KR20180107123A

KR20180107123A - 경지 재배된 담배 식물에서의 카드뮴 축적 감소

Info

Publication number: KR20180107123A
Application number: KR1020187021999A
Authority: KR
Inventors: 루시엥 보베; 베레나 리프스쿠테
Original assignee: 필립모리스 프로덕츠 에스.에이.
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2017-01-27
Publication date: 2018-10-01
Also published as: AU2017211970A1; AR107478A1; CO2018007797A2; MX2018009002A; EA201891707A1; CN108697059B; CA3010142A1; US11213004B2; EP3407704A1; US20190387702A1; JP2019503187A; JP7129335B2; WO2017129739A1; PH12018501304A1; BR112018014765A2; CN108697059A

Abstract

적어도 2개의 중금속 ATPases(HMAs)의 적어도 부분적으로 감소된 발현 또는 활성을 갖는 돌연변이체 식물 또는 그의 부분이 기재되고, 상기 2개의 HMA는 다음을 포함하거나, 다음으로 구성되거나, 본질적으로 구성된다: (i) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; (ii) (i)에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 (iii) HMA를 인코딩하는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 여기서, (i) 또는 (ii) 또는 (iii)에 기재된 HMA 중 하나의 발현 또는 활성이 부분적으로 감소되거나 손실되고 (i) 또는 (ii) 또는 (iii)에 기재된 HMA 중 하나의 발현 또는 활성이 대조군 식물에 비해 손실되며; 그리고 여기서, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은, 돌연변이체 식물이 천연 또는 비-천연 발생 카드뮴의 존재 하에 경지에서 재배될 때 잎의 카드뮴 축적에 있어서 대조군 식물에 비해 적어도 27% 감소를 나타낸다.

Description

경지 재배된 담배 식물에서의 카드뮴 축적 감소

많은 중금속은 토양에 천연 상태로 존재하고, 식물에 상이한 정도로 흡수된다. 망간 또는 아연과 같은 일부 중금속은 식물에 대해 필수적인데, 이는 이들이 효소 활성에 요구된 공동 인자를 나타내기 때문이다. 다른 중금속은 식물에 대해 필수적이지 않고, 몇몇 경우에, 중금속 농도에서의 감소는 유익할 것이다. 카드뮴(Cd)은 식물 또는 인간 발육에 있어 보고된 유익한 효과가 없는 금속 중 하나이다. 이것은 알려진 인간 발암 물질로서 분류된다. Cd가 식물에서 초과하여 축적되면, 감소된 잎 표면, 감소된 건중량, 감소된 물 함량, 감소된 엽록소 함량, 및 감소된 카로티노이드 함량과 같이 다양한 유해한 효과를 촉발시킬 수 있다. 담배는 뿌리에서보다 순(shoot)에서 Cd의 4배 더 높은 레벨을 축적할 수 있는 능력을 특징으로 하는 식물 종이다. 담배와 같은 식물에서 Cd의 축적을 감소시킬 수 있는 것이 바람직하다. 상업적 생산을 위해 대규모로 노지에서의 외부에서 재배할 때 담배와 같은 식물에서 Cd의 축적을 감소시킬 수 있는 것이 특히 바람직하다.

식물에서의 Cd 축적의 정도는 유전자형 및 재배 환경의 복잡도에 기여된 여러 파라미터에 따라 가변적일 수 있다. 예를 들어, 경지 재배된 담뱃잎에서의 Cd 농도는 농업 기후, 토양 파라미터, 및 재배종과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 평균적으로, 경지 재배된 담뱃잎(주맥 및 잎맥을 포함)에서 측정된 Cd 농도는 대략 0.5 내지 5 ppm(백만분율, 또는 담배 잎의 건중량의 μg/g)의 범위에 있을 수 있다. 더 낮고 더 높은 값은 0 내지 6.78 ppm의 범위에서 관찰되었다(Lugon-Moulin 등, 2006).

담뱃잎에서 Cd 축적을 감소시키기 위한 다양한 시도가 이루어졌다. 하나의 방법은 뿌리 액포에서 Cd를 단리함으로써 순에서 Cd의 축적을 감소시키는 것을 수반하였다. 이것은 담배 뿌리에서 애기장대(Arabidopsis thaliana ) CAX2 및 CAX4 칼슘 및 망간 공수송체를 과발현함으로써 달성되었다(Korenkov 등, 2009).

유전자 불활성화를 이용하여 식물 잎에서의 Cd 축적을 줄이기 위해 비 유전자 변형 생물(non-GMO) 접근법을 개발하는 것이 바람직할 수 있다. 유럽을 포함하는 국가에서, 유전자 변형 작물을 재배 및 상업화하기 어렵기 때문에, 유전자 조작 기술을 사용하는 것보다 에틸 메탄설포네이트(EMS) 등으로 처리하여 얻은 단일 뉴클레오티드 다형성을 특징으로 하는 돌연변이체로 작업하는 것이 바람직할 수 있다. 심지어 돌연변이체가 인위적으로 유도되는 경우에, 돌연변이는 GMO로서 간주되지 않는다. 예를 들어, EU에서는 돌연변이 육종으로부터 유래된 식물에 대한 특별한 규정이 없다.

WO2012/041913는 잎에서의 감소된 중금속 함량을 갖는 담배 식물을 기재한다. 이는 HMA 유전자에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 담배 식물의 사용을 통해 달성된다. 돌연변이는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에서 적어도 하나의 아미노산의 치환 또는 결실 또는 삽입을 유발하고 식물 잎에 의한 중금속 흡수를 감소시킨다. 다양한 단일 돌연변이체는, 본원에서 표 1에 요약된 바와 같이 WO2012/041913에서 식별되었다. 이 인용은 수경 재배에서 재배된 작은 묘목의 데이터를 나타낸다. 이 시스템에서, 개방된 경지 시스템에서의 조건을 반영하지 않은 매우 높은 Cd와 Zn의 농도가 제공되었다. 그러한 시스템에서 대조군 식물의 잎에서 측정된 Cd 농도는 토양 조건 하에서 발견된 것에 비해 30 내지 300배 더 높다.

Hermand 등. (2014)은 EMS 처리로 얻은 돌연변이를 이용하여 애기장대 HMA2와 HMA4의 담배 오소로그(ortholog)를 비활성화시키는 효과를 보고한다. AtHMA2와 AtHMA4은 아연(Zn)과 Cd를 뿌리로부터 순으로 수송하는 중금속 ATPases(HMAs)를 인코딩한다. AtHMA2 및 AtHMA4 유전자에 대한 두 개의 오소로그는 각각, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 게놈으로 식별되었고 NtHMAα와 NtHMAβ로 명명되었다. 잎에서의 감소된 Cd 레벨을 갖는 담배 계통을 얻기 위해 이 접근법을 사용할 가능성을 결정하기 위해 발현이 변경되었다. 담배에서 이들 NtHMA 유전자의 역할을 연구하기 위해, NtHMA 유전자 중 하나에 돌연변이를 포함하는 담배 계통은 EMS 돌연변이 유발된 돌연변이체 컬렉션을 스크리닝함으로써 식별되었다. NtHMAα(P294S, E387K, 및 W265*) 또는 NtHMAβ(G515R, R520*)에서 미스센스 돌연변이(P249S, E387K 및 G515R)와 넌센스 돌연변이(W265* 및 R529*)가 식별되었다. 이들 돌연변이는 HMA 단백질의 제2(P294S 및 W265*) 및 제3(E387K, G515R 및 R520*) 세포질 루프에서 아미노산을 변경했거나, 조기 종결 코돈을 도입했다. Hermand 등(2014)에 의해 생성된 동형접합 단일 돌연변이주는 무라시게(Murashige) 및 스쿡(Skoog) 배지를 함유하는 한천 플레이트 상에서 인공 살균 조건 하에 재배되었다. Hermand 등(2014)의 도 4a 및 도 4b에 보고된 바와 같이, 단일 돌연변이체를 사용하여 얻은 결과는 본원의 표 2에서 요약된다. 단일 돌연변이체는 순에서 감소된 Cd와 Zn의 축적을 보여주는 것으로 보고되었다. 단일 돌연변이체 식물은 야생형과 비교할만한 성장 및 발육을 갖는 것으로 보고되었다. NtHMA 유전자 모두에서 넌센스 돌연변이를 함유하는 식물은 강한 왜소 성장을 보여주었고, 종자를 생성하지 않았다. 특히, 도 4a와 도 4b에 보고된 데이터는 인위적으로 높은 Cd와 Zn 농도가 사용되는 멸균 배양에서 재배된 작은 묘목을 사용하여 얻어진다. 이들 인위적으로 높은 Cd 및 Zn 농도는 개방된 경지 조건에서 존재하는 천연 조건을 반영하지 않는다. 도 4a의 대조군 식물의 순에서 측정된 Cd 농도는 약 135 ppm이다. 이들 농도는 경지 조건에서 재배된 식물에서 볼 수 있는 Cd 농도에 비해 약 30 내지 300배 더 높다. 그 작업의 결과에 기초하여, EMS 처리로 얻은 단일 뉴클레오티드 다형성을 함유하는 돌연변이체를 사용하여, Hermand 등(2014)은 NtHMAα /β의 기능이 정상적인 성장 및 발육을 위해 적어도 부분적으로 보존될 필요가 있다고 결론을 내렸고, 순에 Cd가 없는 상업적으로 가치있는 담배 식물을 조작하는 것은 2개의 NtHMA 유전자의 단독 비활성화를 통해 달성될 수 없는 것으로 결론을 내렸다. NtHMA 유전자 중 하나만을 비활성화하면 상업적으로 가치있는 식물이 순에 Cd 농도의 감소를 나타내는 것을 초래할 수 있음이 논의된다. 잎에 Cd를 축적시키는 식물의 능력을 더 줄이기 위해 Hermand 등(2014)은 다른 NtMHA 유전자에서 누출 돌연변이와의 하나의 NtHMA 유전자에서의 넌센스 돌연변이의 조합과 같은 - NtHMA 유전자의 다른 돌연변이를 함께 조합하는 것을 고려한다. 2015년 10월 25일 내지 29일에 프랑스 보르도의 제12회 학술 대회(SOL2015)에서 Liedschulte 등은, HMA4 .1 또는 HMA4 .2(각각 NtHMAα와 NtHMAβ에 대응) 어느 하나의 미스센스 또는 넌센스 돌연변이가 경지 조건에서 재배된 담배 식물의 잎에서 카드뮴 함량을 상당히 감소시키지 않는다는 것을 기재하였다. 이 연구에서, 야생형 대조군에 비해 약 10배 감소된 Cd 함량을 나타내는 HMA4 RNAi 담배 식물이 기재되었다. 그러나, 표현형은 감소된 성장, 더 두꺼운 잎 및 괴사성 병변에 크게 영향을 받았다. 유사한 표현형이 Hermand 등, 2014에 의한 담배 HMA4 이중 넉아웃 돌연변이체에 대해 보고되었다. 19개의 동형접합 미스센스 HMA4 돌연변이주 및 4개의 동형접합 넌센스 HMA4 돌연변이주는 경지에서 그들의 널-분리개체(null-segregant) 대조군에 인접하여 테스트되었다. 표현형의 차이는 HMA4 돌연변이체 식물에서 관찰되지 않았다. HMA4 유전자 중 하나에서 동형접합 미스센스 또는 넌센스 돌연변이를 함유하는 임의의 테스트된 돌연변이주에서 측정 불확실성(20%) 레벨을 넘어서는 통계적으로 유의한(비율 상의 대응표본 t-검정; p<0.05) Cd 및 Zn 감소가 관찰되지 않았다. Liedschulte 등(2015)은 그 연구에서 HMA4의 완전한 녹아웃이 왜소증(dwarfism)와 괴사성 병변을 포함하는, Cd와 Zn의 감소와 표현형의 변이가 크게 야기되는 것으로 결론을 내렸다. 또한, Hermand 등(2014)과 대조적으로, NtHMA4 .1 또는 NtHMA4 .2의 해로운 돌연변이는 경지 조건 하에서 재배된 식물의 Cd 레벨을 상당히 감소시키지 않는 것으로 결론을 내렸다. Hermand 등(2014)의 접근법은 경지 조건에 적용 가능하지 않을 수 있는 것으로 결론을 내렸다.

상업 생산을 위해 대규모로 개방된 경지에서 외부에서 재배될 때, - 담배와 같은 - 식물에서의 Cd 축적을 감소시키기 위해 - 비-GMO 접근법과 같은 - 접근법을 개발하는 것이 당업계에 계속 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 해결하기 위해 시도한다.

WO2012/041913 및 Hermand 등(2014)은 매우 인공적인 무균 또는 수경 재배 조건에서 순에서 감소된 Zn 및 Cd 축적을 보여주는 EMS 돌연변이체 담배를 기재하고 있다. WO2012/041913 및 Hermand 등(2014)의 교시와는 대조적으로, 본 발명은 식물이 Cd의 레벨이 WO2012/041913 및 Hermand 등(2014)에서 사용된 Cd 레벨보다 30 내지 300 배 낮은 개방된 환경(예를 들어, 경지)에서 외부로 재배될 때 식물에서의 Cd의 레벨을 감소시키는 것에 관한 것이다. 본원에 기술된 식물은 상업적 생산을 위해 사용되며, 인위적인 조건 하에서 재배되기보다는 개방된 야외에서 경지 조건 하에서 매우 많은 양으로 재배되도록 요구된다. 인공적인 조건 하에서 식물을 상업적으로 재배하는 것은 비경제적이다. 본 발명은 개방된 경지 조건에서 재배될 때 Cd 축적 레벨이 감소되는 돌연변이체 식물 - 비-GMO 돌연변이체 식물과 같은 -을 제공하기 위해 시도한다.

Hermand 등(2014)에 의해 사용된 조건은 본 개시에서 관심있는 조건인, 개방된 경지 조건의 천연 조건을 반영하지 않는다. Hermand 등(2014)에 의해 보고된 결과는 개방된 경지 조건에서 재배된 식물에서의 Cd 레벨을 감소시키려는 당업자에게 제한된 사용이고, 이는 개방된 경지 조건 및 하기의 Hermand 등(2014)에 의해 사용된 인공 조건에서의 Cd 레벨에 필적하지 않기 때문이다. 더욱이, Liedschulte 등(2015)은 NtHMA4 .1 또는 NtHMA4 .2의 해로운 돌연변이가 불확실성의 측정 레벨(약 20%)을 넘어서는 경지 조건 하에서 재배된 식물의 Cd 레벨을 현저하게 감소시키지 않는 것으로 결론을 내렸다. Hermand 등(2014)의 접근법은 경지 조건에 적용 가능하지 않는 것으로 결론을 내렸다.

본 발명자들은 Hermand 등(2014)에 의해 보고된 단일 W265* 넌센스 돌연변이를 포함하는 다양한 HMA4 동형접합 EMS 단일 돌연변이체를 생성하였고, 이들을 개방된 경지 조건에서 테스트하였다. 이 실험의 결과는 본원의 표 3에서 보고된다. 결과는 Hermand 등(2014)의 W265* 단일 돌연변이체를 포함하는, 테스트된 단일 돌연변이체가 개방된 경지 조건 하에서 어떠한 Cd 감소도 나타내지 않았다는 것을 나타낸다. 표 3의 4번째 열에서 볼 수 있듯이, 개방된 경지 조건 하에서 테스트된 단일 돌연변이체 각각에 대한 대조군 대비 % Cd 감소는 0%였다. 이들 결과는 Liedschulte 등(2015)에 의해 보고된 결과와 일치한다.

본원의 표 3에서 테스트되고 보고된 단일 돌연변이체 중 어느 것도, 개방된 경지 조건 하에서 Cd 감소를 나타내지 않았다는 사실에 기초하여, 본 발명자들은 개방된 경지 조건 하에서 불활성인 이들 단일 돌연변이체 중 2개 이상을 함께 조합하는 것이 개방된 경지 조건 하에서 Cd 감소에 전혀 영향을 미치지 않거나 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 예측하였다. 그러나, 이와 같은 예측과는 완전히 상반되도록, 본 발명자들은 표 3에 보고된 다양한 단일 돌연변이체가 서로 다른 조합으로 함께 조합되어 잎에서의 높은 레벨의 Cd 감소(예를 들어, 20% 이상)가 개방된 경지 조건에서 달성될 수 있는 이중 동형접합 돌연변이체를 형성한다는 것을 밝혀냈다. 일부 경우에서, 개방된 경지 조건에서 달성된 잎에서의 Cd 감소 레벨은 본원에서 표 4, 표 5 및 표 6에서 요약된 바와 같이, 적어도 약 27%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 심지어는 약 90% 이상이다. 이와 같은 높은 레벨의 Cd 감소는 개방된 경지 조건 하에서 재배된 식물에서 Cd의 레벨을 감소시키는 데 매우 유리하다. 놀랍게도, 본원에 기술된 바와 같이 잎에서의 감소된 Cd레벨을 갖는 이중 돌연변이체 식물은 - 감소된 양의 성장/왜소증/바이오매스와 같은 해로운 표현형을 겪지 않는다. 본원에 기술된 이중 돌연변이체에 대해 보고된 유리한 결과는 본 발명자들에 의해 예측되거나 예상되지 않은 발견이다. 이 데이터에 기초하여, 본 발명은 NtHMA4.1 및 NtHMA4.2의 발현 또는 활성을 적어도 부분적으로 감소시킴으로써 식물이 개방된 경지 조건에서 재배될 때 잎에서 Cd의 감소된 축적을 나타낼 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 적합하게는, 비-GMO 식물은 돌연변이 유발의 사용을 통해 제조될 수 있으며 적합하게는 해로운 표현형을 겪지 않는다. NtHMA4.1과 NtHMA4.2는 Hermand 등(2014)에 의해 보고된 바와 같은 NtHMAα과 NtHMAβ에 각각 대응한다. 유리하게는, 상이한 돌연변이체 조합은 감소된 레벨의 카드뮴 및 손상된 표현형 및/또는 산출 없이 상이한 품종을 육종하기 위한 툴킷으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 양태 및 구현예

제1 양태에서, 적어도 2개의 중금속 ATPases(HMAs)의 적어도 부분적으로 감소된 발현 또는 활성의 돌연변이체 식물 또는 그의 부분이 기재되고, 상기 2개의 HMA는: (i) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; (ii) (i)에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 (iii) HMA를 인코딩하는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 본질적으로 구성되고; 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은, 돌연변이체 식물이 천연 또는 비-천연 발생 카드뮴의 존재 하에 경지 재배될 때 잎의 카드뮴 축적에 있어서 대조군 식물에 비해 적어도 27% 감소를 나타내는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분.

적합하게는, (i) 또는 (ii) 또는 (iii)에 기재된 HMA 중 하나의 발현 또는 활성은 부분적으로 감소되거나 손실되고, (i) 또는 (ii) 또는 (iii)에 기재된 HMA 중 하나의 발현 또는 활성은 대조군 식물에 비해 손실된다.

적합하게는, 수확 시점에 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 표현형은 동일한 수확 시점에서 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 동일한 수확 시점에 대조군 식물에 비해 수확 시점에서 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는다.

적합하게는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 (ii) 또는 (iii)에 기재된 각 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에서 또는 조절 영역에서의 적어도 하나의 유전적 변경을 포함하고, 적합하게는, 돌연변이는 미스센스 돌연변이 또는 넌센스 돌연변이이다. 적합하게는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 하나 이상의 다음의 돌연변이를 포함한다: SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 251 내지 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 251 또는 293 또는 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 223 내지 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, 여기에서 식물은 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 223 또는 234 또는 235 또는 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 402 내지 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이. 돌연변이체 식물 또는 그의 부분으로서, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P/N-도메인의 아미노산 위치 402 또는 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 265에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치 265, 223, 234 또는 235에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치 265, 223, 234 또는 235에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 P/N 도메인 제2 세포질 루프의 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 251 내지 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 251 또는 293 또는 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 223 내지 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, 여기에서 식물은 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 223 또는 234 또는 235 또는 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 402 내지 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P/N-도메인의 아미노산 위치 402 또는 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치 265, 223, 234 또는 235에서의 적어도 하나의 돌연변이; 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 P/N 도메인 제2 세포질 루프의 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열의 P/N 도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이.

적합하게는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 하나 이상의 다음의 돌연변이를 포함한다: SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 W265**이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 L223F임); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); 또는 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 G235E임); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 L223F임); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 D234N임); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 G235E임); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); 또는 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 L223F임); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 D234N임); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 G235E임); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 W265**이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 L223F임); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 G235E임); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 L223F임); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 D234N임); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 G235E임); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 L223F임); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 D234N임); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 G235E임); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄).

추가 양태에서, 경지 재배된 식물의 잎에서 카드뮴의 레벨을 감소시키는 방법이 개시되고, 방법은: (a) 2개의 중금속 ATPase(HMA)의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계로서, 상기 2개의 HMA는: (i) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; (ii) (i)에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 (iii) HMA를 인코딩하는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 본질적으로 구성되고, 적합하게는, (HMA)의 발현 또는 활성은 돌연변이 유발 또는 게놈 편집에 의해 감소되는, 단계; (b) 경지에서 식물을 재배하는 단계; (c) 선택적으로, 단계 (b)에서 얻어진 식물 내의 카드뮴 함량을 측정하는 단계; 및 (d) HMA의 발현 또는 활성이 감소되지 않은 대조군 식물에 비해 식물 내의 카드뮴 함량이 감소되는 식물을 식별하는 단계로서, 적합하게는, 식물 또는 그의 부분은, 식물이 천연 또는 비-천연 발생 카드뮴의 존재 하에 경지 재배될 때 잎의 카드뮴 축적에 있어서 대조군 식물에 비해 적어도 27% 감소를 나타내고; 적합하게는, 수확 시점에 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 표현형은 동일한 수확 시점에서 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 동일한 수확 시점에 대조군 식물에 비해 수확 시점에서 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는, 단계를 포함한다.

추가 양태에서, 하나 이상의 유전적 변경을 포함하지 않는 경지 재배된 대조군 식물에 비해 잎에서 카드뮴의 감소된 레벨과 상관되는 경지 재배된 식물에서 하나 이상의 유전자 변이를 식별하기 위한 방법이 개시되고, 상기 방법은: (a) 경지에서 재배될 때 경지에서 재배된 대조군 식물에 비해 잎에서 카드뮴의 감소된 레벨을 갖는 식물을 식별하는 단계로서, 선택적으로, 수확 시점에 식물 또는 그의 부분의 표현형은 동일한 수확 시점에서 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 식물 또는 그의 부분은 동일한 수확 시점에 대조군 식물에 비해 수확 시점에 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는, 단계; (b) 단계 (a)에서 식별된 식물로부터 핵산 샘플을 제공하는 단계; 및 (c) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 HMA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 유전적 변경을 단계 (b)로부터의 핵산 샘플에서 식별하는 단계를 포함하는, 방법.

추가 양태에서, 본원에 기술된 돌연변이체 식물 또는 그의 부분으로부터 식물 재료가 개시되고, 적합하게는 식물 재료는 큐어링되거나 건조된 식물 재료이고, 적합하게는, 수확 시점에서 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 표현형은 동일한 수확 시점에서 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 동일한 수확 시점에서 대조군 식물에 비해 수확 시점에서의 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는다.

추가 양태에서, 경지 재배된 대조군 식물에 비해 경지에서 재배될 때 잎에서의 카드뮴의 감소된 축적을 갖는 식물 재료를 생산하기 위한 방법이 개시되고, 상기 방법은: (a) 본원에 기술된 돌연변이체 식물 또는 그의 부분을 제공하는 단계; (b) 경지에서 식물을 재배하는 단계; 및 (c)식물로부터 식물 재료를 수확하는 단계로서, 적합하게는, 수확 시점에 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 표현형은 동일한 수확 시점에서 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 동일한 수확 시점에 대조군 식물에 비해 수확 시점에서 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는, 단계를 포함한다.

추가 양태에서, 청구항 제7항에 따른 방법에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 돌연변이체 식물 또는 그의 부분 또는 그로부터 유래되거나 유래될 수 있는 식물 재료가 개시되며, 적합하게는, 수확 시점에 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 표현형은 동일한 수확 시점에서의 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 동일한 수확 시점에서 대조군 식물에 비해 수확 시점에서 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는다.

추가 양태에서, 본원에 기술된 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 적어도 일부 또는 식물 재료를 포함하는 식물 제품이 개시된다.

추가 양태에서, 본원에 기술된 돌연변이체 식물 또는 부분 또는 식물 재료 또는 식물 제품을 포함하는 담배 제품 또는 흡연 물품 또는 소모품이 개시된다.

적합하게는, 적어도 하나의 유전적 변경은 (i) 돌연변이 유발제로 종자 물질의 표적화되지 않은 처리에 의해 도입되고; 또는 (ii) 조작된 CRISPR/Cas-기반의 시스템, 조작된 전사 활성제-형 이펙터 뉴클레아제, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제, 또는 조작된 메가뉴클레아제와 같은 - 게놈 편집 시스템에 의해 표적화된다.

추가 양태에서, SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하며 본원에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 금속 ATPase(HMA) 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리펩티드 및 금속 ATPase(HMA)가 개시된다.

추가 양태에서, SEQ ID NO:2에 기술된 비-돌연변이 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 포함하며 본원에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 금속 ATPase(HMA) 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리펩티드 및 금속 ATPase(HMA)가 개시된다.

추가 양태에서, 본원에 기술된 단리된 폴리펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드의 조합이 개시된다.

추가 양태에서, 본원에 기술된 폴리펩티드(들)를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열이 개시된다.

추가 양태에서, 본원에 기술된 단리된 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 작제물, 벡터 또는 발현 벡터가 개시된다.

추가 양태에서, 본원에 기술된 돌연변이체 식물 또는 그의 부분 또는 식물 재료로부터의 돌연변이체 식물 세포가 개시된다.

추가 양태에서, 본원에 기술된 돌연변이체 식물 세포를 포함하는 큐어링된 또는 건조된 식물 재료가 개시된다.

적합하게는, 본원에 기술된 돌연변이체 식물은 돌연변이 유발(예를 들어, EMS 돌연변이 유발) 또는 게놈 편집(예를 들어, 조작된 CRISPR/Cas-기반의 시스템, 조작된 전사 활성제-형 이펙터 뉴클레아제, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제, 또는 조작된 메가뉴클레아제를 이용하여)에 의해 생성된다.

몇몇 장점

본 개시에 따라 식물을 생성하는 것은 다수의 장점을 제공한다.

본원에 기술된 식물은 유전적으로 변형된 농작물을 재배하고 상업화하는 데 있어서의 어려움을 극복하는 비-GMO 식물일 수 있다.

본원에 기술된 식물은 가변적인 Cd 농도를 함유하는 토양에서 재배될 수 있다. 이들 식물 및 유도 종자는 더 광범위한 토양 환경에서 이들을 경작하기 위한 더 많은 옵션을 제공할 수 있고, 이것은 실시자가 이용 가능한, 경작 가능한 토양의 양을 증가시킬 수 있다. 이것은 또한 잠재적으로 허용 가능한 인산염 비료의 범위를 증가시킬 수 있고, 이것은 오염 요소로서 Cd의 더 높은 레벨을 함유할 수 있다. 따라서, 저렴한 비용의 인산염 비료는 농작물 생산을 위해 허용될 수 있다.

본 발명이 적용될 수 있는 식품 농작물의 소비 및 이들 식물로부터 유래된 제품의 흡연은 더 낮은 Cd 레벨으로 인한 더 건강한 옵션일 수 있다. 잎몸 부분을 포함하는 돌연변이체 식물의 지상부와 같이 - 돌연변이체 식물에서의 % Cd 감소는 야생형 대응물에 비해, 대략 적어도 약 20%, 27%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상일 수 있다.

본원에 기술된 돌연변이체 식물의 표현형은 특히 수확 시점에서, 야생형 대응물과 유사하거나 동일할 수 있고, 이것은 생성을 위해 얻어진 바이오매스의 양이 상업적으로 허용된다는 것을 의미한다. 특히, 돌연변이체 식물은 특히 수확 시점에, 성장/왜소증의 감소된 양을 겪지 않는다.

상업적으로 허용되는 바이오매스 레벨과 조합된 가능한 최저 Cd 함량을 이끌어내는 돌연변이 조합은 관심있는 식물 종과 담배 재배종에 따라 선택될 수 있다.

도 1: 8개 조직에서 TN90 및 K326에서 HMA4 .1 및 HMA4 .2에 대한 유전자 발현 레벨. 뿌리와 잎 사이의 유전자 발현은 HMA4 .1과 HMA4 .2 둘 모두에 대해 유사하다. 본 실험에 사용된 식물은 성숙된 경지 재배된 식물이다. 바 및 에러는 3개의 복제 식물의 평균 및 상부 신뢰구간을 나타낸다.
도 2: TN90 및 K326 HMA4 RNAi 계통 및 각 WT 대조군에서 HMA4 .1 및 HMA4 .2의 유전자 발현 레벨. 한천 재배된 식물로부터 뿌리를 통째로 수확하여, 갈아서 추출하였다. 바 및 에러는 4개의 복제 식물의 평균 및 표준 편차(SD)를 나타낸다. *, **, 및 ***는 WT 대조군 식물에 비해 각각 P<0.05, P<0.01 및 P<0.001에서 유의성의 레벨을 나타낸다.
도 3: (a) HMA4 RNAi K326 및 TN90 담배 식물 및 각 배경 WT 식물은 온실에서 로우 N 수정 방식 하에서 5주 동안 재배된다. 건중량에서의 (b, c) Cd/Zn 레벨, (d) 높이, (e) 잎 중량, (f) 잎 두께 및 (g) 물 함량(생중량과 건중량 간의비교)이 결정된다. 바 및 에러는 5개의 식물의 평균 ± SD를 나타낸다. *, **, 및 ***는 처리되지 않은 대조군 식물에 비해 각각 P<0.05, P<0.01 및 P<0.001에서 유의성의 레벨을 나타낸다. 점선은 Cd 측정에 대해 LOQ=0.05 ppm을 나타낸다.
도 4: 온실에서 5주(좌측) 및 11주(우측) 재배한 이후에 감소하는 기능적 HMA4 대립유전자 수를 함유하는 돌연변이체 식물의 건중량에서 (a) 표현형, (b) 잎의 생중량 및 (c) 잎 Cd 및 (d) 잎 Zn 레벨. 유전자형은 패널 아래에 표시된다. A 및 a는 HMA4 .1에 대한 야생형 및 돌연변이체 대립유전자이고, B 및 b는 HMA4 .2에 대한 야생형 및 돌연변이체 대립유전자이다. 바 및 에러는 8개 식물의 평균 ± SD를 나타낸다. *, **, 및 ***는 WT 대조군 식물에 비해 각각 P<0.05, P<0.01 및 P<0.001에서 유의성의 레벨을 나타낸다. 점선은 Cd 측정에 대해 LOQ=0.05 ppm을 나타낸다.
도 5: 온실에서 5주 및 11주 동안 재배된 상이한 이중 돌연변이체 식물 및 각 HMA4 WT 널-분리개체 대조군에서의 (a) 잎 Cd 및 (b) Zn 및 (c) 잎의 생중량 분석. 검은색 바는 널-분리개체 대조군을 나타내고, 회색 바는 각 HMA4 동형접합 이중 돌연변이체를 나타낸다. *, **, 및 ***는 WT 대조군 식물에 비해 각각 P<0.05, P<0.01 및 P<0.001에서 유의성의 레벨을 나타낸다. 점선은 Cd 측정에 대해 LOQ=0.05 ppm을 나타낸다.
도 6: 보통의 Cd 함량이 존재하는 영역에서 경지 재배된 HMA4 돌연변이체의 (a) 잎 Cd 및 (b) 잎의 생중량 데이터. 유전자형이 표시된다: A 및 a는 HMA4 .1에 대한 야생형 및 돌연변이체 대립유전자이고, B 및 b는 HMA4 .2에 대한 야생형 및 돌연변이체 대립유전자이다. 잎 합동표본은 6개(일부 유전자형 3에 대해) 복제된 플롯에서 낮은 줄기 위치에서 수집되었다. 바 및 에러는 3 내지 6개 복제 플롯 측정으로부터의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. *, **, 및 ***는 WT 대조군 식물에 비해 각각 P<0.05, P<0.01 및 P<0.001에서 유의성의 레벨을 나타낸다. 점선은 Cd 측정에 대해 LOQ=0.05 ppm을 나타낸다.
도 7: 보통의 Cd 함량이 존재하는 영역에서 경지 재배된 HMA4 돌연변이체의 (a) 잎 Cd 및 (b) 잎의 건중량 데이터. 검은색 바는 널-분리개체 대조군을 나타내고, 회색 바는 각 HMA4 동형접합 이중 돌연변이체를 나타낸다. 잎 합동표본은 6개(Q293*/W265* 및 Q293*/D234N 4개에 대해) 복제된 플롯에서 낮은 줄기 위치에서 수집되었다. 바 및 에러는 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
도 8: 경지의 높은 Cd 함량이 존재하는 2개의 영역에서 재배된 HMA4 돌연변이체의 (a, b) 잎 Cd 및 (c, d) 큐어링된 잎의 중량 데이터. (a) 및 (c)는 경지 3으로부터 Cd 및 경화된 잎 중량 데이터에 대응하고, b 및 d는 경지 4로부터의 Cd 및 경화된 잎 중량 데이터에 대응한다. 검은색 바는 널-분리개체 대조군을 나타내고, 회색 바는 각 HMA4 동형접합 이중 돌연변이체를 나타낸다. 잎 합동표본은 5개 복제된 플롯에서 낮은 줄기 위치에서 수집되었다. 바 및 에러는 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
도 9: N. 타바쿰 HMA4 단백질의 스키마. 3개의 기능적 도메인은 촉매 기능을 수행한다: 단백질의 제2 및 제3 세포질 루프에 위치한 인산화(P), 뉴클레오티드 결합(N) 및 액츄에이터 (A) 도메인. 넌센스 돌연변이와 조합하여 단백질 기능 및 감소된 Cd에 영향을 미치는 것으로 발견된 미스센스 돌연변이는 밑줄 표시된 문자로 강조된다. 본 연구에서 분석된 모든 다른 미스센스 돌연변이는 넌센스 돌연변이와 조합될 때 Cd 감소에 영향을 미치지 않는다. 넌센스 돌연변이는 검은 색으로 강조된다. (이와 같은 모델은 예시 목적으로만 쓰이며, 도메인 폴딩을 반영하지 않는다.)

정의

본 출원의 범위 내에서 사용되는 기술적인 용어 및 표현은 식물 및 분자 생물학의 관련 분야에서 통상적으로 적용되는 의미가 일반적으로 부여되어야 한다. 모든 이하의 용어 정의는 본 출원의 완전한 내용에 적용된다. 용어 "포함하는(comprising)"은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않고 부정관사 "a" 또는 "an"는 복수를 배제하지 않는다. 단일 단계는 청구항에 인용된 여러 개의 특징의 기능을 충족시킬 수 있다. 주어진 숫자 값 또는 범위의 문맥에서 용어 "약", "필수적으로" 및 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 10% 이내, 또는 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내의 값 또는 범위를 지칭한다.

