KR20140003467A - 항il-18 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인터루킨-18에 대하여 특이적인 결합 특이성을 가지는, 인간, 인간화된 및/또는 키메라 항체 뿐만 아니라, 그의 단편, 유도체/컨쥬게이트 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 IL-18 활성 증가와 관련된 질환의 진단 및 치료에서 상기 항체의 용도로서, 여기서, 후자는 약학 조성물 형태의 것인 것을 포함한다.

Description

항IL-18 항체 및 그의 용도{ANTI-IL-18 ANTIBODIES AND THEIR USES}
본 발명은 인터루킨-18(IL-18)에 결합하여 그의 생물학적 효과를 억제시키는 항체 분자에 관한 것이다. 항IL-18 항체는 예를 들어, 염증, 심혈관 및 자가면역 질환을 비롯한, IL-18 수준 상승과 관련된 장애를 진단 및 치료하는 데 유용할 수 있다.
인터루킨-18(IL-18)은 선천성 및 후천성 면역 반응, 둘 모두에서 중요한 역할을 하는 강력한 사이토카인이다. IL-18은 최초로는, T 헬퍼(Th: T helper) 1형 면역 반응의 1차 효과기 중 하나인 IFNγ 생산을 유도할 수 있는 그의 능력으로 확인되었다(문헌 [Okamura et al., (1995) Nature 378:88-91]). 이후, 특정 환경에서 IL-18은 또한 추가 반응, 예컨대, Th2의 발생에도 기여할 수 있는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Nakanishi et al., (2001) Annu Rev Immunol. 19:423-74]). 분화 클러스터(CD: cluster of differentiation) 4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 그의 자극 효과 이외에도, IL-18은 호중구, 단핵구/대식세포, 자연 살해(NK: natural killer) 세포, 상피 및 내피 세포를 비롯한 각종 세포에 대하여 광범위한 염증 관련 효과를 발휘하는 것으로 나타났다.
IL-18은 인터루킨-1(IL-1) 슈퍼패밀리에 속하며, IL-1베타(IL-1β)와 같이, 먼저 불활성 세포내 폴리펩티드인 프로IL-18(24 kDa)로서 합성된다. 프로펩티드의 효소적 절단을 통해 생물학적으로 활성인 성숙한 형태의 IL-18(18 kDa)이 유리된다. IL-18은 대식세포 및 면역 반응에 관여하는 다른 세포에 의해 생산된다. 그의 생리학적 역할과는 별도로, IL-18은 또한 중증 염증 반응에 기여하는데, 이것이 특정 염증성 장애, 예컨대, 자가면역 질환에서의 그의 역할을 보여준다. IL-18은 IL-18에 결합하여 그의 IL-18 수용체(IL-18R: IL-18 receptor)에의 결합을 차단함으로써 IL-18 활성을 억제시키는 내인성 IL-18 결합 단백질(IL-18BP: IL-18 binding protein)에 의해 부분적으로 조절된다. 그러나, 특정 환경에서는, 계속하여 선천성 면역 반응을 개시할 수 있을 정도로 충분한 IL-18 생물학적 활성을 제공하면서, IL-18의 생물학적 효과를 적절히 억제시키기에는 이러한 음성 피드백 루프가 충분하지 않다.
IL-18의 생물학적 활성은 IL-18이 세포 결합된 IL-18R에 결합하였을 때, 이로써 다른 사이토카인의 발현을 유도하는 세포 신호 전달이 개시됨으로써 발생된다. IL-18R은, β 쇄가 IL-18 결합 모티프를 함유하고, α 쇄는 세포내 신호전달 도메인(TIR: intracellular signalling domain)을 포함하는, 기능적 복합체를 형성하는 2개의 IgG 유사 폴리펩티드 쇄를 포함하는 이종이량체이다(문헌 [Torigoe et al., (1997) J Biol Chem 272:25737]). IL-18은 먼저 IL-18Rα에 결합한 후, β 쇄를 동원하여 기능적 이종이량체를 형성한다. IL-18의 α/β 복합체에의 결합이 세포내 신호전달 캐스캐이드를 활성화시켰다. 따라서, IL-18의 IL-18Rα에의 결합을 차단시키는 것이 원치않는 IL-18을 억제시키는 데 유용할 수 있다.
IL-18은 다수의 인간 질환, 주로 자가면역 또는 염증 질환 및 암에 연루되어 있다. 건선 환자의 경우, 피부 병변 및 순환, 둘 모두에서 IL-18은 증가되어 있었다(문헌 [Flisiak et al. (2006) 11:194]). 다발성 경화증 환자의 뇌척수액 및 혈장 중 혈장 IL-18 수준은 상승되어 있는 것으로 관찰되었다(문헌 [Fassbender et al. (1999) Neurology 53:1104; Nicoletti et al. (2001) Neurology 57:342]). 염증성 장 질환(예컨대, 크론병, 궤양성 대장염) 환자의 경우, 순환에서 IL-18 수준은 상승되어 있었다(문헌 [Ludwiczek et al., (2005) Eur. Cytokine Netw. 16:27]; [Wiercinska-Drapalo et al., (2005) World J Gastroenterol. 11:605]). 류마티스 관절염(RA: rheumatoid arthritis) 환자의 경우, 활액 중 IL-18 수준은 상승되어 있었다(문헌 [Gracie et al., (1999) J Clin Invest 104:1393]). IL-18은 또한 전신 소견을 가지는 다른 관절염 질환, 예컨대, 스틸병(문헌 [Kawashima et al., (2001) Arthritis Rheum. 44 (3):550-60]) 및 전신 소아 특발성 관절염(sJIA: systemic juvenile idiopathic arthritis)(문헌 [Maeno et al., (2002) Arthritis Rheum. 46(9):2539-41]; [Shimizu et al., (2010) Rheumatology 49(9): 1645-53])을 앓는 환자의 혈청 중 증가되어 있는 것으로 나타났으며, 질환 중증도의 마커로서 제안되었다(문헌 [Kawagushi et al., (2001) Arthritis Rheum. 44 (7):1716-7]; [Lotito et al., (2007) J Rheumatol. 34(4): 823-30]). 이러한 자가염증성 장애에서, 순환 IL-18은 상기 질환의 활성기 동안 및 예컨대, 대식세포 활성화 증후근과 같은 합병증이 발병한 환자 서브세트에서 추가로 증가하는 것으로 나타났다(문헌 [Shimizu et al., (2010) Rheumatology 9(9):1645-53]). IL-18은 또한 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD: Chronic Obstructive Pulmonary Disease) 환자에서 전신으로 및 폐 조직, 둘 모두에서 증가하는 것으로 나타났으며, 이 경우, IL-18은 폐포 대식세포, CD8+ T 세포 및 기도 상피 세포와 관련이 있었다(문헌 [Imaoka et al., (2009) Eur Respir J. 31:287-97]; [Kang et al. (2007) J. Immunol. 178 (3):1948-59]; [Petersen et al. (2007) Lung 185:161-71]; [Rovina et al., (2009) Respir Med. 103:1056- 62]). IL-18은 또한 COPD 동시 이환에 기여할 수 있다(문헌 [Petersen et al., (2007) Lung 185:161]; [Larsen et al., (2008) Cardiovasc Res 80:47]).
심혈관 질환의 경우, 급성 관상 동맥 증후군, 심근경색, 관상 동맥 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 및 불안정 협심증에서 순환 IL-18의 혈장 또는 혈청 수준은 상승되어 있는 것으로 관찰되었다(문헌 [Mallat et al., (2002) Heart 88:467]; [Hulthe et al., (2006) Atherosclerosis 188:450]; [Mallat et al., (2001) Circulation 104:1598]). 혈청 IL-18 수준은 또한 경동맥 내중막 두께와도 관련이 있다(문헌 [Yamagami et al., (2004) Arterioscler Thromb Vase Biol 25:1458).
여러 유형의 암은 또한 IL-18 발현 수준 상승과도 관련이 있다. 그러나, IL-18의 역할은 악성 질환에서 이중성을 띨 수 있다(문헌 [Dinarello (2008) Cancer & Metastasis Rev 25:307]). 한편에서, IL-18은 혈관신생 유발성일 수 있고, 이로써, 종양 발생을 촉진시킬 수 있는 반면, 다른 한편에서는 세포 면역 반응, 예컨대, NK 세포 매개 세포독성을 자극시킬 수 있고, 이로써, 항종양형성제로서의 역할을 할 수 있다(문헌 [Kim et al. (2007) Oncogene 26:1468]).
상기와 같은 다수의 임상 관찰 결과가 또한 인간 질환의 동물 모델에서 입증되었다. 이러한 연구는 IL-18 의존성 질환 기전 및 개입을 위한 잠재적으로 표적으로서의 IL-18, 둘 모두를 다루었다. 다발성 경화증에 대해 가장 광범위하게 사용되는 동물 모델인 실험적 자가면역성 뇌염(EAE: experimental autoimmune encephalitis)의 CNS 병변 발생은 IL-18Rα 참여에 의존하는 것으로 나타났다(문헌 [Gutcher et al. (2006) Nat Immunol 7:946]). 동물에게 IL-18을 투여하였을 ?, RA의 콜라겐 유도성 관절염 모델에서 질환은 증강되는 것으로 나타난 반면(문헌 [Gracie et al. (1999) J Clin Invest 104:1393]), IL-18 결핍 또는 IL-18 중화 요법은 질환의 중증도를 약화시켰다(문헌 [Banda et al. (2003) J Immunol 170:2100]). IL-18 넉아웃 마우스는 실험적 유도성 결장염에 대해 내성을 띠는 반면(문헌 [Hovet et al., (2001) Gastroenterol 121:1372]), IL-18을 과다발현하는 트랜스제닉 동물은 상기 질환에 더 쉽게 걸리는 것으로 나타났다(문헌 [Ishikura et al. (2003) J Gastroenterol Hepatol 18:960]). IL-18 중화 치료가 장 염증을 약화시켰다(문헌 [Lochner and Foster (2002) Pathobiol 70:164]).
COPD가 발병된 동물 모델에서, 담배 연기는 국부적으로 폐 조직에서 IL-18 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(문헌 [Kang et al., (2008) J Clin Invest 118:2771], [Kang et al., (2007) J Immunol 178:1948]). 상기 모델에서, IL-18Rα 유전자의 파괴로 인해 IL-18 신호전달이 손상됨으로써 폐 염증은 감소되고, 세포 아포프토시스 및 폐기종이 일어났다(문헌 [Kang et al., (2007) J Immunol 178:1948]). 반대로, 마우스의 폐에서 IL-18의 과다발현은 CD8+ T 세포, 대식세포, 호중구 및 호산구 동원 뿐만 아니라, 폐기종 표현형을 가지는 폐를 특징으로 하는 폐 염증과 관련이 있었다(문헌 [Hoshino et al., (2007) Am J Respir Crit Care Med 176:49]). 만성 폐 염증 이외에도, IL-18은 바이러스 또는 박테리아 유발성 악화와도 관련이 있을 수 있다. 담배 연기 마우스 모델에서, IL-18 수준은 폴리(I:C)를 사용한 마우스 치료 또는 인플루엔자에 의한 감염에 의해 추가로 증강되고, 염증, 폐포 재형성 및 아포프토시스에 기여하는 것으로 나타났다(Kang et al., (2008) 상기 문헌 동일]).
많은 실험 동물 모델은 심혈관 질환, 특히, 죽상동맥경화증 발병에서의 IL-18의 역할을 다루었다. 재조합 IL-18을 ApoE-/- 마우스에게 투여하였을 때, 죽상경화성 병변 크기는 증가하고, 혈장 IFNγ 수준은 상승하였다(문헌 [Tenger et al. (2005) Arterioscler Thromb Vase Biol 25:791]). ApoE-/- 마우스에서 천연적으로 발생된 IL-18 억제제인 IL-18BP의 과다발현은 죽상동맥경화증을 감소시켰고, 플라크 표현형에 주된 변화를 일으켰는데, 이는 병변이 더욱 "안정"하다는 것을 나타내는 것이었다(문헌 [Mallat et al. (2001) Circ Res 89:E41]). 병변이 더 작고, 그의 표현형은 더욱 "안정"하다는 점에서, 이중 넉아웃 ApoE-/- x IL-18-/- 마우스의 표현형은 IL-18BP를 과다발현하는 ApoE-/- 마우스와 유사한 것이었다(문헌 [Elhage et al. (2003) Cardiovasc Res 59:234]). 혈관 손상 래트 모델에서 중화 항IL-18 항체를 투여한 경우, 신생혈관내막 형성은 현저하게 감소하였고(이는 내막내 세포 증식 감소와 상응), IFNγ 및 IL-6 유전자 발현도 현저하게 감소하였다(문헌 [Maffia et al., (2006) Circulation 114:430]). 추가로, IL-18-/- 마우스는 과식증, 비만 및 인슐린 저항에 쉽게 걸리는 것으로 나타났다(문헌 [Netea et al., (2006) Nat. Med. 12:650]).
상기 기술된 바와 같이, IL-18은 질환을 매개하는 염증유발성 사이토카인인 것으로 뿐만 아니라, 감염 및 암에 대한 숙주 방어에 중요한 면역자극성 사이토카인인 것으로 간주될 수 있다.
IL-18에 대하여 세포 표면 수용체와 경쟁하고, IL-18 활성을 중화시키는, 고친화도의, 구성적으로 발현되는 순환 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)이 천연 항염증성 뿐만 아니라, 면역억제성 분자로서 작용할 수 있다. 인간에서, 선택적 스플라이싱으로부터 형성된, IL-18BP의 4가지 상이한 이소폼(a, b, c 및 d)이 확인되었다. 오직 IL-18BPa 및 IL-18BPc만이 인간 IL-18에 결합하여 그의 생물학적 활성을 중화시키는 것으로 나타났으며, 이소폼 a가 이소폼 c보다 10배 더 높은 친화도를 가지는 것으로 나타났다(문헌 [Kim et al., (2000) PNAS 97 1190-1195]). 인간 IL-18의 컴퓨터 모델링을 통해 2개의 하전된 잔기, Glu-42 및 Lys-89가 확인되었는데, 이는 IL-18BP의 큰 소수성 포켓에 매립된, 반대로 하전된 아미노산 잔기와 상호작용한다. 비록 IL-18 수용체 알파 쇄가 IL-18BP와 유의적인 상동성을 공유하는 것은 아니지만, 세포 표면 IL-18 수용체 알파 쇄는 IL-18 결합에 대하여 IL-18BP와 경쟁한다.
NMR 분광법에 의해 가용성 IL-18의 구조를 측정하였는데, 이는 β 트레포일을 형성하는 12개의 가닥으로 구성된 것이었다(문헌 [Kato et al., (2003) Nat. Struct. Biol. 10:966]). 3개의 특이적인 표면 부위가 확인되었다. 부위 I은 코어 배럴 상의 한쪽 측면에 위치하는 5개의 잔기(Arg13, Asp17, Met33, Asp 35 및 Asp132)로 형성되고, IL-18Rα에의 결합을 담당하는 것이다. 부위 II는 β 배럴 상단에 위하는 6개의 잔기(Lys4, Leu5, Lys8, Arg58, Met60 및 Arg104)로 형성되고, 이것 또한 IL-18Rα 결합에 중요하다. 부위 III은 β 배럴 바닥의, 부위 II에 반대되는 곳에 위치하는 것(Lys 79, Lys 89, asp98)으로 형성되고, 이는 IL-18Rβ에 결합한다(문헌 [Kato et al. (2003) 상기 문헌 동일]).
IL-18에 결합하는 항체는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, US6706487, WO 2001/058956, EP 1621616, US 2005/01 7610; EP 0 974 600; 및 WO0158956 참조). 그러나, 치료학적인 면에서 IL-18의 생물학적 활성을 감소시키는 항IL-18 항체가 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 요약
본 발명의 측면은 IL-18의 IL-18R 및 IL-18BP 중 하나 또는 그 둘 모두에의 결합을 억제하여 IL-18 활성을 감소시키는 것인, 인터루킨-18(IL-18)에 대한 단리된 결합 구성원을 제공한다.
본 발명의 결합 구성원은 IL-18 분자 상의 IL-18BP 결합 부위와 전체적으로 또는 부분적으로 중첩되는 에피토프에 결합할 수 있다. IL-18 분자 상의 IL-18BP 결합 부위는 도 13에 제시되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 결합 구성원은 잔기 Tyr1, Gly3, Leu5, Glu6, Lys8, Met51, Lys53, Asp54, Ser55, Gln56, Pro57, Arg58, Gly59, Met60, Arg104, Ser105, 및 Pro107 중 하나 이상을 포함하는 인간 IL-18의 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원은 IL-18 활성 증가와 관련된 질환, 예컨대, 급성 관상 동맥 증후군(ACS: acute coronary syndrome); 죽상동맥경화증; 및 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)을 진단 및 치료하는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 결합 구성원은 또한 시료 중 유리 IL-18의 양을 측정하는 데 유용할 수 있다.
도 1은 항체 1 scFv(삼각형 표시)의 농도 증가에 따른 인간 IL-18, IL-18 수용체 알파 및 IL-18 수용체 베타 복합체 형성 억제를 보여주는 것이다. Y축은 임의의 scFv의 부재하에서 관찰된 총 결합에 대한 비율(%)로서 제시된, IL-18의 IL-18 수용체 복합체에의 특이적 결합을 나타내는 것이다. 데이터는 SEM을 이용하여 얻은 이중 점의 평균값으로 나타낸 것이다.
도 2의 그래프 A는 항체 1 IgG2(삼각형 표시)의 농도 증가에 따른 인간 IL-18, IL-18 수용체 알파 및 IL-18 수용체 베타 복합체 형성 억제를 보여주는 것이고, 그래프 B는 항체 1 IgG2(삼각형 표시)의 농도 증가에 따른 레서스 원숭이 IL-18, IL-18 수용체 알파 및 IL-18 수용체 베타 복합체 형성 억제를 보여주는 것이다. Y축은 임의의 IgG의 부재하에서 관찰된 총 결합에 대한 비율(%)로서 제시된, IL-18의 IL-18 수용체 복합체에의 특이적 결합을 나타내는 것이다. 데이터는 SEM을 이용하여 얻은 이중 점의 평균값으로 나타낸 것이다.
도 3은 항체 1 IgG2(동그라미 표시)의 농도 증가에 따른 인간 IL-18-FH에의 인간 IL-18BPa-Fc 결합 억제를 보여주는 것이다. Y축은 임의의 IgG의 부재하에서 관찰된 총 결합에 대한 비율(%)로서 제시된, IL-18의 IL-18BPa-Fc에의 특이적 결합을 나타내는 것이다. 데이터는 SEM을 이용하여 얻은 이중 점의 평균값으로 나타낸 것이다.
도 4는 항체 9 scFv(동그라미 표시) 및 항체 10 scFv(사각형 표시)의 농도 증가에 따른 인간 IL-18에의 항체 6 GL 결합 억제를 보여주는 것이다. Y축은 임의의 scFv의 부재하에서 관찰된 총 결합에 대한 비율(%)로서 제시된, IL-18의 항체 6 GL에의 특이적 결합을 나타내는 것이다. 데이터는 SEM을 이용하여 얻은 이중 점의 평균값으로 나타낸 것이다.
도 5는 농도가 증가하는 항체 9 scFv(사각형 표시), 항체 10 scFv(동그라미 표시) 및 항체 7 scFv(삼각형 표시)의 존재하에 외인성 인간 IL-18 및 TNFα로 자극을 받은 KG-1 세포에 의한 IFNγ 방출 억제를 보여주는 것이다. Y축은 중화 항체의 부재하에서 수득된 최대 반응에 대한 비율(%)로서 제시된, IFNγ 방출을 나타내는 것이다. 데이터는 SEM을 이용하여 얻은 이중 웰의 평균값으로 나타낸 것이다.
도 6은 농도가 증가하는 배선화된(germlined) 항IL-18 IgG의 존재하에 외인성 인간 IL-18 및 TNFα로 자극을 받은 KG-1 세포에 의한 IFNγ 방출 억제를 보여주는 것이다. Y축은 중화 항체의 부재하에서 수득된 최대 반응에 대한 비율(%)로서 제시된, IFNγ 방출을 나타내는 것이다. 데이터는 SEM을 이용하여 얻은 이중 웰의 평균값으로 나타낸 것이다. 모두가 IgG2로 전환된 것인, 항체 11 GL(동그라미 표시), 항체 12 GL(사각형 표시), 항체 8 GL(다이아몬드 표시), 및 대조군 IgG(삼각형 표시)의 중화 효과는 그래프 A에 제시되어 있다. IgG1TM으로 전환된 항체 12 GL 및 대조군 IgG(열린 삼각형 표시)의 중화 효과는 그래프 B에 제시되어 있다. Y축은 중화 항체의 부재하에서 수득된 최대 반응에 대한 비율(%)로서 제시된, IFNγ 방출을 나타내는 것이다. 데이터는 SEM을 이용하여 얻은 이중 웰의 평균값으로 나타낸 것이다.
도 7은 농도가 증가하는 배선화된 항체 12 IgG1TM(사각형 표시) 및 대조군 IgG(삼각형 표시)의 존재하에 LPS 및 인간 IL-12로 자극을 받은 인간(그래프 A) 및사이노몰구스 원숭이(그래프 B) 기원의 PBMC에 의한 IFNγ 방출 억제를 보여주는 것이다. Y축은 중화 항체의 부재하에서 수득된 최대 반응에 대한 비율(%)로서 제시된, IFNγ 방출을 나타내는 것이다. 데이터는 SEM을 이용하여 얻은 3명의 기증자의 평균값으로 나타낸 것이다.
도 8은 농도가 증가하는 배선화된 항체 12 IgG1TM(동그라미 표시) 또는 대조군 IgG(삼각형 표시)의 존재하에 인간 IL-18로 자극을 받은 인간 호중구상에서의 CD11b 상향 조절 억제를 보여주는 것이다. Y축은 비처리된 세포에서의 발현 수준 공제 후의, CD11b 발현의 기하 평균을 나타내는 것이다. 데이터는 SEM을 이용하여 얻은 이중 웰의 평균값으로 나타낸 것이다.
도 9는 농도가 증가하는 배선화된 항체 12 IgG1TM(사각형 표시) 또는 대조군 IgG(삼각형 표시)의 존재하에 인간 IL-18 및 fMLFF로 자극을 받은 인간 호중구에 의한 활성산소종(ROS: Reactive Oxygen Species) 생산 억제를 보여주는 것이다. Y축은 비처리된 세포에서 관출된 수준 공제 후의, (FL-2 채널에서) ROS 생산에 대하여 양성을 띠는 세포의 비율(%)을 나타내는 것이다. 데이터는 SEM을 이용하여 얻은 이중 웰의 평균값으로 나타낸 것이다.
도 10은 양이 증가하는 항체 12 GL IgG1TM(그래프 A)의 존재하에 인간 IL-18로 자극을 받은 KG-1 세포에 의한 IFNγ 방출의 용량 의존성 유도, 및 항체의 KD를 측정하는 데 사용된 상응하는 쉴드(Schild) 플롯(그래프 B)을 보여주는 것이다.
도 11은 농도가 증가하는 항체 12 GL IgG2(동그라미 표시)에 의한 인간 IL-18-FH에의 인간 IL-18BPa-Fc 결합 억제를 보여주는 것이다. Y축은 임의의 IgG의 부재하에서 관찰된 총 결합에 대한 비율(%)로서 제시된, IL-18의 IL-18BPa-Fc에의 특이적 결합을 나타내는 것이다. 데이터는 SEM을 이용하여 얻은 이중 점의 평균값으로 나타낸 것이다.
도 12는 IL-18(회색)의 폴리펩티드 쇄가 항체 12 GL(검은색)과 복합체를 형성하고 있는, IL-18:항체 12 GL의 복합체를 보여주는 것이다.
도 13은 항체 12 GL(상단) 및 IL-18BP(하단)와 상호작용하는 IL-18 서열 내의 잔기(회색, 밑줄로 표시)(즉, 에피토프)를 보여주는 것이다.
도 14는 IL-18과 상호작용하는 항체 12 GL 서열 내의 잔기(회색; 밑줄로 표시)(즉, 파라토프)를 보여주는 것이다.
도 15 pCLD-1128 플라스미드의 지도를 보여주는 것이다.
도 16은 재조합 IL-18BP를 사용하는 유리 IL-18에 대한 검정법에서 재조합 IL-18로부터의 신호의 농도 의존성 억제를 보여주는 것이다.
도 17은 유리 IL-18에 대한 검정법에서 3개의 인간 객담 시료 중 내인성 유리 IL-18로부터의 신호의 재조합 IL-18BP 및 항체 1 GL에 의한 억제를 보여주는 것이다.
상세한 설명
본 발명은 IL-18에 결합하는 결합 구성원, 예로서, 인간, 인간화된 및/또는 키메라 항체 뿐만 아니라, 그의 단편, 유도체/컨쥬게이트 및 조성물을 제공한다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 결합 구성원은 IL-18의 IL-18BP 및/또는 IL-18R에의 결합을 조절할 수 있고, 예컨대, 생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 IL-18의 생물학적 활성을 감소시키는 데 유용할 수 있다. IL-18에 결합하는 결합 구성원은 또한 예를 들어, 시료 중 IL-18의 존재를 검출하는 데에도 유용할 수 있다.
본 발명의 한 측면은 IL-18의, IL-18R 및 IL-18BP 중 하나 또는 그 둘 모두에의 결합을 억제시킴으로써 IL-18 활성을 감소시키는 것인, IL-18에 대한 단리된 결합 구성원을 제공한다.
단리된 결합 구성원은 IL-18 분자 상의, IL-18BP 결합 부위와 전체적으로 또는 부분적으로 중첩되는 에피토프에 결합할 수 있다.
IL-18BP 결합 부위는 도 13에 제시되어 있다.
예를 들어, IL-18에 대한 단리된 결합 구성원은 인간 IL-18의 잔기 Tyr1, Gly3, Leu5, Glu6, Lys8, Met51, Lys53, Asp54, Ser55, Gln56, Pro57, Arg58, Gly59, Met60, Arg104, Ser105 및 Pro107, 또는 다른 종, 예를 들어, 영장류, 예컨대, 레서스 원숭이의 IL-18로부터의 상응하는 잔기 중 하나 이상을 포함하는 IL-18의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
IL-18에 대한 결합 구성원은 인간 IL-18의 Tyr1, Gly3, Leu5, Glu6, Lys8, Met51, Lys53, Asp54, Ser55, Gln56, Pro57, Arg58, Gly59, Met60, Arg104, Ser105, 및 Pro107로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 잔기 또는 17개의 잔기 모두를 포함하는 IL-18 에피토프에 결합할 수 있다.
예를 들어, IL-18 에피토프는 잔기 Tyr1, Gly3, Leu5, Met51, Lys53, Asp54, Ser55, Gln56, Pro57, Arg58, Gly59, Met60, Arg104 및 Ser105를 포함할 수 있다. 임의적으로, 에피토프는 잔기 Glu6, Lys8 및 Pro107을 추가로 포함할 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, IL-18에 대한 결합 구성원은 Tyr1, Gly3, Leu5, Met51, Lys53, Asp54, Ser55, Gln56, Pro57, Arg58, Gly59, Met60, Arg104 및 Ser105로 이루어진 IL-18 에피토프에 결합할 수 있다.
제시된 에피토프 잔기를 포함하는 IL-18의 서열은 도 13에 제시되어 있다.
IL-18 에피토프의 일부인 것으로 확인된 IL-18 잔기는 본원에서 결합된 IL-18/항체 복합체 중 항체 가변 도메인의 하나 이상의 잔기로부터 0.5 nm (5 Å) 이내에 위치하는 것으로 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 또한, 결합된 IL-18/항체 복합체 중 항체 가변 도메인의 하나 이상의 잔기로부터 근접하게(예컨대, 0.75 nm 이내 또는 1 nm 이내에) 위치하는 다른 IL-18 잔기도 또한 IL-18 에피토프의 일부인 것으로 간주될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, IL-18은 인간 IL-18이다. 인간 IL-18의 다형성 변이체 다수가 공지되어 있다. 가장 일반적인 2가지 다형성 변이체는 SNP 데이터베이스에서 수탁 번호 rs2854746(A32G) 및 rs9282734(H158P)를 가진다. 인간 IL-18의 서열은 공개 데이터베이스에서 이용가능하며(유전자 번호 3606; NCBI NP_001553.1 GI: 4504653; 유니프로트(Uniprot) Q14116-1), 성숙한 인간 IL-18 서열은 서열 번호 169에 제시되어 있다. 비인간 IL-18이란 인간 이외의 종, 예컨대, 설치류 또는 비인간 영장류에서 천연적으로 발생되는 IL-18의 오르토로그를 의미한다. 레서스 원숭이를 비롯한 다른 종으로부터 유래된 IL-18 서열은 당업계에 공지되어 있고, 공개 데이터베이스, 예컨대, 진뱅크(Genbank)에서 이용가능하다. 인간 IL-18의 특이적인 잔기에 상응하는, 다른 종으로부터 유래된 IL-18의 잔기 서열은 서열 정렬 도구를 사용하여 쉽게 확인할 수 있다.
재조합적으로 발현된 성숙한 인간 및 레서스 원숭이 IL-18을 사용하여 본원에 기술된 항체 분자를 선별하고 스크리닝하였다. 종간 교차 반응성 분석을 위한 본원에 기술된 실험에서 비인간 오르토로그, 예컨대, 설치류 및 레서스 원숭이 IL-18을 사용하였다.
기술된 바와 같은 결합 구성원은 인간 IL-18에 결합한다. 결합 구성원은 또한 다른 종으로부터 유래된 IL-18 중의 표적 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 비인간 영장류, 예컨대, 레서스 원숭이 및/또는 사이노몰구스 원숭이로부터 유래된 IL-18에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 구성원은 설치류 IL-18, 예를 들어, 마우스 또는 래트 IL-18에 결합하지 않거나, 또는 실질적으로 결합하지 않는 것으로 나타날 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 본원에 기술된 바와 같은 표적 IL-18 에피토프에 특이적이고, 비표적 에피토프, 예를 들어, IL-18 이외의 다른 단백질로부터의 에피토프에 비하여 고친화도로 상기 표적 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 결합 구성원은 다른 인간 사이토카인, 예컨대, IL-1β 및 IL-1F7보다 10배 이상, 100배 이상, 500배 이상, 1,000배 이상, 또는 2,000배 이상 더 큰, IL-18에 대한 결합 친화도를 보일 수 있다.
결합 구성원은 10-2s-1 미만, 바람직하게는, 10-3s-1 미만, 더욱 바람직하게는, 10-4s-1 미만, 예를 들어, 9 x 10-5 이하, 및 전형적으로, 2 내지 9 x 10-5s-1인, 인간 IL-18 및 임의적으로 레서스 원숭이 IL-18에 대한 해리 상수(kd)를 보일 수 있다(예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 비아코어(Biacore)에 의해 측정된 바, 항체 12GL IgG1 TM에 대하여 2.9 x 10-5s-1).
결합 구성원은 10 nM 미만(예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 비아코어 검정법으로 측정된 바, 항체 1의 KD = 9.96 nM); 바람직하게는, 1 nM 미만, 더욱 바람직하게는, 500 pM 미만, 더욱 바람직하게는, 100 pM 미만, 추가로 바람직하게는, 바람직하게는, 70 pM 미만(예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 비아코어 검정법으로 측정된 바, 항체 12GL IgG1TM의 KD = 63 pM)인, 인간 IL-18에 대한 친화도(kD)를 나타낼 수 있다. 결합 구성원의 결합 반응 속도 및 친화도(평형 해리 상수 KD로 표시됨)는 표준 기법, 예컨대, 표면 플라즈몬 공명을 이용하여, 예컨대, 비아코어(BIAcore)™ 분석법을 사용하여, 또는 본원에 기술된 바와 같이 세포 기반 검정법(쉴드 플롯/pA2 분석법)을 사용하여 약리학적으로 측정될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 IL-18의 IL-18 수용체(IL-18R: IL-18 receptor) 및/또는 IL-18 결합 단백질(IL-18BP: IL-18 결합 단백질)에의 결합을 억제시킬 수 있다. 예를 들어, 결합 구성원은 IL-18에의 결합에 대해 IL-18R(IL-18Rα, 유니프로트 수탁 #Q13478; IL-18Rβ, 유니프로트 수탁 #095256) 및/또는 IL-18BP, 예를 들어, IL-18BP 이소폼 a(유니프로트 수탁 #095998)와 경쟁할 수 있다.
경쟁은 표준 기법, 예컨대, 실시예에 기술되어 있는 바와 같은 IL-18/IL-18BP 균질 시간 분해 형광(HTRF™: homogenous time resolved fluorescence) 경쟁 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 결합 구성원은 예를 들어, 적합한 검정법, 예컨대, HTRF™ IL-18/IL-18BP 경쟁 검정법에서 10 nM인 것으로 측정된 바와 같이, IL-18에의 IL-18BP 결합을 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상 억제시키는 것으로 나타날 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 IL-18의 생물학적 활성을 억제시킬 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 검정법에서 결합 구성원에 의한 IL-18 활성 억제는 결합 구성원이 IL-18에 결합하여 그를 억제시킨다는 것을 나타내는 것이다. IL-18 활성 억제는 편리하게는 IFNγ 생산 감소로 측정될 수 있다. 억제는 또한 예를 들어, ELISA에 의해 다른 가용성 매개 인자, 예컨대, IL-8, MCP-1, CXCL16, GM-CSF, sICAM-1, 및 MMP의 방출을 통해 측정될 수 있다.
IFNγ 및 다른 가용성 매개 인자의 생산 및 방출을 측정하는 기법은 당업계에 주지되어 있고, 세포 기반 검정법, 예컨대, KG-1 검정법 및 PBMC 검정법; 면역학적 기법, 예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯팅 및 면역침전법; 친화도 크로마토그래피 및 다른 생화학적 검정법을 포함한다.
IL-18 활성 억제는 또한 세포상의 활성화 마커, 예컨대, CD11b의 발현 감소, 또는 산화 스트레스의 매개 인자, 예컨대, 예컨대, 활성산소종(ROS)의 생산 감소에 의해 측정될 수 있다. CD11b 또는 ROS의 변화를 측정하는 기법은 당업계에 주지되어 있고, 세포 기반 검정법, 예컨대, 호중구 자극 검정법; 면역학적 기법, 예컨대, 유세포 측정을 위한 면역염색법 및 다른 생화학적 검정법을 포함한다.
IL-18 활성 억제는 부분적으로 또는 전체적으로(즉, 중화) 이루어질 수 있다. 예를 들어, 결합 구성원은 결합 구성원의 부재하의 활성과 비교하여 IL-18 활성을 100%만큼, 또는 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상 또는 50% 이상만큼 억제시킬 수 있다.
결합 구성원의 중화 효능은 측정될 수 있다. 효능은 달리 언급되지 않는 한, 보통 IC50 값으로 표현된다. 기능적 검정법에서, IC50은 생물학적 반응을 그의 최대치의 50%만큼 감소시키는 항체 분자의 농도이다. 리간드 결합 연구에서, IC50은 수용체 결합을 최대 특이적 결합 수준의 50%만큼 감소시키는 농도이다. IC50은 소프트웨어 프로그램, 예컨대, 프리즘(Prism)(그래프패드(GraphPad)) 또는 오리진(Origin)(오리진 랩스(Origin Labs))을 사용하여 S자형 함수를 데이터에 피팅하여 IC50 값을 구함으로써, 최대 생물학적 반응(%)을 로그 결합 구성원 농도의 함수로서 플롯팅함으로써 계산할 수 있다. 효능을 측정하거나 재는 데 적합한 검정법은 당업계에 주지되어 있다.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 예를 들어, IL-18로 유발된 IFNγ의 방출에 의해 측정되는 바, 260 nM 미만, 100 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 1 nM 미만, 또는 0.5 nM 미만의 IL-18에 대한 (효능의 기하 평균으로서 표현된) IC50 값을 나타낼 수 있다. IFNγ 방출에 대한 적합한 검정법으로는 본원에 기술된 바와 같은 KG-1 및 PBMC 검정법을 포함한다.
두 종의 IL-18에 대한 결합 구성원의 교차 반응성 정도를 평가하기 위해 제1 종(예컨대, 인간)으로부터 유래된 IL-18을 사용하여 검정법에서 계산된 결합 구성원의 중화 효능을 제2 종으로부터 유래된 IL-18(예컨대, 레서스 원숭이 IL-18)을 사용하여 같은 검정법에서의 결합 구성원의 중화 효능과 비교할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 비인간 IL-18 검정법에서보다 인간 IL-18 검정법에서 더 큰 중화 효능을 가질 수 있다. 예를 들어, 인간 IL-18에 대한 결합 구성원의 중화 효능은 레서스 원숭이 IL-18에 대한 것보다 더 클 수 있다.
결합 구성원은 항체 골격 내에 하나 이상의 CDR, 예컨대, CDR 세트(즉, 항체 항원 결합 도메인)를 가지는 항체 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 항체 분자의 VH 및 VL 도메인 또한 본 발명의 일부로서 제공된다. 주지되어 있는 바와 같이, VH 및 VL 도메인은 상보성 결정 영역,("CDR: complementarity determining region"), 및 골격 영역("FW: framework region")을 포함한다. VH 도메인은 HCDR 세트를 포함하고, VL 도메인은 LCDR 세트를 포함한다. 항체 분자는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및/또는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다. VH 또는 VL 도메인은 추가로 골격을 포함할 수 있다. VH 또는 VL 도메인 골격은 전형적으로 4개의 골격 영역, FW1, FW2, FW3 및 FW4를 포함하는데, 하기 구조와 같이 이들 사이 사이에 CDR이 배치되어 있다: FW1 - CDR1 - FW2 - CDR2 - FW3 - CDR3 - FW4.
본 발명의 측면에 따른 항체 VH 및 VL 도메인, FW 및 CDR의 예는 하기 표 10 및 11 및 본 개시의 일부를 형성하는 첨부된 서열 목록에 열거되어 있다. 본원에 개시된 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR 세트, HCDR 세트 및 LCDR 세트 모두, 이들 요소의 조합이 본 발명의 측면을 나타낸다. 본원에 기술된 바와 같이, "CDR 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDR 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 의미하고, LCDR 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 의미한다. 달리 언급하지 않는 한, "CDR 세트"는 HCDR 및 LCDR을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 항체 분자는 모노클로날 항체이다.
다른 실시양태에서, 결합 구성원은 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 보통 비항체 단백질 스캐폴드 내에 하나 이상의 CDR, 예컨대, CDR 세트에 의해 제공되는, 비항체 분자 내의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다.
