KR20180119670A

KR20180119670A - 아밀로이드 베타의 축적과 관련된 질환의 치료를 위한 bace 억제제와 항체 또는 항원 결합 단편의 조합

Info

Publication number: KR20180119670A
Application number: KR1020187029098A
Authority: KR
Inventors: 코너 존스톤
Original assignee: 아스트라제네카 아베
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2018-11-02
Also published as: TW201742625A; WO2017158064A1; CA3017418A1; US20190262327A1; EP3429620A1; CN109195630A; JP2019511500A; AR107893A1; AU2017232277A1

Abstract

본 개시내용은 아밀로이드 베타의 축적과 관련된 질환 또는 장애를 갖는 피험체에게 BACE 억제제, 및 아밀로이드 베타 n-42에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 베타의 축적과 관련된 질환 또는 장애를 갖는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 알츠하이머병이다.

Description

아밀로이드 베타의 축적과 관련된 질환의 치료를 위한 BACE 억제제와 항체 또는 항원 결합 단편의 조합

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 3월 15일 출원된 미국 가출원 번호 62/308,698로부터 우선권의 이익을 주장한다. 하기 출원의 명세서는 그의 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

알츠하이머병(AD: Alzheimer's disease)은 인지 장애 및 기억을 악화시키는 것을 특징으로 하고, 환자의 사회적 및 직업적 기능을 약화시키는 신경변성 질환이다. 상기 질환은 뇌 안의 신경 세포의 손실을 유발하고, 이는 의사 전달 및 예컨대, 판단, 계획, 체계화 및 추론과 같은, 더 높은 고기능상의 인지적 장애를 유발하며, 이는 결국 성격을 변화시킬 수 있다. 상기 질환의 말기는 독립적 기능의 완전한 상실을 특징으로 한다.

역사적으로, AD(산발성 및 가족성)는 세포내 신경섬유 매듭(NFT: neurofibrillary tangle) 및 세포외 플라크의 존재로 정의된다. 플라크는 뇌 중의 뉴런 및 성상세포에서 발견되는 막횡단 단백질인 아밀로이드 전구체 단백질(APP: amyloid precursor protein)의 비정상적인 절단으로부터 유도된 아밀로이드 β 펩티드(Aβ: amyloid β peptide)의 응집체이다. Aβ 침착물은 또한 AD 환자의 혈관에서도 발견된다. 콜린성 뉴런은 특히 AD에서 취약하고, 그 결과로서, 신경전달물질의 감소는 다른 신경전달물질 시스템에도 영향을 미치게 된다. 상기 질환의 다른 증상으로는 산화 스트레스, 염증 및 뉴런 아폽토시스(프로그램화된 세포 사멸)를 포함한다. AD 환자에서, 대규모의 뉴런 세포 사멸은 인지를 저하시키고, 결국에는 환자를 사망에 이르게 한다. (문헌 [Younkin, 1995]; [Borchelt et al., 1996]; [Selkoe, 1999]). AD는 일반 집단에서보다 다운 증후군을 앓는 사람들 사이에서 3 내지 5배 더욱 빈번하게 발생한다. 다운 증후군을 앓는 사람들은 또한 다른 성인들보다 더 어린 나이에 AD가 발병될 가능성이 더 높다.

현행 치료법은 단지 대증 치료법이고, 최소로 효과적이며, 단지 제한된 기간 동안 증상을 소폭으로 호전시킨다. Aβ의 과다생산 또는 그 수준의 변화가 산발성 및 조기 발병 AD의 발병기전에서 중요한 이벤트가 되는 것으로 간주되며, 이러한 이유로, Aβ는 a) 그의 형성을 감소시키거나(문헌 [Vassar et al., 1999]), 또는 b) 그의 뇌로부터의 제거를 가속화시키는 기전을 활성화시키도록 디자인된 약물 개발을 위한 주요 표적이 되어 왔다.

아밀로이드 캐스캐이드 가설은 Aβ 펩티드 생산이 뉴런 형성에 악영향을 미침으로써 AD에서 뉴런 사멸 및 치매를 일으킨다고 제안한다. Aβ는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 생산되고, 이는 순차적으로 세크레타제에 의해 절단되어 상이한 길이의 종들이 생성된다. 잔기 42에서 종료되는 Aβ는 APP의 프로세싱에 의해 생산된 Aβ 종들중 소수 성분이다. 다른 형태로는 Aβ1-40 및 N 말단 말단절단물 Aβn-40을 포함한다. 그러나, 잔기 42에서 종료되는 Aβ가 응집 경향이 가장 크고, 아밀로이드 플라크로의 침착을 구동시킨다. 응집 경향이 가장 크다는 점 이외에도, Aβ1-42 펩티드는 배양물 중에서 뉴런에 독성인 것으로 밝혀진 가용성 저-n 중합체(또는 올리고머)를 형성한다. 더욱 큰 눈에 잘 띄는 원섬유 침착물과 달리, 올리고머는 전형적인 병리 검정법에서 검출되지 않는다. 특성이 유사한 올리고머는 AD 뇌로부터 단리되었고, 이는 플라크보다는 질환 진행과 더욱 밀접한 연관성을 가지고 있다(문헌 [Younkin, 1998]; [Walsh et al., 2005a]; [Walsh et al., 2005b]). Aβ1-42, pGluAβ3-42, Aβ3-42 및 4-42를 비롯한, 다수의 Aβ 이소폼이 AD 뇌에서 지배적이며, 그 중 Aβ1-42 및 Aβ4-42가 가족성 및 산발성 AD의 해마 및 피질에서 주된 형태이다(문헌 [Portelius et al., 2010]).

앞서 여러 수동적 백신접종 전략법이 연구되어 왔다. Aβ에 대한 항체의 말초 투여가 아밀로이드 부하를 감소시키는 데 충분하였다(문헌 [Bard et al., 2000]). 상기 실험에서는 비교적 보통 정도의 항체 혈청 수준이 달성되었음에도 불구하고, 수동적으로 투여된 항체는 혈액 뇌 장벽을 건너 중추 신경계로 진입하고, 플라크에 결합하여(decorate), 기존 아밀로이드의 제거를 유도할 수 있었다. Aβ1-40 특이적 항체, Aβ1-42 특이적 항체 및 Aβ의 잔기 1-16에 대한 항체를 비교하였을 때, 마우스 뇌에서 항체 모두 Aβ 축적을 감소시키는 것으로 나타났다(문헌 [Levites et al., 2006]). 유용한 항Aβ 항체의 대표적인 예로는 WO 2014/060444에 기술되어 있는 것을 포함한다.

예컨대, 알츠하이머병 또는 다운 증후군과 같은 질환 치료를 위한 것으로서 관심을 끄는 추가의 치료적 표적은 BACE 억제이다. Aβ 펩티드는 β 아밀로이드 형성 경로의 일부로서, C 말단에서의 하나 이상의 γ 세크레타제에 의한, 및 N 말단에서의, 아스파르틸 프로테아제 또는 Asp2 또는 베타 부위 APP 절단 효소(BACE: Beta site APP Cleaving Enzyme)로도 또한 공지된, β 세크레타제 효소에 의한 APP의 절단으로부터 생성된다. BACE 활성은 APP로부터의 Aβ 펩티드의 생성과 직접적인 상관관계를 가지며(문헌 [Sinha, et al, Nature, 1999, 402, 537-540]), 연구 결과에 따르면, BACE 억제가 Aβ 펩티드 생산을 억제시킨다는 것이 계속해서 점점 더 밝혀지고 있다(문헌 [Roberds, S. L., et al, Human Molecular Genetics, 2001, 10, 1317-1324]). BACE는 부분적으로 활성을 띠는 효소 전구체로서 합성되는 막 결합 타입 1 단백질이고, 이는 뇌 조직에서 풍부하게 발현된다. 이는 주요 β 세크레타제 활성을 나타내는 것으로 사료되고, Aβ 생산에서 속도 제한 단계인 것으로 간주된다. 그러므로, BACE 활성을 감소시키거나, 또는 차단시키는 약물이 뇌에서, 또는 Aβ 또는 그의 단편이 침착되는 다른 곳에서도 Aβ 수준 및 Aβ의 단편의 수준을 감소시킴으로써, 아밀로이드 플라크 형성, 및 AD, 또는 Aβ 또는 그의 단편이 관여하는 다른 질병의 진행을 저속화시켜야 한다.

(예컨대, Aβ 형성을 담당하는 효소를 억제시킴으로써) Aβ 형성을 감소시키고, (예컨대, 현존하는 Aβ에 결합하고, 제거하기 위해 그를 표적화함으로써) 뇌로부터의 Aβ 제거를 가속화시키는 기전을 활성화시키는, 이 둘 모두를 수행하는 신규한 요법이 요구되고 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 Aβ의 축적과 관련된 질환 또는 장애를 갖는 피험체에게 a) 약학적 유효량의,

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 것인 BACE 억제제; 및 b) 약학적 유효량의, Abet0380, Abet0342, Abet0369, Abet0377 또는 Abet0382 중 어느 하나, 또는 이의 생식세포화된(germlined) 변이체로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, Aβ의 축적과 관련된 질환 또는 장애를 갖는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, BACE 억제제는

의 캄실레이트 염이다.

일부 실시양태에서, BACE 억제제는

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시양태에서, BACE 억제제는

의 캄실레이트이다.

일부 실시양태에서, BACE 억제제는

이다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 중 임의의 것에서의 사용을 위한 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380, 또는 이의 생식세포화된 변이체의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380, 또는 이의 생식세포화된 변이체의 중쇄의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380, 또는 이의 생식세포화된 변이체의 경쇄의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변(VL: light chain variable) 도메인 및 중쇄 가변(VH: 중쇄 variable) 도메인을 포함하고; 여기서, VH 도메인은 서열 번호: 524에 기재된 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하고; 여기서, VL 도메인은 서열 번호: 533에 기재된 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인은

서열 번호: 525의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1;

서열 번호: 526의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2; 및

서열 번호: 527의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, VL 도메인은

서열 번호: 534의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1;

서열 번호: 535의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2; 및

서열 번호: 536의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, VH 도메인은 서열 번호: 528, 서열 번호: 529, 서열 번호: 530 및 서열 번호: 531의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인은 서열 번호: 528, 서열 번호: 529, 서열 번호: 530 및 서열 번호: 531의 아미노산 서열을 가지는 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL 도메인은 서열 번호: 537, 서열 번호: 538, 서열 번호: 539 및 서열 번호: 540의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL 도메인은 서열 번호: 537, 서열 번호: 538, 서열 번호: 539 및 서열 번호: 540의 아미노산 서열을 가지는 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인은 서열 번호: 524와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL 도메인은 서열 번호: 533과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인은 서열 번호: 524와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL 도메인은 서열 번호: 533과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인은 서열 번호: 524의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL 도메인은 서열 번호: 533의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 scFv이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab'이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1 또는 인간 IgG2이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1-TM, IgG1-YTE 또는 IgG1-TM-YTE이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화 항체 또는 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 항체 또는 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 500 pM 이하의 해리 상수(Kd)로 단량체 Aβ1-42에 결합하고, Aβ1-40에는 결합하지 않거나, 또는 1 mM 초과의 Kd로 Aβ1-40에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 1 초과의 독성 또는 잠재적으로 독성인 Aβ 단백질 유형(예컨대, Aβ1-42 및 3-파이로-42 아밀로이드 베타)에 결합하기 때문에 유용하다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 아밀로이드 베타 17-42 펩티드(Aβ17-42) 및 아밀로이드 베타 29-42 펩티드(Aβ29-42)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 3-파이로-42 아밀로이드 베타 펩티드 및 11-파이로-42 아밀로이드 베타 펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 아밀로이드 베타 1-43 펩티드(Aβ1-43)에 결합한다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 중 임의의 것을 사용하여 치료되는 질환 또는 장애는 알츠하이머병, 다운 증후군, 및/또는 황반 변성으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 알츠하이머병이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 다운 증후군이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 황반 변성이다. 일부 실시양태에서, BACE 억제제 및 항체 또는 항원 결합 단편은 피험체에게 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, BACE 억제제 및 항체 또는 항원 결합 단편은 개별적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, BACE 억제제 및 항체 또는 항원 결합 단편은 동일한 조성물 중에 존재한다. 일부 실시양태에서, BACE 억제제는 경구 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 피하 투여된다. 일부 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 인지 능력을 개선시키거나, 또는 추가의 인지 장애를 예방한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 기억을 개선시키거나, 또는 추가의 치매를 예방한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 Aβ 축적과 관련된 질환 또는 장애 치료용의, 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 사용하기 위한 BACE 억제제를 포함하는 조성물로서, 여기서, BACE 억제제는

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이고; 여기서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380, Abet0342, Abet0369, Abet0377 또는 Abet0382 중 어느 하나, 또는 이의 생식세포화된 변이체로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 것인, 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 Aβ 축적과 관련된 질환 또는 장애 치료용의, BACE 억제제와 조합하여 사용하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물로서, 여기서, BACE 억제제는

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이고; 여기서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380, Abet0342, Abet0369, Abet0377 또는 Abet0382 중 어느 하나, 또는 이의 생식세포화된 변이체로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 것인, 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, BACE 억제제는

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다. 일부 실시양태에서, BACE 억제제는

의 캄실레이트 염이다.

일부 실시양태에서, BACE 억제제는

이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하고; 여기서, VH 도메인은 서열 번호: 524에 기재된 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하고; 여기서, VL 도메인은 서열 번호: 533에 기재된 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 여기서, VH 도메인은

서열 번호: 525의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1;

서열 번호: 526의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2; 및

서열 번호: 527의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, VL 도메인은

서열 번호: 534의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1;

서열 번호: 535의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2; 및

서열 번호: 536의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 BACE 억제제 및 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 키트로서, 여기서, BACE 억제제는

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이고; 여기서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380, Abet0342, Abet0369, Abet0377 또는 Abet0382 중 어느 하나, 또는 이의 생식세포화된 변이체로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 것인 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, BACE 억제제는

의 캄실레이트 염이다.

일부 실시양태에서, BACE 억제제는

이다.

서열 번호: 525의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1;

서열 번호: 526의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2; 및

서열 번호: 527의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, VL 도메인은

서열 번호: 534의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1;

서열 번호: 535의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2; 및

서열 번호: 536의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다.

도 1은 농도가 증가하는 정제된 경쟁자 scFv에 의한 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 및 Abet0144-GL IgG1-TM의 형성의 억제를 보여주는 것이다(●). 가장 강력한 scFv 클론 중 4개의 클론, Abet0369(도 1a), Abet0377(도 1b), Abet0380(도 1c) 및 Abet0382(도 1d) 모든 모체 Abet0144-GL scFv 서열과 비교하여 효능의 유의적인 개선을 보였다(■).
도 2는 1024 nM(상부 트레이스) 내지 63 pM(하부 트레이스)의 펩티드 농도에서 고정화된 Abet0380-GL IgG1-TM 항체에 결합하는 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 표면 플라스몬 공명(BIA코어(BIAcore)) 트레이스를 보여주는 것이다. 각각의 트레이스는 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델에 피팅된다.
도 3은 고정화된 Abet0380-GL IgG1-TM 항체에 결합하는 일련의 아밀로이드 베타 펩티드에 대한 표면 플라스몬 공명(BIA코어) 트레이스를 보여주는 것이다. 비오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(상부 트레이스) 및 비표지된 뮤린 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(제2 트레이스)에의 결합이 명확하게 나타난다. 비오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-40 펩티드 또는 비표지된 뮤린 아밀로이드 베타 1-40 펩티드(평평한 선)에의 결합에 대해서는 식별되지 않는다(평평한 선).
도 4는 Abet0380-GL IgG1-TM의 시험관내 면역조직화학적 염색으로부터의 샘플 영상을 보여주는 것이다. (a) 양성 대조군 항체는 인간 AD 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 4)을 보인다(ApoE 유전형 3/3; Braak 단계 6; 5 ㎍/ml 항체). (b) Abet0380-GL IgG1-TM 리드 클론은 인접 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 3)을 보인다(10 ㎍/ml). (c) 동일한 양성 대조군 항체는 Tg2576 마우스 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 4)을 보인다(22개월된 마우스; 20 ㎍/ml 항체). (d) Abet0380-GL IgG1-TM 리드 클론은 인접 마우스 뇌 절편 상에서 강한 플라크 인식(점수 = 4)을 보인다(20 ㎍/ml).
도 5는 Abet0380-GL IgG1TM을 사용한 A베타 42 응집체 제조 및 검출의 웨스턴 블롯 분석을 보여주는 것이다. (a) 광 가교 결합되지 않은(비-PICUP) Aβ42 응집체의 Abet0380-GL IgG1-TM 검출. (b) 광 가교 결합된 Aβ42 응집체(PICUP)의 Abet0380-GL IgG1-TM 검출. 여기서, 본 발명자들은 Abet0380-GL IgG1TM이 Aβ1-42 단량체 및 저급 n 올리고머 종(오량체까지 포함)을 특이적으로 인식한다는 것을 입증한다.
도 6은 14일에 걸쳐 매주 반복된 용량을 제공받은 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트에서 용량이 증가하는 Abet0380-GL IgG1-TM 항체에 의한 CSF 중의 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 수준의 용량 의존적 감소(a), 뇌 조직 중의 총 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 증가(b), 및 뇌 조직 중에서의 총 아밀로이드 베타 1-40 펩티드 수준에는 영향이 미치지 않음(도 6c)을 보여주는 것이다.
도 7은 노화된 Tg2576 마우스에게로의 말초 투약 후 168시간 경과하였을 때, 생체내에서의 아밀로이드 베타 플라크에의 Abet0380-GL IgG1-TM의 결합에 관한 면역조직화학적 분석으로부터 수득된 샘플 영상을 보여주는 것이다. 30 mg/kg으로 제공된 양성 대조군 항체는 강한 생체내 플라크 인식(a)을 보인 반면, 30 mg/kg(b) 또는 10 mg/kg(c)으로 제공된 Abet0380-GL IgG1-TM은 임의의 생체내 플라크 데코레이션을 보이지 않는다.
도 8은 상이한 농도 범위의 (10 uM부터 0.17 nM까지) 전장, 말단절단 및 파이로 인간 A베타 펩티드(A베타 1-42, A베타 1-43, A베타 1-16, A베타 12-28, A베타 17-42, A베타 파이로-3-42, 또는 A베타 파이로-11-42)로 이루어진 패널을 이용한 경쟁 결합 실험에서 Abet0380-GL IgG1-TM의 특이성을 보여주는 것이다. 기호 설명:

.
x축은 A베타 펩티드의 농도(로그 M)를 보여주는 것이고, y축은 특이적 결합(%)을 보여주는 것이다. A베타 1-42, A베타 1-43, A베타 17-42, A베타 파이로-3-42 & A베타 파이로-11-42의 경우에 Abet0380-GL IgG1-TM: N 말단 비오틴 A베타 1-42 결합 억제가 관찰되었고, 상기 군에 대한 IC₅₀ 값은 10^-8 내지 10^-9 몰 범위였다. A베타 1-16 또는 A베타 12-28의 경우에는 Abet0380-GL IgG1-TM: N 말단 비오틴 A베타 1-42 결합 억제가 관찰되지 않았다.
도 9는 정상 래트 PK-PD 연구에서 아밀로이드 베타 1-42를 격리시킬 수 있는 항체 Abet0144-GL의 능력을 보여주는 것이다. x축은 비히클 또는 Abet0144-GL의 농도(10 mg/kg, 또는 40 mg/kg)를 보여주는 것이고, y축은 CSF 중의 총 아밀로이드 베타 1-42의 농도(pg/ml)를 보여주는 것이다. CSF 중의 유리 아밀로이드 베타 1-42는 10 또는 40 mg/kg의 Abet0144-GL에 의해 유의적으로 변경되지 않았다(비히클과 비교하였을 때, 각각 5 및 18% 증가). CSF 중의 총 아밀로이드 베타 1-42는 10 mg/kg일 때, 38%만큼, 및 40 mg/kg일 때, 139%만큼 유의적으로 증가되었다. 뇌 조직 중 총 아밀로이드 베타 1-42 또한 10 및 40 mg/kg일 때, 각각 16% 및 50%만큼 유의적으로 증가되었다. 정상 래트에서의 본 연구로부터 얻은 데이터를 통해, Abet0144-GL은, CSF 및 뇌, 둘 모두에서 그 중의 총 아밀로이드 베타 1-42 수준을 증가시키면서, CSF 중 유리 아밀로이드 베타 1-42 수준에는 유의적인 영향을 미치지 않았다는 것이 입증된다.

본 개시내용은 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것과 조합하여 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것을 이용하여 치료를 필요로 하는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 키트 및 조성물 또한 제공한다.

1. 정의

본 개시내용을 기술하기 앞서, 본 개시내용은 기술된 특정 방법 실험 조건으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 이에, 그러한 방법 및 조건은 달라질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이며, 본 개시내용의 범주는 오직 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되는 바, 이에 본원에서 사용된 용어는 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것 또한 이해하여야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 숙련가가 통상 이해하는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 명시되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상도 포함한다.

아미노산은 본원에서 그에 대해 보편적으로 공지되어 있는 3문자 기호에 의해, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)가 권고하는 1문자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 유사하게, 뉴클레오티드는 그에 대해 보편적으로 허용되는 단일 문자 코드로 지칭될 수 있다.

본원에서는 편의상 "및/또는"이 본원에서 사용될 때, 이는 언급된 두 특징부 또는 성분, 각각의 것을 나머지 다른 하나와 함께 또는 그는 포함하지 않고, 구체적으로 개시한 것으로서 이해하여야 함을 나타낸다. 예를 들어 "A 및/또는 B"는 마치 각각의 것이 본원에서 개별적으로 기술된 것과 같이, (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각을 구체적으로 개시한 것으로 이해하여야 한다.

"폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 본 용어는 자연적으로 발생된 아미노산 중합체 및 비자연적으로 발생된 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생된 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다.

본 명세서 전역에 걸쳐, "포함하다(comprise)"라는 단어, 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는"과 같은 파생어는 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제시키는 것이 아니라, 언급된 정수 또는 정수 군을 포함한다는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 특정의 언급된 수치 값과 관련하여 사용될 때, "약"이라는 용어는 그 값이 언급된 값으로부터 10% 이하만큼 달라질 수 있다는 것을 의미한다.

2. BACE 억제제

본 개시내용은 치료를 필요로 하는 피험체를 치료하기 위한, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것과 함께 조합된, 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것의 용도를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법 중 임의의 것에서 사용하기에 적합한 BACE 억제제로는 미국 특허 8,415,483, 8,865,911, 및 9,248,129, 및 미국 특허 출원 공개 2014/0031379(상기 특허들은 각각 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 BACE 억제제는 4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시양태에서, BACE 억제제는 (1r,4r)-4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민:

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 BACE 억제제는 (1r,1'R,4R)-4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민:

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용되는 염"이란, 모체 화합물의 산성 또는 염기성 염을 제조함으로써 그가 변형이 되는 것인, 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 약학적으로 허용되는 염의 예로는 염기성 잔기, 예컨대, 아민의 무기산 또는 유기산 염; 산성 잔기, 예컨대, 카복실산의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용되는 염은 예를 들어, 비독성 무기산 또는 유기산으로부터 형성되는, 모체 화합물의 비독성 염 또는 4급 암모늄 염을 포함한다. 예를 들어, 상기 비독성 염으로는 무기산, 예컨대, 염산으로부터 유도된 것을 포함한다. 본 개시내용의 약학적으로 허용되는 염은 종래 화학 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모체 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 상기 염은 유리 산 또는 염기 형태의 상기 화합물을 물 중에서 또는 유기 용매 중에서, 또는 둘의 혼합물 중에서 화학량적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있고; 일반적으로, 비수성 매질, 예컨대, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토니트릴이 사용된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 BACE 억제제는 화합물: 4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민의 캄실레이트 염이다.

의 캄실레이트 염이다.

의 캄실레이트 염이다.

일부 실시양태에서, BACE 억제제는

이다.

일부 실시양태에서, BACE 억제제는, 실질적으로 표 A에 제시된 바와 같은 하기 피크와 d-간격 값을 나타내는 X선 분말 회절(XRPD: X-ray powder diffraction) 패턴을 제공하는 것을 특징으로 하는,

이다:

<표 A>

일부 실시양태에서, BACE 억제제는, 실질적으로 표 B에 제시된 바와 같은 하기 매우 강한 피크, 강한 피크 및 중간 피크와 d-간격 값을 나타내는 X선 분말 회절 패턴을 제공하는 것을 특징으로 하는,

이다:

<표 B>

본원에서 사용되는 바와 같이, 캄실레이트 염이라는 용어는 또한 그의 모든 용매화물 및 공결정도 포함한다.

본원에서 사용하기에 적합한 BACE 억제제의 대안적 염으로는 숙시네이트, 히드로클로라이드, 포스페이트, 술페이트, 푸마레이트 및 1.5 나프탈렌디술포네이트 염을 포함한다.

본 개시내용은 본 개시내용의 화합물의 모든 호변이성질체 형태를 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "호변이성질체"란, 수소 원자의 이동으로부터 생성되는, 평형 상태로 존재하는 다른 구조적 이성질체를 의미한다. 예를 들어, 생성된 화합물이 케톤 및 불포화된 알콜, 둘 모두의 특성을 가지는 케토-에놀 호변이성이 있다. 호변이성의 다른 예로는 2H-이미다졸-4-아민 및 그의 호변이성질체 1,2-디하이드로이미다졸-5-이민, 및 2H-이미다졸-4-티올 및 그의 호변이성질체 1,2-디하이드로이미다졸-5-티온을 포함한다. 본 명세서 전역에 걸쳐 화합물 표현에서 화합물의 가능한 호변이성질체 중 단 하나만이 도시되었거나, 또는 명명되었다는 것을 이해한다.

본 개시내용의 화합물은 수화물 및 용매화물을 추가로 포함한다.

(1r,1'R,4R)-4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1',2''-이미다졸]-4''-아민의 캄실레이트 염:

.

화합물 (1r,1'R,4R)-4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민의 캄실레이트 염은 적합한 용매, 예를 들어, 2-프로판올, 아세토니트릴, 또는 아세톤, 또는 상기 용매와 물의 혼합물 중의 (1r,1'R,4R)-4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민의 용액으로부터 출발하여, 이어서, 수득된 용액을 실온 내지 80℃ 사이의 온도에서 (1S)-(+)-10-캄포르술폰산과 직접, 또는 적합한 용매, 예를 들어, 2-프로판올 또는 물 중에 용해된 (1S)-(+)-10-캄포르술폰산과 함께 혼합함으로써 수득될 수 있다. 결정화는 용매의 증발에 의해 및/또는 용액을 냉각시킴으로써, 또는 염 반응 결정화로서 직접 수득될 수 있다. 결정화 시작을 위해 시드 결정이 사용될 수 있다. 시드는 소량의 용액을 샘플링한 후, 이를 신속하게 냉각시켜 결정화를 유도함으로써 배치 그 자체로부터 제조될 수 있다. 이어서, 결정을 시드로서 배치에 첨가한다.

X선 분말 회절 분석(XRPD)은 예를 들어, 문헌 [Giacovazzo, C. et al (1995), Fundamentals of Crystallography, Oxford University Press]; [Jenkins, R. and Snyder, R. L. (1996), Introduction to X-Ray Powder Diffractometry, John Wiley & Sons, New York]; [Bunn, C. W. (1948), Chemical Crystallography, Clarendon Press, London]; 또는 [Klug, H. P. & Alexander, L. E. (1974), X-ray Diffraction Procedures, John Wiley and Sons, New York]에 기술된 것과 같은 표준 방법에 따라 제조된 샘플 상에서 수행될 수 있다. X선 회절 분석은 1에서 60˚ 2θ까지 96분 동안 패널리티컬 엑스퍼트 프로(PANalytical X'Pert PRO) MPD 회절계를 사용하여 수행하였다. XRPD 거리 값은 마지막 소수 자리 상에서 ±2 범위로 달라질 수 있다.

상대 강도는 가변 슬릿으로 측정된 회절도로부터 유도된다.

가장 강한 피크 대비 측정된 상대 강도는 50% 초과의 매우 강한(vs), 25 내지 50%의 강한(s), 10 내지 25%의 중간(m), 5 내지 10%의 약한(w), 및 5% 미만의 매우 약한(vw) 상대 피크 높이로서 제공된다. 당업자는 XRPD 강도가 바람직한 배향을 비롯한 다양한 이유로 인해 상이한 샘플 및 상이한 샘플 제제 사이에서 달라질 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 당업자는 회절계에서의 샘플 표면 수준의 변화를 비롯한 다양한 이유로 인해 측정된 각 및 이에 따른 d-간격에서 더 작은 변동이 발생할 수 있다는 것도 알 것이다.

3. 항Aβ 항체 또는 항원 결합 단편

본 개시내용은 치료를 필요로 하는 피험체를 치료하기 위한, 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 함께 조합된, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것의 용도를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법 중 임의의 것에서 사용하기에 적합한 항체 또는 항원 결합 단편으로는 WO 2014/060444 및 US 2015/0299299(상기 특허들은 각각 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 것을 포함한다.

본원에서 정의된 바, "항체 또는 항원 결합 단편"은 하기 항체 또는 항원 결합 단편: Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 임의의 하나 이상의 것, 또는 이의 생식세포화된 변이체의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, "항체 또는 항원 결합 단편"은 하기 항체 또는 항원 결합 단편: Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 하나 이상의 것, 또는 이의 생식세포화된 변이체의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 특정 실시양태에서, "항체 또는 항원 결합 단편"은 Abet0380, 또는 이의 생식세포화된 변이체의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 본 출원 전역에 걸쳐, 달리 명백하게 언급하지 않는 한, CDR은 코티아(Chothia), 카바트(Kabat) 및/또는 IMGT 체계를 사용하여 확인되거나, 정의된다. CDR이 코티아, 카바트 및/또는 IMGT 체계에 의해 존재하는 것으로, 확인되는 것으로, 또는 정의되는 것으로 명시될 때, 이는 CDR이 상기 체계에 따른 것임을 의미한다(예컨대, 코티아 CDR, 카바트 CDR 또는 IMGT CDR). 코티아, 카바트 또는 IMGT CDR을 지칭하는지를 나타내는 데 상기 용어 중 임의의 것이 사용될 수 있다.

본 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 혈장, 뇌 및 뇌척수액(CSF: cerebrospinal fluid) 중 Aβ 펩티드 1-42의 이소폼 및 그의 N 말단 말단절단물(n-42)에 결합함으로써 뇌 및 뇌혈관구조 내의 Aβ n-42(예컨대, Aβ 1-42, Aβ 파이로 3-42, 및/또는 Aβ 4-42) 이소폼의 축적을 예방하거나, 침착을 역전시킬 수 있다. 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 혈액 혈장 및/또는 뇌척수액(CSF) 중 가용성 Aβ1-42에 결합하고, 이를 침전시킴으로써 각각 혈청 및/또는 CSF 중의 Aβ1-42의 농도를 감소시킬 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 조합하여 사용되었을 때, 알츠하이머병 및 아밀로이드증과 연관된 다른 장애에 대한 치료 접근법을 나타낸다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편은 Aβ17-42 내의, 또는 Aβ29-42 내의 표적 에피토프에 대하여 특이적이고, 비표적 에피토프, 예를 들어, Aβ1-40으로부터의 에피토프와 비교하여 높은 친화도로 상기 표적 에피토프에 결합함으로써 아밀로이드 플라크 형성과 연관된 주요 독성 종을 표적화한다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 Aβ1-40보다 Aβ1-42에 대하여 적어도 10배, 적어도 100배, 적어도 1000배 또는 적어도 10,000배 더 큰 결합 친화도를 나타낼 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Aβ1-40에 비해 Aβ1-42에의 결합에 대하여 선택적이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 500 pM 이하의 해리 상수(Kd)로 Aβ1-42에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Aβ1-40에 대해서는 유의적인 결합을 보이지 않는다. 일부 실시양태에서, 친화도 및 결합은 실시예에 기술된 바와 같이, 단량체 Aβ 펩티드를 사용한 표면 플라스몬 공명을 이용하여 측정될 수 있다.

Aβ에의 결합은 또한 실시예에 기술된 바와 같이, 항체가 Aβ에의 결합에 대하여 Aβ 펩티드에 대한 참조 항체 분자와 경쟁할 수 있는지를 측정하기 위해 균일 시분해 형광(HTRF™: homogeneous time resolved fluorescence) 검정법에서 측정될 수 있다.

HTRF™ 검정법은 가깝게 근접하여 존재하는 공여자 형광단과 수용자 형광단 사이의 형광 공명 에너지 전달을 이용하는 균일 검정 기술이다. 이러한 검정법은 관심 분자들 중 한 분자를 공여자 형광단인 유로퓸(Eu3+) 크립테이트에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링시키고, 다른 관심 분자를 수용자 형광단 XL665(안정한 가교 결합된 알로파이코시아닌)에 커플링시킴으로써 거대분자 상호작용을 측정하는 데 이용될 수 있다. (337 nm에서의) 크립테이트 분자의 여기를 통해 620 nm에서 형광이 방출된다. 상기 방출로부터의 에너지는 크립테이트에 가깝게 근접하여 존재하는 XL665로 전달되어, (665 nm에서) XL665로부터 특이적인 장기간 지속되는 형광 방출이 일어날 수 있다. (620 nm에서) 공여자 및 (665 nm에서) 수용자, 둘 모두의 특이적 신호가 측정되고, 이로써, 검정법에서 착색된 화합물의 존재를 보상하는 665/620 nm 비를 계산할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 Aβ1-42에의 결합에 대해 경쟁할 수 있고, 이로써, HTFR™ 경쟁 검정법에서 Aβ1-40이 아닌, Aβ1-42와 참조 항체의 결합을 억제시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 HTRF^™ 검정법에서 Aβ1-42에의 결합에 대해 Abet0144GL을 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90% 억제시킬 수 있다.

달리 언급되어 있지 않은 한, 결합 억제의 효능은 IC₅₀ 값(nM)으로서 표현될 수 있다. 기능 검정법에서, IC₅₀은 생물학적 반응을 그의 최대치의 50%만큼 감소시키는 항체 분자의 농도이다. 리간드 결합 연구에서, IC₅₀은 수용체 결합을 최대 특이적 결합 수준의 50%만큼 감소시키는 농도이다. IC₅₀은 최대 생물학적 반응율(%)을 항체 또는 항원 결합 단편 농도의 로그의 함수로서 플롯팅하고, 소프트웨어 프로그램, 예컨대, 프리즘(Prism)(GraphPad) 또는 오리진(Origin)(Origin Labs)을 이용하여 S자형 함수를 데이터에 피팅시켜 IC₅₀ 값을 생성함으로써 계산될 수 있다. 효능을 측정하거나 결정하기에 적합한 검정법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0144-GL 및 Aβ1-42를 사용한 HTRF™ 에피토프 경쟁 검정법에서 5 nM 이하, 예컨대, 2 nM 이하, 예컨대, 1 nM 이하의 IC₅₀을 가질 수 있다. Abet0144-GL은 서열 번호: 20의 VH 도메인 및 서열 번호: 29의 VL 도메인을 가지는 항체 분자이다. 이 항체 분자는 시험하고자 하는 항체 분자와 동일한 포맷, 예를 들어, scFv 또는 IgG, 예컨대, IgG1 포맷으로 상기 검정법에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용에 따른 IgG 항체 분자는 HTRF 에피토프 경쟁 검정법에서 인간 Aβ1-42에의 결합에 대해 Abet0144-GL IgG와 경쟁할 수 있다. 이러한 검정법에서 효능은 1 nM 미만일 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 HTRF™ 경쟁 검정법에 의해 측정되는 바, Aβ1-40에 비해 Aβ1-42에 대하여 특이적 결합을 보일 수 있다. 상기 검정법에서, Aβ1-40은 Aβ1-42 펩티드에 결하는 항체 또는 항원 결합 단편을 유의적으로 억제시키지 못할 수 있고, 예컨대, 상기 검정법에서, 20% 미만, 예컨대, 10% 미만, 또는 5% 미만의 억제를 보일 수 있고, 일부 실시양태에서, 상기 검정법에서, 유의적으로 억제시키지 못한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Aβ17-42 내의, 더욱 구체적으로, 인간 Aβ29-42 내의 에피토프를 인식하고, 다른 종, 예컨대, 마우스 또는 래트로부터의 Aβ 내의 그의 표적 에피토프도 인식할 수 있다. 2개 종의 Aβ1-42에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 교차 반응성 정도를 평가하기 위해, 제1 종(예컨대, 인간)으로부터의 Aβ1-42를 사용한 HTRF™ 경쟁 검정법에서 계산된 항체 또는 항원 결합 단편의 효능을, 제2 종(예컨대, 마우스 Aβ1-42)으로부터의 Aβ1-42를 사용한 동일한 검정법에서의 항체 또는 항원 결합 단편의 효능과 비교할 수 있다. IC₅₀ 측정에 의해 결정된 효능은 10배 이내 또는 100배 이내에 있을 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, Abet0144GL은 HTRF™ 경쟁 검정법에서 참조 항체로서 사용될 수 있다. 본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은 비인간 Aβ1-42 검정법에서보다 인간 Aβ1-42 검정법에서 더 큰 효능을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 1개 초과의 독성 또는 잠재적으로 독성인 Aβ 단백질 종 타입(예컨대, Aβ1-42 및 3-파이로-42 아밀로이드 베타)에 결합하기 때문에 유용하다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 프레임워크 내에 하나 이상의 CDR, 예컨대, CDR 세트(즉, 항체의 항원 결합 도메인)를 가지는 항체 분자 또는 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 항체 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 항체 분자의 VH 도메인 및 VL 도메인 또한 본 개시내용의 일부로서 제공된다. 널리 공지된 바와 같이, VH 도메인 및 VL 도메인은 상보성 결정 영역("CDR: complementarity determining region") 및 프레임워크 영역("FW: framework region")을 포함한다. VH 도메인은 HCDR 세트를 포함하고, VL 도메인은 LCDR 세트를 포함한다. 항체 분자 또는 그의 항원 결합 단편은 VH CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인, 및/또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다. VH 도메인 또는 VL 도메인은 프레임워크를 추가로 포함할 수 있다. VH 도메인 또는 VL 도메인 프레임워크는 전형적으로 하기 구조로 CDR이 사이 사이에 배치되어 있는 4개의 프레임워크 영역, 즉, FW1, FW2, FW3 및 FW4를 포함한다: FW1 - CDR1 - FW2 - CDR2 - FW3 - CDR3 - FW4.

6개의 짧은 CDR 서열들 중에서 중쇄의 제3 CDR(HCDR3)은 크기 가변성이 더 크다(본질적으로 이를 일으키는 유전자의 배열 기전에 기인하여 다양성이 더 크다). 가장 긴 크기는 26인 것으로 공지되어 있기는 하지만, 2개의 아미노산 크기인 것만큼 짧을 수 있다. CDR 길이 또한 특정의 기저 프레임워크에 의해 수용될 수 있는 길이에 따라 달라질 수도 있다. 기능적으로, HCDR3은 부분적으로는 항체의 특이성을 결정하는 데 있어 중요한 역할을 한다(문헌 [Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974]; [Amit et al., Science, 233:747-753, 1986]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987]; [Chothia et al., Nature, 342:877- 883, 1989]; [Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 199]; [Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990]; [Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990]; 및 [Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991]).

본 개시내용의 측면에 따른 항체 VH 도메인 및 VL 도메인, FW 및 CDR의 예는 표 3 및 4, 본 개시내용의 일부를 형성하는 첨부된 서열 목록에 열거되어 있다. 본원에 개시된 모든 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR 세트들, HCDR 세트 및 LCDR 세트 뿐만 아니라, 상기 요소들의 조합도 본 개시내용의 측면을 나타낸다. 본원에 기술된 바와 같이, "CDR 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDR 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭하고, LCDR 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭한다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체이다

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항원 결합 단편이다. 항원 결합 단편은 분자, 예컨대, Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb 및 Fd를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 다양한 다른 항체 분자, 예를 들어, Fab₂, Fab₃, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 미니바디가 조작되어 있다. 항체 분자 및 그의 구성 및 사용 방법은 문헌 [Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 2005]에 기술되어 있다.

실시예에 기술된 바와 같은 다중 라이브러리의 추가 최적화 및 재조합의 광범위한 프로세스를 통해, Abet0144GL로부터 항체 클론의 패널이 생성되었다. 이들 추가로 최적화된 클론은 Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383으로 명명된다. 그의 CDR 서열 및 가변 도메인 서열은 표 3 및 4에 언급되어 있고, 서열 목록에 기재되어 있다. 생식세포화된 VH 도메인 및 VL 도메인 서열 Abet0380GL, Abet0377GL, Abet0343GL, Abet0369GL 및 Abet0382GL은 표 6 및 표 7에 제시되어 있다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380의 CDR 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380 중쇄의 CDR 중 적어도 1, 2, 또는 3를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380 경쇄의 CDR 중 적어도 1, 2, 또는 3를 포함한다. 표 3 및 4는 Abet0380이 카바트 체계를 사용하여 확인된 CDR 세트를 가지고, 여기서, HCDR1은 서열 번호: 525(카바트 잔기 31-35)이고, HCDR2는 서열 번호: 526(카바트 잔기 50-65)이고, HCDR3은 서열 번호: 527(카바트 잔기 95-102)이고, LCDR1은 서열 번호: 534(카바트 잔기 24-34)이고, LCDR2는 서열 번호: 535(카바트 잔기 50-56)이고, LCDR3은 서열 번호: 536(카바트 잔기 89-97)이라는 것을 보여준다. 다른 최적화된 항체 클론도 유사한 방식으로 표 3 및 4에 제시되어 있고, 이 또한 본 개시내용의 측면으로서 제공된다.

본 개시내용에 따라 인간 Aβn-42에 대한 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 CDR, 예컨대, CDR 세트를 포함할 수 있다. CDR 또는 CDR 세트는 Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 CDR 세트, 또는 이의 생식세포화된 버전일 수 있거나, 또는 본원에 기술된 바와 같이 그의 변이체일 수 있다.

일부 실시양태에서;

HCDR1은 카바트 잔기 31-35로 구성된 것으로서, 그 길이는 5개의 아미노산 길이일 수 있고/거나;

HCDR2는 카바트 잔기 50-65로 구성된 것으로서, 그 길이는 17개의 아미노산 길이일 수 있고/거나;

HCDR3은 카바트 잔기 95-102로 구성된 것으로서, 그 길이는 16개의 아미노산 길이일 수 있고/거나;

LCDR1은 카바트 잔기 24-34로 구성된 것으로서, 그 길이는 11개의 아미노산 길이일 수 있고/거나;

LCDR2는 카바트 잔기 50-56로 구성된 것으로서, 그 길이는 7개의 아미노산 길이일 수 있고/거나;

LCDR3은 카바트 잔기 89-97로 구성된 것으로서, 그 길이는 9개의 아미노산 길이일 수 있다.

항체 또는 항원 결합 단편은 표 3 및 4에 열거된 항체 중 임의의 것의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3, 및/또는 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3, 예컨대, 표 3 또는 4에 열거된 항체 중 임의의 것의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편은 이들 항체 중 어느 한 항체의 VH CDR 세트를 포함할 수 있다. 임의적으로, 항체 또는 항원 결합 단편은 이들 항체 중 한 항체의 VL CDR 세트도 또한 포함할 수 있다. VL CDR은 VH CDR과 동일하거나, 또는 상이한 항체로부터 유래된 것일 수 있다. 표 3에 열거된 항체 중 임의의 것의 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인 및/또는 표 4에 열거된 항체 중 임의의 것의 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인 또한 본원에서 제공된다.

항체 또는 항원 결합 단편은 개시된 HCDR 및/또는 LCDR 세트 내에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예컨대, 최대 5, 10 또는 15개의 돌연변이를 가지는, 표 3 및 4에 열거된 항체 중 임의의 것의 HCDR 및/또는 LCDR 세트를 포함할 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체 분자는 1 또는 2개의 아미노산 돌연변이, 예컨대, 치환을 가지는, Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 어느 하나, 또는 이의 생식세포화된 버전으로부터의 HCDR 및/또는 LCDR 세트를 포함할 수 있다.

예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은

Abet0380 또는 Abet0380GL HCDR의 아미노산 서열이

HCDR1 서열 번호: 525,

HCDR2 서열 번호: 526, 및

HCDR3 서열 번호: 527인 것인

Abet0380 또는 Abet0380GL HCDR 세트를 포함하거나, 또는

1 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 가지는 Abet0380 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인,

(ii) Abet0380 또는 Abet0380GL LCDR의 아미노산 서열이

LCDR1 서열 번호: 534

LCDR2 서열 번호: 535, 및

LCDR3 서열 번호: 536인 것인

Abet0380 또는 Abet0380GL LCDR 세트를 포함하거나, 또는

1 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 가지는 Abet0380 또는 Abet0380GL LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.

돌연변이는 잠재적으로 CDR 세트 내의 어느 잔기에서나 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환은 표 3 및 4에 제시된 바와 같이, Abet0144GL과 비교된 Abet0380, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 임의의 것에서 치환된 위치에서, 또는 Abet0380과 비교된 Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 임의의 것, 또는 이의 생식세포화된 버전에서 치환된 위치에서 이루어질 수 있다.

예를 들어, 하나 이상의 치환은 하기 카바트 잔기 중 하나 이상의 것에 존재할 수 있다:

VH FW1 중 26, 27, 28, 29 또는 30;

VH CDR1 중 31, 32, 33, 34 또는 35;

VH CDR2 중 52a, 53, 54, 55, 56, 57, 58 또는 62;

VH CDR3 중 98, 99, 100h 또는 102;

VL CDR1 중 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34;

VL CDR3 중 89, 90, 92, 93, 94 또는 97.

특정 카바트 잔기 위치에서 가능한 아미노산 치환의 예는 VH 도메인의 경우, 표 10 및 표 12에 제시되어 있고, VL 도메인의 경우, 표 11 및 표 13에 제시되어 있다.

상기 기술된 바와 같이, 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 프레임워크 내에 하나 이상의 CDR, 예컨대, CDR 세트를 가지는 항체 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR 세트를 프레임워크(예컨대, 인간 프레임워크) 내로 이식하여 항체 분자를 제공할 수 있다. 프레임워크 영역은 인간 생식세포 유전자 세그먼트 서열의 것일 수 있다. 따라서, 프레임워크는 생식세포화될 수 있고, 이로써, 프레임워크 내의 하나 이상의 잔기는 가장 유사한 인간 생식세포 프레임워크 내의 동등한 위치에 있는 잔기와 일치하도록 변이된다. 당업자는 생식세포화 이전에 서열이 항체의 프레임워크 서열과 가장 가까운 생식세포 세그먼트를 선택할 수 있고, 생식세포화가 본원에 기술된 검정법에서 항원 결합 또는 효능을 유의적으로 감소시키지 않는다는 것을 확인하기 위해 항체의 친화성 또는 활성을 시험할 수 있다. 인간 생식세포 유전자 세그먼트 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, VBASE 컴필레이션(VBASE, MRC 단백질 조작 센터(MRC Centre of Protein Engineering: 영국 소재), 1997, http//mrc-cpecamacuk)으로부터 정보를 찾을 수 있다.

본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 생식세포 프레임워크, 예컨대, Vh3-23 DP-47 중의 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인을 가지는 단리된 인간 항체 분자일 수 있다. 따라서, VH 도메인 프레임워크 영역 FW1, FW2 및/또는 FW3은 인간 생식세포 유전자 세그먼트 Vh3-23 DP-47의 프레임워크 영역을 포함할 수 있고/있거나, 이 인간 생식세포 유전자 세그먼트의 프레임워크 잔기와 일치하도록 프레임워크 잔기를 돌연변이화시킴으로써 생식세포화될 수 있다. FW4는 인간 생식세포 j 세그먼트의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다.

VH FW1의 아미노산 서열은 서열 번호: 528일 수 있다. VH FW1은 항원 결합에 기여하고/거나, CDR1 루프의 구조적 형태에 중요할 것으로 생각되는 카바트 위치 26-30에 일련의 잔기들을 함유한다. 예를 들어, HCDR1의 선택된 서열과 상승작용하도록 치환이 서열 번호: 528 내에 포함될 수 있다. 하나 이상의 치환은 임의적으로 표 10 또는 표 12에 제시된 것으로부터 선택될 수 있다.

VH FW2의 아미노산 서열은 서열 번호: 529일 수 있다. VH FW3의 아미노산 서열은 서열 번호: 530일 수 있다. VH FW4의 아미노산 서열은 서열 번호: 531일 수 있다.

일반적으로, 항체 또는 항원 결합 단편은 또한, 예컨대, 인간 생식세포 프레임워크, 예컨대, V 람다 23-3 DPL-23 중 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인도 갖는다. 따라서, VL 도메인 프레임워크 영역은 인간 생식세포 유전자 세그먼트 V 람다 23-3 DPL-23의 프레임워크 영역 FW1, FW2 및/또는 FW3을 포함할 수 있고/거나, 이 인간 생식세포 유전자 세그먼트의 프레임워크 잔기와 일치하도록 프레임워크 잔기를 돌연변이화시킴으로써 생식세포화될 수 있다. FW4는 인간 생식세포 j 세그먼트의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. VL FW1의 아미노산 서열은 서열 번호: 537일 수 있다. VL FW2의 아미노산 서열은 서열 번호 538일 수 있다. VL FW3의 아미노산 서열은 서열 번호: 539일 수 있다. VL FW4의 아미노산 서열은 서열 번호: 540일 수 있다.

생식세포화된 VH 또는 VL 도메인은 하나 이상의 버니어(Vernier) 잔기에서 생식세포화될 수 있거나, 생식세포화될 수 없으나, 일반적으로는 생식세포화되지 않는다.

예를 들어, 본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 중쇄 프레임워크 영역 세트:

FW1 서열 번호: 528;

FW2 서열 번호: 529;

FW3 서열 번호: 530;

FW4 서열 번호: 531 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는

1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 돌연변이, 예컨대 치환을 가지는 상기 중쇄 프레임워크 영역 세트를 포함할 수 있다.

본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 중쇄 프레임워크 영역 세트:

FW1 서열 번호: 537;

FW2 서열 번호: 538;

FW3 서열 번호: 539;

FW4 서열 번호: 540 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는

1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 돌연변이, 예컨대 치환을 가지는 상기 경쇄 프레임워크 영역 세트를 포함할 수 있다.

생식세포화되지 않은 항체 분자는 생식세포화된 항체 분자와 비교하여 동일한 CDR을 갖지만, 상이한 프레임워크를 갖는다. 첨부된 서열 목록에서 본원에 제시된 항체 서열들 중 Abet0144-GL, Abet0380-GL, Abet0377-GL, Abet0343-GL, Abet0369-GL, 및 Abet0382-GL의 서열이 생식세포화된다. 본원에 개시된 서열을 가지는 다른 항체 분자의 생식세포화된 항체는 그의 VH 도메인 및 VL 도메인 서열의 프레임워크 영역을 임의적으로 VH 도메인에서 Vh3-23 DP-47로 생식세포화하고, VL 도메인에서 V 람다 23-3 DPL-23으로 생식세포화함으로써 제조될 수 있다.

전형적으로, 상기 논의된 바와 같이 VH 도메인 또는 VL 도메인이 단독으로 항원에 결합하는 데 사용될 수 있지만, VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 형성하여 항체의 항원 결합 부위를 제공한다. 예를 들어, Abet0380-GL VH 도메인 및 VL 도메인 둘 모두를 포함하는 항체의 항원 결합 부위가 형성되도록 Abet0380-GL VH 도메인(서열 번호: 524)은 Abet0380-GL VL 도메인(서열 번호: 533)과 쌍을 형성할 수 있다. 본원에 개시된 다른 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인에 대한 유사한 실시양태가 제공된다. 다른 실시양태에서, Abet0380-GL VH는 Abet0380-GL VL 이외의 다른 VL 도메인과 쌍을 형성한다. 경쇄 무차별 혼합(promiscuity)은 당업계에서 잘 확립되어 있다. 또한, 본 개시내용에 의해 본원에 개시된 다른 VH 도메인 및 VL 도메인에 대한 유사한 실시양태가 제공된다. 따라서, Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0380, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383 중 임의의 것의 VH CDR 또는 생식세포화된 VH 도메인 서열을 포함하는 VH 도메인은 상이한 항체로부터의 VL CDR 또는 생식세포화된 VL 도메인을 포함하는 VL 도메인과 쌍을 형성할 수 있고, 예컨대, VH 도메인 및 VL 도메인은 Abet0319, Abet0321b, Abet0322b, Abet0323b, Abet0328, Abet0329, Abet0332, Abet0342, Abet0343, Abet0369, Abet0370, Abet0371, Abet0372, Abet0373, Abet0374, Abet0377, Abet0378, Abet0379, Abet0380, Abet0381, Abet0382 및 Abet0383으로부터 선택된 상이한 항체로부터 유래될 수 있다.

항체 또는 항원 결합 단편은

(i) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 것, 또는 이의 생식세포화된 버전에 대하여 표 14 또는 첨부된 서열 목록에 제시된 VH 도메인 아미노산 서열, 또는

1 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 가지는 상기 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 아미노산 서열; 및

(ii) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 것, 또는 이의 생식세포화된 버전에 대하여 표 14 또는 첨부된 서열 목록에 제시된 VL 도메인 아미노산 서열, 또는

1 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 가지는 상기 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

항체 분자는

(i) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 것, 또는 이의 생식세포화된 버전에 대하여 표 14에 제시된 VH 도메인 아미노산 서열과 적어도 90%, 95% 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인; 및

(ii) Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 것, 또는 이의 생식세포화된 버전에 대하여 표 14에 제시된 VL 도메인 아미노산 서열과 적어도 90%, 95% 또는 98% 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 Abet0380, Abet0343, Abet0369, Abet0377 및 Abet0382 중 임의의 것, 또는 이의 생식세포화된 버전의 VH 도메인 및 VL 도메인과 적어도 90%, 95% 또는 98% 동일한 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 VH 도메인을 포함하고, 여기서, VH 도메인은

서열 번호: 525의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1;

서열 번호: 526의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2; 및

서열 번호: 527의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 VH 도메인을 포함하고, 여기서, VL 도메인은

서열 번호: 534의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1;

서열 번호: 535의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2; 및

서열 번호: 536의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서, VH 도메인은

서열 번호: 525의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1;

서열 번호: 526의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2; 및

서열 번호: 527의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함하고;

여기서, VL 도메인은

서열 번호: 534의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1;

서열 번호: 535의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2; 및

서열 번호: 536의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, VH 도메인은 서열 번호: 528, 서열 번호: 529, 서열 번호: 530 및 서열 번호: 531 중 임의의 하나 이상의 것과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL 도메인은 서열 번호: 537, 서열 번호: 538, 서열 번호: 539 및 서열 번호: 540 중 임의의 하나 이상의 것과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 도메인은 서열 번호: 524와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL 도메인은 서열 번호: 533과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체 분자 또는 항원 결합 단편은 항체 불변 영역을 포함한다. 항체 분자는 전체 항체, 예컨대, IgG, 즉, IgG1, IgG2 또는 IgG4일 수 있거나, 또는 하기 기술되는 항체 단편 또는 유도체일 수 있다. 항체 분자는 다른 포맷, 예컨대, Fc 영역 내에 YTE(문헌 [Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunology, 169: 5171-5180]; [Dall'Acqua et al. (2006) J Biol. Chem. 281(33):23514-24]) 및/또는 TM 돌연변이(문헌 [Oganesyan et al. (2008) Acta Cryst D64:700-4])를 가지는 IgG1을 가질 수도 있다.

본 개시내용은, 변이체가 카바트에 기술된 EU 인덱스에 의해 넘버링될 때 234번 위치에 페닐알라닌(F) 잔기를 포함하고, 235번 위치에 페닐알라닌(F) 잔기 또는 글루탐산(E) 잔기를 포함하고, 331번 위치에 세린(S) 잔기를 포함하는 것인, 변이체 Fc 영역을 가지는 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 돌연변이 조합물은 본원에서 이하 삼중 돌연변이체(TM: triple mutant)로서 지칭된다.

본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은

(i) 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41889(Abet0007);

(ii) 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41890(Abet0380-GL);

(iii) 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41891(Abet0144-GL);

(iv) 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41892(Abet0377-GL) 중 임의의 것의 핵산 서열 및/또는 벡터에 의해 코딩되는 CDR, VH 도메인, VL 도메인, 항체-항원 결합 부위 또는 항체 분자를 포함할 수 있다.

본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41889, 41890, 41891 또는 41892의 핵산, 벡터 또는 세포주로부터 제조될 수 있거나, 제조가능할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41890의 세포주의 핵산 또는 벡터의 발현에 의해 제조될 수 있다. 핵산 또는 벡터는 임의의 편리한 발현 시스템에 의해 발현될 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 항원 결합 단편은 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41889, 41890, 41891 또는 41892의 세포주에 의해 발현될 수 있다.

본 개시내용의 측면은 또한 수탁 번호 41889, 41890, 41891 또는 41892의 세포주에 함유되어 있는, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산; 수탁 번호 41889, 41890, 41891 또는 41892의 세포주에 함유되어 있는, 상기 핵산을 포함하는 벡터; 및 수탁 번호 41889, 41890, 41891 또는 41892의 세포 또는 세포주도 제공한다.

본 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 수탁 번호 41889, 41890, 41891 또는 41892하에 기탁된 핵산에 의해 코딩된 임의의 항체 분자, 또는 첨부된 서열 목록에 기술된 Abet007, Abet0380-GL, Abet0144-GL 또는 Abet0377-GL의 VH 도메인 및 VL 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자와 인간 Aβ1-42에의 결합에 대해 경쟁하는 항체의 항원 결합 부위 또는 항체 분자를 포함할 수 있다.

항체 또는 항원 결합 단편은 일반적으로 항원 결합 부위를 가지는 분자를 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 분자, 또는 항원 결합 부위를 포함하는 비항체 단백질일 수 있다.

단일클론 항체 및 다른 항체를 수득할 수 있고, 표적 항원에 결합하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 제조하기 위해 재조합 DNA 기술의 기법을 이용할 수 있다. 이러한 기법은 한 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변 영역, 또는 불변 영역 및 프레임워크 영역으로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400, 및 다수의 후속 문헌을 참조한다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포를 유전적으로 돌연변이화시킬 수 있거나, 또는 다르게 변이시킬 수 있고, 이는 제조되는 항체의 결합 특이성을 변경시킬 수 있거나, 변경시키지 않을 수 있다.

항체 조작 분야에서 이용가능한 추가 기법은 인간 항체 및 인간화 항체를 단리하는 것을 가능하게 만들었다. 예를 들어, (Kontermann & Dubel)(문헌 [Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545])에 의해 기술된 바와 같이 인간 하이브리도마를 제조할 수 있다.

마우스 면역계의 다른 성분들을 무손상 상태로 남기면서, 마우스 항체 유전자가 불활성화되어 있고, 인간 항체 유전자로 기능적으로 교체되어 있는 트랜스제닉 마우스가 인간 항체의 단리를 위해 사용될 수 있다(문헌 [Mendez, M. et al. (1997) Nature Genet, 15(2): 146-156]). 인간화 항체는 당업계에서 공지된 기법, 예컨대, 예를 들어, WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 565,332 및 WO93/17105에 개시된 것과 같은 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 추가로, WO2004/006955에는 비인간 항체의 가변 영역의 CDR 서열에 대한 캐노니컬(canonical) CDR 구조 유형을 인간 항체 서열, 예컨대, 생식세포 항체 유전자 세그먼트의 라이브러리로부터의 상응하는 CDR에 대한 캐노니컬 CDR 구조 유형과 비교함으로써 인간 항체 유전자로부터 가변 영역 프레임워크 서열을 선택하는 것에 기초한 항체의 인간화 방법이 기술되어 있다. 비인간 CDR과 유사한 캐노니컬 CDR 구조 유형을 가지는 인간 항체 가변 영역은 인간 프레임워크 서열의 선택에 사용되는 구성원 인간 항체 서열의 서브세트를 형성한다. 서브세트 구성원은 인간 CDR 서열과 비인간 CDR 서열 사이의 아미노산 유사성에 의해 추가로 등급화될 수 있다. WO2004/006955의 방법에서, 선택된 서브세트 구성원 인간 프레임워크를 사용하여 인간 CDR 서열을 비인간 CDR 대응물로 기능적으로 교체하는 키메라 항체의 구성을 위한 프레임워크 서열을 제공하도록 상위 등급의 인간 서열을 선택하여, 비인간 항체와 인간 항체 사이에 프레임워크 서열을 비교할 필요 없이 높은 친화도 및 낮은 면역원성의 인간화 항체를 제공한다. 상기 방법에 따라 제조된 키메라 항체 또한 개시한다.

합성 항체 분자는 예를 들어, (Knappik et al.)(문헌 [Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86]) 또는 (Krebs et al.)(문헌 [Krebs et al. Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84])에 의해 기술된 바와 같이, 합성되고 적합한 발현 벡터 내에서 조립된 올리고뉴클레오티드에 의해 생성된 유전자로부터의 발현에 의해 생성될 수 있다.

전체 항체의 단편(이는 본원에서 항체 단편 또는 항원 결합 단편으로서 지칭될 수 있다)이 항원에 결합하는 기능을 수행할 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 항원 결합 단편의 예로는 (i) VL 도메인, VH 도메인, CL 도메인 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 도메인 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 도메인 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편(문헌 [Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)]; [McCafferty et al. (1990) Nature, 348, 552-554]; [Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490]); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인은 이 두 도메인이 결합하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있게 만드는 펩티드 링커에 의해 연결되어 있는 것인, 단일 쇄 Fv 분자(scFv: single chain Fv)(문헌 [Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988]; [Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988]); (viii) 이중특이적 단일 쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965); 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구성된 "디아바디," 다가 또는 다중특이적 단편(WO94/13804; [Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993])이 있다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 도메인과 VL 도메인을 연결하는 이황화 브릿지의 도입에 의해 안정화될 수 있다(문헌 [Reiter, Y. et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996]). CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디 또한 제조될 수 있다(문헌 [Hu, S. et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996]). 결합 단편의 다른 예로는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에서의 소수의 잔기(항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함)의 부가에 의해 Fab 단편과 상이한 Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab' 단편인 Fab'-SH가 있다.

본 개시내용의 항원 결합 단편은 효소, 예컨대, 펩신 또는 파파인에 의한 분해, 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 브릿지의 절단과 같은 방법에 의해 본원에 열거된 항체 중 임의의 것으로부터 출발하여 수득될 수 있다. 또 다른 방식에서, 본 개시내용에 포함된 항원 결합 단편은 유사하게 당업자에게 널리 공지된 유전적 재조합 기법, 또는 예를 들어, 자동 펩티드 합성기, 예컨대, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 등의 회사에 의해 공급받은 자동 펩티드 합성기에 의한 펩티드 합성, 또는 핵산 합성 및 발현에 의해 수득될 수 있다.

본 개시내용에 따른 기능성 항체 단편은 반감기가 화학적 변경, 특히, PEG화에 의해, 또는 리포솜 내로의 도입에 의해 연장된 임의의 기능성 단편을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 dAb이다. dAb(도메인 항체)는 항체의 작은 단량체 항원 결합 단편, 즉, 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역이다. VH dAb는 낙타과 동물(예컨대, 낙타, 라마)에 자연적으로 존재하고, 낙타과 동물을 표적 항원으로 면역화시키고, 항원 특이적 B 세포를 단리시키고, 개별 B 세포로부터 dAb 유전자를 직접 클로닝함으로써 제조될 수 있다. dAb는 또한 세포 배양물에서도 제조가능하다.

항체를 수득하기 위해 다양한 방법들이 당업계에서 이용가능하다. 항체는 특히, 당업자에게 널리 공지된 표준 방법에 따라 수득될 수 있는 인간, 뮤린, 키메라 또는 인간화 항체 기원의 단일클론 항체일 수 있다.

일반적으로, 특히 뮤린 기원의 단일클론 항체 또는 그의 기능성 단편의 제조에 대해서는 특히, 매뉴얼 "Antibodies"[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988]에 기술된 기법, 또는 (Kohler and Milstein)(문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975])에 의해 기술된 하이브리도마로부터의 제조 기법을 참조할 수 있다.

일부 실시양태에서, 단일클론 항체는 예를 들어, 인간 Aβ1-42, 또는 상기 단일클론 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그의 단편들 중 하나, 예컨대, Aβ17-42로 면역화된 동물 세포로부터 수득될 수 있다.

WO 2006/072620에는 면역글로불린 도메인들의 베타 가닥들 사이에 확장되어 있는 구조적(비CDR) 루프 내의 항원 결합 부위의 조작이 기술되어 있다. 항원 결합 부위는 CDR의 천연 위치와 분리되어 있는 항체 분자의 영역, 예컨대, VH 또는 VL 도메인의 프레임워크 영역, 또는 항체 불변 도메인, 예컨대, CH1 및/또는 CH3에서 조작될 수 있다. 구조적 영역 내에서 조작된 항원 결합 부위는 VH 및 VL 도메인의 CDR 세트에 의해 형성된 항원 결합 부위 이외의 또는 그 대신의 항원 결합 부위일 수 있다. 다수의 항원 결합 부위들이 항체 분자에 존재하는 경우, 이들은 동일한 항원(표적 항원)에 결합하여 항체 또는 항원 결합 단편의 결합가를 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 다수의 항원 결합 부위들은 상이한 항원들(표적 항원 및 하나 이상의 또 다른 항원)에 결합할 수 있고, 이는 이펙터 기능을 추가하거나, 반감기를 연장시키거나, 또는 항체 분자의 생체내 전달을 개선시키는 데 사용될 수 있다.

항체 분자를 포함하는 이종성 제제 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 예를 들어, 상기 제제는 다양한 정도의 글리코실화 및/또는 유도체화된 아미노산, 예컨대, 파이로글루탐산 잔기를 형성하기 위한 N 말단 글루탐산의 고리화와 함께, 전장 중쇄, 및 C 말단 리신이 결여된 중쇄를 가지는 항체의 혼합물일 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Aβ1-42에 결합한다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편은 HTRF™ 경쟁 검정법에서 친화성 및/또는 억제 효능에 대해 최적화될 수 있다. 일반적으로, 효능 최적화는 선택된 항체 또는 항원 결합 단편의 서열(일반적으로, 항체의 가변 도메인 서열)을 돌연변이화시켜 항체 또는 항원 결합 단편의 라이브러리를 생성한 후, 이어서, 상기 라이브러리를 효능에 대해 검정하고, 효능이 더욱 강력한 항체 또는 항원 결합 단편을 선택하는 단계를 포함한다. 따라서, 선택된 "효능 최적화된" 항체 또는 항원 결합 단편은 라이브러리의 생성에 사용된 항체 또는 항원 결합 단편보다 더 높은 효능을 가지는 경향이 있다. 그럼에도 불구하고, 고효능 항체 또는 항원 결합 단편은 최적화 없이도 수득될 수 있고, 예를 들어, 고효능 항체 또는 항원 결합 단편은 초기 스크린으로부터 직접 수득될 수 있다. 검정법 및 효능은 본원의 다른 부분에 더욱 상세히 기술되어 있다. 따라서, 당업자는 고효능을 가지는 항체 또는 항원 결합 단편을 생성할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 3 및 4에 열거된 항체 중 임의의 것, 예컨대 scFv, IgG2, IgG1TM 또는 IgG1의 친화도, 또는 그보다 우수한 친화도로 인간 Aβ1-42에 결합할 수 있다. 대표적인 항체 결합 친화도는 표 5에 제시되어 있다. 상이한 항체 또는 항원 결합 단편의 결합 친화도 및 중화 효능은 적절한 조건하에서 비교될 수 있다.

본원에 기술된 아미노산 서열을 가지는 변이체를 포함하고, Aβ1-42에 대한 항체 또는 항원 결합 단편에서 사용될 수 있는, 본원에 기술된 VH 도메인 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체는 서열을 변경시키거나, 돌연변이화시키고, 원하는 특징을 가지는 항원 항체 또는 항원 결합 단편을 스크리닝하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 원하는 특징의 예로는 항원에 대한 특이성을 가지는 공지된 항체 대비 증가된, 항원에 대한 결합 친화성; 활성이 특정 몰비에서 항원에 대한 공지된 항체 또는 리간드와 경쟁하는 공지된 특정 경쟁 능력인 경우, 상기 항원에 대한 특이성을 가지는 공지된 항체 대비 증가된, 항원 활성 중화; 복합체를 면역침전시킬 수 있는 능력, 명시된 에피토프: 선형 에피토프, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이 펩티드 결합 스캔을 이용함으로써, 예를 들어, 선형 및/또는 구속된 입체구조에서 스크리닝된 펩티드를 사용함으로써 확인된 펩티드 서열, 또는 비연속 잔기에 의해 형성된 입체구조형 에피토프에 결합할 수 있는 능력; 및 인간 Aβ1-42의 새로운 생물학적 활성을 조절할 수 있는 능력을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 방법 또한 본원에서 제공한다.

본원에 개시된 항체 분자의 변이체는 본 개시내용에서 제조될 수 있고, 사용될 수 있다. 다변량 데이터 분석 기법을 구조/성질-활성 관계에 적용하는 데 있어서 컴퓨터 화학의 리드를 따라(예를 들어, 문헌 [Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski)]; [D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)] 참조), 널리 공지된 수학적 기법, 예컨대, 통계 회귀, 패턴 인식 및 분류를 이용하여 항체의 정량 활성-성질 관계를 도출해 낼 수 있다(예를 들어, 문헌 [Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3^rd edition (April 1998) ISBN: 0471170828]; [Kandel, Abraham et al. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995), ISBN: 0133418847]; [Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (December 2000), ISBN: 0198507089]; [Witten, Ian H. et al Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11, 1999), ISBN: 1558605525]; [Denison David G. T. (Editor) et al Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002), ISBN: 0471490369]; [Ghose, Arup K. et al. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8] 참조). 항체의 특성은 항체 서열, 기능적 및 3차원적 구조의 실험적 및 이론적 모델(예를 들어, 가능한 접촉 잔기 또는 계산된 물리화학적 특성의 분석)로부터 유도될 수 있고, 이들 특성은 개별적으로 또는 조합하여 고려될 수 있다.

일부 실시양태에서, VH 도메인 및 VL 도메인으로 구성된 항원 결합 부위는 전형적으로 폴리펩티드의 6개 루프: 즉, 경쇄 가변 도메인(VL)으로부터의 3개 루프 및 중쇄 가변 도메인(VH)으로부터의 3개 루프에 의해 형성된다. 공지된 원자 구조의 항체 분석을 통해 항체 조합 부위의 서열과 3차원적 구조 사이의 관계가 밝혀졌다(문헌 [Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817]; [Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948]). 이들 관계는 VH 도메인 내의 제3 영역(루프)을 제외한 결합 부위 루프가 소수의 주쇄 입체구조: 즉, 캐노니컬 구조 중 하나를 갖는다는 것을 암시한다. 특정 루프에서 형성된 캐노니컬 구조는 루프 및 프레임워크 영역 둘 모두에서 그의 크기 및 핵심 부위에서의 특정 잔기의 존재에 의해 결정되는 것으로 밝혀졌다.

서열-구조 관계에 관한 이 연구는 그의 CDR 루프의 3차원적 구조를 유지하여 결합 특이성을 유지하는 데 중요한 잔기를, 공지된 서열을 갖되 비공지된 3차원적 구조를 가지는 항체에서 예측하는 데 이용될 수 있다. 이 예측은 예측을 리드 최적화 실험으로부터의 결과물과 비교함으로써 백업될 수 있다. 구조적 방법에서, 임의의 자유롭게 이용가능한 또는 상업적인 팩키지, 예컨대, WAM(문헌 [Whitelegg, N.R.u. and Rees, A.R (2000). Prot. Eng., 12, 815-824])을 사용하여 항체 분자(문헌 [Chothia, et al. Science, 223,755-758 (1986)])의 모델을 생성할 수 있다. 이어서, 단백질 시각화 및 분석 소프트웨어 팩키지, 예컨대, 인사이트 II(Insight II)(Accelrys, Inc.)) 또는 딥 뷰(Deep View)(문헌 [Guex, N. and Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723])를 사용하여 CDR 내의 각각의 위치에서의 가능한 치환을 평가할 수 있다. 이어서, 이 정보를 이용하여 활성에 최소 또는 유리한 영향을 미칠 가능성이 있는 치환을 만들 수 있다.

CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열 내에서 치환을 만드는 데 요구되는 기법은 일반적으로 당업계에서 이용가능하다. 활성에 최소 또는 유리한 영향을 미칠 것으로 예측될 수 있거나 예측될 수 없는 치환을 가지는 변이체 서열이 제조될 수 있고, Aβ1-42에 결합할 수 있는 능력 및/또는 임의의 다른 원하는 특성에 대해 시험될 수 있다.

본원에 구체적으로 개시된 서열을 가지는 VH 도메인 및 VL 도메인 중 임의의 것의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체가 논의된 바와 같이 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.

상기 기술된 바와 같이, 본 개시내용의 측면은, VH 도메인의 서열이 하기 첨부된 서열 목록에 제시되어 있는 것인, 표 8에 열거된 항체 중 임의의 것의 VH 도메인과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 VH 도메인을 포함하고/거나; VL 도메인 서열이 첨부된 서열 목록에 제시되어 있는 것인, 표 9에 열거된 항체 중 임의의 것의 VL 도메인과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편, 예컨대, 항체 분자를 제공한다.

본 개시내용의 측면은, VH CDR 서열이 본원에 제시되어 있는 것인, 본원에 열거된 항체 중 임의의 것의 VH CDR 세트와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 VH CDR 세트를 가지는 VH 도메인을 포함하고/거나; VL CDR 서열이 본원에 제시되어 있는 것인, 본원에 열거된 항체 중 임의의 것의 VL CDR 세트와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 VL CDR 세트를 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편, 예컨대, 항체 분자를 제공한다.

두 아미노산 서열의 동일성(%)을 계산하는 데 사용될 수 있는 알고리즘으로는 예컨대, 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST(문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410]), FASTA(문헌 [Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448]), 또는 the 스미쓰-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘(문헌 [Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197])을 포함한다.

특정 가변 도메인은 하나 이상의 아미노산 서열 돌연변이(아미노산 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입), 내지 약 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 미만의 돌연변이를 포함할 수 있다.

돌연변이는 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 만들어질 수 있다. 돌연변이는 일반적으로 기능 상실을 초래하지 않는 바, 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Aβ1-42에 결합할 수 있는 능력을 보유할 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 예컨대, 본원에 기술된 검정법에서 측정된 바, 변경되지 않은 항체 또는 항원 결합 단편과 동일한 정량적 결합 및/또는 중화 능력을 보유할 수 있다. 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Aβ1-42에 결합할 수 있는 개선된 능력을 가질 수 있다.

돌연변이는 하나 이상의 아미노산 잔기를 비자연적으로 발생된 또는 비표준 아미노산으로 교체하는 것, 하나 이상의 아미노산 잔기를 비자연적으로 발생된 또는 비표준 형태로 변형시키는 것, 또는 하나 이상의 비자연적으로 발생된 또는 비표준 아미노산을 서열 내로 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 서열에서 변경의 수 및 위치의 예는 본원의 다른 부분에 기술되어 있다. 자연적으로 발생된 아미노산은 그의 표준 단일 문자 코드에 의해 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로서 확인된 20개의 "표준" L-아미노산을 포함한다. 비표준 아미노산은 폴리펩티드 백본 내로 도입될 수 있거나, 기존 아미노산 잔기의 변형으로부터 생성될 수 있는 임의의 다른 잔기를 포함한다. 비표준 아미노산은 자연적으로 발생된 또는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다. 수개의 자연적으로 발생된 비표준 아미노산, 예컨대, 4-하이드록시프롤린, 5-하이드록시리신, 3-메틸히스티딘, N-아세틸세린 등이 당업계에서 공지되어 있다(문헌 [Voet & Voet, Biochemistry, 2nd Edition, (Wiley) 1995]). 그의 N-알파 위치에서 유도체화되는 아미노산 잔기는 아미노산 서열의 N 말단에만 위치할 것이다. 일반적으로 본 개시내용에서 아미노산은 L-아미노산이지만, D-아미노산일 수도 있다. 따라서, 변경은 L-아미노산을 D-아미노산으로 변경시키거나, 교체하는 것을 포함할 수 있다. 메틸화된, 아세틸화된 및/또는 인산화된 형태의 아미노산 또한 공지되어 있고, 본 개시내용에서 아미노산은 상기와 같이 변형될 수 있다.

본 개시내용의 항체 도메인 및 항체 또는 항원 결합 단편에서 아미노산 서열은 상기 기술된 비천연 또는 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. 비표준 아미노산(예컨대, D-아미노산)은 합성 동안에 아미노산 서열 내로 도입될 수 있거나, 아미노산 서열 합성 후 "원래의" 표준 아미노산의 변형 또는 교체에 의해 아미노산 서열 내로 도입될 수 있다.

비표준 및/또는 비자연적으로 발생된 아미노산의 사용은 구조적 및 기능적 다양성을 증가시키는 바, 이에, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편에서 원하는 결합 및 중화 특성을 달성할 수 있는 잠재능을 증가시킬 수 있다. 추가로, D-아미노산 및 유사체는 동물, 예컨대, 인간에게 투여된 후 L-아미노산을 가지는 폴리펩티드의 생체내 분해로 인해 표준 L-아미노산과 비교하여 상이한 약동적 프로파일을 가지는 것으로 밝혀졌으며, 이는 D-아미노산이 일부 생체내 적용에 유리하다는 것을 의미한다.

하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이유발을 이용하여 전체 가변 도메인 내에서 돌연변이를 발생시킴으로써 본 개시내용의 CDR 유도된 서열을 보유하는 신규 VH 또는 VL 영역을 생성할 수 있다. 이러한 기법은 오류-유발 PCR을 이용한 (Gram et al.)(문헌 [Gram et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci., USA, 89:3576-3580])에 의해 기술되었다. 일부 실시양태에서, 1 또는 2개의 아미노산 치환이 전체 가변 도메인 또는 CDR 세트 내에서 만들어진다.

이용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 대한 돌연변이유발을 유도하는 것이다. 이러한 기법은 (Barbas et al.)(문헌 [Barbas et al., 1994, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 91:3809-3813]) 및 (Schier et al.)(문헌 [Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-567])에 의해 개시되었다.

상기 기술된 기법들은 모두 당업계에서 그 자체로서 공지되어 있고, 당업자는 당업계의 통상의 방법을 이용하여 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하기 위해 상기 기법을 이용할 수 있을 것이다.

본 개시내용의 추가 실시양태는 본원에 기술된 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 치환시키거나, 결실시키거나, 삽입함으로써, 상기 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하는 단계, 임의적으로, 상기와 같이 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계, 및 VH 도메인 또는 VH/VL 조합물 또는 조합물들을 시험하여 임의적으로 하나 이상의 원하는 특성을 가지는, Aβ1-42에 대한 항체 또는 항원 결합 단편 또는 항체의 항원 결합 부위를 확인하는 단계를 포함하는, 인간 Aβ1-42에 대한 항체의 항원 결합 부위를 수득하는 방법을 제공한다. 상기 VL 도메인은 실질적으로 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는 유사한 방법이 이용될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 실질적으로 본원에 기술된 바와 같은 CDR 아미노산 서열은 인간 항체 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분 내에 CDR로서 도입될 수 있다. 실질적으로 본원에 기술된 바와 같은 HCDR3 서열은 본 본 개시내용의 실시양태를 대표하고, 이들은 각각 인간 중쇄 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분 내에 HCDR3으로서 도입될 수 있다.

본 개시내용에서 사용된 가변 도메인은 임의의 생식세포 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 수득될 수 있거나, 또는 유도될 수 있거나, 또는 공지된 인간 가변 도메인의 컨센서스 또는 실제 서열에 기초한 합성 가변 도메인일 수 있다. 가변 도메인은 비인간 항체로부터 유도될 수 있다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 본 개시내용의 CDR 서열(예컨대, CDR3)을, CDR(예컨대, CDR3)이 결여된 가변 도메인의 레퍼토리 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, (Marks et al.)(문헌 [Marks et al Bio/Technology, 1992, 10:779-783])은 가변 도메인 부위의 5' 단부로 또는 그에 인접한 위치로 유도되는 컨센서스 프라이머를 인간 VH 유전자의 제3 프레임워크 영역에 대한 컨센서스 프라이머와 함께 사용하여 CDR3이 결여된 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공하는 것인, 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 제조하는 방법을 기술하였다. (Marks et al.)은 추가로 상기 레퍼토리가 특정 항체의 CDR3과 어떻게 조합될 수 있는지도 기술하였다. 유사한 기법을 이용하여, 본 개시내용의 CDR3 유도된 서열을, CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 셔플링시킬 수 있고, 셔플링된 완전한 VH 또는 VL 도메인을 동족 VL 또는 VH 도메인과 조합하여 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편을 제공할 수 있다. 이어서, 상기 레퍼토리는 적합한 항체 또는 항원 결합 단편이 선택될 수 있도록 적합한 숙주 시스템, 예컨대, WO92/01047(상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다), 또는 (Kay, Winter & McCafferty)(문헌 [Kay, B.K., Winter, J., and McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press])를 비롯한, 다수의 후속 문헌들 중 임의의 것의 파지 디스플레이 시스템에서 디스플레이될 수 있다. 레퍼토리는 10⁴개 이상의 개별 구성원, 예를 들어, 적어도 10⁵, 적어도 10⁶, 적어도 10⁷, 적어도 10⁸, 적어도 10⁹ 또는 적어도 10¹⁰개 이상의 구성원으롤부터의 임의의 것으로 구성될 수 있다. 다른 적합한 숙주 시스템으로는 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, T7 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 세포 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 공유 디스플레이를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

(a) 교체하고자 하는 CDR3을 포함하거나, 또는 CDR3 코딩 영역이 결여되어 있는 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하는 단계;

(b) 상기 레퍼토리를 VH CDR3, 예를 들어, 표 9에 제시된 VH CDR3에 대해 실질적으로 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 공여자 핵산과 조합하여, 상기 공여자 핵산이 레퍼토리 내의 CDR3 영역 내로 삽입되게 함으로써 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하는 단계;

(c) 상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키는 단계;

(d) 인간 Aβ1-42에 대한 항체 또는 항원 결합 단편을 선택하는 단계; 및

(e) 상기 항체 또는 항원 결합 단편 또는 그를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계를 포함하는, 인간 Aβ1-42에 대한 항체 또는 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 개시내용의 VL CDR3을 교체하고자 하는 CDR3을 포함하거나, 또는 CDR3 코딩 영역이 결여되어 있는 VL 도메인을 코딩하는 핵산의 레퍼토리와 조합하는 유사한 방법이 이용될 수 있다.

유사하게, 3개의 CDR 중 하나 이상, 또는 그들 모두 추후에 인간 Aβ1-42에 대한 항체 또는 항원 결합 단편 또는 항체 또는 항원 결합 단편에 대해 스크리닝되는 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 내로 이식될 수 있다.

예를 들어, 표 3 또는 표 4에 열거된 항체 중 하나 이상의 것로부터의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3, 예컨대, HCDR 세트가 사용될 수 있고/거나, 본원에 열거된 항체 중 하나 이상의 것으로부터의 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3, 예컨대, LCDR 세트가 사용될 수 있다.

유사하게, 본원에 개시된 다른 VH 및 VL 도메인, CDR 세트 및 HCDR 세트 및/또는 LCDR 세트가 사용될 수 있다.

면역글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분은 그의 개재 프레임워크 영역과 함께 적어도 3개의 CDR 영역을 포함할 수 있다. 상기 부분은 제1 프레임워크 영역 및 제4 프레임워크 영역 중 하나 또는 둘 모두를 적어도 약 50% 포함할 수도 있고, 여기서, 상기 50%는 제1 프레임워크 영역의 C 말단 50% 및 제4 프레임워크 영역의 N 말단 50%이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N 말단 또는 C 말단 단부에 위치하는 추가 잔기는 자연적으로 발생된 가변 도메인 영역과 일반적으로 관련되어 있지 않은 잔기일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의해 수행된 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편의 구성으로 클로닝 또는 다른 조작 단계를 촉진시키기 위해 도입된 링커에 의해 코딩되는 N 말단 또는 C 말단 잔기가 도입될 수 있다. 다른 조작 단계는 본 개시내용의 가변 도메인을, 항체 불변 영역, 다른 가변 도메인(예를 들어, 디아바디의 제조에서) 또는 본원의 다른 부분에서 더욱 상세하게 논의되는 검출가능한/기능성 표지를 포함하는 추가 단백질 서열에 연결하기 위한 링커의 도입을 포함한다.

비록 본 개시내용의 일부 측면에서, 항체 또는 항원 결합 단편이 한 쌍의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하기는 하지만, VH 또는 VL 도메인 서열에 기초한 단일 결합 도메인이 본 개시내용의 추가 측면을 형성한다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히, VH 도메인이 특이적 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 dAb에 관한 논의를 참조한다.

단일 결합 도메인들 중 어느 하나인 경우, 이들 도메인은 Aβ1-42에 결합할 수 있는 2-도메인 항체 또는 항원 결합 단편을 형성할 수 있는 상보적 도메인을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 이는 WO92/01047(상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 소위 계층적 이중 조합 접근법이라는 것을 이용하는 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있으며, 여기서, H 또는 L 쇄 클론을 함유하는 개별 콜로니를 사용하여 다른 쇄(L 또는 H)를 코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성된 2-쇄 항체 또는 항원 결합 단편을 파지 디스플레이 기법, 예컨대, 상기 참조문헌에 기술된 기법에 따라 선택한다. 이 기법 또한 문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 1992, 10:779-783]에 개시되어 있다.

본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 불변 영역 또는 그의 일부, 예컨대, 인간 항체 불변 영역 또는 그의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 그의 C 말단 단부에서 인간 Cκ 또는 Cλ 쇄를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기초한 항체 또는 항원 결합 단편은 그의 C 말단 단부에서 임의의 항체 이소타입, 예를 들어, 예컨대, IgG, IgA, IgE 및 IgM, 및 임의의 이소타입 서브클래스, 특히 IgG2, IgG1 및 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부(예컨대, CH1 도메인)에 부착될 수 있다. IgG2는 그의 이펙터 기능이 결여되어 있기 때문에, 일부 실시양태에서 유리할 수 있다. 다른 실시양태에서, IgG1은 그의 이펙터 기능 및 제조 용이성 때문에 유리할 수 있다. 이러한 특성을 가지고 있고, 가변 영역을 안정화시키는 임의의 합성 또는 다른 불변 영역 변이체 또한 본 개시내용에서 유용할 수 있다.

본 개시내용의 한 측면은 본원에서 제공된 항체 또는 항원 결합 단편이 인간 Aβ1-42에 결합하도록 또는 결합할 수 있도록 허용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 언급된 바와 같이, 상기 결합은 예컨대, 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산의 투여 후 생체내에서 일어날 수 있거나, 시험관내에서, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역세포화학법, 면역침전, 친화성 크로마토그래피 및 생화학적 또는 세포 기반 검정법에서 일어날 수 있다.

본 개시내용은 또한 경쟁 검정에서 항원 수준을 측정하기 위한 상기와 같은 항체 또는 항원 결합 단편의 용도, 즉, 경쟁 검정법에서 본 개시내용에 의해 제공된 항체 또는 항원 결합 단편을 사용함으로써 샘플 중의 항원 수준을 측정하는 방법도 제공한다. 이는 비결합 항원으로부터 결합된 항원의 물리적 분리가 필요하지 않은 경우일 수 있다. 결합시 물리적 또는 광학적 변화가 일어나도록 리포터 분자를 항체 또는 항원 결합 단편에 연결하는 것도 한가지 가능한 방법이다. 리포터 분자는 정량될 수 있는 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있다. 리포터 분자의 연결은 직접 또는 간접적으로, 예컨대, 펩티드 결합을 통해 공유적으로, 또는 비공유적으로 이루어질 수 있다. 펩티드 결합을 통한 연결은 항체 및 리포터 분자를 코딩하는 유전자 융합물의 재조합 발현의 결과일 수 있다.

항체 또는 항원 결합 단편의 경쟁은 예를 들어, ELISA를 이용하여, 및/또는 생화학적 경쟁 검정법, 예컨대, 태그부착되지 않은 하나 이상의 다른 항체 또는 항원 결합 단편의 존재하에서 검출될 수 있는 한 항체 또는 항원 결합 단편에 특이적 리포터 분자를 태그부착하는 검정법을 이용하여, 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 확인함으로써 시험관내에서 용이하게 검정될 수 있다. 상기 방법은 당업계의 숙련가에게 용이하게 공지되어 있고, 본원에 더욱 상세히 기술되어 있다.

본 개시내용은 본원에서 정의된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편, 예컨대, 표 3 및 4에 열거된 항체 중 임의의 것, 예컨대, IgG2, IgG1 또는 IgG1 삼중 돌연변이("TM"; 문헌 [Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64(Pt 6):700-4]) 포맷의 상기 항체와 인간 Aβ1-42에의 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 항원 결합 단편으로 확장된다. 항체 또는 항원 결합 단편 사이의 경쟁은 예를 들어, 태그부착되지 않은 항체 또는 항원 결합 단편(들)의 존재하에서 검출될 수 있는 한 항체 또는 항원 결합 단편에 특이적 리포터 분자를 태그부착하여 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 확인함으로써 시험관내에서 용이하게 검정될 수 있다. 경쟁은 예를 들어, Aβ1-42가 플레이트에 고정되어 있고, 태그부착되지 않은 또는 비표지된 하나 이상의 다른 항체 또는 항원 결합 단편과 함께 태그부착된 또는 표지된 제1 항체 또는 항원 결합 단편이 상기 플레이트에 첨가되는 ELISA를 이용함으로써 확인될 수 있다. 태그부착된 항체 또는 항원 결합 단편과 경쟁하는 태그부착되지 않은 항체 또는 항원 결합 단편의 존재는 태그부착된 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 방출된 신호의 감소에 의해 관찰된다.

경쟁 검정법은 에피토프 맵핑에서도 이용될 수 있다. 한 예에서, 에피토프 맵핑은 임의적으로 최적화된 중화 및/또는 조절 특징을 가질 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 결합된 에피토프를 확인하는 데 이용될 수 있다. 상기 에피토프는 선형 또는 입체구조형일 수 있다. 입체구조형 에피토프는 Aβ의 적어도 2개의 상이한 단편을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 단편은 Aβ 펩티드가 그의 3차 또는 4차 구조로 폴딩되어 Aβ의 억제제, 예컨대, Aβ 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 인식되는 입체구조형 에피토프를 형성할 때 서로 근접하게 위치한다. 경쟁에 대한 시험에서, 항원의 펩티드 단편, 특히, 관심 에피토프를 포함하거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 펩티드가 사용될 수 있다. 에피토프 서열 및 어느 한 단부에서 하나 이상의 아미노산을 가지는 펩티드가 사용될 수 있다. 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 항원에 대한 그의 결합이 주어진 서열을 가지거나, 포함하는 펩티드에 의해 억제되게 할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된"이라는 용어는 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산이 일반적으로 본 개시내용에 부합하게 되는 상태를 지칭한다. 따라서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, VH 및/또는 VL 도메인, 및 코딩 핵산 분자 및 벡터는 실질적으로 순수한 또는 균질한 형태로, 또는 핵산인 경우, 요구된 기능을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 서열로부터 유래된 핵산 또는 유전자를 함유하지 않거나, 실질적으로 함유하지 않는 형태로 예컨대, 그들의 천연 환경으로부터 단리된 및/또는 정제된 상태로 제공될 수 있다. 단리된 구성원 및 단리된 핵산은 그들과 자연적으로 회합되어 있는 물질, 예컨대, 그들의 천연 환경 또는 그들이 제조되는 환경(예컨대, 세포 배양물)(상기 제조가 시험관내 또는 생체내에서 실시된 재조합 DNA 기술에 의한 제조인 경우)에서 그들과 함께 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산을 함유하지 않게 되거나, 또는 실질적으로 함유하지 않을 것이다. 구성원 및 핵산은 희석제 또는 애주번트로 제제화될 수 있고, 여전히 실용적인 목적을 위해 단리될 수 있다 - 예를 들어, 구성원은 면역검정법에서 사용되기 위해 마이크로타이터 플레이트를 코팅하는 데 사용되는 경우, 일반적으로 젤라틴 또는 다른 담체와 혼합되거나, 진단 또는 치료에 사용되는 경우, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다. 항체 또는 항원 결합 단편은 자연적으로 글리코실화될 수 있거나, 또는 이종성 진핵 세포(예컨대, CHO 또는 NS0(ECACC 85110503) 세포)의 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 또는 (예컨대, 원핵 세포에서의 발현에 의해 제조되는 경우) 글리코실화되지 않을 수 있다.

4. 핵산, 세포 및 제조 방법

추가 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, VH 도메인 및/또는 VL 도메인 을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 및 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편, VH 도메인 및/또는 VL 도메인이 제조될 수 있도록 하는 조건하에서 상기 핵산을 발현시키는 단계, 및 상기 항체 또는 항원 결합 단편, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 회수하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 제조하는 방법을 제공한다. 코딩 핵산 서열의 예는 표 및 첨부된 서열 목록에 기재되어 있다. 본 개시내용에 따른 핵산 서열은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 특정 서열을 가지는 DNA 분자를 포괄하고, T가 U로 치환되어 있는 특정 서열을 가지는 RNA 분자를 포괄한다.

본 개시내용은 또한 예를 들어, 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 상기와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 예컨대, 플라스미드 또는 파지 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구성물도 제공한다.

추가 측면은 본 개시내용의 핵산 및/또는 벡터를 함유하거나, 또는 그로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 본 개시내용은 또한 상기와 같은 하나 이상의 구성물을 포함하는 재조합 숙주 세포주도 제공한다. 제공된 임의의 CDR 또는 CDR 세트, VH 도메인 또는 VL 도메인, 또는 항체의 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예컨대, scFv 또는 IgG(예컨대, IgG2, IgG1 또는 IgG1TM)를 코딩하는 핵산 서열은 코딩된 생성물을 그의 코딩 핵산 서열로부터 발현시키는 단계를 포함하는 코딩된 생성물의 제조 방법과 함께 본 개시내용의 한 측면을 형성한다. 발현은 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 발현에 의한 제조 후, 임의의 적합한 기법을 이용하여 VH 또는 VL 도메인, 또는 항체 또는 항원 결합 단편을 단리 및/또는 정제시킬 수 있고, 적절한 경우, 사용할 수 있다.

따라서, 본 개시내용의 또 다른 측면은 코딩 핵산 서열로부터 발현시키는 단계를 포함하는, 항체 VH 가변 도메인의 제조 방법이다. 상기 방법은 상기 항체 VH 가변 도메인이 제조될 수 있도록 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

VL 가변 도메인, 및 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제조하는 유사한 방법은 본 개시내용의 추가 측면으로서 제공한다.

제조 방법은 생성물의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 제조 방법은 생성물을, 적어도 하나의 추가 성분, 예컨대, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 포함할 수 있다.

각종의 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드를 클로닝하고, 발현시키는 시스템은 널리 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 식물 세포, 사상성 진균, 효모 및 바큘로바이러스 시스템, 및 트랜스제닉 식물 및 동물을 포함한다. 원핵 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에서 잘 확립되어 있다. 검토를 위해, 예를 들어, (Pluckthun)(문헌 [Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)])을 참조한다. 통상의 박테리아 숙주는 E. 콜라이(E. coli)이다.

배양물 중의 진핵 세포에서의 발현 또한 항체 또는 항원 결합 단편의 제조를 위한 옵션으로서 당업자에 의해 이용가능하다(문헌 [Chadd HE and Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194]; [Andersen DC and Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117]; [Larrick JW and Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418]).

이종성 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용가능한 포유동물 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 골수종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 그외 다수를 포함한다.

프로모터 서열을 포함하는 적절한 조절 서열, 종결인자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 경우, 다른 서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택될 수 있거나, 또는 구성될 수 있다. 벡터는 적절한 경우, 플라스미드, 예컨대, 파지미드, 또는 바이러스, 예컨대, 파지일 수 있다(문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual:3rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]). 예를 들어, 핵산 구성물의 제조에 있어서 핵산의 조작, 돌연변이유발, 서열분석, 세포 내로의 DNA의 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석을 위한 다수의 공지된 기법 및 프로토콜이 문헌 (Ausubel et al.)[Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4^th edition 1999]에 상세하게 기술되어 있다.

본 개시내용의 추가 측면은 본원에 개시된 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 시험관내에 존재할 수 있고, 배양물에 존재할 수 있다. 상기 숙주 세포는 생체내에 존재할 수 있다. 숙주 세포의 생체내 존재는 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편이 "인트라바디" 또는 세포내 항체로서 세포내에서 발현되게 할 수 있다. 인트라바디는 유전자 요법을 위해 사용될 수 있다.

또 다른 측면은 본 개시내용의 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 도입은 임의의 이용가능한 기법을 이용할 수 있다. 진핵 세포인 경우, 적합한 기법으로는 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포솜 매개 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예컨대, 백시니아, 또는 곤충 세포인 경우에는 바큘로바이러스를 사용한 형질도입을 포함할 수 있다. 숙주 세포, 특히 진핵 세포 내로의 핵산의 도입은 바이러스 또는 플라스미드 기반 시스템을 이용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피솜에서 유지될 수 있거나, 숙주 세포 내로 또는 인공 염색체 내로 도입될 수 있다. 도입은 단일 또는 다수의 유전자좌에서 하나 이상의 카피의 무작위적인 또는 표적화된 통합에 의해 달성될 수 있다. 박테리아 세포인 경우, 적합한 기법으로는 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.

도입 후, 이어서, 예컨대, 유전자의 발현을 위한 조건하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터 발현되게 하거나, 또는 발현될 수 있도록 허용할 수 있다. 발현된 생성물의 정제는 당업자에게 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.

본 개시내용의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예컨대, 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기법에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함함으로써 촉진될 수 있다.

본 개시내용은 또한 상기와 같은 항체 또는 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 상기 언급한 바와 같은 구성물을 사용하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.

5. 치료 방법

본 개시내용은 본원에 개시된 분자 중 임의의 것의 임의 조합을 이용하여 질환 또는 장애를 갖는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 a) 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것, 및 b) 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것을 이용하여 질환 또는 장애를 갖는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은

서열 번호: 525의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1;

서열 번호: 526의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2; 및

서열 번호: 527의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함하고;

여기서, VL 도메인은

서열 번호: 534의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1;

서열 번호: 535의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2; 및

서열 번호: 536의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, BACE 억제제는

의 캄실레이트 염이다. 일부 실시양태에서, BACE 억제제는

이다.

본원에 기술된 방법 중 임의의 방법을 위해, 본 개시내용은 한 방법의 임의 단계 또는 단계들과, 또 다른 방법으로부터의 임의 단계 또는 단계들의 조합을 고려한다. 본 방법은 특정 질환 또는 장애에 적합한 본 개시내용의 화합물 중 임의의 것을 유효량으로 그를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 본 방법은 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 조합하여 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것을 그를 필요로 하는 피험체에게 전달하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 Aβ의 축적과 관련된 임의의 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, Aβ의 축적은 Aβ의 대뇌 및/또는 해마 축적이다. 일부 실시양태에서, Aβ의 축적은 뉴런내 축적이다. 일부 실시양태에서, Aβ의 축적은 세포외 축적이다. 일부 실시양태에서, Aβ의 축적은 내피 세포내 축적이다. 일부 실시양태에서, Aβ의 축적은 망막내 축적이다. 일부 실시양태에서, Aβ의 축적은 뇌혈관구조내 축적이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 방법 중 임의의 것은 Aβ의 축적을 예방, 감소, 또는 역전시키는 데(예컨대, 제거하는 데) 유용하다.

일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 신경변성 질환 또는 장애이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 알츠하이머병, 다운 증후군, 황반 변성, 또는 인지 장애이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 포유동물이다. 특정 실시양태에서, 피험체는 인간이다.

일부 실시양태에서, 피험체는 치료적 유효 용량의, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것과 함께 조합된, 치료적 유효 용량의, 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것을 투여받는다. "치료적 유효 용량" 또는 "치료적 유효량"이라는 용어는, 투여 목적이 되는 원하는 효과를 일으키는 용량 또는 양을 의미한다. 정확한 용량은 치료 목적에 의존할 것이며, 이는 공지된 기법을 이용하여 당업자에 의해 확인할 수 있을 것이다(예커내, 문헌 [Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding] 참조).

본 개시내용은 그 중에서도 특히, 예를 들어, 아밀로이드 형성 질환의 예방 또는 치료를 위해 환자에서 환자에서 유익한 치료 반응(예컨대, CSF 중 Aβ1-42 감소, 플라크 부하 감소, 플라크 형성 억제, 신경염성 위축증 감소, 인지 기능 개선, 및/또는 인지 저하의 역전, 감소 또는 예방)을 발생시키는 조건하에서 환자에게 본 개시내용의 치료적 항체를 투여함으로써 알츠하이머병 및 다른 아밀로이드 형성 질환을 치료하는 것에 관한 것이다.

본원에서 "치료," "치료하는," "완화"라는 용어 등은 일반적으로 원하는 약리적 및/또는 생리적 효과를 수득한다는 것을 의미하는 것으로 사용되고, 이는 또한 치료되는 병태의 하나 이상의 증상의 중증도를 호전, 완화 및/또는 감소시키는 것을 지칭하는 것으로도 사용된다. 상기 효과는 질환, 병태, 또는 그의 증상의 발병 또는 재발을 완전히 또는 부분적으로 지연시킨다는 측면에서 예방적인 것일 수 있고/거나, 질환 또는 병태, 및/또는 상기 질환 또는 병태가 원인이 되는 악영향을 부분적으로 또는 완전히 치유한다는 측면에서 치료적인 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "치료"란, 포유동물, 특히, 인간의 질환 또는 병태의 임의 치료를 커버하고, (a) 질환 또는 병태에 걸리기 쉽지만, 아직은 질환 또는 병태를 앓는 것으로 진단을 받지는 않은 피험체에서 질환 또는 병태가 발생하지 못하게 막는 것; (b) 질환 또는 병태를 억제시키는 것(예컨대, 그의 발생을 정지시키는 것); 또는 (c) 질환 또는 병태를 경감시키는 것(예컨대, 하나 이상의 증상을 호전시키면서, 질환 또는 병태를 퇴행시키는 것) 중 임의의 하나 이상의 것을 포함한다. 예를 들어, 알츠하이머병의 "치료"는 상기 질환의 완전한 역전 또는 치유, 또는 알츠하이머병이 원인이 되는 병태 및/또는 악영향의 어느 정도의 호전을 포함한다. 단지 예시 목적으로, 알츠하이머병의 "치료"는 알츠하이머병과 연관된 하기 효과 중 임의의 것, 또는 그의 조합의 호전을 포함한다: 정신 쇠약, 정신 혼동, 망상, 방향감각 상실, 건망증, 집중력 저하, 새로운 정보를 기억하지 못함, 공격성, 불안, 이노성, 성격 변화, 자제력 결여, 분노, 무감동, 일반적인 불만, 외로움, 감정 기복, 우울증, 환각, 편집증, 식욕 감퇴, 초조, 근육 운동을 병행하지 못함, 난잡한 말, 시냅스 손상, 뉴런 손실, 아밀로이드 베타 축적, tau 과인산화, tau 단백질 축적, 아밀로이드 플라크 형성, 및 신경섬유 매듭 형성. 이들 병태 중 임의의 것의 호전은 표준 방법 및 당업계에 공지된 기법에 따라 쉽게 평가될 수 있다. 신경변성 질환, 예컨대, 알츠하이머병의 치료 효과를 측정하기 위해 상기에 열거되지 않은 다른 증상 또한 모니터링될 수 있다. 질환 방법에 의해 치료받는 피험체 집단으로는 바람직하지 못한 병태 또는 질환을 앓는 피험체 뿐만 아니라, 상기 병태 또는 질환의 발생 위험이 있는 피험체도 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료는 뇌에서의 Aβ n-42 종의 생성 및/또는 축적을 막는다. 일부 실시양태에서, Aβ n-42 종은 Aβ 1-42, Aβ 파이로 3-파이로-42, Aβ 4-42, 또는 Aβ 11-파이로-42 중 하나 이상의 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료는 Aβ 1-43의 축적을 막는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료는 Aβ 올리고머 및/또는 플라크의 생성 및/또는 축적을 막는다.

본 개시내용은 환자 뇌 중의 Aβ의 아밀로이드 침착물과 연관된 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 질환으로는 알츠하이머병, 다운 증후군, 및 인지 장애를 포함한다. 인지 장애는 아밀로이드 형성 질환의 다른 특징과 함께, 또는 그를 동반하지 않고 발생할 수 있다. 본 개시내용은 Aβ와 연관된 병태인 황반 변성을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 방법은 환자에게 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 조합하여, 1-42 Aβ 및 그의 N 말단 말단절단물에 특이적으로 결합하는 항체를 유효량으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것은 신경병리, 및 일부 환자에서는 알츠하이머병과 연관된 인지 장애를 예방하거나, 또는 호전시키기 위한 치료 요법에서 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 조합하여 사용될 수 있다.

치료로 치료될 수 있는 환자는 증상을 보이는 환자 뿐만 아니라, 질환의 위험은 있지만, 증상은 보이지 않는 개체도 포함한다. 알츠하이머병인 경우, 충분히 오랜 시간 동안 생존하는 경우라면, 잠재적으로는 누구나 위험을 가지고 있다. 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것은 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 조합하여 사용될 수 있고, 피험체 환자의 위험에 대해서는 평가하지 않고, 피험체에게 예방적으로 투여될 수 있다. 치료로 치료될 수 있는 환자로는 알츠하이머병의 공지된 유전적 위험을 가지고 있는 개체, 예를 들어, 이 질환을 앓는 혈족이 있는 개체 및 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 확인된 위험이 있는 개체를 포함한다. 알츠하이머병에 대한 소인의 유전적 마커는 APP 유전자 내의 돌연변이, 특히, 각각 하디(Hardy) 및 스웨디쉬(Swedish) 돌연변이로서 지칭되는, 717번 위치 및 670번 및 671번 위치에 존재하는 돌연변이를 포함한다. 위험의 다른 마커는 프레세닐린 유전자인 PS1 및 PS2; 및 AD, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증의 가족력인 ApoE4 내의 돌연변이이다. 알츠하이머병을 앓고 있는 개체는 상기 질환과 연관된 특징적인 치매에 의해 진단될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 기술된 위험 인자의 존재에 의해서도 진단될 수 있다. 개체에서 알츠하이머병 확인을 보조하는 데 다수의 진단 검사가 이용될 수 있다. 이는 CSF tau 및 Aβ1-42 수준 측정을 포함한다. 상승된 tau 및 감소된 Aβ1-42 수준이 AD의 존재를 나타낼 수 있다. 알츠하이머병을 앓고 있는 개체는 또한 NINCDS-ADRDA 또는 DSM-IV-TR 기준에 의해 진단될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 치료하고자 하는 알츠하이머병은 경미한 알츠하이머병(조기), 중간 정도의 알츠하이머병(중기), 또는 중증의 알츠하이머병(후기) 알츠하이머병이다.

무증상 환자에서, 치료는 임의의 연령(예컨대, 적어도 10, 20, 30세)에서 시작될 수 있다. 일반적으로, 치료는 노후에, 예를 들어, 환자가 그의 또는 그녀의 40, 50, 60 또는 70대에 도달하였을 때에 시작된다. 치료는 환자의 남은 수명의 지속 기간일 수 있는 기간에 걸친 다회 용량 투여를 포함할 수 있다. 반복 용량을 투여할 필요성은 시간의 경과에 걸쳐 항체 수준을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 다운 증후군 환자에서는 알츠하이머병이 조기 발병될 수 있기 때문에, 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 조합하여 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것을 투여하는 것은 다운 증후군 환자가 아닌 환자에서보다 어린 시기에(예컨대, 환자가 적어도 10, 20, 30대일 때) 시작될 수 있다.

예방을 위해, 약학 조성물 또는 의약은 알츠하이머병의 생화학적, 조직학적, 인지 장애 및/또는 거동 증상, 그의 합병증, 및 상기 질환의 발생 동안 나타나는 중간 병리적 표현형을 비롯한, 상기 질환의 위험을 제거하거나 또는 감소시키거나, 상기 질환의 중증도를 경감시키거나, 상기 질환의 발병 지연시키기에 충분한 양으로 알츠하이머병에 걸리기 쉽거나, 또는 다르게는 그의 위험이 있는 환자에게 투여된다. 치료 적용을 위해, 조성물 또는 의약은 상기 질환의 합병증 및 상기 질환의 발생에서 나타나는 중간 병리적 표현형을 비롯한, 상기 질환의 증상(생화학적, 조직학적, 인지 장애 및/또는 거동)을 치유하거나, 또는 적어도 부분적으로 그를 정지시키기에 충분한 양으로 상기 질환을 앓고 있는 것으로 의심되거나, 또는 이미 앓고 있는 환자에게 투여된다.

치료 방법은 (i) 본원에서 언급된 바와 같이 아밀로이드증과 연관된 병태를 앓는 환자를 확인하는 단계, 및 (ii) 치료적 유효 용량의, 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 조합하여, 치료적 유효 용량의, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서, Aβ1-42의 수준은 혈액 혈장 및/또는 CSF 중에서 감소되고, 아밀로이드증은 감소된다.

따라서, 본 개시내용의 추가 측면은 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 조합하여 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법, 단독으로, 또는 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 조합하여 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것을 포함하는 약학 조성물, 단독으로, 또는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것과 조합하여 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것을 포함하는 약학 조성물, 및 투여용 의약 제조에서, 예를 들어, 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 BACE 억제제를 제제화하는 단계를 포함하는, 의약 또는 약학 조성물의 제조 방법에서 상기 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 BACE 억제제의 용도를 제공한다. 약학적으로 허용되는 부형제는 이차 반응을 일으키지 않으면서 약학 조성물 내로 유입되고, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편의 투여를 용이하게 하고/거나, 신체 내에서의 그의 수명 및/또는 그의 효능을 증가시키거나, 용액에서 그의 가용성을 증가시키거나, 또는 그의 보존을 개선시키는 화합물 또는 화합물들의 조합물일 수 있다. 이들 약학적으로 허용되는 비히클은 널리 공지되어 있고, 선택된 활성 화합물(들)의 성질 및 투여 방식의 함수로서 당업자에 의해 적합화될 것이다.

본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은 일반적으로 항체 또는 항원 결합 단편 이외에 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 약학 조성물의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 본 개시내용에 따른, 및 본 개시내용에 따라 사용될 약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편 이외에도 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 물질은 비독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 의존할 것이다.

본원에 기술된 BACE 억제제는 일반적으로 항체 또는 항원 결합 단편 이외에 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 약학 조성물의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 본 개시내용에 따른, 및 본 개시내용에 따라 사용될 약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편 이외에도 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 물질은 비독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 의존할 것이다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것 및 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 임의의 것은 하기 투여 경로: 비경구적, 진피내, 근육내, 복강내, 심근내, 정맥내, 피하, 폐, 비내, 안구내, 경막외, 척수강내, 두개내, 뇌실내 및 경구 경로 중 임의의 하나 이상의 경로에 의해 피험체에게 투여된다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것은 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 동일한 조성물로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것은 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것을 포함하는 조성물로서 별개의 조성물로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것을 포함하는 조성물이 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것을 포함하는 조성물과 개별적으로 투여될 경우, 조성물은 동일한 투여 경로에 의해 피험체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 상이한 투여 경로에 의해 피험체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것을 포함하는 조성물은 주사를 통해 피험체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 주사는 정맥내 주사이다. 일부 실시양태에서, 주사는 피하 주사이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것을 포함하는 조성물은 경구적으로 피험체에게 투여된다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것과 조합하여 피험체에게 투여될 때, 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것의 약학적 유효 용량은 단독으로 투여될 때의 BACE 억제제의 약학적 유효 용량과 비교하여 더 적다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 조합하여 피험체에게 투여될 때, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것의 약학적 유효 용량은 단독으로 투여될 때의 항체 또는 항원 결합 단편의 약학적 유효 용량과 비교하여 더 적다.

예컨대, 정맥내 또는 피하 주사용의 주사가능한 제제의 경우, 활성 성분은 발열원을 함유하지 않고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 가지는, 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태로 존재할 것이다. 본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은 분자의 물리화학적 특성 및 전달 경로에 따라 액체, 반고체 또는 고체 형태로 제제화될 수 있다. 제제는 부형제 또는 부형제들의 조합물, 예를 들어, 당, 아미노산 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 액체 제제는 광범위한 항체 농도 및 pH를 포함할 수 있다. 고체 제제는 예를 들어, 동결건조, 분무 건조, 또는 초임계 유체 기술에 의한 건조에 의해 제조될 수 있다. 치료는 주사(예를 들어, 피하로 또는 정맥내로)에 의해 제공될 수 있다. 치료는 특히 항체 또는 항원 결합 단편의 용량을 감소시키면서, 펄스 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 치료의 물리화학적 특징에 의해, 질환에 대한 특별한 고려사항에 의해, 또는 효능을 최적화하거나, 또는 부작용을 최소화하기 위한 요건에 의해 결정될 수 있다. 한 특정 투여 경로는 정맥내 경로이다. 본 개시내용의 약학 조성물을 투여하는 또 다른 경로는 피하 경로이다. 바늘이 없는 장치를 이용한 피하 주사도 이롭다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것은 주사에 의해 피험체에게 투여된다.

본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것 및 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것은 동시에 또는 순차적으로 피험체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편/BACE 억제제 조합 요법 중 임의의 것은 추가 치료와 추가로 조합된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것 및 본 개시내용의 BACE 억제제 중 임의의 것은 의약 제조에서 사용될 수 있다. 의약은 개체에게 별개 투여용 또는 조합 투여용 의약일 수 있고, 따라서, 조합 제제로서, 또는 별개의 제제로서 항체 또는 항원 결합 단편 및 BACE 억제제를 포함할 수 있다. 별개의 제제는 별개 및 순차적 또는 동시 투여를 용이하게 하는 데 사용될 수 있고, 예컨대, 경구 투여 및 주사(예컨대, 정맥내 및/또는 피하) 투여와 같이, 성분을 상이한 경로에 의해 투여할 수 있게 하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조합 요법 중 임의의 것(예컨대, 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것과 조합하여 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함하는 요법 중 임의의 것)은 추가 요법과 조합하여 피험체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 요법으로는 기억 훈련 연습, 기억력 보조 장치, 인지 훈련, 식이 요법, 작업 요법, 물리 요법, 정신과 요법, 마사지, 침술, 지압, 이동 보조 기구, 보조 동물 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 추가 요법은 피험체에게 추가의 의약 성분을 투여하는 것이다. 일부 실시양태에서, 추가의 의약 성분은 특히, 하나 이상의 다른 약물과 항체 또는 항원 결합 단편의 조합물에 유의적인 시너지 효과를 제공하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 의약 성분은 본원에 열거된 병태 중 하나 이상의 것의 치료를 위해 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것 및/또는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것과 동시에 또는 순차적으로, 또는 그와의 조합 제제로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 추가의 의약 성분은 소형 분자, 폴리펩티드, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및/또는 siRNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 추가의 의약 성분은 도네페질(Aricept), 갈란타민(Razadyne), 메만틴(Namenda), 리바스티그민(Exelon), 또는 타크린(Cognex) 중 임의의 하나 이상의 것이다. 일부 실시양태에서, 추가의 의약 성분은 항우울제, 항불안제, 항정신병제 또는 수면제이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것 및 상기 추가의 의약 성분 중 하나 이상의 것이 의약 제조에서 사용될 수 있다. 의약은 개체에게 별개 투여용 또는 조합 투여용 의약일 수 있고, 따라서, 조합 제제로서, 또는 별개의 제제로서 항체 또는 항원 결합 단편 및 추가 성분을 포함할 수 있다. 별개의 제제는 별개 및 순차적 또는 동시 투여를 용이하게 하는 데 사용될 수 있고, 예컨대, 경구 투여, 정맥내 투여 및 비경구적 투여와 같이, 성분을 상이한 경로에 의해 투여할 수 있게 하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 BACE 억제제 중 임의의 것 및 상기 추가의 의약 성분 중 하나 이상의 것이 의약 제조에서 사용될 수 있다. 의약은 개체에게 별개 투여용 또는 조합 투여용 의약일 수 있고, 따라서, 조합 제제로서, 또는 별개의 제제로서 BACE 억제제 및 추가 성분을 포함할 수 있다. 별개의 제제는 별개 및 순차적 또는 동시 투여를 용이하게 하는 데 사용될 수 있고, 예컨대, 경구 투여 및 비경구적 투여와 같이, 성분을 상이한 경로에 의해 투여할 수 있게 하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것 및 상기 추가의 의약 성분 중 하나 이상의 것이 의약 제조에서 사용될 수 있다. 의약은 개체에게 별개 투여용 또는 조합 투여용 의약일 수 있고, 따라서, 조합 제제로서, 또는 별개의 제제로서 항체 또는 항원 결합 단편 및 추가 성분을 포함할 수 있다. 별개의 제제는 별개 및 순차적 또는 동시 투여를 용이하게 하는 데 사용될 수 있고, 예컨대, 경구 투여 및 비경구적 투여와 같이, 성분을 상이한 경로에 의해 투여할 수 있게 하는 데 사용될 수 있다.

제공된 조성물은 포유동물에게 투여될 수 있다. 투여는 일반적으로 환자에게 유익한 이익을 나타내는 데 충분한 치료적 유효량으로 제공된다. 상기 이익은 적어도, 적어도 하나의 증상 호전일 수 있다. 실제 투여량, 및 투여 속도 및 시간 과정은 치료되는 질환의 성질 및 중증도, 치료받는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 조성물 전달 부위, 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 BACE 억제제 유형, 투여 방법, 투여 일정 및 의사에게 공지된 다른 인자에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예컨대, 투여량 결정 등은 일반 의사 및 다른 의학 박사의 책임 범위 내에 있고, 치료되는 질환의 증상의 중증도 및/또는 질환의 진행에 의존할 수 있다. 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 본 개시내용의 BACE 억제제의 치료적 유효량 또는 적합한 용량은 그의 시험관내 활성을 동물 모델에서의 생체내 활성과 비교함으로써 결정될 수 있다. 시험 동물에서의 유효 투여량을 인간에게 외삽하는 방법은 공지되어 있다. 초기의 더 높은 적재 용량, 이어서, 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 치료는 의사의 재량에 따라 매일, 매주 2회, 매주 또는 매월인 간격으로 반복될 수 있다. 치료는 피하 투여인 경우, 2주 내지 4주마다 반복될 수 있고, 정맥내 투여인 경우, 4주 내지 8주마다 반복될 수 있다. 치료는 주기적일 수 있고, 투여 사이의 주기는 약 2주 이상, 예컨대, 약 3주 이상, 약 4주 이상 또는 약 월 1회이다.

본 개시내용에 비추어 볼 때 본 개시내용의 다양한 추가 측면 및 실시양태는 당업자에게 자명할 것이다.

데이터베이스 참고 번호 및 수탁 번호, 특허, 특허 출원 및 공개문헌을 비롯한, 본 명세서에서 언급된 모든 문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

문맥상 달리 언급되지 않는 한, 상기 기술된 특징의 설명 및 정의는 본 개시내용의 임의의 특정 측면 또는 실시양태로 제한되지 않고, 기술된 모든 측면 및 실시양태에 동등하게 적용된다.

이에, 본 개시내용의 특정 측면 및 실시양태가 첨부된 도면 및 표를 참조하면서 예를 통해 예시적으로 설명될 것이다.

6. 키트

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 BACE 억제제 중 임의의 것 및 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, BACE 억제제는 경구 투여에 적합한 조성물 중에 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 정맥내 또는 피하 투여에 적합한 조성물 중에 있다.

실시예

하기 서열은 NCIMB(영국 스코틀랜드 AB21 9YA 아버딘 벅스부른 크라이브스톤 에스테이트 퍼구손 빌딩 소재)에 기탁되었다:

E. 콜라이 TOP10 세포 Abet0007 = NCIMB 41889

E. 콜라이 TOP10 세포 Abet0380-GL = NCIMB 41890

E. 콜라이 TOP10 세포 Abet0144-GL = NCIMB 41891

E. 콜라이 TOP10 세포 Abet0377-GL = NCIMB 41892

기탁일 = 2011년 11월 2일.

실시예 1. 측면에 위치하는 버니어 잔기를 포함하는 6개의 CDR 모두의 돌연변이화를 통한 Abet0144 - GL의 항체 최적화

특정 항Aβ 항체 모체 클론, Abet0144-GL로부터의 신규한 항Aβ 항체의 최적화 및 특징규명에 관한 설명을 하기에 제공한다.

1.1 리보좀 디스플레이에 적합한 scFv 포맷으로의 Abet0144 - GL 모체 클론의 전환

친화성 최적화를 준비하기 위해 모체 클론을 IgG1-TM 포맷으로부터 단일 쇄 가변 단편(scFv) 포맷으로 전환시켰다. 코돈 최적화된 가변 중쇄(V_H) 및 가변 경쇄(V_L) 도메인을 특이적 클로닝 부위 및 가요성 링커 영역이 추가된 그의 각 IgG 벡터로부터 별개로 증폭시켰다. 이어서, 재조합 PCR을 수행하여 완전한 scFv 구성물을 생성하고, 이 구성물을 리보솜 디스플레이에 필요한 구조적 특징부를 함유하는 변형된 pUC 벡터(pUC-RD) 내로 클로닝하였다. 이들 특징부는 엑소뉴클레아제에 의한 mRNA 전사체의 분해를 방지하기 위한 5' 및 3' 줄기 루프, 리보솜의 mRNA 전사체에의 결합을 촉진시키기 위한 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열, 및 번역된 scFv 분자가 리보솜에 부착된 상태를 그대로 유지하면서 폴딩되게 하는 유전자III 스페이서를 포함한다(문헌 [Groves et al., 2005]).

1.2 표적화된 돌연변이유발에 의한 Abet0144 - GL의 최적화

친화성 기반 리보솜 디스플레이 선별과 함께 표적화된 돌연변이유발 접근법을 이용하여 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 개선된 친화성을 위해 리드 항체(Abet0144-GL)를 추가로 최적화시켰다. (Clackson) 및 (Lowman)(문헌 [Clackson et al., 2004])에 의해 기술된 바와 같이, 표준 분자생물학 기법을 이용하여 6개의 가변 중쇄(V_H) 및 가변 경쇄(V_L) 상보성 결정 영역(CDR) 모두의 올리고뉴클레오티드 지정된 돌연변이유발을 수행함으로써 Abet0144-GL로부터 유도된 큰 scFv 리보솜 라이브러리를 생성하였다. 각각의 CDR로부터 돌연변이화된 서열을 별개의 라이브러리로서 친화성 최적화하였다. V_HCDR1 앞의 5개 버니어 잔기(카바트 잔기 26-30) 또한 표적화된 돌연변이유발을 이용하여 무작위화하고, 이 서열을 조합하고, 남은 V_HCDR1 라이브러리와 함께 성숙화시켰다. 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대하여 더 높은 친화성을 가지는 변이체를 농축시키기 위해 모든 라이브러리들에 대해 친화성 기반 리보솜 디스플레이 선별을 수행하였다. 상기 선별은 본질적으로 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다(문헌 [Hanes et al., 2000]).

간략하면, Abet0144-GL 리드 클론의 6개의 표적화된 돌연변이유발 라이브러리(하나가 각각의 CDR을 커버)를 별개로 mRNA로 전사시켰다. 정지된 번역 프로세스를 이용하여 mRNA-리보솜-scFv 3원 복합체를 형성하였다(문헌 [Hanes et al., 1997]). 이어서, 합성 비오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(Bachem: 독일 소재; 카탈로그: H-5642)의 존재하에 그의 농도를 감소시켜 가면서(100 nM부터 10 nM까지) 상기 복합체를 인큐베이션하면서 그에 대해 4회의 라운드에 걸친 선별을 수행하여 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대해 더 높은 친화성을 가지는 변이체에 대해 선별하였다. 이어서, 항원에 결합된 상기 복합체를 스트렙트아비딘 코팅된 상자성 비드(Dynabeads™, Invitrogen: 영국 소재; 카탈로그: 112-05D) 상에서 포획하고, 비특이적 리보솜 복합체를 세척하여 제거하였다. 이어서, mRNA를 결합된 리보솜 복합체로부터 단리시키고, cDNA로 역전사시키고, PCR에 의해 증폭시켰다. 이 DNA를 다음 라운드의 선별을 위해 사용하였다.

4회의 라운드에 걸친 친화성 성숙화 후, 스크리닝 목적으로 각각의 선별 결과물을 클로닝하였다. 본질적으로 (McCafferty et al.)(문헌 [McCafferty et al., 1994])에 의해 기술된 바와 같이, 리보솜 디스플레이 구성물의 NotI/NcoI 제한 엔도뉴클레아제(New England BioLabs: 미국 소재; 카탈로그: R0189L, R0193L) 분해를 수행한 후, T4 DNA 리가제(New England BioLabs: 미국 소재; 카탈로그: M0202L)를 사용하여 NotI/NcoI로 분해된 pCANTAB6 내로 라이게이션시킴으로써 리보솜 디스플레이에 의해 단리된 scFv를 파지미드 벡터 pCANTAB6으로 클로닝하였다.

1.3 에피토프 경쟁 검정법을 이용한 개선된 클론의 확인

섹션 1.2에 기술된 표적화된 돌연변이유발 접근법의 선별 라운드 3 및 4로부터 무작위적으로 선택된 2,024개의 scFv를 박테리아에서 발현시켜 비정제된 주변세포질 scFv를 제조하였다. HTRF™ 플랫폼을 이용하여 경쟁 포맷 검정법에서 Abet0144-GL IgG1-TM과 동일한 에피토프를 통해 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 결합할 수 있는 scFv를 밝혔다. 구체적으로, 단일 농도의 각각의 비정제된 주변세포질 시험 scFv의 존재하에서 (비오티닐화된 아밀로이드 베타 1-42 펩티드와 연관된) 스트렙트아비딘 크립테이트와 (Abet0144-GL IgG1-TM과 연관된) 항인간 Fc XL665 사이의 공명 에너지 전달(FRET)을 측정하였다. 형광 플레이트 판독기 상에서 측정된 바, scFv에 의한 펩티드 상의 Abet0144-GL IgG1-TM 에피토프의 성공적인 점유는 FRET를 감소시켰다.

경쟁자 펩티드의 부재하에서 Abet0144-GL IgG1-TM의 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에의 결합을 분석함으로써 '총' 결합 신호를 측정하였다. 시험 scFv 샘플의 존재하에서 Abet0144-GL IgG1-TM의 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에의 결합을 분석함으로써 '샘플' 신호를 유도하였다. 마지막으로, 검출 시약 칵테일 단독으로 그에 매개된 형광을 분석함으로써 '크립테이트 블랭크' 신호를 측정하였다.

50 mM MOPS, pH 7.4, 0.5 mM EDTA, 및 0.5 M 수크로스로 구성된 샘플 완충제 중에서 비정제된 주변세포질 scFv를 공급하였다. 프로파일링을 위해, scFv 샘플을 384 웰 V 바닥 플레이트에서 50 mM MOPS, pH 7.4, 0.4 M 플루오르화칼륨, 0.1% 지방산 무함유 소 혈청 알부민 및 0.1% 트윈 20(v/v)으로 구성된 검정 완충제 중에서 원래 스톡 농도의 50%까지 희석시켰다. 액체 취급 로봇을 이용하여 5 ㎕의 각각의 새로 희석된 scFv를 검은색의 얕은 고체 바닥 비결합 384 웰 검정 플레이트의 '샘플' 웰로 옮겼다. (검정 완충제 중에서 제조된) 남은 시약을 하기 순서로 멀티채널 피펫으로 검정 플레이트에 첨가하였다: 5 ㎕ 샘플 완충제('총' 및 '크립테이트 블랭크' 웰에), 10 ㎕ 검정 완충제('크립테이트 블랭크' 웰에), 5 ㎕ 2 nM Abet0144-GL IgG1-TM('샘플' 및 '총' 웰에), 5 ㎕ 5 nM 비오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드('샘플' 및 '총' 웰에), 및 6 nM 스트렙트아비딘 크립테이트 및 60 nM 항His6-XL665로 구성된, 5 ㎕ 검출 칵테일(모든 웰에). 검정 플레이트를 밀봉한 후, 실온의 암실에서 3시간 동안 인큐베이션한 후, 형광 플레이트 판독기 상에서 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서 시분해 형광을 측정하였다.

각 샘플에 대한 델타 F(%) 값을 계산함으로써 데이터를 분석하였다. 델타 F(%)를 식 1에 따라 결정하였다.

식 1:

.

이어서, 델타 F 값을 이용하여 정규화된 결합 값을 식 2에 기술된 바와 같이 계산하였다.

식 2:

.

아밀로이드 베타 1-42 펩티드에의 Abet0144-GL IgG1-TM 결합의 유의적인 억제를 보인 비정제된 주변세포질 scFv에 대해 DNA 서열분석을 수행하였다(문헌 [Osbourn et al., 1996]; [Vaughan et al., 1996]). 독특한 단백질 서열을 가지는 것으로 밝혀진 scFv를 E. 콜라이에서 발현시키고, 친화성 크로마토그래피, 이어서 완충제 교환으로 정제하였다.

상기 기술된 에피토프 경쟁 검정법에서 일련의 scFv 희석물(전형적으로, 4 pM - 1,200 nM)을 시험함으로써 각각의 정제된 scFv의 효능을 측정하였다. 각 샘플에 대한 델타 F(%) 값 및 총 결합(%) 값을 계산함으로써 데이터를 다시 분석하였다. 추가로, 각 농도의 정제된 scFv에 대한 억제(%) 값 또한 식 3에 기술된 바와 같이 계산하였다:

식 3:

억제(%) = 100 - 총 결합(%).

과학적 그래프작성 소프트웨어를 이용하여 억제(%)에 대비 scFv 샘플 농도를 플롯팅하고, 임의의 농도 의존적 반응을 비선형 회귀 곡선으로 피팅하였다. -1 값으로 제한된 힐-기울기(Hill-slope)를 이용하여 상기 분석으로부터 IC₅₀ 값을 수득하였다. 이번 라운드의 선별로부터 수득된 가장 강력한 클론인 Abet0286의 IC₅₀은 1.8 nM이었고, 이는 V_LCDR1 표적화된 돌연변이유발 라이브러리로부터 유래된 것이었다.

시약/장치 공급원: MOPS(Sigma: 영국 소재; 카탈로그: M9381), 플루오르화칼륨(BDH chemicals: 미국 소재; 카탈로그: A6003), 지방산 무함유 소 혈청 알부민(Sigma: 영국 소재; 카탈로그: A6003), 트윈 20(Sigma: 영국 소재; 카탈로그: P2287), Abet0144-GL IgG1-TM(사내 제조), 비오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(rpeptide: 미국 소재; 카탈로그: A1117), 스트렙트아비딘 크립테이트(Cisbio: 프랑스 소재; 카탈로그: 610SAKLB), 항His6-XL665(Cisbio: 프랑스 소재; 카탈로그: 61HISXLB), 384 웰 검정 플레이트(Corning, Costar Life Sciences; 카탈로그: 3676), 384 웰 희석 플레이트(Greiner BioOne: 독일 소재; 카탈로그: 781280), 액체 취급 로봇(MiniTrak™, Perkin Elmer: 미국 소재), 형광 플레이트 판독기(Envision™, Perkin Elmer: 미국 소재), HTRF 기술(Cisbio International: 프랑스 소재), 그래프작성/통계 소프트웨어(Prism, Graphpad: 미국 소재).

1.4 "2원" 라이브러리를 제조하기 위한 성공적인 선별 결과물의 재조합, 및 그의 후속 친화성 최적화

섹션 1.3에 기술된 에피토프 경쟁 검정법을 이용하여, 특정 scFv-리보솜 라이브러리가 처음 4회의 라운드의 선별에 걸쳐 친화성 성숙화되었는지 여부를 판단하였다. 라이브러리들 중 2개의 라이브러리, 즉, V_HCDR3 표적화된 돌연변이유발 라이브러리 및 V_LCDR2 표적화된 돌연변이유발 라이브러리는 Abet0144-GL 모체 클론과 비교하였을 때, 어떤 개선도 보이지 않았고, 추가로 프로세싱하지 않았다.

(V_HCDR1, V_HCDR2, V_LCDR1 및 V_LCDR3을 커버하는) 남은 4개의 표적화된 돌연변이유발 라이브러리 친화성 개선을 보였고, 쌍별 방식으로 재조합하여 6개의 CDR 중 2개의 CDR이 돌연변이화된 6개의 "2원" 재조합 라이브러리를 제조하였다. 예를 들어, V_HCDR1을 커버하는 친화성 성숙화된 라이브러리를 친화성 성숙화된 V_HCDR2 라이브러리와 무작위적으로 재조합하여 V_H1:V_H2 라이브러리를 생성하였다. 남은 라이브러리는 V_H1:V_L1, V_H1:V_L3, V_H2:V_L1, V_H2:V_L3 및 V_L1:V_L3으로서 제조하였다. 각각의 재조합 라이브러리의 서브세트를 이전에 기술된 바와 같이(섹션 1.2) 클로닝하고, 각 라이브러리의 완전성 검증을 위하여 서열분석하기 위해 전송하였다.

이어서, 비오티닐화된 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 존재하에 그의 농도를 감소시켜 가면서(라운드 5 및 6에 대해 각각 5 nM 및 2 nM) 이전에 기술된 바와 같이(섹션 1.2) 계속해서 선별을 수행하였다. 상기와 같이, 스크리닝 목적으로 각각의 선별 결과물을 클로닝하였다(섹션 1.2).

선별 라운드 5 및 6으로부터 무작위적으로 선택된 1,936개의 scFv를 섹션 1.3에 기술된 바와 같이 에피토프 경쟁 검정법에서 스크리닝하였다. 이들 클론의 효능의 증가에 기인하여, 비정제된 scFv를 먼저 25%까지 희석시킨 후, 검정법 플레이트에 첨가하였다. 상기와 같이, 유의적인 억제 특성을 보인 클론은 DNA 서열분석을 위해 전송하고, 독특한 클론을 제조하고, 정제된 scFv로서 분석하였다(섹션 1.3). 상기 선별로부터 수득된 가장 강력한 클론인 Abet0303의 효능은 0.84 nM이었고, 이는 V_H1:V_H2 재조합 라이브러리로부터 유래된 것이었다.

1.5 "3원" 라이브러리를 제조하기 위한 2원 선별 결과물의 재조합, 및 그의 후속 친화성 최적화

섹션 1.3에 기술된 에피토프 경쟁 검정법을 이용하여, 각각의 2원 라이브러리가 이전 2회 라운드의 선별(5 및 6)에 걸쳐 친화성 성숙화되었는지 여부를 판단하였다. 모든 라이브러리들은 친화성 개선을 보였는 바, 이에 추가 친화성 성숙을 위한 것으로 고려되었다.

6개의 2원 라이브러리(섹션 1.4)를 성공적인 라운드 4 결과물(섹션 1.2)과 쌍별 방식으로 재조합하여 6개의 CDR 중 3개가 돌연변이화된 4개의 "3원" 재조합 라이브러리를 형성하였다. 예를 들어, V_H2:V_L3 2원 라이브러리(라운드 6 결과물)를 V_HCDR1 표적화된 돌연변이유발 라이브러리(라운드 4 결과물)와 재조합하여 V_H1:V_H2:V_L3 라이브러리를 생성하였다. 또한, V_H1:V_H2 2원 라이브러리(라운드 6 결과물)를 V_LCDR3 표적화된 돌연변이유발 라이브러리(라운드 4 결과물)와 조합하여 유사한 구성물을 생성하였다. 이들 두 개별 라이브러리를 풀링하여 V_H1:V_H2:V_L3 3원 라이브러리를 생성하였다.

함께 최적화된 CDR 사이의 시너지를 파괴하지 않도록 주의를 기울였다. 예를 들어, V_H1:V_L3 2원 라이브러리는 V_HCDR2 표적화된 돌연변이유발 라이브러리와 재조합하지 않았는데, 이는 이러한 조작이 함께 최적화된 V_HCDR1 서열과 V_LCDR3 서열 사이의 시너지를 파괴할 수 있기 때문이다. 모든 3원 라이브러리 및 그의 유도체에 관한 완전한 목록은 표 1에 제시되어 있다. 각 재조합 라이브러리의 서브세트를 이전에 기술된 바와 같이(섹션 1.2) 클로닝하고, 각 라이브러리의 완전성 검증을 위하여 서열분석하기 위해 전송하였다.

이어서, 비오티닐화된 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 존재하에 그의 농도를 감소시켜 가면서(라운드 7 및 8에 대해 각각 500 pM 및 200 pM) 이전에 기술된 바와 같이(섹션 1.2) 계속해서 선별을 수행하였다. 상기와 같이, 스크리닝 목적으로 각각의 선별 결과물을 클로닝하였다(섹션 1.2).

선별 라운드 7 및 8로부터 무작위적으로 선택된 1,408개의 scFv를 섹션 1.3에 기술된 바와 같이 에피토프 경쟁 검정법에서 스크리닝하였다. "2원" 스크린과 같이, 비정제된 scFv를 먼저 25%까지 희석시킨 후, 검정법 플레이트에 첨가하였다. 상기와 같이, 유의적인 억제 특성을 보인 클론은 DNA 서열분석을 위해 전송하고, 독특한 클론을 제조하고, 정제된 scFv로서 분석하였다(섹션 1.3). 상기 선별로부터 수득된 가장 강력한 클론인 Abet0343의 효능은 0.48 nM이었고, 이는 V_H1:V_H2:V_L3 재조합 라이브러리로부터 유래된 것이었다.

3.6 "4원" 라이브러리를 제조하기 위한 3원 선별 결과물의 재조합, 및 그의 후속 친화성 최적화

섹션 1.3에 기술된 에피토프 경쟁 검정법을 이용하여, 각각의 3원 라이브러리가 이전 2회 라운드의 선별(7 및 8)에 걸쳐 친화성 성숙화되었는지 여부를 판단하였다. 모든 라이브러리들은 친화성 개선을 보였는 바, 이에 추가 친화성 성숙을 위한 것으로 고려되었다.

V_H1:V_H2:V_L1 3원 라이브러리(라운드 8 결과물)를 V_LCDR3 표적화된 돌연변이유발 라이브러리(라운드 4 결과물)와 재조합하고, V_H2:V_L1:V_L3 3원 라이브러리(라운드 8 결과물)를 V_HCDR1 표적화된 돌연변이유발 라이브러리(라운드 4 결과물)와 재조합하였다. 별도로, V_H1:V_H2 2원 라이브러리(라운드 6 결과물)를 V_L1:V_L3 2원 라이브러리(라운드 6 결과물)와 재조하였다. 이들 3개의 개별 라이브러리를 풀링하여, 6개의 CDR 중 4개가 돌연변이화된 단일 "4원" 라이브러리, V_H1:V_H2:V_L1:V_L3을 생성하였다.

함께 최적화된 CDR 사이의 시너지를 파괴하지 않도록 주의를 기울였다. 예를 들어, V_H1:V_L2:V_L3 3원 라이브러리는 V_LCDR1 표적화된 돌연변이유발 라이브러리와 재조합하지 않았는데, 이는 이러한 조작이 함께 최적화된 V_HCDR1/V_HCDR2 서열과 V_LCDR3 서열 사이의 시너지를 파괴할 수 있기 때문이다. 각 재조합 라이브러리의 서브세트를 이전에 기술된 바와 같이(섹션 1.2) 클로닝하고, 서열결정하여 각각의 라이브러리의 완전성을 검증하였다.

이어서, 비오티닐화된 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 존재하에 그의 농도를 감소시켜 가면서(라운드 9 내지 11에 대해 50 pM 내지 10 nM) 이전에 기술된 바와 같이(섹션 1.2) 계속해서 선별을 수행하였다. 상기와 같이, 스크리닝 목적으로 각각의 선별 결과물을 클로닝하였다(섹션 1.2).

선별 라운드 9 내지 11로부터 무작위적으로 선택된 1,672개의 scFv를 섹션 1.3에 기술된 바와 같이 에피토프 경쟁 검정법에서 스크리닝하였다. 이들 클론의 효능의 증가에 기인하여, 비정제된 scFv를 먼저 3.13%까지 희석시킨 후, 검정법 플레이트에 첨가하였다. 상기와 같이, 유의적인 억제 특성을 보인 클론은 DNA 서열분석을 위해 전송하고, 독특한 클론을 제조하고, 정제된 scFv로서 분석하였다(섹션 1.3). 상기 선별로부터 수득된 가장 강력한 클론인 Abet0377의 효능은 0.32 nM (n=2 데이터)이었다. 샘플 억제 곡선은 도 1에 제시되어 있고, 가장 높은 효능을 보인 클론들 중 24개의 클론에 대한 데이터는 표 2에 제시되어 있다. 상응하는 단백질 서열은 표 3 및 표 4에 열거되어 있다.

1.7 표면 플라스몬 공명에 의한 정제된 scFv 포맷의 친화성 개선된 클론의 동적 프로파일링

표면 플라스몬 공명을 이용하여 HTRF™ 에피토프 경쟁 검정법에서 모체 서열인 Abet0144-GL과 비교하여 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 결합 친화성이 유의적으로 개선된 것으로 나타난 정제된 scFv 클론을 분석하였다(섹션 1.3-1.6) 간략하면, 프로테온 프로테인 인터렉션 어레이 시스템(ProteOn Protein Interaction Array System)(BioRad: 미국 소재)을 이용하여 각각의 정제된 scFv와 합성에 의해 제조된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 사이의 상호작용의 동력학적 파라미터를 평가하였다. 이들 실험은 본질적으로 (Karlsson et al.)(문헌 [Karlsson et al., 1991)에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다.

비오티닐화된 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(rPeptide: 미국 소재; 카탈로그: A1117)가 5개의 상이한 표면 밀도에서 비오틴/스트렙트아비딘 상호작용을 통해 사유 스트렙트아비딘 칩(NTA 176-5021)에 비공유적으로 결합되는 검정법을 이용하여 각 시험 scFv와 인간 아밀로이드 베타 1-42 사이의 결합 친화성을 추정하였다. 펩티드에 결합된 scFv를 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2.0)을 60초 동안 단일 주입하여 사이클 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 이 재생으로 scFv 결합 능력의 유의적으로 손실되지는 않았다.

신뢰도하에 적절한 결합 모델에 피팅될 수 있는 센서그램을 관찰하기에 충분한 시간 동안 100 - 200 nM의 각 scFv를 펩티드 표면 상에 순차적으로 통과시켰다. 임의의 완충제 인공물 또는 비특이적 결합 효과의 영향을 감소시키기 위해 비관련 scFv 블랭크를 주요 데이터 세트로부터 공제하였다. 이어서, 적절한 결합 모델을 데이터에 피팅하였다.

Abet0380 scFv의 경우, 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 해리 상수(KD)는 각각 1.93 x 10⁵ M^- ¹ s^-1, 2.85 x 10^-5 s^-1 및 148 pM이었다. 이들 파라미터는 데이터에의 1:1 랭뮤어 피팅으로부터 도출된 것이었다

1.8 인간 IgG1 - TM으로의 친화성 개선된 scFv의 재포맷화

가변 중쇄(V_H) 및 가변 경쇄(V_L) 도메인을, 각각 전체 인간 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터 내로 서브클로닝함으로써 scFv를 IgG1-TM으로 재포맷화시켰다. 가변 중쇄를, 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 함유하는 포유동물 발현 벡터(pEU 14) 내로 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG1-TM 중쇄를 발현시켰다. 유사하게, 가변 경쇄 도메인을, 인간 람다 경쇄 불변 도메인 및 조절 요소의 발현을 위한 포유동물 발현 벡터(pEU 44) 내로 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현시켰다.

IgG로서 항체를 수득하기 위해, 중쇄 및 경쇄 IgG 발현 벡터를 HEK293-EBNA 포유동물 세포(Invitrogen: 영국 소재; 카탈로그: R620-07) 내로 일시적으로 형질감염시켰고, 여기서, IgG가 발현되었고, 배지 내로 분비되었다. 수확물을 풀링하고, 정제하기 전에 여과하였다. 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 IgG를 정제하였다. 배양물 상청액을 적절한 세라믹 단백질 A 칼럼(BioSepra - Pall: 미국 소재) 상에 로딩하고, 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 250 mM NaCl로 세척하였다. 0.1 M 시트르산나트륨(pH 3.0)을 사용하여 결합된 IgG를 칼럼으로부터 용리시키고, 트리스-HCl(pH 9.0)을 첨가하여 중화시켰다. 용리된 물질을 NAP-10 완충제 교환 칼럼(GE Healthcare: 영국 소재; 카탈로그: 17-0854-02)을 이용하여 PBS로 완충제 교환하고, 정제된 IgG를 0.2 ㎛ 필터를 통해 통과시켰다. IgG의 아미노산 서열에 기초한 흡광 계수를 이용하여 IgG의 농도를 분광광도법으로 측정하였다. 정제된 IgG를 SEC-HPLC를 사용하고, SDS-PAGE에 의해 응집 또는 분해에 대해 분석하였다.

1.9 생식세포화

가장 강력한 IgG들 중 5개의 IgG를 그의 상응하는 scFv의 실험적 특징규명에 기초하여 생식세포화를 위해 선택하였다. 클론 Abet0343, Abet0369, Abet0377, Abet0380 및 Abet0382의 정제된 scFv는 모두 에피토프 경쟁 검정법에 의해 측정된 바, 750 pM 미만의 IC₅₀ 값을 나타내었고(표 2), 이들 모두 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바, 250 pM 미만의 실험적 해리 상수를 가졌다(표 5).

생식세포화 프로세스는 VH 도메인 및 VL 도메인 내의 프레임워크 잔기를 가장 유사한 생식세포 서열로 복귀시켜 인간 항체를 동일하게 일치시키는 것으로 구성되었다. 이는 최적화된 항체 계열의 VH 도메인의 경우, Vh3-23(DP-47)이었고, VL 도메인의 경우, Vλ3-3r(DPL-23)이었다. Abet0380의 경우, 1개의 잔기가 카바트 위치 43번에서 VH 도메인 내에서의 변이를 요구하였고(표 6), 1개의 잔기가 카바트 위치 81번에서 VL 도메인 내에서의 변이를 요구하였다(표 7). 남은 4개의 서열은 2개 내지 5개의 변이를 요구하였다(표 6 및 7). 측면에 위치하는 잔기 1 및 3과 동시에 생식세포화된 Abet0343의 경쇄 서열 내의 잔기 2를 제외한 버니어 잔기(문헌 [Foote et al., 1992])는 생식세포화되지 않았다. (Clackson) 및 (Lowman)(문헌 [Clackson et al., 2004])에 의해 기술된 바와 같이, 적절한 돌연변이유발성 프라이머와 함께 표준 부위 지정된 돌연변이유발 기법을 이용하여 상기 아미노산 잔기의 생식세포화를 수행하였다.

1.10 표면 플라스몬 공명을 이용한 친화성 최적화된 IgG의 결합 동적 성질 측정

표면 플라스몬 공명을 이용하여 친화성 최적화된 IgG(섹션 1.8) 및 이의 생식세포화된 대응물(섹션 1.9)의 결합 동적 성질을 분석하였다. 간략하면, 비아코어 T-100(GE Healthcare: 영국 소재) 바이오센서 기계를 이용하여 각 시험 IgG와 합성에 의해 제조된 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 사이의 상호작용의 동적 파라미터를 평가하였다. 상기 실험은 본질적으로 (Karlsson et al.)(문헌 [Karlsson et al., 1991])에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다.

각각의 항체가, 그 자체가 사유 CM5 칩에 아민 결합된 단백질 G 표면에 의해 비공유적으로 포획되는 검정법을 이용하여 각 시험 IgG와 인간 아밀로이드 베타 1-42 사이의 결합 친화성을 추정하였다. 리간드 및 결합된 항체를 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2.0)을 40초 동안 쌍으로 주입하여 사이클 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 이어서, 각 펩티드 주입을 위해 시험 항체를 재적용시켰다.

신뢰도하에 적절한 결합 모델에 피팅될 수 있는 센서그램을 관찰하기에 충분한 시간 동안 합성 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 일련의 희석물(0.063 - 1,024 nM)을 항체 표면 상에 순차적으로 통과시켰다. 각각의 IgG 데이터 세트로부터 블랭크 참조 유동 셀 데이터를 공제하고, 주요 데이터 세트로부터 농도가 0인 항체 단독 완충제 블랭크를 이중 참조 공제하였다. 이어서, BIA이벨루에이션(BIAevaluation) 소프트웨어를 이용하여 동시에 적절한 결합 모델을 각각의 비분석물 적정으로부터의 데이터에 피팅하였다.

계산된 Chi² 값을 이용하여 데이터의 유효성을 평가하였고, 여기서, 허용되는 값은 2 RU² 미만이었다. 잔차를 이용하여 피팅의 전반적인 성과를 평가하였고, 여기서, 편차가 2 RU 미만인 것이 허용되었다.

Abet0380-GL(생식세포화된) IgG1-TM에 대한 예시적 결과는 도 2에 제시되어 있다. 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 해리 상수(KD)는 각각 9.52 x 10⁵ M^-1 s^-1, 3.07 x 10^-4 s^-1 및 322 pM 이었다. 이들 파라미터는 데이터에의 1:1 랭뮤어 피팅으로부터 도출된 것이었다

1.11 표면 플라스몬 공명을 이용한 친화성 최적화된 IgG의 특이성 프로파일링

표면 플라스몬 공명을 이용하여 인간 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 친화성 최적화된 IgG의 특이성을 검증하였다. 간략하면, 비아코어 T-100(GE Healthcare: 영국 소재) 바이오센서 기계를 이용하여 각 시험 IgG와, 합성에 의해 제조된 인간 아밀로이드 베타 1-42 및 인간 아밀로이드 베타 1-40을 포함하는 다양한 소형 펩티드 사이의 상호작용의 동적 파라미터를 평가하였다. 상기 실험은 본질적으로 (Karlsson et al.)(문헌 [Karlsson et al., 1991])에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다.

항체가, 그 자체가 사유 CM5 칩에 아민 결합된 단백질 G 표면에 의해 비공유적으로 포획되는 검정법을 이용하여 각 시험 IgG와 각 펩티드 사이의 상호작용을 추정하였다. 리간드 및 결합된 항체를 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2.0)을 40초 동안 쌍으로 주입하여 사이클 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 이어서, 각 펩티드 주입을 위해 시험 항체를 재적용시켰다. 5 적용 단일 사이클 접근법을 이용하여 항체와 펩티드 사이의 상호작용을 관찰하였다. 리간드 및 결합된 항체를 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2.0)을 40초 동안 쌍으로 주입하여 사이클 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 이어서, 각 펩티드 주입 사이클을 위해 시험 항체를 재적용시켰다.

어떤 결합도 보이지 않았거나, 또는 신뢰도하에 적절한 결합 모델에 피팅될 수 있는 센서그램을 관찰하기에 충분한 시간 동안 각 시험 펩티드(64 내지 1,024 nM)를 항체 표면 상에 순차적으로 통과시켰다. 각각의 IgG 데이터 세트로부터 블랭크 참조 유동 셀 데이터를 공제하고, 주요 데이터 세트로부터 농도가 0인 항체 단독 완충제 블랭크를 이중 참조 공제하였다.

Abet0380-GL(생식세포화된) IgG1-TM에 대한 예시적 결과는 도 3에 제시되어 있다. 2개의 펩티드(비오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-42(rPeptide: 미국 소재; 카탈로그: A1117) 및 비표지된 뮤린 아밀로이드 베타 1-42(rPeptide: 미국 소재; 카탈로그: A1008)는 항체에 대해 강한 결합을 보인 반면, 2개의 펩티드, 비오티닐화된 인간 아밀로이드 베타 1-40(rPeptide: 미국 소재; 카탈로그: A1111) 및 비표지된 뮤린 아밀로이드 베타 1-40(rPeptide: 미국 소재; 카탈로그: A1007)은 항체에 대하여 어떤 결합도 보이지 않는다.

1.12 시험관내 면역조직화학법을 이용하였을 때의 천연 아밀로이드 베타에 대하여 가장 강력한 IgG의 친화성

천연 형태의 아밀로이드 베타 펩티드에 대한 상기 클론의 친화성을 추정하기 위한 목적으로 가장 강력한 IgG를 아밀로이드 베타에 결합할 수 있는 그의 능력에 대해 시험하였다. 간략하면, 리드 항체를 인간 알츠하이머병 뇌 절편 및 Tg2576 마우스 뇌 절편 상에서 스크리닝하여 시험관내에서 아밀로이드 플라크에 결합한 항아밀로이드 베타 1-42 항체를 확인하였다.

상기 실험에서, 중증 알츠하이머병을 앓는 2명의 개체(ApoE 유전자형 3/3, Braak 단계 6 및 ApoE 유전자형 4/3, Braak 단계 5)의 전두 피질로부터 인간 뇌 조직을 단리하였다. 대조군으로서, 1명의 비치매 개체(ApoE 유전형 3/3, Braak 단계 1)로부터 등가의 조직을 단리하였다. 15개월된 Tg2576 마우스(마우스 2마리) 및 22개월된 Tg2576 마우스(마우스 2마리)로부터 마우스 뇌 조직을 단리하였다. 항체를 2, 5, 10 및 20 ug ml^-1 농도로 시험하였다.

한 실험에서, Abet0380-GL IgG1-TM 항체는 Tg2576 뇌 절편 상에서는 점수 4로 코어 플라크(CP: core plaque)를 염색시켰고, 인간 AD 뇌 절편 상에서는 점수 3으로 염색시켰다. 또한, 상기 항체는 정도는 더 약하지만 미만성 플라크(DP: diffuse plaque) 및 대뇌 아밀로이드 맥관병증(CAA: cerebral amyloid angiopathy) 플라크를 염색시켰다. 대조적으로, 양성 대조군 항체는 동일한 조건하에서 인접 절편 상에서 모든 플라크(CP, DP, CAA)에 대해 점수 3-4를 보였다. 대표적인 영상은 도 4에 제시되어 있다.

1.13 웨스턴 블롯에 의한 Abet0380 - GL IgG1 - TM A베타42 인식 프로파일의 입증

SDS-PAGE 전에 Aβ42 올리고머를 가교 결합시키기 위해, PICUP(펩티드의 광 유도 가교 결합: photo-induced cross-linking of peptide)를 하기와 같이 수행하였다. 2 ㎕의 스톡(10 mM)을 18 ㎕의 1xPBS에 첨가하여 1 mM의 Ru(Bpy) 용액을 생성하였다. 추가로, 2 ㎕의 스톡(200 mM)을 18 ㎕의 1xPBS에 첨가하여 20 mM의 과황산암모늄 용액(APS)을 생성하였다. 사용되지 않은 스톡은 드라이 아이스 상에서 즉시 급냉시키고, -80℃ 냉동기에 다시 넣었다. 암실에서 5 ㎕의 Ru(Bpy)를 80 ㎕의 응집체(순수한 10 μM 샘플)에 첨가한 후, 5 ㎕의 APS를 첨가하였다. 10sec 동안 암실에서 램프로 샘플에 방사선 조사하였다. 30 ㎕의 (4x) LDS 샘플 완충제를 즉시 첨가하였다.

이어서, 가교 결합된(PICUP) Aβ1-42 응집체 및 비가교 결합된 Aβ1-42 응집체에 대해 SDS-PAGE를 수행하였다. 용액을 10분 동안 70℃에서 가열 블록 내에서 인큐베이션하였다. 한편, 5 ㎕의 매직 마크(Magic Mark) XP 웨스턴 단백질 표준, 5 ㎕의 노벡스 샤프(Novex Sharp) 미리 염색된 단백질 표준을 조합하여 마커를 생성하였다. 10분 동안 인큐베이션한 후, MES 전개 완충제와 함께 샘플 및 마커를 NuPAGE 노벡스 4-12% 비스-트리스 겔(1.0 mm, 15 웰, 15 ㎕/웰) 상에 로딩하였다. 겔을 35분 동안 200 V에서 전개시켰다.

이어서, 인비트로겐(Invitrogen)의 i블롯(iBlot) 기계를 이용하여 겔을 20 V에서 7분 동안(프로그램 P3) PVDF 막 상으로 블롯팅하였다.

일단 블롯팅이 완료되고 나면, 겔 적층물을 해체한 후, 이어서, PVDF 막을 약하게 회전시키면서 실온에서 1시간 동안 50 ml의 4% MPBST(PBST 중의 4% Marvel)에서 차단시켰다. 이어서, 개별 항체로 프로빙하기 위해 블롯을 스캘펄로 절단하였다. 이를 1차 항체 용액(10 ml의 3% MPBST 중의 2 ug/ml)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다.

이어서, 막을 PBST로 5회(각각 5분) 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 2차 항체 용액(10 ml의 PBST 중의 1 ㎕ 항인간 Fc 특이적 - HRP 접합체)에서 인큐베이션하였다. 막을 PBST로 3x 및 PBS로 2x 세척하였고, 이들은 각각 5분씩 수행되었다.

최종 세척 동안, 화학발광 슈퍼시그널 웨스트 듀라(SuperSignal West Dura) 기질(Thermo Scientific; 34075)을 실온까지 가온시켰다. 각각 600 ㎕씩 두 용액을 조합하였다. PVDF 막으로부터 PBS를 경사분리한 후, 피펫을 이용하여 상기 막을 혼합된 듀라 시약으로 덮었다. 반응을 ~5분(이 시간 동안 VerscDoc Imaging System을 설치하였다) 동안 진행시킨 후, (변환 필터를 이용하여 증강시키면서) 영상을 30 sec 노출로 촬영하였다. 대표적인 영상은 도 5에 제시되어 있다.

실시예 2. 생체내에서의 Abet0380 - GL IgG1 - TM 항체의 특이적인 기능적 반응을 입증하는 연구

2.1 생체내에서의 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 감소에 의한 Abet0380-GL IgG1-TM의 기능적 특징규명

8주령된 수컷 알비노 할란 스프라그-돌리 래트(n = 8-12)는 25 mM 히스티딘, 7% 수크로스, 0.02% p80 계면활성제로 구성된 투약 비히클(pH 6.0)을 이용하여 5 ml/kg으로 정맥내 주사에 의해 1회 용량의 Abet0380-GL IgG1-TM 항체를 제공받았다. 투약 용액을 투약 직전에 제조하였다. 동물을 명시된 시점에 마취시키고, 뇌척수액(CSF)을 대수조(cisterna magna)로부터 흡입하였다. 세포 또는 잔해를 제거하기 위한 20분의 샘플링 이내에 4℃에서 대략 3000 x g에서 10분 동안 CSF 샘플을 원심분리하였다. 이어서, 샘플을 드라이 아이스 상에서 냉동시키고, 후속 분석을 위해 -70℃에서 보관하였다.

동물을 참수하여 희생시키고, 뇌 조직을 해부하고, 디에틸아민(DEA; Fluka, Sigma: 영국 소재; 카탈로그: 31729) 중에서 뇌 조직으로부터 아밀로이드 베타 펩티드를 추출하였다. 간략하면, 냉동된 뇌 조직을 0.2% DEA 및 50 mM NaCl(Merck: 미국 소재; 카탈로그: 1.06404.1000)에서 균질화시켰다. 뇌 균질물을 1시간 동안 133,000 x g에서 초원심분리하였다. 회수된 상청액을 2 M 트리스-HCl(TRIZMA^®-하이드로클로라이드; Sigma: 영국 소재; 카탈로그: 93363)로 pH 8.0까지 중화시키고, 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 동물 실험은 스웨덴 농무부(Swedish Board of Agriculture)에 의해 제공된 관련 지침 및 규정에 따라 수행하였다. 윤리적 허가는 동물 실험에서 전문화된 윤리 위원회: 스톡홀름 소드라 동물 연구 윤리 위원회(Stockholm Sodra Animal Research Ethical Board)로부터 받았다.

Abet0380-GL에 결합된 아밀로이드 베타 1-42 펩티드를 제거하기 위한 면역침전에 이어서, 인비트로겐으로부터 입수한 시판용 ELISA 키트에 의한 분석을 이용하여 래트 CSF에서 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 측정을 수행하였다. 간략하면, 단백질 A 비드의 용액(Dynabeads^® Protein A; Invitrogen: 영국 소재; 카탈로그: 100-02D)을 96 웰 비스커트형(non-skirted) 플레이트(폴리프로필렌 0.2 ml; VWR International: 영국 소재; 카탈로그: 10732-4828)에 첨가하고, 자석(DynaMag™ 96 면; Invitrogen: 영국 소재; 카탈로그: 123.31D)을 이용하여 TBST(50 mM TBS; Sigma: 영국 소재; 카탈로그: T6664 + 0.1% 트윈20)로 2회 세척함으로써 상기 용액으로부터 상기 비드를 분리하였다. 해동된 래트 CSF 샘플(40 ㎕)을 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 경사 회전시키면서 40℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 자석을 사용하여 비드를 펠릿화하고, 30 ㎕의 면역침전된 CSF 샘플을 70 ㎕의 표준 희석제 완충제(프로테아제 억제제로 보충됨; Roche: 영국 소재; 카탈로그: 11836153001)가 이미 첨가된 ELISA 키트(마우스 아밀로이드 베타(1-42) 비색 ELISA 키트; Invitrogen: 영국 소재; 카탈로그: KMB3441)로부터 96 웰 플레이트로 옮겼다. 보정 표준 샘플을 플레이트에 이중으로 첨가하고, 플레이트를 진탕시키면서, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 검출 항체 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다시, 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 2차 항체 작업 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 안정화된 발색체를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 암실에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 정지시키기 위해, 100 ㎕의 정지 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 450 nm의 흡광도에서 2시간 이내에 판독하였다. 단일 CSF 샘플을 분석하고, 다중 비교를 위한 조정 없이, 로그 변환된 데이터에 대한 일원 ANOVA와 함께 프리즘 4(GraphPad: 미국 소재)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.

마우스 아밀로이드 베타 (1-42) 비색 ELISA 키트(Invitrogen: 영국 소재; 카탈로그: KMB3441)의 변형을 사용하여 래트 뇌 균질물 중의 총 아밀로이드 베타 1-42 펩티드(유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 및 Abet0380-GL에 결합된 아밀로이드 베타 1-42 펩티드)의 측정을 수행하였다. 키트 검출 항체를 Abet0380-GL IgG1-TM 항체로 교체하고, 2차 항체를 항인간 IgG HRP-접합체 항체(Jackson ImmunoResearch: 영국 소재; 카탈로그: 109-035-098)로 교체하였다. 간략하면, 샘플 희석제(프로테아제 억제제로 보충됨; Roche: 영국 소재; 카탈로그: 11836153001)에 1:2로 희석된 50 ㎕의 해동된 뇌 균질물 및 표준 샘플을 96 웰 ELISA 플레이트에 이중으로 첨가하였다. 과량의 Abet0380-GL IgG1-TM 항체(50 ㎕, 4 ㎍/ml)를 각 웰에 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 2차 항체 작업 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 안정화된 발색체를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 암실에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 정지시키기 위해, 100 ㎕의 정지 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 450 nm의 흡광도에서 2시간 이내에 판독하였다. 다중 비교를 위한 조정 없이, 로그 변환된 데이터에 대한 일원 ANOVA와 함께 프리즘 4(GraphPad: 미국 소재)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.

마우스 아밀로이드 베타 (1-40) 비색 ELISA 키트(Invitrogen: 영국 소재; 카탈로그: KMB3481)를 사용하여 래트 뇌 균질물 중의 총 아밀로이드 베타 1-40 펩티드의 측정을 수행하였다. 간략하면, 샘플 희석제(프로테아제 억제제로 보충됨; Roche: 영국 소재; 카탈로그: 11836153001)에 희석된 50 ㎕의 해동된 뇌 균질물 및 표준 샘플을 96 웰 ELISA 플레이트에 이중으로 첨가하였다. 50 ㎕의 검출 항체 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 2차 항체 작업 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 플레이트를 400 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하고, 100 ㎕의 안정화된 발색체를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 암실에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 정지시키기 위해, 100 ㎕의 정지 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 450 nm의 흡광도에서 2시간 이내에 판독하였다. 다중 비교를 위한 조정 없이, 로그 변환된 데이터에 대한 일원 ANOVA와 함께 프리즘 4(GraphPad: 미국 소재)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.

2.2 생체내에서의 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 감소에 의한 Abet0380-GL IgG1-TM의 기능적 특징규명

20 mg/kg의 1회 용량의 Abet0380-GL IgG1-TM 항체는 섹션 2.1에 기술된 검정법에서 투약 후 72시간 또는 168시간째에 래트 내의 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 CSF 수준을 정량 한계까지 감소시켰다(데이터는 제시되어 있지 않음). 생체내에서의 Abet0380-GL IgG1-TM 항체의 효과를 추가로 조사하기 위해, 14일에 걸쳐 0.25, 0.5, 1, 5 또는 10 mg/kg의 용량을 매주 래트에게 투여하였다. CSF 중의 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드 뿐만 아니라, 뇌 조직 내의 총 아밀로이드 베타 1-42 또는 1-40 펩티드의 수준을 측정하기 위해 제2 투약 후 168시간째에 동물을 안락사시켰다.

유리 아밀로이드 베타 1-42의 용량 의존적 감소가 CSF에서 입증되었다(도 6a). 2개의 가장 높은 용량인 5 및 10 mg/kg은 이용된 검정법에서 아밀로이드 베타 1-42 펩티드를 정량 한계까지 감소시킨 반면, 0.5 및 1 mg/kg의 용량은 비히클 대조군과 비교될 때, 아밀로이드 베타 1-42 펩티드를 각각 47% 및 61%만큼 유의적으로 감소시켰다. 가장 낮은 용량인 0.25 mg/kg은 CSF 중 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드를 14% 감소시켰지만, 통계적 유의성에는 도달하지 못하였다. Abet0380-GL IgG1-TM 항체에 의한 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 격리로 인해 총 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 용량 의존적 증가가 뇌 조직에서 입증되었다(도 6b) 그러나, 뇌 조직 중의 총 아밀로이드 베타 1-40 펩티드의 수준에는 어떤 영향도 없었는 바(도 6c), 이로써, 아밀로이드 베타 1-42 펩티드에 대한 Abet0380-GL IgG1-TM의 특이성이 입증된다. 요약하면, 래트 연구로부터 수득된 상기 결과는 Abet0380-GL IgG1-TM 항체가 0.5 내지 1 mg/kg의 ED ₅₀ 으로 CSF 중 유리 아밀로이드 베타 1-42 펩티드의 수준을 감소시켰다는 것을 보여주었다.

2.3 Abet0380 - GL IgG1TM의 기능적 특징규명 - 생체내에서의 비플라크 결합 - 노화된 Tg2576 마우스에게로의 말초 투약 후 168시간 경과하였을 때, 생체내에서의 아밀로이드 베타 플라크에의 Abet0380 - GL IgG1 - TM의 결합 부재의 입증

Abet0380-GL IgG1-TM을 1회 말초 투약 후 노화된 Tg2576 마우스에서 아밀로이드 베타 플라크에 결합할 수 있는 그의 능력에 대해 시험하였다. 동물 실험은 스웨덴 농무부에 의해 제공된 관련 지침 및 규정에 따라 수행하였다. 윤리적 허가는 동물 실험에서 전문화된 윤리 위원회: 스톡홀름 소드라 동물 연구 윤리 위원회로부터 받았다. 17개월된 암컷 Tg2576 마우스(n=5)는 25 mM 히스티딘, 7% 수크로스, 0.02% p80 계면활성제로 구성된 투약 비히클(pH 6.0)을 이용하여 5 ml/kg으로 정맥내 주사에 의해 1회 용량의 비히클, 30 mg/kg의 양성 대조군 항체, 또는 10 또는 30 mg/kg의 Abet0380-GL IgG1-TM 항체를 제공받았다. 투약 후 168시간째에 동물을 깊은 마취 상태로 만들고, 실온에서 PBS로, 이어서, 냉(4℃) 포스페이트 완충처리된 4% 파라포름알데히드(PFA)를 관류시켰다. 이어서, 동물을 참수하여 희생시키고, 뇌를 해부하고, 72시간 동안 4℃에서 PFA 중에 침지시켜 고정시켰다. 고정제를 0.1% 소듐 아지드 함유 PBS로 교환하고, 조직을 추가로 프로세싱할 때까지 4℃에서 보관하였다.

뇌 절편 상에서 면역조직화학법을 수행하여 생체내에서의 Abet0380-GL IgG1-TM의 아밀로이드 베타 플라크에의 결합 정도를 평가하였다. 간략하면, 면역조직화학법을 위해 파라핀 포매된 뇌 절편을 제조하였다. 에피토믹스(Epitomics)로부터 입수된 토끼 항마우스 IgG1 및 IgG2 특이적 2차 항체를 사용하여 뇌 실질 내에 침착된 Abet0380-GL IgG1-TM 또는 양성 대조군 항체의 검출을 수행하였다. 옴니맵(OmniMap) 검출 시스템(Ventana Medical Systems: 미국 소재)을 사용하여 벤타나(Ventana) 로봇 상에서 염색을 수행하였다. 생체외에서의 스파이킹(spiking)을 위해, 결합 조직 절편을 주사된 과량의 Abet0380-GL IgG1-TM 또는 양성 대조군 항체로 시험관내에서 염색하였다. 2차 항체 및 발색체는 상기와 동일하였다.

염색의 점수화는 10x의 광학 확대 배율하에서 맹검 방식으로 수행하였다. 데코레이션된 플라크의 분포가 관찰되었다. 플라크 표지화 강도를 0(플라크 염색 부재)부터 최대 4(플라크 데코레이션 강함)까지 상대적 강도 등급에 따라 점수화하였다.

Abet0380-GL IgG1-TM은 10 또는 30 mg/kg의 말초 투약 후 168시간째에 생체내에서 아밀로이드 베타 플라크 또는 대뇌 아밀로이드 맥관병증 (CAA)을 데코레이션하지 않았다. 양성 대조군 항체는 생체내 플라크 데코레이션이 강한 것에서부터 낮은 것까지 나타났다. 모든 동물들에서 코어 플라크, 미만성 플라크 및 CAA와 함께 부분적 및 국소적 분포 패턴이 뚜렷이 보였다. 대표적인 영상이 도 7에 제시되어 있다. Abet0380-GL IgG1-TM 및 양성 대조군 항체를 사용한 동일한 동물로부터의 뇌 조직의 생체외 스파이킹은 이전에 입증된 주사된 항체의 생체외 플라크 결합 능력을 확인시켜 주었다(데이터는 제시되어 있지 않음).

실시예 3. 항Aβ1 -42 서열

예시적 항체 VH 도메인, VL 도메인, 개별 CDR 서열, HCDR 세트, LCDR 세트, 및 프레임워크 영역을 포함하는 항체 분자의 서열의 예가 첨부된 서열 목록에 열거되어 있다.

표 5에 열거된 24개의 최적화된 클론의 서열을 비교하였다. 표 8 및 9는 각각 VH 도메인 및 VL 도메인 사이의 서열 동일성(%)을 보여주는 것이다.

실시예 4: 경쟁 결합 실험에서 Abet0380 - GL IgG1 - TM의 특이성

경쟁 결합 실험에서 Abet0380-GL IgG1-TM의 특이성을 조사하였다. 간략하면, Abet0380-GL IgG1-TM(0.5 nM)을 상이한 농도 범위의 (10 uM부터 0.17 nM까지) 전장, 말단절단 및 파이로 인간 A베타 펩티드(A베타 1-42, A베타 1-43, A베타 1-16, A베타 12-28, A베타 17-42, A베타 파이로-3-42, 또는 A베타 파이로-11-42)로 이루어진 패널과 함께 인큐베이션하였다(실온에서 1hr).

Abet0380-GL IgG1-TM과 A베타 펩티드 N 말단 비오틴 A베타 1-42(1.5 nM) 사이의 인큐베이션 후, 유로퓸 크립테이트 표지된 항인간 Fc 항체(0.8 nM)(CisBio 카탈로그 번호 61HFCKLB) 및 스트렙트아비딘-XL^ent!(5 nM)(CisBio 카탈로그 번호 611SAXLB)을 첨가하였다. 이어서, 검정물을 실온에서 추가로 2 hr 동안 인큐베이션한 후, 표준 균일 시분해 형광(HTRF) 판독 프로토콜을 사용하여 엔비젼(Envision) 플레이트 판독기(PerkinElmer) 상에서 판독하였다. 이어서, 경쟁 부재시, (각각 스트렙트아비딘-XL^ent ^! 및 유로퓸 크립테이트 표지된 항인간 Fc 항체와 복합체를 형성한) Abet0380-GL IgG1-TM과 N 말단 비오틴 A베타 1-42의 상호작용은 유로퓸 크립테이트 공여자 및 XL⁶⁶⁵수용자 형광단의 근접성에 기인하여 시분해 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET: time resolved fluorescence resonance energy transfer)을 통해 측정할 수 있었다. 그러므로, 시험 펩티드에 의한 Abet0380-GL IgG1-TM:N 말단 비오틴 A베타 1-42 상호작용과의 경쟁이 검정 신호를 감소시켰다. 결과는 특이적 결합(%)으로 표시하였고, 여기서, 100% 특이적 결합은 스트렙트아비딘-XL^ent!(5 nM), N 말단 비오틴 A베타 1-42(1.5 nM), Abet0380-GL IgG1-TM(0.5 nM) & 유로퓸 크립테이트 표지된 항인간 Fc 항체(0.8 nM)를 함유하는 웰로부터 도출된 것이었다. 0% 특이적 결합은 Abet0380-GL IgG1-TM이 생략된 웰로부터 도출된 것이었다.

최종 검정 부피는 20 ㎕였고, 모든 반응물은 MOPS pH7.4 (50 mM), 플루오르화칼륨(0.4 M), 트윈 20(0.1%) & 지방산 무함유 BSA(0.1%)를 포함하는 검정 완충제 중에서 제조하였다. 저용량 384 웰 검은색 검정용 플레이트(Costar 3676)에서 검정을 수행하였다.

요약하면, A베타 1-42, A베타 1-43, A베타 17-42, A베타 파이로-3-42 & A베타 파이로-11-42의 경우에 Abet0380-GL IgG1-TM: N 말단 비오틴 A베타 1-42 결합 억제가 관찰되었고, 상기 군에 대한 IC₅₀ 값은 10^-8 내지 10^-9 몰 범위였다. A베타 1-16 또는 A베타 12-28의 경우에는 Abet0380-GL IgG1-TM: N 말단 비오틴 A베타 1-42 결합 억제가 관찰되지 않았다(도 8).

실시예 5: 정상 래트 PK-PD 연구에서 아밀로이드 베타 1-42를 격리시킬 수 있는 항체 Abet0144 - GL의 능력

정상 래트에서의 PK-PD 연구에서 아밀로이드 베타 1-42를 격리시킬 수 있는 항체 Abet0144-GL의 능력을 조사하였다. 2주 동안 매주(0 및 7일째) 래트에 Abet0144-GL(10 또는 40 mg/kg) 또는 비히클을 정맥내로 투여하고, 2차 투약 후 1주째에 희생시켰다. CSF를 유리 및 총 아밀로이드 베타 1-42 측정을 위해 샘플링하고, 뇌를 총 아밀로이드 베타 1-42 측정을 위해 샘플링하였다. 상기 기술된 검정법을 이용하여 유리 및 총 아밀로이드 베타 1-42 수준을 측정하였다.

도 9에 제시된 바와 같이, CSF 중의 유리 아밀로이드 베타 1-42는 10 또는 40 mg/kg의 Abet0144-GL에 의해 유의적으로 변경되지 않았다(비히클과 비교하였을 때, 각각 5 및 18% 증가; 도 9). CSF 중의 총 아밀로이드 베타 1-42는 10 mg/kg일 때, 38%만큼, 및 40 mg/kg일 때, 139%만큼 유의적으로 증가되었다. 뇌 조직 중 총 아밀로이드 베타 1-42 또한 10 및 40 mg/kg일 때, 각각 16% 및 50%만큼 유의적으로 증가되었다. 요약하면, 정상 래트에서의 본 연구로부터 얻은 데이터를 통해, Abet0144-GL은, CSF 및 뇌, 둘 모두에서 그 중의 총 아밀로이드 베타 1-42 수준을 증가시키면서, CSF 중 유리 아밀로이드 베타 1-42 수준에는 유의적인 영향을 미치지 않았다는 것이 입증되었다. 이는 수십 nM 범위의 표적에 대한 친화성을 가지는 항체로부터 예상되는 프로파일이었다.

실시예 6: 6 '- 브로모스피로 [시클로헥산-1,2'- 인덴 ]-1',4( 3'H )- 디온

20-30℃에서 THF(16.75 L) 중 6-브로모-1-인다논(8.38 kg, 39.7 mol)의 교반된 혼합물을 함유하는 100 L 반응 장치에 포타슘 tert-부톡시드(223 g, 1.99 mol)를 투입한다. 이어서, 온도를 20-30℃로 유지시키면서, 메틸 아크릴레이트(2.33 L, 25.8 mol)를 15분 동안 상기 혼합물에 투입하였다. THF(400 mL) 중에 용해된 포타슘 tert-부톡시드(89.1 g, 0.79 mol)의 용액을 첨가한 후, 20-30℃에서 20분 동안 메틸 아크릴레이트(2.33 L, 25.8 mol)를 첨가하였다. 이어서, THF(400 mL) 중에 용해된 포타슘 tert-부톡시드(90 g, 0.80 mol)의 ⅓ 분량을 첨가한 후, 20-30℃에서 20분 동안 메틸 아크릴레이트(2.33 L, 25.8 mol)의 ⅓ 분량을 첨가하였다. 20-30℃에서 1시간 동안, THF(21.9 L) 중에 용해된 포타슘 tert-부톡시드(4.86 kg, 43.3 mol)를 반응 장치에 투입하였다. 반응물을 대략 65℃로 가열하고, 23 L의 용매를 증류시켰다. 반응물 온도를 60℃로 하강시키고, 55-60℃에서 30분 동안, 물(51.1 L)에 용해된 50% 수성 수산화칼륨(2.42 L, 31.7 mol)을 혼합물에 첨가한 후, 혼합물을 60℃에서 6시간 동안 교반하고, 2시간 동안 20℃로 냉각시켰다. 20℃에서 12시간 동안 교반한 후, 고체 물질을 여과하고, 물(8.4 L) 및 THF(4.2 L)의 혼합물로 2회에 걸쳐 세척한 후, 진공하에 50℃에서 건조시켜 6'-브로모스피로[시클로헥산-1,2'-인덴]-1',4(3'H)-디온(7.78 kg; 26.6 mol)을 수득하였다.

실시예 7: (1r,4r)-6'-브로모-4-메톡시스피로[시클로헥산-1,2'-인덴]-1'(3'H)-온

대략 0-5℃에서 대략 25분 동안에 걸쳐, DCM(3.8 L)에 용해된 보란 tert-부틸아민 복합체(845 g, 9.7 mol)를 DCM(42.4 L) 6'-브로모스피로[시클로헥산-1,2'-인덴]-1',4(3'H)-디온(7.7 kg, 26.3 mol)의 슬러리에 투입하였다. 0-5℃에서 1시간 동안 교반하면서 반응물을 방치한 후, 분석을 통해 전환율이 >98%인 것을 확인하였다. 염화나트륨(2.77 kg), 물(13.3 L) 및 37% 염산(2.61 L, 32 mol)으로부터 제조된 용액을 투입하였다. 혼합물을 대략 15℃로 가온시키고, 층으로 정치시킨 후, 상을 분리하였다. 메틸 메탄술포네이트(2.68 L, 31.6 mol) 및 테트라부틸암모늄 클로라이드(131 g, 0.47 mol)와 함께 유기상을 다시 반응 장치로 복귀시키고, 혼합물을 20℃에서 왕성하게 교반하였다. 이어서, 50% 수산화나트륨(12.5 L, 236 mol)을 대략 1시간 동안에 걸쳐 왕성하게 교반된 반응 혼합물에 투입하고, 20℃에서 밤새도록 왕성하게 교반하면서, 반응물을 방치하였다. 물(19 L)을 첨가하고, 분리 후, 수성상을 폐기하였다. 유기층을 대략 40℃로 가열시키고, 33 L의 용매를 증류시켰다. 에탄올(21 L)을 투입하고, 온도를 증가시키면서 증류를 재개하였다(최대 79℃에서 증류된 22 L). 대략 75℃에서 에탄올(13.9 L)을 투입하였다. 온도를 72-75℃로 유지시키면서, 30분 동안에 걸쳐 물(14.6 L)을 투입하였다. 대략 400 mL의 용액을 500 mL 폴리에틸렌 병으로 배출시키고, 샘플은 자발적으로 결정화되었다. 배치를 50℃로 냉각시키고, 결정화된 슬러리 샘플을 다시 용액에 첨가하였다. 혼합물을 40℃로 냉각시켰다. 혼합물을 4시간 동안 20℃로 냉각시킨 후, 밤새도록 교반하였다. 고체를 여과하고, 에탄올(6.6 L) 및 물(5 L)의 혼합물로 세척하고, 진공하에 50℃에서 건조시켜 (1r,4r)-6'-브로모-4-메톡시스피로[시클로헥산-1,2'-인덴]-1'(3'H)-온(5.83 kg, 18.9 mol)을 수득하였다.

실시예 8: ( 1r,4r )-6'- 브로모 -4- 메톡시스피로 [시클로헥산-1,2'- 인덴 ]-1'(3'H)-이민 하이드로클로라이드

주변 온도에서 (1r,4r)-6'-브로모-4-메톡시스피로[시클로헥산-1,2'-인덴]-1'(3'H)-온(5.82 kg; 17.7 mol)을 100 L 반응 장치에 투입한 후, 티타늄(IV) 에톡시드(7.4 L; 35.4 mol) 및 2-메틸테트라하이드로푸란(13.7 L) 중의 tert-부틸술핀아미드(2.94 kg; 23.0 mol)의 용액을 투입하였다. 혼합물을 교반하고, 82℃로 가열하였다. 82℃에서 30분 후, 온도를 (최대 97℃까지) 추가로 증가시키고, 8 L의 용매를 증류시켰다. 반응물을 87℃로 냉각시키고, 반응물 온도를 82℃로 하면서, 2-메틸테트라하이드로푸란(8.2 L)을 첨가하였다. 82℃에서 밤새도록 교반하면서, 반응물을 방치시켰다. 반응물 온도를 (97℃로) 승온시키고, 8.5 L의 용매를 증류시켰다. 반응물을 87℃로 냉각시키고, 반응물 온도를 82℃로 하면서, 2-메틸테트라하이드로푸란(8.2 L)을 첨가하였다. 2시간 후, 반응물 온도를 (97℃까지) 추가로 증가시키고, 8.2 L의 용매를 증류시켰다. 반응물을 87℃로 냉각시키고, 반응물 온도를 82℃로 하면서, 2-메틸테트라하이드로푸란(8.2 L)을 첨가하였다. 반응물을 82℃에서 밤새도록 교반하였다. 반응물 온도를 (97℃까지) 추가로 증가시키고, 8 L의 용매를 증류시켰다. 반응물을 25℃로 냉각시켰다. 디클로로메탄(16.4 L)을 투입하였다. 별개의 반응 장치에 물(30 L)을 첨가하고, 왕성하게 교반하고, 황산나트륨(7.54 kg)을 첨가하고, 생성된 용액을 10℃로 냉각시켰다. 황산(2.3 L, 42.4 mol)을 수용액에 첨가하고, 온도를 20℃로 조정하였다. 6 L의 산성 수용액을 배출시키고, 나중을 위해 저장하였다. 유기 반응 혼합물을 잘 교반하면서 5분 동안에 걸쳐 산성 수용액에 투입하였다. 유기 반응 베쓸을 디클로로메탄(16.4 L)으로 세척하고, 디클로로메탄 세척액 또한 산성수에 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 교반한 후, 20분 동안 정치시켰다. 하부의 수성상을 흘려 보내고, 저장된 6 L의 산성 세액을 첨가한 후, 물(5.5 L)을 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 교반한 후, 20분 동안 정치시켰다. 하부의 유기층을 카보이로 흘려 보내고, 상부의 수층을 폐기하였다. 유기층을 다시 베쓸에 투입한 후, 황산나트륨(2.74 kg)을 투입하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 황산나트륨을 여과하고, 디클로로메탄(5.5 L)으로 세척하고, 혼합된 유기상을 깨끗한 베쓸로 투입하였다. 증류시키기 위해 배치를 가열하였다(최대 온도 57℃에서 31 L 수집). 배치를 40℃로 냉각시키고, 디클로로메탄(16.4 L)을 첨가하였다. 증류시키기 위해 배치를 가열하였다(최대 온도 54℃에서 17 L 수집). 배치를 20℃로 냉각시키고, 디클로로메탄(5.5 L) 및 에탄올(2.7 L)을 첨가하였다. 온도를 16-23℃로 유지시키면서, 45분 동안에 걸쳐 디에틸 에테르(10.6 L; 21.2 mol) 2 M 염화수소를 반응물에 투입하였다. 생성된 슬러리를 20℃에서 1시간 동안 교반한 후, 고체를 여과하고, 디클로로메탄 및 디에틸 에테르의 1:1 혼합물로 3회에 걸쳐 세척하였다(3 x 5.5 L). 고체를 진공하에 50℃에서 건조시켜 (1r,4r)-6'-브로모-4-메톡시스피로[시클로헥산-1,2'-인덴]-1'(3'H)-이민 하이드로클로라이드(6.0 kg; 14.3 mol; ¹H NMR에 의해 검정 82% w/w)를 수득하였다.

실시예 9: ( 1r,4r )-6'- 브로모 -4- 메톡시 -5''- 메틸 - 3'H - 디스피로 [시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''(3''H)-티온

이소프로판올(50.5 L) 중 (1r,4r)-6'-브로모-4-메톡시스피로[시클로헥산-1,2'-인덴]-1'(3'H)-이민 하이드로클로라이드(6.25 kg; 14.9 mol)를 함유하는 반응 장치에 트리메틸오르토포르메이트(4.95 L; 45.2 mol) 및 디이소프로필에틸아민 (3.5 L; 20.0 mol)을 투입하였다. 반응 혼합물을 교반하고, 1시간 동안 75℃로 가열하여 투명 용액을 수득하였다. 온도를 70℃로 고정시키고, 이소프로판올(19.5 kg; 40.6 mol) 중 2-옥소프로판티오아미드의 2 M 용액을 1시간 동안에 걸쳐 투입한 후, 반응물을 69℃에서 밤새도록 교반하였다. 배치에 (1r,4r)-6'-브로모-4-메톡시-5''-메틸-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''(3''H)-티온(3 g; 7.6 mmol)을 시딩하고, 온도를 60℃로 하강시키고, 1시간 동안 교반하였다. 증류에 의해 혼합물을 농축시켰다(증류 온도 대략 60℃; 31 L 증류됨). 온도를 90분 동안 25℃로 하강시키기 전에 60℃에서 1시간 동안 물(31 L)을 첨가한 후, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, 이소프로판올로 2회에 걸쳐 세척하고(2 x 5.2 L), 진공하에 40℃에서 건조시켜 (1r,4r)-6'-브로모-4-메톡시-5''-메틸-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''(3''H)-티온(4.87 kg; 10.8 mol; ¹H NMR에 의해 검정 87% w/w)을 수득하였다.

실시예 10: (1r,1'R,4R)-6'-브로모-4-메톡시-5''-메틸-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민 D(+)-10-캄포르술폰산 염

(1r,4r)-6'-브로모-4-메톡시-5''-메틸-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''(3''H)-티온(5.10 kg; 11.4 mol) 및 아세트산아연 이수화물(3.02 kg; 13.8 mol)을 함유하는 반응 장치에 메탄올(32 L; 224 mol) 중의 7 M 암모니아를 투입하였다. 반응 장치를 실링하고, 혼합물을 80℃로 가열하고, 24시간 동안 교반한 후, 30℃로 냉각시켰다. 1-부탄올(51 L)을 투입하고, 반응 혼합물을 진공 증류에 의해 농축시켜 대략 50 L가 되도록 만들었다. 1-부탄올(25 L)을 첨가하고, 혼합물을 진공 증류에 의해 농축시켜 27 L가 되도록 만들었다. 혼합물을 30℃로 냉각시키고, 1 M 수산화나트륨(30 L; 30 mol)을 투입하였다. 2상 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 하부 수성상을 분리 제거하였다. 물(20 L)을 투입하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 하부 수성상을 분리 제거하였다. 유기상을 70℃로 가열한 후, (1S)-(+)-10-캄포르술폰산(2.4 kg; 10.3 mol)을 투입하였다. 혼합물을 70℃에서 1시간 동안 교반한 후, 3시간 동안에 걸쳐 20℃까지 단계적으로 감소시켰다. 고체를 여과하고, 에탄올(20 L)로 세척하고, 진공하에 50℃에서 건조시켜 (1r,4r)-6'-브로모-4-메톡시-5''-메틸-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민 (+)-10-캄포르 술폰산 염(3.12 kg; 5.13 mol; ¹H NMR에 의해 검정 102% w/w)을 수득하였다.

실시예 11: ( 1r,1'R,4R )-4- 메톡시 -5''- 메틸 -6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민

1-부탄올(7.7 L) 및 물(2.6 L)의 혼합물 중 (1r,4r)-6'-브로모-4-메톡시-5''-메틸-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민 (+)-10-캄포르술폰산 염(1 kg; 1.58 mol), 탄산칼륨(0.763 kg; 5.52 mol)을 함유하는 베쓸에 물(0.1 L)에 용해된 Na₂PdCl₄(1.4 g; 4.76 mmol) 및 3-(디-tert-부틸포스포늄)프로판 술포네이트(2.6 g; 9.69 mmol)를 투입하였다. 혼합물을 주의하여 질소로 불활성화시킨 후, 5-(프로프-1-이닐)피리딘-3-일 보론산(0.29 kg; 1.62 mol)을 투입하고, 혼합물을 다시 주의하여 질소로 불활성화시킨다. 반응 혼합물을 75℃로 가열시키고, 2시간 교반한 후, 분석한 결과, 완전히 전환된 것으로 나타났다. 온도를 45℃로 조정하였다. 교반을 중단하고, 하부 수성상을 분리 제거하였다. 유기층을 물로 3회에 걸쳐 세척하였다(3 x 4 L). 반응물 온도를 22℃로 조정하고, 포스피닉스(Phosphonics) SPM32 스캐빈저(0.195 kg)를 투입하고, 혼합물을 밤새도록 교반하였다. 스캐빈저를 여과하고, 1-부탄올(1 L)로 세척하였다. 반응물을 감압하에서 증류에 의해 3 L로 농축시킨다. 부틸 아세테이트(7.7 L)를 투입하고, 혼합물을 다시 감압하에서 증류에 의해 3 L로 농축시킨다. 부틸 아세테이트(4.8 L)를 투입하고, 혼합물을 60℃로 가열하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반한 후, 감압하에서 증류에 의해 대략 4 L로 농축시켰다. 온도를 60℃로 고정시키고, 헵탄(3.8 L)을 20분 동안에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안에 걸쳐 20℃로 냉각시킨 후, 밤새도록 교반하면서, 방치시켰다. 고체를 여과하고, 부틸 아세테이트:헵탄의 1:1 혼합물(2 x 2 L)로 2회에 걸쳐 세척하였다. 생성물을 진공하에 50℃에서 건조시켜 (1r,1'R,4R)-4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민(0.562 kg; 1.36 mol; ¹H NMR에 의한 검정 100% w/w)을 수득하였다.

실시예 12: ( 1r,1'R,4R )-4- 메톡시 -5''- 메틸 -6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민의 캄실레이트 염의 제조

60℃에서 1.105 kg의 (1r,1'R,4R)-4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민을 8.10 L의 2-프로판올 및 475 mL 물 중에 용해시켰다. 이어서, 60℃에서 1.0 mole 등가물(622 g) (1S)-(+)-10 캄포르술폰산을 투입하였다. (1S)-(+)-10 캄포르술폰산 모두가 용해될 때까지, 슬러리를 교반하였다. 60℃에서 제2 분량의 2-프로판올을 첨가하고(6.0 L), 이어서, 4.3 L의 증류액을 수집할 때까지, 내용물을 증발시켰다. 이어서, 65℃에서 9.1 L 헵탄을 투입하였다. 1시간 지연 후, 배치는 불투명한 상태가 되었다. 이어서, 약 75℃에서 추가 증류를 수행하였고, 8.2 L의 증류액을 수집하였다. 이어서, 배치를 2 hr 동안에 걸쳐 20℃로 냉각시키고, 상기 온도에서 밤새도록 유지시켰다. 이어서, 배치를 여과하고, 1.8 L 2-프로판올 및 2.7 L 헵탄의 혼합물로 세척하였다. 마지막으로, 물질을 감압하에, 및 50℃에서 건조시켰다. 수율은 1.44 kg(83.6% w/w)이었다.

실시예 13: ( 1r,1'R,4R )-4- 메톡시 -5''- 메틸 -6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민의 활성 시험

하기 방법을 이용하여 (1r,1'R,4R)-4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민의 활성 수준을 시험하였다:

TR-FRET 검정법

TR-FRET에서 사용된 β 세크레타제 효소를 하기와 같이 제조한다:

인간 β 세크레타제의 가용성 부분(AA 1 - AA 460)에 대한 cDNA를 ASP2-Fc10-1-IRES-GFP-neoK 포유동물 발현 벡터를 이용하여 클로닝하였다. 유전자를 IgG1의 Fc 도메인(친화성 태그)에 융합시키고, HEK 293 세포 내로 안정적으로 클로닝하였다. 정제된 sBACE-Fc를 트리스 완충제(pH 9.2) 중에서 -80℃에서 보관하였고, 순도는 40%였다.

반응 완충제(Na아세테이트, chaps, 트리톤 x-100, EDTA pH 4.5) 중에서 효소(말단절단된 형태)를 6 ㎍/mL(스톡 1.3 mg/mL)로 희석시키고, 기질(유로퓸)CEVNLDAEFK(Qsy7)을 200 nM(스톡 120 μM)로 희석시켰다. 모든 액체 취급을 위해 로봇 시스템 바이오멕 FX(Biomek FX) 및 벨로서티 11(Velocity 11)을 사용하였고, 기질 용액은 로봇 시스템에 배치할 때까지 얼음 상에서 보존하였다. 효소(9 ㎕)를 플레이트에 첨가하고, 디메틸술폭시드 중의 1 ㎕의 화합물을 첨가하고, 혼합하고, 10분 동안 미리 인큐베이션하였다. 이어서, 기질(10 ㎕)을 첨가하고, 혼합하고, r.t.에서 15분 동안 반응을 진행시켰다. 정지 용액(7 ㎕, Na아세테이트, pH 9)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 340 nm의 여기 파장 및 615 nm의 방출 파장을 이용하여 빅토르 II(Victor II) 플레이트 판독기 상에서 생성물의 형광을 측정하였다. 코스타(Costar) 384 웰 둥근 바닥, 저용량, 비결합 표면 플레이트(Corning #3676)에서 검정법을 수행하였다. 효소의 최종 농도는 2.7 ㎍/ml였고; 기질의 최종 농도는 100 nM(Km = ~250 nM)였다. 시험 화합물 대신 디메틸술폭시드 대조군이 100%의 활성 수준을 정의하였고, 0%의 활성은 효소가 없는 웰(반응 완충제로 대체된 웰)에 의해 정의되었다. 대조군 억제제 또한 용량 반응 검정법에서 사용되었고, 그의 IC₅₀은 ~150 nM이었다.

희석형 TR-FRET 검정법

조건은 TR-FRET 검정법에 대하여 상기 기술된 것과 동일하되, 효소는 50배 더 적고, 암실 실온에서의 6.5 h의 긴 반응 시간으로 수행되는 희석형 TR-FRET 검정법에서 화합물을 추가로 시험하였다.

sAPPβ 방출 검정법

SH-SY5Y 세포를 글루타맥스, 10% FCS 및 1% 비필수 아미노산을 포함하는 DMEM/F-12 중에서 배양하고, 냉동보관하고, 바이알당 7.5-9.5x10⁶개의 세포인 농도로 -140℃에서 보관하였다. 세포를 해동시키고, 384 웰 조직 배양 처리 플레이트에 100 ㎕ 세포 현탁액/웰로, 글루타맥스, 10% FCS 및 1% 비필수 아미노산을 포함하는 DMEM/F-12 중 약 10,000개의 세포/웰인 농도로 시딩하였다. 이어서, 세포 플레이트를 37℃하에, 5% CO₂에서 7-24 h 동안 인큐베이션하였다. 세포 배지를 제거한 후, 글루타맥스, 10% FCS, 1% 비필수 아미노산 및 1% PeSt를 포함하는 DMEM/F-12 중에 희석된 30 ㎕ 화합물을 최종 농도 1%의 DMSO에 첨가하였다. 화합물을 37℃하에, 5% CO₂에서 17 h 동안(밤새도록) 세포와 함께 인큐베이션하였다. sAPPβ 방출 검출을 위해 메소 스케일 디스커버리(MSD: Meso Scale Discovery) 플레이트를 사용하였다. MSD sAPPβ 플레이트를 r.t.에서 진탕시키면서 1 h 동안 트리스 세척 완충제(40 ㎕/웰) 중 1% BSA에서 차단시키고, 트리스 세척 완충제(40 ㎕/웰) 중에서 1회 세척하였다. 20 ㎕의 배지를 미리 차단되고, 세척된 MSD sAPPβ 마이크로플레이트로 옮기고, 세포독성 측정을 위해 세포 플레이트를 ATP 검정법에서 추가로 사용하였다. MSD 플레이트를 r.t.에서 2 h 동안 진탕시키면서 인큐베이션시키고, 배지를 폐기하였다. 웰당 10 ㎕ 검출 항체(1 nM)를 첨가한 후, r.t.에서 2 h 동안 진탕시키면서 인큐베이션한 후, 폐기하였다. 웰당 40 ㎕ 판독 완충제를 첨가하고, 플레이트를 SECTOR 이미저(SECTOR Imager)에서 판독하였다.

ATP 검정법

sAPPβ 방출 검정법에서 언급한 바와 같이, sAPPβ 검출을 위해 세포 플레이트로부터 20 ㎕ 배지를 옮겨 놓은 후, 플레이트를 이용하여 총 세포 ATP를 측정하는, 캠브렉스 바이오사이언스(Cambrex BioScience)로부터 입수한 비아라이트TM 플러스(ViaLightTM Plus) 세포 증식/세포독성 키트를 사용함으로써 세포독성을 분석하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 검정법을 수행하였다. 간략하면, 웰당 10 ㎕ 세포 용해 반응물을 첨가하였다. 플레이트를 r.t.에서 10 min 동안 인큐베이션하였다. 25 ㎕의 재구성된 비아라이트TM 플러스 ATP 시약을 첨가한 후 2 min 경과시, 왈락 빅토르2 1420(Wallac Victor2 1420) 다중표지 계수기에서 발광을 측정하였다. Tox 임계값은 대조군 대비 75% 미만인 신호이다.

결과

(1r,1'R,4R)-4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민 이성질체에 대한 IC₅₀ 값은 하기 표 15에 요약되어 있다.

TR-FRET 검정법에서의 IC ₅₀ (nM)	sAPPβ 방출 검정법에서의 IC ₅₀ (nM)
0.57^a	0.10
^a 희석형 FRET 검정법으로부터의 IC₅₀

실시예 14: ( 1r,1'R,4R )-4- 메톡시 -5''- 메틸 -6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민의 캄실레이트 염의 활성

하기 방법을 이용하여 (1r,1'R,4R)-4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민의 캄실레이트 염의 활성 수준을 시험할 수 있다:

TR-FRET 검정법

인간 β 세크레타제의 가용성 부분(AA 1 - AA 460)에 대한 cDNA를 ASP2-Fc10-1-IRES-GFP-neoK 포유동물 발현 벡터를 이용하여 클로닝하였다. 유전자를 IgG1의 Fc 도메인(친화성 태그)에 융합시키고, HEK 293 세포 내로 안정적으로 클로닝하였다. 정제된 sBACE-Fc를 50 mM 글리신(pH 2.5) 중에서 -80℃에서 보관하고, 1 M 트리스를 이용하여 pH 7.4로 조정하였고, 순도는 40%였다.

반응 완충제(Na아세테이트, chaps, 트리톤 x-100, EDTA pH 4.5) 중에서 효소(말단절단된 형태)를 6 ㎍/mL(스톡 1.3 mg/mL)로 희석시키고, 트루포인트 BACE1 기질(TruPoint BACE1 Substrate)을 200 nM(스톡 120 μM)로 희석시켰다. 디메틸술폭시드(DMSO 최종 농도 5%) 중의 효소 및 화합물을 혼합하고, RT에서 10분 동안 미리 인큐베이션하였다. 이어서, 기질을 첨가하고, 반응물을 RT에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 0.35 vol 정지 용액(Na아세테이트, pH 9)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 340-485 nm의 여기 파장 및 590-615 nm의 방출 파장을 이용하여 빅토르 II 플레이트 판독기 상에서 생성물의 형광을 측정하였다. 효소의 최종 농도는 2.7 ㎍/ml였고; 기질의 최종 농도는 100 nM(Km = ~250 nM)였다. 시험 화합물 대신 디메틸술폭시드 대조군이 100%의 활성 수준을 정의하였고, 0%의 활성은 효소가 없는 웰(반응 완충제로 대체된 웰)에 의해, 또는 포화 용량의 공지된 억제제, 2-아미노-6-[3-(3-메톡시페닐)페닐]-3,6-디메틸-5H-피리미딘-4-온에 의해 정의되었다. 대조군 억제제 또한 용량 반응 검정법에서 사용되었고, 그의 IC₅₀은 ~150 nM이었다.

본 검정법에서 (1r,1'R,4R)-4-메톡시-5''-메틸-6'-[5-(프로프-1-인-1-일)피리딘-3-일]-3'H-디스피로[시클로헥산-1,2'-인덴-1'2''-이미다졸]-4''-아민의 캄실레이트 염의 평균 IC₅₀은 0.2 nM이었다.

sAPPβ 방출 검정법

SH-SY5Y 세포를 글루타맥스, 10% FCS 및 1% 비필수 아미노산을 포함하는 DMEM/F-12 중에서 배양하고, 냉동보관하고, 바이알당 7.5-9.5x10⁶개의 세포인 농도로 -140℃에서 보관한다. 세포를 해동시키고, 384 웰 조직 배양 처리 플레이트에 100 ㎕ 세포 현탁액/웰로, 글루타맥스, 10% FCS 및 1% 비필수 아미노산을 포함하는 DMEM/F-12 중 약 10,000개의 세포/웰인 농도로 시딩한다. 이어서, 세포 플레이트를 37℃하에, 5% CO₂에서 7-24 h 동안 인큐베이션한다. 세포 배지를 제거한 후, 글루타맥스, 10% FCS, 1% 비필수 아미노산 및 1% PeSt를 포함하는 DMEM/F-12 중에 희석된 30 ㎕ 화합물을 최종 농도 1%의 DMSO에 첨가한다. 화합물을 37℃하에, 5% CO₂에서 17 h 동안(밤새도록) 세포와 함께 인큐베이션하였다. sAPPβ 방출 검출을 위해 메소 스케일 디스커버리(MSD) 플레이트를 사용한다. MSD sAPPβ 플레이트를 r.t.에서 진탕시키면서 1 h 동안 트리스 세척 완충제(40 ㎕/웰) 중 1% BSA에서 차단시키고, 트리스 세척 완충제(40 ㎕/웰) 중에서 1회 세척한다. 20 ㎕의 배지를 미리 차단되고, 세척된 MSD sAPPβ 마이크로플레이트로 옮기고, 세포독성 측정을 위해 세포 플레이트를 ATP 검정법에서 추가로 사용한다. MSD 플레이트를 r.t.에서 2 h 동안 진탕시키면서 인큐베이션시키고, 배지를 폐기한다. 웰당 10 ㎕ 검출 항체(1 nM)를 첨가한 후, r.t.에서 2 h 동안 진탕시키면서 인큐베이션한 후, 폐기한다. 웰당 40 ㎕ 판독 완충제를 첨가하고, 플레이트를 SECTOR 이미저에서 판독한다.

ATP 검정법

sAPPβ 방출 검정법에서 언급한 바와 같이, sAPPβ 검출을 위해 세포 플레이트로부터 20 ㎕ 배지를 옮겨 놓은 후, 플레이트를 이용하여 총 세포 ATP를 측정하는, 캠브렉스 바이오사이언스로부터 입수한 비아라이트TM 플러스 세포 증식/세포독성 키트를 사용함으로써 세포독성을 분석한다. 제조사의 프로토콜에 따라 검정법을 수행한다. 간략하면, 웰당 10 ㎕ 세포 용해 반응물을 첨가한다. 플레이트를 r.t.에서 10 min 동안 인큐베이션한다. 25 ㎕의 재구성된 비아라이트TM 플러스 ATP 시약을 첨가한 후 2 min 경과시, 발광을 측정한다. Tox 임계값은 대조군 대비 75% 미만인 신호이다.

실시예 15: 알츠하이머병의 동물 모델에게로의 항체 또는 항원 결합 단편과 BACE 억제제 투여

대표적인 항체 또는 항원 결합 단편(예컨대, Abet0380-GL) 및 대표적인 BACE 억제제(예컨대,

의 캄실레이트 염)를 조합하여 하기 대표 동물 모델 중 어느 하나에 투여한다: 문헌 [Games et al., 1995, Nature, 373(6514):523-7]에 기술되어 있는 PDAPP 마우스; 문헌 [Eketjall et al., 2016, Journal of Alzheimer's Disease, 50(4): 1109-1123]에 기술되어 있는 C57BL/6 마우스 또는 던킨-하틀리(Dunkin-Hartley) 기니아 피그; 상기 실시예 2에 기술되어 있는 스프라그-돌리 래트 및 Tg2576 마우스. 대조군 동물 모델은 상응하는 투여량으로 항체 또는 항원 결합 단편 단독, BACE 억제제 단독, 또는 비히클 대조군을 투여받게 될 것이다. 항체 또는 항원 결합 단편을 실시예 2에 기술된 것과 일관된 방식으로 정맥내로 투여한다. BACE 억제제를 문헌 [Eketjall et al.]에 기술된 것과 유사한 방식으로 경구 투여한다. 조합 요법이 마우스에게 독성인지를 알리는 임의 징후를 모니터링하고(예컨대, 허약, 무기력, 체중 감소, 사망을 알리는 징후에 대해 모니터링하고), 각 약물의 용량을 그에 따라 조정하여 세포독성 효과는 최소화하면서, 치료 효과를 극대화시킨다. 상기 실시예 2에 및 문헌 [Eketjall et al.]에 기술된 것과 유사한 방식으로 동물로부터 뇌, 혈장 및 CSF 샘플의 생체분석(예컨대, 상기 샘플 중의 Aβ 수준의 생체 분석)을 모니터링한다. 당업계에 공지된 거동 및/또는 인지 검정법을 이용하여 마우스에서 상이한 치료 조건이 미치는 효과 또한 평가할 수 있을 것이다. 시험되는 파라미터, 예컨대, Aβ_n _-42 수준이 대조군 동물 모델에서보다 조합 요법을 투여받은 동물 모델에서 더 크게 개선되는 것(예컨대, Aβ₁ _-42 수준이 더 크게 감소)은, BACE 억제제 또는 항체 또는 항원 결합 단편 단독을 이용한 치료보다 조합 요법이 상기 파라미터를 처리함에 있어 더욱 효과적이라는 것을 시사하는 것이다. 당업자는 조합 요법의 효과를 시험하기 위한 다른 모델, 및 다른 파라미터에 대해 알고 있다. 예컨대, 문헌 [Bogstedt et al., 2015, Journal of Alzheimer's Disease, 46:1091-1101] 참조.

참고문헌

본 텍스트에는 다른 참고문헌도 포함된다.

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Claims

Aβ의 축적과 관련된 질환 또는 장애를 갖는 피험체를 치료하는 방법으로서,
상기 피험체에게
a) 약학적 유효량의 하기 BACE 억제제:

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및
b) 약학적 유효량의, Abet0380, Abet0342, Abet0369, Abet0377 또는 Abet0382 중 어느 하나, 또는 이의 생식세포화된(germlined) 변이체로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편
을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, BACE 억제제가

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 방법.
제1항에 있어서, BACE 억제제가

의 캄실레이트 염인 방법.
제1항에 있어서, BACE 억제제가

인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 Abet0380, 또는 이의 생식세포화된 변이체의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 Abet0380, 또는 이의 생식세포화된 변이체의 중쇄의 CDR을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 Abet0380, 또는 이의 생식세포화된 변이체의 경쇄의 CDR을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하고; 여기서, VH 도메인이 서열 번호: 524에 기재된 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하고; 여기서, VL 도메인이 서열 번호: 533에 기재된 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이
서열 번호: 525의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1;
서열 번호: 526의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2; 및
서열 번호: 527의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이
서열 번호: 534의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1;
서열 번호: 535의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2; 및
서열 번호: 536의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이 서열 번호: 528, 서열 번호: 529, 서열 번호: 530 및 서열 번호: 531의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 프레임워크 영역을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이 서열 번호: 528, 서열 번호: 529, 서열 번호: 530 및 서열 번호: 531의 아미노산 서열을 가지는 프레임워크 영역을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이 서열 번호: 537, 서열 번호: 538, 서열 번호: 539 및 서열 번호: 540의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 프레임워크 영역을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이 서열 번호: 537, 서열 번호: 538, 서열 번호: 539 및 서열 번호: 540의 아미노산 서열을 가지는 프레임워크 영역을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이 서열 번호: 524와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이 서열 번호: 533과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이 서열 번호: 524와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이 서열 번호: 533과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이 서열 번호: 524의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이 서열 번호: 533의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 항원 결합 단편인 방법.
제22항에 있어서, 항원 결합 단편이 scFv인 방법.
제22항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab'인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 항체인 방법.
제25항에 있어서, 항체가 단일클론 항체인 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서, 항체가 IgG 항체인 방법.
제27항에 있어서, 항체가 인간 IgG1 또는 인간 IgG2인 방법.
제28항에 있어서, 항체가 인간 IgG1-TM, IgG1-YTE 또는 IgG1-TM-YTE인 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 인간화 항체 또는 항원 결합 단편인 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 인간 항체 또는 항원 결합 단편인 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 500 pM 이하의 해리 상수(K_D)로 단량체 Aβ1-42에 결합하고, Aβ1-40에는 결합하지 않거나, 또는 1 mM 초과의 K_D로 Aβ1-40에 결합하는 것인 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 아밀로이드 베타 17-42 펩티드(Aβ17-42) 및 아밀로이드 베타 29-42 펩티드(Aβ29-42)에 결합하는 것인 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 3-파이로-42 아밀로이드 베타 펩티드 및 11-파이로-42 아밀로이드 베타 펩티드에 결합하는 것인 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 아밀로이드 베타 1-43 펩티드(Aβ1-43)에 결합하는 것인 방법.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애가 알츠하이머병, 다운 증후군, 및/또는 황반 변성으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제36항에 있어서, 질환 또는 장애가 알츠하이머병인 방법.
제36항에 있어서, 질환 또는 장애가 다운 증후군인 방법.
제36항에 있어서, 질환 또는 장애가 황반 변성인 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, BACE 억제제와 항체 또는 항원 결합 단편이 동시에 피험체에게 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, BACE 억제제와 항체 또는 항원 결합 단편이 개별적으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, BACE 억제제와 항체 또는 항원 결합 단편이 동일한 조성물 중에 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, BACE 억제제가 경구 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 정맥내로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 피하 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 인간인 방법.
제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 인지 능력을 개선시키거나, 또는 추가의 인지 장애를 예방하는 방법.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 기억력을 개선시키거나, 또는 추가의 치매를 예방하는 방법.
Aβ 축적과 관련된 질환 또는 장애 치료용의, 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 사용하기 위한 BACE 억제제를 포함하는 조성물로서, 상기 BACE 억제제는

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이고; 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380, Abet0342, Abet0369, Abet0377 또는 Abet0382 중 어느 하나, 또는 이의 생식세포화된 변이체로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 것인 조성물.
Aβ 축적과 관련된 질환 또는 장애 치료용의, BACE 억제제와 조합하여 사용하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물로서, 상기 BACE 억제제는

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이고; 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380, Abet0342, Abet0369, Abet0377 또는 Abet0382 중 어느 하나, 또는 이의 생식세포화된 변이체로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 것인 조성물.
제49항 또는 제50항에 있어서, BACE 억제제가

의 캄실레이트 염인 조성물.
제49항 또는 제50항에 있어서, BACE 억제제가

인 조성물.
제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하고; 여기서, VH 도메인이 서열 번호: 524에 기재된 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 조성물.
제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하고; 여기서, VL 도메인이 서열 번호: 533에 기재된 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 조성물.
제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이
서열 번호: 525의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1;
서열 번호: 526의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2; 및
서열 번호: 527의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함하는 것인 조성물.
제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이
서열 번호: 534의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1;
서열 번호: 535의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2; 및
서열 번호: 536의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함하는 것인 조성물.
BACE 억제제와 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 키트로서, 상기 BACE 억제제는

, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이고; 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 Abet0380, Abet0342, Abet0369, Abet0377 또는 Abet0382 중 어느 하나, 또는 이의 생식세포화된 변이체로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는 것인 키트.
제57항에 있어서, BACE 억제제가

의 캄실레이트 염인 키트.
제57항에 있어서, BACE 억제제가

인 키트.
제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하고; 여기서, VH 도메인이 서열 번호: 524에 기재된 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 키트.
제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 경쇄 가변(VL) 도메인 및 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하고; 여기서, VL 도메인이 서열 번호: 533에 기재된 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 키트.
제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이
서열 번호: 525의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1;
서열 번호: 526의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2; 및
서열 번호: 527의 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함하는 것인 키트.
제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이
서열 번호: 534의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1;
서열 번호: 535의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2; 및
서열 번호: 536의 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함하는 것인 키트.