KR20180115674A - 팔마리아 팔마타 및 자스민의 상승 작용 추출물 및 이를 포함하는 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 팔마리아 팔마타의 수성 추출 후에 수득되고, 이어서 자스민 꽃 머리의 침출이 수행되는, 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 상승 작용 추출물에 관한 것이며, 여기서 팔마리아 팔마타 건조 중량 대 자스민 꽃 머리의 건조 중량의 비율은 40/60 내지 95/5이다.
본 발명은 또한 상기 상승 작용 추출물을 수득하는 방법 및 활성제로서 상기 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 최종적으로, 성인 진피 줄기 세포(SKP)의 "줄기" 특성의 유지를 선호함으로써, 피부의 노화 징후를 없애고 피부의 탄력을 개선하기 위한 상기 조성물의 화장품 용도에 관한 것이다.

Description

팔마리아 팔마타 및 자스민의 상승 작용 추출물 및 이를 포함하는 조성물 및 그의 용도

본 발명은 화장품 분야에 관한 것으로, 특히 진피 수준에서의 작용에 의한 피부 관리에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 자스민 속 식물 (자스민이라 지칭되기도 함) 및 홍조류 팔마리아 팔미타(Palmaria palmata)의 상승 작용 추출물, 상기 추출물을 수득하는 방법, 상기 추출물을 포함하는 조성물 및 피부의 노화 징후를 퇴치하기 위한 화장품 용도, 특히 피부의 탄력성, 유연성 및 견고성을 향상시키기 위한 화장품 용도에 관한 것이다.

노화는 시간이 지남에 따라 신체의 구조와 기능을 변화시키는 일련의 과정, 특히 생리학적 과정에 해당한다. 두 가지 유형의 노화, 즉, 한편으로는 내인성 노화와 다른 한편으로는 외인성 노화가 구별된다. 내인성 노화는 유전적 요인에 기인하고, 피로, 스트레스 상태 동안 발생하는 생화학적 변화, 임신 동안 등과 같은 호르몬 변화에 기인한다. 외인성 노화는 부분적으로 오염, 햇빛, 질병 등과 같이 일생에 걸쳐 신체가 영향을 받는 환경 요인에 기인한다. 그것은 다양한 수단에 의해 신체의 모든 세포에 영향을 미치며 다양한 방법으로 나타나는 느리고 진보적인 과정이다. 예를 들어, 피부의 수준에서, 후자의 외모는 다양한 유형의 내적 또는 외적 침략에 의해 변화되며, 우리는 그 후에 주름 및 선들의 발달, 하이퍼- 또는 하이포- 착색 반점, 피부의 건조 또는 심지어 탈수, 표피의 엷어짐, 탄력 섬유증, 결함(imperfections), 검버섯(age spots)을 볼 수 있다.

피부는 3 가지 세포 층: 표피, 진피, 및 피하 조직으로 주로 구성된 덮개 기관이다. 피부의 표면을 구성하는 표피는 표피 진피 경계(dermoepidermal junction)라고 불리는 다양한 단백질의 매트릭스에 의해 진피에 고정되어 있다.

표피는 표피의 기저막에 위치하는 표피의 줄기 세포에 의해 재생되는, 케라티노사이트라고도 지칭되는 여러 층의 세포로 구성된다.

진피는 피부를 지탱하는 조직으로 주로 프로테오글리칸의 간질성 세포외 매트릭스에 둘러싸인 섬유 아세포, 엘라스틴 섬유 및 콜라겐 섬유(피부 섬유의 70%)로 구성된다. 콜라겐과 엘라스틴 섬유는 섬유 아세포에서 합성된다. 먼저, 프로엘라스틴 형태의 트로포엘라스틴 섬유의 신 합성(neo-synthesis)은 섬유 아세포의 활성과 연관된 과정으로, 이는 세포 외 공간에서 이들 섬유를 분비한다. 성숙 후, 피브릴린과 결합된 엘라스틴은 진피에 신축성을 부여하는 탄성 섬유의 주성분을 나타낸다. 또한, 섬유 아세포는 결합 조직을 재생하고 상처 후 피부의 회복에 기여할 수 있다. 따라서, 피부의 수준에서 많은 기능에 연관된 섬유 아세포는 피부를 건강하고 양호한 상태로 유지하는 데 필수적이다.

예를 들어, 자외선 또는 상처에 의해 손상되었을 때 피부 구조의 재생 또는 회복 활동은 특히 포피(prepuce) 및 모낭과 같은 조직에 위치한 성인 진피 줄기 세포 (피부 유래 전구체 또는 SKPs)의 존재를 의미한다 (Toma 등, 2005, Stem cells 23:727-737). SKP 세포는 섬유 아세포의 재생을 보장한다는 점에서 피부 세포의 주요 전구체 세포(progenitors)이다. 그들은 특히 피부 상처의 회복에 관여한다.

SKP 세포는 일반적으로 줄기 세포의 전형적인 특징을 가지고 있다; 그것들은 자기 재생과 분화를 위한 상당한 능력을 가지고 있으며(Li 등, 2010, J Cell Sci. 123:853-60), 다음과 같은 일련의 분자 마커를 발현하는 세포로 정의된다:

- 네스틴(Nestin) +: 발달 중에 많은 세포에 의해서 발현되는 중간-필라멘트 단백질, 특히 신경관(neural crest)의 세포. 그의 발현은 일시적이며 성인기로 지속되지 않는다.

- OCT4 + (8 량체-결합 전사 인자 4): 미분화 배아 줄기 세포의 자기 재생에 관여하는 다능성 마커.

- SOX2 + (성 결정 영역 Y-box 2): 미분화 배아 줄기 세포의 자기 재생을 유지하는데 필수적인 전사 인자.

피부 노화를 퇴치할 수 있는 활성제를 확인하기 위한 연구는 다양한 효능의 수많은 활성제의 마케팅을 이끌어 냈다. 그러나, 외모를 지연시키거나 피부 노화의 징후를 더욱 효과적으로 퇴치할 수 있는 새로운 화합물을 확인하는 것이 여전히 필요하다. 본 발명에 의해 더 구체적으로 해결하고자 하는 문제는 섬유 아세포에 의해 생성되는 구성 단백질의 대부분의 세포 외 매트릭스의 수준에서 발생하는 피부 노화의 주요 징후를 퇴치할 수 있는 신규 활성제를 확인하는 것이다.

조류는 화장품 분야에서 널리 사용되고 있다. 노화 방지 및 인간 피부의 외모 및 보호를 향상시키기 위한 가능성이 공지되어 있다. 조류의 추출물을 사용하면 피부와 모발의 영양 상태를 개선하면서 양호한 수화 수준을 유지할 수 있다.

미세-조류의 특정 종은 피부 관리를 위해 판매되고 있다. 예를 들어, 아트로스피라(Arthrospira)와 클로렐라(Chlorella)의 추출물은 노화 방지 크림, 항 자극 제품 및 리프레싱 또는 재생 치료 제품으로 잘 알려져 있다.

또한, 조류 팔마리아 속의 종, 특히 팔마리아 팔마타 종은 피부 관리에 효과적인 것으로 알려져 있다. 조류 팔마리아 팔마타는 Dulce 또는 Dulse라고도 한다. 이 해초는 무기물, 특히 불소, 인, 칼륨, 비타민, 단백질 및 다당류(크실란)이 풍부하다. FR2826575는 특히, 각질층(stratum corneum)의 수화를 증가시키는 것뿐만 아니라, 피브로넥틴의 합성 및 섬유 아세포의 증식에 의한 피부 및 모발의 재생을 위해서, 팔마리아 팔마타로부터 추출된 크실란의 화장품 용도를 기술한다.

자스민 꽃, 특히 자스미눔 오피스날(Jasminum officinale) 종의 수성 추출물은 항산화제 특성을 가진 플라보노이드의 알려진 공급원이다. 자스민의 에센셜 오일은 아로마테라피(항산화제) 및 피부과(살균 및 항염증 특성)에 사용된다.

그러나, 한편으로는 자스미눔 오피스날의 추출물 및 다른 한편으로는 팔마리아 팔마타의 추출물의 공지된 용도 중 어느 것도 이들 두 추출물이 서로 독립적으로 또는 서로 조합되어, i) 콜라겐의 증가된 유전자 및/또는 단백질 발현 및/또는 ii) 피부 줄기 세포의 줄기 특성의 증가 특성을 갖고 있음 제시하지 못한다.

현대 화장품의 추세는 주름 개선제나 노화 방지제로서의 효과뿐만 아니라 여러 가지 특성을 결합하여 노화 징후를 개선시키는 광범위한 스펙트럼을 제공하는 천연 기원의 활성 제품의 개발이다.

이제, 발명자들은 팔마리아 팔마타로부터 및 자스미눔 오피스날로부터 수득된 새로운 추출물이 피부 줄기 세포에 상승 효과가 있다는 점에서 피부 관리에 상당한 관심을 갖는다는 것을 입증해 왔다. 이 추출물은 사실상 피부 줄기 세포의 보존을 증가시키고 그들의 기능을 향상시켜 진피의 결합 조직의 구조를 보존하고 심지어 복원하는 것을 가능하게 한다. 이 추출물은 피부의 기계적 특성, 특히 탄알 측정(ballistometry) 시험에서 입증된 것처럼 피부의 탄력성을 개선하여 피부 노화의 특정 징후를 퇴치할 수 있게 한다.

놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명에 따라 사용된 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 상승 작용 추출물이 특히 다음의 이점을 제공한다는 것을 발견했다:

- 상기 추출물은 피부 줄기 세포(SKPs)의 "줄기" 특성 및 특히 진피 세포에서 네스틴 +, OCT4 +, SOX2 +과 관련된 생화학적 마커의 양을 증가시키고,

- 상기 추출물은 피부 탄력성, 피부 유연성 및/또는 피부 견고성을 증가시키며,

- 상기 추출물은 피부의 재생을 증가시키고;

- 상기 추출물은 피부의 세포외 매트릭스의 단백질, 예를 들어 콜라겐, 특히 콜라겐 I, III 또는 V; 프로콜라겐, 특히 프로콜라겐 I, III 또는 V; 및 트로포엘라스틴의 합성을 증가시키며;

- 상기 추출물은 결과적으로 피부 노화와 연관된 피부 징후를 퇴치할 수 있게 한다.

"피부 줄기 세포의 줄기 특성"은 SKP 또는 SKP-유사 세포, 특히 네스틴 +, OCT4 +, SOX2 + 발현의 표현형과 관련된 생화학적 마커의 발현 프로파일을 의미한다.

본 발명 및 그로부터 생기는 이점은 상세한 설명을 읽을 때 더 잘 이해될 것이다.

본 발명은 조류 팔마리아 팔마타의 수성 가수분해물에 식물의 적어도 일부를 침출시킴으로써 수득된 자스민 속 식물의 추출물에 관한 것이다. 상기 추출물을 제조하기 위한 원료로서 사용되는 상기 조류의 건조 중량 대 상기 식물의 건조 중량의 중량비는 바람직하게는 40/60 내지 95/5이다. 이 추출물은 조류 팔마리아 팔마타의 수성 가수분해물과 물에 식물의 적어도 일부를 침출시킴으로써 수득된 자스민 속 식물의 추출물의 혼합물에 의해 수득된 것과 동일한 생물학적 특성을 갖지 않는 본래의 특징을 가지고 있다.