용어 "단리된(isolated)"은 천연적인 환경으로부터 얻어진 임의의 엔티티를 지칭하지만, 이 용어는 임의의 정도의 정제를 내포하지 않는다.

"발현 벡터"는 핵산의 발현을 가능하게 하기 위한 핵산 성분의 조합을 포함하는 핵산 비히클(vehicle)이다. 적절한 발현 벡터는 원형의, 이중가닥의 핵산 플라스미드; 선형의 이중가닥의 핵산 플라스미드; 및 임의의 기원의 다른 기능적으로 동등한 발현 벡터와 같은 과잉 염색체 복제가 가능한 에피솜(episome)을 포함한다. 발현 벡터는 이하에서 정의된 바와 같이 적어도 핵산, 핵산 작제물 또는 핵산 컨쥬게이트(conjugate) 상류에 위치하고 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter)를 포함한다.

용어 "작제물(construct)"은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥의, 재조합된 핵산 단편을 지칭한다. 작제물은 상보적인 "센스 또는 코딩 가닥"으로 염기쌍을 이룬 "주형 가닥(template strand)"을 포함한다. 주어진 작제물은 두 가지 가능한 배향으로 벡터로 삽입될 수 있는데, 즉, 발현 벡터 같은 벡터 내에 위치한 프로모터의 배향과 관련해서 동일한(또는 센스) 배향 또는 역(또는 안티-센스) 배향으로 삽입될 수 있다.

"벡터(vector)"는 핵산, 핵산 작제물 및 핵산 컨쥬게이트 등의 수송을 가능하게 하기 위한 핵산 성분들의 조합을 포함하는 핵산 비히클을 지칭한다. 적합한 벡터는 원형의, 이중가닥의 핵산 플라스미드; 선형의 이중가닥의 핵산 플라스미드; 및 임의의 기원의 다른 벡터와 같은 과잉 염색체 복제가 가능한 에피솜을 포함한다.

"프로모터(promoter)"는 전형적으로 이중가닥의 DNA 단편의 상류에 위치하고 작동 가능하게 연결되어 있는, 핵산 요소/서열을 지칭한다. 프로모터는 관심 있는 고유한 유전자(native gene)에 근접한 영역으로부터 전체적으로 유래될 수 있거나, 다른 고유한 프로모터 또는 합성 DNA 세그먼트로부터 유래되는 다른 요소로 구성될 수 있다.

용어 "상동성(homology), 동일성(identity) 또는 유사성(similarity)"은 서열 정렬(sequence alignment)에 의해서 비교되는 두 개의 폴리펩티드 사이 또는 두 개의 핵산 분자 사이에서의 서열 유사 정도를 지칭한다. 비교되는 두 개의 별개의 핵산 서열 사이의 상동성 정도는 비슷한 위치에서 동일하거나, 매칭되는 뉴클레오티드의 수의 함수이다. 동일성 퍼센트는 육안 검사와 산술적 계산에 의해서 결정될 수 있다. 대안적으로, 두 개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트는 ClustalW, BLAST, FASTA 또는 Smith-Waterman와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교하여 결정될 수 있다. 두 서열에 대한 백분율 동일성은 다음 사항에 따라 상이한 값을 가질 수 있다: (i) 서열들을 정렬하기 위해 사용된 방법, 예를 들면 ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman(상이한 프로그램으로 실행됨) 또는 3D 비교로부터의 구조적 정렬; 및 (ii) 정렬 방법에 의해 사용된 매개변수들, 예를 들면 국소적 대 전체적 정렬, 사용된 쌍 점수 매트릭스 (예를 들면 BLOSUM, 62, PAM250, Gonnet 등) 및 갭-페널티, 예를 들면 함수 형태 및 상수. 정렬을 수행한 후, 두 서열 사이의 백분율 동일성을 계산하는 상이한 방법들이 존재한다. 예를 들면 당업자는 (i) 최단 서열의 길이; (ii) 정렬의 길이; (iii) 서열의 평균 길이; (iv) 비-갭 위치의 수; 또는 (iv) 오버행을 배제한 등가 위치들의 수에 의해 동일성의 수를 나눌 수 있다. 더욱이, 백분율 동일성은 또한 매우 길이 의존적인 것이 인지될 것이다. 그러므로, 서열의 쌍이 더 짧을수록, 당업자가 우연히 일어날 것으로 예상할 수 있는 서열 동일성은 더 높아진다. 대중적인 다수의 정렬 프로그램 ClustalW(Nucleic Acids Research (1994) 22, 4673-4680; Nucleic Acids Research (1997), 24, 4876-4882)는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 다수의 정렬을 생성하기 위한 적합한 방법이다. ClustalW에 대한 적합한 매개변수는 다음과 같을 것이다: 폴리뉴클레오티드 정렬에 대하여: 갭 오픈 페널티 = 15.0, 갭 연장 페널티 = 6.66 및 매트릭스 = Identity(동일성). 폴리펩티드 정렬에 대하여: 갭 오픈 페널티 = 10. o, 갭 연장 페널티 = 0.2 및 매트릭스 = Gonnet. DNA 및 단백질 정렬에 대하여: ENDGAP = -1 및 GAPDIST = 4. 당업자는 최적의 서열 정렬을 위해 이들 및 다른 매개변수를 다르게 하는 것이 필요할 수 있음을 인식할 것이다. 적합하게는, 백분율 동일성의 계산이 이와 같은 정렬로부터 (N/T)로서 계산되며, 여기서 N은 동일한 잔기를 공유하는 서열이 위치한 위치의 수이고, T는 갭을 포함하지만 오버행을 배제한 비교된 위치의 총 수이다.

"변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 의미한다. 변이체는 야생형 서열과 유사한 기능 또는 실질적으로 유사한 기능을 가질 수 있다. 본원에 기술된 변이체에 대해, 유사한 기능은 야생형 효소 기능의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이다. 본원에 기술된 변이체에 대해, 실질적으로 유사한 기능은 야생형 효소 기능의 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 변이체는 야생형 폴리펩티드에 비해 감소된 레벨의 활성을 갖는 효소를 초래하는 하나 이상의 유리한 돌연변이를 가질 수 있다. 변이체는 녹아웃되는 그의 활성을 초래하는 하나 이상의 유리한 돌연변이를 가질 수 있다(즉, 100% 억제, 따라서 비-기능성 폴리펩티드). 하나 이상의 유리한 돌연변이를 갖는 예시적인 변이체는 본원에 기술된다.

용어 "식물"은 수명 주기 또는 발생(development) 중 임의의 단계의 임의의 식물 또는 그의 일부, 및 그의 자손을 지칭한다. 일 구현예에서, 식물은 "담배 식물"로서, 니코티아나(Nicotiana) 속에 속하는 식물을 지칭한다. 바람직한 담배 식물 종들이 본원에 기재되어 있다. 적합하게는, 식물은 대조군 식물에 비해 하나 이상의 유전자의 발현 또는 하나 이상의 단백질의 활성이 조절되는 돌연변이체 식물이다. 적합하게는, 식물에게 돌연변이체 식물을 부여하는 변경은 하나 이상의 유전자들의 발현의 조절 또는 하나 이상의 폴리펩티드들의 활성의 조절을 초래한다. 소정의 구현예에서, 변경은 유전적 변이 또는 유전적 변형이다.

"식물 부분"은, 식물 세포, 식물 원형질체, 전체 식물이 재분화될 수 있는 식물 세포 조직 배양물, 식물 캘러스, 식물 덩어리, 식물 또는 식물의 부분, 예컨대 배아, 꽃가루, 꽃밥, 밑씨, 종자, 잎, 꽃, 자루, 가지, 열매, 뿌리, 뿌리 끝 등이 온전한 식물 세포를 포함한다. 자손, 변이체 및 재분화 식물의 돌연변이체는 또한 그들이 본원에 기술된 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우에, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 식물의 잎이 본 개시에서 사용하기에 특히 적합하다.

"식물 세포"는 식물의 구조적 및 생리학적 단위를 지칭한다. 식물 세포는 세포벽이 없는 원형질체, 단리된 단일 세포 또는 배양된 세포 형태일 수 있거나, 식물 조직, 식물 기관, 또는 전체 식물과 같지만 이에 한정되지 않는 보다 조직화된 단위의 일부분으로서일 수 있다.

용어 "식물 재료"는 바이오매스, 잎, 자루, 뿌리, 꽃 또는 꽃 부분, 열매, 꽃가루, 난세포, 접합체(zygote), 종자, 꺾꽂이, 분비물, 추출물, 세포 또는 조직 배양물, 또는 식물의 임의의 기타 부분 또는 생성물을 포함하는, 식물로부터 수득 가능한 임의의 고체, 액체 또는 기체 조성물, 또는 그의 조합을 지칭한다. 일 구현예에서, 식물 재료는 바이오매스, 자루, 종자 또는 잎을 포함하거나, 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 식물 재료는 잎을 포함하거나, 이로 구성된다.

용어 "품종(variety)"은 동일한 종의 다른 식물로부터 구분되는 일정한 특징을 공유하는 식물의 개체군을 지칭한다. 하나 이상의 뚜렷한 형질을 가지면서, 품종은 이러한 품종 내의 개체들 사이에서 전체적인 변이가 매우 작은 것을 더욱 특징으로 한다. 품종은 종종 상업적으로 판매된다.

본원에 사용되는 용어 "계통(line)" 또는 "육종 계통(breeding line)"은 식물 육종 동안에 사용되는 식물군을 나타낸다. 계통은 다른 형질에 대해서는 개체들 간에 약간의 변이가 나타날 수 있지만, 관심 있는 하나 이상의 특성에 대해서는 개체들 간에 변이가 거의 없으므로 돌연변이체와 구별될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 ‘비-천연 발생’은 천연적으로 형성되지 않거나 또는 천연에 존재하지 않는 엔티티(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 유전자 돌연변이, 폴리펩티드, 식물, 및 식물 세포 및 식물 재료)를 기재하고 있다. 이러한 비-천연 발생 엔티티 또는 인위적인 엔티티는 본원에 기재된 방법 또는 본 기술분야에 공지된 방법에 의해서 제조, 합성, 개시, 변형, 개입, 또는 조작될 수 있다. 이러한 비-천연 발생 엔티티 또는 인위적인 엔티티는 사람에 의해서 제조, 합성, 개시, 변형, 개입, 또는 조작될 수 있다. 따라서, 예시에 의해서, 비-천연 발생 식물, 비-천연 발생 식물 세포 또는 비-천연 발생 식물 재료는 안티센스 RNA, 간섭성 RNA, 메가뉴클레아제 등과 같은 유전자 조작 기술에 의해서 제조될 수 있다. 추가적인 예시에 의해서, 비-천연 발생 식물, 비-천연 발생 식물 세포 또는 비-천연 발생 식물 재료는 제1 식물 또는 식물 세포로부터 제2 식물 또는 식물 세포(그 자체는 천연적으로 발생할 수 있음)로 하나 이상의 유전자 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 다형성)를 유전자이입 또는 전달하여 제조됨으로써, 그 결과물인 식물, 식물 세포 또는 식물 재료 또는 그의 자손은 천연적으로 형성되지 않거나 또는 천연에 존재하지 않는 유전자 구성(예를 들어, 게놈, 염색체 또는 그의 세그먼트)을 포함할 수 있게 된다. 따라서 생성된 식물, 식물 세포 또는 식물 재료는 인공적이거나 또는 비-천연 발생한 것이다. 따라서, 생성된 유전자 서열이 제1 식물 또는 식물 세포로부터의 상이한 유전적 배경을 포함하는 제2 식물 또는 식물 세포에서 천연 발생하더라도, 인공적이거나 또는 비-천연 발생 식물 또는 식물 세포는 제1 천연 발생 식물 또는 식물 세포에서 유전자 서열을 변형하여 제조될 수 있다.

용어 "조절(modulating)"은 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 감소, 억제, 제거, 증가 또는 이와 달리 영향을 미치는 것을 지칭할 수 있다. 용어는 또한, 전사 활성을 조절하는 것을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는, 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 활성을 감소, 억제, 제거, 증가 또는 이와 달리 영향을 주는 것을 지칭할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "감소하다" 또는 "감소된"은 이에 한정하는 것은 아니지만, 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및 단백질 발현과 같은 양 또는 활성에 대해, 약 10% 내지 약 99%의 감소, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 또는 그 이상의 감소를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "억제하다" 또는 "억제된", 또는 “제거하다” 또는 “제거된”은, 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및 발현과 같지만 이에 한정되지 않는 양 또는 활성에 대해, 약 98% 내지 약 100%의 감소, 또는 적어도 98%, 적어도 99%, 그러나 특히 100%의 감소를 지칭한다.

세포의 형질전환은 안정적일 수도 있고 일시적일 수도 있다. 용어 "일시적 형질전환" 또는 "일시적으로 형질전환된" 또는 이의 변이는 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포의 게놈 내로 통합시키지 않고 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입시키는 것을 지칭한다. 대조적으로, 용어 "안정적인 형질전환" 또는 "안정적으로 형질전환된"은 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포의 게놈 내로 도입 및 통합하는 것을 지칭한다. 용어 "안정적인 형질전환체"는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 게놈 또는 소기관 DNA에 안정적으로 통합시킨 세포를 말한다. 본 개시의 핵산, 작제물 및/또는 벡터로 형질전환된 유기체 또는 그의 세포는 일시적으로뿐만 아니라 안정적으로 형질전환될 수 있음을 이해해야 한다. 소정의 구현예에서, 안정적인 형질전환이 바람직하다.

본원에서 사용되는 용어 "증가하다" 또는 "증가된", 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및 단백질 발현과 같지만 이에 한정되지 않는 양 또는 활성에 대해, 약 5% 내지 약 99%의 증가, 또는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 또는 그 이상의 증가를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이 그리고 양의 문맥에서 사용될 때 용어 "실질적으로"는 양이, 비교되고 있는 양의 적어도 약 10%, 적어도 약 9%, 적어도 약 8%, 적어도 약 7%, 적어도 약 6%, 적어도 약 5%, 적어도 약 4%, 적어도 약 3%, 적어도 약 2%, 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 0.1%를 의미한다.

대조군 식물 또는 대조군 식물 세포 등의 문맥에서 용어 "대조군(control)"은 관심 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 조절되지 않아서 효소의 발현 또는 활성이 조절된 식물 또는 식물 세포와 비교 또는 참조를 제공할 수 있는 식물 또는 식물 세포를 의미한다. 따라서, 본 발명의 문맥에서, 대조군은 본원에 기재된 HMA4(들)의 발현 또는 활성을 감소시키는 적어도 하나의 유전적 변경을 포함하지 않을 것이다. 대조군 식물 또는 식물 세포는 빈(empty) 벡터를 포함할 수 있다. 대조군 식물 또는 식물 세포는 야생형 식물 또는 야생형 식물 세포 등에 대응할 수 있다. 이러한 모든 경우에서, 대상 식물과 대조군 식물은 비교 목적으로 동일한 프로토콜을 사용하여 동일한 조건 하에서 재배되고 수확된다. 따라서, 예로서, 대상 식물 및 대조군 식물은, 2개 사이의 비교가 이루어질 수 있도록 - Cd와 같은 - 중금속(들) 함량의 거의 동일한 레벨을 갖는 토양으로부터 재배되고 수확될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 경지의 동일한 부분에서 재배되는 대상 식물 및 대조군 식물을 동반할 수 있어서, 이들이 대략 동일한 토양 Cd 레벨에 노출된다. 본원에 기술된 유전자 또는 폴리펩티드의 레벨, 비율, 활성, 또는 분포의 변화, 또는 식물 표현형에서의 변화, 특히 Cd 및/또는 아연의 감소된 축적은, 대상 식물을 대조군 식물과 비교하여 본원에 기술된 방법을 이용하여 측정될 수 있으며, 적합하게는, 대상 식물 및 대조군 식물은 동일한 프로토콜을 사용하여 경작 및/또는 수확되었다. 대조군 식물은 대상 식물의 표현형 변화를 측정하기 위한 기준점을 제공할 수 있다. 표현형 변화의 측정은 식물 발생, 노화 중이나, 큐어링 후를 포함하여 언제든지 식물에서 측정될 수 있다. 표현형 변화의 측정은 성장 챔버, 온실 또는 경지에서 재배된 식물로부터를 포함하는, 임의의 조건 하에서 재배된 식물에서 측정할 수 있다. 표현형에서의 변화는 종래 기술에 잘 알려진 방법을 이용하여 큐어링 또는 건조 이전 및/또는 그 동안 및/또는 이후에 Cd 함량 및/또는 아연 함량을 측정함으로써 측정될 수 있다.

본원에 사용된 용어 “경지”는 개방된 땅의 영역, 특히 농작물일 수 있거나 농작물로 심어지는 영역으로서 종래 기술에서 정상 의미를 상정한다. 경지는 실험실 또는 온실과 같이 - 인공 환경이 아니라 천연 환경의 부분이다. 따라서, 공통적으로 사람이 만든 빌딩 또는 구조체인 인공 환경과 달리, 경지는 개방된 외부 환경의 부분이다.

본원에 논의된 바와 같이, HMA(들)의 발현 또는 활성은 돌연변이체 식물에서 부분적으로 감소될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 이들 용어 “부분적으로 감소된”은, 돌연변이체 식물에서 HMA(들)의 발현 또는 활성이 대조군 식물에서 HMA(들)의 발현 또는 활성의 레벨보다 약 1% 내지 99% 낮다는 것을 의미한다. 적합하게는, 돌연변이체 식물에서의 HMA(들)의 발현 또는 활성은 대조군 식물에서의 HMA(들)의 발현 또는 활성의 레벨보다 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이다. 예로서, HMA 단백질의 큰 부분을 절단하는 넌센스 돌연변이는 임의의 효소 활성을 보여주지 않도록 예상되어, 활성의 완전한 손실(즉, 제로 활성)을 초래한다. 추가 예로서, 미스센스 돌연변이에 대해, 효소 활성은 대조군 식물과 동일할 수 있고, 부분적으로 감소되거나 검출 가능하지 않을 수 있다(예를 들어, 완전한 손실 또는 제로).

발명의 상세한 설명

단리된 HMA4 폴리펩티드 변이체(돌연변이체)가 본원에 기재되고, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 대한 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열과, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 기재된 야생형 서열에 비해 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함한다. SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2는 비-돌연변이 서열이다. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO:2는 각각 하기의 니코티아나 타바쿰 중금속 1 ATPase (NtHMA4.1) GenBank 기탁 번호: CCQ77798의 아미노산 서열에 대응하고, 니코티아나 타바쿰 중금속 1 ATPase (NtHMA4.2) GenBank 기탁 번호: CCW03243.1의 아미노산 서열에 대응한다. 적합하게는, 단리된 폴리펩티드는 적어도 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 서열 및 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성된다. HMA4.1 및 HMA4.2로서 본원에 언급되는 HMA4의 2개의 상동성을 포함하는 - N. 타바쿰과 같은 특정 식물.

식물, 식물 세포 또는 식물 재료 등에서, 돌연변이체 폴리펩티드의 기능 또는 활성은 조절되고, 감소되고, 부분적으로 비활성화되고, 억제되고, 제거되고, 녹아웃되거나 손실된다. 일 구현예에서, 하나의 돌연변이체 폴리펩티드의 기능 또는 활성은 폴리펩티드 활성이 검출 가능하지 않도록 억제되고, 제거되고, 녹아웃되거나 손실될 수 있다. 일 구현예에서, 2개의 돌연변이체 폴리펩티드(예를 들어, 동일한 유전자의 상동성에 의해 인코딩된 폴리펩티드)의 기능 또는 활성은 폴리펩티드 활성이 검출 가능하지 않도록 억제되고, 제거되고, 녹아웃되거나 손실될 수 있다.

다른 구현예에서, 하나의 돌연변이체 폴리펩티드(예를 들어, 유전자의 하나의 상동성)의 기능 또는 활성은 폴리펩티드 활성이 검출 가능하지 않도록 손실되고, 억제되거나 제거되고, 다른 돌연변이체 폴리펩티드(예를 들어, 유전자의 제2 상동성)의 기능 또는 활성은 HMA 폴리펩티드 활성이 대조군 HMA 폴리펩티드에 비해 낮지만 여전히 검출 가능하도록 감소되거나 부분적으로 감소된다. 이러한 유형의 예시적인 돌연변이 조합은 이중 동형접합성 돌연변이체 G251D/Q561*이고, G251D 돌연변이는 NtHMA4.1 (SEQ ID NO:1)의 활성을 부분적으로 감소시키고, Q561* 돌연변이는 NtHMA4.2 (SEQ ID NO:2)의 활성을 녹아웃하고, 억제하거나 제거한다. SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 활성은 부분적으로 감소되고, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 활성은, HMA4 폴리펩티드 중 하나의 활성이 부분적으로 감소되고 HMA 중 하나의 활성이 손실되는 경우 손실되고, 억제되거나 제거된다. SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 활성은 부분적으로 감소되고, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 활성은, HMA4 폴리펩티드 중 하나의 활성이 부분적으로 감소되고 HMA 중 하나의 활성이 손실되는 경우 손실되고, 억제되거나 제거될 수 있다.

적합하게는, HMA 중 적어도 하나는 완전히 녹아웃되고, HMA 중 적어도 하나는 A-도메인에서, P-도메인의 DKTGT 모티프에서 또는 N-도메인의 HP 좌위(locus)에 위치된 넌센스 또는 미스센스 돌연변이를 포함한다.

식물, 식물 세포 또는 식물 재료 등에서, NtHMA4.1 (SEQ ID NO:1) 및 NtHMA4.2 (SEQ ID NO:2)의 활성은 대조군 식물에 비해 손실되고, 억제되거나 제거될 수 있다. 이러한 유형의 예시적인 돌연변이 조합은 이중 동형접합성 돌연변이체 Q293*/Q561*이고, 여기서 Q293* 돌연변이는 NtHMA4.1 (SEQ ID NO:1)의 활성을 녹아웃하고, 억제하거나 제거하고, Q561* 돌연변이는 NtHMA4.2 (SEQ ID NO:2)의 활성을 녹아웃하고, 억제하거나 제거한다. 다른 예시적인 돌연변이체는 표 4 및 표 5에 기술된다. 본원에 기술된 변이체(돌연변이체) HMA4.1 및 HMA4.2 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 조합 또는 혼합물이 고려된다.

모든 조합에 대해, 다른 상동성에서의 동일한 조합은 각각 고려된다. 예를 들어, 조합 HMA4.1 E296K/ HMA4.2 Q561* 및 조합 HMA4.1 Q561*/ HMA4.2 E296K이 고려된다.

적합하게는, HMA4 폴리펩티드 변이체는, 이들이 대조군에 비해 적어도 약 27%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상의 Cd 감소를 나타내도록 함유되는 식물을 야기한다.

하기의 SEQ ID NO: 1에 대한 적어도 60% 동일성을 갖는 다른 HMA 또는 SEQ ID NO:2는 서열 정렬시 본원에 개시된 위치에 대응하는 위치(들)에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 또한 본 개시에 사용하기 위해 고려된다. 이들 서열의 예는 토마토, 감자 및 가지와 같은 - 가지(Solanaceae)과 로부터 HMA 서열을 포함한다.

변이체 폴리펩티드의 단편은 또한 이들이 하나 이상의 아미노산 돌연변이(들)를 보유한다는 가정 하에 고려된다. 변이체 폴리펩티드 서열의 단편은 적어도 약 25개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 150개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 250개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 500개 아미노산, 약 600개 아미노산, 또는 최대 전장(full-length) 폴리펩티드까지의 범위일 수 있다.

변이체는 임의의 유형의 변경(예를 들어, 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환; 글리코실화 상태의 변화; 리폴딩, 이성질화, 3차원 구조, 또는 자가-결합 상태에 영향을 미치는 변화)을 도입함으로써 생성될 수 있는데, 이것은 돌연변이체 폴리펩티드가 본원에 기술된 바와 같이 Cd의 축적에서의 적어도 감소를 나타내도록 발현되는 식물을 야기하는 것을 가정한다.

폴리펩티드 변이체는 임의의 유형의 변경(예를 들어, 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환; 글리코실화 상태의 변화; 리폴딩, 이성질화, 3차원 구조, 또는 자가-결합 상태에 영향을 미치는 변화)을 도입하여 생성되는 돌연변이체를 포함하는데, 이들은 의도적으로 조작되거나 천연적으로 단리될 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 물질의 2차 결합 활성이 보유되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및 양친매성 성질의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음전하된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양전하된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하며; 그리고 유사한 친수성 값을 가지는 비전하된 극성 헤드기를 가지는 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 보존성 치환은, 예를 들어 하기의 표에 따라서 이루어질 수 있다. 제2 컬럼의 동일한 블록 내의 아미노산 및 적합하게는 세번째 컬럼의 동일한 선 내의 아미노산은 서로 치환될 수 있다:

하나의 적합한 유형의 돌연변이는, 단일 뉴클레오티드 변화가 상이한 아미노산에 대해 코딩하는 코돈을 초래하는 점 돌연변이인 미스센스 돌연변이이다. 미스센스 돌연변이는 HMA4.1 또는 HMA4.2와 같은 - HMA4 폴리펩티드를 부분적으로 비활성화(예를 들어, 감소)하기 위해 특히 효율적일 수 있다.

다른 적합한 유형의 돌연변이는, HMA4.1 또는 HMA4.2와 같이 - 전사된 mRNA 및 절단된, 불완전한 및 비-기능성 HMA4 폴리펩티드에서 사전 종결 코돈 또는 넌센스 코돈에서 단일 뉴클레오티드 변화를 초래하는 점 돌연변이인 넌센스 돌연변이이다. 넌센스 돌연변이는 HMA4.1 또는 HMA4.2와 같이 - HMA4 폴리펩티드의 활성을 억제하거나 제거하거나 녹아웃하기 위해 특히 효율적일 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, HMA4.1 또는 HMA4.2 중 하나의 발현 또는 활성은 적어도 부분적으로 감소되고, 다른 HMA4.1 또는 HMA4.2의 발현 또는 활성은 소정의 구현예에서 대조군 식물에 비해 손실되고, 제거되거나 감소된다. 일 구현예에서, HMA4.1 또는 HMA4.2 중 하나의 발현 또는 활성은 미스센스 점 돌연변이의 사용을 통해 부분적으로 감소되고, 다른 HMA4.1 또는 HMA4.2의 발현 또는 활성은 넌센스 점 돌연변이의 사용을 통해 손실되고, 제거되거나 감소된다.

적합하게는, 본원에 기술된 돌연변이는 이형접합 또는 동형접합 돌연변이이다. 적합하게는, 본원에 기술된 돌연변이는 동형접합 돌연변이이다.

돌연변이(들)는 예를 들어, HMA4.1 또는 HMA4.2의 조절 영역에서 또는 HMA4.1 또는 HMA4.2의 코딩 서열에서 위치될 수 있다. 소정의 구현예에서, 돌연변이(들)는 HMA4.1 또는 HMA4.2의 코딩 서열에 위치된다.

HMA4 폴리펩티드는 표 7에 기재되는 다양한 도메인을 포함한다.

본원에 기술된 돌연변이체의 조합에 대해, 동일한 조합은 각각 다른 상동성에 포함될 수 있다.

적어도 2개의 중금속 ATPases(HMAs)의 발현 또는 활성은 부분적으로 감소되어, HMA를 함유하는 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은, 돌연변이체 식물이 천연 또는 비-천연 발생하는 카드뮴의 존재 시에 경지 재배될 때 잎에서의 카드뮴 축적에서 대조군 식물에 비해 적어도 27% 감소를 나타낸다. HMA의 하나의 발현 또는 활성은 부분적으로 감소되거나 손실되고, 다른 HMA의 발현 또는 활성은 대조군 식물에 비해 손실될 수 있다.

적합하게는, HMA4 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다.

적합하게는, HMA4 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 251 내지 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 251 내지 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 251 또는 293 또는 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 251 또는 293 또는 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

적합하게는, 식물은 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

적합하게는, 식물은 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 223 내지 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 223 내지 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 223 또는 234 또는 235 또는 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 223 또는 234 또는 235 또는 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 402 내지 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 402 내지 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P-도메인의 아미노산 위치 402 또는 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 의 P/N-도메인의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P-도메인의 아미노산 위치 402 또는 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 의 P/N-도메인의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 265에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

보다 적합하게는, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 아미노산 위치 265에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

적합하게는, 변이체는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다: (i) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (ii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iv) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (v) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (vi) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (vii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (viii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (ix) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄); 또는 (x) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄).

적합하게는, 변이체는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다: (i) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iv) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (v) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (vi) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (vii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (viii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (ix) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄); 또는 (x) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄).

넌센스 돌연변이의 임의의 하나가 본원에 기술된 미스센스 돌연변이의 임의의 하나와 조합될 수 있다는 것이 고려된다.

경지에서 외부에서 재배될 때 전술한 변이체를 함유하는 식물을 이용하여 얻어진 데이터의 요약은 표 4, 표 5 및 표 6에 기재된다. 이중 돌연변이체 Q293*/Q561* 또는 Q293*/W265* 또는 Q464*/Q561* 또는 Q293*/G235E 또는 E296K/Q561* 또는 T402I/Q561*를 포함하는 식물은 약 80 내지 96% Cd 감소를 나타낸다. 이중 돌연변이체 G251D/Q561*를 포함하는 식물은 약 33 내지 70% Cd 감소를 나타낸다. 이중 돌연변이체 Q293*/L223F 또는 Q293*/D234N를 포함하는 식물은 약 27 내지 37% Cd 감소를 나타낸다. 초기 스테이지에서 그리고 특정한 조건 하에서 지연된 식물 발육은 이중 돌연변이체 Q293*/Q561* 또는 Q293*/W265* 또는 Q464*/Q561* 또는 Q293*/G235E 또는 E296K/Q561* 또는 T402I/Q561*에 대해 관찰된다. 하지만, 수확 시점에, 각 돌연변이체와 대조군 사이에서 명백한 표현형 차이가 관찰될 수 없다. G251D/Q561*는 정상 성장 및 발육을 보여준다. Q293*/Q561* 또는 Q293*/W265* 또는 Q464*/Q561* 또는 E296K/Q561* 또는 Q293*/G235E가 환경 조건에 따라 초기 스테이지에서 그 잎 상에 괴사성 병변을 보여줄 수 있지만, 괴사성 병변의 존재는 경지에서 수확 시점에 대부분의 조건 하에서 관찰되지 않는다. 테스트된 다른 돌연변이 조합(G382R/Q561*, V351M/Q561*, A188V/Q561*, Q293*/A369V, Q293*/A374V, T189I/Q561*, Q293*/S27L, Q293*/A188V, G128E/Q561*)는 상당하거나 20% Cd 감소보다 더 크게 초래하지 않는다. 적합하게는, 소정의 구현예에서, 이중 돌연변이체는 G382R/Q561* 또는 V351M/Q561* 또는 A188V/Q561* 또는 Q293*/A369V 또는 Q293*/A374V 또는 T189I/Q561* 또는 Q293*/S27L 또는 Q293*/A188V 또는 G128E/Q561*이 아니다.

온실에서 재배될 때 이들 이중 돌연변이체의 일부에 대한 데이터는 표 8에 도시된다. 표 4(실지 시험) 및 표 8(온실)의 비교로부터 알 수 있듯이, 다양한 돌연변이 조합에 대한 Cd 감소의 레벨은 일반적으로 서로 대응한다.

추가 이중 돌연변이체는 온실에서 테스트되었다. 이들 데이터의 결과는 표 9에 제시된다. 경지 데이터 및 온실 데이터에 대해 표 4 및 표 8에 제시된 이중 돌연변이체에 대한 Cd 감소의 레벨 상의 일반적인 동의를 고려하여, 표 9에 제공된 온실 데이터가 또한 일반적으로 경지에서 얻어질 결과에 대응할 것이라는 것이 예측된다. 돌연변이 조합 H438Y/W265*은 단지 약 58% Cd 감소가 초래된 온실 조건 하에서 테스트되었고; 표현형 변화는 관찰되지 않았다(표 9).

소정의 구현예에서, 이중 돌연변이체 Q293*/Q561* 또는 Q293*/W265* 또는 E296K/Q561* 또는 T402I/Q561* 또는 Q464*/Q561* 또는 Q293*/G235E는 경지에서 약 80% 이상의 Cd 감소를 나타내기 때문에 바람직하다. 이와 같은 바람직한 조합의 일 구현예에서, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다: (i) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (ii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iv) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (v) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (vi) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄).

이와 같은 바람직한 조합의 일 구현예에서, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다: (i) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iv) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (v) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (vi) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄).

소정의 구현예에서, 이중 돌연변이체 G251D/Q561* 또는 H438Y/W265* 또는 Q293*/L223F 또는 Q293*/D234N은 바람직한데(예를들어, 담배, 버얼리 담배와 같은 - 식물로의 도입을 위한), 이는 이들이 27 내지 70% Cd 감소를 나타내고 성장에 간섭할 가능성이 없기 때문이다. 이와 같은 바람직한 조합의 일 구현예에서, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다: (i) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (ii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (vi) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iv) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄).

이와 같은 바람직한 조합의 일 구현예에서, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다: (i) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iv) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q293* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄).

소정의 구현예에서, 이중 돌연변이체 T402I/ Q561*가 바람직한데, 이것이 초기 재배 스테이지에서조차 약 90% Cd 감소 및 수용 가능한 형태를 나타내기 때문이다. 따라서, 이와 같은 구현예에 따라, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이를 포함하고, 적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타낸다.

본원에 기술된 돌연변이의 조합이 또한 고려된다. 특히, 이중 돌연변이체에서의 각 단일 돌연변이의 상이한 조합이 고려된다. 그러한 조합의 실시예는 표 11 및 12에 도시되고, 이하에 기술된다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P-도메인의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P-도메인의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P-도메인의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P-도메인의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P-도메인의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P-도메인의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P-도메인의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P-도메인의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

일 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NO:4에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인의 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

적합하게는, 변이체는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다: (i) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 W265**이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (ii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iv) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (v) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (vi) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 L223F임); (vii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (viii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 G235E임); (ix) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (x) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 L223F임); (xi) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 D234N임); (xii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 G235E임); (xiii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (xiv) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 L223F임); (xv) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 D234N임); (xvi) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 G235E임); (xvii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (xviii) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (xix) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); 또는 (xx) SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄).

적합하게는, 변이체는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다: (i) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 W265**이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (iv) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 Q464* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (v) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (vi) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 L223F임); (vii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (viii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 E296K 및 G235E임); (ix) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (x) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 L223F임); (xi) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 D234N임); (xii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 T402I 및 G235E임); (xii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (xiv) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 L223F임); (xv) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 D234N임); (xvi) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 G251D 및 G235E임); (xvii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (xviii) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄); (xix) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); 또는 (xx) SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 돌연변이는 H438Y 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄).

