KR20180123989A - 조절 t 세포에 특이적으로 존재하는 dkk1 단백질 및 그 용도 - Google Patents

조절 t 세포에 특이적으로 존재하는 dkk1 단백질 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 세포 중에서도 특히 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg cell)의 표면에 특이적으로 존재하는 DKK1(Dickkopf-1) 단백질, 이에 특이적인 항체 및 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 DKK1 단백질은 면역 세포, 특히 조절 T 세포의 표면에서 특이적으로 존재하기 때문에, 다양한 면역 관련 질환의 치료제의 새로운 타겟으로 사용될 수 있다.

Description

조절 T 세포에 특이적으로 존재하는 DKK1 단백질 및 그 용도{USE OF DKK1 PROTEIN IN A REGULATORY T CELL}
본 발명은 면역 세포 중에서도 특히 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg cell)의 표면에 특이적으로 존재하는 DKK1(Dickkopf-1) 단백질, 이에 특이적인 항체 및 이들의 용도에 관한 것이다.
면역 세포 중 T 세포는 골수에서 생성되어 흉선에서 성숙하는 면역 세포로, B 세포의 항체 생성을 조정하거나 선천성 면역세포들의 기능을 조정하는 기능을 한다. 상기 T 세포는 T 림프구라고도 하며 다른 면역 세포들의 조력자의 역할을 할 뿐만 아니라, 직접 침입한 물질을 파괴하기도 한다.
면역 세포의 기능 중 가장 중요한 하나는, 면역 세포를 둘러싼 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해선 면역 반응이 억제되는 반면, 자기가 아닌(non-self) 항원 물질에 대해서는 이를 인식하고 면역 반응을 유도하는 것이다. 면역 세포는 발달 과정에서 자기(self)를 인식하는 세포의 사멸이나, 자기 항원에 특이적인 수용체의 돌연변이 유도 또는 자기 항원을 인식하는 면역 세포의 불활성화를 통해 자기 항원에 대한 무반응을 유도하는데, 이를 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다. 이러한 자기 관용에 실패하게 되면 자기 항원에 대한 면역 반응이 유도되어 질환이 초래될 수 있는데, 이를 자가면역질환(autoimmune disease)이라 한다.
상기 자기 관용을 유도하거나 계속 유지함에 있어 1970년대 초 고식적 T 세포(conventional T cells)의 효과 기능(effector function)을 제어할 수 있는 조절 T 세포라는 개념을 도입하였으며(R. K. Gershon and K. Kondo, Immunology, 1970, 18: 723-37) 억제 T 세포의 면역학적 특성 및 기능을 규명하기 위한 연구가 꾸준히 이루어져 왔다.
정상 개체에서 상기 조절 T 세포는 고식적 T 세포의 기능을 제어하여 과도한 면역 반응이나 자기 관용을 유도하지만, 자가면역질환과 만성염증질환에서 조절 T 세포의 기능과 숫자가 현저히 감소 되어있어 조절 T 세포가 제 기능을 적절히 수행하지 못하는 것이 보고되었다. 따라서 자가면역질환과 만성염증질환을 가지는 환자에서 조절 T 세포를 정상적인 수준의 기능과 숫자로 되돌리는 것이 상기 질환의 치료법 중 하나가 될 수 있다.
조절 T 세포를 표적화 할 수 있는 세포 표면 단백질로 CD25, CTLA4, CD38, CD62L, GITR, CD45RB 등이 연구를 통해 제시되었고 동물 및 임상 시험도 진행되어왔지만 조절 T 세포만을 단독으로 표적화할 수 있는 세포 표면 단백질은 현재까지 밝혀지지 않았다.
본 발명의 일 목적은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 존재하는 DKK1(Dickkopf-1) 단백질 또는 이의 항원 결정기를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 존재하는 DKK1 단백질에 특이적인 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 표면에 DKK1 단백질이 발현되는 조절 T 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역 억제제 또는 면역 활성화제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역 관련 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 면역 세포, 특히 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 존재하는 DKK1(Dickkopf-1) 단백질을 발견하고, 상기 단백질의 항원 결정기(epitope)를 선별하였으며, 상기 DKK1 단백질이 발현되는 면역 세포, 특히 조절 T 세포를 선택적으로 선별하여 이를 효과 T 세포(effector T cell)과 공동 배양하는 경우 효과 T 세포의 활성을 억제 시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서 상기 DKK1은 DKK 패밀리 유전자 DKK1, DKK2, DKK3, DKK4 중 하나로, 분비 단백질을 암호화한다. 상기 DKK 단백질은 일반적으로 255에서 350개의 아미노산으로 이루어져 있고, DKK1의 경우 24 KDa에서 29 KDa의 크기를 가지며, N 말단은 당이 결합한 형태(glycosylated)로 존재한다. 본 발명의 일 예시로서, 상기 DKK1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있고, 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다(표 1).