본 발명은 먼저 조류 팔마리아 팔마타 및 자스민 속 식물의 적어도 일부의 상승 작용 추출물에 관한 것이고, 상기 추출물은 i) 상기 조류 팔마리아 팔마타 f의 수성 추출물을 제조하는 단계에 이어 ii) 상기 수성 추출물에 자스민 속 식물의 적어도 일부를 침출시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 것이고, 상기 상승 작용 추출물을 제조하기 위한 원료 물질로서 사용되는 상기 조류의 건조 중량 대 상기 식물 부분의 건조 중량의 중량비는 40/60 내지 95/5이다.

일 구현예에서, 상승 작용 추출물은 이 방법에 의해 수득된다.

본 발명에서, 백분율은 달리 명시하지 않는 한, 중량/중량으로 표시된다.

나머지 설명에서, 용어 "자스민"과 "자스민 속 식물"은 무차별적으로 사용된다.

용어 "추출물"은 일반적으로 천연 식물 원료로부터 얻어지는 분리된 물질을 의미하며 이전에는 자연에 존재하지 않았다.

본 설명에서, 조류 또는 식물에 대한 언급은 수확된 식물 물질을 임의로 건조시키고(스토브 건조 또는 동결 건조와 같은 임의의 공지된 방법에 의해), 임의로 분쇄하여 분말 또는 플레이크로 환원시키는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 "상승 작용 추출물(synergistic extract)"은 팔마리아 팔마타 및 자스민, 바람직하게는 자스미눔 오피스날의 꽃 머리의 수성 추출물을 포함하거나 또는 그로 구성되어, 유전자 발현의 직접적 또는 간접적인 조절에 의한 단백질 합성의 증가에 의해, 또는 단백질의 안정화 또는 메신저 RNA 전사체의 안정화와 같은 다른 생물학적 과정에 의해, 단독으로 배양한 팔마리아 팔마타의 기준 추출물, 단독으로 배양한 자스민의 기준 추출물, 및 이들의 혼합물에 비하여 네스틴 +, OCT4 +, SOX2 +의 발현을 증가시킬 수 있는 추출물을 의미한다. 팔마리아 팔마타의 기준 추출물은 예를 들어 동일한 제조 조건으로 상술한 바와 같은 상승 작용 추출물을 제조하는 방법의 단계 i)를 수행함으로써 수득될 수 있다. 자스민의 기준 추출물은 예를 들어 단계 i)의 말기에 수득된 팔마리아의 수성 추출물의 중량을 동일한 중량의 물로 대체함으로써, 동일한 제조 조건에서 상술한 바와 같은 상승 작용 추출물을 제조하는 방법의 단계 ii)를 수행함으로써 수득될 수 있다. 설명의 전반에 걸쳐, 특성의 증가는 추출물의 건조 물질의 일정한 중량에서 평가된다.

특히, 본 발명에 따른 상승 작용 추출물은 단독으로 배양한 팔마리아 팔마타의 기준 추출물, 단독으로 배양한 자스민의 기준 추출물, 및 임의로 이들의 혼합물에 비해, 피부 줄기 세포의 줄기 특성을 2배 이상 증식시킬 수 있는, 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 수성 추출물을 포함하거나 또는 그로 구성된 추출물이다.

특히, 상기 상승 작용 추출물은 하기와 같이 수행할 수 있다:

단독으로 배양한 팔마리아 팔마타의 기준 추출물, 및 단독으로 배양한 자스민의 기준 추출물에 비해,

- 섬유 아세포에 의해 발현되는 SOX2 +의 메신저 RNA의 양을 8배 이상 증식시키는 것, 및/또는

- 섬유 아세포에 의해 발현되는 네스틴 +의 메신저 RNA의 양을 2배 이상 증식시키는 것, 및/또는

- 섬유 아세포에 의해 발현되는 OCT4 +의 메신저 RNA의 양을 6배 이상 증식시키는 것.

용어 "상승 작용 추출물", "팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 상승 작용 추출물" 또는 "활성제"는 상세한 설명 전반에 걸쳐 동일한 의미의 대안으로 사용될 것이다.

상기 자스민 속 식물의 일부는 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 또는 씨앗일 수 있다. 바람직하게는 상기 부분은 꽃을 포함한다. "꽃 머리"는 줄기가 선택적으로 수반되는 꽃을 포함하는 식물의 일부를 의미한다. 일 구현예에서, 상기 꽃 머리는 꽃과 수 센티미터의 줄기를 포함한다.

본 발명에 따른 추출물은 바람직하게는 팔마리아 팔마타의 수성 추출 후에 수득되고, 이어서 자스민 꽃 머리의 침출이 수행되며, 상기 조류의 건조 중량 대 상기 꽃 머리의 건조 중량의 중량비는 50/50 내지 90/10, 예를 들어 60/40 내지 70/30 또는 80/20 내지 90/10 (포괄적)이다. 일 구현예에서, 중량비는 90/10과 동일하다.

상기 추출물의 제조는 Dulce 또는 Dulse라고도 불리는 팔마리아세아 과(Palmariaceae family)의 홍조류 종인 팔마리아 팔마타의 수성 추출물의 제조에 의해 시작될 수 있다. 그것은 수세기 동안 섬유의 중요한 제공원이 되어 왔다. 이러한 조류는 미네랄이 풍부하고, 특히 불소, 인, 칼륨, 미네랄, 비타민, 단백질 및 다당류(자일란)가 풍부하다.

본 발명에 따라 사용된 팔마리아 팔마타의 수성 추출물은 3 내지 6의 pH에서 및 40 내지 80℃의 온도에서, 적어도 1 시간, 바람직하게는 2 시간 동안 10/1 내지 50/1의 물 대 팔마리아 팔마타(조류의 건조 중량으로 표현됨)의 중량비를 포함하는 팔마리아 팔마타의 수용액의 효소적 가수분해에 의해, 예를 들어 카르보히드라제 및/또는 엔도프로테아제에 의해 수득될 수 있다.

팔마리아 팔마타의 조류는 수확 후 유리하게 건조되고 미세하게 분쇄된다.

물 대 팔마리아 팔마타의 중량비는 바람직하게는 15/1 내지 30/1, 보다 더 바람직하게는 20/1 내지 25/1이다.

상기 pH는 바람직하게는 예를 들어 염산(HCl)을 첨가함으로써 3 내지 6, 바람직하게는 4 내지 5.5, 보다 더 바람직하게는 4 내지 4.5로 조절된다.

가수분해 온도는 바람직하게는 40℃ 내지 80℃, 바람직하게는 50 내지 60℃ 및 보다 더 바람직하게는 55℃이다.

가수분해된 식물 추출물의 사용은 화장품 및 더모-코스메틱스(dermo-cosmetics)에서 많은 이점을 제공한다. 활성 화합물을 방출하는 것 외에도, 가수 분해 및 정제는 보다 안정하고, 보다 용이하게 표준화되고, 화장품에서 알레르기 반응을 일으키지 않는 혼합물을 수득하는 것을 가능하게 한다.

유리하게는, 조절된 가수분해는 팔마리아 팔마타 종의 조류 내에 함유된 당으로의 접근을 허용한다. 본 발명에 따른 추출물은 팔마리아 팔마타 및 자스민으로부터 관심있는 화합물로 농축된 자스민과 팔마리아의 수성 추출물이다.

조절된 효소적 가수분해는 바람직하게는 카르보히드라제로서 자일라나제 및 엔도프로테아제로서 브로멜라인에 의해 수행된다. 이들 효소는 수율 및 가수분해 정도를 최적화할 수 있게 한다.

자일라나제는 이중 치환 메커니즘을 통해 β-1,4-글루코시드의 자일란으로의 가수분해를 촉매하는 글리코실 가수분해 효소 그룹의 효소이다. 자일란의 가수분해는 자일로스를 방출한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 엔도프로테아제는 브로멜라제(bromelase)라 불리기도 하는 브로멜라인(bromelain)이다. 그것은 파인애플의 신선한 줄기와 뿌리에서 추출된 단백 분해 효소이다. 그것은 시스테인의 측쇄의 설페이트화된 그룹을 표적으로 하는 단백질 분해 작용을 갖는 효소들의 혼합물이다.

자일라나제는 상기 반응 혼합물에 첨가된 조류의 건조 중량의 양에 비해 바람직하게는 2 내지 6%, 보다 더 바람직하게는 4%의 양으로 사용되고, 브로멜라인은 바람직하게는 1 내지 3%, 보다 더 바람직하게는 2%의 양으로 사용된다.

이와 같이 수득된 팔마리아 팔마타 의 수성 추출물은 다음으로 원심 분리 및 그에 이어 여과 등의 당업자에게 공지된 방법에 의해 고형 잔류물로부터 분리된다.

이러한 최초의 여과된 수성 추출물은 예를 들어 자스민 꽃 머리에 대한 침출 액체로서 작용할 것이다.

침출은 정의된 시간 동안 액체에 고체를 남기고 그로부터 용해성 화합물을 추출하는 것으로 구성된 과정이다.

바람직하게는, 침출은 주변 온도에서, 예를 들어 18 내지 35℃의 온도에서 2 시간 이상 내지 4 시간 이하의 시간 동안 수행된다.

자스미눔 오피스날 또는 백색 자스민 (또는 일반적인 자스민)은 낙엽성 내지 반영구적인 나뭇잎을 갖는 물푸레나무과(Oleaceae family)의 엉키는 관목(a climbing shrub)으로서, 여름 내내 풍부한 향의 꽃을 제공한다.

자스민 꽃 머리 (식물 부분으로서 꽃을 포함하고 수 센티미터의 줄기가 수반됨)는 종(species) 자스미눔 그랜디플로럼(Jasminum grandiflorum), 자스미눔 오피시날(Jasminum officinale), 자스미눔 오도라티시뭄(Jasminum odoratissimum), 자스미눔 삼박(Jasminum sambac), 자스미눔 오리쿨라툼(Jasminum auriculatum), 자스미눔 플렉사일(Jasminum flexile), 바람직하게는 자스미눔 오피시날(Jasminum officinale) 종들 중의 하나의 꽃 머리로부터 바람직하게 선택된다. 상기 자스민은 바람직하게는 자스미눔 오피시날 종에 속한다.

상기 자스민 꽃 머리는 유리하게 전체로서 사용되고 건조되어 팔마리아 팔마타의 수성 추출물에서 침출되도록 남겨진다.

이렇게 수득된 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 상승 작용 추출물은 여과 후 26.8 내지 30.8　g/kg의 건조 물질 함량, 1.3 내지 2.3　g/kg의 단백질의 농도 및 25.3 내지 29.3　g/kg의 당류(주로 자일로스)의 농도를 갖는다.

이어서, 상기 추출물은 물, 글리세롤, 에탄올, 프로판디올, 부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 에톡실화 또는 프로폭실화된 디글리콜, 사이클릭 폴리올 또는 이들 용매의 임의의 혼합물과 같은 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 용매에서 희석될 수 있다. 바람직하게는, 상기 추출물은 물 및 자일리톨에서 희석되어 30　wt%의 자일리톨에서 최종 추출물을 얻는다. 이어서, 본 발명에 따른 상승 작용 추출물은 280 내지 320 g/kg의 건조 물질의 농도, 8 내지 12　g/kg의 당류의 농도 및 4 내지 5의 pH인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 둘째로 다음 단계들을 포함하고, 다음 단계들에 따라 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 상승 작용 추출물을 수득하는 방법에 관한 것으로:

- 일정량의 팔마리아 팔마타는 10/1 내지 50/1의 물 대 팔마리아 팔마타 (건조 중량으로)의 중량비로 물에 용해되는 단계;

- 팔마리아 팔마타의 수용액은 카르보히드라제 및 엔도프로테아제에 의해 40 내지 80℃의 온도에서 가수분해되는 단계;

- 자스민 꽃 머리는 이전에 수득된 팔마리아 팔마타의 수성 추출물에 침출된 단계(상기 조류의 건조 중량 대 상기 꽃 머리의 건조 중량의 중량비는 40/60 내지 95/5임);

- 수득된 침출 생성물이 여과되고, 다음으로 2 내지 24 시간 동안 40 내지 90℃의 온도에서 가열되어 카르보히드라제 및 엔도프로테아제 효소를 불활성화시키는 단계를 포함한다.

