13 두 약물 모두의 경우 많은 다른 증상과 불쾌감이 보고되고 있다.
이러한 부작용을 보이는 환자들은 mAb 약물을 끊은 후 부작용이 가라 앉는 경우/때 약물을 다시 투여한다. 환자 내의 수준을 모니터링하는 경우, 사용되는 투여량(dose)을 적정하거나 크게 감소시키는 것이 가능하다. 그러나, 현재 순환 mAb 약물 수준을 검사하는데 이용될 수 있는 모니터링 분석법은 없으며, 이러한 검사를 위한 항원들은 자격을 얻지 못했다.
요약
본 출원은 세포예정사(programmed cell death 1) (PD-1) 단백질 및 세포예정사-리간드 (PD-L1) 단백질과 관련된 융합 단백질을 제공한다. 상기 융합 단백질은 천연 단백질의 변형 및/또는 진단 분석에서 기능을 향상시키기 위한 명백한 특성을 갖는 또 다른 도메인으로 구성된 융합 단백질을 포함하는 재조합 단백질일 수 있다.
본원에 기재된 한 측면은 올리고머화 도메인(oligomerization domain)에 융합된 PD-1 단백질을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다. 본원에 기재된 또 다른 측면은 올리고머화 도메인에 융합된 PD-1 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본원에 기재된 또 다른 측면은 올리고머화 도메인에 융합된 PD-L1 단백질을 포함하는 재조합 단백질을 제공한다. 본원에 기재된 또 다른 측면은 올리고머화 도메인에 융합된 PD-L1 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본원에 기재된 또 다른 측면은 올리고머화 도메인에 융합된 PD-1 및 PD-L1 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 상기 융합 단백질은 재조합 단백질이다.
PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 다수의 종 또는 단일 종으로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, PD-1 및/또는 PD-L1 단백질(들)은 인간 PD-1 및/또는 인간 PD-L1 단백질(들)이다. 또 다른 측면에서, 상기 융합 단백질은 PD-1 및/또는 PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 PD-1의 세포외 도메인의 면역글로불린-유사 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 융합 단백질은 PD-L1의 세포외 도메인의 면역 글로불린-유사 도메인을 포함한다.
PD-1 및/또는 PD-L1 세포외 도메인(들) 또는 이의 단편은 다양한 변형된 단백질 또는 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 변형은 PD-1 및 PD-L1의 기능을 변화시키지 않는 한, 야생형 PD-1 및/또는 PD-L1에서 적어도 하나의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가일 수 있다. 이러한 다양한 단백질 또는 펩타이드는 야생형 단백질과 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 서열 상동성을 가질 수 있다.
본원에 기재된 융합 단백질은 PD-1 또는 PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편, 및 올리고머화 도메인을 포함한다.
몇몇 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 PD-1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편, 및 올리고머화 도메인을 포함하고, 상기 올리고머화 도메인은 뮤린(murine) IgG1 Fc 도메인, 뮤린 IgG2A Fc 도메인, GCN4 삼량체 도메인, 클라트린 삼량체(clathrin trimer) 도메인 및 p53 사량체(tetramer) 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택된다.
다른 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편, 및 올리고머화 도메인을 포함하고, 상기 올리고머화 도메인은 뮤린 IgG1 Fc 도메인, 뮤린 IgG2A Fc 도메인, GCN4 삼량체 도메인, 클라트린 삼량체 도메인 및 p53 사량체 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택된다.
본원에 기재된 올리고머화 도메인은 클라트린, GCN4 삼량체화(trimerization) 도메인, p53 사량체화(tetramerization) 도메인 및 오량체성(pentameric) 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인을 포함할 수 있다. 몇몇 측면에서, 상기 올리고머화 도메인은 Fc 도메인, Fc 도메인의 단편, 및 Fc 도메인의 변이체를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 상기 Fc 도메인 또는 이의 단편의 C- 말단에 융합된다. 또 다른 구체예에서, PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 상기 Fc 도메인 또는 이의 단편의 N-말단에 융합된다. 일 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 인간 또는 마우스 면역글로불린일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 올리고머화 도메인은 마우스 IgG1 또는 마우스 IgG2A의 Fc 단편, 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
몇몇 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질의 올리고머화 도메인은 뮤린 IgG1 Fc 도메인 또는 뮤린 IgG2A Fc 도메인이다. 몇몇 측면에서, 뮤린 IgG1 Fc 도메인 또는 뮤린 IgG2A Fc 도메인은 힌지 영역을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 PD-1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질은 힌지 영역을 포함하는 뮤린 IgG1 Fc 도메인 또는 뮤린 IgG2A Fc 도메인을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질은 힌지 영역을 포함하는 뮤린 IgG1 Fc 도메인 또는 뮤린 IgG2A Fc 도메인을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 융합 단백질은 더욱 높은 차원의 구조, 예를 들어 단백질 또는 다량체성 복합체의 일부일 수 있다. 이것은 다량체화(multimerization) 도메인을 갖는 단백질의 의도적인 디자인을 통해 또는 재조합 단백질의 예상치 못한 특성을 통해 본질적으로 존재할 수 있다. 몇몇 측면에서, PD-1 및/또는 PD-L1 단백질 또는 이의 단편은 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 상기 올리고머화 도메인에 융합된다. 몇몇 측면에서, PD-1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 상기 올리고머화 도메인에 융합된다. 몇몇 측면에서, PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 상기 올리고머화 도메인에 융합된다. 몇몇 측면에서, PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인 또는 이의 단편에 융합된다. 몇몇 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질에서, PD-1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 아미노산인 글리신 및 세린을 포함하는 하나 이상의 플렉스(flex) 링커를 통해서 또는 아미노산인 글리신, 프롤린 및 세린을 포함하는 하나 이상의 플렉스 프로(flex pro) 링커를 통해서 상기 올리고머화 도메인에 융합된다. 몇몇 측면에서, 상기 하나 이상의 펩티드 링커는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질에서, PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 아미노산인 글리신 및 세린을 포함하는 하나 이상의 플렉스 링커를 통해 또는 아미노산인 글리신, 프롤린 및 세린을 포함하는 하나 이상의 플렉스 프로 (flex pro) 링커를 통해 상기 올리고머화 도메인에 융합된다. 몇몇 측면에서, 상기 하나 이상의 펩티드 링커는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 14 내지 27 또는 서열 번호 29 내지 30에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면들은 신호 서열을 추가로 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 포함하고, 상기 신호 서열은 PD-1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편의 N-말단에 융합된다. 본 발명의 다른 측면들은 신호 서열을 추가로 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 포함하고, 상기 신호 서열은 PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편의 N-말단에 융합된다.
몇몇 측면에서, 상기 신호 서열은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 신호 서열의 아미노산 서열은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유한다.
본 발명의 몇몇 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 그의 아미노산 서열이 서열 번호 1의 잔기 21 내지 170, 21 내지 145, 33 내지 170, 33 내지 145, 35 내지 170 또는 35 내지 145로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 PD-1의 세포외 도메인을 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 융합 단백질은 그의 아미노산 서열이 서열 번호 1의 잔기 21 내지 170으로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 PD-1의 세포외 도메인을 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 융합 단백질은 그의 아미노산 서열이 서열 번호 1의 잔기 21 내지 170으로 구성되는 PD-1의 세포외 도메인을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 그의 아미노산 서열이 서열 번호 2의 잔기 18 내지 239, 18 내지 238, 18 내지 225, 18 내지 134, 18 내지 127, 19 내지 239, 19 내지 238, 19 내지 225, 19 내지 134, 19 내지 127, 133 내지 225, 133 내지 238, 또는 133 내지 239로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 PD-L1의 세포외 도메인을 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 융합 단백질은 그의 아미노산 서열이 서열 번호 2의 잔기 18 내지 239로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 PD-L1의 세포외 도메인을 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 융합 단백질은 그의 아미노산 서열이 서열 번호 2의 잔기 18 내지 239로 구성되는 PD-L1의 세포외 도메인을 포함한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 그의 아미노산 서열이 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 PD-1의 세포외 도메인을 포함한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 그의 아미노산 서열이 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 PD-L1의 세포외 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 PD-1의 세포외 도메인 또는 이의 단편, 및 그의 아미노산 서열이 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 및 서열 번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 올리고머화 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 PD-L1의 세포외 도메인 또는 이의 단편, 및 그의 아미노산 서열이 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 및 서열 번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 올리고머화 도메인을 포함할 수 있다.
몇몇 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20 및 서열 번호 29로 이루어진 군에서 선택된다. 몇몇 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20 또는 서열 번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된다.
몇몇 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27 및 서열 번호 30으로 이루어진 군에서 선택된다. 몇몇 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27 또는 서열 번호 30에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 몇몇 측면은 PD-1이 재조합 PD-1인 본원에서 기재된 바와 같은 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 여전히 다른 측면은 PD-1이 재조합 인간 PD-1인 본원에서 기재된 바와 같은 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 몇몇 측면은 PD-L1이 재조합 PD-L1인 본원에서 기재된 바와 같은 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 여전히 다른 측면은 PD-L1이 재조합 인간 PD-L1인 본원에서 기재된 바와 같은 융합 단백질에 관한 것이다.
본원에서 기재된 한 측면은 재조합 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 벡터는 신호 펩티드 서열에 연결된 핵산 분자를 암호화한다.
본원에 기재된 또 다른 측면은 PD-1 및/또는 PD-L1 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, (a) 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 숙주 세포를 형질감염시키고, 이때 상기 핵산 분자는 i) PD-1 및/또는 PD-L1 단백질의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상기 PD-1 및/또는 PD-L1 단백질의 세포외 도메인의 N-말단에서 연결된 인간 또는 마우스 IgG의 Fc 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 ii) 인간 또는 마우스 또는 다른 포유동물 IgG의 Fc 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상기 Fc 도메인의 N-말단에서 연결된 PD-1 및/또는 PD-L1 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 융합된 신호 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; (b) 상기 숙주 세포에서 상기 (a)의 핵산 분자를 발현함으로써 융합 단백질을 제조하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 세포외 도메인은 링커를 통해 상기 Fc 도메인에 융합된다. 상기 링커는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5일 수 있다. 본원에 기재된 또 다른 측면은 PD-1 및/또는 PD-L1 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제조하는 방법으로서, (a) 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 숙주 세포를 형질감염시키고; (b) 상기 숙주 세포에서 상기 (a)의 핵산 분자를 발현함으로써 융합 단백질을 제조하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
상기 융합 단백질의 재조합 생산을 위해, 일반적인 분자 클로닝 프로토콜에 기반하여 다양한 발현 벡터가 제작될 수 있다. 상기 벡터 성분들은 하기의 것들 중 하나 이상을 일반적으로 포함하나 이에 제한되지 않는다: 발현된 단백질의 분비를 위한 신호 서열, 진핵 세포에서의 안정한 세포주 스크리닝을 위한 선별 마커 유전자를 포함하는 하나 이상의 마커 유전자, 복제 원점, 인헨서(enhancer) 요소, 프로모터, 전사 종결 서열, 폴리 A 신호, 인슐레이터(insulator) 등.
또한, 본원에서는 PD-1 및/또는 PD-L1 또는 이의 단편, 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본원에서는 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 및/또는 PD-L1 또는 이의 단편, 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 융합 단백질 또는 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
또한, 본원에서는 상기 융합 단백질을 항원으로 사용하는 항체 바이오모니터링(biomonitoring) 방법을 제공한다. 본원에서 기재된 융합 단백질은 치료용 항체 바이오모니터링을 위한 항원(들)으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 항-PD-1 (니볼루맙 및 펨브롤리주맙) 및/또는 항-PD-L1 항체 (아테졸리주맙 및 아벨루맙)을 포함한다.
본원에서 기재된 한 측면은 PD-1 및/또는 PD-L1에 의해 매개된 질병을 진단, 모니터링 또는 병기결정(staging)하는 방법으로서, 적어도 1 회 투여량(at least one dose)의 면역치료를 받은 환자의 시료를 본원에 기재된 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본원에서 기재된 한 측면은 치료용 PD-1 및/또는 PD-L1 항체의 효능을 결정하는 방법으로서, 적어도 1 회 투여량의 면역치료를 받은 환자의 시료를 본원에 기재된 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본원에서 기재된 또 다른 측면은 환자에게 면역치료(immunotherapy)를 제공하는 방법으로서, 상기 환자에게 치료용 항체를 투여하고 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 치료용 항체의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 이러한 방법을 사용하여 항체 기반 치료의 효능을 모니터링할 수 있는 것으로 생각된다.
본원에서 기재된 또 다른 측면은 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 치료 항체를 측정함으로써 PD-1 및/또는 PD-L1에 의해 매개된 질병을 검출 및/또는 모니터링하는 방법을 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 방법은 환자 유래의 시료를 본원에서 기재된 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다. 몇몇 측면에서, 상기 환자는 치료용 항체를 이용한 면역치료의 과정을 받았다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 다른 항-PD-1 치료제로 이루어진 군에서 선택된 생물학적 치료용 항체의 순환 수준의 양을 결정하는 방법으로서, (i) 항체 치료를 받고 있는 환자로부터 시료를 얻고, (ii) 상기 시료를 본원에서 기재된 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 다른-항 PD-L1 치료제로 이루어진 군에서 선택된 생물학적 치료용 항체의 (유리) 순환 수준의 양을 결정하는 방법으로서, (i) 항체 치료를 받고 있는 환자로부터 시료를 얻고, (ii) 상기 시료를 본원에서 기재된 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는(comprising)"과 함께 사용되는 경우의 "a"또는 "an"이라는 용어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 일치한다.
전술한 설명은 아래의 상세한 설명이 보다 잘 이해될 수 있도록 하기 위하여 본원에 개시된 구체예들의 특징 및 기술적 이점을 다소 광범위하게 개략적으로 설명하였다. 청구범위의 주제를 형성하는 추가의 특징들 및 이점들이 이후에 설명될 것이다. 당업자는 개시된 개념 및 특정 구체예는 본원에 개시된 다양한 구체예들의 동일한 목적을 수행하기 위한 다른 구조를 변형 또는 설계하기 위한 기초로서 용이하게 이용될 수 있음을 인식하여야 한다. 또한, 당업자는 이러한 균등 구성이 첨부된 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 것으로 인식하여야 한다. 추가의 목적 및 이점과 함께, 그들의 구성 및 작동 방법에 관하여 본원에 개시된 다양한 구체예들의 특징인 것으로 여겨지는 신규한 특징들은 첨부 도면과 관련하여 고려될 때 더욱 잘 이해될 것이다. 그러나, 각각의 도면은 예시 및 설명의 목적으로만 제공되고, 개시된 구체예들의 제한의 정의로서 의도되지 않는다는 것이 명백히 이해되어야 한다.