구분 서열정보
dickkopf-1 (DKK-1) 아미노산 서열 MMALGAAGAT RVFVAMVAAA LGGHPLLGVS ATLNSVLNSN AIKNLPPPLG GAAGHPGSAV SAAPGILYPG GNKYQTIDNY QPYPCAEDEE CGTDEYCASP TRGGDAGVQI CLACRKRRKR CMRHAMCCPG NYCKNGICVS SDQNHFRGEI EETITESFGN DHSTLDGYSR RTTLSSKMYH TKGQEGSVCL RSSDCASGLC CARHFWSKIC KPVLKEGQVC TKHRRKGSHG LEIFQRCYCG EGLSCRIQKD HHQASNSSRL HTCQRH(서열번호 1)
dickkopf-1 (DKK-1) mRNA, complete cds (GenBank: AF177394.2) 서열 atgatggctc tgggcgcagc gggagctacc cgggtctttg tcgcgatggt agcggcggct ctcggcggcc accctctgct gggagtgagc gccaccttga actcggttct caattccaac gctatcaaga acctgccccc accgctgggc ggcgctgcgg ggcacccagg ctctgcagtc agcgccgcgc cgggaatcct gtacccgggc gggaataagt accagaccat tgacaactac cagccgtacc cgtgcgcaga ggacgaggag tgcggcactg atgagtactg cgctagtccc acccgcggag gggacgcagg cgtgcaaatc tgtctcgcct gcaggaagcg ccgaaaacgc tgcatgcgtc acgctatgtg ctgccccggg aattactgca aaaatggaat atgtgtgtct tctgatcaaa atcatttccg aggagaaatt gaggaaacca tcactgaaag ctttggtaat gatcatagca ccttggatgg gtattccaga agaaccacct tgtcttcaaa aatgtatcac accaaaggac aagaaggttc tgtttgtctc cggtcatcag actgtgcctc aggattgtgt tgtgctagac acttctggtc caagatctgt aaacctgtcc tgaaagaagg tcaagtgtgt accaagcata ggagaaaagg ctctcatgga ctagaaatat tccagcgttg ttactgtgga gaaggtctgt cttgccggat acagaaagat caccatcaag ccagtaattc ttctaggctt cacacttgtc agagacacta a(서열번호 2)
본 발명에서 상기 DKK1은 세포의 증식 및 상처 회복에 관여하는 Wnt 신호체계에서 Wnt3a와 같은 리간드보다 수용체에 강하게 결합하여 Wnt 신호를 경쟁적으로 억제하여, 배아 발달 과정에서 심장, 머리, 손 등의 발달에 중요한 역할을 할 수 있다. 또한 골수액(bone marrow plasma) 내에 존재하는 분비 단백질 형태의 DKK1이 증가한 것을 통해 다발성 골수종(multiple myeloma) 환자의 용해성 골 병변(osteolytic bone lesion)을 확인할 수 있으며, 암이나 골질환의 정도를 판단하는데 사용될 수 있다.
단, 본 발명에서 상기 DKK1은 일반적인 경우와 같이, 세포 밖으로 분비되지 않고, 면역 세포, 특히 조절 T 세포의 표면에 존재하는 것일 수 있다. 이를 통해 면역 세포가 자기 관용을 위한 조절 T 세포의 기능에 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 서열번호 3으로 표시되는 DKK1의 조절 T 세포 외 표면 단백질을 제공한다(표 2).
구분 서열정보
DKK1 extracellular domain TLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH(서열번호 3)
본 발명에서 제공하는 상기 DKK1의 조절 T 세포 외 표면 단백질은, 효과 T 세포에 존재하는 리간드와 상호 작용을 하여 조절 T 세포의 활성을 저하시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 다르면, 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나로 표시되는, 조절 T 세포의 표면 단백질인 DKK1의 항원 결정기(epitope)를 제공한다(표 3).
구분 서열정보
3S2K chain C Linear epitope RIQKRL(서열번호 4)
3S2K chain C Linear epitope HRRKGSHGLE IF(서열번호 5)
3S2K chain C Linear epitope KGQEGSVCLR SSDCASG(서열번호 6)
3S8V chain X Linear epitope RIQSRL(서열번호 7)
3S8V chain X Linear epitope HRRKGSHGLE IF(서열번호 8)
3S8V chain X Linear epitope GEGL(서열번호 9)
3S8V chain X Linear epitope QEGSVCLRSS DCASG(서열번호 10)
3S8V chain X Linear epitope KEGQ(서열번호 11)
3SOQ chain Z Linear epitope NSNAIKN(서열번호 12)
5FWW chain B Linear epitope RVPGASHIH(서열번호 13)
5FWW chain B Linear epitope GTQNWTALQG GKPCLFWNET FQHPYNTLKY PNGE(서열번호 14)
5FWW chain B Linear epitope KDHGNPPPLT GTSKTSNKL(서열번호 15)
5FWW chain B Linear epitope FSDRINQ(서열번호 16)
5FWW chain B Linear epitope CYVGVYWK(서열번호 17)
5FWW chain B Linear epitope IRDSADMVEL LDGYTHRVLA RFHGRSRPPL SFNVSLDFVI(서열번호 18)
5FWW chain B Linear epitope LGEHNYC(서열번호 19)
5FWW chain B Linear epitope FCGNNPDYWK YGE(서열번호 20)
5FWW chain B Linear epitope SQRFK(서열번호 21)
5FWW chain B Linear epitope ATGRV(서열번호 22)
3S2K chain C Discontinuous epitope HKGSGL(서열번호 23)
3S2K chain C Discontinuous epitope IQL(서열번호 24)
3S2K chain C Discontinuous epitope FWIF(서열번호 25)
3S2K chain C Discontinuous epitope EGQGEGRH(서열번호 26)
3S2K chain C Discontinuous epitope KGQEGSVCLR SDASG(서열번호 27)
3S8V chain X Discontinuous epitope IQSRL(서열번호 28)
3S8V chain X Discontinuous epitope HKGSGL(서열번호 29)
3S8V chain X Discontinuous epitope QGSVCRSD(서열번호 30)
3S8V chain X Discontinuous epitope FWIF(서열번호 31)
3S8V chain X Discontinuous epitope EGQGGLR(서열번호 32)
3S8V chain X Discontinuous epitope ASG(서열번호 33)
5FWW chain B Discontinuous epitope GTQNWTALQG GKPCLFWNET FQHPYNTLKY PNGELGEHNY CPCYVGVYWK C(서열번호 34)
5FWW chain B Discontinuous epitope AMYATGRVRV PGASHIHIRD SADMELDGYT HRVLARHGRS PPLSFNVSLD FVIFSDRINQ AQAVK(서열번호 35)
5FWW chain B Discontinuous epitope KDHGNPPPLT GTSKTSNKLF SQRFKSGYFC GNNPDYWKYG ECFGGDG(서열번호 36)
본 발명에서 상기 "항원 결정기(Epitope)"란, 항원 분자에서 항체와 결합하는 부위로, 항체가 인식할 수 있는 부분을 의미한다. 일반적으로 항체는 항원 분자 전체를 인식하는 것이 아니고, 특정의 부분만을 인식하며, 동일한 항원 분자라고 하여도 항체의 종류가 달라지는 경우 다른 항원 결정기 부분을 인식할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 항원 결정기는 DKK1 단백질의 세포 외부로 노출되어 있는 부분이 일부가 절단되어 세포 외부로 방출(Secretion)된 경우에도, 남아있는 일부의 도메인과 효과적으로 결합할 수 있는 항체의 항원 결정기를 포함한다.