특정 구현예에 따라, 본 발명에 따라 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 상승 작용 추출물을 수득하는 방법은 하기 단계들을 포함하고, 하기 단계들에 따라:

a) 플레이크 형태로 건조되고 미세하게 분쇄된 일정량의 팔마리아 팔마타는 10/1 내지 50/1, 바람직하게는 20/1 내지 40/1의 물 대 팔마리아 팔마타의 중량비로 물에 용해되는 단계;

b) 팔마리아 팔마타의 수용액은 카르보히드라제 및 엔도프로테아제에 의해 가수분해되고, 바람직하게는 3 내지 6, 바람직하게는 4 내지 5.5, 보다 더 바람직하게는 4 내지 4.5의 pH에서, 40 내지 80℃, 바람직하게는 50 내지 60℃, 보다 더 바람직하게는 55℃의 온도에서, 적어도 1 시간, 바람직하게는 2 시간의 시간 동안 자일라나제 및 브로멜라인에 의해 수행되는 단계;

c) 여과 보조제의 임의의 첨가 및 원심 분리 후, 팔마리아 팔마타의 수성 추출물이 수득되는 단계;

d) 건조된 자스민 꽃 머리는 주변 온도에서 2 시간 이상 내지 4 시간 이하의 시간 동안 단계 c)에서 수득된 팔마리아 팔마타의 수성 추출물에서 침출되는 단계(상기 조류의 건조 중량 대 상기 꽃 머리의 건조 중량의 중량비는 40/60 내지 95/5이고, 바람직하게는, 상기 조류의 건조 중량 대 상기 꽃 머리의 건조 중량의 중량비는 90/10과 동일함);

e) 이와 같이 단계 d)에서 수득된 침출 생성물이 여과되어 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 추출물을 회수하고, 이는 2 시간 이상 내지 24 시간 이하 동안, 바람직하게는 12 시간 또는 하룻밤 동안 40 내지 90℃, 바람직하게는 80℃의 온도에서 가열되어 카르보히드라제 및 엔도프로테아제 효소를 불활성화시키는 단계; 및

f) 이는 여과에 의해 임의로 정제되어 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 상승 작용 추출물을 수득하는 단계를 포함한다.

단계 d) 동안, 자스민 꽃 머리는 글리콜 또는 보다 일반적으로는 메탄올과 같은 알콜을 함유하는 매질에서 반드시 침출되는 것은 아니며; 물만에 기초하는 액체 매질의 사용이 바람직하다. 더욱이, 팔마리아의 수성 추출물에서 꽃을 침출하는 단계는 꽃에서 페놀 화합물 및 탄수화물을 추출하기 위해 선행 기술에서 종종 예상되는 효소적 가수분해 단계를 필수적으로 포함하지 않는다. 자스민 꽃을 첨가하기 전에, 효소적 가수분해는 팔마리아의 수성 추출물 상에서 수행된다.

단계 b) 내지 e) 후에, 수득된 용액은 탁하게 될 수 있다. 원심 분리 및 여과의 단계는 부유된 고체 잔류물을 제거하기 위해 수행된다. Celatom®과 같은 여과 보조제는 혼합물에 첨가될 수 있고, 이어서 여과 단계는 액상으로부터 고체를 분리하기 위해 수행되고, 고체는 폐기된다. 감소하는 다공성의 필터 상의 여러 번의 연속적인 여과 단계가 수행될 수 있다. 수집된 여액은 다당류에서 풍부한 팔마리아 팔마타의 추출물을 구성한다.

팔마리아 팔마타의 효소적 가수분해 및 팔마리아의 추출물 중의 자스민 꽃 머리의 침출로부터 초래되는 여액은 잔류 효소의 불활성화 후에, 본 발명에 따른 활성 상승 작용 추출물의 제1 형태 또는 제1 여액을 구성한다. 이 단계에서, 제 1 여액은 예를 들어 26.8 내지 30.8　g/kg의 건조 물질의 농도, 1.3 내지 2.3 g/kg의 단백질 화합물의 함량 및 25.3 내지 29.3 g/kg의 당 함량을 갖는다.

이어서, 이러한 제1 활성 여액은 물, 글리세롤, 에탄올, 프로판디올, 부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 에톡실화 또는 프로폭실화된 디글리콜, 사이클릭 폴리올 또는 이들 용매의 임의의 혼합물과 같은 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 용매에서 희석될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제1 활성 여액은 30%의 자일리톨을 함유하는 제 2 여액 또는 최종 추출물이 수득되도록 용매 혼합물에서 희석된다. 본 발명에 따른 상승 작용 추출물은 또한 0.5% 나트륨 벤조에이트를 갖는 오염 물질로부터 보존될 수 있다.

용매에 희석된 제 2 여액은 멸균 조건 하에서 여과되고, 완전 멸균을 위해 저온에서, 바람직하게는 65℃ 에서 밤새 저온 살균될 수 있다.

이러한 구현예에 따라, 본 발명에 따른 상승 작용 추출물을 구성하는 최종 여액이 수득된다. 본 발명에 따라 수득된 상승 작용 추출물은 그의 물리화학적 특성 및 화합물의 함량을 결정하기 위해 당업자에게 익숙한 통상적인 기술에 의해 정성적 및 정량적으로 분석될 수있다.

바람직하게는, 제 1 활성 여액이 30%의 자일리톨을 함유하는 경우, 본 발명에 따른 상승 작용 추출물은 280 내지 320g/kg의 건조 물질의 농도, 8 내지 12g/kg의 당의 농도, 및 4 내지 5의 Ph를 특징으로 한다.

본 발명은 셋째로 피부 노화의 징후를 퇴치하기 위해 상기 조성물의 총 중량의 0.0001% 내지 20　% 건조 중량의 농도로, 바람직하게는 상기 조성물의 총 중량의 0.05% 내지 5　% 건조 중량의 농도로 본 발명에 따른 상승 작용 추출물을 생리학적으로 허용 가능한 매질 중에 포함하는 조성물에 관한 것이다.

"생리학적으로 허용 가능한"이란 본 발명에 따른 상승 작용 추출물 또는 상기 제제를 함유하는 조성물이 독성 또는 불내증 반응을 일으키지 않고 피부 또는 점막과 접촉하기에 적합하다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 상승 작용 추출물은 화장품 분야에서 사용되거나 또는 분말 형태의 유기 중합체에 흡착된 리포솜 또는 임의의 다른 마이크로캡슐과 같은 화장품용 또는 제약학적 담체, 또는 활석 및 벤토나이트와 같은 미네랄 지지체 내에 캡슐화되거나 포함될 수 있다.

이들 조성물은 특히 수성, 수성-알콜성 또는 유성 용액; 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼 또는 다중 에멀젼의 형태일 수 있고; 이들은 또한 피부, 점막, 입술 및/또는 부속기관(appendages)에 도포하기에 적합한 크림, 현탁액 또는 분말의 형태일 수 있다. 이들 조성물은 다소간 액체이거나 크림, 로션, 우유, 혈청, 연고, 겔, 페이스트 또는 발포체의 외관을 가질 수 있다. 이들 조성물은 또한 스틱과 같은 고체 형태일 수도 있고 에어로졸 형태로 피부에 도포될 수도 있다. 이들 조성물은 피부 관리 제품 및/또는 피부 메이크업 제품으로 사용될 수 있다.

이들 조성물은 용매, 공용매 (에탄올, 글리세롤, 벤질 알콜), 증점제, 희석제, 산화 방지제, 염료, 선 필터, 셀프-태닝제, 안료, 필러, 방부제, 향수, 냄새 흡수제, 화장품용 또는 제약학적 활성 성분, 에센셜 오일, 비타민, 필수 지방산, 계면 활성제, 미량 원소, 필름 형성 중합체, 화학적 또는 미네랄 필터, 수화제 또는 온천수, 다당류 또는 폴리펩타이드와 같은 중합체, 메틸 셀룰로스 유형 또는 히드록시프로필 셀룰로오스의 셀룰로스 유도체, 또는 그 밖의 합성 중합체, 폴록사머, 카보머, 실록산, PVA 또는 PVP와 같이 그들의 제형화를 위해 요구되는 보조제 뿐만 아니라 예상된 적용 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 첨가제를 추가로 포함한다.

모든 경우에 있어서, 당업자는 이들 첨가제 및 이들의 비율이 본 발명에 따른 조성물의 요구되는 유리한 특성에 악영향을 미치지 않는 방식으로 선택된다는 점에 유의할 것이다. 이들 첨가제는 예를 들어 상기 조성물의 총 중량의 0.01 내지 20%에 상응할 수 있다. 본 발명의 조성물이 에멀젼인 경우, 유성상은 상기 조성물의 총 중량에 대하여 5 내지 80 중량%, 바람직하게는 5 내지 50 중량%로 나타날 수 있다. 상기 조성물에 사용된 유화제 및 공-유화제는 문제의 분야에서 통상적으로 사용되는 것으로부터 선택될 것이다. 예를 들어, 이들은 조성물의 총 중량에 대하여 0.3 내지 30 중량%의 비율로 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 사용할 수 있는 조성물은 임의의 적합한 경로, 특히 경구 또는 외부 국소로 도포될 수 있으며, 조성물의 제형은 당업자에 의해 적응될 것이다.

유리하게는, 본 발명에 따른 조성물은 국소 도포에 적합한 형태이다. 따라서, 이들 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 매질, 즉 피부 및 부속기관과 양립할 수 있는 매질을 함유해야 하며, 모든 화장품 형태를 포함한다.

유리하게는, 본 발명을 구현하기 위해 사용할 수 있는 조성물은 본 발명에 따른 활성제 외에, 본 발명의 미용 효과와 유사한 및/또는 보완적인 미용 효과를 갖는 하나 이상의 다른 활성제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 이 활성제는 "추가 활성제"로서 정의될 것이다.

예를 들어, 추가적인 활성제 또는 활성제들은 다음: 노화 방지제, 고화제(firming agents), 미백제(lightening agents), 수화제, 미세 순환을 선호하는, 배수제, 제약학적 제제, 엑스폴리에이팅제, 세포 외 기질을 자극하고 에너지 대사를 활성화시키는 박리제, 항균제, 항진균제, 진정제, 항-자유-라디칼 제제, 항-UV 제제, 열감을 제공하고 신선감을 제공하는 마취제, 및 슬리밍제로부터 선택될 수 있다.