도 1은 발현 및 정제 후 환원성 4-20 % 트리스-글리신 TGX 겔을 이용한 다양한 융합 단백질들의 SDS-PAGE 크로마토그래피를 나타낸다.
도 2는 발현 및 정제 후 비환원성 4-20 % 트리스-글리신 TGX 겔을 이용한 다양한 융합 단백질들의 SDS-PAGE 크로마토그래피를 나타낸다.
도 3A는 연속 희석 계열 (0.5 μg/ml로부터 0.04 μg/ml까지의 희석액)에서 항-PD-1 항체에 대한 재조합 PD-1 융합 단백질의 특이적 반응성을 도시한다.
도 3B는 위에서 언급한 바와 같은 희석 계열에서 항-PD-L1 항체에 대한 재조합 PD-L1 융합 단백질의 특이적 반응성을 도시한다. 또한, 이 도면은 PD-L1-Fc 단량체 및 PD-L1-p53 사량체의 반응성의 비교를 도시한다.
도 4A는 인간 혈장에서 항-PD-1 항체 (펨브롤리주맙)의 정량을 위한 다양한 PD-1 융합 단백질들의 비교를 도시한다.
도 4B는 인간 혈장에서 항-PD-1 항체 (펨브롤리주맙)의 정량을 위한 다양한 PD-1 융합 단백질들의 신호 대 컷 오프 잡음(signal to cut off noise)을 도시한다.
도 5는 항-PD-L1 항체에 대한 다양한 PD-L1 융합 단백질들의 특이적 반응성을 도시한다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1은 PD-1 (UniProt: Q15116)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 2는 PD-L1(UniProt: Q9NZQ7)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 3은 인간 IL2 신호 펩티드의 아미노산 서열이다.
서열 번호 4는 유연한(flexible) Gly-Ser 링커의 아미노산 서열이다.
서열 번호 5는 유연한 Gly-Pro-Ser linker (플렉스 Pro 링커)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 6은 CH2 및 CH3 도메인 만을 함유하는 뮤린 IgG1의 아미노산 서열이다.
서열 번호 7은 Fc 영역을 함유하는 뮤린 IgG1의 아미노산 서열이다.
서열 번호 8은 Fc 영역을 함유하는 뮤린 IgG2A의 아미노산 서열이다.
서열 번호 9는 GCN4 삼량체 도메인의 아미노산 서열이다.
서열 번호 10은 클라트린 삼량체 도메인의 아미노산 서열이다.
서열 번호 11은 p53 사량체 도메인의 아미노산 서열이다.
서열 번호 12는 PD-1 단편의 아미노산 서열이다.
서열 번호 13은 PD-L1 단편의 아미노산 서열이다.
서열 번호 14는 본 발명의 일 구체예에 따른 PD-1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-1(GGGGS)2-뮤린 IgG1(오직 CH2, CH3 만) 362 AA 플렉스 링커)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 15는 본 발명의 또 다른 구체예에 따른 PD-1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-1 (GGGPS)2- 뮤린 IgG1(오직 CH2, CH3 만) 362 AA 플렉스 Pro 링커)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 16은 본 발명의 여전히 또 다른 구체예에 따른 PD-1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-1 - 뮤린 IgG1 Fc 365 AA 힌지 없음)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 17은 본 발명의 여전히 또 다른 구체예에 따른 PD-1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-1-뮤린 IgG2A Fc 370 AA 힌지 없음)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 18은 본 발명의 여전히 또 다른 구체예에 따른 PD-1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-1-GCN4 삼량체 도메인)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 19는 본 발명의 여전히 또 다른 구체예에 따른 PD-1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-1-클라트린 삼량체 도메인)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 20은 본 발명의 여전히 또 다른 구체예에 따른 PD-1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-1-p53 사량체 도메인)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 21은 본 발명의 일 구체예에 따른 PD-L1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-L1(GGGGS)2-뮤린 IgG1(오직 CH2, CH3 만) 361 AA 플렉스 링커)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 22는 본 발명의 또 다른 구체예에 따른 PD-L1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-L1(GGGPS)2-뮤린 IgG1(오직 CH2, CH3 만) 361 AA 플렉스 pro 링커)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 23은 본 발명의 여전히 또 다른 구체예에 따른 PD-L1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-L1-뮤린 IgG1 Fc 364 AA 힌지 없음)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 24는 본 발명의 여전히 또 다른 구체예에 따른 PD-L1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-L1-뮤린 IgG2A Fc 370 AA 힌지 없음)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 25는 본 발명의 여전히 또 다른 구체예에 따른 PD-L1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-L1-GCN4 삼량체 도메인)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 26은 본 발명의 여전히 또 다른 구체예에 따른 PD-L1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-L1-클라트린 삼량체 도메인)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 27은 본 발명의 여전히 또 다른 구체예에 따른 PD-L1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-L1-p53 사량체 도메인)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 28은 CH2 및 CH3 만을 함유하는 뮤린 IgG2A의 아미노산 서열이다.
서열 번호 29는 본 발명의 일 구체예에 따른 PD-1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-1(GGGGS)2-p53-Histag)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 30은 본 발명의 일 구체예에 따른 PD-L1 융합 단백질 (HuIL2SS-PD-L1(GGGGS)2-p53-Histag)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 31은 본 발명의 일 구체예에 따른 폴리히스티딘 태그(polyhistidine tag)의 아미노산 서열이다.
상세한 설명
하기의 설명은 단지 본 발명의 다양한 구체예들을 예시하기 위한 것이다. 따라서, 논의된 특정 변경들은 제한의 의도가 있는 것이 아니다. 본원에 제시된 주제들의 정신 또는 범위를 벗어나지 않고 다양한 균등, 변화 및 변경이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이고, 이러한 균등 구체예들은 본원에 포함되는 것으로 이해된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 것으로 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급을 포함한다.
본 명세서 전체에 걸쳐서, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다(comprise)", 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 요소 또는 정수 또는 요소들 또는 정수들의 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소들 또는 정수들의 그룹의 제외를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서의 각각의 구체예는 달리 명백히 언급되지 않는 경우 모든 다른 구체예들에 준용된다.
하기의 용어들은 달리 나타내지 않는 경우 하기의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합(recombinant)"은 (1) 그의 자연발생적인 환경으로부터 제거되었거나, (2) 그 유전자가 자연에서 확인되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 관련이 없거나, (3) 생체분자가 자연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, (4) 자연에서 발생하지 않는 생체분자, 예를 들어, 유전자 또는 단백질을 의미한다. 용어 "재조합"은 클로닝된 DNA 분리물(isolate), 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 유사체, 또는 이종계(heterologous system)들에 의해 생물학적으로 합성되는 폴리뉴클레오티드 유사체뿐만 아니라, 이러한 핵산에 의해 암호화되는 단백질 및/또는 mRNA들을 언급하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산(nucleic acid)"은 DNA 또는 RNA로 구성된 임의의 물질을 의미한다. 핵산은 화학적으로 또는 살아있는 세포에 의해 만들어질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 뉴클레오티드들의 중합체 사슬을 의미한다. 이 용어는 DNA 분자 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 또는 합성 DNA)및 RNA 분자 (예를 들어, mRNA 또는 합성 RNA)뿐만 아니라, 비-천연 뉴클레오티드 유사체, 비-천연 인터-뉴클레오시드 결합, 또는 둘 모두를 포함하는 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함한다. 상기 핵산은 임의의 토폴로지 형태(topological conformation)로 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산은 단일 가닥, 이중 가닥, 삼중 가닥, 사중 가닥, 부분적으로 이중 가닥, 분지형, 헤어핀형, 원형 또는 잠겨진(padlocked) 형태일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질(protein)"은 아미노산 잔기들의 하나 이상의 사슬로 구성되는 거대한 생물학적 분자 또는 거대분자를 의미한다. 많은 단백질들은 생화학적 반응을 촉매하고 신진 대사에 필수적인 효소이다. 또한, 단백질은 근육 내의 악틴 및 미오신 및 세포 형태를 유지하는 스캐폴딩(scaffolding) 시스템을 형성하는 세포골격 내의 단백질과 같은 구조적 또는 기계적 기능들을 갖는다. 다른 단백질들은 세포 신호전달, 면역 반응, 세포 부착 및 세포주기에 있어서 중요하다. 그러나, 단백질은 완전히 인위적이거나 재조합일 수 있다. 즉, 생물학적 계에서 자연적으로 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리 펩타이드(polypeptide)"는 자연발생적 단백질 및 비-자연 발생적 단백질 모두, 및 그의 단편, 돌연변이체, 유도체 및 유사체를 의미한다. 폴리펩티드는 단량체 또는 중합체일 수 있다. 폴리펩티드는, 하나 이상의 명백한 활성을 각각 갖는 다수의 상이한 도메인들을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "융합 단백질(fusion protein)"은 자연발생적 단백질에서 공존하지 않는 둘 이상의 아미노산 서열들을 포함하는 단백질을 의미한다. 융합 단백질은 동일 또는 상이한 유기체로부터 유래한 둘 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 융합 단백질의 둘 이상의 아미노산 서열들은 일반적으로 그들 사이에 종결 코돈이 없이 인-프레임(in frame)으로 존재하고, 일반적으로 융합 단백질의 일부로서 mRNA로부터 번역된다.
본원에서 사용되는 용어 "항원(antigen)"은 각각의 항체에 특이적으로 결합하는 생체분자를 의미한다. 다양한 레퍼토리(repertoire)의 항체는 그의 가변 영역 상호작용 (CDR 루프)을 통해 특정 항원 구조에 결합하며, 이는 자물쇠와 열쇠 사이의 맞음(fit)과 유사하다.
폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용될 때의 용어 "변이체(variant)"는 야생형 유전자와 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 정의는 예를 들어, "대립유전자(allelic)", "스플라이스(splice)", "종(species)" 또는 "다형성(polymorphic)" 변이체도 포함할 수 있다. 스플라이스 변이체는 기준 분자와 유의한 동일성을 가질 수 있지만, 일반적으로 MRNA 프로세싱 동안에 엑손(exon)들의 번갈은 스플라이싱으로 인해 더 많거나 적은 수의 폴리뉴클레오티드들을 가질 수 있다. 해당하는 폴리펩티드들은 추가의 기능성 도메인들을 가질 수 있거나 도메인이 없을 수 있다. 종 변이체는 한 종에서 또 다른 종으로 변화하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 야생형 표적 유전자 산물의 변이체가 본 발명에서 특히 유용하다. 변이체는 핵산 서열내의 적어도 하나의 돌연변이로부터 얻어질 수 있고, 변경된 mRNA들을 초래하거나 그의 구조 또는 기능이 변경될 수 있거나 변경되지 않을 수 있는 폴리펩티드를 초래할 수 있다. 임의의 주어진 천연 또는 재조합 유전자는 대립유전자 형태가 없거나 하나 또는 다수의 대립유전자 형태를 가질 수 있다. 변이체를 야기하는 일반적인 돌연변이 변화는 뉴클레오티드의 자연적인 결실, 첨가 또는 치환에 일반적으로 기인한다. 이러한 타입의 변화들은 단독으로 일어날 수 있거나 주어진 순서로 한 번 또는 여러 번 다른 것과 함께 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체(antibody)" 또는 "면역글로불린(immunoglobulin)"은 동일한 의미를 갖고 본 발명에서 동일하게 사용될 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로블린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 의미한다. 이와 같이, 용어 "항체"는 전체 항체 분자뿐만 아니라 항체 단편 또는 유도체도 포함한다. 항체 단편으로는 Fc, Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 디아바디(diabodies)가 있으나 이에 제한되지 않는다.
천연 항체에서, 두 개의 중쇄(heavy chains)는 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되어 있고, 각각의 중쇄는 디설파이드 결합에 의해 경쇄(light chain)에 연결되어 있다. 두 타입의 경쇄, 즉 람다 (λ) 및 카파(κ)가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5 개의 주요한 중쇄 부류 (또는 이소타입)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각각의 쇄는 별개의 서열 도메인들을 포함한다. 경쇄는 2 개의 도메인, 즉 가변 도메인 (variable domain; VL) 및 불변 도메인 (constant domain; CL)을 포함한다. 중쇄는 4 개의 도메인, 즉 하나의 가변 도메인 (VH) 및 3 개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3, 집합적으로 CH로 지칭됨)을 포함한다. 경쇄 (VL)와 중쇄 (VH) 모두의 가변 영역은 결합 인식 및 항원에 대한 특이성을 결정한다. 경쇄 (CL) 및 중쇄 (CH)의 불변 영역 도메인은 항체 사슬 결합, 분비, 트랜스 태반 이동성(trans-placental mobility), 보체 결합 및 Fc 수용체 (FcR)에의 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단 부분이고, 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변 부분으로 이루어진다. 항체의 특이성은 항체 결합 부위와 항원 결정기 사이의 구조적 상보성에 있다. 항체 결합 부위는 초가변 또는 상보성 결정 영역 (CDR)들로부터 주로 유래되는 잔기들로 구성된다. 때로는, 비-초가변 영역 또는 프레임워크 영역 (FR) 유래의 잔기들이 전체 도메인 구조에 영향을 미치므로 결합 부위에 영향을 미친다. 상보성 결정 영역 또는 CDR들은 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열들을 의미한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3으로 각각 지정된 3 개의 CDR들을 갖는다. 그러므로, 항원-결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역의 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6 개의 CDR들을 포함한다. 프레임워크 영역 (FR)은 CDR들 사이에 삽입된 아미노산 서열을 의미한다.
많은 승인된 치료용 항체들은 G1m17.1:Km3 중쇄 및 경쇄 불변 영역 알로타입(allotype)들을 사용했다 (Jeffris 및 Lefranc 2009). 다른 것들은 대안적인 G1m3:Km3 알로타입들을 사용한다. 알로타입에서의 차이는 오늘날처럼 일반적인 것으로 알려지지 않았기 때문에, 치료용 항체의 거부 반응에서 알로타입의 역할은 mAb 치료가 시작된 때에는 명백하지 않았다. 치료용 mAb의 알로타입과 제거(clearance) 사이에는 명확한 관련이 있다. 이것은 세포 구획 내에서 격리된 mAb의 일부를 혈류로 재순환시키고 빠르게 제거되지 않도록 작용하는 FcRn 신생아 Fc 수용체와의 상호작용 차이 때문이다 (Ternant 등 2016). 이러한 알로타입의 차이와 세포 면역 자극에 대한 영향은 오늘날 더 많이 알려지고 있다 (Webster 등 2016). 면역원성을 생성할 것 같지는 않지만 이들은 반감기에 분명한 영향을 미친다. 따라서, 순환하는 치료용 항체의 양을 측정하는 시험은 약물의 수준 및 투여량 증가에 대한 잠재적 필요성을 나타낼 수 있다. 또는, 특히 T 세포 표면의 항-PD-1의 수준이 높은 수준을 유지하는 경우 일부 환자는 효과적인 수준을 유지하기 위해 약물을 덜 필요로 할 수 있다. 이러한 항원은 특정 시약 또는 면역분석의 분야에 종사하는 사람들에게 익숙한 경쟁 분석법과 함께 사용되는 경우 임의의 타입의 항체 (IgG1, IgG4, DARTs, BiTes 등)에 의한 결합을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 다중 면역 관문 억제제인 mAb 및 다른 약물을 사용하는 차세대 병용 치료법은 수준을 모니터링하는 효과적인 수단을 필요로 한다. 이러한 타입의 병용 치료법은 더욱 효과적일 뿐만 아니라 일반화되고 있다 (Dempke 등 2017). 또한, 본원에 기재된 분석법은 이러한 경우에 항-PD-1 또는 항-PD-L1 성분을 측정하는데 중요할 것이다.
