CN117642509A - 产生用于治疗肌营养不良的重组aav载体 - Google Patents

产生用于治疗肌营养不良的重组aav载体 Download PDF

Info

Publication number
CN117642509A
CN117642509A CN202280049147.2A CN202280049147A CN117642509A CN 117642509 A CN117642509 A CN 117642509A CN 202280049147 A CN202280049147 A CN 202280049147A CN 117642509 A CN117642509 A CN 117642509A
Authority
CN
China
Prior art keywords
raav
cells
seq
aspects
administration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280049147.2A
Other languages
English (en)
Inventor
M·阿拉姆
L·罗迪诺-克拉帕克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sarepta Therapeutics Inc
Original Assignee
Sarepta Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sarepta Therapeutics Inc filed Critical Sarepta Therapeutics Inc
Priority claimed from PCT/US2022/029328 external-priority patent/WO2022245675A1/en
Publication of CN117642509A publication Critical patent/CN117642509A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本公开内容提供了在悬浮条件下培养的哺乳动物贴壁细胞中产生的基因治疗载体，例如重组腺相关病毒(rAAV)，以用于表达人微小抗肌营养不良蛋白基因。本公开内容还提供了使用这些rAAV来治疗肌营养不良例如杜氏肌营养不良的组合物和方法。

Description

产生用于治疗肌营养不良的重组AAV载体
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年10月8日提交的美国临时申请号63/253,998、2021年9月14日提交的美国临时申请号63/243,944、2021年6月11日提交的美国临时申请号63/209,733以及2021年5月17日提交的美国临时申请号63/189,676的优先权，其均通过引用整体并入本文。
以电子形式提供的序列表的引用
与本申请一起提交的以电子形式提供的ASCII文本文件的序列表内容(名称：4140_052PC04_Seqlisting_ST25.txt；大小：60,194字节；创建日期：2022年5月13日)通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开内容属于基因治疗领域。更具体地，本公开内容提供了用于表达小型化的人微小抗肌营养不良蛋白(微小抗肌营养不良蛋白)基因的基因治疗载体，例如腺相关病毒(AAV)载体，其中所述AAV是从在悬浮条件下培养的贴壁细胞中产生的。本公开内容还提供了使用这些载体在骨骼肌(包括膈肌和心肌)中表达微小抗肌营养不良蛋白，以及保护肌纤维免受损伤、增加肌力、减少和/或预防患有肌营养不良的受试者中的纤维化的方法。
背景技术
肌肉质量和力量对日常活动(例如运动和呼吸)以及全身新陈代谢的重要性不言而喻。肌肉功能缺陷会导致肌营养不良(MD)，其表征为肌无力和肌萎缩，并严重影响生活质量。最典型的MD是由编码抗肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)的成员的基因的突变所导致。这些MD是由与通过DAPC束缚的肌膜-细胞骨架的缺失相关的膜脆性所导致的。杜氏肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)是最具破坏性的肌肉疾病之一，每5,000名新生男婴中就有1人患病。
DMD是由DMD基因突变导致mRNA减少和抗肌营养不良蛋白缺乏所引起的，抗肌营养不良蛋白是一种427kD的与抗肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(DAPC)相关的肌膜蛋白(Hoffman等人，Cell51:919-28,1987)。DAPC由肌肉肌膜上的多种蛋白质组成，这些蛋白质通过抗肌营养不良蛋白(一种肌动蛋白结合蛋白)和α-抗肌营养不良蛋白聚糖(一种层粘连蛋白结合蛋白)在细胞外基质(ECM)和细胞骨架之间形成结构连接。这些结构连接在收缩过程中稳定肌肉细胞膜，并防止收缩引起的损伤。缺失抗肌营养不良蛋白后，膜脆性会导致肌膜撕裂和钙的流入，触发钙激活蛋白酶和节段性纤维坏死(Straub等人，CurrOpin.Neurol.10:168-75(1997))。这种肌肉变性和再生的不受控制的循环最终会耗尽肌肉干细胞群(Sacco等人，Cell 143:1059-1071(2010)；Wallace等人,Annu Rev Physiol 71:37-57(2009))，导致进行性肌无力、肌内膜炎症和纤维化瘢痕形成。
如果没有抗肌营养不良蛋白或微小抗肌营养不良蛋白的膜稳定作用，DMD将表现为组织损伤和修复的不受控制的循环，最终通过***增生以纤维化瘢痕组织替换失去的肌纤维。纤维化表征为ECM基质蛋白(包括胶原蛋白和弹性蛋白)的过度沉积。ECM蛋白主要由在响应压力和炎症时被激活的成纤维细胞释放的细胞因子(例如TGFβ)产生。虽然DMD的主要病理特征是肌纤维变性和坏死，但纤维化作为一种病理结果也会产生同样的影响。在DMD患者中，纤维化组织的过度生成限制了肌肉再生，并导致进行性肌无力。在一项研究中，在最初的DMD肌肉活检中存在纤维化与10年随访的不良运动预后高度相关(Desguerre等人，J Neuropathol Exp Neurol 68:762-767(2009))。这些结果表明，纤维化是导致DMD肌肉功能障碍的主要因素，并强调了在出现明显纤维化之前进行早期干预的必要性。
国际公开号WO2019/245973A1(其通过引用整体并入本文)描述了用AAV载体递送微小抗肌营养不良蛋白基因来治疗人类受试者的肌营养不良(例如DMD)，然而，本领域仍然需要改进产生此类AAV载体的方法，特别是适合用于大规模产生此类基因治疗载体的方法。
发明内容
本公开内容涉及通过本文所述的悬浮播种工艺产生的基因治疗载体(例如AAV载体)，所述载体在骨骼肌(包括膈肌和心肌)中表达人微小抗肌营养不良蛋白基因，从而保护肌纤维免受损伤、增加肌力、减少和/或预防纤维化。
本公开内容提供了通过悬浮播种工艺在贴壁哺乳动物细胞中产生重组腺相关病毒(rAAV)rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的方法，包括：(a)在N-2容器中用包含血清的第一生长培养基培养细胞；(b)从第一培养基中移出细胞；(c)将来自步骤(b)的细胞接种到N-1容器中的不含血清或血清浓度低于第一培养基的第二培养基中；(d)在悬浮条件下培养N-1容器中的细胞；以及(e)用来自步骤(d)的细胞接种生物反应器中的第三培养基。
在一些方面，本文所述方法中使用的rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列。在一些方面，所述rAAV包含SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。在一些方面，所述rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。
在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括：(f)用包含rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒、包含AAV rep基因和AAV cap基因的质粒以及腺病毒辅助质粒转染贴壁细胞。
在一些方面，包含rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒包含：SEQ ID NO:9的核酸序列；SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021；或SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977。在一些方面，包含AAV rep基因和AAV cap基因的质粒包含AAV2 rep基因和rAAVrh74cap基因。在一些方面，腺病毒辅助质粒包含腺病毒5E2A、E4ORF6和VA RNA基因。
在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括：(g)裂解贴壁细胞。在一些方面，通过冻融、固体剪切、高渗和/或低渗裂解、液体剪切、超声、高压挤出、去污剂裂解或其组合来裂解贴壁细胞。
在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括(h)通过至少一个柱色谱步骤纯化rAAV。在一些方面，所述至少一个柱色谱步骤包括阴离子交换色谱、尺寸排阻色谱或其组合。
在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括在N-3容器中用所述第一生长培养基培养细胞。在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括在N-4容器中用所述第一生长培养基培养细胞。
在一些方面，生物反应器是贴壁生物反应器。在一些方面，从在贴壁生物反应器中产生的培养物纯化rAAV。
在一些方面，生物反应器中的第三培养基包含至少一种促进细胞粘附的因子。在一些方面，所述至少一种促进细胞粘附的因子选自由血清、FBS、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、钙离子、细胞外基质的蛋白聚糖或非蛋白聚糖多糖及其组合组成的组。在一些方面，生物反应器中的第三培养基包含DMEM和10％FBS。
在一些方面，贴壁细胞在悬浮条件下培养约48-72小时。
在一些方面，N-1容器是悬浮摇瓶。
在一些方面，贴壁细胞选自由HeLa细胞、CHO细胞、HEK-293细胞、VERO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞和COS细胞组成的组。在一些方面，贴壁细胞是HeLa细胞或HEK-293细胞。在一些方面，贴壁细胞是HEK-293细胞。在一些方面，贴壁细胞不是悬浮适应细胞。在一些方面，在悬浮条件下培养细胞不改变所述细胞的贴壁依赖性。在一些方面，所述培养不改变所述细胞以产生新的细胞系。
本公开内容还提供了包含重组腺相关病毒(rAAV)rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的组合物，其中rAAV通过本文所述的任何方法制造。在一些方面，所述组合物包含：a)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的rAAV颗粒；b)包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021的rAAV颗粒；和/或c)包含SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977的rAAV颗粒。
在一些方面，本公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗肌营养不良的组合物，其包含重组腺相关病毒(rAAV)rAAV.rh74MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白，其中rAAV在贴壁细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。在一些方面，rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列。在一些方面，rAAV包含SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。在一些方面，rAAV包含SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列和SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列。
在一些方面，所述组合物包含：(a)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的rAAV；(b)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的rAAV颗粒；(c)包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021的rAAV；(d)包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021的rAAV颗粒；(e)包含SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977的rAAV；和/或(f)包含SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977的rAAV颗粒。
本公开内容还提供了在有需要的人类受试者中治疗肌营养不良的方法，包括向所述人类受试者施用包含本文所述的rAAV的组合物。在一些方面，使用全身施用途径并且以约5.0x1012vg/kg至约1.0x1015vg/kg的剂量施用rAAV。在一些方面，全身施用途径是静脉内途径并且施用的rAAV的剂量为约2x1014vg/kg。
在一些方面，rAAV的剂量以约10mL/kg的浓度施用。在一些方面，rAAV通过注射、灌注或植入施用。在一些方面，rAAV通过灌注在约一小时内施用。在一些方面，rAAV经由外周肢体静脉通过静脉内途径施用。
在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良(Becker’smuscular dystrophy)。在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良。
在一些方面，与施用rAAV之前的微小抗肌营养不良蛋白基因表达水平相比，施用rAAV之后在受试者的细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因表达的水平增加。在一些方面，通过在施用所述rAAV之前和之后通过蛋白质印迹测量肌肉活检中的微小抗肌营养不良蛋白水平来检测所述细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因的表达。在一些方面，与施用之前相比，施用rAAV之后的表达为至少55.4％。
在一些方面，与施用rAAV之前的微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的数量相比，施用rAAV之后受试者的肌肉组织中的微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的平均百分比增加。在一些方面，如在施用rAAV之前和之后的肌肉活检中通过免疫荧光(IF)所检测的，微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的平均百分比为至少70.5％，平均强度为至少116.9％。在一些方面，通过载体基因组计数的微小抗肌营养不良蛋白转导为每个细胞核至少3.87个平均载体基因组拷贝。
在一些方面，所述组合物施用于基因分型的患者。在一些方面，对患者的人抗肌营养不良蛋白(DMD)基因进行基因分型。在一些方面，对基因分型的患者针对人抗肌营养不良蛋白(DMD)基因的外显子18-79中的至少一种突变进行基因分型。
在一些方面，治疗肌营养不良的方法进一步包括在向所述人类受试者施用所述组合物之前对所述人类受试者的DMD基因进行基因分型。在一些方面，基因分型检测DMD基因的外显子18至79中的至少一个突变。在一些方面，所述至少一种突变是移码缺失、移码重复、过早终止或导致人抗肌营养不良蛋白的表达缺失的其他致病性变异。
本公开内容还提供了本文所述的组合物用于在有需要的人类受试者中治疗肌营养不良的用途。在一些方面，本公开内容还提供了本文所述的组合物在制备用于治疗肌营养不良的药物中的用途。
在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良。在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良。
附图说明
图1展示了rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体。在该构建体中，cDNA表达盒的侧翼是AAV2反向末端重复序列(ITR)。该构建体的特点是框内杆缺失(R4-R23)，而铰链1、2和4(H1、H2和H4)以及富含半胱氨酸的结构域保留，从而产生138kDa的蛋白质。微小抗肌营养不良蛋白(3579bp)的表达由MHCK7启动子(795bp)指导。内含子和5’UTR来自质粒pCMVβ(Clontech)。微小抗肌营养不良蛋白盒具有在ATG起始子前方的共有Kozak以及用于mRNA终止的小的53bp的合成多聚A信号。人微小抗肌营养不良蛋白盒含有(R4-R23/Δ71-78)结构域，如Harper等人(Nature Medicine 8:253-261(2002))先前所述。
图2提供了AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:3)。
图3提供了pNLREP2-Caprh74 AAV辅助质粒图谱。
图4提供了Ad辅助质粒pHELP。
图5展示了rAAV.MCK.微小抗肌营养不良蛋白质粒构建体。
图6提供了rAAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:5)。
图7表明了通过免疫细胞化学法测量的腓肠肌肌肉活检的肌纤维中的微小抗肌营养不良蛋白基因表达。
图8A-8C提供了蛋白质印迹图，其表明微小抗肌营养不良蛋白以正确的分子量表达。在图8A和8B中，蛋白质印迹分析检测出受试者1(5岁)、受试者2(4岁)和受试者3(6岁)中的微小抗肌营养不良蛋白表达。在图8C中，因为在初次分析中ULDQ(>80％)超出，受试者4的样品(*)经1:4稀释(至线性范围)，平均值乘以稀释校正因子以得到最终值与正常样品进行比较。平均微小抗肌营养不良蛋白表达相比于正常样品在方法1中为182.7％，在方法2中为222.0％。
图9A-9C表明，在受试者1(图9A)、受试者2(图9B)和受试者3(图9C)中，施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白上调DAPC蛋白、α-肌蛋白聚糖和β-肌蛋白聚糖的表达。
图10提供了图表，其显示了施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白使得肌酸激酶(CK)值持续大幅减少。
图11提供了图表，其显示了从基线至第270天的平均肌酸激酶(CK)变化。该数据表明，施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白之后，随着时间推移CK显著降低。
图12提供了图表，其显示了从基线至第270天的平均NSAA变化和平均CK变化。该数据表明，施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白之后，随着时间推移NSAA显著增加。
图13提供了AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的4977碱基核酸序列(SEQ ID NO:9)。描述了以下分子元件：5’ITR(碱基1-145)；MHCK7启动子(190-981(792个碱基))；内含子(991-1140(150个碱基))；人微小抗肌营养不良蛋白序列(1151-4729(3579个碱基))；多聚A尾(4732-4784(53个碱基))；和3’ITR(4833-4977(145个碱基))。
图14展示了AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白质粒构建体。
图15提供了包含卡那霉素(kanamycin)抗性基因的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白质粒构建体的核酸序列(SEQ ID NO:8)。
图16是本文所述的混合接种训练(seed-train)扩增方法的视觉表示。
图17是使用本文所述的混合接种训练扩增方法产生AAV颗粒的视觉表示。
图18A-18B提供了图表，其显示了根据本文所公开的混合接种训练扩增方法培养(图18A)和仅在贴壁条件下培养(图18B)的HEK-293细胞的活力。
图19A-19B提供了图表，其显示了根据本文所公开的混合接种训练扩增方法培养(图19A)和仅在贴壁条件下培养(图19B)的HEK-293细胞的存活细胞密度。
图20的图表显示了实施例7中描述的队列1(用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白治疗的前11名患者)的平均NSAA评分。所述前11名患者比基线提高了3分。6至7岁的患者(n＝9)比基线提高了2.9分。每个时间点表示所述11名患者。
图21A-21C表明如在实施例11中所讨论，与生理盐水(图21A)相比，在使用delandistrogene moxeparvovec治疗后12周(图21B)和24周(图21C)DMDmdx大鼠的骨骼肌和心肌中的微小抗肌营养不良蛋白的表达(免疫荧光)。图例：LTA＝左胫前肌；HRT＝心脏。
图22A-22B的条形图描述了如在实施例11中所讨论，在使用delandistrogenemoxeparvovec治疗后12周和24周DMDmdx大鼠的肌肉组织中微小抗肌营养不良蛋白表达(免疫荧光)(图22A)和载体转导(载体基因组拷贝)(图22B)的定量。图例：TA＝胫骨肌；HRT＝心脏；MG＝内侧腓肠肌；LG＝外侧内侧腓肠肌；DIA＝膈肌；TRI＝三头肌；PSO＝腰大肌。
图23A-23B的条形图描述了如在实施例11中所讨论，与生理盐水相比，使用delandistrogene moxeparvovec治疗后12周和24周，DMDmdx大鼠的步行(图23A)和垂直活动(图23B)增加。大鼠在活动笼中的移动(步行和垂直活动)是通过每小时激光光束的断点来测量的。每个点表示一只动物的数值。数据呈现为平均值±SD；***＝p<0.001；**＝p<0.01。SD＝标准偏差。
图24A-24B描述了如在实施例11所讨论，与生理盐水相比，在DMDmdx大鼠中进行delandistrogene moxeparvovec基因转移后12周和24周，通过在骨骼肌中的中央成核分析，肌肉变性显著减少。图24A描述了腓肠肌肌肉的苏木精和伊红(H&E)染色。图24B的条形图描述了具有中央核的纤维的百分比。条形图呈现为平均值±SD；****＝p<0.0001。SD＝标准偏差。
图25A-25B描述了如在实施例11中所讨论，骨骼肌和心肌中的胶原蛋白沉积的分析显示，与生理盐水相比，使用delandistrogene moxeparvovec治疗后12周和24周DMDmdx大鼠的纤维化减少。图25A描述了治疗后12周的马森毛状体染色。图25B提供了条形图，其量化了治疗后12周和24周在骨骼肌和心肌中的胶原蛋白沉积。图例：HRT＝心脏；MG＝内侧腓肠肌；DIA＝膈肌。数据呈现为平均值±SD；****＝p<0.0001；*＝p<0.05。SD＝标准偏差。
图26的条形图显示了如在实施例11中所讨论，与生理盐水相比，使用delandistrogene moxeparvovec治疗后1周和12周DMDmdx大鼠血液中的血清肌钙蛋白I水平没有显著变化。条形图表示平均值+SD。每个点表示一只动物的数值。
图27A-27C是条形图，如在实施例11中所讨论，其分析了与生理盐水相比，在使用delandistrogene moxeparvovec治疗后24周通过超声心动图测定的DMDmdx大鼠的心脏功能。图27A描述了左心室收缩末期直径(LVESD)的数据。图27B描述了射血分数(％)(EF)的数据。图27C描述了缩短分数(％)(FS)的数据。
发明详述
本公开内容提供了表达人微小抗肌营养不良蛋白的基因治疗载体，例如rAAV，其中rAAV在哺乳动物贴壁细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。
本公开内容提供了一种通过悬浮播种工艺在贴壁哺乳动物细胞中产生重组腺相关病毒(rAAV)rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的方法，包括：(a)在N-2容器中用包含血清的第一生长培养基培养细胞；(b)从第一培养基中移出细胞；(c)将来自步骤(b)的细胞接种到N-1容器中的不含血清或血清浓度低于第一培养基的第二培养基中；(d)在悬浮条件下培养N-1容器中的细胞；以及(e)用来自步骤(d)的细胞接种生物反应器中的第三培养基。
本公开内容还提供了包含本文所公开的rAAV的组合物(例如药物组合物)，以及使用本文所公开的组合物治疗肌营养不良(例如DMD)的方法。
在DMD的诊断的最早年龄进行的肌肉活检揭示了明显的***增生。肌肉纤维化有多种有害作用。它减少肌内膜营养物质通过***屏障的正常转运、减少血流量、剥夺肌肉中源自血管的营养成分，并且在功能上导致通过肢体挛缩的早期步行能力丧失。随着时间的推移，肌肉中明显的纤维化会使治疗难度倍增。这可以在肌肉活检中通过比较连续的时间点的***增生观察到。这一过程会持续恶化，导致患者丧失步行能力并加速失控，特别是在依赖轮椅的患者中。
如果不进行包括同时采用减少纤维化的方法的早期治疗，外显子跳读、终止密码子通读或基因置换治疗的益处就不可能完全实现。如果不采用减少肌肉纤维化的方法，即使是小分子或蛋白质置换策略也很可能失败。先前的研究用AAV.微小抗肌营养不良蛋白治疗已存在纤维化的年老mdx小鼠证实了无法实现完全的功能恢复(Liu,M等人，Mol Ther11:245-256(2005))。众所周知，DMD心肌病的进展伴随着心室壁的瘢痕和纤维化。
定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义。如有冲突，以本申请(包括定义)为准。除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
在本公开内容中，术语“一个”或“一种”实体是指一个或多个/一种或多种实体；例如，“一个多核苷酸”理解为表示一个或多个/一种或多种多核苷酸。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。
此外，本文中使用的“和/或”应被视为具有或不具有另一个特征或组分的两个指定特征或组分中的每一个的具体公开内容。因此，本文中诸如“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”意在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，诸如“A、B和/或C”等短语中使用的术语“和/或”也意在涵盖以下各个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
本文中使用的术语“大约”是指近似、大致、在……左右或在其区域内。当术语“大约”与数值范围结合使用时，它通过在所设的数值上下扩展边界来调整该范围。通常，除非另有说明，术语“大约”在本文中用于以10％的差值向上或向下(更高或更低)调整数值使其高于或低于所述数值。
在数字或数字系列之前的术语“至少”理解为包括与术语“至少”相邻的数字，以及根据上下文可清楚理解的逻辑上可包括的所有后续数字或整数。例如，核酸分子中核苷酸的数目必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子中的至少18个核苷酸”是指18、19、20或21个核苷酸具有所述特性。当“至少”出现在一系列数字或一个范围之前时，应理解为“至少”可以修饰所述一系列数字或一个范围中的每一个数字。“至少”也不限于整数(例如，“至少5％”包括5.0％、5.1％、5.18％，而不考虑有效数字的个数)。
除非另有特别说明，本文中核苷酸序列仅以单链、以5’至3’方向、从左至右表示。在本文中核苷酸和氨基酸以IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的方式表示，或(对于氨基酸)以37CFR§1.822和既定的用法用单字母代码或三字母代码表示。
本文中使用的“多核苷酸”或“核酸”是指通过磷酸二脂键连接的核苷酸的序列。本文中的多核苷酸以从5’至3’方向的方向表示。本公开内容的多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。在本文中核苷酸碱基以单字母代码表示：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。
除非另有说明，本文中使用的术语“多肽”涵盖肽和蛋白质。
本文中使用的术语“编码序列”或序列“编码”是指“编码”特定蛋白质(例如，胰岛素或葡糖激酶)的DNA或RNA区域(转录的区域)。当处于适当的调控区(例如启动子)的控制下时，编码序列在体外或体内转录(DNA)和翻译(RNA)为多肽。编码序列的边界由在5’(氨基)末端的起始密码子和在3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于原核生物或真核生物的cDNA、原核生物或真核生物的基因组DNA以及合成DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3’侧。
基因可以包含几个可操作地连接的片段，例如启动子、5’前导序列、内含子、编码序列和3’非翻译序列例如包含多聚腺苷酸化位点或信号序列。本文中使用的“基因表达”是指基因转录为RNA和/或翻译为活性蛋白质的过程。
本文中使用的术语“启动子”是指具有控制一个或多个基因(或编码序列)转录的功能的核酸序列或片段，其位于基因转录起始位点的转录方向的上游，并且其在结构上鉴定为存在DNA依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的直接或间接地从启动子调节转录量的任何其他核苷酸序列。“组成型”启动子是指在大多数生理和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是指受生理或发育条件调节的启动子。“组织特异性”启动子是指在特定类型的分化细胞/组织中优先活跃的启动子。
本文中使用的术语“增强子”是一种顺式作用元件，其刺激或抑制相邻基因的转录。抑制转录的增强子也被称为“沉默子”。增强子发挥作用(例如，可以与编码序列相关联)可以在任一方向上、与编码序列和转录区域的下游位置的距离可高达数千碱基对(kb)。
术语“可操作地连接”是指放置调节元件核苷酸序列(例如启动子核苷酸序列)以通过所述调节元件使所述核苷酸序列表达。
本文中使用的术语“转基因”是指被引入细胞中的基因(例如微小抗肌营养不良蛋白)或核酸分子。转基因的一个示例是编码治疗性多肽的核酸。在一些方面，基因可以存在，但在一些情况下，基因在细胞中通常不表达或表达水平不足。在这种背景下，“不足”是指虽然所述基因在细胞中正常表达，但仍可能发展出病况和/或疾病。在某些方面，转基因可以使基因表达增加或过表达。转基因可以包含细胞中的天然序列，包含细胞中天然不存在的序列，或可以包含两者的组合。在某些方面，转基因可以包括与适合于该基因表达的调控序列可操作地连接的序列。在某些方面，转基因未被整合至宿主细胞的基因组中。
本文中使用的术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是单链DNA细小病毒，其仅在其中某些功能由共感染辅助病毒提供的细胞中生长。目前已有十三种AAV血清型被表征。关于AAV的一般信息和综述可参见，例如，Carter,1989,Handbook ofParvoviruses,第1卷，第169-228页，和Berns,1990,Virology,第1743-1764页,RavenPress,(New York)。然而，完全可以预见的是这些相同的原则将适用于其他AAV血清型，因为众所周知的是，各种血清型在结构和功能上、甚至在基因水平上都有相当密切的关系。(参见，例如，Blacklowe,1988,Parvoviruses and Human Disease,第165-174页，J.R.Pattison编辑；和Rose,Comprehensive Virology3:1-61(1974))。例如，所有AAV血清型显然都显示出非常相似的由同源rep基因介导的复制特性；所有AAV血清型都携带三种相关的衣壳蛋白，例如在AAV2中表达的衣壳蛋白。异源双链分析进一步表明了关联性的程度，其揭示了血清型之间在基因组长度上的广泛交叉杂交；以及在与“反向末端重复序列”(ITR)相对应的末端存在类似的自我退火片段。相似的感染性模式还表明，每种血清型的复制功能受到相似的调控控制。
本文中使用的术语“腺相关载体”或“AAV载体”是指包含一个或多个感兴趣的多核苷酸(或转基因，例如微小抗肌营养不良蛋白)的载体，其侧翼为AAV反向末端重复序列(ITR)。当此类AAV载体存在于被编码和表达rep和cap基因产物的载体转染的宿主细胞中时，其可以复制和包装成感染性病毒颗粒。
本文中使用的术语“AAV病毒粒子”、“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和封装多核苷酸的AAV载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如递送至哺乳动物细胞的转基因)，则通常称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，产生AAV载体颗粒必然包括产生AAV载体。因此，载体包含在AAV载体颗粒内。
术语“肌肉特异性控制元件”是指在肌肉组织中特异性表达的调节编码序列表达的核苷酸序列。这些控制元件包括增强子和启动子。本公开内容提供了包含肌肉特异性控制元件MCKH7启动子、MCK启动子和MCK增强子的构建体。
所称的“肌肉细胞”或“肌肉组织”意为来自任何种类的肌肉(例如骨骼肌和平滑肌，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织的肌肉)的细胞或细胞群。此类肌肉细胞可以是已分化的或未分化的，例如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和心脏成肌细胞。
本文中使用的术语“转导”是指通过本公开内容的复制缺陷型rAAV在体内或体外将微小抗肌营养不良蛋白的编码区施用/递送至受体细胞，使得受体细胞表达微小抗肌营养不良蛋白。
本文中使用的术语细胞的“转染”是指为遗传修饰细胞的目的而将遗传物质引入细胞中。转染可以通过本领域已知的多种方法(例如转导或电穿孔)实现。
本文中使用的“载体”是指重组质粒或病毒，其包含在体外或体内递送至宿主细胞中的多核苷酸。“重组”意为与自然界中通常存在的不同。
就载体或病毒衣壳而言，“血清型”定义为基于衣壳蛋白序列和衣壳结构的不同免疫学特征。
“AAV Cap”是指AAV Cap蛋白、VP1、VP2和VP3及其类似蛋白。
“AAV Rep”是指AAV Rep蛋白及其类似蛋白。
就侧翼为其他元件的序列而言，本文中使用的“侧翼”是指存在一个或多个侧翼元件在相对于序列的上游和/或下游(即5’和/或3’)。术语“侧翼”并不意味着序列必须是连续的。例如，在编码转基因的核酸和侧翼元件之间可能存在间插序列。序列(例如转基因)“侧翼”为两个其他元件(例如ITR)表示一个元件位于该序列的5’端，另一个元件位于该序列的3’端；然而，在这两个元件之间可能存在间插序列。
本文中使用的术语“基因治疗”是指将核酸序列(例如，包含与编码转基因(例如微小抗肌营养不良蛋白)的多核苷酸可操作地连接的启动子的核酸)***个体的细胞和/或组织中，以治疗疾病或病况。此类转基因可以是外源的。外源分子或序列应理解为通常不存在于待治疗的细胞、组织和/或个体中的分子或序列。
本文中使用的术语“基因分型”是指确定细胞和/或受试者的基因组内一个或多个位置的特定等位基因组成的过程，例如通过确定该位置的核酸序列。基因分型是指核酸分析和/或在核酸水平的分析。在一些方面，对受试者的人抗肌营养不良蛋白基因(DMD)进行基因分型以表征该基因中的突变，所述突变特别适于用本文所公开的组合物进行治疗。本领域技术人员已知许多基因分型技术。
术语“严格的”是指本领域通常理解为严格的条件。杂交严格性主要由温度、离子强度和变性剂(例如甲酰胺)的浓度确定。对于杂交和洗涤的严格条件的示例是：0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠、在65-68℃下或0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺、在42℃下。参见Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。还可以使用更严格的条件(例如更高的温度、更低的离子强度、更高的甲酰胺或其他变性剂)，然而，将会影响杂交的速率。在涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下，额外的示例性严格杂交条件包括在6x SSC0.05％焦磷酸钠中在37℃下(对于14碱基的寡核苷酸)、在48℃下(对于17碱基的寡核苷酸)、在55℃下(对于20碱基的寡核苷酸)和在60℃下(对于23碱基的寡核苷酸)洗涤。为减少非特异性和/或背景杂交，杂交和洗涤缓冲液中可以包括其他试剂。示例为0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠NaDodSO4(SDS)、ficoll、Denhardt溶液、超声处理的鲑鱼***DNA(或其他非互补DNA)和硫酸葡聚糖，也可以使用其他适合的试剂。这些添加剂的浓度和种类可以改变而不会对杂交条件的严格性产生实质影响。杂交实验通常在pH6.8-7.4的条件下进行，然而，在常用的离子强度条件下，杂交速率几乎与pH值无关。参见Anderson,M.L.M.等人，Nucleic Acid Hybridisation:A Practical Approach,第4章,IRL Press Limited(Oxford,England)(1998)。杂交条件可以由本领域技术人员进行调整以适应这些变量，并使不同序列关联性的DNA形成杂交体。
本文中使用的术语“培养介质”、“培养基质”、“细胞培养基”、“培养基”、“组织培养基”、“组织培养介质”和“生长培养基”是指含有为不断生长的培养真核细胞提供养分的营养物质的溶液。通常，这些溶液提供对于细胞最低限度生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量来源、脂质和微量元素。溶液中还可以含有提高生长和/或存活率的成分，包括激素和生长因子。溶液的pH值和盐浓度被配制为最有利于细胞的存活和增殖。培养基还可以是“成分确定培养基”或“化学成分确定培养基”——不含蛋白质、水解物或组成不明的组分的无血清培养基。成分确定培养基不含动物来源的组分，并且所有组分具有已知的化学结构。本领域技术人员应理解，成分确定培养基可以包含重组糖蛋白或蛋白质，例如但不限于激素、细胞因子、白介素和其他信号传导分子。
本文中使用的术语“基础培养基配方”或“基础培养基”是指用于培养细胞的未经补充或选择性除去某些组分而被修改的任何细胞培养基。
本文中使用的术语“培养物”、“细胞培养物”和“真核细胞培养物”是指真核细胞群，可以是表面附着的(即贴壁的)或是悬浮的，其维持在适合细胞群存活和/或生长的条件下的培养基中。对于本领域普通技术人员来说清楚的是，本文中使用的这些术语可以指包含哺乳动物细胞群和其悬浮于其中的培养基的组合。
本文中使用的术语“分批培养”是指培养细胞的方法，其中最终用于培养细胞的所有组分(包括培养基和细胞本身)是在培养过程开始时提供的。分批培养通常在某一时间点停止，然后收获培养基中的细胞和/或组分，并任选地进行纯化。
本文中使用的术语“补料分批培养”是指培养细胞的方法，其中在培养过程开始后的某一时刻向培养物提供额外的组分。补料分批培养可以使用基础培养基开始。具有在培养过程开始后的某一时刻向培养物提供的额外组分的培养基是补料培养基。提供的组分通常包含在培养过程中耗竭的细胞营养补充剂。补料分批培养通常会在某一时间点停止，然后收获培养基中的细胞和/或组分，并任选地进行纯化。
本文中使用的术语“灌注培养”指的是培养细胞的方法，其中在培养过程开始后连续或半连续地向培养物提供额外的组分。提供的组分通常包含在培养过程中耗竭的细胞营养补充剂。通常在连续或半连续的基础上收获培养基中的部分细胞和/或组分，并任选地进行纯化。
细胞培养的“生长期”是指细胞呈指数增长的时期(对数期)，其中细胞通常会快速***。在此阶段，细胞在细胞生长最大化的条件下培养一段时间，通常在1-4天之间。宿主细胞生长周期的确定可根据所预想的特定宿主细胞来确定，而无需进行过多实验。“细胞生长达到最大化的时间段和条件”及类似术语是指对于特定细胞系而言确定为最有利于细胞生长和***的培养条件。在一些方面，在生长期，细胞通常在约25℃-40℃下、在湿润受控的气氛中、在含有必要添加剂的营养培养基中培养，从而实现特定细胞系的最佳生长。
在一些方面，细胞维持在生长期的时间为约一至七天，例如二至六天，例如六天。特定细胞的生长期的长度可以被确定而无需过多实验。例如，生长期的长度是如果培养物维持在生长条件下，足以使特定细胞繁殖至最大可能存活细胞密度的约20％-80％范围内的存活细胞密度的时间段。在一些方面，“最大生长速率”是指特定细胞系/克隆在其指数生长期测量的生长速率，此时细胞处于新鲜培养基中(例如，在培养过程中营养充足且培养物的任何组分对生长无明显抑制作用的时候测量)。
本文中使用的术语“细胞活力”是指培养的细胞在给定的一组培养条件或实验变化下存活的能力。本文中使用的术语还指在特定时间存活的那部分细胞与当时培养物中活细胞和死细胞总数的比例。
本文中使用的术语“细胞密度”是指存在于给定体积的培养基中的细胞数量。
本文中使用的术语“生物反应器”或“培养器皿”是指用于哺乳动物细胞培养的任何器皿。生物反应器可以是任何大小，只要可用于培养哺乳动物细胞。
本文中使用的术语“生物反应器运行”可以包括细胞培养周期中的一个或多个的延滞期、对数期或平台期生长时期。
本文中使用的术语“N-1培养器皿”、“N-1接种训练培养器皿(N-1seed-trainculture vessel)”、“N-1器皿”、“N1-培养”或“N1容器”是指在N培养器皿(生产培养器皿)之前的培养器皿，其用于使细胞培养物生长至高存活细胞密度，以便随后接种至N(生产)培养器皿中。在N-1培养器皿中生长的细胞培养物可以从在N-1培养器皿之前的几个器皿(例如N-4、N-3和N-2器皿)中培养细胞后获得。
本文中使用的术语“N培养器皿”、“生产培养器皿”、“N器皿”、“N生物反应器”或“生产生物反应器”是指N-1生物反应器之后的生物反应器中的细胞培养物。N培养用于产生AAV。
本文中使用的术语“播种”或“接种”是指将细胞培养物提供给生物反应器或另一个器皿的过程。一方面，细胞先前已在另一个生物反应器或器皿中繁殖。另一方面，在将细胞提供给生物反应器或器皿之前，细胞已被立即冷冻和解冻。该术语指任何数量的细胞，包括单个细胞。
rAAV和产生rAAV(或包含rAAV的组合物)(例如rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不 良蛋白)的方法
本公开内容提供包含重组腺相关病毒(rAAV)rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的组合物，其中rAAV在贴壁哺乳动物细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。在一些方面，rAAV属于血清型AAVrh.74(例如，rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白)。
本公开内容还提供通过悬浮播种工艺在贴壁哺乳动物细胞中产生重组腺相关病毒(rAAV)rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的方法，包括：(a)在N-2容器中用包含血清的第一生长培养基培养细胞；(b)从第一培养基中移出细胞；(c)将来自步骤(b)的细胞接种到N-1容器中的不含血清或血清浓度低于第一培养基的第二培养基中；(d)在悬浮条件下培养N-1容器中的细胞；以及(e)用来自步骤(d)的细胞接种生物反应器中的第三培养基。
在一些方面，本文所述方法中使用的rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列。在一些方面，rAAV包含SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。在一些方面，rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。
在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括：(f)用包含rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒、包含AAV rep基因和AAV cap基因的质粒以及腺病毒辅助质粒转染贴壁细胞。
在一些方面，包含rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒包含：SEQ ID NO:9的核酸序列；SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021；或SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977。在一些方面，包含AAV rep基因和AAV cap基因的质粒包含AAV2 rep基因和rAAVrh74cap基因。在一些方面，腺病毒辅助质粒包含腺病毒5E2A、E4ORF6和VA RNA基因。