이들 추가의 제제는 하기를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다:

- 비타민 A 및 특히 레티노산, 레티놀, 프로피온산 레티놀, 팔미트산 레티놀,

- 비타민 B3 및 더욱 특히 니코틴아미드, 니코틴산 토코페롤,

- 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 판테놀,

- 비타민 C, 특히 아스코르브산, 아스코르빌 글루코시드, 테트라팔미트산 아스코르빌, 아스코르빌 인산 마그네슘 및 나트륨,

- 비타민 E, F, H, K, PP, 코엔자임 Q10,

- 메탈로프로테이나제 억제제, 또는 TIMP 활성화제,

- DHEA, 그의 전구체 및 유도체,

- 아르기닌, 오르니틴, 히드록시프롤린, 히드록시프롤린 디팔미테이트, 팔미토일글리신, 히드록시리신, 메티오닌 및 그의 유도체, N-아실 아미노산 화합물과 같은 아미노산,

- 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 및 헥사 펩타이드 및 이들의 친유성 유도체, 이성질체 및 금속 이온 (예, 구리, 아연, 망간, 마그네슘 등)과 같은 다른 종과의 착물을 포함하는 천연 또는 합성 펩티드. 예를 들어, 상표명 MATRIXYL^®, ARGIRELINE^®, COLLAXYL^TM, PEPTIDE VINCI 02^TM, CHRONOGEN^TM, LAMINIXYL IS^TM, PEPTIDE Q10^TM으로 상업적으로 공지된 펩타이드, 상표명 ATPeptide^TM으로 시판되는 서열 Arg-Gly-Ser-NH₂의 합성 펩타이드, 상표명 SIRPeptide^TM으로 시판되는 서열 Pro-Leu-Asp-Thr-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gln의 합성 펩타이드.

- 대두, 스펠트, 포도 덩굴, 유채, 아마, 쌀, 옥수수, 또는 완두콩의 추출물 등의 식물성 펩타이드 추출물,

- 효모 추출물, 아르테미아 살리나(Artemia salina)의 추출물,

- 데하이드로 아세트산 (DHA),

- 합성 또는 천연 기원의 파이토스테롤,

- 살리실산 및 그의 유도체, 알파- 및 베타-히드록시산, 실란올,

- 아미노 당, 글루코사민, D-글루코사민, N-아세틸-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민, 만노사민, N-아세틸 만노사민, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민,

- 폴리페놀, 이소플라본, 플라보노이드의 추출물, 예컨대, 포도 추출물, 소나무 추출물, 올리브 추출물,

- 세라마이드 또는 인지질과 같은 지질, 스쿠알렌 또는 스쿠알란과 같은 동물 기원의 오일; 식물성 오일, 예컨대 달콤한 아몬드 오일, 야자 기름(copra oil), 피마자유, 호호바 오일, 올리브 오일, 유채유, 땅콩 오일, 해바라기 오일, 밀 배아 오일, 옥수수 배아 오일, 대두유, 면실유, 알팔파 오일, 양귀비 오일, 호박 오일, 달맞이꽃 오일, 기장 기름, 보리 오일, 호밀 오일, 잇꽃 오일, 패션플라워 오일, 헤이즐넛 오일, 팜유, 살구씨 오일(apricot kernel oil), 아보카도 오일, 금송화 오일; 에톡실화 식물성 오일, 시어 버터,

- UV 스크린 및 선 필터.

본 발명의 또 다른 구현예는 피부의 노화 징후를 퇴치하기 위한, 특히 SKP 성인 진피 줄기 세포의 "줄기" 특성의 유지를 선호함으로써, 본 발명에 따른 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 상승 작용 추출물의 화장품 용도에 관한 것이다.

본 발명은 포유류 및 특히 인간에 관한 것이다.

"피부 노화의 징후"는 예를 들어 주름 및 선, 시든 모습, 견고성의 상실, 엷어짐, 탄력성 및/또는 색조의 상실, 광채의 침체 및 상실과 같은 내인성 및 외인성 노화로 인한 피부 및 부속기관의 외관 변화를 의미하지만, 자외선(UV)과 같은 외부 요인으로 인해 유발된 피부의 임의의 내부 열화와 같이 변경된 외관에 항상 반영되지는 않는 피부의 임의의 내부 변화도 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 활성제 또는 이를 함유하는 조성물은 특히 피부의 탄력성, 유연성 및 견고성의 상실을 퇴치할 수 있게 한다.

"피부 노화의 징후를 퇴치하는 것"은 외모를 지연시키거나 시각적 외모를 개선하거나 그러한 징후를 교정하는 것 등을 의미한다. 특히, "노화의 징후를 퇴치하는 것"은 피부의 기계적 성질을 향상시키는 것, 특히 견고성, 유연성 및/또는 탄력성을 증가시키는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명은 또한 피부의 탄력성을 개선시키기 위한 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 상승 작용 추출물의 화장품 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 피부의 탄력성 특성을 개선시키기 위한 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 상승 작용 추출물의 화장품 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 용어 "피부"는 털이 없는 피부 및 신체의 표면 상에 존재하는 모든 각질 부속기관, 특히 강모, 속눈썹, 눈썹, 손톱 및 머리카락을 포함한다.

피부의 영구적인 재생뿐만 아니라 자외선 또는 상처와 같은 손상 후의 피부의 회복은 피부의 줄기 세포라고 불리는 체세포 줄기 세포 또는 피부 내의 SKP의 존재를 의미한다. 줄기 세포의 이러한 예비량은 노화와 외부 요인의 공격적인 작용에 따라 감소하여 피부 재생 용량을 줄이고 피부의 노화 징후의 외관에 기여한다.

"외부 공격적 요소"라는 표현은 환경에서의 공격적인 요소를 의미한다. 예를 들어, 우리는 오염, 자외선 방사 또는 계면 활성제, 방부제 또는 향수와 같은 자극적 성질의 제품과 같은 인자를 언급할 수 있다. 일 예로써, 우리는 오염, 자외선 방사 또는 계면 활성제, 방부제 또는 향수와 같은 자극적 성질의 제품과 같은 인자를 언급할 수 있다. 오염은 예를 들어 디젤 입자, 오존 또는 중금속으로 인한 "외부" 공해와 페인트 용제, 접착제 또는 벽지(톨루엔, 스티렌, 자일렌 또는 벤즈알데하이드 등)로 인한 배출로 인한 것일 수 있는 "내부" 공해, 또는 담배 연기를 의미한다. 대기의 건조는 건조한 피부의 중요한 원인이기도 하다.

이제, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 활성제가 SKP 세포를 보호하고 그 활성을 보강한다는 것을 발견했다. 실제로, 본 발명에 따른 추출물은 피부 줄기 세포의 "줄기" 특성의 특징인 마커의 시너지 증가를 허용하며, 이는 팔마리아 팔마타 만의 추출물 또는 자스민 꽃 머리 만의 수성 추출물에 의한 처리 후에 관찰된 활성화보다 훨씬 더 크다.

따라서 상승 작용 추출물은 노화에 의해 야기되는 피부 손상을 예방 또는 회복하기 위한 화장료 조성물에서 활성제로서 사용될 수 있으며, 이는 아마도 태양에 노출되거나 건조 환경에 의해 가속될 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 피부 견고성, 피부 탄력성, 피부 유연성 및 피부 재생 속도로 구성된 군으로부터 선택되는, 사람의 건강한 피부 영역의 상태들 중 하나 이상을 개선시키기 위한, 팔마리아 팔마타의 수성 추출물에서 상기 꽃 머리의 침출에 의해 얻어진 자스민 꽃 머리의 추출물의 화장품 용도에 관한 것이다.

본 발명의 의미에서, "화장품 용도"는 치료 용도로 의도되지 않은 용도를 의미한다. 이러한 용도의 맥락에서, 추출물은 건강한 사람 피부의 일부에 적용된다. 건강한 피부 영역은 임의의 질병, 임의의 피부 질환 (건선, 습진 또는 여드름) 또는 임의의 상처를 감지하지 못한 피부과 전문의에 의해 쉽게 특징 지어질 수 있다.

노화가 진행되는 동안, 콜라겐의 양이 전반적으로 감소하여 피부 견고성의 손실을 유도한다. 이러한 현상은 피부가 추위 또는 자외선과 같은 외부 공격적 요인에 적용될 때 가속화될 수 있다.

피부 노화는 생물학적 원인이 서로 독립적인 여러 가지 징후로 나타나고, 그에 따라서 특정 표적에 작용하는 활성 성분을 제안하여 노화의 특정 징후의 감소를 유도하여 피부 노화를 퇴치하는 것이 가능하다.

이들 징후는 견고성의 상실, 뻣뻣함의 증가 및 탄력성의 상실을 포함한다. 피부의 기계적 특성의 저하는 주로 피부의 세포외 매트릭스에서 콜라겐 양의 감소로 인한 것이다. 이러한 감소는 그 자체로 효소에 의한 콜라겐 분자의 분해, 이들 동일한 분자의 당화 및 섬유 아세포에 의한 콜라겐 생성의 감소를 포함하여, 서로 독립적인 다양한 원인에 기인한다.

화장료 조성물에 혼입된 당업자에 의해 알려진 노화 방지 효과를 갖는 생물학적 활성 성분은 콜라겐 분해에 책임 있는 콜라게나제의 활성을 억제한다. 콜라겐 당화 메카니즘을 억제하는 다른 활성 성분들은 또한 화장품 케어 제품으로 제안되어 왔다. 이들 활성 성분 및 이들 화장료 조성물은 콜라겐 섬유의 분해 및 분열을 늦춘다. 이러한 제품은 새롭게 합성된 피부 단백질의 양 또는 세포 재생 속도를 증가시키는 것을 가능하게 하지 못한다.

따라서, 여전히 피부 노화의 징후를 퇴치하기 위해 보다 효과적인 생물학적 활성 성분을 제안할 필요가 있다. 본 발명의 목적은 시간이 지남에 따라 피부에서 콜라겐의 양을 안정화시킬 수 있을 뿐만 아니라 콜라겐의 유전자 및/또는 단백질 발현을 증가시킬 수 있는 식물 기원의 새로운 추출물을 제공하여, 결과적으로 유연성 및 탄력성과 같은 피부의 기계적 특성을 개선시키는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 그의 유연성 수준, 그의 탄력성 수준 및/또는 그의 세포 재생 속도를 증가시킴으로써 피부의 노화를 퇴치하기 위해 상기 기술되거나 상기 기술된 방법에 의해 제조된 추출물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추출물에 의해 생성된 피부 유연성 및 탄력성의 증가는 콜라겐, 트로포엘라스틴 및 프로콜라겐으로부터 선택된 진피의 세포 외 매트릭스의 적어도 하나의 단백질의 발현 증가와 관련될 수 있다. 진피 내의 단백질의 발현 증가는 상기 단백질의 유전자 발현 및/또는 단백질 발현의 증가에 상응할 수 있다. 특정 구현예에서, 피부 견고성 및 탄력성의 증가는 예를 들어 콜라겐 I, 콜라겐 III, 프로콜라겐 I, 프로콜라겐 III 및 트로포엘라스틴의 합성의 동시 증가에 의한 콜라겐 및 엘라스틴의 합성의 동시 증가에 의해 야기된다.

피부의 세포 재생의 증가는 피부 줄기 세포의 수의 증가 및/또는 그들의 기능의 개선에 반영될 수 있으며, 이로 인해 상승 작용 추출물의 적용 전에 악화된 피부 결합 조직의 구조를 복원하는 것이 가능하다. 시너지 추출물. 특정 경우에 있어서, 본 발명은 섬유 아세포에 의해 발현된 마커인 네스틴 +, OCT4 + 및 SOX2 + 중의 적어도 하나의 발현을 증가시킴으로써 피부 줄기 세포의 줄기 특성을 복원 또는 향상시키는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 더욱 상세하게는 피부의 견고성, 유연성 및/또는 탄력성을 증가시킴으로써 피부의 노화를 퇴치하기 위한, 팔마리아 팔마타의 수성 추출물에서 상기 꽃 머리의 침출에 의해 얻어진 자스민 꽃 머리의 추출물의 화장품 용도에 관한 것이다. 견고성, 유연성 및/또는 탄력성의 증가는 진피의 섬유 아세포에 의한 단백질의 합성을 증가시킴으로써 유도될 수 있다.