본원에서 사용되는 "부위-지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)"은 돌연변이가 DNA 분자의 한정된 부위에서 생성되는 과정을 의미한다. 상기 한정된 부위는 상호작용의 친화성을 기반으로 선택된 부위를 의미한다. 돌연변이유발을 위한 DNA 분자는 일반적으로 플라스미드로 알려진 원형 분자이다. 일반적으로, 부위-지정 돌연변이유발은 야생형 유전자 서열이 알려져 있는 것을 요구한다. 이러한 기법은 "부위-특이적 돌연변이유발" 또는 "올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발"로 알려져 있다. 결과적으로, "부위-지정 돌연변이"는 부위-지정 돌연변이 유발 기법에 의해 DNA 분자에서 한정된 부위에서 생성된 돌연변이를 의미한다. 일 구체예에서, 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 생성된 돌연변이 DNA 서열은 야생형 서열과 40 % 초과, 45 % 초과, 50 % 초과, 55 % 초과, 60 % 초과, 65 % 초과, 70 % 초과, 75 % 초과, 80 % 초과, 85 % 초과, 90 % 초과, 95 % 초과 또는 98 % 초과의 상동성을 갖는다. 택일적으로, 돌연변이 DNA는 임의의 알려진 돌연변이 유발 과정 (예를 들어, 방사선, 니트로소구아니딘 등)을 이용하여 생체내에서 생성될 수 있다. DNA 작제물 서열은 야생형, 돌연변이 또는 변형 서열일 수 있다. 또한, 상기 서열은 동종 또는 이종일 수 있다.
용어 "야생형 서열(wild-type sequence)"또는 "야생형 유전자(wild-type gene)"는 숙주 세포에서 천연 또는 자연 발생적인 서열을 의미하는 것으로, 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 몇몇 구체예에서, 상기 야생형 서열은 단백질 공학 프로젝트의 출발점인 관심 서열을 의미한다. 상기 야생형 서열은 동종 또는 이종 단백질을 암호화할 수 있다. 동종 단백질은 숙주 세포가 개입 없이 생산할 수 있는 단백질이다. 이종 단백질은 숙주 세포가 생성하지 않지만 개입을 위한 것이다.
용어 "변형된 서열(modified sequence)"및 "변형된 유전자(modified gene)"는 자연발생적인 핵산 서열의 결실, 삽입 또는 차단을 포함하는 서열을 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 몇몇의 바람직한 구체예에서, 변형된 서열의 발현 산물은 끝이 잘린 단백질(truncated protein)이다 (예를 들어, 변형이 서열의 결실 또는 차단인 경우). 몇몇의 특히 바람직한 구체예에서, 끝이 잘린 단백질은 생물학적 활성을 보유한다. 대안적인 구체예에서, 변형된 서열의 발현 산물은 신장된(elongated) 단백질이다 (예를 들어, 핵산 서열 내로의 삽입을 포함하는 변형). 몇몇 구체예에서, 삽입은 끝이 잘린 단백질을 유도한다 (예를 들어, 삽입이 정지 코돈(stop codon)의 형성을 초래하는 경우). 따라서, 삽입은 끝이 잘린 단백질 또는 신장된 단백질을 발현 산물로서 초래할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "돌연변이 서열(mutant sequence)" 및 "돌연변이 유전자(mutant gene)"는 상호교환적으로 사용되고, 숙주 세포의 야생형 서열에서 발생하는 적어도 하나의 코돈에서 변경(alteration)을 갖는 서열을 의미한다. 돌연변이 서열의 발현 산물은 야생형에 비해 변경된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 상기 발현 산물은 변경된 기능적 능력 (예를 들어, 강화된 결합 친화도)을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "링커(linker)"는 1 내지 30 개의 아미노산, 바람직하게는 3 내지 6 개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 링커의 아미노산은 류신 (Leu, L), 이소류신 (Ile, I), 알라닌 (Ala, A), 글리신 (Gly, G), 발린 (Val, V), 프롤린 (Arg, R), 리신 (Lys, K), 아르기닌 (Arg, R), 세린 (Ser, S), 아스파라긴 (Asn, N), 및 글루타민 (Gln, Q), 트립토판 (Trp, W), 메티오닌 (Met, M), 아스파르트산 (Asp, D), 시스테인 (Cys, C), 글루탐산 (Glu, E), 히스티딘 (His, H), 페닐알라닌 (Phe, F), 트레오닌 (The, T) 및 티로신 (Tyr, Y)이다.
"진단(diagnostic)" 또는 "진단된(diagnosed)"은 병리학적 상태 또는 질병에 걸리기 쉬운 환자의 존재 또는 성질을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법들은 이들의 민감도와 특이도에서 차이가 있다. 진단 분석의 "민감도(sensitivity)"는 양성 반응을 보이는 질병에 걸린 개체의 비율 ("진양성"의 퍼센트)이다. 분석에 의해 검출되지 않은 질병에 걸린 개체는 "위음성"이다. "질병에 걸리지 않고 분석에서 음성을 나타내는 개체는 "진음성"으로 명명된다. 진단 분석의 "특이성(specificity)"은 1에서 위양성률(false positive rate)을 뺀 값이며, 이때 "위양성"률은 양성 반응을 보이는 질병이 없는 개체들의 비율로 정의된다. 특정 진단 방법이 상태의 최종 진단을 제공할 수 없지만, 상기 방법이 진단을 돕는 양성 징후를 제공하기만 하면 충분하다.
"환자(patient)"또는 "개체(individual)"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 치료될 포유동물 개체, 바람직하게는 인간 환자를 의미한다. 일부 경우에 있어서, 본 발명의 방법은 실험 동물, 수의학적 용도, 및 마우스, 래트 및 햄스터를 포함하는 설치류를 포함하나 그에 제한되지 않는 질병 동물 모델 및 영장류의 개발에서 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "시료(sample)"는 개체(subject) 또는 환자로부터 얻은 임의의 생물학적 물질을 의미한다. 한 측면에서, 시료는 혈액, 복막액, CSF, 타액 또는 소변을 포함할 수 있다. 다른 측면에서,　시료는 전혈, 혈장, 혈청, 혈액 시료로부터 농축된 B 세포 및 배양된 세포 (예를 들어, 개체 유래의 B 세포)를 포함할 수 있다. 또한, 시료는 신경 조직을 포함하는 생검 조직 시료를 포함할 수 있다. 여전히 다른 측면에서, 시료는 전체 세포 및/또는 세포의 용해물을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"는 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 상태, 또는 이러한 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상을 역전, 완화, 진행 억제, 또는 예방하는 것을 의미한다. "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 개체에게 치료적 이점을 부여하기 위해 필요한 활성제(active agent)의 최소량을 의미하기 위한 것이다. 예를 들어, 포유 동물에 대한 "치료적 유효량"은 장애와 관련이 있는 병리학적 증상, 질병 진행 또는 생리학적 상태, 또는 장애에 굴복하는 것에 대한 저항성을 유도하거나, 개선하거나 또는 그렇지 않으면 개선을 유발하는 양이다.
본원에서 사용되는 용어 "예방(prevention)"은 질병 또는 상태를 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 개체에서 질병 또는 증상이 상태가 발생하는 것을 예방하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "암(caner)", "과증식성(hyperproliferation)" 및 "신생물성(neoplastic)"은 자율 성장을 위한 능력, 즉, 급속하게 증식하는 세포 성장을 특징으로하는 비정상적인 상태를 갖는 세포를 의미한다. 과증식성 및 신생물성 질병 상태는 병리학적, 즉 질병 상태를 특징으로 하거나 구성하는 것으로 분류될 수 있거나, 비-병리학적, 즉 정상 상태에서 벗어나지만 질병 상태와 관련이 없는 것으로 분류될 수 있다. 상기 용어는 침입의 단계 또는 조직 병리학적 유형에 관계없이 모든 유형의 암 성장 또는 발암 과정, 전이 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 의미이다. "암" 또는 "신생물"이란 용어는 영향을 받는 폐, 유방, 갑상선, 림프, 위장관 및 비뇨생식기와 같은 다양한 장기 계통의 악성 종양뿐만 아니라, 대부분의 결장암, 신장 세포 암종, 전립선 암 및/또는 고환 종양, 폐의 비소 세포 암종, 소장의 암 및 식도의 암과 같은 악성종양을 포함하는 선암들을 포함한다.
본원에서 기재된 한 측면은 치료용 항체를 이용하여 치료 효능 및 PD-1 및/또는 PD-L1에 의해 매개되는 질병을 진단, 모니터링 또는 병기결정을 한다. 더욱 구체적으로, 적어도 1 회의 면역치료 과정을 받은 환자에서 치료용 항체를 검출 및 모니터링하는 방법이 개시된다. 본원에 개시된 방법에 따라 다양한 암 또는 만성 감염증이 모니터링, 병기결정 또는 진단될 수 있다.
암의 예로는 B 세포 림프성 신생물, T 세포 림프성 신생물, 비-호지킨 림프종 (NHL), B-NHL, T-NHL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소림프구성 림프종 ((SLL), 외투세포 림프종 (MCL), NK-세포 림프성 신생물 및 골수성 세포 계통 신생물과 같은 혈액학적 악성종양이 있다. 비-혈액학적 암의 예로는 대장암, 유방암, 폐암, 뇌암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 방광암, 대장암, 골암, 자궁경부암, 간암, 구강암, 식도암, 갑상선암, 신장암, 위암, 고환암 및 피부암이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
만성 감염증의 예로는 만성 간염, 폐 감염, 하부 호흡기 감염, 기관지염, 인플루엔자, 폐렴 및 성병과 같은 바이러스, 세균, 기생충 또는 진균 감염이 잇으나, 이에 제한되지 않는다. 바이러스 감염의 예로는 간염 (HAV, HBV, HCV), 단순 포진 (HSV), 대상 포진, HPV, 인플루엔자 (Flu), AIDS　및 AIDS 관련 합병증, 수두 (varicella), 일반 감기, 거대세포바이러스 (CMV) 감염, 천연두 (variola), 콜로라도 진드기 열, 뎅기열, 에볼라 출혈열, 구제역, 라사열(lassa fever), 홍역, 마르부르크 출혈열, 전염성 단핵구증, 유행성 이하선염, 노로바이러스, 소아마비, 진행성 다병성 백혈뇌증 (PML), 광견병, 사스(SARS), 바이러스성 뇌염, 바이러스성 위장염, 바이러스성 수막염, 바이러스성 폐렴, 웨스트 나일병 및 황열이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세균 감염의 예로는 폐렴, 세균성 수막염, 콜레라, 디프테리아, 결핵, 탄저병, 보툴리누스 중독, 브루셀라증, 캄필로박터증, 티푸스, 임질, 리스테리아증, 라임병, 류마티스 열, 백일해 (Whooping Cough), 플라그, 살모넬라증, 성홍열, 이질균증, 매독, 파상풍, 트라코마, 야토병, 장티푸스 및 요로 감염이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 기생충 감염의 예로는 말라리아, 리슈마니어증, 트리파노소마증, 사가스병, 크립토스포리디오시스증, 간질병, 필라리아병, 아메바성 감염, 편모충증, 요충 감염, 주혈흡충병, 조충병, 톡소플라스마증, 섬모충증 및 트리파노소마증이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 진균 감염의 예로는 칸디다증, 아스페르길루스증, 콕시디오이데스 진균증, 크립토코커스증, 히스토플라스마증 및 족부 백선이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 방법은 치료용 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체의 투여량을 결정하는데 이용될 수 있다. 구체적으로, 상기 방법은 치료용 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체의 수준을 측정하기 위해, 적어도 1 회의 면역치료를 받은 인간의 시료를 검사하는 것을 포함하고, 이때 상기 항체의 수준에 따라 상기 항체를 이용한 추가의 치료가 조절될 수 있다.
추가의 측면에서, 본원의 개시는 치료용 항체 치료에 대한 환자의 반응성을 검출하는 방법으로서, 상기 치료용 항체는 PD-1 및/또는 PD-L1에 대한 항체이고, 상기 항체는 환자의 시료에서 불활성 TNF-알파의 존재 또는 양을 결정하는 것을 포함하고, 상기 존재 또는 양은 상기 치료에 대한 상기 환자의 낮거나 감소하는 반응성을 나타내는 것인, 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 상기 치료용 항체 및 상기 치료용 항체에 대한 항-약물 항체의 존재 또는 양을 결정하여 환자 프로파일을 얻는 것을 포함하고, 상기 환자 프로파일은 상기 치료에 대한 반응성을 나타낸다.