일부 경우에 예를 들면, 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 또는 O-메틸포스포로아미다이트(O-methylphosphoroamidite) 연결을 포함하는 대안적인 골격(backbone); 및 펩티드 폴리뉴클레오티드 골격 및 연결기를 가질 수 있는 폴리뉴클레오티드 유사체가 포함되지만, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합을 함유할 것이다. 다른 유사체 폴리뉴클레오티드로는 양성 골격; 비이온성 골격, 및 비-리보오스 골격을 가지는 것을 포함한다. 리보오스-인산 골격의 변형은 다양한 이유 때문에 생길 수 있는데, 예를 들면, 생리학적 환경 또는 바이오칩 상 프로브로서의으로서의 분자들의 안정성 및 반감기를 증대시키기 위한 이유이다. 천연 발생 폴리뉴클레오티드 및 유사체의 혼합이 생길 수 있다; 대안적으로, 상이한 폴리뉴클레오티드 유사체들의 혼합, 및 천연 발생 폴리뉴클레오티드 및 유사체의 혼합이 생길 수 있다.

단리된 HMA4 폴리뉴클레오티드 변이체(돌연변이체)는 본원에 기술되며, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4에 기재된 야생형 서열에 비해 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 및 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함한다. SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4는 비-돌연변이 서열이다. SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4는 각각, 하기의 니코티아나 타바쿰 중금속 1 ATPase (NtHMA4 .1) GenBank 기탁 번호: HF675181.1 및 니코티아나 타바쿰 중금속 1 ATPase (NtHMA4 .2) GenBank 기탁 번호: HF937054.1의 폴리뉴클레오티드 서열에 대응한다. 적합하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 적어도 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 가지는 서열 및 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하거나, 이로 구성되거나, 필수적으로 구성된다.

적합하게는, 식물은 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4 각각에서의 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 (ii)에 기재된 HMA를 인코딩하는 RNA 전사의 전이와 간섭하는 유전자 단편을 포함하고, 적합하게, 돌연변이는 미스센스 돌연변이 또는 넌센스 돌연변이이다.

예를 들면, 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), O-메틸포스포라미다이트(O-methylphosphoroamidite) 연결기 및 펩티드 폴리뉴클레오티드 골격 및 연결기를 포함해서, 다양한 폴리뉴클레오티드 유사체가 공지되어 있다. 다른 유사체 폴리뉴클레오티드로는 양성 골격, 비이온성 골격, 및 비-리보오스 골격을 가지는 것을 포함한다. 하나 이상의 카보사이클릭 당을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 또한 포함된다.

폴리뉴클레오티드에 대한 혼성화 조건의 선택 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본적인 매개변수는 1989년, Sambrook 등에 의해 기술된다. 본원에 기술된 아미노산 서열과 유전 암호의 지식의 조합을 이용해서, 축퇴성 올리고뉴클레오티드의 세트가 생성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 DNA 단편이 단리되고 증폭되는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 프라이머로서 유용하다. 소정의 구현예들에서, 축퇴성 프라이머는 유전자 라이브러리를 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 라이브러리는 이에만 한정하는 것은 아니지만, cDNA 라이브러리, 게놈 라이브러리, 및 심지어 전자 발현 서열 태그(EST) 또는 DNA 라이브러리를 포함한다. 이러한 방법에 의해서 식별되는 상동성 서열은 본원에서 인식되는 서열의 상동성을 인식하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.

또한 감소된 엄격성 조건, 전형적으로 중간 엄격성 조건, 및 일반적으로 높은 엄격성 조건 하에서 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 프라이머 또는 프로브)가 잠재적으로 사용될 수 있다. 혼성화 조건의 선택 및 적절한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본적인 매개변수는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 길이 또는 염기 조성을 기초로 당업계 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 중간 엄격성 조건을 얻는 한가지 방법은 5x 표준 구연산나트륨, 0.5% 도데실 황산나트륨, 1.0 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(pH 8.0), 약 50% 포름아미드의 혼성화 완충액, 6x 표준 구연산나트륨을 함유하는 예비세정 용액의 사용, 및 약 55℃의 혼성화 온도 (또는 약 42℃의 혼성화 온도로, 약 50%의 포름아미드를 함유하는 것과 같은, 다른 유사한 혼성화 용액), 및 0.5x 표준 구연산나트륨, 0.1% 도데실 황산나트륨에서의 약 60℃의 세정 조건과 연관된다. 일반적으로, 높은 엄격성 조건은 상기와 같은 혼성화 조건으로서 정의되지만, 약 68℃, 0.2x 표준 구연산나트륨, 0.1% 도데실 황산나트륨으로 세정한다. SSPE(1x SSPE는 0.15M 염화나트륨, 10 mM 인산나트륨, 및 1.25 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, pH 7.4)는 혼성화 및 세정 완충액에서 표준 구연산나트륨(1 x 표준 구연산나트륨은 0.15 M 염화나트륨 및 15 mM 구연산나트륨)에 대해 치환될 수 있고; 혼성화가 완료된 후에 15 분 동안 세정을 수행한다. 세정 온도 및 세정 염 농도는 본 기술분야의 숙련자들에게 공지되고 이하에 추가로 기술된 바와 같이 (예를 들어, 1989년, Sambrook을 참조), 혼성화 반응 및 이중 안정성을 관리하는 기본 원리를 적용함으로써 원하는 엄격함 정도를 달성하기 위해 필요한 정도로 조정될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 미공지된 서열의 표적 폴리뉴클레오티드에 폴리뉴클레오티드를 혼성화할 때, 혼성체 길이는 혼성화 폴리뉴클레오티드의 길이로 추정된다. 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드가 혼성화할 때, 혼성체 길이는 폴리뉴클레오티드의 서열을 정렬하고 최적의 서열 상보성의 영역 또는 영역들을 식별하여 결정될 수 있다. 길이가 50 미만의 염기쌍인 것으로 예상되는 혼성체를 위한 혼성화 온도는 혼성체의 용융점 보다 5℃ 내지 10℃ 적어야 하고, 이때 용융점은 다음의 식에 따라 결정된다. 길이가 18 미만의 염기쌍인 혼성체의 경우, 용융점(℃)=2(A+T 염기 수)+4(G+C 염기 수)이다. 길이가 18 초과의 염기쌍인 혼성체의 경우, 용융점(℃)=81.5+16.6(log10 [[Na+])+0.41(% G+C)-(600/N)이고, 이때 N은 혼성체 내의 염기 수이고, [[Na+]는 혼성화 완충액 내의 나트륨 이온의 농도이다(1x 표준 구연산나트륨=0.165M에 대한 [[Na+]). 전형적으로, 각각의 이러한 혼성화 폴리뉴클레오티드는 혼성화하는 폴리뉴클레오티드의 길이의 적어도 25%(일반적으로 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 가장 일반적으로 적어도 80%)인 길이를 가지고, 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)의 서열 동일성을 가진다.

단리된 폴리뉴클레오티드가 또한 고려된다. “단리된” 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 천연적으로 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 5’ 및 3’ 말단에 위치한 서열) 측면에 배치되는 서열(최적으로 단백질 인코딩 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 유래되는 세포의 게놈 DNA에서 천연적으로 폴리뉴클레오티드 측면에 배치되는 뉴클레오티드 서열을 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 또는 0.1 kb 미만 함유할 수 있다.

재조합 작제물은 식물 또는 식물 세포를 변형하는데 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드 작제물은 본원에 기술된 하나 이상의 변이체 폴리뉴클레오티드를 인코딩하며, 변이체 폴리펩티드를 발현하는데 적절한 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 식물 또는 식물 세포는 재조합 DNA의 안정적인 통합에 의해서 변경된 게놈을 포함할 수 있다. 재조합 DNA는 유전자 조작되었고 세포의 외부에서 작제된 DNA를 포함하고 천연 발생 DNA 또는 cDNA 또는 합성 DNA를 함유하는 DNA를 포함한다. 식물은 본래 형질전환된 식물 세포로부터 재분화된 식물 및 이후 세대 또는 형질전환된 식물의 교배로부터의 자손 식물을 포함할 수 있다. 적합하게는, 변형은 본원에 기술된 HMA 폴리뉴클레오티드 또는 HMA 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 대조군 식물과 비교해서 변경시킨다. 소정의 구현예에서, 유전자 비활성화의 이용을 통해 Cd 축적을 감소하기 위해 비-GMO 접근법의 이용이 사용된다. 따라서, 예를 들어, 돌연변이 유발, 기형 발생, 또는 발암성 유기 화합물, 예를 들어 에틸 메탄술포네이트(EMS) 같은 하나 이상의 외인성 추가된 화학 물질의 이용을 통해 얻어진 하나 이상의 뉴클레오티드 다형성을 특징으로 하는, 유전 물질에서 무작위 돌연변이를 생성하는 돌연변이체가 사용된다. 처리된 식물의 DNA 라이브러리는 2개의 HMA4 유전자에서 돌연변이에 대해 스크리닝될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드 작제물을 함유하는 벡터가 또한 제공된다. 적절한 벡터 골격은 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 또는 박테리오파지 인공 염색체와 같이 본 기술분야에 일상적으로 사용되는 것들을 포함한다. 적절한 발현 벡터는 제한 없이, 예를 들어 박테리오파지, 배큘로바이러스(baculoviruse), 및 레트로바이러스로부터 유래되는 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한다. 수많은 벡터 및 발현 시스템이 시판 중이다. 벡터는 예를 들어 복제 원점, 지지체 결합 영역(scaffold attachment region) 또는 마커를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 식물 세포에 대해 선택할 수 있는 표현형을 부여할 수 있다. 예를 들어, 마커는 항생제(예를 들어, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 또는 하이그로마이신), 또는 제초제(예를 들어, 글리포세이트, 클로술푸론 또는 포스피노트리신)에 대한 저항성과 같은, 살생제 저항성을 부여할 수 있다. 또한, 발현 벡터는 발현된 폴리펩티드의 조작 또는 검출(예를 들어, 정제 또는 국재화)을 용이하게 하기 위해 고안된 태그 서열을 포함할 수 있다. 루시퍼라아제, 베타-글루쿠로니다아제, 녹색 형광 단백질, 글루타티온 S-전이효소, 폴리히스티딘, c-myc 또는 헤마글루티닌 서열과 같은 태그 서열은 전형적으로 인코딩된 폴리펩티드와의 융합으로서 발현된다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단을 포함해서, HMA 변이체 폴리펩티드 내에 어느 곳에서나 삽입될 수 있다.

식물 또는 식물 세포는 안정적으로 형질전환되도록 그의 게놈 내로 통합된 재조합 폴리뉴클레오티드를 가져서 형질전환될 수 있다. 본원에서 설명한 식물 또는 식물 세포는 안정적으로 형질전환된다. 안정적으로 형질전환된 세포는 전형적으로 각각의 세포분열시에 도입된 폴리뉴클레오티드를 보유한다. 식물 또는 식물 세포는 일시적으로 형질전환되어서 재조합 폴리뉴클레오티드가 그의 게놈 내로 통합되지 않을 수 있다. 일시적으로 형질전환된 세포는 전형적으로 각각의 세포분열시에 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 손실함으로써 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드가 충분한 수의 세포분열 후에 딸세포에서 검출될 수 없도록 한다. 게놈 편집의 이용 또한 고려된다.

바이오리스틱(biolistics), 유전자 총(gun)기술, 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이러스 벡터-매개 형질전환 및 전기천공법을 포함해서, 많은 방법은 본원에서 모두 포괄하는 식물 세포를 형질전환하기 위한 본 기술분야에 이용 가능하다. 외래 DNA를 식물 염색체 내로 통합하기 위한 아그로박테리움 시스템은 식물 유전자 조작을 위해 광범위하게 연구되고, 변형되고 활용되어왔다. 센스 또는 안티센스 배향으로, 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는, 정제된 대상 단백질에 대응하는 DNA 서열을 포함하는 네이키드 재조합 DNA 분자는 통상적인 방법에 의해서 적절한 T-DNA 서열에 연결된다. 이들은 폴리에틸렌 글리콜 기술에 의해서나 전기천공법 기술에 의해서 원형질체 내로 도입되는데, 두 기술 모두 표준이다. 대안적으로, 정제된 대상 단백질을 인코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 이러한 벡터는 살아있는 아그로박테리움 세포 내로 도입되고, 그런 다음 DNA를 식물 세포 내로 전달한다. T-DNA 벡터 서열을 동반하지 않는 네이키드 DNA에 의한 형질전환은 원형질체와 DNA-함유 리포솜의 융합을 통해서나 전기천공법을 통해서 달성될 수 있다. T-DNA 벡터 서열을 동반하지 않은 네이키드 DNA는 불활성의, 고속의 미세투사물을 통해서 세포를 형질전환하는 데에도 사용될 수 있다.

재조합 작제물에 포함될 조절 영역의 선택은 이에만 한정하는 것은 아니지만, 효능, 선택가능성, 유도성, 바람직한 발현레벨, 및 세포- 또는 조직-우선적 발현을 포함하는 여러 요인에 따라 달라진다. 코딩 서열에 대하여 조절 영역을 적절히 선택하고 위치시켜서 HMA 변이체 코딩 서열의 발현을 조절하는 것은 당업자에게 있어 통상적인 과업이다. 폴리뉴클레오티드의 전사는 유사한 방식으로 조절될 수 있다. 일부 적절한 조절 영역은 소정의 세포 유형에서, 전사를 유일하게 또는 우세하게 개시한다. 식물 게놈 DNA에 있는 조절 영역을 식별하고 특징화하기 위한 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 프로모터의 예로는 다른 조직 또는 세포 유형(예를 들어, 뿌리-특이적 프로모터, 순-특이(shoot-specific) 프로모터, 물관-특이(xylem-specific) 프로모터)에 존재하거나, 또는 상이한 발생 단계 동안에 존재하거나, 또는 상이한 환경조건에 반응하여 존재하는 조직-특이적 인자에 의해 인식되는 조직-특이적 프로모터를 포함한다. 프로모터의 예로는 특정한 유도인자(inducer)를 필요로 하지 않고 대부분의 세포 유형에서 활성화될 수 있는 기본구성 프로모터를 포함한다. RNAi 폴리펩티드 생산을 조절하기 위한 프로모터의 예로는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos 또는 유비퀴틴- 또는 파세올린-프로모터를 포함한다. 당업자라면 재조합 프로모터의 다수 변이를 생성하는 것이 가능하다. 식물 프로모터와 더불어, 다른 적절한 프로모터는 세균 기원, 예를 들어, 옥토핀 합성효소 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터 및 (Ti 플라스미드로부터 유래되는) 다른 프로모터로부터 유래될 수 있고, 또는 바이러스 프로모터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 및 19S RNA 프로모터, 담배 모자이크 바이러스의 기본구성 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 19S 및 35S 프로모터, 또는 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터)로부터 유래될 수 있다.

본원에 기술된 HMA의 발현 또는 활성을 감소시키거나 억제하는 것은 다양한 수단에 의해 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 결실, 삽입, 부위 특이적 돌연변이, 징크-핑거 뉴클레아제 등을 포함하여, HMA를 인코딩하는 유전자의 적어도 하나에 하나 이상의 돌연변이를 삽입하는 것 또한 고려된다.

일 양태에서, 적어도 2개의 중금속 ATPases(HMAs)의 적어도 부분적으로 감소된 발현 또는 활성을 갖는 돌연변이체 식물 또는 그의 부분이 제공되고, 상기 2개의 HMA는 다음을 포함하거나, 다음으로 구성되거나, 본질적으로 구성된다: (i) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; (ii) (i)에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 (iii) HMA를 인코딩하는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은, 돌연변이체 식물이 천연 또는 비-천연 발생하는 카드뮴의 존재 하에 경지 재배될 때 잎에서 카드뮴 축적시 대조군 식물에 비해 적어도 27% 감소를 나타낸다.

HMA의 발현 또는 활성은 이를 통해 인코딩된 상기 유전자 또는 단백질의 발현 또는 기능에서의 감소를 야기하는 하나 이상의 돌연변이의 이용을 통해 변조될 수 있다. 본원에 기술된 하나 이상의 돌연변이 외에, 돌연변이체 식물 또는 식물 세포는 하나 이상의 다른 유전자 또는 폴리펩티드에 하나 이상의 추가의 돌연변이를 가질 수 있다. 소정의 구현예들에서, 돌연변이체는 하나 이상의 다른 유전자 또는 폴리펩티드에 하나 이상의 추가의 돌연변이를 가질 수 있다.

다른 양태에서, 경지 재배된 식물의 잎에서 카드뮴의 레벨을 감소시키기 위한 방법이 제공되고, 방법은: (a) 2개의 중금속 ATPase(HMA)의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계로서, 상기 2개의 HMA는: (i) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; (ii) (i)에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 (iii) HMA를 인코딩하는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 본질적으로 구성되고; (b) 경지에서 식물을 재배하는 단계; (c) 선택적으로, 단계 (b)에서 얻어진 식물 내의 카드뮴 함량을 측정하는 단계; 및 (d) HMA의 발현 또는 활성이 감소되지 않은 대조군 식물에 비해 식물 내의 카드뮴 함량이 감소되는 식물을 식별하는 단계로서, 적합하게는, 식물 또는 그의 부분은, 식물이 천연 또는 비-천연 발생 카드뮴의 존재 하에 경지 재배될 때 잎의 카드뮴 축적에 있어서 대조군 식물에 비해 적어도 27% 감소를 나타내고; 적합하게는, 수확 시점에 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 표현형은 동일한 수확 시점에서 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 동일한 수확 시점에 대조군 식물에 비해 수확 시점에서 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는, 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 2개의 HMA의 발현 또는 활성은 본원에 기술된 돌연변이 유발 접근법에 의해, 또는 본원에 기술된 돌연변이체의 이용을 통해 감소된다.

식물의 “수확 시점”은 당업자에게 즉시 명백할 것이다. 환언하면, 당업자는 식물을 수확할 준비가 된 때를 알 것이다. 예로서, 당업자는, 담배 식물을 수확할 때를, 담배 식물의 잎이 여물기 시작하기 때문에 안다. 특정한 다양한 담배에 대해, 이것은 잎이 노랗게 되기 시작한다는 것, 곧 잎이 적절한 큐어링을 위해 알맞고 바람직하다는 것을 의미한다. 또한 녹색에서 갈색으로 또는 녹색에서 노란색으로 그리고 갈색으로 큐어링되는 다양한 담배가 존재한다. 식물은 일단 식물의 부분이 수확할 준비가 되면 전체적으로 또는 부분적으로 수확될 수 있다. 예를 들어, 담배 식물에 대해, 수확 시점은 각 줄기 위치에 대해 한정될 수 있다. 담배 줄기의 바닥 상의 잎은 먼저 색깔(예를 들어, 노란색)이 변하기 시작할 것이고, 수확될 수 있고, 상부 잎은 그런 후에 수확을 위해 나중에 노랗게 될 것이다.또한 하나 이상의 유전적 변경을 포함하지 않는 경지 재배 대조군 식물에 비해 잎에서 카드뮴의 감소된 레벨과 상관되는 경지 재배된 식물에서 하나 이상의 유전적 변이를 식별하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은: (a) 경지에서 재배될 때 경지에서 재배된 대조군 식물에 비해 잎에서 카드뮴의 감소된 레벨을 갖는 식물을 식별하는 단계로서, 선택적으로, 수확 시점에 식물 또는 그의 부분의 표현형은 동일한 수확 시점에서 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 식물 또는 그의 부분은 동일한 수확 시점에 대조군 식물에 비해 수확 시점에 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는, 단계; (b) 단계 (a)에서 식별된 식물로부터 핵산 샘플을 제공하는 단계; 및 (c) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 HMA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 유전적 변경을 단계 (b)로부터의 핵산 샘플에서 식별하는 단계를 포함하는, 방법.

몇몇 구현예에서, 하나 이상의 바람직한 돌연변이는 돌연변이체 식물 개체군의 스크리닝을 통해 식별된다. 일부 구현예에서, 스크리닝 접근법을 통해 식별되는 하나 이상의 바람직한 돌연변이는 상이한 식물 또는 식물 세포에 도입될 수 있고, 도입된 돌연변이는 본 기술분야의 숙련자들에게 공지된 방법들-예컨대 서던 블롯(Southern blot) 분석, DNA 시퀀싱, PCR 분석, 또는 표현형 분석을 이용하여 식별되거나 선택될 수 있다. 유전자 발현에 영향을 주거나 인코딩된 HMA 단백질의 기능을 방해하는 돌연변이는 본 기술분야에 주지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

식물 세포 또는 식물 재료를 포함해서, 관심있는 임의의 식물은 자리-특이적 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오티드-특이적 돌연변이 유발, 화학적-유도 돌연변이 유발, 방사능-유도 돌연변이 유발, 변형된 염기를 이용하는 돌연변이 유발, 간격 이중체 DNA(gapped duplex DNA)를 이용하는 돌연변이 유발, 이중가닥 파괴 돌연변이 유발, 수선-결핍 숙주 균을 이용하는 돌연변이 유발, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발, DNA 셔플링(shuffling) 및 기타 동등한 방법들을 포함해서, 돌연변이 유발을 유도하기 위해서 공지된 다양한 방법에 의해 유전적으로 변형될 수 있다.

돌연변이체 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 돌연변이체 폴리펩티드 변이체를 포함하는 돌연변이체 식물 또는 식물 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 돌연변이체 폴리펩티드 변이체의 HMA 활성은 돌연변이되지 않은 폴리펩티드보다 높거나, 낮거나 또는 거의 동일할 수 있다. 적합하게는, 돌연변이체 폴리펩티드 변이체의 HMA 활성은 본원에 기술된 바와 같이 부분적으로 비활성화(예를 들어, 감소) 또는 손실(예를 들어, 억제 또는 제거)된다.

본원에 기술된 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드에서의 돌연변이는 인공 돌연변이 또는 합성 돌연변이 또는 유전자 조작된 돌연변이를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드에서의 돌연변이는 시험관 내 또는 생체 내 조작 단계를 포함하는 공정을 통해서 수득되거나 또는 수득가능한 돌연변이일 수 있다. 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드에서의 돌연변이는 인간에 의한 개입을 포함하는 공정을 통해서 수득되거나 또는 수득가능한 돌연변이일 수 있다. 예로서, 공정은 예컨대 돌연변이 유발, 기형 발생, 또는 발암성 유기 화합물, 예를 들어 에틸 메탄술포네이트(EMS) 같은 외인성 첨가 화학물질을 사용하는 돌연변이 유발을 포함할 수 있는데, 이것은 유전 물질에서 무작위 돌연변이를 생성한다. 추가적인 예시로서, 공정은 본원에 기술된 하나 이상의 유전자 조작 단계와 같은 하나 이상의 유전자 조작 단계 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 추가적인 실시예에 의해서, 공정은 하나 이상의 식물 교배 단계를 포함할 수 있다.

식물에서 하나 이상의 HMA 폴리펩티드의 활성은, HMA 폴리펩티드 활성이 그 HMA 폴리펩티드의 활성을 감소하거나 억제하도록 변형되지 않았으며 동일한 프로토콜을 사용하여 경작되고 수확된 식물에서 동일한 HMA 폴리펩티드(들)의 활성보다 통계적으로 낮은 경우에 본 개시에 따라 감소되거나 억제된다. 식물에서 HMA 폴리펩티드의 활성은, 본원에 기술된 검정 방법에 의해 검출가능하지 않을 때 제거되는 것으로 간주된다. 돌연변이체 HMA 단백질의 Cd 수송 활성을 분석하기 위해, 효모 기반 검정이 사용될 수 있다. 이러한 검정에서, 전체 길이 서열은 효모 발현 벡터에 클로닝될 수 있고, Cd-민감 ycf1 효모 돌연변이체에서 발현될 수 있다. 로그 상에서의 세포는 상이한 OD₆₀₀에 희석되고, Cd를 함유하는 매질 상에 스포팅된다. 스트레인의 Cd 허용오차는 HMA 돌연변이체 단백질의 수송 활성을 반영한다. 대안으로서, 활성은 HMA 수송 활성을 완전히 소멸시키는 제2 HMA 넌센스 돌연변이와 돌연변이 HMA 서열을 조합할 때 추론될 수 있다. 단백질의 큰 부분을 절단하는 넌센스 돌연변이는 임의의 수송 활성을 보이지 않도록 예측된다. 미스센스 돌연변이에 대해, 효소 활성은 부분적으로 감소되거나 완전히 손실될 수 있다. 넌센스 및 미스센스 돌연변이를 조합하는 이중 돌연변이체에서의 Cd 값이 대조군과 유사할 때, 미스센스 돌연변이가 단백질 활성에 상당한 영향을 미치지 않는다는 것이 추론될 수 있다. Cd 값 및/또는 표현형이 이중 넌센스 돌연변이와 대조군 사이에 있을 때, 미스센스 돌연변이의 부분 활성이 간주될 수 있다. Cd 값과 표현형이 이중 HMA 넌센스 돌연변이체와 유사할 때, 미스센스 돌연변이가 수송 활성을 완전히 폐지하는 것으로 결론을 내릴 수 있다.

돌연변이 유발유전자 서열에서 무작위로 돌연변이를 도입하는 방법은 화학적 돌연변이 유발, EMS 돌연변이 유발 및 방사 돌연변이 유발을 포함할 수 있다. 하나 이상의 표적화된 돌연변이를 세포에 도입하는 방법은 게놈 편집 기술, 특히 아연 핑거 뉴클레아제-매개된 돌연변이 유발(2015, 페톨리노에서 검토됨), 게놈 내 유도된 국부 병변의 표적화 (TILLING; Targeting Induced Local Lesions in Genomes)(2014, Chen 등에서 검토됨), 메가뉴클레아제-매개된 돌연변이 유발(예를 들어, 2011, Arnould 등을 참조), TALEN(2014, Wright 등에서 검토됨) 및 CRISPR/Cas 시스템(2015, Bortesi 및 Fischer에서 검토됨)을 포함하지만, 여기에 제한되지 않는다. 식물에서 게놈/유전자 편집 방법은 예를 들어 Puchta 및 Fauser(2013), Qiwei 및 Caixia, (2015) 및 Chen 및 Gao(2014)에서 검토된다.

위에 기술된 다양한 방법의 조합이 또한 고려된다. 환언하면, 하나의 HMA의 활성 또는 발현은 하나의 특정한 기술을 이용하여 변조될 수 있고, 제2 HMA는 상이한 기술을 이용하여 변조될 수 있다.

돌연변이의 일부 비제한적인 실시예는 적어도 하나의 뉴클레오티드, 단일 뉴클레오티드 다형성 및 간단한 서열 반복의 결실, 삽입, 넌센스 및 미스센스 돌연변이다. 돌연변이 후에, 스크리닝은 조기 종결 코돈 또는 다른 한편으로는 비-기능적인 유전자를 형성하는 돌연변이를 식별하기 위해서 수행될 수 있다. 돌연변이체의 스크리닝은 서열결정에 의해서나, 유전자 또는 단백질에 특이적인 하나 이상의 프로브 또는 프라이머를 사용해서 수행될 수 있다. 조절된 유전자 발현, mRNA의 조절된 안정성, 또는 단백질의 조절된 안정성을 야기할 수 있는, 폴리뉴클레오티드의 특이적인 돌연변이는 또한 형성될 수 있다. 이러한 식물은 "비-천연 발생" 또는 "돌연변이체" 식물로서 본원에서 지칭된다. 돌연변이체 또는 비-천연 발생 식물은 조작되기 이전에 식물에 존재하지 않았던 외래 또는 합성 또는 인공 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 일부분을 포함할 것이다. 외래 핵산은 적어도 10, 20, 30, 40, 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 또는 1500 또는 그 이상의 연속된 또는 비-연속된 뉴클레오티드와 같은, 단일 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 연속된 뉴클레오티드 또는 2개 이상의 비-연속된 뉴클레오티드일 수 있다.

일 구현예에서, 식물의 종자가 돌연변이되고 나서 1세대 돌연변이체 식물로 재배되고, 이것은 그런 후에 좌위에서의 돌연변이에 대해 스크리닝된다. 1세대 식물은 자가-수분되도록 허용될 수 있고, 1세대 식물의 종자는 2세대 식물로 재배될 수 있는데, 그런 다음 이것은 그들의 좌위(loci)에서의 돌연변이를 위해 스크리닝된다. 돌연변이된 식물 재료(종자를 포함)는 돌연변이를 위해서 스크리닝될 수 있지만, 2세대 식물을 스크리닝하는 이점은 모든 체세포 돌연변이가 생식 돌연변이에 해당한다는 것이다. 당업자라면 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 종자, 꽃가루, 식물 조직 또는 식물 세포를 포함해서, 다양한 식물 재료가 돌연변이체 식물을 형성하기 위해 돌연변이되는 것을 이해할 것이다. 그러나 돌연변이된 식물 재료의 유형은 식물 핵산이 돌연변이를 위해 스크리닝될 때 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 비-돌연변이된 식물이 수분되기 전에, 꽃가루가 돌연변이 유발을 거친 경우, 이러한 수분으로부터 발생하는 종자는 1세대 식물로 재배한다. 1세대 식물의 모든 세포는 꽃가루에서 형성되는 돌연변이를 함유할 것이고; 따라서 이러한 1세대 식물은 2세대까지 기다리는 대신에 돌연변이를 위해 스크리닝될 것이다.

화학적 돌연변이원 또는 조사(radiation)를 포함해서, 점 돌연변이, 짧은 결실, 삽입, 전좌, 또는 전이를 생성하는 돌연변이원이 돌연변이를 형성하는 데에 사용될 수 있다. 돌연변이원은 이들에만 한정하는 것은 아니지만, 에틸 메탄술포네이트, 메틸메탄 술포네이트, N-에틸-N-니트로소우레아, 트리에틸멜라민, N-메틸-N-니트로소우레아, 프로카르바진, 클로람부실, 시클로포스파미드, 디에틸 설페이트, 아크릴아미드 모노머, 멜파란, 질소 머스타드(mustard), 빈크리스틴, 디메틸니트로사민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘, 니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린, 7,12 디메틸-벤즈(자)안트라센, 에틸렌 산화물, 헥사메틸포스포아미드, 바이술판, 디에폭시알칸(디에폭시옥탄, 디에폭시부탄, 기타 등등), 2-메톡시-6-클로로-9[[3-에틸-2-클로로-에틸)아미노프로필아미노]아크리딘 디하이드로클로라이드 및 포름알데히드를 포함한다.

원하는 표현형을 유발한다면, 돌연변이원에 의해서 직접적으로 야기되지 않은 좌위에서의 자발적 돌연변이가 또한 고려된다. 또한 적절한 돌연변이 유인제는 예를 들어, X-선, 감마선, 고속 중성자 조사 및 UV 방사와 같은 이온화 방사선을 포함한다. 당업자에게 공지된 식물 핵산 제조의 임의의 방법이 돌연변이 스크리닝을 위한 식물 핵산을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

각각의 식물, 식물 세포 또는 식물 재료로부터 제조되는 핵산은 돌연변이 유발된 식물 조직, 세포 또는 재료에서 기원하는 식물 개체군의 돌연변이를 위한 스크리닝을 신속히 처리하기 위하여 선택적으로 푸울링(pooling)할 수 있다. 하나 이상의 식물, 식물 세포 또는 식물 재료의 후속 세대가 스크리닝될 수 있다. 선택적으로 푸울링된 그룹의 크기는 사용되는 스크리닝 방법의 민감도에 따라 달라진다.

핵산 샘플이 선택적으로 푸울링된 후에, 그들은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 폴리뉴클레오티드-특이적 증폭 기술을 거칠 수 있다. 유전자 또는 유전자에 바로 인접한 서열에 특이적인 임의의 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 선택적으로 푸울링된 핵산 샘플 내에 서열을 증폭시키는 데에 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머의 예가 본원에 기술된다. 적합하게는, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 유용한 돌연변이가 가장 발생하기 쉬운 좌위(locus)의 영역을 증폭시키도록 고안되어 있다. 가장 적합하게는, 프라이머는 폴리뉴클레오티드의 영역 내에서 돌연변이를 검출하도록 설계되어 있다. 추가적으로, 점 돌연변이를 위한 스크리닝을 쉽게 하기 위해서, 프라이머(들) 및 프로브(들)가 공지의 다형성 자리를 피하는 것이 적합하다. 증폭 산물의 검출을 용이하게 하기 위해서, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 임의의 종래의 표지 방법을 이용해서 표지될 수 있다. 프라이머(들) 또는 프로브(들)는 본 기술분야에서 잘 이해되고 있는 방법을 사용해서 본원에서 기술된 서열을 기초로 고안될 수 있다.

증폭 산물의 검출을 용이하게 하기 위해서, 프라이머(들) 또는 프로브(들)가 임의의 종래의 표지 방법을 사용해서 표지될 수 있다. 이들은 본 기술분야에서 잘 이해되고 있는 방법을 사용해서 본원에서 기재되어 있는 서열을 기초로 해서 고안될 수 있다. 다형성은 본 기술분야에 공지된 방법에 의해서 식별될 수 있고 일부가 본 문헌에 기재되어 있다.

추가 양태에서 돌연변이체 식물을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 방법은 본원에서 기술된 기능적인 HMA 폴리펩티드(또는 본원에서 기술된 그의 임의의 조합)를 인코딩하는 유전자를 포함하는 식물의 적어도 하나의 세포를 제공하는 것을 포함한다. 다음에, 식물의 적어도 하나의 세포는 본원에서 기술된 HMA 폴리펩티드(들)의 활성을 조절하기에 효율적인 조건 하에서 처리된다. 그런 다음 적어도 하나의 돌연변이체 식물 세포는 돌연변이체 식물로 번식되며, 여기서 돌연변이체 식물은 대조군 식물의 그것과 비교해서 조절된 레벨의 HMA 폴리펩티드(들)를 가진다. 돌연변이체 식물을 제조하는 이러한 방법의 일 구현예에서, 처리 단계는 적어도 하나의 세포를, 상술한 바와 같고 적어도 하나의 돌연변이체 식물 세포를 수득하기에 효과적인 조건 하에서, 화학적 돌연변이 유발제로 거치게 하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 또 다른 구현예에서, 처리 단계는 하나 이상의 돌연변이체 식물 세포를 수득하기에 효과적인 조건 하에서 하나 이상의 세포를 방사선원을 거치게 하는 것을 포함한다. 용어 "돌연변이체 식물"은, 대조군 식물과 비교할 때 표현형이 변형되는 돌연변이체 식물을 포함한다.

소정의 구현예들에서, 돌연변이체 식물, 돌연변이체 식물 세포 또는 돌연변이체 식물 재료는 또 다른 식물, 식물 세포 또는 식물 재료에서 천연적으로 발생하였으며 원하는 형질을 부여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이는 그 식물에서 비-천연 발생하는 돌연변이를 형성하고 그것에 형질을 부여할 다른 식물, 식물 세포 또는 식물 재료(예를 들어, 돌연변이가 유래되는 식물에 대한 상이한 유전적 배경을 가지는 식물, 식물 세포 또는 식물 재료)에 통합(예를 들어, 침투)될 수 있다. 따라서 실시예에 의해서, 제1 식물에 천연적으로 발생하는 돌연변이는 제1 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가지는 제2 식물과 같은 제2 식물에 도입될 수 있다. 그러므로 숙련자는 원하는 형질을 부여하는 본원에 기술된 유전자의 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 게놈에 천연적으로 보유하는 식물을 검색하고 식별할 수 있다. 천연적으로 발생하는 돌연변이체 대립유전자(들)는 육종, 역교배 및 유전자이입을 포함하는 다양한 방법에 의해서 제2 식물로 전달되어서, 본원에 기술된 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 가지는 계통, 돌연변이체 또는 혼성체를 생성할 수 있다. 원하는 형질을 보여주는 식물은 돌연변이체 식물의 푸울(pool)로부터 스크리닝될 수 있다. 적합하게는, 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열의 지식을 이용하여 선별이 수행된다. 결과적으로 대조군과 비교할 때 유전자 형질을 스크리닝할 수 있다. 이러한 스크리닝 접근은 본원에서 논의된 바와 같은 통상적인 핵산 증폭 및/또는 혼성화 기술의 적용을 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 대조군 식물과 비교하여 감소된 Cd의 레벨을 가지는 돌연변이체 식물을 제조하는 방법을 제공하며, 방법은: (a) 제1 식물로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플이 경지에서 재배된 식물에서 감소된 Cd의 레벨을 초래하는 본원에 기술된 HMA4 폴리펩티드 각각에 동시적인 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 양쪽 돌연변이를 제2 식물로 전달하는 단계를 포함한다. 돌연변이(들)은 유전 공학, 유전자 조작, 유전자이입, 식물 육종, 역교배 및 기타 등등에 의한 것과 같이, 본 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용해서 제2 식물로 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 제2 식물은 제1 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가진다.