본 발명은 또한 피부 줄기 세포 (SKP)의 줄기 특성을 증가시킴으로써 및/또는 피부에서 피부 줄기 세포의 양을 증가시킴으로써 진피의 세포 재생을 증가시키기 위한, 팔마리아 팔마타의 수성 추출물에서 상기 꽃 머리의 침출에 의해 얻어진 자스민 꽃 머리의 추출물의 화장품 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 유리하게는 진피의 적어도 하나의 단백질의 발현을 증가시키기 위한, 전술한 추출물의 국소 경로에 의한 화장품 용도에 관한 것이다. 진피 내의 단백질의 발현 증가는 상기 단백질의 유전자 발현 및/또는 단백질 발현의 증가에 상응할 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 콜라겐, 트로포엘라스틴 및 프로콜라겐으로부터 선택된다. 콜라겐은 바람직하게는 콜라겐 I 또는 콜라겐 III이다. 프로콜라겐은 바람직하게는 프로콜라겐 I, 또는 프로콜라겐 III이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 프로콜라겐 I의 단백질 발현, 콜라겐 III의 단백질 발현, 및 트로포엘라스틴의 단백질 발현을 동시에 증가시키기 위한 추출물의 용도에 관한 것이다.

진피의 콜라겐의 발현 증가는 본 발명에 따른 추출물의 부재하에 측정된 콜라겐의 단백질 발현 수준에 비해 콜라겐의 단백질 발현 수준에서 적어도 15%의 증가일 수 있다. 이러한 증가는 바람직하게는 진피 등가물의 중량의 0.01 중량% 정도의 건조 추출물의 양을 사용하여, 성인 공여자 섬유 아세포로부터 얻은 SKP 또는 SKP 유사 유형의 섬유 아세포 및 피부 줄기 세포를 함유하는 진피 등가물에서 측정된다. 예를 들어, 프로콜라겐 I 및 콜라겐 III의 단백질 발현 수준의 증가는 예를 들어 포낭 형광(epifluorescence) 현미경으로 관찰하여 검출하는 면역 표식 방법을 사용하여 실시예 3에 기재된 바의 프로토콜에 따라 측정된 진피 등가물에서 적어도 20%로 측정되고, 선택적으로 포낭 형광 현미경으로 관찰하여 검출하는 면역 표식 방법을 사용하여 실시예 5에 기재된 바의 프로토콜에 따라 측정된 진피 등가물에서 적어도 15 %의 트로포엘라스틴의 단백질 발현 수준의 증가와 조합된다.

유연성 및/또는 탄력성의 증가는 본 발명에 따른 추출물을 적용하기 전에 측정된 피부 샘플의 유연성 또는 탄력성 각각의 수준에 대해 각각 적어도 15 %의 증가일 수 있다. 유연성 및 탄력성의 증가는 배양 배지의 중량의 0.01 중량% 단위의 건조 중량에 상당하는 추출물의 양을 사용하여 SKP 또는 SKP 유사 유형의 섬유 아세포 및 피부 줄기 세포를 함유하는 진피 등가물에 대해 피부 탄력 측정기(ballistometer)를 사용하여 측정될 수 있다.

피부 탄력 측정 방법은 미리 정해진 높이에서 피부 샘플 위에 떨어진 공의 진동을 추적하는 것으로 구성된다. 방출될 때 공의 침투 깊이(압흔(indentation)이라고 함)는 피부의 강성 및 결과적으로 피부의 유연성을 측정할 수 있게 한다. 사실 상, 공의 침투가 깊어 질수록 피부의 강성이 낮아진다. 탄력성은 진동 피크의 모든 상단을 연결하는 곡선의 기울기(알파라고 함)를 계산하여 평가된다. 피부가 더 탄력적일수록, 공이 더 많이 튀어오르고 경사는 더 낮아진다.

강도의 감소로 표현될 수도 있는 유연성의 증가는 예를 들어 SKP 또는 SKP 유사 유형의 섬유 아세포 및 피부 줄기 세포를 함유하는 진피 등가물에 대한 피부 탄력 측정 방법을 사용하여, 특히 실시예 6의 프로토콜에 따라 본 발명에 따른 추출물을 적용하기 전에 측정된 압흔에 대해 예를 들어 적어도 15 %의 압흔의 감소이다.

탄력성의 증가는 예를 들어 SKP 또는 SKP 유사 유형의 섬유 아세포 및 피부 줄기 세포를 함유하는 진피 등가물에 대한 피부 탄력 측정 방법을 사용하여, 특히 실시예 6의 프로토콜에 따라 본 발명에 따른 추출물을 적용하기 전에 측정된 기울기 알파에 대한 기울기 알파의 적어도 15 %의 증가이다.

피부의 세포 재생의 증가는 본 발명의 추출물의 적용 전후에 배양 배지의 중량의 0.01 중량% 정도의 건조 중량에 상당하는 양으로 사용된 시험 관내에서 배양된 섬유 아세포에 의해 발현되는 SOX2, 네스틴 및/또는 OCT4의 mRNA 양을 비교함으로써 정량적 PCR 방법으로 측정한 섬유 아세포에서 마커 네스틴, OCT4 및 SOX2 중의 적어도 하나의 발현의 증가일 수 있다. 섬유 아세포에서 SOX2, 네스틴 및 OCT4의 mRNA 발현의 증가는 바람직하게는 각각 적어도 250 %, 적어도 100 % 및 적어도 250 %이다.

본 발명은 또한 피부의 견고성, 유연성 및/또는 탄력성을 증가시키거나 재생 속도를 증가시키기 위해, 상기한 바와 같은 상승 작용 추출물을 대상의 건강한 피부에 적용하는 것을 포함하는 화장 케어 방법에 관한 것이다.

이러한 화장품 케어 방법 및 이들 용도에 대해 특정한 구현예는 또한 상기 설명으로부터 초래된다.

본 발명의 다른 장점 및 특징은 이하에 주어진 예시적이고 비제한적인 실시예를 읽음에 따라 보다 상세히 알 수 있다.

모든 도면에서, 그래픽 표현에 사용된 수치는 세 가지 측정의 평균값이다. 오차 막대는 평균 표준 편차를 기반으로 계산된 값 RQmin 및 RQmax에 해당한다: ***: Dunnett 시험에서 매우 높게 유의미함; **: 매우 유의미함, *: 유의미함.
도 1: 섬유 아세포에 다른 추출물을 적용한 후 SOX2, 네스틴 및 OCT4의 mRNA의 qPCR. 그래픽 표현에 사용된 수치는 세 가지 측정의 평균값이다. 오차 막대는 평균 표준 편차를 기반으로 계산된 값 RQmin 및 RQmax에 해당한다: ***: Dunnett 시험에서 매우 높게 유의미함; **: 매우 유의미함, *: 유의미함.
도 2: SKP 세포를 함유하는 진피 등가물에 실시예 1에 따른 상승 작용 추출물의 1%를 적용한 후 세포 외 매트릭스(프로콜라겐 I 및 콜라겐 III)의 단백질의 발현. 그래픽 표현에 사용된 수치는 세 가지 측정의 평균값이다. 오차 막대는 평균 표준 편차를 기반으로 계산된 값 RQmin 및 RQmax에 해당한다: ***: Dunnett 시험에서 매우 높게 유의미함; **: 매우 유의미함, *: 유의미함.
도 3: SKP 유사 세포를 함유하는 진피 등가물에 실시예 1에 따른 상승 작용 추출물의 1 %를 적용한 후의 콜라겐 III의 발현. (평균 +/- SEM; n=6, 조건 당 3 진피 및 진피 등가물 당 2 개의 사진). *: 학생의 "t" 시험에서 유의미함 - 일방적인 가설.
도 4: 실시예 1에 따른 상승 작용 추출물의 1 %를 적용한 후 SKP 유사 세포를 함유하는 진피 등가물의 수축률의 측정 (평균 +/- SEM; n=3 진피 등가물). * *: 학생의 "t" 시험에서 매우 유의미함 - 일방적인 가설.
도 5: 실시예 1에 따른 상승 작용 추출물의 1 %를 적용한 후, SKP 유사 세포를 함유하는 진피 등가물에서 트로포엘라스틴 섬유의 합성의 측정. (평균 +/- SEM; n=10-12, 진피 등가물 당 3-4 개의 사진). *: 학생의 "t" 시험에서 유의미함 - 일방적인 가설.
도 6: 실시예 1에 따른 상승 작용 추출물의 1 %를 적용한 후, SKP 유사 세포를 함유하는 진피 등가물의 강성 및 탄력성의 측정. (평균 +/- SEM; n=15, 진피 등가물 당 5 측정). *: 학생의 "t" 시험에서 유의미함 - 일방적인 가설.
도 7: 실시예 1의 상승 작용 추출물에 의한 마커 SOX2 및 네스틴의 활성화 전후의 광학 현미경 (배율 * 40)에 의한 관측 사진.
다음 실시예들에서 표현된 모든 결과는 학생 또는 Dunnett 시험에 따라 통계적으로 유의미하다(p< 0.05).

실시예 1: 팔마리아 팔마타 및 자스민 꽃 머리의 상승 작용 추출물의 제조

플레이크 형태의 팔마리아 팔마타 180g을 4kg의 물에 용해시키고, HCl로 pH를 4.5 내지 5.5의 값으로 조정한다.

팔마리아 팔마타로부터 당을 추출하기 위해, 가수 분해는 가수 분해 효소 및 프로테아제를 사용하여 수행된다. 이를 위해, 자일라나제 7.2g과 브로멜라인 3.6g을 반응 혼합물에 첨가한다. 이어서, 반응 혼합물을 55℃에서 2 시간 동안 가열한다.

여과 단계는 고체 잔류물을 버리고 탄수화물이 풍부한 여액만을 유지하는 것을 가능하게 한다. 이를 위해, 10　g/kg의 CELATOM ^® (여과 보조제)를 첨가하고, 그 용액을 4000 rev/분으로 10분 동안 원심 분리한다. 원심 분리 후, 잔류 고체를 제거하고 여액을 셀룰로오스 필터 상에서 여과하여 다양한 정도로 정화한다.

제 2 단계에서, 자스미눔 오피스날의 꽃 20g을 수득된 약 3.6kg의 여액에 첨가하고, 침출은 주위 온도에서 2 시간 동안 수행한다.

10　g/kg CELATOM^®을 혼합물에 첨가하고, 고체를 여과에 의해 여액으로부터 분리하였다.

이어서, 여액(팔마리아 팔마타의 효소적 가수분해 및 자스민 꽃 머리의 침출로부터 초래됨)을 80℃에서 밤새 가열하여 잔류 효소를 비활성화시킨다.

이어서, 용액을 감소하는 다공성의 필터로 여과함으로써 정제하여 밝은 호박색의 투명한 용액을 수득한다.

수득된 상승 작용 추출물은 28.8 ± 2.0　g/kg의 건조 물질, 1.8 ± 0.5　g/kg의 단백질 함량 및 27.3 ± 2.0　g/kg의 당 함량을 특징으로 한다.