표 10, 11 및 서열 목록에 제시되어 있는 CDR 세트의 서열 및 골격 서열을 가지는, 항체 1로 지정된 모체 항체 분자의 단리는 본원에 기술된 바와 같다. 최적화 과정을 통해, 항체 1 GL, 항체 2, 항체 3, 항체 4, 항체 5, 항체 6, 항체 6 GL, 항체 7, 항체 7 GL, 항체 8 GL, 항체 9, 항체 10, 항체 11, 항체 11 GL, 및 항체 12 GL로 지정되는 한 패널의 항체 클론을 항체 1로부터 생성하였다. 상기의 최적화된 클론의 CDR 서열 및 가변 도메인 서열은 표 10 및 11을 참조하고, 이는 서열 목록에 기재되어 있다. 예를 들어, 표 11에는 항체 1이, HCDR1이 서열 번호 3(카바트(Kabat) 잔기 31-35b)이고, HCDR2가 서열 번호 4(카바트 잔기 50-65)이고, HCDR3이 서열 번호 5(카바트 잔기 95-102)이고, LCDR1이 서열 번호 8(카바트 잔기 24-34)이고, LCDR2가 서열 번호 9(카바트 잔기 50-56)이고, LCDR3이 서열 번호 10(카바트 잔기 89-97)인 CDR 세트를 가진다는 것이 제시되어 있다. 항체 2는 각각 서열 번호 23, 24, 25, 28, 29, 및 30의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 가진다. 최적화된 다른 항체 클론도 유사한 방식으로 표 11에 제시되어 있고, 이 또한 본 발명의 측면으로서 제공된다.
본 발명에 따른 IL-18에 대한 결합 구성원은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 CDR, 예컨대, CDR3, 및 임의적으로는 또한 CDR1 및 CDR2를 포함함으로써 CDR 세트를 형성할 수 있다. CDR 또는 CDR 세트는 항체 1 CDR 또는 항체 1 CDR 세트일 수 있거나, 또는 항체 1 GL, 항체 2, 항체 3, 항체 4, 항체 5, 항체 6, 항체 6 GL, 항체 7, 항체 7 GL, 항체 8 GL, 항체 9, 항체 10, 항체 11, 항체 11 GL, 및 항체 12 GL 중 임의 것의 CDR 또는 CDR 세트일 수 있거나, 또는 본원에 기술된 바와 같이 그의 변이체일 수 있다.
일부 실시양태에서;
HCDR1은 카바트 잔기 31-35b로 이루어지는 7개의 아미노산 길이일 수 있고/거나;
HCDR2는 카바트 잔기 50-65로 이루어지는 16개의 아미노산 길이일 수 있고/거나;
HCDR3은 카바트 잔기 95-102로 이루어지는 15개의 아미노산 길이일 수 있고/거나;
LCDR1은 카바트 잔기 24-34로 이루어지는 11개의 아미노산 길이일 수 있고/거나;
LCDR2는 카바트 잔기 50-56으로 이루어지는 7개의 아미노산 길이일 수 있고/거나;
LCDR3은 카바트 잔기 89-97로 이루어지는 9개의 아미노산 길이일 수 있다.
결합 구성원은 표 11에 열거되어 있는 항체 중 임의 것의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3, 및/또는 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3, 예컨대, 표 11에 열거되어 있는 항체 중 임의 것의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 결합 구성원은 상기 항체들 중 어느 하나의 VH CDR 세트를 포함할 수 있다. 임의적으로, 이는 또한 상기 항체들 중 하나의 VL CDR 세트를 포함할 수 있다. VL CDR은 VH CDR과 같은 항체이거나, 다른 항체로부터의 것일 수 있다. 표 11에 열거되어 있는 항체 중 임의 것의 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인 및/또는 표 11에 열거되어 있는 항체 중 임의 것의 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인 또한 본원에서 제공한다.
본원에 기술된 바와 같이 인터루킨-18(IL-18)에 특이적으로 결합하는 결합 구성원은:
(a) 서열 번호 153과 동일하거나, 또는 서열 번호 153과 비교하여 1, 2, 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 HCDR1;
(b) 서열 번호 154와 동일하거나, 또는 서열 번호 154와 비교하여 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 HCDR2;
(c) 서열 번호 155와 동일하거나, 또는 서열 번호 155와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 HCDR3;
(d) 서열 번호 158과 동일하거나, 또는 서열 번호 158과 비교하여 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 LCDR1;
(e) 서열 번호 159와 동일하거나, 또는 서열 번호 159와 비교하여 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 LCDR2; 및
(f) 서열 번호 160과 동일하거나, 또는 서열 번호 160과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 LCDR3을 포함할 수 있다.
결합 구성원은 개시된 H 및/또는 L CDR 세트 내에 하나 이상의 치환, 예컨대, 최대 15개 이하, 최대 16개 이하, 또는 최대 17개 이하의 치환을 포함하는, 모체 항체인 항체 1 또는 표 11에 열거되어 있는 항체 중 임의 것의 H 및/또는 L CDR 세트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 분자는 17, 16 또는 15개 이하의 치환, 예컨대, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 치환을 포함하는, 항체 1, 항체 1 GL, 항체 2, 항체 3, 항체 4, 항체 5, 항체 6, 항체 6 GL, 항체 7, 항체 7 GL, 항체 8 GL, 항체 9, 항체 10, 항체 11, 항체 11 GL, 및 항체 12 GL 중 어느 하나로부터의 H 및/또는 L CDR 세트를 포함할 수 있다. 치환은 잠재적으로는 CDR 세트 내의 임의의 잔기에서 이루어질 수 있다.
예를 들어, 적합한 항체 분자는 CDR 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있는데, 여기서, CDR 세트는
(i) HCDR1이 아미노산 서열 서열 번호 3이고;
HCDR2가 아미노산 서열 서열 번호 4이고;
HCDR3이 아미노산 서열 서열 번호 5이고;
LCDR1이 아미노산 서열 서열 번호 8이고;
LCDR2가 아미노산 서열 서열 번호 9이고;
LCDR3이 아미노산 서열 서열 번호 10인, 항체 1 CDR 세트;
(ii) HCDR1이 아미노산 서열 서열 번호 143이고;
HCDR2가 아미노산 서열 서열 번호 144이고;
HCDR3이 아미노산 서열 서열 번호 145이고;
LCDR1이 아미노산 서열 서열 번호 148이고;
LCDR2가 아미노산 서열 서열 번호 149이고;
LCDR3이 아미노산 서열 서열 번호 150인, 항체 11 GL CDR 세트; 또는
(iii) HCDR1이 아미노산 서열 서열 번호 153이고;
HCDR2가 아미노산 서열 서열 번호 154이고;
HCDR3이 아미노산 서열 서열 번호 155이고;
LCDR1이 아미노산 서열 서열 번호 158이고;
LCDR2가 아미노산 서열 서열 번호 159이고;
LCDR3이 아미노산 서열 서열 번호 160인, 항체 12 GL CDR 세트로부터 선택되는 17, 16 또는 15개 이하의 치환을 가진다.
일부 실시양태에서, 치환은 IL-18/mAb 복합체 중 IL-18 잔기로부터 0.5 nm (5 Å) 초과의 거리만큼 떨어져 있는 위치에 존재하는 잔기에서 이루어질 수 있다(도 14 참조). 예를 들어, HCDR3은 카바트 잔기 95, 96, 100A, 100B, 100C, 100f, 100g, 101 및 102로부터 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 위치에 치환을 포함할 수 있다. HCDR2는 카바트 잔기 50, 51, 54-57 및 59-65로부터 선택되는 1, 2, 3, 또는 4개의 위치에 치환을 포함할 수 있다. HCDR1은 카바트 잔기 31-34, 35a 및 35b로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 위치에 치환을 포함할 수 있다. 적합한 LCDR3은 카바트 잔기 89, 90, 95 및 97로부터 선택되는 1, 2, 3, 또는 4개의 위치에 치환을 포함할 수 있다. LCDR2는 카바트 잔기 50 내지 56으로부터 선택되는 1, 2, 3, 또는 4개의 위치에 치환을 포함할 수 있다. LCDR1은 카바트 잔기 24 내지 29, 31, 33 및 34로부터 선택되는 1, 2, 3, 또는 4개의 위치에 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치환은 표 11에 제시된 바와 같이, 항체 1 GL, 항체 2, 항체 3, 항체 4, 항체 5, 항체 6, 항체 6 GL, 항체 7, 항체 7 GL, 항체 8 GL, 항체 9, 항체 10, 항체 11, 항체 11 GL, 및 항체 12 GL 중 임의의 것에서의 치환 위치에서 이루어질 수 있다. 따라서, 하나 이상의 치환은 하기 잔기 중 하나 이상에서 이루어질 수 있다:
HCDR3에서 카바트 잔기 99, 100a, 100b 및 100d;
LCDR3에서 카바트 잔기 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 및 97.
결합 구성원은
카바트 잔기 95가 Thr이고/거나;
카바트 잔기 96이 Pro이고/거나;
카바트 잔기 97이 Ala이고/거나;
카바트 잔기 98이 Tyr이고/거나;
카바트 잔기 99가 Asp 또는 Phe이고/거나;
카바트 잔기 100이 Gly이고/거나;
카바트 잔기 100A가 Asp 또는 Gln이고/거나;
카바트 잔기 100B가 Ala 또는 Asp이고/거나;
카바트 잔기 100C가 Arg이고/거나;
카바트 잔기 100D가 Ala 또는 Thr이고/거나;
카바트 잔기 100E가 Asp이고/거나;
카바트 잔기 100F가 Phe이고/거나;
카바트 잔기 100G가 Phe이고/거나;
카바트 잔기 101이 Asp이고/거나;
카바트 잔기 102가 Val인 HCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, HCDR3에서 카바트 잔기 99는 Phe일 수 있고/거나; 카바트 잔기 100a는 Gln일 수 있고/거나; 카바트 잔기 100b는 Asp일 수 있고/거나; 카바트 잔기 100d는 Thr일 수 있다.
결합 구성원은
카바트 잔기 92가 Tyr, Ser, Leu, His, 또는 Ala이고/거나;
카바트 잔기 93이 Ser, Phe, Tyr, His, 또는 Ile이고/거나;
카바트 잔기 94가 Thr 또는 Pro인 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 결합 구성원은
카바트 잔기 89가 Gln 또는 Ala이고/거나;
카바트 잔기 90이 Gln, Asp, 또는 Asn이고/거나;
카바트 잔기 91이 Ser 또는 Ile이고/거나;
카바트 잔기 92가 Tyr, Ser, Leu, His, 또는 Ala이고/거나;
카바트 잔기 93이 Ser, Phe, Tyr, His, 또는 Ile이고/거나;
카바트 잔기 94가 Thr 또는 Pro이고/거나;
카바트 잔기 95가 Pro, Asn, 또는 Gln이고/거나;
카바트 잔기 96이 Trp이고/거나;
카바트 잔기 97이 Thr 또는 Asp인 LCDR3을 포함할 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, LCDR3에서 카바트 잔기 92는 His일 수 있고/거나; 카바트 잔기 93은 His일 수 있고/거나; 카바트 잔기 94는 Pro일 수 있다.
결합 구성원 중 일부 예에서, HCDR1은 서열 번호 3, 103, 113 또는 153 중 하나일 수 있고; HCDR2는 서열 번호 4, 104, 124, 또는 134 중 하나일 수 있다. 예를 들어, HCDR1은 서열 번호 153일 수 있고; HCDR2는 서열 번호 154일 수 있다.
HCDR3은 서열 번호 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 또는 155 중 하나일 수 있다. 예를 들어, HCDR3은 서열 번호 155일 수 있다.
LCDR1은 서열 번호 158일 수 있고; LCDR2는 아미노산 서열 서열 번호 159일 수 있다.
LCDR3은 서열 번호 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 또는 160 중 하나일 수 있다. 예를 들어, LCDR3은 서열 번호 160일 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, 결합 구성원은 항체 골격 내에 하나 이상의 CDR, 예컨대, CDR 세트를 가지는 항체 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR 세트를 골격(예컨대, 인간 골격) 내로 이식시킴으로써 항체 분자를 수득할 수 있다. 골격 영역은 인간 배선(germline) 유전자 세그먼트 서열로 이루어질 수 있다. 따라서, 골격은 배선화된 것일 수 있고, 이로써 골격 내의 하나 이상의 잔기는 가장 유사한 인간 배선 골격내 등가인 위치에 있는 잔기와 매칭되도록 변이된다. 당업자는 배선화에 앞서 항체의 서열이 항체의 골격 서열에 가장 가까운 배선 세그먼트를 선별할 수 있고, 항체의 친화도 또는 활성을 테스트함으로써 배선화가 본원에 기술된 바와 같은 검정법에서 항원 결합 또는 효능을 유의적으로 감소시켰는지 여부를 확인할 수 있다. 인간 배선 유전자 세그먼트 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 예를 들어, VBASE 컴필레이션(VBASE, MRC Centre of Protein Engineering, UK, 1997, http//mrc-cpe. cam. ac. uk)으로부터 평가될 수 있다
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 인간 배선 골격, 예컨대, Vh4 DP66(4-61) 중 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인을 가지는 단리된 인간 항체 분자일 수 있다. 따라서, VH 도메인 골격 영역 FW1, FW2 및/또는 FW3은 인간 배선 유전자 세그먼트 Vh4 DP66(4-61)의 골격 영역을 포함할 수 있고/거나, 골격 잔기를 상기 인간 배선 유전자 세그먼트의 골격 잔기에 매칭되도록 돌연변이시킴으로써 배선화될 수 있다. FW4는 인간 배선 j 세그먼트 JH2의 골격 영역을 포함할 수 있다. VH FW1의 아미노산 서열은 서열 번호 161일 수 있다. VH FW2의 아미노산 서열은 서열 번호 162일 수 있다. VH FW3의 아미노산 서열은 서열 번호 163일 수 있다. VH FW4의 아미노산 서열은 서열 번호 164일 수 있다. 보통, 결합 구성원은 또한 예컨대, 인간 배선 골격, 예컨대, V 카파 1 L12 중 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 가진다. 따라서, VL 도메인 골격 영역은 인간 배선 유전자 세그먼트 V 카파 1 L12의 골격 영역 FW1, FW2 및/또는 FW3을 포함할 수 있고/거나, 골격 잔기를 상기 인간 배선 유전자 세그먼트의 골격 잔기에 매칭되도록 돌연변이시킴으로써 배선화될 수 있다. FW4는 인간 배선 j 세그먼트 JK2의 골격 영역을 포함할 수 있다. VL FW1의 아미노산 서열은 서열 번호 165일 수 있다. VL FW2의 아미노산 서열은 서열 번호 166일 수 있다. VL FW3의 아미노산 서열은 서열 번호 167일 수 있다. VL FW4의 아미노산 서열은 서열 번호 168일 수 있다. 배선화된 VH 또는 VL 도메인은 하나 이상의 버니어(Vernier) 잔기에서 배선화될 수 있거나, 또는 배선화될 수 없지만, 보통은 배선화되지 않는다.
본 발명의 항체 분자는
카바트 잔기 6은 Gln 또는 Glu일 수 있고/거나;
카바트 잔기 10은 Arg 또는 Gly일 수 있고/거나;
카바트 잔기 13은 Lys 또는 Glu일 수 있고/거나;
카바트 잔기 16은 Gln 또는 Glu인 중쇄 FW1을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 카바트 잔기 41이 Ala 또는 Pro인 중쇄 FW2 및/또는 카바트 잔기 74가 Pro 또는 Ser인 중쇄 FW3을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 카바트 잔기 3이 Val 또는 Gln인 경쇄 FW1; 카바트 잔기 42가 Arg, Lys 또는 Gly인 경쇄 FW2; 카바트 잔기 70이 Asp 또는 Glu이고/거나, 카바트 잔기 81이 Glu 또는 Asp인 경쇄 FW3; 및/또는 카바트 잔기 99가 Gly 또는 Ser인 경쇄 FW4를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 항체 분자 또는 VH 도메인은 하기의 중쇄 골격 영역 세트:
FW1 서열 번호 161;
FW2 서열 번호 162;
FW3 서열 번호 163;
FW4 서열 번호 164를 포함할 수 있거나, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 변경, 예컨대, 치환을 포함하는 상기 중쇄 골격 영역 세트를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 항체 분자 또는 VL 도메인은 하기의 경쇄 골격 영역 세트:
FW1 서열 번호 165;
FW2 서열 번호 166;
FW3 서열 번호 167;
FW4 서열 번호 168을 포함할 수 있거나, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 변경, 예컨대, 치환을 포함하는 상기 경쇄 골격 영역 세트를 포함할 수 있다.
아미노산 변경은 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다.
예를 들어, 항체 분자는
중쇄 FW1이 서열 번호 161이고;
중쇄 FW2가 서열 번호 162이고;
중쇄 FW3이 서열 번호 163이고;
중쇄 FW4가 서열 번호 164이고;
경쇄 FW1이 서열 번호 165이고;
경쇄 FW2가 서열 번호 166이고;
경쇄 FW3이 서열 번호 167이고;
경쇄 FW4가 서열 번호 168인 중쇄 및 경쇄 골격 영역 세트를 포함할 수 있거나, 또는 11개 이하, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변경, 예컨대, 치환을 포함하는 상기 중쇄 및 경쇄 골격 영역 세트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 중쇄 및 경쇄 골격 영역 세트 중에 1개 또는 2개의 아미노산 치환이 존재할 수 있다.
배선화되지 않은 항체 분자는 배선화된 항체 분자와 비교하여 같은 CDR은 같지만, 골격은 상이하다. 본원 첨부된 서열 목록에 제시된 하체 서열 중 항체 1, 항체 6, 항체 7, 항체 8, 항체 11, 및 항체 12의 서열은 배선화된 것이다. 항체 2, 항체 3, 항체 4, 항체 5, 및 항체 9 및 항체 10의 배선화된 항체는 다른 항체에 대하여 본원에 제시된 VH 및 VL 도메인 서열의 골격 영역을 배선화시킴으로써 제조될 수 있다.
비록 상기 논의된 바와 같이 VH 또는 VL 도메인은 단독으로 항원 결합에 사용될 수 있기는 하지만, 전형적으로, VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 형성함으로써 항체 항원 결합 부위를 제공한다. 예를 들어, 항체 12 GL VH 도메인(서열 번호 152)은 항체 12 GLVL 도메인(서열 번호 157)과 쌍을 형성할 수 있고, 이로써, 항체 12 GL VH 및 VL 도메인, 둘 모두를 포함하는 항체 항원 결합 부위가 형성된다. 본원에 개시된 다른 항체의 VH 및 VL 도메인에 대한 유사한 실시양태를 제공한다. 다른 실시양태에서, 항체 12 GL VH는 항체인 항체 12 GL VL 이외의 VL 도메인과 쌍을 형성한다. 경쇄 무차별성(promiscuity)은 당업계에 잘 확립되어 있다. 추가로, 본 발명은 본원에 개시된 다른 VH 및 VL 도메인에 대한 유사한 실시양태도 제공한다. 따라서, 모체 항체 1, 또는 최적화된 클론 항체 1 GL, 항체 2, 항체 3, 항체 4, 항체 5, 항체 6, 항체 6 GL, 항체 7, 항체 7 GL, 항체 8 GL, 항체 9, 항체 10, 항체 11, 항체 11 GL, 및 항체 12 GL 중 임의 것의 VH는 상이한 항체로부터의 VL 도메인과 쌍을 형성할 수 있고, 예컨대, VH 및 VL 도메인은 항체 1, 항체 1 GL, 항체 2, 항체 3, 항체 4, 항체 5, 항체 6, 항체 6 GL, 항체 7, 항체 7 GL, 항체 8 GL, 항체 9, 항체 10, 항체 11, 항체 11 GL, 및 항체 12 GL로부터 선택되는 상이한 항체로부터의 것일 수 있다.
단리된 결합 구성원은
(i) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 142에 제시되어 있는 것이고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 147에 제시되어 있는 것이거나;
(ii) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 142와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환을 가지고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 147과 비교하여 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노산 치환을 가지거나; 또는
(iii) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 142와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 147과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 것인 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 결합 구성원은
(i) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 152에 제시되어 있는 것이고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 157에 제시되어 있는 것이거나;
(ii) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 152와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환을 가지고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 157과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노산 치환을 가지거나; 또는
(iii) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 152와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 157과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 것인 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있다.
단리된 결합 구성원은
(i) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 102에 제시되어 있는 것이고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 107에 제시되어 있는 것이거나;
(ii) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 102와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환을 가지고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 107과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노산 치환을 가지거나; 또는
(iii) VH 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 102와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지고, VL 도메인 아미노산 서열은 서열 번호 107과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 것인 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, scFv와 같은 항체 분자에는 항체 불변 영역이 존재하지 않을 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체 분자는 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 항체 분자는 전체 항체, 예컨대, IgG, 즉, IgG1, IgG2, 또는 IgG4일 수 있거나, 또는 하기 기술하는 바와 같은 항체 단편 또는 유도체일 수 있다. 항체 분자는 또한 예컨대, Fc 영역 중에 YTE를 포함하는 IgG1(문헌 [Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunology, 169:5171-5180]; [Dall'Acqua et al. (2006) J Biol. Chem. 281 (33):23514-24]), 및/또는 TM 돌연변이를 포함하는 IgG1(문헌 [Oganesyan et al. (2008) Acta Cryst D64:700-4])과 같은 다른 포맷을 가질 수도 있다.
항체 12_GL의 VH 및 VL 도메인을 코딩하는 벡터를 포함하는 E. 콜라이(E. coli) TOP10 세포는 부다페스트 조약(Budapest treaty)에 따라 수탁 번호 NCIMB 41786하에 2010년 11월 23일자로 국립 산업 및 해양 박테리아 은행(NCIMB: National Collection of Industrial, food and Marine Bacteria)(NCIMB 리미티드(NCIMB Ltd.: 영국 애버딘))에 기탁되었다. 기탁된 VH 및 VL 도메인의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 152 및 157에 제시되어 있다.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41786의 핵산 서열 및/또는 벡터에 의해 코딩되는 CDR, VH 도메인, VL 도메인, 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41786의 핵산, 벡터 또는 세포주로부터 제조될 수 있거나, 또는 그로부터 제조가능하다. 예를 들어, 결합 구성원은 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41786의 세포주의 핵산 또는 벡터의 발현에 의해 제조될 수 있다. 핵산 또는 벡터는 임의의 편리한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 별법으로, 결합 구성원은 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41786의 세포주에 의해 발현될 수 있다.
본 발명의 측면은 또한 수탁 번호 NCIMB 41786의 세포주에 포함되어 있는, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산; 수탁 번호 NCIMB 41786의 세포주에 포함되어 있는 상기 핵산을 포함하는 벡터; 및 수탁 번호 NCIMB 41786의 세포 또는 세포주를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 IL-18에의 결합에 대하여
(i) IL-18에 결합하고,
(ii) 표 10 및 11에 열거되어 있는 항체 분자, VH 및/또는 VL 도메인, CDR, 예컨대, HCDR3, 및/또는 CDR 세트를 포함하는 것인 임의의 항체 분자와 경쟁하는, 본원에 기술된 바와 같은 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자를 포함하는 결합 구성원을 제공한다.
예를 들어, 결합 구성원, 예컨대, 항체 분자는
(i) 서열 번호 152의 서열을 가지는 VH 도메인 및 서열 번호 157의 서열을 가지는 VL 도메인;
(ii) 서열 번호 152와 비교하였을 때, 15개 이하의 아미노산 치환, 예컨대, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 치환을 가지는 VH 도메인; 및 서열 번호 157과 비교하였을 때, 13개 이하의 아미노산 치환, 예컨대, 예컨대, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 치환을 가지는 VL 도메인; 또는
(iii) 각각 서열 번호 152 및 서열 번호 157과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 분자와 경쟁할 수 있다.
결합 구성원 사이의 경쟁은 쉽게 시험관내에서, 예를 들어, ELISA를 사용함으로써, 및/또는 예컨대, 하나 이상의 다른 태깅되지 않은 결합 구성원의 존재하에 검출될 수 있는 하나의 결합 구성원에 특이적인 리포터 분자를 태깅하는 것과 같은 생화학적 경쟁 검정법에 의하여 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하는 결합 구성원을 확인함으로써 검정될 수 있다. 상기 방법은 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 본원에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 및 상기 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인이 제조되도록 하는 조건하에서 상기 핵산을 발현시키고, 그를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 결합 구성원, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 제조하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 측면은 서열 번호 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151 및 170의 단리된 VH 도메인 핵산 서열; 서열 번호 6, 16, 26, 3 6, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156 및 171의 단리된 VL 도메인 핵산 서열; 및 상기 VH 및 VL 핵산 서열의 쌍을 포함하는 단리된 핵산, 구성물, 및 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원, 예를 들어, 표 10 및 11, 또는 서열 목록에 개시되어 있는 VH CDR 또는 VL CDR 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 예를 들어, 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 상기 기술된 단리된 핵산을 포함하는 벡터, 예컨대, 플라스미드 또는 파지 벡터를 제공한다.
추가 측면은 본 발명의 핵산 및/또는 벡터를 함유하거나, 그로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 추가의 측면은 IL-18, 바람직하게는, 유리 IL-18(즉, IL-18BP에 결합하지 않은 IL-18)의 측정에서의 본 발명의 결합 구성원의 용도, 및 예를 들어, 개체로부터 수득한 시료 중의 유리 IL-18을 측정하는 검정 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 결합 구성원을 함유하는 조성물, 및 요법에 의한 인체 또는 동물 신체 치료 방법을 비롯한, IL-18을 억제 및/또는 중화시키는 방법에서의 상기 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 환자에게 유효량의 본 발명의 결합 구성원을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 또는 진단 방법에서, 예컨대, 인체 또는 동물 신체(예로서, 인간 환자에서)에서의 질환 또는 장애의 치료(이는 예방적 치료를 포함할 수 있다) 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 병증은 본원 다른 곳에서도 상세히 논의되어 있는 바와 같이, IL-18이 중요한 역할을 하는 임의의 것, 예를 들어, IL-18 수준 상승과 관련이 있는 병증을 포함한다.
본 발명의 이러한 측면들과 다른 측면들은 하기에 추가로 상세히 기술된다.
결합 구성원( Binding member )
결합 구성원이라는 용어는 서로 서로에게 결합하는 한 쌍의 분자들 중 하나의 구성원을 기술한다. 결합 쌍의 구성원들은 천연적으로 유도된 것이거나, 전체적으로 또는 부분적으로 합성하여 제조된 것일 수 있다. 분자 쌍의 하나의 구성원은 그의 표면상 한 영역, 또는 공동을 가지는데, 이는 분자 쌍의 나머지 한 구성원과 결합하고, 이로써 그의 특정 공간 및 극성 구조와 상보성을 이루게 된다. 결합 쌍 유형의 예로는, 항원-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질을 포함한다. 본 발명은 항원-항체 유형의 반응에 관한 것이다.
결합 구성원은 보통 항원 결합 부위를 가지는 분자를 포함한다. 예를 들어, 결합 구성원은 항원 결합 부위를 포함하는 항체 분자 또는 비항체 단백질일 수 있다.
항원 결합 부위는 예컨대, 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 등과 같은 비항체 단백질 스캐폴드 상의 CDR 배열에 의해 제공될 수 있거나(문헌 [Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6]; [Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151]; [Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-4691]), 또는 단백질 스캐폴드 내의 루프의 아미노산 잔기를 무작위화하거나 돌연변이시켜 원하는 표적에 대한 결합 특이성을 부여하여 제공할 수 있다. 단백질 내에 새로운 결합 부위를 조작하기 위한 스캐폴드는 문헌 [Nygren et al. 상기 문헌 동일]에 상세하게 리뷰되어 있다. 항체 모방체를 위한 단백질 스캐폴드는, 발명자들이 1 이상의 무작위화된 루프를 가지는 피브로넥틴 III형 도메인을 포함하는 단백질(항체 모방체)을 기술하고 있는 WO/0034784(상기는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 개시되어 있다. 하나 이상의 CDR, 예컨대, HCDR 또는 HCDR3 및/또는 LCDR3 세트가 그 내로 이식될 수 있는 적합한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리 중 임의의 도메인 구성원에 의해 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 비인간 단백질일 수 있다. 비항체 단백질 스캐폴드의 장점은 항원 결합 부위를 적어도 일부 항체 분자보다는 작거나 제조하기 쉬운 스캐폴드 분자 내에 제공할 수 있다는 것이다. 결합 구성원의 크기가 작으면 유용한 생리학적 특성, 예컨대, 세포 내로 진입하거나, 조직 내로 깊숙이 침투하거나, 다른 구조 내의 표적에 도달할 수 있는 능력, 또는 표적 항원의 단백질 공동 내에 결합할 수 있는 능력을 부여받게 될 수 있다. 비항체 단백질 스캐폴드내 항원 결합 부위를 사용하는 것은 문헌 [Wess, 2004 [Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004]에 리뷰되어 있다. 전형적인 것은 안정한 골격과 하나 이상의 가변적 루프를 가지는 단백질로서, 루프 또는 루프들의 아미노산 서열은 특이적으로 또는 무작위적으로 돌연변이되어 표적 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 생성하게 된 것이다. 그러한 단백질은 S. 아우레우스(S. aureus)로부터의 단백질 A의 IgG 결합 도메인, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴 (예컨대, 열번째 피브로넥틴 III형 도메인), 리포칼린 뿐만 아니라, 감마 결정질 및 다른 아필린(Affilin)™ 스캐폴드(실 프로테인(Scil Proteins))를 포함한다. 다른 접근법의 예로는 분자내 이황화 결합을 가지는 작은 단백질인 사이클로티드에 기초하는 합성 "마이크로바디스(Microbodies)," 마이크로프로테인즈(Microproteins)(베르사바디스(Versabodies)™, 아뮤닉스(Amunix)) 및 안키린 반복부 단백질(DARPins, 몰레큘러 파트너스(Molecular Partners))을 포함한다.
항체 서열 및/또는 항원 결합 부위 이외에도, 결합 구성원은 예컨대, 폴딩된 도메인, 또는 분자에 항원에 결합할 수 있는 능력 이외의 또 다른 기능적 특징을 부여하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하는, 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 결합 구성원은 검출 가능한 표지를 보유하거나, 독소 또는 표적화 모이어티 또는 효소에 (예를 들어, 펩티딜 결합 또는 링커를 통하여) 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 결합 구성원은 항원 결합 부위 뿐만 아니라, (예컨대, 효소 도메인 내에) 촉매 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, 항원 결합 부위는 항원에 결합하여 촉매 부위를 항원에 표적화시킨다. 촉매 부위는, 예컨대, 절단에 의하여 항원의 생물학적 기능을 억제시킬 수 있다.
언급한 바와 같이, 비록 비항체 스캐폴드가 CDR을 보유할 수는 있지만, 본 발명의 CDR, 예컨대, CDR3, 또는 CDR 세트를 보유하는 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 그의 실질적인 부분으로서, 이들에서 CDR 또는 CDR 세트는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 천연적으로 발생된 VH 및 VL 항체 가변 도메인 중의 CDR 또는 CDR 세트에 상응하는 위치에 배치되어 있다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 배치는 문헌 [Kabat, et al., 1987 [Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987] 및 그의 최신판을 참조함으로써 결정될 수 있다. 이들 데이터베이스를 질의하는 데 다수의 학술적 및 상업적 온라인 공급원이 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133] 및 현 웹 주소 http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html인 관련 온라인 공급원을 참조할 수 있다.
CDR 영역 또는 CDR은 문헌 [Kabat et al. 1991 [Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington]과 그의 최신판에 의해 정의된 바와 같이 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역를 나타내고자 한다. 항체는 전형적으로 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 함유한다. 본원에서 CDR 또는 CDRs란 경우에 따라 이들 영역 중의 하나, 또는 수개, 또는 심지어 항원 또는 그가 인식하는 에피토프에 대한 항체의 친화도에 의해 결합에 관여하는 대부분의 아미노산 잔기를 포함하는 이들 영역의 전체를 나타내기 위해 사용된다.
6개의 짧은 CDR 서열 중에서, 중쇄의 세번째 CDR(HCDR3)은 크기 가변성이 더 크다(본질적으로 다양성을 제공하는 유전자 배열의 기전에 기인하여 다양성이 더 크다). 비록 가장 긴 것은 26개의 아미노산에 이르는 것으로 알려져 있기는 하지만, 2개의 아미노산 길이만큼 짧을 수도 있. CDR 길이는 또한 특정의 기본 골격에 의해 조정될 수 있는 길이에 따라 달라질 수 있다. 기능적으로, HCDR3은 부분적으로는 항체의 특이성을 결정하는 데 중요한 역할을 한다(문헌 [Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974]; [Amit et al., Science, 233:747-753, 1986]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987]; [hothia et al., Nature, 342:877-883, 1989]; [Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 199]; [Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990]; [Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990]; 및 [Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991]).
항체 분자
이는 천연적인 것이든 또는 부분적 또는 전체적으로 합성되어 제조된 것이든 간에 면역글로불린을 이른다. 이 용어는 또한 항체 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 발명은 천연 형태의 항체에 관한 것이 아니며, 다시 말해서 본 발명의 항체는 천연의 환경에 존재하는 것이 아니라, 천연 공급원으로부터 정제에 의해 단리 또는 수득될 수 있거나, 유전적 재조합에 의해서, 또는 화학적 합성에 의해서 수득할 수 있다는 것, 그리고 또한 후술하는 바와 같은 비천연의 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 항체 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편은 예컨대, Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, 및 Fd와 같은 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나 이상의 항체 항원 결합 부위를 포함하는 각종 다른 항체 분자가 조작되었으며, 이는 예를 들어, Fab2, Fab3, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 미니바디를 포함한다. 항체 분자 및 그의 구성 방법 및 사용 방법은 문헌 [Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136 2005]에 기술되어 있다.
표적 항원에 결합하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 제조하기 위하여 모노클로날 또는 다른 항체를 취하고, 재조합 DNA 기술의 기법을 사용할 수 있다. 그러한 기법은 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 다른 면역글로불린의 불변 영역 또는 불변 영역 + 골격 영역으로 도입시키는 것을 포함한다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400, 및 아주 다양한 후속 문헌을 참조한다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포에 유전적 돌연변이 또는 다른 변이를 일으킬 수 있으며, 이는 생산된 항체의 결합 특이성을 변경시키거나 그러하지 않을 수 있다.
항체는 다수의 방법으로 변형될 수 있기 때문에, "항체 분자"라는 용어는 요구되는 특이성 및/또는 항원에의 결합을 포함하는 항체 항원 결합 부위를 가지는 임의의 결합 구성원 또는 물질을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이 용어는 천연이든 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성된 것이든 간에, 항체 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 비롯한, 항체 단편 및 유도체를 포함하는 것이다. 따라서, (예컨대, 또 다른 종으로부터 유래되거나, 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 것인) 또 다른 폴리펩티드에 융합된 항체 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 분자 또는 등가물도 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A0120694 및 EP-A-0125023, 및 다수의 후속 문헌에 기재되어 있다.
항체 조작 분야에서 이용가능한 추가의 기법을 통해 인간 및 인간화된 항체를 단리할 수 있었다. 예를 들어, 인간 하이브리도마는 문헌 ([Kontermann & Dubel [Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545]])에 기술되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다. 결합 구성원을 생산하는 또 다른 확립된 기법인 파지 디스플레이는 다수의 공개 문헌, 예컨대, 문헌 [Kontermann & Dubel 상기 문헌 동일] 및 WO92/01047(추가로 하기에서 논의), 및 미국 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404에 상세하게 기술되어 있다.
마우스 면역계에서 다른 성분들은 온전하게 보존되고 마우스 항체 유전자는 불활성화되고 기능적으로 인간 항체 유전자로 치환된 트랜스제닉 마우스가 인간 항체를 단리시키는 데 사용될 수 있다(문헌 [Mendez, M. et al. (1997) Nature Genet, 15(2):146-156]). 인간화된 항체는 당업계에 공지된 기법, 예컨대, WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 565,332 및 WO93/17105에 개시되어 있는 것을 사용함으로써 제조될 수 있다. 추가로, WO2004/006955에는 비인간 항체의 가변 영역의 CDR 서열에 대한 정규 CDR 구조 유형을 인간 항체 서열, 예컨대, 배선 항체 유전자 세그먼트의 라이브러리로부터의 상응하는 CDR에 대한 정규 CDR 구조 유형을 비교함으로써 인간 항체 유전자로부터 가변 영역 골격 서열을 선별하는 것에 기초하는, 항체를 인간화하는 방법이 기술되어 있다. 비인간 CDR과 유사한 정규 CDR 구조 유형을 가지는 인간 항체 가변 영역은 인간 항체 서열로부터 인간 골격 서열을 선별할 수 있도록 하는 구성원들의 서브세트를 형성한다. 상기 서브세트 구성원들은 추가로 인간과 비인간 CDR 서열 사이의 아미노산 유사성에 대해 등급화될 수 있다. WO2004/006955의 방법에서는 선별된 서브세트 구성원 인간 골격를 사용하여 인간 CDR 서열을 비인간 CDR 대응물로 기능적으로 치환시킨 키메라 항체를 구성함으로써 비인간과 인간 항체 사이의 골격 서열을 비교할 필요없이 높은 친화성과 낮은 면역원성을 가지는 인간화된 항체를 제공할 수 있도록 하기 위해 상위권의 인간 서열을 선별하여 골격 서열을 제공한다. 본 발명에 따라 제조된 키메라 항체 또한 개시한다.
합성 항체 분자는 예를 들어, (Knappik) 등의 문헌 [Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86] 또는 (Krebs) 등의 문헌 [Krebs et al. Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84]에 기술되어 있는 바와 같이, 적합한 발현 벡터에서 합성되고 조립된 올리고뉴클레오티드에 의해 제조된 유전자로부터의 발현되어 제조될 수 있다.
전체 항체의 단편은 항원에 결합하는 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌 [Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)]; [McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554]; [Holt et al., (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490]); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결되어 2개의 도메인이 회합되어 항원 결합 부위를 형성하는 것인 단일 쇄 Fv 분자(scFv: single chain Fv)(문헌 [Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988]; [Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988]); (viii) 이중특이적 단일 쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구성된 "디아바디," 다가 또는 다중특이적 단편 (WO94/13804; [Holliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993])이 있다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결시키는 이황화 브릿지를 혼입시킴으로써 안정화될 수 있다(문헌 [Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996]). CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니바디 또한 제조될 수 있다(문헌 [Hu, S. et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996]). 결합 단편의 다른 예로는, 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에의 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 비롯한, 수개의 잔기 부가에 의해 Fab 단편과 상이한 것인, Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab' 단편인 것인 Fab'-SH가 있다.