또 다른 양태에서, 대조군 식물과 비교하여 감소된 Cd의 레벨을 가지는 돌연변이체 식물을 제조하는 방법을 제공하며, 방법은: (a) 제1 식물로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플이 경지에서 재배된 식물에서 감소된 Cd의 레벨을 초래하는 본원에 기술된 HMA4 폴리펩티드에 이중 돌연변이를 포함하는지 결정하는 단계; 및 (c) 제1 식물로부터의 양쪽 돌연변이를 제2 식물로 유전자이입하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 유전자이입하는 단계는 선택적으로 역교배 및 기타 등등을 포함해서, 식물 육종을 포함한다. 일 구현예에서, 제2 식물은 제1 식물에 대해 상이한 유전적 배경을 가진다. 일 구현예에서, 제1 식물은 재배종 또는 엘리트 재배종이 아니다. 일 구현예에서, 제2 식물은 재배종 또는 엘리트 재배종이다.

추가 양태는 본원에 기술된 방법에 의해서 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 (재배종 또는 엘리트 재배종 돌연변이체 식물을 포함하는) 돌연변이체 식물에 관한 것이다. 소정의 구현예에서, "돌연변이체 식물"은 본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)의 서열 내에서와 같은, 식물의 특정한 영역에만 국소화되는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 이와 같은 구현예에 따르면, 돌연변이체 식물의 남은 게놈의 서열은 돌연변이 유발 전의 식물과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 것이다.

본 개시는 다른 식물에서 증식 가능하고, 변이주를 이용한 육종에 적용 가능할 가능성이 있다.

해당 식물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 단자엽 및 쌍자엽 식물 및 식물 세포계를 포함하고, 이것은 다음의 과들 중 하나로부터의 종을 포함한다: 쥐꼬리망초과, 부추과, 알스트로에메리아세, 수선화과, 협죽도과, 야자과, 국화과, 매자나무과, 빅사세(Bixaceae), 십자화과, 브로멜리아시에, 삼과, 석죽과, 개비자나무과, 명아주과, 콜키카시에(Colchicaceae), 박과, 마과, 마황과, 에리트록실라시에(Erythroxylaceae), 대극과, 콩과, 꿀풀과, 아마과, 석송과, 아욱과, 멜란티움과, 파초과, 도금양과, 니사나무과, 양귀비과, 침엽수, 질경이과, 벼과, 장미과, 꼭두서니과, 버드나무과, 무환자나무과, 가지과, 주목과, 차나무과, 또는 포도과.

적절한 종은 오크라, 침엽수, 관상수, 겨이삭, 파속식물, 알스트로에메리아, 아나나스, 안드로그라피스, 안드로포곤, 향쑥속, 아룬도, 아트로파, 매자나무, 베타(Beta), 빅사(Bixa), 배추속 식물, 금잔화, 동백나무, 캠토테카(Camptotheca), 대마초, 고추, 카르타무스, 일일초, 개비자나무, 국화, 기나나무, 수박, 커피, 콜키쿰, 콜레우스, 오이, 쿠쿠르비타, 우산대바랭이, 흰독말풀, 패랭이속, 디기칼리스, 항염, 오일야자, 마황, 에리언투스(Erianthus), 에리트록실룸(Erythroxylum), 유클리티스, 페스투카(Festuca), 야생딸기, 갈란투스, 글리신, 고시피움, 해바라기, 파라고무, 호르데움, 사리풀잎, 자트로파, 상추종, 아마, 롤리움, 루피너스, 토마토, 석송속, 마니호트, 알팔파, 박하, 억새, 바나나, 니코티아나, 벼, 수수속, 양귀비속, 파르테니움, 페니세튬, 피튜니아, 갈풀, 산조아재비, 소나무, 새포아풀, 포인세티아, 포플러스, 라우월피아, 피마자, 장미, 사탕수수, 버드나무, 혈근초, 스코폴리아, 호밀, 가지속, 수수, 스파르티나, 시금치, 타나세튬, 주목, 테오브로마, 트리티코세케일, 밀, 우니올라(Uniola), 꽃창포과, 빙카속, 리파리아 및 옥수수 속의 일원을 포함할 수 있다.

적절한 종은 수수속 아종, 수수 아종, 억새 아종, 사탕수수 아종, 에리언투스(Erianthus) 아종, 포플러스 아종, 큰파란줄기(나도기름새), 페니세튬 퍼푸레움(부들), 갈풀(리이드 케너리그라스), 우산잔디(버뮤다 그래스), 페스투카 아룬디나세아(넓은 잎김의털), 스파르티나 펙티나타(프레리 코디-잔디), 알팔파 벼종(알팔파), 아룬도 도낵스(물대), 호밀(라이), 버드나무 아종(버드나무), 유칼립투스 아종(유칼립투스), 트리티코세케일(트리틱 밀 타임스 라이), 대나무, 헬리안투스 안누스(해바라기), 카르타무스 홍화(잇꽃), 자트로파 쿠르카스(자트로파), 피마자 코뮤니스(피마자유), 오일야자(야자), 아마(플랙스), 배추속 식물, 사탕무우 (사탕무), 마니호트 자리공(카사야), 리코페르시콘 에스쿨렌텀(토마토), 렉투카 사티바(상추), 무시클리제 알카(바나나), 가지속 감자(감자), 배추속 식물(브로콜리, 꽃양배추, 양배추), 동백나무 차나무(차), 야생딸기 아나나세 (딸기), 테오브로마 카카오(코코아), 커피 아라비카(커피), 리파리아 포도 (포도), 아나나스 코모수스(파인애플), 캅시쿰 안눔(핫 & 스위트 페퍼), 알리움 세파(양파), 쿠쿠미스 멜로(멜론), 오이(오이), 쿠쿠르비타 맥시마(호박), 쿠쿠르비타 (호박), 스피나세아 올레라세아(시금치), 시트룰루스 라나투스(수박), 아벨모스쿠스 에스쿨렌투스(오크라), 솔라넘 멜로지나(가지), 장미 아종(장미), 패랭이속 카요필러스(카네이션), 피튜니아 아종(피튜니아), 포인세티아 풀체리마(포인세티아), 루피너스 알부스(루핀), 우니올라 파니쿨라타(귀리), 벤트그래스(겨이삭 아종), 포플러스 트레물로이드(아스펜), 소나무 아종(소나무), 침엽수 아종(침염수), 관상수 아종(단풍나무), 호르데움 불가레(보리), 모아 프라텐시스(큰새포아풀), 롤리움 아종(라이그래스) 및 큰조아재비(티모시), 수수속 버들명아주(수수속 풀), 수수 싸리나무(수수, 수수류), 마스칸투스 기간투스(억새), 사탕수수 종(사탕수수), 포플러스, 제아 메이즈(옥수수), 글리신 맥스(콩), 배추속 식물 나프스(카놀라), 트리티쿰 애스티븀(밀), 고시피움 허수튬(코튼), 오리자 사티바(쌀), 헬리안투스 안누스(해바라기), 메디카고 사티바(알팔파), 베타 불가리스(사탕무), 또는 페니세튬 글라우쿰(진주 기장)을 포함할 수 있다.

다양한 구현예는 유전자 발현 레벨을 조절하기 위해 변형된 돌연변이체 식물 또는 식물 세포에 관한 것으로, - 그에 따라 HMA 폴리펩티드의 발현 레벨이 대조군과 비교시 관심있는 조직 내에서 조절되는 식물 또는 식물 세포-예컨대 담배 식물 또는 담배 식물 세포-를 생산할 수 있다. 개시된 조성물 및 방법은 N. 루스티카 (N. rustica) 및 N. 타바쿰(N. tabacum)(예를 들어, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 및 Petico)을 포함해서, 니코티아나 (Nicotiana) 속의 임의의 종에 적용될 수 있다. 다른 종은 N. acaulis , N. acuminata, N. africana , N. alata , N. ameghinoi , N. amplexicaulis , N. arentsii, N. attenuata , N. azambujae , N. benavidesii , N. benthamiana , N. bigelovii, N. bonariensis , N. cavicola , N. clevelandii , N. cordifolia , N. corymbosa, N. debneyi , N. excelsior, N. forgetiana , N. fragrans , N. glauca , N. glutinosa , N. goodspeedii , N. gossei , N. hybrid, N. ingulba , N. kawakamii , N. knightiana , N. langsdorffii , N. linearis , N. longiflora , N. maritima , N. megalosiphon, N. miersii , N. noctiflora , N. nudicaulis , N. obtusifolia , N. occidentalis, N. occidentalis subsp . hesperis , N. otophora , N. paniculata , N. pauciflora, N. petunioides , N. plumbaginifolia , N. quadrivalvis , N. raimondii, N. repanda , N. rosulata , N. rosulata subsp . ingulba , N. rotundifolia, N. setchellii , N. simulans , N. solanifolia , N. spegazzinii , N. stocktonii, N. suaveolens , N. sylvestris , N. thyrsiflora , N. tomentosa , N. tomentosiformis, N. trigonophylla , N. umbratica , N. undulata , N. velutina , N. wigandioides, 및 N. x sanderae을 포함한다.

또한 담배 재배종 및 엘리트(elite) 담배 재배종의 용도도 본원에서 고려된다. 따라서 돌연변이체 식물은 하나 이상의 트랜스제닉 유전자, 또는 하나 이상의 유전자 돌연변이 또는 그의 조합을 포함하는, 담배 품종 또는 엘리트 담배 재배종일 수 있다. 개별 담배 품종 또는 담배 재배종(예를 들어, 엘리트 담배 재배종)에서 이 돌연변이가 천연적으로 발생하지 않는다는 가정 하에, 유전자 돌연변이(들)(예를 들어, 하나 이상의 다형성)는 각각의 담배 품종 또는 담배 재배 품종(예를 들어, 엘리트 담배 재배종)에서 천연적으로 존재하지 않는 돌연변이일 수 있거나 또는 천연 발생 유전자 돌연변이(들)일 수 있다.

특히 유용한 니코티아나 타바쿰 품종은 버얼리종(Burley), 다크종(dark type), 열건종(flue-cured), 및 오리엔탈종(Oriental) 담배를 포함한다. 품종 또는 재배종의 비-제한적인 예는 다음과 같다: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, ’Periqe' tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC number 2 Hybrid 49, Burley 21, KY8959, KY9, MD 609, PG01, PG04, PO1, PO2, PO3, RG11, RG 8, VA509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpγo Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. 본원에서 특정하게 식별되지 않는다고 하더라도 상기한 것들의 로우 컨버터 아변종도 또한 고려된다. 일 구현예에서, 버얼리종 니코티아나 타바쿰이 사용된다.

구현예들은 또한 본원에 기술된 HMA 폴리뉴클레오티드(들)(또는 본원에 기술된 그의 임의의 조합)의 발현 또는 활성을 조절하기 위해서 변형된 돌연변이체 식물을 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 유리하게는, 얻어진 돌연변이체 식물은 대조군 식물에 대한 전반적인 외관과 유사하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 성숙도, 식물 당 잎의 수, 줄기 높이, 잎 삽입각, 잎 크기(폭 및 길이), 마디 거리, 및 잎몸-주맥 비율과 같은 다양한 표현형 특성은 경지 관찰에 의해서 평가될 수 있다.

일 양태는 돌연변이체 식물의 종자와 관련된다. 적합하게는, 종자는 담배 종자이다. 추가 양태는 본원에 기재되는 돌연변이체 식물의 꽃가루 또는 밑씨에 관련된다. 또한, 웅성불임성을 부여하는 핵산을 더 포함하는, 본원에 기술된 돌연변이체 식물이 제공된다.

본원에 기술된 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 재분화 가능한 세포의 조직 배양물이 제공되며, 배양물은 부모의 모든 형태학적 및 생리학적 특성을 발현할 수 있는 식물을 재분화한다. 재생가능한 세포는, 이들을 한정하는 것은 아니지만, 잎, 꽃가루, 배아, 자엽, 배축, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃 및 그의 일부, 밑씨, 순, 자루, 줄기 또는 중과피 및 포자낭 또는 그로부터 유래되는 캘러스 또는 원형질체를 포함한다.

또 다른 양태는, 돌연변이체 식물 또는 세포로부터 유래하거나 유래할 수 있는 큐어링되거나 건조된 식물 재료- 예컨대 큐어링되거나 건조된 잎 또는 큐어링되거나 건조된 담배-에 관한 것으로, 본원에 기술된 HMA 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 발현 또는 그에 따라 인코딩된 단백질의 활성이 감소되고 결과적으로 Cd의 감소된 레벨을 초래한다.

또한, 구현예들은, 본원에 기술된 바와 같이 감소된 Cd 레벨을 갖는 식물 또는 식물 성분(예, 잎 - 예컨대, 큐어링된 잎 또는 건조 잎) 또는 식물 세포를 초래할 수 있는 본원에 기술된 HMA 폴리뉴클레오티드 또는 HMA 폴리펩티드 중 하나 이상의 발현 또는 활성을 조절하기 위해 변형된 돌연변이체 식물 또는 식물 세포를 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

적합하게는 본원에 기술된 식물의 시각적 외관은 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 적합하게는, 바이오매스 및 잎 크기는 대조군 식물과 비교하여 실질적으로 변화되지 않는다. 일 구현예에서, 돌연변이체 식물의 잎 중량은 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 일 구현예에서, 돌연변이체 식물의 잎 개수는 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 일 구현예에서, 돌연변이체 식물의 잎 중량 및 잎 개수는 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 일 구현예에서, 돌연변이체 식물의 줄기 높이는 예를 들어, 경지 이식 뒤 한 달, 두 달, 세 달 이상 또는 토핑 뒤 10일, 20일, 30일 또는 36일 이상에서, 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 예를 들어, 돌연변이체 식물의 줄기 높이는 대조군 식물의 줄기 높이보다 작지 않다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이체 식물의 엽록소 함량은 대조군 식물과 실질적으로 동일하다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이체 식물의 줄기 높이는 실질적으로 대조군 식물과 동일하고 그리고 돌연변이체 식물의 엽록소 함량은 실질적으로 대조군 식물과 동일하다. 다른 구현예에서, 돌연변이체 식물의 잎의 크기 또는 형태 또는 수 또는 천연색은 실질적으로 대조군 식물과 동일하다.

대조군과 비교하여 발현의 감소는 약 5% 내지 약 100%, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%의 감소일 수 있으며, 전사 활성 또는 폴리뉴클레오티드 발현 또는 폴리펩티드 발현의 감소 또는 이들의 조합을 포함한다.

대조군과 비교하여 활성의 감소는 약 5% 내지 약 100%, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%의 감소일 수 있다.

본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 및 재조합 작제물은 관심있는 식물 종, 적합하게는 담배에서의 본원에 기술된 NtHMA4의 발현을 조절하기 위해서 사용될 수 있다. 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 및 재조합 작제물은 관심있는 식물 종, 적합하게는 담배에서 본원에 기술된 돌연변이체 NtHMA4 폴리펩티드의 발현에 사용될 수 있다.

소정의 구현예에서, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 잎 표현형 및 성장율은 대조군 식물과 동일하다. 이들 특성을 부여하는 이중 돌연변이의 예는 G251D/Q561*이다.

소정의 구현예에서, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 잎 표현형은 대조군 식물과 동일하고, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 대조군 식물과 비교하여 초기 스테이지에서 지연된 생장을 나타낸다. 초기 스테이지에서의 지연된 성장은 문제가 있는 것으로 간주되지 않는데, 이는 수확 시점에 대조군 식물과 비교하여 바이오매스 차이가 관찰되지 않기 때문이다. 이들 특성을 부여하는 이중 돌연변이체의 예는 T402I/Q561*이다.

소정의 구현예에서, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 잎 표현형은 초기 스테이지에서의 괴사성 병변의 존재를 제외하고는 대조군 식물과 동일하고, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 초기 스테이지에서 대조군 식물과 비교하여 지연된 생장을 나타낸다. 괴사성 병변의 존재는 문제가 되지 않는데, 이는 괴사성 병변이 경지에서 수확 시점에 대부분의 조건 하에서 관찰되지 않기 때문이다. 이들 특성을 부여하는 이중 돌연변이체의 예는 Q293*/Q561* 또는 Q293*/W265* 또는 E296K/Q561* 또는 Q464*/Q561* 또는 Q293*/G235E이다. 적합하게는, 본원에 기술된 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 성장량은 대조군 식물과 비교하여 감소되지 않는다.

적합하게는, 본원에 기술된 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 대조군 식물과 비교하여 왜성 표현형을 나타내지 않는다. 적합하게는, 본원에 기술된 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 대조군 식물 수확 시점과 비교하여 수확 시점에서 왜성 표현형을 나타내지 않는다.

적합하게는, 본원에 기술된 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 대조군과 비교하여 바이오매스(잎 중량) 감소를 보여주지 않는다. 적합하게는, 본원에 기술된 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 대조군과 비교하여 수확 시점에서의 바이오매스(잎 중량) 감소를 보여주지 않는다.

소정의 구현예에서, 돌연변이체 식물은 성장 동안 아연으로 보충될 수 있다.

다양한 구현예는 폴리뉴클레오티드의 다중 사본을 식물 게놈 내로 통합시킴으로써 본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현 레벨을 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로, 방법은: 본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 식물 세포 숙주를 형질전환하는 것을 포함한다. 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해서 인코딩된 폴리펩티드는 고유한 폴리펩티드이거나 세포와 이형일 수 있다.

본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(또는 본원에 기술된 그의 임의의 조합)의 돌연변이체 대립유전자를 보유하는 식물은 유용한 계통, 돌연변이체 및 혼성체를 형성하기 위하여 식물 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 특히, 돌연변이체 대립유전자는 상술한 상업적으로 중요한 돌연변이체로 침투(introgress)된다. 따라서, 본원에 기술된 돌연변이체 식물을 상이한 유전자 동일성을 포함하는 식물과 교배하는 것을 포함하는 식물 육종 방법이 제공된다. 방법은 추가로 바람직한 유전적 형질 또는 유전적 배경을 가지는 자손이 얻어질 때까지 후손 식물을 다른 식물과 교배시키는 단계 및 선택적으로 반복 교배하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 육종 방법에 의해 작용하는 한가지 목적은 바람직한 유전적 형질을 특히 상업적으로 관심이 있는 다른 품종, 육종 계통, 혼성체 또는 재배종에 도입시키기 위한 것이다. 또 다른 목적은 단일 식물 품종, 계통, 혼성체 또는 재배종에서의 상이한 유전자의 유전자 변형의 적층(stacking)을 용이하게 하기 위한 것이다. 종내 교배뿐만 아니라 종간의 교배가 고려된다. 이러한 교배로부터 발생하는 자손 식물은 또한 육종 계통으로도 지칭되며, 이들은 본 발명의 비-천연 발생 식물의 예이다.

일 구현예에서, 비-천연 발생 또는 돌연변이체 식물을 생산하기 위한 방법이 제공되고, 이 방법은: (a) 자손 담배 종자를 얻기 위해서 돌연변이체 식물을 제2 식물과 교배시키는 단계; (b) 비-천연 발생 식물을 얻기 위해서 식물 재배 조건 하에서 자손 종자를 재배시키는 단계를 포함한다. 본 방법은 다음 단계를 더 포함할 수 있다: (c) 자손 종자를 얻기 위해서 비-천연 발생 식물의 이전 세대를 그 자체 또는 또 다른 식물과 교배시키는 단계; (d) 추가적인 비-천연 발생 식물을 얻기 위해서 식물 재배 조건 하에서 단계 (c)의 자손 종자를 재배시키는 단계 및 (e) 비-천연 발생 식물의 추가적인 세대를 얻기 위해서 단계 (c)와 (d)를 여러번 계속 교배시키고 재배시키는 단계. 본 방법은 선택적으로 단계 (a) 이전에 특이적이고 돌연변이체 식물과 동일하지 않은 유전적 동일성을 가지는 부모 식물을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 육종 프로그램에 따라서, 비-천연 발생 식물의 세대를 생성하기 위해 교배 및 재배 단계를 0회 내지 2회, 0회 내지 3회, 0회 내지 4회, 0회 내지 5회, 0회 내지 6회, 0회 내지 7회, 0회 내지 8회, 0회 내지 9회, 또는 0회 내지 10회 반복한다. 역교배는 부모 중 하나와 가까운 유전적 동일성을 가지는 다음 세대에서의 자손 식물을 얻기 위해, 후손이 그의 부모 또는 그의 부모와 유전적으로 동일한 또 다른 식물과 교배되는 방법의 예시이다. 식물 육종, 특히 식물 육종을 위한 기술은 주지되어 있고 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 방법은 이러한 방법에 의해서 생성되는 비-천연 발생 식물을 추가로 제공한다. 소정의 구현예들은 식물을 선별하는 단계를 배제한다.

본원에 기술된 방법의 일부 구현예에서, 육종으로부터 발생하는 계통 및 변이체 유전자를 위한 스크리닝은 표준 실지 절차를 사용해서 실지에서 평가된다. 본래의 돌연변이를 유발하지 않는 부모를 포함하는 대조군 표현형이 포함되고 개체는 무작위의 완전한 블록 설계 또는 다른 적절한 경지 설계로 경지에 배열되어 있다. 담배의 경우, 표준 농경법이 사용되는데 예를 들어 담배가 큐어링 또는 건조 이전과 그 동안의 화학적 및 다른 일반적인 테스트를 위해 수확되고, 계량되고, 샘플링된다. 데이터의 통계학적인 분석을 수행하여 부모 계통에 대한 선택된 계통의 유사성을 확인한다. 선택된 식물의 세포유전학적 분석을 선택적으로 수행하여 염색체 조성 및 염색체 쌍 관계를 확인한다.

DNA 지문분석, 단일 뉴클레오티드 다형성, 마이크로새틀라이트 마커, 또는 유사한 기술은 본원에 기술된 바와 같은, 유전자의 돌연변이체 대립유전자를 다른 식물 내로 전달 또는 육종하기 위해서 마커-보조 선택(MAS) 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 예를 들어, 육종자는 작물학상 바람직한 유전자형을 가진 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 유전자형을 혼성화하여 분리 개체군들을 형성할 수 있다. F2 또는 역교배 세대에서의 식물은 본원에 기재된 기술 중 하나를 이용해서, 게놈 서열 또는 그의 단편으로부터 나타나는 마커를 이용해서 스크리닝될 수 있다. 돌연변이체 대립유전자를 가지는 것으로 확인된 식물은 역교배되거나 자가수분되어서 스크리닝될 제2 개체군을 형성할 수 있다. 예상되는 유전 패턴 또는 사용되는 MAS 기술에 따라, 원하는 개별 식물의 식별을 보조하기 위하여 역교배의 각각의 주기 전에 선택된 식물을 자가수분하는 것이 필요하다. 역교배 또는 다른 육종 절차는 반복친의 원하는 표현형이 복구될 때까지 반복될 수 있다.

육종 프로그램에서, 성공적인 교배는 수정된 F1 식물을 생산한다. 선택된 F1 식물은 부모 중 하나와 교배될 수 있고, 첫번째 역교배 세대 식물은 변이체 유전자 발현(예를 들어, 유전자의 null 버전)을 위한 재검증된 개체군을 생산하기 위해서 자가수분된다. 역교배, 자가수분 및 스크리닝의 과정은 예를 들어, 마지막 스크리닝이 반복친에 생식력이 있고, 합리적으로 유사한 식물을 생산할 때까지 적어도 4번 반복된다. 요망되는 경우, 식물은 자가수분되고 자손은 변이체 유전자 발현을 나타내는 식물을 확인하기 위해서 그 이후에 다시 스크리닝된다. 일부 구현예에서, F2 세대의 식물 개체군은 변이체 유전자 발현을 위해 스크리닝되고, 예를 들어, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드(또는 본원에 기술된 그의 임의의 조합)을 포함하는 뉴클레오티드 서열 정보를 기초로 하여 프라이머를 가지는 PCR 방법을 사용해서, 표준 방법에 따라서 유전자의 부재로 인해, 예를 들면, 식물은 폴리펩티드를 발현하는 것이 실패하는 것으로 확인된다.

혼성체 변종은 첫번째 변종의 교배모수(female parent) 식물(즉, 종자 부모(seed parent))의 자가수분을 방지함으로써, 교배모수 식물을 수정시키는 두번째 돌연변이체의 웅성 부모 식물로부터의 꽃가루를 허용함으로써, 그리고 F1 혼성체 종자를 교배모수 식물에 형성함으로써 제조될 수 있다. 교배모수 식물의 자가수분은 꽃 발생의 초기단계에 꽃을 제거함으로써 억제될 수 있다. 대안적으로, 웅성불임성의 형태를 통해 교배모수 식물의 꽃가루 형성을 방지할 수 있다. 예를 들어, 웅성불임성은 세포질 웅성불임성(CMS) 또는 이식유전자가 소포자 생성 및/또는 꽃가루 형성, 또는 자기 불화합성을 억제하는 트랜스제닉 웅성불임성에 의해 생성될 수 있다. CMS를 함유하는 교배모수 식물은 특히 유용하다. 교배모수 식물이 CMS인 구현예에서, 꽃가루는 웅성가임 식물로부터 수확되고, 교배모수 식물의 암술머리에 수동적으로 적용되고, 얻어진 F1 종자가 수확된다.

본원에 기술된 품종과 계통은 단일 교배 F1 혼성체를 형성하는데 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 부모 변종의 식물은 웅성 부모 식물에서 교배모수 식물로 천연적 교배수분을 촉진시키기 위해 실질적으로 동형인 인접한 단일 개체군으로써 자랄 수 있다. 교배모수 식물에서 형성된 F1 종자는 선별적으로 기존의 방법으로 수확된다. 대량으로 두 부모 식물 품종을 재배할 수 있고, 교배모수에 의해 형성된 F1 혼성체 종자 및 자가수분의 결과로 인한 웅성 부모에 형성된 종자와의 조합을 수확할 수 있다. 대안적으로, 삼원 교혼성체는 단일 교배 F1 혼성체가 교배모수로써 사용되고, 다른 웅성 부모와 교배되는 경우 수행될 수 있다. 다른 대안으로, 이중-교배 혼성체는 두 개의 다른 단일 교배의 F1 자손이 그들 스스로 교배되는 경우 생성된다.

돌연변이체 식물의 개체군은 원하는 형질이나 표현형을 가지는 개체군의 멤버를 위해 스크리닝되거나 선별될 수 있다. 예를 들어, 단일 형질전환 이벤트의 자손의 개체군은 그에 의해서 인코딩되는 폴리펩티드의 원하는 레벨의 발현 또는 활성을 갖는 식물을 위해 스크리닝될 수 있다. 물리적, 생화학적 방법은 발현 또는 활성 레벨을 식별하는 데 사용될 수 있다. 이것은 폴리뉴클레오티드의 검출을 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; RNA 전사체를 검출하기 위한 노던블롯, S1 RNase 보호, 프라이머 신장법 또는 RT-PCR 증폭; 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소 분석법; 및 폴리펩티드를 검출하기 위한 단백질 겔 전기천공법, 웨스턴블롯, 면역침강법, 및 효소-연결 면역분석법을 포함한다. 가시적 분자결합화, 효소 염색, 및 면역 염색법과 같은 다른 기술들은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 발현 또는 활성을 검출하는 데 사용될 수 있다.

하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 작제물, 하나 이상의 이중가닥의 RNA, 하나 이상의 컨쥬게이트 또는 하니 이상의 벡터/발현 벡터를 포함하는 돌연변이체 식물 세포 및 식물이 본원에 기재되어 있다.

제한 없이, 본원에 기술된 돌연변이체 식물은 본 개시에 따라서 발현 또는 활성이 조절되기 전후에 다른 목적을 위해서 변형될 수 있다. 적합하게는, 돌연변이체 식물은 이들 추가 변형에도 불구하고 비-GMO 식물로서 남아있다. 하나 이상의 다음 유전적 변형은 돌연변이체 식물에 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 질소 대사 중간체의 변환에 관여하는 하나 이상의 유전자는 조절되어, 큐어링시, 대조군 식물보다, 적어도 하나의 담배 특이 니트로사민의 레벨이 낮은 식물(예컨대 잎)을 생산한다. 조절될 수 있는 유전자의 비제한적인 예는 니코틴에서 노르니코틴으로의 변환에 참여하는 CYP82E4, CYP82E5 및 CYP82E10과 같은 아스파라긴 합성효소를 인코딩하는 유전자를 포함하고, WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 및 PCT/US2011/021088에 기재되어 있으며 본원에 상세히 기재되어 있는 바와 같다. 또 다른 구현예에서, 중금속 흡수 또는 중금속 수송에 관여하는 하나 이상의 유전자가 조절되어, 변형(들) 없는 대조군 식물 또는 그의 부분보다 낮은 중금속 함유량을 가지는 식물 또는 식물의 부분(잎과 같은)을 생산한다. 비 제한적인 실시예는 다중 약품 저항성 연관 단백질의 패밀리, 양이온 확산 촉진자(CDF)의 패밀리와, Irt와 같은 단백질(ZIP)인 Zrt-의 패밀리와, 양이온 교환체(CAX)의 패밀리와, 구리 수송체(CORT)의 패밀리와, 중금속 P형 ATP 분해효소(예를 들어, WO2009074325에 기술된 HMAs) 패밀리와, 자연적 저항성 관련 대식세포 단백질(NRAMP)의 동족체의 패밀리 및 카드뮴같은 중금속의 수송에 관여하는 ATP 결합(ABC) 수송체(예를 들어, WO2012/028309에 기술된 MRPs)의 패밀리에서의 유전자를 포함하는데, 이것은 Cd와 같은 중금속의 수송에 참여한다. 본원에서 사용되는 중금속이란 용어는 전이 금속을 포함한다. 다른 변형의 예는 제초제 내성을 포함하며, 예를 들면, 글리포세이트는 많은 광범위한 스펙트럼의 제초제의 활성 성분이다. 글리포세이트 저항성 트랜스제닉 식물은 aroA 유전자(살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)및 E.coli로부터의 글리포세이트 EPSP 합성효소)를 전이시킴으로써 개발되었다. 술포닐우레아 저항성 식물은 애기장대의 돌연변이체 ALS(아세토락테이트 합성효소)를 형질전환시킴으로써 생성되었다. 돌연변이체 아마란터스 하이브리더스(Amaranthus hybridus)에서 광계 II 의 OB 단백질은 식물로 형질전환되어 아트라진 저항성 트랜스제닉 식물을 생산하였다; 그리고 브로목시닐 내성 트랜스제닉 식물은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)세균으로부터 bxn 유전자를 삽입함으로써 생산되었다. 또 다른 예시적인 변형에 의하여 곤충에 저항성인 식물이 야기된다. 바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis)(Bt) 독소는, 피라미드식 cry1Ac 및 cry1C Bt 유전자가 각각 단일 단백질에 저항성 있는 배추좀나방을 조절하여 저항성 곤충의 진화를 현저히 지연시키는 브로콜리에서 최근에 예시된 바와 같이, Bt 저항성 해충의 출현을 지연시키는 효과적인 방법을 제공할 수 있다. 또 다른 예시적인 변형은 병원체(예를 들어, 바이러스, 세균, 곰팡이)로 인한 질병에 저항성인 식물을 야기한다. Xa21 유전자(세균성 마름병에 저항성)를 발현하는 식물과 Bt 융합 유전자 및 키티나제 유전자(노란 줄기 나무좀에 저항성 및 다발에 내성) 둘 모두를 발현하는 식물이 조작된 바 있다. 또 다른 예시적인 변형은 웅성불임성과 같은 생식 능력을 바꾸는 결과를 야기한다. 또 다른 예시적인 변형은 비 생물적 스트레스(예를 들면, 가뭄, 온도, 염도)에 내성인 식물을 야기하고, 내성 트랜스제닉 식물은 애기장대로부터 아실 글리세롤 포스페이트 효소가 전이됨으로써 생산된다; 만니톨 및 소르비톨의 합성에 관여하는 만니톨 탈수소효소 및 소르비톨 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 가뭄 저항성을 향상시킨다. 다른 예시적 변형은 저장 단백질과 기름이 증가된 식물, 광합성 효율이 향상된 식물, 저장수명이 늘어난 식물, 탄수화물 함량이 향상된 식물, 및 곰팡이 저항성 식물; 알칼로이드의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 식물을 야기할 수 있다. S-아데노실-L-메티오닌(SAM) 및/또는 시스타티오닌 감마 합성효소(CGS)의 발현이 조절된 트랜스제닉 식물이 또한 고려된다.

하나 이상의 이러한 형질들은 다른 재배종으로부터 돌연변이체 식물 내로 이입되거나 또는 곧바로 형질전환(transform)될 수 있다. 형질(들)을 돌연변이체 식물에 유전자이입하는 것은 계통 육종, 역교배, 이중-반수체 육종 등과 같은 당업계에 공지된 임의의 식물 육종 방법에 의해 달성될 수 있다(Wernsman, E. A, and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp. 참조). 상술한 분자생물학-기반의 기술들, 특히 RFLP 및 마이크로새틀라이트 마커들이 그러한 역교배에서 자손(progeny)들이 반복친(recurrent parent)과 가장 높은 유전적 동일성을 가지는지 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 이는 반복친과 적어도 90%, 적합하게는 적어도 95%, 보다 적합하게는 적어도 99% 유전적 동일성을 가진, 보다 더 적합하게는 반복친과 유전적으로 동일한, 그리고 공여친(donor parent)으로부터 이입된 형질을 추가로 포함하는 품종들의 생산을 가속화하게 해 준다. 그러한 유전적 동일성의 확인은 본 기술분야에 공지된 분자 마커들에 기초할 수 있다.

최종 역교배는 전이되는 핵산(들)의 순수한 육종 자손을 제공하기 위해 자가교배될 수 있다. 도출되는 식물들은 일반적으로 돌연변이체 식물들의 모든 형태학적 및 생리학적 특성들을 전이된 형질(들)에 더하여 본질적으로 가진다(예를 들어, 하나 이상의 단일 유전자 형질들). 정확한 역교배 프로토콜은 변경되는 형질에 의존하여 적절한 시험 프로토콜을 결정할 것이다. 비록 전이되는 형질이 우성 대립유전자일 경우 역교배 방법들이 단순화되지만, 열성 대립유전자 역시 전이될 수 있다. 이 경우에, 원하는 형질이 성공적으로 전이되었는지 여부를 결정하기 위해 자손에 대해 시험을 진행할 필요가 있을 수 있다.