이어서, 용액을 물로 희석하고 멸균 조건에서 여과하고, 이어서 낮은 온도(65℃ 에서 밤새)에서 저온 살균하여 멸균을 완료한다.

활성 상승 작용 추출물에 상응하는 최종 생성물은 엷은 황색의 투명한 용액이며, 다음: 10 ± 3.0　g/kg의 건조 물질, 8 내지 12　g/kg의 당 함량 및 4 내지 5의 pH를 특징으로 한다.

실시예 2: 팔마리아 팔마타의 기준 추출물, 및 자스민 꽃 머리의 기준 추출물에 비교한, 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물의 적용 후 SOX2, 네스틴 및 OCT4의 mRNAs의 평가

본 연구의 목적은 자스민의 기준 추출물, 팔마리아 팔마타의 기준 추출물 및 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물로 처리한 후 세포들에 의해 발현된, SOX2의 mRNA, 네스틴의 mRNA 및 OCT4의 mRNA의 양을 비교하는 것이다.

SOX2, 네스틴 또는 OCT4의 mRNA의 수준을 정량적 PCR (q-PCR)에 의해 평가하였다.

자스민 꽃 머리 단독 및 팔마리아 팔마타 단독으로부터 유래된 추출물도 생물학적 효능의 비교 시험을 수행할 목적으로 제조되었다.

동일한 조건(동일한 수준의 건조 식물 재료/물 kg, 동일한 pH, 동일한 여과 및 정화 조건)으로 기준 추출물 및 상승 작용 추출물을 제조하는데 주의가 기울여졌다.

자스민의 기준 추출물의 제조:

자스미눔 오피스날의 건조된 꽃 머리 20g을 물 1kg에 넣고 2 시간 동안 주변 온도에서 교반하면서 침출시켰다. 이어서, 고형 잔류물을 버리고 추출물을 정화하기 위해 감소하는 다공성(20-50　μm에서 0.3-0.5　μm에 이르기까지)의 필터를 사용하여 연속 여과를 수행한다.

수득된 추출물은 5 ± 0.5　g/kg의 건조 물질을 특징으로 한다. 다음으로, 추출물을 3 ± 0.5　g/kg 건조 물질의 최종 농도까지 물로 희석하였다. pH를 4로 조절한다. 이어서, 추출물을 0.2　μm 필터 상에서 멸균 여과시키고, 멸균을 완료하기 위해 65℃에서 밤새 낮은 온도 저온 살균으로 방치한다.

팔마리아 팔마타의 기준 추출물의 제조:

플레이크 형태의 팔마리아 팔마타 50g을 1kg의 물에 용해시킨다. 가수 분해는 자일라나제 2g 및 브로멜라인 1g을 사용하여 수행하며, 반응 혼합물에 첨가한다. 이어서, 반응 혼합물을 55℃에서 2 시간 동안 가열한다. 여과 단계는 고체 잔류물을 버리고 탄수화물이 풍부한 여과물만을 유지하는 것을 가능하게 한다. 이를 위해, 10　g/kg Celatom^®(원심 분리 보조제)를 첨가하고, 그 용액을 4000 rev/분으로 10분 동안 원심 분리한다. 원심 분리 후, 잔류 고체를 제거하고 상청액을 셀룰로오스 필터 상에서 여과하여 다양한 정도로 정화한다. 상등액을 7-20　μm의 다공성에 이르기까지 감소하는 다공성의 필터 상에서 여과하여 정화하고 80℃에서 밤새 보관한다. 다음날 추출물을 0.3-0.5　μm에 이르기까지 감소하는 다공성의 필터 상에서 다시 여과한다. 수득된 추출물은 30 ± 2　g/kg의 건조 물질을 특징으로 한다. 이어서, 추출물을 물에서 희석하여 20 ± 2　g/kg 건조 물질을 얻는다. pH를 4-4.5로 조절한다.

이어서, 추출물을 0.2　μm 필터 상에서 멸균 여과한 다음 멸균을 완료하기 위해 낮은 온도 저온 살균을 위해 65℃에서 밤새 보관한다.

mRNAs의 평가에 대한 프로토콜: 정상 인간의 섬유 아세포를 이전에 준비한 다양한 추출물로 처리하고 배양 배지()로 1 부피/부피%로 희석한다. 병행하여, 섬유 아세포의 배양물은 처리하지 않고 방치하여 처리되지 않은 대조군을 구성한다. 배양은 5 % CO₂를 포함하는 가습 분위기에서 37℃에서 진행된다.

이러한 배양의 말기에, 전체 RNAs를 RNeasy mini kit (QIAGEN, 74104)로 추출하고 RNAses의 저해제를 함유하는 고 용량 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems, 4368814)로 역전사한다. 정량적 PCR은 Step One Plus thermocycler (Applied Biosystems)를 사용하여 수행된다. 표적들 SOX2, 네스틴 및 OCT4의 프라이머 및 프로브 뿐만 아니라 내인성 대조군 18S의 그것들은 Taqman Expression Assays (18S에 대해 Applied Biosystems, Hs99999901_s1; SOX2에 대해 Hs01053049_s1, Nestin에 대해 Hs00707120_s1 및 OCT4에 대해 Hs00999632_g1)로부터 수득하고, 멸균수 및 Master Mix (Applied Biosystems)에서 희석하였다.

결과:

도 1에 제시된 바와 같은 결과는 처리되지 않은 대조군에 비해, 팔마리아 팔마타의 기준 추출물 1%로 처리된 섬유 아세포에서 SOX2, 네스틴 및 OCT4 각각의 mRNAs의 발현에서 29%, 26% 및 34%로 통계적으로 유의미한 증가를 보여준다.

자스민 단독의 추출물에 의해서는 어떠한 자극도 관찰되지 않았다.

섬유 아세포가 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물 1%로 처리된 경우에, 그 결과는 처리되지 않은 대조군에 비해, 증가가 팔마리아 팔마타의 추출물에 의해 이전에 관찰된 것보다 각각 SOX2의 mRNAs의 발현에 대해 296%, 네스틴의 mRNAs의 발현에 대해 123% 및 OCT4의 mRNAs의 발현에 대해 285%로 현저하게 더 크다는 것을 보여준다.

결론:

처리되지 않은 대조군 세포, 자스민의 기준 추출물 및 조류의 기준 추출물에 비해, SOX2, 네스틴 및 OCT4의 더 높은 수준의 mRNA가 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물로 전처리된 섬유 아세포에서 관찰된다. 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물은 진피 세포의 "줄기" 특성의 특징적인 마커의 상승적인 상승을 제공한다.

실시예 3: 인간 섬유 아세포 및 SKP 세포를 함유하는 진피 등가물에서 프로콜라겐 I 및 콜라겐 III의 발현에 대한 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물의 활성화 효과의 입증

본 연구의 목적은 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물이 세포 외 매트릭스의 단백질인 프로콜라겐 I 및 콜라겐 III의 발현에 미치는 효과를 측정하는 것이다.

이를 위해, 중합된 소 콜라겐 I, 인간 섬유 아세포 및 SKP 줄기 세포로 구성된 재구축된 진피 등가물로부터 출발하는 특이적 표지화가 수행되었다.

면역 라벨링 프로토콜: 인간의 섬유 아세포는 성인 공여자 피부 외식편으로부터 추출되었다. 이 실험에서 사용된 SKP 세포들은 포피로부터 수득된다. 배양물 중의 SKP 세포들은 7일 동안 배양 배지 (즉, 1부피/부피%)에서 1/100로 희석된 실시예 1에 따른 추출물로 하루에 2번 전처리한다. 실시예 1에서 수득된 추출물은 약 10　g/kg의 건조 중량을 갖기 때문에, 추출물은 배양 배지 중량의 약 0.01 중량%에서 시험된다. 이 모델에서, 줄기 세포는 추출물의 직접 효과를 확인하기 위해 진피 등가물에 혼입되기 전에 추출물로 자극된다. 병행하여, SKP 세포의 배양물은 SKP 세포들의 미처리된 대조군을 구성하도록 처리없이 유지된다. 배양은 5% CO₂를 포함하는 가습 분위기에서 37℃에서 진행된다.

진피 등가물은 구 형태로 배양된 SKP 세포 및 배양 배지에 부유된 섬유 아세포가 SKP 세포의 1 구체와 10000 개의 섬유 아세포의 각각 비율로 첨가되는 것에 I 형 소 콜라겐의 용액을 혼합함으로써 제조되었다. 혼합물을 조심스럽게 균질화하고 6-웰 플레이트의 웰에 분배하였다. 콜라겐 I의 중합은 진피 등가물의 형성을 허용하면서 진행된다. 진피 등가물을 실시예 1에 따라 얻은 상승 작용 추출물로 하루에 2 회, 혼합물의 부피에 대해 1 %의 농도로 5 일 동안 처리하고 5% CO₂를 함유하는 가습 분위기에서 37℃로 유지한다.

샘플을 10% 파라포름알데히드로 고정하고 에탄올 및 자일렌(Shandon) 조에 연속적으로 통과시킨 후 파라핀에 내장한다.

면역 라벨링은 4μm 두께인 섹션에서 수행된다.

프로콜라겐 I에 대해, 조직들은 0.01M 시트레이트 완충액 pH6(Sigma)에서 600W로 마이크로웨이브 마스크제거하고, 이어서 펩신 0.25% (37℃에서 15분; Zymed, Invitrogen)로 효소 처리한다.

콜라겐 III 면역 라벨링을 위한 조직 절편의 처리와 관련하여 600W에서 마이크로웨이브 마스크제거를 수행하고, 0.5% 트립신(37℃에서 15분, Zymed, Invitrogen)으로 효소 처리한다.

포화 30분 후, 절편은 프로콜라겐 I(Millipore)에 특이적인 쥐의 모노클로날 항체, 콜라겐 III(Rockland)에 특이적인 토끼의 모노클로날 항체의 존재 하에 인큐베이션되고, 이어서 항-쥐 2차 항체는 플루오로크롬(Invitrogen)에 결합되거나 또는 항-토끼는 플루오로크롬(Invitrogen)에 결합된다. 이어서, 진피 등가물의 절편은 포낭 형광 현미경 (Nikon Eclipse 80i 현미경)으로 검사한다.

조건 당 3 장의 사진을 Volocity 이미지 분석 소프트웨어(Improvision)로 정량적으로 분석한다.

통계 분석은 JMP 소프트웨어(SAS)로 수행한다.

결과:

도 2에 제시된 바와 같은 결과는 SKP 세포들을 함유하지 않는 처리되지 않은 대조군에 비해, SKP 세포들을 함유하는 처리되지 않은 진피 등가물에서 콜라겐 I 및 콜라겐 III의 신-합성 단백질의 발현에서 18% 및 23%의 현저한 증가를 보여준다.

실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물 1%로 SKP 세포들을 함유하는 진피 등가물의 샘플을 처리하면 SKP 세포들로 처리되지 않은 대조군에 비해 프로콜라겐 I 및 콜라겐 III 각각의 25% 및 29%의 증가를 유발하였다.

결론:

SKP 피부 줄기 세포를 함유하는 진피 등가물에서 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물 1 %의 적용은 프로콜라겐 I 및 콜라겐 III의 발현을 자극한다.

실시예 4: 인간의 섬유 아세포 및 SKP-유사 세포들을 함유하는 진피 등가물에서 피부 수축률 및 콜라겐 III의 발현에 대한 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물의 활성화 효과의 입증

Wenzel 등(Biology Open. 1:516-526, 2012) 및 Hill 등(Plos One, November 2012, Vol. 7, Issue 11, e50742)은 SKP-유사 세포들이 성인 공여자 섬유 아세포에 대해 콜드 스크레스가 시험관 내에서 가해진 후에 단리될 수 있음을 보여주었다.