在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括：(g)裂解贴壁细胞。在一些方面，通过冻融、固体剪切、高渗和/或低渗裂解、液体剪切、超声、高压挤出、去污剂裂解或其组合来裂解贴壁细胞。
在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括(h)通过至少一个柱色谱步骤纯化rAAV。在一些方面，所述至少一个柱色谱步骤包括阴离子交换色谱、尺寸排阻色谱或其组合。
在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括在N-3容器中用所述第一生长培养基培养细胞。在一些方面，所述悬浮播种工艺进一步包括在N-4容器中用所述第一生长培养基培养细胞。
在一些方面，生物反应器是贴壁生物反应器。在一些方面，从在贴壁生物反应器中产生的培养物纯化rAAV。
在一些方面，生物反应器中的第三培养基包含至少一种促进细胞粘附的因子。在一些方面，所述至少一种促进细胞粘附的因子选自由血清、FBS、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、钙离子、细胞外基质的蛋白聚糖或非蛋白聚糖多糖及其组合组成的组。在一些方面，生物反应器中的第三培养基包含DMEM和10％FBS。
在一些方面，贴壁细胞在悬浮条件下培养约48-72小时。
在一些方面，N-1容器是悬浮摇瓶。
在一些方面，贴壁细胞选自由HeLa细胞、CHO细胞、HEK-293细胞、VERO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞和COS细胞组成的组。在一些方面，贴壁细胞是HeLa细胞或HEK-293细胞。在一些方面，贴壁细胞是HEK-293细胞。在一些方面，贴壁细胞不是悬浮适应细胞。在一些方面，在悬浮条件下培养细胞不改变所述细胞的贴壁依赖性。在一些方面，所述培养不改变所述细胞以产生新的细胞系。
在一些方面，用于在贴壁哺乳动物细胞中产生rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的悬浮播种工艺包括：
(a)在N-2容器中用包含血清的第一生长培养基培养细胞；
(b)从第一培养基中移出细胞；
(c)将来自步骤(b)的细胞接种到N-1容器中的不含血清或血清浓度低于第一培养基的第二培养基中；
(d)在悬浮条件下培养N-1容器中的细胞；
(e)在生物反应器中用来自步骤(d)的细胞接种第三种培养基，
(f)用包含rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒、包含AAV rep基因和AAV cap基因的质粒以及腺病毒辅助质粒转染细胞，
(g)裂解细胞，以及
(h)通过至少一个柱色谱步骤纯化rAAV。
在一些方面，rAAV描述于国际公开号WO2019/245973A1中，其通过引用整体明确并入本文。
腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长度为约4.7kb，包括145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。AAV有多种血清型。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV血清型2(AAV2)的核苷酸序列表示于Srivastava等人，JVirol.45:555-564(1983)中，经Ruffing等人，J Gen Virol.75:3385-3392(1994)更正。作为其他示例，AAV-1的完整基因组提供于GenBank登录号NC_002077；AAV-3的完整基因组提供于GenBank登录号NC_1829；AAV-4的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001829；AAV-5基因组提供于GenBank登录号AF085716；AAV-6的完整基因组提供于GenBank登录号NC_001862；AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分分别提供于GenBank登录号AX753246和AX753249(有关AAV-8还参见美国专利号7,282,199和7,790,449)；AAV-9基因组提供于Gao等人，J.Virol.78:6381-6388(2004)；AAV-10基因组提供于Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)；AAV-11基因组提供于Virology,330(2):375-383(2004)。AAVrh.74血清型的克隆描述于Rodino-Klapac等人，Journal of Translational Medicine 5:45(2007)。引导病毒DNA复制(rep)、封装/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在ITR内。三个AAV启动子(以其在图谱上的相对位置而分别命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)与单个AAV内含子的不同剪接偶联(例如在AAV2核苷酸2107和2227处)，使rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep 68、rep52和rep40)。Rep蛋白具有多种酶促特性，最终负责复制病毒基因组。cap基因从p40启动子表达，其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。选择性剪接和非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单个共有多聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95处。AAV的生命周期和遗传学综述于Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology 158:97-129(1992)。
AAV具有独特的特征，使其有望成为用于向细胞递送外来DNA(例如，在基因治疗中)的载体。培养中的细胞的AAV感染是非致细胞病变的，并且对人和其他动物的自然感染是静默和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，使其可以在体内靶向多种不同的组织。此外，AAV缓慢转导***和非***的细胞，并且可以作为转录活跃的核附加体(染色体外元件)在这些细胞的整个生命周期中持续存在。AAV的前病毒基因组以克隆DNA的形式存在于质粒中时具有感染性，因此可以构建重组基因组。此外，由于引导AAV复制、基因组封装和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，基因组内部约4.3kb的部分或全部(编码复制和结构衣壳蛋白rep-cap)可以用外来DNA(例如含有启动子、感兴趣的DNA和多聚腺苷酸化信号的基因盒)代替。rep和cap蛋白可以反式提供。AAV的另一个显著特征是它是一种极其稳定和强大的病毒。它能容易地承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃持续数小时)，因此AAV的低温保存并不那么重要。AAV甚至可以冻干。最后，AAV感染的细胞对超级感染无抗性。
多项研究已经证实了重组AAV介导的在肌肉中长期(>1.5年)的蛋白质表达。参见Clark等人，Hum Gene Ther 8:659-669(1997)；Kessler等人，Proc Nat.Acad Sc.USA 93:14082-14087(1996)；以及Xiao等人，J Virol 70:8098-8108(1996)。还参见Chao等人，MolTher 2:619-623(2000)和Chao等人，Mol Ther 4:217-222(2001)。此外，由于肌肉是高度血管化的，重组AAV转导导致肌肉内注射之后转基因产物出现在全身循环中，如Herzog等人，Proc Natl Acad Sci USA 94:5804-5809(1997)和Murphy等人，Proc Natl Acad Sci USA94:13921-13926(1997)所述。此外，Lewis等人，J Virol.76:8769-8775(2002)证明，骨骼肌纤维具有对于正确的抗体糖基化、折叠和分泌所必需的细胞因子，这表明肌肉能够稳定表达分泌蛋白治疗剂。
本公开内容的重组AAV基因组包含本公开内容的核酸分子和一个或多个的侧翼为AAV ITR的核酸分子。rAAV基因组中的AAV DNA可以来自任何可衍生出重组病毒的AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAVrh.74、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13。假型rAAV的产生公开于，例如WO01/83692中。还设想了其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见，例如，Marsic等人，Molecular Therapy 22(11):1900-1909(2014)。如上文背景技术部分所述，本领域已知各种AAV血清型基因组的核苷酸序列。为促进骨骼肌特异性表达，可以使用AAV1、AAV6、AAV8或AAVrh.74。
本公开内容的DNA质粒包含本公开内容的rAAV基因组。DNA质粒被转移至能够感染AAV辅助病毒(例如腺病毒、E1-缺陷型腺病毒或疱疹病毒)的细胞中，以将rAAV基因组组装成感染性病毒颗粒。产生rAAV颗粒的技术是本领域的标准技术，其中向细胞提供待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能。产生rAAV需要在单个细胞(本文中表示为包装细胞)中存在以下成分：rAAV基因组、与rAAV基因组分离(即不在其中)的AAV rep和cap基因以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自任何可衍生出重组病毒的AAV血清型，也可以来自除rAAV基因组ITR之外的不同AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAVrh.74、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13。假型rAAV的产生公开于，例如，WO01/83692中，其通过引用整体并入本文。
生成包装细胞的方法是创建稳定表达对于AAV颗粒产生所必需的所有组分的细胞系。例如，将包含缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组、与rAAV基因组分离的AAV rep和cap基因以及可选择标志(如新霉素抗性基因)的质粒(或多个质粒)整合至细胞的基因组中。AAV基因组已经通过例如GC加尾(Samulski等人，Proc.Natl.Acad.S6.USA 79:2077-2081(1982))、添加含有限制性内切酶切割位点的合成接头(Laughlin等人，Gene 23:65-73(1983))或直接平端连接(Senapathy&Carter，J.Biol.Chem.259:4661-4666(1984))的程序被引入细菌质粒中。然后用辅助病毒(例如腺病毒)感染包装细胞系。这种方法的优点是细胞具有可选择性，并且适用于大规模产生rAAV。其他适合的方法的示例是利用腺病毒或杆状病毒而不是质粒将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞。
产生rAAV的一般原则综述于，例如，Carter,Current Opinions inBiotechnology 1533-539(1992)；和Muzyczka,N.,Curr.Topics Microbial.Immunol.158:97-129(1992)中。多种方法描述于Ratschin等人，Mol.Cell.Biol.4:2072(1984)；Hermonat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466(1984)；Tratschin等人，Mo1.Cell.Biol.5:3251(1985)；McLaughlin等人，J.Virol.,62:1963(1988)；以及Lebkowski等人，Mol.Cell.Biol.,7:349(1988)。Samulski等人，J.Virol.,63:3822-3828(1989)；美国专利号5,173,414；WO95/13365和相应的美国专利号5,658.776；WO95/13392；WO96/17947；PCT/US98/18600；WO97/09441(PCT/US96/14423)；WO97/08298(PCT/US96/13872)；WO97/21825(PCT/US96/20777)；WO97/06243(PCT/FR96/01064)；WO99/11764；Perrin等人，Vaccine 13:1244-1250(1995)；Paul等人，Human Gene Therapy 4:609-615(1993)；Clark等人，GeneTherapy3:1124-1132(1996)；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；以及美国专利号6,258,595。上述文件均通过引用整体并入本文，并特别强调所述文件中与rAAV产生有关的部分。
因此，本公开内容提供了产生感染性rAAV的包装细胞。一方面，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，例如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(一种同源的293系)。另一方面，包装细胞是未转化的癌细胞，例如低传代293细胞(用腺病毒E1转化的人胎儿肾细胞)、MRC-5细胞(人胎儿成纤维细胞)、WI-38细胞(人胎儿成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胎儿肺细胞)。
本公开内容的重组AAV(即感染性封装rAAV颗粒)包含rAAV基因组。在示例性的方面，两种rAAV的基因组均缺少AAV rep和cap DNA，即基因组的ITR之间没有AAV rep或capDNA。可以构建为包含本公开内容的核酸分子的rAAV的示例载于国际专利申请号PCT/US2012/047999(WO2013/016352)中，其通过引用整体并入本文。
在一个示例性的方面，本发明的重组AAV载体通过三重转染方法(Xiao等人，JVirol 72:2224-2232(1998))使用AAV载体质粒rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白、pNLRep2-Caprh74和pHELP产生。rAAV含有侧翼为AAV2反向末端重复序列(ITR)的微小抗肌营养不良蛋白基因表达盒。正是这一序列被封装至AAVrh74病毒粒子中。该质粒含有微小抗肌营养不良蛋白序列、MHCK7增强子和肌肉特异性启动子的核心启动子元件，以驱动基因表达。表达盒还含有SV40内含子(SD/SA)以促进高水平基因表达，牛生长激素多聚腺苷酸化信号用于高效转录终止。
pNLREP2-Caprh74是AAV辅助质粒，其编码4个野生型AAV2rep蛋白和3个来自血清型rh74的野生型AAV VP衣壳蛋白。pNLREP2-Caprh74质粒的示意图如图3所示。
pHELP腺病毒辅助质粒为11,635bp，其获得于Applied Viromics。该质粒含有腺病毒基因组中对于AAV复制重要的区域，即E2A、E4ORF6和VA RNA(腺病毒E1功能由293细胞提供)。该质粒中的腺病毒序列仅占腺病毒基因组的约40％，不包含对复制至关重要的顺式元件，例如腺病毒末端重复序列。因此，这种产生***预期不会产生感染性腺病毒。pHELP质粒的示意图如图4所示。
本文所公开的rAAV可以通过本领域的标准方法纯化，例如通过柱色谱法或氯化铯梯度法。从辅助病毒中纯化rAAV载体的方法是本领域已知的，包括公开于，例如Clark等人，Hum.Gene Ther.10(6):1031-1039(1999)；Schenpp和Clark,Methods Mol.Med.69 427-443(2002)；美国专利号6,566,118和WO98/09657中的方法。
在一个方面，本公开内容提供了包含肌肉特异性控制元件核苷酸序列和编码微小抗肌营养不良蛋白的核苷酸序列的rAAV。例如，该核苷酸序列编码功能性微小抗肌营养不良蛋白，其中该核苷酸与SEQ ID NO:1具有例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，更典型地至少90％、91％、92％、93％或94％，甚至更典型地至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，其中该蛋白保留微小抗肌营养不良蛋白活性。微小抗肌营养不良蛋白在肌肉收缩过程中为肌膜提供稳定性，例如，微小抗肌营养不良蛋白在肌肉收缩过程中起到减震器的作用。
在一个方面，rAAV是rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白，即rAAV血清型rh74衣壳封装包含由MHCK7启动子/增强子驱动的微小抗肌营养不良蛋白转基因的核酸表达盒或基因组的病毒颗粒形式，在施用于受试者的情况下还以非专有药物名称delandistrogene moxeparvovec称之。在一些方面，当提及实施例中施用了delandistrogene moxeparvovec的研究受试者时，数据(例如条形图)可以更简单地表示为“经治疗的”。
在一个方面，rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9的rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白，或是SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白，其中rAAV在贴壁细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的rAAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
本公开内容还提供了rAAV，其中核苷酸序列包含在严格条件下与SEQ ID NO:1的核酸序列杂交的核苷酸序列或其互补序列，并且编码功能性微小抗肌营养不良蛋白。
在一个方面，rAAV是非复制的重组腺相关病毒(AAV)，其称为SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白，其中rAAV在贴壁细胞中产生，贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。该载体基因组含有基因表达所需的最小元件，包括AAV2反向末端重复序列(ITR)、微小抗肌营养不良蛋白、SV40内含子(SD/SA)和合成多聚腺苷酸化(多聚A)信号，所有这些元件均受MHCK7启动子/增强子控制。载体基因组和表达盒的示意图如图1所示。AAVrh74血清型可以用于IV施用后在骨骼肌和心肌中实现高效基因转移。
在一个方面，本公开内容提供了rAAV，其中肌肉特异性控制元件是人骨骼肌动蛋白基因元件、心脏肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子(MEF)、肌肉肌酸激酶(MCK)、截短的MCK(tMCK)、肌球蛋白重链(MHC)、杂交α-肌球蛋白重链增强子-/MCK增强子-启动子(MHCK7)、C5-12、鼠肌酸激酶增强子元件、骨骼快缩肌钙蛋白c基因元件、慢缩心脏肌钙蛋白c基因元件、慢缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素响应元件(GRE)。
例如，肌肉特异性控制元件是MHCK7启动子核苷酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7，或肌肉特异性控制元件是MCK核苷酸序列SEQ ID NO:4。此外，在本公开内容的任何rAAV载体中，肌肉特异性控制元件核苷酸序列(例如MHCK7或MCK核苷酸序列)与编码微小抗肌营养不良蛋白的核苷酸序列可操作地连接。例如，MHCK7启动子核苷酸序列(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7)与人微小抗肌营养不良蛋白编码序列(SEQ ID NO:1)可操作地连接，如图1或图2(SEQ ID NO:3)或图13(SEQ ID NO:9)中提供的构建体中所列出。在另一个示例中，MCK启动子(SEQ ID NO:4)与人微小抗肌营养不良蛋白编码序列(SEQ ID NO:1)可操作地连接，如图5或图6(SEQ ID NO:5)中提供的构建体中所示。在另一个方面，本公开内容提供了包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的rAAV载体。本公开内容还提供了包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的核苷酸序列的rAAV载体。
在又一个方面，本公开内容提供了包含在质粒中的rAAV构建体，其包含SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的核苷酸序列。例如，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白载体包含SEQ ID NO:3的ITR内且包括ITR的核苷酸序列，如图2所示。在另一个方面，rAAV载体包含5’ITR、MHCK7启动子、嵌合内含子序列、人微小抗肌营养不良蛋白基因的编码序列、多聚A和3’ITR。在一个方面，所述载体包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021。SEQ ID NO:3中所示的质粒进一步包含氨苄青霉素抗性和具有pBR322复制起点的pGEX质粒骨架。
在另一个方面，本公开内容提供了包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的rAAV，其中rAAV在贴壁细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。例如，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白载体构建体包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列，如图13所示。该rAAV载体构建体包含MHCK7启动子、嵌合内含子序列、人微小抗肌营养不良蛋白基因的编码序列和多聚A。在一个方面，该rAAV载体构建体进一步包含在启动子的5’端的ITR和在多聚A的3’端的ITR。在一个方面，rAAV是AAVrh74。
在另一个方面，rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白载体(即病毒载体)包含SEQ ID NO:8的ITR内且包括ITR的核苷酸序列，如图15所示。该rAAV载体包含5’ITR、MHCK7启动子、嵌合内含子序列、人微小抗肌营养不良蛋白基因的编码序列、多聚A和3’ITR。在一个方面，载体包含SEQ ID NO:9的核苷酸1-4977。SEQ ID NO:3中所示的质粒进一步包含卡那霉素抗性和具有pBR322复制起点的pGEX质粒骨架。
在另一个方面，本公开内容提供了包含AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的质粒。在一个方面，质粒包含5’ITR、MHCK7启动子、嵌合内含子序列、人微小抗肌营养不良蛋白基因的编码序列、多聚A和3’ITR。在一个方面，质粒包含卡那霉素抗性，并且任选地包含具有pBR322复制起点的pGEX质粒骨架。在一个特定的方面，质粒如SEQ ID NO:8中所示，如图14和图15所示。
本公开内容提供了包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子核苷酸序列的重组AAV载体，其中rAAV在贴壁细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。该rAAV载体是AAV血清型AAVrh.74。
本公开内容还提供了rAAV，其包含SEQ ID NO:3的ITR内且包括ITR的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列、SEQ ID NO:8的ITR内且包括ITR的核苷酸序列或SEQ ID NO:9中所示的核苷酸序列，其中rAAV在贴壁细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。该rAAV载体是AAV血清型AAVrh.74。
本公开内容的rAAV载体可以是任何AAV血清型，例如血清型AAVrh.74、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。
本公开内容还提供了包含本公开内容的任何rAAV载体的药物组合物(或有时在本文中简称为“组合物”)。
在另一个方面，本公开内容提供了产生rAAV载体颗粒的方法，包括培养用本公开内容的任何rAAV载体转染的细胞，和从转染细胞的上清液中回收rAAV颗粒。本公开内容还提供了包含本公开内容的任何重组AAV载体的病毒颗粒。
包含rAAV的组合物及其施用
在另一个方面，本公开内容设想了包含本公开内容的rAAV的组合物。本公开内容的组合物包含rAAV和药学上可接受的承载体。所述组合物还可以包含其他成分，例如稀释剂和佐剂。可接受的承载体、稀释剂和佐剂对受体无毒性，并且优选地在使用的剂量和浓度下是惰性的，包括缓冲剂和表面活性剂，例如pluronics。
本公开内容提供了用于在有需要的受试者中治疗肌营养不良(例如DMD)的组合物，所述组合物包含重组腺相关病毒(rAAV)rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白，其中rAAV在贴壁细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。
在一些方面，本公开内容提供了包含重组腺相关病毒(rAAV)rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的组合物，其中rAAV在贴壁哺乳动物细胞中通过本文所述的悬浮播种工艺产生。在一些方面，所述组合物包含：a)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的rAAV颗粒；b)包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021的rAAV颗粒；和/或c)包含SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977的rAAV颗粒。
在本公开内容的方法中施用的rAAV的滴度将根据例如特定的rAAV、施用模式、治疗目标、个体和靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域的标准方法确定。rAAV的滴度范围可以是每毫升约1x106、约1x107、约1x108、约1x109、约1x1010、约1x1011、约1x1012、约1x1013至约1x1014或更多抗DNA酶颗粒(DRP)。剂量也可以用病毒基因组(vg)单位表示。确定封装载体基因组滴度的一种示例性方法是使用定量PCR，例如描述于(Pozsgai等人,Mol.Ther.25:855-869(2017))中的方法。
本公开内容设想了在体内或体外用rAAV转导靶细胞的方法。体内方法包括向有需要的动物(包括人类)施用有效剂量或有效多次剂量的包含本公开内容的rAAV的组合物的步骤。如果施用剂量在病症/疾病发生之前，则所述施用是预防性的。如果施用剂量在病症/疾病发生之后，则所述施用是治疗性的。在本公开内容的各个方面，有效剂量是指能够缓解(消除或减轻)与所治疗的病症/疾病状态相关的至少一种症状、减缓或预防病症/疾病状态的发展、降低疾病的程度、导致疾病缓解(部分或全部)和/或延长存活时间的剂量。设想用本公开内容的方法来预防或治疗的疾病的一个示例是DMD。
本公开内容还设想了组合疗法。本文中使用的组合包括同时治疗和顺序治疗。本公开内容的方法与标准药物治疗(例如皮质类固醇)的组合以及与新疗法的组合都是特定设想的。
所述组合物的有效剂量可以通过本领域的标准途径施用，包括但不限于肌肉内、肠胃外、静脉内、口腔、颊部、鼻腔、肺部、颅内、骨内、眼内、直肠或***。本领域技术人员可以根据所治疗的感染和/或疾病状态以及表达微小抗肌营养不良蛋白的靶细胞/组织来选择和/或匹配本公开内容的rAAV的施用途径和AAV组分(特别是AAV ITR和衣壳蛋白)的血清型。
本公开内容提供了局部施用和全身施用有效剂量的本公开内容的rAAV和组合物的方法。例如，全身施用是指施用至循环***中，使整个身体受到影响。全身施用包括肠内施用，例如通过胃肠道吸收，以及通过注射、灌注或植入的肠胃外施用。
特别地，本公开内容的rAAV的实际施用可以通过使用可将rAAV重组载体输送至动物靶标组织的任何物理方法来完成。根据本公开内容的施用方法包括但不限于肌肉注射和血液注射。简单地将rAAV重悬于磷酸盐缓冲生理盐水中已被证明足以提供可用于肌肉组织表达的媒介物，并且对可与rAAV共同施用的承载体或其他成分没有已知的限制(尽管应避免在正常方式中将降解DNA的组合物与rAAV一起使用)。可以对rAAV的衣壳蛋白进行修饰，从而使rAAV能够靶向感兴趣的特定靶标组织(例如肌肉)。参见，例如，WO02/053703，其通过引用并入本文。药物组合物可以制备成注射剂型或局部剂型，以通过透皮输送递送至肌肉。先前已经开发了许多用于肌肉内注射和透皮输送的剂型，并且可以用于本公开内容的实践中。为了方便施用和操纵，rAAV可以与任何药学上可接受的承载体一起使用。
在本公开内容的一个方面，本文所述的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白配制在含有20mM Tris(pH8.0)、1mM氯化镁(MgCl2)、200mM氯化钠(NaCl)和0.001％poloxamer188的缓冲液中。
在本文所公开的方法中施用的rAAV的剂量将根据例如特定的rAAV、施用方式、治疗目标、个体以及靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域的标准方法确定。施用的每种rAAV的滴度范围可以是每毫升约1x106、约1x107、约1x108、约1x109、约1x1010、约1x1011、约1x1012、约1x1013、约1x1014、约2x1014、或约1x1015或更多抗DNA酶颗粒(DRP)。剂量也可以用病毒基因组(vg)单位表示(即分别为1x107vg、1x108vg、1x109vg、1x1010vg、1x1011vg、1x1012vg、1x1013vg、1x1014vg、2x1014vg、1x1015vg)。剂量也可以每公斤(kg)体重的病毒基因组(vg)的单位表示(即分别为1x1010vg/kg、1x1011vg/kg、1x1012vg/kg、1x1013vg/kg、1x1014vg/kg、1.25x1014vg/kg、1.5x1014vg/kg、1.75x1014vg/kg、2.0x1014vg/kg、2.25x1014vg/kg、2.5x1014vg/kg、2.75x1014vg/kg、3.0x1014vg/kg、3.25x1014vg/kg、3.5x1014vg/kg、3.75x1014vg/kg、4.0x1014vg/kg、1x1015vg/kg)。对AAV滴度测定的方法描述于Clark等人，Hum.Gene Ther.,10:1031-1039(1999)中。
特别地，本公开内容的rAAV的实际施用可以通过使用可将rAAV重组载体输送至动物靶标组织的任何物理方法来完成。根据本公开内容的施用包括但不限于肌肉注射和血液注射。简单地将rAAV重悬于磷酸盐缓冲生理盐水中已被证明足以提供可用于肌肉组织表达的媒介物，并且对可与rAAV共同施用的承载体或其他组分没有已知的限制(尽管应避免在正常方式中将降解DNA的组合物与rAAV一起使用)。可以对rAAV的衣壳蛋白进行修饰，从而使rAAV能够靶向感兴趣的特定靶标组织(例如肌肉)。参见，例如，WO02/053703，其通过引用并入本文。药物组合物可以制备成注射剂型或局部剂型，以通过透皮输送递送至肌肉。先前已经开发了许多用于肌肉内注射和透皮输送的剂型，并且可以用于本公开内容的实践中。为了方便施用和操纵，rAAV可以与任何药学上可接受的承载体一起使用。
为了肌肉内注射的目的，可以使用佐剂(例如芝麻油或花生油)或水性丙二醇中的溶液以及无菌水溶液。如果需要，可以对这些水溶液进行缓冲，并先用生理盐水或葡萄糖使液体稀释剂呈等渗状态。rAAV作为游离酸(DNA含有酸性磷酸基团)或药理学上可接受的盐的溶液可以在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。rAAV分散剂还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在一般的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在这方面，所使用的无菌水介质均可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。
适用于注射用途的药学承载体、稀释剂或赋形剂包括无菌水溶液或分散剂，以及用于即时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。在所有情况下所述形式都必须是无菌的，并且必须具有易于注射的流动程度。其在制造和储存的条件下必须保持稳定，并且必须能够防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。承载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等类似物)和其适合的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。合适的流动性可以例如通过使用涂层(例如卵磷脂)、对分散剂而言通过保持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持。可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等类似物)来防止微生物的作用。在多种情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来延长注射组合物的吸收。
通过将所需量的rAAV掺入适当的溶剂中来制备无菌注射溶液，并根据需要加入上文列举的各种其他成分，然后进行过滤灭菌。通常，通过将灭菌后的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散剂，所述媒介物含有基本的分散介质和所需的上文列举的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述方法可以从先前经过无菌过滤的溶液中获得活性成分粉末和任何其他所需成分。
rAAV的转导还可以在体外进行。在一个方面，从受试者取出所需的靶肌肉细胞，用rAAV进行转导，然后再引入受试者中。或者，还可以使用合成或异种肌肉细胞，其中这些细胞不会在受试者中产生不适当的免疫应答。
转导和将转导的细胞再引入受试者中的适合的方法是本领域已知的。在一个方面，可以通过将rAAV与肌肉细胞(例如在适当的培养基中)结合来转导细胞，并使用常规技术例如Southern印迹和/或PCR或使用可选择标志来筛选携带感兴趣的DNA的细胞。然后转导的细胞可以配制成药物组合物，并且通过多种技术(例如通过肌肉内注射、静脉内注射、皮下注射和腹膜内注射，或通过使用例如导管注射入平滑肌和心肌内)将所述组合物引入受试者中。
用本公开内容的rAAV来转导细胞导致微小抗肌营养不良蛋白的持续表达。因此，本公开内容提供了向动物(优选人类)施用/递送表达微小抗肌营养不良蛋白的rAAV的方法。这些方法包括用一种或更多的本公开内容的rAAV来转导组织(包括但不限于组织例如肌肉，器官例如肝脏和大脑，以及腺体例如唾液腺)。可以用包含组织特异性控制元件的基因盒进行转导。例如，本公开内容的一个方面提供了通过肌肉特异性控制元件引导的转导肌肉细胞和肌肉组织的方法，所述控制元件包括但不限于来自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族的控制元件，例如来自myoD基因家族(参见Weintraub等人，Science,251:761-766(1991))、肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2(Cserjesi和Olson,Mol Cell Biol 11:4854-4862(1991))，来自人骨骼肌动蛋白基因(Muscat等人，Mol Cell Biol,7:4089-4099(1987))、心脏肌动蛋白基因的控制元件，肌肉肌酸激酶序列元件(参见Johnson等人，MolCell Biol9:3393-3399(1989))和鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件，来自骨骼快缩肌钙蛋白C基因、慢缩心脏肌钙蛋白C基因和慢缩肌钙蛋白I基因的控制元件，缺氧诱导核因子(Semenza等人，Proc Natl Acad Sci USA 88:5680-5684(1991))，类固醇诱导元件和包含糖皮质激素响应元件(GRE)的启动子(参见Mader和White，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5603-5607(1993))，以及其他控制元件。
肌肉组织是体内DNA递送的一个有吸引力的靶标，因为它不是一个重要的器官，并且容易到达。本公开内容设想了从转导的肌纤维持续表达微小抗肌营养不良蛋白。
因此，本公开内容提供了向有需要的受试者(例如，患有肌营养不良的受试者)施用有效剂量(或基本上同时施用或间隔施用的多个剂量)的编码微小抗肌营养不良蛋白的rAAV的方法。
本公开内容提供了包含SEQ ID NO:3、8或9的核苷酸序列的核酸分子。本公开内容还提供了包含SEQ ID NO:9的核酸序列或SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021的rAAV，和包含SEQ ID NO:9的核酸序列或SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQID NO:3的核苷酸55-5021的rAAV颗粒，其中rAAV在贴壁细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。
本公开内容的另一个方面提供了包含核酸分子、rAAV和rAAV颗粒的组合物，所述核酸分子包含SEQ ID NO:3、8或9的核苷酸序列，所述rAAV包含SEQ ID NO:9的核酸序列或SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021，所述rAAV颗粒包含SEQ IDNO:9的核酸序列或SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021，其中rAAV在贴壁细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。本文所公开的任何方法均可以用这些组合物实施。
贴壁细胞的混合接种训练扩增
本公开内容的一些方面涉及细胞扩增方法，包括：(a)在N-2容器中用包含血清的第一生长培养基培养细胞；(b)从第一培养基中移出细胞；(c)将来自步骤(b)的细胞接种到N-1容器中的不含血清或血清浓度低于第一培养基的第二培养基中；(d)在悬浮条件下培养N-1容器中的细胞；以及(e)用来自步骤(d)的细胞接种生物反应器中的第三培养基。在一个方面，第二培养基是无血清培养基。在另一个方面，第二培养基包含的血清浓度低于第一培养基中的血清浓度。
本公开内容的一些方面涉及接种训练扩增方法，包括(a)在N-3容器中用含有血清的第一培养基培养细胞；(b)从第一培养基中移出细胞；(c)在N-2容器中将来自步骤(b)的细胞接种至不含血清或血清浓度低于第一培养基的第二培养基中；(d)在悬浮条件下在N-2容器中培养细胞；(e)以及在N-1容器中将来自步骤(d)的细胞接种至第二培养基中；以及(f)用来自步骤(d)的细胞接种生物反应器中的第三培养基。在一个方面，第二培养基是无血清培养基。在另一个方面，第二培养基包含的血清浓度低于第一培养基中的血清浓度。
本公开内容的一些方面涉及贴壁细胞的细胞扩增方法，包括(a)在含有血清的第一培养基中在贴壁条件下培养贴壁细胞；(b)从第一培养基中移出贴壁细胞；(c)将贴壁细胞悬浮在不含血清或血清浓度低于第一培养基的第二培养基中；(d)在悬浮条件下培养贴壁细胞；以及(e)在生物反应器中用来自步骤(d)的贴壁细胞接种第三培养基。在一些方面，所述方法可以进一步包括在贴壁条件下将来自步骤(a)的贴壁细胞传代至少一次。在一些方面，所述方法还可以进一步包括在悬浮条件下将来自步骤(d)的贴壁细胞传代至少一次。在一个方面，第二培养基是无血清培养基。在另一个方面，第二培养基包含的血清浓度低于N-1容器中的第一培养基中的血清浓度。
第一培养基、第二培养基和第三培养基可以是适合所培养的特定细胞的任何培养基。在一些方面，培养基含有例如无机盐、碳水化合物(例如糖，例如葡萄糖、半乳糖、麦芽糖或果糖)、氨基酸、维生素(例如B族维生素(例如B12)、维生素A、维生素E、核黄素、硫胺素和生物素)、脂肪酸和脂质(例如胆固醇和类固醇)、蛋白质和肽(例如白蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白和胎球蛋白)、血清(例如包含白蛋白、生长因子和生长抑制因子的组合物，例如胎牛血清、新生牛血清和马血清)、微量元素(例如锌、铜、硒和三羧酸中间体)、水解物(来自植物或动物来源的水解蛋白)及其组合。生长培养基可以是市售培养基，例如5x浓缩的DMEM/F12(Invitrogen)、CD OptiCHO补料(Invitrogen)、CD EfficientFeed(Invitrogen)、CellBoost(HyClone)、BalanCD CHO补料(Irvine Scientific)、BD Recharge(BectonDickinson)、Cellvento补料(EMD Millipore)、Ex-cell CHOZN补料(Sigma-Aldrich)、CHO补料生物反应器补充物(Sigma-Aldrich)、SheffCHO(Kerry)、Zap-CHO(Invitria)、ActiCHO(PAA/GE Healthcare)、Ham'sF10(Sigma)、最小必需培养基([MEM],Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良Eagle培养基([DMEM],Sigma)。
在一些方面，不含血清或血清浓度低于第一血清的无血清生长第二培养基基本上不含(包含不超过微量水平的)钙离子、胎牛血清(FBS)、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白或细胞外基质中可支持细胞锚定的蛋白聚糖或非蛋白聚糖多糖。在一个方面，第二培养基是无血清培养基。在另一个方面，第二培养基包含的血清浓度低于第一培养基中的血清浓度。
在一些方面，生长培养基的pH可以是约6.5和约7.5之间、约6.5和约7.4之间、约6.5和约7.3之间、约6.5和约7.2之间、约6.5和约7.1之间、约6.5和约7.0之间、约6.5和约6.9之间、约6.5和约6.8之间、约6.5和约6.7之间、约6.6和约7.5之间、约6.6和约7.4之间、约6.6和约7.3之间、约6.6和约7.2之间、约6.6和约7.1之间、约6.6和约7.0之间、约6.6和约6.9之间、约6.6和约6.8之间、约6.7和约7.5之间、约6.7和约7.4之间、约6.7和约7.3之间、约6.7和约7.2之间、约6.7和约7.1之间、约6.7和约7.0之间、约6.7和约6.9之间、约6.8和约7.5之间、约6.8和约7.4之间、约6.8和约7.3之间、约6.8和约7.2之间、约6.8和约7.1之间、约6.8和约7.0之间、约6.9和约7.5之间、约6.9和约7.4之间、约6.9和约7.3之间、约6.9和约7.2之间、约6.9和约7.1之间、约7.0和约7.5之间、约7.0和约7.4之间、约7.0和约7.3之间、约7.0和约7.2之间、约7.1和约7.5之间、约7.1和约7.4之间、约7.1和约7.3之间、约7.2和约7.5之间、约7.2和约7.4之间或约7.3和约7.5之间。
在一些方面，细胞可以在32℃至约39℃、约32℃至约37℃、约32℃和约37.5℃之间、约34℃和约37℃之间、约35℃和约37℃之间、约35.5℃和约37.5℃之间、约36℃和约37℃之间或约36.5℃的温度下培养。在一些方面，从培养时期的开始至结束，细胞可以在约37℃的温度下孵育。在一些方面，培养时期的温度可以改变或略有变化，例如以小时或天为基础。在一些方面，可以在培养时期开始后约一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十四天或十五天或在培养时期内的任何时间点改变或变换(例如，增加或降低)温度。在一些方面，可以将温度向上变换约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0℃。在一些方面，可以将温度向下变换约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10℃。
在一些方面，细胞培养可以在含有约1％至约15％CO2的气氛中进行。在一些方面，可以使用含有约14％CO2、12％CO2、10％CO2、8％CO2、6％CO2、5％CO2、4％CO2、3％CO2、2％CO2或约1％CO2的气氛培养细胞。