(Qui) 등의 문헌 [Qui et al., Nat. Biotechnol. 25:921-929 2007]에는 골격 영역에 의해 연결된 단 2개의 CDR을 함유하는 항체 분자가 기술되어 있다. VH 또는 VL 도메인으로부터의 CDR3은 다른 도메인의 CDR1 또는 CDR2 루프에 연결되어 있었다. 선택된 CDR1 또는 CDR2의 C 말단을 거쳐 FR 영역에 의해 CDR3의 N 말단으로 연결되어 있었다. (Qui) 등은 소수성이 가장 적은 패치를 가지는 FR 영역을 선택하였다. 테스트하기에 가장 좋은 항체 조합은 VL CDR1이 VH FR2에 의해서 VH CDR3에 연결된 것(VHCDR1-VHFR2-VLCDR3)이라는 것이 밝혀졌다. 분자량이 약 3 kDa일 경우, 이들 항체 분자는 전체 면역글로불린( 대략 150 kDa) 또는 scFv(대략 28 kDa)와 비교하여 조직 침투성이 개선되었다는 점에서 이점을 제공한다.
본 발명의 항체 단편은 예컨대, 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 분해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 브릿지의 절단과 같은 방법에 의해 본원에 열거된 항체 중 임의의 것으로부터 출발하여 수득될 수 있다. 또 다른 방식으로, 본 발명에 포함되는 항체 단편은 당업자에게 주지되어 있는 유전자 재조합 기법, 또는 다르게는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 사 등에 의해 공급되는 자동 펩티드 합성기에 의한 펩티드 합성에 의해서 또는 핵산 합성 및 발현에 의해서 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 기능적 항체 단편은 반감기가 화학적 변형, 특히 PEG화 또는 리포좀 내의 혼입에 의해 증가된 임의의 기능적 단편을 포함한다.
dAb(도메인 항체)는 항체의 작은 단량체성 항원 결합 단편, 즉, 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역이다. VH dAbs는 낙타류 (예컨대, 낙타, 라마)에서 천연적으로 발생된 것이고, 낙타류를 표적 항원으로 면역화시키고, 항원 특이적 B 세포를 단리시킨 후, 개개의 B 세포로부터 dAb 유전자를 직접 클로닝함으로써 제조될 수 있다. dAb는 또한 세포 배양물에서 제조가능하다. 그들은 작은 크기, 우수한 용해도 및 온도 안정성으로 인해 특히 생리학적으로 유용하고, 선택 및 친화도 성숙에 적합하다. 낙타류 VH dAbs는 "나노바디(nanobodies)™"라는 상표명하에 치료용으로 개발 중에 있다. 본 발명의 결합 구성원은 본원에 실질적으로 기재된 바와 같은 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb, 또는 본원에 실질적으로 기재된 바와 같은 CDR 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인일 수 있다.
이중특이적 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 가변 영역이 동일 분자 내에 조합된 2 세대 모노클로날 항체를 형성한다(문헌 [Holliger and Bohlen 1999암 and metastasis rev. 18:411-419]). 그들의 용도는 새로운 효과기 기능을 동원할 수 있는 능력 또는 종양 세포 표면상의 수개의 분자를 표적화할 수 있는 능력으로부터 진단 분야 및 치료 분야, 둘 모두에서 입증되었다. 이중특이적 항체가 사용되는 경우, 이들은 통상의 이중특이적 항체로서, 다양한 방법(문헌 [Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-449 1993]), 예를 들어, 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 것이거나, 상기 언급한 이중특이적 항체 단편 중 임의의 것일 수 있다. 이들 항체는 화학적 방법(문헌 [Glennie M J et al., 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375]; [Repp R. et al., 1995 J. Hemat. 377-382]) 또는 체세포 방법((문헌 [Staerz U. D. and Bevan M. J. 1986 PNAS 83]; [Suresh M. R. et al., 1986 Method Enzymol. 121: 210-228]), 또는 유사하지만 우선적으로 이종이량체화되도록 하여 원하는 항체 정제 공정이 용이하게 진행될 수 있도록 하는 유전 공학 기법에 의해 수득할 수 있다(문헌 [Merchand et al., 1998 Nature Biotech. 16:677-681]). 이중특이적 항체의 예로는, 상이한 특이성을 가지는 두 항체의 결합 도메인이 사용될 수 있고, 짧은 가요성 펩티드를 통해 직접 연결될 수 있는 것인, 바이트(BiTE)™ 기술의 항체를 포함한다. 이는 2개의 항체를 짧은 단일 폴리펩티드 쇄 상에 조합한다. 디아바디 및 scFv 는 오직 가변 도메인만을 사용하여 Fc 영역없이 구성될 수 있으며, 이는 잠재적으로 항이디오타입 반응의 효과를 감소시킨다.
이중특이적 항체는 전체 IgG로서, 이중특이적 Fab'2로서, Fab' PEG로서, 디아바디 또는 다르게는 이중특이적 scFv로 구성될 수 있다. 추가로, 2개의 이중특이적 항체는 당업계에 공지된 통상의 방법으로 연결됨으로써 4가 항체를 형성할 수 있다.
이중특이적 전체 항체에 대립되는 개념으로서의 이중특이적 디아바디는 또한 그들이 E. 콜라이에서 쉽게 구성되고 발현될 수 있기 때문에 특히 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성을 가지는 디아바디(및 다수의 다른 폴리펩티드, 예컨대, 항체 단편)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이(WO94/13804)를 사용하여 용이하게 선별될 수 있다. 디아바디의 한쪽 아암이, 예를 들어, IL-18에 대해 특이성을 가지는 상태로 일정하게 유지될 경우, 이때 다른 아암은 가변된 라이브러리가 제조될 수 있고, 적절한 특이성의 항체가 선택된다. 이중특이적 전체 항체는 문헌 [Ridgeway et al., 1996 [Ridgeway, J. B. B. et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996]]에 기재된 바와 같은 대체 조작 방법으로 제조될 수 있다.
IL-18에 대한 항체를 수득하기 위한 다양한 방법들이 당업계에서 이용가능하다. 항체는 특히 인간, 뮤린, 키메라 또는 인간화된 기원의 모노클로날 항체일 수 있으며, 이는 당업자에게 주지된 표준 방법으로 수득될 수 있다.
일반적으로, 특히 뮤린 기원의, 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 제조하는 것은 특히 매뉴얼 "안티바디스(Antibodies)"(문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988])에 기술된 기법, 또는 (Kohler) 및 (Milstein)의 문헌 [Koehler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975]에 기술된 바에 따라 하이브리도마로부터 제조하는 기법을 참조할 수 있다.
모노클로날 항체는, 예를 들어, IL-18 또는 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그들의 단편들 중 하나에 대해 면역화된 동물의 세포로부터 수득될 수 있다. 적합한 단편 및 그를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드는 본원에 기술되어 있고, 이는 동물을 면역화시켜 IL-18에 대한 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 상기 IL-18, 또는 그의 단편 중 하나는 특히 통상의 실험 방법에 따라서, IL-18 또는 그의 단편을 코딩하는 cDNA 서열에 함유된 핵산 서열로부터 출발하는 유전적 재조합에 의해, IL-18 및/또는 그의 단편의 펩티드 서열에 포함된 아미노산 서열로부터 출발하는 펩티드 합성법에 의해 제조될 수 있다.
모노클로날 항체는 예를 들어, IL-18 또는 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그들의 단편 중 하나가 사전에 고정화되어 있는 친화도 칼럼 상에서 정제될 수 있다. 더욱 특히, 모노클로날 항체는 단백질 A 및/또는 G 상에서 크로마토그래피한 후, DNA 및 LPS 뿐만 아니라 잔류 단백질 오염물의 제거를 위한 이온 교환 크로마토그래피를 수행하거나 수행하지 않고, 이량체 또는 다른 다량체의 존재에 기인한 잠재적인 응집물을 제거할 목적으로 세파로스 겔 상의 배제 크로마토그래피를 수행하거나 수행하지 않고서 정제될 수 있다. 한 실시양태에서 상기의 모든 기법들을 동시에 또는 연속적으로 사용할 수 있다.
항원 결합 부위
이는 표적 항원의 전체 또는 일부에 결합하고 그에 상보적인 분자의 일부를 이른다. 항체 분자에서, 이는 항체 항원 결합 부위로서 지칭되며, 표적 항원의 전체 또는 일부에 결합하고 그에 상보적인 항체의 일부를 포함한다. 항원이 큰 경우, 항체는 항원의 특정 부분에만 결합하게 되며, 이 부분을 에피토프라 한다. 항체 항원 결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항체 항원 결합 부위는 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있다.
WO2006/072620에는 면역글로불린 도메인의 베타 가닥 사이로 연장되어 있는 구조(비CDR) 루프에서 항원 결합 부위를 조작하는 것이 기술되어 있다. 항원 결합 부위는 CDR의 천연 위치와는 별개인 항체 분자의 영역, 예컨대, VH 또는 VL 도메인의 골격 영역에서, 또는 항체 불변 도메인, 예컨대, CH1 및/또는 CH3에서 조작될 수 있다. 구조 영역에서 조작된 항원 결합 부위는 VH 및 VL 도메인의 CDR 세트에 의해 형성된 항원 결합 부위에 부가적이거나, 그를 대신할 수 있다. 다중 항원 결합 부위가 항체 분자에 존재할 경우, 이는 동일 항원(표적 항원)에 결합함으로써 결합 구성원의 원자가를 증가시킬 수 있다. 별법으로, 다중 항원 결합 부위는 상이한 항원(표적 항원 및 하나 이상의 또 다른 항원)에 결합할 수 있으며, 이는 항체 분자의 효과기 기능을 부가하거나, 반감기를 연장시키거나, 생체내 전달을 개선시키는 데 사용될 수 있다.
단리된
이는 본 발명의 결합 구성원 또는 그러한 결합 구성원을 코딩하는 핵산이 본 발명에 따라 일반적으로 존재하게 되는 상태를 이른다. 따라서, 본 발명에 따른 결합 구성원, VH 및/또는 VL 도메인, 및 코딩 핵산 분자 및 벡터는 예컨대, 그의 천연 환경으로부터 단리 및/또는 정제되어 실질적으로 순수한 또는 균질한 형태로, 또는 핵산인 경우에는 필요한 기능을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 다른 기원 핵산 또는 유전자는 없거나 실질적으로 없는 상태로 제공될 수 있다. 단리된 구성원 또는 단리된 핵산에는 그들과 천연적으로 회합하고 있던 물질, 예컨대, 그의 천연 환경, 또는 생체내 또는 시험관내에서 수행된 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 경우, 그들이 제조된 환경(예컨대, 세포 배양물)에서 그들과 같이 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 없거나 실질적으로 없을 것이다. 구성원 및 핵산은 희석제 또는 애주번트와 함께 제제화될 수 있고, 단리시키고자 하는 실제 목적을 위해서는 추가로-예를 들어, 면역검정법에서 사용하기 위해 마이크로타이터 플레이트를 코팅시키는 데 사용될 경우에는 구성원을 보통 젤라틴 또는 다른 담체와 함께 혼합하거나, 또는 진단 또는 요법에 사용하는 경우에는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합할 것이다. 결합 구성원은 천연적으로 또는 이종 진핵 세포(예컨대, CHO 또는 NS0(ECACC 85110503) 세포에 의해 당화될 수 있거나, 또는 그들은(예를 들어, 원핵 세포 중 발현에 의해 제조되는 경우) 당화되지 않을 수 있다.
항IL-18 항체 분자를 포함하는 비균질 제제 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 예를 들어, 그러한 제제는 전장의 중쇄 및 C 말단 리신이 결여된 중쇄를 가진 항체, 다양한 정도의 당화 및/또는 유도체화된 아미노산, 예컨대, N 말단 글루탐산을 폐환화시켜 형성된 피로글루탐산 잔기를 가진 항체들의 혼합물일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로 기재된 바와 같은"이라는 어구는 본원에 기술된 결합 구성원의 VH 또는 VL 도메인의 관련 CDR의 특징(들)이 그 서열이 본원에 기재된 명시된 영역과 동일하거나 고도로 유사하다는 것을 의미한다. 본원에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 가변 도메인의 명시된 영역(들)과 관련하여 "고도로 유사하다"라는 어구는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인 내에서 이루어질 수 있다는 것으로 간주된다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 결합 구성원은 IL-18의 생물학적 활성을 조절하고 중화시킬 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 IL-18 결합 구성원은 중화 효능에 대하여 최적화될 수 있다. 일반적으로, 효능 최적화는 선택된 결합 구성원의 서열(일반적으로 항체의 가변 도메인 서열)을 돌연변이시켜 결합 구성원의 라이브러리를 생성한 후, 이를 효능에 대해 검정하여 보다 더 강력한 결합 구성원을 선별하는 단계를 포함한다. 따라서, 선별된 "효능이 최적화된" 결합 구성원은 라이브러리 생성의 기원이 되는 결합 구성원보다 더 높은 효능을 가지는 경향이 있다. 그럼에도 불구하고, 고효능 결합 구성원은 또한 최적화 없이도 수득될 수 있으며, 예를 들어, 고효능 결합 구성원은 초기 스크린, 예컨대, 생화학적 중화 검정법으로부터 직접 수득될 수 있다. "효능이 최적화된" 결합 구성원이란 IL-18의 특정 활성 또는 하류 기능을 중화시키는 최적화된 효능을 가지는 결합 구성원을 지칭한다. 검정법과 효능은 본원 다른 곳에 더욱 상세히 기술되어 있다. 본 발명은 효능이 최적화된 결합 구성원 및/또는 최적화되지 않은 결합 구성원 뿐만 아니라, 선택된 결합 구성원으로부터 효능을 최적화시키는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명을 통해 당업자는 고효능의 결합 구성원을 제조할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 결합 구성원의 라이브러리와 항원을 접촉시키는 단계, 및 라이브러리 중 상기 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 구성원을 선별하는 단계를 포함하는, 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 구성원을 수득하는 방법을 제공한다.
라이브러리는 입자 또는 분자 복합체, 예컨대, 복제 가능한 유전적 패키지 예컨대, 효모, 박테리아 또는 박테리오파지(예컨대, T7) 입자, 바이러스, 세포, 또는 공유 결합, 리보솜 또는 다른 시험관내 디스플레이 시스템 상에 디스플레이 될 수 있으며, 각 입자 또는 분자 복합체는 그 위에 디스플레이된 항체 VH 가변 도메인 및 임의적으로 존재할 경우, 디스플레이된 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 함유한다. 파지 디스플레이는 WO92/01047에, 및 예컨대, 미국 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 및 US6521404(이들 출원은 각각 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다)에 기술되어 있다. 리보솜 디스플레이는 문헌 [Hanes J and Plueckthun A. (1997) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1997 May 13; 94(10): 4937-42]; WO01/75097 및 WO2006/072773(이들은 각각 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.
항원에 결합할 수 있고, 박테리오파지 또는 다른 라이브러리 입자 또는 분자 복합체 상에 디스플레이된 결합 구성원을 선별한 후, 상기 선별된 결합 구성원을 디스플레이하고 있는 박테리오파지 또는 다른 입자 또는 분자 복합체로부터 핵산을 취할 수 있다. 그러한 핵산은 상기 선별된 결합 구성원을 디스플레이하고 있는 박테리오파지 또는 다른 입자 또는 분자 복합체로부터 취한 핵산 서열을 가지는 핵산으로부터 발현시켜 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 제조하는 후속 과정에서 사용할 수 있다.
상기 선별된 결합 구성원의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 가지는 항체 VH 가변 도메인은 그러한 VH 도메인을 포함하는 결합 구성원과 같이 단리된 형태로 제공될 수 있다.
IL-18에 결합할 수 있는 능력은 추가로 테스트될 수 있으며, 예컨대, IL-18에의 결합에 대해 본원에 열거되어 있는 것과 같은 항체(예컨대, scFv 포맷 및/또는 IgG 포맷인 것, 예컨대, IgG2 또는 IgG1)중 임의의 것과 경쟁할 수 있는 능력도 추가로 테스트될 수 있다. IL-18을 중화시킬 수 있는 능력은 본원 다른 곳에 추가로 논의되는 바와 같이 테스트될 수 있다.
결합 구성원은 예컨대, scFv, IgG2, IgG1TM 또는 IgG1과 같은, 표 10 및 11에 열거되어 있는 항체 중 임의 것의 친화도로, 또는 우수한 친화도로 IL-18에 결합할 수 있다. 항체 결합 친화도는 하기 표 5에 제시되어 있다.
결합 구성원은 예컨대, scFv, IgG2, IgG1과 같은, 본원에 열거되어 있는 항체 중 임의 것의 효능으로, 또는 증가된 효능으로 IL-18의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다.
상이한 결합 구성원의 결합 친화도 및 중화 효능은 적절한 조건하에서 비교될 수 있다.
그에 대한 아미노산 서열이 본원에 기재되어 있고, IL-18에 대한 결합 구성원에 사용될 수 있는 것을 비롯한, 본원에 기술된 바와 같은 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체는 서열 변경 및 돌연변이, 및 원하는 특징을 가지는 항원 결합 구성원에 대한 스크리닝 방법에 의해 수득될 수 있다. 원하는 특징의 예로는 하기의 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
· 항원에 특이적인 공지 항체에 비하여 증가된 항원에 대한 결합 친화도,
· 활성이 알려져 있을 경우, 항원에 특이적인 공지 항체에 비하여 증가된 항원 활성의 중화,
· 특정 몰비에서 항원에 대해 공지 항체 또는 리간드와 경쟁할 수 있는 구체화된 경쟁 능력,
· 복합체를 면역침전시킬 수 있는 능력,
· 하기 명시되는 에피토프에 결합할 수 있는 능력:
o 본원에 기술된 바와 같은 펩티드 결합 스캔을 사용하여, 예컨대, 선형 및/또는 제한적인 입체 구조로 스크리닝된 펩티드를 사용하여 확인된 펩티드 서열과 같은 선형 에피토프,
o 비연속 잔기에 의해 형성된, 입체 구조 에피토프,
· IL-18, 또는 하류 분자의 새로운 생물학적 활성을 조절할 수 있는 능력.
상기 방법 또한 본원에서 제공한다.
본원에 개시된 항체 분자의 변이체는 본 발명에서 제조되고 사용될 수 있다. 다변량 데이터 분석 기법을 구조/특성 활성 관계에 적용하는 컴퓨터 화학법의 선례를 따라(예를 들어, 문헌 [Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski)]; [D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6] 참조), 주지된 수학적 기법, 예컨대, 통계학적 회귀, 패턴 인식 및 분류를 사용하여 항체의 정량적 활성 특성 관계를 도출해낼 수 있다(예를 들어, 문헌 [Norman et al. Applled Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998) ISBN: 0471170828]; [Kandel, Abraham et al. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995), ISBN: 0133418847]; [Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (December 2000), ISBN: 0198507089]; [Witten, Ian H. et al., Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11, 1999), ISBN: 1558605525]; [Denison David G. T. (Editor) et al., Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002), ISBN: 0471490369]; [Ghose, Arup K. et al. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8] 참조). 항체의 특성은 항체 서열, 기능적 및 3차원 구조의 실험적 및 이론적 모델(예를 들어, 예상되는 접촉 잔기 분석 또는 계산된 물리화학적 특성)로부터 도출될 수 있으며, 이들 특성들은 개별적으로 또는 조합되어 고려될 수 있다.
VH 도메인 및 VL 도메인으로 이루어진 항체 항원 결합 부위는 전형적으로는 6개의 폴리펩티드 루프에 의해 형성된다: 이들 중 3개는 경쇄 가변 도메인(VL)으로부터, 및 나머지 다른 3개는 중쇄 가변 도메인(VH)으로부터의 것이다. 공지된 원자 구조의 항체 분석을 통해 항체 결합 부위의 서열과 3차원 구조 간의 관계를 해명해왔다(문헌 [Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817]; [Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948]). 이러한 관계는, VH 도메인 중 제3 영역( 루프)을 제외한, 결합 부위 루프가 소수의 주쇄 입체 구조: 정규 구조 중 하나를 가진다는 것을 암시한다. 특정 루프 안에 형성된 정규 구조는 그의 크기, 및 그 루프와 골격 영역, 둘 모두의 중요 부위에 특정 잔기가 존재하는 것에 의해 결정되는 것으로 나타났다.
서열과 구조의 관계에 대한 상기와 같은 연구는 서열은 알려졌으나 3차원 구조는 알려지지 않은 항체 중, 그의 CDR 루프의 3차원 구조를 유지하는 데 있어서 중요하고, 그 결과로서 그의 결합 특이성이 유지되도록 하는 것인 잔기를 예측하는데 사용될 수 있다. 이러한 예측 결과는 상기 예측 결과를 선례의 최적화 실험으로부터 얻은 결과와 비교함으로써 지지될 수 있다. 구조 접근법에서, 무료로 이용가능한 임의의 패키지, 또는 시판용 패키지, 예컨대, WAM(문헌 [Whitelegg, N.R.u. and Rees, A.R (2000). Prot. Eng., 12, 815-824])을 이용하여 항체 분자의 모델을 생성할 수 있다(문헌 [Chothia, et al. Science, 223, 755-758 (1986)]). 이어서, 단백질 시각화 및 분석 소프트웨어 패키지, 예컨대, 인사이트 II(Insight II, 악셀레리스 인코포레이티드(Accelerys, Inc.)) 또는 딥 뷰(Deep View)(문헌 [Guex, N. and Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723])를 사용하여 CDR 중 각 위치에서의 가능한 치환을 평가할 수 있다. 이어서, 이러한 정보를 이용하여 가능하게는 활성에 최소의 또는 유익한 효과를 미치는 치환을 수행할 수 있다.
CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 결합 구성원의 아미노산 서열 내에서의 치환을 위해 필요한 기법은 일반적으로 당업계에서 이용가능하다. 활성에 최소의 또는 유익한 효과를 미칠 것으로 예측될 수 있거나 예측될 수 없는 치환을 통해 변이체 서열을 제조할 수 있고, IL-18에 결합하고/거나, 그를 중화시킬 수 있는 능력, 및/또는 임의의 다른 바람직한 특성에 대해 테스트할 수 있다.
그의 서열이 본원에 구체적으로 개시되어 있는 것인, VH 및 VL 도메인 중 임의 것의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체는 논의되는 바와 같이, 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 측면은, 그에 대한 VH 도메인 서열이 하기 첨부된 서열 목록에 제시되어 있는 것인, 본원에 열거된 항체 중 임의 것의 VH 도메인과 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 VH 도메인을 포함하고/거나; 그에 대한 VL 도메인 서열이 첨부된 서열 목록에 제시되어 있는 것인, 표 11에 열거된 항체 중 임의 것의 VL 도메인과 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 VL 도메인을 포함하는 결합 구성원, 예컨대, 항체 분자를 제공한다.
본 발명의 측면은, 그에 대한 VH CDR 서열이 본원에 제시되어 있는 것인, 본원에 열거된 항체 중 임의 것의 VH CDR 세트와 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 VH CDR 세트를 가지는 VH 도메인을 포함하고/거나; 그에 대한 VL CDR 서열이 본원에 제시되어 있는 것인, 본원에 열거된 항체 중 임의 것의 VL CDR 세트와 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지는 VL CDR 세트를 가지는 VL 도메인을 포함하는 결합 구성원, 예컨대, 항체 분자를 제공한다.
두 아미노산 서열의 동일성(%)을 계산하는데 사용될 수 있는 알고리즘으로는 예컨대, BLAST(문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410]), FASTA(문헌 [Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448]), 또는 예컨대, 디폴트 파라미터를 사용하는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘(문헌 [Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197])을 포함한다.
특정 가변 도메인은 하나 이상의 아미노산 서열 변경(아미노산 잔기의 치환, 결실, 및/또는 삽입), 및 약 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 미만의 것을 포함할 수 있다.
변경은 하나 이상의 골격 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다. 변경은 보통 기능을 손실시키지는 않으며, 이로써 그와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 구성원은 IL-18에 결합하고/거나 그를 중화시킬 수 있는 능력을 보유할 수 있다. 예컨대, 본원에 기술된 검정법으로 측정된 바와 같이, 변경이 이루어지지 않은 결합 구성원과 동일한 정량적 결합 및/또는 중화 능력을 보유할 수 있다. 그와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 구성원은 IL-18에 결합하고/거나 그를 중화시킬 수 있는 개선된 능력을 가질 수 있다.
변경은 하나 이상의 아미노산 잔기를 비천연적으로 발생된 또는 비표준 아미노산으로 치환하는 것, 하나 이상의 아미노산 잔기를 비천연적으로 발생된 또는 비표준 형태로 변형시키는 것, 또는 하나 이상의 비천연적으로 발생된 또는 비표준 아미노산을 서열 내로 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 서열에서 변경의 개수 및 위치의 예는 본원 다른 곳에 기술되어 있다. 천연적으로 발생된 아미노산은 20가지의 "표준" L 아미노산을 포함하는데, 이는 표준 단문자 코드 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로 표시된다. 비표준 아미노산은 폴리펩티드 골격 내로 혼입될 수 있거나 현존 아미노산 잔기의 변형으로부터 생겨날 수 있는 임의의 다른 아미노산 잔기를 포함한다. 비표준 아미노산은 천연적으로 발생되거나 비천연적으로 발생된 것일 수 있다. 수개의 천연적으로 발생된 비표준 아미노산은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대, 4-하이드록시프롤린, 5-하이드록시리신, 3-메틸히스티딘, N-아세틸세린 등이 있다(문헌 [Voet & Voet, Biochemistry, 2nd Edition, (Wiley) 1995]). N 알파 위치에서 유도체화된 아미노산 잔기는 단지 아미노산 서열의 N 말단에만 위치할 것이다. 보통, 본 발명에서 아미노산은 L 아미노산이지만, D 아미노산일 수도 있다. 따라서, 변경은 L 아미노산을 D 아미노산으로 변형시키거나, 대체하는 것을 포함할 수 있다. 아미노산의 메틸화, 아세틸화 및/또는 포스포릴화된 형태 또한 알려져 있으며, 본 발명의 아미노산을 그와 같이 변형시킬 수 있다.
본 발명의 항체 도메인 및 결합 구성원의 아미노산 서열은 상기 기술한 바와 같은 비천연 또는 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. 비표준 아미노산(예컨대, D 아미노산)은 합성 동안 아미노산 서열 내로 혼입될 수 있거나, 비표준 아미노산이 아미노산 서열 합성 이후에 "원래의" 표준 아미노산의 변형 또는 대체에 의해 도입될 수 있다.
비표준 및/또는 비천연적으로 발생된 아미노산의 사용은 구조 및 기능적 다양성을 증가시키며, 따라서, 본 발명의 결합 구성원에서 원하는 IL-18 결합 및 중화 특성을 달성할 수 있는 잠재능을 증가시킬 수 있다. 추가로, D 아미노산 및 유사체는 표준 L 아미노산과 비교하였을 때, 상이한 약동학적 프로파일을 가지는 것으로 나타났는데, 이는 동물, 예컨대, 인간에게로의 투여 후, L 아미노산을 가지는 폴리펩티드가 생체내에서 분해되기 때문이며, 이는 D 아미노산이 일부 생체내 적용에 있어서 이롭다는 것을 의미한다.
본 발명의 CDR 유래 서열을 보유하는 신규의 VH 또는 VL 영역은 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자에 대해 무작위 돌연변이 유발법을 사용하여 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 일으키는 방법으로 생성될 수 있다. 그러한 기법은 (Gram) 등(문헌 [Gram et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci., USA, 89:3576-3580])에 의해 기술된 바 있는데, 여기서, (Gram) 등은 오류 빈발(error-prone) PCR을 사용하였다. 일부 실시양태에서, 전체 가변 도메인 또는 CDR 세트 내에 1 또는 2개의 아미노산 치환이 이루어진다.
사용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역으로 돌연변이유발을 유도하는 것이다. 그러한 기법은 (Barbas) 등의 문헌 [Barbas et al., 1994, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA , 91:3809-3813]] 및 (Schier) 등의 문헌 [Schier et al., 1996, J. Mol . Biol . 263:551-567]에 개시되어 있다.
상기 기술된 기법들 모두 당업계에 그 자체로 공지되어 있으며, 당업자는 그러한 기법을 이용하여 당업계의 통상적인 방법을 사용함으로써 본 발명의 결합 구성원을 제공할 수 있을 것이다.
본 발명의 추가 측면은 본원에 기재된 VH 도메인의 아미노산 서열 중에 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 또는 삽입에 의해 상기 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하는 단계, 임의적으로 상기와 같이 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계, 및 VH 도메인 또는 VH/VL 조합물 또는 조합물들을 테스트하여 임의적으로는 하나 이상의 원하는 특성, 예컨대, IL-18 활성을 중화시킬 수 있는 능력을 가진, IL-18에 대한 결합 구성원 또는 항체 항원 결합 부위를 확인하는 단계를 포함하는, IL-18에 대한 항체 항원 결합 부위를 수득하는 방법을 제공한다. 상기 VL 도메인은 실질적으로 본원에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체를 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는 유사한 방법이 사용될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 CDR 아미노산 서열이 인간 항체 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분에 CDR로서 혼입될 수 있다. 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 HCDR3 서열은 본 발명의 실시양태를 나타내며, 이들은 각각 인간 중쇄 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분에 HCDR3으로서 혼입될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 가변 도메인은 임의의 배선 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 수득되거나 유래될 수 있거나, 또는 공지된 인간 가변 도메인의 컨센서스 또는 실제 서열에 기초한 합성 가변 도메인일 수 있다. 가변 도메인은 비인간 항체로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명의 CDR 서열(예컨대, CDR3)은 재조합 DNA 기술을 사용하여 CDR(예컨대, CDR3)이 결여된 가변 도메인의 레퍼토리 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, (Marks) 등의 문헌 [Marks et al., Bio / Technology , 1992, 10: 779-783]에는 가변 도메인 영역의 5' 말단에서 또는 그의 인접한 위치에서 유도된 컨센서스 프라이머를 인간 VH 유전자의 제3 골격 영역에 대한 컨센서스 프라이머와 함께 사용하여 CDR3이 결여된 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공하는, 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 문헌 [Marks et al.]에는 추가로 상기 레퍼토리를 특정 항체의 CDR3와 조합할 수 있는 방법이 기술되어 있다. 유사한 기법을 사용하여, 본 발명의 CDR3 유도된 서열은 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 셔플링될 수 있으며, 셔플링된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 동족 VL 또는 VH 도메인과 조합되어 본 발명의 결합 구성원을 제공할 수 있다. 이어서, 레퍼토리를 적합한 숙주 시스템, 예컨대, WO92/01047(상기는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다), 또는 다수의 후속 문헌 중 임의의 것(문헌 [Kay, Winter & McCafferty [Kay, B.K., Winter, J., and McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press] 포함)의 파지 디스플레이 시스템에 디스플레이될 수 있고, 이로써, 적합한 결합 구성원이 선별될 수 있다. 레퍼토리는 104개 이상의 개별 구성원, 예를 들어, 105개 이상, 106개 이상, 107개 이상, 108개 이상, 109개 이상 또는 1010개 이상의 구성원 또는 그보다 많은 개수의 구성원으로부터의 임의의 것으로부터 구성될 수 있다. 다른 적합한 숙주 시스템은 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, T7 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 세포 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 공유 결합 디스플레이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
(a) 치환시키고자 하는 CDR3을 포함하거나, CDR3 코딩 영역이 결여된 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하는 단계;
(b) 상기 레퍼토리를, 실질적으로 본원에 VH CDR3에 대해, 예를 들어, 표 11에 제시된 VH CDR3에 대해 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 공여체 핵산과 조합하는데, 이는 상기 공여체 핵산이 레퍼토리 중의 CDR3 영역 내로 삽입되도록 수행되며, 이를 통해 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하는 것인 단계;
(c) 상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키는 단계;
(d) IL-18에 대한 결합 구성원을 선별하는 단계; 및
(e) 상기 결합 구성원 또는 그를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계를 포함하는, IL-18에 대한 결합 구성원을 제조하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명의 VL CDR3을, 치환시키고자 하는 CDR3을 포함하거나, CDR3 코딩 영역이 결여된 VL 도메인을 코딩하는 핵산의 레퍼토리와 조합하는 유사한 방법이 사용될 수 있다.
유사하게, 3개의 CDR 중 하나 이상, 또는 그들 모두를 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 내로 이식한 후, IL-18에 대한 결합 구성원 또는 결합 구성원들 대해 스크리닝할 수 있다.
예를 들어, 표 11에 열거된 하나 이상의 항체로부터의 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3, 예컨대, HCDR 세트가 사용될 수 있고/거나, 본원에 열거된 하나 이상의 항체로부터의 LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3, 예컨대, LCDR 세트가 사용될 수 있다.
유사하게, 본원에 개시된 다른 VH 및 VL 도메인, CDR 세트 및 HCDR 세트 및/또는 LCDR 세트가 사용될 수 있다.
면역글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분은 3개 이상의 CDR 영역을 그 사이에 개재된 골격 영역과 함께 포함할 수 있다. 그 부분은 또한 제1 및 제4 골격 영역 중 하나 또는 그 둘 모두를 약 50% 이상 포함할 수 있는데, 여기서, 50%는 제1 골격 영역의 C 말단 50% 및 제4 골격 영역의 N 말단 50%이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N 말단 또는 C 말단 단부에 있는 추가의 잔기는 보통 천연적으로 발생된 가변 도메인 영역과는 관련이 없는 것일 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의해 제조된 본 발명의 결합 구성원의 구성을 통해 클로닝 또는 다른 조작 단계를 촉진시키기 위하여 도입되는 링커에 의해 코딩되는 N 또는 C 말단 잔기를 도입시킬 수 있다. 다른 조작 단계는 본원 다른 곳에 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 링커의 도입으로 본 발명의 가변 도메인을, 항체 불변 영역, 다른 가변 도메인(예를 들어, 디아바디의 제조에서) 또는 검출가능한/기능적 표지를 비롯한 추가의 단백질 서열에 결합시키는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서, 비록 결합 구성원이 한 쌍의 VH 및 VL 도메인을 포함하기는 하지만, VH 또는 VL 도메인 서열에 기초한 단일 결합 도메인이 본 발명의 추가의 측면을 형성한다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특이적인 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 상기 dAb에 대한 논의를 참조할 수 있다.
단일 결합 도메인들 중 어느 하나의 경우에, 이들 도메인은 IL-18에 결합할 수 있는 2개의 도메인 결합 구성원을 형성할 수 있는 상보적 도메인을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 이는 WO92/01047(이는 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다)에 개시된 바와 같은, H 또는 L 쇄 클론 중 어느 하나를 함유하는 개별 콜로니를 사용하여 다른 쇄(L 또는 H)를 코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키는 데 사용되어, 생성된 2쇄 결합 구성원을 예컨대, 상기 문헌에 기재되어 있는 바와 같은 파지 디스플레이 기법에 따라 선별하는 것인, 소위 계층적 이중 조합 접근법을 사용하여 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있다. 이와 같은 기법은 또한 문헌 [Marks et al., Bio / Technology, 1992, 10:779-783]에 개시되어 있다.
본 발명의 결합 구성원은 추가로 항체 불변 영역 또는 그의 일부, 예컨대, 인간 항체 불변 영역 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인을 그의 C-말단 단부에서 인간 Cκ 또는 Cλ 쇄를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착시킬 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기초한 결합 구성원을 그의 C 말단 단부에서 임의의 항체 이소형, 예컨대, IgG, IgA, IgE 및 IgM, 및 이소타입 서브부류 중 임의의 것, 특히 IgG2, IgG1 및 IgG4로부터 유도된 면역글로불린 중쇄 전체 또는 그의 일부(예컨대, 예를 들어, CH1 도메인)에 부착시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, IgG2는 그의 효과기 기능이 없기 때문에 이로울 수 있다. 다른 실시양태에서, IgG1은 그의 효과기 기능 및 조작 용이성 및 제조의 용이함에 기인하여 이로울 수 있다. 이들 특성을 가지며, 가변 영역을 안정화시키는 임의의 합성 또는 다른 불변 영역 변이체 또한 본 발명의 실시태양에서 유용할 수 있다.
결합 구성원은 검출가능한 표지 또는 기능적 표지로 표지화될 수 있다. 따라서, 결합 구성원 또는 항체 분자는 검출가능한 신호 및/또는 정량가능한 신호를 얻기 위한 면역컨쥬게이트 형태로 존재할 수 있다. 면역컨쥬게이트는 검출가능한 표지 또는 기능적 표지와 컨쥬게이트된 본 발명의 항체 분자를 포함할 수 있다. 표지는 신호를 발생시키거나, 발생시키도록 유도될 수 있는 임의의 분자일 수 있으며, 형광성 표지, 방사성 표지, 효소, 화학발광성 표지 또는 광감작제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 결합은 형광 또는 발광, 방사성, 효소 활성 또는 광 흡수를 검출함으로써 검출 및/또는 측정될 수 있다.
적합한 표지로는 일례로서 제한없이,
- 효소, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제("G6PDH: glucose-6-phosphate dehydrogenase"), 알파-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코스 아밀라제, 카본산 안하이드라제, 아세틸콜린스테라제, 리소자임, 말레이트 데하이드로게나제 및 퍼옥시다제 예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제;
- 염료;
- 형광성 표지 또는 형광 물질, 예컨대, 플루오레세인 및 그의 유도체, 형광 색소, 로다민 화합물 및 유도체, GFP(GFP: "녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein)"을 나타냄), 단실, 움벨리페론, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 및 플루오레스카민; 플루오로포어, 예컨대, 란탄계열 크립테이트 및 킬레이트, 예컨대, 유로퓸 등(퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 및 시스 바이오인터내셔널(Cis Bio International));
- 화학발광성 표지 또는 화학발광 물질, 예컨대, 이소루미놀, 루미놀 및 디옥세탄;
- 생체발광성 표지, 예컨대, 루시퍼라제 및 루시페린;
- 감작제;
- 조효소;
- 효소 기질;
- 브롬77, 탄소14, 코발트57, 불소8, 갈륨67, 갈륨68, 수소3(삼중수소), 인듐111, 인듐1 13 m, 인듐123 m, 요오드125, 요오드126, 요오드131, 요오드133, 수은107, 수은203, 인32, 레늄99 m, 레늄101, 레늄105, 루테늄95, 루테늄97, 루테늄103, 루테늄105, 스칸듐47, 셀레늄75, 황35, 테크네튬99, 테크네튬99 m, 텔루륨121m, 텔루륨122 m, 텔루륨125 m, 툴륨165, 툴륨167, 툴륨168, 이트륨199 및 본원에서 언급된 다른 방사성 표지를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 방사성 표지;
- 입자, 예컨대, 라텍스 또는 탄소 입자; 금속 졸; 결정체; 리포솜; 세포 등 (이들은 추가로 염료, 촉매 또는 다른 검출가능한 기로 표지화될 수 있다);
- 분자, 예컨대, 비오틴, 디곡시게닌 또는 5-브로모데옥시우리딘;
- 독소 모이어티, 예컨대, 슈도모나스 외독소(PE(Pseudomonas exotoxin) 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체), 디프테리아(Diptheria) 독소 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체, 보툴리눔(botulinum) 독소 A, B, C, D, E 또는 F, 리신 또는 그의 세포독성 단편, 예컨대, 리신 A, 아브린 또는 그의 세포독성 단편, 사포린 또는 그의 세포독성 단편, 포키위드(pokeweed) 항바이러스 독소 또는 그의 세포독성 단편 및 브리오딘 1 또는 그의 세포독성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 독소 모이어티를 포함한다.
