KR20180034467A - L-dopa의 전신 합성 및 조절 - Google Patents

L-dopa의 전신 합성 및 조절 Download PDF

Info

Publication number
KR20180034467A
KR20180034467A KR1020187003356A KR20187003356A KR20180034467A KR 20180034467 A KR20180034467 A KR 20180034467A KR 1020187003356 A KR1020187003356 A KR 1020187003356A KR 20187003356 A KR20187003356 A KR 20187003356A KR 20180034467 A KR20180034467 A KR 20180034467A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
expression system
ala
leu
glu
Prior art date
Application number
KR1020187003356A
Other languages
English (en)
Inventor
마이클 맥도날드
Original Assignee
마이오도파 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 마이오도파 리미티드 filed Critical 마이오도파 리미티드
Publication of KR20180034467A publication Critical patent/KR20180034467A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C12Y114/15002—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/16—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced pteridine as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.16)
    • C12Y114/16002—Tyrosine 3-monooxygenase (1.14.16.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04016—GTP cyclohydrolase I (3.5.4.16)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03012—6-Pyruvoyltetrahydropterin synthase (4.2.3.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13162—2,5-Diketocamphane 1,2-monooxygenase (1.14.13.162), i.e. camphor 1,2-monooxygenase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 효소 대체 요법(replacement therapy)을 위한 발현 시스템에 관한 것으로, 이 발현 시스템의 전신 투여를 통하여 달성되는, 개체의 혈중 L-DOPA의 안정 수준을 획득하거나 또는 유지하는 것을 목적으로 한다. 따라서, 본 발명은 카테콜아민(catecholamine) 결핍 장애, 이를 테면, 파킨슨병을 비롯한 도파민 결핍 장애의 치료에 유용하다.

Description

L-DOPA의 전신 합성 및 조절{SYSTEMIC SYNTHESIS AND REGULATION OF L-DOPA}
본 출원에 인용된 특허 및 비-특허 모든 문헌은 그 전문이 본원에 참고로써 편입되어 있다.
I. 본 발명의 기술 분야
본 발명은 표적 세포에서 차등적으로 발현되는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된 발현 시스템에 관계하는데; 그리고 이 시스템은 카테콜아민 기능장애와 연관된 의학적 상태, 구체적으로 도파민 결핍과 연관된 질환, 이를 테면, 파킨슨 질환 및 L-DOPA 유도된 이상운동증(dyskinesia)을 비롯한 관련된 장애를 치료하기 위하여, 이를 필요로 하는 환자에게 말초적으로(peripherally) 투여된다.
II. 본 발명의 배경
파킨슨 질환(PD)은 진전증(tremor), 강직성, 자발적인 운동의 지연 및 자세 불안정성을 임상적 특징으로 하는 흔한 신경 퇴행성 질환이다. 흑색질 내 치밀부(substantia nigra pars compacta, SNpc), 뉴런내 세포질 봉입체(intraneuronal cytoplasmic inclusions) 또는 "루위체(Lewy bodies)" 안에 도파민성 뉴런의 상실, 신경아교증 및 선조체(striatal) 도파민 고갈은 주요 신경병리학적 결과다. 사례의 10 %를 차지하는 특정 유전자 결함과 연계된 유전적 사례를 제외하고, PD는 원인 불명의 산발적인 상태다.
도파민은 혈액 뇌 장벽을 넘지 못한다. 선조체 도파민 결손은 도파민의 말초(peripheral) 투여에 의해 해결될 수 없다. 도파민(DA) 전구물질(precursor) L-3,4-디히드록시페닐알라닌(L-DOPA)을 이용한 치료법은 파킨슨 질환 치료에 가장 효과적인 치료다. 그러나, 초기 치료 반응은 우수하지만, 수년 동안 과정에 걸쳐 대부분의 환자는 L-DOPA-유도된 이상운동증과 같은 치료법-관련 부작용을 겪는다.(Obeso, Olanow, & Nutt, 2000)(Ahlskog & Muenter, 2001). 이러한 합병증은 선조체 뉴런에서 과민성 DA 수용체의 간헐적인 박동성 자극으로 인해 발생하는 것으로 보고 있다.(Chase, 1998)(Nutt, Obeso, & Stocchi, 2000).
흑질 도파민 뉴런은 초당 ~4회 주기의 일정한 속도로 활달하게 발화한다. 이와 같은 기본 발화는 음식과 같은 예기치 못했거나 보상적인(rewarding) 자극이 제시될 때 폭발적 상태(phasic bursts)로 간단히 중단된다. 신경 전달 물질 방출의 양은 일반적으로 신경 발사(firing)의 속도를 반영하기 때문에, 선조체 도파민 농도는 상당히 좁은 범위에 머물러 있으며, 흑질선조체 시냅스의 도파민 수용체는 상당히 안정한 농도의 동족(cognate) 신경전달물질에 노출된다. 흑질선조체 도파민성 뉴런의 탈신경이 증가될 때, 외인성 도파로부터 형성된 선조체 도파민에 노출이 잠시 증가되기 시작하고, 그리고 도파민 농도의 상대적 상승 및 하락은 생리학적으로 발생하는 진폭(amplitude)보다 더 큰 진폭을 얻는다. 초기 질병에서는 경구 투여로 인한 도파 전달의 불가피한 변동성이 크게 눈에 띄지 않으며, 대부분의 환자는 일관된 이익을 얻는다. 이러한 안정적인 반응은 외인성 도파를 장기간의 운동 반응으로 전환시키는 잔류 도파민성 뉴런의 능력을 반영한다. 이러한 관찰은 초기 파킨슨 질환에서 흑질 도파민성 뉴런의 충분한 생존 보체(complement)의 존재가 뇌 도파의 성쇠(vicissitudes)로부터 선조체를 보호한다는 개념과 일치한다.
치료가 계속됨에 따라, L-DOPA의 약동학적 성질은 임상적으로 더 큰 관련성을 갖기 시작하고, 90-분 반감기에서 예측되는 더-짧은 기간의 운동 반응이 명백해진다.
L-DOPA의 십이지장(Syed, Murphy, Zimmerman, Mark, & Sage, 1998)(Nyholm 등, 2003) 또는 정맥 주입(Mouradian, Heuser, Baronti, & Chase, 1990), 또는 DA 수용체 항진제 아포모르핀의 피하 주입(Poewe & Wenning, 2000)은 파킨슨 병 환자에서 비정상적인 비자발적 운동의 빈도 및 중증도를 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다.
경피 관과 휴대용 펌프를 통해 레보도파/카르비도파의 겔 제형(formulation)이 십이지장으로 계속 전달되면 경구 약물 요법보다 혈장 농도가 더 일정하게 유지된다. 상기 치료법(Duodopa)은 고아 약제 면제(orphan drug exemption) 하에 미국과 EU에서 승인되었으며, 현재 ~ 800 여명의 환자에게 사용되고 있다. 이 치료법에 대한 근거 자료는 여전히 진화하고 있다. 나이홀름(Nyholm)은 무작위로 교차연구(crossover study)를 실시하였고, 경구용 다중약제에 비교하여 십이지장 레보도파 주입이 냉각기간(off periods) 및 심각한 이상운동증의 정시 발생을 줄이는데 있어서 우월성을 입증했다(Nyholm 등, 2005). 이 증상과 관련된 이점은 개방-표지(open-label) 연구에서 확인되었다(Nilsson, Nyholm, & Aquilonius, 2001),(Nyholm 등, 2008). 더욱 최근에,(Antonini, Chaudhuri, Martinez-Martin, & Odin, 2010) 진행된 파킨슨 질환자 9 명에서 건강-관련 삶의 질에 있어서 치료법의 장기적인 영향을 전망 평가했다. 이 치료법은 일일 냉각기(off periods)와 이상운동증을 유의적으로 단축시켰다. 이로 인해 PDQ-39의 4 가지 영역(움직임, ADL, 오명 및 신체적 불편)이 크게 향상되었다(Wolters, Lees, Volkmann, van Laar, & Hovestadt, 2008).
PD에 대한 duodopa의 약동학-약력학 연구는 L-Dopa(Westin 등, 201 1)의 50% 효과에서 농도는 1.55 mg/L임을 보여주었다(Westin 등, 2011). 레보도파 메틸 에스테르의 내장내(intra-intestinal) 주입을 이용한 유사 연구에서 3000-4000 ng/mL의 레보도파 혈장 수준에서 PD 및 이상운동증 제어가 개선되었다.
파킨슨 질환 뇌에서의 바이러스 벡터의 직접 주입은 뇌의 특정 표적 부위, 즉 DA-고갈된 선조체에서 집중적으로 L-DOPA의 연속적 그리고 국소적 생산을 제공한다. DA-합성 효소 티로신 히드록실라제(TH)의 선조체내 유전자 전달을 이용한 생체내 유전자 치료법에 의한 L-DOPA의 국소 전달은 파킨슨 질환에 대한 잠재적인 치료요법적 중재 수단으로 연구되어 왔다(Horellou 등, 1994)(Kaplitt 등, 1994). TH의 발현이 TH의 공-인자인 테트라히드로비오프테린(tetrahydrobiopterin)의 외부 투여, 또는 이의 속도-제한 합성 효소, GTP 시클로히드롤라제 1(GCH1)의 공동-발현과 복합되지 않는 한(Mandel, Spratt, Snyder, & Leff, 1997)(Bencsics 등, 1996)(Corti 등, 1999), DOPA 생산 수준은 매우 낮았다. 지금까지 가장 유망한 장기(long-term) 결과는 재조합형 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 이용하여 얻었다(Mandel 등, 1998)(Kirik, Rosenblad, & Bjorklund, 1998),(Szczypka 등, 1999). TH 및 GCH1에 대한 유전자를 인코딩하는 고역가 rAAV 벡터의 선조체내 주사는 선조체 DOPA 생산 수준이 임계치를 초과하는 경우, 6-히드록시도파민(6-OHDA)의 주사에 의해 파킨슨병이 부여된 렛에서 명백한 거동 회복을 제공할 수 있다는 것을 보여주었다(Kirik 등, 2002). 추가 연구에 따르면, 선조체에서 DOPA 합성 효소인 TH와 GCH1의 rAAV-매개된 발현은 파킨슨 병의 렛 모델에서 L-DOPA에 의해 유도된 이상운동증을 제거할 수 있음을 보여주었다. rAAV-TH 및 rAAV-GCH1 벡터에 의한 생체내 유전자 요법은 이중 작용을 한다:(i) 전신 간헐적 L-DOPA 치료로 유발된 이상운동증의 완화; 그리고(ii) 자발적인 운동 행동에서 병변-유도된 결핍의 완벽에 가까운 역전. 이러한 변화들은 선조체 오피오이드(opioid) 유전자 발현의 정상화 및 비정상적인 DFosB 발현의 역전과 관련이 있고, 이들 모두는 L-DOPA 치료에 의해 유도된 부적응성 소성(maladaptive plasticity)의 표지로 간주된다(Carlsson 등, 2005).
파킨슨 질환 치료의 개선으로 중재적 뇌 수술, 평생 정맥 내 주입 또는 경피적 내시경으로 위장관 삽입술을 요구하지 않는 경로에 의해 L-DOPA를 장기 지속적으로 투여할 수 있게 되고, 각 투여 경로는 연관된 위험 및 여병을 가진다.
의도된 사용 장소에서의 직접 생산에는 여러 가지 장점이 있지만(최소 투여량 요건 및 말초 영향의 결여), 이 투여 경로는 신경 외과 수술을 필요로 한다. 선조체내 주사 요건은 중재로부터 이익을 얻을 것으로 기대되는 환자의 일부에게만 임상 적용을 제한할 가능성이 있다. 현재 적격한 모든 환자가 이러한 방법으로 치료받기에는 신경 외과적 시설과 신경 외과의가 충분하지 않다.
III. 본 발명의 요약
말초 순환계로 L-DOPA의 치료요법적 또는 준-치료요법적 수준의 직접적 연속적 분비는 창자에서 원하지 않는 탈카복실화, 그리고 섭취한 음식, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염, 장 운동성 및 위장 산성의 변화, 식이 중성 아미노산으로부터 장내 흡수를 위한 경쟁, 그리고 장내 군상(flora)에 의해 형성된 DOPA 대사산물에 따른 일관되지 않는 흡수를 비롯한, 장내 투여와 관련된 문제를 회피할 수 있다.
혈관계로 L-DOPA의 치료요법적 수준의 직접적 연속 분비가 최적일 수 있지만, 준-치료요법 수준의 지속적인 분비는 여전히 중요할 수 있고, 따라서 이상운동증의 발병을 예방하거나 또는 지연시키기에 충분한 일정한 선조체 도파민 농도의 배경 수준을 실행하고, 효능에 요구되는 경구 L-DOPA 보충제의 복용량 최소화한다.
장내 또는 비경구적으로 L-DOPA의 지속적 주입 대신, 하나 또는 그 이상의 말초 조직, 이를 테면, 간 또는 근육으로부터 말초 순환계로의 L-DOPA를 연속적으로 분비하도록 하는 것이 제안된다. 이는 표적 조직에 L-DOPA를 가능하게 하는 유전자를 도입함으로써 달성된다. 티로신 히드록실라제(TH)는 티로신의 L-DOPA로의 히드록실화(히드록실화)를 촉매하고, 공인자(cofactor)로써 테트라히드로비오테린(BH4)를 요구한다. BH4 생합성은 GTP 시클로히드롤라제 1(GCH1)을 요구할 수 있다.
말초 순환계로의 L-DOPA의 분비는 파킨슨 질환과 같은 도파민 결핍 상태에서 다른 형태의 도파민성 요법, 이를 테면, 경구 L-DOPA 또는 도파민 항진제(agonists)에 대한 필요성을 감소시킬 것이다. 최적 수준의 L-DOPA 분비로 추가 도파민 작용제(들)에 대한 필요성이 없게 한다. 최적 수준 이하의 L-DOPA 분비는 추가 작용제(들)의 투여용량(dose)을 감소시킬 것이다. 이것은 경구 또는 비경구 L-DOPA 또는 도파민 작용제의 사용 또는 도파민 결핍에 대한 다른 치료제와 관련된 부작용을 감소시킬 수 있다.
경구 및 비경구 L-DOPA 치료법 및 도파민성 항진제로 인한 문제 소지가 되는 여병, 이를 테면, L-DOPA 유도된 이상운동증 및 온/오프 증후군(on/off syndrome)은 경구 또는 비경구 투약 후, 이들 약제의 약동학적 고점 및 저점(peak and trough) 수준의 변동성에 의한 것으로 간주된다. 치료요법적 또는 준-치료요법적 수준에서 말초 순환계로의 L-DOPA의 일정한 분비의 획득으로 혈장 L-DOPA의 기저 수준이 상승되고, 부가적인 도파민 작용제의 투약분량의 감소가 용이하며, 이로 인하여 고점 대 저점 변이를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 목적은 현재의 치료 전략이 불충분하거나, 또는 현재의 치료가 심각한 부작용과 관련되어 있거나, 및/또는 치료를 받은 개체가 이 치료에 대해 내성을 갖는 경우의 질환 치료를 위한 새로운 분자 도구를 개발하는 것이었다. 보다 구체적으로, 본 발명은 카테콜아민 생합성에 관여하는 효소의 수준을 조절하는 신규한 발현 구조체에 관한 것으로써, 이를 필요로 하는 대상에서 정상적인 카테콜아민 균형을 회복시키는 방법에 이 구조체는 유용하다.
특히, 본 발명은 신경 장애, 바람직하게는 대다수의 환자에서 치료 반응이 감소되고, 장기간 치료 동안 부작용 증가를 경험하는 불치의 퇴행성 신경 장애의 치료 방법에 전술한 발현 구조체의 사용에 관계한다.
본 발명은 L-DOPA 또는 다른 도파민 수용체 자극제의 투여를 포함하는, 파킨슨 질환 및 L-DOPA 유도 이상운동증(LID)의 치료에 주로 관한 것이다. 현재의 치료요법은 초기 질환 단계에서는 대개 효과적이지만, 장기간 치료 동안 대부분의 환자에서 L-DOPA-유도된 이상운동증이 발달된다.
이상운동증의 발생은 L-DOPA 또는 다른 도파민 수용체 자극제의 비-연속적인 전달과 관련이 있는 것으로 보고 있다. 따라서, 본 발명의 주된 목적은 구체적으로 파킨슨 질환의 치료에 필요한 화합물을 필요할 때, 그리고 임의의 부작용을 감소시키는 지속적인 속도로 말초적으로 공급함으로써, 현재 치료를 개선시키는 것이다.
본 발명은 L-DOPA의 전신 수준 조절을 위하여 말초 조직에 투여되는 발현 시스템을 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다:
발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계되고;
및/또는
발현할 때, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
한 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다:
발현할 때, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 1 폴리뉴클레오티드(N1), 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 제 1 프로모터에 작동가능하도록 연계되고, 이때 상기 생물학적 활성은 GCH1의 효소 활성이며;
그리고
발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 2 폴리뉴클레오티드(N2), 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 제 2 프로모터에 작동가능하도록 연계되고, 이때 상기 생물학적 활성은 TH의 효소 활성이며;
그리고
발현할 때,
6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 3 폴리뉴클레오티드(N3), 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 제 3 프로모터에 작동가능하도록 연계되며, 이때 상기 생물학적 활성은 PTPS의 효소 활성이다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 발현 시스템에 의해 형질도입되거나 형질감염된 단리된 숙주 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템, 그리고 임의선택적으로 약학적으로 수용가능한 염, 운반체 또는 어쥬번트가 포함된 약학 조성물에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 의학적 용도을 위한 본원에서 상기 정의된 발현 시스템에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 카테콜아민 기능장애와 연관된 질환의 치료 방법에 이용을 위한 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템에 관한 것이며, 이때 전술한 발현 시스템은 말초적으로 투여되고, 가령, CNS 외부에서 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 카테콜아민 기능장애와 연관된 질환의 치료 방법에 이용을 위하여, 발현할 때, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 인코드하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열이 포함된 발현 시스템에 관한 것으로:
티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 및/또는
GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체;
이때 전술한 발현 시스템은 말초적으로 투여된다.
본 발명은 추가 측면에서, 혈액내 L-DOPA의 치료요법적으로 유효한 농도를 유지시키는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 상기에서 정의된 발현 시스템을 이를 필요로 하는 사람에게 말초 투여(즉, CNS 외부에서의 투여)하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 카테콜아민 기능장애와 연관된 질환을 치료 및/또는 방지하는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템의 치료요법적으로 유효량을 이를 필요로 하는 사람에게 말초적으로 투여하는 것을 포함한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 혈액 안에 L-DOPA의 치료요법적으로 유효한 농도를 유지시키는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 전술한 환자에게 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템을 투여하는 것을 포함한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 L-DOPA 유도된 이상운동증(LID)의 출현을 감소, 지연 및/또는 저지하는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템을 이를 필요로 하는 환자에게 말초적으로 투여하는 것을 포함한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 혈액 안에 L-DOPA의 치료요법적으로 유효한 농도를 획득하거나 및/또는 유지하는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 발현할 때, 최소한 하나의 치료 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함된 발현 시스템을 말초적으로 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 최소한 하나의 치료 폴리펩티드는 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 약학 조성물 및 및 사용 지침을 포함하는 키트에 관한 것이다.
도 1: L-DOPA 생합성의 개요
도 2: 간에서 지속적인 L- DOPA 합성을 위한 AAV 벡터 A) 비시스트로닉(Bicistronic) 벡터: ITR = 역전된 말단 반복 서열, LP1 = 간 프로모터/인헨서 1, HLP= 간-특이적 하이브리드 프로모터(Mcintosh J 등, Blood 2013 121(17) 3335-3344 참고), tTH = 절두된 티로신 히드록실라제(서열 번호: 24), GCH1 = GTP 시클로히드롤라제 1(서열 번호: 20), WPRE = 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소(서열 번호: 28 또는 29). B-E) 모노시스트로닉(Monocistronic) 벡터. HLP: LP1에 대등한 강도의 짧은 간-특이적 프로모터(Mcintosh J 등,, Blood. 2013 Apr 25;121(17):3335-44).
도 3: 동물 연구. A) 6 마리의 동물로 이루어진 3 그룹에 마우스를 무작위로 할당 하였다. 첫날, 이들 동물은 표 A)에서 상세하게 기술된 바와 같이, 각각 어떠한 처리도 받지 않거나(naive), 또는 바이러스 벡터를 제공받았다. B) 2 마리의 동물로 이루어진 2 그룹에 마우스를 무작위로 할당하였다. 첫날, 이들 동물은 표 B)에서 상세하게 기술된 바와 같이, 바이러스 벡터를 제공받았다. A) 및 B): 28일째, 마우스를 희생시켜 L-DOPA 분석을 위한 혈장 수거 및 면역조직화학을 위한 간을 수거하기 1시간 전, 마우스에게 L-DOPA의 탈카복실화를 막기 위해 베세라지드(beserazide) 10mg/kg을, 그리고 L-DOPA 분석을 위해 희생시키고 혈장을 수집하기 1시간 전에 카테콜-O-메틸 전이효소에 의한 L-DOPA의 신진 대사를 차단하는 COMT 억제제를 제공하였다. COMT 억제제의 의도된 투여용량은 마우스를 희생시키고, L-DOPA 분석을 위한 혈장 수집에 앞서, 4시간 및 1시간 전에 톨카폰(tolcapone) 30 mg/g의 2회 투여다. C) 실험 준비의 예시: 28일차 마우스를 희생시키고, 장기를 회수하기 1시간 전, 벤세라지드(benserazide)와 엔타카폰(entacapone)의 낮은 용량의 꼬리 정맥 주사.
도 4: GCH1 착색. A) 도 3에서 A와 관련하여 설명된 바와 같이, 처리를 받지 않은 마우스 또는 마우스 당 7.02 x 1010　vg의 총 투여용량으로 발현 벡터 scAAV-LP1-GCH1 및/또는 scAAV-LP1-tTH로 처리된 마우스의 간 부분. 이 부분은 <1 %의 형질도입을 실증한다. B) 도 3b와 관련하여 설명된 바와 같이, 처리를 받지 않은 마우스 또는 마우스 당 3.6 x 1012　vg의 총 투여용량으로 발현 벡터 scAAV-HLP-GCH1 및 scAAV-HLP-tTH로 처리된 마우스의 간 부분. 이 부분은 ~25%의 형질도입을 실증한다.
도 5: 동물 연구-마우스 혈장 L-DOPA 농도. 마우스에서 혈장 L-DOPA 수준. A)는 평균 L-DOPA 수준을 나타내는 표이며, 반면 B)는 테스트된 모든 마우스에 대한 L-DOPA 수준을 나타내는 도면이다. 그룹은 다음과 같이 처리되었다:
A: 벡터 없음(대조)
B: scAAV-LP1-tTH(3.5x1010) + scAAV-LP1-GCH1(3.5x1010)
C: scAAV-LP1-tTH(7.0x1010)
D: scAAV HLP-tTH(1.8x1012) + scAAV HLP-GCH1(1.8x1012)
E: scAAV-HLP-tTH(3.6x1012)
벡터는 정맥 주사로 투여되었다. 혈장은 투약 28일 후, 벤세라지드(10 mg/kg) 및 엔타카폰으로 처리 후 1시간 시점에 수집되었다.
도 6: 동물 연구-H&E 착색. 도 3에서 B와 관련하여 설명된 바와 같이, 처리를 받지 않은 마우스 또는 마우스 당 3.6 x 1012　vg의 총 투여용량으로 발현 벡터 scAAV-HLP-GCH1 및/또는 scAAV-HLP-tTH로 처리된 마우스의 간 부분은 헤마토실린 및 에오신으로 착색되었다. 얼룩은 조직 손상이나 백혈구 침윤(infiltration)의 흔적을 보이지 않는다.
도 7: 비시스트로닉 구조체의 상동성 재조합. 비시스트로닉 ITR-LP1-GCH1-LP1-tTH-WPRE-ITR 벡터 생산 동안, 공통 LP1 부위에서 상동성 재조합으로 모노시스트로닉 ITR-LP1-tTH-WPRE-ITR이 또한 생산된다.
도 8: 트리시스트로닉(tricistronic) 발현 시스템. 상기 도면은 본 발명의 발현 시스템의 예를 나타낸다. 상기 시스템은 트리시스트로닉 시스템이다. TH 유전자는 구성적(constitutive) 프로모터 EF-1 알파의 제어 하에 있고, IRES 및 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS)를 인코드하는 서열을 포함한다. ITR: 역전된 말단 반복 서열. WPRE: 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소.
정의
비시스트로닉: 본 명세서에서 사용된 용어 "비시스트로닉(bicistronic)"은 발현 시스템, 벡터 또는 플라스미드를 지칭할 수 있다. 비시스트로닉 플라스미드 또는 벡터는 단일 플라스미드 또는 벡터 안에 2개 유전자를 포함한다. 비시스트로닉 발현 시스템은 최소한 하나의 비시스트로닉 플라스미드 또는 최소한 하나의 비시스트로닉 벡터가 포함된 발현 시스템을 지칭한다.
생물학적으로 활성: 용어 '생물학적으로 활성(Biologically active)' 이란 본 발명의 발현 시스템 구조체에 의해 인코딩되는 효소와 관련하여 본원에서 사용되는 경우, 전술한 효소의 효소 활성, 즉 특정 효소 반응을 촉매하는 능력을 의미한다. 구체적으로 생물학적 활성은 티로신 히드록실라제(TH), GTP-시클로히드롤라제(GCH-1) 또는 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS), 또는 본 명세서의 발현 시스템에 의해 인코드되며, 치료 효과를 얻는데 도움이 될 수 있는 임의의 다른 효소의 효소 활성을 지칭할 수 있다.
생물학적으로 활성 단편: 본원에 사용된용어 "생물학적 활성 단편(biologically active fragment)"은 전장의(full length) 폴리펩티드의 생물학적 활성을 공유하는 효소를 비롯한 폴리펩티드의 일부를 나타낸다. 상기 단편의 생물학적 활성은 고유한 전장의 폴리펩티드의 효소 활성보다 더 작거나, 더 크거나 또는 동일할 수 있다. 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편은 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 40, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 70% 서열 동일성을 갖는 단편들을 포함한다. 주어진 폴리펩티드의 생물학적으로 활성 단편은 전술한 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 30% 미만이 결손된 단편을 또한 포함하는데, 이를 테면, 전술한 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 29% 미만이 결손된, 예를 들면, 28% 미만이 결손된, 이를 테면, 27% 미만이 결손된, 예를 들면, 26% 미만이 결손된, 이를 테면, 25% 미만이 결손된, 예를 들면, 24% 미만이 결손된, 이를 테면, 23% 미만이 결손된, 예를 들면, 22% 미만이 결손된, 이를 테면, 21% 미만이 결손된, 예를 들면, 20% 미만이 결손된, 이를 테면, 19% 미만이 결손된, 예를 들면, 18% 미만이 결손된, 이를 테면, 17% 미만이 결손된, 예를 들면, 16% 미만이 결손된, 이를 테면, 15% 미만이 결손된, 예를 들면, 14% 미만이 결손된, 이를 테면, 13% 미만이 결손된, 예를 들면, 12% 미만이 결손된, 이를 테면, 11% 미만이 결손된, 예를 들면, 10% 미만이 결손된, 이를 테면, 9% 미만이 결손된, 예를 들면, 8% 미만이 결손된, 이를 테면, 7% 미만이 결손된, 예를 들면, 6% 미만이 결손된, 이를 테면, 5% 미만이 결손된, 예를 들면, 4% 미만이 결손된, 이를 테면, 3% 미만이 결손된, 예를 들면, 2% 미만이 결손된, 이를 테면, 1% 미만이 결손된다.
생물학적 활성 변이체: 본원에 사용된 용어 "생물학적으로 활성 변이체(biologically active variant)"는 고유의 전장 단백질과 동일한 생물학적 활성을 갖는 효소와 같은, 단백질의 폴리펩티드 부분을 지칭한다. 상기 단편의 생물학적 활성은 고유한 전장의 폴리펩티드의 효소 활성보다 더 작거나, 더 크거나 또는 동일할 수 있다.
카테콜아민 기능장애: 본 명세서에 사용된 용어 카테콜린 기능장애(catecholamine dysfunction)는 건강한 개체에서 동일한 매개 변수와 비교하여, 카테콜아민 합성, 조절, 저장, 흡수, 또는 대사의 이상을 나타낸다. 구체적으로 상기 카테콜아민 기능장애는 도파민 기능장애, 이를 테면, 도파민 결핍이다. 당업자는 카테콜아민 기능장애를 진단할 수 있다.
인지 장애: 본원에서 사용된 '인지 장애(cognitive impairmen)'라는 용어는 혼란, 건망증 및 집중력 저하와 관련된 정신 기능이 약한 상태를 의미한다.
발현: 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 '발현(expression)'이라는 용어는 핵산 서열의 mRNA로의 전사 및/또는 그 핵산 서열의 전사 및 해독되어, 단백질이 생성되는 결과를 얻는 것을 지칭한다.
발현 카세트: 본원에 사용된 바와 같은 용어 '발현 카세트(expression cassette)'는 생체 내에서 단백질을 합성하는데 필요한 모든 요소를 제공하는 게놈 서열을 의미한다. 이것은 DNA로부터 mRNA로의 전사를 유도하는 서열, 즉, 프로모터 서열, 관심대상 단백질에 대한 게놈 서열이 포함된 개방 해독틀(open reading frame) 그리고 mRNA의 폴리아데닐화를 가능하게 하는 3' 비-해독 영역을 포함하나, 이에 국한되지 않는 것들을 포함한다.
발현 시스템: 본원에서 사용된 용어 '발현 시스템(expression system)'은 유전자 산물, 특히 폴리펩티드의 생산을 위해 특별히 고안된 시스템을 의미한다. 발현 시스템은 발현할 때, 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 발현 시스템은 벡터, 이를 테면, 바이러스 벡터, 가령 AAV 벡터 구조체일 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
포유류 세포에서 기능: 본원에 사용된 바와 같은 용어 '포유류 세포에서 기능적(functional in mammalian cells)'이란 서열, 가령, 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 포유류 세포 안으로 도입될 때 생물학적으로 활성인 폴리펩티드로 해독되는 서열을 의미한다.
HLP: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "간-특이적 하이브리드 프로모터(hybrid liver-specific promoter)" 또는 "HLP"는 Mcintosh J 등, Blood 2013 121(17) 3335에서 설명된 바와 같은 프로모터를 지칭한다. 본 발명의 HLP는 인간의 간 특이적 인핸서, 인간의 간 특이적 프로모터 및 변형된 인트론을 포함한다.
한 구체예에서, LP1은 서열 번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 갖는다.
상동성: 본 출원의 목적을 위하여, 본 명세서에서 사용된 용어 서열 '상동성(homology)' 및 '상동의(homologous)'란 서열 '동일성(identity)'및 '동일한(identical)'과 등가인 것으로서 이해되어야 한다.
LP1: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "간 프로모터/인헨서 1" 또는 "LP1"은 Nathwani AC 등, Blood. 2006;107(7):2653-2661 및 Miao HZ 등, Blood. 2004;103(9):3412-3419에서 기술하고 있는 프로모터를 지칭한다. 본 발명의 LP1은 절두된 간-특이적 인헨서 및 절두된 간 특이적 프로모터를 포함한다. 한 구체예에서, LP1은 서열 번호: 39의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 갖는다.
작동가능하도록 연계된: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 '작동가능하도록 연계된(operably linked)'이란 관심대상의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드가 인코딩된 핵산 서열과 전사 조절 서열은 세포 안으로 이들이 도입되었을 때, 이의 발현이 허용되도록 연계된다는 것을 나타낸다.
말초 투여: 본원에서 사용되는 용어 '말초 투여(peripheral administration)'는 중추 신경계(CNS)와 관련하여 말초를 지칭한다. 구체적으로, 말초 투여란 골격근 및 간 조직으로의 투여를 말한다. 당업자는 약학 조성물 및 이의 성분을 전술한 조직으로 투여하는 수단은 잘 알고 있다.
제약 조성물: 또는 약물, 약물 또는 물질은 환자에게 적절하게 투여될 때 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 임의의 화학적 또는 생물학적 물질, 화합물 또는 조성물을 말한다.
일부 약물은 비활성 형태로 판매되고, 이것은 생체 내에서 약학적 활성을 가진 대사산물로 전환된다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "약학 조성물(pharmaceutical composition)" 및 "약제(medicament)"는 불활성 약물 및 활성 대사 물 모두를 포함한다.
플라스미드: 용어 "플라스미드(plasmid)"는 본원에서 네이키드(naked) 상태이거나, 또는 벡터 안에 패키지될 수 있는 폴리 뉴클레오티드를 의미한다. 본 명세서에서, 플라스미드는 형질전환된 세포의 염색체 DNA로부터 바람직하게 물리적으로 분리되고, 독립적으로 복제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 발현 시스템은 당업계에 공지된 바와 같이, 네이키드 상태, 즉, 패키지되지 않은 상태이거나, 또는 벡터 내에 패키지된 하나 이상의 플라스미드를 포함한다.
폴리펩티드: 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 '폴리펩티드(polypeptide)'는 최소한 2개의 아미노산이 포함된 분자를 지칭한다. 상기 아미노산은 천연 또는 합성일 수 있다. '올리고펩티드(oligopeptides)'는 본 명세서에서 길이가 100개 미만의 아미노산의 폴리펩티드로 정의된다. 용어 "폴리펩티드(polypeptide)"는 또한 단백질, 즉 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 단백질, 즉, 기능적 생체 분자를 포함하며; 최소한 2개의 폴리펩티드를 포함할 때, 이들은 공유적으로 연계되거나, 또는 비-공유적으로 연계된 복합체를 형성할 수 있다. 단백질 내의 폴리펩티드는 당화되거나(glycosylated) 및/또는 지질화(lipidated)될 수 있고, 및/또는 보결단(prosthetic group)을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드: 본 명세서에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 사슬 내에 공유 결합된 뉴클레오티드 단량체(monomers)로 구성된 유기 중합체 분자인 분자를 말한다. 본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 최소한 2 개의 핵산이 포함된 분자를 의미한다. 핵산은 자연 발생적이거나 또는 변형된, 이를 테면, 고정된(locked) 핵산(LNA) 또는 펩티드 핵산(PNA)일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 다음의 것과 관련된다:
i) 예정된 코딩 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드, 또는
ii) 예정된 아미노산 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 또는
iii)(i) 또는(ii)의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 폴리펩티드의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 단편은 본 명세서에서 특정된 바와 같은 최소한 하나의 예정된 활성을 보유하며; 그리고
iv) 폴리뉴클레오티드의 상보성 가닥이(i),(ii) 및(iii)중 임의의 하나에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 스트린젼트(strigent) 조건 하에서 혼성화되고, 본 명세서에서 특정된 바와 같은 최소한 하나의 예정된 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코드하는, 폴리뉴클레오티드; 그리고
v)(iii) 또는(iv)의 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오디드 서열에 대하여 축퇴성(degenerate)인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드;
또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 상보성 가닥.
프로모터: 본원에서 사용된 용어 '프로모터(promoter)'는 특정 유전자의 전사를 촉진하는 DNA 영역을 지칭한다. 따라서, 프로모터는 RNA 중합효소의 초기 결합 부위로서 작용하는 오페론의 영역이다. 프로모터는 이들이 규제하는 유전자의 동일한 가닥 상에서 이 유전자의 근처 상류에 일반적으로 위치한다. 본 명세서에서 사용되는 '프로모터'라는 용어는 고유한 프로모터에 구조적으로 한정되지 않지만, 상기 기술된 기능을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 영역으로 이해되어야 한다.
트리시스트로닉: 본 명세서에서 사용된 용어 "트리시스트로닉(tricistronic)"은 발현 시스템, 벡터 또는 플라스미드를 지칭할 수 있다. 트리시스트로닉 플라스미드 또는 벡터는 단일 플라스미드 또는 벡터 안에 3개 유전자를 포함한다. 트리시스트로닉 발현 시스템은 최소한 하나의 트리시스트로닉 플라스미드 또는 최소한 하나의 트리시스트로닉 벡터가 포함된 발현 시스템을 지칭한다.
벡터(vector): 본 발명에 따른 벡터는 외래 유전자 물질을 다른 세포로 전달하기 위한 비히클(vehicle)로서 사용되는 DNA 분자이다. 벡터의 4 가지 주요 유형은 플라스미드, 바이러스, 코스미드(cosmids) 및 인공 염색체이다.
바이러스 벡터: 바이러스성 벡터는 캡시드(capsid)와 게놈을 포함하는 바이러스 입자로 이해되어야 한다. 게놈은 대개 캡시드로 둘러싸여 있다.
발현 시스템
순환계로의 말초 생산 및 일정한 기저 수준의 L-DOPA 분비는 PD를 치료하는데 현재 사용되는 치료법인 경피적 위 절제술(percutaneous gastrostomy)을 통해 소장으로의 지속적인 주입과 유사한 치료 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 이론적 근거는 파킨슨 질환자 또는 L-DOPA의 내인성 말초 분비 상승은 유전적인 티로신 히드록실라제 결핍(Wevers 등, 1999) 및 하지 불안 증후군을 나타낼 수 있는 임의의 다른 상태를 갖는 환자의 전신 순환계로 L-DOPA의 지속적인 주간 분비, 또는 지속적인 24 시간 분비를 제공하는 것이다.