본 발명에서 상기 항원 결정기인 폴리펩티드는 본 발명에 따른 상기 DKK1 단백질에 항체가 결합할 수 있는 부분의 연속 또는 불연속 서열을 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 상기 조절 T 세포의 표면 단백질인 DKK1의 항원 결정기인 폴리펩티드 단편은, 효과 T 세포에 존재하는 리간드와 상호 작용을 하여 조절 T 세포의 활성을 저하시킬 수도 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 서열번호 3으로 표시되는 DKK1의 세포 외 표면 단백질, 또는 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나의 DKK1의 항원 결정기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그럼으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는, 플라스미드가 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주 세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 핵산 분자를 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 다르면, 본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주를 제공한다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩티드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 또는 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩티드(들)로 체내에서 형질주입된 세포가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6(인간 망막 세포)의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 숙주 세포주로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질 또는 상기 DKK1의 항원 결정기를 포함하는 조절 T 세포를 제공한다.
본 발명의 상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질 또는 이의 항원 결정기를 표면에 발현하는 조절 T 세포는 효과 T 세포와 상호 작용을 통해 그 세포 활성을 억제하며, 면역 반응을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질 또는 상기 DKK1의 항원 결정기를 포함하는 조절 T 세포를 유효 성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질을 포함하는 조절 T 세포는 효과 T 세포와 상호 작용을 통해 그 세포 활성을 억제하며, 면역 반응을 억제할 수 있다.
본 발명에서 세포 표면에 DKK1 단백질을 발현하는 조절 T 세포는 과면역 반응에 기인한 면역 관련 질환으로, 예를 들어 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 급성 및 만성염증 질환 등을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기를 유효 성분으로 포함하는, 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기 단편은 효과 T 세포에 존재하는 리간드와 상호 작용을 하여 조절 T 세포의 활성을 억제하여, 면역 관련 질환으로, 예를 들어 암을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 예방, 개선 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으며, 바람직하게는 흑색종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기에 특이적인 항체를 유효 성분으로 포함하는, 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질은 조절 T 세포 표면에 존재하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 항체는 조절 T 세포의 활성을 억제하여 암을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩 되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 항체는 조절 T 세포의 표면에 발현되는 DKK1 단백질 또는 이의 항원 결정기에 특이적으로 결합하여 조절 T 세포의 활성을 억제해 면역 관련 질환으로, 예를 들어 암을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으며, 바람직하게는 흑색종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 항체는 조절 T 세포의 표면에 발현되는 DKK1 단백질 또는 이의 항원 결정기에 특이적으로 결합하여 조절 T 세포의 활성을 증가시킴에 따라 면역 관련 질환으로, 예를 들어 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 급성 및 만성염증 질환 등을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기를 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는, 면역 관련 질환용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)으로서, 생체 내뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질환의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 상기 "siRNA(small interfering RNA)"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. 본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥(WLS mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(WLS mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조 또는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 불일치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 팽창/돌출(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 WLS 유전자의 발현을 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 말단 혹은 점착 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 상기 siRNA분자는 이에 제한되지는 않으나, 전체 길이가 15 내지 30 염기, 바람직하게는 19 내지 21 염기일 수 있다.
본 발명에서 상기 "shRNA(short hairpin RNA)"는 45 내지 70 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서, 타겟유전자 siRNA 염기서열의 센스가닥과 상보적인 안티센스가닥 사이에 3-10개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후, 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스 및 아데노 바이러스에 삽입하여 발현시키면 루프가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 만들어지고 세포내의 다이서(dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다.
본 발명에서 상기 "마이크로 RNA(microRNA)"는 발생, 분화, 증식, 보존 및 아폽토시스 등 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 마이크로 RNA는 일반적으로 타겟 mRNA를 불안정하게 하거나, 번역을 방해함으로써 타겟 mRNA를 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다.
본 발명에서 상기 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예를 들어, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 그의 결합) 역시 당분야에서 공지된 내용으로부터 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA는 조절 T 세포의 표면에 발현되는 DKK1 단백질 또는 이의 항원 결정기를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하여 이들의 발현을 억제해 면역 관련 질환으로, 예를 들어 암을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으며, 바람직하게는 흑색종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA는 조절 T 세포의 표면에 발현되는 DKK1 단백질 또는 이의 항원 결정기를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하여 이들의 발현을 증가시킴에 따라 면역 관련 질환으로, 예를 들어 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 급성 및 만성염증 질환 등을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제 형태로 제조되어 암 또는 면역 질환이 발생된 부위에 직접적으로 주사 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 추가로 다른 항암제와 병용 투여할 수 있으며, 이를 통해서 일반적인 암세포 증식 및 암 전이를 효과적으로 억제하여 암의 치료에 사용될 수 있다.