PD-1 및 PD-L1
본 발명은 PD-1 (세포예정사-1 단백질)의 세포외 도메인 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질, 및/또는 PD-L1 (세포예정사-리간드 1 단백질)의 세포외 도메인 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
PD-1 및 PD-L1 서열은 천연 인간 서열의 변이체일 수 있다. 본원에서 사용 되는 용어 "변이체(variants)"는 기준 개체(reference entity)와 유의한 구조적 동일성을 나타내지만, 기준 개체와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티(moiety)의 존재 또는 수준이 기준 개체와 구조적으로 상이한 개체(entity)를 의미한다. 많은 구체예에서, 변이체는 또한 그의 기준 개체와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 개체가 기준 개체의 "변이체"로 간주되는 지의 여부는 기준 개체와의 그의 구조적 동일성의 정도에 기반하여 결정된다. 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 기준 개체는 특정의 특징적인 구조적 요소를 갖는다. 정의에 따르면 변이체는 하나 이상의 그러한 특징적인 구조적 요소를 공유하는 별개의 화학적 개체이다. 폴리펩티드는 선형 또는 삼차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖고/갖거나 특정 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산들로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 변이 폴리펩티드는 아미노산 서열의 하나 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 골격에 공유 결합된 화학적 모이어티(예를 들어, 탄수화물, 지질 등)의 하나 이상의 차이의 결과로서 기준 폴리펩티드와 다를 수 있다. 몇몇 구체예에서, 변이 폴리펩티드는 기준 펩리펩티드와 적어도 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 또는 99 %의 전체 서열 동일성을 나타낸다. 택일적으로 또는 부가적으로, 몇몇 구체예에서, 변이 폴리펩티드는 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 기준 폴리펩티드와 공유하지 않는다. 몇몇 구체예에서, 상기 기준 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 몇몇 구체예에서, 변이 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 공유한다. 몇몇 구체예에서, 변이 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드의 생물학적 활성들 중 하나 이상이 없다. 몇몇 구체예에서, 변이 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 생물학적 활성의 감소된 수준을 나타낸다. 많은 구체예에서, 관심있는 폴리펩티드가 모체의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖지만 특정 위치에서 소수의 서열 변경을 갖는 경우 상기 관심있는 폴리 펩타이드는 모체 또는 기준 폴리펩티드의 "변이체"로 간주된다. 일반적으로, 모체와 비교하여 변이체 내의 잔기들의 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 % 또는 2 % 미만이 치환된다. 몇몇 구체예에서, 변이체는 모체와 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 치환된 잔기를 갖는다. 보통, 변이체는 매우 작은 수 (예를 들어, 5, 4, 3, 2 또는 1 미만)의 치환된 잔기 (즉, 특정의 생물학적 활성에 관여하는 잔기)를 갖는다. 또한, 변이체는 모체와 비교하여 5, 4, 3, 2 또는 1 개 이하의 부가 또는 결실을 갖는 것이 일반적이고, 보통은 부가 또는 결실이 없다. 또한, 임의의 치환 또는 결실은 대표적으로 약 25, 약 20, 약 19, 약 18, 약 17, 약 16, 약 15, 약 14, 약 13, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6 개 미만이고, 일반적으로는 약 5, 약 4, 약 3, 또는 약 2 개 미만의 잔기이다. 몇몇 구체예에서, 상기 모체 또는 기준 단백질은 자연계에서 확인되는 것이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 관심있는 특정 폴리 펩타이드의 복수의 변이체는 상기 관심있는 폴리펩티드가 감염성 폴리펩티드인 경우에는 자연계에서 일반적으로 확인될 수 있다.
본원에 기재된 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 PD-1 단백질 (서열 번호 1)의 예측된 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 한 측면에서, 상기 PD-1 단백질의 세포외 도메인은 서열 번호 12 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 PD-1의 세포외 도메인은 서열 번호 1의 위치 21 내지 170의 아마노산들로 구성되는 폴리펩티드 서열과 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 PD-1의 세포외 도메인은 서열 번호 1의 잔기 1 내지 171을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 1 내지 170을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 1 내지 145를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 21 내지 171을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 21 내지 170을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 21 내지 145를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 33 내지 171을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 33 내지 170을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 33 내지 145를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 35 내지 171을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 35 내지 170을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 1의 잔기 35 내지 145를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 PD-1의 세포외 도메인은 잔기 1 내지 171을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 1 내지 170을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 1 내지 145를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 21 내지 171을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 21 내지 170을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 21 내지 145를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 33 내지 171을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 33 내지 170을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 33 내지 145를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 35 내지 171을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 1의 잔기 35 내지 170을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 1의 잔기 35 내지 145를 포함하는 폴리펩티드와 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 여전히 또 다른 구체예에서, 상기 PD-1의 세포외 도메인은 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 PD-1의 세포외 도메인은 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열과 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본원에 기재된 또 다른 구체예에서, 상기 융합 단백질은 PD-L1 단백질 (서열 번호 2)의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 서열 번호 13 또는 이의 단편을 포함한다. 또한, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 서열 번호 2의 위치 19 내지 238의 아미노산들로 구성되는 폴리펩티드 서열과 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 서열 번호 2의 잔기 1 내지 240을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 1 내지 239를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 1 내지 238을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 240을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 239를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 238을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 18 내지 239를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 18 내지 238을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 18 내지 225를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 18 내지 134를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 18 내지 127을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 239를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 238을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 225를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 134를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 127을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 133 내지 225를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 133 내지 238을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 2의 잔기 133 내지 239를 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인은 서열 번호 2의 잔기 1 내지 240을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 1 내지 239를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 1 내지 238을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 240을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 239를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 238을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 18 내지 239를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 18 내지 238을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 18 내지 225를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 18 내지 134를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 18 내지 127을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 239를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 238을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 225를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 134를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 19 내지 127을 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 133 내지 225를 포함하는 폴리펩티드, 서열 번호 2의 잔기 133 내지 238을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열 번호 2의 잔기 133 내지 239를 포함하는 폴리펩티드와 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 여전히 또 다른 구체예에서, 상기 PD-L1의 세포외 도메인은 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 PD-L1의 세포외 도메인은 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, mAb들 및 이들의 표적 사이의 개선된 더욱 높은 친화성 상호작용을 위해 부위-지정 돌연변이유발을 통해 특정의 잔기들이 변형될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형은 모체와 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 잔기의 치환을 구성한다. 보통, 부위-지정 돌연변이유발을 이용하는 변형은 매우 작은 수 (예를 들어, 5, 4, 3, 2 또는 1)의 치환된 기능적 잔기 (즉, 결합 친화도에 관여하는 잔기)를 갖는다. 또한, 부위-지정 돌연변이유발을 이용하는 변형은 모체와 비교하여 일반적으로 5, 4, 3, 2 또는 1 개 이하의 부가 또는 결실을 갖고 보통은 추가 또는 결실이 없다. 또한, 임의의 부가, 결실 또는 치환은 일반적으로 약 50 개 잔기, 약 45 개 잔기, 약 40 개 잔기, 약 35 개 잔기, 약 30 개 잔기, 약 25 개 잔기, 약 20 개 잔기, 약 19 개 잔기, 약 18 개 잔기, 약 17 개 잔기, 약 16 개 잔기, 약 15 개 잔기, 약 14 개 잔기, 약 13 개 잔기, 약 12 개 잔기, 약 11 개 잔기, 약 10 개 잔기, 약 9 개 잔기, 약 8 개 잔기, 약 7 잔기, 약 6 개 잔기 미만이고, 보통은 약 5 개 잔기, 약 4 개 잔기, 약 3 개 잔기, 또는 약 2 개 잔기 미만이다. 몇몇 구체예에서, 상기 모체 또는 기준 폴리펩티드는 자연계에서 확인되는 것이다.
일 구체예에서, 항-PD-1 항체와의 상호작용을 위해 중요한 PD-1 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 항체들과 이들의 표적 사이의 개선된 더욱 높은 친화성 상호작용을 위해 변형된다. 몇몇 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 수소 결합에 관여한다. 또 다른 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 염 브릿지(salt bridge)를 형성하는데 관여한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 수(water) 매개 상호작용에 관여한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 반 데르 바알스(van der Waals) 상호작용에 관여한다.
일 구체예에서, 펨브롤리주맙 mAb와의 상호작용을 위해 중요한 PD-1 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 변형된다. 관련 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 PD-1N66, PD-1T76, PD-1K78, PD-1S87, PD-1K131, PD-1F63, PD-1E84, PD-1S87, PD-1G90 및 PD-1A132로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또 다른 관련 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 아미노산 잔기는 PD-1D85이다. 여전히 또 다른 구체예인 관련 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 PD-1K78, PD-1S87 및 PD-1D85로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 여전히 또 다른 구체예인 관련 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 PD-1V64, PD-1Y68, PD-1Q75, PD-1D77, PD-1A81, PD-1F82, PD-1P83, PD-1R86, PD-1Q88, PD-1P89, PD-1G90, PD-1I126, PD-1L128, PD-1A129 및 PD-1I134로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 여전히 또 다른 구체예인 관련 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 PD-1N66, PD-1T76, PD-1K78, PD-1S87, PD-1K131 PD-1F63, PD-1E84, PD-1S87, PD-1G90, PD-1A132, PD-1D85, PD-1K78, PD-1S87 및 PD-1D85, PD-1V64, PD-1Y68, PD-1Q75, PD-1D77, PD-1A81, PD-1F82, PD-1P83, PD-1R86, PD-1Q88, PD-1P89, PD-1G90, PD-1I126, PD-1L128, PD-1A129, 및 PD-1I134로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 니볼루맙 mAb와의 상호작용을 위해 중요한 PD-1 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)가 변형될 수 있다. 관련 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 PD-1P28, PD-1L128, PD-1A129, PD-1P130, PD-1A132, PD-1D29, PD-1R30, PD-1S60 및 PD-1K131로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또 다른 관련 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 PD-1S27, PD-1P28, PD-1P31, PD-1E61, PD-1A129, PD-1P130, PD-1K131, PD-1A132 및 PD-1Q133으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙과 PD-1 사이의 수소 결합 또는 반 데리 바알스 상호작용에 관여한다. 특정 구체예에서, 상기 PD-1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 PD-1L128, PD-1A129, PD-1A130, PD-1K131, 및 PD-1A132로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 구체예에서, PD-1과의 상호작용을 위해 중요한 펨브롤리주맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산(들)이 변형된다, 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 펨브롤리주맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산(들)은 중쇄 CDR1 (HCDR1) 내의 잔기들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 HCDR1 펨브롤리주맙 mAb 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 heavyT30, heavyY33 및 heavyY35로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 펨브롤리주맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산(들)은 중쇄 CDR2 (HCDR2) 내의 잔기들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 HCDR2 펨브롤리주맙 mAb 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 heavyN52, heavyS54, heavyN55, heavyG57, heavyT58, 및 heavyN59로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 펨브롤리주맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산(들)은 중쇄 CDR3 (HCDR3) 내의 잔기들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 HCDR3 펨브롤리주맙 mAb 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 heavyR99, heavyY101, heavyR102, heavyF103, heavyD104, heavyM105, 및 heavyD108로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 펨브롤리주맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산(들)은 경쇄 CDR1 (LCDR1) 내의 잔기들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 LCDR1 펨브롤리주맙 mAb 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 lightT31, lightS32, lightY34, 및 lightY36으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 펨브롤리주맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산(들)은 경쇄 CDR2 (LCDR2) 내의 잔기들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 LCDR2 펨브롤리주맙 mAb 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 lightY53, lightL54, lightY57 및 lightE59로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 펨브롤리주맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산(들)은 경쇄 CDR3 (LCDR3) 내의 잔기들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 LCDR3 펨브롤리주맙 mAb 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 lightS95, lightR96, lightD97, lightL98 및 lightL100으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 구체예에서, PD-1와의 상호작용을 위해 중요한 니볼루맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 변형된다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 니볼루맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 중쇄 CDR1 (HCDR1) 내의 잔기들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 HCDR1 펨브롤리주맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 heavyG26, heavyI27, heavyN31 및 heavyG33으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 니볼루맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 중쇄 CDR2 (HCDR2) 내의 잔기들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 HCDR2 펨브롤리주맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 heavyV50, heavyW52 및 heavyY53으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 니볼루맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 중쇄 CDR3 (HCDR3) 내의 잔기들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 HCDR3 펨브롤리주맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 heavyN99, heavyD100, heavyD101 및 heavyY102로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 니볼루맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 경쇄 CDR1 (LCDR1) 내의 잔기들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 니볼루맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 경쇄 CDR2 (LCDR2) 내의 잔기들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 LCDR2 펨브롤리주맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 lightL46, lightA55 및 lightT56으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 변형되는 니볼루맙 mAb 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 경쇄 CDR3 (LCDR3) 내의 잔기들을 포함한다. 상기 LCDR3 펨브롤리주맙 mAb 내의 아미노산 잔기는 lightS91 이다.
또 다른 구체예에서, 항-PD-L1 항체와의 상호작용을 위해 중요한 PD-L1 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 항체들 및 이들의 표적 사이의 개선된 더욱 높은 친화성 상호작용을 위해 변형된다. 몇몇 구체예에서, 상기 PD-L1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 수소 결합에 관여한다. 또 다른 구체예에서, 상기 PD-L1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 염 브릿지를 형성하는데 관여한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 상기 PD-L1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 수 매개 상호작용에 관여한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 상기 PD-L1 내의 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기(들)는 반 데르 바알스 상호작용에 관여한다.
올리고머화 도메인
본 발명은 PD-1 (예정세포사-1 단백질)의 세포외 도메인 또는 PD-L1 (예정세포사-리간드 1 단백질)의 세포외 도메인 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 본원에서 개시된 올리고머화 도메인은 Fc 도메인, 클라트린 삼량체화 도메인, GCN4 삼량체화 도메인, p53 사량체화 도메인, 및 오량체성 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 도메인 또는 심지어는 신규한 단백질을 생성하는 힌지없는 단량체성 도메인을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 올리고머화 도메인은 올리고머화 영역이 없고, 상기 융합 단백질은 단량체이다. 몇몇 구체예에서, 상기 올리고머화 도메인은 힌지없는 단량체성 Fc 도메인이고 상기 융합 단백질은 단량체이다. 상기 올리고머화 도메인은 항원 또는 항체 가변 도메인의 노출을위한 구조로서 바이러스 유사 입자를 포함할 수 있다. 이러한 올리고머화 도메인들은 당업자에게 알려져 있지만, 이들은 진단을 위한 새로운 단백질을 생성하는데 사용되지 않았었다.
몇몇 측면에서, 상기 올리고머화 도메인은 Fc 도메인, Fc 도메인의 단편, 및 Fc 도메인의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 단백질 또는 다량체성 복합체와 같은 더욱 높은 차원의 구조의 일부일 수 있다. 몇몇 구체예에서, PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인 또는 이의 단편에 융합된다. 일 구체예에서, PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 상기 Fc 도메인의 또는 이의 단편의 C-말단에 융합된다. 또 다른 구체예에서, PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 상기 Fc 도메인 또는 이의 단편의 N-말단에 융합된다.