적합한 효소 및 조효소들이 US4275149, 및 US4318980에 개시되어 있다. 적합한 형광 물질 및 화학발광 물질 또한 US4275149에 개시되어 있다. 표지는 추가로 특이적 동족 검출가능한 모이어티, 예컨대, 표지화된 아비딘 또는 스트렙트아비딘에의 결합에 의해 검출될 수 있는, 비오틴과 같은 화학 모이어티를 포함한다. 검출가능한 표지는 당업계에 공지되어 있는 통상의 화학법으로 본 발명의 항체에 부착될 수 있다.
면역컨쥬게이트 또는 그의 기능적 단편은 당업자에게 공지되어 있는 방법으로 제조될 수 있다. 이는 효소 또는 형광성 표지에 직접, 또는 스페이서기 또는 연결기, 예컨대, 글루타르알데히드와 같은 폴리알데히드, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DPTA)의 매개체를 통해서, 또는 커플링제, 예컨대, 치료학적 컨쥬게이트에 대해 상기 언급된 것의 존재하에서 커플링될 수 있다. 플루오레세인 유형의 표지를 함유하는 컨쥬게이트는 이소티오시아네이트와 반응시켜 제조할 수 있다.
치료학적 방사성 동위원소를 항체에 직접 또는 예컨대, 상기 언급된 EDTA, DTPA와 같은 킬레이팅제를 통하여 커플링시키는 방법으로서, 당업자에게 공지된 방법은 진단에 사용될 수 있는 방사성 원소에도 사용될 수 있다. 또한, 클로라민 T 방법(문헌 [Hunter W. M. and Greenwood F. C. (1962) Nature 194:495])을 사용하여 나트륨125로 표지화하거나, US4424200의 기법을 사용하여 테크네튬99 m으로 표지화하거나, US4479930에 기술되어 있는 바와 같이, DTPA를 통해 부착시키는 것이 가능하다.
표지가 외부적 수단, 예를 들어, 시각 검사, 전자기 방사, 열 및 화학 시약에 의해 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있도록 하는 방법은 다수 존재한다. 표지는 또한 본 발명의 항체에 결합하거나 또는 지지체에 결합하는 또 다른 결합 구성원에 결합될 수 있다.
표지는 직접 신호를 발생시킬 수 있으며, 따라서, 신호를 발생시키는 데 추가의 성분이 필요하지 않다. 많은 유기 분자, 예를 들어, 형광 물질은 자외광 및 가시광을 흡수할 수 있는데, 여기서, 광 흡수가 이들 분자에 에너지를 전달하고, 분자를 여기된 에너지 상태로 상승시킨다. 이어서, 이와 같이 흡수된 에너지는 제 2의 파장에서 광을 방출하여 소산된다. 이 제2의 파장 방출이 또한 에너지를 표지화된 수용체 분자에 전달하고, 그 결과 전달된 에너지가 수령체 분자로부터 광 방출을 통해, 예를 들어, 형광 공명 에너지 전달(FRET: fluorescence resonance energy transfer)에 의해 소산된다. 신호를 직접 발생시키는 다른 표지로는 방사성 동위원소 및 염료를 포함한다.
별법으로, 표지는 신호를 발생시키는 다른 성분을 필요로 할 수 있으며, 그와 같은 신호 발생 시스템은 측정가능한 신호를 발생시키는 데 필요한 모든 성분을 포함할 것이며, 그러한 것으로는 기질, 조효소, 증진제, 추가의 효소, 효소 생성물과 반응하는 물질, 촉매, 활성화제, 보조인자, 억제제, 스캐빈저, 금속 이온 및 신호 생성 물질의 결합에 필요한 특이적 결합 물질을 포함할 수 있다. 적합한 신호 발생 시스템에 관한 상세한 논의는 US5185243에서 살펴볼 수 있다.
본 발명의 한 측면은 본원에서 제공된 바와 같은 결합 구성원이 IL-18에 결합하도록 하거나, 또는 결합할 수 있게 하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 언급한 바와 같이, 그러한 결합은 생체내에서, 예컨대, 결합 구성원, 또는 결합 구성원을 코딩하는 핵산의 투여 이후에 발생할 수 있거나, 또는 시험관내에서, 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역세포화학법, 면역침전법, 친화도 크로마토그래피, 및 생화학적 또는 세포 기반 검정법, 예컨대, KG-1 또는 PBMC 세포 검정법으로 발생할 수 있다.
본 발명은 또한 예를 들어, 바이오센서 시스템에서 본 발명에 따른 결합 구성원을 사용함으로써 항원의 수준을 직접 측정하는 것을 제공한다. 예를 들어, IL-18에의 결합을 검출 및/또는 측정하는 방법은 (i) 상기 결합 구성원을 IL-18에 노출시키는 단계, 및 (ii) 상기 결합 구성원의 IL-18에의 결합을 측정하는 단계로서, 여기서, 결합은 본원에 기술된 바와 같은 임의의 방법 또는 검출가능한 표지를 사용하여 검출되는 것인 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법 및 본원에 기술된 임의의 다른 결합 검출 방법은 그 방법을 수행하는 당사자에 의해서, 예를 들어, 검출가능한 표지를 시각적으로 관찰함으로써 직접 해석될 수 있다. 별법으로, 상기 방법 또는 본원에 기술된 임의의 다른 결합 검출 방법은 자동방사선사진, 사진, 컴퓨터 인쇄물, 유세포 분석 리포트, 그래프, 차트, 결과물을 함유하는 시험관, 또는 용기 또는 웰, 또는 방법 결과의 임의의 다른 시각적 또는 물리적 표시물의 형태로 리포트를 작성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 결합 구성원이 결합하는 IL-18은 유리 IL-18(즉, IL-18BP에 결합되지 않은 IL-18)일 수 있다. 유리 IL-18은 IL-18의 생물학적으로 활성인 형태이다.
결합 구성원의 IL-18에의 결합량이 측정될 수 있다. 정량화는 테스트 시료 중의 항원의 양과 관련될 수 있으며, 이는 진단학상 관심의 대상이 될 수 있다. IL-18 결합에 대한 스크리닝 및 그의 정량화는, 예를 들어, 환자를 본원에서 언급된 질환 또는 장애, 및/또는 비정상적인 IL-18 발현 및/또는 활성을 포함하는 임의의 다른 질환 또는 장애에 대해 스크리닝하는 데 유용할 수 있다.
진단 방법은 (i) 피험체으로부터 조직 또는 체액 시료를 수득하는 단계; (ii) 상기 조직 또는 체액 시료를 하나 이상의 본 발명의 결합 구성원에 노출시키는 단계; 및 (iii) 대조군 샘플과 비교하여, 결합된 IL-18을 검출하는 단계로서, 여기서, 대조군 샘플과 비교하여 IL-18의 결합량이 증가하였다면, 이는 IL-18 발현 또는 활성이 비정상적 수준이라는 것을 나타내는 것일 수 있는 단계를 포함한다. 테스트하고자 하는 조직 또는 체액 시료로는 혈액, 혈청, 뇨, 생검 물질, 종양, 또는 비정상적 수준의 IL-18을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 조직을 포함한다. 비정상적 IL-18 수준 또는 활성의 테스트 결과 양성인 피험체는 또한 본원에 후술하는 바와 같은 치료 방법으로부터 이익을 얻을 수 있다.
당업자는 본원에 개시된 방법을 토대로 그들의 선호도와 일반적 지식에 따라 결합 구성원의 항원에의 결합을 측정하는 적합한 모드를 선택할 수 있다.
시료 중 결합 구성원의 반응성은 임의의 적절한 수단으로 측정될 수 있다. 방사성면역검정법(RIA: radioimmunoassay)이 가능한 한 방법이다. 방사성 표지화된 항원을 비표지화된 항원(테스트 시료)과 혼합하고, 결합 구성원에 결합하도록 둔다. 결합된 항원을 물리적으로 비결합된 항원과 분리시키고, 결합 구성원에 결합된 방사성 항원의 양을 측정한다. 테스트 시료 중에 항원이 많을수록, 더 적은 방사성 항원이 결합 구성원에 결합하게 될 것이다. 경쟁 결합 검정법 또한 리포터 분자에 연결된 항원 또는 유사체를 사용하여 비방사성 항원으로도 사용될 수 있다. 리포터 분자는 형광 색소, 인 또는 스펙트럼 분리된 흡수 또는 방출 특징을 가지는 레이저 염료일 수 있다. 적합한 형광 색소로는 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, 및 텍사스 레드, 및 란탄계열 킬레이트 또는 크립테이트를 포함한다. 적합한 발색성 염료는 디아미노벤지딘을 포함한다.
다른 리포터로는 거대분자 콜로이드성 입자 또는 미립자 물질, 예컨대, 착색된, 자성 또는 상자성 라텍스 비드, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호가 시각적으로 관찰되거나 전자적으로 검출되거나 또는 다른 식으로 기록될 수 있게 하는 생물학적 또는 화학적 활성제를 포함한다. 이들 분자는 예를 들어, 발색 또는 변색시키거나, 전기적 특성에 변화를 일으키는 반응을 촉매화하는 효소일 수 있다. 그들은 에너지 상태 간의 전자 전이를 통해서 특징적인 스펙트럼 흡수 및 방출이 나타날 수 있도록 분자적으로 여기될 수 있다. 이는 바이오센서와 함께 사용되는 화학적 엔티티를 포함할 수 있다. 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙트아비딘 및 알칼리성 포스파타제 검출 시스템이 사용될 수 있다.
개개의 결합 구성원-리포터 컨쥬게이트에 의해 발생되는 신호는 시료(일반 시료 및 테스트 시료) 중 관련 결합 구성원의 결합에 대한 정량가능한 절대적 또는 상대적 데이타를 유도하는데 사용할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 인터루킨-18(IL-18)에 대한 단리된 결합 구성원은 IL-18에의 결합에 대해 IL-18BP와 경쟁할 수 있고, 따라서, 이는 IL-18BP에 결합된 IL-18와, 유리 IL-18(즉, IL-18BP에 결합하지 않은 IL-18) 사이를 구별하는 데 유용할 수 있다.
단리된 본 발명의 결합 구성원은 유리 IL-18의 검출 및/또는 측정에 유리할 수 있다. 유리 IL-18을 검출 및/또는 측정하는 방법은 (i) 본 발명에 따른 결합 구성원을 유리 IL-18에 노출시키는 단계, 및 (ii) 상기 결합 구성원의 유리 IL-18에의 결합을 검출 및/또는 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 결합 구성원의 유리 IL-18에의 결합은 임의의 종래 방법, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 검출 및/또는 측정될 수 있다.
본 발명의 방법은 시료 중 유리 IL-18의 양을 측정하는 데 유용할 수 있다.
시료 중 유리 IL-18을 측정하는 방법은
시료를 본 발명의 결합 구성원과 접촉시키는 단계, 및 결합 구성원의 시료에의 결합을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
결합 구성원의 시료에의 결합은 시료 중에 유리 IL-18이 존재한다는 것을 나타내는 것이다. 결합 구성원의 시료에의 결합량이 시료 중 유리 IL-18의 양을 나타낼 수 있다.
검정법은 IL-18에 결합하는 제1 결합 구성원, 및 이 역시 IL-18에 결합하지만, IL-18 상의 제1 결합 구성원과는 다른 에피토프에 결합하는 것인 제2 결합 구성원을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 제1 또는 제2 결합 구성원 중 하나는 본 발명의 결합 구성원이고, 제1 또는 제2 결합 구성원 중 다른 하나는 공지된 IL-18 결합 구성원, 예컨대, 항IL-18 항체일 수 있다. 적합한 공지된 IL-18 결합 구성원은 당업계에서 이용가능하다.
일부 편리한 검정 포맷에서, 상기 제1 또는 상기 제2 결합 구성원 중 하나는 고체 기판상에 고정화되어 있고, 나머지 다른 하나는 고정화되어 있지 않을 수 있다.
결합 구성원은 당업계에 공지되어 있는 다수의 상이한 방식으로 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 예를 들어, 결합 구성원은 예컨대, 플라스틱 고체 지지체일 경우에는 예컨대, 정전기적 및/또는 소수성 상호작용을 통해 고체 지지체에 직접적으로 흡착될 수 있다. 별법으로, 결합 구성원은 고체 지지체에 공유적으로 부착될 수 있다. 이러한 경우, 고체 지지체는 예컨대, 하이드록실기 또는 아민기와 같은 지지체 표면 상의 화학적 작용기를 도입하거나 활성화시킬 수 있도록 화학적으로 변형될 수 있고, 지지체는 제1 구성원의 고체 지지체에의 공유 결합이 용이하게 일어날 수 있도록 하기 위해, 예컨대, 글루타르알데히드와 같은 가교 결합제를 사용하여 가교 결합될 수 있다. 추가의 별법으로, 결합 구성원은 특이적 결합 상호작용에 의해, 예를 들어, 비오틴과 아비딘 사이의 상호작용에 의해, 또는 단백질 A 또는 단백질 G를 고체 지지체에 고정화시킨 후, 결합 구성원 그 자체에의 특이적 결합을 일으킴으로써 고체 지지체에 간접적으로 부착될 수 있다.
비경쟁적 및 경쟁적 검정법, 및 면역검정법을 비롯한, 유리 IL-18을 검출하는 데 적합한 다수의 상이한 검정 포맷이 당업계에 공지되어 있다.
비경쟁적 검정 포맷은 예를 들어, IL-18에 결합하는 제1 결합 구성원을 고체 지지체에 고정화시키는 것을 포함할 수 있다. 이어서, 고정화된 결합 구성원을 관심의 대상이 되는 시료와 접촉시킬 수 있다. 시료가 IL-18을 함유할 경우, 이는 고정화된 결합 구성원과 결합하게 될 것이다. 이어서, IL-18에 결합하는 제2 결합 구성원을 첨가하고, 결합할 수 있도록 한다. 일부 실시양태에서, 고정화된 제1 결합 구성원이 본 발명의 결합 구성원일 수 있다. 다른 실시양태에서, 제2 결합 구성원이 본 발명의 결합 구성원일 수 있다.
검출될 수 있도록 하기 위해, 제2 결합 구성원을 검출가능한 표지로 표지화할 수 있다. 별법으로, 제2 결합 구성원의 결합은 제3 결합 구성원, 예컨대, 제2 결합 구성원에 특이적으로 결합하고, 검출가능한 표지로 표지화된 항체를 사용하여 측정될 수 있다. 시료 중의 유리 IL-18 분자는 고정화된 제1 결합 구성원에 의해 포획되어 지지체에 고정화된다. 제2 결합 구성원은 포획된 유리 IL-18에 결합하고, 그 자체도 지지체에 고정화된다. 일부 실시양태에서, 표지화된 제3 결합 구성원은 제2 결합 구성원에 결합하고, 또한 지지체에 고정화될 수 있다.
제3 결합 구성원은 예를 들어, 제2 결합 구성원(예컨대, 항IgG 항체)에 직접적으로 결합할 수 있거나, 또는 제2 결합 구성원에 연결 또는 융합되어 있는 친화성 태그에 결합할 수 있다.
적합한 친화성 태그로는 비오틴 또는 펩티딜 서열, 예컨대, MRGS(H)6, DYKDDDDK(FLAG™), T7-, S-(KETAAAKFERQHMDS), 폴리Arg(R5-6), 폴리His(H2-10), 폴리Cys(C4) 폴리Phe(F11) 폴리Asp(D5-16), 스트랩트(Strept)-태그 II(WSHPQFEK), c-myc(EQKLISEEDL), 인플루엔자 HA 태그(문헌 [Murray, P. J. et al., (1995) Anal Biochem 229, 170-9]), Glu-Glu-Phe 태그(문헌 [Stammers, D. K. et al., (1991) FEBS Lett 283, 298-302]), 태그.100(퀴아젠(Qiagen); 포유동물 MAP 키나제 2로부터 유래된 12개의 aa로 된 태그), 크루즈(Cruz) 태그 09™(MKAEFRRQESDR, 산타 크루즈 바이오테크놀러지 인코퍼레이티드(Santa Cruz Biotechnology Inc.)) 및 크루즈 태그 22™(MRDALDRLDRLA, 산타 크루즈 바이오테크놀러지 인코퍼레이티드)를 포함한다.
이어서, 고체 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 표지화된 제2 또는 제3 결합 구성원의 양을 측정하는데, 이에 의해, 검출된 표지화된 결합 구성원의 양은 시료 중에 존재하는 유리 IL-18의 양과 정비례한다.
예를 들어, 시료 중 유리 IL-18을 측정하는 방법은
시료를, IL-18에 결합하는 제1 결합 구성원과 접촉시키는 단계; 및
IL-18에 결합하는 제2 결합 구성원을 사용하여 상기 제1 결합 구성원의 시료 중의 IL-18에의 결합을 측정하는 단계를 포함할 수 있고,
여기서, 상기 제1 또는 제2 결합 구성원 중 하나는 본 발명의 결합 구성원이고, 상기 제1 또는 제2 결합 구성원 중 나머지 다른 하나는 IL-18에의 결합에 대해 본 발명의 결합 구성원과 경쟁하지 않는 항IL-18 결합 구성원이다.
상기 기술된 바와 같이, 제1 결합 구성원은 본 발명의 결합 구성원일 수 있고, 제2 결합 구성원은 IL-18에의 결합에 대해 본 발명의 결합 구성원과 경쟁하지 않는 항IL-18 결합 구성원일 수 있거나; 또는 제2 결합 구성원은 본 발명의 결합 구성원일 수 있고, 제1 결합 구성원은 IL-18에의 결합에 대해 본 발명의 결합 구성원과 경쟁하지 않는 항IL-18 결합 구성원일 수 있다.
관심의 대상이 되는 시료 중 유리 IL-18의 존재를 측정하기 위한 경쟁적 검정법은 본 발명의 결합 구성원을 고체 지지체에 고정화시키는 단계를 포함할 수 있다. 이어서, 표지화된 IL-18을 첨가하고, 이것이 고정화된 본 발명의 결합 구성원에 결합할 수 있도록 한 후, 시료를 첨가한다. 시료가 유리 IL-18을 함유할 경우, 이는 고정화된 본 발명의 결합 구성원에의 결합에 대하여 표지화된 IL-18과 경쟁하게 될 것이다. 이어서, 고체 지지체에 결합된 표지화된 IL-18의 양을 측정한다. 이러한 경우, 검출되는 표지화된 IL-18의 양은 시료 중에 존재하는 유리 IL-18의 양과 반비례한다.
적합한 시료로는 생물학적 유체 시료, 예컨대, 뇌척수액(CSF: cerebrospinal fluid), 담즙, 뇨, 피지, 객담 또는 혈청을 포함한다. 시료는 표준 기법을 사용하여 개체, 예를 들어, 영장류, 예컨대, 인간 또는 원숭이로부터 수득될 수 있다.
본원에서 지칭되는 검출가능한 표지란 신호를 발생시키거나, 발생시키도록 유도될 수 있는 임의의 표지일 수 있으며, 이는 형광 물질, 화학발광 물질(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제), 착색된 표지(예컨대, 라텍스[블루] 또는 콜로이드성 골드[레드]), 방사성 표지, 효소, 및 자기 표지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 표면, 예컨대, 모세관 보어의 표면에 결합된 표지의 양은 형광 또는 발광, 색상, 방사성, 효소 활성, 또는 자기장 변화를 검출함으로써 검출 및/또는 측정될 수 있다. 검출가능한 표지는 종래 화학법을 사용하여 결합 구성원에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 검출가능한 표지는 예컨대, 디지털 카메라 또는 평판 스캐너를 사용하여 광학적 호출에 의해 검출가능한 표지이다. 광학적 호출에 의해 검출될 수 있는 표지로는 형광 물질, 화학발광 물질 및 착색된 표지를 포함한다. 광학적 검출을 위한 신호 발생 기전으로는 (이에 반드시 한정되는 것은 아니지만) 광 흡수, 광 산란, 광 회절, 광 반사, 형광 또는 발광을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이 유리 IL-18을 측정함으로써 생물학적으로 활성인 IL-18의 수준을 시료 중에서 정확하게 측정할 수 있다.
유리 IL-18 측정은 염증 질환, 자가면역 질환, 예컨대, 속발성 혈구탐식 증후군, 대식세포 활성화 증후군, 류마티스 관절염, 및 I형 당뇨병, 및 심혈관 질환, 예를 들어, 관상 동맥 질환, 예컨대, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD) 및 급성 관상 동맥 증후군을 비롯한 질환 병증을 진단 및/또는 예후하는 데 유용할 수 있다.
유리 IL-18 측정은 또한 치료에 대한 질환 병증의 반응성을 평가하는 데 유용할 수 있다.
개체에서 치료에 대한 질환 병증의 반응성을 평가하는 방법은
상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 결합 구성원을 사용하는 상기 치료 전후로 개체로부터 수득된 시료 중 유리 IL-18의 양을 측정하는 단계를 포함할 수 있으며,
여기서, 유리 IL-18 수준 감소가 개체가 상기 치료에 대해 반응성임을 나타내는 것이다.
유리 IL-18의 수준 또는 양은 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 결합 구성원을 사용하여 상기와 같이 투여하기 이전에 개체로부터 수득된 제1 시료 중에서, 및 상기 투여 이후 개체로부터 수득된 제2 시료 중에서 측정될 수 있고, 제1 및 제2 시료 중의 유리 IL-18의 수준 또는 양 간의 차이, 예를 들어, 감소가 질환 병증이 상기 치료에 대해 반응성임을 나타내는 것이다.
개체에서 질환 병증의 치료를 모니터링하는 방법은
(a) 개체가 치료 요법을 받도록 하는 단계; 및
(b) 상기 치료 동안 상기 기술된 방법을 사용하여 개체로부터 수득된 시료 중 유리 IL-18의 수준 또는 양을 모니터링하는 단계를 포함할 수 있고,
여기서, 치료 동안 수득된 시료 중 유리 IL-18의 수준 또는 양의 감소는 요법이 개체에서 질환 병증을 치료하는 데 유효하다는 것을 나타내는 것이다.
치료 동안 환자로부터 수득된 시료 중 유리 IL-18의 수준 또는 양에 있어서 지속적인 변화가 없을 경우, 본 방법은 추가로
(c) 치료 요법을 변경하고, 개체가 변경된 요법을 받도록 하는 단계;
(d) 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 개체로부터 수득된 시료 중 유리 IL-18의 수준을 모니터링하는 단계; 및
(e) 유리 IL-18의 수준에 있어서 지속적인 변화가 관찰될 때까지 단계 c) 및 d)를 반복하는 단계를 포함할 수 있고,
여기서, 치료 동안 유리 IL-18의 수준 또는 양이 지속적으로 변화, 예를 들어, 감소하였다는 것은 변경된 요법이 개체에서 질환 병증을 치료하는 데 유효하다는 것을 나타내는 것이다.
치료 동안 유리 IL-18의 수준 또는 양이 지속적으로 변한 경우, 본 방법은 추가로
(c) 치료 요법을 변경하고, 개체가 변경된 요법을 받도록 하는 단계;
(d) 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 개체로부터 수득된 시료 중 유리 IL-18의 수준을 모니터링하는 단계; 및
(e) 유리 IL-18의 수준에 있어서 최대 변화가 관찰될 때까지 단계 c) 및 d)를 반복하는 단계를 포함할 수 있고,
여기서, 치료 동안 유리 IL-18의 수준 또는 양이 지속적으로 최대 변화하였다면, 이는 변경된 요법이 개체에서 질환 병증을 치료하는 데 유효하다는 것을 나타내는 것이다.
유리 IL-18 측정은 또한 임상 시험을 위해 환자 코호트를 확인하는 데 유용할 수 있다.
환자 코호트를 확인하는 방법은
(a) 질환 병증을 앓는 환자 집단을 확인하는 단계;
(b) 상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 결합 구성원을 사용하여 집단 중 환자로부터 수득된 시료 중 유리 IL-18의 양을 측정하는 단계;
(c) 역치 초과 또는 미만인 양으로 유리 IL-18을 함유하는 시료를 확인하는 단계; 및
(d) 확인된 시료로부터 환자 코호트를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
확인된 환자 코호트는 고수준 또는 저수준의 유리 IL-18(즉, 역치 초과 또는 미만인 수준) 모두를 가질 수 있다.
질환 병증으로는 염증 및 자가면역 질환, 예컨대, 속발성 혈구탐식 증후군, 대식세포 활성화 증후군, 류마티스 관절염, 및 I형 당뇨병, 및 관상 동맥 질환, 예컨대, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD) 및 급성 관상 동맥 증후군을 포함할 수 있다.
상기 기술된 바와 같이 환자에서 모니터링 및/또는 평가될 수 있는 적합한 치료법은 당업계에 주지되어 있다.
본 발명의 한 측면으로서 본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원을 포함하는 키트 또한 제공한다. 키트에서, 결합 구성원은 예컨대, 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 시료 중 그의 반응성이 측정될 수 있도록 표지화될 수 있다. 추가로, 결합 구성원은 고체 지지체에 부착되어 있거나, 부착되어 있지 않을 수 있다. 키트의 성분은 일반적으로 멸균처리되어 밀봉 바이알 또는 다른 용기에 보관된다. 키트는 진단 분석 또는 결합 구성원이 유용할 수 있는 다른 방법에 사용될 수 있다. 키트는 상기 기술된 방법에서의 사용을 위한 것일 수 있다. 키트는 방법, 예컨대, 본 발명에 따른 방법에서 성분의 사용에 관한 설명서를 포함할 수 있다. 상기와 같은 방법의 수행을 보조하거나, 또는 수행될 수 있도록 하는 보조 물질을 본 발명의 키트 내에 포함시킬 수 있다. 보조 물질로는 제1 결합 구성원에 결합하며, 검출가능한 표지(예컨대, 형광성 표지, 방사성 동위원소 또는 효소)에 컨쥬게이트되어 있는 제2의 상이한 결합 구성원을 포함한다. 항체 기반 키트는 또한 면역침전법 수행을 위한 비드를 포함할 수 있다. 키트의 각 성분은 일반적으로 그 자신의 적합한 용기 내에 들어 있다. 따라서, 이들 키트는 일반적으로 각 결합 구성원에 적합한 분리된 용기들을 포함한다. 추가로, 키트는 검정법, 및 상기 검정법 수행으로부터 도출된 데이터를 해석하고 분석하는 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 경쟁 검정법에서 항원 수준을 측정하기 위한 상기한 바와 같은 결합 구성원의 용도, 즉, 경쟁 검정법에서 본 발명에 의해 제공되는 결합 구성원을 사용하여 시료 중 항원의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 이는 비결합된 항원으로부터 결합된 항원의 물리적 분리가 필요하지 않은 경우일 수 있다. 리포터 분자를 결합 구성원에 연결시켜 결합시 물리적 또는 광학적 변화가 일어나도록 하는 것이 가능한 한 방법이다. 리포터 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있고, 이 신호는 정량화될 수 있다. 리포터 분자의 연결은 직접적 또는 간접적으로, 공유적으로, 예컨대, 펩티드 결합을 통해, 또는 비공유적으로 이루어질 수 있다. 펩티드 결합을 통한 연결은 항체와 리포터 분자를 코딩하는 융합 유전자의 재조합 발현의 결과일 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명은 IL-18에 대한 결합에 대하여 본원에서 정의된 임의의 결합 구성원, 예컨대, 표 11에 열거된 항체 중 임의의 것, 예컨대, IgG2, IgG1 또는 IgG1 3중 돌연변이(TM: triple mutation; 문헌 [Oganesyan et al., (2008) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 6 (Pt 6):700-4]) 포맷으로서의 것과 경쟁하는 결합 구성원으로 확장된다. 결합 구성원들 사이의 경쟁은 예를 들어, 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프에 결합하는 결합 구성원을 확인할 수 있도록 하기 위하여 다른 태깅되지 않은 결합 구성원(들)의 존재하에 검출될 수 있는 하나의 결합 구성원에 특이적인 리포터 분자를 태깅함으로써 시험관내에서 쉽게 검정될 수 있다. 경쟁은 예를 들어, IL-18을 플레이트에 고정화시키고, 제1의 태깅된 또는 표지화된 결합 구성원을 하나 이상의 다른 태깅되지 않은 또는 비표지화된 결합 구성원과 함께 플레이트에 첨가하는 것인, ELISA를 사용하여 측정할 수 있다. 태깅된 결합 구성원과 경쟁하는 태깅되지 않은 결합 구성원의 존재는 태깅된 결합 구성원에 의해 방출되는 신호의 감소로 관찰된다.
예를 들어, 본 발명은 (i) IL-18을 지지체에 고정화시키는 단계, (ii) 상기 고정화된 IL-18을 1 이상의 태깅된 또는 표지화된 결합 구성원 및 하나 이상의 태깅되지 않은 또는 비표지화된 테스트 결합 화합물과 함께 동시에 또는 단계적으로 접촉시키는 단계, 및 (iii) 태깅된 결합 구성원으로부터의 결합된 태그의 양의 감소를 관찰하여 새로운 IL-18 결합 화합물을 확인하는 단계를 포함하는, IL-18 결합 화합물을 확인하는 방법을 포함한다. 상기와 같은 방법은 다중 웰 또는 어레이 포맷을 사용하여 고처리량 방식으로 수행될 수 있다. 그러한 감정법은 또한 용액 중에서 수행될 수 있다(예를 들어, 미국 5,814,468 참조). 상기 기술된 바와 같이, 결합 검출은 본 방법을 수행하는 사람이, 예를 들어, 검출가능한 표지 또는 그의 존재의 감소를 시각적으로 관찰함으로써 직접 해석될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 결합 방법은 자동방사선사진, 사진, 컴퓨터 인쇄물, 유세포 분석 리포트, 그래프, 차트, 결과물을 함유하는 시험관, 또는 용기 또는 웰, 또는 방법 결과의 임의의 다른 시각적 또는 물리적 표시물의 형태로 리포트를 작성할 수 있다.
경쟁 검정법 또한 에피토프 지도화에 사용될 수 있다. 일례로, 에피토프 지도화는 임의적으로는 최적화된 중화 및/또는 조절 특징을 가질 수 있는 IL-18 결합 구성원에 의해 결합되는 에피토프를 확인하는 데 사용될 수 있다. 그러한 에피토프는 선형이거나 입체 구조를 가질 수 있다. 입체 구조적 에피토프는 IL-18의 2개 이상의 상이한 단편을 포함할 수 있으며, 상기 단편은 IL-18이 그의 3차 또는 4차 구조로 있을 때 서로에게 근접하게 위치하여 예컨대, IL-18 결합 구성원과 같은 IL-18의 억제제에 의해 인식되는 입체 구조적 에피토프를 형성할 수 있다. 경쟁에 관한 테스트를 할 때, 항원의 펩티드 단편이 사용될 수 있으며, 특히 관심의 대상이 되는 에피토프를 포함하거나 본질적으로 그로 구성된 펩티드가 사용될 수 있다. 에피토프 서열과 함께 어느 쪽 말단에서든 하나 이상의 아미노산을 가지는 펩티드가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 결합 구성원은 그들의 항원에 대한 결합이 주어진 서열을 가지거나 포함하는 펩티드에 의해 억제되도록 하도록 하는 것일 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 하나에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예컨대, scFv 또는 IgG(예컨대, IgG2, IgG1 또는 IgG1)를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 상기와 같은 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구성물을 제공한다.
본 발명 또한 상기와 같은 하나 이상의 구성물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 그의 코딩 핵산 서열로부터의 발현을 포함할 수 있는, 코딩된 생성물을 제조하는 방법과 함께, 제공되는 바와 같은 임의의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예컨대, scFv 또는 IgG(예컨대, IgG2, IgG1 또는 IgG1TM)을 코딩하는 핵산 서열이 본 발명의 하나의 측면을 형성한다. 발현은 적절한 조건하에 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 알맞게 수행될 수 있다. 발현에 의한 제조 후에, 임의의 적합한 기법을 사용하여 VH 또는 VL 도메인, 또는 결합 구성원을 단리 및/또는 정제할 수 있고, 이어서, 적절하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 서열은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 전체적으로 또는 부분적으로 합성일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 관해 언급하는 것은 명시된 서열을 가지는 DNA 분자를 포함하며, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, T가 U로 치환된 명시된 서열을 가지는 RNA 분자를 포함한다.
또 다른 측면은 코딩 핵산 서열로부터의 발현 단계를 포함하는, 항체 VH 가변 도메인을 제조하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 숙주 세포를 상기 항체 VH 가변 도메인을 제조하기 위한 조건하에서 발현시키는 단계를 포함할 수 있다.
VL 가변 도메인 및 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 결합 구성원을 제조하는 유사한 방법이 본 발명의 추가의 측면으로 제공된다.
제조 방법은 생성물을 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 제조 방법은 생성물을 1 이상의 추가의 성분, 예컨대, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 포함할 수 있다.
폴리펩티드를 각종의 상이한 숙주 세포에서 클로닝 및 발현하기 위한 시스템은 주지되어 있다. 적합한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 식물 세포, 사상성 진균, 효모 및 바쿨로바이러스 시스템 및 트랜스제닉 식물 및 동물을 포함한다. 원핵 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에 잘 확립되어 있다. 리뷰를 위해, 예를 들어, (Plueckthun)의 문헌 [Plueckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)])을 참조할 수 있다. 통상의 박테리아 숙주는 E. 콜라이이다.
배양물에서의 진핵 세포에서의 발현은 또한 결합 구성원의 제조 방법에 대한 한 가지 선택 사항으로서 당업자에게 이용될 수 있다 (문헌 [Chadd HE and Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:188-194]; [Andersen DC and Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:117]; [Larrick JW and Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418]).
이종 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용될 수 있는 포유동물 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, HeLa 세포, 새끼햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 다수의 다른 것을 포함한다.
프로모터 서열, 종결인자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 다른 적절한 서열을 비롯한, 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터를 선택 또는 구성할 수 있다. 벡터는 적절하게는 플라스미드, 예컨대, 파지미드, 또는 바이러스, 예컨대, 파지일 수 있다(문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]). 핵산 조작을 위한 많은 공지 기법과 프로토콜, 예를 들어, 핵산 구성물의 제조, 돌연변이 유발, 서열 분석, 세포 내로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 단백질 분석은 문헌 [Ausubel et al. [Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4th edition 1999]에 상세하게 기술되어 있다.
본 발명의 추가 측면은 본원에 개시된 바와 같은 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 상기와 같은 숙주 세포는 시험관내 있거나, 배양물 중에 있을 수 있다. 그러한 숙주 세포는 생체내 있을 수 있다. 숙주 세포의 생체내 존재는 "인트라바디" 또는 세포내 항체로서 본 발명의 결합 구성원이 세포내에서 발현될 수 있도록 할 수 있다. 인트라바디는 유전자 요법에 사용될 수 있다.
또 다른 측면은 본 발명의 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 도입은 임의의 이용가능한 기법을 사용할 수 있다. 진핵 세포에 있어서 적절한 기법으로는 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀 매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예컨대, 백시니아, 또는 곤충 세포의 경우에는 바쿨로바이러스를 사용한 형질도입을 포함한다. 핵산을 숙주 세포, 특히 진핵 세포 내로 도입하는 것은 바이러스 또는 플라스미드 기반 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피솜으로 유지되거나 숙주 세포 또는 인공 염색체 내로 혼입될 수 있다. 혼입은 무작위로 이루어지거나, 단일의 또는 다중의 유전자좌에서 하나 이상의 카피의 표적화된 통합에 의해 이루어질 수 있다. 박테리아 세포에 있어서, 적합한 기법으로는 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.
도입에 이어서 예컨대, 숙주 세포를 유전자 발현 조건하에서 배양하여 핵산으로부터 발현되도록 하거나, 발현될 수 있도록 할 수 있다. 발현된 생성물의 정제는 당업자에 의해 알려진 방법으로 달성할 수 있다.