在一些方面，细胞培养可以通过将细胞培养物中的溶解氧(dO2)保持在约3％至约55％之间、约3％至约50％之间、约3％至约45％之间、约3％至约40％之间、约3％至约35％之间、约3％至约30％之间、约3％至约25％之间、约3％至约20％之间、约3％至约15％之间、约5％至约55％之间、约5％至约50％之间、约5％至约45％之间、约5％至约40％之间、约5％与约35％之间、约5％与约30％之间、约5％与约25％之间、约5％与约20％之间、约5％与约15％之间、约5％与约10％之间、约10％与约55％之间、约10％与约50％之间、约10％与约45％之间、约10％与约40％之间、约10％与约35％之间、约10％与约30％之间、约10％与约25％之间、约10％与约20％之间、约15％与约55％之间、约15％与约50％之间、约15％与约45％之间、约15％与约40％之间、约15％与约35％之间、约15％与约30％之间、约15％与约25％之间、约15％与约20％之间、约20％与约55％之间、约20％与约50％之间、约20％与约45％之间、约20％与约40％之间、约20％与约35％之间、约20％与约30％之间、约20％与约25％之间、约25％与约55％之间、约25％与约50％之间、约25％与约45％之间、约25％与约40％之间、约25％与约35％之间、约25％与约30％之间、约30％与约55％之间、约30％与约50％之间、约30％与约45％之间、约30％与约40％之间、约30％与约35％之间、约35％与约55％之间、约35％与约50％之间、约35％与约45％之间、约35％与约40％之间、约40％与约55％之间、约40％与约50％之间、约40％与约45％之间、约45％与约55％之间、约45％与约50％之间或约50％与约55％之间进行。
在一些方面，可以通过添加碱性溶液(例如碱的碱性溶液)将细胞培养物的pH维持在特定的pH值。细胞培养物的pH值可以维持在约6.5和约7.5之间、约6.5和约7.4之间、约6.5和约7.3之间、约6.5和约7.2之间、约6.5和约7.1之间、约6.5和约7.0之间、约6.5和约6.9之间、约6.5和约6.8之间、约6.5和约6.7之间、约6.6和约7.5之间、约6.6与约7.4之间、约6.6与约7.3之间、约6.6与约7.2之间、约6.6与约7.1之间、约6.6与约7.0之间、约6.6与约6.9之间、约6.6与约6.8之间、约6.7与约7.5之间、约6.7与约7.4之间、约6.7与约7.3之间、约6.7与约7.2之间、约6.7和约7.1之间、约6.7和约7.0之间、约6.7和约6.9之间、约6.8和约7.5之间、约6.8和约7.4之间、约6.8和约7.3之间、约6.8和约7.2之间、约6.8和约7.1之间、约6.8和约7.0之间、约6.9和约7.5之间、约6.9和约7.4之间、约6.9和约7.3之间、约6.9和约7.2之间、约6.9和约7.1之间、约7.0和约7.5之间、约7.0和约7.4之间、约7.0和约7.3之间、约7.0和约7.2之间、约7.1和约7.5之间、约7.1和约7.4之间、约7.1和约7.3之间、约7.2和约7.5之间、约7.2和约7.4之间或约7.3和约7.5之间。
在一些方面，悬浮条件下的细胞培养可以在任何类型的适合稳定或混合/摇动悬浮细胞扩增的细胞培养瓶中进行，使用例如T型烧瓶、滚瓶、转瓶或摇瓶；或其组合。在一些方面，N-1容器是摇瓶。
在一些方面，悬浮条件可以包括一些形式的搅拌。在一些方面，搅拌可以是旋转式搅拌。在一些方面，搅拌可以在频率为约25RPM至约500RPM、约25RPM和约480RPM之间、约25RPM和约460RPM之间、约25RPM和约440RPM之间、约25RPM和约420RPM之间、约25RPM和约400RPM之间、约25RPM和约380RPM之间、约25RPM和约360RPM之间、约25RPM和约340RPM之间、约25RPM和约320RPM之间、约25RPM和约300RPM之间、约25RPM和约280RPM之间、约25RPM和约260RPM之间、约25RPM和约240RPM之间、约25RPM和约220RPM之间、约25RPM和约200RPM之间、约25RPM和约180RPM之间、约25RPM和约160RPM之间、约25RPM和约140RPM之间、约25RPM和约120RPM之间、约25RPM和约100RPM之间、约25RPM和约80RPM之间、约25RPM和约60RPM之间、约25RPM和约40RPM之间、约25RPM和约35RPM之间、约25RPM和约30RPM之间、约50RPM和约500RPM之间、约50RPM和约480RPM之间、约50RPM和约460RPM之间、约50RPM和约440RPM之间、约50RPM和约420RPM之间、约50RPM和约400RPM之间、约50RPM和约380RPM之间、约50RPM和约360RPM之间、约50RPM和约340RPM之间、约50RPM和约320RPM之间、约50RPM和约300RPM之间、约50RPM和约280RPM之间、约50RPM和约260RPM之间、约50RPM和约240RPM之间、约50RPM和约220RPM之间、约50RPM和约200RPM之间、约50RPM和约180RPM之间、约50RPM和约160RPM之间、约50RPM和约140RPM之间、约50RPM和约120RPM之间、约50RPM和约100RPM之间、约50RPM和约80RPM之间、约50RPM和约60RPM之间、约75RPM和约500RPM之间、约75RPM和约480RPM之间、约75RPM和约460RPM之间、约75RPM和约440RPM之间、约75RPM和约420RPM之间、约75RPM和约400RPM之间、约75RPM和约380RPM之间、约75RPM和约360RPM之间、约75RPM和约340RPM之间、约75RPM和约320RPM之间、约75RPM和约300RPM之间、约75RPM和约280RPM之间、约75RPM和约260RPM之间、约75RPM和约240RPM之间、约75RPM和约220RPM之间、约75RPM和约200RPM之间、约75RPM和约180RPM之间、约75RPM和约160RPM之间、约75RPM和约140RPM之间、约75RPM和约120RPM之间、约75RPM和约100RPM之间、约75RPM和约80RPM之间、约100RPM和约500RPM之间、约100RPM和约480RPM之间、约100RPM和约460RPM之间、约100RPM和约440RPM之间、约100RPM和约420RPM之间、约100RPM和约400RPM之间、约100RPM和约380RPM之间、约100RPM和约360RPM之间、约100RPM和约340RPM之间、约100RPM和约320RPM之间、约100RPM和约300RPM之间、约100RPM和约280RPM之间、约100RPM和约260RPM之间、约100RPM和约240RPM之间、约100RPM和约220RPM之间、约100RPM和约200RPM之间、约100RPM和约180RPM之间、约100RPM和约160RPM之间、约100RPM和约140RPM之间、约100RPM和约120RPM之间、约150RPM和约500RPM之间、约150RPM和约480RPM之间、约150RPM和约460RPM之间、约150RPM和约440RPM之间、约150RPM和约420RPM之间、约150RPM和约400RPM之间、约150RPM和约380RPM之间、约150RPM和约360RPM之间、约150RPM和约340RPM之间、约150RPM和约320RPM之间、约150RPM和约300RPM之间、约150RPM和约280RPM之间、约150RPM和约260RPM之间、约150RPM和约240RPM之间、约150RPM和约220RPM之间、约150RPM和约200RPM之间、约150RPM和约180RPM之间、约150RPM和约160RPM之间、约200RPM和约500RPM之间、约200RPM和480RPM之间、约200RPM和约460RPM之间、约200RPM和约440RPM之间、约200RPM和约420RPM之间、约200RPM和约400RPM之间、约200RPM和约380RPM之间、约200RPM和约360RPM之间、约200RPM和约340RPM之间、约200RPM和约320RPM之间、约200RPM和约300RPM之间、约200RPM和约280RPM之间、约200RPM和约260RPM之间、约200RPM和约240RPM之间、约200RPM和约220RPM之间、约240RPM和约500RPM之间、约240RPM和约480RPM之间、约240RPM和约460RPM之间、约240RPM和约440RPM之间、约240RPM和约420RPM之间、约240RPM和约400RPM之间、约240RPM和约380RPM之间、约240RPM和约360RPM之间、约240RPM和约340RPM之间、约240RPM和约320RPM之间、约240RPM和约300RPM之间、约240RPM和约280RPM之间、约240RPM和约260RPM之间、约260RPM和约500RPM之间、约260RPM和约480RPM之间、约260RPM和约460RPM之间、约260RPM和约440RPM之间、约260RPM和约420RPM之间、约260RPM和约400RPM之间、约260RPM和约380RPM之间、约260RPM和约360RPM之间、约260RPM和约340RPM之间、约260RPM和约320RPM之间、约260RPM和约300RPM之间、约260RPM和约280RPM之间、约280RPM和约500RPM之间、约280RPM和约480RPM之间、约280RPM和约460RPM之间、约280RPM和约440RPM之间、约280RPM和约420RPM之间、约280RPM和约400RPM之间、约280RPM和约380RPM之间、约280RPM和约360RPM之间、约280RPM和约340RPM之间、约280RPM和约320RPM之间、约280RPM和约280RPM之间、约300RPM和约500RPM之间、约380RPM和约480RPM之间、约380RPM和约460RPM之间、约380RPM和约440RPM之间、约380RPM和约420RPM之间、约380RPM和约400RPM之间、约400RPM和约500RPM之间、约400RPM和约480RPM之间、约400RPM和约460RPM之间、约400RPM和约440RPM或约400RPM和约420RPM之间进行。搅拌可以连续进行或周期性进行。
在一些方面，细胞在悬浮条件下传代不多于两次。
在一些方面，细胞在悬浮培养中培养约24至约96小时。在一些方面，细胞在悬浮培养中培养约36至约84小时。在一些方面，细胞在悬浮培养中培养约48到72小时。在一些方面，细胞在悬浮培养中培养约54至约66小时。在一些方面，细胞在悬浮培养中培养约24、约30、约36、约42、约48、约54、约60、约66、约72、约78、约84、约90或约96小时。
在本公开内容的一些方面，细胞是贴壁细胞。在一些方面，贴壁细胞是HeLa细胞、CHO细胞、HEK-293细胞、VERO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞或COS细胞。在一些方面，贴壁细胞是人类细胞。在一些方面，贴壁细胞是HeLa或HEK-293细胞。在一些方面，贴壁细胞是HEK-293细胞。
在一些方面，贴壁细胞不是经悬浮适应的。在一些方面，在悬浮条件下培养细胞不改变所述细胞的贴壁依赖性。在一些方面，所述方法不改变所述细胞以产生新的细胞系。本文所公开的方法不会改变细胞的基因组或转录组特征。本文所公开的方法不会改变细胞的表型。
在一些方面，在接种N-1容器之前，细胞在补充血清的生长培养基中在贴壁条件下传代多次。在一些方面，在接种N-1容器之前，在N-2、N-3、N-4、N-5、N-6、N-7、N-8、N-9或N-10容器中培养细胞。在一些方面，在N-3和N-2容器中培养细胞。在一些方面，在N-4、N-3和N-2容器中培养细胞。
在一些方面，生物反应器是贴壁生物反应器。在一些方面，从在贴壁生物反应器中产生的培养物纯化rAAV。
在一些方面，生物反应器包含至少一个、更优选多个供贴壁细胞附着在其上的承载体，所述承载体可以漂浮或固定在生物反应器中。优选地，所述承载体可以通过例如使用聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯乙烯、聚酯、聚丙烯、DEAE-葡聚糖、胶原蛋白、玻璃、海藻酸盐或丙烯酰胺制成。在一些方面，生物反应器可以是含有珠子型微承载体(例如牌珠子承载体，市售于General Electric Corp.的GE Healthcare Inc.)或基质型承载体(例如Fibra-CellTM牌片状承载体，市售于Eppendorf Corp.)的生物反应器。在一些方面，生物反应器使用聚酯纤维承载体，例如/>nano或/>500生物反应器中使用的聚酯纤维承载体(市售于Advanced Technology Materials Inc.(Brussels,Belgium)和Pall corporation(Fall River,Mass))。
在一些方面，生物反应器中的第三培养基包含至少一种促进细胞粘附的因子。在一些方面，所述至少一种促进细胞粘附的因子选自由FBS、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、钙离子、细胞外基质的蛋白聚糖或非蛋白聚糖多糖；及其组合组成的组。在一些方面，所述至少一种促进细胞粘附的因子可以在悬浮细胞接种至生物反应器之前、期间或之后添加至第三培养基中。
在一些方面，生长培养基包含DMEM和约10％重量的FBS。在一些方面，生长培养基包含约2％至约20％重量的FBS。在一些方面，生长培养基包含约3％至约19％重量的FBS。在一些方面，生长培养基包含约4％至约18％重量的FBS。在一些方面，生长培养基包含约5％至约17％重量的FBS。在一些方面，生长培养基包含约6％至约16％重量的FBS。在一些方面，生长培养基包含约7％至约15％重量的FBS。在一些方面，生长培养基包含约8％至约14％重量的FBS。在一些方面，生长培养基包含约9％至约13％重量的FBS。在一些方面，生长培养基包含约10％至约12％重量的FBS。在一些方面，生长培养基包含约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％重量的FBS。
在一些方面，来自步骤(d)的悬浮扩增细胞可以直接接种至生物反应器中。在一些方面，接种至生物反应器中的细胞数量根据生物反应器的大小而变化。在一些方面，使用4m2的生物反应器(例如纳米生物反应器)。在一些方面，所述4m2的生物反应器接种了约1x108至1x109个细胞。在一些方面，所述4m2生物反应器接种了约3x108至7x108个细胞。在一些方面，所述4m2生物反应器接种了约4x108至6x108个细胞。在一些方面，所述4m2生物反应器接种了约5x108个细胞。在一些方面，对于其他大小的生物反应器使用等效的细胞密度。
在一些方面，本公开内容的方法可以进一步包括在生物反应器中培养细胞。在一些方面，细胞培养包括分批培养。在一些方面，细胞培养包括补料分批培养。在一些方面，细胞培养包括灌流培养。
补料分批培养包括向初始细胞培养物中渐增(定期)或连续添加补料培养基，而不从细胞培养物中大量或显著移除生长培养基。补料分批培养中的细胞培养物可以放置在生物反应器(例如，生产生物反应器，例如10,000-L生产生物反应器)中。在一些方面，补料培养基可以与生长培养基相同。补料培养基可以是液体或干粉形式。在一些方面，补料培养基是生长培养基的浓缩形式和/或以干粉形式添加。在一些方面，第一液体补料培养基和不同的第二液体补料培养基都可以添加(例如连续添加)至生长培养基中。在一些方面，向培养物添加第一液体补料培养基和添加第二液体补料培养基可以在大约相同的时间开始。在一些方面，在整个培养时期添加至培养基中的第一液体补料培养基和第二液体补料培养基的总体积可以是大约相同的。
当连续添加补料培养基时，在培养时期补料培养基的添加速率可以是保持恒定或增加的(例如，稳定增加)。在培养时期内补料培养基的连续添加可以在特定的时间点开始(例如，当细胞达到目标存活细胞密度时，例如，存活细胞密度为约1×106个细胞/mL、约1.1×106个细胞/mL、约1.2×106个细胞/mL、约1.3×106个细胞/mL、约1.4×106个细胞/mL、约1.5×106个细胞/mL、约1.6×106个细胞/mL、约1.7×106个细胞/mL、约1.8×106个细胞/mL、约1.9×106个细胞/mL或约2.0×106个细胞/mL)。在一些方面，补料培养基的连续添加可以开始于培养时期的第2天、第3天、第4天或第5天。
在一些方面，当细胞达到目标细胞密度(例如，约1×106个细胞/mL、约1.1×106个细胞/mL、约1.2×106个细胞/mL、约1.3×106个细胞/mL、约1.4×106个细胞/mL、约1.5×106个细胞/mL、约1.6×106个细胞/mL、约1.7×106个细胞/mL、约1.8×106个细胞/mL、约1.9×106个细胞或约2.0×106个细胞/mL)时可以开始渐增(定期)添加补料培养基。在一些方面，渐增补料培养基的添加可以以规律的间隔(例如，每天、每隔天或每三天)进行，或可以在细胞达到特定的目标细胞密度(例如，在培养时期增加的目标细胞密度)时进行。在一些方面，添加的补料培养基的量可以在补料培养基的第一次渐增添加和后续添加之间逐渐增加。在一些方面，在培养时期的任何24小时时期内添加至初始细胞培养物中的液体培养补料培养基的体积可以是含有培养物的生物反应器的初始体积的一部分或初始培养物的体积的一部分。
在一些方面，液体补料培养基的添加(连续或定期)可以发生在培养时期开始之后的以下时间点：6小时和7天之间、约6小时和约6天之间、约6小时和约5天之间、约6小时和约4天之间、约6小时和约3天之间、约6小时和约2天之间、约6小时和约1天之间、约12小时和约7天之间、约12小时和约6天之间、约12小时和约5天之间、约12小时和约4天之间、约12小时和约3天之间、约12小时和约2天之间、约1天和约7天之间、约1天和约6天之间、约1天和约5天之间、约1天和约4天之间、约1天和约3天之间、约1天和约2天之间、约2天和约7天之间、约2天和约6天之间、约2天和约5天之间、约2天和约4天之间、约2天和约3天之间、约3天和约7天之间、约3天和约6天之间、约3天和约5天之间、约3天和约4天之间、约4天和约7天之间、约4天和约6天之间、约4天和约5天之间、约5天和约7天之间或约5天和约6天之间。
在一些方面，在任何24小时时期内添加(连续或定期)至初始细胞培养物中的液体补料培养基的体积可以是生物反应器的容量的0.01×和约0.3×之间。所述部分可以是生物反应器的容量的约0.01×和约0.28×之间、约0.01×和约0.26×之间、约0.01×和约0.24×之间、约0.01×和约0.22×之间、约0.01×和约0.20×之间、约0.01×和约0.18×之间、约0.01×和约0.16×之间、约0.01×和约0.14×之间、约0.01×和约0.12×之间、约0.01×和约0.10×之间、约0.01×和约0.08×之间、约0.01×和约0.06×之间、约0.01×和约0.04×之间、约0.02×和约0.3×之间、约0.02×和约0.28×之间、约0.02×和约0.26×之间、约0.02×和约0.24×之间、约0.02×和约0.22×之间、约0.02×和约0.20×之间、约0.02×和约0.18×之间、约0.02×和约0.16×之间、约0.02×和约0.14×之间、约0.02×和约0.12×之间、约0.02×和约0.10×之间、约0.02×和约0.08×之间、约0.02×和约0.06×之间、约0.02×和约0.05×之间、约0.02×和约0.04×之间、约0.02×和约0.03×之间、约0.025×和约0.3×之间、约0.025×和约0.28×之间、约0.025×和约0.26×之间、约0.025×和约0.24×之间、约0.025×和约0.22×之间、约0.025×和约0.20×之间、约0.025×和约0.18×之间、约0.025×和约0.16×之间、约0.025×和约0.14×之间、约0.025×和约0.12×之间、约0.025×和约0.10×之间、约0.025×和约0.08×之间、约0.025×和约0.06×之间、约0.025×和约0.04×之间、约0.05×和约0.3×之间、约0.05×和约0.28×之间、约0.05×和约0.26×之间、约0.05×和约0.24×之间、约0.05×和约0.22×之间、约0.05×和约0.20×之间、约0.05×和约0.18×之间、约0.05×和约0.16×之间、约0.05×和约0.14×之间、约0.05×和约0.12×之间、约0.05×和约0.10×之间、约0.1×和约0.3×之间、约0.1×和约0.28×之间、约0.1×和约0.26×之间、约0.1×和约0.24×之间、约0.1×和约0.22×之间、约0.1×和约0.20×之间、约0.1×和约0.18×之间、约0.1×和约0.16×之间、约0.1×和约0.14×之间、约0.1×之间、约0.15×和约0.3×之间、约0.15×和约0.2×之间、约0.2×和约0.3×之间或约0.25×和约0.3×之间。
在一些方面，在培养时期内的任何24小时时期内添加(连续或定期)至初始细胞培养物中的液体补料培养基的体积可以是初始细胞培养物的体积的0.02×和约1.0×之间、约0.02×和约0.9×之间、约0.02×和约0.8×之间、约0.02×和约0.7×之间、约0.02×和约0.6×之间、约0.02×和约0.5×之间、约0.02×和约0.4×之间、约0.02×和约0.3×之间、约0.02×和约0.2×之间、约0.02×和约0.1×之间、约0.02×和约0.08×之间、约0.02×和约0.06×之间、约0.02×和约0.05×之间、约0.02×和约0.04×之间、约0.02×和约0.03×之间、约0.05×和约1.0×之间、约0.05×和约0.8×之间、约0.05×和约0.7×之间、约0.05×和约0.6×之间、约0.05×和约0.5×之间、约0.05×和约0.4×之间、约0.05×和约0.3×之间、约0.05×和约0.2×之间、约0.05×和约0.1×之间、约0.1×和约1.0×之间、约0.1×和约0.9×之间、约0.1×和约0.8×之间、约0.1×和约0.7×之间、约0.1×和约0.6×之间、约0.1×和约0.5×之间、约0.1×和约0.4×之间、约0.1×和约0.3×之间、约0.1×和约0.2×之间、约0.2×和约1.0×之间、约0.2×和约0.9×之间、约0.2×和约0.8×之间、约0.2×和约0.7×之间、约0.2×和约0.6×之间、约0.2×和约0.5×之间或约0.2×和约0.4×之间。
在一些方面，在整个培养时期添加(连续或定期)的补料培养基的总量可以是初始培养物的体积的约1％和约40％之间(例如约1％和约35％之间、约1％和约30％之间、约1％和约25％之间、约1％和约20％之间、约1％和约15％之间、约1％和约10％之间、约1％和约5％之间、约1％和约4％之间、约2％和约40％之间、约2％和约35％之间、约2％和约30％之间、约2％和约25％之间、约2％和约20％之间、约2％和约15％之间、约2％和约10％之间、约2％和约5％之间、约3％和约40％之间、约3％和约35％之间、约3％和约30％之间、约3％和约25％之间、约3％和约20％之间、约3％和约15％之间、约3％和约10％之间、约3％和约5％之间、约4％和约40％之间、约4％和约35％之间、约4％和约30％之间、约4％和约25％之间、约4％和约20％之间、约4％和约15％之间、约4％和约10％之间、约4％和约8％之间、约5％和约40％之间、约5％和约35％之间、约5％和约30％之间、约5％和约25％之间、约5％和约20％之间、约5％和约15％之间、约5％和约10％之间、约10％和约40％之间、约10％和约35％之间、约10％和约30％之间、约10％和约25％之间、约10％和约20％之间、约10％和约15％之间、约15％和约40％之间、约15％和约35％之间、约15％和约30％之间、约15％和约25％之间、约15％和约20％之间、约20％和约40％之间、约20％和约35％之间、约20％和约30％之间、约20％和约25％之间、约25％和约40％之间、约25％和约35％之间、约25％和约30％之间、约30％和约40％之间、约30％和约35％之间或约35％和约40％之间)。
在一些方面，在补料分批培养期间添加(连续或渐增)两种不同的补料培养基。在一些方面，添加的第一补料培养基和第二补料培养基的量或体积可以是基本上相同或可以不同。在一些方面，第一补料培养基可以是液体形式，第二补料培养基可以是固体形式。在一些方面，第一补料培养基和第二补料培养基可以是液体补料培养基。
灌流培养包括从生物反应器中移除第一体积的生长培养基，并向生产生物反应器中添加第二体积的第二生长培养基，其中第一体积和第二体积大约相等。通过细胞保留装置或通过例如在沉降锥中的细胞沉降的技术将细胞保留在生物反应器中。在一些方面，生长培养基的移除和添加可以同时或依序进行，或是两者的一些组合。在一些方面，移除和添加可以连续进行，例如以移除和替换生物反应器的容量的体积的0.1％和800％之间、1％和700％之间、1％和600％之间、1％和500％之间、1％和400％之间、1％和350％之间、1％和300％之间、1％和250％之间、1％和100％之间、100％和200％之间、5％和150％之间、10％和50％之间、15％和40％之间、8％和80％之间或4％和30％之间的速率进行。
在一些方面，在每个24小时时期内移除的第一生长培养基的第一体积和添加的第二生长培养基的第二体积可以保持大致相同。在一些方面，移除第一生长培养基的第一体积的速率(体积/单位时间)和添加第二生长培养基的第二体积的速率(体积/单位时间)可以变化，并且取决于特定细胞培养***的条件。在一些方面，移除第一生长培养基的第一体积的速率(体积/单位时间)和添加第二生长培养基的第二体积的速率(体积/单位时间)可以是大约相同的或可以不同。
在一些方面，在每个24小时时期内移除和添加的体积可以通过逐渐增加来改变。在一些方面，在培养时期，在每个24小时时期内移除的第一生长培养基的体积和添加的第二生长培养基的体积可以增加。在一些方面，在24小时时期内可以以生物反应器的容量的0.5％至20％的体积来增加体积。在一些方面，在培养时期内体积可以增加至生物反应器的容积的25％至150％的体积或增加至24小时时期内的第一液体培养基体积。
在一些方面，在培养时期的前48至96小时之后，在每个24小时时期内，移除的第一生长培养基的第一体积和添加的第二生长培养基的第二体积是第一生长培养基的体积的约10％至约95％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约85％至约95％、约60％至约80％或约70％。
在一些方面，第一生长培养基和第二生长培养基可以是相同类型的培养基。在一些方面，第一生长培养基和第二生长培养基可以是不同的。在一些方面，第二液体培养基可以更浓缩一种或更多的培养基成分。
在一些方面，可以通过使用任何自动化***移除第一体积的第一生长培养基。在一些方面，可以使用交替式切向流过滤。在一些方面，可以通过第一体积的第一生长培养基经过无菌膜的渗透或重力流来移除第一体积的第一生长培养基，所述无菌膜具有的分子量截止可将细胞排除。在一些方面，可以通过停止或显著降低搅拌速率持续至少1分钟、至少2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、40分钟、50分钟或1小时，并且从生产生物反应器的顶部移除或吸出第一体积的第一生长培养基来移除第一体积的第一生长培养基。
在一些方面，可以通过泵将第二体积的第二液体培养基添加至第一液体培养基中。在一些方面，可以手动(例如通过移液或注射将第二体积的第二液体培养基直接添加至第一液体培养基中)或以自动化方式将第二液体培养基添加至第一液体培养基中。
在一些方面，所述方法进一步包括使细胞与第一多核苷酸序列接触。在一些方面，所述方法进一步包括用多核苷酸序列转染细胞。在一些方面，多核苷酸序列是质粒。在一些方面，质粒编码选自由AAV、慢病毒、疱疹病毒、多瘤病毒和疫苗病毒组成的组的重组病毒颗粒的衣壳。在一些方面，细胞在将其接种至生物反应器中之前被转染。在一些方面，细胞在将其接种至生物反应器中之后被转染。在一些方面，用包含编码转基因的核酸的第二多核苷酸接触或转染细胞。在一些方面，在产生病毒载体的条件下培养细胞。在一些方面，所述方法进一步包括分离产生的病毒载体。
在一些方面，多核苷酸是病毒载体。在一些方面，病毒载体是腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体。这些载体可以感染多种***和非***的细胞类型，包括滑膜细胞和肝脏细胞。腺病毒和AAV载体在进入细胞之后的附加体性质使这些载体适用于治疗性应用(Russell,J.Gen.Virol.81:2573-2604(2000))；Goncalves,Virol J.2(1):43 2005))，如上所述。AAV载体可以实现转基因表达的非常稳定的长期表达(在狗中长达9年(Niemeyer等人，Blood113(4):797-806(2009))，在人中长达2年(Nathwani等人，N Engl J Med.365(25):2357-2365(2011)；Simonelli等人，Mol Ther.18(3):643-50(2010),Epub 2009Dec.1))。在一些方面，如Russell(2000年，同上)所综述，腺病毒载体被修饰以减少宿主反应。使用AAV载体进行基因治疗的方法描述于Wang等人，2005,J Gene Med.March 9(Epub提前出版)；Mandel等人，Curr Opin Mol Ther.6:482-90(2004)；Martin等人，Eye 18:1049-55(2004)；Nathwani等人，N Engl J Med.22；365:2357-65(2011)和Apparailly等人，Hum GeneTher.16(4):426-34(2005)。
在一些方面，第一多核苷酸序列包含反向末端重复序列、编码至少一种AAV复制蛋白的核酸、编码至少一种AAV包装蛋白的核酸、编码至少一种AAV结构衣壳蛋白的核酸或其组合中的一种或更多。
在一些方面，在产生重组病毒颗粒的条件下培养细胞。在一些方面，所述方法进一步包括分离产生的重组病毒颗粒。
在一些方面，病毒载体包含与适当的调控序列可操作地连接的转基因。术语“调控序列”包括启动子、增强子和其他控制蛋白质转录或翻译的表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于，例如，Goeddel(Gene Expression Technology,Methods inEnzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))。在一些方面，调控序列可以包含启动子序列。在一些方面，启动子序列可以是巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、病毒长末端重复启动子(LTR)(例如来自鼠莫洛尼白血病病毒(MMLV)、劳氏肉瘤病毒或HTLV-1的启动子)、猿猴空泡病毒40(SV40)早期启动子或单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子。
在一些方面，病毒载体包含编码另外多肽的另外核苷酸序列。在一些方面，另外多肽可以是(可选择)标志多肽，其可用于识别、选择和/或筛选含有病毒载体的细胞。在一些方面，标志多肽可以是荧光蛋白GFP、可选择标志基因HSV胸苷激酶(用于在HAT培养基上选择)、细菌潮霉素B磷酸转移酶(用于在潮霉素B上选择)、Tn5氨基糖苷磷酸转移酶(用于在G418上选择)、以及二氢叶酸还原酶(DHFR)(用于在甲氨蝶呤上选择)、CD20、低亲和力神经生长因子基因。获得这些标志基因的来源和使用它们的方法提供于Sambrook和Russel(2001)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版),Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York。
产生病毒载体(例如AAV)的方法
本公开内容的一些方面涉及产生病毒载体(例如本文所公开的rAAV)的方法，所述方法包括根据本文所公开的接种训练扩增方法中的任一项来扩增细胞，在生物反应器中用细胞接种生长培养基，用编码病毒颗粒的多核苷酸序列转染细胞，以及在产生病毒颗粒的条件下在生物反应器中培养细胞。在一些方面，病毒载体的产生公开于美国申请号63/123,602中，其通过引用明确并入本文。
将外源核酸引入宿主细胞的方法是本领域众所周知的，并随所用的宿主细胞而变化。这些技术包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、氯化钙处理、聚乙烯亚胺介导的转染、聚凝胶介导的转染、原生质体融合、电穿孔、病毒或噬菌体感染、将多核苷酸封装在脂质体中以及将DNA直接显微注射至细胞核中。转染可以是瞬时的或是稳定的。
在一些方面，多核苷酸序列是质粒。在一些方面，质粒编码来自AAV的病毒颗粒。
在一些方面，多核苷酸序列是病毒载体。在一些方面，病毒载体编码病毒颗粒。在优选的方面，病毒颗粒来自AAV。在一些方面，rAAV包含SEQ ID NO:9的核酸序列。在一些方面，本公开内容提供了包含SEQ ID NO:9的核酸序列的rAAV颗粒。在一些方面，本公开内容提供了包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021的rAAV。在一些方面，本公开内容提供了包含SEQID NO:3的核苷酸55-5021的rAAV颗粒。在一些方面，rAAV包含SEQ ID NO:8的核苷酸1-4988。在一些方面，本公开内容提供了包含SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977的rAAV颗粒。
在一些方面，病毒载体是AAV载体。在一些方面，AAV载体可以包括重组AAV载体(rAAV)。本文中使用的“rAAV载体”是指重组载体，所述重组载体包含被封装在来自本文所公开的AAV血清型的衣壳蛋白的蛋白质外壳中的AAV基因组的一部分。在一些方面，AAV载体可以包含来自腺相关病毒血清型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10、AAVRH10、AAV11、AAV12等)的反向末端重复序列(ITR)。
通常，载体基因组需要使用侧翼5’和3’ITR序列，以便将载体基因组有效地包装至rAAV衣壳中。在一些方面，存在于rAAV载体中的rAAV基因组至少包含AAV血清型之一的反向末端重复区域(ITR)的核苷酸序列或与其基本上相同的核苷酸序列，以及在适合的调控元件(例如启动子)控制下的编码转基因的核酸序列，其中调控元件和修饰的核酸序列***在两个ITR之间。
几种AAV血清型和相应ITR的完整基因组已被测序(Chiorini等人，J.of Virology73:1309-1319(1999))。它们既可以克隆，也可以通过本领域已知的化学合成法制成，例如使用由例如Applied Biosystems Inc.(Fosters,Calif.,USA)供应的寡核苷酸合成仪或通过标准分子生物学技术。ITR可以从AAV病毒基因组中克隆或从包含AAV ITR的载体中切除。可以使用标准分子生物学技术将ITR核苷酸序列连接至编码一种或更多治疗性蛋白的核苷酸序列的任一端上，或可以用所需的核苷酸序列替换ITR之间的野生型AAV序列。
在一些方面，包装的病毒载体的病毒衣壳组分可以是细小病毒衣壳，例如AAV Cap和/或嵌合衣壳。适合的细小病毒病毒衣壳组分的示例是来自细小病毒科的衣壳组分，例如自主性细小病毒或依赖病毒。例如，病毒衣壳可以是AAV衣壳(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVRH8、AAV9、AAV10、AAVRH10、AAV11或AAV12衣壳；本领域技术人员应知晓可能还有具有相同或类似的功能的其他尚未鉴定的变体)，或可以包括来自两个或更多AAV衣壳的组分。全部的AAV衣壳蛋白包含VP1、VP2和VP3。包含编码AAV VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF可以包含少于全套AAV Cap蛋白，或可以提供全套AAV Cap蛋白。
在一些方面，一种或更多AAV Cap蛋白可以是嵌合蛋白，包括来自两种或更多病毒(优选两种或更多AAV)的AAV Cap的氨基酸序列。例如，嵌合病毒衣壳可以包括AAV1 Cap蛋白或亚基和至少一个AAV2 Cap或亚基。在一些方面，存在于rAAV载体中的rAAV基因组不包含任何编码病毒蛋白的核苷酸序列，例如AAV的rep(复制)或cap(衣壳)基因。在一些方面，rAAV基因组可以进一步包含标志或报告基因，例如编码抗生素抗性基因、荧光蛋白(例如gfp)的基因或编码本领域已知的化学、酶促或其他可检测和/或可选择产物(例如lacZ、aph等)的基因。
在一些方面，存在于所述rAAV载体中的rAAV基因组可以进一步包含与编码转基因的核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。
在一些方面，适合的3’非翻译序列还可以与编码转基因的修饰核酸序列可操作地连接。适合的3’非翻译区可以是与核苷酸序列天然关联的或可以来自不同的基因，例如牛生长激素3’非翻译区(例如bGH多聚腺苷酸化信号、SV40多聚腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号和增强子序列)。
除非另有说明，本领域技术人员已知的方法可以用于构建重组细小病毒和AAV(rAAV)构建体、包装表达细小病毒Rep和/或Cap序列的载体以及瞬时和稳定转染包装细胞。本领域技术人员熟知这些技术。参见，例如，SAMBROOK等人，MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL第2版.(Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；AUSUBEL等人，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Green Publishing Associates,Inc.和John WileySons,Inc.,New York)。
在一些方面，适合的3’非翻译序列还可以与编码转基因的核酸序列可操作地连接。适合的3’非翻译区可以是与核苷酸序列天然关联的或可以来自不同的基因，例如牛生长激素3’非翻译区(例如bGH多聚腺苷酸化信号、SV40多聚腺苷酸化信号、SV40多聚腺苷酸化信号和增强子序列)。
在一些方面，额外的核苷酸序列可以与编码转基因的核酸序列可操作地连接，例如编码信号序列、核定位信号、表达增强子等类似物的核苷酸序列。
除非另有说明，本领域技术人员已知的方法可以用于构建慢病毒构建体、载体以及瞬时和稳定转染的包装细胞。本领域技术人员熟知这些技术。参见，例如，SAMBROOK等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL第2版.(Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；AUSUBEL等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Green PublishingAssociates,Inc.和John Wiley Sons,Inc.,New York)。
在一些方面，根据本公开内容的方法包括用包含rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒、包含AAV rep基因和AAV cap基因的质粒以及腺病毒辅助质粒来转染细胞。在一些方面，包含rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒包含：SEQ ID NO:9的核酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021或SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977。在一些方面，包含AAV rep基因和AAV cap基因的质粒包含AAV2 rep基因和rAAVrh74 cap基因。在一些方面，腺病毒辅助质粒包含腺病毒5E2A、E4ORF6和VA RNA基因。
在一些方面，所述方法进一步包括分离产生的病毒颗粒。病毒载体在细胞内复制，从而扩增并产生病毒颗粒。病毒感染导致转染细胞裂解。因此，病毒载体(例如AAV)的裂解特性允许采用两种不同模式的病毒颗粒产生和分离。第一种模式是在细胞裂解前收获病毒颗粒，利用外部因素使细胞裂解。第二种模式是在产生的病毒几乎完全裂解细胞后，从上清液中收获病毒颗粒。
本领域技术人员已知可以用于活性细胞裂解的方法。在一些方面，可以通过冻融、固体剪切、高渗和/或低渗裂解、液体剪切、超声、高压挤出、去污剂裂解、上述方法的组合等类似方法裂解细胞。
在一些方面，可以使用至少一种去污剂裂解细胞。在一些方面，去污剂可以包括阴离子、阳离子、兼性离子和非离子去污剂。在一些方面，去污剂的浓度可以是约0.1％-5％(w/w)。在一些方面，去污剂可以是Triton X-100。
在一些方面，可以使用核酸酶除去污染的核酸，即转染细胞中的天然核酸。在一些方面，核酸酶可以是 或本领域常用的任何其他DNA酶和/或RNA酶。
从转染细胞中收获或分离病毒载体的方法已广泛公开于WO2005/080556中，其通过引用整体并入本文。
在一些方面，收获或分离病毒载体的时间在转染后约24小时和120小时之间、约36小时和108小时之间、转染后约48小时和约96小时之间、转染后约60小时和约84小时之间。在一些方面，收获或分离载体的时间在转染后约72小时。
在一些方面，分离的病毒颗粒可以进一步纯化。在一些方面，病毒颗粒的纯化可以分几个步骤进行，所述步骤包括澄清、超滤、渗滤或色谱分离。这些方法描述于WO2005/080556中，其通过引用整体并入本文。在一些方面，澄清可以通过过滤步骤完成，从细胞裂解液中除去细胞碎片和其他杂质。在一些方面，超滤用于浓缩病毒溶液。在一些方面，渗滤、缓冲液交换或超滤可以用于除去和交换盐、糖等。本领域技术人员知晓如何找到对于每个纯化步骤的最佳条件。
在一些方面，纯化可以通过密度梯度离心来实现。在一些方面，纯化采用至少一个色谱法步骤。在一些方面，病毒载体可以通过阴离子交换色谱、尺寸排阻色谱或其组合进行纯化。
治疗肌营养不良(例如DMD)的方法
本公开内容提供了在有需要的人类受试者中治疗肌营养不良的方法，所述方法包括施用重组腺相关病毒(rAAV)rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的步骤，其中rAAV以约5.0x1012vg/kg至约1.0x1015vg/kg的剂量通过全身施用途径施用，并且其中rAAV在哺乳动物贴壁细胞中产生，并且其中贴壁细胞在悬浮条件下在N-1容器中培养。在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良。在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良。
本公开内容还提供了在有需要的人类受试者中治疗肌营养不良的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用包含本文所述的rAAV的组合物。在一些方面，rAAV以约5.0x1012vg/kg至约1.0x1015vg/kg的剂量通过全身施用途径施用。在一些方面，全身施用途径是静脉内途径，并且施用的rAAV剂量为约2x1014vg/kg。
在一些方面，施用的rAAV的剂量为约10mL/kg的浓度。在一些方面，rAAV通过注射、灌注或植入施用。在一些方面，rAAV通过灌注在约一小时内施用。在一些方面，rAAV经由外周肢体静脉通过静脉内途径施用。
在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良。在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良。
在一些方面，与施用rAAV之前的微小抗肌营养不良蛋白基因表达水平相比，施用rAAV之后在受试者的细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因表达的水平增加。在一些方面，通过在施用所述rAAV之前和之后通过蛋白质印迹测量肌肉活检中的微小抗肌营养不良蛋白水平来检测所述细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因的表达。在一些方面，与施用之前相比，施用rAAV之后的表达为至少55.4％。
在一些方面，与施用rAAV之前的微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的数量相比，施用rAAV之后受试者的肌肉组织中的微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的平均百分比增加。在一些方面，如在施用rAAV之前和之后的肌肉活检中通过免疫荧光(IF)所检测的，微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的平均百分比为至少70.5％，平均强度为至少116.9％。在一些方面，通过载体基因组计数的微小抗肌营养不良蛋白转导为每个细胞核至少3.87个平均载体基因组拷贝。
在一些方面，在治疗患有DMD的患者的方法中，所述组合物施用于基因分型的患者。在一些方面，对患者的人抗肌营养不良蛋白(DMD)基因进行基因分型。在一些方面，对基因分型的患者针对人抗肌营养不良蛋白(DMD)基因的外显子18-79中的至少一种突变进行基因分型。
在一些方面，治疗肌营养不良的方法进一步包括在向所述人类受试者施用所述组合物之前对所述人类受试者的DMD基因进行基因分型。在一些方面，基因分型检测DMD基因的外显子18至79中的至少一个突变。在一些方面，所述至少一种突变是移码缺失、移码重复、过早终止或导致人抗肌营养不良蛋白的表达缺失的其他致病性变异。
在一些方面，对移码缺失、移码重复、提前终止或导致人抗肌营养不良蛋白不表达的其他致病变异进行检测可确定受试者适宜施用本文所公开的组合物。
在一个方面，DMD基因中的至少一个突变是外显子1-17中的突变、框内缺失、框内重复、意义不明变异(VUS)或完全包含在外显子45中的突变，从而确定受试者不适宜施用本文所公开的组合物。
本公开内容还提供了本文所述的组合物用于在有需要的人类受试者中治疗肌营养不良的用途。在一些方面，本公开内容。本公开内容还提供了本文所述的组合物在制造用于治疗肌营养不良的药物中的用途。
在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良。在一些方面，肌营养不良是杜氏肌营养不良。