몇몇 구체예에서, 상기 올리고머화 도메인은 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 28로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 올리고머화 도메인은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열 (GCN4 삼량체 도메인), 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열 (클라트린 삼량 체 도메인) 및 아미노산 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열 (p53 사량체 도메인)로 이루어진 군에서 선택된다. 몇몇 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열 (GCN4 삼량체 도메인)과 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열 (클라트린 삼량체 도메인)과 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열 (p53 사량체 도메인)과 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 면역글로불린 CH2 도메인 또는 면역글로불린 CH3 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 CH2 및 CH3 도메인, IgG4 CH2 및 CH3 도메인, IgG1 CH2 및 IgG4 CH3 도메인, 및 IgG4 CH2 및 IgG1 CH3 도메인으로 이루어진 군에서 선택된다. 몇몇 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 마우스 또는 인간의 Fc 도메인일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 마우스 IgG1 또는 IgG2A의 Fc 도메인일 수 있다. 다른 구체 예에서, 상기 Fc 도메인은 IgG 힌지 도메인을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열 (뮤린 IgG1, CH2 및 CH3), 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열 (뮤린 IgG1 Fc), 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열 (뮤린 IgG2A Fc) 및 서열 번호 28에 기재된 아미노산 서열 (뮤린 IgG2A, CH2 및 CH3)로 이루어진 군에서 선택된다. 몇몇 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열과 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열과 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 Fc 도메인은 서열 번호 28에 기재된 아미노산 서열과 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 Ig "힌지(hinge)"는, 디설파이드 결합이 면역글로불린의 두 개의 중쇄들을 연결하는 시스테인 잔기를 포함하는 자연발생적인 Ig 힌지 영역 서열의 일부와 서열 동일성 또는 유사성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 본원에서 기재된 힌지 영역 링커의 자연발생적인 면역글로불린 힌지 영역 아미노산 서열과의 서열 유사성은 적어도 50 % 에서 약 75 내지 80 %의 범위, 일반적으로는 약 90 % 초과일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 출원의 융합 단백질의 뮤린 IgG1 Fc 도메인은 힌지를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 본 출원의 융합 단백질의 뮤린 IgG1 Fc 도메인은 힌지가 없다. 뮤린 IgG1 Fc 도메인의 예시적인 아미노산 서열은 서열 번호 6 (힌지 없음) 및 서열 번호 7 (힌지를 가짐)이다.
몇몇 구체예에서, 본 출원의 융합 단백질의 뮤린 IgG2A Fc 도메인은 힌지를포함한다. 몇몇 구체예에서, 본 출원의 융합 단백질의 뮤린 IgG2A Fc 도메인은 힌지가 없다. 뮤린 IgG2A Fc 도메인의 예시적인 아미노산 서열은 서열 번호 28 (힌지 없음) 및 서열 번호 8 (힌지를 가짐)이다.
링커(Linkers)
몇몇 구체예에서, 상기 PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 올리고머화 도메인 또는 이의 단편에 융합된다. 일 구체예에서, 상기 PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 상기 올리고머화 도메인 또는 이의 단편의 C-말단에 융합된다. 또 다른 구체예에서, 상기 PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 상기 올리고머화 도메인 또는 이의 단편의 N-말단에 융합된다.
몇몇 구체예에서, 펩티드 링커는, 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 일반적으로 포함하는 연속적인 아미노산들의 서열로 이루어질 수 있다. 또한, 펩티드 링커는, 적어도 하나의 글리신, 적어도 하나의 프롤린 및 적어도 하나의 세린을 일반적으로 포함하는 연속적인 아미노산들의 서열로 이루어질 수 있다. 예시적인 유연한 링커 및 유연한 pro 링커는 서열 번호4 (GGGS) 또는 서열 번호 5 (GGGPS)에 기재된 아미노산 서열을 포함하지만, 펩티드 링커의 정확한 아미노산 서열은 특별히 제한되지 않는다. 몇몇 구체예에서, 상기 PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 둘 이상의 상이한 펩티드 링커를 통해 올리고머화 도메인 또는 이의 단편에 융합된다. 몇몇 구체예에서, 상기 PD-1 및/또는 PD-L1 단백질은 둘 이상의 동일한 펩티드 링커를 통해 올리고머화 도메인 또는 이의 단편에 융합된다.
본원에 기재된 바와 같은 펩티드 링커는 일반적으로 자연계에서 확인될 수 없지만, 몇몇의 자연발생적인 아미노산 서열은 적당한 링커로서 이용될 수 있거나 적당한 링커를 디자인하는데 사용될 수 있다. 링커는 약 1 내지 30 개 아미노산, 예를 들어 약 2 내지 25, 약 3 내지 20, 약 4 내지 16, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 아미노산을 포함할 수 있다.
신호 펩티드 서열(Signal Peptide Sequence)
본원에 개시된 융합 단백질은 포유동물 세포, 특히 인간 세포와 같은, 발현 벡터의 세포막을 가로 질러 단백질의 전위를 촉진하기 위한 신호 펩티드 서열 (또는 "신호 서열")을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 본원에 개시된 융합 단백질이 포유동물 세포, 특히 인간 세포와 같은, 발현 벡터의 세포막을 가로 질러 폴리펩티드의 전위를 촉진하는 신호 펩티드 서열을 포함하는 경우 폴리펩티드는 신호 펩타이드 서열이 없을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 융합 단백질은 신호 펩티드 서열이 없을 수 있다. 마찬가지로, 합성적으로 생성된 폴리펩티드는 신호 펩티드 서열이 없을 수 있다.
신호 펩티드 서열은 일반적으로 융합 단백질의 N-말단에 포함된다. 신호 펩티드 서열은 진핵 세포에서 단백질의 번역 후에 진핵 세포(예를 들어, 인간 세포와 같은 포유동물 세포)의 세포 표면 막의 외부로 단백질을 전위시키기에 충분한 것이 바람직하지만, 융합 단백질의 다른 서열 모티프도 전위를 촉진할 수 있다.
예시적인 신호 펩티드 서열은 인간 인터루킨-2 신호 펩티드 서열인 서열 번호 3 (MYRMQLLSCIALSLALVTNS)에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 잘 특성규명된 서열은 인간 세포 및 다른 포유동물 세포의 외부로 단백질을 전위시킬 수 있다.
친화성 태그(Affinity Tags)
융합 단백질은 친화성 태그를 선택적으로 포함할 수 있다. 친화성 태그는 정제에 유용하며, 이들 태그는 융합 단백질을 이용하는 분석법에서도 유용할 수 있다. 예시적인 친화성 태그로는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질, 말토오스 결합 단백질, Strep-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, FLAG-태그, V5-태그, Myc-태그, HA-태그, NE-태그, AviTag, Calmodulin-태그, 폴리글루타메이트, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, 비오틴 카르복실 운반 단백질, 녹색 형광 단백질-태그, HaloTag, Nus-태그, 및 티오레독신-태그가 있지만, 친화성 태그의 선택은 특별히 제한되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 융합 단백질은, 예를 들어 친화성 태그가 사용후에 제거되는 경우 또는 융합 단백질이 친화성 태그를 필요로 하지 않는 전략을 사용하여 정제되는 경우, 친화성 태그가 없을 수 있다. 예시적인 친화성 태그는, 7 개의 연속적인 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열(서열 번호 31)을 일반적으로 포함하는 폴리히스티딘이다. 또 다른 예시적인 친화성 태그는 4 내지 10 개의 연속적인 히스티딘을 포함하는 폴리히스티딘 태그이다.
융합 단백질(Fusion Proteins)
본원에서 기재된 구체예들에서 특징이 있는 융합 단백질은 PD-1 (세포예정사-1 단백질)의 세포외 도메인 또는 PD-L1 (세포예정사-리간드 1 단백질)의 세포외 도메인 및 올리고머화 도메인을 포함하고, 상기 올리고머화 도메인은 뮤린 IgG1 Fc 도메인, 뮤린 IgG2A Fc 도메인, GCN4 삼량체 도메인, 클라트린 삼량체 도메인 및 p53 사량체 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택된다.
본원에서 기재된 종류의 융합 단백질은 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 29 또는 서열 번호 30에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 융합 단백질은 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 29 또는 서열 번호 30에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 99.5 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
핵산, 클로닝 세포 및 발현 세포(Nucleic Acids, Cloning Cells, and Expression Cells)
본원에서 기재된 구체예들은 본원에서 기재된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 또한 포함한다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본원에 기재된 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA는 일반적으로 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 관심있는 발현 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 항시적 또는 유도성 발현을 유도할 수 있는 것이 바람직하다. 상기 핵산 서열이 본원에 기재된 융합 단백질을 암호화하는 한, 상기 핵산의 정확한 뉴클레오타이드 서열은 특별히 제한되지 않는다. 코돈은 예를 들어, 관심있는 발현 세포 (예를 들어, 인간 세포와 같은 포유동물 세포)의 코돈 바이어스(codon bias)를 매치시키도록 하고/하거나 클로닝 동안의 편의를 위해 선택될 수 있다. DNA는 예를 들어, 복제 원점 (예를 들어, 원핵 세포에서 플라스미드의 복제를 위한)을 포함할 수 있는 플라스미드일 수 있다.
또한, 본 발명의 다양한 측면은 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 발현 세포 또는 클로닝 세포 일 수있다. 핵산은 일반적으로 대장균에서 클로닝되지만, 다른 클로닝 세포가 사용될 수 있다. 상기 세포가 발현 세포인 경우, 핵산은 선택적으로 염색체의 핵산이다. 즉, 뉴클레오티드 서열이 염색체에 통합되어 있지만, 핵산이 발현 세포에서 예를 들어 염색체외 DNA로서 존재할 수 있다.
본 발명의 다양한 측면은 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 세포를 포함한다. 세포는 일반적으로 발현 세포이다. 상기 발현 세포의 성질은 특별히 제한되지 않는다. 포유동물 발현 세포는 융합 단백질 또는 올리고머성 융합 단백질의 바람직한 접힘(folding), 번역후 변형(post-translational modification) 및/또는 분비(secretion)를 허용할 수 있지만, 다른 진핵 세포 또는 원핵 세포가 발현 세포로 사용될 수 있다. 예시적인 발현 세포로는 CHO, BHK, NS0, Sp2/0, COS, C127, HEK, HT-1080, PER.C6, HeLa, 및 Jurkat 세포가 있다.
본원에서 기재된 본 발명의 또 다른 측면은 PD-1 (세포예정사-1 단백질)의 세포외 도메인 및/또는 PD-L1 (세포예정사-리간드 1 단백질)의 세포외 도메인 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제조하는 방법으로서,
a) 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계,
b) 상기 숙주 세포에서 상기 (a)의 핵산 분자를 발현시켜서 융합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
면역분석 및 시약(Immunoassays and reagents)
면역분석은 일반적으로 세포 표면 항원을 측정하거나 시료에서 항체를 측정하기 위해 사용된다. 일반적으로, 유동 세포 분석법을 이용한 면역형광법이 선택되는 면역분석법이다. 그러나, 예를 들어, 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)과 같은 다른 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 기법은 생물학적 분자 검출을 위한 강력한 분석법을 제공하기 위한 간단한 위상 분리를 이용한 항원-항체 상호작용의 특별한 특성에 기반한다.
ELISA를 위한 방법 및 계측은 면역형광법보다 간단하다. 또한, ELISA 및 면역형광분석법은 완전히 다른 분석법이다. ELISA 분석법은 전신을 반영하는 혈장/혈청 내의 단백질 (항원) 또는 항체를 측정한다. 반면에, 표면 면역형광분석법은 개개의 세포의 표면의 항원을 특이적으로 측정하고 신체 내의 세포의 양에 대한 정보를 제공하지 않는다. 따라서, 전신의 측정을 제공하는 ELISA 분석법을 개발하는 것이 이점이 있다.
한 가지의 잘 알려지고 아주 특이적인 ELISA는 샌드위치 ELISA이다. 이러한 분석법에서, 항체는 고체상 또는 지지체에 결합된 다음, 이 고체상 또는 지지체는 검사되는 시료와 접촉하여 이성분 고체상 항체: 항원 복합체의 형성에 의해 시료로부터 항원을 추출한다. 적당한 배양 기간 후, 고체 지지체는 세척되어 유체 시료의 잔류물을 제거한 후, 알려진 양의 표지된 항체를 함유하는 용액과 접촉된다.
본 발명의 몇몇 구체예들은 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체를 함유하는 조성물을 분석하기 위한 면역분석법에 관한 것이다. 다른 구체예들은 PD-1 및/또는 PD-L1 항원을 함유하는 조성물을 분석하기 위한 면역분석법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 예시적인 면역분석법은 예를 들어, 비색, 형광 또는 화학발광 검출을 사용하는 ELISA 분석법 (효소-결합 면역흡착 분석법)이다. 본 발명에 따른 다른 예시적인 면역분석법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 경사 보정(Slope Correction)을 이용한 ELISA, RIA (방사면역분석), 경쟁적 EIA (경쟁적 효소 면역분석), DAS-ELISA (이중 항체 샌드위치-ELISA), 브릿징-ELISA, 단백질 또는 항체 마이크로어레이 (Luminex 기술에 기반한 것들과 같은 액체 비드-기반 어레이를 포함)의 사용에 기반한 기법, 개별적인 마이크로입자들에 기반한 기술, 시각적 (육안) 해석 또는 휴대용 판독기 또는 벤치탑 판독기(benchtop reader)와 같은 판독기를 사용하는 포인트 오브 케어(Point of Care) 어플리케이션 및 신속 검사를 위해 일반적으로 사용되는 면역크로마토그래피에 기반한 측면 또는 수직 흐름 검사와 같은 콜로이드성 금 또는 다른 가시적인 마이크로입자 또는 형광 입자의 침전에 기반한 분석법, 친화성 크로마토그레피 기법, 균질 이동성 시프트 분석법 (HMSA), 리간드 결합 분석법, 렉틴 결합 분석법, 바이오센서 등이다.
순환하는 항-PD-1 항체는 다른 IgG4 항체와 유사한 반감기를 갖는 것으로 알려져 있다 (Farolfi 등 2016). 또한, PD-1 항체는 순환하는 T 세포를 코팅하고 순환계로부터 효과적으로 제거된다 (혈장에서 더 이상 자유롭게 순환하지 않는다). 이는 인간에서 순환하는 항-PD-1 (니볼루맙) 수준의 비교적 빠른 감소를 일으킨다. 순환 수준, T 세포 체류(resident) 수준 및 결과 사이의 관계는 명확하지 않으므로, 이에 대해 밝힐 수 있는 분석법이 가치가 있다. 그러나, 항-PD-1 (니볼루맙)은 0.3 내지 10 mg/kg의 초기 투여량에 따라 60 내지 80 %의 점유 수준으로 장시간 동안 순환 T 세포 상에 체류 상태로 잔류하는 것으로 알려져 있다 (Brahmer 등 2010). 이러한 기능에서, 항-PD-1은 PD-1의 길항제로서 작용하여 종양에서 PD-L1에 리간드가 결합하는 것을 방지한 다음 면역 반응을 중단시킨다. 투여, T 세포 점유량 및 측정가능한 순환 항-PD-1 또는 항-PD-L1를 결과와 상관시키는 것이 중요하다. 따라서, 본 개시의 목적은 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체를 검출 및/또는 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.
구체적으로, PD-1 및/또는 PD-L1으로 지시되는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 치료용 항체, 항체-항원 복합체 및/또는 항체는 변형된 샌드위치 ELISA 기법 또는 당업자에게 알려진 다른 면역분석 기법을 사용하여 검출 또는 모니터링될 수 있다.
특정 구체예에서, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 생체 약물의 농도는 본 발명의 실시예들에서 나타낸 것과 마찬가지로 ELISA에 의해 측정된다.