다양한 구현예는, NtHMA4 폴리뉴클레오티드의 발현 레벨이 감소되어 그 안의 Cd 함량을 감소시키는 바이오매스뿐 아니라 돌연변이체 식물을 제공한다.

그러한 식물들의 일부, 특히 담배 식물들, 그리고 더욱 특히 담배 식물들의 잎몸(leaf lamina) 및 주맥(midrib)이 에어로졸 형성 재료들, 에어로졸 형성 장치들, 흡연 물품, 흡연가능한 물품, 무연(smokeless) 제품, 및 담배 제품을 비제한적으로 포함하는 다양한 소모품의 제조에 도입되거나 사용될 수 있다. 에어로졸 형성 재료의 예는 비제한적으로 담배 조성물, 담배, 담배 추출물, 대담배(cut tobacco), 컷 필터(cut filter), 큐어링된 또는 건조된 담배, 팽창 담배(expanded tobacco), 균질화된 담배, 재구성(reconstituted) 담배, 및 파이프 담배를 포함한다. 흡연 물품 및 흡연 가능한 물품은 에어로졸 형성 장치들의 유형이다. 흡연 물품 또는 흡연 가능한 물품의 예는 궐련(cigarette), 엽궐련(cigarillos), 및 시가(cigar)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 무연 제품의 예는 씹는 담배류 및 코담배류를 포함한다. 특정한 에어로졸 형성 장치에서는, 연소(또는 태움) 대신에, 담배 조성물 또는 다른 에어로졸 형성 재료가 예를 들면, 하나 이상의 전기 가열 요소에 의해 가열되어 에어로졸을 생성한다. 통상적으로 가열식 흡연 물품에서는, 에어로졸은 열원으로부터, 열원의 내부, 그 주위 또는 그 하류에 위치할 수 있는, 물리적으로 분리된 에어로졸 형성 기재 또는 물질로의 열 전달에 의해 발생된다. 흡연 동안, 휘발성 화합물이 열원으로부터의 열의 전달에 의해서 에어로졸 형성 기재로부터 방출되고 흡연 물품을 통해 흡인된 공기에 연행된다. 방출된 화합물은 냉각되면서 응축되어 사용자에 의해 흡입되는 에어로졸을 형성한다. 이러한 장치는, 예를 들면, 에어로졸 발생 장치의 하나 이상의 전기 가열 요소로부터 가열식 흡연 물품의 에어로졸 형성 기재로의 열 전달에 의해 에어로졸이 발생되는 전기 가열식 에어로졸 발생 장치를 포함한다.

또 다른 유형의 가열식 에어로졸 형성 장치에서는, 가연성 연료 요소 또는 열원으로부터 물리적으로 분리된 에어로졸 형성 물질(당해 열원의 하류 또는 둘레 내에 위치할 수 있음)로 열이 전달되어 에어로졸이 생성된다. 무연 담배 제품 및 다양한 담배-함유 에어로졸 형성 물질들은 박편, 필름, 타블렛, 거품, 또는 구슬과 같은 임의의 포맷의 다른 성분 상에 증착된, 다른 성분과 혼합된, 다른 성분에 둘러싸인 또는 다른 성분들과 결합된, 건조 입자, 세절, 과립, 분말 또는 슬러리를 비롯한, 임의의 형태의, 담배를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '연기'는 흡연 물품, 예컨대 궐련에 의해서, 또는 에어로졸 형성 물질을 연소하여 생성되는 에어로졸의 유형을 설명하는 데 사용된다.

일 구현예에서, 본원에 기술된 돌연변이체 담배 식물들로부터 큐어링된 식물 재료가 또한 제공될 수 있다. 녹색 담뱃잎들을 큐어링하는 공정들은 음건(air-curing), 화건(fire-curing), 열건(flue-curing) 및 양건(sun-curing)을 비제한적으로 포함하는 본 기술분야에 공지된 기술들이다. 녹색 담뱃잎들을 큐어링하는 공정은 수확된 담배의 종류에 의존한다. 예를 들어, 버얼리(Burley)종 및 특정 다크종은 보통 음건종이며, 파이프 담배, 씹는 담배, 및 코담배는 보통 화건종이다.

본원에 기술된 담배 식물을 포함하는 무연 담배 제품은 소비자의 구강에서의 안락함에 적합한 임의의 형태로 제조될 수 있다. 무연 담배 제품은, 박편, 필름, 탭, 폼(foam), 또는 구슬(bead) 같은 임의의 형식의 다른 성분과 피착되거나, 혼합되거나, 둘러싸이거나 다른 방식으로 조합된 건조 입자, 세절, 과립, 분말, 또는 슬러리를 포함하는, 임의의 형태의 담배를 함유한다. 무연 담배 제품은 식용가능하거나 식용가능하지 않을 수 있는 물질로 래핑될 수 있다. 무연 담배 제품의 액체 내용물은 용성 래퍼와의 상호 작용을 배제하기 위해, 예를 들어 구슬 형태로 봉입될 수 있다. 래퍼는 파우치 형상으로 될 수 있어서, 담배 내장형 조성물을 부분적으로 또는 완전히 봉입하거나, 또는 접착제로서 기능하여 복수의 탭, 구슬, 또는 담배 플레이크를 함께 보유한다. 래퍼는 또한 소비자의 입의 형상에 따르는 몰딩 가능한 담배 조성물을 봉입할 수 있다. 구강으로 붕괴 가능한 래퍼는 무연 담배, 예를 들어, 건조 코담배 또는 가용성 담배를 봉입할 수 있고, 식용 가능한 필름(담배를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는)을 이용하여 연속 열성형 또는 수평 형태/충전/밀봉 기기 또는 다른 적합한 포장 기기 상에 형성될 수 있다. 래퍼를 구성하기 위한 예시적인 재료는 HPMC, CMC, 펙틴, 알긴산염, 풀루란, 및 기타 상업적으로 이용가능한, 식용 필름 형성 고분자를 포함하는 필름 조성물을 포함하고 있다. 구강으로 붕괴할 수 없는 래퍼는 직물 또는 부직포 직물로 구성된 것이거나, 코팅 또는 미-코팅 종이로 구성된 것이거나, 또는 천공되었거나 그렇지 않으면 다공성 플라스틱 필름으로 구성된 것일 수 있다. 래퍼는 향미제 및/또는 착색제를 포함할 수 있다. 무연 제품은 소형 포장재가 수직 형태/충전/밀봉 포장 기계에 의해 형성될 수 있는, 블리스터 포장 및 고정-포장과 같은 방법을 포함하여, 상업 포장의 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 래퍼와 함께 조립될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 돌연변이체 식물로부터 건조된 식물 재료가 또한 제공된다. 잎을 건조시키는 공정은 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람들에 의해 알려지고 제한 없이 음건 및 양건을 포함한다. 잎을 건조시키는 정확한 공정은 수확된 식물의 종에 의존한다. 적합하게는, 식물 재료는 수확한 후에 건조된다. 그러므로, 건조된 재료 및 수확-후 건조된 재료의 사용이 본원에서 고려된다. 건조 공정은 하나 이상의 노쇠 관련 유전자를 활성화시킬 수 있다. 본원에 기술된 유전자 및 단백질의 발현 또는 활성은 큐어링 또는 건조 중에 모니터링될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 돌연변이체 담배 식물로부터 식물 재료- 예컨대 잎, 적합하게는 큐어링되거나 건조된 잎-을 포함하는 담배-함유 에어로졸 형성 물질을 포함하는 담배 제품이 기술된다. 본원에 기술된 담배 제품은 변형되지 않은 담배를 추가로 포함할 수 있는 혼합 담배 제품일 수 있다.

본원에 기술된 경지 재배된 식물, 식물의 부분, 식물 재료, 식물 제품 또는 담배 제품에서의 Cd의 양은 야생형 대응물과 비교하여 적어도 약 33%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상만큼 감소될 수 있다. HMA4가 뿌리에서 순으로의 Cd 전류(流: translocation)에서 작용할 때, HMA4의 활성 또는 발현을 감소시키거나 제거하는 것은 잎에서의 감소된 Cd 축적 및 뿌리에서의 증가된 Cd 축적을 초래할 수 있다.

소정의 구현예에서, 비료의 존재 하에 본원에 기술된 식물을 재배하는 것이 바람직할 수 있다. 일 구현예에서, 비료는 식물이 재배되는 시간 이전 또는 그 동안 경지에 추가되는 Zn을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이러한 보충은 여전히 Cd의 감소된 레벨을 가지면서 식물에서의 Zn 함량을 보완하거나 회복하는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 보충은 여전히 Cd의 감소된 레벨을 가지면서 식물의 표현형을 회복하는데 도움을 줄 수 있다. Zn 추가는 줄기 높이 및/또는 잎 중량을 증가시킬 수 있다.

본원에 기술된 식물의 종자는 본 기술분야에 공지된 수단들에 의하여 조절되고 포장 재료에 포장되어 제조품을 형성할 수 있다. 종이 및 천과 같은 포장 재료들은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 종자의 포장은 라벨, 예를 들어, 내부의 종자의 유형을 기재한 포장 재료에 고정된 태그 또는 라벨, 포장 위에 프린트된 라벨을 가질 수 있다.

식별, 선발, 또는 육종을 위한 식물의 유전자형 검사(genotyping)를 위한 조성물, 방법 및 키트는 폴리뉴클레오티드 샘플 내 폴리뉴클레오티드(또는 본원에 기술된 그의 임의의 조합)의 존재를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드들의 적어도 일부를 특이적으로 증폭하기 위한 하나 이상의 프라이머들과 선택적으로 하나 이상의 프로브들 및 선택적으로 증폭 또는 감지를 수행하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 것으로 기술된다.

일 구현예에서, 본원에서 기술된 돌연변이체 식물로부터의 큐어링되거나 건조된 식물 재료가 또한 제공된다. 예를 들어, 담뱃잎들을 큐어링 또는 건조하는 공정은 당업자에게 알려져 있으며, 비제한적으로 음건, 화건, 열건 및 양건을 포함한다. 녹색 담뱃잎들을 큐어링하는 공정은 본원에서 기술한 수확된 담배의 종류에 의존한다.

또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 돌연변이체 식물 재료 - 예컨대 잎, 적합하게는 큐어링된 식물 재료 - 큐어링되거나 건조된 잎을 포함하는 담배 제품을 포함하거나 또는 본원에 기술된 방법들에 의하여 생산되는 담배 제품이 기재되어 있다. 본원에 기술된 담배 제품은 변형되지 않은 담배를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 돌연변이체 식물의 식물 재료, 적합하게는 잎-예를 들어 큐어링되거나 건조된 잎-을 포함하는 담배 제품이 기재되어 있다. 예를 들어, 식물 재료는 담배 제품의 내부 또는 외부에 추가될 수 있으며 연소에 의하여 희망하는 향이 발산된다. 이와 같은 구현예에 따른 담배 제품은 변형되지 않은 담배 또는 변형된 담배일 수 있다. 이와 같은 구현예에 따른 담배 제품은 본원에 개시된 유전자들 외에 하나 이상의 유전자들에서 돌연변이를 갖는 돌연변이체 식물로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명은 발명을 더 상세히 설명하기 위하여 제공되는 하기 실시예에서 추가적으로 기술된다. 본 발명을 수행하기 위하여 현재 고려되는 바람직한 형태를 제공하는 이들 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하도록 의도된 것이다.

실시예

실시예 1 - 재료 및 방법

HMA4 서열

NtHMA4.1 (단백질 서열: SEQ ID NO:1, Genbank: CCQ77798.1; 뉴클레오티드 서열: SEQ ID NO:3, Genbank: HF675181.1) 및 NtHMA4.2 (단백질 서열: SEQ ID NO:2, Genbank: CCW03243.1; 뉴클레오티드 서열: SEQ ID NO:4, Genbank: HF937054.1)

식물 재료

TN90 (PI 543792, TC 586, USDA -GRIN 데이터베이스), K326 (PI 552505, TC 319, USDA-GRIN 데이터베이스). AA37은 아마도 남미 다크 담배와 미국 버얼리 생식질 사이에서의 교배종이다.

HMA4 RNAi 식물의 생성

HMA4 RNAi 작제물의 작제를 위해, HMA4 .1의 엑손 7의 서열(5’-TGAGAGCAAGTCAGGTCATCCGATGGCAGCCGCTCTGGTGGACTATGCACAATCAAATTCCGTTGAGCCAAAGCCTGATAGAGTTGAGCAGTTTCAAAATTTTCCTGGTGAAGGGATATTTGGAAGAATTGATGGAATGGAAATCTATGTCGGGAATAGGAAAATTTCTTCAAGAGCTGGATGTACCACAG-3’)을 센스 및 안티센스 방향으로 사용하고, 인접 인트론(5’-TAAATGGTTGAATCATTTCTTATGCTCATAGTAGAGATAAAACATCAGA GTTATAATTATAAGTATATGATTTCTCCAGTTAATTTTGCTGTTAGATTTTCTTTGACCTGTTTAGCACTAATGCGGTGGATGTTTGAAT-3’)의 부분을 헤어핀 루프로서 이용하였다. 작제물을 게이트웨이(Gateway) 부위를 사용하여 디자인하고, Geneart(Invitrogen, Life technologies, Regensburg, Germany)에 의해 합성하였다. 그런 후에, 이를, 게이트웨이 기술 및 대응하는 효소(Invitrogen, Life technologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 발현 벡터내로 전달하였다. 아그로박테리움 투메파시엔스를, 발현 벡터를 사용하여 형질전환시켰으며, 이전에 기술된 방법(Horsch 등, 1985)을 이용하는 담배 잎 디스크 형질전환에 사용하였다. T0 1차 형질전환체를 토양에서 재배하고 그들의 뿌리를 HMA4 발현에 대해 분석하였다. 가장 우수한 계통(최저 HMA4 발현)을 식별하고 T1 세대 및 야생형 식물을 한천 배지 상에서 성장시키고, 전체 뿌리를 HMA4 발현에 대해 다시 분석하였다.

EMS 돌연변이주 및 TILLING

돌연변이체 개체군을, 돌연변이 유인제인 에틸 메탄설포네이트(EMS)로 담배 AA37 종자를 처리함으로써 생성시켰다. 약 9’800 M2 세대 EMS-처리된 식물(1050 M1 세대 변이체의 분리 자손을 나타냄)의 DNA 라이브러리를 2개의 HMA4 유전자내의 돌연변이에 대해 스크리닝하였다. 5개의 앰플리콘을 서열분석하고 HMA4.1 및 HMA4.2 내의 돌연변이에 대해 각각 분석하였다. 증폭을 위해 다음의 프라이머 쌍을 사용하였다: HMA4.1-엑손1: 정방향 프라이머 5’-GCATGTTCTTATAAGAGAAACTC-3’, 역방향 프라이머 5’-GTGAATTTATTTAACAAGCCACA-3’; HMA4.1-엑손2: 정방향 프라이머 5’-CCAAAATTGTTTCTGCTTCTCC-3’, 역방향 프라이머 5’-CGTCATATAAATTGGGACAAAAG-3’; HMA4.1-엑손4/5: 정방향 프라이머 5’-GTGTCTTTATTTTCTCACTGATA-3’, 역방향 프라이머 5’-TAGTGACGTGATTCATAAGACAA-3’; HMA4.1-엑손6: 정방향 프라이머 5’-ATCAGTCCTTTCACTTGACCC-3’, 역방향 프라이머 5’- AACCATTAGAGCCATTTCAGAA-3’; HMA4.1-엑손7/8: 정방향 프라이머 5’-GATACTGCAATACAAAAGCACAT-3’, 역방향 프라이머 5’-CACTTACTTGGTAATACGTTCT-3’; HMA4.2-엑손1: 정방향 프라이머 5’-TTGCTACTCTGGGTTGCTAC-3’, 역방향 프라이머 5’-TCAAGTTTAAAGTTTGCTTCTAC-3’; HMA4.2-엑손2: 정방향 프라이머 5’-TGTGCATACATAACGTAAATCG-3’, 역방향 프라이머 5’- ATCAAATACCACATAAGTAGGG-3’; HMA4.2-엑손4/5: 정방향 프라이머 5’- TTTAGTCACTTTGACATAAATGG-3’, 역방향 프라이머 5’- AAGACAGAGAACAAGTTCACAT-3’; HMA4.2-엑손6: 정방향 프라이머 5’- TCAGTCCTTTCGCTTGACCT-3’, 역방향 프라이머 5’- GAGAATGTGGTACTCGCAAG-3’; HMA4.2-엑손7/8: 정방향 프라이머 5’- ATACATTGAGGACACATAATCG-3’, 역방향 프라이머 5’- TATACCCCATTCTGACCCTTG-3’. 증폭 제품을 ABI XL3730(Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, CA, USA) 상에서 생거(Sanger) 방법에 따라 서열분석하였다. 마찬가지로 증폭 프라이머를, HMA4.2-엑손6을 제외하고, 서열분석에 사용하였고, 여기서 네스티드 역방향 프라이머 5’- TTATGAATATATGCTACAAATCAC-3’을 서열분석을 위해 사용하였다. 단백질 기능에 대한 영향을 갖는 돌연변이주를 선택하기 위해, 종결 돌연변이뿐만 아니라 미스센스 돌연변이를 선택하였다.

식물 재배를 위한 온실 조건.

다음의 용액을 수정을 위해 사용하였고, 모든 용액은 Yara Benelux B.V. (Vlaardingen, The Netherlands)로부터 구매하였다: “열건종(Flue cured)”: 다량 원소: 666.5 mg NO3- l-1, 18 mg NH4+ l-1 (총 165.39 mg N l-1), 88.78 mg P2O5 l-1, 306.25 mg K2O l-1, 49.99 mg Mg l-1, 185.61 mg Ca l-1, 369.60 mg SO42- l-1; 미량 원소: 0.839 mg Fe l-1, 0.549 mg Mn l-1, 0.262 mg Zn l-1, 0.216 mg B l-1, 0.048 mg Cu l-1, 0.048 mg Mo l-1. “버얼리종(Burley)”:다량 원소: 850.3 mg NO3- l-1, 18.5 mg NH4+ l-1 (총 207.35 mg N l-1), 91.31 mg P2O5 l-1, 383.65 mg K2O l-1, 49.99 mg Mg l-1, 185.61 mg Ca l-1, 369.60 mg SO42- l-1; 미량 원소: 0.839 mg Fe l-1, 0.549 mg Mn l-1, 0.327 mg Zn l-1, 0.324 mg B l-1, 0.048 mg Cu l-1, 0.048 mg Mo l-1. HMA4 RNAi 계통을 “열건종” 또는 “버얼리종” 중 어느 한 용액으로 2가지 병렬 실험에서 수정시켰다. 용액 내 다양한 질산염 함량은 Cd 레벨 또는 HMA4 표현형에 대해 차별적 영향을 갖지 않았다. (본 연구에 제공된 데이터는 “열건종” 용액”으로 수정된 식물로부터의 데이터임.) AA37 계통을 “버얼리” 용액으로 수정시켰다. Zn 추가를 위해, ZnSO4.H2O(Landor, Birsfelden, Switzerland)의 형태로 0.1g의 Zn을 적용하고, 100 ml H2O로 희석하였다. 모든 식물을 16h:8h 광조건:암조건 사이클로 10L 화분에서 재배하였다.

실지 시험

실지 시험을 스위스(보(Vaud))의 경지에서 수행하였다. 모든 식물을 (농경법에 따라) 부유 트레이에 파종하고, 이식 이전에 온실에서 재배시켰다. 식물을 유전자형 부류로 그룹화하였다. 식물을 경지에서 6회 반복되는 실험 유닛으로 그룹화하였다. 첫 해에, 각 돌연변이 조합에 대해, 동형접합 상태에서 두 돌연변이 모두를 보유한 10개의 식물을 HMA4 .1 내 돌연변이에 대해서만 동형접합인10개의 식물, HMA4.2 내 돌연변이에 대해서만 동형접합인 10개의 식물 및 두 HMA4 유전자 모두에 대해 널(null)-분리개체 식물인 10개의 식물에 인접하여 재배하였다. 이중 넌센스 돌연변이체에 대해, 또한 2개의 다른 유전자형이 포함된다(3개의 복제물에서): HMA4.1에 대해 동형접합 넌센스 돌연변이체이고 HMA4 .2에 대해 이형접합 넌센스 돌연변이체인 10개의 식물 및 HMA4 .2에 대해 동형접합 넌센스 돌연변이체이고 HMA4 .1에 대해 이형접합 넌센스 돌연변이체인 10개의 식물(이들 후자의 그룹은 단지 하나의 기능적 비-돌연변이체 대립유전자를 함유함). 두 번째 해에, 각 돌연변이 조합에 대해, 동형접합 상태에서 두 돌연변이 모두를 보유한 20개의 식물을 두 HMA4 유전자 모두에 대해 널-분리개체 식물인 20개의 식물에 인접하여 재배하였다. 경지는 버얼리 재배를 위해 표준 실무에 따라 비옥화시켰다.

두차례의 실지 시험을, 높은 카드뮴을 함유하는 2곳의 담배 성장 영역 내 2곳의 경지에서 1년에 수행하였다. 각 돌연변이 조합에 대해, 동형접합 상태에서 두 돌연변이 모두를 보유한 20개의 식물을 두 HMA4 유전자 모두에 대한 널-분리개체 식물인 20개의 식물에 인접하여 재배하였다.

qPCR를 이용한 발현 분석

총 RNA를 RNeasy 플랜트 미니 키트(Plant Mini Kit)(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 담배로부터 추출하였다. RNA를 RQ1 RNase-부재 DNase(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 효소분해시키고 올리고 dT17 프라이머, dTNP, RNasin Plus RNase 억제제 및 M-MLV 역전사효소, RNase (H-), 점 돌연변이체 (모두Promega, Madison, WI, USA로부터 구입)를 이용하여 역전사시켰다. qRT-PCR을 Mx3005P 시스템(Stratagene, Agilent, Waldbronn, Germany) 상에서 수행하였다. 증폭 반응을, SYBR 2-단계 QRT 로우 Rox(Thermo Scientific, Surrey, UK)를 이용하여 HMA4.1 정방향 프라이머 (5′-TCATGCAGAAATAAGAAGTGCCAG-3′), HMA4.1 역방향 프라이머 (5′-ATGGATGCTTAGAGAGTCCAGGA-3′) 또는 HMA4.2 정방향 프라이머 (5′-GTTATGCGGAAATAAGAAGTGCCTA-3′) 및 HMA4.2 역방향 프라이머 (5′-CATGGATGCTTAGAGAGTCCAGAC-3′)를 사용하여 수행하였다. 내부 표준으로서, actin9 유전자는 정방향 프라이머(5′-CTATTCTCCGCTTTGGACTTGGCA-3′) 및 역방향 프라이머 (5′-AGGACCTCAGGACAACGGAAACG-3′)와 함께 사용되었다.

DNA 추출 및 식물 유전자형 분석

잎 샘플을 BioSprint 96 DNA 식물 키트(Qiagen, Hilden, Germany)과 함께 BioSprint 96 (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다. 식물 유전자형을 결정하기 위해 DNA 샘플을 TaqMan 반응에서 사용하였다. Taqman을 ABI PRISM 7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, CA, USA) 및 TaqMan 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(Fast Advanced Master Mix) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 다음의 Taqman 프라이머(Microsynth, Balgach, Switzerland) 및 프로브(Applied Biosystems, Life Technologies, Warrington, UK)를 활용하였다: HMA4.1 Q293*: 돌연변이체-프로브 5’-AGGATGGCATAGCT-3’, 야생형 (WT) 프로브 5’-AGGATGGCACAGCT-3’, 정방향 프라이머 5’ CTGGCACTACAAATCTAAATGGTAGTATAGTATTT-3’, 역방향 프라이머 5’-CTGGTGTATAATATTTAGCACACTTGTCG-3’; HMA4.1 E296K: 돌연변이체-프로브 5’-CACAGCTTGTCAAAG-3’, WT probe 5’-CACAGCTTGTCGAAG-3’, 정방향 프라이머 5’-CTGGCACTACAAATCTAAATGGTAGTATAGTATTT-3’, 역방향 프라이머 5’-CTGGTGTATAATATTTAGCACACTTGTCG-3’; HMA4.1 T402I: 돌연변이체-프로브 5’-TTTGACAAAACAGGGATTA-3’, WT 프로브 5’-TTTGACAAAACAGGGACTA-3’, 정방향 프라이머 5’-CCATGTGTTGCGCACTTTCA-3’, 역방향 프라이머 5’-AACTCGGTCACCATAAATTCTCCTT-3’; HMA4.1 G251D: 돌연변이체-프로브 5’-AGAAAACACTGACAGACG-3’, WT 프로브 5’-AAAACACTGACAGGCG-3’, 정방향 프라이머 5’-AAGTCGTAAATGTTGATGAAGTCAAGG-3’, 역방향 프라이머 5’-CAGCCCAGACCGTTGAATCTC3’; HMA4.1 V351M: 돌연변이체-프로브 5’-CTTTGGTCACATTGATGA-3’, WT 프로브 5’-TTGGTCACATTGGTGAGT-3’, 정방향 프라이머 5’-GGCTATATCAGCTTCTTTGGCAATT-3’, 역방향 프라이머 5’-AACACATGGCAACTGGTGTAGATAGA-3’; HMA4.1 G382R: 돌연변이체-프로브 5’-TTCTGTTTAAAAGAGCAGAG-3’, WT 프로브 5’-TCTGTTTAAAGGAGCAGAGTA-3’, 정방향 프라이머 5’-CCATGTGTTGCGCACTTTCA-3’, 역방향 프라이머 5’-AACTCGGTCACCATAAATTCTCCTT-3’; HMA4.2 W265*: 돌연변이체-프로브 5’-ATAGATTCAACGGTCTAGG-3’, WT 프로브 5’-TTCAACGGTCTGGGC-3’, 정방향 프라이머 5’-GGTGAAACTATACCTATTGATGGAGTTGTAA-3’, 역방향 프라이머 5’-CACTAAATAAATGAAGCATGAAGGAATACTAC-3’; HMA4.2 Q561*: 돌연변이체-프로브 5’-CAACCATGTGTAGGAT-3’, WT 프로브 5’-TGCCAACCATGTGCAG-3’, 정방향 프라이머 5’-TTGGTGTAAAAGAAGCAATGAGAGAG-3’, 역방향 프라이머 5’-ATCATTTCAGCGTATTGCAGAATTT-3’.

원소 조성물의 분석

수확 시점에, 성숙한 식물의 중간-하부 줄기 위치를 각 경지 플롯(식물당 1개의 잎)에 대한 합동표본에서 수확하였다. 개별적인 온실 식물로부터, 2개의 중간-하부 줄기 위치 잎(모든 식물에 대해 동일한 잎 위치)을 수확하였다. 수확된 재료를 완전히 건조될 때까지 60°C의 오븐에서 건조하였다.

샘플 분석을 ALS (Prague, Czech Republic)에 의해 수행하였다. 샘플을 분석 이전에 균질화시키고 산 및 과산화수소에 의해 광물화시켰다. Zn 및 Cd를 CZ_SOP_D06_02_002 (US EPA 200.8, CSN EN ISO 17294-2)에 따라 유도성 커플링된 플라즈마를 갖춘 질량 분광기(ICP-MS)에 의해 측정하였다.

생물정보학 분석

돌연변이 내성 점수를 UniProt 로부터 식물 서열의 데이터베이스(2012년 12월 30일에 다운로드됨)에 기초하여 SIFT 소프트웨어(Ng 및 Henikoff, 2003)을 이용하여 도출하였다. RNA-seq 라이브러리를 Illumina TruSeq RNA 샘플 프렙 키트를 이용하여 만들고, Illumina HiSeq-2500 상에서 서열분석하였다. 염기 콜링 및 샘플 디멀티플렉싱을 Illumina HiSeq 컨트롤 소프트웨어 및 CASAVA 파이프라인 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 판독치를 Tophat2 소프트웨어 (Kim 등 2013; 버전 2.0.11)를 이용하여 이전에 공개된 게놈(Sierro 등, 2014)으로 매핑하였다. 차별적 유전자 발현을 Cuffdiff(Trapnell 등, 2013, 버전 2.2.1)을 이용하여 계산하였다.

통계

분석 값이 LOQ 미만인 경우, LOQ 값을 계산 및 그래픽 표시에 대해 고려하였다. 유의성의 평가를 위해, 2-측면 T-검정을, 분산의 이질에 대해 Satterthwaite 보정을 이용하여 수행하였다. 경지 실험을 대해, 비율에 대한 대응표본 t-검정을 돌연변이체 플롯 및 그의 대응하는 대조군 플롯에 대해 수행하였다. 미가공 p-값을, 측정 불확실성(20%) 미만의 유의미한 Cd/Zn 감소를 결정하기 위해 우연히 평균 (돌연변이체) < 0.8 * 평균(대조군)일 확률에 대해 계산하였다.

실시예 2 - A. 탈리아나 HMA2 /3/4 수송체의 오소로고의 식별 및 NtHMA4 발현 분석

애기장대 수송체 HMA2, HMA3 및 HMA4는 밀접하게 관련된다. HMA2 및 HMA4가 Zn 및 Cd 뿌리에서 순으로의 전류와 연관되어 있는 반면(Wong 및 Cobbett, 2009), HMA3은 Zn, Cd, Co 및 Pb의 뿌리 공포(vacuolar) 저장에 의한 Cd 축적과 연관되어 있다(Gravot 등, 2004; Morel 등, 2009). 애기장대 서열에 기초하여, 담배 게놈을 추정 AtHMA2/3/4 오소로그에 대해 스크니링하였고, HMA4의 두 동족체, (N. 실베스트리스 및 N. 토멘토시포르미스 각각으로부터 유전된) HMA4 .1 및 HMA4 .2는 N.타바쿰에서 발견된다.

HMA4 .1 및 HMA4 .2의 발현 패턴을 2종의 주요 담배 재배종, TN90 및 K326에서 조사하였다. 열건 담배 유형(K326)은 버얼리 유형(TN90) 담배에 비해 질소가 덜 풍부한 비옥화를 필요로 한다(Lewis 등, 2012). 수정 실무에서의 이들 차이는 또한 Cd 함량이 열건종 담배에 비해 버얼리종 담배에서 더 높은 것으로 발견된 이유를 설명한다(Lugon-Moulin 등, 2006). NtHMA4 .1 및 NtHMA4 .2의 발현 패턴을 경지에서 재배된 TN90 및 K326 담배 식물의 상이한 조직에서 분석하였다. 이들 2종의 재배종에서, 두 유전자 모두는 특히 뿌리 및 꽃 조직에서 발현되나 또한 모든 다른 조직에서는 더 작은 정도인 것으로 밝혀졌다(도 1). 이 패턴은 애기장대에 대해Hussain 등(2004) 및 담배에 대해Hermand 등(2014)에 의해 보고된 GUS-발현 데이터에 따른다.

실시예 3 - 잎 Cd 축적 및 표현형에 대한 NtHMA4 침묵의 영향

Cd를 감소시키기 위한 표적으로서의 NtHMA4 담배 유전자의 잠재성을 평가하기 위해, RNAi 작제물을 두NtHMA4 동족체 모두에 대해 디자인하였다. DNA 단편을 구성적 MMV 프로포터의 제어 하에 바이너리 벡터 내로 클로닝하고(Dey 및 Maiti, 1999), 2개의 전술한 재배종 TN90 및 K326으로 형질전환시켰다. 각 담배 유형에 대해, 두 HMA4 동족체 모두의 감소된 발현에 기초하여 RNAi 계통을 선택하였다(도 2). 계통당 5개의 식물 및 그들 각각의 형질전환되지 않은 대조군을, Zn 보충물이 존재하거나 부재하는 토양에서 재배하였다.

각 계통의 대표 식물을 도 3a에 도시하였다. 그들 각각의 Cd 및 Zn의 함량을 도 3b 및 도 3c에 도시하였다. TN90 및 K326 HMA4 RNAi 계통 모두는 두 재배종 모두에서 대조군 식물(>0.55 ppm Cd)에 비해 Cd가 매우 낮았다(약 LOQ=0.05 ppm). Cd에서의 이러한 10배 초과의 감소뿐만 아니라, 약 4배의 Zn 감소가 관찰되었다. 식물 바이오매스(줄기 높이 및 잎 중량)에 대해, K326 HMA4 RNAi 계통은 매우 잘 수행되어 대조군 식물보다 유의미하게 작지는 않았으며, 심지어 잎은 약간 더 무거웠다(도 3d, 도 3e). 잎 형상은 단지 약간 상이한데, 트랜스제닉 잎은 더 두꺼운 잎맥을 가진 더 둥근 형상이다(도 3a). 대조적으로, TN90 HMA4 RNAi 계통은 왜소 성장을 보이고 잎에 괴사성 패치가 나타났다(도 3a, 도 3d). 잎은 TN90 WT 대조군에 비해 더 두꺼웠다(도 3f). 생중량 및 건중량 측정에 기초하여, 이들 식물은 증가된 수분 함량을 나타냈다(도 3g). 본 실험을 고 질산염 수정 하에서 반복하였으나, 질소 공급은 Cd 레벨과 표현형에 영향을 미치지 않았다(데이터 미도시). 결론적으로, 이들 결과는 두 담배 재배종 모두에서 두 HMA4 동족체 모두를 침묵시키는 것이 잎 Cd를 10배 초과로, Zn을 약 4배 감소시킨다는 것을 입증한다. 그러나, 두 품종에서 유사한 Cd/Zn 감소에도 불구하고, 표현형 효과는 K326과 TN90 사이에서 매우 달랐으며, K326이 더 잘 수행되었다.

흥미롭게도, HMA4 RNAi 식물을 Zn으로 처리하면 식물 Zn 함량이 거의 대조군 레벨으로 보충되고 TN90에서 정상 (버얼리) 식물 표현형을 복원하는 동시에 감소된 Cd 레벨을 여전히 유지하는 것으로 관찰되었다(도 3a 내지 도 3c, 사선 바). Zn 첨가는 TN90 RNAi 계통의 줄기 높이와 잎 중량을 증가시키고 TN90 및 K326 HMA4 RNAi 식물 둘 모두에서 수분 함량과 잎 두께를 감소시킨다(도 3d 내지 도 3g, 사선 바). 이는 Zn이 90% 초과의 감소된 Cd 함량을 유지하면서, HMA4 RNAi를 보완하고 WT 표현형을 회복복원하여, 할 수 있음을 보여준다.