본 발명은 파킨슨 질환, 또는 티로신 하이드록실라제 결핍 또는 하지 불안 증후군을 비롯한 기타 질환의 치료에 치료요법적으로 유용한 순환 L-DOPA의 기저 수준을 만들기 위한 말초 조직의 형질도입 또는 형질 감염이다.
말초 조직의 형질도입은 표적화된 말초 조직이 티로신을 L-3,4-디히드록시페닐알라닌(L-DOPA)으로 전환시킬 수 있는 효소 생산을 가능하게 하는 유전 물질을 전달하는 발현 시스템으로 구성된 유전자 치료법 시스템의 투여에 의해 달성된다. 발현 시스템은 하기에 상세히 설명된 하나 또는 그 이상의 벡터로서 제공될 수 있다. 바람직하게는, 상기 발현 시스템은 최소한 3가지 폴리펩티드, 즉 TH, GCH1 및 PTPS, 그리고 선택적으로 제 4 폴리펩티드의 발현을 허용한다. 일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 2개의 비시스트로닉 벡터 또는 플라스미드로 제공된다. 다른 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 임의선택적으로 모노시스트로닉 벡터 또는 플라스미드와 함께, 1개의 트리시스트로닉 벡터 또는 플라스미드로 제공된다. 다른 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 3개 또는 4개의 모노시스트로닉 벡터 또는 플라스미드로 제공된다.
본 발현 시스템이 표적으로 하는 세포는 성인 대상에서 최소한 세포 전환(turnover)이 낮은 세포가 바람직할 수 있다. 이것은 본원의 벡터 또는 플라스미드가 표적 세포의 염색체 DNA에 통합되지 않고, 벡터 또는 플라스미드는 세포 분열 마다 희석되기 때문이지만, 이 이론에 구속되지는 않는다. 따라서, 세포가 재생함에 따라 치료 효과는 시간 경과에 따라 퇴색될 것으로 예상된다. 본 발현 시스템을 사용하는 유전자 요법에 특히 유리한 표적이 될 수 있는 세포는 근육 세포, 구체적으로 횡문 근육 및 간세포다.
예를 들면, 본 발명은 최소한 하나의, 이를 테면, 2개의 아데노-연관된 바이러스 벡터 혈청형(serotype) 8(간의 형질도입을 목표로)을 포함하고, 그리고 인간 티로신 히드록실라제(가령, hTH2)를 코딩하는 유전 서열을 전단하는 발현 시스템에 근거한 유전자 요법 형태를 취한다. 형질감염 게놈은 TH 유전자 서열의 상류에 간 특이적 프로모터를 포함할 수 있고, 그리고 TH 유전자 서열의 하류에 최대 발현(WPRE)을 위한 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소를 포함할 수 있다. 치료는 바람직하게는 테트라히드로비오프테린을 경구 보충제로 공급하거나, 또는 GPT-시클로히드롤라제-1(GCH1) 유전자의 동시-형질 감염에 의해 내인성으로 생성되는 것을 요구한다. 동시-형질감염은 경구 보충제의 필요성을 없애는 한편, 경구 보충제 의존성은 형질감염 부위에서 L-DOPA 생산을 "중단(turn-off)"할 가능성이 제공하는데, 이것은 독성을 관리하거나, 또는 밤 동안 L-DOPA 생산이 감소되는 기간을 제공하기 위해서 바람직할 수 있어야 한다. GCH1이 요구되는 정도는 표적 조직 유형에 따라 달라질 수 있다(예를 들면, 간 조직은 횡문 근육 조직과 비교하였을 때, 더 높은 내인성 수준의 GCH1을 갖는다). 바람직한 구체예들에서, 치료는 7,8-디히드로네오프테린 트리포스페이트의 6-피루보일테트라히드로프테린 및 트리포스페이트로 전환을 촉매하는 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12)의 공급을 또한 요구한다. 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 바와 같이, PTPS 유전자의 공동-형질감염에 의해 PTPS가 내인성으로 생성된다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 시스템은 최소한 하나의, 이를 테면, 2개의 아데노-연관된 바이러스 벡터 혈청형 1(횡문 근육을 표적으로 하는)을 포함할 수 있다. 이러한 구체예들에서, 상기 발현 시스템 내에 포함된 폴리뉴클레오티드와 연계된 임의의 프로모터는 근육 특이적일 수 있다. 근육 세포, 구체적으로 성숙한(mature) 횡문 근육 세포의 전환은 매우 낮고, 근육 세포, 이를 테면, 성숙한 횡문 근육 세포를 표적으로 하는 것은 특별히 유익한 것으로 간주된다.
상기 발현 시스템은 비시스트로닉일 수 있는데, 가령, 최소한 하나의 비시스트로닉 벡터 또는 플라스미드를 포함한다. 상기 비시스트로닉 시스템은 모노시스트로닉 벡터 또는 플라스미드를 더 포함할 수 있다. 대안으로, 상기 발현 시스템은 트리시스트로닉일 수 있는데, 가령, 최소한 하나의 트리시스트로닉 벡터 또는 플라스미드를 포함한다. 상기 트리시스트로닉 시스템은 모노시스트로닉 벡터 또는 플라스미드를 더 포함할 수 있다.
현행 경구 L-DOPA 약제의 경우와 같이, 말초 데카르복실라제 억제제(예로써, 벤세라진 또는 카르비도파)는 바람직하게는 L-DOPA가 도파민의 말초 전환을 차단시키기 위하여 투여되는데, 이에 따라 선조체에 대한 내성 및 생물학적 이용가능성이 향상된다.
한 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다:
발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계되고;
및/또는
발현할 때, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
한 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다: 발현할 때, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 1 폴리뉴클레오티드(N1), 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 제 1 프로모터에 작동가능하도록 연계되고, 이때 상기 생물학적 활성은 GCH1의 효소 활성이며;
그리고
발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 2 폴리뉴클레오티드(N2), 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 제 2 프로모터에 작동가능하도록 연계되고, 이때 상기 생물학적 활성은 TH의 효소 활성이며;
그리고
발현할 때,
6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 3 폴리뉴클레오티드(N3), 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 제 3 프로모터에 작동가능하도록 연계되며, 이때 상기 생물학적 활성은 PTPS의 효소 활성이다.
한 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다:
발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계되고;
및/또는
발현할 때, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
한 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템은 다음을 포함한다:
발현할 때, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 제 1 프로모터에 작동가능하도록 연계되고;
그리고
발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 2 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 제 2 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
한 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템은 다음을 포함한다:
발현할 때, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 제 1 프로모터에 작동가능하도록 연계되고;
그리고
발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 2 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 제 2 프로모터에 작동가능하도록 연계되고;
그리고
발현할 때, 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 3 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 제 3 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
한 측면에서, 본 발명은 발현할 때, 다음을 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함된 비시스트로닉 발현 시스템에 관한 것이다:
- 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 그리고
- GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체.
본 명세서 전반에 걸쳐, "제 1", "제 2", "제 3" 및 "제 4"라는 용어는 특정 순서를 지칭하는 것이 아니고, 명확하기 위하여 사용됨을 이해할 것이다. 따라서, 일부 구체예들에서, 제 3 폴리펩티드는 제 1 폴리펩티드와 제 2 폴리펩티드 사이에 위치할 수 있다.
본 발명의 비시스트로닉 발현 시스템은 질환 및 장애의 치료를 위하여, 개체 이를 테면, 인간에게 투여하기에 적합하다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 의학적 이용을 위하여 상기 본원에서 정의된 발현 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 발현 시스템은 카테콜라민 수준과 관련된 불균형으로 인한 및/또는 이로 인한 질환 및 장애를 치료하는데 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 카테콜아민 기능장애와 연관된 질환의 치료 방법에 이용을 위하여 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템에 관한 것이며, 이때 전술한 발현 시스템은 말초적으로 투여되는데, 가령, CNS 외부에서 투여된다.
즉, 전술한 측면에서, 본 발명은 발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 그리고 GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함된 비시스트로닉 발현 시스템에 관한 것으로; 이 시스템은 카테콜아민 기능장애와 연관된 질환의 치료 방법에 이용을 위한 것이며, 이때 전술한 발현 시스템은 말초적으로, 가령, CNS 외부에서 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 및/또는 GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 인코드하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열이 포함된 발현 시스템에 관한 것으로; 이 시스템은 카테콜아민 기능장애와 연관된 질환의 치료 방법에 이용을 위한 것이다, 이때 전술한 발현 시스템은 말초적으로 투여된다.
한 구체예에서, 전술한 용도를 위한 상기 발현 시스템은 본 명세서의 상기에서 정의된 비시스트로닉 발현 시스템을 포함한다.
상기 발현 시스템은 3개의 모노시스트로닉 발현 시스템 또는 1개의 모노시스트로닉 발현 시스템과 1개의 비시스트로닉 발현 시스템의 조합일 수도 있다. 상기 발현 시스템은 발현할 때, 4개의 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 구체예들에서, 상기 시스템은 1개의 모노시스트로닉 발현 시스템과 1개의 트리시스트로닉 발현 시스템의 조합, 또는 2개의 모노시스트로닉 발현 시스템과 1개의 비시스트로닉 발현 시스템의 조합, 또는 4개의 모노시스트로닉 발현 시스템의 조합일 수 있다.
따라서 한 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템은 다음을 포함한다:
a) 발현할 때, 다음을 인코드하는 비시스트로닉 발현 시스템:
i) 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체, 및
ii) GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템은 다음을 포함한다:
a) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
i) 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 그리고
b) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
i) GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는
생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체.
여전히 또 다른 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템은 다음을 포함한다:
a) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
i) 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 그리고
b) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
i) GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체.
한 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템은 다음을 포함한다:
a) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
i) 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 그리고
b) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
i) GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체.
따라서 한 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템은 다음을 포함한다:
a) 발현할 때, 다음을 인코드하는 트리시스트로닉 발현 시스템:
i) 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체, 및
ii) GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 그리고
iii) 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 시스템은 다음을 포함한다:
a) 발현할 때, 다음을 인코드하는 비시스트로닉 발현 시스템:
i) 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체, 및
ii) GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 그리고
b) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
iii) 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 시스템은 다음을 포함한다:
a) 발현할 때, 다음을 인코드하는 비시스트로닉 발현 시스템:
i) 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체, 및
ii) 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 그리고
b) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
iii) GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 시스템은 다음을 포함한다:
a) 발현할 때, 다음을 인코드하는 비시스트로닉 발현 시스템:
i) GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체, 그리고
ii) 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 그리고
b) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
iii) 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템은 다음을 포함한다:
a) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
i) 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 그리고
b) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
ii) GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체; 그리고
c) 발현할 때, 다음을 인코드하는 모노시스트로닉 발현 시스템:
iii) 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체.
상기 발현 시스템은 발현할 때, 하기에서 설명하는 바와 같이, 제 4 폴리펩티드를 추가로 인코딩할 수 있다.
본 발명의 발현 시스템의 사용 목적은 본 발명의 발현 시스템으로 치료된 개체의 혈액내 L-DOPA의 치료요법적으로 유효한 농도을 획득하거나 및/또는 유지하는 것이다.
본 발명에 적용되는 생체내 L-DOPA의 생합성에 요구되는 효소 대치 요법은 3가지 효소, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 및/또는 GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 및/또는 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12)중 하나 또는 그 이상에 의존한다.
전술한 효소는 전장의 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성 단편 또는 상기 전장 효소의 변이체로 발현될 수 있다. 생물학적 활성이란 야생형 전장의 효소의 촉매 활성의 최소한 분획(fraction)을 수행할 수 있는 능력은 이 단편 또는 변이체에 의해 유지되어야 한다는 것을 의미한다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 최소한 70% 동일한 GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 발현시킬 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 최소한 70% 동일한 티로신 히드록실라제(TH) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 발현 시킬 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 서열 번호: 41에 최소한 70% 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 발현 시킬 수 있다.
상기 발현 시스템은 전술한 형태 또는 구조가 상기 본 명세서에서 정의된 효소, 또는 이의 단편 또는 변이체 중 임의의 하나에 대해 동일한, 또는 본질적으로 동일하거나, 또는 최소한 본 명세서에서 정의된 동일성 정도를 갖는 유전자 산물을 만든다면, 원칙적으로 임의의 적합한 형태 또는 구조를 가질 수 있다.
바이러스 벡터
대체로, 유전자 요법은 새로운 유전 물질을 환자의 세포로 전달하고, 이로써 환자에게 치료요법적 이익을 얻도록 하는 것이다. 이러한 이익에는 광범위한 질환, 장애 및 기타 상태의 치료 또는 예방이 포함한다.
생체 외(Ex vivo) 유전자 요법 접근법은 단리된 세포(줄기 세포, 신경 및 신경 교세포 전구물질 세포, 그리고 태아 줄기 세포를 포함하나 이에 국한되지 않음)를 변형한 후, 환자에게 주입, 이식 또는 다른 방법으로 이식하는 것과 관련된다. 가령, U.S. 특허 번호 4,868,116, 5,399,346 및 5,460,959 참고. 생체 내 유전자 치료는 생체 내에서 숙주 환자 조직을 직접 표적으로 삼는다.
유전자 전달 벡터로서 유용한 바이러스는 파보바바이러스(papovavirus), 아데노바이러스(adenovirus), 우두 바이러스(vaccinia virus), 아데노-연관된 바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스바이러스(herpesvirus) 및 레트로바이러스(retroviruses)를 포함한다. 적합한 레트로바이러스는 HIV, SIV, FIV, EIAV, MoMLV로 구성된 그룹을 포함한다. 적합한 레트로바이러스의 추가 그룹은 HIV, SIV, FIV, EAIV, CIV로 구성된 그룹을 포함한다. 바람직한 바이러스 벡터의 또 다른 그룹은 알파바이러스(alphavirus), 아데노바이러스, 아데노 연관된 바이러스, 바큘로바이러스(baculovirus), HSV, 코로나바이러스(coronavirus), 소 파필로마 바이러스(papilloma virus), MoMLV, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스로 구성된 군을 포함한다.
간의 또는 횡문 근육 세포의 형질 유도를 위한 바람직한 바이러스는 아데노-연관된 바이러스 및 렌티바이러스(lentiviruses)이다.
AAV의 제조 방법은 당분야, 가령, US 5,677,158에 기술되어 있다.
렌티바이러스 벡터는 복제-결함 렌티 바이러스 입자이다. 이러한 렌티바이러스 입자는 5' 렌티바이러스 LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 시그날, 전술한 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 시그날에 작동가능하도록 연계된 프로모터, 제 2 가닥 DNA 합성의 원점(origin) 그리고 3' 렌티바이러스 LTR이 포함된 렌티바이러스 벡터로부터 생성될 수 있다.
발현 벡터
본 발명에서 사용하기 위한 TH 및/또는 GCH1 및/또는 PTPS 폴리 펩티드의 재조합 발현을 위한 벡터는 당업자에게 상세한 설명을 필료로 하지 않는 통상적인 기술을 사용하여 작제될 수 있다. 그러나, 검토를 위하여 당업자는 Maniatis 등., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,(NY 1982)에 문의할 수 있따. 발현 벡터는 의학 용도로 TH 및/또는 GCH1 및/또는 PTPS 폴리펩티드의 재조합 생산을 위한 생산자 세포를 만드는데 사용하고, 그리고 네이키드 또는 캡슐화 치료요법을 위하여 TH 및/또는 GCH1 및/또는 PTPS 폴리펩티드를 분비하는 치료 세포를 생성하는데 사용될 수 있다.
간략하게, 재조합 발현 벡터의 제작은 표준 결합 기술을 사용한다. 만들어진 벡터에 정확한 서열이 있는 지를 확인하는 분석의 경우, 유전자들은 예를 들면, Messing, 등,(Nucleic Acids Res., 9: 309-, 1981)의 방법, Maxam, 등,(Methods in Enzymology, 65: 499, 1980)의 방법, 또는 당업자에게 공지될 임의의 다른 적합한 방법을 이용하여 서열화된다.
절단된 단편들의 크기 분리는 예를 들면, Maniatis, 등,(Molecular Cloning, pp. 133-134,1982)에서 설명된 통상적인 겔 전기영동에 의해 실행된다.
효율적인 발현 벡터의 생성을 위해서는 정확한 판독 틀 안에 인코드된 유전자의 발현에 필요한 조절 서열을 포함해야 한다. 유전자의 발현은 전사, 해독 또는 해독-후 수준에서 조절된다. 전사 개시는 유전자 발현에 있어서 초기의, 그리고 결정적인 과정(critical event)이다. 이것은 프로모터 및 인헨서 서열에 의존적이며, 이들 서열과 상호 작용하는 특정 세포 인자들에 의해 영향을 받는다. 많은 유전자의 전사 단위(unit)는 프로모터, 그리고 경우에 따라, 인헨서 또는 조절 인자로 구성된다(Banerji 등, Cell 27: 299(1981); Corden 등,, Science 209: 1406(1980); 그리고 Breathnach and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50: 349(1981)) 본 발명의 강력한 프로모터 및 다른 조절 요소는 하기에서 더 상세히 기술된다.
한 구체예에서, 상기 발현 시스템은 벡터, 이를 테면, 바이러스 벡터, 가령, 바이러스 벡터 발현 시스템이다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 시스템은 플라스미드 벡터 발현 시스템이다.
여전히 또 다른 구체예에서, 상기 발현 시스템은 합성 벡터에 기반을 둔다.
여전히 또 다른 구체예에서, 상기 발현 시스템은 코스미드 벡터 또는 인공 염색체다.
특정 구체예들에서, 벡터에 AADC 유전자를 봉입시키는 것은 여러 가지 이유로 불리할 수 있다.
첫째, 조정없이 티로신을 도파민으로 전환시킬 수 있는 새로운 시스템을 생성한다. 형질도입된 세포는 도파민을 소포로 격리시키는 메커니즘이 없기 때문에, 도파민이 세포질에 빠르게 축적될 수 있다. TH 효소가 N-말단 조절 도메인과 함께 남겨진다면, 생성된 도파민은 치료의 효능을 심각하게 제한할 수 있는 네가티브 피드백을 통해 직접적으로 DOPA 합성을 억제할 수 있다. 반면, TH 효소가 절두되면(가령, 서열 번호: 40), 형질도입된 세포는 도파민을 방출하는 메카니즘을 보유하지 않기 때문에, 세포질 도파민 수준이 급속히 증가할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 정의된 발현 시스템은 방향족 아미노산데카르복실라제(AADC) 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 1 내지 40 kb, 예를 들면, 1 내지 30 kb, 이를 테면, 1 내지 20 kb, 예를 들면, 1 내지 15 kb, 이를 테면, 1 내지 10, 예를 들면, 1 내지 8 kb, 이를 테면, 2 내지 7 kb, 예를 들면, 3 내지 6 kb, 이를 테면, 4 내지 5 kb의 패키징 수용력(packaging capacity)을 보유한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 4.5 내지 4.8 kb의 패키징 수용력을 보유하는 바이러스 벡터다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 아데노 연관된 벡터(AAV), 아데노바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택된 바이러스 벡터다.
한 구체예에서, 상기 벡터는 통합(integrating) 벡터다. 또 다른 구체예에서, 상기 벡터는 비-통합 벡터다.
한 구체예에서, 본 발명의 벡터는 최소한의(minimally) 통합 벡터다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 아데노 연관된 벡터(AAV)다.
AAV 벡터를 준비하는 방법은 당업자들에게 잘 공지되어 있다. AAV의 중추 신경계로의 전달 예시를 기술하고 있는 가령, US 5,677,158, US 6,309,634, 및 US 6,451 ,306 참고한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 AAV 벡터는 혈청형 AAV5, AAV1, AAV6, AAV9 및 AAV2 벡터로 구성된 군에서 선택된다. 이들은 근세포, 이를 테면, 근육세포(myocytes) 또는 근육모세포(myoblasts)를 표적으로 하는데 선호적으로 이용된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 AAV 벡터는 혈청형 AAV8, AAV5, AAV2, AAV9 및 AAV7 벡터로 구성된 군에서 선택된다. 이들은 간, 바람직하게는 간세포(hepatocytes)를 표적으로 하는데 선호적으로 이용된다.
연구에서 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 유전자 전달 벡터의 효능이 실증되었으며(McCarty(2008) Mol Ther.16(10): 1648-56) 그리고 최근의 임상 시험에서 유망한 결과를 보여주었다. 그러나, 형질도입에 요구되는 게놈 함유 입자의 수에 있어서, 이들 벡터의 효율은 발현에 앞서, 단일-가닥 DNA(ssDNA) 게놈을 이중-가닥 DNA(dsDNA)로 전환시켜야 하는 필요에 의해 방해받는다. 이 단계는 DNA 합성, 또는 다중 벡터 게놈 간의 염기쌍의 형성없이, dsDNA로 폴드될 수 있는 역전된 반복 게놈을 패키징하는 자가-상보성 벡터의 사용을 통해 완전히 우회될 수 있다. 이 효율성에 있어서 중요한 상충점(trade-off)은 벡터의 코딩 용량의 절반이 손실된다는 점이며, 그리고 현재 사용 가능한 RNA-기반 치료법은 비록 작은 단백질 인코딩 유전자(최대 55 kd까지)이지만, 이를 수용할 수 있다. 자가-상보적 AAV(scAAV) 벡터로 얻은 효율의 증가는 조직, 세포 유형 및 투여 경로에 따라 미미한 효율에서부터 놀라운 효율까지 다양한 범위를 갖는다. 자가-상보적 벡터의 구조 및 물리적 특성과 함께, 간, 근육 및 중추 신경계(CNS)를 비롯한 여러 조직의 다양한 반응의 기본사항은 McCarthy의 재론(review)에 요약되어 있다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 자가-상보적 AAV(scAAV) 벡터다.
한 구체예에서, AAV8 벡터의 게놈은 AAV8 캡시드이외의 AAV 캡시드, 이를 테면, AAV5, AAV9, AAV7, AAV6, AAV2 또는 AAV1 캡시드 안에 패키지된다.
또 다른 구체예에서, AAV7 벡터의 게놈은 AAV7 캡시드이외의 AAV 캡시드, 이를 테면, AAV8, AAV9 AAV5, AAV6, AAV2 또는 AAV1 캡시드 안에 패키지된다.
여전히 또 다른 구체예에서, AAV6 벡터의 게놈은 AAV6 캡시드이외의 AAV 캡시드, 이를 테면, AAV8, AAV9, AAV7, AAV5, AAV2 또는 AAV1 캡시드 안에 패키지된다.
여전히 또 다른 구체예에서, AAV5 벡터의 게놈은 AAV5 캡시드이외의 AAV 캡시드, 이를 테면, AAV8, AAV9, AAV7, AAV6, AAV2 또는 AAV1 캡시드 안에 패키지된다.
또 다른 구체예에서, AAV2 벡터의 게놈은 AAV2 캡시드이외의 AAV 캡시드, 이를 테면, AAV8, AAV9, AAV7, AAV6, AAV5 또는 AAV1 캡시드 안에 패키지된다.
또 다른 구체예에서, AAV1 벡터의 게놈은 AAV1 캡시드이외의 AAV 캡시드, 이를 테면, AAV8, AAV9, AAV7, AAV6, AAV2 또는 AAV5 캡시드 안에 패키지된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 발현 시스템은 하나 또는 그 이상의 플라스미드이며, 이들은 상기 열거된 벡터 안에 패키지될 수 있거나, 또는 네이키드 상태, 즉 패키지 안될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 플라스미드는 네이키드 상태다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 벡터는 포유류 세포를 감염 또는 형질도입시킬 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 벡터는 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 52 및 서열 번호: 53을 포함하는 군에서 선택된 벡터다.
프로모터
프로모터는 특정 유전자의 전사를 시작하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터는 뉴클레오티드의 동일한 가닥(안티센스 가닥의 3 '영역으로, 이는 또한 주형 가닥 및 비-코딩 가닥이라고도 함) 상에, 그리고 이들이 전사하는 유전자의 부근 상류에 위치한다. 프로모터는 전형적으로 약 100-1000개의 염기쌍으로 구성된다.
한 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템은 본 명세서에서 기술된 제 1 및 제 2 프로모터를 포함한다. 한 구체예에서, 전술한 제 1 프로모터와 전술한 제 2 프로모터 서열은 상이한 프로모터 서열이다. 또 다른 구체예에서, 전술한 제 1 프로모터와 전술한 제 2 프로모터 서열은 동일한 프로모터 서열이다.
한 구체예에서, 상기 발현 시스템은 3 개의 폴리펩티드 TH, GCH1 및 PTPS를 인코딩하는 2 개의 폴리뉴클레오티드 사이에 IRES와 함께 위치하는 단일 프로모터를 포함한다.
본 발명의 발현 시스템의 또 다른 구체예는 본 명세서의 상기에서 기술된 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 간 특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계된 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 발현할 때, 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 이것은 발현할 때, 본 명세서의 상기에서 기술된 GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 간 특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 이것은 발현할 때, 본 명세서 상기에서 기술된 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 간 특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
추가 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 본 명세서의 상기에서 기술된 프로모터를 포함하며, 이때 상기 프로모터는 간 프로모터/인헨서 1(LP1) 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체 및/또는 간-특이적 하이브리드 프로모터(HLP) 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택된 간 특이적 프로모터다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 본 명세서의 상기에서 기술된 프로모터를 포함하는데, 이때 상기 프로모터는 서열 번호: 38(HLP) 및/또는 서열 번호: 39(LP1)로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 70% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 75% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 80% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 85% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 90% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 95% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 96% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 97% 동일한, 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 98% 동일한, 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 99% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 100% 동일한 간 특이적 프로모터다.
본 발명의 발현 시스템의 또 다른 구체예는 본 명세서의 상기에서 기술된 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 근육 특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계된 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 발현할 때, 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 이것은 발현할 때, 본 명세서의 상기에서 기술된 GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 근육 특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 이것은 발현할 때, 본 명세서 상기에서 기술된 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 근육 특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
추가 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 본 명세서의 상기에서 기술된 프로모터를 포함하고, 이때 상기 프로모터는 pMCK1350, dMCK, tMCK 및 인간의 느린(slow) 트로포닌 I 유전자 인헨서, 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체의 다중 복사체인 프로모터로 구성된 군에서 선택된 근육 특이적 프로모터다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 본 명세서의 상기에서 기술된 프로모터를 포함하는데, 이때 상기 프로모터는 서열 번호: 38(HLP) 및/또는 서열 번호: 39(LP1)로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 70% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 75% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 80% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 85% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 90% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 95% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 96% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 97% 동일한, 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 98% 동일한, 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 최소한 99% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 100% 동일한 간 특이적 프로모터다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 포유류 세포, 이를 테면, 포유류의 간 및 골격근 또는 평활근의 세포를 포함하나, 이에 국한되지 않은 포유류 세포에 선택적인 프로모터를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 프로모터는 간세포, 근육세포 및 근육모세포로 구성된 군에서 선택된 포유류 세포에 특이적이다.
상기 프로모터는 자연 발생적 프로모터 또는 합성 프로모터일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 구성적 프로모터, 이를 테면, p-MCK(근육 크레아틴 키나제의 프로모터), 예를 들면, p-MCK1350, 인간 느린 트로포닌 I 유전자 인헨서, LB1, HLP, CAG, CBA, CMV, 인간 UbiC, RSV, EF-1 알파, SV40, Mt1, pGK, H1 및/또는 U3의 다중 복사체인 프로모터로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 프로모터를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 EF-1 알파 프로모터를 포함한다. 상기 EF-1 알파 프로모터는 TH 또는 GCH1의 상류에 위치할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 유도성 프로모터, 이를 테면, Tet-On, Tet-Off, Mo-MLV-LTR, Mx1, 프로게스테론, RU486 및/또는 라파마이신(Rapamycin)-유도성 프로모터가 포함된, 그러나 이에 국한되지 않는 프로모터를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 간 세포, 가령, 간세포(hepatocytes)에 특이적인 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 LP1, hAPO-HCR 및/또는 hAAT를 포함한다. 본 발명에서 임의의 간 특이적 프로모터가 유용할 수 있는데, 이를 테면, 게놈 데이터베이스, 이를 테면, Genbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, 이를 테면, http://rulai.cshl.edu/LSPD/에서 찾아볼 수 있는 "간 특이적 유전자 프로모터 데이터베이스(The Liver Specific Gene Promoter Database)"에서 볼 수 있는 프로모터들이 유용할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 근육 세포에 특이적인 하나 또는 그 이상의 프로모터(들)을 포함하는데, 이를 테면, 다음으로 구성된 군에서 선택된 프로모터를 포함하나 이에 국한되지 않는다:
a. 간 프로모터/인헨서 1(LP1),
b. 간-특이적 하이브리드 프로모터(HLP)(Mcintosh J 등, Blood 2013 121(17) 3335-3344 참고),
c. CMV 프로모터 및 SPc5-12의 요소들을 이용하는 근육 특이적 복합된 또는 이중 프로모터,
d. SPc5-12 합성 근육 특이적 프로모터,
e. 근육 특이적 크레아틴 키나제 프로모터 또는 이의 축약된 형태, 이를 테면, dMCK 또는 tMCK, p-MCK1350, 또는 인간 느린 트로포닌 I 유전자 인헨서의 다중 복사체인 프로모터
f. CMV 프로모터,
g. 근육 CAT 프로모터,
h. 골격근 알파 액틴 448 프로모터,
i. 상기 a-f중 임의의 활성 유사체 또는 이들의 단편들.
한 구체예에서, 상기 프로모터의 발현 패턴은 전신 투여가능한 제제, 예를 들어, 테트라사이클린 온/오프(on/off) 유전자 발현 시스템에 의해 조절될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 LB1 및 HLP로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 프로모터(들)을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 서열 번호: 38 및 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 프로모터(들)을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 발현할 때, TH를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 발현할 때, GCH1을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 2개의 프로모터를 더 포함하며, 여기에서 제 1 프로모터는 TH에 작동가능하도록 연계되고, 그리고 제 2 프로모터는 GCH1에 작동가능하도록 연계된다.
상기 2개의 프로모터중 하나 또는 둘 모두다 LB1, HLP, CAG, CBA, CMV, 인간 UbiC, RSV, EF-1 알파, SV40, Mt1, pGK, H1 및/또는 U3로 구성된 군에서 선택된 구성적 프로모터일 수 있다. 한 구체예에서, 두개 프로모터는 모두 EF-1 알파이다.
상기 2개의 프로모터중 하나는 LB1, HLP, CAG, CBA, CMV, 인간 UbiC, RSV, EF-1 알파, SV40, Mt1, pGK, H1 및/또는 U3로 구성된 군에서 선택된 구성적 프로모터일 수 있고, 그리고 상기 2개의 프로모터중 나머지 하나는 근육 세포에 특이적 프로모터, 이를 테면, 다음으로 구성된 군에서 선택되나, 이에 국한되지 않은 프로모터일 수 있다:
a. 간 프로모터/인헨서 1(LP1),
b. 간-특이적 하이브리드 프로모터(HLP)(Mcintosh J 등, Blood 2013 121(17) 3335-3344 참고),
c. CMV 프로모터 및 SPc5-12의 요소들을 이용하는 근육 특이적 복합된 또는 이중 프로모터,
d. SPc5-12 합성 근육 특이적 프로모터,
e. 근육 특이적 크레아틴 키나제 프로모터 또는 이의 축약된 형태, 이를 테면, dMCK 또는 tMCK, p-MCK1350, 또는 인간 느린 트로포닌 I 유전자 인헨서의 다중 복사체인 프로모터,
f. CMV 프로모터,
g. 근육 CAT 프로모터,
h. 골격근 알파 액틴 448 프로모터,
i. 상기 a-f중 임의의 활성 유사체 또는 이들의 단편들.
상기 2개의 프로모터중 하나는 LB1, HLP, CAG, CBA, CMV, 인간 UbiC, RSV, EF-1 알파, SV40, Mt1, pGK, H1 및/또는 U3로 구성된 군에서 선택된 구성적 프로모터일 수 있고, 그리고 상기 2개의 프로모터중 나머지 하나는 유도성 프로모터, 이를 테면, Tet-On, Tet-Off, Mo-MLV-LTR, Mx1, 프로게스테론, RU486 및/또는 라파마이신-유도성 프로모터일 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
상기 2개의 프로모터중 하나는 LB1, HLP, CAG, CBA, CMV, 인간 UbiC, RSV, EF-1 알파, SV40, Mt1, pGK, H1 및/또는 U3로 구성된 군에서 선택된 구성적 프로모터일 수 있고, 그리고 상기 2개의 프로모터중 나머지 하나는 본 명세서의 상기에서 상술된 바와 같이, 간 세포, 가령, 간세포에 특이적인 프로모터일 수 있다.
조절 요소(Regulatory elements)
본 발명에 따른 발현 시스템은 상기 논의된 프로모터에 추가하여, TH 및/또는 GCH-1을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자의 전사를 조절하는 다른 조절 요소를 또한 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 폴리아데닐화 서열, 이를 테면, SV40 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 상기 폴리아데닐화 서열은 전술한 TH 및/또는 GCH-1을 인코딩하는 핵산 서열의 3' 단부에 전형적으로 작동가능하도록 연계된다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 전사-후 조절 요소, 가령, 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)를 더 포함한다.
다양한 구체예들에서, 전술한 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소는 서열 번호: 28 또는 29의 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 전술한 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소는 서열 번호: 29의 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 발현 시스템은 TH 및/또는 GCH-1 전사체의 5' 단부에 전형적으로 작동가능하도록 연계된 인트론을 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함한다. 이러한 IRES는 mRNA 안에서 뉴클레오티드 서열 해독의 내부적 개시를 허용할 수 있다. 따라서 일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 다음을 포함한다: 발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계되고;
그리고
발현할 때, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계되고,
그리고
최소한 하나의 내부 리보솜 진입 부위. 이러한 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드, 및 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12)로 구성된 군에서 선택된 제 3 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으며, 이때 전술한 제 2 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계된다.
일부 구체예들에서, GCH1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 TH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치하고, IRES는 상기 GCH1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류와 TH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한다. 다른 구체예들에서, TH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GCH1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치하고, IRES는 TH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류와 GCH1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한다.
따라서, 일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 TH 및 GCH1의 독립적인 해독 개시 과정을 허용한다. 따라서, TH 및 GCH1 단백질 합성 수준은 상이할 수 있다.
한 구체예에서, 발현되는 효소 간의 비율, 이를 테면, TH:GCH1의 비율을 조정하는 것이 특히 관심대상이다.
한 구체예에서, TH:GCH1 비율은 7:1이다.
일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 다음을 포함한다:
발현할 때, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계되고;
그리고
발현할 때, 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계되고;
그리고
최소한 하나의 내부 리보솜 진입 부위.
이러한 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는, 그리고 프로모터에 작동가능하도록 연계된 제 2 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, GCH1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 PTPS를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치하고, IRES는 상기 GCH1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류와 PTPS를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한다.
다른 구체예들에서, PTPS를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 GCH1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치하고, IRES는 PTPS를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류와 GCH1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한다.
따라서, 일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 PTPS 및 GCH1의 독립적인 해독 개시 과정을 허용한다. 따라서, PTPS 및 GCH1 단백질 합성 수준은 상이할 수 있다.
한 구체예에서, 발현되는 효소 간의 비율, 이를 테면, PTPS:GCH1의 비율을 조정하는 것이 특히 관심대상이다.
한 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템의 프로모터 및/또는 기타 조절 요소는 PTPS와 GCH-1를 모두 발현 지시할 수 있고, 이때 발현된 PTPS:GCH1의 비율은 최소한 3:1, 이를 테면, 최소한 4:1, 예를 들면, 최소한 5:1, 이를 테면, 최소한 6:1, 예를 들면, 최소한 7:1, 이를 테면, 최소한 10:1, 예를 들면, 15:1, 이를 테면, 20:1, 예를 들면, 25:1, 이를 테면, 30:1, 예를 들면, 35:1, 이를 테면, 40:1, 예를 들면, 45:1, 이를 테면, 50:1이다.
한 구체예에서, 상기 PTPS:GCH1 비율은 7:1이다.
일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 다음을 포함한다:
발현할 때, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계되고;
그리고
발현할 때, 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이때 전술한 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하도록 연계되고;
그리고
최소한 하나의 내부 리보솜 진입 부위.
이러한 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 발현할 때, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코드하는, 그리고 프로모터에 작동가능하도록 연계된 제 2 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, TH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 PTPS를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치하고, IRES는 상기 TH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류와 PTPS를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한다.
다른 구체예들에서, PTPS을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 TH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치하고, IRES는 상기 PTPS를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류, 그리고 TH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한다.
따라서, 일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 PTPS 및 TH의 독립적인 해독 개시 과정을 허용한다. 따라서, PTPS 및 TH 단백질 합성 수준은 상이할 수 있다.
한 구체예에서, 발현되는 효소 간의 비율, 이를 테면, TH:GCH1의 비율을 조정하는 것이 특히 관심대상이다.
한 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템의 프로모터 및/또는 기타 조절 요소는 PTPS와 TH를 모두 발현 지시할 수 있고, 이때 발현된 PTPS:TH의 비율은 최소한 3:1, 이를 테면, 최소한 4:1, 예를 들면, 최소한 5:1, 이를 테면, 최소한 6:1, 예를 들면, 최소한 7:1, 이를 테면, 최소한 10:1, 예를 들면, 15:1, 이를 테면, 20:1, 예를 들면, 25:1, 이를 테면, 30:1, 예를 들면, 35:1, 이를 테면, 40:1, 예를 들면, 45:1, 이를 테면, 50:1이다.
한 구체예에서, PTPS:TH 비율은 7:1이다.