또한, 본원에 기재된 융합 단백질은 T 세포의 표면 또는 종양 세포 상의 동일한 항원에의 항체의 결합을 방지하거나 경쟁하기 위해 사용될 수 있다.
한 측면에서, 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 치료용 항체는 치료용 항체를 이용한 적어도 1 회 투여량의 면역치료를 받은 환자에서 측정된다. 상기 치료용 항체는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 치료용 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항체-항원 복합체는 ELISA 기법 또는 다른 면역분법에 의해 측정되고 치료용 항체의 순환 수준을 결정한다. 다음에, 이러한 결과의 해석 및 치료의 변화가 임상 징후와 증상을 잘 알고 있는 종양전문의에 의해 결정되어 항체 면역치료의 효능을 결정한다. 특히 환자가 상이한 알로타입들 (불변 영역 다형성)을 갖는 경우 일부 환자에서의 항체 치료제는 다른 환자에서 보다 빠르게 제거된다.
본 발명의 한 측면은 환자에게 면역치료를 제공하는 방법으로서, 치료용 항체를 환자에게 투여하고 본원에 기재된 융합 단백질을 사용하여 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 치료용 항체의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 이러한 방법을 사용하여 항체 기반 치료법의 효능을 모니터링할 수 있는 것으로 생각된다. 일 구체예에서, 효능이 천천히 나타나고 증상을 제거하지 않는 경우 의사는 투여 량을 증가시키는 것을 원할 수 있다. 본원에서 기재된 이러한 도구는 치료용 항체의 순환 수준의 예상된 변화를 민감한 검출을 가능하게 한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 치료용 항체를 측정함으로써 PD-1및/또는 PD-L1에 의해 매개되는 질병을 검출하고/하거나 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 PD-1 및/또는 PD-L1에 의해 매개되는 질병을 검출하고/하거나 모니터링하는 방법은 환자의 시료를 본원에 기재된 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다. 추가의 구체예에서, 상기 PD-1 및/또는 PD-L1에 의해 매개되는 질병을 검출하고/하거나 모니터링하는 방법은 치료용 항체를 이용한 면역치료의 과정을 받은 환자에 대하여 수행된다.
본 발명의 몇몇 측면은 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 다른 항-PD-1 치료제로 이루어진 군에서 선택된 생물학적 치료용 항체의 순환 수준의 양을 결정하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 구체예에서, 상기 생물학적 치료용 항체의 순환 수준의 양을 결정하는 방법은 (i) 항체 치료를 받고 있는 환자로부터 시료를 얻는 단계; 및 (ii) 상기 시료를 본 발명에 따른 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 아테졸로주맙, 아벨루맙 및 다른 항-PD-L1 치료제로 이루어진 군에서 선택된 생물학적 치료용 항체의 (유리) 순환 수준의 양을 결정하는 방법으로서, (i) 항체 치료를 받고 있는 환자로부터 시료를 얻고, (ii) 상기 시료를 본 발명에 따른 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 구체예들은 PD-1 및/또는 PD-L1 또는 이의 단편 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본원에서는 본원에 기재된 바와 같은 PD-1 및/또는 PD-L1 또는 이의 단편 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 융합 단백질 또는 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
몇몇 구체예들은 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체를 함유하는 조성물을 분석하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 면역분석 시약을 포함한다. 상기 면역분석 시약은 고체 지지체에 결합될 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어 비드, 막(membrane), 마이크로티터 플레이트(microtiter plate), 폴리펩티드 칩, 또는 크로마토그래피 칼럼의 고체 상일 수 있다.
또한, 다양한 구체예들은 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체를 함유하는 조성물을 분석하기 위한 기기를 포함한다. 상기 기기는 시료가 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체를 함유하는 지의 여부를 결정하기 위한 기기일 수 있다. 달리 정의되지 않는 경우, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예시적인 방법 및 물질들이 아래에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사한 또는 균등한 방법 및 물질이 또한 사용될 수 있고 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 기타 참조문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 상충이 있는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선한다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이고 제한하려는 것은 아니다.
본 명세서 및 청구 범위에서, 단어 "포함한다(comprise)", 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 요소 또는 정수 또는 요소들 또는 정수들의 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소들 또는 정수들의 그룹의 제외를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다.
본 발명은 하기 실시예들을 참초하여 더욱 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 명세서에 언급된 모든 문헌 및 특허 인용들은 참조로 명백히 포함된다.
실시예
실시예 1: 관문 단백질의 발현 및 정제(Expression and purification of checkpoint proteins)
인간 PD-1 및 PD-L1의 다양한 융합 단백질들을 암호화하는 유전자들을 합성적으로 제조하고, 포유동물 발현을 위해 코돈을 최적화하고, pTT5 벡터 또는 다른 고발현 포유동물 벡터에 클로닝했다. 일시적인 포유동물 발현을 준비하기 위해 플라스미드 DNA의 낮은 내독소 스케일-업(scale-up) 제조를 수행했다.
인간 배아 신장 (HEK) 293 유도(derivative) 세포의 배양물을 표준 형질감염 프로토콜을 이용하여 스케일-업 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키고 성장시켰다. 원심분리에 의해 세포 펠렛을 수확하고, 세포 배양 상등액 (CCS)에서의 단백질 발현을 형질 감염 후 4 내지 5 일에 웨스턴 블롯 및 SDS-PAGE로 확인하였다.
IgG1 또는 IgG2a를 포함하는 융합 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 투석을 통해 제제화하고, 분획하고(aliquoted), -80 ℃에서 보관하였다. p53 다량체화 도메인을 함유하는 단백질은 C-말단 히스티딘 태그를 가졌고, 고정화된 금속 친화성 크로마토 그래피에 의해 정제하고, 완충액 교환하고, 분획하고, -80 ℃에서 보관했다. 단백질 발현 및 사량체화의 확인은 SDS-PAGE 및 CE-SDS (PD-1-p53-His)에 의해 평가하였다.
도 1 및 도 2는 각각 환원성 조건 및 비-환원성 조건하에서 진행한 4-20 % 트리스-글리신 TGXTM SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 겔들은 InstantBlue™ 단백질 염료로 염색하였다. 각각의 겔의 레인은 왼쪽에서 오른쪽으로 1 에서 10 까지 번호가 매겨져 있다. 첫 번째 레인은 분자량 마커를 포함하고, 레인 2 내지 5 는 서열 번호 14 내지 17 에 해당하는 융합 단백질을 포함하고, 레인 6 내지 8 은 서열 번호 21 내지 23 에 해당하는 융합 단백질을 포함하고, 이들 융합 단백질은 클로닝된 다음 진핵 세포에서 발현시켰다. 각각의 융합 단백질은 검출가능한 수준에서 발현될 수 있었다.
실시예2: PD-1 및 PD-L1 재조합 단백질의 특이성(Specificity of PD-1 and PD-L1 recombinant proteins)
2a. 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체에 대한 특이적 반응성
여러 재조합 PD-1 및 PD-L1 단백질을 상업적 출처의 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체에 대한 특이적 반응성에 대하여 시험하였다. PD-L1 및 PD-1 단백질의 재조합 버전(version)들을 ELISA 분석을 사용하여 직접 표지된 형광 항체와 별도로 시험하였다.
ELISA 플레이트를 PD-1 또는 PD-L1 융합 단백질로 코팅하고, 형광 판독기를 사용하여 APC 접합 항-PD-1 또는 항-PDL-1 항체로 검출하였다. 상이한 항원들 및 동일한 항원의 상이한 버전들을 등몰 농도인 50 nM에서 시험하여 단백질들의 상이한 MW를 보상하였다. 도 3A는 연속 희석 계열 (0.5 μg/ml 내지 0.04 μg/ml의 희석액)에서 항-PD-1 항체에 대한 PD-1-p53 (PD1-(GGGPS)2-p53-HisTag, 서열 번호 29)의 특이적 반응성을 도시한다. 도 3B는 위에서 언급한 바와 같은 희석 계열에서 항-PD-1 항체에 대한 PD-L1-p53 단백질 (PD-L1- (GGGPS)2-p53-HisTag, 서열 번호 30)의 특이적 반응성을 도시한다. 또한, 도 3B는 PD-L1 Fc 단량체 (서열 번호 22) 및 PD-L1 p53 사량체 (서열 번호 30)의 반응성의 비교를 도시한다.
2b. 인간 혈장 내의 항-PD1 항체의 정량을 PD-1 융합 단백질들의 비교
재조합 단백질들인 PD1-(GGGPS)2-IgG1-Fc (오직 CH2, CH3 만) (서열 번호 14), PD1-IgG1-Fc (서열 번호 16) 및 PD1-p53 (서열 번호 29)를 암 치료 및 인간 혈장 내의 항-PD1 mAb 약물 농도의 측정에 사용된 항-PD1 치료용 mAb들의 검출에 대하여 시험했다. 이 경우. 펨브롤리주맙(Keytruda®)이 사용되었다.
ELISA 플레이트를 50 nM의 농도 코팅 완충액(p.H. 7.4)인 PBS에 50 nM의 농도로 희석된 여러 PD-1 융합 단백질로 밤새 코팅 하였다. 다음날, 플레이트를 1xELISA 세척 완충액 (BioRad, BUF031C)으로 5 회 세척하였다. 블로킹 단계는 제조사의 지시에 따라 제조된 1:4 BlockACE (BioRad 사, BUF029) 수용액 200 μL를 첨가함으로써 개시하였다. 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 배양했다. 또 다른 세척 단계 후, 각각의 펨브롤리주맙 표준 농도 100 μL와 IgG1 음성 대조군을 분석 완충액 (1:8 BlockACE 수용액)에 희석하고 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한 다음 예전에 설명된 바와 같이 1xELISA 세척 완충액으로 5 회 세척했다. 이러한 단계 후, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 항체와 Fc 특이적으로 결합된 100 μL의 0.5 μg/ mL 전체 마우스 항-인간 IgG4를 각각의 웰에 첨가했다 (Thermoscientific 사, 클론 HP6023 카탈로그 번호 A-10654). 플레이트를 37 ℃에서 30 분 동안 배양하고; 1XELISA 세척 완충액에서 5 회 세척하고 ABTS 기질 (Roche 사, 카탈로그 번호 11 684 302 001)의 첨가 후 광학 밀도(optical density)를 15, 30 및 60 분에서 측정하였다.
도 4A는 인간 혈장 내의 펨브롤리주맙의 농도를 측정하기위한 PD-1 재조합 단백질의 사용을 도시한다. 생성된 재조합 PD1 단백질 각각에 대한 표준 곡선을 생성하기 위해 펨브롤리주맙 표준을 6 개 농도 (10μg/mL, 1μg/mL, 0.1μg/mL, 0.01μg/mL, 0.001μg/mL 및 0.0001μg/mL)에서 사용했다. 시험된 PD1 단백질은 상이한 올리고머 상태들, 즉, '단량체 유사', 이량체 및 사량체로 존재한다. 데이터는 PD1-Fc (이량체) 및 PD1-Fc (CH2, CH3) ('단량체')보다 PD1-p53 (사량체)이 높은 결합력 및 낮은 EC50 값을 갖는다는 것을 보여준다. 또한, PD1-p53을 사용하면 0.01 내지 10μg/ml 범위의 농도로부터 향상된 S/CO (신호 대 컷오프 잡음)가 제공된다 (도 4B). 이러한 분석에서, 컷-오프 값은 3 개의 음성 혈장 시료에 이러한 시료에 대하여 얻은 광학 밀도의 표준 편차의 3 배를 더한 값의 평균에 의해 결정되었다.
2c. PD-L1 재조합 단백질의 반응성
상이한 PD-L1 융합 단백질들을 특정 항-PD-L1 항체에 대한 이들의 반응성에 대해 시험하였다. PD-L1 (PD-L1-p53 사량체 (서열 번호 30) 및 PD-L1-Fc 이량체 (R & D systems 사))의 재조합 버전들을 형광 표지된 항-PD-L1 mAb로 시험하였다. 간략히 말해서, ELISA 플레이트 (흑색)를 등몰 농도인 20 nM에서 상이한 PD-L1 단백질들로 코팅하고, 형광 판독기를 사용하여 APC 접합 항-PDL-1 항체로 직접 검출하였다. 도 5는 연속 희석 게열 (5 μg/ml 에서 0.001 0.001μg/ml까지의 4 배 희석액) 항-PD-L1 항체에 대한 PD-L1 Fc 이량체 (R & D sys 사) 및 PD-L1 p53 사량체 (서열 번호 30) 반응성의 비교를 도시하고, 농도에 대한 신호 대 컷오프가 도시되어 있다. PD-L1 p53 사량체는 PD-L1-Fc 이량체보다 높은 결합 반응성을 나타내었다.
참조문헌:
1. Goodman, Patel & Kurzrock, PD-1-PD-L1 immune-checkpoint blockade in B-cell lymphomas, Nature Reviews Clinical Oncology, 14:203-220,2017.
2. Elassaiss-Schaap et al., Using Model-Based "Learn and Confirm" to Reveal the Pharmacokinetics-Pharmacodynamics Relationship of Pembrolizumab in the KEYNOTE-001 Trial CPT Pharmacometrics Syst. Pharmacol. (2017) 6,21-28;doi:10.1002/psp4.12132.
3. Agrawal et al. Nivolumab dose selection: challenges, opportunities, and lessons learned for cancer immunotherapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer (2016) 4:72 DOI 10.1186/s40425-016-0177-2
4. Gardiner et al., A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Assessment of BMS-936558, a Fully Human Monoclonal Antibody to Programmed Death-1 (PD-1), in Patients with Chronic Hepatitis C Virus Infection. PLoS ONE, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063818 2013.
5. Zheng et al., Level of circulating PD-L1 expression in patients with advanced gastric cancer and its clinical implications. Chin Journal of Cancer Research, 26, 104-111, 2014.
6. Ono Pharmaceutical Co. Ltd. (2014), Human Anti-human PD-1 Monoclonal Antibody "OPDIVO® Intravenous Infusion 20 mg/100 mg" Receives Manufacturing and Marketing Approval in Japan for the Treatment of Unresectable Melanoma [press release]. Retrieved from http://www.ono.co.jp/eng/news/pdf/sm_cn140704.pdf.]