실시예 4 - 경지에서의 Cd 감소는 NtHMA4 돌연변이의 조합을 요구한다

담배 육종을 위해, 재배종 AA37의 EMS 개체군을 HMA4 내의 돌연변이에 대해 스크리닝하였다. AA37은 남미의 다크 담배와 미국 버얼리 생식질 사이의 교배에서 유래된 재배종이므로, K326보다는 TN90와 더욱 밀접하게 관련되어 있다(Fricano 등, 2012). 비교가능한 발현 프로파일은 HMA4 둘 모두(도 1 및 도 2)가 뿌리로부터 순까지의 Zn 및 Cd 전류와 연관되어 있음을 시사한다. 그러므로, 촉매적으로 중요한 도메인에 대한 엑손 코딩을 HMA4 카피 둘 모두에서 점 돌연변이에 대해 스크리닝하였다. NtHMA4 . 1및 NtHMA4 .2에서 식별된 모든 아미노산 치환을 SIFT 프로그램을 사용하여 단백질 기능에 미칠 수 있는 영향에 대해 분석하였다(Ng 및 Henikoff, 2003). 작은 SIFT 점수(<0.05)는 아미노산 잔기가 기능 레벨에서 허용되지 않을 가능성이 있음을 암시한다. NtHMA4 .1과 NtHMA4 .2에서, 0.05 미만의 SIFT 점수 비를 갖는 각 동족체 내 2개의 넌센스 돌연변이 및각 동족체 내 15개의 미스센스 돌연변이를 포함하여, 36 및 33 개의 돌연변이를 식별하였다(표 10). SIFT 점수를 돌연변이의 선택을 용이하게 하는 도구로서 사용하였다.

두 HMA4 동형 모두에서의 돌연변이를 교배에 의해 조합시켰다. 그러한 교배는 적어도 하나의 넌센스 돌연변이와, 넌센스 돌연변이 또는 SIFT 예측된 미스센스 돌연변이 중 하나인 제2 돌연변이를 포함한다. 각 온실 및 실지 시험 이전에, 분리한 자손(offspring)을 부유 트레이에서 재배하고, Taqman을 사용하여 유전자형 분석하고 토양 이식 이전에 개별 부류로 그룹화하였다.

온실 실험에서, 6가지 조합의 돌연변이를 시험하였다. 그들 각각에 대해, 두 개의 동형접합 돌연변이를 보유한 8개 식물을, HMA4 .1에서 단지 하나의 돌연변이에 대해 동형접합인 8개 식물, HMA4 .2의 돌연변이에 대해서만 동형접합인 8개 식물, 및 두 HMA4 유전자 모두에 대해 8개의 널-분리개체 식물과 함께 재배하였다. 이중 넌센스 돌연변이에 대해, 또한 두개의 다른 유전형이 포함된다: HMA4 .1에 대한 동형접합 넌센스 돌연변이이고 HMA4 .2에 대한 이형접합 넌센스 돌연변이인 8개 식물 및 HMA4 .2에 대한 동형접합 넌센스 돌연변이이고 HMA4 .1에 대한 이형접합 넌센스 돌연변이인 8개의 식물(이들 후자의 그룹은 하나의 기능적인 비-돌연변이체 대립유전자만을 함유함). 토양 (a)에서 5주 및 11주 재배 후, 더 낮은 줄기 위치의 잎을 생중량 결정 (b) 및 Cd, Zn 분석을 위해 수확하였다(도 4c, 도 4d).

단순 넌센스 돌연변이체 및 하나의 기능적 HMA4 대립유전자를 가진 넌센스 돌연변이체와 달리, 이중 넌센스 돌연변이체 HMA4 .1 Q293*/HMA4 .2 Q561*는 HMA4 RNAi 식물에 대해 관찰된 감소와 유사한 Cd 감소를 보였다. 토양에서 5주간 재배한 후, 동형접합 이중 넌센스 돌연변이체는 대조군 식물에서의 0.6 ppm에서 대략 정량 한계 레벨(LOQ = 0.05 ppm)까지의 Cd 감소를 보여준 반면, Zn 함량은 1/3만큼만 감소하였다(도 4c, 도 4d). 11주 후의 CD 분석은, 추가로 식물 성장한 온실 식물이 증가하는 바이오매스에서 Cd를 희석시켰음을 보여준다. 평균 대조군 레벨은 약 0.3ppm Cd인 한편, 분석된 두 개의 이중 돌연변이주는 정량 한계 미만의 Cd 레벨을 보여준다(도 4c). 흥미롭게도, 단일 넌센스 돌연변이체 및 단지 하나의 기능성 HMA4 대립유전자를 보유한 돌연변이체 식물은 중간 Zn 함량을 보여주면서, 대조군 Cd 레벨을 나타냈다. 이들 Zn 레벨은 정상적인 성장에 충분할 것으로 보이고, 이는 대조군에 비해 이들 식물에서 성장 차이가 관찰되지 않기 때문이다. 동형접합 이중 넌센스 돌연변이체는 다른 한편으로는 5주 재배 후 잎 중량의 50% 감소를 보였다. 그러나, 11주 후에, 돌연변이체 식물은 대조군과 동일한 크기에 도달하였고(도 4a, 도 4b), 오직 개화가 약간 지연되었다.

5주 재배 후 조사된 다른 돌연변이체 조합 중, 2가지 다른 조합(E296K/Q561* 및 T402I/Q561*)은 대조군 Zn 함량의 1/3만을 포함하면서 이중 넌센스 돌연변이체와 유사한 Cd 감소를 보였다(도 5a, 도 5b). 이들 두 계통은 마찬가지로 지연된 성장을 보였다: 초기 단계에서 T402I/Q561*은 약 25% 잎 중량 감소를 보여주었고, E296K/Q561*은 50% 감소된 잎 중량을 보여주었다(도 5c). 6주를 더 재배한 후에, 대조군과 이중 돌연변이체 사이에는 잎 크기와 높이에 더 이상의 어떠한 유의미한 차이가 없었다. 그러나, 이중 돌연변이주에서, 꽃 형성이 약간 지연되었다. 두 가지 다른 돌연변이 조합(G382R/Q561* 및 G251D/Q561*)은 유의미한 Cd 감소를 보이지 않았다. 모든 Cd 및 Zn 데이터는 표 8에 요약되어 있다. 표 8의 대조군 그룹에 대해, 모든 개별 대조군 식물의 값을 함께 그룹화하였다.

전체적으로, 이들 실험은 HMA4 유전자 둘 모두가 Cd 레벨을 현저히 감소시키는 데 적어도 부분적으로 영향을 미치는 데 필요함을 보여준다.

실시예 5 - 중간 Cd 조건 하에서 2회의 실지 시험에서 Cd 감소의 검증

온실 데이터를 확인하기 위해 중간 카드뮴 조건 하에서 2회의 경지 실험을 수행하였다. 첫 번째 실험에서, 동일한 유전자형 그룹(단일 돌연변이체, 이중 돌연변이체 및 대조군 식물)을 6개의 복제 플롯으로 재배하였다. 각 복제 유닛은 각각 이중 돌연변이체의 10개 식물, HMA4 WT 대조군 및 2개의 단순 돌연변이를 포함한다. 이중 넌센스 돌연변이체에 대해, 하나의 기능성 비-돌연변이체 대립유전자를 포함하는 두 개의 다른 유전자형이 포함된다(HMA4 .1에 대해 동형접합 넌센스 돌연변이체/HMA4.2에 대해 이형접합 넌센스 돌연변이체 및 HMA4 .1에 대해 이형접합 넌센스 돌연변이체/HMA4 .2에 대해 동형접합 넌센스 돌연변이체). 식물은 스위스의 경지에서 14주 동안 재배하였다. 식물 표현형을 조사하고, 중간-줄기 위치에서의 잎을 수확, 건조 및 Cd/Zn 분석을 받도록 하였다. P-값을 대조군에 비해 돌연변이체에서 Cd의 관찰된 감소가 20% 초과만큼 우연히 이루어질 확률에 대해 계산하였다.

세계적으로, 경지과 온실 데이터는 대응한다. 단일 돌연변이체가 대조군에 비해 어떠한 Cd 감소를 보이지 않은 반면(표 2), 온실(T402I/Q561*; E296K/Q561*; Q293*/Q561*)의 Cd가 낮은 동일한 이중 돌연변이주뿐 아니라 추가의 이중 넌센스 돌연변이체(Q293*/W265*)는, 평균 이중 돌연변이체 값이 적어도 20% 감소되는 확률(p<0.05)(최대 p-값 = 0.0054)을 갖는 경지 조건 하에서 마찬가지로 10배 초과로 감소된 Cd 함량을 나타냈다(표 4). 이들 4가지 계통 외에도, 계통 G251D/Q561*은 30%의 Cd 감소를 나타내지만, 이 계통에서 Cd 함량은 20% 초과로 현저히 감소하지는 않았다(p-값 = 0.1029). Zn 함량이 온실에서 약 70%까지 감소한 반면, 경지에서 재배된 낮은 Cd 계통(T402I/Q561*, E296K/Q561*, Q293*/Q561*, Q293*/W265*)은 최대 약 50%의 Zn 감소만을 보였다(표 4). 첫 번째 실지 시험에서, 잎 중량은 계통 E296K/Q561*에서 감소한 반면, 3개의 다른 낮은 Cd 계통(T402I/Q561*, Q293*/Q561*, Q293*/W265*)에서, 잎 중량은 현저하게 영향을 받지는 않았다(도 6b). 식물 및 잎 형태학은 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, 계통 E296K/Q561*, Q293*/Q561* 및 Q293*/W265*에 대해, 특히 초기 재배 단계에서 하부 잎 상에 괴사성 스폿이 관찰되었다. 이중 돌연변이체(T402I/Q561* 및 G251D/Q561*)는 가장 우수한 표현형을 보이며 어느 시기에도 괴사성 병변을 보이지 않았다. 이들 두 계통은 그들의 대조군과 거의 구별할 수 없었다.

두 번째 실지 시험에서, 동일한 돌연변이 조합을 경지에서 추가 조합(총 18개)과 함께 재배하였다. 이 때 하나의 실험 유닛은 20개의 동형접합 HMA4 이중 돌연변이체 식물과 20개의 HMA4 WT 대조군 식물을 포함한다. 단일 돌연변이체는 다시 분석하지 않았다. Cd/Zn 데이터는 표 5에 도시되어 있고; Cd 데이터와 표현형 데이터에 대한 그래프는 도 7에 도시되어 있다. 첫 번째 실지 시험에서 Cd 감소를 보인 동일한 계통은, 이 때 심지어 70%의 Cd 감소를 보인 계통 G251D/Q561*을 제외하고, 필적할 만한 Cd 감소를 다시 보여주었다. 이들 계통 이외에, 하나 이상의 이중 넌센스 돌연변이를 분석하였고(Q464*/Q561*), 예상대로 94%의 매우 강력한 Cd 감소를 보여주었다. 마찬가지로, 새로운 돌연변이 조합 Q293*/G235E는 94%의 CD 감소를 보였다. 돌연변이 조합 Q293*/L223F 및 Q293*/D234N은 중간 Cd 감소(각각 37% 및 27%)를 나타냈다. 계통 Q293*/Q561*, Q293*/W265*, Q464*/Q561*, Q293*/G235E, E296K/Q561*, T402I/Q561*, G251D/Q561* 및 Q293*/L223F는 20%를 초과하는 현저한 Cd 감소를 보였다(p <0.05; 최대 p-값 = 0.0007). 계통 Q293*/D234N은 27% Cd 감소를 보였지만, 감소는 p <0.05인 경우 20%보다 크지 않았다. 분석된 다른 모든 이중 돌연변이체는 20% 미만의 Cd 감소만을 보였으며 따라서 더 발육시키기에는 흥미롭지 않았다. 돌연변이 조합 Q293*/Q561* 및 Q293*/W265*, Q464*/Q561*, Q293*/G235E 및 E296K/Q561*은 초기 단계에서 잎에 괴사성 스폿이 나타났고 감소된 성장율을 보였다. 그러나, 수확 시점에, 이들 이중 돌연변이체와 그의 대조군 사이에 명확한 차이점은 보이지 않았다. 경지에서 대부분의 돌연변이주의 잎 건중량은 그의 대조군 식물과 유사하였다(도 7b). 그러나, 일부 경우에, 잎 건중량은 Cd 감소와 상관없이 대조군과 약간 달랐다.

실시예 6 - 높은 Cd 조건 하에서 2회의 실지 시험에서 Cd 감소의 검증

2회의 소규모 실지 시험에서, 5개의 유망한 낮은 Cd 돌연변이 조합(이중 넌센스 돌연변이 조합 Q293*/Q561*뿐만 아니라 조합 Q293*/G235E, E296K/Q561*, T402I/Q561* 및 G251D/Q561*)뿐만 아니라 그들의 각 대조군은 높은 Cd 함량으로 공지진 두 영역에서 재배하였다. Cd/Zn 데이터는 표 6에 도시되어 있고; Cd 및 표현형 데이터에 대한 그래프는 도 8에 도시되어 있다. 대조군 식물은 약 3ppm의 Cd를 축적하는 반면, Cd 함량은 각각 제1 영역(경지 3) 및 제2 영역(경지 4)에서 돌연변이 조합 Q293*/Q561*, Q293*/G235E, E296K/Q561* 및 T402I/Q561*에 대해 ≥80% 및 ≥90%까지 감소했다. 조합 G251D/Q561*에 대해, Cd 감소는 두 경지 장소 모두에서 약 45%이었다. 모든 계통에 대해, 평균이 20% 미만인 확률은 유의미했다(p　<　0.05, 최대 p-값 = 0.0068). 잎 중량에 대한 어떤 영향도 관찰되지 않았다(도 8b).

전체적으로, 경지 데이터는 농경지 조건 하에서, 심지어 다른 지역에서, HMA4 돌연변이 조합은 Cd 함량을 5 배에서 10배까지 감소시키는 잠재성이 있음을 보여준다. 식물 발육과 수율은 재배종 AA37의 후기 단계에서 영향을 받지 않는 것으로 보인다.

실시예 7 - NtHMA4는 뿌리에서 순으로의 Cd 전류를 위한 핵심 효소이다

본원에 기재된 HMA4 RNAi 계통뿐 아니라 HMA4 이중 넌센스 돌연변이체에서, 잎 Cd는 10배 초과까지 감소될 수 있으며, 이는 담배에서의 Cd 뿌리에서 순으로의 전달이 본질적으로 HMA4에 의존한다는 것을 나타낸다. 두 HMA4 유전자 모두의 돌연변이는 낮은 Cd 담배를 육종하는 데 필요하다. 온실과 경지 조건 둘 모두에서, HMA4 이중 넌센스 돌연변이체는 90% Cd 감소를 나타낸다. 시험된 모든 Cd 조건 하에서, HMA4 유전자 중 단지 하나에서의 넌센스 돌연변이는 담배 식물에서 Cd 함량을 감소시킬 수 없다.

흥미롭게도, 극히 높은 비-천연 발생 Cd 조건 하에서, NtHMA4 유전자 중 하나에서 단 하나의 넌센스 돌연변이를 보유한 식물에서 Cd의 50% 감소가 관찰되었다(Hermand, 2014). 이것은 높은 Cd 한천 배지에서 AtHMA4의 녹아웃이 순의 Cd 함량을 50% 초과까지 감소시키는 반면, 이들 두 수송체 유전자 모두의 동시 녹아웃이 훨씬 더 큰 감소를 초래하는 경우 애기장대에서 관찰된 것에 대응한다(Wong 및 Cobbett, 2009). NtHMA4 .1과 NtHMA4 .2에 대한 본 발명자들의 연구는, 인공 시스템으로부터의 결과가 식물 육종에 대한 돌연변이의 영향을 평가하기 위해 토양 및 경지 조건 하에서 확인될 필요가 있음을 입증한다.

많은 작물 종과 마찬가지로, 다양한 담배 재배종이 존재한다. 그들은 예를 들어, 수정 요건 및 아미노산 및 당의 축적에서 큰 차이가 난다(Lewis 등, 2012). 분석된 세 재배종에서, TN90, K326 및 AA37, HMA4 붕괴는 필적할 만한 효과, 즉 이들 품종 모두에서 90% 초과까지의 Cd 감소가 달성됨을 보여준다. 그러나, Cd 및 Zn 감소에서 보여진 필적할 만한 효과에도 불구하고, 식물 성능은 매우 다르다. K326은 HMA4의 결여에 의해 단지 약간 영향을 받아, 둥근 잎 형상 및 일정한 바이오매스와 식물 크기를 갖는 증가된 잎맥을 보여주고, TN90은 왜소 성장과 괴사성 병변을 강하게 보여준 반면, TN90과 같은 전형적인 버얼리 식물이 아닌 AA37은 단지 작은 효과를 나타낸다. 이것은 Zn 항상성에 관한 담배 재배종 간의 대사 차이를 분명히 보여준다. 토양에 Zn을 공급하면 다른 수송체가 HMA4를 보완할 수 있고 더 낮은 레벨이긴 하지만 Zn 흡수를 매개할 수 있음을 나타내는 표현형을 복원할 수 있다.

실시예 8 - 영향을 받지 않는 표현형과 조합된 낮은 Cd는 두 NtHMA4 동족체 모두의 미세 조절을 필요로 한다

HMA4 이중 녹아웃의 표현형 효과를 최소화하기 위해, 제2 돌연변이를 HMA4 유전자 중 하나에서 식별하였다. 목표는, 다양한 선택에서 이 조합을 육종할 때, Cd를 현저히 감소시키지만 식물의 표현형에 영향을 주지 않기에 충분하도록 하는 것이다. AA37 EMS 돌연변이체 배경에서 효과는 특히 초기 재배 단계에서 볼 수 있지만, 성장 및 바이오매스에 대한 명확한 영향을 후기 단계에서는 관찰할 수 없었다. 그러나, 다양한 관심과 특히 버얼리 품종에 따른 HMA4 RNAi 계통의 데이터(도 3)에 따르면, 성장에 부정적인 영향이 발생할 수도 있다.

이하에, 추가 식물 육종에 특히 유용한 것으로 고려되는 돌연변이 조합이 기재된다. 이중 HMA4 녹아웃 돌연변이체(Q293*/Q561*, Q293*/W265*, Q464*/Q561*) 이외에, 추가 조합을 필적할 만한 Cd 감소(80 내지 90%)로 식별하였다:

이중 돌연변이체 E296K/Q561* 및 Q293*/G235E가 초기 단계에서 이중 녹아웃 돌연변이체와 유사한 표현형(괴사성 병변, 감소된 성장)을 나타내지만, T402I/Q561* 돌연변이체 식물은 더 우수한 성장을 보이며, 초기 단계에서 잎 상에 괴사성 패치가 나타나지 않았다. 조합 G251D/Q561*은 30 내지 70%의 Cd 감소 및 대조군과 구별할 수 없는 표현형을 제공한다. 두 개의 추가 돌연변이 조합(Q293*/L223F와 Q293*/D234N)은 단지 낮은 Cd 감소만을 보여주었다(1회의 실지 시험에서 각각 37%와 27%).

두 번째 온실 실험은, 조합 H438Y/W265*이 58% Cd 감소를 보였으며 표현형에 영향을 미치지 않는 추가적인 돌연변이 조합으로 수행되었다(표 9).

상기 기재된 돌연변이 조합은 Cd 및 Zn 함량을 투여하고 각 재배종에 대해 최적의 돌연변이 조합을 찾을 수 있는 가능성을 제공한다. 트랜스제닉 계통에 도시된 바와 같이 HMA4의 결여에 의해 더 많이 영향을 받는 버얼리와 같은 재배종에 대해(도 3), 중간 용액을 사용할 필요가 있을 수도 있다(예를 들어, G251D/Q561*, H438Y/W265*, Q293*/L223F, 또는 Q293*/D234).

다음에서, 돌연변이의 국재화를 조사했다(도 9). 중금속 ATPase는 촉매 기능에 중요한 세가지 도메인을 포함한다: 인산화(P), 뉴클레오티드 결합(N) 및 액츄에이터 (A) 도메인. P-도메인은 제3 세포질 루프의 N- 및 C-말단 부분으로 구성된다. 루프의 중간 부분은 N-도메인이다. DKTGT 모티프는 P-도메인에서 발견된다. 이 모티프의 아스파르테이트 잔기는 촉매 동안 활성 효소에서 인산화될 것으로 예측된다. A-도메인에서, 촉매적으로 활성인 TGE(S) 루프는 구조로부터 돌출하여, ATP-결합 도메인에서 인산화된 부위와 상호 작용한다(Banci 등, 2009).

Cd 섭취에 영향을 주는 5개의 기능적 돌연변이는, TGES 모티프에 국재되어 있는 G251*을 갖는 수송체(L223F, D234N, G235E, G251D, E296K)의 A (액츄에이터)-도메인에서 발견된다. 다른 HMA 수송체로부터, A-도메인에서 발생하는 돌연변이가 도메인의 폴딩을 불안정하게 하거나 효소의 다른 도메인과의 상호 작용에 영향을 미친다는 것이 공지되었다(Banci 등, 2009). T402I 돌연변이는 단백질의 제3 세포질 루프에서 P (인산화)-도메인인 DKTGT 모티프에서 발견된다. H438Y 돌연변이는 뉴클레오티드 배위를 손상시킴으로써 작용할 수 있는 단백질의 제3 세포질 루프에서 N(뉴클레오티드 결합)-도메인의 HP 모티프에서 발견된다.

결론적으로, 두 돌연변이가 Cd 전류를 억제하는 데 필요하며, 그 중 하나는 완전 녹아웃이고, 두 번째 넌센스 또는 미스센스 돌연변이는 A-도메인에서, P-도메인의 DKTGT 모티프에서 또는 제2 HMA4 카피에서의 N-도메인의 HP 좌위에 위치되어 있을 가능성이 있다.

전체적으로, 본 작업은 HMA4 돌연변이와 그의 조합이 Cd 함량과 표현형에 미치는 영향을 측정하기 위한 적절한 시스템을 식별할 필요성을 강조한다. 본 작업은 모든 관심 재배종에 대해 표현형 변경없이 낮은 Cd 담배를 수득하기 위해 미세-조절 HMA4 뿌리-순 전류 시스템의 중요성을 보여준다.

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본원에 인용되거나 기술된 간행물은 본 출원의 출원일에 앞서 개시된 관련 정보를 제공한다. 본원에서 언급된 것은, 발명자가 이와 같은 개시보다 선행하하도록 명명하지 않는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않는다. 상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로 인용된다. 본 발명의 다양한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 및 사상에서 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구현예와 관련하여 설명되었지만, 청구범위에 기술된 발명은 이와 같은 특정 구현예에 부당하게 한정되지 않아야 한다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 세포, 분자 및 식물 생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 것을 포함하는, 본원 발명을 실시하기 위하여 기술된 모드들의 다양한 변형들이 이하의 청구범위에 포함된다.

서열

SEQ ID NO:1

니코티아나 타바쿰의 아미노산 서열 중금속ATPase (NtHMA4.1) GenBank 기탁 번호: CCQ77798.

1 MVESEKMNET KKLSKSYFDV LGICCTSEVV LVEKILKNLE GVKEVSVIVT TKTVIVIHDS

61 LLISPQQIVK ALNQARLEAS IRVKGEKNYQ KKWPSPFAIG SGILLGLSFL KYFFAPFQWL

121 ALAAVAVGIP PIIFRGVAAV RNLTLDINIL VLIAVAGSIV LHDYWEAGTI VFLFAIAEWL

181 ESRASHKATA AMSSLVNIVP PTAVLAESGE VVNVDEVKVN SILAVKAGET IPIDGVVVEG

241 ECDVDEKTLT GESFPVSKQR DSTVWAGTTN LNGYISVKTT ALAEDCAVAR MAQLVEDAQN

301 KKSKTQRYID KCAKYYTPAI VAISASLAIV PTALRVHNRN EWYRLALVTL VSACPCALVL

361 STPVAMCCAL SKAATSGLLF KGAEYLETLA KIKIMAFDKT GTITKGEFMV TEFKSLIDGF

421 SLNTLLYWVS SIESKSGHPM AAALVDYAQS NSVEPKPDRV EQFQNFPGEG IFGRIDGMEI

481 YVGNRKISSR AGCTTVPEIE GDSFKGKSVG YIFLGSSPAG IFSLSDVCRI GVKEAMRELK

541 QMGIKTAMLT GDCYAAANHV QDQLGGALDE FQAELLPEDK ATIIKGFQKE APTAMIGDGL

601 NDAPALATAD IGISMGISGS ALAKETGHVI LMTNDIGRIP KAARLARRVR RKIVENMIIS

661 VVTKAAIVAL AIAGYPLVWA AVLADTGTCL LVILNSMLLL RGGTRRHGKK CWRSSTPSHA

721 PHHKDKASCC KSENAPQLCC SDIESQKKCT SQSCSSEVCV PRCQPVSSGS KSCGNNQCPD

781 SIENSGFHSH RRPQCCSSKM AAKACQSAVS ESKSCGNNQC PDSVENSGFH SHPRPECCSS

841 KMAAKACQSA VSESKSCGNN QCPDSVENSG FHSHPRPQCC SSKMAAKAGQ SALSESKSCG

901 NNNCSDSIHK SNCHSLTNSL VCSSKMSAPQ CHSATSSNKS CGSTKCSDFS DKKCCQSDKI

961 PQTCSTKKSA PGCQSAVSGS KSCGNSKCSD SKDNSSHPSH PDHQTCMSKL CAPQSQSATS

1021 SSRTCGNTKC SDTNSKNSCY SQTNSESCSS KMSGPSCKTA NSGSRSCRNK KCQDSATENS

1081 FHSPLTNPLS GEKLSEQKSL DLVRKDKESS HDLRHGCSDE EHDHTNLDKA YDSCALQECC

1141 YSVQGNKTDV SETGIQETAH CDSTNQTCQT ASSGSMTCGN DKILDSLSIH GCHSHDNPLH

1201 EENNLEQKIL DVVGEGIKSP HAVGHGCSDK EHDHSHPEKA YDSCATDDCC FSVQVHGIDD

1261 VSKSEIQETA HCDSTKQSMV ISSSCKHEPK DQVNHCGLHS KTTPTDEELA KLVRRCCKYK

1321 PCHDVRSGCR KHAAECGPTV RSTINILRDN HHHYLDCSGR KVCSLLEKRH IGGCCDSFRK

1381 ECCAKKKHLG ASFGGGLSEI VIE

SEQ ID NO:2

니코티아나 타바쿰의 아미노산 서열 중금속 ATPase (NtHMA4.2) GenBank 기탁 번호: CCW03243.1.

1 MVESEKMNDT KNLSKSYFDV LGICCTSEVV LVEKILKNLE GVKEVSVIVT TKTVIVIHDS

61 LLISQQQIVK ALNQARLEAS IRVKGEKNYQ KKWPSPFAIG SGILLGLSFL KYFFAPFQWL

121 ALAAVAVGIP PIIFRGVAAV RNLTLDINIL VLIAVTGSIV LHDYWEAGTI VFLFTIAEWL

181 ESRASHKATA AMSSLVNIVP PTAVLAESGE VVNVDEVKLN SILAVKAGET IPIDGVVMEG

241 ECDVDEKTLT GESFPVSKQI DSTVWAGTTN LNGYISVKTT ALAEDCAVAR MAQLVEDAQN

301 KKSKTQRYID KCAKYYTPAI VAISASLAIV PTALRVHNRN EWYRLALVTL VSACPCALVL

361 STPVAMCCAL SKAATSGLLF KGAEYLETLA KIKIMAFDKT GTITRGEFMV TEFKSLVDGL

421 GLNTLLYWVS SIESKSGHPM AAALVDYAQS NSVEPKPDRV EQFQNFPGEG IFGRIDGMEI

481 YVGNRKISSR AGCTTVPEIE GDSFQGKSVG YIFLGSSPAG IFGLSDVCRI GVKEAMRELK

541 QMGIKTAMLT GDCYAAANHV QDQLGGAMDE FQAELLPEDK ATIIKGFQKE APTAMIGDGL

601 NDAPALATAD IGISMGISGS ALAKETGHVI LMTNDIGRIP KAARLARRVR RKIVENMIIS

661 VVTKAAIVAL AIAGYPLVWA AVLADTGTCL LVILNSMLLL RVGTHRHGKK CCRSATPSHA

721 PNHKDKASCC KSENAPQLCC SDIESQKKCT SQSCSSEVCV PRCQPVSSGS KSCGNNQCPD

781 SVENSGFHSH PRPQCCSSKM ASKACQSAVS ESKSCGNNQC PDSVENSGFH SHPRPQCCSS

841 KMASKACQSA VSESKSCGNN QCPDSVENSG FHSHPRPQCC SLKMASKACQ SAVSESKSCG

901 NNQCPDSVEN SGFHSHPRPQ CCSSKMAAKA CQSAVSESKS CGNNNCSESI YKSSCHSLTS

961 SLVCSSKMSA PQCHSATSSS KSCGSTKCSN FSDKKCCQYD KIPQTCSTKK SAPGCQSAVS

1021 GSKSCGDSKC SDSKDNSSHP SHPDHQICTS KLCAPQSQSA TSSSRTCGNM KCSDTNSKNS

1081 CYSHTNSESC SSKMSGPACK TANSGSRLCG NKKCLDSANE NSFHSLTNPL CEEKLLEKES

1141 LDLARKDRES NHDLSHGCSD EEHDHLNLDK AHDSCALQEC CYSVQGNKTD VSETGIQEAA

1201 HCDSINQTCQ TAISGSMTCG NNKSLDSLSI HGCHSHDSPL HKESNLEQKS LDVAGEGIKS

1261 PHAVGQGCSD KEHNHSHPEK AYDSCATDDC CFSVQVHGID DVSRSEIQET AHCDSTKQST

1321 VIPSSCEHEP KDQVNHCGSH SKSIPTDEEL AKLVRRCCKY KPCHDVRSGC RKHAAECGPT

1381 VRSTINILRD NHHHHLDCSG RKVCSLLEKR HIGGCCDSFR KECCAKNNHL GASFGGGLSE

1441 IVIE

SEQ ID NO:3

니코티아나 타바쿰의 폴리뉴클레오티드 서열 중금속 ATPase (NtHMA4 .1) GenBank 기탁 번호: HF675181.1.

1 agagaaggag aaaaatggtg gaaagtgaaa aaatgaatga aacaaagaag ttgagcaaga

61 gctattttga tgttttggga atttgctgta cttcagaagt tgttctagtt gaaaaaattc

121 tcaagaatct tgaaggggtt aaagaggttt cagtaattgt cacaacaaag actgtcattg

181 ttattcatga ttctcttctc atttctccgc aacaaattgt taaagcattg aatcaagcaa

241 gattagaagc aagcataaga gtgaaaggag agaaaaacta ccaaaagaaa tggccaagtc

301 catttgcaat tggcagtgga atattgcttg gactctcatt tttgaagtac ttttttgcac

361 ctttccaatg gttagcactt gcagctgttg cagttgggat tcctccaatt atttttagag

421 gtgtggctgc cgtgcgaaac ctcactcttg acatcaacat tcttgtttta atagcagtgg

481 ctggatcaat tgttttacac gattattggg aagctggtac tattgtcttc ttattcgcca

541 ttgcagaatg gctagagtca agggcaagtc acaaggctac cgctgctatg tcatcactgg

601 tcaatatagt ccctccaaca gcagttttag ctgaaagcgg agaagtcgta aatgttgatg

661 aagtcaaggt gaatagcatt cttgctgtga aagctggtga aactatacct attgatggag

721 ttgtagtgga aggggaatgt gacgtggacg agaaaacact gacaggcgag tcgtttccag

781 tttctaagca aagagattca acggtctggg ctggcactac aaatctaaat ggctatatca

841 gtgttaagac tacggctttg gctgaagatt gtgcggtggc taggatggca cagcttgtcg

901 aagatgctca gaacaagaaa tcaaaaaccc aaagatacat cgacaagtgt gctaaatatt

961 atacaccagc aattgtggct atatcagctt ctttggcaat tgttcctact gcattaagag

1021 ttcacaatcg aaatgaatgg tatcgcttgg ctttggtcac attggtgagt gcatgtccgt

1081 gtgcacttgt tctatctaca ccagttgcca tgtgttgcgc actttcaaaa gcagcaacgt

1141 ccggtcttct gtttaaagga gcagagtacc ttgagactct agctaaaatc aaaatcatgg

1201 cttttgacaa aacagggact ataactaaag gagaatttat ggtgaccgag ttcaagtctc

1261 tgattgatgg ttttagtctc aatacactgc tttactgggt ttcaagcatt gagagcaagt

1321 caggtcatcc gatggcagcc gctctggtgg actatgcaca atcaaattcc gttgagccaa

1381 agcctgatag agttgagcag tttcaaaatt ttcctggtga agggatattt ggaagaattg

1441 atggaatgga aatctatgtc gggaatagga aaatttcttc aagagctgga tgtaccacag

1501 taccagaaat agagggtgat agtttcaaag gaaagtctgt tggatacata tttttgggat

1561 catctccagc tggaattttc agtctttccg atgtttgtcg aattggtgta aaagaagcaa

1621 tgagagaact gaagcagatg ggtatcaaaa ccgcgatgct tactggtgat tgttatgcag

1681 ctgccaacca tgtgcaggat cagttaggtg gagctttgga tgaatttcaa gcagaactcc

1741 taccagagga caaggcaaca atcatcaagg gttttcagaa ggaagctcca acagcgatga

1801 taggcgacgg ccttaatgat gctcctgcat tagcaacagc tgacattggc atctcaatgg

1861 gcatctctgg gtcagctctc gctaaagaaa caggccatgt tatactaatg acaaatgaca

1921 tcggaagaat accgaaagct gcacgtcttg ctagaagagt tcgaaggaag attgttgaga

1981 atatgattat atcagtcgtt acaaaggctg ccatagttgc attggcaata gcaggttatc

2041 cattggtttg ggctgctgtc ctcgcagata ctgggacatg cttgctagtg attttgaaca

2101 gcatgctact tctacgagga ggcacacgca gacatgggaa aaaatgttgg agatcttcta

2161 ctccttcgca tgctccccac cacaaagaca aagcttcatg ttgcaagtcg gaaaatgctc

2221 cccagctgtg ttgctctgat attgagtcac aaaagaaatg tacaagtcaa tcatgctcgt

2281 ccgaggtgtg tgttccaaga tgtcaacctg tctcctcagg atcaaagtca tgtggaaata

2341 atcagtgccc agactccatt gaaaatagtg gttttcattc tcatcgccgt cctcaatgct

2401 gctcgtcgaa gatggctgct aaagcatgcc aatctgcagt ttcagaatca aagtcatgcg

2461 gaaataatca gtgcccagac tccgttgaaa atagtggttt tcattctcat ccccgtcctg

2521 aatgctgctc gtcgaagatg gctgctaaag cgtgccaatc tgcagtttca gaatcaaagt

2581 catgtggaaa taatcagtgc ccagactccg ttgaaaatag tggttttcat tctcatcccc

2641 gtcctcaatg ctgttcatcg aagatggctg ctaaagcagg ccaatctgca ctttcagaat

2701 caaagtcatg tggaaataac aattgctcag actccattca caagagtaat tgtcattctt

2761 taactaactc tctagtatgt tcttccaaga tgtctgctcc acaatgtcat tctgctactt

2821 caagcaacaa atcatgtgga agtaccaagt gctccgactt cagtgacaaa aaatgttgtc

2881 aatccgacaa aattcctcaa acgtgctcta ccaagaagtc tgctccagga tgtcaatctg

2941 cagtttctgg gtctaaatca tgtggaaata gcaagtgttc agactcaaaa gacaatagta

3001 gccatccttc acatcccgat catcaaacat gcatgtctaa gttgtgtgct ccacaaagcc

3061 aatctgcaac ttcaagctcc aggacatgtg gaaatacaaa gtgctcggac accaatagca

3121 agaattcttg ttattcacaa accaactctg aatcatgctc ttcaaagatg tctggtccat

3181 catgcaaaac tgctaattca ggttcaaggt catgcagaaa taagaagtgc caggactctg

3241 caaccgagaa cagttttcat tcaccactta ctaatccact cagtggggaa aagctttcgg

3301 agcagaaaag cttggattta gtccgaaaag ataaggaatc aagtcatgat cttcgtcatg

3361 gctgctctga cgaggaacat gatcatacaa atttagacaa ggcatatgac agttgtgcct

3421 tacaagaatg ttgttattcg gttcaaggca ataaaactga tgtatcagaa actggaatcc

3481 aggaaactgc tcattgtgac agcaccaatc aaacatgcca aactgcaagt tcaggatcga

3541 tgacatgcgg aaatgataag atcctggact ctctaagcat ccatggttgt cattcgcatg

3601 ataatccact ccacgaggag aacaacttgg agcagaaaat cttggatgtt gttggagaag

3661 gtataaaatc acctcatgct gtcggtcatg gctgttcgga caaggaacac gatcactcac

3721 atccagaaaa ggcatatgac agttgtgcaa cagatgattg ttgtttttca gttcaagtcc

3781 atggcattga cgacgtatca aaaagtgaaa ttcaagaaac tgctcattgt gacagcacaa

3841 agcagagcat ggtcatctcc agcagctgca aacatgaacc aaaagatcag gtaaatcact

3901 gtggacttca ctctaaaact actccaactg atgaagaact agccaagctg gttagaagat

3961 gctgcaaata caaaccatgc cacgacgtcc gttctggctg caggaagcat gctgcagaat

4021 gtggtccaac cgttcgatca accatcaata tcttacggga caaccatcat cattacctag

4081 actgcagtgg tcgtaaggtt tgttcgctgt tggagaagag acacatcggt ggatgctgtg

4141 acagcttcag aaaagaatgt tgtgccaaga aaaaacacct tggagcaagt tttggaggag

4201 gtttatcaga aattgtcata gagtagatgc aatccgaagt gtacat

SEQ ID NO:4

니코티아나 타바쿰의 폴리뉴클레오티드 서열 중금속 ATPase (NtHMA4 .2) GenBank 기탁 번호: HF937054.1.

