BR112020017500A2 - Modulação do teor de aminoácidos em uma planta - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se às sequências polinucleotídicas de genes que codificam a aspartato transaminase (aat) de nicotiana tabacum e a modulação de sua expressão. é descrita uma célula vegetal compreendendo: (i) um polinucleotídeo composto, constituído ou essencialmente constituído por uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência com seq id no: 1, seq id no: 3, seq id no: 5, seq id no: 7, seq id no: 9, seq id no: 11, seq id no: 13 ou seq id no: 15; (ii) um polipeptídeo codificado pelo polipeptídeo indicado em (i); (ii) um polipeptídeo composto, constituído ou essencialmente constituído por uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com a seq id no: 6 ou seq id no: 8, pelo menos 93% de identidade de sequência com seq id no: 2 ou seq id no: 10 ou seq id no: 12 ou pelo menos 94% de identidade de sequência com seq id no: 4 ou seq id no: 14 ou seq id no: 16; ou (iv) um construto, vetor ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo isolado indicado em (i), em que a referida célula vegetal compreende pelo menos uma modificação que modula a expressão ou atividade do polinucleotídeo ou do polipeptídeo em comparação com a célula vegetal controle na qual a expressão ou atividade do polinucleotídeo ou polipeptídeo não foi modificada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODU- LAÇÃO DO TEOR DE AMINOÁCIDOS EM UMA PLANTA".

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção divulga sequências de polinucleotí- deos dos genes que codificam aspartato transminase (AAT) a partir de Nicotiana tabacum e variantes, homólogos e fragmentos destes. As sequências de polipeptídeos codificadas por estes e variantes, homó- logos, e fragmentos dos mesmos são também divulgadas. A modula- ção da expressão dos genes NtAAT ou a função ou atividade do(s) polipeptídeo(s) NtAAT codificado(s) para modular os níveis de um ou mais aminoácidos livres – como aspartato – e metabólitos ou subpro- dutos derivados - como amônia - em uma planta ou parte desta tam- bém é divulgada.

FUNDAMENTOS

[002] Acrilamida é um composto químico de fórmula C3H5NO (nome IUPAC é prop-2-enamida) e preocupações foram levantadas em relação a sua potencial toxidade. A origem de acrilamida no aeros- sol dos artigos para fumar compreendendo tabaco pode ser, pelo me- nos em parte, a partir de aminoácidos que estão presentes no material de tabaco usado para a produção de artigos para fumar. Os tipos de tabaco cultivados apresentam um aumento no total de aminoácidos livres durante a cura, particularmente tipos de tabaco curados ao ar e tipos de tabaco curados ao sol. A variação do teor de aminoácidos em material de tabaco curado está relacionada ao tempo de cura à tempe- ratura ambiente (cura pelo ar) em comparação com a cura por estufa (que é um processo de secagem rápida) permitindo que reações en- zimáticas ainda estejam ativas 10-15 dias após a colheita. Além disso, o material de tabaco curado ao ar exibe maior teor de água do que ou- tros tabacos curados, retardando o processo de secagem à temperatu- ra ambiente, sendo considerado um segundo fator permitindo que al-

guma reação enzimática ainda esteja ativa mais tarde na fase de cura. É desejável diminuir os níveis de aminoácidos e metabólitos e subpro- dutos derivados de plantas, especialmente em material vegetal curado e fumaça e aerossol derivados deste. Como é provável que a amônia seja um subproduto de aminoácidos produzidos durante a cura, o nível de amônia em folhas curadas, fumaça e aerossol também pode ser diminuído. Também é desejável diminuir a formação de odores indese- jáveis em aerossol ou fumaça quando o tabaco é aquecido ou quei- mado.

[003] A presente invenção visa a atender a essa necessidade na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] Uma série de sequências de polinucleotídeos que codifica AAT de Nicotiana tabacum são descritas neste documento, as quais estão envolvidas na biossíntese de aminoácidos durante a cura preco- ce. Mudanças em genes NtATT que não são superexpressos durante a cura não contribuirão para a modulação dos níveis de aminoácidos e metabólitos derivados destes. No entanto, esses genes provavelmente estarão envolvidos em outras vias metabólicas e mudanças em sua expressão podem resultar em um fenótipo que é agronomicamente prejudicial (por exemplo, crescimento lento). Sabendo quais NtAAT genes são superexpressos durante a cura permite, de forma vantajo- sa, a seleção de plantas com alterações apenas nos genes relevantes e reduz potenciais efeitos negativos em outros processos metabólicos.

[005] A AAT catalisa a transferência reversível do grupo α-amino entre aspartato e glutamato, sendo, portanto, uma enzima chave no metabolismo de aminoácidos canalizando nitrogênio do glutamato e do aspartato. A síntese de aspartato é essencial para a síntese de outros aminoácidos como asparagina, treonina, isoleucina, cisteína e metio- nina. Durante o processo de cura, o aspartato é convertido em aspa-

ragina via asparagina sintetase.

Asparagina e glutamina são compos- tos chave para a remobilização n em folhas senescentes, sendo aspa- ragina o principal aminoácido produzido em folhas curadas do tipo Bur- ley.

Asparagina é conhecida por resultar em acrilamida após o aque- cimento da folha de tabaco.

O aspartato também é fundamental na biossíntese de outros aminoácidos - como treonina, metionina e cisteí- na - alguns dos quais resultam em um odor de enxofre após o aqueci- mento.

Ao modular a expressão e/ou atividade de AAT divulgada, ago- ra é possível alterar o produto químico de partes de plantas, tal como folhas, e a fumaça ou aerossóis derivados deste.

Curiosamente, al- guns genes de tabaco AAT ainda podem ser expressos pelo menos 8 dias a partir do início do processo de cura pelo ar, conforme descrito neste documento.

Por exemplo, a quantidade de um ou mais aminoá- cidos, tal como aspartato e metabólitos derivados destes, tal como amônia, durante e após a cura pode ser modulada e, portanto, a for- mação de acrilamida formada durante o aquecimento de tabaco pode ser modulada e, apropriadamente, reduzida.

A título de exemplo adici- onal, a formação de outros aminoácidos que podem resultar em um odor de enxofre mediante aquecimento de tabaco pode também ser modulada e, apropriadamente, reduzida.

Várias sequências de polinu- cleotídeos genômicos AAT a partir de Nicotiania tabacum são descri- tas neste documento, incluindo NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5)NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7)NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1)NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3)NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9)NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11)NtAAT4-S (SEQ ID NO: 13) e NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15). As sequências de po- lipeptídeos deduzidas correspondentes para NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2), NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4), NtAAT3-S (SEQ ID NO: 10), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 14) e NtAAT4-T (SEQ ID NO: 16) são também divulgadas.

NtAAT2-S e NtAAT2-T, e em menor grau NtAAT1-

S, NtAAT1-T, são mostrados para desempenhar um papel particular na biossíntese de aspartato durante a cura. Em contraste, as transcri- ções NtAAT4-S e NtAAT4-T são reguladas negativamente principal- mente durante os primeiros dois dias de cura da folha, embora NtA- AT4-T permaneça expressa após oito dias de cura pelo ar, de modo que o envolvimento da proteína NtAAT4-T na cura não possa ser ex- cluído. A expressão de NtAAT3-S permanece baixa durante a cura da folha e não é modulada durante a fase de amarelamento. NtAAT3-T às vezes é ligeiramente induzido durante a cura, no entanto o nível de expressão permanece relativamente baixo.

ALGUMAS VANTAGENS

[006] De forma vantajosa, sequências de polinucleotídeos de NtAAT podem ser altamente expressas durante a cura, particularmen- te, a partir do início da cura. Modular a expressão de uma ou mais se- quências de polinucleotídeos de NtAAT pode resultar em níveis modu- lados de acrilamida em aerossol desde que o nível de aspartato possa ser modulado ao longo do processo de cura. Em particular, diminuir a expressão de uma ou mais sequências de polinucleotídeos de NtAAT pode resultar em níveis diminuídos de acrilamida em aerossol.

[007] Uma vez que o aspartato é chave na biossíntese de outros aminoácidos, tais como treonina, metionina e cisteína, alguns dos quais resultam em um odor de enxofre mediante aquecimento, modu- lar a expressão de sequências de polinucleotídeos de NtAAT pode modular este odor indesejado. Além disso, sabendo que a amônia é passível de ser um subproduto de aminoácidos produzidos durante a cura, diminuir a expressão de sequências de polinucleotídeos de NtA- AT e/ou a atividade da proteína codificada pelas mesmas pode diminu- ir o nível de amônia no material vegetal e fumaça e aerossol derivados desta. O aumento dos aminoácidos ocorre particularmente no tabaco curado ao ar e no tabaco curado ao sol, pois esses métodos de cura resultam em teor elevado de aminoácidos em material de tabaco cura- do em comparação com o material de tabaco curado por estufa. A pre- sente descrição é, portanto, particularmente aplicável ao material de tabaco curado ao ar e curado por estufa.

[008] De forma vantajosa, há impacto limitado em níveis de nico- tina nas plantas modificadas descritas neste documento, que é dese- jável quando as plantas modificadas são destinadas a serem usadas para a produção de plantas de tabaco e produtos de tabaco consumi- dos.

[009] De forma vantajosa, as plantas modificadas não- geneticamente podem ser criadas que podem ser mais aceitáveis ao consumidor.

[0010] De forma vantajosa, a presente descrição não é restringida ao uso de plantas mutantes de EMS. Uma planta mutante de EMS po- de ter menos potencial para trazer propriedades melhoradas à uma cultura após reprodução. Uma vez que a reprodução é iniciada, a(s) característica(s) desejadas da planta mutante de EMS pode(m) ser perdida(s) por diferentes razões. Por exemplos, várias mutações po- dem ser adquiridas, a mutação pode ser dominante ou recessiva e a identificação de uma mutação pontual em um gene alvo pode ser difícil de alcançar. Em contraste, a presente descrição explora o uso de poli- nucleotídeos de NtAAT que podem ser especificamente manipulados para produzir plantas com um fenótipo desejável. A descrição pode ser aplicada a várias variedades de plantas ou culturas.

[0011] Em um aspecto, descreve-se uma célula vegetal compre- endendo: (i) um polinucleotídeo composto, constituído ou essencial- mente constituído por uma sequência com pelo menos 80% de identi- dade de sequência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15; (ii) um polipeptídeo codificado pelo polipeptídeo indi-

cado em (i); (ii) um polipeptídeo composto, constituído ou essencial- mente constituído por uma sequência com pelo menos 95% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID No: 8, pelo menos 93% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID No: 4 ou SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID No: 12 ou pelo menos 94% de identida- de de sequência com SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16; ou (iv) um construto, vetor ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotí- deo isolado indicado em (i), em que a referida célula vegetal compre- ende pelo menos uma modificação que modula a expressão ou ativi- dade do polinucleotídeo ou do polipeptídeo em comparação com a cé- lula vegetal controle na qual a expressão ou atividade do polinucleotí- deo ou polipeptídeo não foi modificada.

[0012] Em outro aspecto, é divulgada uma célula vegetal compre- endendo: (i) um polinucleotídeo composto, constituído ou essencial- mente constituído por uma sequência com pelo menos 80% de identi- dade de sequência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15; (ii) um polipeptídeo codificado pelo polipeptídeo indi- cado em (i); (ii) um polipeptídeo composto, constituído ou essencial- mente constituído por uma sequência com pelo menos 95% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID No: 8, pelo menos 93% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID No: 12 ou pelo menos 94% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16; ou (iv) um construto, vetor ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotí- deo isolado indicado em (i), em que a referida célula vegetal compre- ende pelo menos uma modificação que modula a expressão ou ativi- dade do polinucleotídeo ou do polipeptídeo em comparação com a cé- lula vegetal controle na qual a expressão ou atividade do polinucleotí- deo ou polipeptídeo não foi modificada. Apropriadamente, a referida célula vegetal compreende um polinucleotídeo composto, constituído ou essencialmente constituído por uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, apropriadamente, em que a célula vegetal compreende um polinucleotídeo composto, constituído ou es- sencialmente constituído por uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

[0013] Apropriadamente, a referida célula vegetal compreende um polipeptídeo compreendendo, constituído ou essencialmente constituí- do por uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequên- cia com SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID No: 8 ou pelo menos 93% de identi- dade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID No: 4, apropriada- mente, em que a célula vegetal compreende um polipeptídeo compre- endendo, constituído ou essencialmente constituído por uma sequên- cia com pelo menos 93% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID No: 4.

[0014] Apropriadamente, a referida célula vegetal compreende um polipeptídeo compreendendo, constituído ou essencialmente constituí- do por uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequên- cia com SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID No: 8 ou pelo menos 93% de identi- dade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 94% de identi- dade de sequência ou SEQ ID No: 4, apropriadamente, em que a célu- la vegetal compreende um polipeptídeo compreendendo, constituído ou essencialmente constituído por uma sequência com pelo menos 93% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 94% de identidade de sequência com SEQ ID No: 4. Apropriadamente, a expressão e/ou atividade de um ou mais NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8), NtA- AT2-S (SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4) é modulada enquanto a expressão e/ou atividade de um ou mais NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14) e NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 16) não é modulada.

[0015] Apropriadamente, pelo menos uma modificação é uma mo- dificação do genoma da célula vegetal ou uma modificação do constru- to, vetor ou vetor de expressão ou uma modificação transgênica.

[0016] Apropriadamente, a modificação do genoma da célula ve- getal, ou a modificação do construto, vetor ou vetor de expressão é uma mutação ou edição.

[0017] Apropriadamente, a modificação diminui a expressão ou atividade do polinucleotídeo ou do polipeptídio em comparação uma célula vegetal controle.

[0018] Apropriadamente, a célula vegetal compreende um polinu- cleotídeo de interferência compreendendo uma sequência que é pelo menos 80% complementar a pelo menos 19 nucleotídeos de um RNA transcrito do polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1(i).

[0019] Apropriadamente, a expressão modulada ou atividade do polinucleotídeo ou do polipeptídeo modula o nível de aminoácidos em folha curada ou seca derivada da célula vegetal em comparação com o nível de aminoácidos em folha curada ou seca derivada de uma planta controle, apropriadamente em que o aminoácido é aspartato ou um metabólito derivado dele.

[0020] Apropriadamente, o nível de nicotina em folha curada ou seca da célula vegetal é substancialmente o mesmo que o nível de nicotina na folha curada ou seca de uma célula vegetal controle; e/ou em que o nível de acrilamida na folha curada ou seca derivada da cé- lula vegetal é diminuído em comparação com o nível de acrilamida na folha curada ou seca derivada de uma planta controle e/ou em que o nível de amônia na folha curada ou seca derivada da célula vegetal é diminuído em comparação com o nível de aminoácidos na folha cura- da ou seca derivada de uma planta controle.

[0021] Em um aspecto adicional, descreve-se uma planta ou parte desta compreendendo a célula vegetal descrita neste documento. Em um aspecto adicional, descreve-se uma planta ou parte desta confor- me descrita neste documento, em que a quantidade de aspartato ou metabólito derivado desta é modificada em pelo menos uma parte da planta em comparação com uma planta controle ou parte desta.

[0022] Em um aspecto adicional, descreve-se um material vegetal, material vegetal curado ou material vegetal homogeneizado, derivado da planta ou parte desta conforme descrita neste documento, apropri- adamente, em que o material vegetal curado é material vegetal curado ao ar ou curado ao sol ou curado por estufa.

[0023] Em um aspecto adicional, descreve-se um material vegetal conforme descrito neste documento, compreendendo biomassa, se- mente, caule, flores ou folhas da planta ou parte desta conforme des- crita neste documento.

[0024] Em um aspecto adicional, descreve-se um produto de taba- co compreendendo a célula vegetal conforme descrita neste documen- to, uma parte da planta conforme descrita neste documento ou o mate- rial vegetal conforme descrito neste documento.

[0025] Em um aspecto adicional, descreve-se um método para produzir a planta conforme descrita neste documento, compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma célula vegetal compreendendo um po- linucleotídeo composto, constituído ou essencialmente constituído por um polinucleotídeo composto, constituído ou essencialmente constituí- do por uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequên- cia com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15; (b) modificar a célula vegetal para modular a expressão do referido poli-

nucleotídeo em comparação com uma célula vegetal controle; e (c) propagar a célula vegetal em uma planta.

[0026] Apropriadamente, a etapa (c) compreende cultivar a planta de um corte ou muda que compõe a célula vegetal.

[0027] Apropriadamente, a etapa de modificação da célula vegetal compreende modificar o genoma da célula por edição genômica ou engenharia genômica.

[0028] Apropriadamente, a edição genômica ou engenharia genô- mica é selecionada entre tecnologia CRISPR/Cas, mutagênese medi- ada por nuclease dedo de zinco, mutagênese química ou por radiação, recombinação homóloga, mutagênese direcionada por oligonucleotí- deo e mutagênese mediada por meganuclease.

[0029] Apropriadamente, a etapa de modificação da célula vegetal compreende transfectar a célula com um construto composto, constitu- ído ou essencialmente constituído por uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15 operacionalmente ligado a um promotor constitutivo.

[0030] Apropriadamente, a etapa de modificação da célula vegetal compreende introduzir um polinucleotídeo compreendendo uma se- quência que é pelo menos 80% complementar a um RNA transcrito do polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1(i), na célula.

[0031] Apropriadamente, a célula vegetal é transfectada com um construto que expressa um polinucleotídeo de interferência compreen- dendo uma sequência que é pelo menos 80% complementar a pelo menos 19 nucleotídeos de um RNA transcrito do polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1(i).

[0032] Em um aspecto adicional, descreve-se um método de pro- dução de material vegetal curado com uma quantidade alterada de aspartato ou metabólito derivado desta em comparação com o material vegetal controle, compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma plan- ta ou parte desta ou o material vegetal conforme descrito neste docu- mento; (b) colher opcionalmente o material vegetal desta; e (c) curar o material vegetal.

[0033] Apropriadamente, o material vegetal compreende folhas curadas, caules curados ou flores curadas, ou uma mistura destes.

[0034] Apropriadamente, o método de cura é selecionado do grupo que consiste em cura pelo ar, cura pelo fogo, cura por fumaça e cura em estufa.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0035] A Figura 1 é um gráfico que mostra o teor de aminoácidos livres totais após a colheita (madura), após dois dias de cura (48h) e no final da cura em tabaco cultivado do tipo Virgínia, Burley e Oriental.

[0036] A Figura 2 é um gráfico que mostra as quantidades pós- colheita de aspartato (asp) e asparagina (asn) em amostras de folhas de tabaco do tipo burley suíço cultivado no campo (três réplicas de fo- lha a granel). Os aminoácidos livres foram medidos em amostras de folhas (posição de talo médio) coletadas de forma de curso de tempo em um celeiro de cura pelo ar até 50 dias de cura.

[0037] A Figura 3 é um gráfico que mostra o teor de nicotina no meio da folha das plantas NtAAT2-S/T RNAi T0 (E324) e as respecti- vas plantas controle (CTE324).

[0038] A Figura 4 é um gráfico que mostra o teor de asparagina no meio da folha das plantas NtAAT2-S/T RNAi T0 (E324) e as respec- tivas plantas controle (CTE324).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0039] Os títulos de seção conforme usado nesta descrição são meramente para fins de organização e não se destinam a ser um fator limitante.

[0040] Salvo se definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente compreendidos para um versado na técnica. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo definições, controlará. Os materiais e os métodos preferenciais são descritos abaixo, embora os métodos e os materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento podem ser usados na prática ou teste da presente invenção. Os materiais, métodos e exemplos divulgados neste docu- mento são ilustrativos apenas e não pretende ser um fator limitante.

[0041] Os termos "compreender", "incluir", "ter", "poder", "conter" e variantes destes, como usado aqui, se destinam a ser frases, termos ou palavras de transição em aberto que não excluem a possibilidade de ações ou estruturas adicionais.

[0042] As formas singular "um(a)", "e" e "o(a)" incluem referências plurais a menos que o contexto claramente dite de outra forma.

[0043] O termo "e/ou" se refere a (a) ou (b) ou ambos (a) e (b).

[0044] A presente descrição contempla outras modalidades "com- postas", "constituídas" e "essencialmente constituídas" pelas modali- dades ou elementos apresentados neste documento, se explicitamente estabelecido ou não.

[0045] Para a recitação de intervalos numéricos neste documento, cada número intermediário entre com o mesmo grau de precisão é ex- plicitamente contemplado. Por exemplo, para o intervalo 6-9, os núme- ros 7 e 8 são contemplados, além de 6 e 9, e para o intervalo 6,0-7,0, os números, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 e 7,0 são ex- plicitamente contemplados.

[0046] Como usado em toda a especificação e as reivindicações, os seguintes termos têm os seguintes significados:

[0047] "Sequência de codificação" ou "codificação de polinucleotí- deos" significa os nucleotídeos (RNA ou molécula de DNA) que com-

põem um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo. A sequência codificante pode incluir ainda os sinais de iniciação e terminação ope- rativamente ligados aos elementos reguladores incluindo um promotor e sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células de um indivíduo ou um mamífero ao qual o polinucleotídeo é adminis- trado. A sequência de código pode ser códon otimizado.

[0048] "Complemento" ou "complementar" pode significar Watson- Crick (por exemplo, A-T/U e C-G) ou emparelhamento de base de Ho- ogsteen entre nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos. A "comple- mentaridade" refere-se a uma propriedade compartilhada entre dois polinucleotídeos, de modo que quando forem alinhadas antiparalela- mente uma à outra, as bases de nucleotídeos em cada posição serão complementares.

[0049] "Construto" refere-se a um fragmento de polinucleotídeo recombinante de dupla fita que compreende um ou mais polinucleotí- deos. O construto compreende uma "fita modelo" emparelhada a uma fita complementar "fita senso ou codificadora". Um dado construto po- de ser inserido em um vetor em duas possíveis orientações, ou numa mesma orientação (ou senso) ou na orientação oposta (ou antissen- so), com relação à orientação de um promotor posicionado dentro dos limites de um vetor - tal como um vetor de expressão.

[0050] O termo "controle" no contexto de uma planta controle ou células vegetais controle significa uma planta controle ou células vege- tais controle em que a expressão, função ou atividade de um ou mais genes ou polipeptídeos não foram modificadas (por exemplos, aumen- tadas ou reduzidas), podendo, portanto, fornecer uma comparação com uma planta em que a expressão, função ou atividade dos mes- mos um ou mais genes ou polipeptídeos foram modificadas. Como usado aqui, uma "planta controle" é uma planta que é substancialmen- te equivalente a uma planta de teste ou planta modificada em todos os parâmetros com exceção dos parâmetros de teste. Por exemplo, quando se refere a uma planta na qual um polinucleotídeo foi introdu- zido, em certas modalidades, uma planta controle é uma planta equi- valente em que nenhum polinucleotídeo foi introduzido. Em certas mo- dalidades, uma planta controle é uma planta equivalente na qual foi introduzida um polinucleotídeo controle. Em tais casos, o polinucleotí- deo controle é um que é esperado para resultar em pouco ou nenhum efeito fenotípico na planta. A planta controle pode compreender um vetor vazio. A planta controle pode corresponder a uma planta do tipo selvagem. A planta controle pode ser um segregante nulo em que o segregante T1 já não possui o transgene.

[0051] O "DNA doador" ou "modelo de doador" refere-se a um fra- gmento de DNA de fita dupla ou molécula que inclui pelo menos uma porção do gene de interesse. O DNA doador pode codificar um poli- peptídeo completamente funcional ou um polipeptídeo parcialmente funcional.

[0052] O "gene ou polipeptídeo endógeno" refere-se a um gene ou polipeptídeo que se origina do genoma de um organismo e não sofreu uma alteração, como uma perda, ganho ou troca de material genético. Um gene endógeno sofre transmissão de gene normal e expressão gênica. Um polipeptídeo endógeno sofre expressão normal.

[0053] As "sequências de potencializador" se referem às sequên- cias que podem aumentar a expressão gênica. Essas sequências po- dem ser localizadas a montante, dentro de íntrons ou a jusante da re- gião transcrita. A região transcrita é compreendida em éxons e íntrons intermediários, a partir do promotor para a região de terminação da transcrição. A potencialização da expressão gênica pode ser através de vários mecanismos que incluem aumentar a eficiência transcricio- nal, estabilização de mRNA maduro e potencialização translacional.

[0054] "Expressão" se refere à produção de um produto funcional.

Por exemplo, a expressão de um fragmento de polinucleotídeo pode se referir a transcrição do fragmento de polinucleotídeo (por exemplo, a transcrição resultando em mRNA ou RNA funcional) e/ou tradução de mRNA em um precursor ou polipeptídeo maduro. "Superexpressão" refere-se à produção de um produto de gene em organismos transgê- nicos que excedem os níveis de produção em um organismo de se- gregação nulo (ou não transgênico) no mesmo experimento.

[0055] "Funcional" e "totalmente funcional" descreve um polipeptí- deo que tem função ou atividade biológica. Um "gene funcional" refere- se a um gene transcrito ao mRNA, que é traduzido para um polipeptí- deo funcional ou ativo.

[0056] O "construto genético" refere-se a moléculas de DNA ou RNA que compõem um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo. A sequência codificante pode incluir sinais de iniciação e terminação operacionalmente ligados a elementos reguladores incluindo um pro- motor e sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão.

[0057] "Edição genômica" se refere a mudar de um gene endóge- no que codifica um polipeptídeo endógeno, de modo que a expressão de polipeptídeo de um polipeptídeo endógeno truncado ou um polipep- tídeo endógeno com uma substituição de aminoácido é obtida. Edição genômica pode incluir substituir a região do gene endógeno a ser dire- cionada ou substituir todo o gene endógeno com uma cópia do gene que tem um truncamento ou uma substituição de aminoácido com um mecanismo de reparação, tal como HDR. Edição genômica também pode incluir gerar uma substituição de aminoácido no gene endógeno gerando-se uma quebra de fita dupla no gene endógeno que, então, é reparado usando NHEJ. NHEJ pode adicionar ou excluir pelo menos um par de base durante o reparo que pode gerar uma substituição de aminoácido. Edição de genoma também pode incluir a deleção de um segmento do gene pela ação simultânea de duas nucleases na mesma fita de DNA a fim de criar um truncamento entre os dois locais alvo de nuclease e reparar a quebra de DNA por NHEJ.

[0058] "Heteróloga", com respeito a uma sequência, significa uma sequência que se origina de uma espécie estranha ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma nativa na com- posição e/ou locus genômico por intervenção humana deliberada.