例如，施用rAAV的剂量为约5.0x1012vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至1.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约5.0x1013vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约2.0x1013vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约1.0x1013vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或1.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至1.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约5.0x1013vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约5.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约6.0x1014vg/kg、或1.0x1013vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或5.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至1.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约5.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约6.0x1014vg/kg、或5.0x1013vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约6.0x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约5.0x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约4.0x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.0x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至6.0x1014、或约1.25x1014vg/kg至5.0x1014、或约1.25x1014vg/kg至4.0x1014、或约1.25x1014vg/kg至1.0x1015、或约1.25x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约2.75x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或1.25x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或1.5x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至6.0x1014、或约1.5x1014vg/kg至5.0x1014、或约1.5x1014vg/kg至4.0x1014、或约1.5x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约3.25x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约2.75x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或1.75x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至6.0x1014、或约1.75x1014vg/kg至5.0x1014、或约1.75x1014vg/kg至4.0x1014、或约1.75x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约3.25x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.75x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.25x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至1.0x1015、或约2.0x1014vg/kg至6.0x1014、或约2.0x1014vg/kg至5.0x1014、或约2.0x1014vg/kg至约4.0x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至约3.25x1014vg/kg。
在一些方面，人类受试者的年龄在约4岁和小于8岁之间。在一些方面，人类受试者的年龄为约4、约4.25、约4.5、约4.75、约5、约5.25、约5.5、约5.75、约6、约6.25、约6.5、约6.75、约7、约7.25、约7.5或约7.75岁。
在一些方面，人类受试者的年龄在约8岁和小于18岁之间。在一些方面，人类受试者的年龄为约8、约8.25、约8.5、约8.75、约9、约9.25、约9.5、约9.75、约10、约10.25、约10.5、约10.75、约11、约11.25、约11.5、约11.75、约12、约12.25、约12.5、约12.75、约13、约13.25、约13.5、约13.75、约14、约14.5、约14.75、约15、约15.25、约15.5、约15.75、约16、约16.25、约16.5、约16.75、约17、约17.25、约17.5或约17.75岁。
在一个方面，本公开内容的方法包括全身施用rAAV，其中全身施用途径是静脉内途径，并且施用rAAV的剂量为约2.0x1014vg/kg。在另一个方面，本公开内容的方法包括全身施用rAAV，其中全身施用途径是静脉内途径，并且施用rAAV的剂量为约5.0x1012vg/kg、或约6.0x1012vg/kg、或约7.0x1012vg/kg、或约8.0x1012vg/kg、或约9.0x1012vg/kg、或约1.0x1013vg/kg、或约1.25x1013vg/kg、或约1.5x1013vg/kg、或约1.75x1013vg/kg、或约2.25x1013vg/kg、或约2.5x1013vg/kg、或约2.75x1013vg/kg、或约3.0x1013vg/kg、或约3.25x1013vg/kg、或约3.5x1013vg/kg、或约3.75x1013vg/kg、或约4.0x1013vg/kg、或约5.0x1013vg/kg、或约6.0x1013vg/kg、或约7.0x1013vg/kg、或约8.0x1013vg/kg、或约9.0x1013vg/kg、或约1.0x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg、或约2.25x1014vg/kg、或约2.5x1014vg/kg、或约2.75x1014vg/kg、或约3.0x1014vg/kg、或约3.25x1014vg/kg、或约3.5x1014vg/kg、或约3.75x1014vg/kg、或约4.0x1014vg/kg、或约5.0x1014vg/kg、或约6.0x1014vg/kg、或约1x1015vg/kg。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白或AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
在本公开内容的任何方法中，rAAV的剂量可以以约5mL/kg至约15mL/kg、或约8mL/kg至约12mL/kg、或8mL/kg至约10mL/kg、或5mL/kg至约10mL/kg或约10mL/kg至12mL/kg、或约10mL/kg至15mL/kg或10mL/kg至约20mL/kg施用。在一个特定的方面，rAAV的剂量以约10mL/kg施用。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白或AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
在本公开内容的任何方法中，rAAV的剂量可以通过注射、灌注或植入施用。例如，rAAV的剂量通过灌注在约一小时内施用。此外，rAAV的剂量经由外周肢体静脉(例如外周臂部静脉或外周腿部静脉)通过静脉内途径施用。或者，灌注可以在约30分钟、约1.5小时、约2小时、约2.5小时或约3小时内施用。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
通过本公开内容的任何方法施用的rAAV可以包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。此外，通过本公开内容的任何方法施用的rAAV包括SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。例如，rAAV可以包含SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。
在一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
在本公开内容的任何方法中，施用的rAAV属于血清型AAVrh7.4。
在一些方面，本公开内容的方法治疗杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良。一个示例性的方面是在有需要的人类受试者中治疗杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良的方法，包括施用一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的步骤，其中施用途径是静脉内灌注，并且施用的rAAV的剂量为在约一小时内约2x1014vg/kg，并且其中rAAV载体包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
在治疗肌营养不良的任何方法中，施用rAAV之后，受试者的细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因表达的水平增加。通过在施用rAAV之前和之后的肌肉活检中通过蛋白质印迹测量微小抗肌营养不良蛋白水平来检测细胞中微小抗肌营养不良蛋白基因的表达。特别地，与施用rAAV之前的微小抗肌营养不良蛋白的水平相比，施用rAAV之后的微小抗肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％至至少约80％、或至少约70％至至少约90％、或至少约80％至至少约90％。例如，与施用rAAV之前的微小抗肌营养不良蛋白的水平相比，施用rAAV之后的微小抗肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％或至少约71％或至少约72％或至少约73％或至少约74％或至少约75％或至少约76％或至少约77％、或至少约78％或至少约79％或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％。
此外，通过在施用rAAV之前和之后的肌肉活检中通过免疫组织化学测量微小抗肌营养不良蛋白水平来检测细胞中微小抗肌营养不良蛋白基因的表达。与施用rAAV之前的微小抗肌营养不良蛋白的水平相比，施用rAAV之后的微小抗肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％至至少约80％、或至少约70％至至少约90％、或至少约80％至至少约90％。例如，与施用rAAV之前的微小抗肌营养不良蛋白的水平相比，施用rAAV之后的微小抗肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％或至少约71％或至少约72％或至少约73％或至少约74％或至少约75％或至少约76％或至少约77％或至少约78％或至少约79％或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％。
在治疗肌营养不良的任何方法中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后受试者的血清CK水平降低。例如，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天，受试者的血清CK水平降低约65％至约90％或约65％至约95％或约75％至约90％或约80％至约90％或约85％至约95％或约87％至约95％或约87％至约90％。特别地，在本公开内容的治疗肌营养不良的任何方法中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天受试者的血清CK水平降低约87％，或在本公开内容的治疗肌营养不良的任何方法中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天受试者的血清CK水平降低约72％，或在本公开内容的治疗肌营养不良的任何方法中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天受试者的血清CK水平降低约73％，或在本公开内容的治疗肌营养不良的任何方法中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天受试者的血清CK水平降低约78％，或在本公开内容的治疗肌营养不良的任何方法中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天受试者的血清CK水平降低约95％。在治疗肌营养不良的任何方法中，与施用rAAV之前微小抗肌营养不良蛋白的数量相比，施用rAAV之后受试者的肌肉组织中的微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加。例如，通过在施用rAAV之前和之后的肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量微小抗肌营养不良蛋白水平来检测微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。
在本文所述的治疗肌营养不良的任何方法中，施用rAAV上调DAPC蛋白(例如α-肌蛋白聚糖或β-肌蛋白聚糖)的表达。例如，与施用rAAV之前α-肌蛋白聚糖的水平相比，施用rAAV之后受试者的α-肌蛋白聚糖的水平增加。此外，与施用rAAV之前的β-肌蛋白聚糖的水平相比，施用rAAV之后受试者的β-肌蛋白聚糖的水平增加。通过在施用rAAV之前和之后的肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量α-肌蛋白聚糖或β-肌蛋白聚糖蛋白水平来检测α-肌蛋白聚糖或β-肌蛋白聚糖的水平。
在治疗肌营养不良的任何方法中，施用rAAV之后受试者的疾病进展被延缓，如以下任一方法所测量：六分钟步行测试、起立时间、上行4级台阶、上行和下行4级台阶、北极星行走评估(North Star Ambulatory Assessment,NSAA)、10米计时测试、100米计时测试、手持测力计(HHD)、计时起立行走和/或粗大运动分测试量表(Bayley-III)评分。
例如，在任何方法中，与施用rAAV之前的NSAA评分相比，施用rAAV之后至少270天受试者的NSAA评分改进至少1.5、2.0、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5分。而且，在任何方法中，与施用rAAV之前的起立时间相比，施用rAAV之后至少270天受试者的起立时间改进了至少约0.8秒。此外，在任何方法中，与施用rAAV之前的上行4级台阶测试的时间相比，在施用rAAV之后至少270天受试者的上行4级台阶测试的时间改进至少约1.2秒。此外，在任何方法中，与施用rAAV之前的100米计时测试相比，施用rAAV之后至少270天受试者的100米计时测试改进至少约7秒。
在另一个方面，本公开内容提供了在患者的细胞中表达微小抗肌营养不良蛋白基因的方法，包括向患者施用SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。例如，通过在施用rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体之前和之后的肌肉活检中通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量微小抗肌营养不良蛋白水平来检测患者细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因的表达。此外，通过检测每个细胞核中更多的载体基因组数量来测量患者的微小抗肌营养不良蛋白基因的表达，其中每个细胞核中1个载体基因组为约50％的微小抗肌营养不良蛋白表达，每个细胞核中大于1个拷贝与微小抗肌营养不良蛋白表达水平一致。例如，细胞具有每个细胞核1.2个载体拷贝、或每个细胞核1.3个载体拷贝、或每个细胞核1.4个载体拷贝、或每个细胞核1.5个载体拷贝、或每个细胞核1.6个载体拷贝、或每个细胞核1.7个载体拷贝、或每个细胞核1.8个载体拷贝、或每个细胞核1.9个载体拷贝。
在一些方面，本公开内容提供了在有需要的受试者中降低血清CK水平的方法，所述方法包括向患者施用SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。例如，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天患者的血清CK水平降低至少约65％至约90％或约65％至约95％或约75％至约90％或约80％至约90％或约85％至约95％或约87％至约95％或约87％至约90％。特别地，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天受试者的血清CK水平降低约87％，或在本公开内容的治疗肌营养不良的任何方法中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天受试者的血清CK水平降低约72％，或者在本公开内容的治疗肌营养不良的任何方法中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天受试者的血清CK水平降低约73％，或在本公开内容的治疗肌营养不良的任何方法中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天受试者的血清CK水平降低约78％，或在本公开内容的治疗肌营养不良的任何方法中，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后60天受试者的血清CK水平降低约95％。
本公开内容还提供了在患者肌肉组织中增加微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的方法，包括向患者施用SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。例如，通过在施用rAAV之前和之后在肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量抗肌营养不良蛋白水平来检测微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。此外，通过检测每个细胞核中更多的载体基因组数量来测量患者的微小抗肌营养不良蛋白基因的表达，其中每个细胞核中1个载体基因组为约50％的微小抗肌营养不良蛋白表达，每个细胞核中大于1个拷贝与微小抗肌营养不良蛋白表达水平一致。例如，细胞具有每个细胞核1.2个载体拷贝、或每个细胞核1.3个载体拷贝、或每个细胞核1.4个载体拷贝、或每个细胞核1.5个载体拷贝、或每个细胞核1.6个载体拷贝、或每个细胞核1.7个载体拷贝、或每个细胞核1.8个载体拷贝、或每个细胞核1.9个载体拷贝。
在另一个方面，本公开内容提供了在有需要的患者中增加α-肌蛋白聚糖的表达的方法，包括向患者施用SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。例如，通过在施用rAAV之前和之后的肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量α-肌蛋白聚糖蛋白水平来检测α-肌蛋白聚糖的水平。
此外，本公开内容提供了在有需要的患者中增加β-肌蛋白聚糖的表达的方法，包括向患者施用SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。例如，通过在施用rAAV之前和之后的肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量β-肌蛋白聚糖蛋白水平来检测β-肌蛋白聚糖的水平。
本公开内容还提供了治疗患有杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良的患者的方法，包括向患者施用SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列，使得患者的疾病进展被延缓，如以下任一方法所测量：六分钟步行测试、起立时间、上行4级台阶、上行和下行4级台阶、北极星行走评估(NSAA)、10米计时测试、100米计时测试、手持测力计(HHD)、计时起立行走和/或粗大运动分测试量表(Bayley-III)评分。
例如，在任何方法中，与施用rAAV前的NSAA评分相比，施用rAAV之后至少270天受试者的NSAA评分改进至少1.5、2.0、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5分。与施用rAAV之前的起立时间相比，施用rAAV之后至少270天受试者的起立时间改进了至少约0.8秒。此外，在任何方法中，与施用rAAV之前的上行4级台阶测试的时间相比，在施用rAAV之后至少270天受试者的上行4级台阶测试的时间改进至少约1.2秒。此外，在任何方法中，与施用rAAV之前的100米计时测试相比，施用rAAV之后至少270天受试者的100米计时测试改进至少约7秒。
“纤维化”是指细胞外基质(ECM)组分的过度或不受控的沉积以及组织(包括骨骼肌、心肌、肝脏、肺、肾脏和胰腺)在损伤后的异常修复过程。沉积的ECM组分包括纤连蛋白和胶原蛋白，例如胶原蛋白1、胶原蛋白2或胶原蛋白3。
本公开内容还提供了在患有肌营养不良的受试者中减少或预防纤维化的方法，包括施用治疗有效量的包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子核苷酸序列的rAAV；或包含SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV载体。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在另一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在另一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5066的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在又一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
在另一个方面，本公开内容提供了在有需要的受试者中预防纤维化的方法，包括施用治疗有效量的SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子核苷酸序列；或包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAV74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV载体。例如，可以向患有肌营养不良的受试者施用本公开内容的任何rAAV以预防纤维化，例如，在观察到受试者中的纤维化之前施用本公开内容的表达人微小抗肌营养不良蛋白的rAAV。此外，本公开内容的表达人微小抗肌营养不良蛋白基因的rAAV可以施用于有发展纤维化的风险的受试者，例如患有或被诊断患有肌营养不良(例如DMD)的受试者。本公开内容的rAAV可以施用于患有肌营养不良的受试者，以预防这些受试者中的新的纤维化。
本公开内容设想了在观察到受试者中的纤维化之前施用rAAV。此外，rAAV可以施用于有发展纤维化的风险的受试者，例如患有或被诊断患有肌营养不良(例如DMD)的受试者。rAAV可以施用于已经发展纤维化的患有肌营养不良的患者，以预防这些患者中的新的纤维化。
本公开内容还提供了在患有肌营养不良的受试者中增加肌力和/或肌肉质量的方法，包括施用治疗有效量的SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子核苷酸序列；或包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV。
本公开内容设想了在观察到受试者中的纤维化之前或在肌力减少之前或在肌肉质量减少之前向被诊断患有DMD的受试者施用rAAV载体。
本公开内容还设想了向已经发展纤维化的患有肌营养不良的受试者施用SEQ IDNO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子核苷酸序列；或包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV，以预防这些受试者中的新的纤维化或减少这些患者中的纤维化。本公开内容还提供了向具有肌力减少或肌肉质量减少的患有肌营养不良的受试者施用SEQ IDNO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子核苷酸序列；或包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV载体，以保护肌肉免受进一步损伤。
本公开内容还提供了在患有肌营养不良(例如DMD)的人类受试者中治疗心肌病的方法，包括向所述人类受试者施用本文所述的任何组合物(例如delandistrogenemoxeparvovec)。在一些方面，所述方法用于在患有DMD的受试者中改善心脏功能。在一些方面，心脏功能通过以下方式改善：例如，增加射血分数(EF)；增加缩短分数(FS)；降低左心室舒张期内径(LVIDd)；降低左心室收缩末期直径(LVESD)；和/或维持或降低血清肌钙蛋白血液水平。在本公开内容的任何方法中，受试者可能患有肌营养不良(例如DMD)或任何其他抗肌营养不良蛋白相关的肌营养不良。
在本文所述的本公开内容的任何方法的其他方面，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后受试者的血清CK水平降低的百分比水平选自由以下组成的组：
a)施用之后90天、180天或270天为至少78％；
b)施用之后270天为至少46、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或85％；
c)施用之后180天为至少72、73、74或95％；
d)施用之后90天为至少87％、88％、93％或95％；
e)施用之后270天为至少70％；
f)施用之后90天、180天或270天为70％至95％；
g)施用之后90天、180天或270天为至少56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％；以及
h)施用之后90、180或270天为至少56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95％。
在另一个方面，本公开内容提供了用于在有需要的人类受试者中治疗肌营养不良的组合物，其中所述组合物包含一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白，其中组合物配制用于全身施用途径，并且rAAV的剂量为约1x1014vg/kg至约4x1014vg/kg。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
例如，本公开内容的组合物包含的rAAV的剂量为约5.0x1012vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至1.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约5.0x1013vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约2.0x1013vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约1.0x1013vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或1.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至1.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约5.0x1013vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约5.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约6.0x1014vg/kg、或1.0x1013vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或5.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至1.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约5.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约6.0x1014vg/kg、或5.0x1013vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约6.0x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约5.0x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约4.0x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.0x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至6.0x1014、或约1.25x1014vg/kg至5.0x1014、或约1.25x1014vg/kg至4.0x1014、或约1.25x1014vg/kg至1.0x1015、或约1.25x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约2.75x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或1.25x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或1.5x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至6.0x1014、或约1.5x1014vg/kg至5.0x1014、或约1.5x1014vg/kg至4.0x1014、或约1.5x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约3.25x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约2.75x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或1.75x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至6.0x1014、或约1.75x1014vg/kg至5.0x1014、或约1.75x1014vg/kg至4.0x1014、或约1.75x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约3.25x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.75x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.25x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至1.0x1015、或约2.0x1014vg/kg至6.0x1014、或约2.0x1014vg/kg至5.0x1014、或约2.0x1014vg/kg至约4.0x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至约3.25x1014vg/kg。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
在一个方面，本公开内容的组合物配制用于静脉内施用，并且其包含的rAAV的剂量为约2.0x1014vg/kg。在另一个方面，本公开内容的组合物配制用于静脉内施用，并且其包含的rAAV的剂量为约5.0x1012vg/kg、或约6.0x1012vg/kg、或约7.0x1012vg/kg、或约8.0x1012vg/kg、或约9.0x1012vg/kg、或约1.0x1013vg/kg、或约1.25x1013vg/kg、或约1.5x1013vg/kg、或约1.75x1013vg/kg、或约2.25x1013vg/kg、或约2.5x1013vg/kg、或约2.75x1013vg/kg、或约3.0x1013vg/kg、或约3.25x1013vg/kg、或约3.5x1013vg/kg、或约3.75x1013vg/kg、或约4.0x1013vg/kg、或约5.0x1013vg/kg、或约6.0x1013vg/kg、或约7.0x1013vg/kg、或约8.0x1013vg/kg、或约9.0x1013vg/kg、或约1.0x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg、或约2.25x1014vg/kg、或约2.5x1014vg/kg、或约2.75x1014vg/kg、或约3.0x1014vg/kg、或约3.25x1014vg/kg、或约3.5x1014vg/kg、或约3.75x1014vg/kg、或约4.0x1014vg/kg、或约5.0x1014vg/kg、或约6.0x1014vg/kg、或约1x1015。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977、SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在另一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
在本公开内容的任何组合物中，rAAV的剂量以约5mL/kg至约15mL/kg、或约8mL/kg至约12mL/kg、或8mL/kg至约10mL/kg、或5mL/kg至约10mL/kg、或约10mL/kg至12mL/kg、或约10mL/kg至15mL/kg、或10mL/kg至约20mL/kg递送。在一个特定的方面，组合物包含以约10mL/kg的剂量递送的rAAV。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在另一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
本公开内容的组合物配制用于通过注射、灌注或植入施用。例如，所述组合物配制用于通过灌注在约一小时内施用。此外，本公开内容的组合物配制用于经由外周肢体静脉(例如外周臂部静脉或外周腿部静脉)静脉内施用。或者，灌注可以在约30分钟、或约1.5小时、或约2小时、或约2.5小时或约3小时内施用。
本公开内容的任何组合物包含rAAV或rAAV载体，所述rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列，所述rAAV载体包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。
特别地，本公开内容的组合物用于治疗杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良。例如，本公开内容提供了用于在有需要的人类受试者中治疗杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良的组合物，其中所述组合物包含一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白，其中所述组合物配制用于通过静脉内灌注在约一小时内施用，并且施用的rAAV的剂量为约2x1014vg/kg，并且其中rAAV包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。
在另一个方面，本公开内容还提供了包含rAAV的组合物，其用于在有需要的受试者中减少纤维化。此外，本公开内容还提供了包含rAAV载体的组合物，其用于在患有肌营养不良的受试者中预防纤维化。
本公开内容还提供了包含rAAV的组合物，其用于在患有肌营养不良的受试者中增加肌力和/或肌肉质量。在又一个方面，本公开内容提供了包含本公开内容的任何rAAV的组合物，其用于治疗肌营养不良。
在本公开内容的任何组合物的其他方面，与施用组合物之前的血清CK水平相比，在向需要治疗肌营养不良的人类受试者施用所述组合物之后受试者的血清CK水平降低的百分比水平选自由以下组成的组：
a)施用之后90天、180天或270天为至少78％；
b)施用之后270天为至少46％、55％、70％或85％；
c)施用之后180天为至少72％、73％、74％或95％；
d)施用之后90天为至少87％、99％、93％或95％；
e)施用之后270天为至少70％；
f)施用之后90天、180天或270天为70％至95％；
g)施用之后90天、180天或270天为至少69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％；以及
h)施用之后90、180或270天为69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95％。
在另一个方面，本公开内容提供了一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白用于制备在有需要的人类受试者中治疗肌营养不良的药物的用途，其中所述药物配制用于全身施用途径，并且rAAV的剂量为约1x1014vg/kg至约4x1014vg/kg。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
例如，所述药物包含的rAAV的剂量为约5.0x1012vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至1.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约5.0x1013vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约2.0x1013vg/kg、或约5.0x1012vg/kg至约1.0x1013vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或1.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至1.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约5.0x1013vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约5.0x1014vg/kg、或约1.0x1013vg/kg至约6.0x1014vg/kg、或1.0x1013vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或5.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至1.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约1.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约5.0x1014vg/kg、或约5.0x1013vg/kg至约6.0x1014vg/kg、或5.0x1013vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约6.0x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约5.0x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约4.0x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.0x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或1.0x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至6.0x1014、或约1.25x1014vg/kg至5.0x1014、或约1.25x1014vg/kg至4.0x1014、或约1.25x1014vg/kg至1.0x1015、或约1.25x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约2.75x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或1.25x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或1.5x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至6.0x1014、或约1.5x1014vg/kg至5.0x1014、或约1.5x1014vg/kg至4.0x1014、或约1.5x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约3.25x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约2.75x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或1.75x1014vg/kg至约1.0x1015vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至6.0x1014、或约1.75x1014vg/kg至5.0x1014、或约1.75x1014vg/kg至4.0x1014、或约1.75x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约3.25x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约3.0x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.75x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.5x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.25x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg至约2.0x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至1.0x1015、或约2.0x1014vg/kg至6.0x1014、或约2.0x1014vg/kg至5.0x1014、或约2.0x1014vg/kg至约4.0x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至约3.75x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至约3.5x1014vg/kg、或约2.0x1014vg/kg至约3.25x1014vg/kg。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
在一个方面，本公开内容的药物配制用于一定剂量的rAAV的全身施用，其中全身施用途径是静脉内途径，并且施用的rAAV的剂量为约2.0x1014vg/kg。在另一个方面，本公开内容的药物配制用于一定剂量的rAAV的全身施用，其中全身施用途径为静脉内途径，并且rAAV的剂量为约5.0x1012vg/kg、或约6.0x1012vg/kg、或约7.0x1012vg/kg、或约8.0x1012vg/kg、或约9.0x1012vg/kg、或约1.0x1013vg/kg、或约1.25x1013vg/kg、或约1.5x1013vg/kg、或约1.75x1013vg/kg、或约2.25x1013vg/kg、或约2.5x1013vg/kg、或约2.75x1013vg/kg、或约3.0x1013vg/kg、或约3.25x1013vg/kg、或约3.5x1013vg/kg、或约3.75x1013vg/kg、或约4.0x1013vg/kg、或约5.0x1013vg/kg、或约6.0x1013vg/kg、或约7.0x1013vg/kg、或约8.0x1013vg/kg、或约9.0x1013vg/kg、或约1.0x1014vg/kg、或约1.25x1014vg/kg、或约1.5x1014vg/kg、或约1.75x1014vg/kg、或约2.25x1014vg/kg、或约2.5x1014vg/kg、或约2.75x1014vg/kg、或约3.0x1014vg/kg、或约3.25x1014vg/kg、或约3.5x1014vg/kg、或约3.75x1014vg/kg、或约4.0x1014vg/kg、或约5.0x1014vg/kg、或约6.0x1014vg/kg、或约1x1015vg/kg。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