본 연구의 목적은 동일한 공여자로부터 수득된 섬유 아세포 및 SKP-유사 세포들을 함유하는 콜라겐의 진피 등가물에서 콜라겐 III의 발현 및 진피 등가물의 수축률에 대한 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물의 영향을 결정하는 것이다.

진피 등가물의 수축률은 콜라겐 미세 섬유에 결합하여 하나의 동일한 방향으로 배향시키고 세포외 매트릭스를 치밀화시킨 섬유 아세포의 수축 활성과 관련된 과정이다. 직경은 며칠 후에 안정화된다. 면역 라벨링은 세포외 매트릭스의 특정 단백질의 합성을 모니터링하기 위해 재구축된 진피 등가물로부터 시작하여 수행하였다.

프로토콜: 인간의 섬유 아세포는 성인 공여자 피부 외식편으로부터 추출되었다. 배양물 중의 이들 섬유 아세포의 일부는 SKP-유사 세포들을 생성하기 위해 저온 스트레스(4℃, 밤새)에 가해졌다. 이와 같이 수득된 SKP 세포들과 동일한 특성을 갖는 세포들을 여기서는 "SKP 유사"라고 부른다. 이 실험에서 사용된 SKP-유사 세포들은 6일 동안 배양 배지(즉, 1부피/부피%) 중에서 1/100로 희석된 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물로 하루에 2회 처리된다. 병행하여, SKP 유사 배양물은 처리되지 않은 SKP 유사 대조군을 구성하도록 처리없이 유지한다. 배양은 5% CO₂를 함유하는 가습 분위기에서 37℃에서 진행된다.

진피 등가물은 다세포 구체 형태로 배양된 SKP 유사 세포들이 첨가된 I 형 소 콜라겐의 혼합물로 제조하였다. SKP-유사 세포들 및 섬유 아세포는 1 구체 내지 10000개의 섬유 아세포의 비율로 포함되었다. 콜라겐 I/세포들의 매트릭스 혼합물은 6-웰 플레이트의 웰에 분포되어 있다. 진피 등가물은 일단 중합되면 배지에서 부유 배양된다. 진피 등가물은 5 일 동안 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물로 1 % 농도로 1 일 2 회 처리하고 5% CO₂를 함유하는 가습 분위기에서 37℃로 유지하였다. 실시예 1로부터 추출물은 약 10　g/kg의 건조 중량을 가지기 때문에, 추출물은 배양 배지 중량의 약 0.01 중량%로 시험한다.

매일, 조건 당 3 개의 진피 등가물에 대해, 진피 등가물의 직경의 감소에 반영되는 피부 수축률을 배양물에서 사진을 촬영하여 모니터링한 다음 이미지 분석 소프트웨어(이미지 J)를 사용하여 정량화한다.

배양이 완료되면, 조직을 10% 파라포름알데히드로 고정시키고 에탄올 및 자일렌(Shandon) 조에 연속적으로 통과시킨 후 파라핀에 내장한다.

면역 라벨링은 4μm의 두께인 절편 상에서 수행되었다.

콜라겐 III의 경우, 절편은 마이크로웨이브 마스크제거한 후 트립신 0.5% (37℃에서 15분, Zymed, Invitrogen)로 효소 처리하였다. 포화 30분 후, 절편은 콜라겐 III (Rockland)에 특이적인 토끼의 폴리클로날 항체의 존재 하에 인큐베이션되고, 이어서 항-토끼 2차 항체는 플루오로크롬(Invitrogen)에 결합된다. 이어서, 진피 등가물의 절편은 포낭 형광 현미경 (Nikon Eclipse 80i 현미경)으로 검사한다.

조건 당 3 장의 사진을 Volocity 이미지 분석 소프트웨어(Improvision)로 정량적으로 분석한다.

통계 분석은 JMP 소프트웨어(SAS)로 수행한다.

결과: 도 3에 제시된 바와 같은 결과는 SKP-유사 세포들에 의해 처리되지 않은 대조군에 비해, 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물 1%로 처리된 진피 등가물에서 콜라겐 III의 단백질의 발현에서 29%의 현저한 증가를 보였다.

도 4에 제시된 바와 같은 진피 등가물의 직경의 분석은 SKP-유사 세포들에 의해 처리되지 않은 대조군에 비해, 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물로 처리한지 4일 후 진피 등가물의 수축에서 매우 현저한 증가를 보였다.

결론: 성인 공여자 섬유 아세포로부터 수득된 피부 "줄기" 세포들(SKP-유사 세포들)을 함유하는 진피 등가물에서 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물 1%의 적용은 조직의 수축을 개선하고 콜라겐 III의 발현을 자극한다.

실시예 5: 인간의 섬유 아세포 및 SKP-유사 세포들을 함유하는 진피 등가물에서 트로포엘라스틴 섬유의 합성에 대한 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물의 활성화 효과의 입증

본 연구의 목적은 동일한 공여자로부터 수득된 섬유 아세포 및 SKP-유사 세포들을 함유하는 콜라겐의 진피 등가물에서 트로포엘라스틴 섬유의 합성에 대한 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물의 효과를 결정하는 것이다.

면역 라벨링은 섬유 아세포로부터 시작하는 트로포엘라스틴 섬유의 합성을 모니터링하기 위해 재구축된 진피 등가물로부터 시작하여 수행하였다.

프로토콜: 동일한 공여자로부터 수득된 섬유 아세포 및 SKP-유사 세포들을 함유하는 콜라겐의 진피 등가물은 처리와 별도로 실시예 5에서 특정된 바와 동일한 프로토콜에 따라 제조하였다. 사실 상, 이 실험에서 사용된 SKP-유사 세포들은 5 일 동안 배양 배지 (즉, 1부피/부피%)에서 1/100로 희석된 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물로 하루에 2 회 처리하였다. 진피 등가물은 6 일 동안 1 %의 농도로 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물로 하루에 2 회 처리하였다. 실시예 1에서 수득된 추출물은 약 10　g/kg의 건조 중량을 갖기 때문에, 추출물은 배양 배지 중량의 약 0.01 중량 %에서 시험된다.

배양이 완료되면, 조직을 10% 파라포름알데히드로 고정시키고 에탄올 및 자일렌(Shandon) 조에 연속적으로 통과시킨 후 파라핀에 내장한다.

면역 라벨링 4μm의 두께인 절편 상에서 수행되었다.

절편은 0.5% 트립신 (37℃에서 15분, Zymed, Invitrogen)으로 효소 처리에 의해 마스크제거되었다. 포화 30분 후, 절편을 트로포엘라스틴(Abcam)에 특이적인 토끼 폴리클로날 항체의 존재 하에 인규베이션하고, 이어서 항-토끼 2차 항체는 플루오로크롬(Invitrogen)에 결합된다. 이어서, 진피 등가물의 절편은 포낭 형광 현미경(Nikon Eclipse 80i 현미경)으로 검사한다.

조건 당 10 내지 12 장의 사진이 분석된다. 강한 형광으로 세포의 수와 총 세포 수가 계수된다.

통계 분석은 JMP 소프트웨어(SAS)로 수행한다.

결과: 도 5에 제시된 바와 같은 결과는 SKP-유사 세포들로 처리되지 않은 대조군에 비해, 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물 1%로 처리된 진피 등가물에서 트로포엘라스틴 섬유의 합성에서 19%의 현저한 증가를 보였다.

결론: 성인 공여자 섬유 아세포로부터 수득된 피부 "줄기" 세포들(SKP-유사 세포들)을 함유하는 진피 등가물에서 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물 1%의 적용은 탄성 섬유의 합성을 개선한다.

실시예 6: 인간의 섬유 아세포 및 SKP -유사 세포들을 함유하는 진피 등가물의 탄력성 특성에 대한 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물의 활성화 효과의 입증

본 연구의 목적은 동일한 공여자로부터 수득된 섬유 아세포 및 SKP-유사 세포들을 함유하는 콜라겐의 진피 등가물의 탄력성 특성에 대한 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물의 효과를 결정하는 것이다. 기준 피부 탄력 측정기 BLS780 (Monaderm)는 피부의 탄력성과 강성을 결정하는 장치이다. 그것은 측정값을 자동으로 매개변수화하는 소프트웨어에 의해 제공된다.

프로토콜: 동일한 공여자로부터 수득된 섬유 아세포 및 SKP-유사 세포들을 함유하는 콜라겐의 진피 등가물은 처리와 별도로 실시예 4에서 특정된 바와 동일한 프로토콜에 따라 제조하였다. 사실 상, 이 실험에서 사용된 SKP-유사 세포들은 5 일 동안 배양 배지 (즉, 1 부피/부피%)에서 1/100로 희석된 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물로 하루에 2 회 처리하였다. 진피 등가물은 10 일 동안 1 %의 농도로 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물로 하루에 2 회 처리하였다. 실시예 1에서 수득된 추출물은 약 10　g/kg의 건조 중량을 갖기 때문에, 추출물은 배양 배지 중량의 약 0.01 중량 %에서 시험된다.

방법론: 진피 등가물에 프로브를 놓는다. 공은 프로브에서 빠져 나와 장치에 의해 미리 결정된 일정한 힘으로 침투하고 피부 표면에서 튀어 오른다. 이어서, 그것은 안정화되기 전에 몇 가지 진동을 수행한다. 공이 튀어 나올 때의 침투 깊이(압흔이라 칭해짐)는 피부의 강성을 측정할 수 있게 한다. 사실 상, 공에 의해 이루어진 압흔이 깊을수록 조직은 더 부드럽고, 그에 따라 더 낮은 강성을 갖는다. 두 번째 기준은 피부의 탄력성을 결정할 수 있게 하는 피크(알파라고 함)의 모든 꼭대기를 연결하는 곡선의 기울기이다. 탄력성이 좋은 피부의 경우, 공은 더 많이 튀어 오르고, 그에 따라 기울기는 더 낮은 값을 갖는다.

결과: 도 6에 제시된 바와 같은 결과는 SKP-유사 세포들로 처리되지 않은 대조군에 비해, 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물 1%로 처리된 진피 등가물의 탄력성에서 19%의 현저한 증가를 보였다. 병행하여, 진피 등가물의 강성에서 17%의 현저한 감소가 대조군에 비교하여 관찰되었다.

결론: 성인 공여자 섬유 아세포로부터 수득된 피부의 "줄기" 세포들(SKP-유사 세포들)을 함유하는 진피 등가물에서 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물 1%의 적용은 진피 등가물의 탄력성 특성 및 유연성을 개선한다.

실시예 7: 본 발명의 상승 작용 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 예

A- 세럼

제조를 위한 프로토콜:

주 용기에 물을 넣는다. 온화한 균질화 하에 가열한다.

Pemulen TR-2를 천천히 물에 붓고 완전히 재수화될 때까지 혼합한다. 70° 내지 75℃의 온도를 유지한다.

중합체가 임의의 덩어리 없이 완전히 혼합되면, 방부제를 섞어서 하나씩 첨가한다.

두 번째 용기에서, B 상을 혼합하고 75℃로 가열한다.

균질화하면서 B 상을 주 용기에 첨가한다.

60 내지 65℃로 냉각시키고 사전 혼합된 상 C를 첨가한다.

40 내지 45℃로 냉각시키고 D 단계 성분을 하나씩 첨가하고 각각의 첨가 사이에 혼합한다.