TH:GCH1, PTPS:TH 또는 PTPS:GCH1 간의 비율은 상기 정의된 바와 같은 벡터로 형질감염되거나 또는 형질도입된 시료 숙주로부터의 시료에서 발현된 TH와 GCH1 효소의 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다.
대안으로, 상기 비율은 상기 정의된 바와 같은 벡터로 형질감염되거나 또는 형질도입된 시료 숙주로부터의 시료에서 테트라히드로비오테린(BH4)의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
대안으로, 상기 비율은 상기 정의된 바와 같은 벡터로 형질감염되거나 또는 형질도입된 시료 숙주로부터의 시료에서 전사된 mRNA의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
대안으로, 상기 비율은 상기 정의된 바와 같은 벡터로 형질감염되거나 또는 형질도입된 시료 숙주로부터의 시료에서 발현된 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
티로신 히드록실라제 (Tyrosine hydroxylase )
티로신 히드록실라제(약어로 TH)는 티로신을 도파민의 전구물질인 3,4-디히드록시페닐알라닌(DOPA)로의 전환을 촉매하는 모노옥시게나제(monooxygenase)다. TH 활성은 환경 변화 그리고 신경 및 호르몬 자극에 대한 전사 및 해독-후 기전에 의해 조절된다.
TH 활성의 가장 강력한(acute) 조절은 인산화(phosphorylation)를 통한 단백질의 해독-후 변형을 통해 일어난다.
언급한 바와 같이, 티로신 히드록실라제의 주요 기능은 티로신의 도파민으로의 전환이다. TH는 주로 도파민성 뉴런에서 발견되지만, 이것들에 국한되지는 않는다. TH 녹아웃(knock out) 유전자형은 마우스 배아 14 일 이내에 치명적이기 때문에, TH 유전자는 배아 발달에 필수적이며, 한편 TH 돌연변이에 대한 이형접합된 마우스는 카테콜라민 수준의 약간 감소와 함께, 정상적으로 발달한다.
TH 효소는 카테콜라민의 생산에 관여하는 다른 많은 효소와는 달리, 인돌 유도체를 수용하지 않기 때문에 매우 특이적이다. 카테콜아민의 합성에서 속도-제한 효소로써, TH는 아드레날린성 뉴런의 생리학에서 중요한 역할을 한다. 카테콜아민, 이를 테면, 도파민은 전술한 아드레날린성 뉴런의 신호 전달에서 중요한 역할을 한다. 아드레날린성 뉴런의 기능장애는 말초 신경병증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴병, 허혈성 뇌졸중, 급성 뇌 손상, 급성 척수 손상, 신경계 종양, 다발성 경화증, 말초 신경 외상 또는 손상, 신경독에 노출, 대사성 질환 이를 테면, 당뇨병 또는 신장 기능 장애 그리고 전염성 물질에 의한 손상 또는 기분장애 이를 테면, 우울증과 같은 몇 가지 신경퇴생성 장애를 일으킨다.
본 발명의 구조체 및 방법으로 투여되는 TH는 파킨슨 질환 치료에 사용될 수 있다. 도 1에서 실증된 바와 같이, L-DOPA는 효소 티로신 히드록실라제(TH)에 의해 아미노산 L-티로신로부터 생합성된다.
L-티로신은 효소 페닐알라닌 히드롤라제(PAH)에 의해 아미노산 페닐알라닌으로부터 생합성된다.
페닐알라닌은 간세포 및 횡문 근육 세포(Thony, 2010)이 포함된 세포의 혈장 막을 통하여 운반된다.
티로신 히드록실화는 카테콜아민의 합성에서 속도-제한 단계다.
인간은 4 가지 TH의 아이소자임(isozymes)을 가지고 있는데, 이들은 pre-mRNA 스플라이싱으로 met30에 이어 추가 아미노산을 생성하기 때문에 이들의 R 도메인이 상이하다.
상기 효소의 복잡한 조절은 2가지 광범위한 범주로써 발생하는 것으로 알려져 있다: 효소 활성의 단기 조절(티로신에 의한 기질 억제(Reed, Lieb, & Nijhout, 2010) 피드백 억제(Kumer & Vrana, 1996), 알로스테릭(allosteric) 조절, 및 효소 인산화) 그리고 유전자 발현의 중-장기 조절(전사 조절, 대체 RNA 스플라이싱, RNA 안정성, 해독 조절, 및 효소 안정성).
일단 TH가 합성되면, 효소는 인산화없이 활성화되며, 카테콜아민과 결합하지 않으면 인산화가 활성화되어야 한다.(Bobrovskaya 등, 2007)
TH는 방향족 아미노산 히드록실라제(AAAHs) 페닐알라닌 히드록실라제(PheH) 및 트립토판 히드록실라제(TrpH)를 또한 포함하는 효소 패밀리 구성원이다. 세 가지 효소 모두 아미노산의 방향족 고리의 히드록실화를 수행한다. 이들은 모두 결합된 철 원자와의 반응에서 이원자(diatomic) 산소와 환원된 비오프테린을 이용한다. 철 원자는 2개의 히스티딘 잔기 및 글루타메이트 잔기에 의해 활성 부위 갈라진 틈의 제 위치에 유지되며, 촉매 작용을 수행하기 위해서는 제1 철(ferrous) 상태이어야 한다. 이러한 활성 부위 유사성외에도, 상기 패밀리는 3 차원 구조의 다른 특징들을 공유한다. TH는 160개 아미노산 잔기의 아미노-말단 조절 도메인(R), 이어서 촉매 도메인(C) 그리고 카르복실 말단에서 훨씬 더 짧은 코일드-코일형(coiled-coil) 도메인의, 다중 도메인 구조를 갖는다. 상기 효소는 테트라머를 형성한다.
상기 R 도메인은 위치 8, 19, 31 및 40에 세린을 함유한다. 이들은 모두 cAMP-의존적 단백질 키나제(PKA)에 의해 인산화된다(Fitzpatrick, 1999). TH가 PKA에 의해 인산화될 때, 카테콜아민에 의한 피드백 억제에 덜 민감해진다(Daubner, Lauriano, Haycock, & Fitzpatrick, 1992). 비록 결정 구조를 통하여 이를 증명하지는 못하지만, 인산화는 활성 부위의 개구(opening) 밖으로 R 도메인을 이용시키고, 포스포타제에 의한 탈인산화는 이것들 방해 위치로 되돌린다는 가설은 논리이다(Daubner, Le, & Wang, 2011).
TH는 이의 조절 도메인에서 3 개의 세린 잔기 중 어느 하나가 인산화된 후에 활성화된다. Ser40은 주로 PKA에 의해 인산화되고, 이로 인하여 카테콜아민 친화성은 감소된다. Ser31은 여러 키나제에 의해 인산화되고, 이로 인하여 테트라히드로비오테린의 KM 값은 감소된다. Ser19는 ser19 또는 ser19와-40 둘 모두 다를 변형시키는 효소에 의해 인산화되고, 다른 인자가 없는 경우 활성화되지 않는다. CaMKII에 의한 ser19의 인산화는 동일한 키나아제에 의한 ser40의 인산화를 촉진시킨다. 샤프롱(chaperone) 단백질에 대한 안정화와 더 엄격한 결합 가능성이 있지만, 다중부위 인산화의 임의의 다른 결과는 아직 확립되지 않았다. 도파민, 노르에피네프린, 및 에피네프린은 모두 TH의 피드백 억제제이며, 그리고 ser40 인산화에 대한 TH 활성의 가장 큰 변화는 카테콜라민에 대한 Kd 값의 변화다. TH에 대한 DA 친화력은 효소가 인산화되었을 때, 300-배 감소한다(Ramsey & Fitzpatrick, 1998).
처음 32개 아미노산이 결여된(TH△32), 처음 68개 아미노산이 결여된(TH△68), 처음 76개 아미노산이 결여된, 또는 처음 120개 아미노산이 결여된, rTyrH 결손 변이체의 도파민 억제가 연구되었다(Daubner & Piper, 1995). 이들 결손 변이체를 화학량론적 양의 도파민으로 사전배양하여 억제를 시험하였다; TyrHD32는 도파민에 의해 90% 억제되었지만, TyrHD68 및 다른 절두체(truncates)는 억제되지 않았다. 또한, 도파민 결합 및 방출 속도를 조사하였을 때, 도파민은 TH△32로부터 방출되지 않았지만 그러나, TH△68에서는 빠르게 방출되었다(Ramsey & Fitzpatrick, 1998). 도파민은 DOPA보다 1,000-배 더 강하게 결합하며, 디히드록시페닐아세테이트는 DOPA보다 100-배 덜 단단하게 결합한다(Ramsey & Fitzpatrick, 2000).
TH는 또한 효소의 비-인산화된 형태 및 Ser40-인산화된 형태 모두에 존재하는 제 2 낮은 친화력(K(D) = 90 nM) 도파민 결합 부위를 함유하는데, 이 부위는 효소의 비-인산화된 형태 및 Ser40-인산화된 형태 모두에 존재한다. 도파민이 높은-친화력 부위에 결합하면 V(max)는 감소되고, 공인자 테트라히드로비오테린에 대한 KM은 증가되며, 한편 도파민의 낮은-친화력 부위에 결합으로 테트라히드로비오테린에 대한 KM을 증가시킴으로써, TH 활성은 조정된다. 동역학 분석에서 두 부위는 모두 4 개의 인간 TH 아이소폼에 각각 존재한다.
낮은 친화력 부위에서 도파민의 해리는 비-인산화된 효소에 대해 TH 활성을 12-배 증가시키고, Ser40-인산화된 효소에 대해서는 9-배 증가시킨다. 상기 낮은-친화력 도파민-결합 부위는 대부분 조건 하에서 카테콜아민 합성 조절에 주요 기전이 될 가능성을 갖는다(Gordon, Quinsey, Dunkley, & Dickson, 2008).
N 말단 조절 도메인의 처음 대략 160개 아미노산이 결여된 절두된 TH는 티로신을 DOPA로의 전환을 촉매하는데 여전히 활성을 갖는다(가령, 서열 번호: 40). TH의 또 다른 절두된 형태는 처음 155개 아미노산을 제거한 것이다. 위치 8, 19, 31, 40에 있는 세린은 피드백 조절 또는 TH의 조절에서 인산화/탈인산화에 특히 중요한 것으로 간주된다. 따라서, 기타 절두들 또한 본 발명에서 유용할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 TH는 처음 10-300개 아미노산이 결여된, 이를 테면, 처음 100-250개 아미노산이 결여되고, 이를 테면, 처음 130-210개 아미노산이 결여되고, 바람직하게는 이를 테면, 처음 140-170개 아미노산이 결여되고, 더욱 바람직하게는 이를 테면, 처음 150-160개 아미노산이 결여된다.
3가지 방향족 아미노산, 히드록실라제 TH, 페닐알라닌 히드록실라제(PAH) 및 트립토판 히드록실라제(TRPH) 모두 C 말단에서 대략적으로 330개 아미노산의 상당히 높은 상동성 촉매 도메인을 공유한다면, 기질 특이성은 부분적으로 각 조절 도메인으로 인한 것임이 제안되었다. 각 효소의 R 도메인이 다른 효소의 C 도메인에 부착된 TH 및 PAH의 키메라 돌연변이체(chimeric mutants)가 작제되었다(Daubner, Hillas, & Fitzpatrick, 1997). 이들 키메라 돌연변이체, 뿐만 아니라 이들의 N-말단 R 도메인이 결여된 절두된 돌연변이체 그리고 야생형 효소를 이용하여, Daubner 등은 이들 효소의 아미노산 기질 특이성을 특정함에 있어서 아미노-말단 도메인의 역할을 실증하였다. 상기 절두된 단백질들은 이들 아미노산에 대하여 낮은 결합 특이성을 나타내었다. 이들 조절 도메인의 부착으로 상기 특이성은 상당히 증가되었지만, 그러나, 이 특이성은 키메라 단백질에서 촉매 도메인에 의해 결정되었다.
본 발명에서 TH를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26 및 서열 번호: 27에서 제시된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26 및 서열 번호: 27에 대하여 최소한 70% 동일성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26 및 서열 번호: 27에 대하여 75% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 80% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 85% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 90% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 95% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 96% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 97% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 98% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 99% 서열 동일성을 갖는 서열이 포함된 TH 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 발현 시스템 구조체에 포함된 TH를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 TH 폴리펩티드의 생물학적으로 활성 단편 또는 변이체를 또한 인코드할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 TH 폴리뉴클레오티드의 이러한 단편 또는 변이체는 최소한 50개의 연접 아미노산, 이를 테면, 75개의 연접 아미노산, 예를 들면, 100개의 연접 아미노산, 이를 테면, 150개의 연접 아미노산, 예를 들면, 200개의 연접 아미노산, 이를 테면, 250개의 연접 아미노산, 예를 들면, 300개의 연접 아미노산, 이를 테면, 350개의 연접 아미노산, 예를 들면, 400개의 연접 아미노산, 이를 테면, 450개의 연접 아미노산을 포함하는 TH 폴리펩티드를 인코드한다.
한 구체예에서, 상기 생물학적으로 활성 단편은 티로신 히드록실라제의 촉매 도메인(서열 번호: 13) 또는(서열 번호: 40)이다.
특정 구체예들에서, 명시된 티로신 히드록실라제는 본 발명의 인코드된 TH 폴리펩티드의 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17의 돌연변이된 및/또는 치환된 변이체 또한 본 발명에서 포함된다. 한 구체예에서, 이 아미노산 서열에서 치환은 보전적이며, 이때 아미노산은 화학적 및/또는 물리적 성질이 유사한 또 다른 아미노산으로 치환된다. 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17 및/또는 인코드된 TH 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 부위에서 돌연변이가 발생될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 TH 생물학적 활성을 부여하는 임의의 돌연변이, 이를 테면, 예를 들면, 중립(neutral) 돌연변이 또는 침묵(silent) 돌연변이에 관계한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 7, 서열 번호: 40, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17중 임의의 하나에서 세린 잔기 S8, S19, S31, S40 또는 S404 또는 이의 등가의 아미노산 잔기중 하나 또는 그 이상이 변경된 돌연변이에 관한 것이다.
한 구체예에서, 상기 생물학적 활성 변이체는 돌연변이된 티로신 히드록실라제 폴리펩티드인데, 이때 서열 번호: 7의 잔기 S19, S31, S40 또는 S404중 하나 또는 그 이상은 또 다른 아미노산 잔기로 변경되었다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템 구조체에 의해 발현된 티로신 히드록실라제(TH) 폴리펩티드는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 70% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 75% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 80% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 85% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 90% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 95% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 96% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 97% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 98% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 99% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 100% 동일하다.
GTP - 시클로히드롤라제 1
GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1)는 GTP 시클로히드롤라제 효소 패밀리의 구성원이다. GCH1은 엽산염과 비오프테린 생합성 경로의 일부다. GCH1은 GTP를 7,8-DHNP-3'-TP로의 전환을 촉매하는 테트라히드로비오테린(BH4) 생합성의 첫번째 그리고 속도-제한 효소다. BH4　는 모노아민 신경전달물질 세로토닌(5-히드록시트립타민(5-HT), 멜라토닌, 도파민, 노르아드레날린, 및 아드레날린의 생합성에서 방향족 아미노산 히드록실라제(AAAH)에 의해 요구되는 필수 공인자다. 이 유전자의 돌연변이는 L-DOPA-반응성 근긴장이상 뿐만 아니라 악성 페닐케톤뇨증(phenylketonuria)과 과페닐알라닌혈증(hyperphenylalaninemia)과 관련이 있다.
상이한 아이소폼(isoforms)을 인코딩하는 몇 가지 대안적으로 스플라이스된 전사 변이체가 기술되어 있지만; 그러나, 모든 변이체가 기능적 효소를 생성하는 것은 아니다.
GCH1은 몇 가지 질환을 비롯한 많은 임상적 영향(implication)을 지니고 있다. GCH1의 결핍은 GTP 시클로히드롤라제 1 결핍이 그 원인이다(GCH1 D; GTP 시클로히드롤라제 I 결핍으로 인한 비정형 중증 페닐케톤뇨증으로도 알려져 있음). GCH1 D는 테트라히드로비오테린 결핍에 의한 악성 과페닐알라닌 혈증의 원인 중 하나이다. 신경전달물질 도파민 및 세로토닌의 결핍으로 인하여, 이를 테면, 파킨슨 질환이 초래되는 결함성 신경전달물질의 원인이기도 하다. 주요 증상으로는 정신운동 지연, 긴장성 장애, 경련, 졸음, 과민성, 비정상적인 움직임, 고열, 과다침분비, 및 연하 곤란을 포함한다.
일부 환자는 중증의 과페닐알라닌혈증와 경증 근긴장이상 유형 5(낮동안 요동(diurnal fluctuation)이 있는 근긴장이상-파킨슨증) 사이의 중간 수준의 중증도의 표현형을 나타낼 수 있다. 이와 같은 중간 표현형에서 현저한 운동 지연이 있지만, 정신 지체가 없으며, 그리고 만약 있다하더라도, 최소한의 과페닐알라닌혈증이 있다.
GCH1의 결함은 근긴장이상 유형 5(DYT5)의 원인이며; 또한 주간 요동을 동반한 진행성 근긴장이상증, 상염색체 우성 세가와(Segawa) 증후군, 또는 주간 요동을 동반하는 근긴장이상-파킨슨 병으로도 알려져 있다. DYT5는 DOPA-반응성 근긴장이상이다. 근긴장이상은 지속적인 무의식적 근육 수축의 존재로 정의되며, 종종 비정상적인 자세로 이어진다. DYT5는 하지의 근긴장이상으로 인한 아동기에서 걸음걸이 문제 및 저녁이 될수록 근긴장이상의 악화되는 것이 전형적이다. 특징적인 주간 요동을 보이는 자세 변화와 운동 장애로 특징화된다. 몸통의 비틀림은 드문 경우다. 증상들은 잠들면 완화되고, 증상은 피로와 운동에 의해 악화된다. 부작용이 없는 L-DOPA에 유리한 반응이 있다.
본 발명의 구조체 및 방법으로 투여되는 GCH1은 파킨슨 질환 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에서 GCH1을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 30에서 제시된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 30 그리고 서열 번호: 30에 대하여 최소한 70% 동일성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게는 75% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 80% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 85% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 90% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 95% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 96% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 97% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 98% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 99% 서열 동일성을 갖는 서열이 포함된 GCH1 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 발현 시스템 구조체에 포함된 GCH1을 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 GCH1 폴리펩티드의 생물학적으로 활성 단편 또는 변이체를 또한 인코드할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 의해 인코드되는 GCH1의 이러한 단편 또는 변이체는 최소한 50개의 연접 아미노산, 이를 테면, 75개의 연접 아미노산, 예를 들면, 100개의 연접 아미노산, 이를 테면, 150개의 연접 아미노산, 예를 들면, 200개의 연접 아미노산, 이를 테면, 250개의 연접 아미노산을 포함하며, 이때 문제의 서열에 명시된 임의의 아미노산은 전술한 단편 또는 변이체에서 아미노산중 15개 미만이 변경되면, 상이한 아미노산으로 변경된다.
본 발명의 인코드된 GCH1 폴리펩티드의 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6의 돌연변이된 그리고 치환된 형태 또한 포함된다. 한 구체예에서, 이 아미노산 서열에서 치환은 보전적이며, 이때 아미노산은 화학적 및/또는 물리적 성질이 유사한 또 다른 아미노산으로 치환된다. 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6안에 및 또는 인코드된 GCH1 폴리펩티드 안에 하나 또는 그 이상의 부위에서 돌연변이가 일어날 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 GCH1 생물학적 활성을 부여하는 임의의 돌연변이, 이를 테면, 예를 들면, 중립 돌연변이 또는 침묵 돌연변이에 관계한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템 구조체에 의해 발현된 생물학적으로 활성 단편은 최소한 50개의 연접 아미노산을 포함하며, 이때 선택된 서열에 명시된 임의의 아미노산은 이 서열에 있는 아미노산중 15개 미만이 변경되면, 상이한 아미노산으로 변경된다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템 구조체에 의해 발현되는 GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1) 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 70% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 75% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 80% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 85% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 90% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 95% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 96% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 97% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 98% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 최소한 99% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 100% 동일하다.
6- 피루보일테트라히드로프테린 합성효소( PTPS , EC 4.2.3.12)
6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12)는 7,8-디히드로네오프테린 트리포스페이트를 6-피루보일테트라히드로프테린 및 트리포스페이트로의 전환을 촉매하는 효소다. 상기 반응은 가역적이다. 6-피루보일테트라히드로프테린은 테트라히드로비오테린(BH4) 생합성의 중간생성물이다. 구체적으로, PTPS는 GCH1의 생산과 활성을 촉진하는 것으로 보인다. BH4는 페닐알라닌 히드록실라제의 안정성 및 활성 그리고 이로 인하여 L-DOPA의 생합성에 역할을 하는 것으로 보고되었다.
PTPS는 간에서 발현된다. 이론에 얽매이지 않고, 간에서 PTPS의 순수한 내인성 발현 수준이 L-DOPA의 생합성을 허용하기에 충분하다는 가설이 있다.
따라서, 하기에 기술된 바와 같이, 숙주 세포에서 형질감염될 본 발현 시스템은 발현할 때, 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12)를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 이는 숙주 세포가 간세포가 아닌 구체예와 관련이 있는데, 예를 들어 숙주 세포는 근세포와 같은 근육 세포 또는 근육 세포 전구물질인 근육모세포이다.
본 발명의 구조체 및 방법으로 투여되는 PTPS는 파킨슨 질환 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에서 PTPS을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 41에서 제시된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 41 그리고 서열 번호: 41에 대하여 최소한 70% 동일성을 갖는 서열, 더욱 바람직하게는 75% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 80% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 85% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 90% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 95% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 96% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 97% 서열 동일성, 예를 들면, 최소한 98% 서열 동일성, 이를 테면, 최소한 99% 서열 동일성을 갖는 서열이 포함된 PTPS 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 발현 시스템 구조체에 포함된 PTPS를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 PTPS 폴리펩티드의 생물학적으로 활성 단편 또는 변이체를 또한 인코드할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 의해 인코드되는 PTPS의 이러한 단편 또는 변이체는 최소한 50개의 연접 아미노산, 이를 테면, 75개의 연접 아미노산, 예를 들면, 100개의 연접 아미노산, 이를 테면, 150개의 연접 아미노산, 예를 들면, 200개의 연접 아미노산, 이를 테면, 250개의 연접 아미노산을 포함하며, 이때 문제의 서열에 명시된 임의의 아미노산은 전술한 단편 또는 변이체에서 아미노산중 15개 미만이 변경된다면, 상이한 아미노산으로 변경된다.
서열 번호: 41 및 본 발명의 인코드된 PTPS 폴리펩티드의 돌연변이된 그리고 치환된 형태 또한 포함된다. 한 구체예에서, 이 아미노산 서열에서 치환은 보전적이며, 이때 아미노산은 화학적 및/또는 물리적 성질이 유사한 또 다른 아미노산으로 치환된다. 서열 번호: 41 및 또는 인코드된 PTPS 폴리펩티드 안에 하나 또는 그 이상의 부위에서 돌연변이가 일어날 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 PTPS 생물학적 활성을 부여하는 임의의 돌연변이, 이를 테면, 예를 들면, 중립 돌연변이 또는 침묵 돌연변이에 관계한다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템 구조체에 의해 발현된 생물학적으로 활성 단편은 최소한 50개의 연접 아미노산을 포함하며, 이때 선택된 서열에 명시된 임의의 아미노산은 이 서열에 있는 아미노산중 15개 미만이 변경되도록, 상이한 아미노산으로 변경된다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템 구조체에 의해 발현되는 PTPS 폴리펩티드는 서열 번호: 41에 대하여 최소한 70% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 최소한 75% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 최소한 80% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 최소한 85% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 최소한 90% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 최소한 95% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 최소한 96% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 최소한 97% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 최소한 98% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 최소한 99% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 100% 동일하다.
세포 계통(Cell lines)
한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터/발현 시스템으로 유전적으로 변형된 단리된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 네이키드 세포를 통하여 TH 및/또는 GCH-1의 생체내전달에 적합한 세포에 또한 관한 것으로, 이 세포는 TH 및/또는 GCH-1을 과발현하도록 유전적으로 변형되고, 그리고 환자에게 이식되어, 관심대상의 말초 조직에 말초적으로 생물학적 활성을 갖는 TH 및/또는 GCH-1 폴리펩티드를 전달할 수 있다. 이러한 세포는 광범위하게 치료 세포로 불릴 수 있다.
생체외 유전자 요법의 경우, 선호되는 세포 집단은 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템에 의해 형질도입되거나 형질감염된 단리된 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 더욱 바람직하게는 영장류 세포, 더욱 바람직하게는 인간 세포로 구성된 군에서 선택된다.
한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 생체외에서 형질감염되고, 후속적으로 포유류 안으로 투여, 이를 테면, 이식된다.
한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 간세포, 근육세포 및 근육모세포로 구성된 군에서 선택된다.
한 구체예에서, 전술한 포유류 세포는 간 세포, 이를 테면, 간세포(hepatocyte)다.
또 다른 구체예에서, 상기 포유류 세포은 근육 세포, 이를 테면, 근세포 또는 근육 세포 전구물질, 이를 테면, 근육모세포다. 이러한 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 바람직하게는 프로모터에 작동가능하도록 연계되고, 그리고 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 또한 포함한다.
상기 발현 시스템의 의학적 용도
본 명세서의 상기에서 명시된 바와 같이, 본 발명에 따른 발현 시스템은 의료용으로 의도된다.
상당히 바람직한 측면에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 질환 또는 카테콜아민 기능장애와 연관된 장애의 치료를 위하여 말초 투여에 이용된다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 혈액내 L-DOPA의 치료요법적으로 유효한 농도를 유지하는 방법에 특히 사용하기에 적합한데, 전술한 방법은 전술한 발현 시스템을 이를 필요로 하는 사람에게 말초 투여하는 것을 포함한다.
치료요법적으로 유효량 또는 환언하면, 혈장 L-DOPA의 치료요법적 범위는 0.2-1.5 mg/L 범위안에 보통 있지만, 임의의 시점 및 치료 상태와의 상관관계는 치료 과정에 걸쳐서 가변적이다. 이 변이는 혈장에 도달하고, 혈액 뇌 장벽을 통과하는 사이의 지체(lag) 그리고 혈액 뇌 장벽을 통과하는 활발한 수송을 위한 다른 아미노산과의 경쟁과 같은 요인과 관련된다.
전신 유전자 요법은 L-DOPA의 기저 수준을 부드럽게 유도하고, 이로써 L-DOPA의 순환계 수준이 최저(troughs)가 되는 것을 방지하는데, 만약 통상적인 경구 L-DOPA가 제공된다면, 최저 수준이 발생될 것이다. 따라서, 본 발명은 L-DOPA 유도된 이상운동증(LID)의 치료 및/또는 방지에 유용하다.
따라서, 상기 발현 시스템은 카테콜아민 기능장애와 연관된 상태 또는 질환, 이를 테면, 파킨슨 질환 및 L-DOPA 유도된 이상운동증의 치료를 목적으로 말초 투여용으로 기획되고, 제형화된다.
본 발명은 추가 측면에서, 혈액내 L-DOPA의 치료요법적으로 유효한 농도를 유지시키는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 상기에서 정의된 발현 시스템을 이를 필요로 하는 사람에게 말초 투여(즉, CNS 외부에서의 투여)하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 카테콜아민 기능장애와 연관된 질환을 치료 및/또는 방지하는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템의 치료요법적으로 유효량을 이를 필요로 하는 사람에게 말초적으로 투여하는 것을 포함한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 혈액 안에 L-DOPA의 치료요법적으로 유효한 농도를 유지시키는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 전술한 환자에게 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템을 투여하는 것을 포함한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 L-DOPA 유도된 이상운동증(LID)의 출현을 감소, 지연 및/또는 저지의 출현을 감소, 지연 및/또는 저지하는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템을 이를 필요로 하는 환자에게 말초적으로 투여하는 것을 포함한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 혈액 안에 L-DOPA의 치료요법적으로 유효한 농도를 획득하거나 및/또는 유지하는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 발현할 때, 최소한 하나의 치료 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함된 벡터를 말초적으로 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 최소한 하나의 치료 폴리펩티드는 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적으로 활성 단편 또는 이의 변이체다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 징후는 카테콜아민 기능 장애, 구체적으로 카테콜아민 결핍, 이를 테면, 도파민 결핍과 연관된 징후를 포함한다.
한 구체예에서, 카테콜아민 기능장애와 연관된 질환은 중추 및/또는 말초 신경계, 이를 테면, 신경퇴행성 장애의 질환, 장애 또는 손상이다.
한 구체예에서, 본 발명에 의해 치료가능한 질환은 기저핵(basal ganglia) 질환이다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 파킨슨 질환(PD), 이상운동증, DOPA 반응성 근긴장이상, ADHD, 정신분열증, 우울증, 혈관 파킨슨증, 본태성 진전증, 만성 스트레스, 유전적 도파민 수용체 이상, 만성적 아편(opoid), 코카인, 알코올 또는 마리화나 사용, 부신기능부전, 고혈압, 저혈압, 노르아드레날린 결핍, 외상후 스트레스 장애, 병적 도박 장애, 치매, 루이체(Lewy body) 치매 및 유전적 티로신 히드록실라제 결핍으로 구성된 군에서 선택된 질환 치료용으로 국소 투여된다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템 및/또는 숙주 세포는 파킨슨 질환, 비전형적 파킨슨 질환, 이를 테면, 다발성 위축증, 진행성 핵성 마비, 혈관 또는 동맥경화성 파킨슨 질환, 약물에 의해 유도된 파킨슨증 및 GTP 시클로히드롤라제 1 결핍증 및/또는 도파민 결핍에 의한 임의의 근긴장이상증의 치료 방법에 사용된다.
구체적으로 상기 발현 시스템은 파킨슨 질환(PD) 및 이와 연관된 증후 및 상태의 치료에 유용하다.
한 측면에서, 본 발명은 환자의 혈액 안에 L-DOPA의 치료요법적으로 유효한 농도를 유지시키는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 전술한 환자에게 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템을 투여하는 것을 포함한다
한 측면에서, 본 발명은 L-DOPA 유도된 이상운동증(LID)의 출현을 감소, 지연 및/또는 저지의 출현을 감소, 지연 및/또는 저지하는 방법에 관한 것으로, 전술한 방법은 본 명세서 정의된 발현 시스템을 이를 필요로 하는 환자에게 말초적으로 투여하는 것을 포함한다.
발현 시스템의 투여
본 발명의 적절한 효과를 달성하기 위해서, 발현 시스템을 말초적으로, 즉 국소적으로 또는 전신적으로 투여하는 것이 필요하지만 어느 경우이든 CNS 외부에서 투여하는 것이며,,발현 시스템 중 일부는 궁극적으로 CNS를 침투할 수 있기는 하지만 그렇게 투여하는 것이다.
본 발명의 발현 시스템은 적합한 약학 조성물의 형태로 일반적으로 투여된다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 상기 발현 시스템이 포함된 약학 조성물에 또한 관한 것이다. 이러한 조성물은 전형적으로 상기 발현 시스템과 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 수용가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)"란 표현은 약학적 투여와 양립가능한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장액 및 흡수 지연제 및 이와 유사한 임의의 그리고 모든 것들을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 발현 시스템과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 상기 조성물에서의 이들의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물 또한 상기 조성물에 혼합될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 적합한 투여 경로의 예는 비경구, 예컨대 근육 내, 정맥 내, 간내, 피내, 피하 및 경점막 투여 또는 격리 사지 관류(isolated limb perfusion)를 포함한다.
주사가능한 용도에 적합한 약학 조성물은 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위하여, 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위하여, 적합한 운반체는 생리학적 염수, 정균수, Cremophor EL.TM.(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염 완충된 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 무균이어야 하며, 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 그것은 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며, 박테리아와 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 운반체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이와 유사한 것들) 그리고 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질로 존재할 수 있다. 미생물 작용은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브 산, 티메로살 및 이와 유사한 것들과 같은 다양한 항균 및 항진균제에 의해 방지될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 등장 물질, 예를 들면 당류, 폴리알코올, 이를 테면, 만니톨, 솔비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다.
멸균 주사용 용액은 적절한 용매에서 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께, 필요한 양의 발현 시스템을 필요에 따라 혼합한 후, 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투해야 하는 장벽에 적합한 침투제를 이 제형에 사용한다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어, 점막 투여, 세제, 담즙 염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지된 연고(ointments), 살베스(salves), 겔 또는 크림으로 제형화된다.
한 구체예에서, 상기 물질은 이를 테면, 임플란트 및 미세캡슐화된 전달계를 비롯한 방출 제어 제형와 같이, 신체로부터의 이 화합물이 신속하게 제거되지 않도록 보호하는 운반체와 함께 제조된다. 생분해가능한, 생체적합성 폴리머, 이를 테면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르, 및 폴리락트산이 이용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자들에게 자명할 것이다. 이 물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포좀 현탁액(바이러스 성 항원에 대한 단일클론 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포좀을 포함하는)은 또한 약학적으로 허용되는 운반체로 사용될 수 있다. 예를 들면, U.S. 특허 번호 4,522,811에서 설명된 바와 같이, 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조 될 수 있다.
투여의 용이함 및 투여량(dosage)의 균일성을 위하여, 단위 투약형(dosage unit form)으로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단위 투약형은 치료할 대상을 위한 일원화된 투약형으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 요구되는 약학 운반체와 연합하여, 원하는 치료 효과를 내도록 계산하여 미리 결정된 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 명세는 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 개체의 치료를 위하여 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 본질적인 한계에 의해 결정되고, 직접적으로 이에 따라 달라진다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템이 포함된 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 약학 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩 또는 디스펜서(dispenser)에 포함될 수 있다.
따라서 한 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 약학 조성물 및 및 사용 지침을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 명세서의 상기에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 목적은 발현 시스템이 CNS에 대하여 말초적으로 투여되는, 즉, 뇌로의 주사를 비롯한, 뇌 외과적 수술 사용을 피하기 위해, CNS 외부로 투여되는 유전자 치료를 위한 발현 시스템을 제공하는 것이다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 말초적으로 정맥으로 투여된다.
한 구체예에서, 상기 투여는 간 문맥(portal vein)에서 이루어진다. 이러한 투여는 간을 표적으로 한다.
본 발명에 따른 발현 시스템은 말초적으로 간내 투여를 통하여 또한 투여될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 말초적으로 근육내 투여에 의해 투여된다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 발현 시스템은 격리 사지 관류(isolated limb perfusion)에 의해 투여된다. 이 경우에서, 네이키드 플라스미드 DNA는 Hagstrom 등,(2004) Mol. Ther. 10(2): 386-398에서 설명된 바와 같이, 투여될 수 있다.
상기 발현 시스템이 치료 효과를 가지려면 여러 번 투여가 필요할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 최소 1 회, 이를 테면, 1 회, 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 7 회, 8 회, 9 회, 10 회 또는 그 이상으로 투여된다. 투여될 투약량은 치료될 개체, 발현 시스템 및 프로모터를 비롯한 다수의 인자에 좌우될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 최소한 1x1011　vg/체중(kg), 이를 테면, 최소한 1 x1012　vg/체중(kg)의 투약량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 최소한 1 x1011　vg/근육량(kg), 이를 테면, 최소한 1 x1012vg/근육량(kg)의 투약량으로 투여될 수 있다. 이러한 투약량은 예를 들어, 인간에게 적용될 수 있다.
복합 치료(Combination treatment)
본 명세서의 상기에서 정의된 발현 시스템에 의한 치료 요법은 기타 적합한 화합물에 의해 보충될 수 있다. 이러한 구체예의 하나로써, 본 발명은 치료요법적으로 유효량의 L-DOPA의 전신 투여와 함께, 상기 발현 시스템을 보충 투여하는 것을 더 포함한다.
한 구체예에서, 치료요법적으로 유효량의 테트라히드로비오테린(BH4) 또는 이의 유사체는 본 발명의 발현 시스템을 통하여 유전자 요법을 받고 있는 환자에게 투여된다.
한 구체예에서, BH4　유사체는 사프로프테린(sapropterin)이다.
본 발명의 한 구체예에서, 치료요법적으로 유효량의 말초 데카르복실라제 억제제가 투여된다. 상기 데카르복실라제 억제제는 벤세라진 및 카르비도파로 구성된 군에서 일반적으로 선택된다.
추가 구체예에서, 치료요법적으로 유효량의 카테콜-O-메틸전이효소(COMT) 억제제는 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
카테콜-O-메틸전이효소(COMT) 억제제는 톨카폰, 엔타카폰 및 니테카폰(nitecapone)으로 구성된 군에서 일반적으로 선택된다.
특정 구체예들에서, BH4, 데카르복실라제 억제제 및/또는 카테콜-O-메틸전이효소(COMT) 억제제(들)은 경구로 투여된다.
대안으로, 상기 BH4, 데카르복실라제 억제제 및/또는 카테콜-O-메틸전이효소(COMT) 억제제(들)은 정맥내 또는 근육내로 투여된다.
하나의 복합 치료에서, BH4, 데카르복실라제 억제제 및/또는 COMT-억제제 및/또는 이의 유사체들은 전신 투여된다.
하나의 복합 치료에서, BH4, 데카르복실라제 억제제 및/또는 COMT-억제제 및 이의 유사체들은 장내(enteral) 또는 비경구 투여된다.