在本公开内容的任何用途，所述药物包含的rAAV的剂量为约5mL/kg至约15mL/kg、或约8mL/kg至约12mL/kg、或8mL/kg至约10mL/kg、或5mL/kg至约10mL/kg、或约10mL/kg至12mL/kg、或约10mL/kg至15mL/kg、或10mL/kg至约20mL/kg。在一个特定的方面，剂量或rAAV为约10mL/kg。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，rAAV是AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。在一个方面，AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白是SEQ ID NO:5的核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小抗肌营养不良蛋白。
在本公开内容的任何用途，所述药物配制用于通过注射、灌注或植入施用。例如，所述药物配制用于通过灌注在约一小时内施用。此外，所述药物配制用于经由外周肢体静脉(例如外周臂部静脉或外周腿部静脉)静脉内施用。或者，灌注可以在约30分钟、或约1.5小时、或约2小时、或约2.5小时或约3小时内施用。
在本公开内容的任何用途，所述药物包含rAAV，所述rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列或SEQID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。
本公开内容的特定用途是用于制备治疗杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良的药物。例如，本公开内容提供了一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白用于制备在有需要的人类受试者中治疗杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良的药物的用途，其中所述药物配制用于通过静脉灌注在约一小时内施用，并且施用的rAAV的剂量为约2x1014vg/kg，并且其中rAAV包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。
在又一个方面，本公开内容提供了rAAV用于制备在有需要的受试者中减少纤维化的药物的用途。例如，有需要的受试者可以患有肌营养不良，例如DMD或任何其他抗肌营养不良蛋白相关的肌营养不良。
在另一个方面，本公开内容提供了rAAV用于制备在患有肌营养不良的受试者中预防纤维化的药物的用途。
此外，本公开内容还提供了rAAV用于制备在患有肌营养不良的受试者中增加肌力和/或肌肉质量的药物的用途。
本公开内容还提供了rAAV用于制备治疗肌营养不良的药物的用途。
本公开内容提供了包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的MHCK7启动子核苷酸序列的rAAV载体用于制备治疗肌营养不良的药物的用途，或包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrf74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列的rAAV载体用于治疗肌营养不良的用途。
在本公开内容的任何用途的其他方面，与施用rAAV之前的血清CK水平相比，在向受试者施用rAAV之后受试者的血清CK水平降低的百分比水平选自由以下组成的组：
a)施用之后90天、180天或270天为至少78％；
b)施用之后270天为至少46％、55％、70％或95％；
c)施用之后180天为至少72％、73％、74％或95％；
d)施用之后90天为至少87％、88％、93％或95％；
e)施用之后270天为至少70％；
f)施用之后90天、180天或270天为70％至95％；
g)施用之后90天、180天或270天为至少69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％；以及
h)施用之后90天、180天或270天为69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。
在治疗肌营养不良的任何组合物或治疗肌营养不良的药物的任何用途中，在施用组合物或药物之后，受试者的细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因表达的水平增加。通过在施用组合物或药物之前和之后的肌肉活检中通过蛋白质印迹测量微小抗肌营养不良蛋白水平来检测细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因的表达。特别地，与施用组合物或药物之前的微小抗肌营养不良蛋白的水平相比，施用组合物或药物之后的微小抗肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％至至少约80％、或至少约70％至至少约90％、或至少约80％至至少约90％。例如，与施用组合物或药物之前的微小抗肌营养不良蛋白的水平相比，施用组合物之后微小抗肌营养不良蛋白水的平增加至少约70％或至少约71％或至少约72％或至少约73％或至少约74％或至少约75％或至少约76％或至少约77％或至少约78％或至少约79％或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％。
此外，通过在施用组合物或药物之前或之后的肌肉活检中通过免疫组织化学测量微小抗肌营养不良蛋白水平来检测细胞中微小抗肌营养不良蛋白基因的表达。与施用组合物或药物之前的微小抗肌营养不良蛋白的水平相比，施用rAAV之后的微小抗肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％至至少约80％、或至少约70％至至少约90％、或至少约80％至至少约90％。例如，与施用组合物或药物之前的微小抗肌营养不良蛋白的水平相比，施用组合物或药物之后微小抗肌营养不良蛋白的水平增加至少约70％或至少约71％或至少约72％或至少约73％或至少约74％或至少约75％或至少约76％或至少约77％或至少约78％或至少约79％或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％。
在治疗肌营养不良的任何组合物中，与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用rAAV之后受试者的血清CK水平降低。例如，与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物之后60天受试者的血清CK水平降低约65％至约90％或约65％至约95％或约75％至约90％或约80％至约90％或约85％至约95％或约87％至约95％或约87％至约90％。特别地，在本公开内容的治疗肌营养不良的任何组合物中，与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物之后60天受试者的血清CK水平降低约87％，或在本公开内容的治疗肌营养不良的任何组合物或治疗肌营养不良的药物的任何用途中，与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物之后60天受试者的血清CK水平降低约72％，或在本公开内容的治疗肌营养不良的任何组合物中，与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物之后60天受试者的血清CK水平降低约73％，或在本公开内容的治疗肌营养不良的任何组合物或治疗肌营养不良的药物的任何用途中，与施用组合物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物之后60天受试者的血清CK水平降低约78％，或在本公开内容的治疗肌营养不良的任何组合物或治疗肌营养不良的药物的任何用途中，与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物之后60天受试者的血清CK水平降低约95％。在治疗肌营养不良的任何组合物或治疗肌营养不良的药物的任何用途中，与施用组合物或药物之前的微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的数量相比，施用组合物或药物之后受试者的肌肉组织中的微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加。例如，通过在施用组合物或药物之前和之后的肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量微小抗肌营养不良蛋白水平来检测微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。
在治疗肌营养不良的任何组合物或治疗肌营养不良的药物的任何用途中，施用组合物或药物上调DAPC蛋白(例如α-肌蛋白聚糖或β-肌蛋白聚糖)的表达。例如，与施用组合物或药物之前的α-肌蛋白聚糖的水平相比，施用组合物或药物之后受试者体内的α-肌蛋白聚糖的水平增加。此外，与施用组合物或药物之前的β-肌蛋白聚糖的水平相比，施用组合物或药物之后受试者的β-肌蛋白聚糖的水平增加。通过在施用组合物或药物之前和之后的肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量α-肌蛋白聚糖或β-肌蛋白聚糖蛋白水平来检测α-肌蛋白聚糖或β-肌蛋白聚糖的水平。
在治疗肌营养不良的任何组合物或治疗肌营养不良的药物的任何用途中，施用组合物或药物之后受试者的疾病进展被延缓，如以下任一方法所测量：六分钟步行测试、起立时间、上行4级台阶、上行和下行4级台阶、北极星行走评估(NSAA)、10米计时测试、100米计时测试、手持测力计(HHD)、计时起立行走和/或粗大运动分测试量表(Bayley-III)评分。
例如，在施用治疗肌营养不良的任何组合物或治疗肌营养不良的药物的任何用途之后，与施用rAAV之前的NSAA评分相比，施用组合物或药物之后至少270天受试者的NSAA评分改进至少1.5、2.0、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5分。而且，在任何方法中，与施用组合物或药物之前的起立时间相比，施用组合物或药物之后至少270天受试者的起立时间改进了至少约0.8秒。此外，在本公开内容的任何方法或用途中，与施用组合物或药物之前的上行4级台阶测试的时间相比，施用组合物或药物之后至少270天受试者的上行4级台阶测试的时间改进至少约1.2秒。此外，在本公开内容的任何方法或用途中，与施用组合物或药物之前的100米计时测试相比，施用组合物或药物之后至少270天受试者的100米计时测试改进至少约7秒。
在另一个方面，本公开内容提供了用于在患者细胞中表达微小抗肌营养不良蛋白基因的组合物，所述组合物包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。在又一个方面，本公开内容提供了一定剂量的SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列用于制备在患者细胞中表达微小抗肌营养不良蛋白基因的药物的用途。例如，通过在施用rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体之前和之后的肌肉活检中通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量微小抗肌营养不良蛋白水平来检测患者细胞中微小抗肌营养不良蛋白基因的表达。此外，通过检测每个细胞核中更多的载体基因组数量来测量患者的微小抗肌营养不良蛋白基因的表达，其中每个细胞核中1个载体基因组为约50％的微小抗肌营养不良蛋白表达，每个细胞核中大于1个拷贝与微小抗肌营养不良蛋白表达水平一致。例如，细胞具有每个细胞核1.2个载体拷贝、或每个细胞核1.3个载体拷贝、或每个细胞核1.4个载体拷贝、或每个细胞核1.5个载体拷贝、或每个细胞核1.6个载体拷贝、或每个细胞核1.7个载体拷贝、或每个细胞核1.8个载体拷贝、或每个细胞核1.9个载体拷贝。
在又一个方面，本公开内容提供了用于在有需要的患者中降低血清CK水平的组合物，所述组合物包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。此外，本公开内容提供了一定剂量的SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列用于制备在有需要的患者中降低血清CK水平的药物的用途。例如，与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物60天之后患者的血清CK水平降低至少约65％至约90％或约65％至约95％或约75％至约90％或约80％至约90％或约85％至约95％或约87％至约95％或约87％至约90％。特别地，与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物之后60天受试者的血清CK水平降低约87％，或与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物之后60天降低约72％，或与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物之后60天降低约73％，或与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物之后60天降低约78％，或与施用组合物或药物之前的血清CK水平相比，施用组合物或药物之后60天降低约95％。
本公开内容还提供了用于在患者肌肉组织中增加微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的组合物，所述组合物包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。此外，本公开内容提供了一定剂量的SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列用于制备在患者肌肉组织中增加微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的药物的用途。例如，通过在施用组合物或药物之前和之后的肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量抗肌营养不良蛋白水平来检测微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的数量。此外，通过检测每个细胞核中更多的载体基因组数量来测量患者的微小抗肌营养不良蛋白基因的表达，其中每个细胞核中1个载体基因组为约50％的微小抗肌营养不良蛋白表达，每个细胞核中大于1个拷贝与微小抗肌营养不良蛋白表达水平一致。例如，细胞具有每个细胞核1.2个载体拷贝、或每个细胞核1.3个载体拷贝、或每个细胞核1.4个载体拷贝、或每个细胞核1.5个载体拷贝、或每个细胞核1.6个载体拷贝、或每个细胞核1.7个载体拷贝、或每个细胞核1.8个载体拷贝、或每个细胞核1.9个载体拷贝。
在另一个方面，本公开内容提供了用于在有需要的患者中增加α-肌蛋白聚糖的表达的组合物，所述组合物包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。本公开内容还提供了一定剂量的SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列用于制备在有需要的患者中增加α-肌蛋白聚糖的表达的药物的用途。例如，通过在施用组合物或药物之前或之后的肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量α-肌蛋白聚糖蛋白水平来检测α-肌蛋白聚糖的水平。
此外，本公开内容提供了用于在有需要的患者中增加β-肌蛋白聚糖的表达的组合物，其包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列。本公开内容还提供了SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列用于制备在有需要的患者中增加β-肌蛋白聚糖的表达的药物的用途。例如，通过在施用组合物或药物之前和之后的肌肉活检上通过蛋白质印迹或免疫组织化学测量β-肌蛋白聚糖蛋白水平来检测β-肌蛋白聚糖的水平。
本公开内容还提供了一定剂量的SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6的核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体核苷酸序列用于制备治疗患有杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良的患者的药物的用途，使得药物的施用导致患者的疾病进展被延缓，如以下任一方法所测量：六分钟步行测试、起立时间、上行4级台阶、上行和下行4级台阶、北极星行走评估(NSAA)、10米计时测试、100米计时测试、手持测力计(HHD)、计时起立行走和/或粗大运动分测试量表(Bayley-III)评分。
例如，与施用组合物或药物之前的NSAA评分相比，施用组合物或药物之后至少270天受试者的NSAA评分改进至少1.5、2.0、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5分。而且，与施用组合物或药物之前的起立时间相比，施用组合物或药物之后至少270天受试者的起立时间改进了至少约0.8秒。此外，与施用组合物或药物之前的上行4级台阶测试的时间相比，施用组合物或药物之后至少270天受试者的上行4级台阶测试的时间改进至少约1.2秒。此外，与施用组合物或药物之前的100米计时测试相比，施用组合物或药物之后至少270天受试者的100米计时测试改进至少约7秒。
应当理解，具体实施方式部分(而非发明内容和摘要部分)意在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可以阐述发明人所设想的本公开内容的一个或多个但不是全部的示例性方面，因此其不意味着以任何方式限制本公开内容和所附权利要求。
以下实施例为说明而非限制的目的提供。所描述的数值范围包括每个范围内的每个整数值，并且包括所述的最低和最高整数。
实施例
实施例1
A)AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的生成
AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白质粒含有侧翼为AAV2反向末端重复序列(ITR)的人微小抗肌营养不良蛋白cDNA表达盒(参见图1)。微小抗肌营养不良蛋白构建体的特征是框内杆缺失(R4-R23)，而铰链1、2和4以及富含半胱氨酸的结构域仍然产生138kDa的蛋白质。微小抗肌营养不良蛋白(3579bp)的表达由MHCK7启动子(792bp)引导。通过移出MCK启动子并***MHCK7启动子，从rAAV.MCK.微小抗肌营养不良蛋白质粒构建该质粒。在核心启动子之后，存在用于有效转录起始的53bp内源性小鼠MCK外显子1(未翻译)，随后是SV40晚期16S/19S剪接信号(150bp)和小型5'UTR(61bp)。内含子和5’UTR源自质粒pCMVβ(Clontech)。微小抗肌营养不良蛋白盒具有紧接在ATG起始点前面的共有Kozak和用于mRNA终止的小型53bp合成多聚A信号。人微小抗肌营养不良蛋白盒包含(R4-R23/Δ71-78)结构域，如Harper等人(Nature Medicine 8,253-261(2002))先前所述。互补DNA针对人类使用进行了密码子优化，并由GenScript(Piscataway,NJ)(Mol Ther 18,109-117(2010))合成。该载体中包含的唯一病毒序列是AAV2的反向末端重复序列，这是病毒DNA复制和包装所必需的。微小抗肌营养不良蛋白盒具有用于mRNA终止的小型53bp合成多聚A信号。
先前的研究已经使用MHCK7启动子验证了心脏表达(Salva等人,Mol Ther 15,320-329(2007)和使用AAVrh74实现骨骼、膈肌和心肌表达(Sondergaard等人,Annals ofClinical and Transl Neurology 2,256-270(2015))。图1的构建体的序列被封装到AAVrh.74病毒粒子中。AAVrh.74血清型的分子克隆是从恒河猴***克隆的，并在Rodino-Klapac等人,Journal of Translational Medicine 5,45(2007)中进行了讨论。
表1显示了质粒AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白(SEQ ID NO:3)的分子特征
表1.质粒rAAV.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的分子特征
B)从编码卡那霉素(Kan)抗性的质粒生成AAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体
MHCK7.μDys.KAN的克隆是通过从MHCK7.μDys.AMP质粒和卡那霉素主链中分离MHCK7.μDys片段，并使用NEBuilder克隆工作流程对其进行退火来实现的。通过使用SnaBI进行限制性内切酶消化来分离MHCK7.μDys片段。消化在50μL总反应中于1xCutSmart缓冲液(NEB)和1μL SnaBI中在37℃下进行1小时。使用1％琼脂糖凝胶在105伏下运行1.5小时，通过电泳分离所得片段。切下对应于MHCK7.μDys***物的条带，并使用凝胶纯化试剂盒(Macherey-Nagel)进行纯化。所得片段的DNA浓度为10ng/μL。Kan主链片段通过XbaI限制性酶消化在50μL反应中使用1xCutSmart缓冲液(NEB)和1μL XbaI在37℃下消化1小时来分离。使用1％琼脂糖凝胶在105伏下运行1.5小时，通过电泳分离所得片段。切下对应于Kan主链的条带并通过凝胶纯化试剂盒(Macherey-Nagel)纯化。所得片段的DNA浓度为8.1ng/μL。使用NEB Builder克隆工作流程对两个片段进行退火，该工作流程能够连接具有重叠序列的两个片段。NEBuilder克隆反应按照制造商方案以20μL总反应体积在1xNEBuilder HiFiDNA Assembly Master Mix中使用MHCK7.μDys与卡那霉素主链的1:1比例在50℃下进行15分钟。通过向细胞中添加2.5μL克隆产物，然后在冰上放置30分钟，然后在42℃下放置30秒，再在冰上放置5分钟，将所得克隆转化到稳定感受态大肠杆菌(C3040)中。转化后，将950μL生长培养基添加到细胞中，并使其在30℃下生长1.5小时，其中以225rpm摇动。生长后，将450μL这些细胞铺在50μg/mL卡那霉素LB琼脂板上，并在干燥培养箱中于30℃下孵育过夜。从该平板中挑取菌落并在含有50μg/mL卡那霉素的LB中培养过夜。使用/>Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)从3mL该培养物中分离DNA。该DNA用于确认克隆产物。通过用PmeI、MscI和SmaI进行限制性内切酶消化，然后进行凝胶电泳来确认克隆产物。克隆产物还通过测序额外确认。所得质粒如SEQ ID NO:8所示，并显示在图14和15中。将图13的构建体的序列(其对应于SEQ ID NO:9的序列)和SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977封装到如上所述的AAVrh.74病毒体中。
实施例2
针对杜氏肌营养不良的全身基因递送临床试验
这是针对DMD受试者的使用SEQ ID NO:3、核苷酸55-5021的rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的单剂量对照试验。队列A包括六名年龄为3个月至3岁的受试者，队列B包括六名年龄为4岁至7岁的受试者。所有受试者均接受静脉内微小抗肌营养不良蛋白载体(10mL/kg中2x1014 vg/kg)。rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白在含有20mM Tris(pH8.0)、1mM氯化镁(MgCl2)、200mM氯化钠(NaCl)和0.001％泊洛沙姆188的缓冲液中配制。
在该研究中，rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白通过外周手臂静脉输注，以便它可以到达体内的所有肌肉。队列A中招募了6名年龄为3个月至3岁的DMD受试者，队列B中招募了6名年龄为4岁至7岁的DMD受试者。所有受试者均接受静脉内微小抗肌营养不良蛋白载体(10mL/kg中2x1014 vg/kg)。利用针对MHCK7启动子的引物，使用Prism 7500Taqman检测器***(PE Applied Biosystems)，使用定量PCR测定与超螺旋DNA质粒标准品相比在施用的剂量下封装的载体基因组滴度(Pozsgai等人,Mol.Ther.25(4):855-869(2017))。
受试者在全国儿童医院的儿科重症监护室(PICU)中接受了超过1小时的输液。在基因治疗之前，在筛选访视时进行了肌肉活检。受试者将在递送后90天进行第二次肌肉活检，以确定该基因是否实现缺失的抗肌营养不良蛋白的替代。基因转移后，仔细监测患者的任何治疗副作用。该监测包括在筛选访视期间以及在第0、1、7、14、30、60、90和180天以及第9、12、18、24、30和36个月的血液和尿液检测以及体检，以确保没有来自基因注射的副作用。
队列A的受试者(n＝6)年龄为3个月至3岁，并接受静脉内rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白载体(10mL/kg中2x1014vg/kg)。基因转移前一天，队列A中的受试者开始服用强的松或地夫可特1mg/kg，并维持30天，同时监测免疫反应。如果第30天呈阴性，则在1周内停止使用类固醇。如果T细胞对AAV或微小抗肌营养不良蛋白的反应>125SFC/106PBMC，则维持类固醇直至水平降至此阈值以下。
队列B的受试者(n＝6)年龄为4岁至7岁，并接受静脉内rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白载体(10mL/kg中2x1014vg/kg)。这些受试者在整个试验过程中维持稳定剂量的皮质类固醇，但如果T细胞对AAV或微小抗肌营养不良蛋白的反应>125SFC/106PBMC，则可能会在短时间内增加皮质类固醇剂量。
资格标准
该研究的纳入标准如下：
·入组年龄：队列A：3个月至7岁(含)，队列B：4至7岁(含)。
·具有移码(缺失或重复)或外显子18至58之间的过早终止密码子突变的DMD基因的分子特征。
·CK升高>1000U/L
·队列A受试者：粗大运动的Bayley-III运动评估低于平均水平，定义为≤9的量表分数
·队列B：100米计时测试低于平均水平，定义为<预测值的80％
·任何种族群体的男性。
·能够配合运动评估测试。
·队列A受试者：既往未接受皮质类固醇治疗。
·队列B受试者：筛选前至少12周口服皮质类固醇的稳定剂量当量，并且剂量预计在整个研究期间保持恒定(适应体重变化的修改除外)。
该研究的排除标准如下：
·基于临床观察的活动性病毒感染。
·心肌病体征，包括射血分数低于40％的超声心动图。
·HIV感染、乙型肝炎或丙型肝炎感染的血清学证据。
·自身免疫性疾病的诊断(或持续治疗)。
·被认为具有临床意义的异常实验室值
·PI认为伴随疾病或对长期药物治疗的需要会给基因转移带来不必要的风险。
·通过ELISA免疫测定确定AAVrh74或AAV8抗体滴度>1:400的受试者。
·研究者认为可能损害受试者遵守方案所需测试或程序的能力或损害受试者的健康、安全或临床可解释性的医疗状况或情有可原的情况。
·基因转移访视前4周内出现严重感染(例如肺炎、肾盂肾炎或脑膜炎)(入组可能会推迟)。
·在针对本研究进行筛选之前的最后6个月内，接受过实验性或其他形式的任何研究药物(皮质类固醇除外)或外显子跳跃药物(包括ExonDys)。
·接受过任何类型的基因治疗、基于细胞的治疗(例如干细胞移植)或CRISPR/Cas9治疗。
·家人不想向初级保健医生和其他医疗提供者透露患者的研究参与情况。
结果指标
主要结果指标是基于发生不良事件的参与者的数量的安全性(时间范围：3年)。监测不良反应并对其严重程度和与研究文章的相关性进行评分。
次要结果指标如下：
粗大运动分测试量表(Bayley-III)评分(时间范围：筛选，第30天-3年)：粗大运动量表评分测量了运动发育。从第30天开始到3年，每次随访时对队列A进行Bayley-III粗大运动分测验评分。筛选时年龄为43-47个月(含)的任何受试者具有与42个月大儿童的标准数据进行比较的计算出的量表评分。Bayley-III提供了1-42个月大儿童的规范数据。
100米计时测试(100m)的物理治疗评估(时间范围：筛选，第30天-3年)：100m是队列B的主要运动结果。100米计时测试是为队列A在孩子3岁时启动的探索性结果。
北极星行走评估(NSAA)的物理治疗评估(时间范围：筛选，第30天-3年)：北极星行走评估(NSAA)是为队列A在孩子四岁时以及为队列B启动的探索性结果。NSAA测量患有杜氏肌营养不良的年轻男孩的行走质量。
针对儿童修改的计时起立行走(TUG)物理治疗评估(时间范围：筛选，第30天-3年)：队列B的探索性结果包括针对儿童修改的计时起立行走(TUG)。
上行和下行4个台阶的物理治疗评估(时间范围：筛选，第30天-3年)：队列B的探索性结果将包括上行和下行4个台阶。
手持测力计(HHD)的物理治疗评估(时间范围：筛选，第30天-3年)：队列B的探索性结果包括针对膝伸肌和膝屈肌以及肘屈肌和肘伸肌的手持测力计(HHD)。
通过免疫荧光进行微小抗肌营养不良蛋白基因表达定量(时间范围：筛选，第90天)：通过免疫荧光对微小抗肌营养不良蛋白基因表达水平进行定量，并在肌肉活检前后进行比较。
通过蛋白质印迹进行微小抗肌营养不良蛋白基因表达定量(时间范围：筛选，第90天)：通过蛋白质印迹分析对微小抗肌营养不良蛋白基因表达水平进行定量，并在肌肉活检前后进行比较。
基因治疗后CK的降低(时间范围：3年)：循环血液中CK水平的降低。
心脏磁共振成像(1年时)。
微小抗肌营养不良蛋白基因表达
通过免疫荧光(IF)纤维强度分析和定量了微小抗肌营养不良蛋白表达从基线的变化。如表2所示，受试者1(5岁)在施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白后，显示腓肠肌活检的肌纤维中微小抗肌营养不良蛋白的78％表达；受试者2(4岁)在施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白后，显示腓肠肌活检的肌纤维中微小抗肌营养不良蛋白的73.5％表达；和受试者3(6岁)在施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白后，显示腓肠肌活检的肌纤维中微小抗肌营养不良蛋白的77.0％表达。受试者4(4岁)在施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白后，显示腓肠肌活检的肌纤维中微小抗肌营养不良蛋白的96.2％表达。所有患者都显示出正确地定位于肌肉肌膜的转导的微小抗肌营养不良蛋白的稳健表达，如通过免疫组织化学测量的(图7)。
表2
还通过定量如通过活检肌肉组织的蛋白质印迹测量的微小抗肌营养不良蛋白表达来评估微小抗肌营养不良蛋白基因表达从基线到第60天的变化。如图8A和8B所示，蛋白质印迹分析检测到受试者1(5岁)、受试者2(4岁)和受试者3(6岁)中的微小抗肌营养不良蛋白表达。图8C提供了检测受试者4(4岁)中微小抗肌营养不良蛋白表达的蛋白质印迹分析。如通过蛋白质印迹测量的，所有治疗后活检均显示微小抗肌营养不良蛋白的稳健水平，与使用方法1的正常情况相比，对于受试者1-4具有74.3的平均值，并且与根据针对脂肪和纤维化组织进行调整的方法2的正常情况相比，具有95.8％。
对于每个受试者，测量了肌纤维每个核的载体基因组拷贝。如表3所示，在施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白后，每个受试者的每个核酸酶的载体基因组拷贝大于1。该载体的一个拷贝指示微小抗肌营养不良蛋白基因的约50％表达。在受试者1-3中测量到每个细胞核的平均1.6个载体拷贝，这与观察到的高微小抗肌营养不良蛋白表达水平一致。当包含受试者4的值时，平均载体拷贝数/μgDNA>105，其中每个细胞核具有平均3.3个载体拷贝。
表3
受试者 载体拷贝数/μg DNA 每个核的拷贝数
1 >105 1.7
2 >105 1.3
3 >105 1.9
在施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白之前和之后通过免疫组织化学测量肌肉活检组织中的α-肌聚糖和β-肌聚糖的蛋白质水平。rAAVrh74.MHCK7的施用也导致受试者中DAPC蛋白的上调。如图9所示，在受试者1(图9A)、受试者2(图9B)和受试者3(图9C)中，与施用rAAVrh74.MHCK7之前肌肉活检中这些蛋白质的水平相比，肌肉活检组织中α-肌聚糖和β-肌聚糖的表达增加。
循环血清CK水平
静脉输注rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白载体(10mL/kg中2x1014 vg/kg)后，每30天获取血液样品。每次访视时测量CK水平，并与施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白之前获得的基线水平(访视第0天)进行比较。下表4提供了基线血清CK水平(单位/升)。如图10所示，施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白2个月后，循环血清CK水平降低约87％。所有受试者的血清肌酸激酶(CK)水平均显著下降，治疗后2个月时CK的平均下降超过87％(n＝3)。CK是一种与肌肉损伤相关的酶，并且DMD患者一致地表现出高水平的CK。事实上，显著升高的CK通常被用作DMD的初步诊断工具，然后进行确认性基因检测。
表4和图10提供了每个受试者的CK水平。图11提供了随时间变化的平均CK水平，并表明在施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白后，平均CK水平随时间显著降低。27,064U/L的平均基线CK水平(表4的平均值)下降约63％至9,982U/L的平均值(平均值，第270天，表5)。
表4
表5：从基线到第270天的CK水平的变化
功效评估
除了微小抗肌营养不良蛋白和CK水平之外，还通过以下功能测试来测量功效：从地板起立的时间、上行4级台阶、北极星行走评估(NSAA)、起立时间测试、4次上楼梯测试、10米计时测试(10m)和100米计时测试(100m)。数据在下表6和7中提供，并且该数据证明在施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白后9个月时一致的持久改善。图12中还提供了随着时间推移的NSAA改善。
表6：从基线到第270天的NSAA变化
表7：从基线到第270天的变化
安全性评估
研究中没有观察到严重不良事件(SAE)。三名受试者具有升高的γ-谷氨酰转移酶(GGT)，其在一周内使用增加的类固醇来缓解并恢复到基线水平。没有其他具有临床意义的实验室发现。在治疗的第一周，患者通常有伴随增加的类固醇给药的短暂的恶心。这与肝酶升高或任何其他异常无关。
实施例3
随机双盲安慰剂对照全身基因递送I/IIa期临床试验
这是一项针对DMD受试者的使用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的随机双盲单剂量试验。该研究包括24名年龄为4至7岁的受试者。受试者在入组时被随机分配以接受治疗或安慰剂。12名受试者接受静脉内rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白载体(约10mL/kg中2x1014 vg/kg)，13名受试者接受10mL/kg安慰剂(乳酸林格氏菌)。安慰剂受试者将在最后一名治疗的受试者给药一年后以与12名先前治疗的受试者相同的方式重新接受治疗。受试者接受携带微小抗肌营养不良蛋白的rAAV或乳酸林格氏菌的在大约1小时内的输注。对腓肠肌进行治疗前和治疗后(90天)针刺肌肉活检。
本研究的主要目的是评估通过外周肢体静脉对DMD受试者静脉内施用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的安全性。通过血液学、血清化学、尿液分析、对rAAVrh74和微小抗肌营养不良蛋白的免疫反应的变化以及报告的病史和症状观察来评估安全终点。抗肌营养不良蛋白基因表达与安全性一起作为主要结果指标。使用经过验证的免疫荧光和免疫印迹测定进行定量。基因治疗后CK的降低用作次要结果。功效通过以下功能测试来测量：起立时间、上行4级台阶、北极星行走评估(NSAA)、10米计时测试(10m)、100米计时测试(100m)。探索性测量包括膝伸肌和膝屈肌、肘屈肌和肘伸肌的手持式测力计(HHD)。
该研究的纳入标准如下：
·入组年龄：4-7岁(含)。
·具有移码(缺失或重复)或外显子18至58之间的过早终止密码子突变的DMD基因的分子特征。
·有症状的肌营养不良的指征：CK升高>1000U/L且低于100米步行测试的平均预测时间百分比
·任何种族群体的男性都有资格。
·能够配合运动评估测试。
·筛选前至少12周口服皮质类固醇的稳定剂量当量，并且剂量预计在整个研究期间保持恒定(适应体重变化的可能修改除外)。
该研究的排除标准如下：
·基于临床观察的活动性病毒感染。
·心肌病体征，包括射血分数低于40％的超声心动图。
·HIV感染、乙型肝炎或丙型肝炎感染的血清学证据。
·自身免疫性疾病的诊断(或持续治疗)。
·被认为具有临床意义的异常实验室值(GGT>3XULN、胆红素≥3.0mg/dL、肌酐≥1.8mg/dL、Hgb<8或>18g/Dl；WBC>18,500/cmm)、血小板≤50,000。
·PI认为伴随疾病或对长期药物治疗的需要会给基因转移带来不必要的风险。
·通过ELISA免疫测定确定AAVrh74或AAV8抗体滴度>1:400的受试者。如果筛选时终点滴度呈阳性，则可以在排除之前重复测试。
·研究者认为可能损害受试者遵守方案所需测试或程序的能力或损害受试者的健康、安全或临床可解释性的医疗状况或情有可原的情况。
·基因转移访视前4周内出现严重感染(例如肺炎、肾盂肾炎或脑膜炎)(入组可能会推迟)。
·在针对本研究进行筛选之前的最后6个月内，接受过实验性或其他形式的任何研究药物(皮质类固醇除外)或外显子跳跃药物(包括ExonDys)。
·接受过任何类型的基因治疗、基于细胞的治疗(例如干细胞移植)或CRISPR/Cas9治疗。
·家人不想向初级保健医生和其他医疗提供者透露患者的研究参与情况。
功效评估
抗肌营养不良蛋白基因表达与安全性一起作为主要结果指标。使用经过验证的免疫荧光和免疫印迹测定进行定量。基因治疗后CK的降低是次要结果。此外，功效通过以下功能测试来测量：从地板起立的时间、上行4级台阶、北极星行走评估(NSAA)、10米计时测试(10m)、100米计时测试(100m)]。探索性测量包括膝伸肌和膝屈肌、肘屈肌和肘伸肌的手持式测力计(HHD)。
使用超声引导下的肌肉活检来定量比较基线与第90天的转基因表达。活检在与原始活检相同的肌肉上但在相对的腿上进行。在所有受试者给药后一年，安慰剂交叉受试者将在第1次访视时重新启动研究时间表。安慰剂受试者在第二次基线筛选时不会进行以下项目：心脏MRI和肌肉活检。安慰剂受试者在第90天接受肌肉活检(总共3次肌肉活检)。使用间接免疫荧光(IF)对冰冻切片进行针对抗肌营养不良蛋白的染色。进行全玻片扫描，并使用经过验证的图像扫描和MuscleMapTM分析算法对微小抗肌营养不良蛋白强度和阳性纤维百分比进行量化。肌肉形态测量是在不知情的情况下进行的，包括纤维尺寸直方图。盲法冷冻肌肉活检切片用于使用经过验证的蛋白质印迹方法对微小抗肌营养不良蛋白进行定量蛋白质分析。
腓肠肌的肌肉穿刺活检(除非PI认为对特定受试者有禁忌，在这种情况下PI将选择替代肌肉进行活检)用于量化微小抗肌营养不良蛋白表达。
功效分析
主要疗效终点是通过活检肌肉组织的蛋白质印迹测量的微小抗肌营养不良蛋白表达量从基线到第90天的变化。主要功效终点的治疗组差异通过协方差分析(ANCOVA)模型进行评估，其中治疗作为固定因素，基线值作为协变量。Wilcoxon秩和检验作为支持性分析进行。通过免疫荧光(IF)纤维强度对微小抗肌营养不良蛋白表达从基线的变化进行类似分析。
支持性功效终点包括从地板起立时间、上行4级台阶、NSAA、10米定时测试(10m)、100米定时测试(100m)的从基线到每个预定评估的变化以及CK的变化。探索性材料包括针对膝伸肌和膝屈肌以及肘屈肌和肘伸肌的HHD。使用ANCOVA模型评估治疗组差异，其中治疗作为固定因素，基线值作为协变量。Wilcoxon秩和检验作为支持性分析进行。
实施例4
上述实施例2和3中描述的试验和研究可替代地利用SEQ ID NO:9所示；如SEQ IDNO:8，核苷酸1-4977所示；或如SEQ ID NO:6，核苷酸56-5022所示的rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体进行。
实施例5
pAAV.MCK.微小抗肌营养不良蛋白构建体的生成
通过将驱动密码子优化的人微小抗肌营养不良蛋白cDNA序列的MCK表达盒***到AAV克隆载体psub201(Samulski,R.J.等人,J.Virol.61(10):3096-3101(1987))中，构建了pAAV.MCK.微小抗肌营养不良蛋白质粒。构建体中包含肌肉特异性调节元件，以驱动肌肉特异性基因表达。该调节元件包含与351bp MCK核心启动子(近端)融合的小鼠MCK核心增强子(206bp)。在核心启动子之后，该构建体包含用于有效转录起始的53bp内源性小鼠MCK外显子1(未翻译)，随后是SV40晚期16S/19S剪接信号(97bp)和小型5'UTR(61bp)。内含子和5’UTR源自质粒pCMVβ(Clontech)。微小抗肌营养不良蛋白盒具有紧接在ATG起始点前面的共有Kozak和用于mRNA终止的小型53bp合成多聚A信号。人微小抗肌营养不良蛋白盒包含(R4-R23/Δ71-78)结构域，如Harper等人,Nat.Med.8(3):253-61(2002)先前所述。
pAAV.MCK.微小抗肌营养不良蛋白质粒含有侧翼为AAV2反向末端重复序列(ITR)的人微小抗肌营养不良蛋白cDNA表达盒(参见图5)。该序列被封装到AAVrh.74病毒体中。AAVrh.74血清型的分子克隆是从恒河猴***克隆的，并在Rodino-Klapac等人,JTransl.Med.5:45(2007)中进行了描述。
实施例6
使用混合接种训练扩增产生rAAV
以下过程可用于产生本文所述的rAAV构建体。
HEK-293细胞在贴壁条件下传代四次。在进入倒数第二次扩增培养之前，收获细胞并离心以洗去血清(@300g，5分钟)，并以0.5+E6个细胞/mL的接种密度重悬于悬浮摇瓶中的无血清生长培养基(EXPI293)中。然后让它们在48-72小时内生长和数量扩增。然后收集悬浮细胞并接种在摇瓶或WAVE袋中，取决于生物反应器接种所需的活细胞数量。72小时结束时，使用细胞计数设备测定活细胞的浓度。然后，将含有优选的总活细胞的必要体积添加至含有DMEM和10％FBS的贴壁生物反应器中。适当添加额外的FBS以考虑添加的无血清悬浮培养物体积，使得最终FBS浓度维持在10％。
如图18所示，接种训练和贴壁***中的细胞活力相似。关于活细胞密度(VCD)，在混合接种训练***中，第6次传代后的VCD高于第1次传代后的VCD(图19A)，这与贴壁***相当(图19B)。
在接种贴壁生物反应器之后，用带有本文所述的微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒(包括例如SEQ ID NO:8的转基因质粒中包含的SEQ ID NO:9所示的构建体)瞬时转染贴壁培养物。除了转基因质粒外，还包括rep/cap质粒(AAV2 rep/rh74 cap)和辅助质粒。在所需的生长周期后，通过细胞裂解和柱层析收获rAAV颗粒。
在一些方面，rAAV通过悬浮播种工艺产生，包括：
(a)在N-2容器中用包含血清的第一生长培养基培养细胞；
(b)从第一培养基中移出细胞；
(c)将来自步骤(b)的细胞接种到N-1容器中的不含血清或血清浓度低于第一培养基的第二培养基中；
(d)在悬浮条件下培养N-1容器中的细胞；以及
(e)用来自步骤(d)的细胞接种生物反应器中的第三培养基。
在一些方面，悬浮播种工艺还包括：
(f)用包含rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒、包含AAV rep基因和AAV cap基因的质粒以及腺病毒辅助质粒转染细胞。
在一些方面，包含rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒包含：SEQ ID NO:9的核酸序列、SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021、或SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977。在一些方面，包含AAV rep基因和AAV cap基因的质粒包含AAV2 rep基因和rAAVrh74cap基因。
在一些方面，腺病毒辅助质粒包含腺病毒5E2A、E4ORF6和VA RNA基因。
在一些方面，悬浮播种工艺还包括：(g)裂解细胞。在一些方面，通过冻融、固体剪切、高渗和/或低渗裂解、液体剪切、超声、高压挤出、去污剂裂解或其组合来裂解细胞。
在一些方面，悬浮播种工艺进一步包括：(h)通过至少一个柱色谱步骤纯化rAAV。在一些方面，至少一个柱色谱步骤包括阴离子交换色谱或尺寸排阻色谱或其组合。
实施例7