본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예컨대, 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기법에 따라서 게놈과의 재조합을 촉진시키는 서열을 포함시킴으로써 촉진될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 결합 구성원 또는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 발현 시스템 중에서 상기 언급된 구성물을 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 인간 또는 동물 피험체, 예컨대, 인간에서의 진단 또는 치료 방법에 사용될 수 있다. IL-18에 대한 결합 구성원은 IL-18과 관련이 있는 장애 및/또는 IL-18의 활성을 감소시키는 것이 이익이 되는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
IL-18에 대한 결합 구성원은 개체에서 IL-18의 활성을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 IL-18의 활성 감소를 필요로 하는 개체에게 유효량의 하나 이상의 본 발명의 결합 구성원을 단독으로, 또는 당업계에 공지되어 있거나, 본원에 기술된 바와 같은 또 다른 적절한 약제와의 병용 치료 요법으로 투여하여 IL-18의 활성이 감소되도록 하는 단계를 포함하는, 개체에서 IL-18의 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 하기 열거된 병증을 치료하는 데 사용될 수 있다:
1. 골 및 관절: 예를 들어, 선천성 고관절 이형성증에 대해 원발성 및 속발성, 둘 모두에 해당되는 골관절염/골관절증과 관련이 있거나, 그를 포함하는 관절염증; 경추부 및 요추부 척추염, 및 요통 및 경부통; 류마티스 관절염; 스틸병; 강직성 척추염을 비롯한 음성 혈청 반응 척추관절병증; 건선성 관절염; 반응 관절염; 미분화성 척추관절병증; 패혈성 관절염 및 다른 감염 관련 관절병증 및 골 장애, 예컨대, 결핵, 예를 들어, 포트병(Potts' disease) 및 폰세트 증후군(Poncet's syndrome); 급성 및 만성 결정 유도성 윤활막염, 예를 들어, 우레이트 통풍, 칼슘 피로포스페이트 침착 질환, 및 칼슘 아파타이트 관련 건, 윤활낭 및 윤활막 염증; 베체트병(Behcet's disease); 원발성 및 속발성 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrom); 전신 경화증 및 제한형 공피증; 전신 홍반 루푸스, 혼합 결합 조직 질환, 및 미분화성 결합 조직 질환; 염증성 근육병증, 예를 들어, 피부근육염 및 다발성 근육염; 류마티스성 다발성 근육통; 가와사키병(Kawasaki disease); 특발성 관절염, 예를 들어, 전신 소아 특발성 관절염(sJIA) 및 특발성 염증성 관절염증(관절 분포와는 상관없이) 및 관련 증후군; 대식세포 활성화 증후군; 류마티스열 및 그의 전신성 합병증; 식혈세포성 증후군; 식혈세포성 림프조직구증; CAP 증후군; 맥관염, 예를 들어, 거대 세포 동맥염, 타카야수 동맥염(Takayasu's arteritis), 초그-스토라우스 증후군(Churg-Strauss syndrom), 결절 다발성 동맥염, 현미경적 다발성 동맥염, 및 바이러스 감염, 과민 반응, 한랭글로불린, 및 파라단백질과 관련된 맥관염; 요통; 가족성 지중해 열(Familial Mediterranean fever); 머클-웰즈 증후군(Muckle-Wells syndrome); 및 가족성 동면성 열; 기쿠치병(Kikuchi disease); 약물 유도성 관절통, 건염, 및 근육병증;
2. 외상[예를 들어, 스포츠 외상] 또는 질환에 기인한 근골격계 장애의 통증 및 결합 조직 재형성: 관절염증(예를 들어, 류마티스 관절염, 골관절염, 통풍 또는 결정 관절병증), 다른 관절 질환(예컨대, 추간판 변성 또는 측두하악 관절 변성), 골 재형성 질환(예컨대, 골다공증, 파젯트병 또는 골괴사), 다발연골염, 공피증, 혼합 결합 조직병, 척추관절병증 또는 치주병(예컨대, 치주염);
3. 심혈관: 신허혈; 뇌졸중; 죽상동맥경화증(atherosclerosis); 동맥경화(arteriosclerosis); 복부 대동맥 동맥류; 말초 동맥 질환; 협심증; 급성 관상 동맥 증후군; 심근경색; 울혈심부전; 혈관재건술 후의 재협착; 뇌혈관 질환, 예를 들어, 다발 경색 치매; 말초 혈관 질환, 예를 들어, 발기부전; 관상 동맥 및 말초 순환에 영향을 주는 장애; 심장막염; 심근염, 염증성 및 자가면역 심근병증, 예를 들어, 심근 사르코이드; 허혈성 재관류 손상; 심내막염, 판막염, 및 대동맥염, 예를 들어, 감염성(예를 들어, 매독성); 맥관염; 근위 및 말초 정맥 장애, 예를 들어, 정맥염 및 혈전증, 예를 들어, 심부정맥 혈전증 및 정맥류성 정맥 합병증;
4. 내분비계 질환: 당뇨병, 예를 들어, 2형 당뇨병 및 당뇨 합병증, 예컨대, 당뇨 신장병증, 신경병증 및 망막병증;
5. 기도: 기도 폐쇄성 질환, 예를 들어, 천식, 예를 들어, 기관지, 알레르기성, 내인성, 외인성, 운동 유도성, 약물 유도성(아스피린 및 NSAID 유도성) 및 먼지 유도성 천식(간헐성 및 지속성, 둘 모두, 모든 중증도의 천식), 및 다른 병인의 기도 과반응성; 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD); 기관지염, 예를 들어, 감염성 및 호산성 기관지염; 폐기종; 기관지확장증; 낭성 섬유증; 사코이드증; 농부 폐 및 관련 질환; 과민성 폐렴; 폐 섬유증, 예를 들어, 잠재성 섬유성 폐포염, 특발성 간질성 폐렴, 항신생물 요법 합병 섬유증 및 만성 감염, 예를 들어, 결핵 및 아스페르길루스증 및 다른 진균 감염; 폐 이식 합병증; 폐 혈관계의 혈관염성 및 혈전성 장애, 및 폐 고혈압; 진해 활성, 예를 들어, 기도의 염증성 및 분비 병증과 관련된 만성 기침, 및 의원성 기침 치료; 급성 및 만성 비염, 예를 들어, 약물 비염, 및 혈관운동 비염; 연중 및 계절성 알레르기성 비염, 예를 들어, 신경성 비염(건초열); 코 폴립증; 급성 바이러스 감염, 예를 들어, 감기, 및 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자, 코로나바이러스(SARS 포함) 및 아데노바이러스에 기인한 감염;
6. 피부: 건선, 아토피 피부염, 접촉성 피부염 또는 다른 습진 피부병, 및 지연 과민 반응; 식물피부염 및 광피부염; 지루 피부염, 포진 피부염, 편평태선, 경화성 위축성 태선, 괴저농피증, 피부 사르코이드, 원판상 홍반성 루푸스, 천포창, 유사천포창, 수포성 표피박리증, 두드러기, 혈관부종, 맥관염, 독성 홍반, 피부 호산구증가증, 원형 탈모증, 남성형 대머리, 스위트 증후군(Sweet's syndrom), 웨버-크리스찬 증후군(Weber-Christian syndrom), 다형 홍반; 연조직염(감염성 및 비감염성, 둘 모두); 지방층염; 피부 림프종s, 비흑색종 피부암 및 다른 형성이상 병변; 약물 유도성 장애, 예를 들어, 고정 약물 발진;
7. 눈: 안검염; 결막염, 예를 들어, 연중 및 봄철 알레르기성 결막염; 홍채염; 전부 및 후부 포도막염; 맥락막염; 자가면역; 망막에 영향을 주는 퇴행성 또는 염증성 장애; 안염, 예를 들어, 교감성 안염; 사코이드증; 감염, 예를 들어, 바이러사, 진균 및 박테리아 감염;
8. 위장관: 설염, 치은염, 치주염; 위식도염, 예를 들어, 역류; 호산성 위자염, 비만세포증, 크론병, 결장염, 예를 들어, 궤양성 대장염, 직장염, 항문소양증; 복강 질환, 과민성 대장 증후군, 및 소화관과 동떨어진 영향을 미칠 수 있는 음식물 관련 알레르기(예를 들어, 편두통, 비염, 또는 습진);
9. 복부: 간염, 예를 들어, 자가면역 간염, 알코올 간염 및 바이러스 간염; 간 섬유증 및 간경화증; 담낭염; 췌장염(급성 및 만성인 것 둘 모두);
10. 비뇨생식계: 신장염, 예를 들어, 간질성 신장염 및 사구체신염; 신증후군; 방광염, 예를 들어, 급성 및 만성 (간질성) 방광염 및 헌너 궤양(Hunner's ulcer); 급성 및 만성 요도염, 전립샘염, 부고환염, 난소염 및 난관염; 외음부 질염; 페이로니병(Peyronie's disease); 발기부전(남성 및 여성, 둘 모두);
11. 동종이식 거부: 예를 들어, 신장, 심장, 간, 폐, 골수, 피부 또는 각막 이식 후의, 또는 수혈 이후의 급성 및 만성 동종이식 거부; 또는 만성 이식편대숙주병;
12. CNS: 알츠하이머병 및 다른 치매성 장애, 예를 들어, CJD 및 nvCJD; 아밀로이드증; 다발성 경화증 및 다른 탈수초 증후군; 뇌 죽상동맥경화증 및 혈관염; 측두 동맥염; 중증근육무력증; 급성 및 만성 통증(급성, 간헐성 또는 지속성, 중추 또는 말초 기원이든 간에), 예를 들어, 내장 통증, 두통, 편두통, 삼차 신경통, 비정형적인 얼굴 통증, 관절 및 골통, 암 및 종양 침윤으로부터 유발된 통증, 신경병성 통증 증후군, 예를 들어, 당뇨성, 대상포진후 및 HIV 관련 신경병증; 신경사르코이드증; 악성, 감염성 또는 자가면역 과정의 중추 및 말초 신경계 합병증;
13. 다른 자가면역 및 알레르기성 장애, 예를 들어, 하시모토 갑상샘염,그레이브스병, 애디슨병, 특발성 혈소판감소자색반, 호산성 근막염, 고IgE 증후군, 항인지질항체 증후군;
14. 염증성 또는 면역학적 성분을 포함하는 다른 장애; 예를 들어, 후천성 면역 결핍증(AIDS: acquired immune deficiency syndrome), 나병, 세자리 증후군(Sezary syndrome), 및 부신생물 증후군;
15. 전이성 또는 비전이성 고형암 또는 악성 림프종, 예컨대, 백혈병, 육종, 피부암, 방광암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립샘암, 폐암, 결장직장암, 자궁경부암, 간암, 두부경부암, 식도암, 췌장암, 신장암, 위암 및 뇌암 중 임의 유형의 것을 비롯한 암.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 장애 또는 그의 증상 중 하나 이상의 예방적 치료 및 중증도 감소, 또는 발병 지연 또는 발병 위험 감소를 비롯한, 상기 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본원에서 언급된 장애 중 임의의 것 중 1 이상의 증상 치료 또는, 그의 중증도 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 하나 이상의 본 발명의 결합 구성원을 단독으로, 또는 당업계에 공지되어 있거나, 본원에 기술된 바와 같은 또 다른 적절한 약제와의 병용 치료 요법으로 투여하여 상기 장애 중 임의의 것 중 1 이상의 증상의 중증도가 감소되도록 하는 단계를 포함하는, 본원에서 언급된 장애 중 임의의 것 중 1 이상의 증상을 치료하거나, 그의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 결합 구성원은 질환을 앓는 동물 및 동물 모델에서, 예를 들어, 영장류 모델, 예컨대, 레서스 또는 사이노몰구스 원숭이 모델에서 사용될 수 있다. 적합한 동물 모델은 또한 면역 손상된 비인간 포유동물, 예컨대, 마우스 또는 래트를 포함할 수 있으며, 이는 인간 세포와 함께 재구성될 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 IL-18, 예컨대, IL-18 발현 및/또는 활성, 특히, 비정상적인 발현/활성을 포함하는 질환 또는 장애 치료에서 치료제로서 유용하다. 치료 방법은 그를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원을 투여하고, 여기서, IL-18의 비정상적인 발현 및/또는 활성은 감소되는 것인 단계를 포함할 수 있다. 치료 방법은 (i) 예를 들어, 상기 기술된 진단 방법을 사용하여 비정상적인 IL-18 수준 또는 활성을 보이는 환자를 확인하는 단계, 및 (ii) 환자에게 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원을 투여하고, 여기서, IL-18의 비정상적인 발현 및/또는 활성은 감소되는 것인 단계를 포함할 수 있다. 유효량이란 질환 또는 장애가 반드시 치유되어야 하는 것은 아니지만, 치료되는 특정 질환 또는 장애의 1 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나 경감시키기 위해 IL-18의 비정상적인 발현 및/또는 활성을 감소시키는 양이다.
본 발명은 또한 유효량의 하나 이상의 본 발명의 결합 구성원과 접촉시키거나, 그를 투여함으로써 IL-18의 1 이상의 효과를 길항시키는 단계를 포함하는, IL-18의 1 이상의 효과를 길항시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 길항될 수 있는 IL-18의 효과로는 그의 수용체에의 및/또는 IL-18BP에의 결합, 및 상기 결합 반응의 결과로서 일어나는 임의의 하류 효과를 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 제공된 것과 같은 결합 구성원을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법, 상기 결합 구성원을 포함하는 약학 조성물, 및 투여용 약제의 제조에서, 예를 들어, 결합 구성원을 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 제제화하는 것을 포함하는, 약제 또는 약학 조성물 제조 방법에서의 상기 결합 구성원의 용도를 제공한다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 2차 반응을 일으키지 않으며, 예를 들어, 결합 구성원의 투여 촉진, 체내에서의 그의 수명 연장 및/또는 그의 효능 증가, 용액 중의 그의 용해도 증가, 또는 그의 보관 개선을 허용하는, 약제학적 조성물 내로 유입되는 화합물 또는 그들의 조합일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 비히클은 주지되어 있고, 선택된 활성 화합물(들)의 특성 및 투여 방식에 따라 당업자에 의해 적합화될 것이다.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 보통 결합 구성원 외에 1 이상의 성분을 포함할 수 있는 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물 및 본 발명에 따라 사용되는 약학 조성물은 결합 구성원 이외에 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정제 또는 당업자에게 주지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 비독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 하기 논의되는 바와 같이, 경구, 흡입, 기관내, 국소, 관절내, 소포내 투여, 또는 주사에 의한 투여일 수 있는, 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
경구 투여용 약학 조성물, 예를 들어, 단일 도메인 항체 분자(예컨대, "나노바디™") 등 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 그러한 경구용 제제는 정제, 캡슐제, 분제, 액제 또는 반고체 형태일 수 있다. 정제는 예컨대, 젤라틴과 같은 고체 담체 또는 애주번트를 포함할 수 있다. 액체 약학 조성물은 일반적으로, 예컨대, 물, 페트롤륨, 동물성 오일 또는 식물유, 광유 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 생리식염수, 덱스트로스 또는 다른 사카라이드 용액, 또는 글리콜, 예컨대, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜도 포함될 수 있다.
정맥내 주사 또는 환부에의 주사(예컨대, 관절내 주사)를 위한 경우, 활성 성분은 발열 물질이 없고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 가지는 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 것이다. 당업자는, 예컨대, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트 첨가 링거 주사액과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있을 것이다. 보존제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 사용될 수 있으며, 이들은 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산과 같은 완충제; 예컨대, 아스코르브산 및 메티오닌과 같은 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3'-펜타놀; m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드; 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 예컨대, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; 예컨대, EDTA와 같은 킬레이팅제; 예컨대, 수크로스, 만닛톨, 트레할로즈 또는 솔비톨과 같은 당; 예컨대, 나트륨과 같은 염 형성 카운터 이온; 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 착물); 및/또는 예컨대, 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS))™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 분자의 물리화학적 특성 및 전달 경로에 따라서 액체, 반고체 또는 고체형 형태로 제제화될 수 있다. 제제는 부형제 또는 부형제의 조합, 예를 들어, 당, 아미노산 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 액체 제제는 넓은 범위의 항체 농도 및 pH를 포함할 수 있다. 고체 제제는 동결 건조, 분무 건조에 의해 제조되거나, 예를 들어, 초임계 유체 기술에 의해 건조시켜 제조될 수 있다. 항IL-18 제제는 의도된 전달 경로에 따라 달라질 것이다:예를 들어, 폐 전달용 제제는 흡입시 확실하게 폐 깊은 곳까지 관통될 수 있는 물리적 특성을 가진 입자로 구성될 수 있고; 국소용 제제는 약물이 작용 부위에 잔류하는 시간을 연장시키는 점도 조절제를 포함할 수 있다. 결합 구성원은 결합 구성원의 빠른 방출을 막는 담체와 함께, 예컨대, 방출 조절형 제제로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 임플란트, 경피용 패취, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 그러한 제제를 제조하는 많은 방법들이 당업자에게 알려져 있다(문헌 [Robinson, J. R. ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]).
항IL-18 치료는 경구 투여로(예컨대, 단일 도메인 항체 분자(예컨대, "나노바디™") 형태로), 주사에 의해(예를 들어, 피하, 관절내, 정맥내, 복강내, 동맥내 또는 근육내 ), 흡입에 의해, 기관내, 소포내 경로에 의해(방광 내로 점적 주입), 또는 국소적으로(예컨대, 안내, 비내, 직장, 환부로, 피부상에) 수행될 수 있다. 치료는 특히 결합 구성원의 용량을 감소시키면서 펄스 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 치료의 물리화학적 특징에 의해, 질환을 특별히 고려하여, 또는 효능을 최적화하거나, 또는 부작용을 최소화하기 위한 요건에 따라 결정될 수 있다. 한 특정 투여 경로는 정맥내 투여이다. 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 또 다른 경로는 피하 투여이다. 항IL-18 치료는 병원내에서 사용하는 것으로 제한되지 않을 것으로 예상된다. 따라서, 바늘이 없는 장치를 사용한 피하 주사 또한 유리하다.
조성물은 치료하고자 하는 병증에 따라, 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 치료와 병행하여 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
IL-18에 대한 결합 구성원은 추가의 약제 성분과 함께 병용 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 병용 치료는 상당한 상승 효과를 얻기 위하여 사용될 수 있으며, 특히, 항IL-18 결합 구성원을 하나 이상의 다른 약물과 병용하는 경우에 그러하다. IL-18에 대한 결합 구성원은 본원에 열거된 병증들 중 하나 이상의 것을 치료하기 위해 또 다른 치료제 또는 치료제들과 함께 동시에, 또는 순차적으로 또는 복합 제제로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 구성원은 하기 제제들 중 하나 이상의 것과 함께 병용하여 또는 이에 추가하여 제공될 수 있다:
- 사이토카인 또는 사이토카인 기능의 효능제 또는 길항제(예컨대, SOCS 시스템의 조절제와 같은, 사이토카인 신호 경로에 작용하는 작용제), 예컨대, 알파-, 베타- 및/또는 감마-인터페론; 인슐린 유사 성장 인자 I형(IGF-I: insulin-like growth factor type I), 그의 수용체 및 관련 결합 단백질; 인터루킨(IL), 예컨대, 하나 이상의 IL-1 내지 IL-37, 및/또는 예컨대, 아나킨라와 같은 인터루킨 길항제 또는 억제제; 인터루킨 패밀리 구성원 수용체의 억제제 또는 그러한 수용체의 특정 서브유니트의 억제제(예를 들어, 토실리주맙(악템라(Actemra)™; 로슈(Roche)), 인간 IL-6 수용체에 대한 인간화된 IgG1 모노클로날 항체), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α: tumour necrosis factor alpha) 억제제, 예컨대, 항TNF 모노클로날 항체(예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 및/또는 CDP870), 및/또는 TNF 수용체 길항제, 예컨대, 면역글로불린 분자(예컨대, 에타너셉트) 및/또는 예컨대, 펜톡시필린과 같은 저분자량 작용제;
- B 세포 조절제, 예컨대, B 림프구를 표적화하는 모노클로날 항체(예컨대, CD20(리툭시맙) 또는 MRA-aIL16R) 또는 T 림프구를 표적화하는 모노클로날 항체(예컨대, CTLA4-Ig, HuMax Il-15 또는 아바타셉트);
- 파골세포 활성을 억제하는 조절제, 예를 들어, RANKL에 대한 항체;
- 케모카인 또는 케모카인 수용체 기능의 조절제, 예컨대, CCR1, CCR2, CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 및 CCR11(C-C 패밀리에 대한 것) 길항제; CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5 및 CXCR6(CX-C 패밀리에 대한 것) 길항제 및 CX3CR1(C-X3-C 패밀리에 대한 것) 길항제;
- 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP: matrix metalloprotease) 억제제, 즉, 스트로멜리신, 콜라게나제, 및 젤라티나제, 어그리카나제 억제제 중 하나 이상; 특히, 콜라게나제-1(MMP-1), 콜라게나제-2(MMP-8), 콜라게나제-3(MMP-13), 스트로멜리신-1(MMP-3), 스트로멜리신-2(MMP-10), 및/또는 스트로멜리신-3(MMP-11) 및/또는 MMP-9 및/또는 MMP-12의 억제제, 예컨대, 독시사이클린;
- 류코트리엔 생합성 억제제, 5-리폭시게나제(5-LO) 억제제 또는 5-리폭시게나제 활성화 단백질(FLAP: 5-lipoxygenase activating protein) 길항제; 예컨대, 질루톤; ABT-761; 펜루톤; 테폭살린; 애보트(Abbott)-79175; 애보트-85761; N-(5-치환된)-티오펜-2-알킬술폰아미드; 2,6-디-tert-부틸페놀하이드라존; 메톡시테트라하이드로피란, 예컨대, 제네카(Zeneca) ZD-2138; 화합물 SB-210661; 피리디닐-치환된 2-시아노나프탈렌 화합물, 예컨대, L-739,010; 2-시아노퀴놀린 화합물, 예를 들어, L-746,530; 인돌 및/또는 퀴놀린 화합물, 예컨대, MK-591, MK-886, 및/또는 BAY x 1005;
- 예컨대, L-651,392와 같은 페노티아진-3-1s; 예컨대, CGS-25019c와 같은 아미디노 화합물; 예컨대, 온타졸라스트와 같은 벤족살아민; 예컨대, BIIL 284/260과 같은 벤젠카복스이미드아미드; 및 예컨대, 자피르루카스트, 아블루카스트, 몬테루카스트, 프란루카스트, 베르루카스트(MK-679), RG-12525, Ro245913, 이라루카스트(CGP 45715A), 및 BAY x 7195로 이루어진 군으로부터 선택되는 류코트리엔(LT: leukotriene) B4, LTC4, LTD4, 및 LTE4에 대한 수용체 길항제;
- 포스포디에스터라제(PDE: phosphodiesterase) 억제제, 예컨대, 테오필린 및/또는 아미노필린과 같은 메틸크잔틴; 및/또는 선택적 PDE 이소엔자임 억제제, 예컨대, PDE4 억제제 및/또는 이소폼 PDE4D 억제제 및/또는 PDE5 억제제;
- 히스타민 1형 수용체 길항제, 예컨대, 세티리진, 로라타딘, 데스로라타딘, 펙소페나딘, 아크리바스틴, 테르페나딘, 아스테미졸, 아젤라스틴, 레보카바스틴, 클로로페니라민, 프로메타진, 사이클리진 및/또는 미졸라스틴(일반적으로 경구적으로, 국소적으로 또는 비경구적으로 적용);
- 양성자 펌프 억제제(예컨대, 오메프라졸) 또는 위장보호 히스타민 2형 수용체 길항제;
- 히스타민 4형 수용체 길항제;
- 알파 1/알파 2 아드레날린 수용체 효능제 혈관수축 교감신경 흥분제, 예컨대, 프로필헥세드린, 페닐에프린, 페닐프로파놀라민, 에페드린, 슈도에페드린, 나파졸린 하이드로클로라이드, 옥시메타졸린 하이드로클로라이드, 테트라하이드로졸린 하이드로클로라이드, 크실로메타졸린 하이드로클로라이드, 트라마졸린 하이드로클로라이드 및 에틸노르에피네프린 하이드로클로라이드;
- 항콜린제, 예컨대, 무스카린 수용체(M1, M2, 및 M3) 길항제, 예컨대, 아트로핀, 하이오신, 글리코피롤레이트, 이프라트로퓸 브로마이드, 티오트로퓸 브로마이드, 옥시트로퓸 브로마이드, 피렌제핀, 및 텔렌제핀;
- 베타 아드레날린 수용체 효능제(베타 수용체 서브타입 1-4 포함), 예컨대, 이소프레날린, 살부타몰, 포르모테롤, 살메테롤, 터부탈린, 오르시프레날린, 비톨테롤 메실레이트, 및/또는 피르부테롤, 예컨대, 그의 거울상 이성질체;
- 크로몬, 예컨대, 나트륨 크로모글리케이트 및/또는 네도크로밀 나트륨;
- PDE-4 억제제, 예컨대, 로플루밀라스트;
- 글루코코르티코이드, 예컨대, 플루니졸라이드, 트리암시놀론 아세토니드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 부데소니드, 플루티카존 프로피오네이트, 시클레조니드 및/또는 모메타존 프로에이트;
- 예컨대, PPAR과 같은 핵 호르몬 수용체를 조절하는 작용제;
- 면역글로불린(Ig) 또는 Ig 제제, 또는 예컨대, 항IgE(예컨대, 오말리주맙) 과 같은 Ig 기능을 조절하는 길항제 또는 항체;
- 다른 전신 또는 국소 적용되는 항염증제, 예컨대, 탈리도미드 또는 그의 유도체, 레티노이드, 디트라놀, 및/또는 칼시포트리올;
- 아미노살리실레이트와, 예컨대, 술파살라진, 메살라진, 발살라지드 및 올살라진과 같은 술파피리딘의 조합, 및 예컨대, 티오퓨린과 같은 면역조절제, 예컨대, 부데소나이드와 같은 코르티코스테로이드;
- 항박테리아제, 예컨대, 페니실린 유도체, 테트라사이클린, 마크롤리드, 베타 락탐, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸, 및/또는 흡입영 아미노글리코시드; 및/또는 항바이러스제, 예컨대, 아사이클로비어, 팜시클로비어, 발라사이클로비어, 간사이클로비어, 시도포비어; 아만타딘, 리만타딘; 리바비린; 자나마비어 및/또는 오셀타마비어; 프로테아제 억제제, 예컨대, 인디나비어, 넬피나비어, 리토나비어, 및/또는 사퀴나비어; 뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 예를 들어, 디다노신, 라미부딘, 스타부딘, 잘시타빈, 지도부딘; 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 예컨대, 네비라핀, 에파비렌츠; 또는 항체, 예컨대, 팔리비주맙(시나지스(Synagis)™);
- 심혈관제, 예컨대, 티아지드 또는 루우프 이뇨제; 혈관확장제, 예컨대, 니트로글리세린, 칼슘 채널 차단제, 알파 아드레날린수용체 차단제, 베타 아드레날린수용체 차단제 또는 복합 알파 및 베타 아드레날린수용체 차단제, 안지오텐신 전환 효소(ACE: angiotensin-converting enzyme) 억제제, 안지오텐신 2 수용체 길항제; 알도스테론 길항제 또는 칼륨 보존성 이뇨제; 지질 강하제, 예컨대, 스타틴, 콜레스테롤 흡수 억제제 및/또는 피브레이트; 예컨대, 펜톡시필린과 같은 혈액 세포 형태 조절제; 예컨대, 혈소판 응집 억제제와 같은 혈전용해제 및 항응고제;
- CNS 치료제, 예컨대, 항우울제(예컨대, 세르트랄린), 항파킨슨 약물(예컨대, 데프레닐, L-도파, 로피니롤, 프라미펙솔; MAOB 억제제, 예컨대, 셀레진, 및 라사질린; 예컨대, 타스마르와 같은 comP 억제제; A-2 억제제, 도파민 재흡수 억제제, NMDA 길항제, 니코틴 효능제, 도파민 효능제 및/또는 뉴런 산화질소 신타제 억제제), 및 항알츠하이머 약물, 예컨대, 도네페질, 리바스티그민, 타크린, COX-2 억제제, 프로펜토필린 또는 메트리포네이트;
- 급성 및 만성 통증 치료제, 예컨대, 중추 또는 말초 신경 작용 진통제, 예컨대, 아편 유사체 또는 유도체, 카바마제핀, 펜토인, 나트륨 발프로에이트, 아미트리프틸린 또는 다른 항우울제, 파라세타몰 또는 비스테로이드성 항염증제;
- 비경구적으로 또는 국소적으로 적용되는 (흡입 포함) 국부 마취제, 예컨대, 리그노카인 또는 그의 유사체;
- 항골다공증제, 예컨대, 랄록시펜과 같은 호르몬제, 또는 알렌드로네이트와 같은 비포스포네이트;
- (i) 트립타제 억제제; (ii) 혈소판 활성화 인자(PAF: platelet activating factor) 길항제; (iii) 인터루킨 전환 효소(ICE: interleukin converting enzyme) 억제제; (iv) IMPDH 억제제; (v) 부착 분자 억제제(VLA-4 길항제 포함); (vi) 카텝신; (vii) 키나제 억제제, 예컨대, 티로신 키나제 억제제(예컨대, Btk, Itk, Jak3 MAP 억제제의 예로 게피티닙, 이마티닙 메실레이트를 포함할 수 있다), 세린/트레오닌 키나제 억제제(예컨대, MAP 키나제, 예컨대, p38, JNK, 단백질 키나제 A, B 및 C 및 IKK의 억제제), 또는 세포주기 조절에 관여하는 키나제(예컨대, 사이클린 의존 키나제)의 억제제; (viii) 글루코스-6 포스페이트 데하이드로게나제 억제제; (ix) 키닌 B1.- 및/또는 B2-수용체 길항제; (x) 항통풍제, 예컨대, 콜히친; (xi) 크잔틴 옥시다제 억제제, 예컨대, 알로퓨리놀; (xii) 요산뇨증제, 예컨대, 프로벤시드, 술핀피라존 및/또는 벤즈브로마론; (xiii) 성장 호르몬 분비촉진제; (xiv) 전환 성장 인자(TGFβ: transforming growth factorβ); (xv) 혈소판 유래 성장 인자(PDGF: platelet-derived growth factor); (xvi) 섬유모세포 성장 인자, 예컨대, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF: basic fibroblast growth factor); (xvii) 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor); (xviii) 캡사이신 크림; (xix) 타키키닌 NK1 및/또는 NK3 수용체 길항제, 예컨대, NKP-608C, SB-233412(탈네탄트), 및/또는 D-4418; (xx) 엘라스타제 억제제, 예컨대, UT-77 및/또는 ZD-0892; (xxi) TNF-알파 전환 효소 억제제(TACE: TNF-alpha converting enzyme inhibitor); (xxii) 유도된 산화질소 신타제(iNOS: induced nitric oxide synthase) 억제제; (xxiii) TH2 세포 상에 발현된 화학유인물 수용체 동종 분자(예컨대, CRTH2 길항제); (xxiv) P38 억제제; (xxv) 톨 유사 수용체(TLR: Toll-like receptor) 기능을 조절하는 물질; (xxvi) 예컨대, P2X7과 같은 퓨린 수용체 활성을 조절하는 작용제; (xxvii) 예컨대, NFκB, API, 및/또는 STATS와 같은 전사인자 활성화 억제제 또는 (xxviii) 카스파제 억제제, 예컨대, Boc-Asp-FMK, z-VAD-FMK, YVAD-FMK, Ac-WEHD-CHO, Ac-DEVD-CHO, Ac-YVADCHO, t-부톡시카보닐-IETD-CHO, 및 t-부톡시카보닐-AEVD-CHO.
억제제는 특이적이거나, 혼합 억제제, 예컨대, 상기 언급한 분자(예컨대, 수용체) 또는 분자 부류 중 1 초과의 것을 표적화하는 억제제일 수 있다.
결합 구성원은 또한 공동 투여로 또는 면역접합체 형태로 화학요법제 또는 또 다른 티로신 키나제 억제제와 함께 사용될 수 있다. 상기 항체의 단편은 또한 재조합 기전 또는 생화학적 커플링 이후 상기 기술한 항체의 특이성을 IL-18이 관련된 활성에 관여하는 다른 분자를 인식할 수 있는 다른 항체의 특이성과 결합시켜 수득되는 이중특이적 항체에 사용될 수 있다.
염증 질환, 예컨대, 상기 기술된 염증성 병증, 예컨대, 류마티스 관절염, 골관절염, 천식, 알레르기, 알레르기성 비염, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 건선, 전신 홍반 루푸스, 전신 소아 특발성 관절염, 자가면역 질환, 여드름, 혈관염, 및 스틸병의 치료를 위해, 본 발명의 결합 구성원은 하나 이상의 작용제, 예컨대, 비스테로이드성 항염증제(이하, NSIAD: non steroidal anti-inflammatory agent), 예를 들어, 국소적으로 또는 전신적으로 투여되든 간에, 비선택적 사이클로옥시게나제(COX: cyclo-oxygenase-1/COX-2) 억제제, 예컨대, 피록시캄, 디클로페낙, 프로피온산, 예컨대, 나프록센, 플루비프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜 및 이부프로펜, 페나메이트, 예컨대, 메페남산, 인도메타신, 술린닥, 아자프로파존, 피라졸론, 예컨대, 페닐부타존, 살리실레이트, 예컨대, 아스피린); 선택적 COX-2 억제제(예컨대, 멜록시캄, 셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브, 루마로콕시브, 파레콕시브 및 에토리콕시브); 사이클로옥시게나제 억제 산화질소 공여제(CINOD: cyclo-oxygenase inhibiting nitric oxide donor); 글루코코르티코스테로이드(국소, 경구, 근육내, 정맥내 또는 관절내 투여); 메토트렉세이트, 레플루노마이드; 하이드록사이클로로퀸, d-페니실라민, 오라노핀 또는 다른 비경구 또는 경구 금 제제; 진통제; 다이아세레인; 하이알루론산 유도체와 같은 관절내 요법; 및 글루코사민과 같은 영양 보충제와 함께 병용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 결합 구성원은 또한 현존하는 암 치료용 치료제와 함께 병용하여 사용될 수 있다.
병용하여 사용하고자 하는 적합한 작용제로는 하기의 것을 포함한다:
(i) 종양 내과에서 사용되는 것과 같은 항증식성/항신생물 약물 및 그의 조합, 예컨대, 글리벡(이마티닙 메실레이트), 알킬화제(예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판 및 니트로소우레아); 항대사제(예를 들어, 항엽산대사제, 예컨대, 플루오로피리미딘, 예컨대, 5-플루오로우라실 및 테가푸르, 랄티트렉세드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노시드, 하이드록시우레아, 겜시타빈 및 파클리탁셀); 항종양 항생제(예를 들어, 안트라사이클린, 예컨대, 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신 C, 닥티노마이신 및 미트라마이신); 항분열제(예를 들어, 빈카알칼로이드, 예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈, 및 탁소이드, 예컨대, 탁솔 및 탁소텔); 및 토포이소머라제 억제제(예를 들어, 에피포도필로톡신, 예컨대, 에토포시드 및 테니포시드, 암사크린, 토포테칸 및 캄토테신);
(ii) 세포증식 억제제, 예컨대, 항에스트로겐(예를 들어, 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 드롤록시펜 및 요독시펜), 에스트로겐 수용체 하향조절제(예를 들어, 플베스트란트), 항안드로겐(예를 들어, 비칼루타미드, 플루타미드, 닐루타미드 및 시프로테론 아세테이트), LHRH 길항제 또는 LHRH 효능제(예를 들어, 고세렐린, 류프로렐린 및 부세렐린), 프로게스토겐(예를 들어, 메게스트롤 아세테이트), 아로마타제 억제제(예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸 및 엑세메스탄) 및 예컨대, 피나스테라이드와 같은 5α-리덕타제 억제제;
(iii) 암 세포 침윤을 억제시키는 작용제(예를 들어, 메탈로프로테이나제 억제제, 예컨대, 마리마스타트 및 유로키나제 플라스미노겐 활성인자 수용체 기능의 억제제);
(iv) 성장 인자 기능의 억제제, 예를 들어, 성장 인자 항체, 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 항erbb2 항체 트라스투주맙 및 항erbb1 항체 세툭시맙 [C225]), 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 티로신 키나제 억제제 및 세린/트레오닌 키나제 억제제, 예를 들어, 표피 성장 인자 패밀리 억제제(예를 들어, EGFR 패밀리 티로신 키나제 억제제, 예컨대, N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(게피티닙, AZD1839), N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민(엘로티닙 OSI-774) 및 6-아크릴아미도-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(CI 1033)), 예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자 패밀리 억제제 및 예를 들어, 간세포 성장 인자 패밀리 억제제;
(v) 항혈관신생제, 예컨대, 혈관 내피 성장 인자의 효과를 억제시키는 억제제(예를 들어, 항혈관 내피 세포 성장 인자 항체인 베바시주맙, 국제 특허 출원 WO97/22596, WO97/30035, WO97/32856 및 WO98/13354(이들은 각각 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다)에 개시된 것과 같은 화합물) 및 다른 기전에 의해 작용하는 화합물(예를 들어, 리노마이드, 인테그린 αvβ3 기능의 억제제 및 안지오스타틴);
(vi) 혈관 손상제, 예컨대, 콤브레타스타틴 A4 및 국제 특허 출원 WO99/02166 WO00/40529, WO00/41669, WO01/92224, WO02/04434 및 WO02/08213(이들은 각각 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다)에 개시된 화합물;
(vii) 안티센스 요법, 예를 들어, 상기 열거한 바와 같은 표적에 대한 것, 예컨대, ISIS 2503, 항ras 안티센스;
(viii) 유전자 요법 접근법, 비정상적인 유전자, 예컨대, 비정상적인 p53 또는 비정상적인 BRCA1 또는 BRCA2를 대체하는 접근법, GDEPT(유전자 유도 효소 프로드럭 요법: gene directed enzyme pro-drug therapy)로서, 예컨대, 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 박테리아 니트로리덕타제 효소를 사용하는 접근법, 화학요법 또는 방사선요법에 대한 환자의 내성을 증가시키는 접근법으로 예컨대, 다중 약물 내성 유전자 요법; 및
(ix) 면역치료 접근법, 예를 들어, 환자 종양 세포의 면역원성을 증가시키는 생체외 및 생체내 요법, 예컨대, 사이토카인, 예컨대, 인터루킨 2, 인터루킨 4 또는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자로 형질감염, T 세포 아네르기를 감소시키는 접근법, 형질감염된 면역 세포, 예컨대, 사이토카인 형질감염된 수지상 세포를 사용하는 접근법, 사이토카인 형질감염된 종양 세포주를 사용하는 접근법 및 항이디오타입 항체를 사용하는 접근법.
본 발명의 결합 구성원 및 상기 추가의 의약 성분 중 하나 이상은 약제의 제조에 사용될 수 있다. 약제는 개별적으로 또는 배합되어 개체에게 투여될 수 있으며, 따라서, 복합 제제로서 또는 개별 제제로서 결합 구성원 및 추가의 성분을 포함할 수 있다. 개별 제제는 개별 및 순차적 또는 동시 투여를 촉진하는 데, 및 성분이 상이한 경로에 의해, 예컨대, 경구 및 비경구로 투여되도록 하는 데 사용될 수 있다.
제공된 조성물은 포유동물에게 투여될 수 있다. 투여는 보통 환자에게 이익을 주기에 충분한 양인 "치료학상 유효량"으로 이루어진다. 그러한 이익은 적어도 1 이상의 증상을 적어도 호전시키는 것일 수 있다. 실제 투여량, 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 것의 특성 및 중증도, 치료받는 포유동물, 개개 환자의 임상 증상, 장애의 원인, 조성물 전달 부위, 결합 구성원의 유형, 투여 방법, 투여 스케줄 및 임상의에게 알려진 다른 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 처방, 예컨대, 투여량 결정 등은 일반의 및 다른 내과의의 책임 소재하에 있으며, 치료될 질환의 증상의 중증도 및/또는 진행 상황에 따라 달라진다. 항체의 적절한 용량은 당업계에 주지되어 있다. 본원, 또는 문헌 [Physician's Desk Reference (2005)]에 명시되어 있는 바와 같은 구체적인 투여량이 투여되는 약제의 유형에 대해 맞게 적절히 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 구성원의 치료학상 유효량 또는 적합한 용량은 동물 모델에서 시험관내 활성 및 생체내 활성을 비교하여 결정될 수 있다. 시험 동물의 유효 투여량을 인간에 대한 것으로 외삽하는 방법이 알려져 있다. 정확한 용량은 항체가 진단용인지, 예방용인지 또는 치료용인지 여부, 치료하고자 하는 부위의 크기 및 위치, 항체의 정확한 특성(예를 들어, 전체 항체, 단편 또는 디아바디), 및 임의의 검출가능한 표지 또는 항체에 부착된 다른 분자의 성질을 비롯한, 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 전형적인 항체 용량의 범위는 전신 적용인 경우, 100 ㎍ 내지 1 g, 국소 적용인 경우, 1 ㎍ 내지 1 mg이 될 것이다. 초기에는 고용량의 부하 용량으로, 이어서, 1회 이상의 더용량으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 항체는 전체 항체, 예컨대, IgG1 이소형일 것이다. 상기는 성인 환자의 1회 치료용 용량이며, 이는 영유아에 대하여는 비례적으로 조정될 수 있고, 이는 또한 분자량에 비례하여 다른 항체 포맷으로 조정될 수 있다. 치료는 의사의 재량에 따라 매일, 매주 2회씩, 매주 또는 1개월 간격으로 반복될 수 있다. 치료는 피하 투여에 대해서는 매 2 내지 4주 마다, 정맥내 투여에 대해서는 매 4 내지 8주 마다 이루어질 수 있다. 치료는 주기적이며, 투여 사이의 기간은 약 2주 이상, 예컨대, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 또는 약 월 1회이다. 치료는 외과 수술 이전 및/또는 이후에 이루어질 수 있고/거나, 외과적 치료의 해부학적 부위에 직접적으로 수행되거나 적용될 수 있다.