1 atagaaagaa gagaatggtg gaaagtgaga aaatgaatga cacaaagaat ctgagcaaga

61 gctattttga tgttttggga atttgctgta cttcagaagt tgttcttgtt gaaaaaattc

121 tcaagaatct tgaaggggtt aaagaggttt cagtaattgt cacaacaaag actgtcattg

181 ttattcatga ttctctcctc atttctcagc aacaaattgt taaagcattg aatcaagcaa

241 gattagaagc aagtataaga gtgaaaggag agaaaaacta ccaaaagaaa tggccaagtc

301 catttgcaat tggcagtgga atattgcttg gactctcatt tttgaagtac ttttttgcac

361 ctttccaatg gttagcactt gcagctgttg cagttgggat tcctccaatt atttttaggg

421 gtgtggctgc cgtgcgaaac ctcactcttg acatcaacat tcttgtttta atagcagtga

481 cgggatcaat tgttttacac gattattggg aagctggtac tattgtcttc ttattcacca

541 ttgcagaatg gctagagtca agggcaagtc acaaggctac tgctgctatg tcatcactgg

601 tcaatatagt ccctccaaca gcagttttag ctgaaagtgg agaagtcgta aatgttgatg

661 aagtcaagtt gaatagcatt cttgctgtta aagctggtga aactatacct attgatggag

721 ttgtaatgga aggggaatgt gacgtggacg agaaaacact gacaggcgag tcgtttccag

781 tttctaagca aatagattca acggtctggg ctggcactac aaatctaaat ggctatatca

841 gtgttaagac tacggctttg gctgaagatt gtgcggtggc taggatggcg cagcttgtcg

901 aagatgctca gaacaagaaa tcaaaaaccc aaagatacat tgacaagtgt gctaaatatt

961 atacaccagc aattgtggct atatcagctt ctttggcaat agttcctact gcattaagag

1021 ttcacaatcg aaatgagtgg tatcgcttgg ctttggtcac gttggtgagt gcatgtccgt

1081 gtgcacttgt gctatctaca ccagttgcca tgtgttgtgc actttctaaa gcagcaacgt

1141 ccggtcttct gtttaaagga gcagagtacc ttgagactct tgctaaaatc aaaatcatgg

1201 cttttgacaa aacagggact ataactagag gagaatttat ggtgaccgag ttcaagtctc

1261 tggttgatgg tcttggtctc aatacactgc tttactgggt ttcaagtatt gagagcaagt

1321 caggtcatcc gatggcagcc gctctggttg actatgcaca atcaaattcc gttgagccaa

1381 agcctgatag agttgagcag tttcaaaatt ttcctggtga agggatattt ggaagaattg

1441 atggaatgga aatctatgtc gggaatagga aaatttcttc aagagctgga tgtactacag

1501 taccagaaat agagggtgat agtttccaag gaaagtctgt tggatacata tttttgggat

1561 catctcccgc tggaattttc ggtctttccg atgtttgtcg aattggtgta aaagaagcaa

1621 tgagagagct gaagcagatg ggtatcaaaa ccgcgatgct tactggtgat tgttatgcag

1681 ctgccaacca tgtgcaggat cagttaggtg gagctatgga tgaatttcaa gcggaactct

1741 taccagagga caaggcaaca atcatcaagg gttttcagaa ggaagctcca acagcgatga

1801 taggcgacgg ccttaatgat gctcctgcat tagcaacagc tgacattggc atctcaatgg

1861 gcatctctgg gtcagctctc gcgaaagaaa caggccatgt tatactaatg acaaatgaca

1921 tcggaagaat accaaaagct gcacgtcttg ctagaagagt tcgaaggaag attgttgaga

1981 atatgattat atcagtcgtt acaaaggccg ccatagttgc attggcaata gcaggttatc

2041 cattggtttg ggctgctgtc ctcgcggata ctgggacatg cttgctagtg atcttgaaca

2101 gcatgctact tctacgagta ggcacacaca gacatgggaa aaaatgttgt agatctgcta

2161 ctccttcgca tgctcccaac cacaaagaca aagcttcttg ttgcaagtcg gaaaatgctc

2221 cgcagctgtg ttgctctgat attgagtcac aaaagaaatg tacgagtcaa tcatgctcgt

2281 ccgaggtgtg tgttccaaga tgtcaacctg tctcctcggg atcaaagtca tgtggaaata

2341 atcagtgccc agactccgtt gaaaatagtg gttttcattc tcatccccgt cctcaatgct

2401 gctcgtcgaa gatggcttct aaagcatgcc aatctgcagt ttcagaatca aagtcatgtg

2461 gaaataatca gtgcccagac tccgttgaaa atagtggttt tcattctcat ccccgccctc

2521 aatgctgctc gtctaagatg gcttctaaag catgccaatc tgcagtttca gaatcaaagt

2581 catgtggaaa taatcagtgc ccagactccg ttgaaaatag tggttttcat tctcatcccc

2641 gtcctcaatg ctgctcgttg aagatggctt ctaaagcatg ccaatctgca gtttcagaat

2701 caaagtcatg tggaaataat cagtgcccag actccgttga aaatagtggt tttcattctc

2761 atccccgtcc tcaatgctgc tcgtcgaaga tggctgctaa agcatgccaa tctgcagttt

2821 cagaatcaaa gtcatgtgga aataacaatt gctcggagtc catttacaag agtagttgtc

2881 attctttaac aagttctcta gtatgttctt ccaagatgtc tgctccacaa tgtcattctg

2941 ccacttcaag ctccaaatca tgtggaagta ccaagtgctc caacttcagt gacaaaaaat

3001 gttgccaata tgacaaaatt cctcaaacgt gctctaccaa gaagtctgct ccaggatgtc

3061 aatctgcagt ttctgggtct aaatcatgtg gagatagcaa gtgttcagac tcgaaagaca

3121 atagtagcca tccttcacat cccgatcatc aaatatgcac gtctaagttg tgtgctccac

3181 aaagccaatc tgcaacttca agctccagga catgtggaaa tatgaagtgc tcggacacca

3241 atagcaagaa ttcttgttat tcacatacca actctgaatc atgctcttca aagatgtctg

3301 gtccagcatg caaaactgct aattcaggtt caaggttatg cggaaataag aagtgcctag

3361 actctgcaaa cgagaacagt tttcattcac ttactaatcc actctgtgag gaaaagcttt

3421 tggagaagga aagcttggat ttagcccgaa aagataggga atcaaatcat gatcttagtc

3481 atggttgctc tgacgaggaa catgatcatc taaatttaga caaggcacat gacagttgtg

3541 ccttacaaga atgttgttat tctgttcaag gcaataaaac tgatgtatca gaaactggaa

3601 tccaggaagc tgctcattgt gacagcatca atcaaacatg ccaaactgca atttcaggat

3661 caatgacatg cggaaataat aagagtctgg actctctaag catccatggt tgtcattcac

3721 atgatagtcc actccacaag gagagcaact tggagcagaa aagcttggat gttgctggag

3781 aaggtataaa atcacctcat gctgtcggtc aaggctgttc ggacaaggag cacaatcact

3841 cgcatccaga aaaggcgtat gacagttgtg caacagacga ttgttgtttt tcagttcaag

3901 tccatggcat tgacgacgta tcaagaagtg aaattcaaga aactgctcat tgtgacagca

3961 caaaacagag cacggtcatc cccagcagct gcgaacatga accaaaagat caggtaaatc

4021 actgtggatc tcactctaaa agtattccaa ctgatgaaga actagccaag ctggttagaa

4081 gatgctgcaa atacaaacca tgccacgatg tccgctctgg ctgcaggaag catgctgcag

4141 aatgtggtcc aaccgttcga tcaaccatca atatcttacg ggacaaccat catcatcatc

4201 tagactgcag tggtcgtaag gtttgttcgc tgttggagaa gagacacatt ggtggatgct

4261 gtgacagctt cagaaaagaa tgttgtgcca agaacaatca ccttggagca agttttggag

4321 gaggtttatc agaaattgtc atagagtaga tgcaatctga agtgtacata tgttgt

[표 1]

WO2012/041913A1에 기술된 단일 HMA 돌연변이체에서의 Cd 및 Zn 데이터의 요약. WO’913에서의 돌연변이체의 명칭은 본원의 돌연변이체 명칭 및 Hermand 등, 2014 에 기술된 돌연변이체와 상이하다. 이것은 WO’913에 사용된 불완전한 서열로 인한 것이다. 첫째 열에서, 대응하는 표준 명칭이 사용된다.

[표 2]

Hermand 등(2014) Metallomics . 6(8): 1427-1440의 도 4a 및 도 4c에서 보고된 데이터의 요약

[표 3]

실지 시험 1 (보통 Cd 영역): 단일 돌연변이체의 경지 데이터

대규모 경지 실험에서 재배된 동형접합 단일 돌연변이체 및 그들의 널-분리개체 대조군의 플롯의 합동표본의 Cd/Zn 값(평균 ± 표준 편차). Cd/Zn 감소의 %는 대조군 값에 비교하여 계산된다. p-값(대응표본 T-검정)은 평균(돌연변이주)이 우연히 <0.8 * 평균 (대조군 계통)일 확률에 대해 계산된다. 유의성 >20% Cd/Zn 감소(p < 0.05)을 갖는 계통에 대해, p-값은 굵게 강조된다. 실지 시험에서, 7개의 돌연변이 조합에 대해, 각 단일 돌연변이체, 이중 돌연변이체 및 대조군 식물은 6개의 복제 플롯(Q293*/Q561*에 대해 5, E296/Q561*에 대해 4 및 Q293*/W265*에 대해 3)에서 재배되었다. 각 복제 유닛은 각각 이중 돌연변이체의 10개 식물, HMA4 WT 대조군 및 2개의 단순 돌연변이를 포함한다. 돌연변이 Q293* 및 Q561*가 여러 조합에서 발생할 때, 이들 단일 돌연변이체에 대한 데이터는 각각 8 및 33 플롯값에 기초한다. 단일 돌연변이체 식물은 도 6에서 알 수 있는 대조군에 비해 바이오매스(잎 중량) 감소를 보여주지 않는다.

[표 4]

대규모 경지 실험에서 재배된 동형접합 이중 돌연변이체 및 그들의 널-분리개체 대조군의 플롯의 합동표본의 Cd/Zn 값(평균 ± 표준 편차). Cd/Zn 감소의 %는 대조군 값에 비교하여 계산된다. p-값(대응표본 T-검정)은 평균(돌연변이주)이 우연히 <0.8 * 평균 (대조군 계통)일 확률에 대해 계산된다. 유의성 >20% Cd/Zn 감소(p < 0.05)을 갖는 계통에 대해, p-값은 굵게 강조된다. 실지 시험에서, 7개의 돌연변이 조합의 분리개체 종자 로트가 파종되고 그 유전자형에 대해 분석된다. 각 돌연변이 조합에 대해, 4개의 유전자형 그룹은 6개의 복제 플롯(Q293*/Q561*에 대해 5, E296/Q561*에 대해 4 및 Q293*/W265*에 대해 3)에서 성장되었다. 각 복제 유닛은 각각 이중 돌연변이체의 10개 식물, HMA4 WT 대조군 및 2개의 단순 돌연변이를 포함한다. 표현형 데이터(잎 생중량)는 도 6에 도시된다.

[표 5]

실지 시험 2 (보통 Cd 영역): 이중 돌연변이체의 경지 데이터

대규모 경지 실험에서 재배된 동형접합 이중 돌연변이체 및 그들의 널-분리개체 대조군의 플롯의 합동표본의 Cd/Zn 값(평균 ± 표준 편차). Cd/Zn 감소의 %는 대조군 값에 비교하여 계산된다. p-값(대응표본 T-검정)은 평균(돌연변이주)이 우연히 <0.8 * 평균 (대조군 계통)일 확률에 대해 계산된다. 유의성 >20% Cd/Zn 감소(p < 0.05)을 갖는 계통에 대해, p-값은 굵게 강조된다. 실지 시험에서, 18개 돌연변이 조합에 대해, 이중 돌연변이체 및 대조군 식물은 6개의 복제 플롯에서 재배되었다(Q293*/W265* 및 Q293*/D234N에 대해 4). 각 복제 유닛은 각각 이중 돌연변이체의 20개 식물, HMA4 WT 대조군을 포함하였다. 표현형 데이터(잎 건중량)는 도 7에 도시된다.

[표 6]

실지 시험 3 및 4의 경지 데이터: 높은 Cd 영역

높은 카드뮴 영역에서의 2개의 경지 실험에서 재배된 동형접합 이중 돌연변이체 및 널-분리개체 대조군의 플롯의 합동표본의 Cd/Zn 값(평균 ± 표준 편차). Cd/Zn 감소의%는 대조군 값에 비교하여 계산된다. p-값(대응표본 T-검정)은 평균(돌연변이주)이 우연히 <0.8 * 평균 (대조군 계통)일 확률에 대해 계산된다. 유의성 >20% Cd/Zn 감소(p < 0.05)을 갖는 계통에 대해, p-값은 굵게 강조된다. 실지 시험에서, 5개 돌연변이 조합에 대해, 이중 돌연변이체 및 대조군 식물은 5개의 복제 플롯에서 재배되었다. 각 복제 유닛은 각각 이중 돌연변이체의 20개 식물, HMA4 WT 대조군을 포함하였다. 돌연변이체 및 대조군 둘 모두에 대한 수용 가능한 재배를 갖는 유일한 플롯이 분석되었다(경지 3에서를 제외하고, 대부분의 계통에 대해 5개 플롯; T402I/Q561*에 대해 4개 플롯; 경지 4에서: G251D/Q561*에 대해 4개 플롯 및 Q293*/Q561*에 대해 3개 플롯). 표현형 데이터(큐어링된 잎 중량)는 도 8에 도시된다.

[표 7]

HMA4의 도메인 구조는 UniProt (AtHMA2: Q9SZW4; AtHMA4: O64474)에 의해 애기장대 HMA2 및 HMA4 단백질 및 각 도메인 주석과의 서열 정렬로부터 도출되었다.

[표 8]

선택된 이중 돌연변이체의 온실 데이터

동형접합 이중 돌연변이체(돌연변이는 “HMA4.1에서의 동형접합 돌연변이/HMA4.2에서의 동형접합 돌연변이”로서 표시됨) 및 모든 이중 돌연변이체의 널-분리개체 대조군(총 54개 식물)인 8개의 식물(Q293*/A374V에 대해 6개의 식물)의 Cd/Zn 값(평균 ± 표준 편차). Cd/Zn 감소의%는 대조군 값에 비교하여 계산된다. 표를 덜 복잡하게 만들기 위해, 모든 54개의 대조군 식물은 상기 표에서 함께 분석되고, 이중 돌연변이체 플롯의 Cd/Zn 값은 모든 대조군과 비교된다. (T-검정이 수행되고, 괄호 내의 값은 P<0.05에서 유의한 감소를 나타내지 않는다.) 이 실험에서의 식물은 온실에서 큰 화분에서 재배된다. 화분에서 재배한 지 4주 그리고 11주 후에 분석된 식물 형태 및 산출량을 나타낸다.

[표 9]

추가로 선택된 이중 돌연변이체의 온실 데이터

동형접합 HMA4 돌연변이체(돌연변이는 “HMA4.1에서의 동형접합 돌연변이/HMA4.2에서의 동형접합 돌연변이”로서 표시됨)의 2개의 추가 조합 및 각 이중 돌연변이체에 대한 널-분리개체 대조군의 동일한 수의 잎 Cd/Zn 값(H438Y/W265*에 대해 9개의 복제 식물 및 L36F/Q561*에 대해 6개의 복제 식물의 평균 ± 표준 편차). Cd/Zn의%는 대조군 값에 비교하여 계산된다.

[표 10]

HMA4 .1 및 HMA4 .2에서의 식별되고 유효한 돌연변이의 목록. 아미노산 변화 및 대응하는 SIFT 점수를 나타낸다. 관심 돌연변이는 굵게 강조된다(오리지널 SIFT 점수의 치환된 aa < 0.05의 SIFT 점수를 갖는 넌센스 돌연변이 또는 미스센스 돌연변이.

[표 11]

잎의 Cd 함량을 감소시킬 것으로 예상되는 돌연변이 조합의 실시예

[표 12]