使用商业代表性材料来评估rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体在患有杜氏肌营养不良的受试者中的安全性和表达的一项开放标签、全身基因递送研究
这是一项在患有杜氏肌营养不良的男孩中进行的1b期开放标签研究，其使用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的商业代表性材料。最初，招募了20名患者，并且该实施例7提供了来自前11名年龄小于8岁的患者的数据(例如，2名患者年龄4-5岁；9名患者年龄6-7岁)(队列1；最多20名年龄≥4岁至<8岁的男性DMD能行走的受试者)(表7)。该研究后来扩大到包括队列2(约6名年龄≥8至<18岁的男性DMD能行走的受试者)和队列3(约6名男性DMD不能行走的受试者)，如实施例8中进一步描述的。
表8：基线人口统计数据：队列1的前11名患者
主要目标是评估输注后12周(第1部分)来自rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体(例如商业代表性材料)的微小抗肌营养不良蛋白表达(如通过活检肌肉组织的蛋白质印迹测量的)，相应终点为通过蛋白质印迹测量的微小抗肌营养不良蛋白表达量从基线到第12周(第1部分)的变化。次要目标是评估：(1)第12周时通过免疫荧光(IF)纤维强度评估的微小抗肌营养不良蛋白的表达；(2)第12周时通过抗肌营养不良蛋白阳性纤维的IF百分比(PDPF)评估的微小抗肌营养不良蛋白表达；和(3)安全性。
适用于实施例7和8的研究纳入标准如下：
受试者必须满足以下所有标准才有资格参与本研究：
1.仅队列1(行走<8年)：出生时为男性，可行走，筛选时年龄≥4至<8岁，并且筛选访视时NSAA评分>17且≤26。
2.仅队列2(行走≥8年)：出生时为男性，可行走，筛选时年龄≥8至<18岁，并且筛选访视时NSAA评分≥15且≤26。
3.仅队列3(不能行走)：出生时为男性，并且至少9个月不能行走，NSAA步行评分为“0”，并且在筛选访视时无法执行10MWR，并且具有≥2的PUL条目评分。开始丧失行走能力的定义是参与者或护理人员报告的连续使用轮椅的年龄，近似于最近的月份。
4.在筛选之前，基于临床结果记录和之前使用临床诊断基因测试进行的确认性基因测试，对DMD做出明确诊断。
5.有症状性肌营养不良的指征：
·CK升高>1000U/L且
·仅队列1和2(行走)：低于100MWR预测时间的95％。
6.能够配合运动评估测试。
7.筛选前至少12周口服皮质类固醇的每周稳定剂量当量，并且预计在整个研究第一年中剂量保持恒定(适应体重变化的修改除外)。
8.通过ELISA测定，rAAVrh74抗体滴度≤1:400(即未升高)。
9.性活跃的受试者必须同意在整个研究期间使用安全套，并且女性***还必须使用医学上可接受的避孕措施(例如口服避孕药)。
10.具有父母或法定监护人或者是年龄≥18岁的受试者，其能够理解并遵守研究访视时间表和所有其他方案要求。
11.愿意提供知情允许或同意(如果适用)，并且有父母或法定监护人，或者是年龄≥18岁的受试者，其愿意提供书面知情同意以参加研究。
该研究的排除标准如下：
符合以下任何标准的受试者将被排除在本研究之外：
1.具有筛选ECHO的<40％的左心室射血分数或心肌病的临床体征和/或症状。
2.仅队列2和3(行走≥8年和不能行走)：筛选时FVC<预测值的50％和/或需要夜间通气支持。
3.在第1天之前3个月内的大手术或在本研究期间的任何时间计划进行手术。
4.存在除DMD之外的任何其他显著遗传疾病。
5.具有当前、慢性或活动性人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎或乙型肝炎感染的血清学证据。
6.被诊断患有自身免疫性疾病。
7.患有伴随疾病或需要长期药物治疗，研究者认为这会给基因转移带来不必要的风险。
8.研究者认为可能损害受试者遵守方案所需测试或程序的能力或损害受试者的健康、安全或临床可解释性的医疗状况或情有可原的情况。
9.第1天前4周内出现有症状的感染(例如上呼吸道感染、肺炎、肾盂肾炎、脑膜炎)。
10.表现出研究者认为可能影响运动发育的认知迟缓或障碍。
11.按照规定的时间范围使用以下任何一种疗法进行治疗：
·任何时候：
–基因治疗
–基于细胞的治疗(例如干细胞移植)
–CRISPR/Cas9，或任何其他形式的基因编辑
·从第一天起的12周内：
-使用人类生长因子或vamorolone
·从第一天起的6个月内：
-任何研究药物
-仅队列1：旨在增加抗肌营养不良蛋白表达的任何治疗(例如TranslarnaTM、EXONDYS 51、VYONDYS 53、VILTEPSOTM)。注：接受这些治疗的队列2和3中的受试者预计在第1天之前停止。旨在增加抗肌营养不良蛋白表达的治疗可能在第72周后恢复和/或开始
12.在第1天访视后4周内接受过活病毒疫苗，或在第1天访视后2周内接受过灭活疫苗，或预计在第1天后的前3个月内接受疫苗接种。
13.具有被认为具有临床意义的异常实验室值，包括但不限于：
·γ-谷氨酰转移酶(GGT)>2倍正常上限(ULN)
·总胆红素>ULN。注意，不排除被认为是由吉尔伯特综合征引起的总胆红素升高。
·白细胞计数>18,500/μl
·血小板≤150,000/μL
14.受试者或家人不想向全科医生/初级保健医生和其他医疗提供者披露受试者的研究参与情况。
研究者认为，受试者不太可能遵守研究方案。所有受试者均通过单次IV输注接受rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体(1.33×1014vg/kg)(例如商业代表性材料)。
功效评估：
在基线和第12周从所有受试者收集用于评估微小抗肌营养不良蛋白表达的肌肉活检。使用开放活检或VACORA核心活检收集肌肉活检。活检需要从内侧腓肠肌收集肌肉组织。如果内侧腓肠肌不可行，则需要申办者事先批准才能使用替代肌肉。
活检样品用于通过蛋白质印迹、IF强度和PDPF来量化转基因表达。
每个核的平均载体基因组拷贝数以及从基线的变化被确定为3.87(±2.4)。通过蛋白质印迹测定，正常微小抗肌营养不良蛋白表达的平均百分比和从基线的变化被确定为55.4％(±43.4)。通过免疫荧光测定，抗肌营养不良蛋白阳性纤维的平均百分比被确定为70.5％(从基线的变化为57.7％(±22.2))，平均强度为116.9％(从基线的变化为75.9％±46.4)。这些结果与施用了实施例4中描述的材料的实施例3的安慰剂组患者一致(例如，每个核的平均载体拷贝数-2.62；正常表达的％-51.7％；抗肌营养不良蛋白阳性纤维的％-79.2％；％强度100.6％)。
图20以图形方式显示了来自队列1(用rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白治疗的前11名患者)的平均NSAA评分。前11名患者从基线提高了3分。6至7岁儿童(n＝9)从基线提高2.9分。每个时间点代表11名患者。
商业代表性材料的安全性与rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的先前经验一致。在11名患者中观察到79起治疗引起的不良事件。最常见的不良事件是呕吐，通常在第一周内发病，症状较轻，并接受标准止吐药治疗。肝酶的增加是短暂的，并且对类固醇有反应，其中任何患者都没有肝功能受损的体征。观察到两名患者的严重不良事件并得到完全解决。一名患者转氨酶升高，并接受静脉内类固醇治疗。一名患者出现恶心和呕吐。没有任何不良事件提示补体介导的事件。
总体而言，rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的特征通过商业代表性材料得到证实。观察到稳健的转导(例如，每个核平均载体基因组拷贝数为3.87)。观察到平均稳健表达并正确定位于肌膜(例如，蛋白质印迹-55.4％；阳性纤维-70.5％；强度-116.9％)。通过施用具有商业代表性的材料，观察到安全、耐受性良好且一致的安全性特征。未观察到补体临床表现。总的来说，这些结果证实了制造过程和分析，并且足以供应杜氏营养不良症人群。
实施例8
实施例7中描述的试验和研究扩展到3个队列中的约32名受试者：队列1由最多20名年龄≥4岁至<8岁的男性DMD能行走的受试者组成；队列2由约6名年龄≥8岁至<18岁的男性DMD能行走的受试者组成；队列3由约6名男性DMD不能行走的受试者组成。
每个队列中的前2名入组受试者将是哨点受试者，给药间隔至少1周。在组合的队列2和队列3中，至少3名体重<50kg的受试者将被纳入，并且至少3名体重≥50kg的受试者将被纳入。该研究将由以下4个阶段组成：
1.长达约3周的筛选期(输注前)，在此期间将评估疾病特征和基线治疗，并完成输注前评估。
2.基线期(输注前)，其从确认资格时开始，在第一天输注前一天结束，在此期间完成基线评估。
3.输注期，在此期间将在获得rAAVrh74酶联免疫吸附测定(ELISA)样品后31天内向所有受试者施用开放标签rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的单次静脉内(IV)输注。第1天体重<70kg的受试者将接受IVrAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白(1.33×1014vg/kg)；第1天体重≥70kg的受试者将接受9.31x1015 vg的rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白总固定剂量，相当于70kg受试者的1.33x1014 vg/kg的剂量。从输注前一天开始，除了输注后至少60天的基线稳定口服皮质类固醇剂量外，受试者每天还将接受至少1mg/kg的糖皮质激素(强的松等效物)；1mg/kg/天添加的类固醇给药后将是60mg/天的每日总剂量(在相关GGT增加和/或其他临床显著肝功能异常情况下添加的类固醇除外)。如果确认GGT水平≥150U/L或输注后出现其他有临床意义的肝功能异常，则输注后添加的用于免疫抑制的糖皮质激素应增加至每天2mg/kg(或者如果受试者接受60mg/天固定剂量，则应增加至120mg/天)。研究者可能会对免疫抑制治疗进行后续调整，以应对随后发生的急性肝损伤或其他不良事件。如果肝脏生化指标(包括相对于基线的GGT、胆红素和ALT)严重或十分严重地升高，或者分别对2mg/kg/天或120mg/天没有反应的升高，则必须咨询肝病专家。在这种情况下，可以考虑IV推注类固醇。实施例8和实施例7中所示的剂量是使用线性化DNAqPCR标准确定的。另外，本文所示的剂量是利用超螺旋DNAq PCR标准确定的。例如，实施例7和8中所示的1.33×1014vg/kg的剂量对应于本文另外描述的2×1014vg/kg的剂量。上述实施例7和8中描述的试验和研究利用SEQ ID NO:9中所示；如SEQ ID NO:8，核苷酸1-4977所示；或如SEQ ID NO:6所示；核苷酸56-5022的rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体进行。
4.260周的随访期(输注后)，在此期间将评估安全性、有效性和表达参数。受试者将被期望参加远程和亲自访视以完成所需的程序/评估。随访期的第1部分将从输注后(第1天)开始直至第12周。随访期的第2部分将从第12周后开始直至第260周。输注后的前12周(第1部分)需要频繁访视(几乎每周一次)。根据研究者的临床判断，允许进行额外的计划外访视。对于完成研究的受试者，最后一次研究访视将在第260周进行。对于提前终止输注后随访的受试者，将需要提前终止访视；然而，应强烈鼓励每位受试者继续研究随访直至输注后260周。
该研究进一步扩大到包括队列4，该队列由约6名≥3岁至<4岁的男性DMD能行走的受试者组成。队列4中的受试者(其在筛选时未服用针对其DMD的口服皮质类固醇)在输注前1周开始1.5mg/kg/天的强的松/强的松龙，其在输注后将持续至少60天。
以下排除标准仅针对队列1和4指定：任何旨在增加抗肌营养不良蛋白表达的治疗(例如TranslarnaTM、EXONDYS 51、VYONDYS 53、VILTEPSOTM)。旨在增加抗肌营养不良蛋白表达的治疗可以在第72周后恢复和/或开始。
实施例9
基因诊断
在另外的研究中，或者在上述研究中，如果适用的话，受试者必须在基于临床发现的记录和使用临床诊断基因测试的先前验证性基因测试进行筛选之前具有DMD的明确诊断。
基因测试用于对患者针对人类抗肌营养不良蛋白(DMD)基因中至少一种突变进行基因分型。如本文所用，“基因分型”是指确定在基因组内的一个或多个位置处细胞和/或受试者的特定等位基因组成的过程，通过确定该位置的核酸序列。基因分型是指核酸分析和/或在核酸水平上的分析。
一方面，治疗本文所述的DMD的方法进一步包括在将组合物施用于人类受试者之前对所述人类受试者的人类抗肌营养不良蛋白(DMD)基因进行基因分型。
在一些方面，对受试者的人抗肌营养不良蛋白基因(DMD)进行基因分型，以表征适合用本文公开的组合物治疗的基因的突变。
在一些方面，对受试者的DMD基因的外显子18至79中的至少一种突变进行基因分型。具体而言，对受试者针对预计导致患者中抗肌营养不良蛋白的缺失的突变进行基因分型。例如，在一些方面，针对完全包含在外显子18至79之间的DMD基因中的移码缺失、移码重复、过早终止或其他致病性变异对受试者进行基因分型。这些突变中的至少一种的鉴定表明患者有资格接受根据本公开内容的治疗。
在一些方面，DMD基因的患者基因分型可以提供表明受试者不适合根据本公开内容的治疗的结果。例如，显示外显子1-17之间或包含外显子1-17的突变、框内缺失、框内重复、意义不确定的变异(“VUS”)、完全包含在外显子45内的突变的基因分型结果表明该患者不适合根据本公开内容的治疗。
许多基因分型技术是本领域技术人员已知的。
实施例10
旨在评估Delandistrogene Moxeparvovec在杜氏肌营养不良受试者中的安全性和有效性的3期跨国、随机、双盲、安慰剂对照全身基因递送研究。
这是一项在大约120名≥4岁至<8岁的男性DMD能行走的受试者中的研究药物rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白(也如上文实施例6-8中所述)的全身基因递送的随机、双盲、安慰剂对照两部分研究。随机化根据按随机化时的年龄组(≥4至<6岁vs.≥6至<8岁)和筛选时NSAA总分(≤22vs.>22)进行分层；随机化时，至少50％的受试者必须被随机分入≥4至<6岁年龄组。所有患者将有机会在第1部分或第2部分中接受静脉内(IV)研究药物(1.33×1014vg/kg)。在治疗臂中，参与者将在第1天接受研究药物的单次静脉内(IV)输注。然后，参与者将在第2年接受匹配的安慰剂的单次IV输注。在安慰剂臂中，参与者将在第1天接受匹配的安慰剂IV输注。然后，参与者将有机会在第2年接受研究药物的单次IV输注。该研究将由以下4个阶段组成：
·筛选期(输注前)，其在第一天输注前最多31天开始，并且在此期间将评估疾病特征和基线治疗，并完成输注前评估。
·基线期(输注前)，其在确认资格时开始，并在第一天输注前一天结束，在此期间完成基线评估。
·输注期，在此期间将在获得rAAVrh74酶联免疫吸附测定(ELISA)样品后31天内施用盲法研究药物或安慰剂的单次静脉内(IV)输注。在第1部分的输注期中，大约60名受试者将接受IV研究药物(1.33×1014vg/kg；如使用线性DNA qPCR标准确定的)，并且大约60名受试者将接受安慰剂(生理盐水、0.9％氯化钠溶液)。在第2部分的输注期中，在第1部分中接受安慰剂的受试者将接受IV研究药物，在第1部分中接受研究药物的受试者将接受安慰剂。除不设盲的现场药剂师外，所有受试者、父母/照顾者、研究者和现场工作人员将对受试者治疗(研究药物或安慰剂)不知情。从输注前一天开始，所有受试者将接受额外的糖皮质激素(强的松等效物)至少60天。
·104周的随访期(第1部分输注后)，在此期间将在第1部分和第2部分中评估安全性和有效性参数。受试者将预计参加远程和亲自访视以完成所需的程序/评估。根据研究者的临床判断，允许进行额外的计划外访视。对于完成研究的受试者，最后一次研究访视将在第2部分第52周进行。对于提前停止输注后随访的受试者，将需要结束研究/提前终止访视；然而，应强烈鼓励每位受试者继续研究随访直至每次输注后52周。
纳入/排除标准：
纳入标准：
受试者必须满足以下所有标准才有资格参与本研究：
1.出生时为男性，可行走，随机化时年龄≥4至<8岁。
2.在筛选之前，基于临床结果记录和之前使用临床诊断基因测试进行的确认性基因测试，具有DMD的明确诊断。遗传报告必须描述预计导致抗肌营养不良蛋白缺失的完全包含在外显子18至79之间(含)的DMD基因中的移码缺失、移码重复、过早终止(“无义”)、典型剪接位点突变或其他致病性变异。
a.外显子1-17之间或包括外显子1-17的突变不符合资格。
b.框内删除、框内重复和意义不确定的变异(“VUS”)不符合资格。
c.完全包含在外显子45内(含)的突变不符合资格。
3.能够配合运动评估测试。
4.在筛选访视时NSAA评分>16且<29。
5.在筛选访视时从地板起立的时间<5秒。
6.筛选前至少12周内稳定每日剂量的口服皮质类固醇，并且在整个研究过程中剂量和治疗方案预计保持不变(适应体重变化的修改除外)。
7.通过ELISA测定，rAAVrh74抗体滴度<1:400(即未升高)。
8.性活跃的受试者必须同意在整个研究期间使用安全套，并且女性***还必须使用医学上可接受的避孕措施(例如口服避孕药)。
9.具有父母或法定监护人，其能够理解并遵守研究访视时间表和所有其他方案要求。
10.愿意提供知情同意书(如果适用)，并且有愿意为受试者提供知情同意书以参与研究的父母或法定监护人。
排除标准
符合以下任何标准的受试者将被排除在本研究之外：
1.具有筛选ECHO时<40％的左心室射血分数或心肌病的临床体征和/或症状。
2.在第1天之前3个月内的大手术，或在本研究期间任何时间会干扰研究的计划进行的手术或程序。
3.存在研究者认为造成基因转移的不必要的风险或在研究者看来可能损害受试者遵守方案所需测试或程序的能力或损害受试者的健康、安全或临床可解释性的医疗状况或情有可原的情况的任何其他临床上显著的疾病，包括心脏、肺、肝、肾、血液、免疫或行为疾病，或感染或恶性肿瘤或伴随疾病或对长期药物治疗的需要。
4.具有当前、慢性或活动性人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎或乙型肝炎感染的血清学证据。
5.第1天前4周内出现有症状的感染(例如上呼吸道感染、肺炎、肾盂肾炎、脑膜炎)。
6.表现出研究者认为可能影响运动发育的认知迟缓或障碍。
7.按照规定的时间范围，采用任何以下疗法进行治疗：
·任何时候：
–基因治疗
–基于细胞的治疗(例如干细胞移植)
–CRISPR/Cas9，或任何其他形式的基因编辑
·在第一天后的12周内以及研究期间的任何时间：
-使用人类生长因子或vamorolone
·在第一天后的6个月内以及研究期间的任何时间：
-任何研究药物
-任何旨在增加抗肌营养不良蛋白表达的治疗(例如TranslarnaTM、EXONDYS 51TM、VILTEPSOTM)
8.在第1天访视后4周内接受过活病毒疫苗，或在第1天访视后2周内接受过灭活疫苗，或预计在第1天后的前3个月内接受疫苗接种。
9.具有被认为具有临床意义的异常实验室值，包括但不限于：
·γ-谷氨酰转移酶>2倍正常上限(ULN)
·谷氨酸脱氢酶(GLDH)>15U/L
·总胆红素>ULN。注意，不排除被认为是由吉尔伯特综合征引起的总胆红素升高。
·白细胞计数>18,500/μl
·血小板≤150,000/μL
10.家人不想向全科医生/初级保健医生和其他医疗提供者披露受试者的研究参与情况。
11.研究者认为，受试者不太可能遵守研究方案。
基因诊断
在筛选之前，受试者必须基于临床发现的记录和使用临床诊断基因测试的先前验证性基因测试具有DMD的明确的诊断。遗传报告必须描述预计导致抗肌营养不良蛋白缺失的完全包含在外显子18至79(含)之间的DMD基因中的移码缺失、移码重复、过早终止或其他致病性变异。
a.外显子1-17之间或包括外显子1-17的突变不符合资格。
b.框内删除、框内重复和意义不确定的变异(“VUS”)不符合资格。
c.完全包含在外显子45内(含)的突变不符合资格。
统计方法：
样品量：
本研究的样品量基于主要功效终点的效力，即NSAA总分从基线到第52周(第1部分)的变化。
假设所有受试者中3.5的标准差和第52周(第1部分)时10％的退出率(具有0.05的1型误差(两侧)、随机化比例为1:1的120的样品量)将提供约90％的效力来检测研究药物组和安慰剂组之间从基线到第52周(第1部分)的NSAA总分变化的2.2的平均差异。
该研究还针对≥4岁至<6岁的年龄组。该研究将招募至少60名年龄≥4岁至<6岁的受试者。假设≥4至<6岁年龄组中主要终点的3.2的标准差和第52周(第1部分)时10％的退出率(具有0.05的1型误差(两侧)、随机化比例为1:1的60的样品量)将提供至少80％的效力来检测研究药物组和安慰剂组之间从基线到第52周(第1部分)的NSAA总分变化的2.5的平均差异。
针对多重性调整的测试程序将用于将整体1型误差控制在0.05的两侧水平，细节将在SAP中指定。
随机化
受试者将以1:1的比例随机分配以通过单次IV输注接受研究药物或安慰剂。在研究第1部分中接受研究药物的受试者将在第2部分中接受安慰剂。在研究第1部分中接受安慰剂的受试者将有机会在第2部分中接受研究药物。
随机化将按随机化时的年龄组(≥4至<6岁或≥6至<8岁)和筛选时NSAA总分(≤22或>22)进行分层；随机化时，至少50％的受试者必须被随机分入≥4至<6岁年龄组。所有患者将有机会在第1部分或第2部分中接受静脉内(IV)研究药物(1.33×1014vg/kg)。
皮质类固醇
在初次筛选访视之前，受试者必须每天服用稳定剂量的口服皮质类固醇至少12周，并且在整个研究过程中剂量保持恒定(适应体重变化的修改除外)。皮质类固醇类型、给药频率、皮质类固醇剂量开始和结束日期以及剂量的所有变化都将记录在受试者的源文件和eCRF中。
输注前免疫抑制剂
在输注前一天(研究药物或安慰剂)，除了用于DMD的基线稳定口服皮质类固醇外，受试者还将开始用于免疫抑制的额外的糖皮质激素(强的松等效物)。接受用于其DMD的基线每日皮质类固醇给药的受试者除了添加的1mg/kg/天的免疫抑制剂量外，还将服用其通常的DMD皮质类固醇剂量。1mg/kg/天给药将随后达到60mg/天的每日总剂量。
输注后免疫抑制剂
输注后的前60天，受试者将保持其用于DMD的基线每日稳定口服皮质类固醇剂量，此外，将服用用于免疫抑制的1mg/kg/天的糖皮质激素(强的松等效物)。经医疗监测员批准，可以允许提前逐渐减量以管理不良事件(AE)。1mg/kg/天给药将随后达到60mg/天的每日总剂量，除了在GGT升高和/或其他临床上显著的肝功能异常的情况下添加的类固醇之外。
如果受试者因呕吐而不能耐受口服免疫抑制糖皮质激素，则应静脉内施用糖皮质激素。
如果确认GGT水平≥150U/L或输注后出现其他临床上显著的肝功能异常，则应增加输注后添加的用于免疫抑制的糖皮质激素。研究者可能会对免疫抑制治疗进行后续调整，以应对随后发生的急性肝损伤或其他不良事件。对于肝脏生化指标(包括相对于基线的GGT、胆红素、GLDH和ALT)的严重或非常严重的升高，或者对2mg/kg/天或120mg/天没有反应的升高，必须咨询肝病专家。在这种情况下，可以考虑IV推注类固醇。
·如果除了其DMD类固醇外受试者还服用1mg/kg的用于免疫抑制添加的类固醇，则除了其DMD类固醇外应服用的该剂量应增加至2mg/kg的用于免疫抑制添加的类固醇。
·如果受试者接受60mg/天的固定剂量，则这应增加至120mg/天。
具有正常GGT值且在第60天没有急性肝损伤体征的受试者应在2周内逐渐减少其免疫抑制性糖皮质激素。根据研究者的判断，可以调整逐渐减量的持续时间以管理AE，但在第90天之后继续使用超过基线每日治疗方案的剂量的类固醇应与医学监测员讨论。第60天时具有升高的GGT值和/或急性肝损伤体征的受试者中的免疫抑制性糖皮质激素应如上文所述进行管理，直至GGT值正常化(或明显趋于正常)并且急性肝损伤的所有体征消退，此时他们应在2周内逐渐减少其免疫抑制糖皮质激素。一旦用于免疫抑制的额外类固醇逐渐减少，他们应该保持其用于DMD的基线每日类固醇治疗方案，并根据体重进行任何必要的调整。
功效分析：
北极星行走评估(NSSA)
主要终点和一些次要终点将使用适当的多重测试方法以分层方式进行测试，该方法在双侧0.05水平上提供对族状1型错误率的强有力控制。
对于NSAA总分从基线到第52周(第1部分)的变化的主要终点，将由治疗组提供基线时NSAA总分、第1部分中每次基线后访视以及第1部分中从基线到每次基线后访视的变化的汇总统计数据。对于其中将收集2个NSAA分数的基线和第52周(第1部分)访视，将在分析中使用平均NSAA分数。
作为主要分析，将使用基于约束最大似然的混合模型重复测量分析来比较2个治疗组的从基线到第52周(第1部分)的NSAA总分变化。在此模型中，响应向量由第1部分中每次基线后访视的NSAA总分的从基线的变化组成。该模型将包括治疗组(分类的)、访视(分类的)、按访视交互作用的治疗组、随机化时的年龄组的协变量。
NSAA是临床医生管理的量表，其用于对各种功能活动的表现进行评级(Mazzone,E等人,Neuromuscul Disord.20(11):712-716(2010))。它被设计用于能够站立的患有DMD的男孩，并且其已用于本研究年龄范围(≥4岁和<8岁)的DMD男孩(Connolly AM等人,“Motorand cognitive assessment of infants and young boys with Duchenne MuscularDystrophy:results from the Muscular Dystrophy Association DMD ClinicalResearch Network,”Neuromuscul Disord.23(7):529-539(2013))；Mercuri E等人,“Revised North Star Ambulatory Assessment for Young Boys with DuchenneMuscular Dystrophy,”PLoS One 11(8):e0160195(2016))。
在此评估期间，受试者进行17种不同的功能活动，包括10MWR、从坐姿站起来、用一条腿站立、爬上箱形台阶、走下箱形台阶、从躺着起来坐着、从地板上起来、将头抬离地板、脚后跟站立和跳跃。
受试者将被如下分级：2＝正常，没有活动的明显改变；1＝修改的方法，但无需他人的物理帮助即可实现目标；和0＝无法独立实现目标。
临床评估手册中提供了有关NSAA管理的详细信息。
两个NSAA分数将在基线时的单独2天、第1部分中第52周的单独2天和第2部分中第52周的单独2天收集。
从地板起立的时间
从地板起立的时间测试是NSAA(第11项)的一部分，它量化了受试者从双臂并拢的仰卧位置开始，以双臂并拢的直立姿势站立所需的时间(Henricson,EK等人,Muscle Nerve48(1):55-67(2013))。受试者完成任务所需的时间将在NSAA管理期间被记录。与NSAA一样，将在基线时和第1部分和第2部分中的第52周访视的2天中收集从地板起立的时间。
10米步行/跑步
计时10MWR是NSAA的一部分(第17项)，并量化受试者从站立位置跑步或行走10米(在直走道上)所需的时间(McDonald,CM等人,Muscle Nerve 48(3):357-368(2013))。鼓励受试者跑过10米标记。受试者完成该距离所需的时间将在NSAA管理期间记录。与NSAA一样，计时10MWR将在第1部分和第2部分的基线和第52周访视时收集。
上行4级台阶的时间
计时的4个台阶测试量化了受试者上行4个标准台阶(每台阶高度6英寸)所需的时间(Bushby,K等人,Clin Investig(Lond).1(9):1217-1235(2011))。将记录受试者爬上4个标准尺寸台阶所需的时间。
100米步行/跑步
100MWR量化了受试者从站立位置跑步或行走100米(在直走道上)所需的时间(Alfano,LN等人,Neuromuscul Disord.27(5):452-457(2017))。鼓励受试者跑过100米标记。受试者完成该距离所需的时间将被记录。
可穿戴设备
将为受试者提供可穿戴设备来收集日常身体活动。可穿戴设备的目的是在研究现场访视之外准确测量受试者在正常日常生活中的运动和活动水平。该设备由2个传感器组成，其中一个传感器佩戴在每个脚踝上。由于可穿戴设备电池每天使用后需要充电，因此传感器不会在夜间佩戴。现场人员、受试者和家长/看护者将接受有关正确使用该设备的培训。
在预输注期间，可穿戴设备将每天佩戴在两个脚踝上持续三周，以捕获基线值。在随访期间，在第1部分和第2部分中的第12、24、36和52周/提前终止诊所访视之前，可穿戴设备将每天佩戴在两个脚踝上持续三周。在诊所访视时将不佩戴可穿戴设备，但受试者在完成临床测试后将立即恢复使用。
微小抗肌营养不良蛋白表达
将在第1部分第12周和第2部分第12周从一组受试者中收集用于评估微小抗肌营养不良蛋白表达的肌肉活检。肌肉活检应在申办者赞同的情况下使用开放活检或VACORA核心活检进行收集。活检必须要求从内侧腓肠肌收集肌肉组织。如果内侧腓肠肌不可行，则需要申办者事先批准才能使用替代肌肉。
活检样品将用于通过针对肌肉含量调整的蛋白质印迹来量化微小抗肌营养不良蛋白的表达，并且将使用免疫组织化学作为IF强度和PDPF来评估微小抗肌营养不良蛋白的定位。有关处理和加工活检组织的更多详细信息，参阅活检手术和实验室手册。
载体基因组和定量
将收集血清以评估不同时间点的载体定量。第一天，将在输注结束后约4至6小时收集样品。
载体基因组拷贝将在第1部分第12周和第2部分第12周使用聚合酶链式反应在肌肉活检样品中测量。
肌酸激酶
研究药物输注后的肌酸激酶水平将用作探索性功效度量。
患者报告结果测量信息***
基于区域可用性的受试者子集将完成PROMIS测量；研究操作手册中将概述参与国家。
PROMIS是一系列经开发和验证用于评估与健康相关的生活质量的工具(PROMIS儿科和家长代理概况工具。可参见http://www.healthmeasures.net/images/PROMIS/manuals/PROMIS_Pediatric_and_Proxy_Profile_Scoring_Manual.pdf.,10October2018,Bevans,KB等人,Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res.10(4):385-396(2010)。PROMIS测量已根据美国食品和药物管理局评估患者报告的结果的方法学标准进行了开发(Bevans,KB等人,Food and Drug Administration.Guidance for Industry Patient-Reported Outcome Measures:Use in Medical Product Development to SupportLabeling Claims；https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidances/ucm193282.pdf.；10October 2018)，并且由评估和监测成人和儿童的身体、心理和社会健康的以人为本的项目组成。本研究中针对儿童结果的具体测量将包括以下代理测量：
·PROMIS家长代理项目库V2.0-移动性
·PROMIS家长代理SF V2.0-上肢-简表8a
·PROMIS家长代理SF V2.0-疲劳-简表10a
如果受试者在研究期间年满8岁，受试者也将执行并完成以下儿科PROMIS测量。家长/看护人将继续完成代理测量。
·PROMIS儿科项目库V2.0-移动性
·PROMIS儿科项目库V2.0-上肢-简表8a
·PROMIS儿科项目库V2.0-疲劳-简表10a
第1部分中的关键功效评估的概述：
主要结果测量：第52周NSAA总分从基线的变化。
次要结果测量：
-第12周时，通过蛋白质印迹测量参与者子集的微小抗肌营养不良蛋白表达量(第12周)。
-第52周时从地板起立的时间、完成100米和10米步行/跑步的时间以及计时楼梯上行4级台阶测试的从基线的变化(基线，第52周)
-通过可穿戴设备测量的步速95百分位数(SV95C)的从基线的变化(基线至第52周)
-第52周时每个领域患者报告的结果测量信息(PROMIS)分数的从基线的变化(基线，第52周)
PROMIS是一系列经开发和验证用于评估与健康相关的生活质量的工具。家长将被问到“考虑到您孩子的可观察症状、身体能力、日常活动能力和整体健康状况的各个方面，您如何评价自研究开始以来您孩子临床状态的变化？使用以下评分标准：1＝改善极其大，2＝改善很大，3＝改善很小，4＝没有变化，5＝稍差，6＝差很多，7＝极差。”
-第1部分：通过NSAA测量的第52周时获得或改善的技能数量(从基线直至第52周)。
实施例11
全身递送Delandistrogene Moxeparvovec后DMDmdx大鼠的心脏功能的评估
DMDmdx大鼠模型是一种有价值的杜氏肌营养不良(DMD)小动物模型，其表型特性非常接近人类DMD病理学。参见Larcher T.等人,Plos One 9(10):e110371(2014)；Szabó,P.L.等人,Disease Models&Mechanisms 14:dmm047704.doi:10.1242/dmm.047704(2021)。本研究的目的是评估年龄为21-28天的雄性Sprague-Dawley DMD突变大鼠(DMDmdx大鼠)在全身递送单剂量(1.33x1014vg/kg)delandistrogene moxeparvovec后与盐水相比较的心脏功能。
研究终点包括安全药理学测量、骨骼肌和心肌中的靶向微小抗肌营养不良蛋白表达、生物分布、组织学和超声心动图以评估心脏功能。治疗队列包括全身递送单剂量(1.33x1014vg/kg)本文所述的rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白载体(delandistrogene moxeparvovec)的DMDmdx大鼠。对照队列包括接受盐水的DMDmdx大鼠。如下所述，在12周和24周时间点评估两个队列之间的心脏功能。
微小抗肌营养不良蛋白在骨骼肌和心肌中的靶向表达
已证明delandistrogene moxeparvovec的全身递送在骨骼肌和心肌两者中的靶向表达。在用delandistrogene moxeparvovec相对盐水治疗后，DMDmdx大鼠的骨骼和心肌中微小抗肌营养不良蛋白表达的可视化(免疫荧光)显示于图21A-21C中。图21A-21C展示了与用delandistrogene moxeparvovec治疗后与盐水相比12周(图21B)和24周(图21C)DMDmdx大鼠的骨骼肌(“LTA”)和心肌(“HRT”)中的微小抗肌营养不良蛋白表达(图21A)。
图22A-22B描绘了在用delandistrogene moxeparvovec治疗后12周和24周时DMDmdx大鼠的一些肌肉组织中微小抗肌营养不良蛋白表达(免疫荧光)(图22A)和载体转导(载体基因组拷贝)(图22B)的定量。图例：TA＝胫骨肌；HRT＝心脏；MG＝内侧腓肠肌；LG＝外侧内侧腓肠肌；DIA＝膈肌；TRI＝三头肌；PSO＝腰大肌。
肌肉退化和纤维化的减少
与盐水相比，在DMDmdx大鼠中施用delandistrogene moxeparvovec后12周和24周，通过骨骼肌中枢成核分析观察到肌肉退化的显著减少。图24A描绘了左内侧腓肠肌的H&E染色，其说明了与盐水治疗的DMDmdx大鼠中表现出的更严重的营养不良表型相比，delandistrogene moxeparvovec治疗的DMDmdx大鼠的肌肉病理学的改善。
还对LMG中的组织学参数进行了量化。检查了中央成核和纤维直径(肌肉退化的标志)。参见Pastoret,C.等人,J Neur Sci 129:97-105(1995)；L.R.Rodino-Klapac等人,MolGenet.22:4929-4937(2013),Potter R.A.等人Hum Gene Ther.32:375-89(2021)。平均中央成核显示经治疗的动物的中央成核(CN)的改善，表明经治疗的动物的较少的肌肉退化。盐水给药的大鼠在12周和24周队列中均表现出大于50％的平均阳性中央成核百分比，而在12周和24周队列中delandistrogene moxeparvovec中央成核均小于25％(图24B)。在12周和24周时，用盐水治疗的动物和用delandistrogene moxeparvovec治疗的动物之间的差异均具有统计学显著性，并且显示使用delandistrogene moxeparvovec治疗的变性/再生过程的改善和肌纤维损伤的减少。在第12周和第24周时，与生理盐水相比，使用delandistrogene moxeparvovec治疗的纤维直径显示纤维尺寸分布的正常化和纤维平均直径的增加，这表明正常化的肌肉环境。
通过量化组织切片中胶原蛋白的百分比来分析纤维化。图25A-25B描绘了骨骼肌和心肌中胶原沉积的分析。图25A中的图像描绘了治疗后12周时的马森毛状体染色。图25A中的代表性图像显示了在给药后12周时delandistrogene moxeparvovec和盐水治疗的动物的MG和HRT的纤维化。蓝色染色表示纤维化，红色染色表示肌纤维。与盐水相比，在12周和24周时用delandistrogene moxeparvovec治疗后DMDmdx大鼠中纤维化减少。图25B量化了治疗后12周和24周各种类型的骨骼肌和心肌中的胶原蛋白沉积。纤维化的定量显示，在所有分析的组织中，delandistrogene moxeparvovec治疗的队列在每个染色的肌肉切片中具有比盐水治疗的队列更低的纤维化面积百分比(图25B)。(HRT＝心脏；MG＝内侧腓肠肌；DIA＝膈肌)。
心脏功能评估
在施用delandistrogene moxeparvovec后，与盐水相比，在24周时通过超声心动图评估DMDmdx大鼠的心室收缩性能。描述“治疗”队列相对对照(“盐水”)队列的数据的条形图如图27A(对于左心室收缩末期直径(LVESD)；图27B(对于射血分数(％)(EF))1和图27C(对于缩短分数(％)(FS))所示。
相对盐水治疗的DMDmdx大鼠，delandistrogene moxeparvovec的施用导致射血分数(EF)(图27B)和缩短分数(FS)(图27B)的适度改善。使用delandistrogene moxeparvovec的逆转舒张的趋势导致LVIDd(左心室内径，舒张)和LVIDs(左心室内径，收缩)/LVESD(左心室收缩末期直径)的轻度减小，以及舒张末期体积(EDV)的减小。图27A的条形图中显示了用delandistrogene moxeparvovec相对盐水治疗后24周左心室收缩末期直径的轻度减小。
图27A-27C中所示的数据(反映了心脏功能的三个超声心动图测量结果)显示了用delandistrogene moxeparvovec治疗后24周朝向持久心脏功能的积极趋势。数据支持delandistrogene moxeparvovec在DMDmdx大鼠中改善心脏功能和逆转不良心脏重塑方面的功效。
改善的步行和垂直运动
DMDmdx大鼠的运动是在开放场地活动笼中使用激光监测来测量的。移动和垂直活动(垂直运动的测量)是基于每小时光束中断的次数来测量的。随着时间的推移，患病动物由于肌肉损伤而失去行走和垂直运动能力。尸检的两周内进行活动笼。
所有治疗组在所有时间点的运动(包括步行和垂直活动)均显著增加。证明了在全身递送delandistrogene moxeparvovec后12周，行走和垂直活动的统计上显著的增加(图23A和23B)。在24周时间点也出现了同样的趋势。
在治疗队列相对盐水队列中在24周时在行走中观察到显著差异(图23A)。24周时垂直活动的改善不太明显，但与生理盐水治疗的年龄匹配的DMDmdx队列相比仍然具有统计显著性(图23B)。
总而言之，该数据显示，与盐水相比，在12周和24周时间点，用delandistrogenemoxeparvovec治疗后，DMDmdx大鼠的活动能力具有显著功能改善。
血清肌钙蛋白水平
在1.33x1014 delandistrogene moxeparvovec(n＝6)相对盐水(n＝6)给药后一周(7天)，在DMDmdx大鼠亚组中评估血清中的肌钙蛋白I水平。相对生理盐水(n＝5)，在尸检时(n＝5)在给药后12周在不同的动物亚组中对肌钙蛋白I进行了评估。
肌钙蛋白I测量血清中肌钙蛋白I蛋白的水平。当心肌受损时，例如心脏病发作时，这些蛋白质就会被释放。心脏受损越严重，血清中肌钙蛋白I的含量就越多。与DMD动物模型一致，血清中肌钙蛋白I升高和心脏病是DMDmdx大鼠模型的特征。
然而，如图26所示，在给药后1周和给药后12周，经盐水治疗的动物和经delandistrogene moxeparvovec治疗的动物之间的血清肌钙蛋白1血液水平没有观察到显著差异，这表明基因疗法治疗不会引起心脏毒性。
结论
本研究旨在测试delandistrogene moxeparvovec治疗在DMDmdx大鼠模型中的功效和功能改善。DMDmdx大鼠模型表现出比DMDmdx小鼠模型更严重的表型，并且更好地模拟DMD患者的心脏和纤维化表型。
使用delandistrogene moxeparvovec治疗后，活动笼的生活功能结果有所改善。在所有时间点与盐水对照组相比，治疗的动物的垂直活动和行走能力均显著改善。所有时间点的持续功能改善表明临床预期剂量的1.33x1014 vg/kg delandistrogenemoxeparvovec的全身递送的表达和功能的持久性。
超声心动图显示，在治疗后12周和24周，使用delandistrogene moxeparvovec全身治疗的改善的心脏病指标。总体而言，该数据表明，在DMDmdx大鼠模型中，在递送后24周期间，使用delandistrogene moxeparvovec治疗的心脏功能的改善。
在DMDmdx大鼠模型中，微小抗肌营养不良蛋白在包括心脏在内的肌肉中表达，并且这与营养不良发病机制的减少和改善的行走能力有关。超声心动图证明，微小抗肌营养不良蛋白在心脏中的靶向表达减少心脏纤维化并改善心脏功能。总之，delandistrogenemoxeparvovec已在骨骼肌和心肌中表现出靶向表达，这与mdx大鼠模型中改善的功能结果(例如心脏)相对应。
参考资料
1.Hoffman,E.P.,Brown,R.H.,Jr.&Kunkel,L.M.Dystrophin:the proteinproduct of the Duchenne muscular dystrophy locus.Cell51,919-928(1987).
2.Straub,V.&Campbell,K.P.Muscular dystrophies and the dystrophin-glycoprotein complex.Curr Opin Neurol10,168-175(1997).
3.Sacco,A.,等人,Short telomeres and stem cell exhaustion modelDuchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.Cell143,1059-1071(2010).
4.Wallace,G.Q.&McNally,E.M.Mechanisms of muscle degeneration,regeneration,and repair in the muscular dystrophies.Annu Rev Physiol71,37-57(2009).
5.Zhou,L.&Lu,H.Targeting fibrosis in Duchenne muscular dystrophy.JNeuropathol Exp Neurol69,771-776(2010).
6.Desguerre,I.,等人,Endomysial fibrosis in Duchenne musculardystrophy:a marker of poor outcome associated with macrophage alternativeactivation.J Neuropathol Exp Neurol68,762-773(2009).
7.DiPrimio,N.,McPhee,S.W.&Samulski,R.J.Adeno-associated virus for thetreatment of musclediseases:toward clinical trials.Curr Opin Mol Ther12,553-560(2010).
8.Mendell,J.R.,等人,Sustained alpha-sarcoglycan gene expression aftergene transfer in limb-girdle muscular dystrophy,type2D.Ann Neurol68,629-638(2010).
9.Mendell,J.R.,等人,Limb-girdle muscular dystrophy type 2Dgenetherapy restores alpha-sarcoglycan and associated proteins.Ann Neurol66,290-297(2009).
10.Mendell,J.R.,等人,A phase 1/2a follistatin gene therapy trial forbecker muscular dystrophy.Molecular therapy:the journal of the AmericanSociety of Gene Therapy23,192-201(2015).
11.Carnwath,J.W.&Shotton,D.M.Muscular dystrophy in the mdx mouse:histopathology of the soleus and extensor digitorum longus muscles.J NeurolSci80,39-54(1987).
12.Coulton,G.R.,Morgan,J.E.,Partridge,T.A.&Sloper,J.C.The mdx mouseskeletal muscle myopathy:I.A histological,morphometric and biochemicalinvestigation.Neuropathol Appl Neurobiol14,53-70(1988).
13.Cullen,M.J.&Jaros,E.Ultrastructure of the skeletal muscle in the Xchromosome-linked dystrophic(mdx)mouse.Comparison with Duchenne musculardystrophy.Acta Neuropathol77,69-81(1988).