본 발명의 다양한 추가의 측면 및 실시양태는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에서 언급된 데이터베이스 참조 및 수탁 번호, 특허, 특허 출원 및 공개 문헌을 비롯한 모든 문헌은 그의 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 "및/또는"은 2가지 명시된 특징 또는 성분들 각각이 다른 것과 함께, 또는 다른 것은 포함하지 않고 구체적으로 개시되는 것으로서 이해되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"란 마치 각각이 본원에서 개별적으로 기재된 것과 같이, (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B가 각각 구체적으로 개시되는 것으로서 이해되어야 한다.
문맥상 달리 언급하지 않는 한, 상기 기재된 특징에 관한 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 측면 또는 실시양태로 제한되지 않으며, 이는 기술된 모든 측면 및 실시양태에 동등하게 적용된다.
이제, 단지 일례로서, 및 첨부된 도면 및 표를 참고로 하여 본 발명의 특정 측면 및 실시양태를 예시할 것이다.
실시예
실시예 1
항18 항체 생성 및 리드 선별
1.1 재조합 인간 IL -18 항원의 발현 및 정제
박테리아 발현을 위해 인간 IL-18(유니프로트 엔트리 Q14116-1; 서열 번호 169)을 pET 21a 벡터(노바겐(Novagen)) 내로 클로닝하고, E. 콜라이 BL21 DE3*에서 발현시켰다. 인자 Xa 절단 부위와 함께 N 말단 GST 태그, 히스티딘 태그(8xHis)를 포함하는 구성물을 실험실에서(in-house) 생성하였다. 가용성 발현 후, 표준 친화도 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제한 후, 인자 Xa 절단 및 크기 배제 정제를 수행함으로써 생물학상 활성인 인간 IL-18을 생성하였다.
인간 IL-18의 바쿨로바이러스 발현을 위해, N 말단 Flag 태그 및 히스티딘 태그를 가지도록 구성물을 디자인하였다. 구성물을 pDONR221(인비트로겐(Invitrogen: 영국 페이즐리)) 내로 클로닝하고, 곤충 세포에서의 발현을 위해 제조사의 설명서에 따라 목적(destination) 벡터 pDEST8(인비트로겐: 영국 페이즐리)로 옮겨 놓았다. 표준 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 기법에 의해 단백질을 정제하였다.
EZ-연결 비오틴(Biotin)-BMCC 시약(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific: 미국 뉴욕주 로체스터); 카탈로그 번호 21900)을 사용하여 유리 시스테인 상의 SH 기를 통해 IL-18의 비오티닐화를 수행하였다.
1.2 선별
사상성 파지 M13 에 기초한 파지미드 벡터 내로 클로닝된 나이브 인간 단일 쇄 Fv(scFv) 파지 디스플레이 라이브러리를 선별에 사용하였다(문헌 [Vaughan et al., (1996) Nature Biotechnology 14 (3):309-14]; [Lloyd et al., (2009) Protein Eng Des Sel. (3):159-68]; [Hutchings et al., (2001) Generation of Naive Human Antibody Libraries, in Antibody Engineering, Ed. by R. Kontermann & S. Dubel, Springer Laboratory Manuals, Berlin, p93]; [Groves et al., (2006) J Immunol Methods. 313(1-2): 129-39]). 본질적으로는 앞서 문헌 [Vaughan et al., ((1996) Nature Biotechnology 14 (3) :309-14)] 및 [Hawkins et al., ((1992) Journal of Molecular Biology 226, 889-896)]에 기술되어 있는 바와 같이, 재조합 인간 IL-18(메디컬 앤드 바이얼라지컬 라보라토리즈 컴퍼니(Medical and Biological Laboratories Co.: 일본 나고야)) 상에서 일련의 선별 사이클을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리로부터 항IL-18 특이 scFv 항체를 단리시켰다. 간략하면, 1회차 패닝 선별을 위해, 사전에 4℃에서 밤새도록 눈크 맥시소르프(Nunc maxisorp) 마이크로타이터 플레이트(써모 피셔 사이언티픽(미국 뉴욕주 로체스터); 카탈로그 번호 439454)의 웰에 흡착된 래트 항 IL-18 모노클로날 항체, 클론159-12B(메디컬 앤드 바이얼라지컬 라보라토리즈(Medical and Biological Laboratories: 일본); 카탈로그 번호 D045-3)에 의해 특이적으로 둘베코스 포스페이트 완충제 염수(DPBS: Dulbecco's phosphate buffer saline(pH 7.4)) 중의 인간 IL-18을 포획하였다. 웰을 PBS로 세척한 후, 1시간 동안 PBS-마벨(Marvel)(3% w/v)로 차단하였다. 4배 과량의 포획 항체인 래트 항IL-18 모노클로날 항체를 함유하는, PBS-마벨(3% w/v) 중 정제된 파지를 1시간 동안 선별 해제 플레이트의 웰(맥시소르프 마이크로타이터 플레이트의 웰상에 흡착된 래트 항IL-18 모노클로날 항체)에 첨가한 후, 코팅된 항원(재조합 인간 IL-18)에 결합할 수 있도록 1시간 동안 두었다. PBS-트윈(0.1% v/v) 및 PBS를 사용하여 일련의 세척 사이클에 의해 비결합 파지를 제거하였다. 결합된 파지 입자를 용리시키고, E. 콜라이 TGI 박테리아 내로 감염시키고, 다음 회차의 선별을 위해 구제하였다(문헌 [Vaughan et al., (1996) Nature Biotechnology 14 (3): 309-314]). 파지 입자를 100 nM 비오티닐화된 IL-18과 인큐베이션시켜 제2회차 선별을 용액 중에서 수행한 후, 상기 기술된 바와 같이, 제3회차 래트 항 IL-18 모노클로날 항체 포획 선별을 수행하였다.
1.3 비정제된 scFv 에 의한 IL -18 수용체 알파 및 베타 쇄에의 IL -18 결합 억제
인비젼(Envision) 플레이트 판독기(퍼킨 엘머(미국 매사추세츠주 보스톤))를 사용하여 균질 시간 분해 형광(HTRF™, 시스 바이오인터내셔널) 수용체-리간드 결합 검정법으로 주변세포질 표본으로부터의 비정제된 scFv를 스크리닝하였다. PBS(pH 8) 중의 트리스비피리딘-Eu3+-크립테이트-NHS(시스 바이오인터내셔널(프랑스 바뇰 쉬르 세즈); 카탈로그 번호 65EUSABA)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 인간 IL-18R 알파 쇄([IL-18Rα]; R&D 시스템즈(R&D Systems: 미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 816-LR)의 유로피움 크립테이트 표지화를 달성하였다. PBS(pH 8) 중의 EZ 연결 술포-NHS-LC-비오틴(써모 피셔 사이언티픽(미국 뉴욕주 로체스터); 카탈로그 번호 21335)을 사용하여 유리 아민을 통해 인간 IL-18R 베타 쇄([IL-18Rβ]; R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 118-AP)를 비오티닐화시켰다. HTRF™ 검정법에서, 비정제된 scFv 시료는 인간 재조합 IL-18의 그의 수용체에 대한 결합 상호작용에 대해 유로피움 크립테이트 표지화된 인간 IL-18Rα 및 비오티닐화된 인간 IL-18Rβ와 경쟁하였다. 50 mM MOPS 완충제(pH 7.4), 0.5 mM EDTA 및 0.5 M 소르비톨 중에서 제조된, scFv를 함유하는 비정제된 박테리아 주변세포질 추출물로서 선별 결과물을 스크리닝하였다. 5 ㎕의 비정제된 scFv 시료를 코스타(Costar)® 384 웰 검정용 플레이트(코팅(Corning: 미국 매사추세츠주 로웰), 카탈로그 번호 77776-818)에 첨가하였다. 이어서, 5 ㎕의 6 nM 재조합 인간 IL-18(실험실내 E. 콜라이 유래)을 첨가한 후, 10 nM 비오티닐화된 IL-18Rβ, 2.5 nM 유로피움 크립테이트 표지화된 IL-18Rα 및 30 nM 스트렙트아비딘 엑슬런트 !(Xlent !)(시스 바이오인터내셔널(프랑스 바뇰 쉬르 세즈); 카탈로그 번호 611SAXLB)를 함유하는 혼합물 10 ㎕를 첨가하였다. 주변세포질 추출물 대신 최종 농도 5 nM의 대조군 마우스 모노클로날 항인간 IL-18 항체(메디컬 & 바이얼라지컬 라보라토리즈 컴퍼니(일본 나고야); 클론 125-2H)를 사용하여 비특이적 결합을 측정하였다. 0.4 M KF 및 0.1% BSA를 함유하는 PBS(검정용 완충제) 중에서 모든 희석을 수행하였다. 검정용 플레이트를 실온에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 320 nm에서 유로피움 분자를 여기시키고, 인비젼 플레이트 판독기(퍼킨 엘머(미국 매사추세츠주 월섬))를 사용하여 유로피움 분자에 대해 620 nm에서의 방출, 및 XL665 분자에 대해 665 nm에서의 방출 파장을 측정함으로써 시간 분해 형광을 판독하였다.
각 시료에 대한 Δ F 값(%)을 계산함으로써 데이터를 분석하였다. Δ F는 하기 수학식 1에 따라 구하였다.
수학식 1:
Figure pct00001
이어서, Δ F 값(%)을 사용하여 수학식 2에 기술되어 있는 바와 같이 특이적 결합률(%)을 계산하였다.
수학식 2:
Figure pct00002
1.4 정제된 scFv 에 의한 IL -18 수용체 알파 및 베타 쇄에의 IL -18 결합 억제
비정제된 주변세포질 추출물과 같이, IL-18 수용체 알파 및 수용체 베타 결합 상호작용에 대하여 유의적인 억제 효과를 보인 scFv 추출물에 대한 DNA 서열 분석을 수행하였다(문헌 [Vaughan et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 309-314]; [Osbourn et al., (1996) Immunotechnology. 2, 181-196]). 독특한 서열을 가지는 scFv를 E. 콜라이에서 발현시키고, (문헌 [Bannister et al., (2006) Biotechnology and bioengineering, 94. 931-937]에 기술되어 있는 바와 같이) 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 비정제된 scFv 주변세포질 표본을 정제된 scFv로 대체하여, 섹션 1.3에 기술되어 있는 HTRF™ 검정법으로 정제된 scFv의 일련의 희석액을 테스트함으로써 scFv의 효능을 측정하였다.
섹션 1.3에 기술되어 있는 바와 같이 Δ F 값(%) 및 특이적 결합률(%)을 계산함으로써 데이터를 분석하였다. 4 파라미터 로그 방정식(수학식 3)을 사용하여 곡선을 피팅함으로써 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 이용하여 IC50 값을 구하였다.
수학식 3:
Y = 기저값 +(최고치-기저값)/(1+10exp((로그EC50-X)*기울기))
X는 로그 농도이고,
Y는 특이적 결합이다.
도 1에 도시되어 있는 바와 같이, 항체 1의 정제된 scFv 표본은 IL-18 수용체 복합체의 형성을 억제시켰으며, 여기서, IC50 값은 12 nM(n=1)이었다.
1.5 항체 1 scFv 의 IgG2 로의 리포맷팅
가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인을, 각각 전체 인간 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터 내로 서브클로닝하여 항체 1 scFv를 IgG2로 리포맷팅하였다. 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 함유하는 포유동물 발현 벡터(pEU9.2) 내로 가변 중쇄를 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG2 중쇄를 발현시켰다. 유사하게, 인간 카파 경쇄 불변 도메인 및 조절 요소로 이루어진, 발현용 포유동물 발현 벡터(pEU3.4) 내로 가변 경쇄 도메인을 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현시켰다. 중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 벡터는 본래 문헌 [Persic et al., (1997) Gene 187:9-18]에 기술되어 있다. IgG2로서 항체 1을 수득하기 위해, 중쇄 및 경쇄 IgG를 발현하는 벡터를 일시적으로 HEK293-EBNA 포유동물 세포에 형질감염시킴으로써 상기 항체가 발현되었고, 배지 내로 분비되었다. 수거된 배지를 원심분리에 의해 정화시킨 후, 정제하였다. 프로테인 A(Protein A)(GE 헬쓰케어(GE Healthcare))를 사용하여 IgG를 정제하였다. 50 mM 트리스, 0.15 M NaCl 완충제(pH 8) 중에서 사전에 평형화된 1 ml 칼럼 상에 배양물 상청액을 로딩하였다. 0.1 M 시트레이트(pH 3)를 사용하여 칼럼으로부터 직접 1 M 트리스(pH 10)로 IgG를 용리시켰다. 용출액을 NAP-10 완충제 교환 칼럼(GE 헬쓰케어)을 사용하여 1 x DPBS로 완충제 교환시켰다. 정제된 IgG를 0.2 ㎛ 멸균 여과시키고, 내독소에 대해 분석하고, SDS-PAGE에 의해 특징을 규명하고, 280 nm에서의 흡광도에 의해 농도를 측정하였다.
1.6 항체 1 IgG2 에 의한 IL -18 수용체 알파 및 베타 쇄에의 IL -18 결합 억제
상기 기술된 바와 같이, IL-18, IL-18Rα 및 IL-18Rβ 복합체 형성을 방해한 정제된 항체 1 scFv를 재조합 IgG2로 전환시켰다. 정제된 항체 1 IgG2를 연속하여 희석시키고, 섹션 1.3.에 기술된 HTRF™ IL-18 리간드-수용체 검정법으로 테스트하였다. 항체 1의 IgG2 표본이 인간 IL-18/인간 IL-18 수용체 복합체의 형성을 억제시켰고, 여기서, IC50 값은 2.9 nM(기하평균, n=2; 도 2A)이었다.
일부 실험에서, 재조합 인간 IL-18을 최종 1.5 nM의 재조합 레서스 원숭이 IL-18(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 2548-RM; 수탁 번호 AAK13416)로 대체하였다. 레서스 원숭이 IL-18의 아미노산 서열은 사이노몰구스 원숭이 IL-18과 100%의 상동성을 보여준다. 표지화된 인간 IL-18 수용체, 검출 시약 및 검정 파라미터는 섹션 1.3에 기술된 바와 같았다. 항체 1 IgG2 표본은 재조합 레서스 원숭이 IL-18/인간 IL-18 수용체 복합체 형성을 억제시켰고, 여기서, IC50 값은 5.4 nM(기하 평균, n=2; 도 2B)이었다.
1.7 항체 1 IgG2에 의한, IL-18로 자극을 받은 KG -1 세포에 의한 IFN γ 생산 억제
KG-1 세포 검정법을 사용하여 재조합 인간 IL-18의 생물학적 활성을 중화시키는 항체 1 IgG2의 효능을 확립하였다. KG-1 세포(인간 골수성 백혈병 세포주)는 IL-18Rα 및 IL-18Rβ 쇄를 발현하고, 외인성 재조합 인간 IL-18에 대한 반응으로 인터페론 감마(IFNγ)를 생산하는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Konishi et al., (1997) J. Immunol. Methods 209(2):187-191]). 5% v/v 열 불활성화된 FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신[인비트로겐 코포레이션(영국 페이즐리); 카탈로그 번호 15140-122])을 함유하는 배양 배지(IMDM [인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.: 영국 페이즐리); 카탈로그 번호 21980-032] 중 105개의 세포/100 ㎕/웰로 KG-1 세포(ECACC(영국); 카탈로그 번호 86111306)를 코스타® 96 웰 편평 바닥의, 조직 배양물로 처리된 플레이트(코닝(미국 매사추세츠주 로웰) 카탈로그 번호 3596)로 플레이팅하였다. IL-18과의 시너지 작용을 통해 IFNγ 생산을 유도하는 것으로 밝혀진, 재조합 종양 괴사 인자 알파(TNFα)(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 210-TA)를 최종 농도 1.1 nM로 첨가하였다. 항체 1 IgG2의 효능을 측정하기 위해, U자형 바닥 96 웰 폴리프로필렌 플레이트(그레이너 바이오-원(Greiner Bio-One: 오스트리아 크렘스먼스터); 카탈로그 번호 650201)에서 배양 배지 중 항체의 일련의 희석액(세포 검정법에서 최종 농도 700 nM 내지 0.1 nM)을 제조함으로써 테스트 용액을 제조하였다. 재조합 인간 IL-18(실험실내, E. 콜라이 유래)을 각 웰에 첨가하여 세포 검정법에서 최종 농도가 3 ng/ml 내지 8 ng/ml가 되도록 하였다. 1.1 nM TNFα의 존재하여 최종 농도에서 최대 IFNγ 분비를 대략 50% 정도 증가시키는 용량에 기초하여 농도를 선택하였다. 항체 1/IL-18 혼합물을 실온에서 30-45분 동안 인큐베이션시킨 후, 상기 명시된 바와 같이 제조된 KG-1 세포로 100 ㎕의 시료를 옮겨 놓았다. 습윤 대기하에 37℃/5% CO2에서 22-24 동안 세포를 인큐베이션시킨 후, 150 ㎕의 상청액을 각 웰로부터 수집하고, 하기 명시하는 바와 같이, IFNγ의 농도를 측정하였다.
간략하면, 밤새도록 눈크 검은색 96 웰 맥시소르프 플레이트(써모 피셔 사이언티픽(미국 뉴욕주 로체스터); 카탈로그 번호 437111)를 4 ㎍/ml의 포획 항IFNγ 항체(BD 바이오사이언시스 파미겐(BD Biosciences Pharmingen: 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스); 카탈로그 번호 551221; 클론 NIB42)로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBS로 세척하고, 각 웰 중 3% 분유를 함유하는 PBS(마벨) 200 ㎕로 차단함으로써 비특이적 결합을 막았다. 실온에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이션시키고, PBS로 3회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 웰을, 1/2로 희석된 실험용 시료 또는 표준 곡선 확립에 사용된 일련으로 희석된 재조합 인간 IFNγ(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 285-IF)(농도 범위 40,000-39 pg/ml) 100 ㎕로 충전시켰다. 상기 시료를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 0.01% 트윈-20을 함유하는 PBS 중에서 플레이트를 3회에 걸쳐 세척하였다. IFNγ의 플레이트에의 결합을 검출하기 위해, 100 ㎕의 비오티닐화된 항IFNγ 항체(BD 바이오사이언시스 파미겐(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스); 카탈로그 번호 554550; 클론 4S.B3)을 1 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 0.01% 트윈-20을 함유하는 PBS 중에서 플레이트를 3회에 걸쳐 세척한 후, DELFIA 검정용 완충제(퍼킨 엘머(미국 매사추세츠주 보스톤); 카탈로그 번호 4002-0010) 중에서 1/1,000으로 희석된 100 ㎕의 델피아(DELFIA)® Eu로 표지된 스트렙트아비딘(퍼킨 엘머(미국 매사추세츠주 보스톤); 카탈로그 번호 1244-360)을 첨가하였다. 플레이트를 추가로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, DELFIA 세척액(퍼킨 엘머(미국 매사추세츠주 보스톤); 카탈로그 번호 1244-114)을 사용하여 7회에 걸쳐 세척하였다. 100 ㎕의 DELFIA 증강용 용액(퍼킨 엘머(미국 매사추세츠주 보스톤); 카탈로그 번호 4001-0010)을 각 웰에 첨가하고, 암실에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 인비젼 플레이트 판독기(퍼킨 엘머(미국 매사추세츠주 보스톤))하여 해리 증강 시간 분해 형광을 측정함으로써 각 웰에서의 반응을 측정하였다.
항체 부재하에서 IL-18로 자극을 받은 KG-1 세포에 대하여 수득된 유로피움 계수를 사용하여 실험 데이터를 정규화하고, IFNγ 방출을 50% 억제시키는 항체의 농도(IC50)를 구하였다. 4 파라미터 로그 방정식(섹션 1.4에서 수학식 3)을 사용하여 곡선을 피팅함으로써 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 IC50 값을 계산하였다.
정제된 IgG2로서 테스트되었을 때, 항체 1의 IC50은 258 nM(기하평균, n=4, 95%CI: 121-550 nM)이었다
1.8 표면 플라즈몬 공명을 사용한, 항체 1 IgG2 의 IL -18에의 결합 친화도 측정
비아코어 2000(GE 헬쓰케어) 바이오센서 장치를 사용하여 항체 1과 재조합적으로 발현된 인간 IL-18 사이의 상호작용에 관한 동력학적 파라미터를 평가하였다. 상기 실험은, 본질적으로 문헌 [Karlsson et al., (1991) J. Immunol. Methods 145 (1-2): 229-240]에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다.
바이오센서는 바이오센서 칩의 덱스트란 층에 공유적으로 부착되어 있는 리간드 분자 위로 흐르는 피분석물 분자의 상호작용으로부터 발생되는 표면 농도의 변화를 연구하기 위해 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)의 광학 효과를 이용한다. 전형적으로, 정의된 농도의 피분석물 종은 커플링된 리간드 위를 통과하고, 로컬 SPR 신호 증가로서 임의의 결합을 검출하게 된다(회합 단계). 이어서, 완충제를 유동시키는 완충제 흐름 기간으로 이어지는데, 이 기간 동안 표면에 고정화된 리간드로부터 피분석물 종의 해리가 상기 신호 감소로서 관찰될 수 있다(해리 단계). 이어서, 칩 결합 리간드로부터 남아있는 피분석물을 제거할 수 있고, 여러 상이한 농도의 피분석물을 이용하여 상기 절차를 반복할 수 있다. 커플링된 리간드의 절대 결합능도 동력학적 프로파일도 전체 실험 기간 동안 변하지 않고, 실험 동안 계속하여 사용되는 일련의 대조군을 사용하여 모니터링될 수 있도록 실험을 디자인하였다. 전형적으로는 EDTA를 함유하는, 사유 HEPES 완충처리된 염수(HBS-EP+; GE 헬쓰케어)를 피분석물 시료에 대한 희석제 완충제로서, 해리 단계 동안의 유동 완충제로서 사용하였다. 실험 데이터는 '공명 단위'(RU: Resonance Unit)로서 기록되는데, 이는 시간 경과에 따른 SPR 신호에 바로 상응하는 임의 단위이다. RU는 칩 표면 상의 굴절률 변화에 정비례하며, 이는 다시 결합된 피분석물 질량의 대략적인 측정값에 해당한다. 이어서, 사유 BIA이밸류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어 팩키지를 사용하여 데이터를 처리하고, 결합 모델을 데이터 세트에 피팅할 수 있다. 회귀되는 회합(ka; M-1s-1) 및 해리(kd; s-1) 속도 상수를 통해 해리(KD; M) 친화도 상수를 계산할 수 있다.
항체가 대략 600 RU의 최종 표면 밀도로 사유 CM3 칩 표면에 아민 연결부에 의해 공유적으로 커플링되어 있는 것인 검정법을 사용하여 항체 1 IgG2와 IL-18 피분석물 사이의 결합 친화도를 예측하였다. 항체에 결합된 IL-18을 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2)의 쌍을 이룬 15 s간의 주입에 의해 사이클 중간에 칩 표면을 재생시켰다. 재생에 의한 항체 결합 활성의 유의적인 손실은 없었다.
확실하게 1:1 결합 모델로 피팅될 수 있는 센서그램을 관찰하기 위하여 충분한 시간 동안 재조합 인간 IL-18의 일련의 희석액(0.4-200 nM)을 순차적으로 항체 1 IgG2 상에 통과시켰다. 각 IgG 데이터세트로부터 블랭크 참조 플로우 셀 데이터를 감산하고, 농도가 0인 완충제 블랭크를 주된 데이터 세트로부터 이중 참조 감산하여 임의의 완충제 아티팩트 또는 (최소) 비특이적 결합 효과를 감소시켰다. 이어서, BIA이밸류에이션 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델을 동시에 각 피분석물 적정으로부터의 데이터로 피팅하였다.
그의 최소 허용값은 각각 < 2 및 > 100인 것으로 제한되는, 계산된 Chi2 및 T 값(파라미터 값/오프셋)을 사용하여 데이터의 유효성을 평가하였고, 잔차 (< 2 RU)를 사용하여 피트의 전반적인 성공 여부에 대해 평가하였다.
피분석물로서 재조합 인간 IL-18을 사용하였을 때, 항체 1 IgG2 회합 속도(Ka), 해리 속도(Kd) 및 친화도 상수(KD)는 각각 7.35 x 105 M-1s-1, 7.32 x 10-3s-1 및 9.96 nM이었다.
1.9 표면 플라즈몬 공명 바이오센서를 사용한 항체 1 IgG2 의 결합 특이성 분석.
비아코어 2000 바이오센서 장치(GE 헬쓰케어)를 사용하여 항체 1 IgG2와, 다양한 재조합적으로 발현된 IL-18 단백질 및 IL-18과 생물학적으로 관련된 단백질 사이의 상호작용의 특이성을 평가하였다.
항체 1이 대략 600 RU의 최종 표면 밀도로 CM3 칩 표면에 아민 연결부에 의해 공유적으로 커플링되어 있는 것인 검정법을 사용하여 항체 1과 피분석물 단백질 사이의 결합 상호작용을 분석하였다. 전기영동용 완충제 중에 희석된 200 nM의, 재조합 인간 IL-18, 레서스 원숭이 IL-18(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 2548-RM), 래트 IL-18(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 521-RL- 025), 인간 IL-1베타(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 201-LB) 또는 인간 IL-1F7/FIL1제타(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 1975-IL-025) 용액을 칩 표면 상에 주입하였다. 이후, 항체에 결합된 IL-18을 제거하기 위해 10 mM 글리신(pH 2)의 쌍을 이룬 주입에 의해 사이클 중간에 칩 표면을 재생시켰다.
항체 1에 제공되는 단백질 중, IgG는 오직 인간 및 레서스 원숭이 IL-18에만 선택적으로 결합하는 것으로 관찰되었다. 재조합 래트 IL-18, 인간 IL-1베타 또는 인간 IL-1F7/FIL1제타, 어느 것에서도 유의적인 결합은 관찰되지 않았다.
1.10 IL -18 결합 단백질 에피토프 경쟁 검정법에서의 항체 1의 특징 규명
항체 1이 인간 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)의 인간 IL-18에의 결합을 억제시킬 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 에피토프 경쟁 검정법을 개발하였다. scFv의 경우, 4,893 nM 내지 41.4 pM 범위로, IgG2의 경우, 987 nM 내지 16.8 pM 범위로 하여 정제된 scFv 또는 IgG2로서 항체의 희석액 시리즈를 제조하였다. 각각의 희석액 10 ㎕씩을 코스타® 384 웰 검정용 플레이트(코닝(미국 매사추세츠주 로웰) 카탈로그 번호 3676)로 옮겨 놓았다. 별도로, 1.73 nM 크립테이트 표지화된 항FLAG 항체(시스 바이오인터내셔널(프랑스 바뇰 쉬르 세즈); 카탈로그 번호 61FG2KLB)를, FLAG 및 His 태그를 포함하는, 3.2 nM의 바쿨로바이러스에 의해 생산된 IL-18(실험실내)과 조합하였다. 5 ㎕의 상기 혼합물을 항체 1 scFv 또는 IgG2와 함께 검정용 플레이트에 첨가하였다. PBS(pH 8) 중의 EZ 연결 술포-NHS-LC-비오틴(써모 피셔 사이언티픽(미국 뉴욕주 로체스터); 카탈로그 번호 21335)을 사용하여 유리 아민을 통해 인간 IL-18BPa-Fc(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 119BP)를 비오티닐화시켰다. 0.8 nM의 비오티닐화된 IL-18BPa-Fc를 20 nM 스트렙트아비딘 엑슬런트 !(시스 바이오인터내셔널, 카탈로그 번호 611SAXLB)와 조합하고, 5 ㎕의 상기 용액을 검정용 플레이트에 첨가하였다.
최종 농도 25 nM의 (실험실내에서 생성된) 인간 IL-18을 사용하여 비특이적 결합을 정의하였다. 0.4 M KF 및 0.1% BSA를 함유하는 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)(검정용 완충제) 중에서 모든 희석을 수행하였다.
검정용 플레이트를 실온에서 4시간 동안, 이어서, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 인비젼 플레이트 판독기(퍼킨 엘머(미국 매사추세츠주 보스톤))를 사용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서의 시간 분해 형광을 판독하였다. 섹션 1.3 및 1.4에 기술되어 있는 바와 같은 수학식을 사용하여 결과를 계산하였다.
정제된 scFv 항체 1의 표본은 2,446 nM에서 평균 86% 정도 억제시켰다. 항체 1의 IgG2 표본은 상기 검정법에서 493 nM에서 평균 68% 정도 억제시켰다(도 3).
실시예 2
항체 최적화
2.1 표적화된 돌연변이 유발에 의한 항체 1의 최적화
표적화된 돌연변이 유발 접근법 및 친화도 기반 파지 디스플레이 선별법을 사용하여 인간 및 레서스 원숭이 IL-18, 둘 모두에 대하여 개선된 친화도를 가지도록 항체 1을 최적화시켰다. 문헌 [Clackson and Lowman (2004) A Practical 접근법, 2004. Oxford University Press]에 기술되어 있는 것과 같은 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 중쇄 가변(VH) 및 경쇄 가변(VL) 상보성 결정 영역 3(CDR3: complementarity determining regions 3)의 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발에 의해 항체 1로부터 유래된 큰 scFv-파지 라이브러리를 생성하였다.
재조합 인간 및 레서스 원숭이의 IL-18 형태에 대하여 더 높은 친화도를 가지는 변이체를 선별하기 위해 라이브러리에 대하여 친화도 기반 파지 디스플레이 선별을 수행하였다(문헌 [Thompson (1996) Journal of Molecular Biology 256:77-88]). 간략하면, scFv 파지 입자를 용액 중 재조합 비오티닐화된 재조합 인간 IL-18(바이오-huIL-18, 실험실내, E. 콜라이 유래)과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 제조사의 설명서에 따라 스트렙트아비딘 코팅된 상자성 비드(인비트로겐 코포레이션(영국 페이즐리); 다이나비드(Dynabeads)® M280) 상에, 항원에 결합된 ScFv-파지를 포획시켰다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이(문헌 [Osbourn e al (1996) Immunotechnology, 2 (3); 181-96]) 선별된 scFv-파지 입자를 구제하고, (3회에 걸쳐 25 nM 내지 500 pM인) 농도를 감소시켜 가면서 비오티닐화된 인간 IL-18의 존재하에 선별 과정을 반복하였다. 상기 과정을 통해 생화학적 에피토프 경쟁 검정법(섹션 2.3) 및 KG-1 세포 검정법(표 1)에서 효능이 개선된 항체 2, 항체 3, 항체 4 및 항체 5가 단리되었다.
이어서, 3회에 걸친 친화도 기반 선별 완료시, VH 및 VL 무작위화된 라이브러리를 재조합하여, 클론이 무작위적으로 쌍을 이루는, 개별적으로 무작위화된 VH 및 VL 서열을 포함하는 단일 라이브러리를 형성하였다. 추가로 3회에 걸쳐 (500 pM 내지 20 pM인) 농도를 감소시켜 가면서 비오티닐화된 인간 IL-18의 존재하에서 상기 기술된 바와 같이 선별을 계속 수행하여 개선된 클론 항체 6 및 항체 7을 단리시켰다.
2.2 무작위 돌연변이 유발에 의한 리드 항체의 최적화
재조합 인간 및 레서스 원숭이 IL-18에의 결합을 개선시킬 수 있는 것인, scFv 가변 도메인 내의 중요한 잔기를 확인하기 위하여 무작위 돌연변이 유발 접근법을 사용하여 항체 6 및 항체 7을 추가로 최적화시켰다. 항체 6 및 7의 가변 영역 전역에 걸쳐 무작위 돌연변이를 도입함으로써 큰 scFv-리보솜 디스플레이 라이브러리를 작성하였다. 이는 돌연변이 유발 1회당 핵산 서열 1 킬로베이스에 대하여 평균 8.1개의 돌연변이를 혼입하기 위해 제조사의 지침서에 따라 어 다이버시파이(A Diversify)™ PCR 무작위 돌연변이 유발용 키트(BD 바이오사이언시스(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스); 카탈로그 번호 630703))를 사용하여 2회의 돌연변이 유발을 통해 달성하였다.
선별은 본질적으로 앞서 기술된 바와 같이(문헌 [Hanes et al., (2000) Methods in Enzymology 328:404-430]) 수행하였다. 간략하면, 표적화된 CDR3 무작위화 전략법으로부터 확인된 2개의 리드 클론(항체 6 및 항체 7)의 무작위 돌연변이 유발 라이브러리를 mRNA로 전사시킨 후, 풀링하여 1개의 라이브러리를 형성하였다. 정지된 번역 과정을 사용하여, mRNA-리보솜-scFv 복합체를 형성하였다(문헌 [Hanes J and Plueckthun A. (1997) Proc Natl Acad Sci U. S. A. 1997 May 13; 94(10): 4937-42]). 이어서, (3회에 걸쳐 1 nM 내지 30 pM인) 농도를 감소시켜 가면서 비오티닐화된 인간 IL-18 또는 비오티닐화된 레서스 원숭이 IL-18의 존재하에서 인큐베이션시킨 후, 상기 복합체를 3회에 걸쳐 선별함으로써 인간 및 레서스 원숭이의 IL-18 형태, 둘 모두에 대하여 더 높은 친화도를 가지는 변이체를 선별하였다. 이어서, 스트렙트아비딘 코팅된 상자성 비드(다이나비드™) 상에, 항원에 결합된 상기 복합체를 포획시켰다. 비특이적 리보솜 복합체를 세척해 내고, 결합된 리보솜 복합체로부터 mRNA를 단리시키고, cDNA로 역전사시킨 후, PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 DNA를 다음 회차의 선별을 위해 사용하고/거나, 스크리닝을 위해 클로닝하였다. 리보솜 디스플레이에 의해 단리된 ScFv를 리보솜 디스플레이 구성물의 NcoI/NotI 제한 엔도뉴클레아제 분해(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs: 미국 매사추세츠주 입스위치)에 의해 파지미드 벡터 pCANTAB6으로 클로닝한 후, T4 DNA 리가제(뉴 잉글랜드 바이오랩스(미국 매사추세츠주 입스위치))를 사용하여 NcoI/NotI 분해된 pCANTAB6으로 결찰시켰다(문헌 [McCafferty et al., (1994) Appl. Biochem. Biotech. 47:157-171]).
상기 최적화 전략법을 통해 개선된 클론 항체 9 및 항체 10을 단리시킬 수 있었다.
부위 지정 돌연변이 유발에 의해 항체 7, 항체 9 및 항체 10에 추가의 점 돌연변이를 도입함으로써 항체 8 GL, 항체 11, 항체 11 GL 및 항체 12 GL을 얻었다. 상기 점 돌연변이는 HCDR1(Ser31Ala) 및 HCDR2(Ile51Leu, Ser65Gly)에서 이루어졌다.
2.3 에피토프 경쟁 검정법을 사용한 개선된 클론 확인
섹션 2.1에 기술된 표적화된 돌연변이 유발 접근법으로부터 2회차 및 3회차 선별로부터 무작위로 선별된 880개의 scFv를 박테리아에서 발현시키고, 비정제된 scFv를 에피토프 경쟁 HTRF™ 검정 포맷으로 스크리닝하였다. 상기 검정법에서, 비정제된 scFv는 유로피움 크립테이트 표지화된 인간 IL-18(실험실내)에의 결합하에 대하여 항체 1 IgG2와 경쟁하였다. 중성 pH의 PBS 중 트리스비피리딘-Eu3+-크립테이트-4-카복시-4'-(말레이미도프로피온아미도-2-아미노에틸-아미노카보닐)(시스 바이오인터내셔널(프랑스 바뇰 쉬르 세즈); 카탈로그 번호 65EUMABA)을 사용하여 재조합 인간 IL-18의 유로피움 크립테이트 표지화를 달성하였다. 50 mM MOPS 완충제(pH 7.4) 중에서 제조된 비정제된 scFv, 0.5 mM EDTA 및 0.5 M 수크로스를 함유하는 비희석된 또는 희석된 주변세포질 추출물로서 선별 결과물을 스크리닝하고, 0.4 M KF 및 0.1% BSA를 함유하는 포스페이트 완충처리된 염수(PBS)(검정용 완충제) 주에 희석하였다. 24 nM의 항체 1 IgG2 및 30 nM의 항인간 Fc XL665(시스 바이오인터내셔널(프랑스 바뇰 쉬르 세즈); 카탈로그 번호 61HFCXLA)를 함께 검정용 완충제 중에 희석하였다. 상기 용액 10 ㎕를 코스타® 384 웰 검정용 플레이트(코팅(미국 매사추세츠주 로웰), 카탈로그 번호 3676)로 옮겨 놓았다. 5 ㎕의 비정제된 scFv를 검정용 플레이트에 첨가한 후, 유로피움 크립테이트 표지화된 재조합 인간 IL-18을 1.2 nM로 희석하였다. 모노클로날 마우스 항인간 IL-18 클론125-2H(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스)를 20 nM의 최종 농도로 사용하여 비특이적 결합을 측정하였다. 검정용 플레이트를 실온에서 3시간 동안 인큐베이션시킨 후, 섹션 1.3에 기술되어 있는 바와 같이, 인비젼 플레이트 판독기(퍼킨 엘머(미국 매사추세츠주 보스톤))를 사용하여 620 nm 및 665 nm 방출 파장에서의 시간 분해 형광을 판독하였다. 섹션 1.3에 기술되어 있는 바와 같은 수학식을 사용하여 데이터를 특이적 결합률(%)로서 계산하였다. 항체 1 IgG2가 IL-18에 결합하지 못하도록 하면서, 유의적인 억제 특성을 보인 scFv의 DNA 서열을 분석하고, 독특한 서열을 가지는 scFv를 정제된 표본으로서 제조하였다.