7. Bristol-Meyers Squibb (2016), Opdivo® (Nivolumab) Granted First Approval of a PD-1 Inhibitor in Hematology for the Treatment of Classical Hodgkin Lymphoma Patients Who Have Relapsed or Progressed After Auto-HSCT and Post-transplantation Brentuximab Vedotin by the FDA1 [press release]. Retrieved from https://news.bms.com/press-release/cancer/opdivo-니볼루맙-granted-first-approval-pd-1-inhibitor-hematology-treatment-cla
8. Federal Drug Administration (2014), FDA expands approved use of Opdivo to treat lung cancer, [press announcement]. Retrieved from https://www.fda.gov/NewsEvents/newsroom/ PressAnnouncements/ucm436534.htm
9. Federal Drug Administration (2015), FDA approves Opdivo to treat advanced form of kidney cancer, [press announcement]. Retrieved from https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/ PressAnnouncements/ucm473971.htm
10. Federal Drug Administration (2017),FDA grants accelerated approval to pembrolizumab for first tissue/site agnostic indication [press announcement]. Retrieved from https://www.fda.gov /Drugs/InformationOnDrugs/ApprovedDrugs/ucm560040.htm
11. Thompson RH, Gillett MD, Cheville JC, Lohse CM, Dong H, Webster WS, Krejci KG, Lobo JR, Sengupta S, Chen L, Zincke H, Blute ML, Strome SE, Leibovich BC, Kwon ED (2004). Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. PNAS USA. 101 (49): 17174-9. doi:10.1073/pnas.0406351101
12. Opdivo (package insert), Bristol-Meyers Squibb, New York, NY; 2017.
13. Pembrolizumab (package insert), Merck, Kelinworth, NJ; 2017.
14. Ybe JA, Fontaine SN, Stone T, Nix J, Lin X, and S Mishra. 2013 Nuclear localization of clathrin involves a labile helix outside the trimerization domain. FEBS Lett. 2013 January 16; 587(2): 142-149. doi:10.1016/j.febslet.2012.11.005
15. Yang X, Lee J, Mahony EM, Kwong PD, Wyatt R, and J Sodroski. 2002. Highly Stable Trimers Formed by Human Immunodeficiency Virus Type 1 Envelope Glycoproteins Fused with the Trimeric Motif of T4 Bacteriophage Fibritin J Virology p. 4634-4642 Vol. 76, No. 9
16. Lee W, Harvey TS, Yin Y, Yau P, Litchfield D, and CH Arrowsmith. 1994. Solution structure of the tetrameric minimum transforming domain of p53 Nature Structural Biology 1, 877 - 890
17. Lee JY, Lee,HT, Shin W, Chae J, Kin SH, Lim H, Heo TW, Park KY, Lee YJ, Ruy SE, Lee JU, Heo YS. Structural Bassi of checkpoint blockade by monoclonal antibodies in cancer immunotherapy. et al, Nat. Commun,,2016, 7:13354.
18. Brahmer JR, Drake CG, Wollner I, Powderly JD, Picus J, Sharfman WH, Stankevich E, Pons A, Salay TM, McMiller TL, Gilson MM, Wang C, Selby M, Taube JM, Anders R, Chen L, Korman AJ, Pardoll DM, Lowy I, Topalian SL. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J Clin Oncol. 2010 Jul 1;28(19):3167-75.
19. Farolfi A, Schepisi G, Conteduca V, Burgio SL, Lolli C, De Giorgi U. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and clinical efficacy of Nivolumab in the treatment of metastatic renal cell carcinoma. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2016 Sep;12(9):1089-96.
20. Jefferis R, Lefranc MP. Human immunoglobulin allotypes: possible implications for immunogenicity. MAbs. 2009 Jul-Aug;1(4):332-8.
21. Ternant D, Arnoult C, Pugniere M, Dhommee C, Drocourt D, Perouzel E, Passot C, Baroukh N, Mulleman D, Tiraby G, Watier H, Paintaud G, Gouilleux-Gruart V. IgG1 Allotypes Influence the Pharmacokinetics of Therapeutic Monoclonal Antibodies through FcRn Binding. J Immunol. 2016 Jan 15;196(2):607-13.
22. Webster CI, Bryson CJ, Cloake EA, Jones TD, Austin MJ, Karle AC, Spindeldreher S, Lowe DC, Baker MP A comparison of the ability of the human IgG1 allotypes G1m3 and G1m1,17 to stimulate T-cell responses from allotype matched and mismatched donors. MAbs. 2016; 8(2):253-63.
23. Dempke WCM, Fenchel K, Uciechowski P, Dale SP. Second- and third-generation drugs for immuno-oncology treatment-The more the better? Eur J Cancer. 2017 Mar;74:55-72.
<110> GRIFOLS DIAGNOSTIC SOLUTIONS INC. <120> IMMUNOASSAYS AND ENGINEERED PROTEINS FOR MONITORING ANTIBODY TREATMENTS TO THE IMMUNE CHECKPOINT INHIBITORS PD-1 AND PD-L1 <130> 62593080 <150> US 62/593080 <151> 2017-11-30 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Synthetic <400> 3 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser 20 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Synthetic <400> 4 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Synthetic <400> 5 Gly Gly Gly Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Synthetic <400> 6 Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 1 5 10 15 Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp 20 25 30 Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp 35 40 45 Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 50 55 60 Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp 65 70 75 80 Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro 85 90 95 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala 100 105 110 Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp 115 120 125 Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile 130 135 140 Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn 145 150 155 160 Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys 165 170 175 Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys 180 185 190 Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu 195 200 205 Ser His Ser Pro Gly Ile 210 <210> 7 <211> 227 <212> PRT <213> Synthetic <400> 7 Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu 1 5 10 15 Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr 20 25 30 Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys 35 40 45 Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val 50 55 60 His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 65 70 75 80 Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu 145 150 155 160 Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro 165 170 175 Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val 180 185 190 Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu 195 200 205 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser 210 215 220 Pro Gly Ile 225 <210> 8 <211> 232 <212> PRT <213> Synthetic <400> 8 Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile 20 25 30 Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val 50 55 60 Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln 85 90 95 Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val 115 120 125 Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu 145 150 155 160 Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr 165 170 175 Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr 195 200 205 Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys 210 215 220 Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 225 230 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> Synthetic <400> 9 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 10 <211> 94 <212> PRT <213> Synthetic <400> 10 Gly Ser His Met Trp Lys Gln Ser Val Glu Leu Ala Lys Lys Asp Ser 1 5 10 15 Leu Tyr Lys Asp Ala Met Gln Tyr Ala Ser Glu Ser Lys Asp Thr Glu 20 25 30 Leu Ala Glu Glu Leu Leu Gln Trp Phe Leu Gln Glu Glu Lys Arg Glu 35 40 45 Cys Phe Gly Ala Cys Leu Phe Thr Cys Tyr Asp Leu Leu Arg Pro Asp 50 55 60 Val Val Leu Glu Leu Ala Trp Arg His Asn Ile Met Asp Phe Ala Met 65 70 75 80 Pro Tyr Phe Ile Gln Val Met Lys Glu Tyr Leu Thr Lys Val 85 90 <210> 11 <211> 40 <212> PRT <213> Synthetic <400> 11 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 1 5 10 15 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 20 25 30 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly 35 40 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 1 5 10 15 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 35 40 45 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg 50 55 60 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 65 70 75 80 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 85 90 95 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 100 105 110 Thr Glu Arg Arg Ala Glu 115 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile 35 40 45 Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr 50 55 60 Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala 65 70 75 80 Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg 85 90 95 Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys 100 105 110 Val Asn Ala Pro Tyr 115 <210> 14 <211> 362 <212> PRT <213> Synthetic <400> 14 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val 20 25 30 Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser 35 40 45 Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr 50 55 60 Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp 65 70 75 80 Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met 85 90 95 Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly 100 105 110 Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala 115 120 125 Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 145 150 155 160 Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 165 170 175 Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp 180 185 190 Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu 195 200 205 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met 210 215 220 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 225 230 235 240 Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 245 250 255 Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln 260 265 270 Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe 275 280 285 Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu 290 295 300 Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe 305 310 315 320 Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn 325 330 335 Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 340 345 350 Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Ile 355 360 <210> 15 <211> 362 <212> PRT <213> Synthetic <400> 15 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val 20 25 30 Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser 35 40 45 Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr 50 55 60 Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp 65 70 75 80 Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met 85 90 95 Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly 100 105 110 Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala 115 120 125 Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Pro Ser Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 145 150 155 160 Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 165 170 175 Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp 180 185 190 Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu 195 200 205 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met 210 215 220 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 225 230 235 240 Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 245 250 255 Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln 260 265 270 Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe 275 280 285 Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu 290 295 300 Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe 305 310 315 320 Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn 325 330 335 Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 340 345 350 Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Ile 355 360 <210> 16 <211> 365 <212> PRT <213> Synthetic <400> 16 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val 20 25 30 Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser 35 40 45 Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr 50 55 60 Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp 65 70 75 80 Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met 85 90 95 Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly 100 105 110 Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala 115 120 125 Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Arg Asp Cys Gly 130 135 140 Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile 145 150 155 160 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys 165 170 175 Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln 180 185 190 Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln 195 200 205 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu 210 215 220 Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg 225 230 235 240 Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 245 250 255 Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro 260 265 270 Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr 275 280 285 Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln 290 295 300 Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly 305 310 315 320 Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu 325 330 335 Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn 340 345 350 His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Ile 355 360 365 <210> 17 <211> 370 <212> PRT <213> Synthetic <400> 17 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val 20 25 30 Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser 35 40 45 Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr 50 55 60 Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp 65 70 75 80 Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met 85 90 95 Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly 100 105 110 Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala 115 120 125 Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile 130 135 140 Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly 145 150 155 160 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile 165 170 175 Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp 180 185 190 Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His 195 200 205 Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 210 215 220 Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys 225 230 235 240 Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu 245 250 255 Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr 260 265 270 Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu 275 280 285 Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp 290 295 300 Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val 305 310 315 320 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu 325 330 335 Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His 340 345 350 Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro 355 360 365 Gly Lys 370 <210> 18 <211> 171 <212> PRT <213> Synthetic <400> 18 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val 20 25 30 Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser 35 40 45 Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr 50 55 60 Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp 65 70 75 80 Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met 85 90 95 Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly 100 105 110 Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala 115 120 125 Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Gly Tyr Ile Pro Glu Ala 130 135 140 Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu 145 150 155 160 Leu Ser Thr Phe Leu His His His His His His 165 170 <210> 19 <211> 238 <212> PRT <213> Synthetic <400> 19 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val 20 25 30 Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser 35 40 45 Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr 50 55 60 Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp 65 70 75 80 Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met 85 90 95 Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly 100 105 110 Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala 115 120 125 Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Gly Ser His Met Trp Lys 130 135 140 Gln Ser Val Glu Leu Ala Lys Lys Asp Ser Leu Tyr Lys Asp Ala Met 145 150 155 160 Gln Tyr Ala Ser Glu Ser Lys Asp Thr Glu Leu Ala Glu Glu Leu Leu 165 170 175 Gln Trp Phe Leu Gln Glu Glu Lys Arg Glu Cys Phe Gly Ala Cys Leu 180 185 190 Phe Thr Cys Tyr Asp Leu Leu Arg Pro Asp Val Val Leu Glu Leu Ala 195 200 205 Trp Arg His Asn Ile Met Asp Phe Ala Met Pro Tyr Phe Ile Gln Val 210 215 220 Met Lys Glu Tyr Leu Thr Lys Val His His His His His His 225 230 235 <210> 20 <211> 185 <212> PRT <213> Synthetic <400> 20 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val 20 25 30 Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser 35 40 45 Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr 50 55 60 Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp 65 70 75 80 Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met 85 90 95 Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly 100 105 110 Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala 115 120 125 Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Lys Pro Leu Asp Gly Glu 130 135 140 Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg 145 150 155 160 Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu 165 170 175 Pro Gly His His His His His His His 180 185 <210> 21 <211> 361 <212> PRT <213> Synthetic <400> 21 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val 20 25 30 Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu 35 40 45 Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp 50 55 60 Lys Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln 65 70 75 80 His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala 100 105 110 Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg 115 120 125 Ile Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 145 150 155 160 Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 165 170 175 Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe 180 185 190 Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu 195 200 205 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His 210 215 220 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala 225 230 235 240 Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg 245 250 255 Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met 260 265 270 Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro 275 280 285 Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn 290 295 300 Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val 305 310 315 320 Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr 325 330 335 Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu 340 345 350 Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Ile 355 360 <210> 22 <211> 361 <212> PRT <213> Synthetic <400> 22 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val 20 25 30 Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu 35 40 45 Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp 50 55 60 Lys Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln 65 70 75 80 His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala 100 105 110 Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg 115 120 125 Ile Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr Gly Gly Gly Pro Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Pro Ser Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 145 150 155 160 Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 165 170 175 Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe 180 185 190 Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu 195 200 205 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His 210 215 220 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala 225 230 235 240 Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg 245 250 255 Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met 260 265 270 Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro 275 280 285 Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn 290 295 300 Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val 305 310 315 320 Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr 325 330 335 Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu 340 345 350 Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Ile 355 360 <210> 23 <211> 364 <212> PRT <213> Synthetic <400> 23 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val 20 25 30 Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu 35 40 45 Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp 50 55 60 Lys Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln 65 70 75 80 His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala 100 105 110 Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg 115 120 125 Ile Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 130 135 140 Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 145 150 155 160 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val 165 170 175 Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 180 185 190 Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro 195 200 205 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 210 215 220 Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val 225 230 235 240 Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 245 250 255 Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys 260 265 270 Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp 275 280 285 Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro 290 295 300 Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser 305 310 315 320 Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala 325 330 335 Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His 340 345 350 His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Ile 355 360 <210> 24 <211> 369 <212> PRT <213> Synthetic <400> 24 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val 20 25 30 Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu 35 40 45 Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp 50 55 60 Lys Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln 65 70 75 80 His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala 100 105 110 Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg 115 120 125 Ile Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys 130 135 140 Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro 145 150 155 160 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser 165 170 175 Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp 180 185 190 Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr 195 200 205 Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val 210 215 220 Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu 225 230 235 240 Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg 245 250 255 Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val 260 265 270 Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr 275 280 285 Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr 290 295 300 Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu 305 310 315 320 Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys 325 330 335 Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu 340 345 350 Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 355 360 365 Lys <210> 25 <211> 170 <212> PRT <213> Synthetic <400> 25 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val 20 25 30 Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu 35 40 45 Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp 50 55 60 Lys Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln 65 70 75 80 His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala 100 105 110 Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg 115 120 125 Ile Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro 130 135 140 Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu 145 150 155 160 Ser Thr Phe Leu His His His His His His 165 170 <210> 26 <211> 237 <212> PRT <213> Synthetic <400> 26 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val 20 25 30 Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu 35 40 45 Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp 50 55 60 Lys Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln 65 70 75 80 His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala 100 105 110 Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg 115 120 125 Ile Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr Gly Ser His Met Trp Lys Gln 130 135 140 Ser Val Glu Leu Ala Lys Lys Asp Ser Leu Tyr Lys Asp Ala Met Gln 145 150 155 160 Tyr Ala Ser Glu Ser Lys Asp Thr Glu Leu Ala Glu Glu Leu Leu Gln 165 170 175 Trp Phe Leu Gln Glu Glu Lys Arg Glu Cys Phe Gly Ala Cys Leu Phe 180 185 190 Thr Cys Tyr Asp Leu Leu Arg Pro Asp Val Val Leu Glu Leu Ala Trp 195 200 205 Arg His Asn Ile Met Asp Phe Ala Met Pro Tyr Phe Ile Gln Val Met 210 215 220 Lys Glu Tyr Leu Thr Lys Val His His His His His His 225 230 235 <210> 27 <211> 184 <212> PRT <213> Synthetic <400> 27 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val 20 25 30 Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu 35 40 45 Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp 50 55 60 Lys Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln 65 70 75 80 His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala 100 105 110 Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg 115 120 125 Ile Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr 130 135 140 Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu 145 150 155 160 Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro 165 170 175 Gly His His His His His His His 180 <210> 28 <211> 217 <212> PRT <213> Synthetic <400> 28 Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe 35 40 45 Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu 50 55 60 Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys 85 90 95 Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser 100 105 110 Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro 130 135 140 Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 210 215 <210> 29 <211> 195 <212> PRT <213> Synthetic <400> 29 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val 20 25 30 Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser 35 40 45 Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr 50 55 60 Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp 65 70 75 80 Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met 85 90 95 Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly 100 105 110 Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala 115 120 125 Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Pro Ser Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile 145 150 155 160 Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu 165 170 175 Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly His His His His 180 185 190 His His His 195 <210> 30 <211> 194 <212> PRT <213> Synthetic <400> 30 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val 20 25 30 Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu 35 40 45 Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp 50 55 60 Lys Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln 65 70 75 80 His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala 100 105 110 Gly Val Tyr Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg 115 120 125 Ile Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr Gly Gly Gly Pro Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Pro Ser Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg 145 150 155 160 Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu 165 170 175 Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly His His His His His 180 185 190 His His <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Synthetic <400> 31 His His His His His His His 1 5

Claims (29)

  1. 세포예정사-1 (PD-1) 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편, 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 올리고머화 도메인은 뮤린 IgG1 Fc 도메인, 뮤린 IgG2A Fc 도메인, GCN4 삼량체 도메인, 클라트린 삼량체 도메인 및 p53 사량체 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 뮤린 IgG1 Fc 도메인 또는 뮤린 IgG2A Fc 도메인은 힌지 영역을 포함하는, 융합 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 PD-1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 상기 올리고머화 도메인에 융합되어 있는, 융합 단백질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 아미노산인 글리신 및 세린을 포함하는 하나 이상의 플렉스 링커를 통해서 또는 아미노산인 글리신, 프롤린 및 세린을 포함하는 하나 이상의 플렉스 프로 링커를 통해 상기 올리고머화 도메인에 융합되어 있는, 융합 단백질.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 상기 올리고머화 도메인에 융합되어 있는, 융합 단백질.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 서열을 추가로 포함하고, 상기 신호 서열은 상기 PD-1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편의 N-말단에 융합되어 있는, 융합 단백질.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 신호 서열은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는, 융합 단백질.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1의 세포외 도메인의 아미노산 서열은
    (i) 서열 번호 1의 잔기 21 내지 170으로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (ii) 서열 번호 1의 잔기 21 내지 145로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iii) 서열 번호 1의 잔기 33 내지 170으로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iv) 서열 번호 1의 잔기 33 내지 145로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (v) 서열 번호 1의 잔기 35 내지 170으로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열; 및
    (iv) 서열 번호 1의 잔기 35 내지 145로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열
    로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 단백질.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 12에 기재된 아마노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머화 도메인의 아미노산 서열은
    (i) 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (ii) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iii) 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iv) 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (v) 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (vi) 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열; 및
    (vii) 서열 번호 28에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열
    로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 단백질.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은
    (i) 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (ii) 서열 번호 15에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iii) 서열 번호 16에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iv) 서열 번호 17에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (v) 서열 번호 18에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (vi) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (vii) 서열 번호 20에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열; 및
    (viii) 서열 번호 29에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열
    로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 단백질.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1이 재조합 PD-1인, 융합 단백질.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1이 재조합 인간 PD-1인, 융합 단백질.