14.Dupont-Versteegden,E.E.&McCarter,R.J.Differential expression ofmuscular dystrophy in diaphragm versus hindlimb muscles of mdx mice.MuscleNerve15,1105-1110(1992).
15.Stedman,H.H.,等人,The mdx mouse diaphragm reproduces thedegenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.Nature352,536-539(1991).
16.Deconinck,A.E.,等人,Utrophin-dystrophin-deficient mice as a modelfor Duchenne muscular dystrophy.Cell90,717-727(1997).
17.Grady,R.M.,等人,Skeletal and cardiac myopathies in mice lackingutrophin and dystrophin:a model for Duchenne muscular dystrophy.Cell90,729-738(1997).
18.Love,D.R.,等人,An autosomal transcript in skeletal muscle withhomology to dystrophin.Nature339,55-58(1989).
19.Tinsley,J.M.,等人,Primary structure of dystrophin-relatedprotein.Nature360,591-593(1992).
20.Tinsley,J.,等人,Expression of full-length utrophin preventsmuscular dystrophy in mdx mice.Nat Med4,1441-1444(1998).
21.Squire,S.,等人,Prevention of pathology in mdx mice by expressionof utrophin:analysis using an inducible transgenic expression system.Hum MolGenet11,3333-3344(2002).
22.Rafael,J.A.,Tinsley,J.M.,Potter,A.C.,Deconinck,A.E.&Davies,K.E.Skeletal muscle-specific expression of a utrophin transgene rescuesutrophin-dystrophin deficient mice.Nat Genet19,79-82(1998).
23.Zhou,L.,等人,Haploinsufficiency of utrophin gene worsens skeletalmuscle inflammation and fibrosis in mdx mice.J Neurol Sci264,106-111(2008).
24.Gutpell,K.M.,Hrinivich,W.T.&Hoffman,L.M.Skeletal Muscle Fibrosisin the mdx/utrn+/-Mouse Validates Its Suitability as a Murine Model ofDuchenne Muscular Dystrophy.PloS one10,e0117306(2015).
25.Rodino-Klapac,L.R.,等人,Micro-dystrophin and follistatin co-delivery restores muscle function in aged DMD model.Human moleculargenetics22,4929-4937(2013).
26.Nevo,Y.,等人,The Ras antagonist,farnesylthiosalicylic acid(FTS),decreases fibrosis and improves muscle strength in dy/dy mouse model ofmuscular dystrophy.PloS one6,e18049(2011).
27.Rodino-Klapac,L.R.,等人,A translational approach for limb vasculardelivery of the micro-dystrophin gene without high volume or high pressurefor treatment of Duchenne muscular dystrophy.J Transl Med5,45(2007).
28.Mulieri,L.A.,Hasenfuss,G.,Ittleman,F.,Blanchard,E.M.&Alpert,N.R.Protection of human left ventricular myocardium fromcutting injury with2,3-butanedione monoxime.Circ Res65,1441-1449(1989).
29.Rodino-Klapac,L.R.,等人,Persistent expression of FLAG-tagged microdystrophin in nonhuman primates following intramuscular and vasculardelivery.Molecular therapy:the journal of the American Society of GeneTherapy18,109-117(2010).
30.Grose,W.E.,等人,Homologous recombination mediates functionalrecovery of dysferlin deficiency following AAV5 gene transfer.PloS one7,e39233(2012).
31.Liu,M.,等人,Adeno-associated virus-mediated microdystrophinexpression protects young mdx muscle from contraction-induced injury.MolTher11,245-256(2005).
32.Harper,S.Q.,等人,Modular flexibility of dystrophin:implicationsfor gene therapy of Duchenne muscular dystrophy.Nature medicine8,253-261(2002).
33.Rodino-Klapac,L.R.,等人,Persistent expression of FLAG-tagged microdystrophin in nonhuman primates following intramuscular and vasculardelivery.Mol Ther18,109-117(2010).
34.Salva,M.Z.,等人,Design of tissue-specific regulatory cassettes forhigh-level rAAV-mediated expression in skeletal and cardiac muscle.MolTher15,320-329(2007).
35.Sondergaard,P.C.,等人,AAV.Dysferlin Overlap Vectors RestoreFunction in Dysferlinopathy Animal Models.Annals of clinical andtranslational neurology2,256-270(2015).
36.De,B.P.,等人,High levels of persistent expression of alpha1-antitrypsin mediated by the nonhuman primate serotype rh.10adeno-associatedvirus despite preexisting immunity to common human adeno-associatedviruses.Mol Ther13,67-76(2006).
37.Rodino-Klapac,L.R.,等人,A translational approach for limb vasculardelivery of the micro-dystrophin gene without high volume or high pressurefor treatment of Duchenne muscular dystrophy.Journal of translationalmedicine5,45(2007).
38.Bulfield等人,X chromosome-linked muscular dystrophy(mdx)in themouse.Proc Natl Acad Sci U S A.1984；81(4):1189-1192.
39.Sicinski等人,The molecular basis of muscular dystrophy in the mdxmouse:a point mutation.Science.1989 30；244(4912):1578-80
序列表
<110> 萨雷普塔治疗公司
ALAM, MAROOF
RODINO-KLAPAC, LOUISE
<120> 产生用于治疗肌营养不良的重组AAV载体
<130> 4140.052PC04
<150> US 63/253,998
<151> 2021-10-08
<150> US 63/243,944
<151> 2021-09-14
<150> US 63/209,733
<151> 2021-06-11
<150> US 63/189,676
<151> 2021-05-17
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3579
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
atgctgtggt gggaggaggt ggaggattgt tatgaaaggg aggacgtgca gaagaagact 60
tttaccaagt gggtgaacgc tcagttcagc aaatttggga agcagcacat cgagaatctg 120
ttttccgacc tgcaggatgg gagacggctg ctggatctgc tggaaggact gactggccag 180
aagctgccca aagagaaggg gagcactagg gtgcacgccc tgaacaacgt gaacaaagct 240
ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggat ctggtgaata ttggcagtac tgatatcgtg 300
gacgggaacc acaaactgac actgggcctg atctggaaca ttattctgca ctggcaggtg 360
aaaaatgtga tgaagaacat catggccggg ctgcagcaga ccaattccga gaagatcctg 420
ctgtcttggg tgcggcagag cacccgcaac tatccccagg tgaacgtgat taacttcact 480
acatcctgga gcgacgggct ggccctgaat gctctgattc acagccacag gcctgatctg 540
ttcgactgga atagcgtggt gtgccagcag tctgccacac agcgcctgga acatgccttc 600
aatatcgctc ggtaccagct ggggatcgaa aaactgctgg acccagagga tgtggacact 660
acatacccag ataaaaagtc tattctgatg tacattacta gcctgttcca ggtgctgcca 720
cagcaggtgt ctattgaagc cattcaggag gtggaaatgc tgccccgccc ccccaaagtg 780
actaaagagg agcattttca gctgcatcat cagatgcatt acagccagca gattaccgtg 840
agcctggctc agggatatga gcgcaccagt agtccaaaac cacggttcaa gtcctacgct 900
tatacccagg ctgcctacgt gacaactagc gaccctacta gatccccctt tccatcccag 960
cacctggagg ccccagagga caagagcttt gggtccagcc tgatggaaag cgaggtgaat 1020
ctggatcggt accagacagc cctggaggag gtgctgagct ggctgctgag tgctgaagac 1080
acactgcagg cccagggcga aatttccaat gacgtggaag tggtgaagga tcagttccac 1140
acacacgagg gctatatgat ggacctgaca gctcaccagg ggcgcgtggg caatatcctg 1200
cagctgggct ctaaactgat cggcaccggg aaactgagtg aggacgagga aacagaagtg 1260
caggagcaga tgaacctgct gaacagccgc tgggagtgtc tgagagtggc tagtatggag 1320
aagcagtcca acctgcaccg ggtgctgatg gacctgcaga accagaaact gaaagagctg 1380
aacgactggc tgacaaagac tgaggaacgc acaaggaaga tggaggagga gccactggga 1440
cccgacctgg aggatctgaa gagacaggtg cagcagcata aggtgctgca ggaggatctg 1500
gaacaggagc aggtgcgggt gaactccctg acacatatgg tggtggtggt ggacgaatct 1560
agtggagatc acgccaccgc cgccctggag gaacagctga aggtgctggg ggaccggtgg 1620
gccaacattt gccggtggac cgaggacagg tgggtgctgc tgcaggacat cctgctgaaa 1680
tggcagaggc tgaccgagga gcagtgtctg tttagtgctt ggctgagcga gaaagaggac 1740
gccgtgaaca agatccacac aaccggcttt aaggatcaga acgaaatgct gtctagcctg 1800
cagaaactgg ctgtgctgaa ggccgatctg gagaaaaaga agcagagcat gggcaaactg 1860
tatagcctga aacaggacct gctgagcacc ctgaagaaca agagcgtgac ccagaagaca 1920
gaagcctggc tggataactt tgcccgctgc tgggacaacc tggtgcagaa actggagaaa 1980
agtacagctc agatctctca ggctgtgacc acaacccagc ctagcctgac ccagacaacc 2040
gtgatggaaa ccgtgaccac cgtgacaacc cgcgaacaga tcctggtgaa acatgcccag 2100
gaagagctgc cacctccacc tccccagaag aagagaaccc tggagcggct gcaggagctg 2160
caggaagcca ctgacgaact ggacctgaag ctgaggcagg ccgaagtgat taaggggtct 2220
tggcagcctg tgggcgatct gctgattgat tccctgcagg accacctgga aaaggtgaag 2280
gctctgagag gcgaaattgc tccactgaag gagaacgtga gtcatgtgaa cgatctggct 2340
agacagctga caacactggg catccagctg agcccataca atctgagcac actggaggac 2400
ctgaatacca ggtggaagct gctgcaggtg gctgtggaag accgggtgcg gcagctgcat 2460
gaggcccatc gcgacttcgg accagccagc cagcactttc tgagcacatc cgtgcagggg 2520
ccctgggaga gggccatttc tcccaacaag gtgccctact atattaatca cgagacccag 2580
accacttgtt gggaccatcc caagatgaca gaactgtacc agtccctggc cgatctgaac 2640
aacgtgaggt ttagcgctta cagaaccgct atgaagctga gacggctgca gaaggccctg 2700
tgcctggatc tgctgtccct gtccgccgcc tgcgatgccc tggatcagca taatctgaag 2760
cagaacgatc agccaatgga tatcctgcag atcatcaact gcctgaccac tatctacgac 2820
aggctggagc aggagcacaa caacctggtg aacgtgcctc tgtgcgtgga tatgtgcctg 2880
aactggctgc tgaacgtgta tgacactggg cgcaccggcc ggatcagagt gctgagtttt 2940
aaaactggga ttatctccct gtgtaaggcc cacctggagg acaagtacag gtacctgttc 3000
aagcaggtgg ctagtagcac tggattttgt gaccagcgcc gcctgggact gctgctgcat 3060
gatagtatcc agattcctag acagctggga gaggtggcta gtttcggagg atctaacatc 3120
gaacccagcg tgcgcagctg tttccagttt gccaataaca aacctgaaat cgaggctgct 3180
ctgttcctgg attggatgcg cctggaacca cagagcatgg tgtggctgcc tgtgctgcac 3240
agagtggctg ccgccgaaac tgccaagcac caggctaaat gcaacatctg caaggaatgt 3300
cccattatcg gctttcgcta caggagtctg aaacatttta actacgatat ttgccagagc 3360
tgcttctttt ccggaagagt ggccaaagga cacaagatgc actaccctat ggtggaatat 3420
tgcaccccaa ctacatctgg cgaagatgtg cgcgattttg ccaaggtgct gaagaataag 3480
tttcggacta agaggtactt cgccaagcac ccccgcatgg ggtatctgcc agtgcagaca 3540
gtgctggaag gagacaatat ggagaccgat acaatgtga 3579
<210> 2
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 腺相关病毒
<400> 2
gtttaaacaa gcttgcatgt ctaagctaga cccttcagat taaaaataac tgaggtaagg 60
gcctgggtag gggaggtggt gtgagacgct cctgtctctc ctctatctgc ccatcggccc 120
tttggggagg aggaatgtgc ccaaggacta aaaaaaggcc atggagccag aggggcgagg 180
gcaacagacc tttcatgggc aaaccttggg gccctgctgt ctagcatgcc ccactacggg 240
tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct ggttataatt 300
aacccagaca tgtggctgcc cccccccccc caacacctgc tgcctctaaa aataaccctg 360
tccctggtgg atcccctgca tgcgaagatc ttcgaacaag gctgtggggg actgagggca 420
ggctgtaaca ggcttggggg ccagggctta tacgtgcctg ggactcccaa agtattactg 480
ttccatgttc ccggcgaagg gccagctgtc ccccgccagc tagactcagc acttagttta 540
ggaaccagtg agcaagtcag cccttggggc agcccataca aggccatggg gctgggcaag 600
ctgcacgcct gggtccgggg tgggcacggt gcccgggcaa cgagctgaaa gctcatctgc 660
tctcaggggc ccctccctgg ggacagcccc tcctggctag tcacaccctg taggctcctc 720
tatataaccc aggggcacag gggctgccct cattctacca ccacctccac agcacagaca 780
gacactcagg agccagccag cggcgcgccc 810
<210> 3
<211> 8562
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 腺相关病毒
<400> 3
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctgcgcgc 60
tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 120
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 180
cttgtagtta atgattaacc cgccatgcta cttatctacg tagccatgct ctagagttta 240
aacaagcttg catgtctaag ctagaccctt cagattaaaa ataactgagg taagggcctg 300
ggtaggggag gtggtgtgag acgctcctgt ctctcctcta tctgcccatc ggccctttgg 360
ggaggaggaa tgtgcccaag gactaaaaaa aggccatgga gccagagggg cgagggcaac 420
agacctttca tgggcaaacc ttggggccct gctgtctagc atgccccact acgggtctag 480
gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 540
agacatgtgg ctgccccccc ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct 600
ggtggatccc ctgcatgcga agatcttcga acaaggctgt gggggactga gggcaggctg 660
taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 720
tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 780
cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 840
cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 900
ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 960
aacccagggg cacaggggct gccctcattc taccaccacc tccacagcac agacagacac 1020
tcaggagcag ccagcggcgc gcccaggtaa gtttagtctt tttgtctttt atttcaggtc 1080
ccggatccgg tggtggtgca aatcaaagaa ctgctcctca gtggatgttg cctttacttc 1140
taggcctgta cggaagtgtt acttctgctc taaaagctgc ggaattgtac ccgcggccgc 1200
caccatgctg tggtgggagg aggtggagga ttgttatgaa agggaggacg tgcagaagaa 1260
gacttttacc aagtgggtga acgctcagtt cagcaaattt gggaagcagc acatcgagaa 1320
tctgttttcc gacctgcagg atgggagacg gctgctggat ctgctggaag gactgactgg 1380
ccagaagctg cccaaagaga aggggagcac tagggtgcac gccctgaaca acgtgaacaa 1440
agctctgaga gtgctgcaga acaacaacgt ggatctggtg aatattggca gtactgatat 1500
cgtggacggg aaccacaaac tgacactggg cctgatctgg aacattattc tgcactggca 1560
ggtgaaaaat gtgatgaaga acatcatggc cgggctgcag cagaccaatt ccgagaagat 1620
cctgctgtct tgggtgcggc agagcacccg caactatccc caggtgaacg tgattaactt 1680
cactacatcc tggagcgacg ggctggccct gaatgctctg attcacagcc acaggcctga 1740
tctgttcgac tggaatagcg tggtgtgcca gcagtctgcc acacagcgcc tggaacatgc 1800
cttcaatatc gctcggtacc agctggggat cgaaaaactg ctggacccag aggatgtgga 1860
cactacatac ccagataaaa agtctattct gatgtacatt actagcctgt tccaggtgct 1920
gccacagcag gtgtctattg aagccattca ggaggtggaa atgctgcccc gcccccccaa 1980
agtgactaaa gaggagcatt ttcagctgca tcatcagatg cattacagcc agcagattac 2040
cgtgagcctg gctcagggat atgagcgcac cagtagtcca aaaccacggt tcaagtccta 2100
cgcttatacc caggctgcct acgtgacaac tagcgaccct actagatccc cctttccatc 2160
ccagcacctg gaggccccag aggacaagag ctttgggtcc agcctgatgg aaagcgaggt 2220
gaatctggat cggtaccaga cagccctgga ggaggtgctg agctggctgc tgagtgctga 2280
agacacactg caggcccagg gcgaaatttc caatgacgtg gaagtggtga aggatcagtt 2340
ccacacacac gagggctata tgatggacct gacagctcac caggggcgcg tgggcaatat 2400
cctgcagctg ggctctaaac tgatcggcac cgggaaactg agtgaggacg aggaaacaga 2460
agtgcaggag cagatgaacc tgctgaacag ccgctgggag tgtctgagag tggctagtat 2520
ggagaagcag tccaacctgc accgggtgct gatggacctg cagaaccaga aactgaaaga 2580
gctgaacgac tggctgacaa agactgagga acgcacaagg aagatggagg aggagccact 2640
gggacccgac ctggaggatc tgaagagaca ggtgcagcag cataaggtgc tgcaggagga 2700
tctggaacag gagcaggtgc gggtgaactc cctgacacat atggtggtgg tggtggacga 2760
atctagtgga gatcacgcca ccgccgccct ggaggaacag ctgaaggtgc tgggggaccg 2820
gtgggccaac atttgccggt ggaccgagga caggtgggtg ctgctgcagg acatcctgct 2880
gaaatggcag aggctgaccg aggagcagtg tctgtttagt gcttggctga gcgagaaaga 2940
ggacgccgtg aacaagatcc acacaaccgg ctttaaggat cagaacgaaa tgctgtctag 3000
cctgcagaaa ctggctgtgc tgaaggccga tctggagaaa aagaagcaga gcatgggcaa 3060
actgtatagc ctgaaacagg acctgctgag caccctgaag aacaagagcg tgacccagaa 3120
gacagaagcc tggctggata actttgcccg ctgctgggac aacctggtgc agaaactgga 3180
gaaaagtaca gctcagatct ctcaggctgt gaccacaacc cagcctagcc tgacccagac 3240
aaccgtgatg gaaaccgtga ccaccgtgac aacccgcgaa cagatcctgg tgaaacatgc 3300
ccaggaagag ctgccacctc cacctcccca gaagaagaga accctggagc ggctgcagga 3360
gctgcaggaa gccactgacg aactggacct gaagctgagg caggccgaag tgattaaggg 3420
gtcttggcag cctgtgggcg atctgctgat tgattccctg caggaccacc tggaaaaggt 3480
gaaggctctg agaggcgaaa ttgctccact gaaggagaac gtgagtcatg tgaacgatct 3540
ggctagacag ctgacaacac tgggcatcca gctgagccca tacaatctga gcacactgga 3600
ggacctgaat accaggtgga agctgctgca ggtggctgtg gaagaccggg tgcggcagct 3660
gcatgaggcc catcgcgact tcggaccagc cagccagcac tttctgagca catccgtgca 3720
ggggccctgg gagagggcca tttctcccaa caaggtgccc tactatatta atcacgagac 3780
ccagaccact tgttgggacc atcccaagat gacagaactg taccagtccc tggccgatct 3840
gaacaacgtg aggtttagcg cttacagaac cgctatgaag ctgagacggc tgcagaaggc 3900
cctgtgcctg gatctgctgt ccctgtccgc cgcctgcgat gccctggatc agcataatct 3960
gaagcagaac gatcagccaa tggatatcct gcagatcatc aactgcctga ccactatcta 4020
cgacaggctg gagcaggagc acaacaacct ggtgaacgtg cctctgtgcg tggatatgtg 4080
cctgaactgg ctgctgaacg tgtatgacac tgggcgcacc ggccggatca gagtgctgag 4140
ttttaaaact gggattatct ccctgtgtaa ggcccacctg gaggacaagt acaggtacct 4200
gttcaagcag gtggctagta gcactggatt ttgtgaccag cgccgcctgg gactgctgct 4260
gcatgatagt atccagattc ctagacagct gggagaggtg gctagtttcg gaggatctaa 4320
catcgaaccc agcgtgcgca gctgtttcca gtttgccaat aacaaacctg aaatcgaggc 4380
tgctctgttc ctggattgga tgcgcctgga accacagagc atggtgtggc tgcctgtgct 4440
gcacagagtg gctgccgccg aaactgccaa gcaccaggct aaatgcaaca tctgcaagga 4500
atgtcccatt atcggctttc gctacaggag tctgaaacat tttaactacg atatttgcca 4560
gagctgcttc ttttccggaa gagtggccaa aggacacaag atgcactacc ctatggtgga 4620
atattgcacc ccaactacat ctggcgaaga tgtgcgcgat tttgccaagg tgctgaagaa 4680
taagtttcgg actaagaggt acttcgccaa gcacccccgc atggggtatc tgccagtgca 4740
gacagtgctg gaaggagaca atatggagac cgatacaatg tgagcggccg caataaaaga 4800
tctttatttt cattagatct gtgtgttggt tttttgtgtg tctagagcat ggctacgtag 4860
ataagtagca tggcgggtta atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca 4920
ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc 4980
cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctggcgt aatagcgaag 5040
aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgattcc 5100
gttgcaatgg ctggcggtaa tattgttctg gatattacca gcaaggccga tagtttgagt 5160
tcttctactc aggcaagtga tgttattact aatcaaagaa gtattgcgac aacggttaat 5220
ttgcgtgatg gacagactct tttactcggt ggcctcactg attataaaaa cacttctcag 5280
gattctggcg taccgttcct gtctaaaatc cctttaatcg gcctcctgtt tagctcccgc 5340
tctgattcta acgaggaaag cacgttatac gtgctcgtca aagcaaccat agtacgcgcc 5400
ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 5460
tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 5520
cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 5580
acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 5640
ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 5700
gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 5760
tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 5820
ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta aatatttgct tatacaatct tcctgttttt 5880
ggggcttttc tgattatcaa ccggggtaca tatgattgac atgctagttt tacgattacc 5940
gttcatcgat tctcttgttt gctccagact ctcaggcaat gacctgatag cctttgtaga 6000
gacctctcaa aaatagctac cctctccggc atgaatttat cagctagaac ggttgaatat 6060
catattgatg gtgatttgac tgtctccggc ctttctcacc cgtttgaatc tttacctaca 6120
cattactcag gcattgcatt taaaatatat gagggttcta aaaattttta tccttgcgtt 6180
gaaataaagg cttctcccgc aaaagtatta cagggtcata atgtttttgg tacaaccgat 6240
ttagctttat gctctgaggc tttattgctt aattttgcta attctttgcc ttgcctgtat 6300
gatttattgg atgttggaat cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 6360
tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc 6420
agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat 6480
ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt 6540
catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg 6600
tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 6660
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 6720
cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 6780
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 6840
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 6900
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 6960
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 7020
aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 7080
aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 7140
gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 7200
cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 7260
atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 7320
tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 7380
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 7440
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 7500
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 7560
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 7620
tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 7680
aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 7740
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 7800
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 7860
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 7920
agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 7980
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 8040
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 8100
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 8160
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 8220
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 8280
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 8340
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 8400
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 8460
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 8520
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gc 8562
<210> 4
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 腺相关病毒
<400> 4
cagccactat gggtctaggc tgcccatgta aggaggcaag gcctggggac acccgagatg 60
cctggttata attaacccag acatgtggct gctccccccc cccaacacct gctgcctgag 120
cctcaccccc accccggtgc ctgggtctta ggctctgtac accatggagg agaagctcgc 180
tctaaaaata accctgtccc tggtgggctg tgggggactg agggcaggct gtaacaggct 240
tgggggccag ggcttatacg tgcctgggac tcccaaagta ttactgttcc atgttcccgg 300
cgaagggcca gctgtccccc gccagctaga ctcagcactt agtttaggaa ccagtgagca 360
agtcagccct tggggcagcc catacaaggc catggggctg ggcaagctgc acgcctgggt 420
ccggggtggg cacggtgccc gggcaacgag ctgaaagctc atctgctctc aggggcccct 480
ccctggggac agcccctcct ggctagtcac accctgtagg ctcctctata taacccaggg 540
gcacaggggc tgcccccggg tcac 564
<210> 5
<211> 8409
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 腺相关病毒
<400> 5
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcgcg 60
ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc 120
cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc actaggggtt 180
ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct aattatctac gtagccatgt ctagacagcc 240
actatgggtc taggctgccc atgtaaggag gcaaggcctg gggacacccg agatgcctgg 300
ttataattaa cccagacatg tggctgctcc ccccccccaa cacctgctgc ctgagcctca 360
cccccacccc ggtgcctggg tcttaggctc tgtacaccat ggaggagaag ctcgctctaa 420
aaataaccct gtccctggtg ggctgtgggg gactgagggc aggctgtaac aggcttgggg 480
gccagggctt atacgtgcct gggactccca aagtattact gttccatgtt cccggcgaag 540
ggccagctgt cccccgccag ctagactcag cacttagttt aggaaccagt gagcaagtca 600
gcccttgggg cagcccatac aaggccatgg ggctgggcaa gctgcacgcc tgggtccggg 660
gtgggcacgg tgcccgggca acgagctgaa agctcatctg ctctcagggg cccctccctg 720
gggacagccc ctcctggcta gtcacaccct gtaggctcct ctatataacc caggggcaca 780
ggggctgccc ccgggtcacc accacctcca cagcacagac agacactcag gagccagcca 840
gccaggtaag tttagtcttt ttgtctttta tttcaggtcc cggatccggt ggtggtgcaa 900
atcaaagaac tgctcctcag tggatgttgc ctttacttct aggcctgtac ggaagtgtta 960
cttctgctct aaaagctgcg gaattgtacc cgcggccgcc accatgctgt ggtgggagga 1020
ggtggaggat tgttatgaaa gggaggacgt gcagaagaag acttttacca agtgggtgaa 1080
cgctcagttc agcaaatttg ggaagcagca catcgagaat ctgttttccg acctgcagga 1140
tgggagacgg ctgctggatc tgctggaagg actgactggc cagaagctgc ccaaagagaa 1200
ggggagcact agggtgcacg ccctgaacaa cgtgaacaaa gctctgagag tgctgcagaa 1260
caacaacgtg gatctggtga atattggcag tactgatatc gtggacggga accacaaact 1320
gacactgggc ctgatctgga acattattct gcactggcag gtgaaaaatg tgatgaagaa 1380
catcatggcc gggctgcagc agaccaattc cgagaagatc ctgctgtctt gggtgcggca 1440
gagcacccgc aactatcccc aggtgaacgt gattaacttc actacatcct ggagcgacgg 1500
gctggccctg aatgctctga ttcacagcca caggcctgat ctgttcgact ggaatagcgt 1560
ggtgtgccag cagtctgcca cacagcgcct ggaacatgcc ttcaatatcg ctcggtacca 1620
gctggggatc gaaaaactgc tggacccaga ggatgtggac actacatacc cagataaaaa 1680
gtctattctg atgtacatta ctagcctgtt ccaggtgctg ccacagcagg tgtctattga 1740
agccattcag gaggtggaaa tgctgccccg cccccccaaa gtgactaaag aggagcattt 1800
tcagctgcat catcagatgc attacagcca gcagattacc gtgagcctgg ctcagggata 1860
tgagcgcacc agtagtccaa aaccacggtt caagtcctac gcttataccc aggctgccta 1920
cgtgacaact agcgacccta ctagatcccc ctttccatcc cagcacctgg aggccccaga 1980
ggacaagagc tttgggtcca gcctgatgga aagcgaggtg aatctggatc ggtaccagac 2040
agccctggag gaggtgctga gctggctgct gagtgctgaa gacacactgc aggcccaggg 2100
cgaaatttcc aatgacgtgg aagtggtgaa ggatcagttc cacacacacg agggctatat 2160
gatggacctg acagctcacc aggggcgcgt gggcaatatc ctgcagctgg gctctaaact 2220
gatcggcacc gggaaactga gtgaggacga ggaaacagaa gtgcaggagc agatgaacct 2280
gctgaacagc cgctgggagt gtctgagagt ggctagtatg gagaagcagt ccaacctgca 2340
ccgggtgctg atggacctgc agaaccagaa actgaaagag ctgaacgact ggctgacaaa 2400
gactgaggaa cgcacaagga agatggagga ggagccactg ggacccgacc tggaggatct 2460
gaagagacag gtgcagcagc ataaggtgct gcaggaggat ctggaacagg agcaggtgcg 2520
ggtgaactcc ctgacacata tggtggtggt ggtggacgaa tctagtggag atcacgccac 2580
cgccgccctg gaggaacagc tgaaggtgct gggggaccgg tgggccaaca tttgccggtg 2640
gaccgaggac aggtgggtgc tgctgcagga catcctgctg aaatggcaga ggctgaccga 2700
ggagcagtgt ctgtttagtg cttggctgag cgagaaagag gacgccgtga acaagatcca 2760
cacaaccggc tttaaggatc agaacgaaat gctgtctagc ctgcagaaac tggctgtgct 2820
gaaggccgat ctggagaaaa agaagcagag catgggcaaa ctgtatagcc tgaaacagga 2880
cctgctgagc accctgaaga acaagagcgt gacccagaag acagaagcct ggctggataa 2940
ctttgcccgc tgctgggaca acctggtgca gaaactggag aaaagtacag ctcagatctc 3000
tcaggctgtg accacaaccc agcctagcct gacccagaca accgtgatgg aaaccgtgac 3060
caccgtgaca acccgcgaac agatcctggt gaaacatgcc caggaagagc tgccacctcc 3120
acctccccag aagaagagaa ccctggagcg gctgcaggag ctgcaggaag ccactgacga 3180
actggacctg aagctgaggc aggccgaagt gattaagggg tcttggcagc ctgtgggcga 3240
tctgctgatt gattccctgc aggaccacct ggaaaaggtg aaggctctga gaggcgaaat 3300
tgctccactg aaggagaacg tgagtcatgt gaacgatctg gctagacagc tgacaacact 3360
gggcatccag ctgagcccat acaatctgag cacactggag gacctgaata ccaggtggaa 3420
gctgctgcag gtggctgtgg aagaccgggt gcggcagctg catgaggccc atcgcgactt 3480
cggaccagcc agccagcact ttctgagcac atccgtgcag gggccctggg agagggccat 3540
ttctcccaac aaggtgccct actatattaa tcacgagacc cagaccactt gttgggacca 3600
tcccaagatg acagaactgt accagtccct ggccgatctg aacaacgtga ggtttagcgc 3660
ttacagaacc gctatgaagc tgagacggct gcagaaggcc ctgtgcctgg atctgctgtc 3720
cctgtccgcc gcctgcgatg ccctggatca gcataatctg aagcagaacg atcagccaat 3780
ggatatcctg cagatcatca actgcctgac cactatctac gacaggctgg agcaggagca 3840
caacaacctg gtgaacgtgc ctctgtgcgt ggatatgtgc ctgaactggc tgctgaacgt 3900
gtatgacact gggcgcaccg gccggatcag agtgctgagt tttaaaactg ggattatctc 3960
cctgtgtaag gcccacctgg aggacaagta caggtacctg ttcaagcagg tggctagtag 4020
cactggattt tgtgaccagc gccgcctggg actgctgctg catgatagta tccagattcc 4080
tagacagctg ggagaggtgg ctagtttcgg aggatctaac atcgaaccca gcgtgcgcag 4140
ctgtttccag tttgccaata acaaacctga aatcgaggct gctctgttcc tggattggat 4200
gcgcctggaa ccacagagca tggtgtggct gcctgtgctg cacagagtgg ctgccgccga 4260
aactgccaag caccaggcta aatgcaacat ctgcaaggaa tgtcccatta tcggctttcg 4320
ctacaggagt ctgaaacatt ttaactacga tatttgccag agctgcttct tttccggaag 4380
agtggccaaa ggacacaaga tgcactaccc tatggtggaa tattgcaccc caactacatc 4440
tggcgaagat gtgcgcgatt ttgccaaggt gctgaagaat aagtttcgga ctaagaggta 4500
cttcgccaag cacccccgca tggggtatct gccagtgcag acagtgctgg aaggagacaa 4560
tatggagacc gatacaatgt gagcggccgc aataaaagat ctttattttc attagatctg 4620
tgtgttggtt ttttgtgtgt ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa 4680
tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 4740
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 4800
cagtgagcga gcgagcgcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 4860
tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggaagttcc agacgattga gcgtcaaaat 4920
gtaggtattt ccatgagcgt ttttcctgtt gcaatggctg gcggtaatat tgttctggat 4980
attaccagca aggccgatag tttgagttct tctactcagg caagtgatgt tattactaat 5040
caaagaagta ttgcgacaac ggttaatttg cgtgatggac agactctttt actcggtggc 5100
ctcactgatt ataaaaacac ttctcaggat tctggcgtac cgttcctgtc taaaatccct 5160
ttaatcggcc tcctgtttag ctcccgctct gattctaacg aggaaagcac gttatacgtg 5220
ctcgtcaaag caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 5280
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 5340
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 5400
ccctttaggg ttccgattta gtgatttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 5460
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 5520
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 5580
ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 5640
gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttaaat 5700
atttgcttat acaatcttcc tgtttttggg gcttttctga ttatcaaccg gggtacatat 5760
gattgacatg ctagttttac gattaccgtt catcgattct cttgtttgct ccagactctc 5820
aggcaatgac ctgatagcct ttgtagagac ctctcaaaaa tagctaccct ctccggcatg 5880
aatttatcag ctagaacggt tgaatatcat attgatggtg atttgactgt ctccggcctt 5940
tctcacccgt ttgaatcttt acctacacat tactcaggca ttgcatttaa aatatatgag 6000
ggttctaaaa atttttatcc ttgcgttgaa ataaaggctt ctcccgcaaa agtattacag 6060
ggtcataatg tttttggtac aaccgattta gctttatgct ctgaggcttt attgcttaat 6120
tttgctaatt ctttgccttg cctgtatgat ttattggatg ttggaagttc ctgatgcggt 6180
attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa 6240
tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc 6300
cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga 6360
gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg 6420
tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg 6480
gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 6540
atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 6600
agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 6660
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 6720
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 6780
gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 6840
tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 6900
acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 6960
aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 7020
cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 7080
gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 7140
cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 7200
tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 7260
tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 7320
ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 7380
tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 7440
gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 7500
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 7560
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 7620
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 7680
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 7740
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 7800
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcgtac atacctcgct ctgctaatcc 7860
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 7920
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 7980
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 8040
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 8100
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 8160
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 8220
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 8280
acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gggtttgagt 8340
gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaccaag 8400
cggaagagc 8409
<210> 6
<211> 8611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 腺相关病毒
<400> 6
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcgcg 60
ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc 120
cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc actaggggtt 180
ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct aattatctac gtagccatgt ctagagttta 240
aacaagcttg catgtctaag ctagaccctt cagattaaaa ataactgagg taagggcctg 300
ggtaggggag gtggtgtgag acgctcctgt ctctcctcta tctgcccatc ggccctttgg 360
ggaggaggaa tgtgcccaag gactaaaaaa aggccatgga gccagagggg cgagggcaac 420
agacctttca tgggcaaacc ttggggccct gctgtctagc atgccccact acgggtctag 480
gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 540
agacatgtgg ctgccccccc ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct 600
ggtggatccc ctgcatgcga agatcttcga acaaggctgt gggggactga gggcaggctg 660
taacaggctt gggggccagg gcttatacgt gcctgggact cccaaagtat tactgttcca 720
tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac 780
cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca 840
cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca 900
ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat 960
aacccagggg cacaggggct gccctcattc taccaccacc tccacagcac agacagacac 1020