여기서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 카페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈블라스틴, 이다루비신, 미토마이신, 블레로마이신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 올라파립, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 5FU, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 추가로 다른 면역 억제제와 병용 투여할 수 있으며, 이를 통해서 일반적인 과면역 반응으로 인한 질환 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에서 상기 면역 억제제로는 글루코코르티코이드(Glucocorticoids), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamid), 사이클로스포린(Cyclosporin), 타크롤리무(Tacrolimu), 라파마이신(Rapamycin), Ⅳ형 PDE 억제제(Type Ⅳ PDE inhibitors), p38 키나제 억제제(p38 kinase inhibitors), 아자티오프린(Azathioprine), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 미조리빈(Mizoribin), 메토트렉세이트(Methotrexate), 레플루노미드(Leflunomid), 및 브레퀴나(Brequina)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 치료를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기에 특이적인 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 면역 관련 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 치료를 필요로 하는 대상은 면역 관련 질환이 있거나, 그 증상이 의심되는 개체로, 여기서, 상기 면역 관련 질환의 일 예시로는 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등의 암일 수 있고, 다른 예시로는 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피 또는 급성 및 만성염증 질환 등일 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 항체는 조절 T 세포의 표면에 발현되는 DKK1 단백질 또는 이의 항원 결정기에 특이적으로 결합하여 조절 T 세포의 활성을 억제해 면역 관련 질환으로, 예를 들어 암을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 항체는 조절 T 세포의 표면에 발현되는 DKK1 단백질 또는 이의 항원 결정기에 특이적으로 결합하여 조절 T 세포의 활성을 증가시킴에 따라 면역 관련 질환으로, 예를 들어 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 급성 및 만성염증 질환 등을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 치료를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기를 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 면역 관련 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 치료를 필요로 하는 대상은 면역 관련 질환이 있거나, 그 증상이 의심되는 개체로, 여기서, 상기 면역 관련 질환의 일 예시로는 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등의 암일 수 있고, 다른 예시로는 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피 또는 급성 및 만성염증 질환 등일 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA는 조절 T 세포의 표면에 발현되는 DKK1 단백질 또는 이의 항원 결정기를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하여 이들의 발현을 억제해 면역 관련 질환으로, 예를 들어 암을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA는 조절 T 세포의 표면에 발현되는 DKK1 단백질 또는 이의 항원 결정기를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하여 이들의 발현을 증가시킴에 따라 면역 관련 질환으로, 예를 들어 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 급성 및 만성염증 질환 등을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 투여란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 치료 방법은 상기 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA를 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자의 발현 억제제 또는 단백질의 활성 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, siRNA일 경우 0.01ng/kg-10㎎/kg, 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 경우 0.01ng/kg-10㎎/kg, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 상기 투여 시 추가로 다른 항암제 또는 다른 면역 억제제를 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (a) 상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기를 포함하는 조절 T 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기의 발현 수준이 감소 또는 증가 조절(down or upregulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 면역 활성화제 또는 면역 억제제임을 판별하는 단계를 포함하는 면역 활성화제 또는 면역 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "스크리닝"이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 스크리닝은, 면역 관련 질환의 의심 개체에 이러한 질환의 치료용 후보 물질의 투여 후 본 발명의 단백질의 발현이 감소 또는 증가되는 경우에, 후보 물질을 면역 억제제 또는 면역 활성화제로 판별하는 스크리닝 방법이다. 분자생물학적 어쎄이(assay), 디지털 이미징, 세포학적 및 조직학적 검사와 같은 수단적 방법들이 질환 발병 병소 또는 질환 의심 조직에 대한 본 발명의 유전자와 단백질의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기의 발현 수준으로, 양 또는 활성은 상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.
본 발명에서 상기 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 유전자의 존재 또는 부존재를 확인하기 위한 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석하는 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (a) 상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기를 코딩하는 유전자를 포함하는 조절 T 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 유전자의 발현 수준이 감소 또는 증가 조절(down or upregulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 면역 활성화제 또는 면역 억제제임을 판별하는 단계를 포함하는 면역 활성화제 또는 면역 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기를 코딩하는 유전자의 발현 수준은 상기 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기와, 이를 코딩하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명에서 상기 프라이머란, 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 DKK1의 세포 외 표면 단백질을 코딩하는 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
또한 본 발명에서 프로브란, mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 DKK1의 세포 외 표면 단백질을 코딩하는 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석하는 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기에 특이적인 항체를 유효 성분으로 포함하는, 면역 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 진단은 위암의 발병 유무 및 전이 여부를 확인하는 것이다.
또한, 본 발명에서 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질은 조절 T 세포 표면에 존재하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 상기 항체를 이용하여 조절 T 세포의 표면에 존재하는 DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기의 발현 수준을 측정함으로써 면역 관련 질환을 진단할 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 면역 관련 질환은 암일 수 있고, 보다 상세하게는 암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으며, 바람직하게는 흑색종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 면역 관련 질환은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 급성 및 만성염증 질환 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기를 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는, 면역 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질은 조절 T 세포 표면에 존재하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 상기 항체를 이용하여 조절 T 세포의 표면에 존재하는 DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 면역 관련 질환을 진단할 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 면역 관련 질환은 암일 수 있고, 보다 상세하게는 암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으며, 바람직하게는 흑색종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 면역 관련 질환은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 급성 및 만성염증 질환 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 진단용 조성물을 포함하는 면역 관련 질환의 진단 키트를 제공한다.