하나의 복합 치료에서, BH4, 데카르복실라제 억제제 및/또는 COMT-억제제 및 이의 유사체들은 경구, 정맥내 또는 근육내로 투여된다.
VII. 실시예들
실시예 1: AAV 생산 플라스미드의 백터 작제 클로닝
모노시스트로닉 자가-상보적 AAV 생산 플라스미드의 생성
간략하게 설명하자면, 이중-가닥의 rAAV2/8-LP1-GCH1 및 rAAV2/8-LP1-tTH를 만드는데 차례로 이용된 AAV 생산 플라스미드, scAAV-LP1-GCH1(pAA009) 및 scAAV-LP1-TH(pAA010)(서열 번호: 34)는 scAAV-LP1-hFIXco를 Xbal 및 Spel으로 절단하고, 이를 차례로 pLA100(ssAAV-SYN-GCH1-SYN-TH-WPRE) 및 pLA109(ssAAV-SYN-GCH1-SYN-tTH)로부터 단리된 GCH1 또는 tTH Nhel/Nhel PCR 단편을 결찰시킴으로써 구축되었다. ScAAV-LP1-GCH1(pAA009)(서열 번호: 35) 및 scAAV-LP1-tTH(pLA010)(서열 번호: 34) 벡터는 다음과 같이 구축되었다: pLA100(ssAAV-SYN-GCH1-SYN-TH)의 992 bp의 GHC1 단편은 적절한 완충액에서 25 ng 주형 DNA, 200 μM dNTPs(NEB) 및 GoTaq 중합효소(Promega)와 함께, 0.75 pmol/μl의 농도에서 프라이머 AA16(Nhel 부위, 5'-ccaagctagcATGGAGAAGGGCCCTGTG-3', 서열 번호: 42를 함유하는 순방향(forward) 프라이머) 및 AA17(Nhel 부위, 5'-ccaagctagcGGTCGACTAAAAAACCTCC-3', 서열 번호: 43를 함유하는 역방향 프라이머)를 이용하여 증폭되었다. PCR 증폭 조건은 다음과 같다: 95℃(2분), 이어서 95℃(30s)/65℃(30s)/72℃(30s)를 30회 주기, 그리고 72℃에서 5분간 최종 연장. pLA109(ssAAV-SYN-GCH1-SYN-tTH)의 1858 bp의 tTH-WPRE 단편은 적절한 완충액에서 25 ng DNA, 200 μM dNTPs(NEB) 및 Phusion 중합효소(Thermo Scientific)와 함께, 0.4pmol/μl의 농도에서 프라이머 AA33(Nhel 부위, 5'-CCAAgctagcATGAGCCCCGCGGGGCCCAAG-3', 서열 번호: 44를 함유한 순방향 프라이머) 및 AA34(Nhel 부위, 5'-CCAAgctagcGGGGGATCTTCGATGCTAGAC-3', 서열 번호: 45를 함유한 역 프라이머)를 이용하여 증폭되었다. PCR 증폭 조건은 다음과 같다: 98℃(30s), 이어서 98℃(10s)/63℃(30s)/72℃(1 분)을 30회,주기 그리고 72℃에서 10분간 최종 연장. PCR 산물(삽입물)은 Nhel으로 3h 동안 37℃에서 절단되었으며, 플라스미드 scAAV-LP1-hFIXco(벡터)(서열 번호: 43)는 Xbal/Spel로 3h 동안 37℃에서 절단되어, hFIXco 유전자를 제거하였다. 1% 아가로즈 겔 상에서 100 V에서 1h 이동시켜 전기영동하고, UV 투과조명기를 통하여 시각화시킴으로써, 절단을 분석했다. 단편(GCH1 삽입물: 992 bp; tTH 삽입물: 1858; 벡터: 3525 bp)는 스캘펄(scalpel) 칼을 이용하여 겔로부터 잘라낸 후, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)를 이용하여 겔로부터 정제하였다. 벡터를 상기 삽입물중 하나로 16℃에서 하룻밤동안 결찰시키고, SURE 박테리아로 형질전환시켰다. 콜로니를 찍어내어, Xcml 분해로 분석함으로써, GCH1 또는 tTH PCR 단편의 존재 여부를 확인한 다음, 후속적으로 시퀀싱하여 각 구조체에 예상 서열이 포함되어 있는지를 확인했다.
상기 최종 이식유전자(transgene) 구조체는 간-특이적 LP1 인헨서/프로모터의 제어 하에 AAV2 ITRs의 측면에 있는 인간 GCH1 또는 절두된 인간 TH 유전자(가령, 서열 번호: 40)를 포함하는 dsAAV 생산을 위한 2개의 플라스미드다.
LP1 프로모터는 pAA009 및 pAA010에 있는 HLP로 대체
AAV 생산 플라스미드, scAAV-HLP-GCH1(pAA011)(서열 번호: 31) 및 scAAV-HLP-tTH(pAA016)(서열 번호: 32)를 이용하여 차례로 이중-가닥의 rAAV2/8-HLP-GCH1 및 rAAV2/8-HLP-tTH를 만들었다. 간략하게 설명하자면, pAA011(서열 번호: 35)은 AV-HLP-codop-hFVIII-V3(Amit Nathwani가 친절하게 제공함)의 HLP 프로모터는 프라이머 세트 AA43/AA44(5' CCAATGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTCTAGATGTTTGCTGCTTGCAATGT TTGC 3' /5' CCAAGAATTCGCTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGTG 3', 차례로 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47)를 증폭시키고, 그리고 LP1 프로모터를 대신하여 Mscl 및 EcoRI을 갖는 이를 pAA009(서열 번호: 35) 안으로 클로닝암으로써, 구축되었다. pAA016(서열 번호: 32)는 오버랩핑 PCR을 통하여 상기 단편 HLP-tTH를 증폭시킴으로써 생성되었다. 프라이머 쌍 AA57/AA67(5' CCAAGCTAGC TGT TTG CTG CTT GCA ATG TTT GC 3'/5'GATCCTTGCTACGAGCTTGAATGATTCACTGTCCCAGGTCAGT 3', 차례로 서열 번호: 48 및 서열 번호: 49) 및 AA68/RmuscTHext2(5'ACTGACCTG G GACAGTG AATCATTCAAG CTCGTAG CAAG G ATC 3'/5'AAAgctagcTTCGATGCTAGACGATCCAG 3', 차례로 서열 번호: 50 및 서열 번호: 51)을 이용하여 오버랩핑 서열이 함유된, 차례로 단편 HLP 및 tTH를 만드는데 이용될 수 있다. 프라이머 AA57/AA67을 이용하여 오버램핑 PCR을 통하여 tTH에 HLP를 융합시켰고, Nhel 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)를 이용하여 pcDNA3.1(+)안으로 서브클론시켰고, 이로 인하여 pAA015가 생성되었다. 끝으로, Nhel을 이용하여 pAA015로부터 상기 HLP-tTH 단편을 잘라내고, 그리고 벡터 pAV-LP1-hFIXco의 제한 부위 Nhel와 Spel 사이에 결찰시키고, 이로 인하여 pAA016(서열 번호: 32)이 생성되었다.
20 μl의 PCR 반응에서 적절한 완충액 안에 20 ng 주형 DNA, 200 μM dNTPs(NEB) 및 Phision 고충실도(High Fidelity) 중합효소(Fischer Scientific)를 이용하여 298 bp HLP 단편이 증폭되었다. PCR 증폭 조건은 다음과 같다: 98℃(30s), 이어서 98℃(10s)/65℃(15s)/72℃(60s)을 30회 주기, 그리고 72℃에서 10분간 최종 연장.
오버랩핑 PCR에 의해 생성된 2.1 kb HLP-tTH 단편은 20 μl PCR 반응에서 45 ng의 HLP 주형 DNA 및 306 ng tTH 주형 DNA(이들 각각은 PCR을 이용하여 미리 만들어둠)를 이용하여 증폭되었다. 200 μM dNTPs(NEB) 및 Phision 고충실도 중합효소(Fischer Scientific)는 적절한 완충액에서 이용되었고, PCR 증폭 주기 조건은 다음과 같다: 98℃(30s), 이어서 98℃(10s)/60℃(15s)/72℃(60s)를 30회 주기, 그리고 72℃에서 10 분간 최종 연장.
비시스트로닉 단일-가닥의 AAV 생산 플라스미드의 생성
AAV 생산 플라스미드 ssAAV-LP1 1-GCH1-LP1-tTH(pAA019)(서열 번호: 33)는 단일-가닥의 rAAV2/8-LP1-GCH1-LP1-tTH 및 이의 재조합형 부산물 rAAV2/8-LP1-tTH를 만드는데 이용되었다. 간략하게 설명하자면, 상기 발현 카세트 LP1-GCH1-LP1-tTH-WPRE는 pBluescript II SK(+)에 서브클론시켜 pAA018을 만들고, 그 다음 ITRs를 함유하는 AAV 골격 pSUB201에 클론시키고, 이로 인하여 pAA019(서열 번호: 33)가 생성되었다. 상기 프로모터 LP1은 주형으로써 12.5 ng scAAV-LP1-hFIXco를 이용하여 프라이머 AA01/AA02로 증폭되었고, Blpl 및 Sbfl 제한 부위를 이용하여 pTRUF11로 클론되었고, 이로 인하여 pAA001이 생성되었다. 그 다음, GCH1 유전자는 주형으로써 27 ng의 pAAV-Syn-GCH1-Syn-TH를 이용하여 프라이머 AA03/AA004로 증폭되었고, 그리고 후속적으로 Sbfl 및 Tth111l 부위를 이용하여 pAA001 안으로 클론되었고, 이로 인하여 pAA002가 생성되었다. 그 다음, LP1-GCH1 단편은 프라이머 쌍 AA37/AA38을 이용하여 pAA002로부터 증폭되었고, 이것은 Xbal/Blpl 및 Xbal/Sphl/BstBI/Tth111l 제한 부위와의 오버행을 함유하고 있는데, 이들은 각각 모듈 벡터의 구축을 허용한다. LP1-GCH1 단편은 Xbal 제한 부위를 통하여 AAV 골격 pSub201에 결찰되었고, 이로 인하여 pAA003이 형성되었다. 골격에 ITRs 존재로 인한 클로닝 곤란을 회피하기 위하여, LP1-GCH1은 클로닝 벡터 pUC18의 Xbal 부위로 전이되었고, 이로 인하여 pAA004가 생성되었다. 제 2 LP1 프로모터는 pAA010로부터 프라이머 쌍 AA006/AA07을 이용하여 증폭시키고, BstBI 및 Tth111l 제한 부위를 이용하여 pAA004로 클로닝시킴으로써 추가되었고, 이로써 pAA005가 생성되었다. tTH 유전자를 상기 구조체에 추가하기 위하여, LP1-GCH1-LP1 단편은 pUC18에 여분의 Sphl 부위의 존재로 인하여 골격 pBluescript II SK(+) 안으로 교환되어야만 했다. pAA005에서 Xbal 부위들을 이용하여 실행하였고, pBluescript II SK(+) 안으로 결찰시킨 후, 이 새로운 구조체는 pAA006으로 명명하였다. 그 다음, tTH-WPRE 단편은 프라이머 쌍 AA53/AA65 및 50 ng의 주형을 이용하여 pLA109(AAV-Syn-GCH1-Syn-tTH)로부터 증폭되었다. tTH 유전자는 제한 부위 Sphl 및 BstBI을 통하여 pAA006에 삽입되었고, 이로 인하여 pAA018이 생성되었다. pAA018의 서열화 후, Tth111l 부위에서의 돌연변이가 발현되었고, GCH1-LP1 서열을 재클로닝함으로써, 이를 고정하였다. 여기에서, Ttth111l 부위의 바로 하류에 Bglll 제한 부위를 추가하고, pLA100 및 pLA109에 있는 것과 정확하게 동일한 GCH1 kozak 서열의 혼입을 허용하는 새로운 프라이머 세트가 기획되었다. 프라이머 쌍 AA73/AA84 및 AA85/AAA07을 각각 이용하여 새로운 GCH1 서열 및 제 2 LP1 프로모터를 증폭시켰다. 프라이머 쌍 AA73/AA07과 함께 오버랩핑 PCR을 실행하여 GCH1-LP1을 융합하고, 이는 제한 부위 Sbfl 및 BstBI을 이용하여 pAA017 안으로 후속적으로 클론되었고, 이로 인하여 pAA018이 생성되었다. 끝으로, 전체 비시스트로닉 LP1-GCH1-LP1-tTH 발현 카세트는 AAV 골격 pSub201로 전달되어, 재조합형 AAV가 생산되었고, 이를 pAA019(서열 번호: 33)로 명명하였다.
오버랩핑 PCR을 이용하여 HLP 프로모터를 tTH 유전자에 융합시킴으로써, 모노시스트로닉 자가-상보적 AAV-HLP-tTH가 생성되었다. AV-HLP-codop-hFVIII-V3(Amit Nathwani의 실험실에서 제공된 플라스미드)로부터 HLP 서열이 증폭되었다. tTH의 서열은 주요 세린 인산화 부위를 제거하기 위하여 N 말단 160개의 아미노산이 절두된 TH의 서열(가령, 서열 번호: 40)이며, 상기 제거된 부위는 도파민 또는 L-DOPA에 의한 TH의 피드백 억제를 가능하게 하는데 관계한다. 일단 HLP와 tTH가 증폭되었다면, 이들은 오버랩핑 PCR을 이용하여 융합되었고, 그리고 Nhel 제한 부위를 이용하여 pcDNA3.1(+) 안으로 서브클론되었다. 품질 관리 절단 및 서열화(quality control digestions and sequencing) 후, 상기 발현 카세트 HLP-tTH는 Amit Nathwani에서 제공받은 AAV 자가-상보적 골격에 클론되었다(도 2).
모노시스트로닉 자가-상보적 AAV-HLP-GCH는 pGPT001(SYN-GCH1-SYN-TH) 로부터 GCH1 유전자를 클로닝하고, 이를 자가-상보적 AAV 골격 pAV-LP1-hFIXco(서열 번호: 36)(Amit Nathwani이 제공함)에 클로닝하였고, 이로 인하여 AAV-LP1-GCH1이 생성됨으로써, 만들어졌다. 제 2 단계에서, 상기 HLP 프로모터 서열은 AV-HLP-codop-hFVIII-V3(서열 번호: 37)로부터 증폭되었고, scAAV-LP1-GCH1에 결찰되었고, 이로 인하여 LP1은 HLP로 대체되어, scAAV-HLP-GCH1이 형성되었다(도 2).
비시스트로닉 단일-가닥의 AAV-LP1-GCH1-LP1-tTH는 골격으로 AAV 플라스미드 pSUB201을 이용하여 만들어졌다. 각 요소(유전자 또는 프로모터)가 용이하게 제거되거나 또는 대체될 수 있는 모듈 벡터를 만들기 위하여 ITRs 측면에 있는 최적 제한 부위를 동정하였다. 두 LP1 서열은 PCR에 의해 pAV-LP1-hFIXco로부터 증폭되었고, pSUB201 안으로 클로닝되었다. GCH1 및 tTH는 뇌 연구에 이용된 기존의 비시스트로닉 벡터(SYN-GCH1-SYN-tTH)로부터 증폭되었고, pSUB201에 클로닝되어, ssAAV-LP1-GCH1-LP1-tTH가 형성되었다. 상기 클로닝의 연대(chronology)는 제 LP1-GCH1-제 2 LP1-tTH이다(도 2).
당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용하여 다른 벡터들을 작제하였다. 관심대상 서열은 제한, 결찰 및 Gibson 합체를 통하여 벡터 안에 서브클론되었다.
AAV 벡터는 흡착성 HEK293 세포에서 3중 형질감염으로 준비되었고, 그리고 임의선택적으로 이오딕사놀(iodixanol) 구배 원심분리에 의해 농축되었다.
실시예 2: L-DOPA 억제
파킨슨 질환(PD) 환자의 간에서 L-DOPA 생산을 유도하는 GTP 시클로히드롤라제 1 및/또는 티로신 히드록실라제(차례로 AAV2/8 GCH1 또는 AAV2/8 tTH)를 갖는 유전자를 나르는 아데노-연관된 바이러스 벡터의 능력을 평가하기 위한 투약 섭생이 기획되었다.
2가지 연구가 실행되었다. 제 1 연구에서, 18마리의 CD1 마우스는 6개 동물로 구성된 3개 군에 무작위로 할당되었다. 1일차, 동물들은 하기 표에 나타낸 바와 같이, 처리되었다:
Figure pct00001
상기 벡터, scLP1-GCH1(서열 번호:35) 및 scLP1-tTH(서열 번호:34)는 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 준비되었다. 상기 벡터는 볼루스 정맥(꼬리 정맥) 주사를 통하여 투여되었다.
제 1 연구에서, 4마리의 CD1 마우스는 2마리 동물로 구성된 2개 군에 무작위로 할당되었다. 1일차, 동물들은 하기 표에 나타낸 바와 같이, 처리되었다:
Figure pct00002
상기 벡터, scHLP-GCH1(서열 번호:31) 및 scHLP-tTH(서열 번호:32)는 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 준비되었다.
제 1 연구 및 제 2 연구 벡터는 모두 볼루스 정맥(꼬리 정맥) 주사를 통하여 투여되었다(도 3).
28일 동안 추가 실험없이 마우스들을 관찰하였다. 부작용이 기록되지는 않았다. 28일차, 희생시키기 1시간 전, 이들 마우스에게 벤세라지드 10 mg/kg를 복막 주사를 통하여 투여되었고, 낮은 투여용량의 엔타카폰이 복막 주사를 통하여 투여되었다. 엔타카폰의 이론적 주사된 투여용량은 30 mg/kg이었다(도 3).
희생 시점에 심장 천자(cardiac puncture)를 통하여 혈액 시료를 채취하였고, 동물에게 PBS에 이어서 PFA를 주입한 후, 간을 회수하였다.
혈액은 헤파린이 함유된 바이알에 수거하고, 최종 동물이 희생될 때 까지 얼음 위에 보관하고, 그 다음 4℃에서 회전시킨 후, 후속적으로 항산화제 없이, 혈장은 -70℃에 동결시켰다.
L-DOPA는 검증된 방법을 사용하여 ABS Laboratories Ltd(BioPark, Broadwater Road, Welwyn Garden City, Hertfordshire, AL7 3AX, United Kingdom에서 분석되었으며, 시료와 함께 이중의 적절한 교정 표준 및 품질 관리 샘플, 그리고 중수소화된 내부 표준과 함께, 적절한 교정 표준 및 품질 관리 샘플을 이중으로 하여, European Medicines Agency bioanalytical 지침에 따라 수행되었다.
그 결과들은 도 5에 나타내었고, 이때 그룹 A, B 및 C는 제 1 동물 연구에서, 그리고 그룹 D 및 E는 제 2 동물 연구의 것이다.
간을 PFA에 고정시킨 다음, 파라핀에 매립하였고, 슬라이드에 올려 놓고 분석하였다. GCH1 특이적 항체를 사용하여 GCH1 발현에 대하여 간 절편을 분석하였다. 유용한 GCH1 특이적 항체는 시판되는 것들이며, 가령, 마우스 IgG MCA3138Z, Serotec,Oxford, UK를 포함하며, 이는 1 :2000 AbD에서 이용될 수 있다. UK. 제 1 동물 연구에서 얻은 결과는 도 4a에 나타낸다. 형질도입은 <1 %인 것으로 결정되었다. 제 2 동물 연구에서 얻은 결과는 도 4b에 나타낸다. 형질도입은 ~25%인 것으로 결정되었다.
TH의 발현은 Pel Freez 및 Abeam에 의해 생성된 것들이 포함된 다수의 항-티로신 히드록실라제 항체를 이용하여 측정될 수 있다:
Pelfreez 항-티로신 히드록실라제 토끼 다클론 항체와 IHC에 유용한 희석. 1 :750
Abcam 항-티로신 히드록실라제 토끼 단일클론 [EP1532Y]과 IHC에 유용한 희석-1:1000
간 절편은 또한 표준 절차를 사용하여 헤마토실린 및 에오신으로 염색되었다. 헤마토실린 및 에오신 착색에서 조직 손상 또는 백혈구 침윤은 없었다(도 6 참고)
결론
제 1 동물 연구에서 낮은 투여용량의 벡터(7.02 x 1010　vg/마우스)가 투여되었다. 간 조직면역화학에 의해 나타난 바와 같이, 이것으로 형질도입은 <1 %이었다(도 4a 참고). 제 2 동물 연구에서 더 높은 투여용량의 벡터(3.6 x 1012　vg/마우스)가 투여되었고, 형질도입은 상당히 더 높았는데, 즉 ~25%이었다(도 4b 참고). Hiroyuki Nakai 등, J. Virol. 2005, 79(1):214는 >70%의 형질도입을 획득하기 위하여 2E12를 초과하는 투여용량(vg/마우스)의 AAV8 벡터가 필요하다고 제안하였다. 이와 일치하게, 더 높은 투여용량은 형질도입을 강화시켰다.
HLP는 LP1(Mcintosh J 등,, Blood. 2013 Apr 25;121(17):3335-44)에 대등한 강도의 짧은 간-특이적 프로모터다. L-DOPA 분석에서 내부 대조는 동물 연구 1 과 2에서 일관된 감도를 확인하였다.
도 5에서 나타낸 바와 같이, 그룹 2와 3의 마우스에서 전신 L-DOPA 수준(차례로 B와 C로 표시됨)은 대조의 수준보다 약간 더 높다. 그러나, 제 2 동물 연구의 그룹 1과 2의 마우스에서 전신 L-DOPA 수준(차례로 D와 E로 표시됨)은 대조보다 상당히 더 높았다. 2가지 연구에서 관찰된 전신 L-DOPA 수준의 차이는 투여용량의 차이로 인한 것이며, 이로써 형질도입 효과는 상이하다.
추가 연구에서, 2 또는 3 투여용량의 벤세라지드와 엔타카폰 또는 톨카폰은 L-DOPA 분석을 위한 혈액 수거 8시간 전에 투여될 것이며, 혈장은 분석 전 항산화제와 함께(25% w/v 메타비술피트 나트륨/물) 보존될 것이다.
실시예 3: 벡터 합성
혈액 뇌 방벽을 통과하여 말초 순환계로 일정한 숙도(steady rate)로 L-DOPA를 분비하도록 하기 위하여, 일련의 벡터를 합성하고, 말초 조직으로 형질감염 및 형질도입시켰으며, 도파민 합성을 위한 프로드럭으로 이용될 수 있다.
이들은 다음의 배위(configurations) 또는 요소를 갖는 벡터를 포함한다:
● 상기 벡터(들)은 인간 티로신 히드록실라제 아이소폼을 인코드하는 핵산 서열을 포함하며, 이때, 상기 핵산 서열은 자가-상보적 게놈으로 구성된다.
● 한 구체예에서, 상기 핵산 서열은 기능을 하는 효소의 약 160개 N-말단 아미노산이 결여된 N-말단 절두된 티로신 히드록실라제 효소를 인코도하도록 절두된다(서열 번호: 15) 또는(서열 번호: 40). 상기 N-말단 절두된 효소는 기능을 하지만, 이 효소에 의해 촉매되는 반응 산물(들)에 의해 피드백 억제되는 경향이 적다. 따라서, 원하는 L-DOPA 산물의 치료요법적으로 효과적인 수준으로 생산 증가가 이루어진다.
● 한 구체예에서, 상기 구조체는 자가-상보적 게놈을 이용하지 않는다.
● 벡터 구조체는 간 및 근육을 표적으로 하는 AAV 혈청형 변이체로 만들어진다. 이들은 간의 경우 혈청형 8, 5, 2 및 7, 그리고 근육의 경우 혈청형 5, 1, 6 및 2를 포함한다.
● 벡터 구조체들은 조직 특이적 프로모터의 변이체들, 이를 테면, 간의 경우 LP1을 포함한다.
● 모델 벡터 서열은 Nathwani 등,의 문헌(첨부된)에 첨부된 것에서 제공된다. 우리 벡터는 Nathwani 등의 모든 Factor IX 게놈과 유사한 서열을 가질 수 있지만, 그러나 FIX 코드 사이에 삽입된 자가-상보적인 TH 코드를 갖는다.
실시예 4: 간에서 GCH 및 TH의 발현
1일차, 마우스는 0.15 ml의 비시스트로닉 벡터 조제물(ssAAV2/8-LP1-GCH1-LP1-절두된-TH) 3.60E+12 vg/마우스를 볼루스 정맥(꼬리 정맥) 주사(이 조제물은 상동성 재조합에 의해 형성된 모노시스트로닉 ssLP1-tTH 부분을 포함한다); 또는 0.15 ml의 비히클 조제물을 볼루스 정맥(꼬리 정맥) 주사; 또는 10 mg/kg 경구 L-DOPA를 제공받는다.
상기 마우스는 희생시키고, 실시예 3에서 설명된 바와 같이, 혈장을 수거하기 전 10-15일 동안 관찰한다.
간에서 GCH1 및 TH의 발현 분석은 qPC에 의해 실행된다.
상기 비시스트로닉 벡터를 제공받은 마우스로부터 얻은 간 단편에서 GCH1의 발현을 보이기 위하여 실시예 3에서 설명된 바와 같이, 면역조직화학 분석이 실행된다. 벡터 형질감염의 표지로써 GCH1의 발현이 이용될 수 있다.
웨스턴 블랏(Western Blot) 분석을 실행하여 GCH1은 오직 벡터를 볼루스 정맥 주사로 제공받은 마우스의 간에서만 발현된다는 것을 보여준다.
실시예 5: 간에서 L- DOPA의 합성
혈장 내 단백질을 0.4 M 과염소산으로 침전시킴으로써, EDTA 혈장안 L-DOPA 수준을 측정한다. 원심분리를 통하여 침전된 단백질을 제거한 후, 과염소산 층 부분을 96-웰 플레이트로 옮기고, 0.1% 포름산으로 희석한다. L-DOPA(I) 및 이의 안정적으로 동위원소 라벨된 내부 표준 L-DOPA-d3　(II)은 LC-MS/MS으로 분석된다.
Figure pct00003
L-DOPA는 혈장에서 불안정하기 때문에, L-DOPA를 포함하는 모든 혈장은 1% 메타비술피트 나트륨을 추가함으로써 안정화시키고, -80℃의 명목적 온도에서 냉동 보관된다. 교정 표준(Calibration standard)은 0(블랭크), 0.020, 0.050, 0.100, 0.250, 1.00, 2.50, 5.00 및 10.0 g/mL에서, 그리고 품질 관리 시료(QCs)는 0.060, 0.800 및 8.00 μg/mL에서 준비된다.
분석은 ACE AQ 50mm x 3mm의 액체 크로마토그래피 컬럼 상에서 Agilent 1 100 시리즈 바이러니 펌프(binary pump) 및 CTC Analytics™ CTC HTS-xt PAL 자동샘플러를 이용하여 0.1% 포름산 아세토니트릴 구배에서 실행된다. 질량 스펙트럼 분석은 Turbolonspray™ 이온 소스와 함께 피팅된 Applied Biosystems™ API4000를 이용하여 실행된다. L-DOPA 및 L-DOPA-d3　의 모니터된 다중 반응 이온(MRM)은 각각 m/z 198.2 → 152.1 및 201.2 → 155.1이었다. 교정 곡선은 가중 선형 회귀(linear regression weighted) 1/x2를 이용하여 피팅된다.
실시예 6: 스크리닝(Screening)
● 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 준비된 각 벡터는 마우스 그룹(그룹당 대략 6마리)의 꼬리 정맥 또는 뒷다리 큰(bulk) 근육으로 주사되었다. 마우스는 투약 후 2-6주간 관찰된다. 말초 혈액이 수거되고, L-DOPA에 대하여 분석된다.
● 동물은 L-DOPA 합성에 필수적인 공인자를 제공하기 위하여, 간 또는 근육에서 테트라히드로비오테린(구강 또는 복막내) 또는 GCH1 및/또는 PTPS 생산을 형질도입하는 AAV 벡터를 함께 동시 투여받는다.
● L-DOPA의 이화작용을 제한하기 위하여, 동물의 전신으로(구강 또는 복막내) 데카르복실라제 억제제(가령, 벤세라진) 및 카테콜-O-메틸전이효소(COMT) 억제제를 제공한다. 말초 L-DOPA 수준을 평가하기 위하여 시료를 수거하기 최소 24시간 전 시점에 이들이 투여된다.
● 대조 동물 그룹은 동일한 방식으로, 그러나, 벡터 주사 없이 처리된다. 이들 그룹은 상기 벡터 처리된 동물의 L-DOPA와 비교하기 위하여 대조군으로 삼는다.
● 최적의 L-DOPA 생산을 얻기 위한, 상이한 비율의 TH, GCH1 및 PTPS를 발현시키는 모노시스트로닉, 비시스트로닉 또는 트리시스트로닉 벡터, 플라스미드 또는 발현 시스템이 비교될 수 있다.
● 최적의 L-DOPA 생산을 얻는데 상이한 비율의 벡터(각각은 하나 또는 그 이상의 유전자를 발현한다)가 비교될 수 있다.
실시예 7: 전임상 ( Preclinical )
● 치료요법적으로 관련 수준에서 L-DOPA의 지속적인 분비 및 수용가능한 내성(tolerance) 및 안정성을 실증하기 위하여, 가장 높은 말초 L-DOPA 수준을 만드는 백터는 설치류 및 인간이외의 영장류의 급성 및 만성 연구에서 테스트된다.
● 급성 연구에서, 설치류 및 인간이외의 영장류의 근육내 또는 정맥내(말초 정맥으로 또는 간문액으로)로 주사된다. 이들 동물은 주사 후 28일간 관찰된다. 관찰에는 체중, 음식 섭취, 임상 징후 또는 증상 관찰, 전혈 카운트(full blood count), 요소 및 전해질, 간 기능 검사 그리고 크레아틴 포스포키나제 측정이 포함된다. 조직 부검 다음에, 조직병리학적인 이상이 있는지 검사하고, 그리고 벡터의 생체내 분포를 평가한다.
● 만성 연구에서, 설치류 및 인간이외의 영장류의 근육내 또는 정맥내(말초 정맥으로 또는 간문액으로)로 주사된다. 이들 동물은 주사 후 6-12 개월간 관찰된다. 관찰에는 체중, 음식 섭취, 임상 징후 또는 증상 관찰, 전혈 카운트(full blood count), 요소 및 전해질, 간 기능 검사 그리고 크레아틴 포스포키나제 측정이 포함된다. 조직 부검 다음에, 조직병리학적인 이상이 있는지 검사하고, 그리고 벡터의 생체내 분포를 평가한다.
● 추가 전임상 연구에는 돌연변이 유발성 시험, 발암성 시험 및 임상 연구를 가능하게 하는 데 필요한 기타 시험(가령, 심장 또는 QT 간격에 대한 벡터 또는 벡터 생성물의 영향 평가)이 포함될 수 있다.
실시예 8: 임상(Clinical)
● 위 연구의 만족스러운 결과를 조건으로, 간문맥으로 IM, IV, 직접 주입, 또는 분리된 사지 관류를 이용하여 최적으로 실행되는 벡터를 기반으로 임상 연구가 설계된다.
● 임상 시험에는 BH4 또는 구강 L-DOPA의 투여없이(구강 또는 복막내), 데카르복실라제 억제제(가령, 벤세라진)와 카테콜 O-메틸전이효소(COMT) 억제제를 병용 투여한 경우 그리고 투여하지 않은 경우의 치료 환자에서 L-DOPA의 약물 동태학에 대한 상세한 평가가 포함된다.
● 임상 연구는 급성 L-DOPA 생산(벡터 주사 후 약 4 내지 8 주) 및 벡터 주사 후 3, 6, 12, 18 및 24 개월을 포함하는 시점에서 만성 L-DOPA 생산을 평가할 것이다.
● 임상 연구에는 파킨슨 질환 치료 보조제로서의 본 발명의 급성 및 만성 안전성 및 효능 평가가 포함될 것이다.