[0059] A "reparação direcionada por homologia" ou "HDR" se refe- re a um mecanismo nas células para reparar as lesões de DNA de fita dupla quando uma porção homóloga de DNA está presente no núcleo, principalmente na fase G2 e S do ciclo celular. A HDR usa um DNA doador ou modelo de doador para guiar o reparo e pode ser usado pa- ra criar alterações de sequência específica ao genoma, incluindo a adição de alvo de todos genes. Se um modelo de doador for fornecido junto com a nuclease local específica, então, o maquinário celular re- parará a ruptura por recombinação homóloga, que é reforçada em vá- rias ordens de grandeza na presença de clivagem de DNA. Quando a porção de DNA homólogo estiver ausente, NHEJ pode ocorrer em vez disso.

[0060] Os termos "homologia, identidade ou similaridade" referem- se ao grau de similaridade sequencial entre dois polipeptídeos ou en- tre duas moléculas de polinucleotídeo comparadas por meio de ali- nhamento sequencial. O grau de homologia entre dois polinucleotídeos discretos sendo comparados é uma função do número de nucleotídeos idênticos ou correspondentes em posições comparáveis.

[0061] "Idêntico" ou "identidade", no contexto de dois ou mais poli- nucleotídeos ou polipeptídeos significam que as sequências têm uma determinada porcentagem de resíduos que são iguais ao longo de uma região especificada. A porcentagem pode ser calculada alinhan- do-se idealmente as duas sequências, comparando as duas sequên- cias sobre a região especificada, determinando o número de posições em que o resíduo idêntico ocorre em ambas as sequências para pro- duzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na região determinada e multiplicar o resultado por 100, para produzir a porcen- tagem da identidade de sequência.

Em casos em que as duas se- quências são de comprimentos diferentes ou o alinhamento produz uma ou mais extremidades escalonadas e a região especificada de comparação inclui apenas uma única sequência, os resíduos de se- quência única estão incluídos no denominador, mas não o numerador do cálculo.

Quando se compara o DNA e o RNA, timina (T) e uracila (U) podem ser considerados equivalentes.

A identidade pode ser de- terminada manualmente ou usando um algoritmo de sequência de computador como ClustalW, ClustalX, BLAST, FASTA ou Smith- Waterman.

O programa de alinhamento múltiplo popular ClustalW (Nucleic Acids Research (1994) 22, 4673-4680; Nucleic Acids Rese- arch (1997), 24, 4876-4882) é uma maneira adequada para gerar múl- tiplos alinhamentos de polipeptídeos ou polinucleotídeos.

Os parâme- tros para ClustalW podem ser conforme a seguir: Para alinhamentos de polinucleotídeo: Penalidade de Abertura de Gap = 15,0, Penalidade de Extensão de Gap = 6,66 e Matriz = Identidade.

Para alinhamentos de polipeptídeo: Penalidade de Abertura de Gap = 10. o, Penalidade de Extensão de Gap = 0,2 e Matriz = Gonnet.

Para os alinhamentos de DNA e Proteína: ENDGAP = -1 e GAPDIST = 4. Aqueles versados na técnica estarão cientes de que pode ser necessário variar esses e ou- tros parâmetros para alinhamento de sequência ideal.

Apropriadamen- te, o cálculo das identidades de porcentagem é calculado, então, um alinhamento como (N/T), onde N é o número das posições em que as sequências compartilham de um resíduo idêntico e T é o número total das posições comparadas incluindo as aberturas, que excluem ove- rhangs.

[0062] Os termos "aumentar" ou "aumentado", refere-se a um au- mento de cerca de 10% a cerca de 99%, ou um aumento de pelo me- nos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pe- lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, ou pelo menos 200%, ou mais de uma quantidade ou uma fun- ção ou uma atividade, tal como, mas não limitada a função ou ativida- de de polipeptídeo, função ou atividade transcricional e/ou expressão de polipeptídeo. O termo "aumentado", ou a expressão "uma quanti- dade aumentada" pode se referir a uma quantidade ou uma função ou uma atividade em uma planta de tabaco modificada ou um produto de tabaco gerado a partir da planta de tabaco modificada que é que me- nor do que o que seria encontrado em uma planta de tabaco ou um produto de tabaco da mesma variedade de planta processada da mesma maneira, que não foi modificada. Portanto, em alguns contex- tos, uma planta do tipo selvagem da mesma variedade que foi proces- sada da mesma forma é usada como controle para medir se um au- mento na quantidade é obtido.

[0063] O termo "diminuir" ou "diminuído", conforme usado neste documento, refere-se a uma redução de cerca de 10% a cerca de 99%, ou uma redução de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo me- nos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pe- lo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 100%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 200% mais de uma quantidade ou uma função, tal como função de polipeptí- deo, função transcricional, ou expressão de polipeptídeo. O termo "re- duzido", ou a expressão "uma quantidade reduzida" pode se referir a uma quantidade ou uma função em uma planta modificada ou produto gerado da planta modificada que é menor do que o que seria encon- trado em uma planta ou produto da mesma variedade da planta pro- cessada na mesma maneira, que não foi modificada. Portanto, em al- guns contextos, uma planta do tipo selvagem da mesma variedade que foi processada na mesma maneira é usada como um controle pa- ra medir se uma redução na quantidade é obtida.

[0064] O termo "inibir" ou "inibido" se refere a uma redução de cerca de 98% a cerca de 100%, ou uma redução de pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas particularmente de 100%, de uma quantidade ou uma função ou uma atividade, tal como, mas não se limitada à fun- ção ou atividade de polipeptídeo, função ou atividade transcricional e/ou expressão de polipeptídeo.

[0065] O termo "introduzido" significa fornecer um polinucleotídeo (por exemplo, um construto) ou polipeptídeo em uma célula. Introduzi- do inclui referência à incorporação de um polinucleotídeo em uma cé- lula eucariótica na qual o polinucleotídeo pode ser incorporado no ge- noma da célula, e inclui referência à provisão transitória de um polinu- cleotídeo ou polipeptídeo para a célula. Introduzido inclui referência aos métodos de transformação estável ou transitórios, assim como cruzamentos sexual. Portanto, "introduzido" no contexto da inserção de um polinucleotídeo (por exemplo, um construto recombinan- te/construto de expressão) em uma célula, significa "transfecção" ou "transformação" ou "transdução" e inclui a referência à incorporação de um fragmento de ácido nucleico em uma célula eucariótica em que o fragmento de ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou DNA mito- condrial), convertido em um replicon autônomo ou expresso transitori- amente (por exemplo, mRNA transfectado).

[0066] Os termos "isolado" ou "purificado" se referem ao material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham como encontrado em seu estado nativo. Pureza e homogeneidade são normalmente determinadas usando téc- nicas de química analítica tal como eletroforese em gel de poliacrila- mida ou cromatografia líquida de alta performance. Um polipeptídeo que é a espécie predominante presente em uma preparação é subs- tancialmente purificado. Em particular, um polinucleotídeo isolado é separado de quadros de leitura abertos que flanqueiam o gene dese- jado e codificam polipeptídeos diferentes do polipeptídeo desejado. O termo "purificado", conforme usado neste documento, denota que um polinucleotídeo ou polipeptídeo dá origem a essencialmente uma ban- da em um gel eletroforético. Particularmente, isso significa que o poli- nucleotídeo ou polipeptídeo é pelo menos 85% puro, mais preferenci- almente, pelo menos 95% puro e, mais preferencialmente, pelo menos 99% puro. Os polinucleotídeos isolados podem ser purificados de uma célula hospedeira em que ocorrem naturalmente. Os métodos de puri- ficação de polinucleotídeos convencionais conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para obter os polinucleotídeos isolados. O termo também abrange polinucleotídeos recombinantes e polinucle- otídeos quimicamente sintetizados.

[0067] "Modular" ou "modulação" refere-se a causar ou facilitar uma mudança, alteração ou modificação qualitativa ou quantitativa em um processo, via, função ou atividade de interesse. Sem limitação, tal mudança, alteração ou modificação pode ser um aumento ou diminui- ção no processo, via, função ou atividade de interesse relativos. Por exemplo, a expressão genética ou expressão de polipeptídeo ou fun- ção ou atividade de polipeptídeo pode ser modulada. Normalmente, a mudança, alteração, ou modificação será determinada por compara- ção a um controle.

[0068] "Via de união de extremidades não homólogas (NHEJ)" conforme usada aqui refere-se a uma via que repara as quebras de fita dupla no DNA mediante ligação direta das extremidades de quebra sem a necessidade de um modelo homólogo. A religação independen- te de modelo das extremidades do DNA por NHEJ é um processo de reparo propenso a erro, estocástico, que introduz microinserções alea- tórias e microdeleções (indels) no ponto de interrupção de DNA. Esse método pode ser usado para interromper, excluir ou alterar intencio- nalmente o quadro de leitura das sequências de genes alvo. NHEJ normalmente usa sequências de DNA homólogas curtas chamadas micro-homologias para orientar a reparação. Essas micro-homologias estão muitas vezes presentes em overhangs de fita única na extremi- dade das quebras de fita dupla. Quando os overhangs forem perfeita- mente compatíveis, NHEJ geralmente repara a quebra com precisão, ainda reparação imprecisa, levando à perda de nucleotídeos pode também ocorrer, mas é muito mais comum quando os overhangs não são compatíveis.

[0069] O termo "de ocorrência não natural" descreve uma entida- de, tal como um polinucleotídeo, uma mutação genética, um polipeptí- deo, uma planta, uma célula vegetal e material vegetal, que não é for- mada pela natureza e que não existe na natureza. Tais entidades de ocorrência não natural ou entidades artificiais podem ser feitas, sinteti- zadas, iniciadas, modificadas, adulteradas ou manipuladas por méto- dos descritos aqui, ou que são conhecidos no âmbito da técnica. Tais entidades de ocorrência não natural ou entidades artificiais podem ser feitas, sintetizadas, iniciadas, modificadas, adulteradas ou manipula- das por humanos. Assim, a titulo de exemplo, uma planta de ocorrên- cia não natural, uma célula vegetal de ocorrência não natural, ou mate- rial vegetal de ocorrência não natural podem ser feitos usando-se téc- nicas tradicionais de criação de plantas - como retrocruzamento - ou por técnicas de manipulação genética - tais como RNA antissenso, RNA de interferência, meganuclease e semelhantes. A título de exem-

plo adicional, uma planta de ocorrência não natural, uma célula vegetal de ocorrência não natural, ou material vegetal de ocorrência não natu- ral podem ser produzidos mediante introgressão de ou transferência de uma ou mais mutações genéticas (por exemplo, um ou mais poli- morfismos) de uma primeira planta ou célula vegetal a uma segunda planta ou célula vegetal (que pode ser, ela própria, de ocorrência natu- ral), de modo que a planta, célula vegetal ou material vegetal resultan- te, ou progênie das mesmas compreendam uma constituição genética (por exemplo, um genoma, um cromossomo ou segmento do mesmo) que não é formado pela natureza e que não existe na natureza. A planta, célula vegetal ou material vegetal resultantes são, portanto, artificiais ou de ocorrência não natural. Em conformidade a isso, uma planta ou célula vegetal artificial ou de ocorrência não natural pode ser produzida modificando-se uma sequência genética em uma primeira planta ou célula vegetal de ocorrência natural, ainda que a sequência genética resultante ocorra naturalmente em uma segunda planta ou célula vegetal que compreende background genético diferente da pri- meira planta ou célula vegetal. Em certas modalidades, uma mutação não é uma mutação de ocorrência natural que existe naturalmente em um polinucleotídeo ou polipeptídeo, tal como um gene ou um polipep- tídeo. Diferenças de background genético podem ser detectadas por diferenças fenotípicas ou por técnicas de biologia molecular conheci- das na técnica, tais como sequenciamento de polinucleotídeos, pre- sença ou ausência de marcadores genéticos (por exemplo, marcado- res de RNA microssatélites).

[0070] Os "oligonucleotídeo" ou "polinucleotídeo" significa pelo menos dois nucleotídeos covalentemente ligados entre si. A represen- tação de uma única fita também define a sequência da fita comple- mentar. Portanto, um polinucleotídeo também engloba a fita comple- mentar de uma única fita retratada. Muitas variantes de um polinucleo-

tídeo podem ser usadas para a mesma finalidade que um determinado polinucleotídeo. Assim, um ácido nucleico também engloba os ácidos nucleicos substancialmente idênticos e complementos destes. Uma única fita fornece uma sonda que pode se hibridizar para uma sequên- cia alvo sob condições de hibridização rigorosas. Portanto, um polinu- cleotídeo também engloba uma sonda que hibridiza sob circunstâncias da hibridização rigorosas. Os polinucleotídeos podem ser de fita única ou fita dupla ou podem conter porções de ambas a sequência de fita dupla e fita única. O polinucleotídeo pode ser DNA, ambos de genômi- co e cDNA, RNA ou híbrido, em que os polinucleotídeo podem conter combinações de desoxirribo- e ribonucleotídeos e combinações de ba- ses incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, hi- poxantina xantina, isocitosina e isoguanina. Os polinucleotídeos po- dem ser obtidos por métodos de síntese química ou por métodos de recombinação.

[0071] A especificidade do DNA de fita única para hibridizar os fra- gmentos complementares é determinada pela "rigorosidade" das con- dições de reação (Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor (1989)). A rigorosidade de hibridização aumenta à medida que a propensão para formar DNA duplex diminui. Em reações de hibridização de polinucleotídeo, o rigor pode ser escolhido para favorecer a hibridações específicas (alta rigo- rosidade), que pode ser usada para identificar, por exemplo, clones de comprimento total de uma biblioteca. A hibridização menos específico (baixa rigorosidade) pode ser usada para identificar moléculas ou segmentos de DNA relacionadas, mas não exatas (homólogas, mas não idênticas). Os duplexes de DNA são estabilizados por: (1) o núme- ro de pares de bases complementares; (2) o tipo de pares de bases; (3) concentração de sal (força iônica) da mistura de reação; (4) a tem- peratura da reação; e (5) a presença de certos solventes orgânicos,

tais como formamida, que diminuem a estabilidade de duplex de DNA. Em geral, quanto mais a sonda, maior a temperatura necessária para anelamento adequado. É uma abordagem comum para variar a tempe- ratura; temperaturas mais altas relativas resultam em condições mais rigorosas de reação. Hibridizar sob "condições rigorosas" descreve protocolos de hibridação nos quais sequências de polinucleotídeos pelo menos 60% homólogo um ao outro permanecem hibridizadas. Geralmente, as condições rigorosas são selecionadas para estar a cerca de 5°C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos. O Tm é a temperatura (sob definida força iônica, pH e concentração de polinu- cleotídeo) em que 50% das sondas complementares à determinada sequência alvo hibridizam a determinada sequência alvo em equilíbrio. Uma vez que as determinadas sequências alvo estão geralmente pre- sentes em excesso, em Tm, 50% das sondas estão ocupadas no es- tado de equilíbrio.

[0072] As "condições hibridização rigorosas" são condições que permitem uma sonda, iniciador ou oligonucleotídeo para hibridizar apenas à sua sequência específica. As condições rigorosas são de- pendentes da sequência e serão diferentes. As condições rigorosa normalmente incluem: (1) baixa força iônica e lavagens de alta tempe- ratura, por exemplo, cloreto de sódio a 15 mM, citrato de sódio a 1,5 mM, sulfato de dodecil de sódio a 0,1%, a 50°C; (2) um agente de desnaturação durante hibridização, por exemplo, formamida a 50% (v/v), albumina de soro bovino a 0,1%, Ficoll a 0,1%, polivinilpirrolidona a 0,1%, tampão de fosfato de sódio a 50 mM (cloreto de sódio a 750 mM, citrato de sódio a 75 mM, pH 6,5), a 42 °C; ou (3) formamida a 50%. As lavagens normalmente também compreendem 5xSSC (NaCl a 0,75 M, citrato de sódio a 75 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, solução de 5xDenhardt, DNA de es-

perma de salmão lisado (50 µg/mL), SDS a 0,1% e sulfato de dextrano a 10% a 42 °C, com uma lavagem a 42 °C em 0,2xSSC (citrato de só- dio/cloreto de sódio) e formamida a 50% a 55 °C, seguido por uma la- vagem de alto rigorosidade consistindo em 0,1xSSC contendo EDTA a 55 °C. Apropriadamente, as condições são de modo que as sequên- cias de pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% homólogo ao outro normalmente permanecem hibridizadas umas às outras.

[0073] "Condições moderadamente rigorosas" usam soluções de lavagem e condições hibridização que são menos rigorosas, de modo que um polinucleotídeo hibridizará todo, fragmentos, derivados ou aná- logos do polinucleotídeo. Um exemplo compreende hibridização em 6xSSC, solução de 5xDenhardt, SDS a 0,5% e 100 µg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado a 55 °C, seguido de uma ou mais lavagens em 1xSSC, SDS a 0,1% a 37 °C. A temperatura, força iônica, etc., pode ser ajustada para acomodar fatores experimentais tais como o comprimento de sonda. Outras condições de rigorosidade moderada foram descritas (ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Bio- logy, Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J. (1993); Kri- egler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, Nova York, N.Y. (1990); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2ª edição, John Wiley & Sons, Nova York, N.Y. (1988)).

[0074] "Condições de baixa rigorosidade" usam soluções de lava- gem e condições hibridização que são menos rigorosas, de modo que um polinucleotídeo hibridizará todo, fragmentos, derivados ou análo- gos do polinucleotídeo. Um exemplo não limitativo das condições de hibridização de baixa rigorosidade inclui hibridização em formamida a 35%, 5xSSC, Tris HCl a 50 mM(pH 7,5), EDTA a 5 mM, PVP a 0,02%, Ficoll a 0,02%, BSA a 0,2%, 100 µg/mL de DNA de esperma de sal- mão desnaturado, sulfato de dextrano a 10% (p/v) a 40 °C, seguido de uma ou mais lavagens em 2xSSC, Tris HCl a 25 mM (pH 7,4), EDTA a 5 mM e SDS a 0,1% a 50 °C. Outras condições de baixa rigorosidade, tais como aquelas para hibridizações de espécies cruzadas, são bem descritas (ver Ausubel et al., 1993; Kriegler, 1990).

[0075] "Operativamente ligado" significa que a expressão de um gene está sob o controle de um promotor com o qual está conectado espacialmente. Um promotor pode ser posicionado 5' (a montante) ou 3' (a jusante) de um gene sob seu controle. A distância entre o promo- tor e um gene pode ser aproximadamente o mesmo que a distância entre o promotor e o gene que controla no gene do qual o promotor é derivado. Como é conhecido na técnica, a variação nessa distância pode ser acomodada sem perda de função do promotor. "Operativa- mente ligado" refere-se à associação de fragmentos de polinucleotí- deos em um único fragmento, de modo que a função de um seja regu- lada pelo outro. Por exemplo, um promotor é ligado de forma operável a um fragmento de polinucleotídeo quando for capaz de regular a transcrição desse fragmento de polinucleotídeo.

[0076] O termo "planta" refere-se a qualquer planta em qualquer estágio de seu ciclo de vida ou desenvolvimento, e suas progênies. Em uma modalidade, a planta é uma planta de tabaco, que se refere a uma planta pertencente ao gênero Nicotiana. O termo "planta" inclui a referência a plantas inteiras, órgãos vegetais, tecidos vegetais, propá- gulos de plantas, planta células e progênie dos mesmos. As células vegetais incluem, sem limitação, as células das sementes, as culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, calo de tecido, fo- lhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. Es- pécie, cultivares, híbridos apropriados e variedades de planta do taba- co são descritos neste documento.

[0077] "Polinucleotídeo", "sequência de polinucleotídeos", "frag- mento de polinucleotídeos" são usados permutavelmente neste docu-

mento para se referir a um polímero de RNA ou DNA que é de fita úni- ca ou dupla, opcionalmente contendo bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Os nucleotídeos (geralmente encontrados em sua forma de 5'-monofosfato) são referidos pela sua designação de letra única da seguinte forma: "A" para adenilato ou desoxigenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), "C" para citidilato ou desoxiciti- dilato, "G" para guanilato ou desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" pa- ra desoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas (C ou T), "K" para G ou T, "H" para A ou C ou T, "I" para inosina e "N" pa- ra qualquer nucleotídeo. Um polinucleotídeo pode ser, sem limitação, um DNA genômico, DNA complementar (cDNA), RNAm, ou RNA an- tissenso ou fragmento(s) dos mesmos. Além disso, um polinucleotídeo pode ser DNA de fita dupla ou fita simples, DNA que seja uma mistura de regiões de fita simples e fita dupla, uma molécula híbrida que com- preende DNA e RNA, ou uma molécula híbrida com uma mistura de regiões de fita simples e fita dupla ou fragmento(s) destas. Além disso, o polinucleotídeo pode ser composto de regiões de fita tripla compre- endendo DNA, RNA ou ambos ou fragmento(s) dos mesmos. Um poli- nucleotídeo pode conter uma ou mais bases modificadas, tais como fosfotioatos, e pode ser um ácido nucleico peptídeo (PNA). Geralmen- te, os polinucleotídeos podem ser montados a partir de fragmentos iso- lados ou clonados de cDNA, DNA genômico, oligonucleotídeos, ou nu- cleotídeos individuais ou uma combinação dos precedentes. Embora os polinucleotídeos descritos neste documento sejam mostrados como sequências de DNA, os polinucleotídeos incluem suas respectivas se- quências de RNA, e suas sequências complementares de DNA ou RNA (por exemplo, completamente complementares), incluindo os complementos reversos destes. Os polinucleotídeos da presente des- crição estão estabelecidos na listagem de sequência em anexo.

[0078] "Polipeptídeo" ou "sequência de polipeptídeos" se refere a um polímero de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoá- cido são um análogo químico artificial de um aminoácido natural cor- respondente, assim como polímeros de aminoácidos de ocorrência natural. Os termos são também inclusivos de modificações, incluindo, mas não se limitando a, glicosilação, fixação de lipídios, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação. Os polipeptídeos da presente descrição estão esta- belecidos na listagem de sequência em anexo.

[0079] "Promotor" significa uma molécula sintética ou naturalmente derivada que é capaz de conferir, ativando ou aumentando a expres- são de um polinucleotídeo em uma célula. O termo refere-se a um elemento/sequência de polinucleotídeo, tipicamente posicionado a montante e funcionalmente vinculado a um fragmento de polinucleotí- deo de fita dupla. Promotores podem ser derivados inteiramente de regiões próxima a um gene nativo de interesse, ou podem ser compos- tos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores nati- vos ou segmentos de polinucleotídeos sintéticos. Um promotor pode compreender uma ou mais sequências regulatórias transcricionais es- pecíficas para acentuar ainda mais a expressão e/ou alterar a expres- são espacial e/ou expressão temporal do mesmo. Um promotor tam- bém pode compreender elementos potencializadores ou repressores distais, que podem estar localizados tanto quanto vários mil pares de bases do local de início da transcrição. Um promotor pode ser deriva- do de fontes incluindo viral, bacteriana, fungos, plantas, insetos e ani- mais. Um promotor pode regular a expressão de um componente de gene constitutivamente ou diferencialmente em relação à célula, tecido ou órgão em que a expressão ocorre ou, com relação ao estágio de desenvolvimento no qual ocorre a expressão ou em resposta a estímu- los externos tais como estresses fisiológicos, patógenos, íons metáli- cos ou agentes indutores.

[0080] "Promotor tecido-específico" e "promotor tecido-preferido" como usado permutavelmente neste documento referem-se a um pro- motor que se expressa predominantemente, mas não necessariamen- te exclusivamente em um tecido ou órgão, mas que também pode ser expresso em uma célula específica. Um "promotor regulado pelo de- senvolvimento" se refere a um promotor cuja função é determinada pelos eventos de desenvolvimento. Um "promotor constitutivo" se refe- re a um promotor que faz com que um gene seja expresso na maioria dos tipos de células na maioria das vezes. Um "promotor indutor" ex- pressa seletivamente uma sequência de DNA ligada operativamente em resposta à presença de um estímulo endógeno ou exógeno, por exemplo por compostos químicos (indutores químicos) ou em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou de desenvolvimento. Exemplos de promotores induzíveis ou regulados incluem, mas não estão limitados a, promotores regulados pela luz, calor, estresse, inun- dação ou seca, patógenos, fito-hormônios, ferimento ou produtos quí- micos tais como o etanol, jasmonato, ácido salicílico ou agentes de proteção.

[0081] "Recombinante", conforme usado neste documento, refere- se a uma combinação artificial de dois outros segmentos separados da sequência, tal como síntese química ou pela manipulação de segmen- tos isolados de polinucleotídeos por técnicas de engenharia genética. O termo também inclui a referência a uma célula ou vetor, que foi mo- dificada pela introdução de um ácido nucleico heterólogo ou uma célu- la derivada a partir de uma célula tão modificada, mas não abrange a alteração da célula ou vetor pelos eventos de ocorrência natural (por exemplo, mutação espontânea, transformação ou transdução ou transposição natural) tal como os que ocorrem sem intervenção huma- na.

[0082] "Construto recombinante" se refere a uma combinação de polinucleotídeos que não são normalmente encontrados juntos na na- tureza. Por conseguinte, um construto recombinante pode compreen- der sequências reguladoras e sequências que são derivadas a partir de fontes diferentes ou sequências reguladoras e sequências codifi- cantes derivadas da mesma fonte, mas dispostas em uma maneira diferente do que normalmente encontrado na natureza. O construto recombinante pode ser um construto de DNA recombinante.

[0083] "Sequências reguladoras" e "elementos reguladores", con- forme usados permutavelmente neste documento, referem sequências de nucleotídeo localizadas a montante (sequências não codificantes 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificantes 3') de uma se- quência de código, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência de codificação associ- ada. As sequências reguladoras podem incluir, mas não estão limita- das a, promotores, sequências líder de tradução, os íntrons e sequên- cias de reconhecimento de poliadenilação. Os termos "sequência regu- latória" e "elemento regulatório" são usados permutavelmente neste documento.

[0084] "Nuclease de sítio específico" se refere a uma enzima ca- paz de especificamente reconhecer e clivar as sequências de DNA. O nuclease de local específico pode ser projetada. Exemplos de nuclea- ses de local específico projetadas incluem nucleases de dedo zinco (ZFNs), nucleases de efetor de TAL (TALENs), sistemas baseados em CRISPR/Cas9 e meganucleases.

[0085] O termo "tabaco" é usado em um sentido coletivo para se referir à plantação de tabaco, (por exemplo, uma pluralidade de plan- tas de tabaco crescidas no campo e tabaco crescido de forma não hi- dropônica) plantas de tabaco e partes desta, incluindo, mas não limita- do a, raízes, caules, folhas, flores e sementes preparados e/ou obti- dos, conforme descrito neste documento. Entende-se que "tabaco" se refere a plantas Nicotiana tabacum e produtos destas.