tcaggagcca gccagcggcg cgcccaggta agtttagtct ttttgtcttt tatttcaggt 1080
cccggatccg gtggtggtgc aaatcaaaga actgctcctc agtggatgtt gcctttactt 1140
ctaggcctgt acggaagtgt tacttctgct ctaaaagctg cggaattgta cccgcggccg 1200
ccaccatgct gtggtgggag gaggtggagg attgttatga aagggaggac gtgcagaaga 1260
agacttttac caagtgggtg aacgctcagt tcagcaaatt tgggaagcag cacatcgaga 1320
atctgttttc cgacctgcag gatgggagac ggctgctgga tctgctggaa ggactgactg 1380
gccagaagct gcccaaagag aaggggagca ctagggtgca cgccctgaac aacgtgaaca 1440
aagctctgag agtgctgcag aacaacaacg tggatctggt gaatattggc agtactgata 1500
tcgtggacgg gaaccacaaa ctgacactgg gcctgatctg gaacattatt ctgcactggc 1560
aggtgaaaaa tgtgatgaag aacatcatgg ccgggctgca gcagaccaat tccgagaaga 1620
tcctgctgtc ttgggtgcgg cagagcaccc gcaactatcc ccaggtgaac gtgattaact 1680
tcactacatc ctggagcgac gggctggccc tgaatgctct gattcacagc cacaggcctg 1740
atctgttcga ctggaatagc gtggtgtgcc agcagtctgc cacacagcgc ctggaacatg 1800
ccttcaatat cgctcggtac cagctgggga tcgaaaaact gctggaccca gaggatgtgg 1860
acactacata cccagataaa aagtctattc tgatgtacat tactagcctg ttccaggtgc 1920
tgccacagca ggtgtctatt gaagccattc aggaggtgga aatgctgccc cgccccccca 1980
aagtgactaa agaggagcat tttcagctgc atcatcagat gcattacagc cagcagatta 2040
ccgtgagcct ggctcaggga tatgagcgca ccagtagtcc aaaaccacgg ttcaagtcct 2100
acgcttatac ccaggctgcc tacgtgacaa ctagcgaccc tactagatcc ccctttccat 2160
cccagcacct ggaggcccca gaggacaaga gctttgggtc cagcctgatg gaaagcgagg 2220
tgaatctgga tcggtaccag acagccctgg aggaggtgct gagctggctg ctgagtgctg 2280
aagacacact gcaggcccag ggcgaaattt ccaatgacgt ggaagtggtg aaggatcagt 2340
tccacacaca cgagggctat atgatggacc tgacagctca ccaggggcgc gtgggcaata 2400
tcctgcagct gggctctaaa ctgatcggca ccgggaaact gagtgaggac gaggaaacag 2460
aagtgcagga gcagatgaac ctgctgaaca gccgctggga gtgtctgaga gtggctagta 2520
tggagaagca gtccaacctg caccgggtgc tgatggacct gcagaaccag aaactgaaag 2580
agctgaacga ctggctgaca aagactgagg aacgcacaag gaagatggag gaggagccac 2640
tgggacccga cctggaggat ctgaagagac aggtgcagca gcataaggtg ctgcaggagg 2700
atctggaaca ggagcaggtg cgggtgaact ccctgacaca tatggtggtg gtggtggacg 2760
aatctagtgg agatcacgcc accgccgccc tggaggaaca gctgaaggtg ctgggggacc 2820
ggtgggccaa catttgccgg tggaccgagg acaggtgggt gctgctgcag gacatcctgc 2880
tgaaatggca gaggctgacc gaggagcagt gtctgtttag tgcttggctg agcgagaaag 2940
aggacgccgt gaacaagatc cacacaaccg gctttaagga tcagaacgaa atgctgtcta 3000
gcctgcagaa actggctgtg ctgaaggccg atctggagaa aaagaagcag agcatgggca 3060
aactgtatag cctgaaacag gacctgctga gcaccctgaa gaacaagagc gtgacccaga 3120
agacagaagc ctggctggat aactttgccc gctgctggga caacctggtg cagaaactgg 3180
agaaaagtac agctcagatc tctcaggctg tgaccacaac ccagcctagc ctgacccaga 3240
caaccgtgat ggaaaccgtg accaccgtga caacccgcga acagatcctg gtgaaacatg 3300
cccaggaaga gctgccacct ccacctcccc agaagaagag aaccctggag cggctgcagg 3360
agctgcagga agccactgac gaactggacc tgaagctgag gcaggccgaa gtgattaagg 3420
ggtcttggca gcctgtgggc gatctgctga ttgattccct gcaggaccac ctggaaaagg 3480
tgaaggctct gagaggcgaa attgctccac tgaaggagaa cgtgagtcat gtgaacgatc 3540
tggctagaca gctgacaaca ctgggcatcc agctgagccc atacaatctg agcacactgg 3600
aggacctgaa taccaggtgg aagctgctgc aggtggctgt ggaagaccgg gtgcggcagc 3660
tgcatgaggc ccatcgcgac ttcggaccag ccagccagca ctttctgagc acatccgtgc 3720
aggggccctg ggagagggcc atttctccca acaaggtgcc ctactatatt aatcacgaga 3780
cccagaccac ttgttgggac catcccaaga tgacagaact gtaccagtcc ctggccgatc 3840
tgaacaacgt gaggtttagc gcttacagaa ccgctatgaa gctgagacgg ctgcagaagg 3900
ccctgtgcct ggatctgctg tccctgtccg ccgcctgcga tgccctggat cagcataatc 3960
tgaagcagaa cgatcagcca atggatatcc tgcagatcat caactgcctg accactatct 4020
acgacaggct ggagcaggag cacaacaacc tggtgaacgt gcctctgtgc gtggatatgt 4080
gcctgaactg gctgctgaac gtgtatgaca ctgggcgcac cggccggatc agagtgctga 4140
gttttaaaac tgggattatc tccctgtgta aggcccacct ggaggacaag tacaggtacc 4200
tgttcaagca ggtggctagt agcactggat tttgtgacca gcgccgcctg ggactgctgc 4260
tgcatgatag tatccagatt cctagacagc tgggagaggt ggctagtttc ggaggatcta 4320
acatcgaacc cagcgtgcgc agctgtttcc agtttgccaa taacaaacct gaaatcgagg 4380
ctgctctgtt cctggattgg atgcgcctgg aaccacagag catggtgtgg ctgcctgtgc 4440
tgcacagagt ggctgccgcc gaaactgcca agcaccaggc taaatgcaac atctgcaagg 4500
aatgtcccat tatcggcttt cgctacagga gtctgaaaca ttttaactac gatatttgcc 4560
agagctgctt cttttccgga agagtggcca aaggacacaa gatgcactac cctatggtgg 4620
aatattgcac cccaactaca tctggcgaag atgtgcgcga ttttgccaag gtgctgaaga 4680
ataagtttcg gactaagagg tacttcgcca agcacccccg catggggtat ctgccagtgc 4740
agacagtgct ggaaggagac aatatggaga ccgatacaat gtgagcggcc gcaataaaag 4800
atctttattt tcattagatc tgtgtgttgg ttttttgtgt gtctagagca tggctacgta 4860
gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac ccctagtgat ggagttggcc 4920
actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc 4980
ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gccagctggc gtaatagcga 5040
agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggaagtt 5100
ccagacgatt gagcgtcaaa atgtaggtat ttccatgagc gtttttcctg ttgcaatggc 5160
tggcggtaat attgttctgg atattaccag caaggccgat agtttgagtt cttctactca 5220
ggcaagtgat gttattacta atcaaagaag tattgcgaca acggttaatt tgcgtgatgg 5280
acagactctt ttactcggtg gcctcactga ttataaaaac acttctcagg attctggcgt 5340
accgttcctg tctaaaatcc ctttaatcgg cctcctgttt agctcccgct ctgattctaa 5400
cgaggaaagc acgttatacg tgctcgtcaa agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg 5460
cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc 5520
tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc 5580
gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgattta cggcacctcg 5640
accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg 5700
tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg 5760
gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt 5820
cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa 5880
tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt atacaatctt cctgtttttg gggcttttct 5940
gattatcaac cggggtacat atgattgaca tgctagtttt acgattaccg ttcatcgatt 6000
ctcttgtttg ctccagactc tcaggcaatg acctgatagc ctttgtagag acctctcaaa 6060
aatagctacc ctctccggca tgaatttatc agctagaacg gttgaatatc atattgatgg 6120
tgatttgact gtctccggcc tttctcaccc gtttgaatct ttacctacac attactcagg 6180
cattgcattt aaaatatatg agggttctaa aaatttttat ccttgcgttg aaataaaggc 6240
ttctcccgca aaagtattac agggtcataa tgtttttggt acaaccgatt tagctttatg 6300
ctctgaggct ttattgctta attttgctaa ttctttgcct tgcctgtatg atttattgga 6360
tgttggaagt tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 6420
atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac 6480
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 6540
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 6600
cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata 6660
atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 6720
ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 6780
cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt 6840
cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta 6900
aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc 6960
ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa 7020
gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc 7080
cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt 7140
acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact 7200
gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac 7260
aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata 7320
ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta 7380
ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg 7440
gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat 7500
aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt 7560
aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga 7620
aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa 7680
gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 7740
gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac 7800
tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc 7860
gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 7920
caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 7980
actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcgt 8040
acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 8100
cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 8160
gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta 8220
cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 8280
gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 8340
tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc 8400
tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg 8460
gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat 8520
aaccgtatta ccgggtttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc 8580
agcgagtcag tgagcgacca agcggaagag c 8611
<210> 7
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 腺相关病毒
<400> 7
aagcttgcat gtctaagcta gacccttcag attaaaaata actgaggtaa gggcctgggt 60
aggggaggtg gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga 120
ggaggaatgt gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga 180
cctttcatgg gcaaaccttg gggccctgct gtctagcatg ccccactacg ggtctaggct 240
gcccatgtaa ggaggcaagg cctggggaca cccgagatgc ctggttataa ttaacccaga 300
catgtggctg cccccccccc cccaacacct gctgcctcta aaaataaccc tgtccctggt 360
ggatcccctg catgcgaaga tcttcgaaca aggctgtggg ggactgaggg caggctgtaa 420
caggcttggg ggccagggct tatacgtgcc tgggactccc aaagtattac tgttccatgt 480
tcccggcgaa gggccagctg tcccccgcca gctagactca gcacttagtt taggaaccag 540
tgagcaagtc agcccttggg gcagcccata caaggccatg gggctgggca agctgcacgc 600
ctgggtccgg ggtgggcacg gtgcccgggc aacgagctga aagctcatct gctctcaggg 660
gcccctccct ggggacagcc cctcctggct agtcacaccc tgtaggctcc tctatataac 720
ccaggggcac aggggctgcc ctcattctac caccacctcc acagcacaga cagacactca 780
ggagcagcca gc 792
<210> 8
<211> 8629
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卡那霉素质粒
<400> 8
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgctctag 180
agtttaaaca agcttgcatg tctaagctag acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag 240
ggcctgggta ggggaggtgg tgtgagacgc tcctgtctct cctctatctg cccatcggcc 300
ctttggggag gaggaatgtg cccaaggact aaaaaaaggc catggagcca gaggggcgag 360
ggcaacagac ctttcatggg caaaccttgg ggccctgctg tctagcatgc cccactacgg 420
gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat 480
taacccagac atgtggctgc cccccccccc ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct 540
gtccctggtg gatcccctgc atgcgaagat cttcgaacaa ggctgtgggg gactgagggc 600
aggctgtaac aggcttgggg gccagggctt atacgtgcct gggactccca aagtattact 660
gttccatgtt cccggcgaag ggccagctgt cccccgccag ctagactcag cacttagttt 720
aggaaccagt gagcaagtca gcccttgggg cagcccatac aaggccatgg ggctgggcaa 780
gctgcacgcc tgggtccggg gtgggcacgg tgcccgggca acgagctgaa agctcatctg 840
ctctcagggg cccctccctg gggacagccc ctcctggcta gtcacaccct gtaggctcct 900
ctatataacc caggggcaca ggggctgccc tcattctacc accacctcca cagcacagac 960
agacactcag gagcagccag cggcgcgccc aggtaagttt agtctttttg tcttttattt 1020
caggtcccgg atccggtggt ggtgcaaatc aaagaactgc tcctcagtgg atgttgcctt 1080
tacttctagg cctgtacgga agtgttactt ctgctctaaa agctgcggaa ttgtacccgc 1140
ggccgccacc atgctgtggt gggaggaggt ggaggattgt tatgaaaggg aggacgtgca 1200
gaagaagact tttaccaagt gggtgaacgc tcagttcagc aaatttggga agcagcacat 1260
cgagaatctg ttttccgacc tgcaggatgg gagacggctg ctggatctgc tggaaggact 1320
gactggccag aagctgccca aagagaaggg gagcactagg gtgcacgccc tgaacaacgt 1380
gaacaaagct ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggat ctggtgaata ttggcagtac 1440
tgatatcgtg gacgggaacc acaaactgac actgggcctg atctggaaca ttattctgca 1500
ctggcaggtg aaaaatgtga tgaagaacat catggccggg ctgcagcaga ccaattccga 1560
gaagatcctg ctgtcttggg tgcggcagag cacccgcaac tatccccagg tgaacgtgat 1620
taacttcact acatcctgga gcgacgggct ggccctgaat gctctgattc acagccacag 1680
gcctgatctg ttcgactgga atagcgtggt gtgccagcag tctgccacac agcgcctgga 1740
acatgccttc aatatcgctc ggtaccagct ggggatcgaa aaactgctgg acccagagga 1800
tgtggacact acatacccag ataaaaagtc tattctgatg tacattacta gcctgttcca 1860
ggtgctgcca cagcaggtgt ctattgaagc cattcaggag gtggaaatgc tgccccgccc 1920
ccccaaagtg actaaagagg agcattttca gctgcatcat cagatgcatt acagccagca 1980
gattaccgtg agcctggctc agggatatga gcgcaccagt agtccaaaac cacggttcaa 2040
gtcctacgct tatacccagg ctgcctacgt gacaactagc gaccctacta gatccccctt 2100
tccatcccag cacctggagg ccccagagga caagagcttt gggtccagcc tgatggaaag 2160
cgaggtgaat ctggatcggt accagacagc cctggaggag gtgctgagct ggctgctgag 2220
tgctgaagac acactgcagg cccagggcga aatttccaat gacgtggaag tggtgaagga 2280
tcagttccac acacacgagg gctatatgat ggacctgaca gctcaccagg ggcgcgtggg 2340
caatatcctg cagctgggct ctaaactgat cggcaccggg aaactgagtg aggacgagga 2400
aacagaagtg caggagcaga tgaacctgct gaacagccgc tgggagtgtc tgagagtggc 2460
tagtatggag aagcagtcca acctgcaccg ggtgctgatg gacctgcaga accagaaact 2520
gaaagagctg aacgactggc tgacaaagac tgaggaacgc acaaggaaga tggaggagga 2580
gccactggga cccgacctgg aggatctgaa gagacaggtg cagcagcata aggtgctgca 2640
ggaggatctg gaacaggagc aggtgcgggt gaactccctg acacatatgg tggtggtggt 2700
ggacgaatct agtggagatc acgccaccgc cgccctggag gaacagctga aggtgctggg 2760
ggaccggtgg gccaacattt gccggtggac cgaggacagg tgggtgctgc tgcaggacat 2820
cctgctgaaa tggcagaggc tgaccgagga gcagtgtctg tttagtgctt ggctgagcga 2880
gaaagaggac gccgtgaaca agatccacac aaccggcttt aaggatcaga acgaaatgct 2940
gtctagcctg cagaaactgg ctgtgctgaa ggccgatctg gagaaaaaga agcagagcat 3000
gggcaaactg tatagcctga aacaggacct gctgagcacc ctgaagaaca agagcgtgac 3060
ccagaagaca gaagcctggc tggataactt tgcccgctgc tgggacaacc tggtgcagaa 3120
actggagaaa agtacagctc agatctctca ggctgtgacc acaacccagc ctagcctgac 3180
ccagacaacc gtgatggaaa ccgtgaccac cgtgacaacc cgcgaacaga tcctggtgaa 3240
acatgcccag gaagagctgc cacctccacc tccccagaag aagagaaccc tggagcggct 3300
gcaggagctg caggaagcca ctgacgaact ggacctgaag ctgaggcagg ccgaagtgat 3360
taaggggtct tggcagcctg tgggcgatct gctgattgat tccctgcagg accacctgga 3420
aaaggtgaag gctctgagag gcgaaattgc tccactgaag gagaacgtga gtcatgtgaa 3480
cgatctggct agacagctga caacactggg catccagctg agcccataca atctgagcac 3540
actggaggac ctgaatacca ggtggaagct gctgcaggtg gctgtggaag accgggtgcg 3600
gcagctgcat gaggcccatc gcgacttcgg accagccagc cagcactttc tgagcacatc 3660
cgtgcagggg ccctgggaga gggccatttc tcccaacaag gtgccctact atattaatca 3720
cgagacccag accacttgtt gggaccatcc caagatgaca gaactgtacc agtccctggc 3780
cgatctgaac aacgtgaggt ttagcgctta cagaaccgct atgaagctga gacggctgca 3840
gaaggccctg tgcctggatc tgctgtccct gtccgccgcc tgcgatgccc tggatcagca 3900
taatctgaag cagaacgatc agccaatgga tatcctgcag atcatcaact gcctgaccac 3960
tatctacgac aggctggagc aggagcacaa caacctggtg aacgtgcctc tgtgcgtgga 4020
tatgtgcctg aactggctgc tgaacgtgta tgacactggg cgcaccggcc ggatcagagt 4080
gctgagtttt aaaactggga ttatctccct gtgtaaggcc cacctggagg acaagtacag 4140
gtacctgttc aagcaggtgg ctagtagcac tggattttgt gaccagcgcc gcctgggact 4200
gctgctgcat gatagtatcc agattcctag acagctggga gaggtggcta gtttcggagg 4260
atctaacatc gaacccagcg tgcgcagctg tttccagttt gccaataaca aacctgaaat 4320
cgaggctgct ctgttcctgg attggatgcg cctggaacca cagagcatgg tgtggctgcc 4380
tgtgctgcac agagtggctg ccgccgaaac tgccaagcac caggctaaat gcaacatctg 4440
caaggaatgt cccattatcg gctttcgcta caggagtctg aaacatttta actacgatat 4500
ttgccagagc tgcttctttt ccggaagagt ggccaaagga cacaagatgc actaccctat 4560
ggtggaatat tgcaccccaa ctacatctgg cgaagatgtg cgcgattttg ccaaggtgct 4620
gaagaataag tttcggacta agaggtactt cgccaagcac ccccgcatgg ggtatctgcc 4680
agtgcagaca gtgctggaag gagacaatat ggagaccgat acaatgtgag cggccgcaat 4740
aaaagatctt tattttcatt agatctgtgt gttggttttt tgtgtgtcta gagtcgacca 4800
gagcatggct acgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta 4860
gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca 4920
aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 4980
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 5040
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 5100
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 5160
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 5220
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 5280
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 5340
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 5400
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 5460
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 5520
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 5580
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 5640
acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 5700
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 5760
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 5820
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 5880
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 5940
tctaaagtat atatgagtaa aaatattccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag 6000
gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc 6060
aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 6120
ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 6180
caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 6240
gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg 6300
cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 6360
gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatcc 6420
caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 6480
cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 6540
actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 6600
gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc 6660
gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 6720
ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 6780
cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 6840
atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 6900
accggtaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 6960
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 7020
ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga 7080
ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 7140
cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 7200
cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 7260
tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 7320
gcatcaggcg attccaacat ccaataaatc atacaggcaa ggcaaagaat tagcaaaatt 7380
aagcaataaa gcctcagagc ataaagctaa atcggttgta ccaaaaacat tatgaccctg 7440
taatactttt gcgggagaag cctttatttc aacgcaagga taaaaatttt tagaaccctc 7500
atatatttta aatgcaatgc ctgagtaatg tgtaggtaaa gattcaaacg ggtgagaaag 7560
gccggagaca gtcaaatcac catcaatatg atattcaacc gttctagctg ataaattcat 7620
gccggagagg gtagctattt ttgagaggtc tctacaaagg ctatcaggtc attgcctgag 7680
agtctggagc aaacaagaga atcgatgaac ggtaatcgta aaactagcat gtcaatcata 7740
tgtaccccgg ttgataatca gaaaagcccc aaaaacagga agattgtata agcaaatatt 7800
taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca 7860
ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag 7920
atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc 7980
aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc 8040
taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc 8100
ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa 8160
gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc 8220
acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtact atggttgctt tgacgagcac 8280
gtataacgtg ctttcctcgt tagaatcaga gcgggagcta aacaggaggc cgattaaagg 8340
gattttagac aggaacggta cgccagaatc ctgagaagtg tttttataat cagtgaggcc 8400
accgagtaaa agagtctgtc catcacgcaa attaaccgtt gtcgcaatac ttctttgatt 8460
agtaataaca tcacttgcct gagtagaaga actcaaacta tcggccttgc tggtaatatc 8520
cagaacaata ttaccgccag ccattgcaac ggaatcgcca ttcgccattc aggctgcgca 8580
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagct 8629
<210> 9
<211> 4977
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卡那霉素盒
<400> 9
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgctctag 180
agtttaaaca agcttgcatg tctaagctag acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag 240
ggcctgggta ggggaggtgg tgtgagacgc tcctgtctct cctctatctg cccatcggcc 300
ctttggggag gaggaatgtg cccaaggact aaaaaaaggc catggagcca gaggggcgag 360
ggcaacagac ctttcatggg caaaccttgg ggccctgctg tctagcatgc cccactacgg 420
gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat 480
taacccagac atgtggctgc cccccccccc ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct 540
gtccctggtg gatcccctgc atgcgaagat cttcgaacaa ggctgtgggg gactgagggc 600
aggctgtaac aggcttgggg gccagggctt atacgtgcct gggactccca aagtattact 660
gttccatgtt cccggcgaag ggccagctgt cccccgccag ctagactcag cacttagttt 720
aggaaccagt gagcaagtca gcccttgggg cagcccatac aaggccatgg ggctgggcaa 780
gctgcacgcc tgggtccggg gtgggcacgg tgcccgggca acgagctgaa agctcatctg 840
ctctcagggg cccctccctg gggacagccc ctcctggcta gtcacaccct gtaggctcct 900
ctatataacc caggggcaca ggggctgccc tcattctacc accacctcca cagcacagac 960
agacactcag gagcagccag cggcgcgccc aggtaagttt agtctttttg tcttttattt 1020
caggtcccgg atccggtggt ggtgcaaatc aaagaactgc tcctcagtgg atgttgcctt 1080
tacttctagg cctgtacgga agtgttactt ctgctctaaa agctgcggaa ttgtacccgc 1140
ggccgccacc atgctgtggt gggaggaggt ggaggattgt tatgaaaggg aggacgtgca 1200
gaagaagact tttaccaagt gggtgaacgc tcagttcagc aaatttggga agcagcacat 1260
cgagaatctg ttttccgacc tgcaggatgg gagacggctg ctggatctgc tggaaggact 1320
gactggccag aagctgccca aagagaaggg gagcactagg gtgcacgccc tgaacaacgt 1380
gaacaaagct ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggat ctggtgaata ttggcagtac 1440
tgatatcgtg gacgggaacc acaaactgac actgggcctg atctggaaca ttattctgca 1500
ctggcaggtg aaaaatgtga tgaagaacat catggccggg ctgcagcaga ccaattccga 1560
gaagatcctg ctgtcttggg tgcggcagag cacccgcaac tatccccagg tgaacgtgat 1620
taacttcact acatcctgga gcgacgggct ggccctgaat gctctgattc acagccacag 1680
gcctgatctg ttcgactgga atagcgtggt gtgccagcag tctgccacac agcgcctgga 1740
acatgccttc aatatcgctc ggtaccagct ggggatcgaa aaactgctgg acccagagga 1800
tgtggacact acatacccag ataaaaagtc tattctgatg tacattacta gcctgttcca 1860
ggtgctgcca cagcaggtgt ctattgaagc cattcaggag gtggaaatgc tgccccgccc 1920
ccccaaagtg actaaagagg agcattttca gctgcatcat cagatgcatt acagccagca 1980
gattaccgtg agcctggctc agggatatga gcgcaccagt agtccaaaac cacggttcaa 2040
gtcctacgct tatacccagg ctgcctacgt gacaactagc gaccctacta gatccccctt 2100
tccatcccag cacctggagg ccccagagga caagagcttt gggtccagcc tgatggaaag 2160
cgaggtgaat ctggatcggt accagacagc cctggaggag gtgctgagct ggctgctgag 2220
tgctgaagac acactgcagg cccagggcga aatttccaat gacgtggaag tggtgaagga 2280
tcagttccac acacacgagg gctatatgat ggacctgaca gctcaccagg ggcgcgtggg 2340
caatatcctg cagctgggct ctaaactgat cggcaccggg aaactgagtg aggacgagga 2400
aacagaagtg caggagcaga tgaacctgct gaacagccgc tgggagtgtc tgagagtggc 2460
tagtatggag aagcagtcca acctgcaccg ggtgctgatg gacctgcaga accagaaact 2520
gaaagagctg aacgactggc tgacaaagac tgaggaacgc acaaggaaga tggaggagga 2580
gccactggga cccgacctgg aggatctgaa gagacaggtg cagcagcata aggtgctgca 2640
ggaggatctg gaacaggagc aggtgcgggt gaactccctg acacatatgg tggtggtggt 2700
ggacgaatct agtggagatc acgccaccgc cgccctggag gaacagctga aggtgctggg 2760
ggaccggtgg gccaacattt gccggtggac cgaggacagg tgggtgctgc tgcaggacat 2820
cctgctgaaa tggcagaggc tgaccgagga gcagtgtctg tttagtgctt ggctgagcga 2880
gaaagaggac gccgtgaaca agatccacac aaccggcttt aaggatcaga acgaaatgct 2940
gtctagcctg cagaaactgg ctgtgctgaa ggccgatctg gagaaaaaga agcagagcat 3000
gggcaaactg tatagcctga aacaggacct gctgagcacc ctgaagaaca agagcgtgac 3060
ccagaagaca gaagcctggc tggataactt tgcccgctgc tgggacaacc tggtgcagaa 3120
actggagaaa agtacagctc agatctctca ggctgtgacc acaacccagc ctagcctgac 3180
ccagacaacc gtgatggaaa ccgtgaccac cgtgacaacc cgcgaacaga tcctggtgaa 3240
acatgcccag gaagagctgc cacctccacc tccccagaag aagagaaccc tggagcggct 3300
gcaggagctg caggaagcca ctgacgaact ggacctgaag ctgaggcagg ccgaagtgat 3360
taaggggtct tggcagcctg tgggcgatct gctgattgat tccctgcagg accacctgga 3420
aaaggtgaag gctctgagag gcgaaattgc tccactgaag gagaacgtga gtcatgtgaa 3480
cgatctggct agacagctga caacactggg catccagctg agcccataca atctgagcac 3540
actggaggac ctgaatacca ggtggaagct gctgcaggtg gctgtggaag accgggtgcg 3600
gcagctgcat gaggcccatc gcgacttcgg accagccagc cagcactttc tgagcacatc 3660
cgtgcagggg ccctgggaga gggccatttc tcccaacaag gtgccctact atattaatca 3720
cgagacccag accacttgtt gggaccatcc caagatgaca gaactgtacc agtccctggc 3780
cgatctgaac aacgtgaggt ttagcgctta cagaaccgct atgaagctga gacggctgca 3840
gaaggccctg tgcctggatc tgctgtccct gtccgccgcc tgcgatgccc tggatcagca 3900
taatctgaag cagaacgatc agccaatgga tatcctgcag atcatcaact gcctgaccac 3960
tatctacgac aggctggagc aggagcacaa caacctggtg aacgtgcctc tgtgcgtgga 4020
tatgtgcctg aactggctgc tgaacgtgta tgacactggg cgcaccggcc ggatcagagt 4080
gctgagtttt aaaactggga ttatctccct gtgtaaggcc cacctggagg acaagtacag 4140
gtacctgttc aagcaggtgg ctagtagcac tggattttgt gaccagcgcc gcctgggact 4200
gctgctgcat gatagtatcc agattcctag acagctggga gaggtggcta gtttcggagg 4260
atctaacatc gaacccagcg tgcgcagctg tttccagttt gccaataaca aacctgaaat 4320
cgaggctgct ctgttcctgg attggatgcg cctggaacca cagagcatgg tgtggctgcc 4380
tgtgctgcac agagtggctg ccgccgaaac tgccaagcac caggctaaat gcaacatctg 4440
caaggaatgt cccattatcg gctttcgcta caggagtctg aaacatttta actacgatat 4500
ttgccagagc tgcttctttt ccggaagagt ggccaaagga cacaagatgc actaccctat 4560
ggtggaatat tgcaccccaa ctacatctgg cgaagatgtg cgcgattttg ccaaggtgct 4620
gaagaataag tttcggacta agaggtactt cgccaagcac ccccgcatgg ggtatctgcc 4680
agtgcagaca gtgctggaag gagacaatat ggagaccgat acaatgtgag cggccgcaat 4740
aaaagatctt tattttcatt agatctgtgt gttggttttt tgtgtgtcta gagtcgacca 4800
gagcatggct acgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta 4860
gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca 4920
aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 4977

Claims (53)

1.一种通过悬浮播种工艺在贴壁哺乳动物细胞中产生重组腺相关病毒(rAAV)rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白的方法，包括：
(a)在N-2容器中用包含血清的第一生长培养基培养细胞；
(b)从第一培养基中移出细胞；
(c)将来自步骤(b)的细胞接种到N-1容器中的不含血清或血清浓度低于第一培养基的第二培养基中；
(d)在悬浮条件下培养N-1容器中的细胞；以及
(e)用来自步骤(d)的细胞接种生物反应器中的第三培养基。
2.权利要求1的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列。
3.权利要求2的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述rAAV包含SEQ ID NO:1的人微小抗肌营养不良蛋白核苷酸序列和SEQ ID NO:7的MHCK7启动子序列。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述悬浮播种工艺还包括：
(f)用包含rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒、包含AAVrep基因和AAV cap基因的质粒以及腺病毒辅助质粒转染贴壁细胞。
6.权利要求5的方法，其中包含rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白构建体的转基因质粒包含：
SEQ ID NO:9的核酸序列；
SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021；或者
SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977。
7.权利要求5或6的方法，其中所述包含AAV rep基因和AAV cap基因的质粒包含AAV2rep基因和rAAVrh74 cap基因。
8.权利要求5至7中任一项的方法，其中所述腺病毒辅助质粒包含腺病毒5E2A、E4ORF6和VA RNA基因。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述悬浮播种工艺还包括：
(g)裂解贴壁细胞。
10.权利要求9的方法，其中通过冻融、固体剪切、高渗和/或低渗裂解、液体剪切、超声、高压挤出、去污剂裂解或其组合来裂解所述贴壁细胞。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述悬浮播种工艺还包括：
(h)通过至少一个柱色谱步骤纯化rAAV。
12.权利要求11的方法，其中所述至少一个柱色谱步骤包括阴离子交换色谱、尺寸排阻色谱或其组合。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述悬浮播种工艺进一步包括在N-3容器中用所述第一生长培养基培养细胞。
14.权利要求13的方法，其中所述悬浮播种工艺进一步包括在N-4容器中用所述第一生长培养基培养细胞。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述生物反应器是贴壁生物反应器。
16.权利要求15的方法，其中从在贴壁生物反应器中产生的培养物纯化rAAV。
17.权利要求15或16的方法，其中生物反应器中的第三培养基包含至少一种促进细胞粘附的因子。
18.权利要求17的方法，其中所述至少一种促进细胞粘附的因子选自血清、FBS、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、钙离子、细胞外基质的蛋白聚糖或非蛋白聚糖多糖和其组合。
19.权利要求17或18的方法，其中所述生物反应器中的第三培养基包含DMEM和10％FBS。
20.权利要求1至19中任一项的方法，其中将所述贴壁细胞在悬浮条件下培养约48-72小时。
21.权利要求1至20中任一项的方法，其中所述N-1容器是悬浮摇瓶。
22.权利要求1至21中任一项的方法，其中所述贴壁细胞选自由HeLa细胞、CHO细胞、HEK-293细胞、VERO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞和COS细胞组成的组。
23.权利要求22的方法，其中所述贴壁细胞是HeLa细胞或HEK-293细胞。
24.权利要求23的方法，其中所述贴壁细胞是HEK-293细胞。
25.权利要求1至24中任一项的方法，其中所述贴壁细胞不是经悬浮适应的。
26.权利要求1至25中任一项的方法，其中在悬浮条件下培养细胞不改变所述细胞的贴壁依赖性。
27.权利要求1至26中任一项的方法，其中所述培养不改变所述细胞以产生新的细胞系。
28.一种组合物，其包含重组腺相关病毒(rAAV)rAAVrh74.MHCK7.微小抗肌营养不良蛋白，其中所述rAAV是通过权利要求1至27中任一项的方法制备的。
29.权利要求28的组合物，其中所述组合物包含：
a)包含SEQ ID NO:9的核酸序列的rAAV颗粒；
b)包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-5021的rAAV颗粒；和/或
c)包含SEQ ID NO:8的核苷酸1-4977的rAAV颗粒。
30.一种治疗有需要的人类受试者中的肌营养不良的方法，包括向所述人类受试者施用权利要求29的组合物。
31.权利要求30的方法，其中所述rAAV使用全身施用途径并以约5.0x1012 vg/kg至约1.0x1015 vg/kg的剂量施用。
32.权利要求31的方法，其中所述全身施用途径是静脉内途径并且所施用的rAAV的剂量为约2x 1014vg/kg。
33.权利要求30至32中任一项的方法，其中rAAV的剂量以约10mL/kg的浓度施用。
34.权利要求30至33中任一项的方法，其中所述rAAV通过注射、输注或植入来施用。
35.权利要求34的方法，其中所述rAAV通过输注在大约一小时内施用。
36.权利要求30至35中任一项的方法，其中所述rAAV经由外周肢体静脉通过静脉内途径施用。
37.权利要求30至36中任一项的方法，其中所述肌营养不良是杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良。
38.权利要求37的方法，其中所述肌营养不良是杜氏肌营养不良。
39.权利要求30至38中任一项的方法，其中与施用所述rAAV之前的微小抗肌营养不良蛋白基因表达的水平相比，在施用所述rAAV之后所述受试者的细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因表达的水平增加。
40.权利要求39的方法，其中通过在施用所述rAAV之前和之后通过蛋白质印迹测量肌肉活检中的微小抗肌营养不良蛋白水平来检测所述细胞中的微小抗肌营养不良蛋白基因的表达。
41.权利要求40的方法，其中与施用之前相比，施用rAAV之后的表达为至少55.4％。
42.权利要求30至41中任一项的方法，其中与施用所述rAAV之前的微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的数量相比，在施用所述rAAV之后所述受试者的肌肉组织中的微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的平均百分比增加。
43.权利要求42的方法，其中如在施用rAAV之前和之后的肌肉活检中通过免疫荧光(IF)所检测的，微小抗肌营养不良蛋白阳性纤维的平均百分比为至少70.5％，平均强度为至少116.9％。
44.权利要求30至43中任一项的方法，其中通过载体基因组计数的微小抗肌营养不良蛋白转导为每个细胞核至少3.87个平均载体基因组拷贝。
45.权利要求30至44中任一项的方法，其中将所述组合物施用于基因分型的患者。
46.权利要求45的方法，其中对所述基因分型的患者针对人抗肌营养不良蛋白(DMD)基因的外显子18-79中的至少一种突变进行基因分型。
47.权利要求45或46的方法，进一步包括在向所述人类受试者施用所述组合物之前对所述人类受试者的DMD基因进行基因分型。
48.权利要求47的方法，其中所述基因分型检测DMD基因的外显子18至79中的至少一种突变。
49.权利要求48的方法，其中所述至少一种突变是移码缺失、移码重复、过早终止或导致人抗肌营养不良蛋白的表达缺失的其他致病性变异。
50.权利要求28或29的组合物用于治疗有需要的人类受试者中的肌营养不良的用途。
51.权利要求28或29的组合物在制备用于治疗肌营养不良的药物中的用途。
52.权利要求50或51的用途，其中所述肌营养不良是杜氏肌营养不良或贝克肌营养不良。
53.权利要求52的用途，其中所述肌营养不良是杜氏肌营养不良。
CN202280049147.2A 2021-05-17 2022-05-13 产生用于治疗肌营养不良的重组aav载体 Pending CN117642509A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63/189,676 2021-05-17
US63/209,733 2021-06-11
US63/243,944 2021-09-14
US202163253998P 2021-10-08 2021-10-08
US63/253,998 2021-10-08
PCT/US2022/029328 WO2022245675A1 (en) 2021-05-17 2022-05-13 Production of recombinant aav vectors for treating muscular dystrophy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117642509A true CN117642509A (zh) 2024-03-01

Family

ID=90023812

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280049147.2A Pending CN117642509A (zh) 2021-05-17 2022-05-13 产生用于治疗肌营养不良的重组aav载体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117642509A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210022038A (ko) 근육 이영양증을 치료하기 위한 근육 특이적 마이크로-디스트로핀의 아데노-연관 바이러스 벡터 전달
KR102649707B1 (ko) 근이영양증을 치료하기 위한 마이크로-디스트로핀의 아데노-관련 바이러스 벡터 전달
KR102178322B1 (ko) 변형된 인자 ix, 및 세포, 기관 및 조직으로 유전자를 전달하기 위한 조성물, 방법 및 용도
JP2023053254A (ja) 筋ジストロフィーを治療するための筋肉特異的マイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクター送達
IL272339B1 (en) Cellular models and treatments for eye diseases
CN109451729B (zh) 工程化病毒载体减少了炎症和免疫反应的诱导
KR20180016722A (ko) 재조합 glut1 아데노-관련 바이러스 벡터 작제물 및 glut1 발현을 회복하기 위한 관련된 방법
KR20200023280A (ko) 신경 세로이드 지질갈색소증에 대한 유전자 요법
US20210393801A1 (en) Adeno-Associated Virus Vector Delivery for Muscular Dystrophies
CN113817775B (zh) 修饰的阿柏西普、组合物、方法及其在基因治疗中的应用
US20210299275A1 (en) Gene therapy for the treatment of galactosemia
KR20240001708A (ko) 유전적 장애의 치료를 위해 생체내 뉴클레아제-매개의 유전자 표적화를 위한 조성물 및 방법
KR20240021765A (ko) 근이영양증 치료를 위한 재조합 aav 벡터의 제조
EP3596203A1 (en) Rational polyploid adeno-associated virus vectors and methods of making and using the same
CN117642509A (zh) 产生用于治疗肌营养不良的重组aav载体
CN115109788A (zh) Aav介导的人脂蛋白脂酶肝脏异位表达载体及其用途
CN117693592A (zh) 用于治疗遗传性疾患的体内核酸酶介导的基因靶向的组合物和方法
CN115698332A (zh) 在单细胞水平上评估载体转导效率和/或特异性的方法
KR20230117177A (ko) 진행성 골화성 섬유이형성증을 위한 신규 유전자 치료제의개발

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination