KR20180128781A - 콜라비론의 제조방법 - Google Patents

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KR20180128781A
KR20180128781A KR1020170064318A KR20170064318A KR20180128781A KR 20180128781 A KR20180128781 A KR 20180128781A KR 1020170064318 A KR1020170064318 A KR 1020170064318A KR 20170064318 A KR20170064318 A KR 20170064318A KR 20180128781 A KR20180128781 A KR 20180128781A
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Abstract

본 발명은 가르시니아 콜라로부터 물과 에탄올 이외의 다른 유기용매를 사용하지 않고, 단시간 내에 경제적이고 효율적으로 고순도의 콜라비론을 추출하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법으로 제조된 고순도의 콜라비론은 다양한 건강기능식품, 약학적 조성물 등으로 활용 가능하다는 장점이 있다.

Description

콜라비론의 제조방법{A method for manufacturing kolaviron}
본 발명은 가르시니아 콜라 열매로부터 순수한 콜라비론 성분을 추출하는 제조방법과 이렇게 추출한 콜라비론의 약학적 효과에 대한 것이다.
아프리카에서 자생하는 식물인 가르시니아 콜라(Garcinia Kola)는 Clusiaceae 또는 Guttiferae 과(Family)에 속하는 꽃 나무이다. 이 나무는 카메룬, 베냉, 콩고, 코트디부아르, 가봉, 나이지리아, 라이베리아, 가나, 세네갈, 시에라리온 등의 습한 저지대에서 자연 서식한다. 이 식물의 열매는 전통적으로 아프리카인들에게 기침과 발열의 질병을 치료하는 민간요법에서부터 간, 콩팥, 대장 등에 유익한 역할을 한다고 전해진다. Gegenbaurs morphol. Jahrb. Leipzig 136 (1990) p95~101에서 Victor B. Braide 등은 가르시니아 콜라 열매가 쥐의 간, 콩팥, 대장에 미치는 영향을 실험하여 보고하였고, Pharmacological Research Vol42 (2000) p75에서 Olatunde Farombi는 사염화탄소에 대한 쥐의 독성을 완화시키는 효과로의 가르시니아 콜라 속의 콜라비론의 효과를 개시하고 있다.
가르시니아 콜라 열매에는 조지방 약 7.8%, 조단백 약 5.9%이 포함되어 있으며, 건조 열매 파우더 100g 당 다음과 같은 미네랄 성분(K, 약 50g; Ca, 약 10g; Mg, 약 17g; N, 약 125g; P, 약 72g), 및 당 성분(약 18.1g), 아스코르브산(약 13g) 등이 함유되어 있다. 이외에 GB-1 (Garcinia biflavonoid 1, 가르시니아 바이플라보노이드 1) (II-3-4'-11-4~'-1-5-11-5-1-7-11-7-heptahydroxy-3,8"-biflavone), GB-2 (Garcinia biflavonoid 2, 가르시니아 바이플라보노이드 2) (11-3-11-3'-1-4'-11-4~'-1-5-11-5-1-7-11-7-octahydroxy-3,8"-biflavone), 및 Kolaflavone [garcinianin] (Tr-3-11-3'-I1-4"-1-5-TI-5-I-7-I1-7-heptahydroxy-3, P-biflavone)과 binaringenin 혼합물인 콜라비론(하기 화학식 참고)이 소량 포함되어 있는 것으로 알려져 있다(O.R.Ayepola et al. Phytomedicine 21, 2014). 가르시니아 콜라 열매는 천연 콜라비론을 얻을 수 있는 몇 안되는 원천에 해당한다.
Figure pat00001
Pharmacological Research Vol42 (2000) p75에 의하면 두 가지 방법으로 가르시니아 콜라를 의약품 소재로 사용하고 있다.
첫째, 가르시니아 콜라 열매를 건조시킨 뒤, 분쇄하여 그대로 섭취하는 방법이다(Victor B.Braide, Gegenbaurs morphol. Jahrb. Leipzig 136 (1990) p95~101).
둘째, 가르시니아 콜라 열매를 건조 분쇄 후, Petroleum ether (bp 40-60도)를 이용한 Soxhlet으로 지방 성분을 빼내는 작업을 24시간 동안 수행하고, 건조한 다음 아세톤으로 콜라비론(Kolaviron)을 추출한다. 그 다음 농축시키고, 물로 희석한 다음 에틸 아세테이트(Ethyl acetate)로 추출하고, 이후 수분을 제거하고 용매를 모두 날려보내고 진공 건조하여 Kolaviron을 얻는 방법이다(Olatunde Farombi, Pharmacological Research Vol42 (2000) p75).
이 중 첫 번째 방법은 매우 단순하기는 하지만 열매에 남겨진 섬유질과 탄수화물 성분이 너무 많고, 상대적으로 콜라비론 함량이 낮기 때문에 매우 많은 양을 섭취해야 한다는 단점이 있다. 또한 열대 기후인 아프리카에서 자생하는 식물의 특성 상 건조된 열매에서 많은 양의 박테리아와 곰팡이 등의 미생물이 검출된다는 사실이 이 공정을 통한 제품의 신뢰를 떨어지게 만들고 있다.
두번째 방법은 비교적 순수한 콜라비론을 얻게 되지만 공정이 복잡하고 시간과 비용이 많이 소요된다는 단점이 있다. 또한 추출 용매로 아세톤과 에틸아세테이트를 사용하기 때문에 식품 등으로 적용할 수 없다는 점도 문제시 된다.
상기 두 가지 방법 이외에 좀더 비용을 절약하고, 빠르게 공정을 완성하며, 물과 에탄올 이외의 다른 유기용매를 사용하지 않음으로써 건강 기능 식품의 원료로 활용할 수 있는 콜라비론 제조 공정을 완성하며, 나아가 이렇게 제조한 콜라비론의 약학적 특성을 확인하는 것이 본 발명이 속한 분야에서 절실히 요구되고 있다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 유기용매, 특히 독성이 커서 문제되는 유기용매의 사용을 최소화하고, 경제적이면서 고효율로 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (S1) 가르시니아 콜라 열매에 에탄올을 첨가해 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및 (S2) 에탄올 추출물에 대해 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 (S2) 단계는 다음의 단계에 따라 순차적으로 진행하는 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법을 제공한다.
즉, 상기 (S2) 단계는
(S2-1)에탄올 추출물을 흡착 수지 컬럼에 가하여 흡착시키는 단계;
(S2-2)상기 흡착 수지 컬럼에 물을 통과시켜 비흡착 성분을 세정하는 단계; 및
(S2-3)상기 흡착 수지 컬럼에 에탄올을 가하여 용출물을 획득하는 단계를 포함한다.
또한, 바람직하게 본 발명은 상기 흡착 수지로 폴리스티렌(polystyrene)과 디비닐벤젠(divinylbenzene)의 중합된 역상(reversed phase)의 흡착제를 사용하는 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법을 제공한다. 더 바람직하게, 상기 흡착 수지는 다이아이온 HP-20인 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 (S2) 단계의 에탄올은 80 ~ 98% (v/v)의 에탄올인 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, (S1) 단계의 에탄올은 80 ~ 95%(v/v)의 에탄올인 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, (S2) 단계의 에탄올 추출물은 여과하고 물로 희석하는 단계를 거친 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 콜라비론은
순도가 95% 이상인, 바람직하게는 97% 이상인 콜라비론; 또는
가르시니아 바이클라보노이드 2 (C30H22O12), 가르시니아 바이플라보노이드 1(C30H22O11), 콜라플라바논(C31H24O12) 및 바이나린제닌(C30H22O10)을 포함하는 콜라비론인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상술한 방법에 따라 제조된,
순도가 95% 이상인, 바람직하게는 97% 이상인 콜라비론; 또는
가르시니아 바이클라보노이드 2 (C30H22O12), 가르시니아 바이플라보노이드 1(C30H22O11), 콜라플라바논(C31H24O12) 및 바이나린제닌(C30H22O10)을 포함하는 콜라비론을 함유하는 건강기능식품을 제공한다.
.
또한, 본 발명은 상술한 방법에 따라 제조된
순도가 95% 이상인, 바람직하게는 97% 이상인 콜라비론; 또는
가르시니아 바이클라보노이드 2 (C30H22O12), 가르시니아 바이플라보노이드 1(C30H22O11), 콜라플라바논(C31H24O12) 및 바이나린제닌(C30H22O10)을 포함하는 콜라비론을 유효성분으로 함유하는 관절염 치료, 예방 또는 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 (S1) 가르시니아 콜라 열매에 에탄올을 첨가해 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및 (S2) 에탄올 추출물에 대해 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, (a) 가르시니아 콜라 열매를 분쇄하는 단계; (b) 건조하는 단계; (c) 에탄올로 추출하는 단계; (d) 추출물 필터단계; (e) 물을 혼합하는 단계; (f) HP-20 수지 컬럼에 (e)의 결과물을 투입하는 단계; (g) HP-20 수지 컬럼에 과량의 물로 세정하는 단계; (h) HP-20 수지 컬럼에 에탄올로 콜라비론을 꺼내는 단계; (i) 꺼낸 에탄올 용액을 회전 농축기로 농축 단계; (j) 농축액을 진공 건조하는 단계; 및 (k) 건조된 콜라비론을 분쇄하여 완성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라비론을 제조하는 방법에 관한 것이다.
(S1) 단계
가르시니아 콜라(Garcinia Kola) 열매는 이의 산지, 수확시기, 품종 등에 제한을 두지 않는다. 본 발명에 따른 방법에 이용하기 위해 가장 바람직한 가르시니아 콜라의 부위는 열매이나, 다른 부분도 일부 혼입될 수 있다.
가르시니아 콜라 열매는 분쇄 및/또는 건조 후 추출하는 공정에 투입될 수 있다. 분쇄는 당업계 공지된 다양한 방법에 따라 실시하며, 이에 제한되지 않지만 500메쉬(mesh) 이상, 바람직하게 5 ~ 100메쉬(mesh)를 통과할 정도의 크기로 분쇄할 수 있다. 건조는 당업계 공지된 다양한 방법에 따라 실시하며, 예를 들어 50~80℃ 사이의 온도에서 실시할 수 있으나, 열매에 포함된 습기를 제거하되 그 외 성분이 변화하지 않는 온도 범위 내에서 적절히 실시할 수 있으며, 상기 온도 범위에 제한되지 않는다. 분쇄 및 건조는 동시에 이뤄질 수도 있고, 이시에 이뤄질 수도 있으며, 두 공정의 순서에 제한을 두지 않는다.
가르시니아 콜라 열매의 에탄올 추출물을 얻기 위해, 가르시니아 콜라 열매에 에탄올을 첨가하고 유효성분이 추출될 수 있을 정도로 충분히 교반한다. 상기 에탄올은 바람직하게 80 ~ 95%(v/v)의 에탄올일 수 있다. 또한, 구체적 실시예에 따르면, 1 ~ 2 시간 정도 교반할 수 있으나, 이는 가르시니아 콜라 열매의 양에 따라 적절히 조절할 수 있다.
(S2) 단계
에탄올 추출물에 대해 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행한다.
에탄올 추출물은 여과 및/또는 희석 후 소수성 상호작용 크로마토그래피 공정에 투입될 수 있다. 상기 여과 및 희석은 당업계 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있고, 희석용매는 바람직하게 물을 사용할 수 있다.
소수성 상호작용 크로마코그래피는 다음의 방법에 따라 실시할 수 있다:
- 에탄올 추출물을 흡착 수지 컬럼에 가하여 흡착시키는 단계;
- 상기 흡착 수지 컬럼에 물을 통과시켜 비흡착 성분을 세정하는 단계; 및
- 상기 흡착 수지 컬럼에 에탄올을 가하여 용출물을 획득하는 단계.
콜라비론이 흡착 수지와 결합할 수 있는 조건 하에서 에탄올 추출물을 흡착 수지 컬럼에 가하여 흡착 수지에 접촉시킨다. 선택적으로, 증가된 농도의 비극성 용매를 흡착 수지 컬럼에 가하여, 콜라비론 흡착 수지의 물 함량을 감소시킨다. 상기 흡착 수지 컬럼에 남아있는 비흡착 성분이 해리되는 조건 하에서 극성 용매, 바람직하게 물(보다 바람직하게, 흡착 수지의 부피 대비 5 ~ 10배)을 이용해, 컬럼을 세정하여 불순물과 비결합 상태의 콜라비론을 제거한다. 마지막으로, 콜라비론이 흡착 수지로부터 해리되는 조건 하에서 극성 용매, 바람직하게 알코올, 보다 바람직하게 80 ~ 98% (v/v) 에탄올을 가하여 용출물을 획득한다.
상기 흡착 수지로 바람직하게 폴리스티렌(polystyrene)과 디비닐벤젠(divinylbenzene)의 중합된 역상(reversed phase)의 흡착제를 사용할 수 있으며, 예컨대, 다이아이온 HP-20, Amberlite XAD-2, Bio-beads SM-2 등이 포함될 수 있다.
제조된 콜라비론
본 발명에 따라 제조된 콜라비론은 가르시니아 콜라에서 유래된 또는 이로부터 유도된, 콜라비론 외의 성분들(이하, 불순물이라 칭함)은 최소화된 고순도의 콜라비론이다.
바람직하게, 본 발명에 따라 제조된 콜라비론은 다음 중 어느 하나의 콜라비론일 수 있다:
순도가 95% 이상인, 바람직하게는 97% 이상인 콜라비론; 또는
가르시니아 바이클라보노이드 2 (C30H22O12), 가르시니아 바이플라보노이드 1(C30H22O11), 콜라플라바논(C31H24O12) 및 바이나린제닌(C30H22O10)을 포함하는 콜라비론.
제조된 콜라비론의 활용
본 발명에 따라 제조된 콜라비론은 다양한 방법으로 활용될 수 있다. 예컨대, 건강기능식품, 식품 조성물, 화장료 조성물, 약학 조성물 등에 포함될 수 있다.
특히, 본 발명에 따라 제조된 콜라비론은 콜라비론의 함량이 높고 그 외 불순물의 함량이 낮을 뿐만 아니라, 추출용매로 물 및 알코올 외 유기용매를 사용하지 않았으므로 인체에 무해하다는 장점이 있다.
일 예로, 본 발명에 따라 제조된 콜라비론을 함유하는 건강기능식품을 제공할 수 있다. 상기 건강기능식품은 당업계 공지된 콜라비론의 식품학적, 약리학적 효과에 기초한다.
또 다른 예로, 본 발명에 따라 제조된 콜라비론을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 당업계 공지된 콜라비론의 약리학적 효과에 기초한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 관절염 치료, 예방 또는 개선용으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 콜라비론을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한"이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
상기 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀루로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 포함될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 유효한 양"이란, 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 관절염의 개선, 예방 및/또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들어, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 가지 경로가 포함될 수 있다. 경구 투여를 포함하는 경우, 당해 조성물은 정제, 캅셀제, 카쉐제, 젤캅제(gelcap), 액제, 현탁제 등의 형태로 경구 제형화될 수 있다. 정제 또는 캅셀제는 결합제(예를 들면, 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈, 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제(예를 들면, 락토스, 미세결정성 셀룰로스, 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들면, 스테아르산마그네슘, 활석 또는 실리카); 붕해제(예를 들면, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트)와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 통상의 수단으로 제조할 수 있다. 정제는 당해 분야에 잘 공지된 방법으로 피복시킬 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 액제, 시럽제 또는 현탁제의 형태를 취할 수 있으나, 이에 한정되지 않거나, 이들은 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클과 구성하기 위한 무수 생성물로서 존재할 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁화제(예를 들면, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체, 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예를 들면, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예를 들면, 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올, 또는 분획화된 야채 오일); 및 방부제(예를 들면, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)과 같은 약제학적으로 허용되는 첨가제와 함께 통상적인 수단으로 제조할 수 있다. 당해 제제는 또한 경우에 따라 완충제 염, 풍미제, 착색제, 및 감미제를 함유할 수 있다. 경구 투여용 제제는 관절염을 치료하기 위해 본 발명에서 유용한 결합 단백질(들)의 서방출, 제어 방출, 또는 지속된 방출을 위해 적합하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물은 관절염의 개선, 예방 및/또는 치료 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 식품학적으로 유효한 양의 콜라비론을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 식품학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강기능식품(health feed) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 천연 소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 다라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 콜라비론은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 복합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 콜라비론을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물에는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명에 따르면, 가르시니아 콜라로부터 물과 에탄올 이외의 다른 유기용매를 사용하지 않고, 단시간 내에 경제적이고 효율적으로 고순도의 콜라비론을 추출할 수 있고, 이러한 방법으로 제조된 고순도의 콜라비론은 다양한 건강기능식품, 약학적 조성물 등 인간의 섭식 가능한 원료로서 활용 가능하다.
도 1은 본 발명에 따라 가르시니아 콜라로부터 고순도의 콜라비론을 제조하는 방법의 일 실시예를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따라 가르시니아 콜라로부터 추출된 고순도의 콜라비론의 HPLC 그래프를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 고순도의 콜라비론 함유 가르시니아 콜라 추출물의 관절염 치료 효과를 도시한 것이다. X축: RANKL SHL(ug/ml), Y축: TRAP activity(%)
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 가르시니아 콜라로부터 콜라비론의 추출
단단한 가르시니아 콜라(Garcinia Kola) 열매를 5~100 메쉬를 통과할 정도의 크기로 분쇄한 후, 50~80℃ 온도에서 건조하였다. 건조된 가르시니아 콜라 분쇄물에 약95%(v/v)의 에탄올을 가하고 1~2시간 교반한 후 여과하여 에탄올 추출물을 얻었다. 에탄올 추출물을 교반하면서 물을 혼합하여 콜라비론의 용해도를 낮춘 용액을 HP-20 수지가 채워진 지름 15~20cm, 길이 1m 정도의 컬럼에 투입하여 콜라비론이 HP-20 수지의 다공성 부분에 흡착되어 들어가도록 하였다. HP-20 수지 부피의 약 5~10배의 물을 반복적으로 투여하여, 에탄올과 물에 모두 용해되는 당 전분 잔여 기름 등 원하는 유효성분을 제외한 불순물을 제거하였다. 95%의 에탄올을 컬럼에 투입하여 다공성 부분에 흡착되어 있던 콜라비론을 용출하였다. 용출물을 회전 농축 교반기(Rotary evaporator)로 최대한 농축하여 점성이 높은 상태로 만들어 준 다음, 콜라비론 농축액을 진공 오븐에서 1㎜Hg 이하의 진공으로 40~60℃ 온도로 5~12시간 건조하였다. 완전히 건조된 콜라비론을 분쇄하여 파우더 형태로 최종 제품화하였다.
실시예 2. 콜라비론의 HPLC 분석
실시예 1의 방법에 따라 제조된 콜라비론 샘플과 표준폼("Ayepola et al. BMC Complementary and Alternative Medicine 2013, 13:363"의 제조방법에 따른 콜라비론 시료) 50mg을 에탄올에 녹여 최종 50ml로 표선을 맞추고, HPLC 기기분석 조건은 다음과 같았다:
[기기분석 조건]
컬럼 : Capcellpak C18 4.6*150mm, 5um
이동상 : A-0.1% formic acid in water / B-Acetonitril
Time A solution B solution
0 min 100 0
0~10 min 85 15
10~50 min 60 40
50~60 min 85 15
60~80 min 100 0
Flow rate : 1.0ml/min
Injection volume : 10μl
Oven temp.:30℃
파장 : 295nm
LC-Mass 분석 결과는 표 2에 기재된 바와 같았다.