본 발명에서 상기 "키트"란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 키트는 암, 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 급성 및 만성염증 질환 등의 면역 관련 질환의 진단 마커인 DKK1 세포 외 표면 단백질의 발현수준을 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 확인함으로써 상기 질환을 진단할 수 있다. 본 발명의 키트에는 면역 관련 질환의 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 조절 T 세포에 존재하는 상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질, 또는 상기 항원 결정기에 특이적인 항체를 이용하여 상기 세포 외 표면 단백질 또는 항원 결정기의 발현 수준을 측정하여 면역 관련 질환에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 예시로, 상기 면역 관련 질환은 암일 수 있고, 보다 상세하게는 암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으며, 바람직하게는 흑색종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 면역 관련 질환은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 급성 및 만성염증 질환 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 조절 T 세포에서 본 발명의 상기 DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기를 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 이용하여 상기 유전자의 발현 수준을 측정하여 면역 관련 질환에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 예시로, 상기 면역 관련 질환은 암일 수 있고, 보다 상세하게는 암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으며, 바람직하게는 흑색종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 면역 관련 질환은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 급성 및 만성염증 질환 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 DKK1 단백질은 면역 세포, 특히 조절 T 세포의 표면에서 특이적으로 존재하기 때문에, 다양한 면역 관련 질환의 치료제의 새로운 타겟으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 DKK1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 DKK1 단백질의 항원 결정기(epitope)를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 DKK1 단백질의 항원 결정기(epitope)를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 DKK1 단백질의 항원 결정기(epitope)를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 DKK1 단백질의 3S8V chain X 내의 항원 결정기(epitope)를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 DKK1 단백질의 3SOQ chain Z 내의 항원 결정기(epitope)를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 DKK1 단백질의 5FWW chain B 내의 항원 결정기(epitope)를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 DKK1 단백질의 5FWW chain B 내의 항원 결정기(epitope)를 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포의 표면에 DKK1 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실시예 1] DKK1 C 말단 구조 확인
DKK1은 분비 단백질의 형태로 그에 특이적인 리간드에 해당하는 LRP6와 결합하는 것으로 알려져 있어, DKK1이 리간드와 결합하기 위하여 C 말단 부분의 182~266번의 아미노산 구조가 중요하고, 이를 통해 DKK1과 LRP6가 높은 결합력을 갖기 때문에 이와의 결합이 Wnt 세포신호전달 체계에 중요한 역할을 한다. 상기 DKK1의 C 말단 단백질의 구조는 도 1과 같다.
[실시예 2] DKK1 항원 결정기(epitope) 아미노산 서열 예측
상기 염기서열의 예측은 DKK1 단백질의 구조를 기반으로 하는 항원 결정기 예측 소프트웨어(epitope prediction software)인 ABCpred(도 2), BCEpred(도 3), Discotope 및 Ellipro 서버(http://tools.iedb.org/ellipro/)를 이용하였다(도 4 내지 8). 상기 Ellipro 및 Discotope 검색 엔진은 현존하는 항원 결정기를 예측하는 알고리즘 중에서 가장 신뢰도가 높다고 알려진 검색엔진에 해당하여 이를 이용하였다.
항원 결정기 예측 소프트웨어에 상기 실시예 1에서 분석된 세포외 도메인을 입력한 뒤, 예측된 항원 결정기의 예측된 연속 또는 불연속 아미노산 서열을 도 2 내지 8에 나타내었다.
도 2 내지 8에서 보는 바와 같이, 연속된 항원 결정기 아미노산 서열은 서열번호 4 내지 22로 총 19개가 예측되었고, 불연속된 항원 결정기 아미노산 서열은 서열번호 23 내지 36로 총 14개가 예측되었다.
[실시예 3] 조절 T 세포에서 DKK1 mRNA의 특이적 발현 확인
DKK1 단백질이 조절 T 세포에 특이적인 바이오마커(biomarker)로 작용할 수 있는지 검증하였다.
상기 검증을 위하여, C57BL/6 또는 Foxp3 및 FRP가 공통적으로 발현되도록 한 쥐의 비장으로부터 CD4 비드를 통해 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다.
이후, CD25 항체를 이용하여 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 이용해 조절 T (CD4+CD25+ T)세포 및 비-조절 T (CD4+CD25- T)세포를 분리하였다. 각각의 세포 및 상기 준비예 1에서 분화된 세포는 트리졸(Trizol)을 이용하여 mRNA를 추출한 뒤, 게노믹 RNA는 gDNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 gDNA를 제거하였다. gDNA가 제거된 mRNA는 BDsprint cDNA 합성 키트 (Clonetech)를 통해 cDNA로 합성하였다.