[0086] O termo "produtos de tabaco" se refere a produtos de taba- co de consumo, incluindo, mas não limitado a, materiais de fumo (por exemplo, cigarros, charutos e tabaco para cachimbo), rapé, tabaco de mascar e pastilhas, assim como componentes, materiais e ingredien- tes para fabricação de produtos de tabaco de consumo. Apropriada- mente, esses produtos de tabaco são fabricados de folhas e caules de tabaco colhidos do tabaco e cortados, secos, curados e/ou fermenta- dos de acordo com técnicas convencionais em preparação de tabaco.

[0087] "Terminador de transcrição", "sequências de terminação" ou "terminador" se referem a sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência de codificação, incluindo sequências de reconheci- mento de poliadenilação e outras sequências que codificam sinais re- guladores capazes de afetar o processamento de mRNA ou expressão gênica. O sinal de poliadenilação é geralmente caracterizado afetando- se a adição do ácido poliadenílico trata à extremidade de 3' do precur- sor de mRNA.

[0088] "Transgênico" se refere a qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de planta ou planta, o genoma do qual foi alterado pela presença de um polinucleotídeo heterólogo, tais como um cons- truto de DNA recombinante, incluindo aqueles eventos transgênicos iniciais, assim como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou pro- pagação assexuada do evento transgênico inicial. O termo "transgêni- co" não abrange a alteração do genoma (cromossômica ou extra cro- mossômica) por métodos de reprodução de plantas convencionais ou mediante eventos que ocorrem naturalmente tais como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação bac- teriana não recombinante, transposição não recombinante ou mutação espontânea.

[0089] "Planta transgênica" refere-se a uma planta que compreen-

de, dentro de seu genoma, um ou mais polinucleotídeos heterólogos, isto é, uma planta ou uma árvore que contém material genético re- combinante não é normalmente encontrado em plantas ou árvores desse tipo e que foi introduzido na planta em questão (ou em progeni- tores da planta) por manipulação humana. Por exemplo, o polinucleo- tídeo heterólogo estável pode ser integrado de forma estável dentro do genoma de modo que o polinucleotídeo seja passado para as gera- ções sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de um construto recombinante. O de- senvolvimento comercial de germoplasma geneticamente melhorado também avançou para o estágio de introdução de múltiplos traços em plantas de cultivo, muitas vezes referidas como uma abordagem de empilhamento de gene. Nesta abordagem, os múltiplos genes que conferem características diferentes de interesse podem ser introduzi- dos em uma planta. O empilhamento de gene pode ser realizado por muitos meios que incluem, mas não se limitam a, cotransformação, retransformação e cruzamento de linhagens com diferentes transge- nes. Assim, uma planta que é cultivada a partir de uma célula vegetal em que o DNA recombinante é introduzido pela transformação é uma planta transgênica, visto que são todos descendentes da planta que contêm o transgene introduzido (seja produzida sexualmente ou asse- xuadamente). Entende-se que o termo planta transgênica engloba to- da a planta ou árvore e partes da planta ou árvore, por exemplo, grãos, sementes, flores, folhas, raízes, frutos, pólen, caules e seme- lhantes. Cada polinucleotídeo heterólogo pode conferir um traço dife- rente para as plantas transgênicas.

[0090] "Efetor do tipo ativador de transcrição" ou "TALE" se refere a uma estrutura de proteína que reconhece e se liga a uma determina- da sequência de DNA. O "domínio de ligação a DNA de TALE" refere- se a um domínio de ligação a DNA que inclui um arranjo de 33-35 re-

petições de aminoácido em tandem, também conhecido como módulos de RVD, cada um dos quais especificamente reconhece um único par de base de DNA. Os módulos de RVD podem ser dispostos em qual- quer ordem para montar um arranjo que reconhece uma sequência definida. Uma especificidade de ligação de um domínio de ligação a DNA de TALE é determinada pelo arranjo de RVD seguido por uma única repetição truncada de 20 aminoácidos. Um domínio de ligação a DNA de TALE pode ter módulos de RVD de 12 a 27, cada um dos quais contém um RVD e reconhece um único par de base de DNA. RVDs específicos foram identificados que reconhecer cada um dos quatro nucleotídeos de DNA possíveis (A, T, C e G). Devido ao fato de que os domínios de ligação a DNA de TALE são modulares, repete-se que reconhecem os quatro nucleotídeos de DNA diferentes podem es- tar ligados juntos para reconhecer qualquer sequência de DNA deter- minada. Esses domínios ligados a DNA alvo podem, então, ser combi- nados com domínios catalíticos para criar as enzimas funcionais, inclu- indo fatores de transcrição artificial, metiltransferases, integrases, nu- cleases e recombinases.

[0091] "Nucleases com efetor do tipo ativador de transcrição" ou "TALENs" conforme usado permutavelmente neste documento se refe- re a polipeptídeos de fusão projetadas do domínio catalítico de uma nuclease, tal como endonuclease FokI e um domínio de ligação a DNA de TALE projetado pode ser direcionado para uma sequência de DNA personalizada.

[0092] Um "monômero de TALEN" se refere a um polipeptídeo de fusão projetado com um domínio de nuclease catalítico e um domínio de ligação a DNA de TALE projetado. Dois monômeros de TALEN po- dem ser criados para direcionar e clivar uma região alvo de TALEN.

[0093] "Transgene" se refere a um gene ou material genético que contém uma sequência de genes que foi isolada a partir de um orga-

nismo e é introduzida em um organismo diferente. Esse segmento não nativo de DNA pode manter a capacidade de produzir RNA ou polipep- tídeo no organismo transgênico ou pode alterar a função normal do código genético do organismo transgênico. A introdução de um trans- gene tem potencial para alterar o fenótipo de um organismo.

[0094] "Variante" em relação a um polinucleotídeo significa: (i) uma porção ou fragmento de um polinucleotídeo; (ii) o complemento de um polinucleotídeo ou porção dela; (iii) um polinucleotídeo substan- cialmente idêntico a um polinucleotídeo de interesse ou o seu com- plemento; ou (iv) um polinucleotídeo que hibridize sob condições rigo- rosas ao polinucleotídeo de interesse, complemente-o ou um polinu- cleotídeo substancialmente idêntico a ele.

[0095] "Variante" em relação a um peptídeo ou polipeptídeo signi- fica um peptídeo ou polipeptídeo que difere na sequência pela inser- ção, deleção ou substituição conservativa de aminoácidos, mas man- tém pelo menos uma função biológica. Variante também pode signifi- car um polipeptídeo que mantém pelo menos uma função ou atividade biológica. Uma substituição conservativa de um aminoácido, isto é, que repõem um aminoácido com um aminoácido diferente de proprie- dades semelhantes (por exemplo, capacidade hidrofílica, grau e distri- buição de regiões carregadas) é reconhecida na técnica como tipica- mente envolvendo uma pequena mudança.

[0096] O termo "variedade" refere-se a uma população de plantas que têm em comum características constantes que as separam de ou- tras plantas da mesma espécie. Apesar de possuir um ou mais traços distintivos, uma variedade é caracterizada ainda por uma pequeníssi- ma variação geral entre indivíduos dentro desta variedade. Uma varie- dade é frequentemente vendida comercialmente.

[0097] "Vetor" se refere a um veículo de polinucleotídeo que com- preende uma combinação de componentes de polinucleotídeos para permitir o transporte de polinucleotídeos, construtos de polinucleotí- deos e conjugados de polinucleotídeos e semelhantes. Um vetor pode ser um vetor viral, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de levedura. Um vetor pode ser um vetor de DNA ou RNA. Vetores apropriados incluem epissomas capazes de re- plicação extracromossômica, tais como plasmídeos de nucleotídeos de fita dupla; plasmídeos de nucleotídeos de fita dupla linearizados; e ou- tros vetores de qualquer origem. Um "vetor de expressão", conforme usado neste documento, é um veículo de polinucleotídeo que compre- ende uma combinação de componentes de polinucleotídeos para per- mitir a expressão de construtos de polinucleotídeos e conjugados de polinucleotídeos e semelhantes. Vetores de expressão apropriados incluem epissomas capazes de replicação extracromossômica, tais como plasmídeos de nucleotídeos circulares de fita dupla; plasmídeos de nucleotídeos linearizados de fita dupla; e outros vetores de expres- são funcionalmente equivalentes de qualquer origem. Um vetor de ex- pressão compreende pelo menos um promotor posicionado a montan- te e operacionalmente ligado a um polinucleotídeo, construtos de poli- nucleotídeos ou conjugado de polinucleotídeos, conforme definido abaixo.

[0098] "Dedo de zinco" se refere a uma estrutura de polipeptídeo que reconhece e se liga a sequências de DNA. O domínio dedo de zinco é o motivo mais comum de ligação a DNA no proteoma humano. Um dedo de zinco único contém aproximadamente 30 aminoácidos e o domínio normalmente funciona mediante ligação de 3 pares de bases consecutivos do DNA através de interações de uma cadeia lateral de aminoácido única por par de base.

[0099] "Nuclease dedo de zinco" ou "ZFN" se refere a uma molé- cula de proteína quimérica que compreende pelo menos um domínio de ligação a dedo de zinco de DNA efetivamente ligado a pelo menos uma nuclease ou parte de uma nuclease capaz de clivar DNA quando totalmente montada.

[00100] A menos que definido de outra forma neste documento, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente des- crição terão os significados que são comumente entendidos por aque- les de conhecimento comum na técnica. Por exemplo, quaisquer no- menclaturas usadas em conexão com, e técnicas de, célula e cultura de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e produto químico de polipeptídeo e polinucleotídeo e hibridação descri- tos neste documento são aquelas que são conhecidas e usadas na técnica. O sentido e o escopo dos termos devem ser claros; no evento, no entanto, de qualquer ambiguidade latente, definições fornecidas neste documento tomam precedente sobre qualquer dicionário ou de- finição extrínseca. Além disso, a menos que exigido de outro modo pelo contexto, os termos singulares incluirão pluralidades e os termos plurais deverão incluir o singular. Polinucleotídeos

[00101] Em uma modalidade, fornece-se um polinucleotídeo isolado composto, constituído ou essencialmente constituído de uma sequên- cia com pelo menos 60% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências descritas neste documento, incluindo qualquer um dos polinucleotídeos mostrados na listagem de sequência. De for- ma apropriada, o polinucleotídeo isolado compreende, consiste em ou é essencialmente composto de uma sequência tendo pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 96% de 95%, 97%, 98%, 99% ou 100 % de identidade sequencial ao mesmo. Ade- quadamente, o polinucleotídeo(s) descrito neste documento codifica um polipeptídeo ativo AAT que tem pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% ou mais da função ou atividade do polipeptídeo(s) mostrado na listagem de sequência.

[00102] Em outra modalidade, fornece-se um polinucleotídeo com- posto, constituído ou essencialmente constituído por um polinucleotí- deo com pelo menos 80% de identidade sequencial com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15.

[00103] Em outra modalidade, fornece-se um polinucleotídeo que é composto, constituído ou essencialmente constituído por uma sequên- cia de polinucleotídeo com pelo menos 80% de identidade de sequên- cia com SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO: 7.

[00104] Em certas modalidades, fornece-se um polinucleotídeo iso- lado composto, constituído ou essencialmente constituído por uma se- quência com pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

[00105] Apropriadamente, os polipeptídeos isolados são compos- tos, constituídos ou essencialmente constituídos por uma sequência com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de se- quência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO:

15.

[00106] Apropriadamente, os polipeptídeos isolados são compos- tos, constituídos ou essencialmente constituídos por uma sequência com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de se- quência com SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7.

[00107] Apropriadamente, os polipeptídeos isolados são compos- tos, constituídos ou essencialmente constituídos por uma sequência com pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de se- quência com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

[00108] Em outra modalidade, fornecem-se polinucleotídeos com- postos, constituídos ou essencialmente constituídos por polinucleotí- deos com homologia substancial (ou seja, similaridade sequencial) ou identidade substancial com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15.

[00109] Em outra modalidade, fornecem-se polinucleotídeos com- postos, constituídos ou essencialmente constituídos por polinucleotí- deos com homologia substancial (ou seja, similaridade sequencial) ou identidade substancial com SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7.

[00110] Em outra modalidade, fornecem-se polinucleotídeos com- postos, constituídos ou essencialmente constituídos por polinucleotí- deos com homologia substancial (ou seja, similaridade sequencial) ou identidade substancial com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

[00111] Em outra modalidade, são fornecidos fragmentos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15 com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substan- cial com os mesmos que têm pelo menos cerca de 80%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de sequência com os fragmentos cor- respondentes de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15.

[00112] Em outra modalidade, fornecem-se fragmentos de SEQ ID

NO:5 ou SEQ ID NO: 7 com homologia substancial (isto é, similaridade sequencial) ou identidade substancial aos mesmos que têm pelo me- nos cerca de 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de se- quência com os fragmentos correspondentes de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7.

[00113] Em outra modalidade, fornecem-se fragmentos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 com homologia substancial (isto é, similarida- de sequencial) ou identidade substancial aos mesmos que têm pelo menos cerca de 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de se- quência com os fragmentos correspondentes de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

[00114] Em outra modalidade, fornecem-se polinucleotídeos com- preendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou simila- ridade com a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7 que codifica um polipep- tídeo que funciona como uma AAT.

[00115] Em outra modalidade, fornecem-se polinucleotídeos com- preendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou simila- ridade com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 que codifica um polipep- tídeo que funciona como uma AAT.

[00116] Em outra modalidade, fornecem-se polinucleotídeos com- preendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou simila- ridade com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15 que codificam um polipeptídeo que funciona como uma AAT.

[00117] Em outra modalidade, fornecem-se polinucleotídeos com- preendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou simila-

ridade com a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7 que codifica um polipep- tídeo que funciona como uma AAT.

[00118] Em outra modalidade, fornecem-se polinucleotídeos com- preendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou simila- ridade com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 que codifica um polipep- tídeo que funciona como uma AAT.

[00119] Em outra modalidade, fornece-se um polímero de polinu- cleotídeos composto, constituído ou essencialmente constituído por um polinucleotídeo projetado neste documento como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15.

[00120] Em outra modalidade, fornece-se um polímero de polinu- cleotídeos composto, constituído ou essencialmente constituído por um polinucleotídeo projetado neste documento como SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7.

[00121] Em outra modalidade, fornece-se um polímero de polinu- cleotídeos composto, constituído ou essencialmente constituído por um polinucleotídeo projetado neste documento como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

[00122] Apropriadamente, os polinucleotídeos descritos neste do- cumento codificam um polipeptídeo AAT.

[00123] Conforme descrito neste documento, NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) são os genes mais expressos após 48 horas de cura em comparação com o tabaco verde. O nível de expressão pode ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 vezes maior do que o do tabaco verde. O uso de NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) é preferido em certas modalidades da presente des- crição. Um polinucleotídeo pode incluir um polímero de nucleotídeos, que pode ser ácido desoxirribonucleico modificado ou não modificado (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA). Por conseguinte, um polinucleotí-

deo pode ser, sem limitação, um DNA genômico, DNA complementar (cDNA), mRNA, ou RNA antissenso ou fragmento(s) dos mesmos. Além disso, um polinucleotídeo pode ser DNA de fita dupla ou fita úni- ca, DNA que seja uma mistura de regiões de fita única e fita dupla, uma molécula híbrida que compreende DNA e RNA, ou uma molécula híbrida com uma mistura de regiões de fita única e fita dupla ou frag- mento(s) das mesmas. Além disso, o polinucleotídeo pode ser com- posto de regiões de fita tripla compreendendo DNA, RNA ou ambos ou fragmento(s) dos mesmos. Um polinucleotídeo pode conter uma ou mais bases modificadas, tais como fosfotioatos, e pode ser um ácido nucleico peptídeo. Geralmente, os polinucleotídeos podem ser monta- dos a partir de fragmentos isolados ou clonados de cDNA, DNA genô- mico, oligonucleotídeos, ou nucleotídeos individuais ou uma combina- ção dos precedentes. Embora as sequencias de polinucleotídeos des- critas neste documento sejam representadas como sequências de DNA, elas incluem suas respectivas sequências de RNA, e suas se- quências complementares de DNA ou RNA (por exemplo, completa- mente complementares), incluindo os complementos reversos destes.

[00124] Um polinucleotídeo geralmente conterá ligações fosfodiés- ter, ainda que em alguns casos sejam incluídos análogos de polinucle- otídeos que podem ter estruturas diferentes, compreendendo, por exemplo, fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, ou ligações de O-metilfosforoamidita; e estruturas e ligações de polinucleotídeos de peptídeos. Outros polinucleotídeos análogos incluem aqueles com es- truturas principais positivas; estruturas principais não iônicas e estrutu- ras principais de não-ribose. Modificações da estrutura ribose-fosfato podem ser realizadas por uma gama de motivos, por exemplo, para aumentar a estabilidade e meia-vida de tais moléculas em ambientes fisiológicos ou como sonda em um biochip. Misturas de polinucleotí- deos de ocorrência natural e análogos podem ser realizadas: alternati-

vamente, misturas de diferentes análogos de polinucleotídeos, e mistu- ras de polinucleotídeos de ocorrência natural e análogos podem ser realizadas.

[00125] Conhece-se uma variedade de análogos de polinucleotí- deos, incluindo, por exemplo, fosforamidato, fosforotioato, fosforoditio- ato, ligações de O-metilfosforoamidita e estruturas e ligações de poli- nucleotídeos de peptídeos. Outros polinucleotídeos análogos incluem aqueles com estruturas principais positivas, estruturas principais não iônicas e estruturas principais de não ribose. Polinucleotídeos conten- do um ou mais açúcares carbocíclicos são igualmente incluídos.

[00126] Outros análogos incluem polinucleotídeos de peptídeo que são análogos de polinucleotídeo de peptídeo. Estas estruturas são substancialmente não iônicas sob condições neutrais, em contraste à estrutura de fosfodiéster altamente carregada de polinucleotídeos de ocorrência natural. Isto pode resultar em vantagens. Primeiro, a estru- tura de polinucleotídeo de peptídeo pode exibir cinética de hibridização aumentada. Polinucleotídeos de peptídeos têm maiores mudanças de temperatura de fusão para pares de base não correspondentes versus perfeitamente correspondentes. DNA e RNA tipicamente exibem uma queda na temperatura de fusão de 2-4 °C para não correspondência interna. Com a estrutura de polinucleotídeo de peptídeo não iônica, a queda é mais perto de 7-9 °C. Similarmente, devido à sua natureza não iônica, a hibridização das bases anexadas a essas estruturas é relativamente insensível a concentrações de sal. Além disso, polinu- cleotídeos de peptídeo podem não ser degradados ou degradados a um menor grau por enzimas celulares, podendo ser, portanto, mais estáveis.

[00127] Entre os usos dos polinucleotídeos divulgados, e fragmen- tos destes, encontra-se o uso de fragmento como sondas em ensaios de hibridização de ácido nucleico ou iniciadores para uso em ensaios de amplificação de ácido nucleico. Tais fragmento geralmente com- preendem pelo menos cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais nucleotídeos contíguos de uma sequência de DNA. Em outras modalidades, um fragmento de DNA compreende pelo menos cerca de 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou 60 ou mais nucleotídeos contíguos de uma sequência de DNA. Portanto, em um aspecto, fornece-se tam- bém um método para detectar um polinucleotídeo compreendendo o uso das sondas ou iniciadores ou ambos. Promotores exemplificativos encontram-se descritos neste documento.

[00128] Os parâmetros básicos que influenciam na escolha das condições de hibridização e orientação para reconhecer condições adequadas são descritos por Sambrook, J., E. F. Fritsch, e T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Usando o conhecimento do código genético em combinação com as sequências de polipeptí- deos descritas neste documento, conjuntos de oligonucleotídeos de- generados podem ser preparados. Tais oligonucleotídeos são úteis como iniciadores, por exemplo, em reações em cadeia de polimerase (PCR), mediante as quais fragmentos de DNA são isolados e amplifi- cados. Em determinadas modalidades, iniciadores degenerados po- dem ser usados como sondas para bibliotecas genéticas. Tais bibliote- cas incluem bibliotecas de cDNA, bibliotecas genômicas e até mesmo bibliotecas de DNA ou marcadores de sequência expressa eletrônicos. Sequências homólogas identificadas por este método seriam então utilizadas como sondas para identificar homólogos das sequências identificadas nas mesmas.

[00129] Também de uso potencial são polinucleotídeos e oligonu- cleotídeos (por exemplo, sondas e iniciadores) que hibridizam-se sob condições de rigorosidade reduzidas, condições normalmente mode- radamente rigorosas, e condições comumente altamente rigorosas aos polinucleotídeos, tais como descritos neste documento. Os parâmetros básicos que influenciam na escolha das condições de hibridização e aconselhamentos no sentido de reconhecer condições adequadas são estabelecidos por Sambrook, J., E. F. Fritsch, e T. Maniatis (1989, Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. e podem ser prontamente determina- dos por aqueles moderadamente versados na técnica com base, por exemplo, no comprimento ou composição da base do polinucleotídeo.

[00130] Uma maneira de alcançar condições de moderada a alta- mente rigorosas são definidas neste documento. Deve-se entender que a temperatura de lavagem e a concentração de sal de lavagem podem ser ajustadas conforme o necessário, de modo a atingir-se o grau desejado de rigorosidade, aplicando-se os princípios básicos que regem as reações de hibridização e estabilidade duplex, como sabido por aqueles versados na técnica e descrito com mais detalhes abaixo (ver, por exemplo, Sambrook, J., E. F. Fritsch, e T. Maniatis (1989, Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). Ao hibridizar-se um polinucleotídeo a um polinucleotídeo de sequência desconhecia, o comprimento do hí- brido é assumido como sendo o mesmo do polinucleotídeo hibridizan- te. Quando polinucleotídeos de sequência conhecida são hibridizados, o comprimento do híbrido pode ser determinado alinhando-se as se- quências dos polinucleotídeos e identificando-se a região ou regiões de complementaridade sequencial ideal. A temperatura de hibridização para híbridos que supostamente têm comprimento de menos de 50 pares de base deve ser de 5 a 10 menor que a temperatura de fusão do híbrido, em que a temperatura de fusão é determinada em confor- midade com as seguintes equações. Para híbridos com menos de 18 pares de base de comprimento, temperatura de fusão (°C)=2(número de bases A+T)+4(número de bases G+C). Para híbridos com mais de

18 pares de base de comprimento, temperatura de fusão (°C)=81,5+16,6(log10[Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), onde N é o núme- ro de bases no híbrido, e [Na+] é a concentração de íons de sódio no tampão de hibridização ([Na+] para 1x Citrato de Sódio Pa- drão=0,165M). Normalmente, cada um destes polinucleotídeos de hi- bridização tem um comprimento que é pelo menos 25% (geralmente pelo menos 50%, 60%, ou 70% e mais comumente pelo menos 80%) do comprimento de um polinucleotídeo ao qual ele se hibridiza, e tem pelo menos 60% de identidade sequencial (por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) com um polinucleotídeo com o qual ele se hibridiza.

[00131] Conforme será compreendido pelo indivíduo versado na técnica, um DNA linear tem duas orientações possíveis: o sentido 5'-a- 3' e o sentido 3'-a-5'. Por exemplo, se uma primeira sequência de refe- rência for posicionada no sentido 5'-a-3', e se uma segunda sequência for posicionada no sentido 5'-a-3' dentro da mesma fita/molécula de polinucleotídeo, então a primeira sequência de referência e a segunda sequência são orientadas no mesmo sentido, ou têm a mesma orien- tação. Normalmente, uma sequência promotora e um gene de interes- se sob a regulação de um dado promotor são posicionados na mesma direção. No entanto, com relação a uma primeira sequência posiciona- da no sentido 5'-a-3', e se uma segunda sequência for posicionada no sentido 3'-a-5' dentro da mesma fita/molécula de polinucleotídeo, en- tão a primeira sequência e a segunda sequência são orientadas no sentido antissenso, ou têm orientação antissenso. Duas sequências com orientações antissenso em relação uma à outra podem ser alter- nativamente descritas como tendo a mesma orientação, se a primeira sequência (sentido 5'-a-3') e a sequência complementar reversa da primeira sequência (primeira sequência posicionada em 5'-a-3') são posicionados dentro da mesma molécula/fita de polinucleotídeo. As sequências estabelecidas aqui são mostradas no sentido 5'-a-3'.

[00132] Pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5)NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7)NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1)NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3)NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9)NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11)NtAAT4-S (SEQ ID NO: 13) e NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15).

[00133] Em certas modalidades, pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5) e NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7).

[00134] Em certas modalidades, pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3).

[00135] Em certas modalidades, pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3).

[00136] Em certas modalidades, pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) enquanto um ou mais de NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 13) e NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15) não incluir modificações (por exemplo, mu- tação(ões)).

[00137] Em certas modalidades, pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) enquanto NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 13) e NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15) ) não incluir modificações (por exemplo, muta- ção(ões)).

Polipeptídeos

[00138] Em outro aspecto, fornece-se um polipeptídeo isolado com- posto, constituído ou essencialmente constituído por um polipeptídeo com pelo menos 60% de identidade sequencial com qualquer um dos polipeptídeos descritos neste documento, incluindo qualquer um dos polipeptídeos mostrados na listagem de sequência. De forma apropri- ada, o polipeptídeo isolado compreende, consiste em ou é essencial- mente composto de uma sequência tendo pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%,

99.9% ou 100% de identidade sequencial aos mesmos.

[00139] Em uma modalidade, é fornecido um polipeptídeo codifica- do por qualquer um dos polinucleotídeos descritos neste documento, incluindo um polinucleotídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO:

15.

[00140] Em outra modalidade, fornece-se um polipeptídeo isolado composto, constituído ou essencialmente constituído por uma sequên- cia com pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de se- quência com SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12.

[00141] Em outra modalidade, fornece-se um polipeptídeo isolado composto, constituído ou essencialmente constituído por uma sequên- cia com pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,

93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

[00142] Em outra modalidade, fornece-se um polipeptídeo isolado composto, constituído ou essencialmente constituído por uma sequên- cia com pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8.

[00143] Em outra modalidade, fornece-se um polipeptídeo isolado composto, constituído ou essencialmente constituído por uma sequên- cia com pelo menos 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID No: 8; pelo menos 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de se- quência com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID No: 4; ou pelo menos 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16.

[00144] O polipeptídeo pode incluir as sequências que compreen- dem um grau suficiente ou substancial de identidade ou similaridade a SEQ ID NO: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 para funcionar como uma AAT. O polipeptídeo pode incluir as sequências compreendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou similaridade com SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8 para funcionar como uma AAT. O polipep- tídeo pode incluir as sequências compreendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou similaridade com SEQ ID NO: 2 ou

SEQ ID NO: 4 para funcionar como uma AAT. Os fragmentos dos poli- peptídeos tipicamente mantêm parte ou toda a função ou atividade de AAT da sequência completa.