실시예 9: 서열의 개요
서열 번호: 1: GTP 시클로히드롤라제 1(인간)
서열 번호: 2: GTP 시클로히드롤라제 1 아이소폼(Isoform) GCH-2(인간)
서열 번호: 3: GTP 시클로히드롤라제 1 아이소폼 GCH-3(인간)
서열 번호: 4: GTP 시클로히드롤라제 1 아이소폼 GCH-4(인간)
서열 번호: 5: GTP 시클로히드롤라제 1(렛(rat))
서열 번호: 6: GTP 시클로히드롤라제 1(마우스)
서열 번호: 7: 티로신 3-히드록실라제(인간)
서열 번호: 8: 티로신 3-모노옥시게나제(인간)
서열 번호: 9: 티로신 히드록실라제(인간)
서열 번호: 10: 티로신 히드록실라제(인간)
서열 번호: 11: 티로신 3-모노옥시게나제(인간)
서열 번호: 12: 절두된 티로신 히드록실라제, TH(도메인에 상응; 인간)
서열 번호: 13: ser40에서 돌연변이된 TH
서열 번호: 14: 서열 번호: 14: Ser19 + Ser40에서 돌연변이된 TH
서열 번호: 15: 서열 번호: 15: Ser19 + Ser31 + Ser40에서 돌연변이된 TH
서열 번호: 16: 서열 번호: 16: 티로신 3-히드록실라제(렛)
서열 번호: 17: 티로신 3-히드록실라제(마우스)
서열 번호: 18: 아데노-연관된 바이러스 2 좌측 말단 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 19: 아데노-연관된 바이러스 2 우측 말단 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 20: 호모 사피엔스 GTP 시클로히드롤라제 1(GCH1), 전사체 변이체 1
서열 번호: 21: 원숭이 바이러스 40 초기(early) 폴리-아데닐화 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 22: 원숭이 바이러스 40 후기(late) 폴리-아데닐화 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 23: 호모 사피엔스 티로신 히드록실라제(TH), 전사체 변이체 2 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 24: 절두된 TH, 촉매 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 25: ser40에서 돌연변이된 TH, 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 26: ser19 및 ser40로 돌연변이된 TH, 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 27: ser19, ser31 및 ser40로 돌연변이된 TH, 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 28: 우드척 간염 B 바이러스(WHV8) 전사-후 조절 요소 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 29: 돌연변이된 우드척 간염 B 바이러스(WHV8) 전사-후 조절 요소 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 30: GCH-1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 31: pAA011-scAAV-HLP-GCHI
서열 번호: 32: pAA016-scAAV-HLP-tTH
서열 번호: 33: pAAo19-scAAV-LP1-GCH1-LP1-tTH
서열 번호: 34: pAA010 scAAV-LP1-tTH
서열 번호: 35: pAA009 scAAV-LP1-GCH1
서열 번호: 36: scAAV-LP1-hFIXco
서열 번호: 37: pAV HLP FVIII V3 kan
서열 번호: 38: 간-특이적 하이브리드 프로모터(HLP)
서열 번호: 39: 간 프로모터/인헨서 1(LP1)
서열 번호: 40: tTH = 절두된 티로신 히드록실라제
서열 번호: 41: PTPS = 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소
서열 번호: 42: 프라이머 AA16
서열 번호: 43: 프라이머 AA17
서열 번호: 44: 프라이머 AA33
서열 번호: 45: 프라이머 AA34
서열 번호: 46: 프라이머 AA43
서열 번호: 47: 프라이머 AA44
서열 번호: 48: 프라이머 AA57
서열 번호: 49: 프라이머 AA67
서열 번호: 50: 프라이머 AA68
서열 번호: 51: 프라이머 RmiscTHext2
서열 번호: 52: 모노시스트로닉 전달 플라스미드 TH
서열 번호: 53: 비시스트로닉 전달 플라스미드 GCH1 PTPS
서열 번호: 1: GTP 시클로히드롤라제 1(인간)
>sp|P30793|GCH1_인간 GTP 시클로히드롤라제 1 OS=호모 사피엔스 GN=GCH1 PE=1 SV=1 EC=3.5.4.16
대체 이름(들):
GTP 시클로히드롤라제 I
단축명=GTP-CH-l 또는 GCH-1 또는 GCH1 또는 GCH1
유기체: 호모 사피엔스(인간)
http://www.uniprot.org/uniprot/P30793
Figure pct00004
서열 번호: 2: GTP 시클로히드롤라제 1 아이소폼(Isoform) GCH-2(인간)
>sp|P30793-2|GCH1_GTP 시클로히드롤라제 1의 인간 아이소폼 GCH-2 OS=호모 사피엔스 GN=GCH1
Figure pct00005
Figure pct00006
서열 번호: 3: GTP 시클로히드롤라제 1 아이소폼 GCH-3(인간)
>sp|P30793-3|GCH1_GTP 시클로히드롤라제 1의 인간 아이소폼 GCH-3 OS=호모 사피엔스 GN=GCH1
Figure pct00007
서열 번호: 4: GTP 시클로히드롤라제 1 아이소폼 GCH-4(인간)
>sp|P30793-4|GCH1_GTP 시클로히드롤라제 1의 인간 아이소폼 GCH-4 OS=호모 사피엔스 GN=GCH1
Figure pct00008
서열 번호: 5: GTP 시클로히드롤라제 1(렛)
>sp|P22288|GCH1_RAT GTP 시클로히드롤라제 1 OS=라투스 노르베기쿠스(rattus norvegicus) GN=Gch1 PE=1 SV=1
Figure pct00009
서열 번호: 6: GTP 시클로히드롤라제 1(마우스)
>sp|Q05915|GCH1_마우스 GTP 시클로히드롤라제 1 OS=무스 무스쿨루스(mus musculus) GN=Gch1 PE=2 SV=1
Figure pct00010
서열 번호: 7: 티로신 3-히드록실라제(인간)
EC=1.14.16.2
대체 이름(들): 티로신 3-모노옥시게나제 또는 티로신 3-히드록실라제 또는 티로신 히드록실라제, 단축명=TH
유기체: 호모 사피엔스(인간)
Figure pct00011
서열 번호: 8: 티로신 3-모노옥시게나제(인간)
>sp|P07101 |TY3H_인간 티로신 3-모노옥시게나제 OS=호모 사피엔스 GN=TH PE=1 SV=5
Figure pct00012
서열 번호: 9: 티로신 히드록실라제(인간)
>tr|Q2M3B4|Q2M3B4_인간 티로신 히드록실라제 OS=호모 사피엔스 GN=TH PE=2 SV=1
Figure pct00013
서열 번호: 10: 티로신 히드록실라제(인간)
>tr|B7ZL73|B7ZL73_인간 TH 단백질 OS=호모 사피엔스 GN=TH PE=2 SV=1
Figure pct00014
서열 번호: 11: 티로신 3-모노옥시게나제(인간)
>sp|P07101 |TY3H_인간 티로신 3-모노옥시게나제 OS=호모 사피엔스 GN=TH PE=1 SV=5
Figure pct00015
서열 번호: 12: 절두된 TH(촉매 도메인에 상응)
Figure pct00016
서열 번호: 13: ser40에서 돌연변이된 TH
Figure pct00017
서열 번호: 14: ser19 + ser40에서 돌연변이된 TH
Figure pct00018
서열 번호: 15: ser19 + ser31 + ser40에서 돌연변이된 TH
Figure pct00019
서열 번호: 16: 티로신 3-히드록실라제(렛)
>sp|P04177|TY3H_RAT 티로신 3-모노옥시게나제 OS=라투스 노르베기쿠스(rattus norvegicus) GN=Th PE=1 SV=3
Figure pct00020
Figure pct00021
서열 번호: 17: 티로신 3-히드록실라제(마우스)
>sp|P24529|TY3H_마우스 티로신 3-모노옥시게나제 OS=무스 무스쿨루스(mus musculus) GN=Th PE=1 SV=3
Figure pct00022
서열 번호: 18: 아데노-연관된 바이러스 2 좌측 말단 뉴클레오티드 서열
Figure pct00023
서열 번호: 19: 아데노-연관된 바이러스 2 우측 말단 뉴클레오티드 서열
Figure pct00024
서열 번호: 20: 호모 사피엔스 GTP 시클로히드롤라제 1(GCH1), 전사체 변이체 1
Figure pct00025
서열 번호: 21: 원숭이 바이러스 40 초기(early) 폴리-아데닐화 뉴클레오티드 서열
Figure pct00026
서열 번호: 22: 원숭이 바이러스 40 후기(late) 폴리-아데닐화 뉴클레오티드 서열
Figure pct00027
서열 번호: 23: 호모 사피엔스 티로신 히드록실라제(TH), 전사체 변이체 2 뉴클레오티드 서열
Figure pct00028
Figure pct00029
서열 번호: 24: 절두된 TH(촉매 도메인 인코딩), 뉴클레오티드 서열
Figure pct00030
서열 번호: 25: ser40에서 돌연변이된 TH, 뉴클레오티드 서열
Figure pct00031
서열 번호: 26: ser19 및 ser40로 돌연변이된 TH, 뉴클레오티드 서열
Figure pct00032
Figure pct00033
서열 번호: 27: ser19, ser31 및 ser40로 돌연변이된 TH, 뉴클레오티드 서열
Figure pct00034
서열 번호: 28: 우드척 간염 B 바이러스(WHV8) 전사-후 조절 요소 뉴클레오티드 서열
Figure pct00035
서열 번호: 29: 돌연변이된 우드척 간염 B 바이러스(WHV8) 전사-후 조절 요소 뉴클레오티드 서열
Figure pct00036
Figure pct00037
서열 번호: 30 GCH1 뉴클레오티드 서열
Figure pct00038
서열 번호: 31 pAA011-scAAV-HLP-GCH1:
Figure pct00039
Figure pct00040
서열 번호: 32: pAA016-scAAV-HLP-tTH:
Figure pct00041
Figure pct00042
서열 번호: 33: pAAo19-scAAV-LP1-GCH1-LP1-tTH:
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
서열 번호: 34: pAA010 scAAV-LP1-tTH
Figure pct00046
Figure pct00047
서열 번호: 35: pAA009 scAAV-LP1-GCH1
Figure pct00048
Figure pct00049
서열 번호: 36: scAAV-LP1-hFIXco
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
서열 번호: 37: pAV HLP FVIII V3 kan
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
서열 번호: 38: 간-특이적 하이브리드 프로모터(HLP)
Figure pct00056
서열 번호: 39: 간 프로모터/인헨서 1(LP1)
Figure pct00057
서열 번호: 40: tTH = 절두된 티로신 히드록실라제
Figure pct00058
서열 번호: 41: PTPS = 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소
>ENA|BAA04959|BAA04959.1 호모 사피엔스(인간) 6-피루보일-테트라히드로프테린 합성효소
Figure pct00059
서열 번호: 42: 프라이머 AA16
Figure pct00060
서열 번호: 43: 프라이머 AA17
Figure pct00061
서열 번호: 44: 프라이머 AA33
Figure pct00062
서열 번호: 45: 프라이머 AA34
Figure pct00063
서열 번호: 46: 프라이머 AA43
Figure pct00064
서열 번호: 47: 프라이머 AA44
Figure pct00065
서열 번호: 48: 프라이머 AA57
Figure pct00066
서열 번호: 49: 프라이머 AA67
Figure pct00067
서열 번호: 50: 프라이머 AA68
Figure pct00068
서열 번호: 51: 프라이머 RmuscTHext2
Figure pct00069
서열 번호: 52: MLF003noefgp
Figure pct00070
Figure pct00071
서열 번호: 53 MDL004
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
<110> Myodopa Limited <120> Systemic synthesis and regulation of L-DOPA <130> P2868PC01 <160> 53 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Lys Gly Pro Val Arg Ala Pro Ala Glu Lys Pro Arg Gly Ala 1 5 10 15 Arg Cys Ser Asn Gly Phe Pro Glu Arg Asp Pro Pro Arg Pro Gly Pro 20 25 30 Ser Arg Pro Ala Glu Lys Pro Pro Arg Pro Glu Ala Lys Ser Ala Gln 35 40 45 Pro Ala Asp Gly Trp Lys Gly Glu Arg Pro Arg Ser Glu Glu Asp Asn 50 55 60 Glu Leu Asn Leu Pro Asn Leu Ala Ala Ala Tyr Ser Ser Ile Leu Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gly Glu Asn Pro Gln Arg Gln Gly Leu Leu Lys Thr Pro Trp 85 90 95 Arg Ala Ala Ser Ala Met Gln Phe Phe Thr Lys Gly Tyr Gln Glu Thr 100 105 110 Ile Ser Asp Val Leu Asn Asp Ala Ile Phe Asp Glu Asp His Asp Glu 115 120 125 Met Val Ile Val Lys Asp Ile Asp Met Phe Ser Met Cys Glu His His 130 135 140 Leu Val Pro Phe Val Gly Lys Val His Ile Gly Tyr Leu Pro Asn Lys 145 150 155 160 Gln Val Leu Gly Leu Ser Lys Leu Ala Arg Ile Val Glu Ile Tyr Ser 165 170 175 Arg Arg Leu Gln Val Gln Glu Arg Leu Thr Lys Gln Ile Ala Val Ala 180 185 190 Ile Thr Glu Ala Leu Arg Pro Ala Gly Val Gly Val Val Val Glu Ala 195 200 205 Thr His Met Cys Met Val Met Arg Gly Val Gln Lys Met Asn Ser Lys 210 215 220 Thr Val Thr Ser Thr Met Leu Gly Val Phe Arg Glu Asp Pro Lys Thr 225 230 235 240 Arg Glu Glu Phe Leu Thr Leu Ile Arg Ser 245 250 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Lys Gly Pro Val Arg Ala Pro Ala Glu Lys Pro Arg Gly Ala 1 5 10 15 Arg Cys Ser Asn Gly Phe Pro Glu Arg Asp Pro Pro Arg Pro Gly Pro 20 25 30 Ser Arg Pro Ala Glu Lys Pro Pro Arg Pro Glu Ala Lys Ser Ala Gln 35 40 45 Pro Ala Asp Gly Trp Lys Gly Glu Arg Pro Arg Ser Glu Glu Asp Asn 50 55 60 Glu Leu Asn Leu Pro Asn Leu Ala Ala Ala Tyr Ser Ser Ile Leu Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gly Glu Asn Pro Gln Arg Gln Gly Leu Leu Lys Thr Pro Trp 85 90 95 Arg Ala Ala Ser Ala Met Gln Phe Phe Thr Lys Gly Tyr Gln Glu Thr 100 105 110 Ile Ser Asp Val Leu Asn Asp Ala Ile Phe Asp Glu Asp His Asp Glu 115 120 125 Met Val Ile Val Lys Asp Ile Asp Met Phe Ser Met Cys Glu His His 130 135 140 Leu Val Pro Phe Val Gly Lys Val His Ile Gly Tyr Leu Pro Asn Lys 145 150 155 160 Gln Val Leu Gly Leu Ser Lys Leu Ala Arg Ile Val Glu Ile Tyr Ser 165 170 175 Arg Arg Leu Gln Val Gln Glu Arg Leu Thr Lys Gln Ile Ala Val Ala 180 185 190 Ile Thr Glu Ala Leu Arg Pro Ala Gly Val Gly Val Val Val Glu Ala 195 200 205 Thr Ser Ala Glu Pro 210 <210> 3 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Glu Lys Gly Pro Val Arg Ala Pro Ala Glu Lys Pro Arg Gly Ala 1 5 10 15 Arg Cys Ser Asn Gly Phe Pro Glu Arg Asp Pro Pro Arg Pro Gly Pro 20 25 30 Ser Arg Pro Ala Glu Lys Pro Pro Arg Pro Glu Ala Lys Ser Ala Gln 35 40 45 Pro Ala Asp Gly Trp Lys Gly Glu Arg Pro Arg Ser Glu Glu Asp Asn 50 55 60 Glu Leu Asn Leu Pro Asn Leu Ala Ala Ala Tyr Ser Ser Ile Leu Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gly Glu Asn Pro Gln Arg Gln Gly Leu Leu Lys Thr Pro Trp 85 90 95 Arg Ala Ala Ser Ala Met Gln Phe Phe Thr Lys Gly Tyr Gln Glu Thr 100 105 110 Ile Ser Asp Val Leu Asn Asp Ala Ile Phe Asp Glu Asp His Asp Glu 115 120 125 Met Val Ile Val Lys Asp Ile Asp Met Phe Ser Met Cys Glu His His 130 135 140 Leu Val Pro Phe Val Gly Lys Val His Ile Gly Tyr Leu Pro Asn Lys 145 150 155 160 Gln Val Leu Gly Leu Ser Lys Leu Ala Arg Ile Val Glu Ile Tyr Ser 165 170 175 Arg Arg Leu Gln Val Gln Glu Arg Leu Thr Lys Gln Ile Ala Val Ala 180 185 190 Ile Thr Glu Ala Leu Arg Pro Ala Gly Val Gly Val Val Val Glu Ala 195 200 205 Thr <210> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Lys Gly Pro Val Arg Ala Pro Ala Glu Lys Pro Arg Gly Ala 1 5 10 15 Arg Cys Ser Asn Gly Phe Pro Glu Arg Asp Pro Pro Arg Pro Gly Pro 20 25 30 Ser Arg Pro Ala Glu Lys Pro Pro Arg Pro Glu Ala Lys Ser Ala Gln 35 40 45 Pro Ala Asp Gly Trp Lys Gly Glu Arg Pro Arg Ser Glu Glu Asp Asn 50 55 60 Glu Leu Asn Leu Pro Asn Leu Ala Ala Ala Tyr Ser Ser Ile Leu Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gly Glu Asn Pro Gln Arg Gln Gly Leu Leu Lys Thr Pro Trp 85 90 95 Arg Ala Ala Ser Ala Met Gln Phe Phe Thr Lys Gly Tyr Gln Glu Thr 100 105 110 Ile Ser Asp Val Leu Asn Asp Ala Ile Phe Asp Glu Asp His Asp Glu 115 120 125 Met Val Ile Val Lys Asp Ile Asp Met Phe Ser Met Cys Glu His His 130 135 140 Leu Val Pro Phe Val Gly Lys Val His Ile Gly Tyr Leu Pro Asn Lys 145 150 155 160 Gln Val Leu Gly Leu Ser Lys Leu Ala Arg Ile Val Glu Ile Tyr Ser 165 170 175 Arg Arg Leu Gln Val Gln Glu Arg Leu Thr Lys Gln Ile Ala Val Ala 180 185 190 Ile Thr Glu Ala Leu Arg Pro Ala Gly Val Gly Val Val Val Glu Ala 195 200 205 Thr Lys Ser Asn Lys Tyr Asn Lys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Ser Ser 210 215 220 Cys His Leu Phe Val Ala Ile Leu Lys 225 230 <210> 5 <211> 241 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 5 Met Glu Lys Pro Arg Gly Val Arg Cys Thr Asn Gly Phe Pro Glu Arg 1 5 10 15 Glu Leu Pro Arg Pro Gly Ala Ser Arg Pro Ala Glu Lys Ser Arg Pro 20 25 30 Pro Glu Ala Lys Gly Ala Gln Pro Ala Asp Ala Trp Lys Ala Gly Arg 35 40 45 Pro Arg Ser Glu Glu Asp Asn Glu Leu Asn Leu Pro Asn Leu Ala Ala 50 55 60 Ala Tyr Ser Ser Ile Leu Arg Ser Leu Gly Glu Asp Pro Gln Arg Gln 65 70 75 80 Gly Leu Leu Lys Thr Pro Trp Arg Ala Ala Thr Ala Met Gln Phe Phe 85 90 95 Thr Lys Gly Tyr Gln Glu Thr Ile Ser Asp Val Leu Asn Asp Ala Ile 100 105 110 Phe Asp Glu Asp His Asp Glu Met Val Ile Val Lys Asp Ile Asp Met 115 120 125 Phe Ser Met Cys Glu His His Leu Val Pro Phe Val Gly Arg Val His 130 135 140 Ile Gly Tyr Leu Pro Asn Lys Gln Val Leu Gly Leu Ser Lys Leu Ala 145 150 155 160 Arg Ile Val Glu Ile Tyr Ser Arg Arg Leu Gln Val Gln Glu Arg Leu 165 170 175 Thr Lys Gln Ile Ala Val Ala Ile Thr Glu Ala Leu Gln Pro Ala Gly 180 185 190 Val Gly Val Val Ile Glu Ala Thr His Met Cys Met Val Met Arg Gly 195 200 205 Val Gln Lys Met Asn Ser Lys Thr Val Thr Ser Thr Met Leu Gly Val 210 215 220 Phe Arg Glu Asp Pro Lys Thr Arg Glu Glu Phe Leu Thr Leu Ile Arg 225 230 235 240 Ser <210> 6 <211> 241 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Glu Lys Pro Arg Gly Val Arg Cys Thr Asn Gly Phe Ser Glu Arg 1 5 10 15 Glu Leu Pro Arg Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Glu Lys Ser Arg Pro 20 25 30 Pro Glu Ala Lys Gly Ala Gln Pro Ala Asp Ala Trp Lys Ala Gly Arg 35 40 45 His Arg Ser Glu Glu Glu Asn Gln Val Asn Leu Pro Lys Leu Ala Ala 50 55 60 Ala Tyr Ser Ser Ile Leu Leu Ser Leu Gly Glu Asp Pro Gln Arg Gln 65 70 75 80 Gly Leu Leu Lys Thr Pro Trp Arg Ala Ala Thr Ala Met Gln Tyr Phe 85 90 95 Thr Lys Gly Tyr Gln Glu Thr Ile Ser Asp Val Leu Asn Asp Ala Ile 100 105 110 Phe Asp Glu Asp His Asp Glu Met Val Ile Val Lys Asp Ile Asp Met 115 120 125 Phe Ser Met Cys Glu His His Leu Val Pro Phe Val Gly Arg Val His 130 135 140 Ile Gly Tyr Leu Pro Asn Lys Gln Val Leu Gly Leu Ser Lys Leu Ala 145 150 155 160 Arg Ile Val Glu Ile Tyr Ser Arg Arg Leu Gln Val Gln Glu Arg Leu 165 170 175 Thr Lys Gln Ile Ala Val Ala Ile Thr Glu Ala Leu Gln Pro Ala Gly 180 185 190 Val Gly Val Val Ile Glu Ala Thr His Met Cys Met Val Met Arg Gly 195 200 205 Val Gln Lys Met Asn Ser Lys Thr Val Thr Ser Thr Met Leu Gly Val 210 215 220 Phe Arg Glu Asp Pro Lys Thr Arg Glu Glu Phe Leu Thr Leu Ile Arg 225 230 235 240 Ser <210> 7 <211> 496 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Pro Thr Pro Asp Ala Thr Thr Pro Gln Ala Lys Gly Phe Arg Arg 1 5 10 15 Ala Val Ser Glu Leu Asp Ala Lys Gln Ala Glu Ala Ile Met Ser Pro 20 25 30 Arg Phe Ile Gly Arg Arg Gln Ser Leu Ile Glu Asp Ala Arg Lys Glu 35 40 45 Arg Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Pro Ser Glu Pro 50 55 60 Gly Asp Pro Leu Glu Ala Val Ala Phe Glu Glu Lys Glu Gly Lys Ala 65 70 75 80 Val Leu Asn Leu Leu Phe Ser Pro Arg Ala Thr Lys Pro Ser Ala Leu 85 90 95 Ser Arg Ala Val Lys Val Phe Glu Thr Phe Glu Ala Lys Ile His His 100 105 110 Leu Glu Thr Arg Pro Ala Gln Arg Pro Arg Ala Gly Gly Pro His Leu 115 120 125 Glu Tyr Phe Val Arg Leu Glu Val Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Ser Gly Val Arg Gln Val Ser Glu Asp Val Arg Ser Pro Ala Gly 145 150 155 160 Pro Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu Leu Asp Lys Cys 165 170 175 His His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp Leu Asp His Pro 180 185 190 Gly Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Leu Ile Ala Glu 195 200 205 Ile Ala Phe Gln Tyr Arg His Gly Asp Pro Ile Pro Arg Val Glu Tyr 210 215 220 Thr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr Thr Thr Leu Lys 225 230 235 240 Gly Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Gly Glu His Leu Glu Ala Phe Ala 245 250 255 Leu Leu Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Glu Asp Asn Ile Pro Gln Leu 260 265 270 Glu Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Phe Gln Leu Arg 275 280 285 Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu Ala Ser Leu Ala 290 295 300 Phe Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Ala Ser Ser Pro 305 310 315 320 Met His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu Leu Gly His Val 325 330 335 Pro Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe Ser Gln Asp Ile Gly 340 345 350 Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ser Thr 355 360 365 Leu Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asn Gly Glu 370 375 380 Val Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr Gly Glu Leu Leu 385 390 395 400 His Cys Leu Ser Glu Glu Pro Glu Ile Arg Ala Phe Asp Pro Glu Ala 405 410 415 Ala Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln Ser Val Tyr Phe 420 425 430 Val Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys Leu Arg Ser Tyr Ala 435 440 445 Ser Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp Pro Tyr Thr Leu 450 455 460 Ala Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro Gln Ala Val Arg Arg Ser Leu Glu 465 470 475 480 Gly Val Gln Asp Glu Leu Asp Thr Leu Ala His Ala Leu Ser Ala Ile 485 490 495 <210> 8 <211> 528 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Pro Thr Pro Asp Ala Thr Thr Pro Gln Ala Lys Gly Phe Arg Arg 1 5 10 15 Ala Val Ser Glu Leu Asp Ala Lys Gln Ala Glu Ala Ile Met Val Arg 20 25 30 Gly Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ser Leu Thr Gly Ser Pro Trp Pro Gly 35 40 45 Thr Ala Ala Pro Ala Ala Ser Tyr Thr Pro Thr Pro Arg Ser Pro Arg 50 55 60 Phe Ile Gly Arg Arg Gln Ser Leu Ile Glu Asp Ala Arg Lys Glu Arg 65 70 75 80 Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Pro Ser Glu Pro Gly 85 90 95 Asp Pro Leu Glu Ala Val Ala Phe Glu Glu Lys Glu Gly Lys Ala Val 100 105 110 Leu Asn Leu Leu Phe Ser Pro Arg Ala Thr Lys Pro Ser Ala Leu Ser 115 120 125 Arg Ala Val Lys Val Phe Glu Thr Phe Glu Ala Lys Ile His His Leu 130 135 140 Glu Thr Arg Pro Ala Gln Arg Pro Arg Ala Gly Gly Pro His Leu Glu 145 150 155 160 Tyr Phe Val Arg Leu Glu Val Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Leu 165 170 175 Ser Gly Val Arg Gln Val Ser Glu Asp Val Arg Ser Pro Ala Gly Pro 180 185 190 Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu Leu Asp Lys Cys His 195 200 205 His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp Leu Asp His Pro Gly 210 215 220 Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Leu Ile Ala Glu Ile 225 230 235 240 Ala Phe Gln Tyr Arg His Gly Asp Pro Ile Pro Arg Val Glu Tyr Thr 245 250 255 Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr Thr Thr Leu Lys Gly 260 265 270 Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Gly Glu His Leu Glu Ala Phe Ala Leu 275 280 285 Leu Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Glu Asp Asn Ile Pro Gln Leu Glu 290 295 300 Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Phe Gln Leu Arg Pro 305 310 315 320 Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu Ala Ser Leu Ala Phe 325 330 335 Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Ala Ser Ser Pro Met 340 345 350 His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu Leu Gly His Val Pro 355 360 365 Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe Ser Gln Asp Ile Gly Leu 370 375 380 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ser Thr Leu 385 390 395 400 Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asn Gly Glu Val 405 410 415 Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr Gly Glu Leu Leu His 420 425 430 Cys Leu Ser Glu Glu Pro Glu Ile Arg Ala Phe Asp Pro Glu Ala Ala 435 440 445 Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln Ser Val Tyr Phe Val 450 455 460 Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys Leu Arg Ser Tyr Ala Ser 465 470 475 480 Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp Pro Tyr Thr Leu Ala 485 490 495 Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro Gln Ala Val Arg Arg Ser Leu Glu Gly 500 505 510 Val Gln Asp Glu Leu Asp Thr Leu Ala His Ala Leu Ser Ala Ile Gly 515 520 525 <210> 9 <211> 497 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Pro Thr Pro Asp Ala Thr Thr Pro Gln Ala Lys Gly Phe Arg Arg 1 5 10 15 Ala Val Ser Glu Leu Asp Ala Lys Gln Ala Glu Ala Ile Met Ser Pro 20 25 30 Arg Phe Ile Gly Arg Arg Gln Ser Leu Ile Glu Asp Ala Arg Lys Glu 35 40 45 Arg Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Pro Ser Glu Pro 50 55 60 Gly Asp Pro Leu Glu Ala Val Ala Phe Glu Glu Lys Glu Gly Lys Ala 65 70 75 80 Met Leu Asn Leu Leu Phe Ser Pro Arg Ala Thr Lys Pro Ser Ala Leu 85 90 95 Ser Arg Ala Val Lys Val Phe Glu Thr Phe Glu Ala Lys Ile His His 100 105 110 Leu Glu Thr Arg Pro Ala Gln Arg Pro Arg Ala Gly Gly Pro His Leu 115 120 125 Glu Tyr Phe Val Arg Leu Glu Val Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Ser Gly Val Arg Gln Val Ser Glu Asp Val Arg Ser Pro Ala Gly 145 150 155 160 Pro Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu Leu Asp Lys Cys 165 170 175 His His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp Leu Asp His Pro 180 185 190 Gly Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Leu Ile Ala Glu 195 200 205 Ile Ala Phe Gln Tyr Arg His Gly Asp Pro Ile Pro Arg Val Glu Tyr 210 215 220 Thr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr Thr Thr Leu Lys 225 230 235 240 Gly Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Gly Glu His Leu Glu Ala Phe Ala 245 250 255 Leu Leu Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Glu Asp Asn Ile Pro Gln Leu 260 265 270 Glu Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Phe Gln Leu Arg 275 280 285 Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu Ala Ser Leu Ala 290 295 300 Phe Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Ala Ser Ser Pro 305 310 315 320 Met His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu Leu Gly His Val 325 330 335 Pro Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe Ser Gln Asp Ile Gly 340 345 350 Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ser Thr 355 360 365 Leu Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asn Gly Glu 370 375 380 Val Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr Gly Glu Leu Leu 385 390 395 400 His Cys Leu Ser Glu Glu Pro Glu Ile Arg Ala Phe Asp Pro Glu Ala 405 410 415 Ala Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln Ser Val Tyr Phe 420 425 430 Val Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys Leu Arg Ser Tyr Ala 435 440 445 Ser Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp Pro Tyr Thr Leu 450 455 460 Ala Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro Gln Ala Val Arg Arg Ser Leu Glu 465 470 475 480 Gly Val Gln Asp Glu Leu Asp Thr Leu Ala His Ala Leu Ser Ala Ile 485 490 495 Gly <210> 10 <211> 501 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Pro Thr Pro Asp Ala Thr Thr Pro Gln Ala Lys Gly Phe Arg Arg 1 5 10 15 Ala Val Ser Glu Leu Asp Ala Lys Gln Ala Glu Ala Ile Met Val Arg 20 25 30 Gly Gln Ser Pro Arg Phe Ile Gly Arg Arg Gln Ser Leu Ile Glu Asp 35 40 45 Ala Arg Lys Glu Arg Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val 50 55 60 Pro Ser Glu Pro Gly Asp Pro Leu Glu Ala Val Ala Phe Glu Glu Lys 65 70 75 80 Glu Gly Lys Ala Met Leu Asn Leu Leu Phe Ser Pro Arg Ala Thr Lys 85 90 95 Pro Ser Ala Leu Ser Arg Ala Val Lys Val Phe Glu Thr Phe Glu Ala 100 105 110 Lys Ile His His Leu Glu Thr Arg Pro Ala Gln Arg Pro Arg Ala Gly 115 120 125 Gly Pro His Leu Glu Tyr Phe Val Arg Leu Glu Val Arg Arg Gly Asp 130 135 140 Leu Ala Ala Leu Leu Ser Gly Val Arg Gln Val Ser Glu Asp Val Arg 145 150 155 160 Ser Pro Ala Gly Pro Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu 165 170 175 Leu Asp Lys Cys His His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp 180 185 190 Leu Asp His Pro Gly Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg Lys 195 200 205 Leu Ile Ala Glu Ile Ala Phe Gln Tyr Arg His Gly Asp Pro Ile Pro 210 215 220 Arg Val Glu Tyr Thr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr 225 230 235 240 Thr Thr Leu Lys Gly Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Gly Glu His Leu 245 250 255 Glu Ala Phe Ala Leu Leu Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Glu Asp Asn 260 265 270 Ile Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly 275 280 285 Phe Gln Leu Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu 290 295 300 Ala Ser Leu Ala Phe Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His 305 310 315 320 Ala Ser Ser Pro Met His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu 325 330 335 Leu Gly His Val Pro Met Leu Ala Asp His Thr Phe Ala Gln Phe Ser 340 345 350 Gln Asp Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu 355 360 365 Lys Leu Ser Thr Leu Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys 370 375 380 Gln Asn Gly Glu Val Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr 385 390 395 400 Gly Glu Leu Leu His Cys Leu Ser Glu Glu Pro Glu Ile Arg Ala Phe 405 410 415 Asp Pro Glu Ala Ala Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln 420 425 430 Ser Val Tyr Phe Val Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys Leu 435 440 445 Arg Ser Tyr Ala Ser Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp 450 455 460 Pro Tyr Thr Leu Ala Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro Gln Ala Val Arg 465 470 475 480 Arg Ser Leu Glu Gly Val Gln Asp Glu Leu Asp Thr Leu Ala His Ala 485 490 495 Leu Ser Ala Ile Gly 500 <210> 11 <211> 528 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Pro Thr Pro Asp Ala Thr Thr Pro Gln Ala Lys Gly Phe Arg Arg 1 5 10 15 Ala Val Ser Glu Leu Asp Ala Lys Gln Ala Glu Ala Ile Met Val Arg 20 25 30 Gly Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ser Leu Thr Gly Ser Pro Trp Pro Gly 35 40 45 Thr Ala Ala Pro Ala Ala Ser Tyr Thr Pro Thr Pro Arg Ser Pro Arg 50 55 60 Phe Ile Gly Arg Arg Gln Ser Leu Ile Glu Asp Ala Arg Lys Glu Arg 65 70 75 80 Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Pro Ser Glu Pro Gly 85 90 95 Asp Pro Leu Glu Ala Val Ala Phe Glu Glu Lys Glu Gly Lys Ala Val 100 105 110 Leu Asn Leu Leu Phe Ser Pro Arg Ala Thr Lys Pro Ser Ala Leu Ser 115 120 125 Arg Ala Val Lys Val Phe Glu Thr Phe Glu Ala Lys Ile His His Leu 130 135 140 Glu Thr Arg Pro Ala Gln Arg Pro Arg Ala Gly Gly Pro His Leu Glu 145 150 155 160 Tyr Phe Val Arg Leu Glu Val Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Leu 165 170 175 Ser Gly Val Arg Gln Val Ser Glu Asp Val Arg Ser Pro Ala Gly Pro 180 185 190 Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu Leu Asp Lys Cys His 195 200 205 His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp Leu Asp His Pro Gly 210 215 220 Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Leu Ile Ala Glu Ile 225 230 235 240 Ala Phe Gln Tyr Arg His Gly Asp Pro Ile Pro Arg Val Glu Tyr Thr 245 250 255 Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr Thr Thr Leu Lys Gly 260 265 270 Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Gly Glu His Leu Glu Ala Phe Ala Leu 275 280 285 Leu Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Glu Asp Asn Ile Pro Gln Leu Glu 290 295 300 Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Phe Gln Leu Arg Pro 305 310 315 320 Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu Ala Ser Leu Ala Phe 325 330 335 Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Ala Ser Ser Pro Met 340 345 350 His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu Leu Gly His Val Pro 355 360 365 Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe Ser Gln Asp Ile Gly Leu 370 375 380 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ser Thr Leu 385 390 395 400 Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asn Gly Glu Val 405 410 415 Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr Gly Glu Leu Leu His 420 425 430 Cys Leu Ser Glu Glu Pro Glu Ile Arg Ala Phe Asp Pro Glu Ala Ala 435 440 445 Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln Ser Val Tyr Phe Val 450 455 460 Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys Leu Arg Ser Tyr Ala Ser 465 470 475 480 Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp Pro Tyr Thr Leu Ala 485 490 495 Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro Gln Ala Val Arg Arg Ser Leu Glu Gly 500 505 510 Val Gln Asp Glu Leu Asp Thr Leu Ala His Ala Leu Ser Ala Ile Gly 515 520 525 <210> 12 <211> 338 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated TH corresponding to catalytic domain <400> 12 Met Pro Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu Leu Asp Lys 1 5 10 15 Cys His His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp Leu Asp His 20 25 30 Pro Gly Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Leu Ile Ala 35 40 45 Glu Ile Ala Phe Gln Tyr Arg His Gly Asp Pro Ile Pro Arg Val Glu 50 55 60 Tyr Thr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr Thr Thr Leu 65 70 75 80 Lys Gly Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Gly Glu His Leu Glu Ala Phe 85 90 95 Ala Leu Leu Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Glu Asp Asn Ile Pro Gln 100 105 110 Leu Glu Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Phe Gln Leu 115 120 125 Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu Ala Ser Leu 130 135 140 Ala Phe Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Ala Ser Ser 145 150 155 160 Pro Met His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu Leu Gly His 165 170 175 Val Pro Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe Ser Gln Asp Ile 180 185 190 Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ser 195 200 205 Thr Leu Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asn Gly 210 215 220 Glu Val Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr Gly Glu Leu 225 230 235 240 Leu His Cys Leu Ser Glu Glu Pro Glu Ile Arg Ala Phe Asp Pro Glu 245 250 255 Ala Ala Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln Ser Val Tyr 260 265 270 Phe Val Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys Leu Arg Ser Tyr 275 280 285 Ala Ser Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp Pro Tyr Thr 290 295 300 Leu Ala Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro Gln Ala Val Arg Arg Ser Leu 305 310 315 320 Glu Gly Val Gln Asp Glu Leu Asp Thr Leu Ala His Ala Leu Ser Ala 325 330 335 Ile Gly <210> 13 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser40 TH mutant <400> 13 Met Pro Thr Pro Asp Ala Thr Thr Pro Gln Ala Lys Gly Phe Arg Arg 1 5 10 15 Ala Val Ser Glu Leu Asp Ala Lys Gln Ala Glu Ala Ile Met Ser Pro 20 25 30 Arg Phe Ile Gly Arg Arg Gln Glu Leu Ile Glu Asp Ala Arg Lys Glu 35 40 45 Arg Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Pro Ser Glu Pro 50 55 60 Gly Asp Pro Leu Glu Ala Val Ala Phe Glu Glu Lys Glu Gly Lys Ala 65 70 75 80 Val Leu Asn Leu Leu Phe Ser Pro Arg Ala Thr Lys Pro Ser Ala Leu 85 90 95 Ser Arg Ala Val Lys Val Phe Glu Thr Phe Glu Ala Lys Ile His His 100 105 110 Leu Glu Thr Arg Pro Ala Gln Arg Pro Arg Ala Gly Gly Pro His Leu 115 120 125 Glu Tyr Phe Val Arg Leu Glu Val Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Ser Gly Val Arg Gln Val Ser Glu Asp Val Arg Ser Pro Ala Gly 145 150 155 160 Pro Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu Leu Asp Lys Cys 165 170 175 His His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp Leu Asp His Pro 180 185 190 Gly Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Leu Ile Ala Glu 195 200 205 Ile Ala Phe Gln Tyr Arg His Gly Asp Pro Ile Pro Arg Val Glu Tyr 210 215 220 Thr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr Thr Thr Leu Lys 225 230 235 240 Gly Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Gly Glu His Leu Glu Ala Phe Ala 245 250 255 Leu Leu Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Glu Asp Asn Ile Pro Gln Leu 260 265 270 Glu Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Phe Gln Leu Arg 275 280 285 Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu Ala Ser Leu Ala 290 295 300 Phe Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Ala Ser Ser Pro 305 310 315 320 Met His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu Leu Gly His Val 325 330 335 Pro Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe Ser Gln Asp Ile Gly 340 345 350 Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ser Thr 355 360 365 Leu Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asn Gly Glu 370 375 380 Val Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr Gly Glu Leu Leu 385 390 395 400 His Cys Leu Ser Glu Glu Pro Glu Ile Arg Ala Phe Asp Pro Glu Ala 405 410 415 Ala Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln Ser Val Tyr Phe 420 425 430 Val Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys Leu Arg Ser Tyr Ala 435 440 445 Ser Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp Pro Tyr Thr Leu 450 455 460 Ala Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro Gln Ala Val Arg Arg Ser Leu Glu 465 470 475 480 Gly Val Gln Asp Glu Leu Asp Thr Leu Ala His Ala Leu Ser Ala Ile 485 490 495 Gly <210> 14 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser19 Ser40 TH mutant <400> 14 Met Pro Thr Pro Asp Ala Thr Thr Pro Gln Ala Lys Gly Phe Arg Arg 1 5 10 15 Ala Val Glu Glu Leu Asp Ala Lys Gln Ala Glu Ala Ile Met Ser Pro 20 25 30 Arg Phe Ile Gly Arg Arg Gln Glu Leu Ile Glu Asp Ala Arg Lys Glu 35 40 45 Arg Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Pro Ser Glu Pro 50 55 60 Gly Asp Pro Leu Glu Ala Val Ala Phe Glu Glu Lys Glu Gly Lys Ala 65 70 75 80 Val Leu Asn Leu Leu Phe Ser Pro Arg Ala Thr Lys Pro Ser Ala Leu 85 90 95 Ser Arg Ala Val Lys Val Phe Glu Thr Phe Glu Ala Lys Ile His His 100 105 110 Leu Glu Thr Arg Pro Ala Gln Arg Pro Arg Ala Gly Gly Pro His Leu 115 120 125 Glu Tyr Phe Val Arg Leu Glu Val Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Ser Gly Val Arg Gln Val Ser Glu Asp Val Arg Ser Pro Ala Gly 145 150 155 160 Pro Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu Leu Asp Lys Cys 165 170 175 His His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp Leu Asp His Pro 180 185 190 Gly Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Leu Ile Ala Glu 195 200 205 Ile Ala Phe Gln Tyr Arg His Gly Asp Pro Ile Pro Arg Val Glu Tyr 210 215 220 Thr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr Thr Thr Leu Lys 225 230 235 240 Gly Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Gly Glu His Leu Glu Ala Phe Ala 245 250 255 Leu Leu Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Glu Asp Asn Ile Pro Gln Leu 260 265 270 Glu Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Phe Gln Leu Arg 275 280 285 Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu Ala Ser Leu Ala 290 295 300 Phe Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Ala Ser Ser Pro 305 310 315 320 Met His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu Leu Gly His Val 325 330 335 Pro Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe Ser Gln Asp Ile Gly 340 345 350 Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ser Thr 355 360 365 Leu Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asn Gly Glu 370 375 380 Val Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr Gly Glu Leu Leu 385 390 395 400 His Cys Leu Ser Glu Glu Pro Glu Ile Arg Ala Phe Asp Pro Glu Ala 405 410 415 Ala Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln Ser Val Tyr Phe 420 425 430 Val Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys Leu Arg Ser Tyr Ala 435 440 445 Ser Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp Pro Tyr Thr Leu 450 455 460 Ala Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro Gln Ala Val Arg Arg Ser Leu Glu 465 470 475 480 Gly Val Gln Asp Glu Leu Asp Thr Leu Ala His Ala Leu Ser Ala Ile 485 490 495 Gly <210> 15 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser 19 Ser31 Ser40 TH mutant <400> 15 Met Pro Thr Pro Asp Ala Thr Thr Pro Gln Ala Lys Gly Phe Arg Arg 1 5 10 15 Ala Val Glu Glu Leu Asp Ala Lys Gln Ala Glu Ala Ile Met Glu Pro 20 25 30 Arg Phe Ile Gly Arg Arg Gln Glu Leu Ile Glu Asp Ala Arg Lys Glu 35 40 45 Arg Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Pro Ser Glu Pro 50 55 60 Gly Asp Pro Leu Glu Ala Val Ala Phe Glu Glu Lys Glu Gly Lys Ala 65 70 75 80 Val Leu Asn Leu Leu Phe Ser Pro Arg Ala Thr Lys Pro Ser Ala Leu 85 90 95 Ser Arg Ala Val Lys Val Phe Glu Thr Phe Glu Ala Lys Ile His His 100 105 110 Leu Glu Thr Arg Pro Ala Gln Arg Pro Arg Ala Gly Gly Pro His Leu 115 120 125 Glu Tyr Phe Val Arg Leu Glu Val Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Ser Gly Val Arg Gln Val Ser Glu Asp Val Arg Ser Pro Ala Gly 145 150 155 160 Pro Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu Leu Asp Lys Cys 165 170 175 His His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp Leu Asp His Pro 180 185 190 Gly Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Leu Ile Ala Glu 195 200 205 Ile Ala Phe Gln Tyr Arg His Gly Asp Pro Ile Pro Arg Val Glu Tyr 210 215 220 Thr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr Thr Thr Leu Lys 225 230 235 240 Gly Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Gly Glu His Leu Glu Ala Phe Ala 245 250 255 Leu Leu Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Glu Asp Asn Ile Pro Gln Leu 260 265 270 Glu Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Phe Gln Leu Arg 275 280 285 Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu Ala Ser Leu Ala 290 295 300 Phe Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Ala Ser Ser Pro 305 310 315 320 Met His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu Leu Gly His Val 325 330 335 Pro Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe Ser Gln Asp Ile Gly 340 345 350 Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ser Thr 355 360 365 Leu Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asn Gly Glu 370 375 380 Val Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr Gly Glu Leu Leu 385 390 395 400 His Cys Leu Ser Glu Glu Pro Glu Ile Arg Ala Phe Asp Pro Glu Ala 405 410 415 Ala Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln Ser Val Tyr Phe 420 425 430 Val Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys Leu Arg Ser Tyr Ala 435 440 445 Ser Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp Pro Tyr Thr Leu 450 455 460 Ala Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro Gln Ala Val Arg Arg Ser Leu Glu 465 470 475 480 Gly Val Gln Asp Glu Leu Asp Thr Leu Ala His Ala Leu Ser Ala Ile 485 490 495 Gly <210> 16 <211> 498 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 16 Met Pro Thr Pro Ser Ala Pro Ser Pro Gln Pro Lys Gly Phe Arg Arg 1 5 10 15 Ala Val Ser Glu Gln Asp Ala Lys Gln Ala Glu Ala Val Thr Ser Pro 20 25 30 Arg Phe Ile Gly Arg Arg Gln Ser Leu Ile Glu Asp Ala Arg Lys Glu 35 40 45 Arg Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser Ser Glu 50 55 60 Pro Gly Asn Pro Leu Glu Ala Val Val Phe Glu Glu Arg Asp Gly Asn 65 70 75 80 Ala Val Leu Asn Leu Leu Phe Ser Leu Arg Gly Thr Lys Pro Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Arg Ala Val Lys Val Phe Glu Thr Phe Glu Ala Lys Ile His 100 105 110 His Leu Glu Thr Arg Pro Ala Gln Arg Pro Leu Ala Gly Ser Pro His 115 120 125 Leu Glu Tyr Phe Val Arg Phe Glu Val Pro Ser Gly Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Leu Leu Ser Ser Val Arg Arg Val Ser Asp Asp Val Arg Ser Ala Arg 145 150 155 160 Glu Asp Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu Leu Asp Lys 165 170 175 Cys His His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp Leu Asp His 180 185 190 Pro Gly Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Leu Ile Ala 195 200 205 Glu Ile Ala Phe Gln Tyr Lys His Gly Glu Pro Ile Pro His Val Glu 210 215 220 Tyr Thr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr Val Thr Leu 225 230 235 240 Lys Gly Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Arg Glu His Leu Glu Gly Phe 245 250 255 Gln Leu Leu Glu Arg Tyr Cys Gly Tyr Arg Glu Asp Ser Ile Pro Gln 260 265 270 Leu Glu Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Phe Gln Leu 275 280 285 Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu Ala Ser Leu 290 295 300 Ala Phe Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Ala Ser Ser 305 310 315 320 Pro Met His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu Leu Gly His 325 330 335 Val Pro Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe Ser Gln Asp Ile 340 345 350 Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ser 355 360 365 Thr Val Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asn Gly 370 375 380 Glu Leu Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr Gly Glu Leu 385 390 395 400 Leu His Ser Leu Ser Glu Glu Pro Glu Val Arg Ala Phe Asp Pro Asp 405 410 415 Thr Ala Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln Pro Val Tyr 420 425 430 Phe Val Ser Glu Ser Phe Asn Asp Ala Lys Asp Lys Leu Arg Asn Tyr 435 440 445 Ala Ser Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp Pro Tyr Thr 450 455 460 Leu Ala Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro His Thr Ile Gln Arg Ser Leu 465 470 475 480 Glu Gly Val Gln Asp Glu Leu His Thr Leu Ala His Ala Leu Ser Ala 485 490 495 Ile Ser <210> 17 <211> 498 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Met Pro Thr Pro Ser Ala Ser Ser Pro Gln Pro Lys Gly Phe Arg Arg 1 5 10 15 Ala Val Ser Glu Gln Asp Thr Lys Gln Ala Glu Ala Val Thr Ser Pro 20 25 30 Arg Phe Ile Gly Arg Arg Gln Ser Leu Ile Glu Asp Ala Arg Lys Glu 35 40 45 Arg Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser Ala Glu 50 55 60 Pro Gly Asn Pro Leu Glu Ala Val Val Phe Glu Glu Arg Asp Gly Asn 65 70 75 80 Ala Val Leu Asn Leu Leu Phe Ser Leu Arg Gly Thr Lys Pro Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Arg Ala Leu Lys Val Phe Glu Thr Phe Glu Ala Lys Ile His 100 105 110 His Leu Glu Thr Arg Pro Ala Gln Arg Pro Leu Ala Gly Ser Pro His 115 120 125 Leu Glu Tyr Phe Val Arg Phe Glu Val Pro Ser Gly Asp Leu Ala Ala 130 135 140 Leu Leu Ser Ser Val Arg Arg Val Ser Asp Asp Val Arg Ser Ala Arg 145 150 155 160 Glu Asp Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser Glu Leu Asp Lys 165 170 175 Cys His His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu Asp Leu Asp His 180 185 190 Pro Gly Phe Ser Asp