SEQUENCE LISTING <110> Philip Morris Products S.A. <120> Reducing cadmium accumulation in field grown plants <130> P10255EP <140> EP16153529.9 <141> 2016-01-29 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1403 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 1 Met Val Glu Ser Glu Lys Met Asn Glu Thr Lys Lys Leu Ser Lys Ser 1 5 10 15 Tyr Phe Asp Val Leu Gly Ile Cys Cys Thr Ser Glu Val Val Leu Val 20 25 30 Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Glu Gly Val Lys Glu Val Ser Val Ile 35 40 45 Val Thr Thr Lys Thr Val Ile Val Ile His Asp Ser Leu Leu Ile Ser 50 55 60 Pro Gln Gln Ile Val Lys Ala Leu Asn Gln Ala Arg Leu Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ile Arg Val Lys Gly Glu Lys Asn Tyr Gln Lys Lys Trp Pro Ser Pro 85 90 95 Phe Ala Ile Gly Ser Gly Ile Leu Leu Gly Leu Ser Phe Leu Lys Tyr 100 105 110 Phe Phe Ala Pro Phe Gln Trp Leu Ala Leu Ala Ala Val Ala Val Gly 115 120 125 Ile Pro Pro Ile Ile Phe Arg Gly Val Ala Ala Val Arg Asn Leu Thr 130 135 140 Leu Asp Ile Asn Ile Leu Val Leu Ile Ala Val Ala Gly Ser Ile Val 145 150 155 160 Leu His Asp Tyr Trp Glu Ala Gly Thr Ile Val Phe Leu Phe Ala Ile 165 170 175 Ala Glu Trp Leu Glu Ser Arg Ala Ser His Lys Ala Thr Ala Ala Met 180 185 190 Ser Ser Leu Val Asn Ile Val Pro Pro Thr Ala Val Leu Ala Glu Ser 195 200 205 Gly Glu Val Val Asn Val Asp Glu Val Lys Val Asn Ser Ile Leu Ala 210 215 220 Val Lys Ala Gly Glu Thr Ile Pro Ile Asp Gly Val Val Val Glu Gly 225 230 235 240 Glu Cys Asp Val Asp Glu Lys Thr Leu Thr Gly Glu Ser Phe Pro Val 245 250 255 Ser Lys Gln Arg Asp Ser Thr Val Trp Ala Gly Thr Thr Asn Leu Asn 260 265 270 Gly Tyr Ile Ser Val Lys Thr Thr Ala Leu Ala Glu Asp Cys Ala Val 275 280 285 Ala Arg Met Ala Gln Leu Val Glu Asp Ala Gln Asn Lys Lys Ser Lys 290 295 300 Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Lys Cys Ala Lys Tyr Tyr Thr Pro Ala Ile 305 310 315 320 Val Ala Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Val Pro Thr Ala Leu Arg Val 325 330 335 His Asn Arg Asn Glu Trp Tyr Arg Leu Ala Leu Val Thr Leu Val Ser 340 345 350 Ala Cys Pro Cys Ala Leu Val Leu Ser Thr Pro Val Ala Met Cys Cys 355 360 365 Ala Leu Ser Lys Ala Ala Thr Ser Gly Leu Leu Phe Lys Gly Ala Glu 370 375 380 Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Lys Ile Lys Ile Met Ala Phe Asp Lys Thr 385 390 395 400 Gly Thr Ile Thr Lys Gly Glu Phe Met Val Thr Glu Phe Lys Ser Leu 405 410 415 Ile Asp Gly Phe Ser Leu Asn Thr Leu Leu Tyr Trp Val Ser Ser Ile 420 425 430 Glu Ser Lys Ser Gly His Pro Met Ala Ala Ala Leu Val Asp Tyr Ala 435 440 445 Gln Ser Asn Ser Val Glu Pro Lys Pro Asp Arg Val Glu Gln Phe Gln 450 455 460 Asn Phe Pro Gly Glu Gly Ile Phe Gly Arg Ile Asp Gly Met Glu Ile 465 470 475 480 Tyr Val Gly Asn Arg Lys Ile Ser Ser Arg Ala Gly Cys Thr Thr Val 485 490 495 Pro Glu Ile Glu Gly Asp Ser Phe Lys Gly Lys Ser Val Gly Tyr Ile 500 505 510 Phe Leu Gly Ser Ser Pro Ala Gly Ile Phe Ser Leu Ser Asp Val Cys 515 520 525 Arg Ile Gly Val Lys Glu Ala Met Arg Glu Leu Lys Gln Met Gly Ile 530 535 540 Lys Thr Ala Met Leu Thr Gly Asp Cys Tyr Ala Ala Ala Asn His Val 545 550 555 560 Gln Asp Gln Leu Gly Gly Ala Leu Asp Glu Phe Gln Ala Glu Leu Leu 565 570 575 Pro Glu Asp Lys Ala Thr Ile Ile Lys Gly Phe Gln Lys Glu Ala Pro 580 585 590 Thr Ala Met Ile Gly Asp Gly Leu Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Thr 595 600 605 Ala Asp Ile Gly Ile Ser Met Gly Ile Ser Gly Ser Ala Leu Ala Lys 610 615 620 Glu Thr Gly His Val Ile Leu Met Thr Asn Asp Ile Gly Arg Ile Pro 625 630 635 640 Lys Ala Ala Arg Leu Ala Arg Arg Val Arg Arg Lys Ile Val Glu Asn 645 650 655 Met Ile Ile Ser Val Val Thr Lys Ala Ala Ile Val Ala Leu Ala Ile 660 665 670 Ala Gly Tyr Pro Leu Val Trp Ala Ala Val Leu Ala Asp Thr Gly Thr 675 680 685 Cys Leu Leu Val Ile Leu Asn Ser Met Leu Leu Leu Arg Gly Gly Thr 690 695 700 Arg Arg His Gly Lys Lys Cys Trp Arg Ser Ser Thr Pro Ser His Ala 705 710 715 720 Pro His His Lys Asp Lys Ala Ser Cys Cys Lys Ser Glu Asn Ala Pro 725 730 735 Gln Leu Cys Cys Ser Asp Ile Glu Ser Gln Lys Lys Cys Thr Ser Gln 740 745 750 Ser Cys Ser Ser Glu Val Cys Val Pro Arg Cys Gln Pro Val Ser Ser 755 760 765 Gly Ser Lys Ser Cys Gly Asn Asn Gln Cys Pro Asp Ser Ile Glu Asn 770 775 780 Ser Gly Phe His Ser His Arg Arg Pro Gln Cys Cys Ser Ser Lys Met 785 790 795 800 Ala Ala Lys Ala Cys Gln Ser Ala Val Ser Glu Ser Lys Ser Cys Gly 805 810 815 Asn Asn Gln Cys Pro Asp Ser Val Glu Asn Ser Gly Phe His Ser His 820 825 830 Pro Arg Pro Glu Cys Cys Ser Ser Lys Met Ala Ala Lys Ala Cys Gln 835 840 845 Ser Ala Val Ser Glu Ser Lys Ser Cys Gly Asn Asn Gln Cys Pro Asp 850 855 860 Ser Val Glu Asn Ser Gly Phe His Ser His Pro Arg Pro Gln Cys Cys 865 870 875 880 Ser Ser Lys Met Ala Ala Lys Ala Gly Gln Ser Ala Leu Ser Glu Ser 885 890 895 Lys Ser Cys Gly Asn Asn Asn Cys Ser Asp Ser Ile His Lys Ser Asn 900 905 910 Cys His Ser Leu Thr Asn Ser Leu Val Cys Ser Ser Lys Met Ser Ala 915 920 925 Pro Gln Cys His Ser Ala Thr Ser Ser Asn Lys Ser Cys Gly Ser Thr 930 935 940 Lys Cys Ser Asp Phe Ser Asp Lys Lys Cys Cys Gln Ser Asp Lys Ile 945 950 955 960 Pro Gln Thr Cys Ser Thr Lys Lys Ser Ala Pro Gly Cys Gln Ser Ala 965 970 975 Val Ser Gly Ser Lys Ser Cys Gly Asn Ser Lys Cys Ser Asp Ser Lys 980 985 990 Asp Asn Ser Ser His Pro Ser His Pro Asp His Gln Thr Cys Met Ser 995 1000 1005 Lys Leu Cys Ala Pro Gln Ser Gln Ser Ala Thr Ser Ser Ser Arg 1010 1015 1020 Thr Cys Gly Asn Thr Lys Cys Ser Asp Thr Asn Ser Lys Asn Ser 1025 1030 1035 Cys Tyr Ser Gln Thr Asn Ser Glu Ser Cys Ser Ser Lys Met Ser 1040 1045 1050 Gly Pro Ser Cys Lys Thr Ala Asn Ser Gly Ser Arg Ser Cys Arg 1055 1060 1065 Asn Lys Lys Cys Gln Asp Ser Ala Thr Glu Asn Ser Phe His Ser 1070 1075 1080 Pro Leu Thr Asn Pro Leu Ser Gly Glu Lys Leu Ser Glu Gln Lys 1085 1090 1095 Ser Leu Asp Leu Val Arg Lys Asp Lys Glu Ser Ser His Asp Leu 1100 1105 1110 Arg His Gly Cys Ser Asp Glu Glu His Asp His Thr Asn Leu Asp 1115 1120 1125 Lys Ala Tyr Asp Ser Cys Ala Leu Gln Glu Cys Cys Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Gln Gly Asn Lys Thr Asp Val Ser Glu Thr Gly Ile Gln Glu Thr 1145 1150 1155 Ala His Cys Asp Ser Thr Asn Gln Thr Cys Gln Thr Ala Ser Ser 1160 1165 1170 Gly Ser Met Thr Cys Gly Asn Asp Lys Ile Leu Asp Ser Leu Ser 1175 1180 1185 Ile His Gly Cys His Ser His Asp Asn Pro Leu His Glu Glu Asn 1190 1195 1200 Asn Leu Glu Gln Lys Ile Leu Asp Val Val Gly Glu Gly Ile Lys 1205 1210 1215 Ser Pro His Ala Val Gly His Gly Cys Ser Asp Lys Glu His Asp 1220 1225 1230 His Ser His Pro Glu Lys Ala Tyr Asp Ser Cys Ala Thr Asp Asp 1235 1240 1245 Cys Cys Phe Ser Val Gln Val His Gly Ile Asp Asp Val Ser Lys 1250 1255 1260 Ser Glu Ile Gln Glu Thr Ala His Cys Asp Ser Thr Lys Gln Ser 1265 1270 1275 Met Val Ile Ser Ser Ser Cys Lys His Glu Pro Lys Asp Gln Val 1280 1285 1290 Asn His Cys Gly Leu His Ser Lys Thr Thr Pro Thr Asp Glu Glu 1295 1300 1305 Leu Ala Lys Leu Val Arg Arg Cys Cys Lys Tyr Lys Pro Cys His 1310 1315 1320 Asp Val Arg Ser Gly Cys Arg Lys His Ala Ala Glu Cys Gly Pro 1325 1330 1335 Thr Val Arg Ser Thr Ile Asn Ile Leu Arg Asp Asn His His His 1340 1345 1350 Tyr Leu Asp Cys Ser Gly Arg Lys Val Cys Ser Leu Leu Glu Lys 1355 1360 1365 Arg His Ile Gly Gly Cys Cys Asp Ser Phe Arg Lys Glu Cys Cys 1370 1375 1380 Ala Lys Lys Lys His Leu Gly Ala Ser Phe Gly Gly Gly Leu Ser 1385 1390 1395 Glu Ile Val Ile Glu 1400 <210> 2 <211> 1444 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 2 Met Val Glu Ser Glu Lys Met Asn Asp Thr Lys Asn Leu Ser Lys Ser 1 5 10 15 Tyr Phe Asp Val Leu Gly Ile Cys Cys Thr Ser Glu Val Val Leu Val 20 25 30 Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Glu Gly Val Lys Glu Val Ser Val Ile 35 40 45 Val Thr Thr Lys Thr Val Ile Val Ile His Asp Ser Leu Leu Ile Ser 50 55 60 Gln Gln Gln Ile Val Lys Ala Leu Asn Gln Ala Arg Leu Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ile Arg Val Lys Gly Glu Lys Asn Tyr Gln Lys Lys Trp Pro Ser Pro 85 90 95 Phe Ala Ile Gly Ser Gly Ile Leu Leu Gly Leu Ser Phe Leu Lys Tyr 100 105 110 Phe Phe Ala Pro Phe Gln Trp Leu Ala Leu Ala Ala Val Ala Val Gly 115 120 125 Ile Pro Pro Ile Ile Phe Arg Gly Val Ala Ala Val Arg Asn Leu Thr 130 135 140 Leu Asp Ile Asn Ile Leu Val Leu Ile Ala Val Thr Gly Ser Ile Val 145 150 155 160 Leu His Asp Tyr Trp Glu Ala Gly Thr Ile Val Phe Leu Phe Thr Ile 165 170 175 Ala Glu Trp Leu Glu Ser Arg Ala Ser His Lys Ala Thr Ala Ala Met 180 185 190 Ser Ser Leu Val Asn Ile Val Pro Pro Thr Ala Val Leu Ala Glu Ser 195 200 205 Gly Glu Val Val Asn Val Asp Glu Val Lys Leu Asn Ser Ile Leu Ala 210 215 220 Val Lys Ala Gly Glu Thr Ile Pro Ile Asp Gly Val Val Met Glu Gly 225 230 235 240 Glu Cys Asp Val Asp Glu Lys Thr Leu Thr Gly Glu Ser Phe Pro Val 245 250 255 Ser Lys Gln Ile Asp Ser Thr Val Trp Ala Gly Thr Thr Asn Leu Asn 260 265 270 Gly Tyr Ile Ser Val Lys Thr Thr Ala Leu Ala Glu Asp Cys Ala Val 275 280 285 Ala Arg Met Ala Gln Leu Val Glu Asp Ala Gln Asn Lys Lys Ser Lys 290 295 300 Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Lys Cys Ala Lys Tyr Tyr Thr Pro Ala Ile 305 310 315 320 Val Ala Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Val Pro Thr Ala Leu Arg Val 325 330 335 His Asn Arg Asn Glu Trp Tyr Arg Leu Ala Leu Val Thr Leu Val Ser 340 345 350 Ala Cys Pro Cys Ala Leu Val Leu Ser Thr Pro Val Ala Met Cys Cys 355 360 365 Ala Leu Ser Lys Ala Ala Thr Ser Gly Leu Leu Phe Lys Gly Ala Glu 370 375 380 Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Lys Ile Lys Ile Met Ala Phe Asp Lys Thr 385 390 395 400 Gly Thr Ile Thr Arg Gly Glu Phe Met Val Thr Glu Phe Lys Ser Leu 405 410 415 Val Asp Gly Leu Gly Leu Asn Thr Leu Leu Tyr Trp Val Ser Ser Ile 420 425 430 Glu Ser Lys Ser Gly His Pro Met Ala Ala Ala Leu Val Asp Tyr Ala 435 440 445 Gln Ser Asn Ser Val Glu Pro Lys Pro Asp Arg Val Glu Gln Phe Gln 450 455 460 Asn Phe Pro Gly Glu Gly Ile Phe Gly Arg Ile Asp Gly Met Glu Ile 465 470 475 480 Tyr Val Gly Asn Arg Lys Ile Ser Ser Arg Ala Gly Cys Thr Thr Val 485 490 495 Pro Glu Ile Glu Gly Asp Ser Phe Gln Gly Lys Ser Val Gly Tyr Ile 500 505 510 Phe Leu Gly Ser Ser Pro Ala Gly Ile Phe Gly Leu Ser Asp Val Cys 515 520 525 Arg Ile Gly Val Lys Glu Ala Met Arg Glu Leu Lys Gln Met Gly Ile 530 535 540 Lys Thr Ala Met Leu Thr Gly Asp Cys Tyr Ala Ala Ala Asn His Val 545 550 555 560 Gln Asp Gln Leu Gly Gly Ala Met Asp Glu Phe Gln Ala Glu Leu Leu 565 570 575 Pro Glu Asp Lys Ala Thr Ile Ile Lys Gly Phe Gln Lys Glu Ala Pro 580 585 590 Thr Ala Met Ile Gly Asp Gly Leu Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Thr 595 600 605 Ala Asp Ile Gly Ile Ser Met Gly Ile Ser Gly Ser Ala Leu Ala Lys 610 615 620 Glu Thr Gly His Val Ile Leu Met Thr Asn Asp Ile Gly Arg Ile Pro 625 630 635 640 Lys Ala Ala Arg Leu Ala Arg Arg Val Arg Arg Lys Ile Val Glu Asn 645 650 655 Met Ile Ile Ser Val Val Thr Lys Ala Ala Ile Val Ala Leu Ala Ile 660 665 670 Ala Gly Tyr Pro Leu Val Trp Ala Ala Val Leu Ala Asp Thr Gly Thr 675 680 685 Cys Leu Leu Val Ile Leu Asn Ser Met Leu Leu Leu Arg Val Gly Thr 690 695 700 His Arg His Gly Lys Lys Cys Cys Arg Ser Ala Thr Pro Ser His Ala 705 710 715 720 Pro Asn His Lys Asp Lys Ala Ser Cys Cys Lys Ser Glu Asn Ala Pro 725 730 735 Gln Leu Cys Cys Ser Asp Ile Glu Ser Gln Lys Lys Cys Thr Ser Gln 740 745 750 Ser Cys Ser Ser Glu Val Cys Val Pro Arg Cys Gln Pro Val Ser Ser 755 760 765 Gly Ser Lys Ser Cys Gly Asn Asn Gln Cys Pro Asp Ser Val Glu Asn 770 775 780 Ser Gly Phe His Ser His Pro Arg Pro Gln Cys Cys Ser Ser Lys Met 785 790 795 800 Ala Ser Lys Ala Cys Gln Ser Ala Val Ser Glu Ser Lys Ser Cys 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1010 1015 1020 Ser Cys Gly Asp Ser Lys Cys Ser Asp Ser Lys Asp Asn Ser Ser 1025 1030 1035 His Pro Ser His Pro Asp His Gln Ile Cys Thr Ser Lys Leu Cys 1040 1045 1050 Ala Pro Gln Ser Gln Ser Ala Thr Ser Ser Ser Arg Thr Cys Gly 1055 1060 1065 Asn Met Lys Cys Ser Asp Thr Asn Ser Lys Asn Ser Cys Tyr Ser 1070 1075 1080 His Thr Asn Ser Glu Ser Cys Ser Ser Lys Met Ser Gly Pro Ala 1085 1090 1095 Cys Lys Thr Ala Asn Ser Gly Ser Arg Leu Cys Gly Asn Lys Lys 1100 1105 1110 Cys Leu Asp Ser Ala Asn Glu Asn Ser Phe His Ser Leu Thr Asn 1115 1120 1125 Pro Leu Cys Glu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Glu Ser Leu Asp Leu 1130 1135 1140 Ala Arg Lys Asp Arg Glu Ser Asn His Asp Leu Ser His Gly Cys 1145 1150 1155 Ser Asp Glu Glu His Asp His Leu Asn Leu Asp Lys Ala His Asp 1160 1165 1170 Ser Cys Ala Leu Gln Glu Cys Cys Tyr Ser Val Gln Gly Asn Lys 1175 1180 1185 Thr Asp Val Ser Glu Thr Gly Ile Gln Glu Ala Ala His Cys Asp 1190 1195 1200 Ser Ile Asn Gln Thr Cys Gln Thr Ala Ile Ser Gly Ser Met Thr 1205 1210 1215 Cys Gly Asn Asn Lys Ser Leu Asp Ser Leu Ser Ile His Gly Cys 1220 1225 1230 His Ser His Asp Ser Pro Leu His Lys Glu Ser Asn Leu Glu Gln 1235 1240 1245 Lys Ser Leu Asp Val Ala Gly Glu Gly Ile Lys Ser Pro His Ala 1250 1255 1260 Val Gly Gln Gly Cys Ser Asp Lys Glu His Asn His Ser His Pro 1265 1270 1275 Glu Lys Ala Tyr Asp Ser Cys Ala Thr Asp Asp Cys Cys Phe Ser 1280 1285 1290 Val Gln Val His Gly Ile Asp Asp Val Ser Arg Ser Glu Ile Gln 1295 1300 1305 Glu Thr Ala His Cys Asp Ser Thr Lys Gln Ser Thr Val Ile Pro 1310 1315 1320 Ser Ser Cys Glu His Glu Pro Lys Asp Gln Val Asn His Cys Gly 1325 1330 1335 Ser His Ser Lys Ser Ile Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ala Lys Leu 1340 1345 1350 Val Arg Arg Cys Cys Lys Tyr Lys Pro Cys His Asp Val Arg Ser 1355 1360 1365 Gly Cys Arg Lys His Ala Ala Glu Cys Gly Pro Thr Val Arg Ser 1370 1375 1380 Thr Ile Asn Ile Leu Arg Asp Asn His His His His Leu Asp Cys 1385 1390 1395 Ser Gly Arg Lys Val Cys Ser Leu Leu Glu Lys Arg His Ile Gly 1400 1405 1410 Gly Cys Cys Asp Ser Phe Arg Lys Glu Cys Cys Ala Lys Asn Asn 1415 1420 1425 His Leu Gly Ala Ser Phe Gly Gly Gly Leu Ser Glu Ile Val Ile 1430 1435 1440 Glu <210> 3 <211> 4246 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 3 agagaaggag aaaaatggtg gaaagtgaaa aaatgaatga aacaaagaag ttgagcaaga 60 gctattttga tgttttggga atttgctgta cttcagaagt tgttctagtt gaaaaaattc 120 tcaagaatct tgaaggggtt aaagaggttt cagtaattgt cacaacaaag actgtcattg 180 ttattcatga ttctcttctc atttctccgc aacaaattgt taaagcattg aatcaagcaa 240 gattagaagc aagcataaga gtgaaaggag agaaaaacta ccaaaagaaa tggccaagtc 300 catttgcaat tggcagtgga atattgcttg gactctcatt tttgaagtac ttttttgcac 360 ctttccaatg gttagcactt gcagctgttg cagttgggat tcctccaatt atttttagag 420 gtgtggctgc cgtgcgaaac ctcactcttg acatcaacat tcttgtttta atagcagtgg 480 ctggatcaat tgttttacac gattattggg aagctggtac tattgtcttc ttattcgcca 540 ttgcagaatg gctagagtca agggcaagtc acaaggctac cgctgctatg tcatcactgg 600 tcaatatagt ccctccaaca gcagttttag ctgaaagcgg agaagtcgta aatgttgatg 660 aagtcaaggt gaatagcatt cttgctgtga aagctggtga aactatacct attgatggag 720 ttgtagtgga aggggaatgt gacgtggacg agaaaacact gacaggcgag tcgtttccag 780 tttctaagca aagagattca acggtctggg ctggcactac aaatctaaat ggctatatca 840 gtgttaagac tacggctttg gctgaagatt gtgcggtggc taggatggca cagcttgtcg 900 aagatgctca gaacaagaaa tcaaaaaccc aaagatacat cgacaagtgt gctaaatatt 960 atacaccagc aattgtggct atatcagctt ctttggcaat tgttcctact gcattaagag 1020 ttcacaatcg aaatgaatgg tatcgcttgg ctttggtcac attggtgagt gcatgtccgt 1080 gtgcacttgt tctatctaca ccagttgcca tgtgttgcgc actttcaaaa gcagcaacgt 1140 ccggtcttct gtttaaagga gcagagtacc ttgagactct agctaaaatc aaaatcatgg 1200 cttttgacaa aacagggact ataactaaag gagaatttat ggtgaccgag ttcaagtctc 1260 tgattgatgg ttttagtctc aatacactgc tttactgggt ttcaagcatt gagagcaagt 1320 caggtcatcc gatggcagcc gctctggtgg actatgcaca atcaaattcc gttgagccaa 1380 agcctgatag agttgagcag tttcaaaatt ttcctggtga agggatattt ggaagaattg 1440 atggaatgga aatctatgtc gggaatagga aaatttcttc aagagctgga tgtaccacag 1500 taccagaaat agagggtgat agtttcaaag gaaagtctgt tggatacata tttttgggat 1560 catctccagc tggaattttc agtctttccg atgtttgtcg aattggtgta aaagaagcaa 1620 tgagagaact gaagcagatg ggtatcaaaa ccgcgatgct tactggtgat tgttatgcag 1680 ctgccaacca tgtgcaggat cagttaggtg gagctttgga tgaatttcaa gcagaactcc 1740 taccagagga caaggcaaca atcatcaagg gttttcagaa ggaagctcca acagcgatga 1800 taggcgacgg ccttaatgat gctcctgcat tagcaacagc tgacattggc atctcaatgg 1860 gcatctctgg gtcagctctc gctaaagaaa caggccatgt tatactaatg acaaatgaca 1920 tcggaagaat accgaaagct gcacgtcttg ctagaagagt tcgaaggaag attgttgaga 1980 atatgattat atcagtcgtt acaaaggctg ccatagttgc attggcaata gcaggttatc 2040 cattggtttg ggctgctgtc ctcgcagata ctgggacatg cttgctagtg attttgaaca 2100 gcatgctact tctacgagga ggcacacgca gacatgggaa aaaatgttgg agatcttcta 2160 ctccttcgca tgctccccac cacaaagaca aagcttcatg ttgcaagtcg gaaaatgctc 2220 cccagctgtg ttgctctgat attgagtcac aaaagaaatg tacaagtcaa tcatgctcgt 2280 ccgaggtgtg tgttccaaga tgtcaacctg tctcctcagg atcaaagtca tgtggaaata 2340 atcagtgccc agactccatt gaaaatagtg gttttcattc tcatcgccgt cctcaatgct 2400 gctcgtcgaa gatggctgct aaagcatgcc aatctgcagt ttcagaatca aagtcatgcg 2460 gaaataatca gtgcccagac tccgttgaaa atagtggttt tcattctcat ccccgtcctg 2520 aatgctgctc gtcgaagatg gctgctaaag cgtgccaatc tgcagtttca gaatcaaagt 2580 catgtggaaa taatcagtgc ccagactccg ttgaaaatag tggttttcat tctcatcccc 2640 gtcctcaatg ctgttcatcg aagatggctg ctaaagcagg ccaatctgca ctttcagaat 2700 caaagtcatg tggaaataac aattgctcag actccattca caagagtaat tgtcattctt 2760 taactaactc tctagtatgt tcttccaaga tgtctgctcc acaatgtcat tctgctactt 2820 caagcaacaa atcatgtgga agtaccaagt gctccgactt cagtgacaaa aaatgttgtc 2880 aatccgacaa aattcctcaa acgtgctcta ccaagaagtc tgctccagga tgtcaatctg 2940 cagtttctgg gtctaaatca tgtggaaata gcaagtgttc agactcaaaa gacaatagta 3000 gccatccttc acatcccgat catcaaacat gcatgtctaa gttgtgtgct ccacaaagcc 3060 aatctgcaac ttcaagctcc aggacatgtg gaaatacaaa gtgctcggac accaatagca 3120 agaattcttg ttattcacaa accaactctg aatcatgctc ttcaaagatg tctggtccat 3180 catgcaaaac tgctaattca ggttcaaggt catgcagaaa taagaagtgc caggactctg 3240 caaccgagaa cagttttcat tcaccactta ctaatccact cagtggggaa aagctttcgg 3300 agcagaaaag cttggattta gtccgaaaag ataaggaatc aagtcatgat cttcgtcatg 3360 gctgctctga cgaggaacat gatcatacaa atttagacaa ggcatatgac agttgtgcct 3420 tacaagaatg ttgttattcg gttcaaggca ataaaactga tgtatcagaa actggaatcc 3480 aggaaactgc tcattgtgac agcaccaatc aaacatgcca aactgcaagt tcaggatcga 3540 tgacatgcgg aaatgataag atcctggact ctctaagcat ccatggttgt cattcgcatg 3600 ataatccact ccacgaggag aacaacttgg agcagaaaat cttggatgtt gttggagaag 3660 gtataaaatc acctcatgct gtcggtcatg gctgttcgga caaggaacac gatcactcac 3720 atccagaaaa ggcatatgac agttgtgcaa cagatgattg ttgtttttca gttcaagtcc 3780 atggcattga cgacgtatca aaaagtgaaa ttcaagaaac tgctcattgt gacagcacaa 3840 agcagagcat ggtcatctcc agcagctgca aacatgaacc aaaagatcag gtaaatcact 3900 gtggacttca ctctaaaact actccaactg atgaagaact agccaagctg gttagaagat 3960 gctgcaaata caaaccatgc cacgacgtcc gttctggctg caggaagcat gctgcagaat 4020 gtggtccaac cgttcgatca accatcaata tcttacggga caaccatcat cattacctag 4080 actgcagtgg tcgtaaggtt tgttcgctgt tggagaagag acacatcggt ggatgctgtg 4140 acagcttcag aaaagaatgt tgtgccaaga aaaaacacct tggagcaagt tttggaggag 4200 gtttatcaga aattgtcata gagtagatgc aatccgaagt gtacat 4246 <210> 4 <211> 4376 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 4 atagaaagaa gagaatggtg gaaagtgaga aaatgaatga cacaaagaat ctgagcaaga 60 gctattttga tgttttggga atttgctgta cttcagaagt tgttcttgtt gaaaaaattc 120 tcaagaatct tgaaggggtt aaagaggttt cagtaattgt cacaacaaag actgtcattg 180 ttattcatga ttctctcctc atttctcagc aacaaattgt taaagcattg aatcaagcaa 240 gattagaagc aagtataaga gtgaaaggag agaaaaacta ccaaaagaaa tggccaagtc 300 catttgcaat tggcagtgga atattgcttg gactctcatt tttgaagtac ttttttgcac 360 ctttccaatg gttagcactt gcagctgttg cagttgggat tcctccaatt atttttaggg 420 gtgtggctgc cgtgcgaaac ctcactcttg acatcaacat tcttgtttta atagcagtga 480 cgggatcaat tgttttacac gattattggg aagctggtac tattgtcttc ttattcacca 540 ttgcagaatg gctagagtca agggcaagtc acaaggctac tgctgctatg tcatcactgg 600 tcaatatagt ccctccaaca gcagttttag ctgaaagtgg agaagtcgta aatgttgatg 660 aagtcaagtt gaatagcatt cttgctgtta aagctggtga aactatacct attgatggag 720 ttgtaatgga aggggaatgt gacgtggacg agaaaacact gacaggcgag tcgtttccag 780 tttctaagca aatagattca acggtctggg ctggcactac aaatctaaat ggctatatca 840 gtgttaagac tacggctttg gctgaagatt gtgcggtggc taggatggcg cagcttgtcg 900 aagatgctca gaacaagaaa tcaaaaaccc aaagatacat tgacaagtgt gctaaatatt 960 atacaccagc aattgtggct atatcagctt ctttggcaat agttcctact gcattaagag 1020 ttcacaatcg aaatgagtgg tatcgcttgg ctttggtcac gttggtgagt gcatgtccgt 1080 gtgcacttgt gctatctaca ccagttgcca tgtgttgtgc actttctaaa gcagcaacgt 1140 ccggtcttct gtttaaagga gcagagtacc ttgagactct tgctaaaatc aaaatcatgg 1200 cttttgacaa aacagggact ataactagag gagaatttat ggtgaccgag ttcaagtctc 1260 tggttgatgg tcttggtctc aatacactgc tttactgggt ttcaagtatt gagagcaagt 1320 caggtcatcc gatggcagcc gctctggttg actatgcaca atcaaattcc gttgagccaa 1380 agcctgatag agttgagcag tttcaaaatt ttcctggtga agggatattt ggaagaattg 1440 atggaatgga aatctatgtc gggaatagga aaatttcttc aagagctgga tgtactacag 1500 taccagaaat agagggtgat agtttccaag gaaagtctgt tggatacata tttttgggat 1560 catctcccgc tggaattttc ggtctttccg atgtttgtcg aattggtgta aaagaagcaa 1620 tgagagagct gaagcagatg ggtatcaaaa ccgcgatgct tactggtgat tgttatgcag 1680 ctgccaacca tgtgcaggat cagttaggtg gagctatgga tgaatttcaa gcggaactct 1740 taccagagga caaggcaaca atcatcaagg gttttcagaa ggaagctcca acagcgatga 1800 taggcgacgg ccttaatgat gctcctgcat tagcaacagc tgacattggc atctcaatgg 1860 gcatctctgg gtcagctctc gcgaaagaaa caggccatgt tatactaatg acaaatgaca 1920 tcggaagaat accaaaagct gcacgtcttg ctagaagagt tcgaaggaag attgttgaga 1980 atatgattat atcagtcgtt acaaaggccg ccatagttgc attggcaata gcaggttatc 2040 cattggtttg ggctgctgtc ctcgcggata ctgggacatg cttgctagtg atcttgaaca 2100 gcatgctact tctacgagta ggcacacaca gacatgggaa aaaatgttgt agatctgcta 2160 ctccttcgca tgctcccaac cacaaagaca aagcttcttg ttgcaagtcg gaaaatgctc 2220 cgcagctgtg ttgctctgat attgagtcac aaaagaaatg tacgagtcaa tcatgctcgt 2280 ccgaggtgtg tgttccaaga tgtcaacctg tctcctcggg atcaaagtca tgtggaaata 2340 atcagtgccc agactccgtt gaaaatagtg gttttcattc tcatccccgt cctcaatgct 2400 gctcgtcgaa gatggcttct aaagcatgcc aatctgcagt ttcagaatca aagtcatgtg 2460 gaaataatca gtgcccagac tccgttgaaa atagtggttt tcattctcat ccccgccctc 2520 aatgctgctc gtctaagatg gcttctaaag catgccaatc tgcagtttca gaatcaaagt 2580 catgtggaaa taatcagtgc ccagactccg ttgaaaatag tggttttcat tctcatcccc 2640 gtcctcaatg ctgctcgttg aagatggctt ctaaagcatg ccaatctgca gtttcagaat 2700 caaagtcatg tggaaataat cagtgcccag actccgttga aaatagtggt tttcattctc 2760 atccccgtcc tcaatgctgc tcgtcgaaga tggctgctaa agcatgccaa tctgcagttt 2820 cagaatcaaa gtcatgtgga aataacaatt gctcggagtc catttacaag agtagttgtc 2880 attctttaac aagttctcta gtatgttctt ccaagatgtc tgctccacaa tgtcattctg 2940 ccacttcaag ctccaaatca tgtggaagta ccaagtgctc caacttcagt gacaaaaaat 3000 gttgccaata tgacaaaatt cctcaaacgt gctctaccaa gaagtctgct ccaggatgtc 3060 aatctgcagt ttctgggtct aaatcatgtg gagatagcaa gtgttcagac tcgaaagaca 3120 atagtagcca tccttcacat cccgatcatc aaatatgcac gtctaagttg tgtgctccac 3180 aaagccaatc tgcaacttca agctccagga catgtggaaa tatgaagtgc tcggacacca 3240 atagcaagaa ttcttgttat tcacatacca actctgaatc atgctcttca aagatgtctg 3300 gtccagcatg caaaactgct aattcaggtt caaggttatg cggaaataag aagtgcctag 3360 actctgcaaa cgagaacagt tttcattcac ttactaatcc actctgtgag gaaaagcttt 3420 tggagaagga aagcttggat ttagcccgaa aagataggga atcaaatcat gatcttagtc 3480 atggttgctc tgacgaggaa catgatcatc taaatttaga caaggcacat gacagttgtg 3540 ccttacaaga atgttgttat tctgttcaag gcaataaaac tgatgtatca gaaactggaa 3600 tccaggaagc tgctcattgt gacagcatca atcaaacatg ccaaactgca atttcaggat 3660 caatgacatg cggaaataat aagagtctgg actctctaag catccatggt tgtcattcac 3720 atgatagtcc actccacaag gagagcaact tggagcagaa aagcttggat gttgctggag 3780 aaggtataaa atcacctcat gctgtcggtc aaggctgttc ggacaaggag cacaatcact 3840 cgcatccaga aaaggcgtat gacagttgtg caacagacga ttgttgtttt tcagttcaag 3900 tccatggcat tgacgacgta tcaagaagtg aaattcaaga aactgctcat tgtgacagca 3960 caaaacagag cacggtcatc cccagcagct gcgaacatga accaaaagat caggtaaatc 4020 actgtggatc tcactctaaa agtattccaa ctgatgaaga actagccaag ctggttagaa 4080 gatgctgcaa atacaaacca tgccacgatg tccgctctgg ctgcaggaag catgctgcag 4140 aatgtggtcc aaccgttcga tcaaccatca atatcttacg ggacaaccat catcatcatc 4200 tagactgcag tggtcgtaag gtttgttcgc tgttggagaa gagacacatt ggtggatgct 4260 gtgacagctt cagaaaagaa tgttgtgcca agaacaatca ccttggagca agttttggag 4320 gaggtttatc agaaattgtc atagagtaga tgcaatctga agtgtacata tgttgt 4376 <210> 5 <211> 191 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 5 tgagagcaag tcaggtcatc cgatggcagc cgctctggtg gactatgcac aatcaaattc 60 cgttgagcca aagcctgata gagttgagca gtttcaaaat tttcctggtg aagggatatt 120 tggaagaatt gatggaatgg aaatctatgt cgggaatagg aaaatttctt caagagctgg 180 atgtaccaca g 191 <210> 6 <211> 139 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 6 taaatggttg aatcatttct tatgctcata gtagagataa aacatcagag ttataattat 60 aagtatatga tttctccagt taattttgct gttagatttt ctttgacctg tttagcacta 120 atgcggtgga tgtttgaat 139 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1-Exon1 forward primer <400> 7 gcatgttctt ataagagaaa ctc 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1-Exon1 reverse primer <400> 8 gtgaatttat ttaacaagcc aca 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1-Exon2 forward primer <400> 9 ccaaaattgt ttctgcttct cc 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1-Exon2 reverse primer <400> 10 cgtcatataa attgggacaa aag 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1-Exon4/5 forward primer <400> 11 gtgtctttat tttctcactg ata 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1-Exon4/5 reverse primer <400> 12 tagtgacgtg attcataaga caa 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1-Exon6 forward primer <400> 13 atcagtcctt tcacttgacc c 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1-Exon6 reverse primer <400> 14 aaccattaga gccatttcag aa 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1-Exon7/8 forward primer <400> 15 gatactgcaa tacaaaagca cat 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1-Exon7/8 reverse primer <400> 16 cacttacttg gtaatacgtt ct 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2-Exon1 forward primer <400> 17 ttgctactct gggttgctac 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2-Exon1 reverse primer <400> 18 tcaagtttaa agtttgcttc tac 23 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2-Exon2 forward primer <400> 19 tgtgcataca taacgtaaat cg 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2-Exon2 reverse primer <400> 20 atcaaatacc acataagtag gg 22 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2-Exon4/5 forward primer <400> 21 tttagtcact ttgacataaa tgg 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2-Exon4/5 reverse primer <400> 22 aagacagaga acaagttcac at 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2-Exon6 forward primer <400> 23 tcagtccttt cgcttgacct 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2-Exon6 reverse primer <400> 24 gagaatgtgg tactcgcaag 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2-Exon7/8 forward primer <400> 25 atacattgag gacacataat cg 22 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2-Exon7/8 reverse primer <400> 26 tataccccat tctgaccctt g 21 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 forward primer <400> 27 tcatgcagaa ataagaagtg ccag 24 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 reverse primer <400> 28 atggatgctt agagagtcca gga 23 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2 forward primer <400> 29 gttatgcgga aataagaagt gccta 25 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2 reverse primer <400> 30 catggatgct tagagagtcc agac 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin 9 forward primer <400> 31 ctattctccg ctttggactt ggca 24 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin 9 reverse primer <400> 32 aggacctcag gacaacggaa acg 23 <210> 33 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 Q293* mutant-probe <400> 33 aggatggcac agct 14 <210> 34 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 wild type probe <400> 34 aggatggcac agct 14 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 forward primer <400> 35 ctggcactac aaatctaaat ggtagtatag tattt 35 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 reverse primer <400> 36 ctggtgtata atatttagca cacttgtcg 29 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 E296K mutant-probe <400> 37 cacagcttgt caaag 15 <210> 38 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 wild type probe <400> 38 cacagcttgt cgaag 15 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 forward primer <400> 39 ctggcactac aaatctaaat ggtagtatag tattt 35 <210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 reverse primer <400> 40 ctggtgtata atatttagca cacttgtcg 29 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 T402I mutant-probe <400> 41 tttgacaaaa cagggatta 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 wild type probe <400> 42 tttgacaaaa cagggacta 19 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 forward primer <400> 43 ccatgtgttg cgcactttca 20 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 reverse primer <400> 44 aactcggtca ccataaattc tcctt 25 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 G251D mutant-probe <400> 45 agaaaacact gacagacg 18 <210> 46 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.1 wild type probe <400> 46 aaaacactga caggcg 16 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.1 forward primer <400> 47 aagtcgtaaa tgttgatgaa gtcaagg 27 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.1 reverse primer <400> 48 cagcccagac cgttgaatct c 21 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 V351M mutant-probe <400> 49 ctttggtcac attgatga 18 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.1 wild type probe <400> 50 ttggtcacat tggtgagt 18 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.1 forward primer <400> 51 ggctatatca gcttctttgg caatt 25 <210> 52 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.1 reverse primer <400> 52 aacacatggc aactggtgta gataga 26 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.1 G382R mutant-probe <400> 53 ttctgtttaa aagagcagag 20 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.1 wild type probe <400> 54 tctgtttaaa ggagcagagt a 21 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.1 forward primer <400> 55 ccatgtgttg cgcactttca 20 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.1 reverse primer <400> 56 aactcggtca ccataaattc tcctt 25 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2 W265* mutant-probe <400> 57 atagattcaa cggtctagg 19 <210> 58 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.2 wild type probe <400> 58 ttcaacggtc tgggc 15 <210> 59 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.2 forward primer <400> 59 ggtgaaacta tacctattga tggagttgta a 31 <210> 60 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.2 reverse primer <400> 60 cactaaataa atgaagcatg aaggaatact ac 32 <210> 61 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA4.2 Q561* mutant-probe <400> 61 caaccatgtg taggat 16 <210> 62 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.2 wild type probe <400> 62 tgccaaccat gtgcag 16 <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.2 forward primer <400> 63 ttggtgtaaa agaagcaatg agagag 26 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMA 4.2 reverse primer <400> 64 atcatttcag cgtattgcag aattt 25

Claims

적어도 2개의 중금속 ATPase(HMA)의 적어도 부분적으로 감소된 발현 또는 활성을 갖는 돌연변이체 식물 또는 그의 부분으로서, 상기 2개의 HMA는:
(i) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2와 적어도 65% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드;
(ii) (i)에 기재된 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(iii) HMA를 인코딩하는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4과 적어도 65% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 본질적으로 구성되고;
상기 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은, 상기 돌연변이체 식물이 천연 또는 비-천연 발생 카드뮴의 존재 하에 경지 재배될 때 잎의 카드뮴 축적에 있어서 대조군 식물에 비해 적어도 27% 감소를 나타내는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분.
제1항에 있어서, (i) 또는 (ii) 또는 (iii)에 기재된 상기 HMA 중 하나의 발현 또는 활성은 부분적으로 감소되거나 손실되고, (i) 또는 (ii) 또는 (iii)에 기재된 상기 HMA 중 하나의 발현 또는 활성은 대조군 식물에 비해 손실되는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분.
제1항 또는 제2항에 있어서, 수확 시점에 상기 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 표현형은 동일한 수확 시점에서의 상기 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 상기 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 상기 동일한 수확 시점에서 상기 대조군 식물에 비해 수확 시점에서의 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (ii) 또는 (iii)에 기재된 각 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에서 또는 조절 영역에서의 적어도 하나의 유전적 변경을 포함하고, 적합하게는, 상기 돌연변이는 미스센스 돌연변이 또는 넌센스 돌연변이인, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 돌연변이 그룹들 중 하나 이상을 포함하는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분:
SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 251 내지 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 251 또는 293 또는 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 223 내지 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, 여기에서 상기 식물은 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 223 또는 234 또는 235 또는 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 402 내지 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이. 돌연변이체 식물 또는 그의 부분으로서, SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 P/N-도메인의 아미노산 위치 402 또는 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N 도메인의 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인의 상기 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치 265, 223, 234 또는 235에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치 265, 223, 234 또는 235에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프의 상기 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 상기 P/N 도메인 제2 세포질 루프의 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 251 내지 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 251 또는 293 또는 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 223 내지 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, 여기에서 상기 식물은 SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 223 또는 234 또는 235 또는 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 402 내지 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 제3 루프의 상기 P/N-도메인의 아미노산 위치 402 또는 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 A-도메인 루프에서의 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이, 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N-도메인 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 상기 HMA 폴리펩티드의 상기 A-도메인 루프의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N 도메인의 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이;
SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치에 대응하는 위치 265, 223, 234 또는 235에서의 적어도 하나의 돌연변이; 및
SEQ ID NO:4에 기재된 비-돌연변이 서열의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프의 상기 제2 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 상기 P/N 도메인 제2 세포질 루프의 제3 세포질 루프 내 아미노산 위치에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이; 적합하게는, SEQ ID NO:4에 기재된 상기 비-돌연변이 서열의 상기 P/N 도메인의 상기 제3 세포질 루프의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이 및 SEQ ID NO:3에 기재된 상기 비-돌연변이 서열에 의해 인코딩된 HMA 폴리펩티드의 상기 A 도메인 루프의 상기 제2 세포질 루프의 아미노산 위치 265, 223, 234 또는 235에 대응하는 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 돌연변이 그룹들 중 하나 이상을 포함하는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분:
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q293* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q293* 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 E296K 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 T402I 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q293* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q293* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q293* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 H438Y 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q464* 및 W265**이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q464* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q464* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q464* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 E296K 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 E296K 및 L223F임);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 E296K 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 E296K 및 G235E임);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 T402I 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 T402I 및 L223F임);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 T402I 및 D234N임);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 T402I 및 G235E임);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 L223F임);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 D234N임);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 G235E임);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 H438Y 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 H438Y 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 H438Y 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 H438Y 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q293* 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q293* 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 E296K 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 T402I 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q293* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q293* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 293에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q293* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1에 기재된 비-돌연변이 서열의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 H438Y 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q464* 및 W265**이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q464* 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q464* 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 464에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 Q464* 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 E296K 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 E296K 및 L223F임);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 E296K 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 296에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 E296K 및 G235E임);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 T402I 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 T402I 및 L223F임);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 T402I 및 D234N임);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 402에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 T402I 및 G235E임);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 265에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 W265*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 L223F임);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 D234N임);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 251에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 G251D 및 G235E임);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 561에 대응하는 위치에서의 넌센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 H438Y 및 Q561*이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 223에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 H438Y 및 L223F이고, *는 종결 코돈을 나타냄);
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 234에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 H438Y 및 D234N이고, *는 종결 코돈을 나타냄); 및
SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 438에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 위치 235에 대응하는 위치에서의 미스센스 돌연변이(적합하게는, 상기 돌연변이는 H438Y 및 G235E이고, *는 종결 코돈을 나타냄).
경지 재배된 식물의 잎에서 카드뮴의 레벨을 감소시키는 방법으로서:
(a) 2개의 중금속 ATPase(HMA)의 발현 또는 활성을 감소시키는 단계로서, 상기 2개의 HMA는:
(i) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2와 적어도 65% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드;
(ii) (i)에 기재된 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(iii) HMA를 인코딩하는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 구성되거나 본질적으로 구성되고,
적합하게는, 상기 HMA의 발현 또는 활성은 돌연변이 유발 또는 게놈 편집에 의해 감소되는, 단계;
(b) 상기 경지에서 상기 식물을 재배하는 단계;
(c) 선택적으로, 단계 (b)에서 얻어진 상기 식물 내의 상기 카드뮴 함량을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 HMA의 발현 또는 활성이 감소되지 않은 대조군 식물에 비해 식물 내의 카드뮴 함량이 감소되는 식물을 식별하는 단계로서, 적합하게는, 상기 식물 또는 그의 부분은, 상기 식물이 천연 또는 비-천연 발생 카드뮴의 존재 하에 경지 재배될 때 잎의 카드뮴 축적에 있어서 상기 대조군 식물에 비해 적어도 27% 감소를 나타내고; 적합하게는, 수확 시점에 상기 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 표현형은 상기 동일한 수확 시점에서 상기 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 상기 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 상기 동일한 수확 시점에 상기 대조군 식물에 비해 수확 시점에서 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는, 단계를 포함하는, 방법.
하나 이상의 유전적 변경을 포함하지 않는 경지 재배된 대조군 식물에 비해 잎에서 카드뮴의 감소된 레벨과 상관되는 경지 재배된 식물에서 하나 이상의 유전적 변경을 식별하는 방법으로서:
(a) 상기 경지에서 재배될 때 상기 경지에서 재배된 대조군 식물에 비해 잎에서 카드뮴의 감소된 레벨을 갖는 식물을 식별하는 단계로서, 선택적으로, 수확 시점에 상기 식물 또는 그의 부분의 표현형은 상기 동일한 수확 시점에서 상기 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 상기 식물 또는 그의 부분은 상기 동일한 수확 시점에 상기 대조군 식물에 비해 수확 시점에 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는, 단계;
(b) (a) 단계에서 식별된 상기 식물로부터 핵산 샘플을 제공하는 단계; 및
(c) SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2에 기재된 비-돌연변이 서열과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 HMA를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 상기 폴리뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 유전적 변경을 단계 (b)로부터의 상기 핵산 샘플에서 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 돌연변이체 식물 또는 그의 부분으로부터의 식물 재료로서, 적합하게는 상기 식물 재료는 큐어링되거나 건조된 식물 재료이고, 적합하게, 수확 시점에서 상기 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 표현형은 상기 동일한 수확 시점에서 상기 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 상기 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 상기 동일한 수확 시점에서 상기 대조군 식물에 비해 수확 시간에서 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는, 식물 재료.
경지에서 재배될 때 경지 재배된 대조군 식물에 비해 잎의 카드뮴의 감소된 축적을 갖는 식물 재료를 생산하기 위한 방법으로서:
(a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체 식물 또는 그의 부분을 제공하는 단계;
(b) 상기 경지에서 상기 식물을 재배하는 단계; 및
(c) 상기 식물로부터 식물 재료를 수확하는 단계로서, 적합하게는, 수확 시점에 상기 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 표현형은 상기 동일한 수확 시점에서 상기 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 상기 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 상기 동일한 수확 시점에 상기 대조군 식물에 비해 수확 시점에서 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는, 단계를 포함하는, 방법.
제8항에 따른 방법에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 돌연변이체 식물 또는 그의 부분 또는 그로부터 유래되거나 유래될 수 있는 식물 재료로서, 적합하게는, 수확 시점에 상기 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 표현형은 상기 동일한 수확 시점에서의 상기 대조군 식물과 동일하고, 적합하게는, 상기 돌연변이체 식물 또는 그의 부분은 상기 동일한 수확 시점에서 상기 대조군 식물에 비해 수확 시점에서 바이오매스(예를 들어, 잎 중량) 감소를 보여주지 않는, 돌연변이체 식물 또는 그의 부분 또는 식물 재료.
제1항 내지 제6항 또는 제11항 중 어느 한 항의 돌연변이체 식물 또는 그의 부분의 적어도 일부분, 또는 제9항의 식물 재료를 포함하는 식물 제품.
제1항 내지 제6항 또는 제11항 중 어느 한 항의 돌연변이체 식물 또는 그의 부분, 또는 제9항의 식물 재료 또는 제12항의 식물 제품을 포함하는 담배 제품 또는 흡연 물품 또는 소모품.