동일한 조건을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 항체 IgG2 에피토프 경쟁 검정법으로 정제된 scFv 표본의 희석액 시리즈를 테스트함으로써 정제된 scFv 항체의 효능을 측정하였다. 항체 2, 항체 3, 항체 4 및 항체 5의 정제된 scFv 표본이 항체 1 IgG2와 유로피움 크립테이트 표지화된 IL-18 사이의 상호작용을 억제시켰는데, 여기서, IC50 값은 각각 0.5, 0.6, 0.6 및 0.17 nM이었다(n=1).
재조합 표적화된 돌연변이 유발 선별 후의 스크리닝은 상기 기술된 것과 동일한 에피토프 경쟁 검정법을 사용하였는데, 단, 예외적으로 유로피움 크립테이트 표지화된 IL-18 농도는 0.2 nM의 최종 검정 농도로 감소시켰다. 상기 검정법을 사용하여 개선된 클론을 확인하고, 섹션 2.4에 기술된 바와 같이 KG-1 기능적 세포 검정법에서 직접 프로파일링을 위해 계속 진행시켰다. 상기 접근법으로부터 항체 6 및 항체 7이 개선된 scFv인 것으로 확인되었다. 상기 리드 항체를 추가로 최적화시키기 위해, 섹션 2.2에 기술된 바와 같이 무작위 돌연변이 유발 접근법을 진행하였다.
무작위 돌연변이 유발 선별로부터의 scFv를 박테리아에서 발현시키고, 비정제된 scFv를 HTRF™ 에피토프 경쟁 검정 포맷으로 스크리닝하였다. 상기 검정법을 통해 배선화된(GL) 항체 6 IgG2(IgG의 배선화는 섹션 2.7에 기술되어 있다)에 결합하지 못하도록 유로피움 크립테이트 표지화된 IL-18을 억제시킬 수 있는 비정제된 scFv의 능력에 관하여 테스트하였다. 상기 기술된 것과 동일한 포맷을 사용하였는데, 단, 예외적으로 항체 1 IgG2를 최종 농도 12 nM의 항체 6 GL IgG2로 대체하고, 유로피움 크립테이트 표지화된 재조합 인간 IL-18을 0.2 nM의 최종 농도로 사용하였다. 상기 검정법에서 비특이적 결합을 정의하기 위해, 항체 6 GL IgG2를 대조군 웰로부터 누락시켰다.
무작위 돌연변이 유발 선별의 스크리닝으로부터 확인된 히트에 대해 순위를 매기고, 최상의 scFv의 서열을 분석하고, 정제하였다. scFv의 효능을 측정하기 위해, 정제된 scFv의 희석액 시리즈를 상기 기술된 항체 6 GL IgG2 에피토프 경쟁 검정법으로 테스트하였다. 정제된 항체 9 및 항체 10 표본은 항체 6 GL IgG2와 유로피움 크립테이트 표지화된 재조합 인간 IL-18 사이의 상호작용을 억제시켰으며, 여기서, IC50 값은 각각 5.2 및 5.7 nM(n=1)(도 4)이었다.
2.4 최적화된 클론( scFv )에 의한, IL-18로 자극을 받은 KG -1 세포에 의한 IFN γ 생산 억제
효능제로서 인간 및 레서스 원숭이 IL-18을 사용하는 IFNγ 방출 KG-1 세포 검정법으로 표적화된 돌연변이 유발 및 무작위 돌연변이 유발에 의해 생성된 정제된 최적화된 scFv 항체의 효능 또한 측정하였다. 검정법은 섹션 1.7에 기술되어 있는 바와 같이 설정하였다. 일부 실험에서는 인간 IL-18을 재조합 레서스 원숭이 IL-18(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 2548-RM/CF)로 대체하였고, 이를 최종 농도 4 ng/ml로 사용하였다. scFv의 최종 농도 범위를 100 nM 내지 0.03 nM로 하여 테스트하였다. 정제된 scFv 항체에 대한 예시적인 효능은 하기 표 1에서 제공한다. 항체 7, 항체 9 및 항체 10 scFv에 대한 대표적인 데이터는 도 5에 제시되어 있다.
2.5 scFv 의 IgG2 및 IgG1TM 으로의 리포맷팅
가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인을, 각각 전체 인간 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터 내로 서브클로닝하여 scF를 IgG2로 리포맷팅하였다. 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 함유하는 포유동물 발현 벡터(pEU9.2) 내로 가변 중쇄를 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG2 중쇄를 발현시켰다. 유사하게, 인간 카파 경쇄 불변 도메인 및 조절 요소로 이루어진, 발현용 포유동물 발현 벡터(벡터 pEU3.4) 내로 가변 경쇄 도메인을 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현시켰다. IgG2로서 항체를 수득하기 위해, 중쇄 및 경쇄 IgG를 발현하는 벡터를 일시적으로 HEK293-EBNA 포유동물 세포에 형질감염시킴으로써 상기 항체가 발현되었고, 배지 내로 분비되었다. 수거된 배지를 원심분리에 의해 정화시킨 후, 정제하였다. 프로테인 A(GE 헬쓰케어)를 사용하여 IgG를 정제하였다. 50 mM 트리스, 0.15 M NaCl 완충제(pH 8) 중에서 사전에 평형화된 1 ml 칼럼 상에 배양물 상청액을 로딩하였다. 0.1 M 시트레이트(pH 3)를 사용하여 칼럼으로부터 직접 1 M 트리스(pH 10)로 IgG를 용리시켰다. 용출액을 NAP-10 완충제 교환 칼럼(GE 헬쓰케어)을 사용하여 1 x DPBS로 완충제 교환시켰다. 정제된 IgG를 0.2 ㎛ 멸균 여과시키고, 내독소에 대해 분석하고, SDS-PAGE에 의해 특징을 규명하고, 280 nm에서의 흡광도에 의해 농도를 측정하였다.
항체 12 GL을 또한 불변 도메인 내에 3개의 단일 아미노산 치환(TM)을 함유하는 인간 IgG1 이소형으로 전환시켰다([IgG1TM]; 문헌 [Oganesyan et al., (2008) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64 (Pt 6):700-4]). 간략하면, IgG 경쇄 유전자는 항체 가변 도메인 서열에 융합된 분비 리더 서열 및 인간 카파 Km3 불변 도메인 서열로 만들어졌다. IgG 중쇄 유전자는 TM 변형을 포함하는 인간 감마 1(f) 불변 도메인 서열과 함께, 항체 가변 도메인에 융합된 분비 리더 서열로 만들어졌다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서의 고수준의 발현을 위해 경쇄 및 중쇄 유전자를 코딩하는 DNA 서열을 최적화한 후(서열 번호 170 및 171 참조)(진아트 아게(Geneart AG: 독일 레겐스부르크)), 각각 발현 카세트 벡터, pEE12.4 및 pEE6.4(론자 바이얼라지스(Lonza Biologies: 영국 슬라우) 내로 DNA를 클로닝하였다. 이어서, 그의 측면에 전사 조절 서열을 포함하는 항체 중쇄 유전자를 항체 경쇄 플라스미드 내로 삽입하여 이중 항체 유전자, 탠덤 벡터(pCLD-1128)를 형성하였다(도 15 참조). pCLD-1128 플라스미드를 선형화시키고, 화학적으로 규명된 배지(CD-CHO; 인비트로겐(영국 페이즐리)) 중 현탁 배양물 중에서 성장하도록 사전에 적합화된 CHO 숙주 세포주, CHOK1SV(론자 바이얼라지스)로 형질감염시켰다. 메티오닌 술폭시민을 함유하는 글루타민 무함유 CD-CHO에서의 성장에 의해 CHO 게놈 내로 통합된 pCLD-1128 플라스미드 카피를 함유하는 형질감염체를 선별하였다.
고수율로 항체를 발현하는 풀을 선별하고, 확장시켜 유가식 생산 배양물에 접종하였다. 접종 후 대략 14일 정도 경과하였을 때, 배양 수확물을 원심분리 및/또는 여과에 의해 정화하여 세포 및 세포 파편을 제거하였다. 이어서, 단백질 A 친화도 크로마토그래피, 이어서, 적합한 완충제로의 PD10 완충제 교환에 의해 생성된 배양물 상청액으로부터 항체를 회수하였다.
2.6 최적화된 클론( IgG )에 의한, IL -18로 자극을 받은 KG -1 세포에 의한 IFN γ 생산 억제
KG-1 세포 검정법에서 가장 강력한 효능을 가진 scFv 클론을 상기 기술된 바와 같이(섹션 2.5) IgG로 전환시키고, 최종 농도 범위를 20 nM 및 0.002 nM로 하여 상기 세포 검정법으로 다시 테스트하였다. 정제된 IgG 항체에 대한 예시적인 효능은 하기 표 2에서 제공한다.
2.7 배선화
항체 1 및 친화도 최적화된 항IL-18 항체의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 VBASE 데이터베이스 중의 공지된 인간 배선 서열에 대하여 정렬하고(문헌 [Tomlinson (1997) Journal of Molecular biology 224:487-499]), 서열 유사성에 의해 가장 유사한 배선을 확인하였다. 최적화된 항체 계통의 VH 도메인의 경우, 이는 Vh4_DP-66_(4-61)이었다. VL 도메인의 경우, 이는 Vκ1_L12였다. 변이없이 그대로 유지된 버니어 잔기를 제외하면(문헌 [Foote & Winter (1992) J Mol Biol. 224(2): 487-99]), 배선화 과정은 인간 항체와 동일하게 매치되도록 VH 및 VL 도메인 중의 골격 잔기를 가장 유사한 배선 서열로 복귀시키는 것으로 이루어졌다. 제조된 모든 항체의 VH 및 VL 도메인 서열은 하기 표 12 및 13에 제시되어 있다. 상기 아미노산 잔기의 배선화는 적절한 돌연변이 유발성 프라이머와 함께 표준 부위 지정 돌연변이 유발 기법을 이용하여 수행하였다. 이어서, 무작위 돌연변이 유발 전략법으로부터 CDR 내로 도입된 변이를 전체적으로 배선화된 골격 내로 도입하였다. 이어서, IgG2 또는 IgG1TM 포맷의 배선화된 항체를 KG-1 세포 검정법으로 재평가함으로써 효능상의 유의적인 감소는 없었다는 것을 확인하였다. 배선화된(GL) 항체에 대한 예시적인 효능은 하기 표에서 제공한다. 항체 8 GL, 항체 11 GL 및 항체 12 GL IgG에 대한 대표적인 데이터는 도 6에 제시되어 있다.
2.8 배선화된 최적화된 클론( IgG )에 의한, LPS 및 IL-12에 의해 자극을 받은 인간 PBMC에 의한 IFN γ 생산 억제
재조합 인간 및 레서스 원숭이 IL-18을 억제시키는 그의 효능 뿐만 아니라, 내인적으로 생산된 IL-18을 중화시킬 수 있는 그의 능력에 대하여 배선화된 IgG를 테스트하였다. 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)를 인간 연막 혈액 또는 사이노몰구스 원숭이 혈액으로부터 정제하고, LPS(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트루이스); 카탈로그 번호 L-6143) 및 재조합 인간 IL-12(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 219-IL)로 자극하여 IL-18 의존 기전을 통해 IFNγ를 방출하도록 유도하였다. 내인성 IL-18을 길항시키고, 그 결과로서 IFNγ 생산을 차단시킬 수 있는 최적화된 배선화된 IgG의 능력을 상기 검정법으로 평가하였다. 간략하면, 10% v/v 열 불활성화된 FBS[SAFC 바이오사이언시스; 카탈로그 번호 12076C], 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신[인비트로겐 코포레이션(영국 페이즐리); 카탈로그 번호 15140-122])을 함유하는 배양 배지(RPMI-1640[인비트로겐 코포레이션(영국 페이즐리); 카탈로그 번호 61870-010] 중에서 10분 동안 300 g로 원심분리함으로써 PBMC를 세척하였다. PBMC를 배양 배지 중에 재현탁시키고, (항체 8 GL IgG2, 항체 11 GL IgG2 및 항체 12 GL IgG2의 평가를 위해서) 4 x 105개의 세포/100 ㎕/웰로, 또는 (항체 12 GL IgG1TM의 경우에는) 2 x 105개의 세포/100 ㎕/웰로 코스타® 96 웰 편평 바닥 조직 배양물로 처리된 플레이트(코닝(미국 매사추세츠주 로웰) 카탈로그 번호 3596)에 플레이팅하였다. 최적화된 배선화된 IgG의 효능을 측정하기 위해, U자형 바닥 96 웰 폴리프로필렌 플레이트(그레이너 바이오-원(오스트리아 크렘스먼스터); 카탈로그 번호 650201)에서 배양 배지 중 IgG의 일련의 희석액(세포 검정법에서 최종 농도 2.5 pM 내지 16.7 nM)을 제조함으로써 테스트 용액을 제조하였다. PBMC를 함유하는 플레이트의 웰로 50 ㎕의 상기 용액을 옮겨 놓았다. 이어서, 내인성 IL-18의 생산을 유도하기 위해, 둘 모두의 최종 농도는 1 ng/ml인 LPS(시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스); 카탈로그 번호 L-6143) 및 재조합 인간 IL-12(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 219-IL)의 혼합물 50 ㎕를 첨가함으로써 세포를 자극하였다. 습윤 대기하에 37℃/5% CO2에서 24시간 동안 세포를 인큐베이션시킨 후, 각 웰로부터 150 ㎕의 상청액을 수집하고, 섹션 1.7에 명시되어 있는 바와 같이, IFNγ의 농도를 측정하였다.
항체 부재하에서 LPS 및 IL-12에 의해 자극을 받은 PBMC에 대하여 수득된 유로피움(Europium) 계수를 사용하여 실험 데이터를 정규화하고, IFNγ 방출을 50% 억제시키는 항체의 농도(IC50)를 구하였다. 4 파라미터 로그 방정식(섹션 1.4에서 수학식 3)을 사용하여 곡선을 피팅함으로써 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 IC50 값을 계산하였다.
상기 검정법에서 배선화된(GL) 항체에 대한 예시적인 효능은 하기 표 4에서 제공한다. 인간 및 사이노몰구스 원숭이 PBMC 기반의 검정법에서 항체 12 GL IgG1TM에 대한 대표적인 데이터는 도 7에 제시되어 있다.
2.9 항체 12 GL IgG 1 TM 에 의한 1차 호중구 상에서의 IL -18 유도성 CD11b 상향 조절 억제
CD11b는 활성화 동안 호중구 상에서 상향 조절되는 것으로 나타났다. 상기 세포는 다수의 염증성 장애에서 중요한 역할을 하며, 시험관내 IL-18 유도성 CD11b 상향 조절을 억제시킬 수 있는 항체 12 GL IgG1TM의 능력을 유세포 분석법으로 측정하였다.
건강한 인간 지원자로부터 신선한 말초 혈액을 수득하고, 동량의 2.4% 덱스트란(GE 헬쓰케어, 카탈로그 번호 17-0320-01)을 혈액에 첨가하고, 도립시켜 잘 혼합하였다. 이어서, 1시간 동안 적혈구를 침강시켰다. 이어서, 10 x PBS(인비트로겐 코포레이션(영국 페이즐리); 카탈로그 #14200059)로 퍼콜(Percoll) 9:1을 희석하여 100% 스톡 용액을 제조함으로써 불연속 퍼콜 구배(GE 헬쓰케어, 카탈로그 번호 17-0891-01)를 제조하였다. 상기 스톡 용액을 1 x PBS(인비트로겐 코포레이션(영국 페이즐리); 카탈로그 #14190)로 추가로 희석시켜 72% 용액 및 67% 용액를 제조하였다. 이어서, 72% 용액 3 ㎕를 15 ml 팔콘(Falcon)® 튜브(BD 바이오사이언시스(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스); 카탈로그 번호 352096)에 첨가하고, 62% 용액 3 ml를 72% 용액 위에 적층하였다. 적혈구 고갈 후, 적혈구가 고갈된 세포 현탁액을 15 ml 튜브 중의 62% 용액의 상단 위에 적층하였다. 브레이크를 건 상태로 20분 동안 1,138 x g로 상기 튜브를 원심분리하였다. 72%와 62% 퍼콜 사이의 계면으로부터 과립구 층을 제거하여 PBS를 함유하는 새 50 ml 팔콘® 튜브(BD 바이오사이언시스(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스); 카탈로그 번호 352070) 내로 넣은 후, 10분 동안 300 x g로 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 과립구를 50 ml PBS 중에 재현탁시키고, 트립판 블루 배제 염료를 사용하여 계수하였다. 이어서, 과립구를 5분 동안 200 x g로 펠릿화하고, 자극용 완충제(RPMI-1640[인비트로겐 코포레이션(영국 페이즐리); 카탈로그 번호 61870] 및 2% BSA[시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스); 카탈로그 번호 A9576]) 중 1-2 x 106/ml로 재현탁시켰다. 100 ㎕의 세포 현탁액을 둥근 바닥 96 웰 폴리스티렌의, 조직 배양물로 처리된 플레이트(코스타(오스트리아 크렘스먼스터); 카탈로그 번호 650201)의 웰에 분배하였다. 이어서, 세포를, 첨가하기 전 5분 동안 사전에 혼합된 (2.55 pM 내지 16.7 nM 범위의) 항체 12 GL IgG1TM 및 2.78 nM 재조합 인간 IL-18(실험실내, E. 콜라이 유래)의 적정물을 함유하는 100 ㎕의 용액으로 처리하였다. 플레이트를 5% CO2 습윤 대기하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.
이어서, 세포를 4℃에서 3분 동안 300 x g로 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 털어 냈다. 세포를 150 ㎕의 PBS 중에 재현탁시키고, 다시 원심분리하였다. 세포를 0.1 ㎍의 FITC 컨쥬게이트된 항인간 CD11b(이바이오사이언스 인코퍼레이티드(eBioscience Inc.: 미국 캘리포니아주 샌디에고); 카탈로그 #11-0118, 클론 ICRF44)를 함유하는 (2% FBS를 포함하는) 100 ㎕ FACS 완충제 중에 재현탁시키고, 30분 동안 얼음상에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 4℃에서 3분 동안 300 x g로 원심분리에 의해 150 ㎕ 빙냉 PBS 중에서 2회에 걸쳐 세척한 후, PBS 중 150 ㎕의 3.7% 포름알데히드(시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스); 카탈로그 번호 F1635-1GA) 중에 고정시켰다. FACS캔토 II(FACSCanto II) 유세포 분석기(BD 바이오사이언시스(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스))를 사용하여 CD11b 발현의 변화를 측정하였다. 호중구는 그의 특징적인 전방 산란(FSC: forward scatter) 및 측방 산란(SSC: side scatter) 특성에 의해 확인하였다. 상응하는 집단을 게이팅하고, FL-1 채널(여기 파장 488 nm, 필터 530/30)에서 형광을 분석하여 CD11b 발현 수준을 평가하였다.
항체 12 GL IgG1TM은 인간 호중구 상에서의 CD11b의 IL-18 유도성 상향 조절을 억제시킬 수 있었으며(도 8), 여기서, IC50의 기하 평균은 2.032 nM (95% CI: 1.021-4.046 nM; n=7)이었다.
2.10 항체 12 GL IgG 1 TM 에 의한, 1차 호중구에 의한 IL -18 유도성 활성산소 종 생산 억제
적절한 공동 자극 인자, 예컨대, 포르밀화된 펩티드의 존재하에서, IL-18은 호중구에 의한, 활성산소종(ROS)을 비롯한 다수의 염증유발 매개 인자 생산을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Elbin et al., (2005) Clin Diagn Lab Immunol. 12(3):436-46]). 호중구에 의한 포르밀 펩티드 유도성 ROS 생산의 시험관내 IL-18 유도성 증진을 억제시킬 수 있는 항체 12 GL IgG1TM의 능력을 유세포 분석법으로 평가하였다.
섹션 2.9에 기술되어 있는 바와 같이 인간 혈액으로부터 호중구를 단리시킨 후, 1.5 ㎍/ml의 ROS 감수성 염료인 하이드로에티딘(인비트로겐(영국 페이즐리); 카탈로그 번호 D11347)을 함유하는 RPMI-1640 중에 세포를 1 x 106/ml로 재현탁시키고, 5% CO2 습윤 대기하에 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 5분 동안 300 x g로 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 제거하고, 2% BSA를 포함하는 RPMI-1640 50 ml 중에 재현탁시켰다. 한번 더 원심분리한 후, 마지막으로 세포를 2% BSA를 포함하는 RPMI-1640 중에 3 - 5 x 106/ml의 농도로 재현탁시켰다. 50 ㎕의 상기 세포 현탁액을 96 웰 폴리스티렌의, 조직 배양물로 처리된 플레이트(코스타(오스트리아 크렘스먼스터); 카탈로그 번호 650201) 내에 플레이팅하였다. 이어서, 세포를, 첨가하기 전 5분 동안 사전에 혼합된 (2.55 pM 내지 16.7 nM 범위의) 항체 12 GL IgG1TM 및 2.78 nM 재조합 인간 IL-18(실험실내, E. 콜라이 유래)의 적정물을 함유하는 100 ㎕의 용액으로 처리하였다. 플레이트를 5% CO2 습윤 대기하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 400 nM fMLFF(바켐(Bachem: 독일); 카탈로그 번호 H-4294)를 함유하는, 2% BSA를 포함하는 50 ㎕의 RPMI-1640으로 세포를 자극하였다. 세포를 5% CO2 습윤 대기하에 37℃에서 추가의 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 4℃에서 3분 동안 300 x g로 원심분리에 의해 150 ㎕ 빙냉 PBS 중에서 2회에 걸쳐 세척한 후, PBS 중 150 ㎕의 3.7% 포름알데히드(시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스); 카탈로그 번호 F1635-1GA) 중에 고정시켰다. FACS캔토 II 유세포 분석기(BD 바이오사이언시스(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스))를 사용하여 ROS 생산을 측정하였다. 호중구는 그의 특징적인 전방 산란(FSC) 및 측방 산란(SSC) 특성에 의해 확인하였다. 상응하는 집단을 게이팅하고, FL-2 채널(여기 파장 488 nm, 필터 585/42)에서 형광을 분석하여 ROS 수준을 평가하였다.
항체 12 GL IgG1TM은 인간 호중구에서의 fMLFF 유도성 ROS 생산의 IL-18 매개 증진을 억제시킬 수 있었으며(도 9), 여기서, IC50의 기하 평균은 0.200 nM(n=2)이었다.
2.11 표면 플라즈몬 공명을 사용한, 항체 8 GL 및 항체 12 GL IgG 의 IL -18에의 결합 친화도 측정
상기 섹션(섹션 1.8)에 상세하게 설명되어 있는 바와 같아, 비아코어 2000 또는 T-100(GE 헬쓰케어) 바이오센서 장치를 사용하여 항IL-18 항체, 항체 8 GL 및 항체 12 GL과, 재조합적으로 발현된 인간 IL-18(실험실내, E. 콜라이 유래) 또는 레서스 원숭이 IL-18(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 2548-RM) 사이의 상호작용의 동력학적 파라미터를 평가하였다.
본질적으로, 각 IgG와 IL-18 피분석물 사이의 결합 친화도는 아민 연결부에 의해 IgG를 CM3 또는 CM5 칩에 공유적으로 커플링시키고, (0.4 - 200 nM로) 재조합 IL-18을 희석시킨 후, 이어서, 칩 표면 상에 통과시킴으로써(섹션 1.8 참조) 평가하였다. 생성된 데이터를 1:1 랭뮤어 모델(ka kd 동시)로 피팅하였고, 평균값은 하기 5에 기록되어 있다.
2.12 세포 기반 검정법: pA 2 분석을 이용한 항체 12 GL IgG 1 TM 친화도의 약리학적 측정
경쟁적 길항제의 친화도를 정량화하는 주된 약리학적 도구는 쉴드 분석법이다. 상기 접근법을 사용하여, 기능적 검정법에서 길항제의 친화도를 예측하는 시스템 비의존성 수단을 측정할 수 있다. 상기 방법은 길항제 농도 및 그의 친화도가 효능제 반응의 길항작용을 결정한다는 개념을 기반으로 한다. 길항작용은 정량화될 수 있고, 길항제의 농도는 공지되어 있는 바, 길항제의 친화도를 측정할 수 있다. 이러한 길항작용은 길항제의 존재 및 부재하에 측정되는, 등가의 활성을 가지는 효능제 농도의 비(용량비(DR: dose ratio)로 지칭)를 측정함으로써 정량화된다.
용량비는 단일 농도의 결합 구성원의 존재하의 효능제의 EC50에 대한, 결합 구성원 부재하의 효능제(전형적으로 IL-18)의 EC50의 비를 취함으로써 계산할 수 있다. 이어서, 로그(DR-1)로 표현되는 용량비를 로그[결합 구성원]에 대한 선형 회귀에 사용하여 쉴드 회귀를 도출할 수 있다. 따라서, 각 농도의 결합 구성원에 대해서 상응하는 DR 값이 있게 되고, 이들을 로그[결합 구성원]에 대한 로그(DR-1)의 회귀로 플롯팅한다. 길항작용이 경쟁적일 경우, 하기 주어진 쉴드 수학식에 따라 로그(DR-1)과 로그[결합 구성원] 사이에 선형 관계가 성립할 것이다:
로그(DR-l) = 로그 [B] - 로그 KB
(여기서, [B]는 결합 구성원의 몰 농도이다).
이러한 상황에서, 세로 좌표 값이 0이면, x축의 절편을 얻을 수 있다(로그 [B] = 로그 KB). 따라서, 로그(DR-1)이 0이 되게 하는 결합 구성원의 농도는 로그 KB, 즉, 결합 구성원-수용체 복합체의 평형 해리 상수가 될 것이다. 이것은 결합 구성원 친화도를 평가하기 위한 시스템 비의존성 정량화 방법이다. 전통적으로, 이 접근법은 수용체 길항제의 친화도를 측정하는 데 사용되지만, 리간드 중화에 대한 유사한 가정을 기반으로 하여, 용량비 계산을 통해서는 또한 세포 상에서의 IL-18 활성을 중화시키는 결합 구성원 친화도를 예측할 수 있어야 한다. KB 값은 로그 플롯으로부터 얻어지는 바, 이는 로그 정규 분포된 것이다. 상기 특정 농도의 음의 로그는 실험상 pA 2 , 즉, 효능제 용량 반응 곡선의 2배 이동을 일으키는 길항제의 농도를 언급한다. 하기 수학식으로부터 용량비에 대한 단일 값을 제공하는 단일 농도 길항제로부터 pA2를 계산하여 길항제의 효능을 정량화할 수 있다:
pA 2 = 로그(DR-1) - 로그[B]
(여기서, [B] = 원래의 준최대 반응을 유도하기 위해 효능제 농도를 2배로 배가시키는 길항제의 몰 농도이다.
DR = 용량비는 길항제의 존재 및 부재하에 측정되는, 등가의 활성을 가지는 효능제 농도의 비를 측정함으로써 정량화된다.
pA2는 용량 반응 검정법 데이터로부터 계산될 수 있다).
pA2 방법을 사용하여 인간 IL-18에 대한 항체 12 GL IgG1TM 친화도를 측정하기 위해, 섹션 1.7에 기술되어 있는 바와 같이 KG-1 세포를 플레이팅하였다. 배양 배지 중에서 항체 12 GL IgG1TM의 일련의 희석액(세포 검정법에서 최종 농도 20 nM, 6.66 nM, 2.22 nM, 0.74 nM, 0.25 nM 및 0)을 제조하고, 세포에 첨가하였다. 배양 배지 중에서 재조합 인간 IL-18의 일련의 희석액(세포 검정법 중 최종 농도 42 nM 내지 0.25 pM) 또한 제조하고, 세포에 첨가하여, 각 항체 12 GL IgG1TM 농도에 대하여 용량 범위의 IL-18을 테스트하였다. 습윤 대기하에 37℃/5% CO2에서 22-24시간 동안 세포를 인큐베이션시킨 후, 각 웰로부터 150 ㎕의 상청액을 수집하고, 섹션 1.7에 기술되어 있는 바와 같이 IFNγ의 농도를 측정하였다. 일부 실험에서는, 인간 IL-18을, 다양한 농도의 항체 12 GL IgG1TM(최종 농도 60 nM, 20 nM, 6.66 nM, 2.22 nM, 0.74 nM, 0.25 nM 및 0)의 존재하에, 125 nM 내지 0.25 nM의 최종 농도로 사용되는 레서스 원숭이 IL-18로 대체하였다.
실험 데이터를 플롯팅하여 KG-1 세포에 의한 IFNγ 생산을 50% 증가시키도록 하는 데 필요한 IL-18의 양(EC50)을 각 항체의 농도에 대하여 측정하였다. 4 파라미터 로그 방정식(수학식 3)을 사용하여 곡선을 피팅함으로써 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 EC50 값을 계산하였다. 이어서, 항체의 EC50 값 및 농도를 사용하여 그래프패드 프리즘에서 쉴드 플롯을 작성하고, 상기 기술된 바와 같이 pA2 및 KD 값을 측정하였다. 도 10은 항체 12 GL IgG1TM에 의한, KG-1 세포에 대해 미치는 인간 IL-18 효과의 용량 의존성 억제의 일례와, 그에 상응하는 쉴드 플롯(이를 통해 pA2 및 KD 값 측정 가능)의 예를 보여주는 것이다.
KG-1 세포 기반 검정법을 사용하여 항체 12 GL IgG1TM에 대해 수득된 pA2 및 KD 값은 하기 표 6에 요약되어 있다.
2.13 표면 플라즈몬 공명( SPR ) 바이오센서를 사용한 항체 8 GL 및 항체 12 GL의 결합 특이성 분석
비아코어 2000 또는 T-100(GE 헬쓰케어) 바이오센서 장치를 사용하여 항IL-18 항체, 항체 8 GL 및 항체 12 GL과, 다양한 재조합적으로 발현된 IL-18 및 관련 단백질 사이의 상호작용의 특이성을 평가하였다.
앞서(섹션 1.9) 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, 각각의 IgG와 상이한 피분석물 사이의 결합 상호작용은, 아민 연결부에 의해 IgG를 CM5 칩에 공유적으로 커플링시키고, 재조합 단백질을 재조합 단백질을 칩 표면 상에 통과시키는 검정법을 사용함으로써 예측하였다.
항체 8 GL 및 항체 12 GL은 인간 및 레서스 원숭이 IL-18에 결합하는 것으로 나타났지만, 마우스 IL-18, 래트 IL-18, 인간 IL-1F7 또는 인간 IL-1β에는 어떤 결합도 보이지 않았다(표 7).
2.14 IL -18 BP 에피토프 경쟁 검정법에서 항체 12 GL 의 특징 규명
정제된 항체 12 GL IgG2의 희석액 시리즈를 제조하여 항체가 IL-18과 IL-18BP 사이의 결합 상호작용을 억제시킬 수 있는지 여부를 측정하고, 이로써, 항체 12 GL이 재조합 인간 IL-18 상에서 IL-18BP와 동일한 입체 구조 에피토프에 결합하였다는 것을 나타내었다. 검정법은 섹션 1.10에 기술되어 있는 바와 같이 설정하였다.
섹션 1.3 및 1.4에 기술되어 있는 것과 동일한 수학식을 사용하여 결과를 계산하였다.
도 11에 예시되어 있는 바와 같이, 항체 12 GL IgG2의 IC50은 0.2 nM (95%CI: 0.1 - 0.4 nM, n=4)이었다.
2.15 항체 12 GL IgG 1 TM 에 의한, IL -18 BP 에의 IL -18 결합 억제
인간 IL-18에의 결합에 대한 항체 12 GL IgG1TM 및 IL-18BP 사이의 경쟁에 관한 평가는 추가로, 비아코어2000 또는 T100의 것과 유사한 방식으로 작동하는 프로테온 XPR(ProteOn XPR) 장치(바이오래드(Bio-Rad: 미국 캘리포니아주 허큘리스))를 사용하여 평가하였다. 본 실험에서, 3가지 상이한 밀도(범위 230-6,340 RU)의 항체 12 GL IgG1TM 또는 IL-18BPa-Fc(R&D 시스템즈(미국 미네소타주 미니애폴리스); 카탈로그 번호 119-BP)로 이루어진 아민 연결된 표면을 통해 100 nM 용액(최종 밀도 10 RU 내지 330 RU)으로부터 인간 IL-18(실험실내, E. 콜라이 유래)을 포획할 수 있도록 한 후, 안정화시켰다. 이후, 100 nM의 추가의 항체 12 GL IgG1TM 및 IL-18BP를 포획된 IL-18 상에 통과시키고, 생성된 센서그램을 조사함으로써 IL-18에의 임의 결합이 있는지 여부를 확인하였다. 항체 12 GL IgG1TM 또는 IL-18BPa-Fc의 조합 중 어느 것에서도 추가의 결합은 관찰되지 않았다. 이는 항체 12 GL IgG1TM 및 IL-18BPa가 IL-18 상의 중첩 에피토프를 가진다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 3
결정학적 연구
3.1 인간 IL -18 및 항체 12 GL Fab 단편의 정제
섹션 1.1에 언급된 인간 IL-18 구성물, His-GST-IL-18을 E. 콜라이에서 가용성 방식으로 발현시켰다. 표준 친화도 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제한 후, 인자 Xa 절단을 수행하였다. 이어서, 절단된 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피 및 표준 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하여 임의의 오염성 절단된 태그를 제거한 후, 결정학용의 원심분리식 농축 장치를 사용하여 단백질을 농축시켰다.
항체 12 GL IgG를 맙셀렉트 수레 프로테인 A(MabSelect SuRe Protein A)(GE 헬쓰케어)에의 흡착에 의해 조절 배지로부터 정제하고, 그로부터 용리시켰다. 정제된 항체 12 GL(+ 30 mM 시스테인)을 30 mM 시스테인을 함유하는 포스페이트 완충처리된 염수(pH 7.2) 중 파파인(시그마 알드리치: 미국 미주리주 세인트루이스) 중에서 5 mg의 파파인 대 100 mg의 IgG의 비로 인큐베이션시켜 Fab 단편을 수득하였다. 96분 동안 인큐베이션시킨 후, 50 mM의 최종 농도로 요오도아세트아미드를 첨가함으로써 분해를 종결시켰다. 분해물을 맙셀렉트 수레 프로테인 A(GE 헬쓰케어)(pH 7.2)에 적용시킨 후, 비결합 Fab 단편을 수집하여 Fab 단편을 정제하였다. 농축 후, 탈염 PD-10 칼럼(GE 헬쓰케어)을 사용하여 Fab 완충제를 50 mM 아세트산나트륨, 30 mM 염화나트륨 + 2% w/v 소르비톨(pH 5.50)로 교환하였다.
3.2 IL -18 및 항체 12 GL Fab 복합체 형성
항체 12 GL Fab 및 인간 IL-18(실험실내, E. 콜라이 유래)을 1:1의 몰비로 (약간 과량의 IL-18과 함께) 혼합하고, +4℃에서 밤새도록 완만하게 교반하였다. 형성된 복합체를 2.5 mL/min으로 20 mM HEPES(pH 7.5), 150 mM NaCl 중에서 평형화된 하이로드 수퍼덱스(HiLoad Superdex) 75 pg 26/60 칼럼(GE 헬쓰케어) 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과량의 IL-18로부터 분리하였다. 복합체는 단일 피크로서 용리되었고, 이를 수집하고, MWCO = 10 kDa으로 아미콘(Amicon) 원심분리기 장치를 사용하여 10 mg/mL로 농축시켰다.
3.3 결정화, 데이터 수집 및 구조 측정
단백질 완충제(20 mM HEPES(pH 7.5), 150 mM NaCl) 중 15 mg/mL 농도의 IL-18:항체 12 GL Fab 복합체를 사용하여 광범위한 증기 확산 결정화 시험을 설정하여 결정화 조건을 확인하였다. 단백질을 원심분리한 후, 인텔리-플레이트 플랫 레지(Intelli-plate Flat ledge)(아트 로빈스(Art Robbins))에 싯팅 드롭(sitting drop)을 100 nL 단백질 용액 및 100 nL 웰 용액과 함께 설치하였다. 첫번째 결정은 2주 이내에 에탄올, 3-메틸-1,5-펜타디올(MPD) 중 하나 또는 그 둘 모두를 함유하는 드롭 중에서 출현하였다. 결정은, 회절 실험에서는 유용하지 않은 바늘형 또는 바늘형 번들로서 나타났다. UV 현미경 관찰법에 의해 결정이 단백질임을 확인하였다.
결정화 조건의 최적화 전반에 걸쳐 시딩을 사용하였다. 회절 테스트하기 위한 결정을 수득하기 위해, 수회에 걸쳐 마이크로시딩 및 마크로시딩을 수행하였다. 30 ㎕의 웰 용액 중에서 결정을 분쇄함으로써 마이크로시딩을 위한 시드 스톡을 수득하였다. 시드 스톡을 희석하고, 다양한 희석을 결정화 드롭에, 예컨대, 10 nL의 묽은 시등 스톡을 200 nL 드롭에 첨가하였다. 마이크로시딩 또한 사용하였는데, 여기서, 결정과 같은 바늘형 번들을 더 작은 조각으로 파쇄시키고 이를 새 결정화 드롭으로 옮겨 놓았다.
데이터 수집에 사용되는 결정은 +20℃에서 35-40% 에탄올을 함유하는 500 ㎕ 웰 용액을 이용하여 넥스탈 플레이트(Nextal plates)(퀴아젠(Qiagen))에서 행잉 드롭(hanging drops)으로부터 수득하였다. 마이크로시딩을 사용하였는데, 여기서, 1:1의 비로 단백질 및 웰 용액을 함유하는 새 3 ㎕ 결정화 드롭으로 결정 조각을 옮겨 놓았다. 최상의 결정은 마이크로시딩 드롭에서 출현하였지만, 보다 큰 조각보다는 작은 핵의 결과일 가능성이 높았다. 원격 데이터 수집을 위해 대략 200 ㎛의 생성된 막대형 결정을 프랑스 그러노블에 소재하는 유럽 싱크로트론 방사광 시설(ESRF: European Synchrotron Radiation Facility)로 송부하였다. ESRF에서의 ID23-1 빔 라인에서 ADSC Q315R 검출기 상의 100 K에서 단일 결정으로부터 수집된 데이터는 2.5 Å인 것으로 나타났다.
100 K에서 단일 결정으로부터 데이터를 수집하였다. MOSFLM(문헌 [Leslie, A (1991) Crystallographic computing V pp. 27-38])을 사용하여 데이터세트를 통합하고, 스칼라(CCP4 스위트)로 스케일링하였다. 데이터 수집 통계는 하기 표 9에 제시되어 있다. 결정은 셀 치수가 a=b=95.1, c=316.9, α=β=90, γ=120인 공간군 P3121에 속하였다. 비대칭 단위는 2 카피수의 IL-18-Fab 복합체를 포함하였는데, 이로 인해 매튜 계수(Matthew's coefficient)는 3.1이고, 용매 함량은 60%가 되었다.