[00145] Conforme descrito neste documento, NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) são os genes mais expressos após 48 horas de cura em comparação com o tabaco verde. O nível de expressão pode ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 vezes maior do que o do tabaco verde. O uso de NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) é preferido em certas modalidades da presente des- crição. Conforme discutido neste documento, os polipeptídeos também incluem mutantes produzidos pela introdução de qualquer tipo de alte- ração (por exemplo, inserções, deleções ou substituições de aminoá- cidos; modificações em etapas de glicosilação; modificações que afe- tam o redobramento ou isomerizações, estruturas tridimensionais, ou etapas de autoassociação), que podem ser deliberadamente modifica- das ou naturalmente isoladas, contanto que ainda mantenham parte ou toda a sua função ou atividade. Apropriadamente, esta função ou atividade é modulada.

[00146] Uma deleção se refere à remoção de um ou mais aminoá- cidos de um polipeptídeo. Uma inserção refere-se a um ou mais resí- duos de aminoácidos serem introduzidos em um local predeterminado em um polipeptídeo. Inserções podem compreender inserções intras- sequência de aminoácidos individuais ou múltiplos. Uma substituição refere-se à substituição de aminoácidos do polipeptídeo por outros aminoácidos com propriedades similares (tais como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão a formar ou romper estrutu- ras de alfa-hélices ou estruturas de folhas beta). As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos individuais, mas podem ser também reunidos, dependendo de restrições funcionais colocadas so- bre o polipeptídeo e podem variar de cerca de 1 a cerca de 10 amino-

ácidos. As substituições de aminoácido são, preferivelmente, substitui- ções conservadoras de aminoácidos, tal como descrito abaixo. As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos podem ser de- sempenhadas usando-se técnicas sintéticas de peptídeos - tais como síntese de peptídeo em fase sólida, ou por manipulação de DNA re- combinante. Métodos para a manipulação de sequências de DNA para produzir variantes de substituição, inserção ou deleção de um polipep- tídeo são bem conhecidos na técnica. A variante pode ter alterações que produzem uma mudança silenciosa e resultam em um polipeptí- deo funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácidos delibe- radas podem ser realizadas com base em uma similaridade em polari- dade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e a natureza anfipática dos resíduos, contanto que a atividade secundária de liga- ção da substância seja mantida. Por exemplo, aminoácidos negativa- mente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoá- cidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e aminoáci- dos com grupos polares de cabeça com valores de hidrofilicidade simi- lares incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina. Substituições con- servadoras podem ser realizadas, por exemplo, segundo a Tabela abaixo. Aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e, preferen- cialmente, na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos um pelo outro: ALIFÁTICO Não polar Gly Ala Pro Ile Leu Val Polar - não carregado Cys Ser Thr Met Asn Gly Polar - carregado Asp Glu Lys Arg AROMÁTICO His Phe Trp Tyr

[00147] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo maduro ou um polipeptídeo imaturo ou um polipeptídeo derivado de um polipeptídeo imaturo. Os polipeptídeos podem encontrar-se em forma linear ou po- dem ser ciclizados usando-se métodos conhecidos. Os polipeptídeos compreendem tipicamente pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30 ou pelo menos 40 aminoácidos contíguos.

[00148] Pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2), NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4), NtAAT3-S (SEQ ID NO: 10), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 14) e NtAAT4-T (SEQ ID NO: 16).

[00149] Em certas modalidades, pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4),

[00150] Em certas modalidades, pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6) e NtAAT1-T T (SEQ ID NO: 8),

[00151] Em certas modalidades, pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4).

[00152] Em certas modalidades, pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4) enquanto uma ou mais de NtAAT3-S (SEQ ID NO: 10), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 14) e NtAAT4-T (SEQ ID NO: 16) não incluem modificações (por exemplo, mutação(ões)).

[00153] Em certas modalidades, pelo menos uma modificação (por exemplo, mutação) pode ser incluída em uma ou mais de NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4) enquanto NtAAT3-S (SEQ ID NO: 10),

NtAAT3-T (SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 14) e NTAAT4-T (SEQ ID NO: 16) não incluem modificações (por exemplo, muta- ção(ões)). Modificação das Plantas a. Transformação

[00154] Construtos recombinantes podem ser usados para trans- formar plantas ou células vegetais de modo a modular expressão, fun- ção ou atividade de polipeptídeos. Um construto recombinante de poli- nucleotídeos com compreender um polinucleotídeo codificando um ou mais polinucleotídeos descritos aqui, funcionalmente ligados a uma região reguladora adequada à expressão do polipeptídeo. Portanto, um polinucleotídeo pode compreender uma sequência de codificação que codifica um polipeptídeo tal como descrito aqui. Plantas ou células vegetais em que a expressão, função ou atividade de polipeptídeos são moduladas podem incluir plantas mutantes, plantas de ocorrência não natural, plantas ou células vegetais transgênicas, artificiais ou ge- neticamente projetadas. Apropriadamente, a planta ou célula vegetal transgênica compreende um genoma que foi alterado pela integração estável do DNA recombinante. O DNA recombinante inclui DNA que foi geneticamente modificado e construído fora de uma célula e inclui DNA que contém DNA de ocorrência natural ou cDNA ou DNA sintéti- co. Uma planta transgênica pode incluir uma planta regenerada a partir de uma célula vegetal originalmente transformado e plantas transgêni- cas de progênie de gerações posteriores ou cruzas de uma planta transformada. Apropriadamente, a modificação transgênica altera a expressão ou função ou atividade do polinucleotídeo ou o polipeptídeo descrito neste documento em comparação com uma planta controle.

[00155] O polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo recombi- nante pode ser um polipeptídeo nativo, ou pode ser heterólogo à célu- la. Em alguns casos, o construto recombinante contém um polinucleo-

tídeo que modula expressão, funcionalmente ligado a uma região re- guladora. Exemplos de regiões reguladoras apropriadas são descritos aqui.

[00156] Vetores contendo construtos de polinucleotídeo tais como aqueles descritos aqui são também divulgados. Estruturas de vetor adequadas incluem, por exemplo, aquelas rotineiramente usadas na técnica, como plasmídeos, vírus, cromossomos artificiais, cromosso- mos bacterianos artificiais, cromossomos artificiais de fermento, ou cromossomos artificiais bacteriófagos. Vetores de expressão adequa- dos incluem, sem limitação, plasmídeos e vetores virais derivados de, por exemplo, bacteriófagos, baculovírus e retrovírus. Numerosos veto- res e sistemas de expressão encontram-se comercialmente disponí- veis.

[00157] Os vetores podem incluir, por exemplo, origens de replica- ção, regiões de anexação por andaime, ou marcadores. Um gene marcador pode conferir um fenótipo selecionável em uma célula vege- tal. Por exemplo, um marcador pode conferir resistência biocida, tal como resistência a um antibiótico (por exemplo, canamicina, G418, bleomicina ou higromicina), ou um herbicida (por exemplo, o glifosato, chlorsulfuron ou fosfinotricina). Além disso, um vetor de expressão po- de incluir uma sequência de marcador projetada para facilitar a mani- pulação ou detecção (por exemplo, purificação ou localização) do poli- peptídeo expresso. Sequências de marcador, tais como sequências de luciferase, beta-glucuronidase, polipeptídeo verde fluorescente, gluta- tiona, S-transferase, polistidina, c-myc ou hemaglutinina tipicamente são expressas como fusão com o polipeptídeo codificado. Tais marca- dores podem ser inseridos em qualquer lugar dentro dos limites do po- lipeptídeo, incluindo no terminal carboxila ou amino.

[00158] A planta ou célula vegetal podem ser transformadas fazen- do com que o polinucleotídeo recombinante integrado ao seu genoma para tornar-se estavelmente transformada. A planta ou a célula vegetal descrita aqui podem ser estavelmente transformadas. Células esta- velmente transformadas tipicamente retêm o polinucleotídeo introduzi- do a cada divisão celular. Uma planta ou célula vegetal pode ser tran- sitoriamente transformada de modo que o polinucleotídeo recombinan- te não seja integrado ao seu genoma. Células transitoriamente trans- formadas tipicamente perdem todo o polinucleotídeo recombinante in- troduzido, ou alguma porção do mesmo, a cada divisão celular, de modo que o polinucleotídeo recombinante introduzido não pode ser detectado em células filhas após um número suficiente de divisões ce- lulares.

[00159] Uma série de métodos estão disponíveis na técnica para transformar uma célula vegetal, incluindo biolística, técnicas de injeção de gene, transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vetores virais, método de congelamento, bombardeio de micropartículas, absorção direta de DNA, sonicação, microinjeção, transferência mediada por vírus vegetais e eletroporação. O sistema Agrobacterium para integração de DNA estrangeiro em cromossomos vegetais já foi extensamente estudado, modificado e explorado para engenharia genética vegetal. Moléculas de DNA recombinante nu que compreendem sequências de DNA correspondentes ao polipeptídeo purificado em questão, funcionalmente ligada em orientação senso ou antissenso a sequências reguladoras, são vinculadas a sequências T- DNA apropriadas mediante métodos convencionais. Essas são intro- duzidas nos protoplastos mediante técnicas de polietileno glicol ou técnicas de eletroporação, ambas das quais são padrão. Alternativa- mente, tais vetores compreendendo moléculas de DNA recombinantes que codificam o polipeptídeo purificado em questão são introduzidos em células vivas de Agrobacterium, que em seguida transferem o DNA às células vegetais. A transformação mediante DNA nu sem sequên-

cias de vetor de T-DNA anexadas pode ser efetuada por meio de fu- são de protoplastos com lipossomas contendo DNA ou por meio de eletroporação. O DNA nu não acompanhado por sequências de vetor de T-DNA pode ser igualmente utilizado na transformação de células por meio de microprojéteis inertes de alta velocidade.

[00160] Se uma célula ou tecido em cultura for utilizado como tecido receptor para a transformação, a plantas poderão ser regeneradas a partir de culturas transformadas caso assim se deseja, por técnicas conhecidas a indivíduos versados na técnica.

[00161] A escolha de regiões reguladoras a serem incluías em construtos recombinantes depende de diversos fatores, incluindo, mas não se limitando a, eficiência, seletividade, indutibilidade, nível de ex- pressão desejada e expressão preferencial de tecido ou célula. Para o indivíduo versado na técnica, constitui questão corriqueira modular a expressão de uma sequência de codificação mediante a seleção e po- sicionamento apropriados de regiões reguladores relativas à sequên- cia de codificação. A transcrição de um polinucleotídeo pode ser mo- dulada de maneira similar. Algumas regiões reguladoras apropriadas iniciam a transcrição apenas, ou predominantemente, em certos tipos de células. São conhecidos no âmbito da técnica métodos para identi- ficar e caracterizar regiões reguladores em DNA genômico vegetal.

[00162] Promotores adequados incluem promotores específicos a tecidos reconhecidos por fatores específicos a tecidos presentes em diferentes tecidos ou tipos de célula (por exemplo, promotores especí- ficos a raízes, promotores específicos à injeção, promotores específi- cos a xileno), ou presentes durante diferentes etapas de desenvolvi- mento, ou presentes em resposta a diferentes condições ambientais. Os promotores adequados incluem promotores constitutivos que po- dem ser ativados na maior parte dos tipos de células sem demandar indutores específicos. Exemplos de promotores apropriados para o controle de produção de polipeptídeos RNAi incluem o vírus do mosai- co da couve-flor 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos ou promotores de ubiquitina ou faseolina. Indivíduos versados na técnica são capazes de gerar múltiplas variações de promotores re- combinantes.

[00163] Promotores específicos a tecidos são elementos de contro- le de transcrição que são ativos apenas em células particulares ou te- cidos em momentos específicos ao longo do desenvolvimento da plan- ta, como em tecidos vegetativos ou tecidos reprodutivos. Expressão específica a tecidos pode ser vantajosa, por exemplo, quando a ex- pressão de polinucleotídeos em certos tecidos é preferencial. Exem- plos de promotores específicos a tecidos sob controle de desenvolvi- mento incluem promotores que podem iniciar a transcrição apenas (ou primeiramente apenas) em certos tecidos, tais como tecidos vegetati- vos, por exemplo, raízes ou folhas, ou tecidos reprodutores, tais como frutos, óvulos, sementes, pólen, pistilos, flores ou qualquer tecido em- briônico. Os promotores específicos a tecidos reprodutores podem ser, por exemplo, específicos à antera, específicos a óvulos, específico a embriões, específicos a endosperma, específicos a tegumento, especí- ficos a semente e a revestimento de semente, específicos a pólen, es- pecíficos a pétala, específicos a sépala ou combinações destes.

[00164] Promotores específicos a folhas incluem piruvato, promotor de ortofosfato diquinase (PPDK) de planta C4 (milho), promotor cab- m1Ca+2 do milho, o promoter de gene relacionado a myb Arabidopsis thaliana (Atmyb5), promotores de ribulose-bifosfato carboxilase (RBCS) (por exemplo, os genes de tomate RBCS 1, RBCS2 E RBCS3A expressos em folhas e mudas cultivadas a luz, RBCS1 e RBCS2 expressos em frutos de tomate em desenvolvimento ou pro- motor de ribulose-bifosfato carboxilase expresso quase que exclusi- vamente em células mesofílicas em lâminas de folha e bainhas foliares em altos níveis).

[00165] Promotores específicos a senescência adequados incluem um promotor de tomate ativo durante o amadurecimento do fruto, se- nescência e abscisão de folhas, um promoter de milho de gene codifi- cando uma protease de cisteína, o promotor de 82E4 e o promotor de genes SAG. Promotores específicos a antera podem ser utilizados. Promotores preferenciais a raízes adequados conhecidos a indivíduos versados na técnica podem ser escolhidos. Os promotores preferenci- ais a sementes adequados incluem tanto promotores específicos a sementes (os promotores ativos durante o desenvolvimento da semen- te, tais como promotores de polipeptídeos de armazenamento de se- mentes) e promotores de germinação de sementes (promotores ativos durante germinação de sementes). Tais promotores preferenciais in- cluem Cim1 (mensagem induzida por citocinina); cZ19B1 (milho 19 kDa zein); milps (mio-inositol-1-fosfato sintase); mZE40-2, também co- nhecido como Zm-40; nuclc; e celA (celulose sintase). O gama-zein é um promotor específico a endosperma. Glob-1 é um promotor especí- fico a embrião. Para dicotiledôneas, promotores específicos a semen- tes incluem beta-faseolina de feijão, napina, -congliclina, lectina de soja, cruciferina e semelhantes. Para monocotiledôneas, promotores específicos a sementes incluem um promotor de milho 15 kDa zein, um promotor 22 kDa zein, um promotor 27 kDa zein, um promotor g- zein, um promotor 27 kDa gama-zein (tal como promotor gzw64A ver número de Acesso Genbank S78780), um promotor ceroso, um pro- motor encolhido 1, um promotor encolhido 2, um promotor de globulina 1 (ver número de acesso Genbank L22344), um promotor Itp2, um promotor cim1, promotores de milho end1 e end2, promotor nuc1, promotor Zm40, eep1 e eep2; lec1, promotor de tioredozina H; promo- tor milp15, promotor PCNA2; e o promotor encolhido-2.

[00166] Exemplos de promotor indutíveis incluem promotores reati-

vos a ataque patogênico, condições anaeróbicas, temperatura eleva- da, luz, seca, temperatura fria ou alta concentração salina. Promotores indutíveis por patógenos incluem aqueles de polipeptídeos relaciona- dos a patogênese (polipeptídeos PR), que são incluídos após infecção por patógeno (por exemplo, polipeptídeos de PR, polipeptídeos SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase).

[00167] Além de promotores vegetais, demais promotores adequa- dos podem ser derivados de origem bacteriana, por exemplo, o promo- tor de sintase de octopina, o promotor de sintase de nopalina e demais promotores derivados de plamídeos Ti, ou podem ser derivados de promotores virais (por exemplo, promotores de RNA 35S e 19S do ví- rus de mosaico de couve-flor (CaMV), promotores constitutivos de ví- rus de mosaico de tabaco, promotores de vírus de mosaico de couve- flor (CaMV) 19S e 35S, ou promotores do vírus de mosaico da escrotu- lária 35S).

[00168] Métodos adequados de introduzir polinucleotídeos em célu- las vegetais e posterior inserção no genoma da planta incluem microin- jeção (Crossway et al, Biotechniques 4:320-334 (1986)), eletroporação (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986)), trans- formação mediada por Agrobacterium (US 5,981,840 e US 5,563,055), transferência de gene direto (Paszkowski et al, EMBO J. 3:2717-2722 (1984)) e aceleração de partículas balísticas (ver, por exemplo, US 4,945,050; US 5,879,918; US 5,886,244; US 5,932,782; Tomes et al., em Plant Cell,Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin) (1995); e McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)). b. Mutação

[00169] Uma planta ou célula vegetal compreendendo uma muta- ção em um ou mais dos polinucleotídeos ou polipeptídeos descritos neste documento é divulgado, em que a referida mutação resulta em função ou atividade de AAT modulada. Além de uma ou mais muta- ções descritas, as plantas ou células vegetais mutantes podem ter uma ou mais mutações adicionais ou nos mesmos polinucleotídeos ou polipeptídeos, conforme descrito neste documento, ou em um ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos dentro do genoma.

[00170] Também fornece-se um método para modular o nível de um polipeptídeo AAT, conforme descrito neste documento, em uma planta (curada) ou em material vegetal (curado), o referido método compre- endendo introduzir no genoma da referida planta uma ou mais muta- ções que modulam a expressão de pelo menos um gene, em que o referido pelo menos um gene é selecionado das sequências de acordo com a presente descrição.

[00171] Também fornece-se um método para identificar uma planta com níveis aumentados de protease, o referido método compreenden- do a seleção de uma amostra de ácido nucleico de uma planta de ta- baco de interesse para a presença de uma ou mais mutações nas se- quências de acordo com a presente descrição e, opcionalmente, corre- lacionando as mutações identificadas com as mutações que são co- nhecidas para modular os níveis de uma ou mais AAT.

[00172] Também divulga-se uma planta ou célula vegetal que é he- terozigótica ou homozigótica para uma ou mais mutações em um gene de acordo com a presente descrição, em que a referida mutação resul- ta na expressão modulada do gene ou função ou atividade do polipep- tídeo codificado deste modo.

[00173] Um número de abordagens pode ser usado para combinar mutações em uma planta, incluindo o cruzamento sexual. Uma planta com uma ou mais mutações heterozigóticas ou homozigóticas mais favoráveis em um gene de acordo com a descrição atual que modula a expressão do gene ou a função ou atividade do polipeptídeo codificado deste modo pode ser cruzada com uma planta com uma ou mais mu-

tações heterozigóticas ou homozigóticas favoráveis em um ou mais outros genes que modulam a expressão ou a função ou atividade do polipeptídeo codificado deste modo. Em uma modalidade, os cruza- mentos são feitos para introduzir uma ou mais mutações heterozigóti- cas ou homozigóticas dentro de um gene de acordo com a presente descrição dentro da mesma planta.

[00174] A função ou atividade de um ou mais polipeptídeos da pre- sente descrição em uma planta é aumentada ou diminuída se a função ou atividade for mais elevada ou mais baixa em do que a função ou atividade dos mesmos polipeptídeos em uma planta que não foi modi- ficada para inibir a função ou atividade deste polipeptídeo e que foi cultivada, colhida e curada usando os mesmos protocolos.

[00175] Em algumas modalidades, as mutações favoráveis são in- troduzidas em uma planta ou célula vegetal utilizando uma abordagem de mutagênese e a mutação introduzida é identificada ou selecionada usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, como análise por Southern blot, sequenciamento de DNA, análise PCR ou análise fenotípica. As mutações que afetam a expressão gênica ou que interferem na função do polipeptídeo codificado podem ser deter- minadas usando métodos que são bem conhecidos na técnica. Muta- ções nos éxons dos genes geralmente resultam em mutantes nulos. As mutações em resíduos conservados podem ser particularmente efi- cazes em inibir a função metabólica do polipeptídeo codificado. Será apreciado, por exemplo, que uma mutação em uma ou mais regiões altamente conservadas provavelmente alteraria a função de polipeptí- deo, enquanto uma mutação fora dessas regiões altamente conserva- das provavelmente teria pouco ou nenhum efeito na função de polipep- tídeo. Além disso, uma mutação em um único nucleotídeo pode criar um códon de parada, o que resultaria em um polipeptídeo truncado e, dependendo da extensão do truncamento, perda de função.

[00176] Métodos para a obtenção de polinucleotídeos e polipeptí- deos mutantes também são divulgados. Qualquer planta de interesse, incluindo uma célula vegetal ou material vegetal, pode ser genetica- mente modificado por meio de vários métodos sabidamente capazes de induzir mutagênese, incluindo mutagênese direcionada a local es- pecífico, mutagênese direcionada a oligonucleotídeo, mutagênese quimicamente induzida, mutagênese induzida por irradiação, mutagê- nese utilizando-se bases modificadas, mutagênese utilizando-se DNA duplex lacunar, mutagênese de ruptura de fita dupla, mutagênese utili- zando-se fitas hospedeiras deficientes em reparo, mutagênese por meio de síntese total de gene, shuffling de DNA e outros métodos equivalentes.

[00177] Fragmentos de polinucleotídeos e polipeptídeos são tam- bém divulgados. Fragmentos de um polinucleotídeo podem codificar fragmentos de polipeptídeos que mantêm a função biológica do poli- peptídeo nativo e, portanto, estão envolvidos na rede de transporte metabólito em uma planta. Alternativamente, os fragmentos de um po- linucleotídeo que são úteis como a sondas de hibridização ou iniciado- res de PCR geralmente não codifica fragmento de polinucleotídeos, mantendo a função biológica. Além disso, os fragmentos dos polinu- cleotídeos divulgados incluem aqueles que podem ser montados den- tro dos construtos recombinantes, conforme discutido neste documen- to. Fragmentos de um polinucleotídeo podem variar de pelo menos, cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 75 nu- cleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos cerca de 150 nucleotídeos, cer- ca de 200 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 300 nu- cleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos, cer- ca de 600 nucleotídeos, cerca de 700 nucleotídeos, cerca de 800 nu- cleotídeos, cerca de 900 nucleotídeos, cerca de 1000 nucleotídeos, cerca de 1100 nucleotídeos, cerca de 1200 nucleotídeos, cerca de

1300 nucleotídeos ou cerca de 1400 nucleotídeos e até o comprimento total de polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos descritos neste documento. Fragmentos de um polipeptídeo podem variar de pelo me- nos cerca de 25 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos, cerca de 75 aminoácidos, cerca de 100 aminoácidos, cerca de 150 aminoácidos, cerca de 200 aminoácidos, cerca de 250 aminoácidos, cerca de 300 aminoácidos, cerca de 400 aminoácidos, cerca de 500 aminoácidos e até o comprimento total do polipeptídeo descrito neste documento. Va- riantes mutantes de polipeptídeos podem ser utilizadas na criação de plantas ou células vegetais transgênicas, de ocorrência não natural, ou mutantes (por exemplo, plantas mutantes, de ocorrência não natural, transgênicas, artificiais ou geneticamente modificadas) ou células ve- getais que compreendem uma ou mais variantes mutantes de polipep- tídeos. Apropriadamente, variantes de polipeptídeos mutantes mantêm a função do polipeptídeo não mutante. A função da variante de poli- peptídeo mutante pode ser mais elevada, mais baixa ou mais ou me- nos a mesma que a do polipeptídeo que não mutante.

[00178] Mutações nos polinucleotídeos e polipeptídeos descritos neste documento podem incluir mutações artificiais ou mutações sinté- ticas ou mutações geneticamente projetadas. Mutações nos polinucle- otídeos e polipeptídeos descritos neste documento podem ser muta- ções obtidas ou passíveis de ser obtidas por meio de um processo que inclui uma etapa de manipulação in vitro ou in vivo. Mutações nos poli- nucleotídeos e polipeptídeos descritos neste documento podem ser mutações obtidas ou passíveis de ser obtidas por meio de um proces- so que inclui intervenção humana.

[00179] Métodos que introduzem uma mutação randomicamente em um polinucleotídeo pode incluir mutagênese química e mutagêne- se de radiação. A mutagênese química envolve o uso de produtos químicos adicionados exogenamente, tal como compostos orgânicos mutagênicos, teratogênicos ou carcinogênicos, para induzir mutações. Agentes mutagênicos que criam primariamente mutações de ponto e pequenas deleções, inserções, mutações missense, repetições de se- quência simples, transversões e/ou transições, incluindo mutagênese ou radiação químicas, podem ser usados para criar as mutações. Agentes mutagênicos incluem metanossulfonato de etila, metilmetano sulfonato, N-etil-N-nitrosureia, trietilmelamina, N-metil-N-nitrosureia, procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, dietil sulfato, monômero de acrilamida, melfalano, mostarda de nitrogênio, vincristina, dimetilnitro- samina, N-metil-N'-nitro-Nitrosoguanidina, nitrosoguanidina, 2- aminopurina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno, óxido de etileno, hexame- tilfosforamida, bissulfano, diepoxialcanos (diepoxioctano, diepoxibuta- no, e semelhantes), dicloridrato de 2-metóxi-6-cloro-9[3-(etil-2-cloro- etil)aminopropilamino]acridina e formaldeído.

[00180] Mutações específicas no locus que podem não ter sido dire- tamente causadas pelo agente mutagênico são igualmente contem- plados, contanto que resultem no fenótipo desejado. Agentes mutagê- nicos podem também incluir, por exemplo, radiação de ionização - co- mo raios X, raios gama, irradiação por nêutron rápido e radiação UV. A dosagem da substância química ou radiação mutagênica é determina- da experimentalmente para cada tipo de tecido vegetal de modo que uma frequência de mutação seja obtida abaixo de um nível limiar ca- racterizado pela letalidade ou esterilidade reprodutiva. Qualquer méto- do de preparação de polinucleotídeo vegetal conhecido por aqueles versados na técnica podem ser usados para preparar o polinucleotídeo vegetal para seleção de mutações.

[00181] O processo de mutação pode incluir uma ou mais etapas de cruzamento vegetal.