교반하면서 실온(25℃)으로 냉각시킨다.

B-나이트 크림

프로토콜:

부드럽게 균질화하면서 주 용기에 물을 첨가한다. A 상의 나머지 성분을 하나씩 첨가하고 혼합하면서 70-75℃로 가열한다.

두 번째 용기에서, B 상의 성분을 혼합하고, 혼합하면서 75℃로 가열한다.

격렬하게 교반하면서(10 분) A 상 (70-75℃)에 B 상(70-75℃)을 첨가한다. 냉각시키기 시작한다.

60-65℃에서 C 상을 혼합물에 뿌린다. 폴리머를 완전히 수화시키기 위해 잘 혼합한다(선택적으로 혼합 속도를 증가시킨다).

프리믹스 D 상; 혼합물에 첨가하고 전체를 조심스럽게 혼합하여 균일한 혼합물을 얻는다. 혼합물은 진하게 된다. 계속 냉각시킨다.

40℃로 냉각시키고 천천히 교반한다. E상의 성분을 하나씩 첨가하고 각각의 첨가 사이에서 잘 교반한다.

실온에서 F상을 첨가한다. 잘 혼합한다. 25℃에서 멈춘다.

C- 해독 크림

프로토콜:

부드럽게 균질화하면서 주 용기에 물을 첨가한다. Versene을 첨가하고 완전히 용해될 때까지 혼합한다. 70-75℃로 가열한다.

두 번째 용기에서, B 상의 성분을 혼합하고, 혼합하면서 70℃-75℃로 가열한다.

75℃에서 10 분 동안 격렬하게 교반하면서 A 상에 B 상을 첨가한다. 냉각시키기 시작한다.

60-65℃로 냉각시키고 각각의 첨가 사이에서 혼합하면서, C 상의 성분을 하나씩 첨가한다.

40-45℃로 냉각시키고 각각의 첨가 사이에서 혼합하면서, D 상의 성분을 하나씩 첨가한다.

실온으로 서서히 교반하면서 냉각시킨다. 25℃에서 멈춤다.

실시예 8: SKP-유사 세포들에서 마커들 SOX2, OCT4 및 네스틴의 단백질 발현에 대한 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물의 활성화 효과의 입증

본 연구의 목적은 줄기 세포들: SOX2, OCT4 및 네스틴의 특징인 단백질의 발현에 대한 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물의 효과를 결정하는 것이다.

이를 위해, 특이적 라벨링은 파라핀에 내장된 SKP-유사 세포들의 펠렛 상에서 수행되었다.

면역 라벨링 프로토콜: SKP-유사 세포들은 성인 공여자 피부 외식편으로부터 추출된 인간의 섬유 아세포로부터 단리하였다. SKP-유사 세포들은 2 일 동안 배양 배지(즉, 1부피/부피%)에서 1/100로 희석된 실시예 1에 따른 추출물로 하루에 2 회 처리하였다. 실시예 1에서 수득된 추출물은 약 10　g/kg의 건조 중량을 갖기 때문에, 추출물은 배양 배지 중량의 약 0.01 중량 %에서 시험된다. 배양은 5% CO₂를 함유하는 가습 분위기에서 37℃에서 진행된다.

배양 말기에, SKP-유사 세포들은 세포 펠렛으로 제조하고 10% 파라포름알데히드로 고정시키고 에탄올 및 자일렌(Shandon) 조에 연속적으로 통과시킨 후 파라핀에 내장한다.

면역 라벨링 4μm의 두께인 절편 상에서 수행되었다.

3회의 면역 라벨링을 위해, 절편들은 0.01M 시트레이트 완충액 pH6(Sigma)에서 600W로 마이크로웨이브 마스크제거에 적용된다. 포화 30분 후, 절편들은 네스틴(abcam)에 특이적인 쥐의 모노클로날 항체, OCT4 또는 SOX2(Abcam)에 특이적인 토끼의 모노클로날 항체의 존재 하에 인큐베이션되고, 이어서 항-쥐 2차 항체는 플루오로크롬(Invitrogen)에 결합되거나 또는 항-토끼 항체는 플루오로크롬(Invitrogen)에 결합된다. 이어서, SKP-유사 세포들의 절편은 포낭 형광 현미경 (Nikon Eclipse 80i 현미경)으로 검사한다.

결과:

현미경 관찰(배율 *40)은 처리되지 않은 것과 비교하여 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물이 적용된 조건에서 SOX2, OCT4 및 네스틴 라벨링의 강도의 증가를 보였다. 도 7은 SOX2 및 네스틴 라벨링을 위해 수득된 사진을 재현한다.

결론:

SKP-유사 세포들에서 실시예 1에 따라 수득된 상승 작용 추출물 1%의 적용은 SOX2, OCT4 및 네스틴 줄기 세포 마커들의 발현을 자극한다.

Claims (14)

1. 조류(alga) 팔마리아 팔마타 및 자스민 속 식물의 꽃 머리(flower head)의 상승 작용 추출물(synergistic extract)로서, 상기 추출물은 i) 상기 조류 팔마리아 팔마타의 수성 추출물을 제조하는 단계에 이어 ii) 상기 수성 추출물 중에 자스민 속 식물의 꽃 머리의 침출을 행하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득할 수 있는 것이고, 상기 상승 작용 추출물을 제조하기 위한 원료 물질로서 사용되는 상기 조류의 건조 중량 대 상기 꽃 머리의 건조 중량의 중량비는 40/60 내지 95/5인, 상승 작용 추출물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 조류의 건조 중량 대 상기 꽃 머리의 건조 중량의 중량비가 8/1 내지 10/1인 것을 특징으로 하는, 추출물.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 자스민 속 식물이 종(species) 자스미눔 그랜디플로럼(Jasminum grandiflorum), 자스미눔 오피시날(Jasminum officinale), 자스미눔 오도라티시뭄(Jasminum odoratissimum), 자스미눔 삼박(Jasminum sambac), 자스미눔 오리쿨라툼(Jasminum auriculatum), 자스미눔 플렉사일(Jasminum flexile), 바람직하게는 자스미눔 오피시날로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 추출물.
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 꽃 머리가 전체의(whole) 건조된 꽃 머리인, 추출물.
5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i)에서, 상기 팔마리아 팔마타의 수성 추출물이 카르보히드라제 및 엔도프로테아제를 사용하는 효소적 가수분해, 및 이어서 여과 및/또는 원심 분리에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는, 추출물.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 카르보히드라제는 상기 조류의 건조 중량의 2 내지 6　중량%, 바람직하게는 4 중량%의 농도로 바람직하게는 사용되는 크실라나제이고, 상기 엔도프로테아제는 상기 조류의 건조 중량의 1 내지 3 중량% 및 바람직하게는 2 중량%의 농도로 사용되는 브로멜라인 것을 특징으로 하는, 추출물.
7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물이 26.8 내지 30.8　g/kg의 건조 물질 함량, 1.3 내지 2.3　g/kg의 단백질 함량 및 25.3 내지 29.3　g/kg의 당 함량을 갖는 것을 특징으로 하는, 추출물.
8. 청구항 7에 있어서, 단계 ii)의 말기에, 상기 추출물이 물, 글리세롤, 에탄올, 프로판디올, 부틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 에톡실화된 또는 프로폭실화된 디글리콜, 사이클릭 폴리올 또는 이들 용매의 임의의 혼합물로부터 선택되는 1 종 이상의 생리학적으로 허용되는 용매에 희석된 것을 특징으로 하는, 추출물.
9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 팔마리아 팔마타 및 자스민 속 식물의 꽃 머리의 상승 작용 추출물의 수득 방법으로서, 하기 a) 내지 f) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 팔마리아 팔마타 및 자스민 속 식물의 꽃 머리의 상승 작용 추출물의 수득 방법:
   a) 일정량의 건조되고 미세하게 분쇄된 팔마리아 팔마타 조류를 물 대 팔마 리아 팔마타의 중량비 10/1 내지 50/1, 바람직하게는 20/1 내지 40/1로 물에 용해시키는 단계;
   b) 팔마리아 팔마타의 수용액이 카르보히드라제 및/또는 엔도프로테아제에 의해 3 내지 6, 바람직하게는 4 내지 5.5, 보다 더 바람직하게는 4 내지 4.5의 pH에서, 40 내지 80℃, 바람직하게는 50 내지 60℃, 보다 더 바람직하게는 55℃의 온도에서, 적어도 1 시간, 바람직하게는 2 시간의 시간 동안 가수분해되는 단계;
   c) 여과 보조제 및 원심 분리의 선택적인 첨가 후, 팔마리아 팔마타의 수성 추출물이 수득되는 단계;
   d) 건조된 자스민 속 식물의 꽃 머리가 단계 c)에서 수득된 팔마리아 팔마타의 수성 추출물 중에 주변 온도에서 적어도 2시간 및 최대 4시간의 시간 동안 침출되는 단계(상기 조류의 건조 중량 대 상기 꽃 머리의 건조 중량의 중량비는 40/60 내지 95/5임);
   e) 단계 d)에서 이렇게 수득된 침출 생성물이 여과되어 팔마리아 팔마타 및 자스민 속 식물의 꽃 머리의 추출물을 회수하되, 이는 적어도 2 시간 내지 24 시간 이하 및 바람직하게는 12 시간 동안 또는 하룻밤 동안, 40 내지 90℃, 바람직하게는 80℃의 온도에서 가열되어 카르보히드라제 및 엔도프로테아제 효소를 불활성화시키는 단계; 및
   f) 여과에 의해 선택적으로 정제되어 상기 팔마리아 팔마타 및 자스민 속 식물의 꽃 머리의 상승 작용 추출물을 수득하는 단계.
10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 청구되거나 또는 청구항 9의 방법에 의해 수득되는, 팔마리아 팔마타 및 자스민 속 식물의 꽃 머리의 상승 작용 추출물을 생리학적으로 허용되는 용매 중에 포함하는, 화장료 조성물.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 조성물은 상기 팔마리아 팔마타 및 자스민 속 식물의 꽃 머리의 상승 작용 추출물을, 상기 조성물의 총 중량의 0.0001 건조 중량% 내지 20　건조 중량%의 농도로, 그리고 바람직하게는 조성물의 총 중량의 0.05 건조 중량% 내지 5　건조 중량%의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 상기 조성물이 비타민 A, 레티노산, 레티놀, 비타민 B3, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 F, 비타민 H, 비타민 K, 비타민 PP, 코엔자임 Q10, 금속단백분해효소 억제제, 아미노산, 카르니틴, 카르노신, 타우린, 천연 또는 합성 펩타이드, 식물성 펩타이드 추출물, 효모 추출물, 아르테미아 살리나(Artemia salina) 추출물, 합성 또는 천연 기원의 파이토스테롤, 살리실산, 올리고당류, 다당류, 아미노 당류, 폴리페놀, 플라보노이드, 지질, 인지질, 동물 기원의 오일, 식물성 오일, 에톡실화 식물성 오일, 자외선 차단제 및 선 필터(sun filter)로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 활성제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
13. 성인 진피 줄기 세포(SKP)의 "줄기" 특성의 유지를 선호함으로써 노화 피부의 징후를 퇴치하기 위한, 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 청구된 팔마리아 팔마타 및 자스민 속 식물의 꽃 머리의 상승 작용 추출물 또는 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 청구된 조성물의 화장품 용도.
14. 청구항 13에 있어서, 피부의 탄력성, 유연성 및/또는 견고성을 향상시키기 위한 용도.

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