각각 프로테인 데이터 뱅크(Protein Data Bank) 엔트리 3F62(문헌 [Krumm et al., (2008) PNAS 105 (52):20711-20715]) 및 1AQK(문헌 [Faber et al., (1998) Immunotechnology 3:253-370])로부터 유도된 IL-18 및 항체 12 GL Fab에 대한 검색 모델과 함께 프로그램 페이져(Phaser)(CCP4 스위트 1994)를 사용하여 분자 치환법에 의해 IL-18:항체 12 GL Fab 복합체 구조를 측정하였다.
초기 검색 모델(1AQK_가변)은 하기 루프: LC 93-99, HC 27-32, 51-58, 73.76, 및 101-107이 제거된, 1AQK로부터의 Fab 가변 도메인(중쇄 잔기 2-122, 경쇄 2-111)을 함유하였다. 페이져는 공간군 P3121에 단일 용액을 제공하였다. 1 카피수의 상기 모델이 발견되었고, 상기 용액을 그대로 고정시킨 상태로 유지시키면서, 하나의 루프(54-61)가 제거된 3F62(IL-18:IL-18BP 복합체)로부터 추출된 IL-18 검색 모델을 다음에 배치시켰다. 상기 용액을 고정시키고, 1AQK로부터의 항체 12 GL Fab 불변 도메인(LC 잔기 112-216 및 HC 123-226)에 대한 검색도 성공적으로 수행하였다. IL-18:항체 12 GL Fab(1AQK_가변) 복합체의 두번째 카피를 비대칭 단위에 배치하였다. 1AQK HC로부터 불변 도메인(중쇄 123-226)을 검색하고, 발견하였다. 그러나, 페이저로 Fab LC 불변의 위치를 확인하는 데는 실패하였다. 오토버스터(글로벌 페이징(Global phasing)) 강체 제련으로 모델을 진행시켰다. 생성된 지도는 품질이 우수하였고, 항체 12 GL Fab 측쇄를 프로그램 쿠트(Coot)(문헌 [Emsley P. et al., (2010) Acta Cryst D66: 86-501])에서 서열로 재모델링하고, 쿠트 프로그램을 사용하여 수동으로 항체 12 GL 서열에 매치되도록 누락 루프를 재건하였다. 쿠트에서 차이 밀도 지도로 내장시켰다. 추가 사이클로 오토버스터 정련을 수행한 후, 제2 분자 중 마지막 LC 불변 도메인은 쿠트에서 수동으로 배치하여야 했다. 카바트 번호매김에 따라 Fab 쇄를 번호매김하였다(문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.:National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine]). 완전한 모델을 프로그램 Refmac5(CCP4 스위트 1994)로 정련하였고, 최종 R 인자는 24.5%이고, 유리 R 인자는 28.6%였다.
3.4 IL -18:항체 12 GL Fab 복합체의 결정 구조
인간 IL-18:항체 12 GL 복합체의 결정을 공간군 P3121에서 수득하였다. 전자 밀도 지도의 전반적인 품질은 우수하였고, 이를 통해 잔기 중 97%를 정확하게 모델링할 수 있었다. 특히, 에피토프 및 파라토프 영역이 잘 정의되었다. IL-18의 최종 모델은 잔기 1-156을 함유한다. 2개의 루프 영역(잔기 33-41 및 131-132)이 전자 밀도에서 무질서한 상태였고, 이들 부분을 모델로부터 배제시켰다. 동일한 루프가 에코바이러스로부터의 IL-18BP(PDB 수탁 코드 3F62; 문헌 [Krumm et al., 2008 상기 문헌 동일])와의 복합체에서 IL-18의 공개된 결정 구조 모델로부터 배제되어 있으며, 이는 비결합된 IL-18(PDB 코드 1J0S; 문헌 [Kato et al., (2003) Nat Struct Biol 10(11): 966-971])의 용액상 구조에서 고도로 가요성인 것으로 보고되어 있다. 항체 12 GL Fab의 최종 모델은 경쇄(LC) 잔기 1-213(비대칭 단위인 두번째 분자에서는 1-212) 및 중쇄(HC) 1-226으로 구성되었다. 최종 모델은 2 카피수의 IL-18-항체 12 GL Fab 복합체 및 79개의 물 분자를 함유하였다.
결정 구조를 통해 각 IL-18 분자가 하나의 항체 12 GL Fab 단편에 결합하는 것으로 나타났다(도 12). 이러한 결정 구조를 통해 IL-18 및 항체 12 GL 사이의 에피토프 상호작용을 원자적으로 상세하게 조사할 수 있었다. 이는 하기 표 9에 제시되어 있는데, 여기서, 잔기 번호는 쇄 표지를 포함한다(H: 항체 12 GL 중쇄, L: 항체 12 GL 경쇄). CCP4 프로그램 CONTACT(CCP4, 1994)를 사용하여 거리를 구하였다. 둘은 등가인 바, 두 복합체 중 하나만을 기술할 필요가 있었다. 상호작용은 항체 단편의 중쇄 및 경쇄, 둘 모두로부터의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하였다. 에피토프의 일부를 형성하는, IL-18 중의 아미노산 잔기는 Tyr1, Gly3, Leu5, Glu6, Lys8, Met51, Lys53, Asp54, Ser55, Gln56, Pro57, Arg58, Gly59, Met60, Arg104, Ser105 및 Pro107이었다. 항체 12 GL 경쇄로부터의 기여 잔기는 Gly28, Ser30, Trp32, Ser91, His92, His93 및 Pro94였다. 경쇄 골격 1로부터는 단일의 아미노산 기여만이 있었는데, 이는 잔기 Asp1이었다. 중쇄로부터의 기여 잔기는 Tyr35, Tyr52, Tyr53, Tyr58, Ala97, Tyr98, Phe99, Gly100, Thr100D 및 Asp100E였다.
IL-18의 전체적인 구조는 IL-18:IL-18BP 복합체(3F62; 문헌 [Krumm et al., 2008 상기 문헌 동일])로부터의 IL-18과 매우 유사하였고, 전체 Cα 평균 평방근 편차는 0.87 Å2였다. 그러나, IL-18:IL-18BP 복합체와 비교하였을 때, 한 루프(잔기 55-59)의 3 Å 위치 이동이 있었다. 이러한 이동에도 불구하고, 파라토프와의 상호작용점을 다수 보유하고 있는 루프의 전체 입체 구조는 여전히 아주 많이 유사하였다. 대조적으로, 루프(55-59)의 입체 구조는 기록된 비결합된 IL-18의 NMR 용액상 구조(문헌 [Kato et al., 2003 상기 문헌 동일]) 뿐만 아니라, IL-18:125-2H 복합체(문헌 [Argiriadi, M.A. et al., (2009) JBC 284: 24478-24489])의 결정 구조로부터 벗어났으며, 최대 이동은 각각 5 Å 및 7 Å이었다. 최근 공개된 결정 구조에서 밝혀진 바와 같이 (문헌 [Krumm et al., 2008 상기 문헌 동일]), 항체 12 GL의 결합 모드는 에코바이러스으로부터의 IL-18BP와 거의 완전하게 중첩되었다. IL-18:항체 12 GL Fab 복합체의 결정 구조를 통해 125-2H(2VXT; 문헌 [Argiriadi et al., 2009 상기 문헌 동일])와 항체 12 GL 에피토프 사이에 중첩은 본질적으로 존재하지 않는다는 것으로 밝혀졌다.
종간의 교차 반응성과 관련하여, 항체 12 GL은 마우스 IL-18과는 교차 반응성을 띠지 않지만, 사이노몰구스 IL-18과는 교차 반응성을 가지는 것으로 나타났다. 사이노몰구스 원숭이 및 인간 IL-18 에피토프는 100% 동일하였다.
실시예 4
유리 IL -18 검정법
전자발광(ECL: electroluminescent) 면역검정법으로 유리 IL-18의 농도를 측정하였다.
밤새도록 농도 0.625 ㎍/ml의 항체 12 GL을 96 웰 플레이트(스탠다드 플레이트(Standard Plate), 메조스케일 디스커버리(Mesoscale Discovery))의 탄소 전극 상에 코팅하였다. 웰을 세척한 후, 1 내지 3시간 동안 I-블록(I-Block) 완충제(트로픽스(Tropix))와 함께 인큐베이션시켰다. 재조합 인간 IL-18(R&D 시스템즈)로부터 I-블록 완충제 중에서 표준 및 QC 농도로 제조하였다. 웰을 세척하고, 표준, QC, 및 희석되지 않은 테스트 시료를 실온에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 세척하고, 0.5 g/ml 비오티닐화된 검출용 항체(MBL 바이오인터내셔널(MBL International))를 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 웰을 세척하고, 스트렙트아비딘-술포태그(SulfoTag)(메조스케일 디스커버리)를 각 웰에 첨가하였다. 30 min 동안의 인큐베이션 시간 경과 후, 웰을 세척하고, 판독용 완충제(메조스케일 디스커버리)를 각 웰에 첨가하였다. 섹터 임마거2400(Sector Immager2400)(메조스케일 디스커버리) 상에서 ECL 신호를 판독하였다. 결과는 도 16 및 17에 제시되어 있다.
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[표 10]
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NCIMB Ltd. NCIMB41786 20101123
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune Limited <120> Anti-IL-18 Antibodies and their uses <130> IL18-100P1 <150> US 61/424920 <151> 2010-12-20 <160> 171 <170> Medimmune Ltd patent software March 2010 release. Output verified by USPTO Checker version 4.4.0. <210> 1 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggtacagc tgcagcagtc aggcccaaga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgg 120 cagcccgccg ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatcaggag acacgcccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tatattactg tgcaagaacc 300 cccgcgtatg atggcgatgc ccgggcagat ttctttgacg tctggggcag gggaaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Gln 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Pro Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 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gggagtatct attatagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatcaggag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tatattactg tgcaagaacc 300 cccgcgtatg atggcgatgc ccgggcagat ttctttgacg tctggggcag gggaaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 12 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Asp Gly Asp Ala Arg Ala Asp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 5 <210> 14 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Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 5 <210> 21 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 caggtacagc tgcagcagtc aggcccaaga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgg 120 cagcccgccg ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatcaggag acacgcccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tatattactg tgcaagaacc 300 cccgcgtatg atggcgatgc ccgggcagat ttctttgacg tctggggcag gggaaccctg 360 gtcaccgtct 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Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Pro Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Asp Gly Asp Ala Arg Ala Asp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 5 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Thr Pro Ala Tyr Asp Gly Asp Ala Arg Ala Asp Phe Phe Asp Val 5 10 15 <210> 36 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gacatcgtga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gggtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggagagccc ctaaggtctt gatctataag gcatctactt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcag agcctctacc ccccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Tyr Pro Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gln Gln Ser Leu Tyr Pro Pro Trp Thr 5 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180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatcaggag acacgcccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tatattactg tgcaagaacc 300 cccgcgtatg atggcgatgc ccgggcagat ttctttgacg tctggggcag gggcaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 52 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Gln 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Pro Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Asp Gly Asp Ala Arg Ala Asp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 5 <210> 54 <211> 16 <212> PRT <213> Homo 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ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gatgattttg caacttacta ctgtgccaac atcgccttcc ccccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 77 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Asn Ile Ala Phe Pro Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 5 10 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Ala Asn Ile Ala Phe Pro Pro Trp Thr 5 <210> 81 <211> 375 <212> DNA 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15 <210> 146 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gggtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaggtctt gatctataag gcatctactt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gatgattttg caacttacta ctgtcaacag agtcaccacc cgccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 147 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His His Pro Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 148 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Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Leu Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Phe Gly Gln Asp Arg Thr Asp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 153 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Ala Asp Gly Tyr Tyr Trp Ser 5 <210> 154 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Ser Leu Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Gly 5 10 15 <210> 155 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Thr Pro Ala Tyr Phe Gly Gln Asp Arg Thr Asp Phe Phe Asp Val 5 10 15 <210> 156 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 156 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gggtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaggtctt gatctataag gcatctactt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gatgattttg caacttacta ctgtcaacag agtcaccacc cgccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 157 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His His Pro Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 158 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 5 10 <210> 159 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser 5 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Gln Gln Ser His His Pro Pro Trp Thr 5 <210> 161 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser 20 25 30 <210> 162 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 5 10 <210> 163 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Arg Val Thr Ile Ser Gly Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 164 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 165 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 166 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr 5 10 15 <210> 167 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 168 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 5 10 <210> 169 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 <210> 170 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 170 caggtacagc tgcaggagtc cggccctggc ctggtgaagc cttccgagac actgtccctg 60 acctgcaccg tgtccggcgg ctccatctcc gccgacggct actactggtc ctggatcagg 120 cagcctcctg gcaagggcct ggagtggatc ggctccctgt actactccgg ctccacctac 180 tacaaccctt ccctgaaggg cagagtgacc atctccggcg acacctccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgtcctccgt gaccgccgct gacaccgccg tgtactactg cgcccggacc 300 cctgcctact tcggacagga ccggaccgac ttcttcgacg tgtggggcag gggaaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 171 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 171 gacatccaga tgacccagtc cccctccacc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgcc gggcctccca gggcatctcc tcttggctgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ctaaggtgct gatctacaag gcctctaccc tggagtccgg cgtgccttcc 180 cggttctccg gctccggctc tggcaccgag ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct 240 gacgacttcg ccacctacta ctgccagcag tcccaccacc ctccctggac cttcggccag 300 ggcaccaagc tggagatcaa g 321 1

Claims (95)

  1. 인간 IL-18 상의 IL-18BP 결합 부위와 전체적으로 또는 부분적으로 중첩되는 인간 IL-18의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 인간 IL-18에 대한 단리된 항체 분자.
  2. 제1항에 있어서, 항체 분자가 잔기 Tyr1, Gly3, Leu5, Glu6, Lys8, Met51, Lys53, Asp54, Ser55, Gln56, Pro57, Arg58, Gly59, Met60, Arg104, Ser105 및 Pro107 중 하나 이상을 포함하는 인간 IL-18의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 항체 분자.
  3. 제2항에 있어서, 에피토프가 잔기 Tyr1, Gly3, Leu5, Glu6, Lys8, Met51, Lys53, Asp54, Ser55, Gln56, Pro57, Arg58, Gly59, Met60, Arg104, Ser105 및 Pro107을 포함하는 것인 항체 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IL-18 수용체(IL-18R) 및/또는 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에의 IL-18 결합을 억제시키는 것인 항체 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, IL-18에의 결합에 대하여 IL-18BP와 경쟁하는 것인 항체 분자.
  6. 제5항에 있어서, IL-18에의 IL-18BP 결합에 대해 90% 이상의 억제율을 보이는 것인 항체 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1 nM 미만의 IC50 값으로 인간 IL-18에 결합하는 것인 항체 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-18에 대하여 9 10-5s-1 미만인 해리 속도(kd)를 보이는 것인 항체 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-18에 대하여 10 nM 미만, 바람직하게는, 100 pM 미만인 친화도(kD)를 보이는 것인 항체 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    HCDR1이 아미노산 서열 서열 번호 153을 가지고;
    HCDR2가 아미노산 서열 서열 번호 154를 가지고;
    HCDR3이 아미노산 서열 서열 번호 155를 가지고;
    LCDR1이 아미노산 서열 서열 번호 158을 가지고;
    LCDR2가 아미노산 서열 서열 번호 159를 가지고;
    LCDR3이 아미노산 서열 서열 번호 160을 가지는 것으로 정의되는, 모체 CDR 세트: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나, 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 상기 모체 CDR 세트를 포함하는 것인 항체 분자.
  11. 제9항에 있어서,
    (a) 서열 번호 153과 동일하거나, 또는 서열 번호 153과 비교하여 3개 이하의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 HCDR1;
    (b) 서열 번호 154와 동일하거나, 또는 서열 번호 154와 비교하여 4개 이하의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 HCDR2;
    (c) 서열 번호 155와 동일하거나, 또는 서열 번호 155와 비교하여 5개 이하의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 HCDR3;
    (d) 서열 번호 158과 동일하거나, 또는 서열 번호 158과 비교하여 4개 이하의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 LCDR1;
    (e) 서열 번호 159와 동일하거나, 또는 서열 번호 159와 비교하여 4개 이하의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 LCDR2; 및
    (f) 서열 번호 160과 동일하거나, 또는 서열 번호 160과 비교하여 9개 이하의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 LCDR3을 포함하는 것인 항체 분자.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, HCDR3에서
    카바트 잔기 97이 Ala이고;
    카바트 잔기 98이 Tyr이고;
    카바트 잔기 99가 Asp 또는 Phe이고;
    카바트 잔기 100이 Gly이고;
    카바트 잔기 100D가 Ala 또는 Thr이고;
    카바트 잔기 100E가 Asp인 것인 항체 분자.
  13. 제10내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, HCDR3에서
    카바트 잔기 95가 Thr이고/거나;
    카바트 잔기 96이 Pro이고/거나;
    카바트 잔기 97이 Ala이고/거나;
    카바트 잔기 98이 Tyr이고/거나;
    카바트 잔기 99가 Asp 또는 Phe이고/거나;
    카바트 잔기 100이 Gly이고/거나;
    카바트 잔기 100A가 Asp 또는 Gln이고/거나;
    카바트 잔기 100B가 Ala 또는 Asp이고/거나;
    카바트 잔기 100C가 Arg이고/거나;
    카바트 잔기 100D가 Ala 또는 Thr이고/거나;
    카바트 잔기 100E가 Asp이고/거나;
    카바트 잔기 100F가 Phe이고/거나;
    카바트 잔기 100G가 Phe이고/거나;
    카바트 잔기 101이 Asp이고/거나;
    카바트 잔기 102가 Val인 것인 항체 분자.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, HCDR3에서
    HCDR3 중 카바트 잔기 99가 Phe이고/거나;
    HCDR3 중 카바트 잔기 100a가 Gln이고/거나;
    HCDR3 중 카바트 잔기 100b가 Asp이고/거나;
    HCDR3 중 카바트 잔기 100d가 Thr인 것인 항체 분자.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, HCDR3이 서열 번호 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 또는 155 중 어느 하나인 것인 항체 분자.
  16. 제15항에 있어서, HCDR3이 아미노산 서열 서열 번호 155인 것인 항체 분자.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, HCDR2에서
    카바트 잔기 52가 Tyr이고;
    카바트 잔기 53이 Tyr이고;
    카바트 잔기 58이 Tyr인 것인 항체 분자.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, HCDR1에서
    카바트 잔기 35가 Tyr인 것인 항체 분자.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    LCDR3 중 카바트 잔기 92가 Tyr, Ser, Leu, His, 또는 Ala이고/거나;
    LCDR3 중 카바트 잔기 93이 Ser, Phe, Tyr, His, 또는 Ile이고/거나;
    LCDR3 중 카바트 잔기 94가 Thr 또는 Pro인 것인 항체 분자.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    LCDR3 중 카바트 잔기 91이 Ser 또는 Ile이고/거나;
    LCDR3 중 카바트 잔기 92이 His이고/거나;
    LCDR3 중 카바트 잔기 93이 His이고/거나;
    LCDR3 중 카바트 잔기 94가 Pro인 것인 항체 분자.
  21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    LCDR3 중 카바트 잔기 89가 Gln 또는 Ala이고/거나;
    LCDR3 중 카바트 잔기 90이 Gln, Asp, 또는 Asn이고/거나;
    LCDR3 중 카바트 잔기 91이 Ser 또는 Ile이고/거나;
    LCDR3 중 카바트 잔기 95가 Pro, Asn, 또는 Gln이고/거나;
    LCDR3 중 카바트 잔기 96이 Trp이고/거나;
    LCDR3 중 카바트 잔기 97이 Thr 또는 Asp인 것인 항체 분자.
  22. 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, LCDR3이 서열 번호 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 또는 160인 것인 항체 분자.
  23. 제21항에 있어서, LCDR3이 아미노산 서열 서열 번호 160인 것인 항체 분자.
  24. 제9항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, HCDR1이 서열 번호 3, 103, 113 또는 153이고; HCDR2가 서열 번호 4, 124, 134, 144, 또는 154인 것인 항체 분자.
  25. 제22항에 있어서, HCDR1이 아미노산 서열 서열 번호 153이고/거나; HCDR2가 아미노산 서열 서열 번호 154인 것인 항체 분자.
  26. 제10항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, LCDR1에서
    카바트 잔기 30이 Ser이고;
    카바트 잔기 32가 Trp인 것인 항체 분자.
  27. 제10항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    LCDR1이 아미노산 서열 서열 번호 158이고/거나;
    LCDR2가 아미노산 서열 서열 번호 159인 것인 항체 분자.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 표 11에 제시되어 있는 바와 같은, 항체들 항체 1, 항체 1 GL, 항체 2, 항체 3, 항체 4, 항체 5, 항체 6, 항체 6 GL, 항체 7, 항체 7 GL, 항체 8 GL, 항체 9, 항체 10, 항체 11, 항체 11_GL, 및 항체 12 GL 중 어느 것에 대한 CDR 세트를 포함하는 것인 항체 분자.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VH 도메인 및 항체 VL 도메인을 포함하고,
    여기서, VH 도메인은 각각 서열 번호 153, 154 및 155의 아미노산 서열을 가지는 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하고;
    VL 도메인은 각각 서열 번호 158, 159 및 160의 아미노산 서열을 가지는 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하는 것인 항체 분자.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및/또는 경쇄 골격 영역이 인간 배선(germline) 유전자 세그먼트 서열로 배선화된 것인 항체 분자.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, VL FW1에서 카바트 잔기 1이 Asp인 것인 항체 분자.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 및 152로부터 선택되는 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하는 것인 항체 분자.
  33. 제32항에 있어서, VH 도메인이 서열 번호 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 및 152로부터 선택되는 것인 항체 분자.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 및 157로부터 선택되는 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 것인 항체 분자.
  35. 제34항에 있어서, VL 도메인이 서열 번호 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 및 157로부터 선택되는 것인 항체 분자.
  36. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 항체 VH 도메인 및 항체 VL 도메인을 포함하고, 여기서, 항체 VH 도메인 및 항체 VL 도메인의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 2 및 7, 각각 서열 번호 12 및 17; 각각 서열 번호 22 및 27; 각각 서열 번호 32 및 37; 각각 서열 번호 42 및 47; 각각 서열 번호 52 및 57; 각각 서열 번호 62 및 67; 각각 서열 번호 72 및 77; 각각 서열 번호 82 및 87; 각각 서열 번호 92 및 97; 각각 서열 번호 102 및 107; 각각 서열 번호 112 및 117; 각각 서열 번호 122 및 127; 각각 서열 번호 132 및 137; 각각 서열 번호 142 및 147; 또는 각각 서열 번호 152 및 157과 90% 이상 동일한 것인 항체 분자.
  37. 제36항에 있어서, 항체 분자가 항체 VH 도메인 및 항체 VL 도메인을 포함하고, 여기서, 항체 VH 도메인 및 항체 VL 도메인의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 2 및 7, 각각 서열 번호 12 및 17; 각각 서열 번호 22 및 27; 각각 서열 번호 32 및 37; 각각 서열 번호 42 및 47; 각각 서열 번호 52 및 57; 각각 서열 번호 62 및 67; 각각 서열 번호 72 및 77; 각각 서열 번호 82 및 87; 각각 서열 번호 92 및 97; 각각 서열 번호 102 및 107; 각각 서열 번호 112 및 117; 각각 서열 번호 122 및 127; 각각 서열 번호 132 및 137; 각각 서열 번호 142 및 147; 또는 각각 서열 번호 152 및 157인 것인 항체 분자.
  38. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 VH 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 152와 90% 이상 동일하고, 항체 VL 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 157과 90% 이상 동일한 것인 항체 분자.
  39. 제38항에 있어서, 항체 VH 도메인의 아미노산 서열이 서열 번호 152이고 항체 VL 도메인 서열의 아미노산 서열이 서열 번호 157인 것인 항체 분자.
  40. 서열 번호 152의 아미노산 서열을 가진 항체 VH 도메인 및 항체 VL 도메인 서열 서열 번호 157을 포함하는 항체 분자와 IL-18에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체 분자.
  41. 기탁물 수탁 번호 NCIMB 41786의 핵산 서열에 의해 코딩되는 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 분자.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 scFv인 것인 항체 분자.
  43. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 항체 불변 영역을 포함하는 것인 항체 분자.
  44. 제43항에 있어서, 항체 분자가 모노클로날 항체인 것인 항체 분자.
  45. 제44항에 있어서, 항체 분자가 키메라 항체, 인간화된 항체, 또는 완전한 인간 항체인 것인 항체 분자.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 IgG인 것인 항체 분자.
  47. 제46항에 있어서, 항체 분자가 IgG1 또는 IgG4인 것인 항체 분자.
  48. 제47항에 있어서, 항체 분자가 Fc　영역에서 YTE 및 TM 돌연변이를 갖는 IgG1인 것인 항체 분자.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 단리된 VH 도메인.
  50. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 단리된 VL 도메인.
  51. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
  52. 인체 또는 동물 신체 치료 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 포함하는 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 개체에서 IL-18 활성을 감소시키는 데 사용하기 위한 조성물.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 개체에서 IL-18 발현 또는 활성 증가와 관련된 질환 치료에서 사용하기 위한 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 질환이 염증, 심혈관 또는 자가면역 질환인 것인 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 질환이 급성 관상 동맥 증후군(AVS); 죽상동맥경화증; 및 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)으로부터 선택되는 것인 조성물.
  57. 개체에서 IL-18의 활성을 감소시키기 위한 약제 제조를 위한, 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 용도.
  58. 개체에서 IL-18 발현 또는 활성 증가와 관련된 질환 치료용 약제 제조를 위한, 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 용도.
  59. 제58항에 있어서, 질환이 염증, 심혈관 또는 자가면역 질환인 것인 용도.
  60. 제59항에 있어서, 질환이 급성 관상 동맥 증후군(AVS); 죽상동맥경화증; 및 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)으로부터 선택되는 것인 용도.
  61. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체를 치료하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 항체 분자가 개체에서 IL-18의 활성을 감소시키는 것인 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 개체에서 IL-18 발현 또는 활성 증가와 관련된 질환을 치료하기 위한 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 질환이 염증, 심혈관 또는 자가면역 질환인 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 질환이 급성 관상 동맥 증후군(ACS); 죽상동맥경화증; 및 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)으로부터 선택되는 것인 방법.
  66. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자, 제49항에 따른 VH 도메인, 또는 제50항 따른 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  67. 제66항에 따른 핵산으로 시험관내에서 형질전환된 숙주 세포.
  68. 항체 분자 VH 또는 VL 도메인 제조를 위한 조건하에서 제67항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 VH 또는 VL 도메인을 제조하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 항체 분자 VH 도메인 또는 VL 도메인을 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 항체 분자 VH 도메인 또는 VL 도메인을, 1 이상의 추가의 성분을 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  71. 모체 VH 도메인 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3이 표 11에 제시되어 있는 HCDR 세트인 것인, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 모체 VH 도메인의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 모체 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하는 단계, 및 임의적으로 상기와 같이 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하여 하나 이상의 VH/VL 조합물을 제공하는 단계; 및
    모체 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 상기 VH 도메인 또는 VH/VL 조합물 또는 조합물들을 테스트하여 IL-18에 대한 항체 항원 결합 도메인을 확인하는 단계
    를 포함하는, 인간 IL-18에 대한 항체 항원 결합 도메인을 제조하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 모체 VH 도메인이 서열 번호 152에 따른 VH 도메인인 것인 방법.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 하나 이상의 VL 도메인을, 모체 VL 도메인 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이 표 11에 제시된 VL CDR 세트인 것인, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 모체 VL 도메인의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 제공하여 각각이 모체 VL 도메인의 아미노산 서열 변이체인 하나 이상의 VL 도메인을 제조하는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 모체 VL 도메인이 서열 번호 157에 따른 VL 도메인인 것인 방법.
  75. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 모체 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 상기 VH 도메인이 CDR 돌연변이 유발에 의해 제공되는 것인 방법.
  76. 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 항원 결합 도메인을 IgG, scFV 또는 Fab 항체 분자의 성분으로서 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  77. VH 도메인을 코딩하는 출발 핵산, 또는 각각 VH 도메인을 코딩하는 핵산들의 출발 레퍼토리를 제공하는 단계로서, 여기서, VH 도메인 또는 VH 도메인들은 치환시키고자 하는 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3을 포함하거나, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3 코딩 영역이 결여된 것인 단계;
    상기 출발 핵산 또는 출발 레퍼토리를 표 11에 제시된 HCDR1, HCDR2, 및/또는 HCDR3의 아미노산 서열을 코딩하거나, 또는 그의 돌연변이에 의해 제조된 공여체 핵산 또는 공여체 핵산들과 조합하는데, 상기 공여체 핵산 또는 공여체 핵산들이 출발 핵산 또는 출발 레퍼토리 중의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내로 삽입되도록 수행되며, 이를 통해 VH 도메인을 코딩하는 핵산들의 생성물 레퍼토리를 제공하는 것인 단계;
    상기 생성물 레퍼토리의 핵산들을 발현시켜 생성물 VH 도메인을 제조하는 단계;
    임의적으로 상기 생성물 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계;
    생성물 VH 도메인 및 임의적으로 VL 도메인을 포함하는, IL-18에 대한 결합 구성원을 선별하는 단계; 및
    상기 결합 구성원 또는 그를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계
    를 포함하는, 인간 IL-18에 결합하는 결합 구성원을 제조하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 공여체 핵산이 상기 HCDR1 및/또는 HCDR2의 돌연변이에 의해 제조되는 것인 방법.
  79. 제77항에 있어서, 공여체 핵산이 HCDR3의 돌연변이에 의해 제조되는 것인 방법.
  80. 제77항에 있어서, 핵산의 무작위 돌연변이에 의해 공여체 핵산을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  81. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 결합 구성원내 포함된 생성물 VH 도메인을 항체 불변 영역에 부착시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  82. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 생성물 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 IgG, scFv 또는 Fab 항체 분자를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  83. 제77항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, IL-18에 결합하는 항체 항원 결합 도메인 또는 결합 구성원을 인간 IL-18의 IL-18R에의 결합을 억제하는 능력에 대해 테스트하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  84. 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-18에 결합하고, IL-18R에의 인간 IL-18 결합을 억제시키는 항체 분자를 포함하는 결합 구성원을 수득하는 것인 방법.
  85. 제77항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 scFv인 것인 방법.
  86. 제77항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 IgG인 것인 방법.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 항체 분자를 수득하는 단계, 및 항체 분자를 1 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 포함하는, 항체 분자 조성물을 제조하는 방법.
  88. 시료 중 IL-18을 측정하는 방법에서 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자의 용도.
  89. 제88항에 있어서, IL-18이 유리 IL-18인 것인 용도.
  90. (i) 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자를 IL-18에 노출시키는 단계; 및
    (ii) 상기 결합 구성원의 IL-18에의 결합을 검출 및/또는 측정하는 단계
    를 포함하는, IL-18을 검출 및/또는 측정하는 방법.
  91. (i) 시료를 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자와 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 항체 분자의 시료에의 결합을 측정하는 단계
    를 포함하고,
    여기서, 항체 분자의 시료에의 결합이 시료 중 IL-18의 양을 나타내는 것인, 시료 중 IL-18을 측정하는 방법.
  92. 시료를 IL-18과 결합하는 제1 항체 분자와 접촉시키는 단계; 및
    IL-18에 결합하는 제2 항체 분자를 사용하여 상기 제1 항체 분자의 시료 중 IL-18에의 결합을 측정하는 단계
    를 포함하고,
    여기서, 상기 제1 또는 제2 항체 분자 중 하나는 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자이고, 상기 제1 또는 제2 결합 구성원 중 나머지 다른 하나는 IL-18에 대한 결합에 대하여, 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 항체 분자와 경쟁하지 않는 항IL-18 항체 분자인 것인, 시료 중 IL-18을 측정하는 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 시료가 뇌척수액(CSF), 담즙, 뇨, 피지, 객담 또는 혈청 시료인 것인 방법.
  94. 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, IL-18이 유리 IL-18인 것인 방법.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, IL-18이 유리 IL-18인 것인 방법.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20200308A1 (ar) * 2012-09-07 2017-06-16 Novartis Ag جزيئات إرتباط il-18
US10570199B2 (en) * 2012-11-21 2020-02-25 Km Biologics Co., Ltd. Human antibody against IL-18
US10858426B2 (en) * 2013-09-05 2020-12-08 Ab2 Bio Sa IL-18 binding protein (IL-18BP) in inflammatory diseases
WO2015160795A1 (en) * 2014-04-14 2015-10-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating inflammation
MY194040A (en) * 2015-03-05 2022-11-09 Ab2 Bio Sa Il-18 binding protein (il-18bp) and antibodies in inflammatory diseases
WO2018162724A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Mab Discovery Gmbh Antibodies specifically binding to human il-1r7
WO2019213686A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Therapeutic compositions and uses therefor
JP6892180B2 (ja) 2018-12-03 2021-06-23 株式会社ｍＡｂＰｒｏｔｅｉｎ 活性型インターロイキン−１８タンパク質のネオエピトープを認識する抗体、及びその応用
CN109870570A (zh) * 2018-12-29 2019-06-11 广东云天抗体生物科技有限公司 一种检测猴il-18的酶联免疫试剂盒
GB202007404D0 (en) 2020-05-19 2020-07-01 Nasser Syed Muhammad Tahir Treatment for viral respiratory infections
CA3184764A1 (en) * 2020-06-01 2021-12-09 Avalo Therapeutics, Inc. Methods and treatment involving antibodies to il-18
CN112415191A (zh) * 2020-11-06 2021-02-26 郑州人福博赛生物技术有限责任公司 一种白细胞三烯检测试剂盒
JPWO2023286694A1 (ko) 2021-07-13 2023-01-19
WO2023067348A1 (en) 2021-10-21 2023-04-27 Biosirius Ltd Treatment for virally-induced pneumonia
WO2023121643A1 (en) * 2021-12-20 2023-06-29 Avalo Therapeutics, Inc. Methods and treatment for adult-onset still's disease and systemic-onset juvenile idiopathic arthritis involving antibodies to il-18
WO2023178192A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Compugen Ltd. Il-18bp antagonist antibodies and their use in monotherapy and combination therapy in the treatment of cancer

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US565332A (en) 1896-08-04 Toy for making soap-bubbles
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4424200A (en) 1979-05-14 1984-01-03 Nuc Med Inc. Method for radiolabeling proteins with technetium-99m
US4479930A (en) 1982-07-26 1984-10-30 Trustees Of The University Of Massachusetts Amines coupled wth dicyclic dianhydrides capable of being radiolabeled product
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5185243A (en) 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9206318D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Cambridge Antibody Tech Binding substances
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DE69230142T2 (de) 1991-05-15 2000-03-09 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US6492160B1 (en) 1991-05-15 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6225447B1 (en) 1991-05-15 2001-05-01 Cambridge Antibody Technology Ltd. Methods for producing members of specific binding pairs
US5962255A (en) 1992-03-24 1999-10-05 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing recombinant vectors
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5872215A (en) 1991-12-02 1999-02-16 Medical Research Council Specific binding members, materials and methods
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
US6184225B1 (en) 1996-02-13 2001-02-06 Zeneca Limited Quinazoline derivatives as VEGF inhibitors
DE69709319T2 (de) 1996-03-05 2002-08-14 Astrazeneca Ab 4-anilinochinazolin derivate
US5814468A (en) 1996-03-27 1998-09-29 Coulter International Corp. Methods of enumerating receptor molecules for specific binding partners on formed bodies and in solution
GB9718972D0 (en) 1996-09-25 1997-11-12 Zeneca Ltd Chemical compounds
GB9714249D0 (en) 1997-07-08 1997-09-10 Angiogene Pharm Ltd Vascular damaging agents
CA2276216A1 (en) 1998-06-24 1999-12-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo An artificial peptide capable of neutralizing the biological activity of interleukin-18
DE69941267D1 (de) 1998-12-10 2009-09-24 Bristol Myers Squibb Co Proteingerüste für antikörper-nachahmer und andere bindende proteine
GB9900334D0 (en) 1999-01-07 1999-02-24 Angiogene Pharm Ltd Tricylic vascular damaging agents
GB9900752D0 (en) 1999-01-15 1999-03-03 Angiogene Pharm Ltd Benzimidazole vascular damaging agents
AR022952A1 (es) 1999-03-19 2002-09-04 Smithkline Beecham Corp ANTICUERPO MONOCLONAL DE ROEDOR ESPECIFICAMENTE NEUTRALIZANTE PARA LA INTERLEUQUINA-18 HUMANA , UN FRAGMENTO FAB NEUTRALIZANTE o FRAGMENTO F(AB')2, UNA REGION DE COMPLEMENTARIEDAD DE CADENA LIGERA DE INMONOGLOBULINA(CDR), UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO, COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LO COMPRENDE, EL
KR20110032012A (ko) 2000-02-10 2011-03-29 아보트 러보러터리즈 사람 인터류킨-１８에 결합하는 항체 및 이를 제조하고 사용하는 방법
CA2402452A1 (en) 2000-03-31 2001-10-11 Cambridge Antibody Technology Limited Improvements to ribosome display
JP2003535078A (ja) 2000-05-31 2003-11-25 アストラゼネカ アクチボラグ 血管損傷活性のあるインドール誘導体
EP1301498A1 (en) 2000-07-07 2003-04-16 Angiogene Pharmaceuticals Limited Colchinol derivatives as angiogenesis inhibitors
BR0112224A (pt) 2000-07-07 2003-06-10 Angiogene Pharm Ltd Composto, composição farmacêutica, uso de um composto ou de um sal, solvato ou pró-droga farmaceuticamente aceitável do mesmo, e, processo para preparar um composto
IL166244A0 (en) 2001-07-12 2006-01-15 Jefferson Foote Super humanized antibodies
CA2523912A1 (en) * 2003-04-30 2004-11-11 Japan Science And Technology Agency Human antihuman interleukin-18 antibody, fragment thereof and method of using the same
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
US20050100965A1 (en) * 2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins
CA2594356C (en) 2005-01-05 2018-07-17 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. Synthetic immunoglobulin domains with binding properties engineered in regions of the molecule different from the complementarity determining regions
GB0500099D0 (en) 2005-01-05 2005-02-09 Cambridge Antibody Tech Methods and means relating to protein variants
EP2245064B1 (en) * 2007-12-21 2014-07-23 Medimmune Limited BINDING MEMBERS FOR INTERLEUKIN-4 RECEPTOR ALPHA (IL-4Ralpha)
CA2713342A1 (en) * 2008-01-30 2009-08-13 Abbott Laboratories Compositions and methods for crystallizing antibody fragments
US9209965B2 (en) 2014-01-14 2015-12-08 Microsemi Semiconductor Ulc Network interface with clock recovery module on line card

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Publication number Publication date
EP2655416A1 (en) 2013-10-30
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