Gln Ala Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Leu Ile Ala 195 200 205 Glu Ile Ala Phe Gln Tyr Lys Gln Gly Glu Pro Ile Pro His Val Glu 210 215 220 Tyr Thr Lys Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val Tyr Ala Thr Leu 225 230 235 240 Lys Gly Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Arg Glu His Leu Glu Ala Phe 245 250 255 Gln Leu Leu Glu Arg Tyr Cys Gly Tyr Arg Glu Asp Ser Ile Pro Gln 260 265 270 Leu Glu Asp Val Ser His Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Phe Gln Leu 275 280 285 Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe Leu Ala Ser Leu 290 295 300 Ala Phe Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Ala Ser Ser 305 310 315 320 Pro Met His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu Leu Leu Gly His 325 330 335 Val Pro Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe Ser Gln Asp Ile 340 345 350 Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ser 355 360 365 Thr Val Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln Asn Gly 370 375 380 Glu Leu Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Tyr Gly Glu Leu 385 390 395 400 Leu His Ser Leu Ser Glu Glu Pro Glu Val Arg Ala Phe Asp Pro Asp 405 410 415 Thr Ala Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr Gln Pro Val Tyr 420 425 430 Phe Val Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys Leu Arg Asn Tyr 435 440 445 Ala Ser Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe Asp Pro Tyr Thr 450 455 460 Leu Ala Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro His Thr Ile Arg Arg Ser Leu 465 470 475 480 Glu Gly Val Gln Asp Glu Leu His Thr Leu Thr Gln Ala Leu Ser Ala 485 490 495 Ile Ser <210> 18 <211> 145 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 18 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcct 145 <210> 19 <211> 145 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 19 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145 <210> 20 <211> 753 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 atggagaagg gccctgtgcg ggcaccggcg gagaagccgc ggggcgccag gtgcagcaat 60 gggttccccg agcgggatcc gccgcggccc gggcccagca ggccggcgga gaagcccccg 120 cggcccgagg ccaagagcgc gcagcccgcg gacggctgga agggcgagcg gccccgcagc 180 gaggaggata acgagctgaa cctccctaac ctggcagccg cctactcgtc catcctgagc 240 tcgctgggcg agaaccccca gcggcaaggg ctgctcaaga cgccctggag ggcggcctcg 300 gccatgcagt tcttcaccaa gggctaccag gagaccatct cagatgtcct aaacgatgct 360 atatttgatg aagatcatga tgagatggtg attgtgaagg acatagacat gttttccatg 420 tgtgagcatc acttggttcc atttgttgga aaggtccata ttggttatct tcctaacaag 480 caagtccttg gcctcagcaa acttgcgagg attgtagaaa tctatagtag aagactacaa 540 gttcaggagc gccttacaaa acaaattgct gtagcaatca cggaagcctt gcggcctgct 600 ggagtcgggg tagtggttga agcaacacac atgtgtatgg taatgcgagg tgtacagaaa 660 atgaacagca aaactgtgac cagcacaatg ttgggtgtgt tccgggagga tccaaagact 720 cgggaagagt tcctgactct cattaggagc taa 753 <210> 21 <211> 155 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 21 ttcgagcaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 60 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 120 tgtatcttat catgtctgga tcgtctagca tcgaa 155 <210> 22 <211> 192 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 22 cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60 aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120 ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt 180 gggaggtttt tt 192 <210> 23 <211> 1490 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 atgcccaccc ccgacgccac cacgccacag gccaagggct tccgcagggc cgtgtctgag 60 ctggacgcca agcaggcaga ggccatcatg tccccgcggt tcattgggcg caggcagagc 120 ctcatcgagg acgcccgcaa ggagcgggag gcggcggtgg cagcagcggc cgctgcagtc 180 ccctcggagc ccggggaccc cctggaggct gtggcctttg aggagaagga ggggaaggcc 240 gtgctaaacc tgctcttctc cccgagggcc accaagccct cggcgctgtc ccgagctgtg 300 aaggtgtttg agacgtttga agccaaaatc caccatctag agacccggcc cgcccagagg 360 ccgcgagctg ggggccccca cctggagtac ttcgtgcgcc tcgaggtgcg ccgaggggac 420 ctggccgccc tgctcagtgg tgtgcgccag gtgtcagagg acgtgcgcag ccccgcgggg 480 cccaaggtcc cctggttccc aagaaaagtg tcagagctgg acaagtgtca tcacctggtc 540 accaagttcg accctgacct ggacttggac cacccgggct tctcggacca ggtgtaccgc 600 cagcgcagga agctgattgc tgagatcgcc ttccagtaca ggcacggcga cccgattccc 660 cgtgtggagt acaccgccga ggagattgcc acctggaagg aggtctacac cacgctgaag 720 ggcctctacg ccacgcacgc ctgcggggag cacctggagg cctttgcttt gctggagcgc 780 ttcagcggct accgggaaga caatatcccc cagctggagg acgtctcccg cttcctgaag 840 gagcgcacgg gcttccagct gcggcctgtg gccggcctgc tgtccgcccg ggacttcctg 900 gccagcctgg ccttccgcgt gttccagtgc acccagtata tccgccacgc gtcctcgccc 960 atgcactccc ctgagccgga ctgctgccac gagctgctgg ggcacgtgcc catgctggcc 1020 gaccgcacct tcgcgcagtt ctcgcaggac attggcctgg cgtccctggg ggcctcggat 1080 gaggaaattg agaagctgtc cacgctgtac tggttcacgg tggagttcgg gctgtgtaag 1140 cagaacgggg aggtgaaggc ctatggtgcc gggctgctgt cctcctacgg ggagctcctg 1200 cactgcctgt ctgaggagcc tgagattcgg gccttcgacc ctgaggctgc ggccgtgcag 1260 ccctaccaag accagacgta ccagtcagtc tacttcgtgt ctgagagctt cagtgacgcc 1320 aaggacaagc tcaggagcta tgcctcacgc atccagcgcc ccttctccgt gaagttcgac 1380 ccgtacacgc tggccatcga cgtgctggac agcccccagg ccgtgcggcg ctccctggag 1440 ggtgtccagg atgagctgga cacccttgcc catgcgctga gtgccattgg 1490 <210> 24 <211> 1029 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 atgagccccg cggggcccaa ggtcccctgg ttcccaagaa aagtgtcaga gctggacaag 60 tgtcatcacc tggtcaccaa gttcgaccct gacctggact tggaccaccc gggcttctcg 120 gaccaggtgt accgccagcg caggaagctg attgctgaga tcgccttcca gtacaggcac 180 ggcgacccga ttccccgtgt ggagtacacc gccgaggaga ttgccacctg gaaggaggtc 240 tacaccacgc tgaagggcct ctacgccacg cacgcctgcg gggagcacct ggaggccttt 300 gctttgctgg agcgcttcag cggctaccgg gaagacaata tcccccagct ggaggacgtc 360 tcccgcttcc tgaaggagcg cacgggcttc cagctgcggc ctgtggccgg cctgctgtcc 420 gcccgggact tcctggccag cctggccttc cgcgtgttcc agtgcaccca gtatatccgc 480 cacgcgtcct cgcccatgca ctcccctgag ccggactgct gccacgagct gctggggcac 540 gtgcccatgc tggccgaccg caccttcgcg cagttctcgc aggacattgg cctggcgtcc 600 ctgggggcct cggatgagga aattgagaag ctgtccacgc tgtactggtt cacggtggag 660 ttcgggctgt gtaagcagaa cggggaggtg aaggcctatg gtgccgggct gctgtcctcc 720 tacggggagc tcctgcactg cctgtctgag gagcctgaga ttcgggcctt cgaccctgag 780 gctgcggccg tgcagcccta ccaagaccag acgtaccagt cagtctactt cgtgtctgag 840 agcttcagtg acgccaagga caagctcagg agctatgcct cacgcatcca gcgccccttc 900 tccgtgaagt tcgacccgta cacgctggcc atcgacgtgc tggacagccc ccaggccgtg 960 cggcgctccc tggagggtgt ccaggatgag ctggacaccc ttgcccatgc gctgagtgcc 1020 attggctaa 1029 <210> 25 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser40 TH mutant <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1491) <223> Ser40 TH mutant <400> 25 atgcccaccc ccgacgccac cacgccacag gccaagggct tccgcagggc cgtgtctgag 60 ctggacgcca agcaggcaga ggccatcatg tccccgcggt tcattgggcg caggcaggag 120 ctcatcgagg acgcccgcaa ggagcgggag gcggcggtgg cagcagcggc cgctgcagtc 180 ccctcggagc ccggggaccc cctggaggct gtggcctttg aggagaagga ggggaaggcc 240 gtgctaaacc tgctcttctc cccgagggcc accaagccct cggcgctgtc ccgagctgtg 300 aaggtgtttg agacgtttga agccaaaatc caccatctag agacccggcc cgcccagagg 360 ccgcgagctg ggggccccca cctggagtac ttcgtgcgcc tcgaggtgcg ccgaggggac 420 ctggccgccc tgctcagtgg tgtgcgccag gtgtcagagg acgtgcgcag ccccgcgggg 480 cccaaggtcc cctggttccc aagaaaagtg tcagagctgg acaagtgtca tcacctggtc 540 accaagttcg accctgacct ggacttggac cacccgggct tctcggacca ggtgtaccgc 600 cagcgcagga agctgattgc tgagatcgcc ttccagtaca ggcacggcga cccgattccc 660 cgtgtggagt acaccgccga ggagattgcc acctggaagg aggtctacac cacgctgaag 720 ggcctctacg ccacgcacgc ctgcggggag cacctggagg cctttgcttt gctggagcgc 780 ttcagcggct accgggaaga caatatcccc cagctggagg acgtctcccg cttcctgaag 840 gagcgcacgg gcttccagct gcggcctgtg gccggcctgc tgtccgcccg ggacttcctg 900 gccagcctgg ccttccgcgt gttccagtgc acccagtata tccgccacgc gtcctcgccc 960 atgcactccc ctgagccgga ctgctgccac gagctgctgg ggcacgtgcc catgctggcc 1020 gaccgcacct tcgcgcagtt ctcgcaggac attggcctgg cgtccctggg ggcctcggat 1080 gaggaaattg agaagctgtc cacgctgtac tggttcacgg tggagttcgg gctgtgtaag 1140 cagaacgggg aggtgaaggc ctatggtgcc gggctgctgt cctcctacgg ggagctcctg 1200 cactgcctgt ctgaggagcc tgagattcgg gccttcgacc ctgaggctgc ggccgtgcag 1260 ccctaccaag accagacgta ccagtcagtc tacttcgtgt ctgagagctt cagtgacgcc 1320 aaggacaagc tcaggagcta tgcctcacgc atccagcgcc ccttctccgt gaagttcgac 1380 ccgtacacgc tggccatcga cgtgctggac agcccccagg ccgtgcggcg ctccctggag 1440 ggtgtccagg atgagctgga cacccttgcc catgcgctga gtgccattgg c 1491 <210> 26 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser19 Ser49 TH mutant <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1491) <223> Ser19, Ser40 TH mutant <400> 26 atgcccaccc ccgacgccac cacgccacag gccaagggct tccgcagggc cgtggaggag 60 ctggacgcca agcaggcaga ggccatcatg tccccgcggt tcattgggcg caggcaggag 120 ctcatcgagg acgcccgcaa ggagcgggag gcggcggtgg cagcagcggc cgctgcagtc 180 ccctcggagc ccggggaccc cctggaggct gtggcctttg aggagaagga ggggaaggcc 240 gtgctaaacc tgctcttctc cccgagggcc accaagccct cggcgctgtc ccgagctgtg 300 aaggtgtttg agacgtttga agccaaaatc caccatctag agacccggcc cgcccagagg 360 ccgcgagctg ggggccccca cctggagtac ttcgtgcgcc tcgaggtgcg ccgaggggac 420 ctggccgccc tgctcagtgg tgtgcgccag gtgtcagagg acgtgcgcag ccccgcgggg 480 cccaaggtcc cctggttccc aagaaaagtg tcagagctgg acaagtgtca tcacctggtc 540 accaagttcg accctgacct ggacttggac cacccgggct tctcggacca ggtgtaccgc 600 cagcgcagga agctgattgc tgagatcgcc ttccagtaca ggcacggcga cccgattccc 660 cgtgtggagt acaccgccga ggagattgcc acctggaagg aggtctacac cacgctgaag 720 ggcctctacg ccacgcacgc ctgcggggag cacctggagg cctttgcttt gctggagcgc 780 ttcagcggct accgggaaga caatatcccc cagctggagg acgtctcccg cttcctgaag 840 gagcgcacgg gcttccagct gcggcctgtg gccggcctgc tgtccgcccg ggacttcctg 900 gccagcctgg ccttccgcgt gttccagtgc acccagtata tccgccacgc gtcctcgccc 960 atgcactccc ctgagccgga ctgctgccac gagctgctgg ggcacgtgcc catgctggcc 1020 gaccgcacct tcgcgcagtt ctcgcaggac attggcctgg cgtccctggg ggcctcggat 1080 gaggaaattg agaagctgtc cacgctgtac tggttcacgg tggagttcgg gctgtgtaag 1140 cagaacgggg aggtgaaggc ctatggtgcc gggctgctgt cctcctacgg ggagctcctg 1200 cactgcctgt ctgaggagcc tgagattcgg gccttcgacc ctgaggctgc ggccgtgcag 1260 ccctaccaag accagacgta ccagtcagtc tacttcgtgt ctgagagctt cagtgacgcc 1320 aaggacaagc tcaggagcta tgcctcacgc atccagcgcc ccttctccgt gaagttcgac 1380 ccgtacacgc tggccatcga cgtgctggac agcccccagg ccgtgcggcg ctccctggag 1440 ggtgtccagg atgagctgga cacccttgcc catgcgctga gtgccattgg c 1491 <210> 27 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser19 Ser31 Ser40 TH mutant <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1491) <223> Ser19, Ser31, Ser40 TH mutant <400> 27 atgcccaccc ccgacgccac cacgccacag gccaagggct tccgcagggc cgtggaggag 60 ctggacgcca agcaggcaga ggccatcatg gagccgcggt tcattgggcg caggcaggag 120 ctcatcgagg acgcccgcaa ggagcgggag gcggcggtgg cagcagcggc cgctgcagtc 180 ccctcggagc ccggggaccc cctggaggct gtggcctttg aggagaagga ggggaaggcc 240 gtgctaaacc tgctcttctc cccgagggcc accaagccct cggcgctgtc ccgagctgtg 300 aaggtgtttg agacgtttga agccaaaatc caccatctag agacccggcc cgcccagagg 360 ccgcgagctg ggggccccca cctggagtac ttcgtgcgcc tcgaggtgcg ccgaggggac 420 ctggccgccc tgctcagtgg tgtgcgccag gtgtcagagg acgtgcgcag ccccgcgggg 480 cccaaggtcc cctggttccc aagaaaagtg tcagagctgg acaagtgtca tcacctggtc 540 accaagttcg accctgacct ggacttggac cacccgggct tctcggacca ggtgtaccgc 600 cagcgcagga agctgattgc tgagatcgcc ttccagtaca ggcacggcga cccgattccc 660 cgtgtggagt acaccgccga ggagattgcc acctggaagg aggtctacac cacgctgaag 720 ggcctctacg ccacgcacgc ctgcggggag cacctggagg cctttgcttt gctggagcgc 780 ttcagcggct accgggaaga caatatcccc cagctggagg acgtctcccg cttcctgaag 840 gagcgcacgg gcttccagct gcggcctgtg gccggcctgc tgtccgcccg ggacttcctg 900 gccagcctgg ccttccgcgt gttccagtgc acccagtata tccgccacgc gtcctcgccc 960 atgcactccc ctgagccgga ctgctgccac gagctgctgg ggcacgtgcc catgctggcc 1020 gaccgcacct tcgcgcagtt ctcgcaggac attggcctgg cgtccctggg ggcctcggat 1080 gaggaaattg agaagctgtc cacgctgtac tggttcacgg tggagttcgg gctgtgtaag 1140 cagaacgggg aggtgaaggc ctatggtgcc gggctgctgt cctcctacgg ggagctcctg 1200 cactgcctgt ctgaggagcc tgagattcgg gccttcgacc ctgaggctgc ggccgtgcag 1260 ccctaccaag accagacgta ccagtcagtc tacttcgtgt ctgagagctt cagtgacgcc 1320 aaggacaagc tcaggagcta tgcctcacgc atccagcgcc ccttctccgt gaagttcgac 1380 ccgtacacgc tggccatcga cgtgctggac agcccccagg ccgtgcggcg ctccctggag 1440 ggtgtccagg atgagctgga cacccttgcc catgcgctga gtgccattgg c 1491 <210> 28 <211> 610 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis B virus <400> 28 cgtcgacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta 60 tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc 120 ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga 180 ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac 240 ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc 300 cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc 360 tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt cctttccatg 420 gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc 480 ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc 540 gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg 600 aattcgagct 610 <210> 29 <211> 610 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated Woodchuck hepatitis B virus (WHV8) post-transcriptional regulatory element <220> <221> misc_feature <222> (1)..(610) <223> Mutated WHV8 <400> 29 cgtcgataat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta 60 tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc 120 ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga 180 ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac 240 ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc 300 cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc 360 tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg 420 gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc 480 ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc 540 gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg 600 aattcgagct 610 <210> 30 <211> 748 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atggagaagg gccctgtgcg ggcaccggcg gagaagccgc ggggcgccag gtgcagcaat 60 gggttccccg agcgggatcc gccgcggccc gggcccagca ggccggcgga gaagcccccg 120 cggcccgagg ccaagagcgc gcagcccgcg gacggctgga agggcgagcg gccccgcagc 180 gaggaggata acgagctgaa cctccctaac ctggcagccg cctactcgtc catcctgagc 240 tcgctgggcg agaaccccca gcggcaaggg ctgctcaaga cgccctggag ggcggcctcg 300 gccatgcagt tcttcaccaa gggctaccag gagaccatct cagatgtcct aaacgatgct 360 atatttgatg aagatcatga tgagatggtg attgtgaagg acatagacat gttttccatg 420 tgtgagcatc acttggttcc atttgttgga aaggtccata ttggttatct tcctaacaag 480 caagtccttg gcctcagcaa acttgcgagg attgtagaaa tctatagtag aagactacaa 540 gttcaggagc gccttacaaa acaaattgct gtagcaatca cggaagcctt gcggcctgct 600 ggagtcgggg tagtggttga agcaacacac atgtgtatgg taatgcgagg tgtacagaaa 660 atgaacagca aaactgtgac cagcacaatg ttgggtgtgt tccgggagga tccaaagact 720 cgggaagagt tcctgactct cattagga 748 <210> 31 <211> 4205 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAA011 - scAAV-HLP-GCH1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4205) <223> pAA011 - scAAV-HLP-GCH1 <400> 31 aaagcttccc ggggggatct gggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 120 agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tccttctaga tgtttgctgc 180 ttgcaatgtt tgcccatttt agggtggaca caggacgctg tggtttctga gccagggggc 240 gactcagatc ccagccagtg gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc 300 ttggttaata ttcaccagca gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg 360 gacgaggaca gggccctgtc tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagtgaa 420 tcgctagcga attctagcat ggagaagggc cctgtgcggg caccggcgga gaagccgcgg 480 ggcgccaggt gcagcaatgg gttccccgag cgggatccgc cgcggcccgg gcccagcagg 540 ccggcggaga agcccccgcg gcccgaggcc aagagcgcgc agcccgcgga cggctggaag 600 ggcgagcggc cccgcagcga ggaggataac gagctgaacc tccctaacct ggcagccgcc 660 tactcgtcca tcctgagctc gctgggcgag aacccccagc ggcaagggct gctcaagacg 720 ccctggaggg cggcctcggc catgcagttc ttcaccaagg gctaccagga gaccatctca 780 gatgtcctaa acgatgctat atttgatgaa gatcatgatg agatggtgat tgtgaaggac 840 atagacatgt tttccatgtg tgagcatcac ttggttccat ttgttggaaa ggtccatatt 900 ggttatcttc ctaacaagca agtccttggc ctcagcaaac ttgcgaggat tgtagaaatc 960 tatagtagaa gactacaagt tcaggagcgc cttacaaaac aaattgctgt agcaatcacg 1020 gaagccttgc ggcctgctgg agtcggggta gtggttgaag caacacacat gtgtatggta 1080 atgcgaggtg tacagaaaat gaacagcaaa actgtgacca gcacaatgtt gggtgtgttc 1140 cgggaggatc caaagactcg ggaagagttc ctgactctca ttaggagcta atgcatcccc 1200 atcgatgatc cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg 1260 cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt 1320 ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag 1380 ggggaggtgt gggaggtttt ttagtcgacc gctagtccac tccctctctg cgcgctcgct 1440 cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 1500 cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggac agatccgggc ccgcatgcgt cgacaattca 1560 ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc 1620 cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 1680 ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt 1740 acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 1800 gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 1860 tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 1920 cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta 1980 tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 2040 ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 2100 ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 2160 attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 2220 gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 2280 ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 2340 cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 2400 gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 2460 tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 2520 gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 2580 ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 2640 tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 2700 gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 2760 caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 2820 cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 2880 atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 2940 gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 3000 attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 3060 cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 3120 atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 3180 tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 3240 ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 3300 ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac 3360 cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 3420 gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 3480 gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 3540 acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 3600 gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 3660 agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 3720 tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 3780 agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 3840 cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 3900 gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc 3960 ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac 4020 aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact 4080 cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg 4140 agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gctctcgaga 4200 tctag 4205 <210> 32 <211> 5129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAA016 - scAAV-HLP-tTH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5129) <223> pAA016 - scAAV-HLP-tTH <400> 32 aaagcttccc ggggggatct gggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 120 agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctggaggg gtggagtcgt 180 gacccctaaa atgggcaaac attgcgctag ctgtttgctg cttgcaatgt ttgcccattt 240 tagggtggac acaggacgct gtggtttctg agccaggggg cgactcagat cccagccagt 300 ggacttagcc cctgtttgct cctccgataa ctggggtgac cttggttaat attcaccagc 360 agcctccccc gttgcccctc tggatccact gcttaaatac ggacgaggac agggccctgt 420 ctcctcagct tcaggcacca ccactgacct gggacagtga atcattcaag ctcgtagcaa 480 ggatccaccg gtcaccatga gccccgcggg gcccaaggtc ccctggttcc caagaaaagt 540 gtcagagctg gacaagtgtc atcacctggt caccaagttc gaccctgacc tggacttgga 600 ccacccgggc ttctcggacc aggtgtaccg ccagcgcagg aagctgattg ctgagatcgc 660 cttccagtac aggcacggcg acccgattcc ccgtgtggag tacaccgccg aggagattgc 720 cacctggaag gaggtctaca ccacgctgaa gggcctctac gccacgcacg cctgcgggga 780 gcacctggag gcctttgctt tgctggagcg cttcagcggc taccgggaag acaatatccc 840 ccagctggag gacgtctccc gcttcctgaa ggagcgcacg ggcttccagc tgcggcctgt 900 ggccggcctg ctgtccgccc gggacttcct ggccagcctg gccttccgcg tgttccagtg 960 cacccagtat atccgccacg cgtcctcgcc catgcactcc cctgagccgg actgctgcca 1020 cgagctgctg gggcacgtgc ccatgctggc cgaccgcacc ttcgcgcagt tctcgcagga 1080 cattggcctg gcgtccctgg gggcctcgga tgaggaaatt gagaagctgt ccacgctgta 1140 ctggttcacg gtggagttcg ggctgtgtaa gcagaacggg gaggtgaagg cctatggtgc 1200 cgggctgctg tcctcctacg gggagctcct gcactgcctg tctgaggagc ctgagattcg 1260 ggccttcgac cctgaggctg cggccgtgca gccctaccaa gaccagacgt accagtcagt 1320 ctacttcgtg tctgagagct tcagtgacgc caaggacaag ctcaggagct atgcctcacg 1380 catccagcgc cccttctccg tgaagttcga cccgtacacg ctggccatcg acgtgctgga 1440 cagcccccag gccgtgcggc gctccctgga gggtgtccag gatgagctgg acacccttgc 1500 ccatgcgctg agtgccattg gctaactagt ggatccgtcg ataatcaacc tctggattac 1560 aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga 1620 tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc 1680 tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa 1740 cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc 1800 acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc 1860 atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 1920 gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg 1980 attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct 2040 tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg 2100 agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cctggaattc gagctcggta cagcttatcg 2160 ataccgtcga cttcgagcaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 2220 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 2280 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcgtctagc atcgaagatc ccccgctagt 2340 ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 2400 gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggacagatcc 2460 gggcccgcat gcgtcgacaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 2520 cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 2580 agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 2640 cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc 2700 actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca 2760 cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg 2820 accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga 2880 cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 2940 tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 3000 taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 3060 tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 3120 gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 3180 gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 3240 cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 3300 tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 3360 tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 3420 atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 3480 ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 3540 gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 3600 gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 3660 gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 3720 gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 3780 gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 3840 cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 3900 atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 3960 tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 4020 ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 4080 gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 4140 tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 4200 ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt 4260 ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 4320 gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 4380 ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 4440 tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 4500 ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 4560 agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 4620 agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 4680 gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 4740 tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt 4800 accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca 4860 gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 4920 attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 4980 gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 5040 gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 5100 catgattacg ccaagctctc gagatctag 5129 <210> 33 <211> 8013 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAAo19 - scAAV-LP1-GCH1-LP1-tTH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8013) <223> pAAo19 - scAAV-LP1-GCH1-LP1-tTH <400> 33 cagcagctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg 60 acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc 120 atcactaggg gttccttgta gttaatgatt aacccgccat gctacttatc tacgtagcca 180 tgctctagag ctgagcccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac 240 agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca 300 tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc 360 ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggga atgactcctt tcggtaagtg cagtggaagc 420 tgtacactgc ccaggcaaag cgtccgggca gcgtaggcgg gcgactcaga tcccagccag 480 tggacttagc ccctgtttgc tcctccgata actggggtga ccttggttaa tattcaccag 540 cagcctcccc cgttgcccct ctggatccac tgcttaaata cggacgagga cagggccctg 600 tctcctcagc ttcaggcacc accactgacc tgggacagtg aatccggact ctaaggtaaa 660 tataaaattt ttaagtgtat aatgtgttaa actactgatt ctaattgttt ctctctttta 720 gattccaacc tttggaactg acctgcagga ttcaagctgc tagcaaggat ccaccggtaa 780 catggagaag ggccctgtgc gggcaccggc ggagaagccg cggggcgcca ggtgcagcaa 840 tgggttcccc gagcgggatc cgccgcggcc cgggcccagc aggccggcgg agaagccccc 900 gcggcccgag gccaagagcg cgcagcccgc ggacggctgg aagggcgagc ggccccgcag 960 cgaggaggat aacgagctga acctccctaa cctggcagcc gcctactcgt ccatcctgag 1020 ctcgctgggc gagaaccccc agcggcaagg gctgctcaag acgccctgga gggcggcctc 1080 ggccatgcag ttcttcacca agggctacca ggagaccatc tcagatgtcc taaacgatgc 1140 tatatttgat gaagatcatg atgagatggt gattgtgaag gacatagaca tgttttccat 1200 gtgtgagcat cacttggttc catttgttgg aaaggtccat attggttatc ttcctaacaa 1260 gcaagtcctt ggcctcagca aacttgcgag gattgtagaa atctatagta gaagactaca 1320 agttcaggag cgccttacaa aacaaattgc tgtagcaatc acggaagcct tgcggcctgc 1380 tggagtcggg gtagtggttg aagcaacaca catgtgtatg gtaatgcgag gtgtacagaa 1440 aatgaacagc aaaactgtga ccagcacaat gttgggtgtg ttccgggagg atccaaagac 1500 tcgggaagag ttcctgactc tcattaggag ctaatgcatc cccatcgatg atccagacat 1560 gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt 1620 tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca 1680 agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt 1740 tttttagtcg accagatctg acaaggtccc ctaaaatggg caaacattgc aagcagcaaa 1800 cagcaaacac acagccctcc ctgcctgctg accttggagc tggggcagag gtcagagacc 1860 tctctgggcc catgccacct ccaacatcca ctcgacccct tggaatttcg gtggagagga 1920 gcagaggttg tcctggcgtg gtttaggtag tgtgagaggg gaatgactcc tttcggtaag 1980 tgcagtggaa gctgtacact gcccaggcaa agcgtccggg cagcgtaggc gggcgactca 2040 gatcccagcc agtggactta gcccctgttt gctcctccga taactggggt gaccttggtt 2100 aatattcacc agcagcctcc cccgttgccc ctctggatcc actgcttaaa tacggacgag 2160 gacagggccc tgtctcctca gcttcaggca ccaccactga cctgggacag tgaatccgga 2220 ctctaaggta aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga ttctaattgt 2280 ttctctcttt tagattccaa cctttggaac tgattcgaaa ttcaagctgc tagcaaggat 2340 ccaccggtca ccatgagccc cgcggggccc aaggtcccct ggttcccaag aaaagtgtca 2400 gagctggaca agtgtcatca cctggtcacc aagttcgacc ctgacctgga cttggaccac 2460 ccgggcttct cggaccaggt gtaccgccag cgcaggaagc tgattgctga gatcgccttc 2520 cagtacaggc acggcgaccc gattccccgt gtggagtaca ccgccgagga gattgccacc 2580 tggaaggagg tctacaccac gctgaagggc ctctacgcca cgcacgcctg cggggagcac 2640 ctggaggcct ttgctttgct ggagcgcttc agcggctacc gggaagacaa tatcccccag 2700 ctggaggacg tctcccgctt cctgaaggag cgcacgggct tccagctgcg gcctgtggcc 2760 ggcctgctgt ccgcccggga cttcctggcc agcctggcct tccgcgtgtt ccagtgcacc 2820 cagtatatcc gccacgcgtc ctcgcccatg cactcccctg agccggactg ctgccacgag 2880 ctgctggggc acgtgcccat gctggccgac cgcaccttcg cgcagttctc gcaggacatt 2940 ggcctggcgt ccctgggggc ctcggatgag gaaattgaga agctgtccac gctgtactgg 3000 ttcacggtgg agttcgggct gtgtaagcag aacggggagg tgaaggccta tggtgccggg 3060 ctgctgtcct cctacgggga gctcctgcac tgcctgtctg aggagcctga gattcgggcc 3120 ttcgaccctg aggctgcggc cgtgcagccc taccaagacc agacgtacca gtcagtctac 3180 ttcgtgtctg agagcttcag tgacgccaag gacaagctca ggagctatgc ctcacgcatc 3240 cagcgcccct tctccgtgaa gttcgacccg tacacgctgg ccatcgacgt gctggacagc 3300 ccccaggccg tgcggcgctc cctggagggt gtccaggatg agctggacac ccttgcccat 3360 gcgctgagtg ccattggcta actagtggat ccgtcgataa tcaacctctg gattacaaaa 3420 tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg 3480 ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct 3540 tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg 3600 gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct 3660 gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg 3720 ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg 3780 tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc 3840 tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc 3900 gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc 3960 ggatctccct ttgggccgcc tccccgcctg gaattcgagc tcggtacagc ttatcgatac 4020 cgtcgacttc gagcaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 4080 tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 4140 tcatcaatgt atcttatcat gtctggatcg tctagcatcg aagatccccc gcatgctcta 4200 gagcatggct acgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta 4260 gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca 4320 aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 4380 tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 4440 ggcgaatgga attccagacg attgagcgtc aaaatgtagg tatttccatg agcgtttttc 4500 ctgttgcaat ggctggcggt aatattgttc tggatattac cagcaaggcc gatagtttga 4560 gttcttctac tcaggcaagt gatgttatta ctaatcaaag aagtattgcg acaacggtta 4620 atttgcgtga tggacagact cttttactcg gtggcctcac tgattataaa aacacttctc 4680 aggattctgg cgtaccgttc ctgtctaaaa tccctttaat cggcctcctg tttagctccc 4740 gctctgattc taacgaggaa agcacgttat acgtgctcgt caaagcaacc atagtacgcg 4800 ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca 4860 cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc 4920 gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct 4980 ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg 5040 ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc 5100 ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg 5160 attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg 5220 aattttaaca aaatattaac gtttacaatt taaatatttg cttatacaat cttcctgttt 5280 ttggggcttt tctgattatc aaccggggta catatgattg acatgctagt tttacgatta 5340 ccgttcatcg attctcttgt ttgctccaga ctctcaggca atgacctgat agcctttgta 5400 gagacctctc aaaaatagct accctctccg gcatgaattt atcagctaga acggttgaat 5460 atcatattga tggtgatttg actgtctccg gcctttctca cccgtttgaa tctttaccta 5520 cacattactc aggcattgca tttaaaatat atgagggttc taaaaatttt tatccttgcg 5580 ttgaaataaa ggcttctccc gcaaaagtat tacagggtca taatgttttt ggtacaaccg 5640 atttagcttt atgctctgag gctttattgc ttaattttgc taattctttg ccttgcctgt 5700 atgatttatt ggatgttgga attcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 5760 atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 5820 cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 5880 tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg 5940 tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat 6000 gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 6060 acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 6120 ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 6180 gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 6240 ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 6300 gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 6360 agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 6420 caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 6480 gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 6540 agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 6600 gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 6660 aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg 6720 ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 6780 tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 6840 tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 6900 gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 6960 atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 7020 ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 7080 aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 7140 ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 7200 ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 7260 tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 7320 cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 7380 gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 7440 gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 7500 tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 7560 ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 7620 gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 7680 ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 7740 tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 7800 ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 7860 gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 7920 acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg 7980 cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgc 8013 <210> 34 <211> 5369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAA010 scAAV-LP1-tTH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5369) <223> pAA010 scAAV-LP1-tTH <400> 34 aaagcttccc ggggggatct gggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 120 agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctggaggg gtggagtcgt 180 gacccctaaa atgggcaaac attgcaagca gcaaacagca aacacacagc cctccctgcc 240 tgctgacctt ggagctgggg cagaggtcag agacctctct gggcccatgc cacctccaac 300 atccactcga ccccttggaa tttcggtgga gaggagcaga ggttgtcctg gcgtggttta 360 ggtagtgtga gaggggaatg actcctttcg gtaagtgcag tggaagctgt acactgccca 420 ggcaaagcgt ccgggcagcg taggcgggcg actcagatcc cagccagtgg acttagcccc 480 tgtttgctcc tccgataact ggggtgacct tggttaatat tcaccagcag cctcccccgt 540 tgcccctctg gatccactgc ttaaatacgg acgaggacag ggccctgtct cctcagcttc 600 aggcaccacc actgacctgg gacagtgaat ccggactcta aggtaaatat aaaattttta 660 agtgtataat gtgttaaact actgattcta attgtttctc tcttttagat tccaaccttt 720 ggaactgaat tctagcatga gccccgcggg gcccaaggtc ccctggttcc caagaaaagt 780 gtcagagctg gacaagtgtc atcacctggt caccaagttc gaccctgacc tggacttgga 840 ccacccgggc ttctcggacc aggtgtaccg ccagcgcagg aagctgattg ctgagatcgc 900 cttccagtac aggcacggcg acccgattcc ccgtgtggag tacaccgccg aggagattgc 960 cacctggaag gaggtctaca ccacgctgaa gggcctctac gccacgcacg cctgcgggga 1020 gcacctggag gcctttgctt tgctggagcg cttcagcggc taccgggaag acaatatccc 1080 ccagctggag gacgtctccc gcttcctgaa ggagcgcacg ggcttccagc tgcggcctgt 1140 ggccggcctg ctgtccgccc gggacttcct ggccagcctg gccttccgcg tgttccagtg 1200 cacccagtat atccgccacg cgtcctcgcc catgcactcc cctgagccgg actgctgcca 1260 cgagctgctg gggcacgtgc ccatgctggc cgaccgcacc ttcgcgcagt tctcgcagga 1320 cattggcctg gcgtccctgg gggcctcgga tgaggaaatt gagaagctgt ccacgctgta 1380 ctggttcacg gtggagttcg ggctgtgtaa gcagaacggg gaggtgaagg cctatggtgc 1440 cgggctgctg tcctcctacg gggagctcct gcactgcctg tctgaggagc ctgagattcg 1500 ggccttcgac cctgaggctg cggccgtgca gccctaccaa gaccagacgt accagtcagt 1560 ctacttcgtg tctgagagct tcagtgacgc caaggacaag ctcaggagct atgcctcacg 1620 catccagcgc cccttctccg tgaagttcga cccgtacacg ctggccatcg acgtgctgga 1680 cagcccccag gccgtgcggc gctccctgga gggtgtccag gatgagctgg acacccttgc 1740 ccatgcgctg agtgccattg gctaactagt ggatccgtcg ataatcaacc tctggattac 1800 aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga 1860 tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc 1920 tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa 1980 cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc 2040 acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc 2100 atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 2160 gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg 2220 attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct 2280 tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg 2340 agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cctggaattc gagctcggta cagcttatcg 2400 ataccgtcga cttcgagcaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 2460 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 2520 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcgtctagc atcgaagatc ccccgctagt 2580 ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 2640 gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggacagatcc 2700 gggcccgcat gcgtcgacaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 2760 cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 2820 agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 2880 cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc 2940 actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca 3000 cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg 3060 accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga 3120 cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 3180 tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 3240 taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 3300 tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 3360 gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 3420 gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 3480 cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 3540 tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 3600 tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 3660 atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 3720 ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 3780 gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 3840 gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 3900 gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 3960 gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 4020 gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 4080 cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 4140 atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 4200 tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 4260 ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 4320 gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 4380 tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 4440 ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt 4500 ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 4560 gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 4620 ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 4680 tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 4740 ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 4800 agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 4860 agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 4920 gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 4980 tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt 5040 accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca 5100 gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 5160 attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 5220 gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 5280 gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 5340 catgattacg ccaagctctc gagatctag 5369 <210> 35 <211> 4503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAA009 scAAV-LP1-GCH1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4503) <223> pAA009 scAAV-LP1-GCH1 <400> 35 aaagcttccc ggggggatct gggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 120 agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctggaggg gtggagtcgt 180 gacccctaaa atgggcaaac attgcaagca gcaaacagca aacacacagc cctccctgcc 240 tgctgacctt ggagctgggg cagaggtcag agacctctct gggcccatgc cacctccaac 300 atccactcga ccccttggaa tttcggtgga gaggagcaga ggttgtcctg gcgtggttta 360 ggtagtgtga gaggggaatg actcctttcg gtaagtgcag tggaagctgt acactgccca 420 ggcaaagcgt ccgggcagcg taggcgggcg actcagatcc cagccagtgg acttagcccc 480 tgtttgctcc tccgataact ggggtgacct tggttaatat tcaccagcag cctcccccgt 540 tgcccctctg gatccactgc ttaaatacgg acgaggacag ggccctgtct cctcagcttc 600 aggcaccacc actgacctgg gacagtgaat ccggactcta aggtaaatat aaaattttta 660 agtgtataat gtgttaaact actgattcta attgtttctc tcttttagat tccaaccttt 720 ggaactgaat tctagcatgg agaagggccc tgtgcgggca ccggcggaga agccgcgggg 780 cgccaggtgc agcaatgggt tccccgagcg ggatccgccg cggcccgggc ccagcaggcc 840 ggcggagaag cccccgcggc ccgaggccaa gagcgcgcag cccgcggacg gctggaaggg 900 cgagcggccc cgcagcgagg aggataacga gctgaacctc cctaacctgg cagccgccta 960 ctcgtccatc ctgagctcgc tgggcgagaa cccccagcgg caagggctgc tcaagacgcc 1020 ctggagggcg gcctcggcca tgcagttctt caccaagggc taccaggaga ccatctcaga 1080 tgtcctaaac gatgctatat ttgatgaaga tcatgatgag atggtgattg tgaaggacat 1140 agacatgttt tccatgtgtg agcatcactt ggttccattt gttggaaagg tccatattgg 1200 ttatcttcct aacaagcaag tccttggcct cagcaaactt gcgaggattg tagaaatcta 1260 tagtagaaga ctacaagttc aggagcgcct tacaaaacaa attgctgtag caatcacgga 1320 agccttgcgg cctgctggag tcggggtagt ggttgaagca acacacatgt gtatggtaat 1380 gcgaggtgta cagaaaatga acagcaaaac tgtgaccagc acaatgttgg gtgtgttccg 1440 ggaggatcca aagactcggg aagagttcct gactctcatt aggagctaat gcatccccat 1500 cgatgatcca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 1560 gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 1620 aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 1680 ggaggtgtgg gaggtttttt agtcgaccgc tagtccactc cctctctgcg cgctcgctcg 1740 ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 1800 gtgagcgagc gagcgcgcag agagggacag atccgggccc gcatgcgtcg acaattcact 1860 ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 1920 tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 1980 ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac 2040 gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 2100 cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg 2160 tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca 2220 gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 2280 tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 2340 aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 2400 catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 2460 tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 2520 tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 2580 ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 2640 ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 2700 cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 2760 ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 2820 tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 2880 gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 2940 ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 3000 aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 3060 acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 3120 tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 3180 cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 3240 gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 3300 taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 3360 tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 3420 cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 3480 ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 3540 accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 3600 cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca 3660 cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 3720 tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 3780 taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 3840 gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 3900 agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 3960 ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 4020 acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 4080 caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 4140 tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 4200 tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc 4260 aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag 4320 gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca 4380 ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag 4440 cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc tctcgagatc 4500 tag 4503 <210> 36 <211> 5059 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scAAV-LP1-hFIXco <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5059) <223> scAAV-LP1-hFIXco <400> 36 aaagcttccc ggggggatct gggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 120 agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctggaggg gtggagtcgt 180 gacccctaaa atgggcaaac attgcaagca gcaaacagca aacacacagc cctccctgcc 240 tgctgacctt ggagctgggg cagaggtcag agacctctct gggcccatgc cacctccaac 300 atccactcga ccccttggaa tttcggtgga gaggagcaga ggttgtcctg gcgtggttta 360 ggtagtgtga gaggggaatg actcctttcg gtaagtgcag tggaagctgt acactgccca 420 ggcaaagcgt ccgggcagcg taggcgggcg actcagatcc cagccagtgg acttagcccc 480 tgtttgctcc tccgataact ggggtgacct tggttaatat tcaccagcag cctcccccgt 540 tgcccctctg gatccactgc ttaaatacgg acgaggacag ggccctgtct cctcagcttc 600 aggcaccacc actgacctgg gacagtgaat ccggactcta aggtaaatat aaaattttta 660 agtgtataat gtgttaaact actgattcta attgtttctc tcttttagat tccaaccttt 720 ggaactgaat tctagaccac catgcagagg gtgaacatga tcatggctga gagccctggc 780 ctgatcacca tctgcctgct gggctacctg ctgtctgctg agtgcactgt gttcctggac 840 catgagaatg ccaacaagat cctgaacagg cccaagagat acaactctgg caagctggag 900 gagtttgtgc agggcaacct ggagagggag tgcatggagg agaagtgcag ctttgaggag 960 gccagggagg tgtttgagaa cactgagagg accactgagt tctggaagca gtatgtggat 1020 ggggaccagt gtgagagcaa cccctgcctg aatgggggca gctgcaagga tgacatcaac 1080 agctatgagt gctggtgccc ctttggcttt gagggcaaga actgtgagct ggatgtgacc 1140 tgcaacatca agaatggcag atgtgagcag ttctgcaaga actctgctga caacaaggtg 1200 gtgtgcagct gcactgaggg ctacaggctg gctgagaacc agaagagctg tgagcctgct 1260 gtgccattcc catgtggcag agtgtctgtg agccagacca gcaagctgac cagggctgag 1320 gctgtgttcc ctgatgtgga ctatgtgaac agcactgagg ctgaaaccat cctggacaac 1380 atcacccaga gcacccagag cttcaatgac ttcaccaggg tggtgggggg ggaggatgcc 1440 aagcctggcc agttcccctg gcaagtggtg ctgaatggca aggtggatgc cttctgtggg 1500 ggcagcattg tgaatgagaa gtggattgtg actgctgccc actgtgtgga gactggggtg 1560 aagatcactg tggtggctgg ggagcacaac attgaggaga ctgagcacac tgagcagaag 1620 aggaatgtga tcaggatcat cccccaccac aactacaatg ctgccatcaa caagtacaac 1680 catgacattg ccctgctgga gctggatgag cccctggtgc tgaacagcta tgtgaccccc 1740 atctgcattg ctgacaagga gtacaccaac atcttcctga agtttggctc tggctatgtg 1800 tctggctggg gcagggtgtt ccacaagggc aggtctgccc tggtgctgca gtacctgagg 1860 gtgcccctgg tggacagggc cacctgcctg aggagcacca agttcaccat ctacaacaac 1920 atgttctgtg ctggcttcca tgaggggggc agggacagct gccaggggga ctctgggggc 1980 ccccatgtga ctgaggtgga gggcaccagc ttcctgactg gcatcatcag ctggggggag 2040 gagtgtgcca tgaagggcaa gtatggcatc tacaccaaag tctccagata tgtgaactgg 2100 atcaaggaga agaccaagct gacctgactc gatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta 2160 ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc 2220 attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaactagt ccactccctc 2280 tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt 2340 tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggacagatcc gggcccgcat 2400 gcgtcgacaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta 2460 cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 2520 cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc 2580 ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta 2640 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 2700 cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 2760 ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc 2820 tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag 2880 gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 2940 caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 3000 ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 3060 gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 3120 tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 3180 ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 3240 tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 3300 atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 3360 gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 3420 caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 3480 ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 3540 ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 3600 ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 3660 ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 3720 gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 3780 ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 3840 taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 3900 agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 3960 atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 4020 aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 4080 caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 4140 ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc 4200 cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 4260 tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 4320 gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 4380 ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 4440 gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 4500 caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 4560 ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 4620 tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 4680 ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 4740 agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 4800 aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 4860 gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 4920 tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt 4980 tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg 5040 ccaagctctc gagatctag 5059 <210> 37 <211> 9189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAV HLP FVIII V3 kan <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9189) <223> pAV HLP FVIII V3 kan <400> 37 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttc 240 ccggggggat ctttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg 300 gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 360 agagagggag tggccaactc catcactagg ggttccggag gggtggagtc gtgacgtgaa 420 ttacgtcata gggttaggga ggtcgtatac tgtttgctgc ttgcaatgtt tgcccatttt 480 agggtggaca caggacgctg tggtttctga gccagggggc gactcagatc ccagccagtg 540 gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca 600 gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc 660 tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagtgaa tcgcggccgc caccatgcag 720 attgagctga gcacctgctt cttcctgtgc ctgctgaggt tctgcttctc tgccaccagg 780 agatactacc tgggggctgt ggagctgagc tgggactaca tgcagtctga cctgggggag 840 ctgcctgtgg atgccaggtt cccccccaga gtgcccaaga gcttcccctt caacacctct 900 gtggtgtaca agaagaccct gtttgtggag ttcactgacc acctgttcaa cattgccaag 960 cccaggcccc cctggatggg cctgctgggc cccaccatcc aggctgaggt gtatgacact 1020 gtggtgatca ccctgaagaa catggccagc caccctgtga gcctgcatgc tgtgggggtg 1080 agctactgga aggcctctga gggggctgag tatgatgacc agaccagcca gagggagaag 1140 gaggatgaca aggtgttccc tgggggcagc cacacctatg tgtggcaggt gctgaaggag 1200 aatggcccca tggcctctga ccccctgtgc ctgacctaca gctacctgag ccatgtggac 1260 ctggtgaagg acctgaactc tggcctgatt ggggccctgc tggtgtgcag ggagggcagc 1320 ctggccaagg agaagaccca gaccctgcac aagttcatcc tgctgtttgc tgtgtttgat 1380 gagggcaaga gctggcactc tgaaaccaag aacagcctga tgcaggacag ggatgctgcc 1440 tctgccaggg cctggcccaa gatgcacact gtgaatggct atgtgaacag gagcctgcct 1500 ggcctgattg gctgccacag gaagtctgtg tactggcatg tgattggcat gggcaccacc 1560 cctgaggtgc acagcatctt cctggagggc cacaccttcc tggtcaggaa ccacaggcag 1620 gccagcctgg agatcagccc catcaccttc ctgactgccc agaccctgct gatggacctg 1680 ggccagttcc tgctgttctg ccacatcagc agccaccagc atgatggcat ggaggcctat 1740 gtgaaggtgg acagctgccc tgaggagccc cagctgagga tgaagaacaa tgaggaggct 1800 gaggactatg atgatgacct gactgactct gagatggatg tggtgaggtt tgatgatgac 1860 aacagcccca gcttcatcca gatcaggtct gtggccaaga agcaccccaa gacctgggtg 1920 cactacattg ctgctgagga ggaggactgg gactatgccc ccctggtgct ggcccctgat 1980 gacaggagct acaagagcca gtacctgaac aatggccccc agaggattgg caggaagtac 2040 aagaaggtca ggttcatggc ctacactgat gaaaccttca agaccaggga ggccatccag 2100 catgagtctg gcatcctggg ccccctgctg tatggggagg tgggggacac cctgctgatc 2160 atcttcaaga accaggccag caggccctac aacatctacc cccatggcat cactgatgtg 2220 aggcccctgt acagcaggag gctgcccaag ggggtgaagc acctgaagga cttccccatc 2280 ctgcctgggg agatcttcaa gtacaagtgg actgtgactg tggaggatgg ccccaccaag 2340 tctgacccca ggtgcctgac cagatactac agcagctttg tgaacatgga gagggacctg 2400 gcctctggcc tgattggccc cctgctgatc tgctacaagg agtctgtgga ccagaggggc 2460 aaccagatca tgtctgacaa gaggaatgtg atcctgttct ctgtgtttga tgagaacagg 2520 agctggtacc tgactgagaa catccagagg ttcctgccca accctgctgg ggtgcagctg 2580 gaggaccctg agttccaggc cagcaacatc atgcacagca tcaatggcta tgtgtttgac 2640 agcctgcagc tgtctgtgtg cctgcatgag gtggcctact ggtacatcct gagcattggg 2700 gcccagactg acttcctgtc tgtgttcttc tctggctaca ccttcaagca caagatggtg 2760 tatgaggaca ccctgaccct gttccccttc tctggggaga ctgtgttcat gagcatggag 2820 aaccctggcc tgtggattct gggctgccac aactctgact tcaggaacag gggcatgact 2880 gccctgctga aagtctccag ctgtgacaag aacactgggg actactatga ggacagctat 2940 gaggacatct ctgcctacct gctgagcaag aacaatgcca ttgagcccag gagcttcagc 3000 cagaatgcca ctaatgtgtc taacaacagc aacaccagca atgacagcaa tgtgtctccc 3060 ccagtgctga agaggcacca gagggagatc accaggacca ccctgcagtc tgaccaggag 3120 gagattgact atgatgacac catctctgtg gagatgaaga aggaggactt tgacatctac 3180 gacgaggacg agaaccagag ccccaggagc ttccagaaga agaccaggca ctacttcatt 3240 gctgctgtgg agaggctgtg ggactatggc atgagcagca gcccccatgt gctgaggaac 3300 agggcccagt ctggctctgt gccccagttc aagaaggtgg tgttccagga gttcactgat 3360 ggcagcttca cccagcccct gtacagaggg gagctgaatg agcacctggg cctgctgggc 3420 ccctacatca gggctgaggt ggaggacaac atcatggtga ccttcaggaa ccaggccagc 3480 aggccctaca gcttctacag cagcctgatc agctatgagg aggaccagag gcagggggct 3540 gagcccagga agaactttgt gaagcccaat gaaaccaaga cctacttctg gaaggtgcag 3600 caccacatgg cccccaccaa ggatgagttt gactgcaagg cctgggccta cttctctgat 3660 gtggacctgg agaaggatgt gcactctggc ctgattggcc ccctgctggt gtgccacacc 3720 aacaccctga accctgccca tggcaggcag gtgactgtgc aggagtttgc cctgttcttc 3780 accatctttg atgaaaccaa gagctggtac ttcactgaga acatggagag gaactgcagg 3840 gccccctgca acatccagat ggaggacccc accttcaagg agaactacag gttccatgcc 3900 atcaatggct acatcatgga caccctgcct ggcctggtga tggcccagga ccagaggatc 3960 aggtggtacc tgctgagcat gggcagcaat gagaacatcc acagcatcca cttctctggc 4020 catgtgttca ctgtgaggaa gaaggaggag tacaagatgg ccctgtacaa cctgtaccct 4080 ggggtgtttg agactgtgga gatgctgccc agcaaggctg gcatctggag ggtggagtgc 4140 ctgattgggg agcacctgca tgctggcatg agcaccctgt tcctggtgta cagcaacaag 4200 tgccagaccc ccctgggcat ggcctctggc cacatcaggg acttccagat cactgcctct 4260 ggccagtatg gccagtgggc ccccaagctg gccaggctgc actactctgg cagcatcaat 4320 gcctggagca ccaaggagcc cttcagctgg atcaaggtgg acctgctggc ccccatgatc 4380 atccatggca tcaagaccca gggggccagg cagaagttca gcagcctgta catcagccag 4440 ttcatcatca tgtacagcct ggatggcaag aagtggcaga cctacagggg caacagcact 4500 ggcaccctga tggtgttctt tggcaatgtg gacagctctg gcatcaagca caacatcttc 4560 aaccccccca tcattgccag atacatcagg ctgcacccca cccactacag catcaggagc 4620 accctgagga tggagctgat gggctgtgac ctgaacagct gcagcatgcc cctgggcatg 4680 gagagcaagg ccatctctga tgcccagatc actgccagca gctacttcac caacatgttt 4740 gccacctgga gccccagcaa ggccaggctg cacctgcagg gcaggagcaa tgcctggagg 4800 ccccaggtca acaaccccaa ggagtggctg caggtggact tccagaagac catgaaggtg 4860 actggggtga ccacccaggg ggtgaagagc ctgctgacca gcatgtatgt gaaggagttc 4920 ctgatcagca gcagccagga tggccaccag tggaccctgt tcttccagaa tggcaaggtg 4980 aaggtgttcc agggcaacca ggacagcttc acccctgtgg tgaacagcct ggaccccccc 5040 ctgctgacca gatacctgag gattcacccc cagagctggg tgcaccagat tgccctgagg 5100 atggaggtgc tgggctgtga ggcccaggac ctgtactgat cgcgaataaa agatctttat 5160 tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt gtgatgcagc ccaagctgta gataagtagc 5220 atggcgggtt aatcattaac tacaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc 5280 gctcgctcgc tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc 5340 ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaaagatcc gggcccgcat 5400 gcgtcgacaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta 5460 cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 5520 cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg catccatcac 5580 actggcggcc gctcgagcat gcatctagag ggcccaattc gccctatagt gagtcgtatt 5640 acaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac 5700 ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 5760 ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggacgcgc cctgtagcgg 5820 cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 5880 cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 5940 ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 6000 cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 6060 ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 6120 tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 6180 ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 6240 aattcagggc gcaagggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 6300 cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 6360 gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 6420 ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 6480 ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 6540 agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 6600 gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 6660 atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 6720 gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 6780 tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 6840 agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc ccaccttgct 6900 cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 6960 gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 7020 gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 7080 gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 7140 ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 7200 tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 7260 gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 7320 cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg aattgaaaaa 7380 ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 7440 gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 7500 tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 7560 ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 7620 tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 7680 atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 7740 gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 7800 caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 7860 ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 7920 ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 7980 ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 8040 ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 8100 gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 8160 ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 8220 taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 8280 agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 8340 atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 8400 aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 8460 caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 8520 ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc 8580 cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 8640 tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 8700 gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 8760 ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 8820 gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 8880 caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 8940 ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 9000 tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 9060 ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 9120 agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 9180 aagcggaag 9189 <210> 38 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid liver-specific promoter (HLP) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(252) <223> Hybrid liver-specific promoter (HLP) <400> 38 tgtttgctgc ttgcaatgtt tgcccatttt agggtggaca caggacgctg tggtttctga 60 gccagggggc gactcagatc ccagccagtg gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac 120 tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg 180 cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc tcctcagctt caggcaccac cactgacctg 240 ggacagtgaa tc 252 <210> 39 <211> 545 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt 180 agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc 240 aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt 300 ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc 360 ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg 420 caccaccact gacctgggac agtgaatccg gactctaagg taaatataaa atttttaagt 480 gtataatgtg ttaaactact gattctaatt gtttctctct tttagattcc aacctttgga 540 actga 545 <210> 40 <211> 342 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tTH = truncated Tyrosine Hydroxylase <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(342) <223> tTH = truncated Tyrosine Hydroxylase <400> 40 Met Ser Pro Ala Gly Pro Lys Val Pro Trp Phe Pro Arg Lys Val Ser 1 5 10 15 Glu Leu Asp Lys Cys His His Leu Val Thr Lys Phe Asp Pro Asp Leu 20 25 30 Asp Leu Asp His Pro Gly Phe Ser Asp Gln Val Tyr Arg Gln Arg Arg 35 40 45 Lys Leu Ile Ala Glu Ile Ala Phe Gln Tyr Arg His Gly Asp Pro Ile 50 55 60 Pro Arg Val Glu Tyr Thr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Trp Lys Glu Val 65 70 75 80 Tyr Thr Thr Leu Lys Gly Leu Tyr Ala Thr His Ala Cys Gly Glu His 85 90 95 Leu Glu Ala Phe Ala Leu Leu Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Glu Asp 100 105 110 Asn Ile Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Arg Phe Leu Lys Glu Arg Thr 115 120 125 Gly Phe Gln Leu Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ala Arg Asp Phe 130 135 140 Leu Ala Ser Leu Ala Phe Arg Val Phe Gln Cys Thr Gln Tyr Ile Arg 145 150 155 160 His Ala Ser Ser Pro Met His Ser Pro Glu Pro Asp Cys Cys His Glu 165 170 175 Leu Leu Gly His Val Pro Met Leu Ala Asp Arg Thr Phe Ala Gln Phe 180 185 190 Ser Gln Asp Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile 195 200 205 Glu Lys Leu Ser Thr Leu Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys 210 215 220 Lys Gln Asn Gly Glu Val Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser 225 230 235 240 Tyr Gly Glu Leu Leu His Cys Leu Ser Glu Glu Pro Glu Ile Arg Ala 245 250 255 Phe Asp Pro Glu Ala Ala Ala Val Gln Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Tyr 260 265 270 Gln Ser Val Tyr Phe Val Ser Glu Ser Phe Ser Asp Ala Lys Asp Lys 275 280 285 Leu Arg Ser Tyr Ala Ser Arg Ile Gln Arg Pro Phe Ser Val Lys Phe 290 295 300 Asp Pro Tyr Thr Leu Ala Ile Asp Val Leu Asp Ser Pro Gln Ala Val 305 310 315 320 Arg Arg Ser Leu Glu Gly Val Gln Asp Glu Leu Asp Thr Leu Ala His 325 330 335 Ala Leu Ser Ala Ile Gly 340 <210> 41 <211> 438 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 atgagcacgg aaggtggtgg ccgtcgctgc caggcacaag tgtcccgccg catctccttc 60 agcgcgagcc accgattgta cagtaaattt ctaagtgatg aagaaaactt gaaactgttt 120 gggaaatgca acaatccaaa tggccatggg cacaattata aagttgtggt gacagtacat 180 ggagagattg accctgctac gggaatggtt atgaatctgg ctgatctcaa aaaatatatg 240 gaggaggcga ttatgcagcc ccttgatcat aagaatctgg atatggatgt gccatacttt 300 gcagatgtgg tgagcacgac tgaaaatgta gctgtttata tctgggacaa cctccagaaa 360 gttcttcctg taggagttct ttataaagta aaagtatacg aaactgacaa taatattgtg 420 gtttataaag gagaatag 438 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AA16 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> primer AA16 <400> 42 ccaagctagc atggagaagg gccctgtg 28 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AA17 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> primer AA17 <400> 43 ccaagctagc ggtcgactaa aaaacctcc 29 <210> 44 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AA33 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> primer AA33 <400> 44 ccaagctagc atgagccccg cggggcccaa g 31 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AA34 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> primer AA34 <400> 45 ccaagctagc gggggatctt cgatgctaga c 31 <210> 46 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AA43 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> primer AA43 <400> 46 ccaatggcca actccatcac taggggttcc ttctagatgt ttgctgcttg caatgtttgc 60 60 <210> 47 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AA44 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> primer AA44 <400> 47 ccaagaattc gctagcgatt cactgtccca ggtcagtg 38 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AA57 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> primer AA57 <400> 48 ccaagctagc tgtttgctgc ttgcaatgtt tgc 33 <210> 49 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AA67 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> primer AA67 <400> 49 gatccttgct acgagcttga atgattcact gtcccaggtc agt 43 <210> 50 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AA68 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> Primer AA68 <400> 50 actgacctgg gacagtgaat cattcaagct cgtagcaagg atc 43 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RmiscTHext2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> primer RmiscTHext2 <400> 51 aaagctagct tcgatgctag acgatccag 29 <210> 52 <211> 5638 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monocistronic delivery plasmid TH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5638) <223> Monocistronic delivery plasmid TH <400> 52 gcgatcgcgg ctcccgacat cttggaccat tagctccaca ggtatcttct tccctctagt 60 ggtcataaca gcagcttcag ctacctctca attcaaaaaa cccctcaaga cccgtttaga 120 ggccccaagg ggttatgcta tcaatcgttg cgttacacac acaaaaaacc aacacacatc 180 catcttcgat ggatagcgat tttattatct aactgctgat cgagtgtagc cagatctagt 240 aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 300 cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 360 cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 420 tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta 480 ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg 540 actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg ctgatgcggt 600 tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 660 accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 720 gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 780 atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatcagatc tttgtcgatc ctaccatcca 840 ctcgacacac ccgccagcta gagatcccgg gaccatgagc cccgcggggc ccaaggtccc 900 ctggttccca agaaaagtgt cagagctgga caagtgtcat cacctggtca ccaagttcga 960 ccctgacctg gacttggacc acccgggctt ctcggaccag gtgtaccgcc agcgcaggaa 1020 gctgattgct gagatcgcct tccagtacag gcacggcgac ccgattcccc gtgtggagta 1080 caccgccgag gagattgcca cctggaagga ggtctacacc acgctgaagg gcctctacgc 1140 cacgcacgcc tgcggggagc acctggaggc ctttgctttg ctggagcgct tcagcggcta 1200 ccgggaagac aatatccccc agctggagga cgtctcccgc ttcctgaagg agcgcacggg 1260 cttccagctg cggcctgtgg ccggcctgct gtccgcccgg gacttcctgg ccagcctggc 1320 cttccgcgtg ttccagtgca cccagtatat ccgccacgcg tcctcgccca tgcactcccc 1380 tgagccggac tgctgccacg agctgctggg gcacgtgccc atgctggccg accgcacctt 1440 cgcgcagttc tcgcaggaca ttggcctggc gtccctgggg gcctcggatg aggaaattga 1500 gaagctgtcc acgctgtact ggttcacggt ggagttcggg ctgtgtaagc agaacgggga 1560 ggtgaaggcc tatggtgccg ggctgctgtc ctcctacggg gagctcctgc actgcctgtc 1620 tgaggagcct gagattcggg ccttcgaccc tgaggctgcg gccgtgcagc cctaccaaga 1680 ccagacgtac cagtcagtct acttcgtgtc tgagagcttc agtgacgcca aggacaagct 1740 caggagctat gcctcacgca tccagcgccc cttctccgtg aagttcgacc cgtacacgct 1800 ggccatcgac gtgctggaca gcccccaggc cgtgcggcgc tccctggagg gtgtccagga 1860 tgagctggac acccttgccc atgcgctgag tgccattggc taagacgcca cctaatcaac 1920 ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1980 cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 2040 tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 2100 ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 2160 gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 2220 cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 2280 ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tcccatcttg actgactgag 2340 atacagcgta ccttcagctc acagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca 2400 caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat 2460 ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt 2520 ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg 2580 gtattggccc atctctatcg gtatcgtagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt 2640 gaggggtttt ttgtgcccct cgggccggat tgctatctac cggcattggc gcagaaaaaa 2700 atgcctgatg cgacgctgcg cgtcttatac tcccacatat gccagattca gcaacggata 2760 cggcttcccc aacttgccca cttccatacg tgtcctcctt accagaaatt tatccttaag 2820 gtcgtcagct atcctgcagg cgatctctcg atttcgatca agacattcct ttaatggtct 2880 tttctggaca ccactagggg tcagaagtag ttcatcaaac tttcttccct ccctaatctc 2940 attggttacc ttgggctatc gaaacttaat taaccagtca agtcagctac ttggcgagat 3000 cgacttgtct gggtttcgac tacgctcaga attgcgtcag tcaagttcga tctggtcctt 3060 gctattgcac ccgttctccg attacgagtt tcatttaaat catgtgagca aaaggccagc 3120 aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 3180 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 3240 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 3300 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 3360 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 3420 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 3480 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 3540 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 3600 gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 3660 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 3720 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 3780 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 3840 tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 3900 agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 3960 gtctatttcg ttcatccata gttgcattta aatttccgaa ctctccaagg ccctcgtcgg 4020 aaaatcttca aacctttcgt ccgatccatc ttgcaggcta cctctcgaac gaactatcgc 4080 aagtctcttg gccggccttg cgccttggct attgcttggc agcgcctatc gccaggtatt 4140 actccaatcc cgaatatccg agatcgggat cacccgagag aagttcaacc tacatcctca 4200 atcccgatct atccgagatc cgaggaatat cgaaatcggg gcgcgcctgg tgtaccgaga 4260 acgatcctct cagtgcgagt ctcgacgatc catatcgttg cttggcagtc agccagtcgg 4320 aatccagctt gggacccagg aagtccaatc gtcagatatt gtactcaagc ctggtcacgg 4380 cagcgtaccg atctgtttaa acctagatat tgatagtctg atcggtcaac gtataatcga 4440 gtcctagctt ttgcaaacat ctatcaagag acaggatcag caggaggctt tcgcatgagt 4500 attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 4560 gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcgcgagtg 4620 ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 4680 cgctttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 4740 gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 4800 tattcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 4860 gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gattggagga 4920 ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 4980 tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 5040 gcaatggcaa caaccttgcg taaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 5100 caacagttga tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 5160 cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 5220 atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 5280 gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 5340 attaagcatt ggtaaccgat tctaggtgca ttggcgcaga aaaaaatgcc tgatgcgacg 5400 ctgcgcgtct tatactccca catatgccag attcagcaac ggatacggct tccccaactt 5460 gcccacttcc atacgtgtcc tccttaccag aaatttatcc ttaagatccc gaatcgttta 5520 aactcgactc tggctctatc gaatctccgt cgtttcgagc ttacgcgaac agccgtggcg 5580 ctcatttgct cgtcgggcat cgaatctcgt cagctatcgt cagcttacct ttttggca 5638 <210> 53 <211> 6431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bicistronic delivery plasmid GCH1 PTPS <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6431) <223> Bicistronic delivery plasmid GCH1 PTPS <400> 53 gcgatcgcgg ctcccgacat cttggaccat tagctccaca ggtatcttct tccctctagt 60 ggtcataaca gcagcttcag ctacctctca attcaaaaaa cccctcaaga cccgtttaga 120 ggccccaagg ggttatgcta tcaatcgttg cgttacacac acaaaaaacc aacacacatc 180 catcttcgat ggatagcgat tttattatct aactgctgat cgagtgtagc cagatctagt 240 aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 300 cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 360 cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 420 tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta 480 ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg 540 actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg ctgatgcggt 600 tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 660 accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 720 gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 780 atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatcagatc tttgtcgatc ctaccatcca 840 ctcgacacac ccgccagcaa tatggccaca accgcggccg tagatcccgg gaccatggag 900 aagccgcggg gagtcaggtg caccaatggg ttctccgagc gggagctgcc gcggcccggg 960 gccagcccgc ctgccgagaa gtcccggccg cccgaggcca agggcgcaca gccggccgac 1020 gcctggaagg cagggcggca ccgcagcgag gaggaaaacc aggtgaacct ccccaaactg 1080 gcggctgctt actcgtccat tctgctctcg ctgggcgagg acccccagcg gcaggggctg 1140 ctcaagacgc cctggagggc ggccaccgcc atgcagtact tcaccaaggg ataccaggag 1200 accatctcag atgtcctgaa tgatgctata tttgatgaag atcatgacga gatggtgatt 1260 gtgaaggaca tagatatgtt ctccatgtgt gagcatcacc ttgttccatt tgtaggaagg 1320 gtccatattg gctatcttcc taacaagcaa gtccttggtc tcagtaaact tgccaggatt 1380 gtagaaatct acagtagacg actacaagtt caagagcgcc tcaccaaaca gattgcggtg 1440 gccatcacag aagccttgca gcctgctggc gttggagtag tgattgaagc gacacacatg 1500 tgcatggtaa tgcgaggcgt gcagaaaatg aacagcaaga ctgtcactag caccatgctg 1560 ggcgtgttcc gggaagaccc caagactcgg gaggagttcc tcacactaat caggagctga 1620 gactataggg tgggtattat gtgttcatca accatcctaa aaatacccgg taaacaggtg 1680 cagccccaga tctgggcagc aggagggggc agtgggaagc ttaacgcgcc acgactatag 1740 ggtgggtatt atgtgttcat caaccatcct aaaaataccc ggtaaacagg tgcagcccca 1800 gatctgggca gcaggagggg gcagtgggaa gcttatctag tctcgaggta ccgagctctt 1860 acgcgtgcta gctcgagatc tggatatcga ctatagggtg ggtattatgt gttcatcaac 1920 catcctaaaa atacccggta aacaggtgca gccccagatc tgggcagcag gagggggcag 1980 tgggtctgtt ctatttttac cagccagttg ctgctggaca cagttttcat agcctcccct 2040 cggctctgcc cctcacagtc tgcagtctac ggcgaggcac aggccagccc agctccacga 2100 ggactgaaca agaagcttga tatcgaattg gtaccatcga ggaactgaaa aaccagaaag 2160 ttaactggta agtttagtct ttttgtcttt tatttcaggt cccggatccg gtggtggtgc 2220 aaatcaaaga actgctcctc agtggatatc gcctttactt ctaggccacc atgagcgcgg 2280 cgggtgacct tcgtcgccgc gcgcgactgt cgcgcctcgt gtccttcagc gcgagccacc 2340 ggctgcacag cccatctctg agcgatgaag agaacttaag agtgtttggg aaatgcaaca 2400 atccgaatgg ccacgggcac aactataaag ttgtggtgac agtccatgga gagattgatc 2460 ctgttacagg aatggttatg aatttgaccg acctcaaaga atacatggag gaggccatca 2520 tgaagcctct tgatcacaag aacctggacc tggatgtgcc gtactttgcg gatgctgtga 2580 gcacgacaga aaatgtagct gtctacatct gggaaagcct ccagaaactt cttccagtgg 2640 gagctcttta taaagtaaaa gtgtttgaaa ccgacaacaa catcgtagtc tataaaggag 2700 aatagtaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 2760 gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 2820 tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 2880 gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 2940 cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 3000 ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 3060 cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttcccatc 3120 ttgactgact gagatacagc gtaccttcag ctcacagaca tgataagata cattgatgag 3180 tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat 3240 gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc 3300 attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac 3360 ctctacaaat gtggtattgg cccatctcta tcggtatcgt agcataaccc cttggggcct 3420 ctaaacgggt cttgaggggt tttttgtgcc cctcgggccg gattgctatc taccggcatt 3480 ggcgcagaaa aaaatgcctg atgcgacgct gcgcgtctta tactcccaca tatgccagat 3540 tcagcaacgg atacggcttc cccaacttgc ccacttccat acgtgtcctc cttaccagaa 3600 atttatcctt aaggtcgtca gctatcctgc aggcgatctc tcgatttcga tcaagacatt 3660 cctttaatgg tcttttctgg acaccactag gggtcagaag tagttcatca aactttcttc 3720 cctccctaat ctcattggtt accttgggct atcgaaactt aattaaccag tcaagtcagc 3780 tacttggcga gatcgacttg tctgggtttc gactacgctc agaattgcgt cagtcaagtt 3840 cgatctggtc cttgctattg cacccgttct ccgattacga gtttcattta aatcatgtga 3900 gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 3960 aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 4020 ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 4080 gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 4140 ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 4200 ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 4260 cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 4320 attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 4380 ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 4440 aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 4500 gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 4560 tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 4620 ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 4680 taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 4740 atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcat ttaaatttcc gaactctcca 4800 aggccctcgt cggaaaatct tcaaaccttt cgtccgatcc atcttgcagg ctacctctcg 4860 aacgaactat cgcaagtctc ttggccggcc ttgcgccttg gctattgctt ggcagcgcct 4920 atcgccaggt attactccaa tcccgaatat ccgagatcgg gatcacccga gagaagttca 4980 acctacatcc tcaatcccga tctatccgag atccgaggaa tatcgaaatc ggggcgcgcc 5040 tggtgtaccg agaacgatcc tctcagtgcg agtctcgacg atccatatcg ttgcttggca 5100 gtcagccagt cggaatccag cttgggaccc aggaagtcca atcgtcagat attgtactca 5160 agcctggtca cggcagcgta ccgatctgtt taaacctaga tattgatagt ctgatcggtc 5220 aacgtataat cgagtcctag cttttgcaaa catctatcaa gagacaggat cagcaggagg 5280 ctttcgcatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 5340 ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 5400 gggtgcgcga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 5460 tcgccccgaa gaacgctttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 5520 attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 5580 tgacttggtt gagtattcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 5640 agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 5700 aacgattgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 5760 tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 5820 cacgatgcct gtagcaatgg caacaacctt gcgtaaacta ttaactggcg aactacttac 5880 tctagcttcc cggcaacagt tgatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 5940 tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 6000 tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 6060 tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 6120 aggtgcctca ctgattaagc attggtaacc gattctaggt gcattggcgc agaaaaaaat 6180 gcctgatgcg acgctgcgcg tcttatactc ccacatatgc cagattcagc aacggatacg 6240 gcttccccaa cttgcccact tccatacgtg tcctccttac cagaaattta tccttaagat 6300 cccgaatcgt ttaaactcga ctctggctct atcgaatctc cgtcgtttcg agcttacgcg 6360 aacagccgtg gcgctcattt gctcgtcggg catcgaatct cgtcagctat cgtcagctta 6420 cctttttggc a 6431

Claims (131)

  1. 발현 시스템으로서,
    발현 시, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드(N1)로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터에 작동가능하도록 연계되고, 상기 생물학적 활성은 GCH1의 효소 활성인, 상기 제1 폴리뉴클레오티드;
    발현 시, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 이의 변이체를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드(N2)로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 제2 프로모터에 작동가능하도록 연계되고, 상기 생물학적 활성은 TH의 효소 활성인, 상기 제2 폴리뉴클레오티드;
    및
    발현 시, 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS, EC 4.2.3.12) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드(N3)로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 제3 프로모터에 작동가능하도록 연계되며, 상기 생물학적 활성은 PTPS의 효소 활성인, 상기 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 시스템.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 발현 시스템은,
    적어도 하나의 제1 프로모터에 작동가능하도록 연계된 폴리뉴클레오티드(N')로서, 발현 시, 제1 폴리펩티드(P1)와 제2의 상이한 폴리펩티드(P2)를 인코딩하는, 상기 폴리뉴클레오티드(N');
    및
    적어도 하나의 제2 프로모터에 작동가능하도록 연계된 제2 폴리뉴클레오티드(N")로서, 발현 시, 제3 폴리펩티드(P3)를 인코딩하는, 상기 제2 폴리뉴클레오티드(N")를 포함하되;
    P1, P2 및 P3은 상이하고, 그리고
    P1, P2 및 P3은 GCH1, TH 및 PTPS 폴리펩티드, 또는 이들의 생물학적 활성 단편 또는 변이체로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는, 발현 시스템.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 프로모터는 2개의 프로모터인, 발현 시스템.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 2개의 프로모터는 동일한, 발현 시스템.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 2개의 프로모터는 상이한, 발현 시스템.