Peak No. 표준품(LC-MS) 실시예 1 (LC-MS) 성분명
Peak 1 573.1023 572.939 Garcinia biflavonoid 2
Peak 2 557.1074 556.980 Garcinia biflavonoid 1
Peak 3 587.1178 587.124 Kolaflavanone
Peak 4 557.1072 556.980 Garcinia biflavonoid 1
Peak 5 541.1123 541.079 Binaringenin
Peak 6 555.0909 Not Detected Kolaflavone
Reference : Ayepola et al. BMC Complementary and Alternative Medicine 2013
그리고 HPLC분석 결과는 표 3에 기재된 바와 같았다. 하기 표 3의 1차와 2차는 각각 동일한 시기에 수득한 G.kola로부터 표준폼 제조방법("Ayepola et al. BMC Complementary and Alternative Medicine 2013, 13:363"의 제조방법)과 실시예 1의 방법으로 추출하여 만든 시료를 분석한 결과이다. 그리고, 표 3에서 %는 위에서 기술한 HPLC method로 분석하였을 때 나오는 전체 peak의 합을 100%로 계산하였을 때 각 해당 peak의 면적비율을 %로 계산한 값이다.
1차 2차
Peak No. 성분명 표준폼 실시예 1 표준폼 실시예 1
Peak 1 Garcinia biflavonoid 2 25.7% 25.6% 18.3% 19.9%
Peak 2 Garcinia biflavonoid 1 55.7% 55.4% 60.4% 60.2%
Peak 3 Kolaflavanone 5.8% 5.7% 8.3% 7.6%
Peak 4 Garcinia biflavonoid 1 4.3% 4.2% 3.8% 3.9%
Peak 5 Binaringenin 5.6% 5.5% 7.9% 6.5%
Peak 6 Kolaflavone N.D. N.D. N.D. N.D.
계 97.1% 96.4% 98.7% 98.1%
Reference : Ayepola et al. BMC Complementary and Alternative Medicine 2013
상기 표 2 및 3을 통해 알 수 있는 바와 같이, 표준품과 실시예 1을 비교해 본 결과, 표준품의 제조방법에서 확인되는 성분과 실시예 1의 제조방법에서 확인되는 성분 간에 거의 차이가 없으며 유사함을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 정제된 콜라비론의 관절염 치료 효과
실시예 1에 따라 정제된 콜라비론의 관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, 파골세포를 사용하여 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)의 활성 저해 여부를 조사하였다.
파골세포는 관절염 원인과 밀접한 관계가 있고, 타르트레이트(tartrate)에 대해 저항성을 나타내는 산성 포스파타제 (acid phosphatase)인 TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase)을 가지며, 이는 다른 골조직 세포와 구별할 수 있는 파골세포의 세포 화학적 표지효소로 이용된다고 알려져 있다. 따라서, 상기 파골세포의 TRAP의 활성 저해 여부를 통해 관절염 치료 효과를 확인하였다.
# 실험동물사육조건
5주령의 ICR Mouse(중앙실험동물(주), 대한민국)
온도 조건 20~24℃, 습도 조건 50%~55%, 주야 조명 조건 12시간 주기, 물과 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였다.(삼양사료, 대한민국), 상기 조건으로 7일간 사육하여 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
상기 ICR 마우스의 경골(tibia)을 적출하여, 양끝을 절단하고 α-MEM essential medium을 통과시켜 골수세포를 수집하고, 50ng/mL M-CSF(macrophage-colony stimulation factor)를 처리하여 24시간 배양하였다. 미부착 세포를 α-MEM으로 세척한 후 96 well에 5×104 cells/well이 되도록 분주하고, 50 ng/mL의 M-CSF가 첨가된 α-MEM 배지에 3일간 배양하였다. 그 후 50 ng/mL의 MCSF와 100 ng/mL의 RANKL(Receptor Activator for Nuclear Factor κB Ligand)을 함께 처리하고, 시료를 농도별로 처리하여 4일간 배양하였다. 배지를 제거하여 PBS로 세척한 다음 10% formaldehyde로 고정한 cell에 기질용액(1.36 mg/mL 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, 10 mM tartrate, 50 mM citrate buffer pH 4.6)을 100 μL씩 분주하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 효소 반응액을 새로운 plate에 옮기고 0.1N NaOH로 반응을 중지시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 활성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 표시하여 그래프로 나타내었다 (도 3).
그래프에 나타낸 바와 같이, 제조된 콜라비론이 각각 농도 의존적으로 파골세포의 생성 억제 작용을 한다는 것을 확인하였다. 구체적으로, RANKL를 처리하지 않아 분화가 진행되지 않은 대조군에서는 TRAP 활성이 거의 확인되지 않은 반면, RANKL 처리를 통해 분화된 경우 현저하게 높은 TRAP 활성이 확인되었다. 또한, RANKL 처리를 통해 분화시킨 경우에도, 제조된 콜라비론이 처리되는 경우 농도 의존적으로 TRAP 활성을 감소시키는 것이 확인되었고, 특히, 100 μg/ml만 처리한 경우에도 대조군과 거의 유사한 정도로 TRAP 활성을 감소시키는 것으로 확인되어, 상기 결과로부터, 제조된 콜라비론은 우수한 관절염 치료, 예방 또는 개선 효과를 갖는 것으로 확인되었다.

Claims (10)

  1. (S1) 가르시니아 콜라 열매에 에탄올을 첨가해 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및 (S2) 에탄올 추출물에 대해 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (S2) 단계는 다음의 단계에 따라 순차적으로 진행하는 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법:
    (S2-1) 에탄올 추출물을 흡착 수지 컬럼에 가하여 흡착시키는 단계;
    (S2-2) 상기 흡착 수지 컬럼에 물을 통과시켜 비흡착 성분을 세정하는 단계; 및
    (S2-3) 상기 흡착 수지 컬럼에 에탄올을 가하여 용출물을 획득하는 단계.
  3. 제2항에 있어서, 상기 흡착 수지로 폴리스티렌(polystyrene)과 디비닐벤젠(divinylbenzene)의 중합된 역상(reversed phase)의 흡착제를 사용하는 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 흡착 수지는 다이아이온 HP-20인 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 에탄올은 80 ~ 98% (v/v)의 에탄올인 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, (S1) 단계의 에탄올은 80 ~ 95%(v/v)의 에탄올인 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, (S2) 단계의 에탄올 추출물은 여과하고 물로 희석하는 단계를 거친 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 콜라비론은 다음 중 어느 하나의 콜라비론인 것을 특징으로 하는, 가르시니아 콜라 열매로부터 콜라비론을 제조하는 방법:
    순도가 95% 이상인 콜라비론; 또는
    가르시니아 바이클라보노이드 2 (C30H22O12), 가르시니아 바이플라보노이드 1(C30H22O11), 콜라플라바논(C31H24O12) 및 바이나린제닌(C30H22O10)을 포함하는 콜라비론.
  9. 제1항의 방법에 따라 제조된 다음 중 어느 하나의 콜라비론을 함유하는 건강기능식품:
    순도가 95% 이상인 콜라비론; 또는
    가르시니아 바이클라보노이드 2 (C30H22O12), 가르시니아 바이플라보노이드 1(C30H22O11), 콜라플라바논(C31H24O12) 및 바이나린제닌(C30H22O10)을 포함하는 콜라비론.
  10. 제1항의 방법에 따라 제조된 다음 중 어느 하나의 콜라비론을 유효성분으로 함유하는 관절염 치료, 예방 또는 개선용 약학적 조성물:
    순도가 95% 이상인 콜라비론; 또는
    가르시니아 바이클라보노이드 2 (C30H22O12), 가르시니아 바이플라보노이드 1(C30H22O11), 콜라플라바논(C31H24O12) 및 바이나린제닌(C30H22O10)을 포함하는 콜라비론.
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