상기 cDRNA에서 DKK1 mRNA의 발현량을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하였다. 상기 실시간 중합효소연쇄반응은 SYBR Green (Molecular Probes)을 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 95℃에서 3분, 61℃에서 15초, 72℃에서 30초씩 40 사이클의 조건으로, 하기 표 4의 프라이머를 이용하여 수행하였고, 상대적인 유전자 발현량은 ΔCT 방법을 이용하여 계산하였으며, HPRT를 이용하여 일반화(normalization)하여, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
구분 서열
DKK1 정방향(forward) 5′-GCG GCA AGA CCT ACA CCA AGA G-3′
역방향(reverse) 5′-CTT TCG GTA GTG GCG GGT AAG C-3′
Gapdh 정방향(forward) 5′-GCC TTC CGT GTT CCT ACC-3′
역방향(reverse) 5′-GCC TGC TTC ACC ACC TTC-3′
DKK2 정방향(forward) 5′-TGG ATC ATG ACT TCC GTGACG CTT-3′
역방향(reverse) 5′-GCC ATC TTG CCA TGG TCT TGG TTT-3′
DKK3 정방향(forward) 5′-AGA ACT CCA AGA GGC ACA GAG CAA-3′
역방향(reverse) 5′-TGT TGT GAG GGA TCT GACAAG CCA-3′
DKK4 정방향(forward) 5′-TGG TGG TGG CTC TCC TTG-3′
역방향(reverse) 5′-AGT TCC GCA CAT CCT TCT TG-3′
Wnt3a 정방향(forward) 5′-TCG GAG ATG GTG GTA GAG AAA CAC-3'
역방향(reverse) 5'-AAG TTG GGT GAG GCC TCG TAG TAG-3'
Wnt5a 정방향(forward) 5'-ACA ACC TGG CAG ATG TAG CCT GTA-3'
역방향(reverse) 5'-CGC GCT ATC ATA CTT CTC CTT GAG-3'
Wnt7b 정방향(forward) 5'-CCC AAT GGA GAC AAA TCC CTT TAC-3'
역방향(reverse) 5'- GAA ACC GTT TTG AGT GTG ACT GGT-3'
Wnt10b 정방향(forward) 5'-GTT TCC GTG AGA GTG CTT TCT CCT-3'
역방향(reverse) 5'-TCT TGC TCA CCA CTA CCC TTC CAT-3'
Wnt11 정방향(forward) 5'- GGG CTT CAA AGG AAA CTG ATA GGA-3'
역방향(reverse) 5'-CCT TGA AAG GTC AAA TGC ACA GTC-3'
도 9에서 보는 바와 같이, 조절 T 세포에서 DKK 패밀리 유전자와 Wnt 유전자의 발현은 거의 확인되지 않았지만, DKK1 유전자의 발현이 현저하게 높은 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 DKK1은 조절 T 세포의 바이오 마커로 사용될 가능성이 매우 높은 것을 알 수 있다.
[실시예 4] 면역 세포에서 DKK1 mRNA의 발현 확인
DKK1 단백질이 조절 T 세포에 특이적인 바이오마커(biomarker)로 작용할 수 있는지 검증하였다.
상기 실시예 3에서와 같이 분리된 CD4+ T 세포 중 Treg(CD4+RFP+) 세포, 분화 전 T 세포(naive T cell), 효과 T 세포(effector T cell)를 CD62L 항체(ebioscience)와 형광 활성 세포 분류기를 이용해 분리하고, CD8+ T 세포, B 세포를 CD8 β사슬에 대한 항체, CD19에 대한 항체를 이용하여 분리한 뒤, CD3 및 CD28에 대한 항체(ebioscience)가 존재 또는 존재하지 않는 조건 또는, CD4+ T 세포 아형으로 분화할 수 있는 조건에서 배양하고, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 mRNA를 추출한 뒤, DKK1 mRNA의 발현을 확인하여, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 DKK1 유전자는 조절 T 세포에서만 높았고, 같은 조절 T 세포에서도 CD3와 CD28에 대한 항체를 처리한 군이 DKK1의 발현이 더 높았으며, 분화 신호에 의해 신체 말단이나 실험적으로 조절 T 세포로 분화한 유도 조절 T 세포(induced Treg)보다 흉선에서 생성되는 자연 조절 T 세포(natural Treg)에서 DKK1의 발현이 높았다.
[실시예 5] 조절 T 세포에서 DKK1 단백질의 특이적 발현 확인
DKK1 단백질이 세포 치료의 타겟이 되기 위해서는 조절 T 세포의 표면에 발현 되어야 더욱 효과적으로 타겟 치료를 할 수 있으므로, DKK1 단백질이 표면에서의 발현 여부를 확인하였다.
상기 실시예 4의 각각의 분화된 T 세포 아형을 항-CD4-APC 및 항 DKK1-PE 항체로 염색하고, 형광 이용 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter; FACS)를 이용하여 각각의 세포 표면에서 DKK1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 보는 바와 같이, T 세포 수용체 신호가 활성화 되었을 때 조절 T 세포(CD4+ Foxp+)가 Foxp3를 발현하지 않는 다른 효과 T 세포(Effector T cell)에 비해 발현하는 DKK1이 높았다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
<110> Good T Cells, Inc. <120> USE OF DKK1 PROTEIN IN A REGULATORY T CELL <130> DPB172735k01 <150> KR 10-2017-0058336 <151> 2017-05-10 <150> KR 10-2017-0058337 <151> 2017-05-10 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 266 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Met Ala Leu Gly Ala Ala Gly Ala Thr Arg Val Phe Val Ala Met 1 5 10 15 Val Ala Ala Ala Leu Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Val Ser Ala Thr 20 25 30 Leu Asn Ser Val Leu Asn Ser Asn Ala Ile Lys Asn Leu Pro Pro Pro 35 40 45 Leu Gly Gly Ala Ala Gly His Pro Gly Ser Ala Val Ser Ala Ala Pro 50 55 60 Gly Ile Leu Tyr Pro Gly Gly Asn Lys Tyr Gln Thr Ile Asp Asn Tyr 65 70 75 80 Gln Pro Tyr Pro Cys Ala Glu Asp Glu Glu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Pro Thr Arg Gly Gly Asp Ala Gly Val Gln Ile Cys Leu 100 105 110 Ala Cys Arg Lys Arg Arg Lys Arg Cys Met Arg His Ala Met Cys Cys 115 120 125 Pro Gly Asn Tyr Cys Lys Asn Gly Ile Cys Val Ser Ser Asp Gln Asn 130 135 140 His Phe Arg Gly Glu Ile Glu Glu Thr Ile Thr Glu Ser Phe Gly Asn 145 150 155 160 Asp His Ser Thr Leu Asp Gly Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Leu Ser Ser 165 170 175 Lys Met Tyr His Thr Lys Gly Gln Glu Gly Ser Val Cys Leu Arg Ser 180 185 190 Ser Asp Cys Ala Ser Gly Leu Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Ser Lys 195 200 205 Ile Cys Lys Pro Val Leu Lys Glu Gly Gln Val Cys Thr Lys His Arg 210 215 220 Arg Lys Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Tyr Cys Gly 225 230 235 240 Glu Gly Leu Ser Cys Arg Ile Gln Lys Asp His His Gln Ala Ser Asn 245 250 255 Ser Ser Arg Leu His Thr Cys Gln Arg His 260 265 <210> 2 <211> 801 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgatggctc tgggcgcagc gggagctacc cgggtctttg tcgcgatggt agcggcggct 60 ctcggcggcc accctctgct gggagtgagc