  6. 청구항 2에 있어서, P1 및 P2를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 더 포함하는, 발현 시스템.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 제1 프로모터에 작동가능하도록 연계된 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하되,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드는, 발현 시,
    제1 폴리펩티드,
    제2 폴리펩티드, 및
    제3 폴리펩티드를 인코딩하고,
    상기 제1 폴리펩티드, 상기 제2 폴리펩티드 및 상기 제3 폴리펩티드는 GCH1 폴리펩티드, TH 폴리펩티드 및 PTPS 폴리펩티드, 또는 이들의 생물학적 활성 단편 또는 변이체로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는, 발현 시스템.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1) 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 70% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 75% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 80% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 85% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 90% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 95% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 96% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 97% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 98% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 99% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 100% 동일한, 발현 시스템.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티로신 히드록실라제(TH) 폴리펩티드는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13 및 서열 번호: 14로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 70% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 75% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 80% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 85% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 90% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 95% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 96% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 97% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 98% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 99% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 100% 동일한, 발현 시스템.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS)는 서열 번호: 41에 대하여 적어도 70% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 적어도 75% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 적어도 80% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 적어도 85% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 적어도 90% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 적어도 95% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 적어도 96% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 적어도 97% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 적어도 98% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 적어도 99% 동일하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 41에 대하여 100% 동일한, 발현 시스템.
  11. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 70% 동일한, 발현 시스템.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티로신 히드록실라제(TH) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 및 서열 번호: 17로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 대하여 적어도 70% 동일한, 발현 시스템.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 6-피루보일테트라히드로프테린 합성효소(PTPS) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 서열 번호: 41에 대하여 적어도 70% 동일한, 발현 시스템.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편 또는 변이체의 상기 생물학적 활성은 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 40, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 1 1, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 41로 구성된 군에서 선택된 전장의 효소에 상응하는 효소 활성인, 발현 시스템.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 단편은 티로신 히드록실라제의 촉매 도메인(서열 번호: 12) 및/또는(서열 번호: 40)인, 발현 시스템.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 변이체는 돌연변이된 티로신 히드록실라제 폴리펩티드이며, 서열 번호: 7의 잔기 S19, S31, S40 또는 S404중 하나 또는 그 이상이 또 다른 아미노산 잔기로 변경된, 발현 시스템.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 20의 서열을 포함하는, 발현 시스템.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 제2 티로신 히드록실라제(TH) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 인코팅하는 상기 제2 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 23, 24, 25, 26 및 27로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하는, 발현 시스템.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프로모터, 상기 제 2 프로모터 및 상기 제3 프로모터는 상이한 프로모터 서열인, 발현 시스템.
  20. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프로모터, 상기 제2 프로모터 및 상기 제3 프로모터는 동일한 프로모터 서열인, 발현 시스템.
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 포유류 세포에 대해서 선택적인 프로모터인, 발현 시스템.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 간세포, 근육세포 및 근육모세포에 대해서 선택적인 프로모터인, 발현 시스템.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터인, 발현 시스템.
  24. 청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 MCK, 이를 테면, p-MCK1350, 인간 느린 트로포닌 I 유전자 인핸서의 다중 복사체, CAG, CBA, CMV, 인간 UbiC, RSV, EF-1 알파, SV40, Mt1, pGK, H1 및/또는 U3으로 구성된 군에서 선택된 구성적으로 활성인 프로모터인, 발현 시스템.
  25. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터인, 발현 시스템.
  26. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 Tet-On, Tet-Off, Mo-MLV-LTR, Mx1, 프로게스테론, RU486 및/또는 라파마이신-유도성 프로모터로 구성된 군에서 선택된 유도성 프로모터인, 발현 시스템.
  27. 청구항 1 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 LP1, hAPO-HCR 및/또는 hAAT인, 발현 시스템.
  28. 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 근육 세포에 특이적인, 발현 시스템.
  29. 청구항 1 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 다음으로 구성된 군에서 선택된 근육 특이적 프로모터인, 발현 시스템:
    a. CMV 프로모터 및 SPc5-12의 요소를 이용하는 근육 특이적 복합된 또는 이중 프로모터,
    b. SPc5-12 합성 근육 특이적 프로모터,
    c. 근육 특이적 크레아틴 키나제 프로모터 또는 이의 축약된 형태, 이를 테면, dMCK 또는 tMCK 또는 p-MCK1350, 또는 인간 느린 트로포닌 I 유전자 인핸서의 다중 복사체,
    d. CMV 프로모터,
    e. 근육 CAT 프로모터,
    f. 골격근 알파 액틴 448 프로모터,
    g. 상기 a 내지 f 중 어느 하나의 임의의 활성 유사체 또는 단편.
  30. 청구항 1 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시, 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 간 특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계된, 발현 시스템.
  31. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시, 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는데, 이것은 발현 시, GTP-시클로히드롤라제 1(GCH1; EC 3.5.4.16) 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 간 특이적 프로모터에 작동가능하도록 연계된, 발현 시스템.
  32. 청구항 1 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 간 프로모터/인핸서 1(LP1) 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체 및/또는 간-특이적 하이브리드 프로모터(HLP) 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체로 구성된 군에서 선택된 간 특이적 프로모터, 발현 시스템.
  33. 청구항 1 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호: 38(HLP) 및/또는 서열 번호: 39(LP1)로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 70% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 75% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 80% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 85% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 90% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 95% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 96% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 97% 동일한, 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 98% 동일한, 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 99% 동일한, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 38 및/또는 서열 번호: 39로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 대하여 100% 동일한 간 특이적 프로모터인, 발현 시스템.
  34. 청구항 1 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터의 발현 패턴은 전신으로 투여가능한 물질에 의해 조절되는, 발현 시스템.
  35. 청구항 1 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 플라스미드인, 발현 시스템.
  36. 청구항 1 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 네이키드 플라스미드 DNA인, 발현 시스템.
  37. 청구항 1 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 벡터 내에 패키지된 플라스미드 DNA인, 발현 시스템.
  38. 청구항 1 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 벡터인, 발현 시스템.
  39. 청구항 1 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터은 바이러스 벡터인, 발현 시스템.
  40. 청구항 1 내지 39중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 합성 벡터인, 발현 시스템.
  41. 청구항 1 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 코스미드 벡터인, 발현 시스템.
  42. 청구항 1 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 인공 염색체인, 발현 시스템.
  43. 청구항 1 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 방향족 아미노산 데카르복실라제(AADC) 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는, 발현 시스템.
  44. 청구항 1 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 1 내지 40 kb, 예를 들면, 1 내지 30 kb, 이를 테면, 1 내지 20 kb, 예를 들면, 1 내지 15 kb, 이를 테면, 1 내지 10, 예를 들면, 1 내지 8 kb, 이를 테면, 2 내지 7 kb, 예를 들면, 3 내지 6 kb, 이를 테면, 4 내지 5 kb의 패키징 수용력(packaging capacity)을 보유하는, 발현 시스템.
  45. 청구항 1 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 4.5 내지 4.8 kb의 패키징 수용력을 보유하는, 발현 시스템.
  46. 청구항 1 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 통합 및 비-통합 바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택되는, 발현 시스템.
  47. 청구항 1 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 연관된 벡터(AAV), 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택되는, 발현 시스템.
  48. 청구항 1 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 연관된 벡터(AAV), 아데노바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택되는, 발현 시스템.
  49. 청구항 1 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 연관된 벡터(AAV)인, 발현 시스템.
  50. 청구항 1 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터는 자가-상보적 AAV(scAAV) 벡터인, 발현 시스템.
  51. 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 티로신 히드록실라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 자가-상보적 서열인, 발현 시스템.
  52. 청구항 1 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노 연관된 벡터(AAV)는 혈청형 AAV5, AAV1, AAV6 및 AAV2 벡터로 구성된 군에서 선택되는, 발현 시스템.
  53. 청구항 1 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노 연관된 벡터(AAV)는 혈청형 AAV8, AAV5, AAV2, AAV9 및 AAV7 벡터로 구성된 군에서 선택되는, 발현 시스템.
  54. 청구항 1 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, AAV8 벡터의 게놈은 AAV8 캡시드 이외의 AAV 캡시드에 패키지되는, 이를 테면, AAV5, AAV9, AAV7, AAV6, AAV2 또는 AAV1 캡시드에 패키지되는, 발현 시스템.
  55. 청구항 1 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, AAV7 벡터의 게놈은 AAV7 캡시드 이외의 AAV 캡시드에 패키지되는, 이를 테면, AAV8, AAV9, AAV5, AAV6, AAV2 또는 AAV1 캡시드에 패키지되는, 발현 시스템.
  56. 청구항 1 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, AAV6 벡터의 게놈은 AAV6 캡시드 이외의 AAV 캡시드에 패키지되는, 이를 테면, AAV8, AAV9, AAV7, AAV5, AAV2 또는 AAV1 캡시드에 패키지되는, 발현 시스템.
  57. 청구항 1 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, AAV5 벡터의 게놈은 AAV5 캡시드 이외의 AAV 캡시드에 패키지되는, 이를 테면, AAV8, AAV9, AAV7, AAV6, AAV2 또는 AAV1 캡시드에 패키지되는, 발현 시스템.
  58. 청구항 1 내지 57 중 어느 한 항에 있어서, AAV2 벡터의 게놈은 AAV2 캡시드 이외의 AAV 캡시드에 패키지되는, 이를 테면, AAV8, AAV9, AAV7, AAV6, AAV5 또는 AAV1 캡시드에 패키지되는, 발현 시스템.
  59. 청구항 1 내지 58 중 어느 한 항에 있어서, AAV1 벡터의 게놈은 AAV1 캡시드 이외의 AAV 캡시드에 패키지되는, 이를 테면, AAV8, AAV9, AAV7, AAV6, AAV2 또는 AAV5 캡시드에 패키지되는, 발현 시스템.
  60. 청구항 1 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 포유류 세포를 감염, 형질감염 또는 형질도입시킬 수 있는 벡터인, 발현 시스템.
  61. 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 간 세포, 이를 테면, 간세포(hepatocyte)인, 발현 시스템.
  62. 청구항 1 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 근육 세포, 이를 테면, 근세포 또는 근육 세포 전구물질, 이를 테면, 근육모세포인, 발현 시스템.
  63. 청구항 1 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성 단편은 적어도 100개의 연접 아미노산을 포함하고, 선택된 서열에 명시된 임의의 아미노산은 상기 서열 내 아미노산 잔기 중 10개 미만이 변경되도록 상이한 아미노산으로 변경된, 발현 시스템.
  64. 청구항 60에 있어서, 상기 단편의 상기 효소 활성은 전장 효소의 효소 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 전장 효소의 효소 활성의 적어도 20%, 바람직하게는 전장 효소의 효소 활성의 적어도 30%, 바람직하게는 전장 효소의 효소 활성의 적어도 40%, 바람직하게는 전장 효소의 효소 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 전장 효소의 효소 활성의 적어도 60%, 바람직하게는 전장 효소의 효소 활성의 적어도 70%, 바람직하게는 전장 효소의 효소 활성의 적어도 80%, 바람직하게는 전장 효소의 효소 활성의 적어도 95%, 바람직하게는 전장 효소의 효소 활성과 실질적으로 동일한, 발현 시스템.
  65. 청구항 1 내지 64 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36 및 서열 번호: 37을 포함하는 군에서 선택된 벡터인, 발현 시스템.
  66. 청구항 1 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 폴리아데닐화 서열을 더 포함하는 발현 시스템.
  67. 청구항 1 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 폴리아데닐화 서열은 SV40 폴리아데닐화 서열인, 발현 시스템.
  68. 청구항 1 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SV40 폴리아데닐화 서열 또는 서열들은 서열 번호: 21 및 서열 번호: 22로 구성된 군에서 선택된 서열을 보유하는, 발현 시스템.
  69. 청구항 1 내지 68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 서열은 상기 TH 및/또는 GCH-1를 인코딩하는 핵산 서열의 3' 단부에 작동가능하도록 연계된, 발현 시스템.
  70. 청구항 1 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, 전사-후 조절 요소를 더 포함하는 발현 시스템.
  71. 청구항 1 내지 70 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사-후 조절 요소는 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)인, 발현 시스템.
  72. 청구항 1 내지 71 중 어느 한 항에 있어서, 상기 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소는 서열 번호: 28 또는 서열 번호: 29의 서열을 포함하는, 발현 시스템.
  73. 청구항 1 내지 72 중 어느 한 항에 있어서, 인트론을 더 포함하는 발현 시스템.
  74. 청구항 1 내지 73 중 어느 한 항에 있어서, 인트론을 더 포함하되, 상기 인트론은 TH 및/또는 GCH-1 전사체의 5' 단부에 작동가능하도록 연계된, 발현 시스템
  75. 청구항 1 내지 74 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비율은 청구항 1 내지 74 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템으로 형질감염된 또는 형질도입된 시료 숙주 로부터의 시료 내 발현된 TH 및 GCH1 효소의 활성을 측정함으로써 결정되는, 발현 시스템.
  76. 청구항 1 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH:GCH1 비율은 청구항 1 내지 75 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템으로 형질감염된 또는 형질도입된 시료 숙주로부터의 시료 내 테트라히드로비오프테린(BH4)의 양을 측정함으로써 결정되는, 발현 시스템.
  77. 청구항 1 내지 76 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH:GCH1 비율은 청구항 1 내지 76 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템으로 형질감염된 또는 형질도입된 시료 숙주로부터의 시료 내 전사된 mRNA의 양에 의해 결정되는, 발현 시스템.
  78. 청구항 1 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TH:GCH1 비율은 청구항 1 내지 77 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템으로 형질감염된 또는 형질도입된 시료 숙주로부터의 시료 내 발현된 단백질의 양에 의해 결정되는, 발현 시스템.
  79. 청구항 1 내지 78 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 최소한의 통합 발현 시스템인, 발현 시스템.
  80. 청구항 1 내지 79 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 포유류 세포, 이를 테면, 근육 세포, 이를 테면, 근세포 또는 근육 세포 전구물질 이를 테면, 근육모세포를 감염, 형질감염 또는 형질도입시킬 수 있는 벡터인, 발현 시스템.
  81. 청구항 1 내지 80 중 어느 한 항에 있어서, 제4 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, 발현 시스템.
  82. 청구항 1 내지 81 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 폴리뉴클레오티드는, 발현 시, TH, GCH1 또는 PTPS를 인코딩하는 폴리펩티드들 중 적어도 하나의 발현을 보고할 수 있는 리포터(reporter)를 인코딩하는, 발현 시스템.
  83. 청구항 1 내지 82 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터는 형광 단백질, 이를 테면, GFP 또는 eGFP인, 발현 시스템.
  84. 청구항 1 내지 83 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 폴리뉴클레오티드는, 발현 시, 운반 단백질, 이를 테면, 소포 모노아민 운반체(VMAT)를 인코딩하는, 발현 시스템.
  85. 청구항 1 내지 84 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 폴리뉴클레오티드는, 발현 시, VMAT 억제제를 인코딩하는, 발현 시스템.
  86. 청구항 1 내지 85 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템에 의해 형질도입된 또는 형질감염된 단리된 숙주 세포.
  87. 청구항 1 내지 86 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 단리된 숙주 세포.
  88. 청구항 1 내지 87 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 단리된 숙주 세포.
  89. 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 영장류 세포인, 단리된 숙주 세포.
  90. 청구항 1 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인, 단리된 숙주 세포.
  91. 청구항 1 내지 90 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 간세포, 근육세포 및 근육모세포로 구성된 군에서 선택된, 단리된 숙주 세포.
  92. 청구항 1 내지 91 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 발현 시스템 또는 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물.
  93. 의학 용도를 위한, 청구항 1 내지 92 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  94. 카테콜아민 기능장애와 연관된 질환의 치료 방법에 이용을 위한 청구항 1 내지 93 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물로서, 상기 발현 시스템은 말초에 투여되는, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  95. 청구항 1 내지 94 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이용은 혈중 치료적으로 유효한 농도의 L-DOPA를 획득하고/획득하거나 유지하는 것을 포함하는, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  96. 혈중 치료적으로 유효한 농도의 L-DOPA를 유지시키는 방법에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 95 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물로서, 상기 방법은 상기 발현 시스템을 이를 필요로 하는 사람에게 말초 투여하는 것을 포함하는, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  97. 청구항 1 내지 96중 어느 한 항에 있어서, 치료적으로 유효한 농도의 L-DOPA의 전신 투여로 상기 발현 시스템 또는 상기 숙주 세포의 상기 투여를 보충하는 것을 더 포함하는, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  98. 청구항 1 내지 97 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 유효량의 테트라히드로비오테린(BH4) 또는 이의 유사체를 투여하는 것을 더 포함하는, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  99. 청구항 1 내지 98 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 유효량의 테트라히드로비오테린(BH4) 유사체를 투여하는 것을 더 포함하되, 상기 유사체는 사프로프테린인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  100. 청구항 1 내지 99 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 유효량의 말초 데카르복실라제 억제제를 투여하는 것을 더 포함하는, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  101. 청구항 1 내지 100 중 어느 한 항에 있어서, 벤세라진 및 카르비도파로 구성된 군에서 선택된 치료적 유효량의 말초 데카르복실라제 억제제를 투여하는 것을 더 포함하는, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  102. 청구항 1 내지 101 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 유효량의 카테콜-O-메틸전이효소(COMT) 억제제를 투여하는 것을 더 포함하는, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  103. 청구항 1 내지 102 중 어느 한 항에 있어서, 톨카폰, 엔타카폰 및 니테카폰으로 구성된 군에서 선택된 치료적 유효량의 카테콜-O-메틸전이효소(COMT) 억제제를 투여하는 것을 더 포함하는, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  104. 청구항 1 내지 103 중 어느 한 항에 있어서, BH4, 데카르복실라제 억제제 및/또는 COMT-억제제 및 이들의 유사체의 상기 투여는 전신 투여에 의한 것인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  105. 청구항 1 내지 104 중 어느 한 항에 있어서, BH4, 데카르복실라제 억제제 및/또는 COMT-억제제 및 이들의 유사체의 상기 투여는 장내 또는 비경구 투여에 의한 것인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  106. 청구항 1 내지 105 중 어느 한 항에 있어서, BH4, 데카르복실라제 억제제 및/또는 COMT-억제제 및 이들의 유사체의 상기 투여는 경구, 정맥 또는 근육내 투여에 의한 것인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  107. 청구항 1 내지 106 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템의 말초 투여는 CNS 외부의 비경구 투여인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  108. 청구항 1 내지 107 중 어느 한 항에 있어서, BH4, 데카르복실라제 억제제 및/또는 COMT-억제제 및 이들의 유사체의 상기 투여는 분리 사지 관류(isolated limb perfusion)에 의한 것인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  109. 청구항 1 내지 108 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템의 말초 투여는 근육내 투여인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  110. 청구항 1 내지 109 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템의 말초 투여는 정맥내 투여인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  111. 청구항 1 내지 110 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템의 정맥내 투여는 간 문맥에서 실시되는, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  112. 청구항 1 내지 111 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템의 말초 투여는 간 내 투여인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  113. 청구항 1 내지 112 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템의 말초 투여는 피하 투여인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  114. 청구항 1 내지 113 중 어느 한 항에 있어서, 카테콜아민 기능장애는 카테콜아민 결핍인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  115. 청구항 1 내지 114 중 어느 한 항에 있어서, 카테콜아민 결핍은 도파민 결핍인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  116. 청구항 1 내지 115 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카테콜아민 기능장애와 연관된 질환은 중추 및/또는 말초 신경계의 질환, 장애 또는 손상인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  117. 청구항 1 내지 116 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중추 및/또는 말초 신경계의 질환, 장애 또는 손상은 신경퇴행성 장애인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  118. 청구항 1 내지 117 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카테콜아민 기능장애의 질환은 기저핵 질환인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  119. 파킨슨병(PD); L-DOPA 유도된 이상운동증(LID)이 포함된 이상운동증; DOPA 반응성 근긴장이상; ADHD; 정신분열증; 우울증; 혈관 파킨슨증; 본태성 진전증; 만성 스트레스; 유전적 도파민 수용체 이상; 만성적 아편(opoid); 코카인; 알코올 또는 마리화나 사용; 부신기능부전; 고혈압; 저혈압; 노르아드레날린 결핍; 외상-후 스트레스 장애; 병적 도박 장애; 치매; 루이체(Lewy body) 치매 및 유전적 티로신 히드록실라제 결핍으로 구성된 군에서 선택된 질환의 치료 방법에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 118 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  120. 파킨슨병, 그리고 비전형적 파킨슨병, 이를 테면, 다발성 위축증, 진행성 핵성 마비, 혈관 또는 동맥경화성 파킨슨병, 약물에 의해 유도된 파키슨증 및 GTP 시클로히드롤라제 1 결핍증 및/또는 도파민 결핍에 의한 임의의 근긴장이상증이 포함된 질환의 치료 방법에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 119 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  121. 청구항 1 내지 120 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 파킨슨병(PD)인, 발현 시스템, 숙주 세포, 또는 약학 조성물.
  122. 환자의 혈중에 치료적으로 유효한 농도의 L-DOPA를 유지시키는 방법에 있어서, 청구항 1 내지 121 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 발현 시스템, 숙주 세포 또는 약학 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  123. L-DOPA 유도된 이상운동증(LID)의 출현을 감소, 지연 및/또는 예방하는 방법에 있어서, 청구항 1 내지 122 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템, 숙주 세포 또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 말초 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  124. 혈중에 치료적으로 유효한 농도의 L-DOPA를 획득하고/획득하거나 유지하는 방법에 있어서, 발현 시스템, 숙주 세포 또는 약학 조성물을 말초 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  125. 혈중에 치료적으로 유효한 농도의 L-DOPA를 획득하고/하거나 유지하는 방법에 있어서, 발현 시, 적어도 하나의 치료적 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 포함된 벡터를 말초 투여하는 것을 포함하되, 상기 적어도 하나의 치료적 폴리펩티드는 티로신 히드록실라제(TH; EC 1.14.16.2) 폴리펩티드, 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체인, 방법.
  126. 카테콜아민 기능장애, 이를 테면, 파킨슨병 또는 L-DOPA 유도된 이상운동증의 치료 또는 예방 방법에 있어서, 청구항 1 내지 125 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 발현 시스템, 숙주 세포 또는 약학 조성물을 말초 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  127. 청구항 126에 있어서, 상기 발현 시스템은 분리된 사지 관류를 통하여 투여되는, 방법.
  128. 청구항 127에 있어서, 상기 분리 사지 관류는 근육 또는 정맥에 상기 발현 시스템을 주사하는 적어도 하나의 단계를 포함하는, 방법.
  129. 청구항 125 내지 128 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템, 숙주 세포 또는 약학 조성물은 근육에 적어도 2회 주사되는, 방법.
  130. 청구항 125 내지 128 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템, 숙주 세포 또는 약학 조성물은 정맥에 적어도 1회 주사되는, 방법.
  131. 청구항 1 내지 130 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템, 숙주 세포 및/또는 약학 조성물, 그리고 사용 지침을 포함하는 키트.
KR1020187003356A 2015-08-03 2016-08-01 L-dopa의 전신 합성 및 조절 KR20180034467A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562200151P 2015-08-03 2015-08-03
US62/200,151 2015-08-03
PCT/EP2016/068315 WO2017021359A1 (en) 2015-08-03 2016-08-01 Systemic synthesis and regulation of l-dopa

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180034467A true KR20180034467A (ko) 2018-04-04

Family

ID=56682101

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187003356A KR20180034467A (ko) 2015-08-03 2016-08-01 L-dopa의 전신 합성 및 조절

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20190032079A1 (ko)
EP (1) EP3331570A1 (ko)
JP (1) JP2018522595A (ko)
KR (1) KR20180034467A (ko)
CN (1) CN108136048A (ko)
CA (1) CA2992511A1 (ko)
RU (1) RU2018104098A (ko)
WO (1) WO2017021359A1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201420139D0 (en) 2014-11-12 2014-12-24 Ucl Business Plc Factor IX gene therapy
EP3810647A4 (en) * 2018-04-26 2022-08-17 The University of North Carolina at Chapel Hill METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF HEMOPHILIA
EP3830293A4 (en) * 2018-07-27 2022-05-04 The Regents of the University of California BIOMARKER FOR THORACIC AORTIC ANEURYSM
US10842885B2 (en) 2018-08-20 2020-11-24 Ucl Business Ltd Factor IX encoding nucleotides
CN113874513A (zh) * 2019-03-13 2021-12-31 世代生物公司 非病毒dna载体及其用于表达fviii治疗剂的用途
GB2587319A (en) * 2019-08-12 2021-03-31 Healing Genes Llc Genetic construct
EP4181937A1 (en) * 2020-07-15 2023-05-24 Danmarks Tekniske Universitet Therapeutic microbes
GB2601752A (en) * 2020-12-08 2022-06-15 Maavrx Ltd Expression vector
CA3226119A1 (en) * 2021-08-04 2023-02-09 Giuseppe RONZITTI Hybrid promoters for gene expression in muscles and in the cns
WO2023049874A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Duke University Compositions for and methods of treating and/or preventing glutaric aciduria type-i

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
IL79289A (en) 1985-07-05 1992-01-15 Whitehead Biomedical Inst Introduction and expression of foreign genetic material into keratinocytes using a recombinant retrovirus
WO1989002468A1 (en) 1987-09-11 1989-03-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Transduced fibroblasts and uses therefor
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5677158A (en) 1995-06-07 1997-10-14 Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US6451306B1 (en) 1998-04-15 2002-09-17 The Regents Of The University Of California Methods for therapy of neurodegenerative disease of the brain
ES2324540T3 (es) 1998-05-27 2009-08-10 Genzyme Corporation Vectores aav para la fabricacion de medicamentos para la administracion potenciada por conveccion.
GB0024550D0 (ko) * 2000-10-06 2000-11-22 Oxford Biomedica Ltd
KR100456062B1 (ko) * 2001-06-18 2004-11-08 박영식 재조합 대장균에 의한 테리딘 화합물의 제조방법
CA2779437A1 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 Genepod Therapeutics Ab Novel viral vector construct for neuron specific continuous dopa synthesis in vivo
GB201118636D0 (en) * 2011-10-28 2011-12-07 Oxford Biomedica Ltd Nucleotide sequence

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018522595A (ja) 2018-08-16
RU2018104098A3 (ko) 2020-08-10
EP3331570A1 (en) 2018-06-13
WO2017021359A1 (en) 2017-02-09
CN108136048A (zh) 2018-06-08
US20190032079A1 (en) 2019-01-31
RU2018104098A (ru) 2019-09-06
CA2992511A1 (en) 2017-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20180034467A (ko) L-dopa의 전신 합성 및 조절
CN111344395B (zh) 产生经修饰的自然杀伤细胞的方法及使用方法
AU774643B2 (en) Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids
CN108753824B (zh) 用于治疗视网膜营养不良的病毒载体
KR20200064129A (ko) 트랜스제닉 선택 방법 및 조성물
KR20180097631A (ko) 핵산을 와우 및 전정 세포에 전달하기 위한 물질 및 방법
JP2023036921A (ja) 蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための物質および方法
CN112218882A (zh) Foxp3在经编辑的cd34+细胞中的表达
AU2016343979A1 (en) Delivery of central nervous system targeting polynucleotides
KR102628872B1 (ko) 세포의 증식을 제어하기 위해 세포 분열 좌위를 사용하기 위한 도구 및 방법
KR20220097875A (ko) 게놈 통합을 위한 방법 및 조성물
KR20210005179A (ko) 헤모글로빈-관련 돌연변이를 편집하기 위한 상동성-지정 복구 주형 설계 및 전달
KR20180016722A (ko) 재조합 glut1 아데노-관련 바이러스 벡터 작제물 및 glut1 발현을 회복하기 위한 관련된 방법
KR20010024296A (ko) 벡터 구조체와 세포 ｄｎａ의 비상동 재조합법에 의한내생 유전자 발현
AU2016364229A1 (en) Means and methods for preparing engineered proteins by genetic code expansion in insect cells
CN109451729B (zh) 工程化病毒载体减少了炎症和免疫反应的诱导
AU2016302335A1 (en) GLP-1 and use thereof in compositions for treating metabolic diseases
CN112262214A (zh) 病毒载体及包装细胞系
AU2024204421A1 (en) Therapeutic genome editing in Wiskott-Aldrich syndrome and X-linked thrombocytopenia
KR20240022575A (ko) 아머링된 키메라 수용체 및 이의 사용 방법
CN115298307A (zh) 核酸调节元件的新组合及其方法和用途
CN115768890A (zh) 通过分子和物理启动对t细胞免疫疗法的热控制
KR20210151785A (ko) 비바이러스성 dna 벡터 및 fviii 치료제 발현을 위한 이의 용도
KR20220023962A (ko) 파브리병을 치료하기 위한 조성물, 디바이스 및 방법
KR20220041214A (ko) Il-1 수퍼패밀리의 사이토카인의 시공적 제한 활성으로 무장된 면역반응성 세포