[00182] Após a mutação, uma varredura pode ser desempenhada para identificar mutações que criam códons de parada prematuros e demais genes não funcionais. Após a mutação, uma seleção pode ser realizada para identificar mutações que criam genes funcionais capa- zes de serem expressos em níveis aumentados ou diminuídos. A sele- ção de mutantes pode ser realizada por sequenciamento, ou por meio do uso de uma ou mais sondas ou iniciadores específicos ao gene ou polipeptídeo. Mutações específicas em polinucleotídeos podem ser também criadas que podem resultar em expressão gênica modulada, estabilidade de mRNA modulada, ou estabilidade de polipeptídeo mo- dulada. Tais plantas são referidas aqui como plantas "de ocorrência não natural" ou "mutantes". Tipicamente, as plantas mutantes ou de ocorrência não natural incluirão pelo menos uma porção de nucleotí- deo estrangeiro, ou sintético, ou artificial (por exemplo, DNA ou RNA) que não se encontrava presente na planta antes desta ser manipulada. O nucleotídeo estrangeiro pode ser um nucleotídeo único, dois ou mais nucleotídeos, dois ou mais nucleotídeos contíguos ou dois ou mais nucleotídeos não contíguos – tais como, pelo menos, 10, 20, 30, 40, 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 ou 1500 ou mais nucleotídeos contíguos ou não contíguos. c. Transgênicas e edição

[00183] Além da mutagênese, as composições que podem modular a expressão ou a função ou atividade de um ou mais dos polinucleotí- deos ou polipeptídeos descritos neste documento incluem polinucleo- tídeos específicos a sequências que podem interferir na transcrição de um ou mais genes endógenos; polinucleotídeos específicos a sequên- cia que podem interferir na tradução de transcrições de RNA (por exemplo, RNAs de fita dupla, siRNAs, ribozimas); polipeptídeos espe- cíficos a sequências que podem interferir na estabilidade um ou mais polipeptídeos; polinucleotídeos específicos a sequências que podem interferir na atividade enzimática de um ou mais polipeptídeos no to- cante a substratos ou polipeptídeos reguladores; anticorpos que exi-

bem especificidade para um ou mais polipeptídeos; compostos de mo- léculas pequenas que podem interferir na estabilidade de um ou mais polipeptídeos ou na função enzimática de um ou mais polipeptídeos ou na função de ligação de um ou mais polipeptídeos; polipeptídeos dedo de zinco que se ligam a um ou mais polinucleotídeos; e meganuclea- ses que têm função em direção a um ou mais polinucleotídeos. Tecno- logias de edição de genes, tecnologias de edição genética e tecnologi- as de edição de genomas são bastante conhecidas no âmbito da téc- nica. d. Nucleases Dedo de Zinco

[00184] Polipeptídeos dedo de zinco podem ser usados para modu- lar a função ou a atividade de um ou mais dos polinucleotídeos descri- tos neste documento. Em diversas modalidades, uma sequência ge- nômica de DNA que compreende uma parte ou a inteireza da sequên- cia codificante do polinucleotídeo é modificada por mutagênese dedo de zinco mediada por nuclease. A sequência de DNA genômica é var- rida à procura de um sítio único para ligação de polipeptídeo dedo de zinco. Alternativamente, a sequência de DNA genômica é varrida à procura de dois sítios únicos para ligação de polipeptídeo de dedos de zinco, em que ambos os sítios estão em fitas opostas e em proximida- de um do outro, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais pares de base separados. Em conformidade, os polipeptídeos de dedos de zinco que se ligam a polinucleotídeos são fornecidos.

[00185] Um polipeptídeo de dedos de zinco pode ser projetado para reconhecer um sítio alvo selecionado em um gene. Um polipeptídeo de dedos de zinco pode compreender qualquer combinação de motivos derivados a partir de domínios de ligação de DNA de dedos de zinco naturais ou domínios de ligação de DNA de dedos de zinco não natu- rais por truncamento ou expansão ou um processo de mutagênese direcionada a um sítio acoplado a um método de seleção, tal como,

mas não se limitando a, seleção por exibição de fago, seleção por bac- teriana de duplo híbrido ou seção bacteriana de hibrido único. O termo "domínio de ligação a DNA de dedos de zinco não natural" se refere a um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco que liga uma se- quência com três pares de base dentro do ácido nucleico alvo e que não ocorre na célula ou organismo que compreendem o ácido nucleico que deverá ser modificado. Os métodos para o projeto de um polipep- tídeo de dedos de zinco que liga os polinucleotídeos que são únicos a um gene-alvo são conhecidos na técnica.

[00186] Em outras modalidades, um polipeptídeo de dedos de zinco pode ser selecionado para ligar-se a uma sequência reguladora de um polinucleotídeo. Mais especificamente, a sequência reguladora pode compreender um sítio de iniciação de transcrição, um códon inicial, uma região de um éxon, um limite de um éxon-íntron, um terminador, ou um códon de parada. Nesse sentido, a descrição fornece células vegetais ou planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica, produzidas por mutagênese de dedo de zinco mediada por nuclease em proximidade, ou dentro de um ou mais polinucleotídeos descritos aqui, e métodos para produzir tal planta ou célula vegetal por mutagê- nese de dedos de zinco mediada por nuclease. Métodos para distribui- ção de proteína de dedos de zinco e nuclease de dedos de zinco a uma planta são similares àqueles descritos abaixo para distribuição de meganuclease. e. Meganucleases

[00187] Em outro aspecto, métodos para a produção de plantas mu- tantes, de ocorrência não natural, ou transgênicas ou geneticamente modificadas de qualquer outra maneira usando-se meganucleases, tais com I-CreI, são descritas. Meganucleases de ocorrência natural bem como meganucleases recombinantes podem ser usadas especifi- camente para causar uma ruptura de dupla fita em um único local ou em relativamente poucos locais no DNA genômico de uma planta para permitir a interrupção de um ou mais polinucleotídeos descritos neste documento. A meganuclease pode ser uma meganuclease adulterada com propriedades de reconhecimento de DNA alteradas. Polipeptídeos de meganuclease podem ser distribuídos a células vegetais por meio de uma variedade de mecanismos diferentes conhecidos na técnica.

[00188] As invenções englobam o uso de meganucleases para ina- tivar um polinucleotídeo descrito neste documento (ou qualquer com- binação dos mesmos como descrita neste documento) em uma célula vegetal ou planta. Particularmente, a descrição fornece um método para inativar um polinucleotídeo em uma planta usando uma meganu- clease que compreende: a) fornecer uma célula vegetal que compre- ende um polinucleotídeo tal como descrito neste documento; (b) intro- duzir uma meganuclease ou construto que codifica uma meganuclease na referida célula vegetal; e (c) permitir que a meganuclease inative substancialmente o(s) polinucleotídeo(s).

[00189] Meganucleases podem ser usadas para clivar sítios de re- conhecimento de meganuclease dentro das regiões codificantes de um polinucleotídeo. Tal clivagem frequentemente resulta na delação de DNA no sítio de reconhecimento da meganuclease após reparo muta- gênico de DNA por junção não homóloga de extremidades. Tais muta- ções na sequência de codificação de genes são tipicamente suficien- tes para inativar o gene. Esse método para modificar uma célula vege- tal envolve, primeiro, a entrega de um cassete de expressão de me- ganuclease a uma célula vegetal usando-se um método de transfor- mação adequado. Para maior eficiência, é desejável ligar o cassete de expressão de meganuclease a um marcador selecionável e selecionar células transformadas de forma bem-sucedida na presença de um agente de seleção. Essa abordagem resultará na integração do casse- te de expressão da meganuclease no genoma, no entanto, o que pode não ser desejável se houver probabilidade de a planta requerer apro- vação regulatória. Em tais casos, o cassete de expressão de meganu- clease (e gene marcador selecionável ligado) pode ser segregado em gerações subsequentes de plantas usando-se técnicas convencionais de reprodução.

[00190] Após a entrega do cassete de expressão de meganuclease, células vegetais são cultivadas, inicialmente, sob condições típicas ao procedimento de transformação que foi usado. Isto pode significar o crescimento de células transformadas em meios em temperaturas abaixo de 26˚ C, frequentemente no escuro. Tais condições-padrão podem ser utilizadas por um período de tempo, preferencialmente 1-4 dias, para permitir que a célula vegetal se recupere do processo de transformação. Em qualquer ponto após este período inicial de recupe- ração, a temperatura de cultivo pode ser aumentada para estimular a atividade da meganuclease projetada para clivar e causar mutação ao sítio de reconhecimento da meganuclease. f. TALENs

[00191] Um método de edição de genes envolve o uso de nuclea- ses com efetor do tipo ativador de transcrição (TALENs), que induzem rompimentos de fita dupla às quais as células podem responder com mecanismos de reparo. NHEJ reconecta o DNA em/de qualquer lado de uma ruptura da fita dupla onde há pouca ou nenhuma sobreposição de sequência para o anelamento. Esse mecanismo de reparo induz a erros no genoma através de inserção ou deleção, ou rearranjo cro- mossômico. Tais erros podem tornar não funcionais os produtos gené- ticos codificados naquela localidade. Para certas aplicações, pode ser desejável remover precisamente o polinucleotídeo do genoma da plan- ta. Tais aplicações são possíveis usando-se um par de meganuclea- ses adulteradas, cada qual capaz de clivar um sítio de reconhecimento de meganuclease em qualquer um dos lados da deleção pretendida.

TALENs que são capazes de reconhecer e ligar-se a um gene e intro- duzir uma ruptura de fita dupla no genoma podem também ser usados. Assim, em outro aspecto, métodos para produzir plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas ou de qualquer outro modo ge- neticamente modificados são descritos neste documento usando Nu- cleases Tal-Efetoras são contempladas. g. CRISPR/Cas

[00192] Outro método de edição de genes envolve o uso do sistema bacteriano CRISPR/Cas. Bactérias e arqueobactérias exibem elemen- tos cromossômicos chamados repetições palindrômicas curtas agru- padas e regularmente espaçadas (CRISPR) que são parte de um sis- tema imunológico adaptativo que protege contra DNA invasor viral e plasmídeo. Em sistemas CRISPR Tipo II, RNAs CRISPR (crRNAs) funcionando com crRNA trans-ativador (tracrRNA) e polipeptídeos as- sociados a CRISPR (Cas) para introduzir rupturas de fita dupla no DNA alvo. Clivagem de alvo por Cas9 requer pareamento de base en- tre o crRNA e tracrRNA assim como pareamento de bases entre o crRNA e o DNA alvo. O reconhecimento do alvo é facilitado pela pre- sença de um curto motivo chamado motivo adjacente ao protoespaça- dor (PAM) que se conforma à sequência NGG. Este sistema pode ser aproveitado para edição de genoma. Cas9 normalmente é programado por um RNA duplo que consiste em crRNA e tracrRNA. No entanto, os componentes nucleares destes RNAs podem ser combinados em um único "RNA guia" híbrido para focalização de Cas9. O uso de um RNA guia não codificante para direcionar o DNA para clivagem específica a um local promete ser significativamente mais direto que tecnologias já existentes - tais como as TALENs. Usando a estratégia CRISPR/Cas, o redirecionamento do complexo de nuclease apenas demanda intro- dução de uma nova sequência de RNA e não há necessidade de pro- jetar novamente a especificidade dos fatores de transcrição de poli-

peptídeo. A tecnologia CRISPR/Cas foi implementada em plantas no método de aplicação internacional WO 2015/189693, que divulga uma plataforma de edição de genomas mediada por virais que é ampla- mente aplicável entre espécies vegetais. O genoma RNA2 do vírus do chocalho de tabaco (TRV) foi projetado para transportar e distribuir RNA guia em plantas Nicotiana benthamiana superexpressando Cas9 endonuclease. No contexto da presente descrição, um RNA guia pode ser derivado de qualquer uma das sequências divulgadas neste docu- mento e do ensino de WO2015/189693 aplicado para editar o genoma de uma célula vegetal e obter uma planta mutante desejada. O ritmo acelerado do desenvolvimento da tecnologia gerou uma grande varie- dade de protocolos com ampla aplicabilidade em plantae, que foram bem catalogados em uma série de artigos recentes de revisão científi- ca (por exemplo, Plant Methods (2016) 12:8; e Front Plant Sci. (2016) 7:506). Uma revisão dos sistemas CRISPR/Cas com um foco especial em sua aplicação é descrita em Biotechnology Advances (2015) 33, 1, 41-52). Desenvolvimentos mais recentes no uso de CRISPR/Cas para manipulação de genomas vegetais são discutidos em Acta Pharma- ceutica Sinica B (2017) 7, 3, 292-302 e Curr. Op. em Plant Biol. (2017) 36, 1–8. Os plasmídeos de CRISPR/Cas9 para uso em plantas estão listados em "addgene", o repositório de plasmídeos sem fins lucrativos (addgene.org) e os plasmídeos CRISPR/Cas estão disponíveis comer- cialmente. h. Modificação antissenso

[00193] A tecnologia antissenso é outro método bem conhecido que pode ser usado para modular a expressão de um polipeptídeo. Uma polinucleotídeo do gene a ser reprimido é clonado e funcionalmente ligado a uma região reguladora e uma sequência de terminação de transcrição de modo que fita antissenso de RNA seja transcrita. O construto recombinante é, então, transformado em uma célula vegetal e a fita antissenso de RNA é produzida. O polinucleotídeo não precisa ser a sequência inteira do gene a reprimir, mas tipicamente será subs- tancialmente complementar a pelo menos uma porção da fita senso do gene a ser reprimido.

[00194] Um polinucleotídeo pode ser transcrito em ribozima, ou RNA catalítico, que afeta a expressão de um mRNA. Ribozimas po- dem ser projetadas especificamente para se parearem com virtual- mente qualquer RNA alvo e clivar a estrutura de fosfodiéster em uma localização específica, portanto, inativando funcionalmente o RNA al- vo. Polinucleotídeos heterólogos podem codificar ribozimas projetadas para clivar transcrições de mRNA específicas, evitando assim a ex- pressão de um polipeptídeo. Ribozimas cabeça-de-martelo são úteis à destruição de mRNAs particulares, muito embora várias ribozimas que clivam mRNA em sequências de reconhecimento específicas a locais possam ser utilizadas. Ribozimas cabeça-de-martelo clivam mRNAs em locações ditadas pelas regiões flanqueadoras que formam pares de base complementares com o mRNA alvo. O único requisito é que o RNA alvo contenha um polinucleotídeo 5'-UG-3'. A construção e a pro- dução de ribozimas cabeça-de-martela são conhecidas no âmbito da técnica. Sequências de ribozima cabeça-de-martelo podem ser embu- tidas em um RNA estável tal como RNA de transferência (tRNA) para intensificar a eficácia da clivagem in vivo.

[00195] Em uma modalidade, o polinucleotídeo específico a se- quências que podem interferir na tradução de transcrição(ões) de RNA é RNA de interferência. Interferência de RNA ou silenciamento de RNA é um processo evolutivamente conservado segundo o qual mRNAs específicos podem ser direcionados para degradação enzimática. Um RNA de fita dupla (RNA de fita dupla) é introduzido ou produzido por uma célula (por exemplo, vírus de RNA de fita dupla, ou polinucleotí- deo de RNA de interferência) para iniciar a via do RNA de interferên-

cia. O RNA de fita dupla pode ser convertido em múltiplos duplexes pequenos de RNA de interferência (siRNA) de 21-24 bp de compri- mento por RNases III, que são endonucleases de fita dupla específicas a RNA. Os siRNAs podem ser reconhecidos por complexos silenciado- res induzidos por RNA que promovem o desenrolamento de pequenos siRNA através de um processo dependente de ATP. A fita antissenso desenrolada do siRNA guia os complexos silenciadores ativados indu- zidos por RNA ao mRNA direcionado que compreende uma sequência complementar à fita antissenso do siRNA. O mRNA alvo e a fita antis- senso podem forma uma hélice em forma de A, e o principal sulco da hélice em forma de A pode ser reconhecido pelos complexos silencia- dores ativados induzidos por RNA. O mRNA alvo pode ser clivado por complexos silenciadores induzidos por RNA em um sítio único definido pelo sítio de ligação da extremidade 5' da fita de siRNA. Os complexos silenciadores ativados induzidos por RNA podem ser reciclados para catalisar outro evento de clivagem.

[00196] Vetores de expressão de RNA de interferência podem compreender construtores de RNA de interferência que codificam poli- nucleotídeos de RNA de interferência que exibem interferência de RNA reduzindo o nível de expressão de mRNAs, pré-mRNAs ou vari- antes de RNA relacionadas. Os vetores de expressão podem compre- ender um promotor posicionado a montante e funcionalmente ligado a um construto de RNA de interferência, tal como descrito mais detalha- damente aqui. Vetores de expressão de RNA de interferência podem compreender um promotor de núcleo mínimo, um construto de RNA de interferência interessante, uma região reguladora a montante (5'), uma região regulatória a jusante (3'), incluindo terminação de transcrição e sinais de poliadenilação, e outras sequências conhecidas a indivíduos versados na técnica, como diversos marcadores de seleção.

[00197] As moléculas de RNA de fita dupla podem incluir moléculas de siRNA agrupadas a partir de um único oligonucleotídeo em uma estrutura em haste-alça, em que regiões autocomplementares senso e antissenso da molécula de siRNA são ligadas por meio de ligantes peptídicos à base de polinucleotídeos ou não, bem como RNA circular de fita simples com duas ou mais estruturas de alça e uma haste com- preendendo fitas autocomplementares senso e antissenso, em que o RNA circular pode ser processado tanto in vivo ou in vitro para gerar uma molécula siRNA ativa capaz de mediar o RNA de interferência.

[00198] O uso de pequenas moléculas de RNA em formato de grampo de cabelo também é contemplado. Elas compreendem uma sequência antissenso específica, em acréscimo à sequência comple- mentar reversa (senso), tipicamente separada por um espaçador ou sequência de ansa. Clivagem do espaçador ou ansa fornece uma mo- lécula de RNA de fita única e seu complemento inverso, de modo que possam anelar-se para formar uma molécula de RNA de fita dupla (opcionalmente com etapas de processamento adicionais que podem resultar em acréscimo ou remoção de um, dois, três ou mais nucleotí- deos da extremidade 3' ou 5' de uma ou outra fita, ou ambas). O espa- çador pode ter comprimento suficiente para permitir que as sequência antissenso e senso se anelem e formem uma estrutura de fita dupla (ou haste) antes da clivagem do espaçador (e, opcionalmente, subse- quentes etapas de processamento que podem resultar no acréscimo ou na remoção de um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos da ter- minação 3' ou 5' de uma ou outra fita, ou ambas). A sequência de es- paçador tipicamente não tem relação com o polinucleotídeo que se situa entre duas regiões polinucleotídicas complementares que, quan- do aneladas em um polinucleotídeo de fita dupla, compreendem um pequeno RNA em formato de grampo de cabelo. A sequência de es- paçador compreende geralmente entre 3 e cerca de 100 nucleotídeos.

[00199] Qualquer polinucleotídeo de RNA de interesse pode ser produzido mediante seleção de uma composição de sequência ade- quada, tamanho de ansa, e comprimento de hasta para produção de um duplex em formato de grampo de cabelo.

Um intervalo adequado para projetar comprimentos de hasta de um duplex em formato de grampo de cabelo inclui comprimentos de haste de pelo menos cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos – como, por exemplo, cerca de 14-30 nucleotídeos, cerca de 30-50 nucleotí- deos, cerca 50-100 nucleotídeos, cerca de 100-150 nucleotídeos, cer- ca de 150-200 nucleotídeos, cerca de 200-300 nucleotídeos, cerca de 300-400 nucleotídeos, cerca de 400-500 nucleotídeos, cerca de 500- 600 nucleotídeos, e cerca de 600-700 nucleotídeos.

Um intervalo ade- quado para projetar comprimentos de alça de um duplex em formato de formato de grampo de cabelo, inclui comprimentos de alça de cerca de 4-25 nucleotídeos, cerca de 25-50 nucleotídeos, ou maiores se o comprimento de haste do duplex de hair for substancial.

Em determi- nadas modalidades, um RNA de fita dupla ou molécula ssRNA tem entre cerca de 15 e cerca de 40 nucleotídeos de comprimento.

Em ou- tra modalidade, a molécula de siRNA é uma molécula de RNA de fita dupla ou ssRNA com comprimento entre cerca de 15 e cerca de 35 nucleotídeos.

Em outra modalidade, a molécula de siRNA é uma mo- lécula de RNA de fita dupla ou ssRNA com comprimento entre cerca de 17 e cerca de 30 nucleotídeos.

Em outra modalidade, a molécula de siRNA é uma molécula de RNA de fita dupla ou ssRNA com com- primento entre cerca de 19 e cerca de 25 nucleotídeos.

Em outra mo- dalidade, a molécula de siRNA é uma molécula de RNA de fita dupla ou ssRNA com comprimento entre cerca de 21 a cerca de 23 nucleotí- deos.

Em determinadas modalidades, estruturas em formato de gram- po de cabelo com regiões em duplex com comprimento máximo de 21 nucleotídeos podem promover silenciamento eficaz direcionado ao siRNA, independentemente de sequência de alça ou do comprimento.

As sequências exemplares para interferência de RNA são descritas neste documento.

[00200] A sequência alvo de mRNA tem, tipicamente, entre cerca de 14 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. O mRNA alvo po- de, portanto, ser varrido para regiões de comprimento entre cerca de 14 e cerca de 50 nucleotídeos que preferencialmente obedecem a um ou mais dos seguintes critérios: uma razão A+T/G+C entre cerca de 2:1 e cerca de 1:2; um dinucleotídeo AA ou dinucleotídeo CA na ex- tremidade 5'; uma sequência de pelo menos 10 nucleotídeos consecu- tivos únicos para o mRNA alvo (ou seja, a sequência não está presen- te em outras sequências de mRNA da mesma planta); e nenhuma "carreira" de mais de três nucleotídeos de guanina (G) consecutivos ou mais de três nucleotídeos consecutivos de citosina (C). Esses critérios podem ser avaliados usando diversas técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, programas de computador tais como BLAST, podem ser usados para procurar bancos de dados publicamente disponíveis para determinar se uma sequência alvo selecionada é única para o mRNA alvo. Alternativamente, uma sequência alvo pode ser selecionada (e sequência de siRNA pode ser projetada) usando softwares de compu- tador comercialmente disponíveis (por exemplo, OligoEngine, Target Finder e Ferramenta de Projeção de siRNA que estejam comercial- mente disponíveis).

[00201] Em uma modalidade, selecionam-se sequências alvo de mRNA com comprimento entre cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos que obedecem a um ou mais dos critérios acima. Em outra modalida- de, selecionam-se as sequências-alvo que têm comprimento entre cerca de 16 e cerca de 30 nucleotídeos que obedecem a um ou mais dos critérios acima. Em uma modalidade adicional, selecionam-se se- quências-alvo que têm comprimento entre cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos que obedecem a um ou mais dos critérios acima. Em ou-

tra modalidade, selecionam-se as sequências-alvo que têm compri- mento entre cerca de 19 e cerca de 25 nucleotídeos que obedecem a um ou mais dos critérios acima.

[00202] Em uma modalidade exemplar, as moléculas de siRNA compreendem uma sequência antissenso específica que é comple- mentar a pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer um dos polinucleotídeos descritos neste documento.

[00203] A sequência antissenso específica composta pela molécula de siRNA pode ser idêntica ou substancialmente idêntica ao comple- mento. Em uma modalidade, a sequência antissenso específica com- posta pela molécula de siRNA é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao complemento da se- quência do mRNA alvo. Métodos para determinar a identidade de se- quência são conhecidos no âmbito da técnica e podem ser determina- dos, por exemplo, usando-se o programa BLASTN do software da Uni- versity of Wisconsin Computer Group (GCG) ou fornecidos no site do NCBI.

[00204] Um método para induzir silenciamento de RNA de dupla fita em plantas é a transformação com um RNA em formato de grampo de cabelo produtor de construto de gene (vide Nature (2000) 407, 319- 320). Tais construtos compreendem regiões invertidas da sequência de genes alvo, separadas por um espaçador apropriado. A inserção de uma região de íntron vegetal funcional como um fragmento do espa- çador aumenta ainda mais a eficiência da indução do silenciamento gênico, devido à geração de RNA em formato de grampo de cabelo unido por íntron (Plant J. (2001), 27, 581-590). De maneira apropriada, o comprimento de haste é de cerca de 50 a nucleotídeos a cerca de 1 kilobase. Métodos para produzir RNA em formato de grampo de cabe- lo emendado por íntron são bem descritos no âmbito da técnica (ver,

por exemplo, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617).

[00205] Moléculas de RNA de interferência com estrutura duplex ou de fita dupla, por exemplo, RNA de fita dupla ou pequeno RNA em formato de grampo de cabelo, pode ter extremidades planas, ou pode ter overhangs 3' ou 5'. Tal como utilizado neste documento, "overhang" refere-se a nucleotídeos não pareados ou nucleotídeos que se proje- tam de uma estrutura duplex quando um terminal 3' estende-se para além do terminal 5' da outra fita (overhang 3'), ou vice-versa (overhang 5'). Os nucleotídeos que compreendem o overhang podem ser ribonu- cleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou versões modificadas dos mes- mos. Em uma modalidade, pelo menos uma fita da molécula de RNA de interferência tem overhang 3' com comprimento entre cerca de 1 a cerca de 6 nucleotídeos. Em outras modalidades, o overhang 3' tem a partir de cerca de 1 a cerca de 5 nucleotídeos, a partir de cerca de 1 a cerca de 3 nucleotídeos e a partir de cerca de 2 a cerca de 4 nucleotí- deos de comprimento.

[00206] Quando a molécula de RNA de interferência compreende um overhang 3' em uma extremidade da molécula, a outra extremida- de pode ser de extremidade plana ou ter também um overhang (5' ou 3'). Quando a molécula de RNA de interferência compreende um ove- rhang em ambas as extremidades da molécula, o comprimento dos overhangs pode ser o mesmo ou diferente. Em uma modalidade, a molécula de RNA de interferência compreende overhangs 3' de cerca de 1 a cerca de 3 nucleotídeos em ambas as extremidades da molécu- la. Em uma modalidade adicional, a molécula de RNA de interferência é um RNA de fita dupla com um overhang 3' de 2 nucleotídeos em ambas as extremidades da molécula. Em mais modalidade adicional, os nucleotídeos que compreendem o overhang do RNA de interferên- cia são dinucleotídeos TT ou dinucleotídeos UU.

[00207] As moléculas de RNA de interferência podem compreender uma ou mais estruturas cap 5' ou 3'. O termo "estrutura cap' refere-se a uma modificação química incorporada em qualquer um dos terminais do nucleotídeo, que protege a molécula de degradação por exonu- clease, e pode também facilitar entregar ou localização dentro dos limi- tes de uma célula.

[00208] Outra modificação aplicável a moléculas de RNA de interfe- rência é a ligação química à molécula de RNA de interferência de uma ou mais unidades ou conjugados que intensificam a função, a distribui- ção celular, a captação celular, biodisponibilidade ou estabilidade da molécula de RNA de interferência. Os polinucleotídeos podem ser sin- tetizados ou modificados por métodos bem estabelecidos no âmbito da técnica. Modificações químicas incluem modificações 2', introdução de bases não naturais, anexação covalente a um ligante e substituição de ligações de fosfato por ligações de tiofosfato. Nesta modalidade, a in- tegridade da estrutura duplex é fortalecida por pelo menos uma e tipi- camente duas ligações químicas.