gccaccttga actcggttct caattccaac 120 gctatcaaga acctgccccc accgctgggc ggcgctgcgg ggcacccagg ctctgcagtc 180 agcgccgcgc cgggaatcct gtacccgggc gggaataagt accagaccat tgacaactac 240 cagccgtacc cgtgcgcaga ggacgaggag tgcggcactg atgagtactg cgctagtccc 300 acccgcggag gggacgcagg cgtgcaaatc tgtctcgcct gcaggaagcg ccgaaaacgc 360 tgcatgcgtc acgctatgtg ctgccccggg aattactgca aaaatggaat atgtgtgtct 420 tctgatcaaa atcatttccg aggagaaatt gaggaaacca tcactgaaag ctttggtaat 480 gatcatagca ccttggatgg gtattccaga agaaccacct tgtcttcaaa aatgtatcac 540 accaaaggac aagaaggttc tgtttgtctc cggtcatcag actgtgcctc aggattgtgt 600 tgtgctagac acttctggtc caagatctgt aaacctgtcc tgaaagaagg tcaagtgtgt 660 accaagcata ggagaaaagg ctctcatgga ctagaaatat tccagcgttg ttactgtgga 720 gaaggtctgt cttgccggat acagaaagat caccatcaag ccagtaattc ttctaggctt 780 cacacttgtc agagacacta a 801 <210> 3 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Leu Asn Ser Val Leu Asn Ser Asn Ala Ile Lys Asn Leu Pro Pro 1 5 10 15 Pro Leu Gly Gly Ala Ala Gly His Pro Gly Ser Ala Val Ser Ala Ala 20 25 30 Pro Gly Ile Leu Tyr Pro Gly Gly Asn Lys Tyr Gln Thr Ile Asp Asn 35 40 45 Tyr Gln Pro Tyr Pro Cys Ala Glu Asp Glu Glu Cys Gly Thr Asp Glu 50 55 60 Tyr Cys Ala Ser Pro Thr Arg Gly Gly Asp Ala Gly Val Gln Ile Cys 65 70 75 80 Leu Ala Cys Arg Lys Arg Arg Lys Arg Cys Met Arg His Ala Met Cys 85 90 95 Cys Pro Gly Asn Tyr Cys Lys Asn Gly Ile Cys Val Ser Ser Asp Gln 100 105 110 Asn His Phe Arg Gly Glu Ile Glu Glu Thr Ile Thr Glu Ser Phe Gly 115 120 125 Asn Asp His Ser Thr Leu Asp Gly Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Leu Ser 130 135 140 Ser Lys Met Tyr His Thr Lys Gly Gln Glu Gly Ser Val Cys Leu Arg 145 150 155 160 Ser Ser Asp Cys Ala Ser Gly Leu Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Ser 165 170 175 Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu Lys Glu Gly Gln Val Cys Thr Lys His 180 185 190 Arg Arg Lys Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Tyr Cys 195 200 205 Gly Glu Gly Leu Ser Cys Arg Ile Gln Lys Asp His His Gln Ala Ser 210 215 220 Asn Ser Ser Arg Leu His Thr Cys Gln Arg His 225 230 235 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Ile Gln Lys Arg Leu 1 5 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His Arg Arg Lys Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe 1 5 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Lys Gly Gln Glu Gly Ser Val Cys Leu Arg Ser Ser Asp Cys Ala Ser 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Arg Ile Gln Ser Arg Leu 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 His Arg Arg Lys Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe 1 5 10 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Glu Gly Leu 1 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Glu Gly Ser Val Cys Leu Arg Ser Ser Asp Cys Ala Ser Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Lys Glu Gly Gln 1 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asn Ser Asn Ala Ile Lys Asn 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Arg Val Pro Gly Ala Ser His Ile His 1 5 <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gly Thr Gln Asn Trp Thr Ala Leu Gln Gly Gly Lys Pro Cys Leu Phe 1 5 10 15 Trp Asn Glu Thr Phe Gln His Pro Tyr Asn Thr Leu Lys Tyr Pro Asn 20 25 30 Gly Glu <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Lys Asp His Gly Asn Pro Pro Pro Leu Thr Gly Thr Ser Lys Thr Ser 1 5 10 15 Asn Lys Leu <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Phe Ser Asp Arg Ile Asn Gln 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Cys Tyr Val Gly Val Tyr Trp Lys 1 5 <210> 18 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ile Arg Asp Ser Ala Asp Met Val Glu Leu Leu Asp Gly Tyr Thr His 1 5 10 15 Arg Val Leu Ala Arg Phe His Gly Arg Ser Arg Pro Pro Leu Ser Phe 20 25 30 Asn Val Ser Leu Asp Phe Val Ile 35 40 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Leu Gly Glu His Asn Tyr Cys 1 5 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Phe Cys Gly Asn Asn Pro Asp Tyr Trp Lys Tyr Gly Glu 1 5 10 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Gln Arg Phe Lys 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ala Thr Gly Arg Val 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 His Lys Gly Ser Gly Leu 1 5 <210> 24 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ile Gln Leu 1 <210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Phe Trp Ile Phe 1 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Gly Gln Gly Glu Gly Arg His 1 5 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Lys Gly Gln Glu Gly Ser Val Cys Leu Arg Ser Asp Ala Ser Gly 1 5 10 15 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Ile Gln Ser Arg Leu 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 His Lys Gly Ser Gly Leu 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gln Gly Ser Val Cys Arg Ser Asp 1 5 <210> 31 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Phe Trp Ile Phe 1 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Glu Gly Gln Gly Gly Leu Arg 1 5 <210> 33 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ala Ser Gly 1 <210> 34 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gly Thr Gln Asn Trp Thr Ala Leu Gln Gly Gly Lys Pro Cys Leu Phe 1 5 10 15 Trp Asn Glu Thr Phe Gln His Pro Tyr Asn Thr Leu Lys Tyr Pro Asn 20 25 30 Gly Glu Leu Gly Glu His Asn Tyr Cys Pro Cys Tyr Val Gly Val Tyr 35 40 45 Trp Lys Cys 50 <210> 35 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ala Met Tyr Ala Thr Gly Arg Val Arg Val Pro Gly Ala Ser His Ile 1 5 10 15 His Ile Arg Asp Ser Ala Asp Met Glu Leu Asp Gly Tyr Thr His Arg 20 25 30 Val Leu Ala Arg His Gly Arg Ser Pro Pro Leu Ser Phe Asn Val Ser 35 40 45 Leu Asp Phe Val Ile Phe Ser Asp Arg Ile Asn Gln Ala Gln Ala Val 50 55 60 Lys 65 <210> 36 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Lys Asp His Gly Asn Pro Pro Pro Leu Thr Gly Thr Ser Lys Thr Ser 1 5 10 15 Asn Lys Leu Phe Ser Gln Arg Phe Lys Ser Gly Tyr Phe Cys Gly Asn 20 25 30 Asn Pro Asp Tyr Trp Lys Tyr Gly Glu Cys Phe Gly Gly Asp Gly 35 40 45

Claims (24)

  1. (a) DKK1(Dickkopf-1)의 세포 외 표면 단백질 또는 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나로 표시되는 항원 결정기를 포함하는 조절 T 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기의 발현 수준이 감소 또는 증가 조절(down or upregulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 면역 활성화제 또는 면역 억제제임을 판별하는 단계를 포함하는 면역 활성화제 또는 면역 억제제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기의 발현 수준은 상기 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 수행되는, 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질은 서열번호 3으로 표시되는, 스크리닝 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포 외 표면 단백질 또는 상기 항원 결정기의 발현 수준은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는, 스크리닝 방법.
  5. (a) DKK1(Dickkopf-1)의 세포 외 표면 단백질 또는 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나로 표시되는 항원 결정기를 코딩하는 유전자를 포함하는 조절 T 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 유전자의 발현 수준이 감소 또는 증가 조절(down or upregulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 면역 활성화제 또는 면역 억제제임을 판별하는 단계를 포함하는 면역 활성화제 또는 면역 억제제의 스크리닝 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 이용하여 수행되는, 스크리닝 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 DKK1의 세포 외 표면 단백질은 서열번호 3으로 표시되는, 스크리닝 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는, 스크리닝 방법.
  9. 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나로 표시되는 DKK1(Dickkopf-1)의 항원 결정기.
  10. 서열번호 3으로 표시되는 DKK1(Dickkopf-1)의 세포 외 표면 단백질을 포함하는 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg cell)를 유효 성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피 및 급성 및 만성염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  12. 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나로 표시되는 DKK1(Dickkopf-1)의 항원 결정기를 포함하는 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg cell)를 유효 성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피 및 급성 및 만성염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  14. DKK1의 세포 외 표면 단백질, 또는 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나로 표시되는 항원 결정기에 특이적인 항체를 유효 성분으로 포함하는, 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 암인, 약학 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피 및 급성 및 만성염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  17. DKK1의 세포 외 표면 단백질, 또는 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나로 표시되는 항원 결정기를 코딩하는 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는, 면역 관련 질환용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 암인, 약학 조성물.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피 및 급성 및 만성염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  20. DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나로 표시되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는, 면역 관련 질환의 진단용 조성물.
  21. DKK1 세포 외 표면 단백질 또는 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나로 표시되는 항원 결정기를 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는, 면역 관련 질환의 진단용 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항의 조성물을 포함하는 면역 관련 질환의 진단 키트.
  23. 조절 T 세포에 존재하는 DKK1의 세포 외 표면 단백질, 또는 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나로 표시되는 항원 결정기에 특이적인 항체를 이용하여 상기 표면 단백질 또는 항원 결정기의 발현 수준을 측정하여 면역 관련 질환에 관한 정보를 제공하는 방법.
  24. 조절 T 세포에 존재하는 DKK1의 세포 외 표면 단백질, 또는 서열번호 4 내지 36 중 어느 하나로 표시되는 항원 결정기를 코딩하는 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 이용하여 상기 유전자의 발현 수준을 측정하여 면역 관련 질환에 관한 정보를 제공하는 방법.
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