  14. 세포예정사-리간드 1 (PD-L1) 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편, 및 올리고머화 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 올리고머화 도메인은 뮤린 IgG1 Fc 도메인, 뮤린 IgG2A Fc 도메인, GCN4 삼량체 도메인, 클라트린 삼량체 도메인, 및 p53 사량체 도메인, 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 단백질.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 뮤린 IgG1 Fc 도메인 또는 뮤린 IgG2A Fc 도메인은 힌지 영역을 포함하는, 융합 단백질.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 상기 올리고머화 도메인에 융합되어 있는, 융합 단백질.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 아미노산인 글리신 및 세린을 포함하는 하나 이상의 플렉스 링커를 통해서 또는 아미노산인 글리신, 프롤린 및 세린을 포함하는 하나 이상의 플렉스 프로 링커를 통해서 상기 올리고머화 도메인에 융합되어 있는, 융합 단백질.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 상기 올리고머화 도메인에 융합되어 있는, 융합 단백질.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 서열을 추가로 포함하고, 상기 신호 서열은 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편의 N-말단에 융합되어 있는, 융합 단백질.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 신호 서열은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는, 융합 단백질.
  21. 제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인의 아미노산 서열은
    (i) 서열 번호 2의 잔기 18 내지 239로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (ii) 서열 번호 2의 잔기 18 내지 238로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iii) 서열 번호 2의 잔기 18 내지 225로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iv) 서열 번호 2의 잔기 18 내지 134로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (v) 서열 번호 2의 잔기 18 내지 127로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (vi) 서열 번호 2의 잔기 19 내지 239로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (vii) 서열 번호 2의 잔기 19 내지 238로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (viii) 서열 번호 2의 잔기 19 내지 225로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (ix) 서열 번호 2의 잔기 19 내지 134로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (x) 서열 번호 2의 잔기 19 내지 127로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (xi) 서열 번호 2의 잔기 133 내지 225로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (xii) 서열 번호 2의 잔기 133 내지 238로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열; 및
    (xiii) 서열 번호 2의 잔기 133 내지 239로 구성되는 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열
    로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 단백질.
  22. 제 14 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-L1 단백질의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  23. 제 14 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머화 도메인의 아미노산 서열은
    (i) 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (ii) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iii) 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iv) 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (v) 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (vi) 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열; 및
    (vii) 서열 번호 28에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열
    로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 단백질.
  24. 제 14 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은
    (i) 서열 번호 21에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (ii) 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iii) 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (iv) 서열 번호 24에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (v) 서열 번호 25에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (vi) 서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열;
    (vii) 서열 번호 27에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%의 상동성을 공유하는 아미노산 서열; 및
    (viii) 서열 번호 30에 기재된 아미노산 서열과 적어도 70 %의 상동성을 공유하는 아미노산 서열
    로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 단백질.
  25. 제 14 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-L1이 재조합 PD-L1인, 융합 단백질.
  26. 제 14 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-L1이 재조합 인간 PD-L1인, 융합 단백질.
  27. 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 다른 항-PD-1 치료제로 이루어진 군에서 선택된 생물학적 치료용 항체의 순환 수준의 양을 결정하는 방법으로서, (i) 상기 항체 치료를 받고 있는 환자로부터 시료를 얻고; (ii) 상기 시료를 제 1 항에 따른 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  28. 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 다른 항-PD-L1 치료제로 이루어진 군에서 선택된 생물학적 치료용 항체의 (유리) 순환 수준의 양을 결정하는 방법으로서, (i) 상기 항체 치료를 받고 있는 환자로부터 시료를 얻고; (ii) 상기 시료를 제 14 항에 따른 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리히스티딘 친화성 태그를 추가로 포함하는 융합 단백질.
KR1020197001646A 2017-11-30 2018-11-29 면역 관문 억제제인 pd-1 및 pd-l1에 대한 항체 치료를 모니터링하기 위한 면역분석 및 조작된 단백질 KR20190065234A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762593080P 2017-11-30 2017-11-30
US62/593,080 2017-11-30
PCT/IB2018/059449 WO2019106592A2 (en) 2017-11-30 2018-11-29 Immunoassays and engineered proteins for monitoring antibody treatments to the immune checkpoint inhibitors pd1 and pd-l1

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217008441A Division KR20210035915A (ko) 2017-11-30 2018-11-29 면역 관문 억제제인 pd-1 및 pd-l1에 대한 항체 치료를 모니터링하기 위한 면역분석 및 조작된 단백질

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190065234A true KR20190065234A (ko) 2019-06-11

Family

ID=64665106

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217008441A KR20210035915A (ko) 2017-11-30 2018-11-29 면역 관문 억제제인 pd-1 및 pd-l1에 대한 항체 치료를 모니터링하기 위한 면역분석 및 조작된 단백질
KR1020197001646A KR20190065234A (ko) 2017-11-30 2018-11-29 면역 관문 억제제인 pd-1 및 pd-l1에 대한 항체 치료를 모니터링하기 위한 면역분석 및 조작된 단백질

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217008441A KR20210035915A (ko) 2017-11-30 2018-11-29 면역 관문 억제제인 pd-1 및 pd-l1에 대한 항체 치료를 모니터링하기 위한 면역분석 및 조작된 단백질

Country Status (9)

Country Link
US (2) US11919938B2 (ko)
EP (1) EP3512874A2 (ko)
JP (3) JP6967578B2 (ko)
KR (2) KR20210035915A (ko)
CN (1) CN110167959A (ko)
AR (1) AR114294A1 (ko)
TW (1) TW201925241A (ko)
UY (1) UY37986A (ko)
WO (1) WO2019106592A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023158093A1 (ko) * 2022-02-21 2023-08-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102171766B1 (ko) * 2018-02-02 2020-10-29 주식회사 뉴라클제네틱스 Pd-l1 결합력이 증대된 pd-1 변이체

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
CA2222055A1 (en) 1995-05-23 1996-11-28 Morphosys Gesellschaft Fur Proteinoptimierung Mbh Multimeric proteins
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
ATE433491T1 (de) 2001-01-18 2009-06-15 Vlaams Interuniv Inst Biotech Oligomerische komplexe von chimären proteinen mit verbessertem immunogenen potential
AR036993A1 (es) * 2001-04-02 2004-10-20 Wyeth Corp Uso de agentes que modulan la interaccion entre pd-1 y sus ligandos en la submodulacion de respuestas inmunologicas
FI117667B (fi) * 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
AR063975A1 (es) 2006-11-28 2009-03-04 Centelion Fusiones fc con receptor para fgf soluble modificadas con actividad biologica mejorada
CN101830986A (zh) 2009-03-13 2010-09-15 北京表源生物技术有限公司 一种融合蛋白多聚体
US8907053B2 (en) * 2010-06-25 2014-12-09 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunosuppression modulating compounds
WO2012088461A2 (en) * 2010-12-23 2012-06-28 Biogen Idec Inc. Linker peptides and polypeptides comprising same
JP6161541B2 (ja) * 2011-02-03 2017-07-12 ゾーマ テクノロジー リミテッド 細菌中の機能的タンパク質発現を向上させるための方法および物質
TWI496886B (zh) * 2011-06-24 2015-08-21 Taipei Veteran General Hospital 提升感染性與惡性疾病之治療之免疫反應
KR20150135148A (ko) 2014-05-23 2015-12-02 주식회사 제넥신 Pd-l1 융합 단백질 및 이의 용도
BR112016027897A2 (pt) * 2014-06-18 2017-10-24 Albert Einstein College Medicine Inc polipeptídio multimérico, ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira geneticamente modificada, composição, método, e, método de tratamento de uma infecção num indivíduo
SG10201900571YA (en) * 2014-07-22 2019-02-27 Cb Therapeutics Inc Anti-pd-1 antibodies
JP6952028B2 (ja) * 2015-09-29 2021-10-20 シャンハイ チャンジアン バイオテクノロジー カンパニー リミテッド Ｐｄ−１抗体およびその使用
CN105999223B (zh) 2016-04-26 2020-05-12 中国人民解放军第四军医大学 PDL1-IgGFc融合蛋白抑制重症疟疾发病的应用
CN110461349A (zh) * 2016-11-10 2019-11-15 科乐斯疗法公司 激活素受体iia型变体及其使用方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023158093A1 (ko) * 2022-02-21 2023-08-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 암 환자에 대한 면역관문억제제의 반응성 예측용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
US11919938B2 (en) 2024-03-05
JP2022023168A (ja) 2022-02-07
US20240124549A1 (en) 2024-04-18
TW201925241A (zh) 2019-07-01
UY37986A (es) 2019-03-29
JP2020504075A (ja) 2020-02-06
AR114294A1 (es) 2020-08-19
EP3512874A2 (en) 2019-07-24
CN110167959A (zh) 2019-08-23
JP6967578B2 (ja) 2021-11-17
JP2023068027A (ja) 2023-05-16
WO2019106592A2 (en) 2019-06-06
WO2019106592A3 (en) 2019-07-18
US20200299353A1 (en) 2020-09-24
KR20210035915A (ko) 2021-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7069261B2 (ja) Ｃｄ７３特異的結合分子及びその使用
KR102593409B1 (ko) Her3 항원 결합 분자
EP2723376B1 (en) Anti-axl antibodies and uses thereof
ES2677367T3 (es) Anticuerpos anti-Axl y usos de los mismos
KR20210109520A (ko) 항체 및 이의 용도
KR20220086554A (ko) Her3 항원-결합 분자를 사용한 암의 치료 및 예방
US20240124549A1 (en) Immunoassays and engineered proteins for monitoring antibody treatments to the immune checkpoint inhibitors pd1 and pd-l1
CN114729038A (zh) Cd39的高亲和力抗体及其用途
EP3916016A1 (en) Novel bispecific antibody molecule and bispecific antibody simultaneously combining pd-l1 and lag-3
JP7436711B2 (ja) 抗ｓｉｒｐ－アルファ抗体
EP4223778A1 (en) Anti-claudin18.2 and cd3 bispecific antibody and use thereof
AU2021250840A1 (en) Compositions and methods for detecting and treating ovarian cancer
JP2024038166A (ja) 新規抗ｐａｄ４抗体
TW202104262A (zh) 結合pd-1的抗體
CN117098548A (zh) 抗b7-h3抗体及其用途
CN115298216A (zh) 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途
KR20210108972A (ko) 항페리오스틴 항체 및 이의 용도
JP2020508636A (ja) ＩＦＮ−γ誘導性制御性Ｔ細胞転換性抗癌（ＩＲＴＣＡ）抗体およびその使用
EP4293047A1 (en) Anti-pd-l1 antibody and use thereof
TW202241957A (zh) 抗ｐｄ－１抗體及其用途
TW202328191A (zh) 使用her3抗原結合分子的癌症之治療及預防
ES2712736T3 (es) Anticuerpos anti-Axl y sus usos
JP2022501062A (ja) Ｅｐｎ１を標的とする抗体

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
A107 Divisional application of patent