[00209] Os nucleotídeos em uma ou ambas as fitas individuais po- dem ser modificados para modular a ativação de enzimas celulares, tais como, por exemplo, sem limitação, certas nucleases. Técnicas pa- ra reduzir ou inibir a ativação de enzimas celulares são conhecidos no âmbito da técnica, incluindo, mas não se limitando a, modificações 2'- amino, modificações 2'-fluoro, modificações 2'-alquil, modificações de estrutura não carregada, modificações de morfolino, modificações 2'- O-metil, e fosforamidato.

[00210] Ligantes podem ser conjugados a uma molécula de RNA de interferência, por exemplo, para intensificar sua absorção celular. Em determinadas modalidades, um ligante hidrofóbico é conjugado à mo- lécula para facilitar permeação direta da membrana celular. Em certos casos, a conjugação de um ligante catiônico a oligonucleotídeos fre-

quentemente resulta em resistência melhorada a nucleases.

[00211] "Segmentação induzida por lesões locais nos genomas" (TILLING) é outra tecnologia de mutagênese que podem ser usados para gerar e/ou identificar polinucleotídeos que codificam polipeptídeos com expressão modificada ou função. TILLING também pode permitir a seleção de plantas que carregam tais mutantes. TILLING combina mutagênese de alta densidade com métodos de rastreio de alta vazão. Métodos para TILLING são bem conhecidos no âmbito da técnica (ver McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457 e Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

[00212] Várias modalidades são direcionadas a vetores de expres- são que compreendem um ou mais polinucleotídeos ou construtos de RNA de interferência que compreendem um ou mais polinucleotídeos descritos neste documento.

[00213] Várias modalidades são direcionadas a vetores de expres- são que compreendem um ou mais polinucleotídeos ou um ou mais construtos de RNA de interferência descritos neste documento.

[00214] Várias modalidades são direcionadas a vetores de expres- são que compreende um ou mais polinucleotídeos ou um ou mais construtos de RNA de interferência codificando um ou mais polinucleo- tídeos de RNA de interferência descritos neste documento que são capazes de se autoanelarem para formar uma estrutura em formato de grampo de cabelo, em que o construto compreende (a) um ou mais dos polinucleotídeos descritos neste documento; (b) uma segunda se- quência codificando um elemento espaçador que forma uma alça da estrutura de formato de grampo de cabelo; e (c) uma terceira sequên- cia compreendendo uma sequência reversa complementar da primeira sequência posicionada na mesma orientação da primeira sequência, em que a segunda sequência é posicionada entre a primeira sequên- cia e a terceira sequência é funcionalmente ligada à primeira sequên-

cia e à terceira sequência.

[00215] As sequências divulgadas podem ser utilizadas na constru- ção de vários polinucleotídeos que não forma estruturas de formato de grampo de cabelo. Por exemplo, um RNA de fita dupla pode ser for- mado por (1) transcrição de uma primeira fita do DNA ligando-se fun- cionalmente a um primeiro promotor, e (2) transcrição da sequência complementar reversa da primeira fita do fragmento de DNA ligando- se funcionalmente ao segundo promotor. Cada fita do polinucleotídeo pode ser transcrita a partir do mesmo vetor de expressão, ou a partir de diferentes vetores de expressão. O duplex de RNA com interferên- cia de RNA pode ser enzimaticamente convertido em siRNAs para modular níveis de RNA.

[00216] Assim, várias modalidades são direcionadas a vetores de expressão que compreendem um ou mais polinucleotídeos ou constru- tos de RNA de interferência descritos neste documento que codificam polinucleotídeos de RNA de interferência capazes de autoanelarem, em que o construto compreende (a) um ou mais dos polinucleotídeos descritos neste documento; e (b) uma segunda sequência compreen- dendo uma sequência complementar (por exemplo, complementar re- versa) a primeira sequência, posicionada na mesma orientação da primeira sequência.

[00217] Várias composições e métodos são fornecidos para modu- lar os níveis de expressão endógenos de um ou mais dos polipeptí- deos descritos neste documento (ou qualquer combinação destes, tal como descrito neste documento) mediante a promoção de co- supressão de expressão de gene.

[00218] Várias composições e métodos são fornecidos para modu- lar o nível de expressão do gene endógeno modulando-se a tradução de mRNA. Uma célula vegetal (tabaco) hospedeira pode ser transfor- mada com um vetor de expressão que compreende: um promotor fun-

cionalmente ligado a um polinucleotídeo, posicionado em orientação antissenso em relação ao promotor para habilitar a expressão de poli- nucleotídeos de RNA que têm uma sequência complementar a uma porção de mRNA.

[00219] Diversos vetores de expressão para modulação a tradução de mRNA podem compreender: um promotor funcionalmente ligado a um polinucleotídeo em que a sequência é posicionada em orientação antissenso com respeito ao promotor. Os comprimentos dos polinucle- otídeos de RNA antissenso podem variar, e podem ter a partir de cer- ca de 15-20 nucleotídeos, cerca de 20-30 nucleotídeos, cerca de 30- 50 nucleotídeos, cerca de 50-75 nucleotídeos, cerca de 75-100 nucleo- tídeos, cerca de 100-150 nucleotídeos, cerca de 150-200 nucleotídeos e cerca de 200-300 nucleotídeos. i. Elementos genéticos móveis

[00220] Alternativamente, genes podem ser marcados para inativa- ção mediante a introdução de transposons (elementos IS) em geno- mas de plantas de interesse. Tais elementos genéticos móveis podem ser introduzidos pela fertilização cruzada sexual e pode-se verificar, em mutantes de inserção, se houve perda na função polipeptídica. O gene interrompido em uma planta parente pode ser introduzido em ou- tras plantas cruzando-se a planta parente com planta não sujeita a mu- tagênese induzida por transposon por meio de, por exemplo, fertiliza- ção cruzada sexual. Qualquer técnica padrão de reprodução conheci- da a indivíduos versados na técnica pode ser utilizada. Em uma moda- lidade, um ou mais genes podem ser inativados por meio da inserção de um ou mais transposons. Mutações podem resultar em interrupção homozigota de um ou mais genes, em interrupção heterozigota de um ou mais genes, ou uma combinação entre interrupções heterozigotas e homozigotas se mais de um gene é interrompido. Elementos transpo- níveis adequados incluem retrotransposons, retroposons e elementos semelhantes a SINE. Tais métodos são conhecidos a indivíduos ver- sados na técnica. j. Ribozimas

[00221] Alternativamente, genes podem ser marcados para inativa- ção introduzindo-se ribozimas derivadas a partir de pequenos RNAs circulares capazes de autoclivagem e replicação em plantas. Estes RNAs podem replicar-se tanto sozinhos (RNAs viroides) quanto com um vírus auxiliador (RNAs satélite). Exemplos de RNAs adequados incluem aqueles derivados de viroide de bronzeamento do abacate ("avocado sunblotch viroid") e RNAs derivados do vírus da mancha anelar no tabaco, vírus da faixa temporária de luzerna, vírus do mos- queado aveludado do tabaco, vírus do mosqueado de solanum nodiflo- rum e vírus do mosqueado do trevo subterrâneo. Várias ribozimas alvo específicas do RNA são conhecidos a indivíduos versados na técnica.

[00222] As plantas ou células vegetais mutantes ou de ocorrência não natural podem ter qualquer combinação de uma ou mais muta- ções em um ou mais genes que resultam na expressão modulada ou na função ou atividade desses genes ou seus produtos. Por exemplo, as plantas ou células vegetais mutantes ou de ocorrência não natural podem ser uma única mutação em um único gene; múltiplas mutações em um único gene; uma única mutação em dois ou mais ou três ou quatro ou mais genes; ou múltiplas mutações em dois ou mais ou três ou mais ou quatro ou mais genes. Exemplos destas mutações são descritos aqui. A título de exemplo adicional, as plantas ou células ve- getais mutantes ou de ocorrência não natural podem ter uma ou mais mutações em uma porção específica do(s) gene(s) - como em uma região do gene que codifica um sítio ativo da proteína ou porção do mesmo. A título de exemplo, além disso, as plantas ou células vege- tais mutantes ou de ocorrência não natural podem ter uma ou mais mutações em uma região fora de um ou mais gene(s) - como em uma região a montante ou a jusante do gene que regula, contanto que mo- dulem a atividade ou expressão do(s) gene(s). Elementos a montante podem incluir fatores promotores, potenciadores ou de transcrição.

Al- guns elementos – como potenciadores – podem ser posicionados a montante ou a jusante do gene que regulam.

O elemento (ou elemen- tos) não precisam se situar próximos ao gene que regula, já que foram descobertos alguns elementos situados a diversas centenas de milha- res de pares de base a montante ou a jusante do gene que ele regula.

As plantas ou células vegetais mutantes ou de ocorrência não natural podem ter uma ou mais mutações localizadas dentre os primeiros 100 nucleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 200 nucleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 300 nucleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 400 nucleotídeos do(s) gene(s),dentre os primeiros 500 nu- cleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 600 nucleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 700 nucleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 800 nucleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 900 nu- cleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 1000 nucleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 1100 nucleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 1200 nucleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 1300 nucleotídeos do(s) gene(s), dentre os primeiros 1400 nucleotí- deos do(s) gene(s) ou dentre os primeiros 1500 nucleotídeos do(s) ge- ne(s). As plantas ou células vegetais mutantes ou de ocorrência não natural podem ter uma ou mais mutações localizadas dentre o primei- ro, segundo, terço, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo-primeiro, décimo-segundo, décimo-terceiro, décimo-quarto ou décimo-quinto conjunto de 100 nucleotídeos do(s) gene(s) ou combi- nações do mesmo.

Plantas ou células vegetais mutantes ou de ocor- rência não natural (por exemplo, plantas ou células vegetais mutantes, transgênicas ou de ocorrência natural e semelhantes, tal como des- crito aqui) que compreendem as variantes do polipeptídeo mutante são divulgadas.

[00223] Em uma modalidade, sementes de plantas passam por mu- tagênese e crescem até se tornarem plantas mutantes de primeira ge- ração. Permite-se então que as plantas de primeira geração polinizem a si próprias, e sementes da planta de primeira geração são cultivadas até se tornarem plantas de segunda geração, que passam então por uma seleção à procura de mutantes em seus loci. Embora o material vegetal mutagenizado possa ser varrido à procura de mutações, uma vantagem da seleção em plantas de segunda geração é que todas as mutações somáticas correspondem a mutações de linhagem germina- tiva. Um indivíduo versado na técnica compreenderia que uma varie- dade de materiais vegetais, incluindo, mas não se limitando a, semen- tes, pólen, tecido e células vegetais, pode sofrer mutagênese de modo a criar plantas mutantes. No entanto, o tipo de material vegetal muta- genizado pode afetar quando o polinucleotídeo vegetal é triado à pro- cura de mutações. Por exemplo, quando o pólen é sujeitado a muta- gênese antes da polinização de uma planta não mutagenizado as se- mentes resultantes desta polinização são cultivadas até se tornarem plantas de primeira geração. Todas as células das plantas de primeira geração conterão mutações criadas no pólen; portanto, estas plantas de primeira geração podem então ser selecionadas à procura de mu- tações, em vez de esperar até a segunda geração.

[00224] Preparação de plantas modificadas, triagem e cruzamento

[00225] O polinucleotídeo preparado a partir de plantas individuais, células vegetais ou material vegetal pode ser agrupado, opcionalmen- te, de modo a acelerar a triagem à procura de mutações na população de plantas originárias do tecido, células ou material vegetal mutageni- zado. Uma ou mais gerações subsequentes de plantas, células vege- tais ou material vegetal podem ser selecionadas. O tamanho do grupo opcionalmente agrupado depende da sensibilidade do método de se-

leção usado.

[00226] Depois de as amostras serem opcionalmente agrupadas, elas podem ser submetidas a técnicas de amplificação específicas a polinucleotídeos, tal como PCR. Qualquer um ou mais iniciadores ou sondas específicos ao gene ou sequências imediatamente adjacentes ao gene podem ser utilizados para amplificar as sequências dentro da amostra opcionalmente agrupada. Apropriadamente, os um ou mais iniciadores ou sondas são projetados para amplificar as regiões do lo- cus onde mutações úteis são mais propensas a surgir. Mais preferen- cialmente, o iniciador é projetado para detectar mutações dentro de regiões do polinucleotídeo. Além disso, é preferível que o(s) inicia- dor(es) e sonda(s) evitem sítios polimórficos conhecidas de modo a facilitar seleção à procura de mutações pontual. Para facilitar a detec- ção de produtos de amplificação, os um ou mais iniciadores ou sondas podem ser marcados usando-se qualquer método convencional de marcação. Iniciador(es) ou sonda(s) podem ser projetados com base nas sequências descritas aqui usando-se métodos bastante conheci- dos no âmbito da técnica.

[00227] Para facilitar a detecção de produtos de amplificação, os iniciador(es) ou sonda(s) podem ser marcados usando-se qualquer método convencional de marcação. Estes podem ser projetados com base nas sequências descritas aqui usando-se métodos bastante co- nhecidos no âmbito da técnica.

[00228] Polimorfismos podem ser identificados por meios conheci- dos no âmbito da técnica, e alguns já foram descritos na literatura re- lacionada.

[00229] Em algumas modalidades, uma planta pode ser regenerada ou cultivada a partir da planta, tecido de planta ou célula da planta. Quaisquer métodos apropriados para regeneração ou crescimento de uma planta a partir de uma célula de planta ou tecido de planta podem ser utilizados, tais como, sem limitação, cultura de tecidos ou regene- ração de protoplastos. Apropriadamente, plantas podem ser regenera- das pelo crescimento de células de plantas transformadas em meio de indução de calos, meio de indução de disparo e/ou meio de indução de origem. Vide, por exemplo, Plant Cell Reports (1986) 5:81-84. Estas plantas podem então ser crescidas e também polinizadas com a mes- ma cepa transformada ou cepas diferentes e o híbrido resultante tendo a expressão da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida estável e herdada, e que as sementes colhidas para garantir a expressão das característi- cas fenotípicas desejadas tenham sido alcançadas. Assim como usado neste documento, "sementes transformadas" refere-se a sementes que contêm o construto de nucleotídeo estável integrada no genoma da planta.

[00230] Por conseguinte, em um outro aspecto, fornece-se um mé- todo para o preparo de uma planta mutante. O método envolver o for- necimento de pelo menos uma célula de uma planta que compreende um gene que codifica um polinucleotídeo funcional descrito aqui (ou qualquer combinação destes, tal como descrito aqui). Em seguida, pe- lo menos uma célula da planta é tratada em condições eficazes para modular a função dos polinucleotídeos descritos neste documento. A pelo menos uma célula vegetal é então propagada em planta mutante, onde a planta mutante tem um nível modulado de polipeptídeo(s) des- crito(s) (ou qualquer combinação destes, como descrito neste docu- mento) em comparação ao nível de uma planta controle. Em uma mo- dalidade deste método de produção de plantas mutantes, a etapa de tratamento envolve sujeitar a pelo menos uma célula a um agente químico mutagenizante, tal como descrito acima, e sob condições efi- cazes à produção de pelo menos uma célula vegetal mutante. Em ou-

tra modalidade deste método, a etapa de tratamento envolve sujeitar a pelo menos uma célula a uma fonte de radiação sob condições efica- zes à produção de pelo menos uma célula vegetal mutante. O termo "planta mutante" inclui plantas mutantes em que o genótipo é modifi- cado em comparação a uma planta controle, apropriadamente por ou- tros meios diferentes de engenharia genética ou modificação genética.

[00231] Em determinadas modalidades, a planta mutante, célula vegetal mutante ou material vegetal mutante pode compreender uma ou mais mutações que ocorreram naturalmente em outra planta, célula vegetal ou material vegetal e conferem um atributo desejado. Essa mutação pode ser incorporada (por exemplo, por meio de introgres- são) em outra planta, célula vegetal ou material vegetal (por exemplo, uma planta, célula vegetal ou material vegetal com fundamento genéti- co diferentes da planta a partir da qual derivou-se a mutação) para dar-lhe um atributo desejado. Portanto, a título de exemplo, uma muta- ção que ocorreu naturalmente em uma primeira planta pode ser intro- duzida em uma segunda planta - como, por exemplo, uma segunda planta com um fundamento genético diferente do da primeira planta. A pessoa versada na técnica é, portanto, capaz de procurar por e identi- ficar uma planta que carrega naturalmente em seu genoma um ou mais alelos mutantes dos genes descritos aqui que dão um traço dese- jado. O alelo, ou alelos, mutante que ocorre naturalmente pode ser transferido à segunda planta por meio de diversos métodos, incluindo reprodução, retrocruzamento e introgressão para produzir linhagens, variedade ou híbridos que têm uma ou mais mutações nos genes des- critos aqui. A mesma técnica também pode ser aplicada à introgressão de uma ou mais mutações não naturais de uma primeira planta em uma segunda planta. Plantas que exibem uma característica desejada podem ser isoladas mediante seleção dentre um agrupamento de plantas mutantes. Apropriadamente, a seleção é realizada utilizando o conhecimento do polinucleotídeo, conforme descrito neste documento.

Consequentemente, é possível varrer à procura de um traço genético em comparação a um controle.

Tal abordagem de triagem pode envol- ver a aplicação de técnicas convencionais de amplificação e/ou hibridi- zação, conforme discutido neste documento.

Assim, um aspecto adici- onal da presente descrição se relaciona a um método de identificação de uma planta mutante compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma amostra que compreende polinucleotídeo de uma planta; e (b) determinar a sequência de polinucleotídeo, em que a diferença na se- quência do polinucleotídeo, em comparação ao polinucleotídeo de uma planta controle, é indicativo de que a referida planta é uma planta mutante.

Em outro aspecto, é fornecido um método para identificar uma planta mutante que acumula níveis aumentados ou reduzidos de um ou mais aminoácidos em comparação com uma planta controle compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma amostra de uma plan- ta a ser triada; (b) determinar se a referida amostra compreende uma ou mais mutações em um ou mais polinucleotídeos descritos neste documento; e (c) determinar o nível de pelo menos um aminoácido da referida planta.

Em outro aspecto, é fornecido um método para prepa- rar uma planta mutante que tenha níveis aumentados ou reduzidos de pelo menos um aminoácido em comparação com uma planta controle compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma amostra de uma pri- meira planta; (b) determinar se a referida amostra compreende uma ou mais mutações em um ou mais dos polinucleotídeos descritos neste documento que resultam em níveis modulados de pelo menos um aminoácido; e (c) transferir uma ou mais mutações para uma segunda planta.

A mutação (ou mutações) pode ser transferida a uma segunda planta usando-se vários métodos conhecidos no âmbito da técnica - tais como engenharia genética, manipulação genética, introgressão, reprodução de plantas, retrocruzamento e semelhantes.

Em uma mo-

dalidade, a primeira planta é uma planta de ocorrência natural. Em uma modalidade, a segunda planta tem um background genético dife- rente da primeira planta. Em outro aspecto, é fornecido um método para preparar uma planta mutante que tenha níveis aumentados ou reduzidos de pelo menos um aminoácido em comparação com uma planta controle compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma amos- tra de uma primeira planta; (b) determinar se a referida amostra com- preende uma ou mais mutações em um ou mais dos polinucleotídeos descritos neste documento que resultam em níveis modulados de pelo menos um aminoácido; e (c) fazer introgressão de uma ou mais muta- ções da primeira planta para uma segunda planta. Em uma modalida- de, a etapa de introgressão compreende reprodução de plantas, opci- onalmente incluindo retrocruzamento e semelhantes. Em uma modali- dade, a primeira planta é uma planta de ocorrência natural. Em uma modalidade, a segunda planta tem um fundamento genético diferente da primeira planta. Em uma modalidade, a primeira planta não é culti- var nem cultivar elite. Em uma modalidade, a segunda planta é um cul- tivar ou cultivar elite. Um aspecto adicional refere-se a uma planta mu- tante (incluindo uma planta mutante de cultivar ou de cultivar elite) ob- tida ou passível de ser obtida pelos métodos descritos aqui. Em de- terminadas modalidades, as "plantas mutantes" podem ter uma ou mais mutações localizadas apenas a uma região específica da planta – tais como dentro dos limites da sequência dos um ou mais polinucle- otídeo(s) descrito(s) aqui. De acordo com esta modalidade, a sequên- cia genômica restante da planta mutante será a mesma ou substanci- almente a mesma que a da planta antes da mutagênese.

[00232] Em determinadas modalidades, as "plantas mutantes" po- dem ter uma ou mais mutações localizadas em uma região genômica da planta – como dentro da sequência de um ou mais dos polinucleo- tídeos descritos aqui e em uma ou mais regiões adicionais do genoma.

De acordo com esta modalidade, a sequência genômica restante da planta mutante não será a mesma ou não será substancialmente a mesma que a da planta antes da mutagênese. Em determinadas mo- dalidades, as plantas mutantes podem não ter uma ou mais mutações em um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais éxons do polinucleotídeo ou polinucleotídeos descritos aqui; ou podem não ter uma ou mais mutações em um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais íntron do(s) polinucleo- tídeo(s) descritos aqui; ou podem não ter uma ou mais mutações em um promotor do polinucleotídeo ou polinucleotídeos descritos aqui; ou podem não ter uma ou mais mutações na região não traduzida 3' do polinucleotídeo ou polinucleotídeos descritos aqui; ou podem não ter uma ou mais mutações na região não traduzida 5' do polinucleotídeo ou polinucleotídeos descritos aqui; ou podem não ter uma ou mais mu- tações na região codificadora do polinucleotídeo ou polinucleotídeos descritos aqui; ou podem não ter uma ou mais mutações na região não codificadora do polinucleotídeo ou polinucleotídeos descritos aqui; ou qualquer combinação de duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou seis ou mais partes dos mesmos.

[00233] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de identi- ficação de uma planta, célula vegetal ou material vegetal compreen- dendo uma mutação em um gene que codifica um polinucleotídeo descrito neste documento compreendendo: (a) submeter uma planta, uma célula vegetal ou material vegetal à mutagênese; (b) obter uma amostra da referida planta, célula vegetal ou material vegetal ou des- cendentes dos mesmos; e (c) determinar a sequência polinucleotídica do gene ou de um variante ou um fragmento do mesmo, em que a di- ferença na referida sequência é indicativa de uma ou mais mutações no mesmo. Este método também permite a seleção de plantas com mutações que ocorrem em regiões genômicas que afetam a expressão do gene em uma célula vegetal, como um sítio de iniciação de trans- crição, um códon de iniciação, uma região de um íntron, um limite de um éxon-íntron, um terminador ou um códon de parada.

[00234] Famílias, espécies, variedades, sementes e cultura tecidual de plantas

[00235] Plantas adequadas para uso em modificação genética in- cluem plantas e sistemas de células vegetais monocotiledôneas e di- cotiledôneas, incluindo espécie de uma das seguintes famílias: Acan- thaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiace- ae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanace- ae, Taxaceae, Theaceae, ou Vitaceae.

[00236] Espécies adequadas podem incluir membros dos gêneros Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, An- drographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsi- cum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cin- chona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Eri- anthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ja- tropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Pa- nicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum,

Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uni- ola, Veratrum, Vinca, Vitis, e Zea.

[00237] As espécies adequadas podem incluir Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Po- pulus spp., Andropogon gerardii (grama bluestem grande), Pennisetum purpureum (capim elefante), Phalaris arundinacea (capim junco), Cynodon dactylon (grama bermuda), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (esparto de pradaria), Medicago sativa (alfal- fa), Arundo donax (junco gigante), Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale (triticale), bambu, Helianthus annuus (girassol), Carthamus tinctorius (açafrão), Jatropha curcas (pinhão manso), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palmeira), Linum usitatissimum (linho), Brassica juncea, Beta vulgaris (beterraba sacarina), Manihot esculenta (cassaya), Lycopersicon escu- lentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Musyclise alca (banana), So- lanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócoli, couve-flor, cou- ve-de-bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (moran- go), Theobroma cacao (cacau), Coffeycliseca (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimenta e pimen- tão), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora-menina), Cucurbita moschata (abóbora-cheirosa), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (berinjela), Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Lupinus albus (tre- moço), Uniola paniculata (aveia), erva-fina (Agrostis spp.), Populus tremuloides (álamo tremedor), Pinus spp. (pinho), Abies spp. (abeto), Acer spp. (boldo), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (capim- do-campo), Lolium spp. (azevém) e Phleum pratense (erva-dos-

prados), Panicum virgatum (painaço amarelo), Sorghuycliseor (sorgo, erva do sudão), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (ca- na-energia), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (colza), Triticum aestivum (trigo), Gos- sypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (beterraba sacarina) ou Pennisetum glaucum (milheto- pérola).

[00238] Várias modalidades são direcionadas a plantas de tabaco mutantes, plantas ou células vegetais de tabaco de ocorrência não na- tural ou plantas de tabaco transgênicas modificadas para modular ní- veis de expressão de gene, produzindo, portanto, plantas ou células vegetais - tais como uma planta ou células vegetais de tabaco - em que o nível de expressão de um polipeptídeo é modulado dentro de tecidos de interesse, em comparação à planta de controle. As compo- sições e métodos divulgados podem ser aplicados a qualquer espécie do gênero Nicotiana, incluindo N. rusticae N. tabacum (por exemplo, LAB21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao,Perique, Beinhart 1000-1, e Petico). Outras espécies incluem N. acaulis, N. acuminata, N. africa- na, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonari- ensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. deb- neyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knighti- ana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalo- siphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occi- dentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. rai- mondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundi- folia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N.

tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. veluti- na, N. wigandioides, e N. x sanderae. Apropriadamente, a planta de tabaco é N. tabacum.

[00239] O uso de tabacos cultivar e tabacos cultivar elite são igual- mente contemplados aqui. A planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica pode, portanto, ser uma variedade de tabaco ou tabaco cultivar elite que compreende um ou mais transgenes, ou uma ou mais mutações genéticas ou uma combinação destes. A mutação, ou muta- ções, genética (por exemplo, um ou mais polimorfismos) podem ser mutações que não existem naturalmente na variedade individual de tabaco ou tabaco cultivar (por exemplo, tabaco cultivar elite) ou pode ser mutação, ou mutações, que ocorrem naturalmente, contanto que a mutação não ocorra naturalmente na variedade de tabaco individual ou cultivar de tabaco (por exemplo, tabaco cultivar elite).

[00240] Variedades particularmente úteis de Nicotiana tabacum in- cluem tabacos do tipo Burley, do tipo escuro, do tipo curado em curti- ção, e do tipo Oriental. Exemplos não limitantes de variedades ou cul- tivares são: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N- 7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, ’Perique' tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50,

PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G- 28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B13P, Xanthi (Mit- chell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC number 2 Hybrid 49, Burley 21, KY8959, KY9, MD 609, PG01, PG04, PO1, PO2, PO3, RG11, RG 8, VA509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpão Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsa- ge E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Sam- sun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Sub- variedades de baixo conversor dos tipos acima, ainda que não identifi- cadas especificamente aqui, são igualmente contempladas.

[00241] As modalidades são também direcionadas a composições e métodos para produção de plantas mutantes, plantas de ocorrência não natural, plantas híbridas ou plantas transgênicas que foram modi- ficadas para modular a expressão ou função de polinucleotídeos des- critos neste documento (ou qualquer combinação dos mesmos, con- forme descrito neste documento). Vantajosamente, as plantas mutan- tes, plantas de ocorrência não natural, plantas híbridas ou plantas transgênicas que são obtidas podem ser similares ou substancialmen- te idênticas em termos de aparência geral às plantas controle. Várias características fenotípicas tais como grau de maturidade, número de folhas por planta, altura do caule, ângulo de inserção da folha, tama-

nho da folha (largura e comprimento), distância entre pessoas e razão lamina-zona intervenal, podem ser avaliadas mediante observações de campo.

[00242] Um aspecto refere-se a uma semente de uma planta mu- tante, uma planta de ocorrência não natural, uma planta híbrida ou planta transgênica descrita aqui. Preferencialmente, a semente é uma semente do tabaco. Um aspecto adicional refere-se a pólen ou a um óvulo de uma planta mutante, uma planta de ocorrência não natural, uma planta híbrida ou planta transgênica descrita aqui. Além disso, fornece-se uma planta mutante, uma planta de ocorrência não natural, uma planta híbrida ou planta transgênica descrita aqui que compreen- de adicionalmente um polinucleotídeo que confere esterilidade mascu- lina.

[00243] Fornece-se igualmente uma cultura de tecido de células regeneráveis da planta mutante, planta de ocorrência não natural, planta híbrida ou planta transgênica ou parte das mesmas tal como descrito aqui, cuja cultura regenera plantas capazes de expressar to- das as características morfológicas e fisiológicas da planta-mãe. As células regeneráveis incluem células de folhas, pólen, embriões, coti- lédones, hipocótilos, raízes, pontas de raízes, anteras, flores e uma parta das mesmas, óvulos, rebentos, hastes, caules, medula e cápsu- las ou calos ou protoplastos derivados a partir das mesmas. O material vegetal descrito neste documento pode ser material de tabaco curado – tal como material de tabaco curado pelo ar ou curado pelo sol. Exemplos de variedades de tabaco curados pelo ar e pelo sol são do tipo Burley e do tipo Escuro. O material vegetal descrito que é neste documento pode ser material de tabaco curado em estufa – tal como o tipo Virgínia.

[00244] A recomendação do CORESTA para a cura do tabaco está descrita em: Guia CORESTA N°17, abril de 2016, Sustentabilidade na

Produção da Folha de Tabaco.

[00245] Uma finalidade é fornecer plantas mutantes, transgênicas ou de ocorrência não natural ou partes das mesmas que apresentem níveis de NtAAT que resultem em níveis modulados de pelo menos um aminoácido - tal como aspartato - no material vegetal, por exemplo, em folhas curadas. Uma vez que o aspartato é conhecido por resultar em acrilamida no aquecimento da folha de tabaco, modular os níveis de aspartato também pode levar à modulação dos níveis de acrilamida. A síntese de aspartato é essencial também para a síntese de outros aminoácidos - tal como asparagina, treonina, isoleucina, cisteína e me- tionina. Assim, os níveis de um ou mais desses outros aminoácidos podem ser modulados quando os níveis de aspartato são modulados. Certos aminoácidos - como treonina, metionina e cisteína - podem re- sultar em um odor de enxofre na fumaça ou aerossóis que são produ- zidos no aquecimento. Portanto, a modulação desses níveis de ami- noácidos também permite a modulação deste odor de enxofre.

[00246] Em certas modalidades, a atividade e/ou expressão de um ou mais dentre NtAAT1-S, NtAAT1-T, NtAAT2-S, NtAAT2-T, NtAAT3- S, NtAAT3-T, NtAAT4-S e NtAAT4-T é modulada.

[00247] Em certas modalidades, a atividade e/ou expressão de um ou mais dentre NtAAT1-S e NtAAT1-T é modulada.

[00248] Em certas modalidades, a atividade e/ou expressão de um ou mais dentre NtAAT2-S e NtAAT2-T é modulada.

[00249] Em certas modalidades, a atividade e/ou expressão de um ou mais dentre NtAAT1-S, NtAAT1-T, NtAAT2-S e NtAAT2-T é modu- lada.

[00250] Em certas modalidades, a expressão e/ou atividade de um ou mais dentre NtAAT1-S, NtAAT1-T, NtAAT2-S e NtAAT2-T é modu- lada enquanto a expressão e/ou atividade de um ou mais dentre NtA- AT3-S, NtAAT3-T, NtAAT4-S e NtAAT4-T não é modulada.

[00251] Em certas modalidades, a expressão e/ou atividade de um ou mais dentre NtAAT1-S, NtAAT1-T, NtAAT2-S e NtAAT2-T é modu- lada enquanto a expressão e/ou atividade de NtAAT3-S NtAAT3-T, NtAAT4-S e NtAAT4-T não é modulada.

[00252] Apropriadamente, plantas mutantes, transgênicas ou de ocorrência não-natural ou partes das mesmas têm substancialmente o mesmo aspecto visual que o da planta controle.

[00253] Por conseguinte, são descritas neste documento plantas mutantes, transgênicas ou de ocorrência não natural ou partes das mesmas ou células vegetais com níveis modulados de pelo menos um aminoácido em comparação com as células controle ou plantas contro- le. As plantas ou células vegetais mutantes, transgênicas ou de ocor- rência não natural foram modificadas para modular a síntese ou fun- ção de um ou mais polipeptídeos descritos neste documento pela mo- dulação da expressão de um ou mais polinucleotídeos corresponden- tes descritos neste documento. Assim, os níveis modulados de pelo menos um aminoácido são observados pelo menos nas folhas verda- des, folhas adequadamente curadas.

[00254] Um aspecto adicional refere-se a uma planta ou célula mu- tante, de ocorrência não-natural ou transgênica, em que a expressão ou função de um ou mais polipeptídeos AAT descritos neste documen- to são modulados (por exemplo, reduzidos) e uma parte da planta (por exemplo, folhas verdes, folhas adequadamente curadas ou tabaco cu- rado) tem níveis modulados (por exemplo, reduzidos) de pelo menos um aminoácido com pelo menos 5% nele em comparação a uma plan- ta controle na qual a expressão ou a função dos referidos polipeptí- deos não foi modulada (por exemplo, reduzida). Em certas modalida- des, o nível de pelo menos um aminoácido na planta - tal como folhas verdes, folhas adequadamente curadas ou tabaco curado - pode ser modulado (por exemplo, reduzido), por exemplo, em pelo menos 5%,

pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% ou pelo menos 150% ou pelo menos 200% mais de uma quantidade ou função. O nível de pelo menos um aminoácido pode ser reduzido a quantidades indetectáveis.

[00255] Um aspecto adicional, refere-se a um material vegetal cu- rado – tal como folha curada ou tabaco curado – derivado ou que pode ser derivado de uma planta ou célula mutante, de ocorrência não- natural ou transgênica, na qual a expressão de um ou mais dos poli- nucleotídeos descritos neste documento ou a função do polipeptídeo codificado por eles é modulada (por exemplo, reduzida) e em que o nível de pelo menos um aminoácido é modulado (por exemplo, reduzi- do) em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo me- nos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pe- lo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% ou pelo menos 150% ou pelo menos 200% em comparação com uma planta controle.

[00256] Apropriadamente, o aspecto visual da referida planta ou parte da mesma (por exemplo, folha) é substancialmente idêntico ao da planta controle. Apropriadamente, a planta é uma planta de tabaco ou uma planta de café.

[00257] As modalidades também são direcionadas a composições e métodos para produção de plantas ou células vegetais mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas que foram modificadas para modular a expressão ou função de um ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos descritos neste documento, o que pode resultar em plan- tas ou componentes vegetais (por exemplo, folhas - tais como folhas verdes ou folhas curadas - ou tabaco) ou células vegetais com teor modulado de pelo menos um aminoácido.

[00258] As plantas mutantes, de ocorrência não-natural ou transgê- nicas podem ser similares ou substancialmente idênticas em termos de aparência visual às plantas controle correspondentes. Em uma mo- dalidade, o peso da folha da planta mutante, de ocorrência não-natural ou transgênica é substancialmente o mesmo que o da planta controle. Em uma modalidade, o número de folhas da planta mutante, de ocor- rência não-natural ou transgênica é substancialmente o mesmo que o da planta controle. Em uma modalidade, o peso da folha e o número de folhas da planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica são substancialmente os mesmos que os da planta controle. Em de- terminada modalidade, a altura do caule das plantas mutantes, de ocorrência não-natural ou transgênicas é a mesma que a da planta controle, por exemplo, um, dois ou três ou mais meses após transplan- te de campo ou 10, 20, 30 ou 36 ou mais dias após a poda apical. Por exemplo, a altura do caule das plantas mutantes, de ocorrência não- natural ou transgênicas não é menor que a altura do caule das plantas controle. Em outra modalidade, o teor de clorofila da planta mutante, de ocorrência não-natural ou transgênica é substancialmente o mesmo que o das plantas controle. Em uma outra modalidade, a altura do cau- le das plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas é substancialmente a mesma que a das plantas controle, e o teor de clo- rofila das plantas mutantes, de ocorrência não-natural ou transgênicas é substancialmente o mesmo que o das plantas controle. Em outras modalidades, o tamanho ou forma ou número ou coloração das folhas das plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas são substancialmente os mesmo que os das plantas controle. Apropriada- mente, a planta é uma planta de tabaco ou uma planta de café.

[00259] Em outro aspecto, é fornecido um método para modular a quantidade de pelo menos um aminoácido em pelo menos uma parte de uma planta (por exemplo, folhas – tais como folhas curadas – ou no tabaco), compreendendo as etapas de: (i) modular a expressão ou função de um ou mais dos polipeptídeos descritos neste documento (ou qualquer combinação deles conforme descrito neste documento), adequadamente, em que os polipeptídeos são codificados pelos poli- nucleotídeos correspondentes descritos neste documento; (ii) medir o nível de pelo menos um aminoácido em pelo menos uma parte (por exemplo, folhas – tais como folhas curadas – ou tabaco ou em fuma- ça) da planta mutante, de ocorrência não-natural ou transgênica obtida na etapa (i); e (iii) identificar uma planta mutante, de ocorrência não natural ou transgênica na qual o nível do pelo menos um aminoácido nela foi modulado em comparação com uma planta controle. Apropria- damente, o aspecto visual da referida planta mutante, transgênica ou de ocorrência não natural é substancialmente o mesmo que o da plan- ta controle. Apropriadamente, a planta é uma planta do tabaco.

[00260] Em outro aspecto, é fornecido um método para modular a quantidade de pelo menos um aminoácido em pelo menos uma parte de do material vegetal curado - tal como uma folha curada - compre- endendo as etapas de: (i) modular a expressão ou função de um ou mais dos polipeptídeos (ou qualquer combinação deles conforme des- crito neste documento) , adequadamente, em que os polipeptídeos são codificados pelos polinucleotídeos correspondentes descritos neste documento; (ii) cultivar o material vegetal - tal como uma ou mais fo- lhas - e curar por um período de tempo; (iii) medir o nível de pelo me- nos um aminoácido em pelo menos uma parte do material vegetal cu- rado obtido na etapa (ii) ou durante a etapa (ii); e (iv) identificar materi- al vegetal curado no qual o nível do pelo menos um aminoácido nele foi modulado em comparação com uma planta controle.

[00261] Um aumento na expressão, em comparação a um controle pode ser a partir de 5% a cerca de 100%, ou um aumento de pelo me- nos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pe- lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou 100% ou mais – como, por exemplo, 200%, 300%, 500%, 1000% ou mais, o que inclui um aumento na função transcricional, expressão de polinucleotídeo, ou expressão de polipep- tídeo ou uma combinação dos mesmos.

[00262] Um aumento na função ou atividade, em comparação a um controle, pode ser a partir de 5% a cerca de 100%, ou um aumento de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou 100% ou mais - como, por exemplo, 200%, 300%, 500%, 1000% ou mais.

[00263] Uma redução na expressão, em comparação a um controle, pode ser a partir de 5% a cerca de 100%, ou um aumento de pelo me- nos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pe- lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou 100%, o que inclui uma redução na função trans- cricional ou expressão de polinucleotídeo, ou expressão de polipeptí- deo, ou uma combinação dos mesmos. Por conseguinte, a expressão é reduzida.

[00264] Uma redução na função ou atividade, em comparação a um controle, pode ser a partir de 5% a cerca de 100%, ou uma redução de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou 100%. Por conseguinte, a função ou atividade é reduzida.

[00265] Os polinucleotídeos e construtos recombinantes descritos neste documento podem ser usados para modular a expressão, fun- ção ou atividade dos polinucleotídeos ou polipeptídeos descritos neste documento em uma espécie vegetal de interesse, apropriadamente o tabaco.

[00266] Uma variedade de métodos à base de polinucleotídeos po- de ser usada para aumentar a expressão de genes em plantas e célu- las vegetais. A título de exemplo, um construto, vetor ou vetor de ex- pressão compatível com a planta a ser transformada podem prepara- dos que compreendam o gene de interesse, conjuntamente a um pro- motor a montante capaz de superexpressar o gene na planta ou célu- las vegetais. Promotores exemplares encontram-se descritos aqui. Após a transformação, e quando cultivado em condições adequadas, o promotor pode impulsionar a expressão de modo a modular os níveis desta enzima na planta, ou em um tecido específico da mesma. Em uma modalidade exemplar, um vetor carregando um ou mais polinu- cleotídeos descritos aqui (ou qualquer combinação dos mesmos, tal como descrita aqui) é gerado para superexpressar o gene em uma planta ou célula vegetal. O vetor carrega um promotor adequado - tal como o promotor do vírus do mosaico da couve-flor CaMV 35S - a montante do transgene, impulsionando sua expressão constitutiva em todos os tecidos da planta. O vetor carrega igualmente um gene de resistência antibiótica, de modo a conferir seleção às linhagens celula- res e calos transformados.

[00267] A expressão das sequências de promotores pode ser me- lhorada, incluindo sequências de controle de expressão, incluindo po- tenciadores, elementos ativadores de cromatina, elementos responsi- vos do fator de transcrição e afins. Essas sequências de controle po- dem ser constitutivas e regular ascendentemente a transcrição de for-

ma universal; ou elas podem ser facultativas e regular ascendente- mente a transcrição em resposta a sinais específicos. Sinais associa- dos com a senescência e sinais que são ativos durante o processo de cura são especificamente indicados.

[00268] Várias modalidades são, portanto, direcionadas a métodos para modular o nível de expressão de um ou mais polinucleotídeos descritos neste documento (ou qualquer combinação dos mesmos, conforme descrito neste documento) pela integração de múltiplas có- pias do polinucleotídeo em um genoma vegetal, compreendendo: transformar uma célula hospedeira vegetal com um vetor de expressão que compreende um promotor operacionalmente ligado a um ou mais polinucleotídeos descritos neste documento. O polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo recombinante pode ser um polipeptídeo nativo, ou pode ser heterólogo à célula.

[00269] Em uma modalidade, a planta de uso na presente descrição é uma planta curada pelo ar, pois tais plantas têm um alto teor de ami- noácidos (superior a cerca de 27,4mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo) e um alto teor de amônia (superior a cerca de 0,18% em peso seco quando cultivadas em cam- po) no final da cura. As plantas mutantes, de ocorrência não-natural ou transgênicas ou partes delas que são curadas pelo ar têm um teor de aminoácido inferior a cerca de 27,4mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura – inferior a cerca de 20mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quan- do cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 15mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 10mg/g de teor de ami- noácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 5mg/g de teor de aminoácidos livres em pe- so seco quando cultivadas em campo no final da cura. As plantas mu-

tantes, de ocorrência não-natural ou transgênicas ou partes delas que são curadas pelo ar têm um teor de amônia que é inferior a cerca de 0,18% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 0,15% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 0,10% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 0,05% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura.

[00270] Em outra modalidade, a planta de uso na presente descri- ção é uma planta que é curada pelo sol, pois tais plantas têm um alto teor de aminoácidos (superior a cerca de 26,5mg/g de teor de aminoá- cidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cu- ra) e um alto teor de amônia (superior a cerca de 0,14% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura). As plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas ou partes delas que são cu- radas pelo sol têm um teor de aminoácido inferior a cerca de 26,5/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura – inferior a cerca de 20mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 20mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 15mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 10mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 5mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura. As plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas ou partes delas que são curadas pelo sol têm um teor de amônia que é inferior a cerca de 0,14% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 0,10% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 0,05% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura.

[00271] Em outra modalidade, a planta de uso na presente descri- ção é uma planta que é curada em estufa. Tais plantas têm um teor de aminoácidos que é superior a cerca de 3mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura e um teor de amônia que é superior a cerca de 0,02% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura. As plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas ou partes delas que são cura- das em estufa têm um teor de aminoácido inferior a cerca de 3mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura – inferior a cerca de 2,5mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 2,0mg/g de teor de aminoácidos livres em peso se- co quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 1,5mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultiva- das em campo no final da cura ou inferior a cerca de 1,0mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 0,5mg/g de teor de aminoácidos livres em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura. As plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas ou partes delas que são curadas pelo sol têm um teor de amônia que é inferior a cerca de 0,02% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 0,10% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura ou inferior a cerca de 0,05% em peso seco quando cultivadas em campo no final da cura.

[00272] Em certas modalidades, o uso de plantas curadas pelo ar ou curadas pelo sol é preferencial.

[00273] O teor de aminoácido pode ser medido usando vários mé- todos conhecidos na técnica. Um desses métodos é o Método MP 1471 rev 5 2011, Resana, Itália: Chelab Silliker S.r.l, Mérieux NutriSci-

ences Company. Para determinação de aminoácidos em folhas de plantas curadas, após a remoção da nervura central, a lâmina curada é seca a 40°C por 2-3 dias, se necessário. O material do tabaco é en- tão moído em pó fino (~100 uM) antes da análise do teor de aminoáci- dos. Outro método para medir o teor de aminoácidos no material vege- tal é descrito em UNI EN ISO 13903:2005. Em uma modalidade, o mé- todo usado para medir o teor de aminoácidos em material vegetal é descrito em UNI EN ISO 13903:2005

[00274] O teor de amônia pode ser determinado por Skalar: MT24- Nitrato, Alcaloides Totais, Amônia, Cloreto, TKN. Para determinação de amônia em folhas de plantas curadas, após a remoção da nervura central, a lâmina curada é seca a 40°C por 2-3 dias, se necessário. O material do tabaco é então moído em pó fino (~100 uM) antes da aná- lise do teor de amônia. Outros métodos para medir o teor de amônia são conhecidos na técnica e incluem os métodos descritos em: Health Canada (1999) Determination of ammonia in whole tobacco. Tobacco Control Programme. Método Oficial T-302 de Health Canada; e estudo Reino Unido do constituinte da fumaça de Tobacco Manufacturers Or- ganization (2002). Anexo A Parte 5 Método: determinação dos rendi- mentos de amônia na fumaça de cigarro convencional usando o cro- matógrafo de íons Dionex DX-500, Relatório Nº GC15/M24/02.

[00275] Uma planta carregando um alelo mutante de um ou mais polinucleotídeos descritos aqui (ou qualquer combinação dos mesmos, tal como descrito aqui) pode ser utilizada em um programa de repro- dução vegetal para criar linhagens, variedades e híbridos úteis. Em particular, o alelo mutante é colocado mediante introgressão nas vari- edades comercialmente importantes descritas acima. Deste modo, são fornecidos métodos para reprodução de plantas que compreendem o cruzamento de uma planta mutante, uma planta de ocorrência não na- tural, ou uma planta transgênica como descrita aqui com uma planta que compreende identidade genética diferente. O método pode com- preender adicionalmente o cruzamento de uma planta de progênie com outra planta, e opcionalmente, a repetição do cruzamento até que se obtenha uma progênie com características genéticas ou fundamen- to genético desejados. Uma finalidade atendida por tais métodos de reprodução é introduzir uma característica genética desejada em ou- tras variedades, linhagens de reprodução, híbrido e cultivares, especi- ficamente aqueles que são comercialmente interessantes. Outro pro- pósito é facilitar o empilhamento de modificações genéticas de diferen- tes genes em uma variedade, linhagens, híbridos e cultivares de uma planta individual. São contemplados acasalamentos intraespecíficos bem como interespecíficos. As plantas de progênie que surgem de tais cruzamentos, também denominadas como linhagens de reprodução, são exemplos de plantas de ocorrência não natural.

[00276] Em uma modalidade, um método é fornecido para produzir uma planta de ocorrência não-natural compreendendo: (a) cruzar uma planta mutante ou transgênica com uma segunda planta para produzir sementes de progênie de tabaco; (b) cultivar a semente de progênie de tabaco, sob condições de cultivo de plantas, para produzir uma planta de ocorrência não-natural. O método pode compreender ainda: (c) cruzar a geração anterior de plantas de ocorrência não natural con- sigo mesma ou com outra planta para produzir semente de tabaco de progênie; (d) cultivar a semente de tabaco de progênie da etapa (c) sob condições de cultivo de planta, para produzir plantas de ocorrência não-natural adicionais; e (e) repetir as etapas de cruzamento e cultivo de (c) e (d) múltiplas vezes para gerar mais gerações de plantas de ocorrência não natural. O método pode compreender opcionalmente, antes da etapa (a), uma etapa de fornecer uma planta-mãe que com- preenda uma identidade genética caracterizada e não-idêntica à planta mutante ou transgênica. Em algumas modalidades, dependendo do programa de reprodução, as etapas de cruzamento e cultivo são repe- tidas de 0 a 2 vezes, de 0 a 3 vezes, de 0 a 4 vezes, 0 a 5 vezes, e 0 a 6 vezes, de 0 a 7 vezes, de 0 a 8 vezes, de 0 a 9 vezes ou de 0 a 10 vezes, de modo a gerar gerações de plantas de ocorrência não natu- ral. O retrocruzamento é um exemplo de um tal método em que a pro- gênie é cruzada com um de seus pais ou com outra planta genetica- mente similar a seus pais, de modo a obter-se uma planta de progênie na geração seguinte que tenha uma identidade genética mais próxima daquela de seus pais. As técnicas para reprodução de plantas são bastante conhecidas e podem ser usadas nos métodos da descrição. A descrição fornece adicionalmente plantas de ocorrência não natural produzidas por esses métodos. Certas modalidades excluem a etapa de selecionar uma planta.

[00277] Em algumas modalidades dos métodos descritos aqui, li- nhagens resultantes da reprodução e seleção à procura de genes va- riantes são avaliadas no campo usando-se procedimentos de campo padrão. Os genótipos controle, incluindo o ancestral original não muta- genizado, são incluídos e entradas são dispostas no campo em um desenho de bloco completo randomizado ou outro desenho de campo apropriado. Para o tabaco, são usadas práticas agronômicas padrão, por exemplo, o tabaco é colhido, pesado e amostrado à procura de substâncias químicas, e outras testagens comuns realizadas antes e depois da cura. Análises estatísticas dos dados são desempenhadas para confirmar a similaridade das linhagens selecionadas às linhagens ancestrais. Análises citogenéticas das plantas selecionadas são opci- onalmente desempenhadas para confirmar o complemento cromos- sômico e relações de pareamento de cromossomos.

[00278] Identidade de DNA, polimorfismo de nucleotídeo único, marcadores de microssatélite ou tecnologias similares podem ser utili- zadas em um programa de reprodução de seleção auxiliada por mar-

cadores (MAS) para transferir ou reproduzir alelos mutantes de um gene em outros tabacos, tal como descrito aqui. Por exemplo, um re- produtor pode criar populações segregantes a partir de hibridizações de um genótipo que contém um alelo mutante com um genótipo agro- nomicamente desejado. Plantas nas gerações F2 ou com retrocruza- mento podem ser selecionadas usando um marcador desenvolvido a partir de uma sequência genômica ou um fragmento dos mesmos, usando uma das técnicas listadas aqui. Plantas identificadas como possuindo o alelo mutante podem ser retrocruzadas ou autopoliniza- das para criar uma segunda população a ser selecionada. Dependen- do do padrão de herança esperado ou da tecnologia MAS usada, pode ser necessário autopolinizar as plantas selecionadas antes de cada ciclo de retrocruzamento para auxiliar a identificação das plantas indi- viduais desejadas. O retrocruzamento ou outro procedimento de re- produção pode ser repetido até que o fenótipo desejado original recor- rente seja recuperado.

[00279] De acordo com a descrição, em um programa de reprodu- ção, cruzamentos bem sucedidos produzem plantas F1 que são fér- teis. As plantas F1 selecionadas podem ser cruzadas com um de seus pais, e as plantas da primeira geração por retrocruzamento são auto- polinizadas para produzir uma população que é triada novamente para a expressão gênica variante (por exemplo, a versão nula do gene). O processo de retrocruzamento, autopolinização e seleção é repetido, por exemplo, pelo menos 4 vezes até a seleção final produzir uma planta que seja fértil e razoavelmente similar ao ancestral recorrente. Esta planta, se desejado, é autopolinizada e a progênie posteriormente é selecionada novamente para confirmar que a planta apresenta ex- pressão do gene variante. Em algumas modalidades, uma população de plantas na geração F2 é selecionada quanto à expressão gênica variante, por exemplo, uma planta é identificada como não conseguin-

do expressar um polipeptídeo, devido a ausência do gene de acordo com os métodos padrão, por exemplo, usando um método PCR com iniciadores com base nas informações da sequência polinucleotídica para os polinucleotídeos descritos neste documento (ou qualquer combinação destes, conforme descrito neste documento).

[00280] Variedades de tabaco híbrido podem ser produzidas evi- tando a autopolinização das plantas-mãe femininas (ou seja, origem de sementes) de uma primeira variedade, permitindo que o pólen de plantas-mãe masculinas de uma segunda variedade fertilize as plan- tas-mãe femininas e permitindo que as sementes híbridas F1 se for- mem nas plantas femininas. A autopolinização das plantas femininas pode ser evitada enfraquecendo as flores na fase inicial de desenvol- vimento da flor. Como alternativa, formação de pólen pode ser evitada nas plantas-mãe femininas usando uma forma de esterilidade masculi- na. Por exemplo, a esterilidade masculina pode ser produzida pela es- terilidade masculina citoplasmática (CMS), ou esterilidade masculina transgênica em que um transgene inibe a formação de microsporogê- nese e/ou pólen, ou autoincompatibilidade. As plantas-mãe femininas contendo CMS são particularmente úteis. Em modalidades em que as plantas-mãe femininas são CMS, o pólen é colhido a partir de plantas masculinas férteis e aplicado manualmente aos estigmas das plantas- mãe femininas com CMS, e a semente F1 resultante é colhida.

[00281] As variedades e linhagens aqui descritas podem ser usadas para formar híbridos F1 de tabaco com cruzamento único. Em tais mo- dalidades, as plantas das variedades originais podem crescer como populações adjacentes substancialmente homogêneas para facilitar a polinização cruzada natural das plantas originais masculinas com as plantas originais femininas. A semente de F1 formada sobre as plantas originais femininas é colhida seletivamente por métodos convencio- nais. Também pode-se cultivar as duas variedades de plantas-mãe em massa e colher uma mistura de sementes F1 híbrida formada sobre o ancestral feminino e as sementes formadas no ancestral masculino como resultado de autopolinização. Alternativamente, três cruzamen- tos podem ser realizados em que um híbrido F1 de cruzamento único é usado como um ancestral feminino e é cruzado com um ancestral masculino diferente. Como outra alternativa, híbridos de cruzamento duplo podem ser criados em que a progênie F1 de dois diferentes cru- zamentos únicos são cruzados entre si.

[00282] Uma população de plantas mutantes, com ocorrência não natural, ou transgênicas pode ser triada ou selecionada para identificar aqueles membros da população que têm uma característica ou fenóti- po desejado. Por exemplo, uma população de progênie de um evento de transformação única pode ser selecionada para identificar aquelas plantas que tem um nível desejado de expressão ou função dos poli- peptídeos codificados. Métodos físicos e bioquímicos podem ser usa- dos para identificar os níveis de expressão ou de atividade. Estes in- cluem análise Southern ou amplificação por PCR para a detecção de um polinucleotídeo; Northern blots, proteção da S1 RNase, extensão de iniciador, ou amplificação de RT-PCR para a detecção de transcri- ções de RNA; ensaios enzimáticos para detecção de função enzimáti- ca ou de ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e eletroforese em gel de polipeptídeo, Western blots, imunoprecipitação e imunoen- saios ligados a enzima para detectar os polipeptídeos. Outras técnicas como a hibridização in situ, coloração de enzima e ensaios por imu- nocoloração e de enzima também podem ser usadas para detectar a presença ou expressão, função ou a atividade de polipeptídeos ou po- linucleotídeos.

[00283] As células de plantas ou plantas mutantes, de ocorrência não natural, ou transgênicas são descritas aqui compreendendo um ou mais polinucleotídeos recombinantes, um ou mais construtos polinu-

cleotídicos, um ou mais RNAs de dupla-hélice, um ou mais conjuga- dos, ou um ou mais vetores/vetores de expressão.

[00284] Sem limitação, as plantas e partes delas descritas neste documento podem ser modificadas antes ou após a expressão, função ou atividade de um ou mais polinucleotídeos e/ou polipeptídeos de acordo com a presente descrição terem sido modulados.

[00285] Uma ou mais das seguintes modificações genéticas podem estar presentes nas plantas mutantes, de ocorrência não-natural ou transgênicas ou partes delas.

[00286] Um ou mais genes que estão envolvidos na conversão de intermediários metabólicos nitrogenados podem ser modificados, re- sultando em níveis mais baixos de, pelo menos, uma nitrosamina es- pecífica do tabaco (TSNA). Exemplos não limitantes desses genes in- cluem aqueles que codificam a nicotina desmetilase - tais como CYP82E4, CYP82E5 e CYP82E10 conforme descrito em WO2006/091194, WO2008/070274, WO2009/064771 e WO2011/088180 – e redutase de nitrato, conforme descrito em WO2016046288.

[00287] Um ou mais genes que estão envolvidos na captação de metais pesados ou no transporte de metais pesados podem ser modi- ficados, resultando em um teor de metais pesados menor. Exemplos não limitantes incluem genes da família de polipeptídeos associados à resistência a multidroga, a família dos facilitadores de difusão de cá- tion (CDF), a família de Zrt-, polipeptídeos semelhantes Irt (ZIP), a fa- mília dos trocadores de cátion (CAX), a família de transportadores de cobre (COPT), da família de ATPases de metais pesados (por exem- plo, HMAs, como descrito em WO2009/074325 e WO2017/129739), a família de homólogos dos polipeptídeos de macrófagos associadas a resistência natural (NRAMP) e outros membros da família de transpor- tadores de cassete de ligação de ATP (ABC) (por exemplo, MRPs),

conforme descrito em WO2012/028309, que participam no transporte de metais pesados - como o cádmio.

[00288] Outras modificações exemplares podem resultar em plantas com expressão ou função modulada de isopropilmalato sintase que resulta em uma mudança na composição do éster de sacarose que pode ser usada para alterar o perfil favorável (vide WO2013/029799).

[00289] Outras modificações exemplares podem resultar em plantas com expressão ou função modulada da treonina sintase em que os níveis de metional podem ser modulados (vide WO2013/029800).

[00290] Outras modificações exemplares podem resultar em plantas com expressão ou função modulada de uma ou mais dentre neoxanti- na sintase, licopeno beta ciclase e 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase para modular o teor de beta-damascenona para alterar o perfil do sa- bor (vide WO2013/064499).

[00291] Outras modificações exemplares podem resultar em plantas com expressão ou função modulada de membros da família CLC de canais de cloreto para modular os níveis de nitrato neles (vide WO2014/096283 e WO2015/197727).

[00292] Outras modificações exemplares podem resultar em plantas com expressão ou função modulada de um ou mais AATs para modu- lar níveis de um ou mais aminoácidos – como aspartato – na folha e níveis modulados de acrilamida em aerossol produzidos após o aque- cimento ou combustão da folha (vide WO2017042162).

[00293] Exemplos de outras modificações incluem a modulação da tolerância ao herbicida, por exemplo, o glifosato é um ingrediente ativo de muitos herbicidas de amplo espectro. Plantas transgênicas resis- tentes ao glifosato foram desenvolvidas pela transferência do gene aroA (uma sintetase EPSP de glifosato de Salmonella typhimurium e E. coli). As plantas resistentes à sulfonilureia têm sido produzidas, transformando o gene mutante ALS (acetolactato sintetase) da Arabi-

dopsis. O polipeptídeo OB do fotossistema II do Amaranthus hybridus mutante foi transferida em plantas para produzir plantas transgênicas resistentes à atrazina; e plantas transgênicas resistentes ao bromoxinil foram produzidas pela incorporação do gene bxn da bactéria Klebsiella pneumoniae.

[00294] Outra modificação exemplar resulta em plantas que são resistentes a insetos. As toxinas do Bacillus thuringiensis (Bt) podem fornecer uma maneira eficaz para retardar o surgimento de pragas re- sistentes ao Bt, como ilustrado recentemente no brócolis onde genes cry1Ac e cry1C Bt piramidais controlaram a traça das crucíferas resis- tente a qualquer polipeptídeo único e atrasaram significativamente a evolução de insetos resistentes.

[00295] Outra modificação exemplar resulta em plantas que são resistentes a doenças causadas por patógenos (por exemplo, vírus, bactérias, fungos). As plantas expressando o gene Xa21 (resistência à ferrugem bacteriana) com plantas expressando tanto um gene de fu- são Bt quanto um gene da quitinase (resistência à broca do tronco amarelo e tolerância a bainha) têm sido projetadas.

[00296] Outra modificação exemplar resulta na alteração da capaci- dade reprodutiva, tais como esterilidade masculina.

[00297] Outra modificação exemplar resulta em plantas que são tolerantes ao estresse abiótico (por exemplo, seca, temperatura, sali- nidade) e as plantas transgênicas tolerantes foram produzidas por transferência de enzima de fosfato de acil glicerol de Arabidopsis; ge- nes que codificam a manitol desidrogenase e sorbitol desidrogenase, que estão envolvidos na síntese de manitol e sorbitol, melhoram a re- sistência à seca.

[00298] Outra modificação exemplar resulta em plantas em que a atividade de uma ou mais glicosiltransferases endógenas - como N- acetilglicosaminiltransferase, β(1,2)-xilosiltransferase e a(1,3)-fucosil-

transferase é modulada (vide WO/2011/117249).

[00299] Outra modificação exemplar resulta em plantas em que a atividade de uma ou mais nicotina N-demetilases é modulada de modo que os níveis de nornicotina e metabólitos de nornicotina - que são formados durante a cura possam ser modulados (vide WO2015169927).

[00300] Outras modificações exemplares podem resultar em plantas com armazenamento melhorado de polipeptídeos e óleos, plantas com maior eficiência fotossintética, plantas com vida útil prolongada, plan- tas com teor de carboidrato intensificado e plantas resistentes a fun- gos. As plantas transgênicas, em que a expressão de S-adenosil-L- metionina (SAM) e/ou cistationina gama-sintase (CGS) tem sido modu- lada também são contempladas.

[00301] Um ou mais genes envolvidos na via de síntese da nicotina podem ser modificados resultando em plantas ou partes de plantas que, quando curadas, produzem níveis modulados de nicotina. Os ge- nes de síntese de nicotina podem ser selecionados a partir do grupo composto por: A622, BBLa, BBLb, JRE5L1, JRE5L2, MATE1, MATE 2, MPO1, MPO2, MYC2a, MYC2b, NBB1, nic1, nic2, NUP1, NUP2, PMT1, PMT2, PMT3, PMT4 e QPT ou uma combinação de um ou mais destes.

[00302] Um ou mais genes que estão envolvidos no controle da quantidade de um ou mais alcaloides podem ser modificados resultan- do em plantas ou partes de plantas que produzem níveis modulados de alcaloides. Os genes de controle de nível alcaloide podem ser sele- cionados a partir do grupo composto por; BBLa, BBLB, JRE5L1, JRE5L2, MATE1, MATE 2, MYC2a, MYC2b, nic1, nic2, NUP1 e NUP2 ou uma combinação de dois ou mais deles.

[00303] Um ou mais desses traços podem sofrer introgressão nas plantas mutantes, de ocorrência não natural ou transgênicas a partir de outro cultivar ou podem ser diretamente transformados nestas.

[00304] Várias modalidades fornecem plantas mutantes, plantas de ocorrência não-natural ou plantas transgênicas, assim como a biomas- sa, em que o nível de expressão de um ou mais polinucleotídeos, de acordo com a presente descrição, são modulados para, assim, modu- lar o nível dos polipeptídeos codificados por eles.

[00305] As partes das plantas descritas neste documento, particu- larmente a lâmina de folha e nervura central dessas plantas, podem ser incorporadas ou usadas para fazer vários produtos de consumo incluindo mas não limitados a materiais formadores de aerossol, dis- positivos formadores de aerossol, artigos fumígenos, artigos para fu- mar, produtos sem fumaça, produtos medicinais ou cosméticos, prepa- rações intravenosas, comprimidos, pós e produtos de tabaco. Exem- plos de materiais formadores de aerossol incluem composições de ta- baco, tabacos, extrato de tabaco, tabaco cortado, material de preen- chimento cortado, tabaco curado, tabaco expandido, tabaco homoge- neizado, tabaco reconstituído e tabacos para cachimbo. Artigos fumí- genos e artigos para fumar são tipos de dispositivos formadores de aerossol. Exemplos de artigos fumígenos ou artigos para fumar inclu- em cigarros, cigarrilhas e charutos. Exemplos de produtos sem fumaça compreendem o tabaco para mascar e rapé. Em certos dispositivos formadores de aerossol, ao invés de combustão, uma composição de tabaco ou outro material formador de aerossol é aquecido por um ou mais elementos de aquecimento elétrico para produzir um aerossol. Em outro tipo de dispositivo formador de aerossol, um aerossol é pro- duzido pela transferência de calor de um elemento combustível ou de uma fonte de calor, para um material formador de aerossol fisicamente separado, que pode estar localizado dentro, ao redor ou a jusante da fonte de calor. Produtos de tabaco sem combustão e vários materiais de formação de aerossol contendo tabaco podem conter tabaco sob qualquer forma, incluindo como partículas secas, pedaços, grânulos, pós, ou uma pasta, depositados, misturados, rodeados por ou outra forma combinados com outros ingredientes em qualquer formato, tais como flocos, filmes, guias, espumas ou grânulos. Conforme usado neste documento, o termo 'fumar' é usado para descrever um tipo de aerossol que é produzido por artigos fumígenos, tais como cigarros, ou pela combustão um material formador de aerossol.

[00306] Em uma modalidade, também é fornecido material vegetal curado das plantas mutantes, transgênicas e de ocorrência não natural aqui descritas. Processos de cura das folhas verdes do tabaco são co- nhecidos por aqueles que versados na técnica e incluem, sem limita- ção, cura ao ar, cura ao fogo, cura por fumeiro e cura ao sol, conforme descrito aqui.

[00307] Em outra modalidade, são descritos produtos de tabaco incluindo materiais de formação de aerossóis que contem tabaco com- posto por material vegetal – tais como folhas, de preferência folhas curadas - de plantas de tabaco mutantes, de ocorrência não natural, ou transgênicas aqui descritas. Os produtos de tabaco aqui descritos podem ser um produto de tabaco misturado que se pode incluir ainda tabaco sem modificações.

[00308] Produtos e métodos para manejo de culturas e agricultura

[00309] As plantas mutantes, de ocorrência não natural, ou trans- gênicas podem ter outros usos como, por exemplo, na agricultura. Por exemplo, as plantas mutantes, de ocorrência não natural, ou transgê- nicas aqui descritas podem ser usadas para fazer ração animal e pro- dutos de comida humana.

[00310] A descrição também fornece métodos para a produção de sementes, compreendendo o cultivo da planta mutantes, de ocorrência não natural ou plantas transgênicas descritas neste documento e a coleta de sementes de plantas cultivadas. As sementes de plantas aqui descritas podem ser condicionadas e ensacadas em material de embalagem por meios conhecidos na técnica para formar um artigo de fabricação. Embalagens de materiais como papel e pano são bem co- nhecidas na técnica. Um pacote de sementes pode ter um rótulo, por exemplo, uma etiqueta ou rótulo afixado ao material de embalagem, um rótulo impresso na embalagem que descreve a natureza das se- mentes contidas nele.

[00311] Composições, métodos e kits para genotipagem de plantas para identificação, seleção ou reprodução podem incluir um meio de detectar a presença de um polinucleotídeo (ou qualquer combinação respectiva conforme descrita aqui) em uma amostra de polinucleotí- deos. Por conseguinte, uma composição é descrita compreendendo um ou mais iniciadores para amplificar especificamente pelo menos uma porção de um ou mais dos polinucleotídeos e, opcionalmente, uma ou mais sondas e, opcionalmente, um ou mais reagentes para a realização da amplificação ou detecção.

[00312] Nesse sentido, os iniciadores ou sondas do gene específico do oligonucleotídeo compreendendo cerca de 10 ou mais polinucleotí- deos contíguos correspondentes ao(s) polinucleotídeo(s) descritos neste documento são divulgados. Os referidos iniciadores ou sondas podem compreender ou consistir de cerca de 15, 20, 25, 30, 40, 45 ou 50 mais polinucleotídeos contíguos que hibridizam (por exemplo, hibri- dizam especificamente) para o(s) polinucleotídeo(s) aqui descrito(s). Em algumas modalidades, os iniciadores ou sondas podem compre- endem ou consistir de cerca de 10 a 50 nucleotídeos contíguos, cerca de 10 a 40 nucleotídeos contíguos, cerca de 10 a 30 nucleotídeos con- tíguos, ou cerca de 15 a 30 nucleotídeos contíguos que podem ser usados em métodos dependentes de sequência da identificação do gene (por exemplo, hibridação Southern) ou isolamento (por exemplo, hibridização de colônias bacterianas ou placas de bacteriófago in situ)

ou detecção do gene (por exemplo, como um ou mais iniciadores de amplificação na amplificação ou detecção). Um ou mais iniciadores ou sondas específicos podem ser concebidos e utilizados para amplificar ou detectar uma parte ou todo(s) o(s) polinucleotídeo(s). A título de exemplo específico, dois iniciadores podem ser usados em um proto- colo de PCR para amplificar um fragmento de polinucleotídeo. A PCR também pode ser realizada usando um iniciador que é derivado de uma sequência polinucleotídica e um segundo iniciador que se hibridi- za à sequência a montante ou a jusante da sequência polinucleotídica – tais como uma sequência promotora, a extremidade 3' do precursor do mRNA, ou uma sequência derivada de um vetor. Exemplos de téc- nicas termais e isotérmicos útil para in vitro amplificação de polinucleo- tídeos são bem conhecidos na técnica. A amostra pode ser, ou pode ser derivada de uma planta, uma célula vegetal ou material vegetal, ou um produto de tabaco feito ou derivado da planta, da célula vegetal ou do material vegetal, conforme descrito aqui.

[00313] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de detec- ção dos polinucleotídeos descritos neste documento (ou qualquer combinação destes, conforme descrito neste documento) em uma amostra compreendendo a etapa de: (a) fornecer uma amostra com- posta por, ou suspeita de ser composta por um polinucleotídeo; (b) por em contato a referida amostra com um ou mais iniciadores ou uma ou mais sondas para detectar especificamente pelo menos uma porção dos polinucleotídeos; e (c) detectar a presença de um produto de am- plificação, em que a presença de um produto de amplificação é indica- tiva da presença de polinucleotídeos na amostra. Em um outro aspec- to, também é fornecido o uso de um ou mais iniciadores ou sondas para detectar especificamente pelo menos uma porção dos polinucleo- tídeos. Kits para detectar pelo menos uma porção dos polinucleotídeos também são fornecidos os quais compreendem um ou mais iniciadores ou sondas para detectar especificamente pelo menos uma porção dos polinucleotídeos. O kit pode incluir reagentes para amplificação polinu- cleotídica - tais como PCR - ou reagentes para tecnologia de detecção de hibridização da sonda - como Southern Blots, Northern Blots, hibri- dização in situ ou microarranjo. O kit pode incluir reagentes para tec- nologia de detecção de ligação de anticorpo como Western Blots, Eli- sa, espectrometria de massa SELDI ou tiras de teste. O kit pode incluir reagentes para sequenciamento de DNA. O kit pode compreender re- agentes e instruções para o uso do kit.

[00314] Em algumas modalidades um kit pode incluir instruções pa- ra um ou mais dos métodos descritos. Os kits descritos podem ser úteis para a determinação de identidade genética, estudos filogenéti- cos, genotipagem, haplotipagem, análise do pedigree ou reprodução e plantas, particularmente com marcação codominante.

[00315] A presente descrição também fornece um método de geno- tipagem de uma planta, uma célula vegetal ou o do material vegetal, compreendendo um polinucleotídeo conforme descrito neste documen- to. A genotipagem fornece um meio de distinguir homólogos de um par de cromossomos e pode ser usada para diferenciar segregantes em uma população de planta. Os métodos de marcador molecular podem ser usados para estudos filogenéticos, caracterizando as relações ge- néticas entre variedades de culturas, identificando cruzamentos ou hí- bridos somáticos, localização de segmentos cromossômicos afetando traços monogênicas, clonagem com base mapeada e o estudo da he- rança quantitativa. O método específico de genotipagem pode empre- gar várias técnicas analíticas de marcador molecular incluindo Polimor- fismo de comprimento de fragmentos amplificados (AFLPs). AFLPs são o produto das diferenças alélicas entre fragmentos de amplificação causados pela variabilidade de polinucleotídeo. Assim, a presente descrição fornece adicionalmente um meio para seguir a segregação de um ou mais genes ou polinucleotídeos bem como sequências cro- mossômicas geneticamente ligadas a estes genes ou polinucleotídeos, utilizando essas técnicas como análise AFLP.

[00316] A invenção é descrita adicionalmente nos Exemplos abaixo, que são fornecidos para descrever a invenção em maiores detalhes. Estes exemplos, que estabelecem um modo preferencial atualmente previsto para a realização da invenção, destinam-se a ilustrar e não a limitar a invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Identificação dos principais genes regulados positi- vamente por aminoácidos depois da cura em folha de tabaco Bur- ley, Virgínia e Oriental

[00317] Para identificar as principais funções que contribuem para a alteração de aminoácidos livres durante o período de cura precoce da folha de tabaco Burley, Virgínia e Oriental, uma análise de super- representação para a função de genes regulados positivamente em folhas curadas após cura de 48h, em comparação com as folhas ma- duras na colheita (log2 fold change >2, valor p ajustado <0,05) é reali- zada no tabaco Burley, Virginia e Oriental. São identificados genes en- volvidos na produção de aminoácidos livres que estão ativos após 48h de cura independentemente dos tipos de cura e das variedades de ta- baco. São investigados genes de tabaco que impactam a produção de aspartato durante o início da cura e pertencentes à família de AAT.

[00318] O conjunto completo de polinucleotídeos NtAAT é identifi- cado no genoma do tabaco, sendo NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5), NtA- AT1-T (SEQ ID NO: 7), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1), NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3), NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11), NtA- AT4-S (SEQ ID NO: 13) e NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15) e suas sequên- cias polipeptídicas deduzidas são NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1- T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2), NtAAT2-T (SEQ ID NO:

4, NtAAT3-S (SEQ ID NO: 10), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 14) e NtAAT4-T (SEQ ID NO: 16).

[00319] As análises da expressão gênica mostram que NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) e NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) são os genes mais ex- pressos (>11x) após 48h de cura no tabaco Burley, Virgínia e Oriental em comparação com as folhas verdes (ver Tabela 1). Curiosamente NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7) também é regulado positivamente após a cura de 48h, mas em menor grau (>2,5). Apenas NtAAT2-S e NtAAT2- T já estão regulados positivamente em folhas maduras, sugerindo que esses genes são os principais impulsores para fornecer aspartato para a síntese de asparagina.

[00320] Os genes NtAAT2-S e NtAAT2-T não são apenas altamente expressos durante o início da cura da folha quando a clorofila é degra- dada, mas também na pétala (vide Tabela 2). Sua expressão é muito baixa na raiz e na folha (vide Tabela 2) e outros tecidos, sugerindo que a função de NtAAT2-S E NtAAT2-T está ligada a uma localização em órgãos acima do solo sem clorofila. A mesma observação parece ser também válida para NtAAT1-S e NtAAT1-T, mas em menor grau. Por- tanto, não pode-se excluir que NtAAT1-S e NtAAT1-T também contri- buem para a síntese de aspartato na folha curada. Pelo contrário, NtAAT3-S/NtAAT3-T E NtAAT4-S/NtAAT4-T parecem ser mais consti- tutivamente expressos em todos os tecidos vegetais (vide Tabela 2).

[00321] As análises de coexpressão confirmaram que NtAAT2-S, NtAAT2-T, NtASN1-S e NtASN1-T são corregulados durante a fase da cura precoce. Para isso, foi usado um banco de dados de transcripto- ma de cura de Burley constituído por 34 amostras de Burley não cura- das e curadas precocemente. Constatou-se que 168 genes são coex- pressos com NtASN1-S e NtASN1-T e 12 genes com NtAAT2-S e NtAAT2-T (limiar >0,9). Entre este conjunto transcriptômico, os trans- critos de NtAAT2-S e NtAAT2-T e NtASN1-S e NtASN1-T estão pre-

sentes nos dois conjuntos de sequências de RNA (9 sequências em comum) associados a outros 5 transcritos. Tal coexpressão associada a um experimento de curso de tempo durante a cura (vide Figura 2) e coexpressão em pétalas e folhas curadas precocemente (vide Tabela 2 e WO2017/042162) sugere que NtAAT2-S e NtAAT2-T e NtASN1-S e NtASN1-T contribuem para a assimilação de nitrato em aminoácidos e asparagina de forma coordenada.

[00322] O silenciamento de NtAAT2-S e NtAAT2-T em plantas de tabaco Burley é investigado para determinar se ambos os genes con- tribuem para diminuir o aspartato nas folhas de Burley curadas. Um fragmento de DNA específico (SEQ ID NO: 17) dentro da sequência de codificação de NtAAT2-S e NtAAT2-T é clonado com o forte promotor do Vírus do Mosaico de Mirabilis (Mirabilis Mosaic Virus - MMV) em um vetor GATEWAY. O fragmento gênico de NtAAT2-S e NtAAT2-T é flanqueado entre MMV e a sequência do terminador em 3' do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens. A linhagem de tabaco de Burley TN90e4e5e10 (Zyvert) é transformada usando protocolos padrão de transformação mediada por Agrobacterium. TN90e4e5e10 (Zyvert) representa uma seleção de uma população de Burley muta- genizada de etil metano sulfonato (EMS) que contém mutações knockout em CYP82E4, CYP82E5v2 e CYP82E10 (vide Phytochemis- try (2010) 71: 17-18) para prevenir a produção de nornicotina. Usar essa linha de fundo pode evitar possíveis complicações ao interpretar os futuros dados do TSNA.

[00323] Para permitir a seleção de plantas com baixo teor de aspar- tato, 16 folhas de plantas T0 independentes (E324) e 4 linhagens con- trole (CTE324) respectivas são analisadas após cura de 60h para de- terminar o impacto na nicotina, como controle (vide Figura 3) e aspar- tato (vide Figura 4). Não há diferença significativa no teor de nicotina entre as folhas da planta T0 (E324) e as linhagens controle (CTE324).

As melhores linhagens T0 que apresentam o nível mais baixo de as- partato são 3, 8, 13, 16, 17 e 20, nas quais a quantidade de aspartato é detectada em níveis muito baixos (75 ug/g) ou não detectável. As sementes são cultivadas a partir dessas melhores linhagens T0 que apresentam o nível mais baixo de aspartato. A progênie T1 é avaliada por qPCR para determinar a eficiência dos eventos de silenciamento de NtAAT2-S e NtAAT2-T em relação ao conteúdo aspartato e aspa- ragina.

[00324] Como aspartato está em uma via importante para a síntese de outros aminoácidos como asparagina, treonina, isoleucina, cisteína e metionina, a manipulação dos genes NtAAT (por exemplo, com um promotor constitutivo ou um promotor de senescência específico – como SAG12 ou E4) pode alterar a química das folhas curadas do ta- baco. Da mesma forma, os genes NtAAT submetidos a nocaute usan- do uma estratégia de edição de genes – como CRISPR-Cas ou sele- ção de mutante, podem alterar a química de aminoácido da folha, bem como a química da fumaça e aerossol das principais variedades de tabaco comercial.

[00325] Qualquer publicação citada ou descrita neste documento fornece informações relevantes reveladas antes da data de depósito do presente pedido. Afirmações neste documento não devem ser in- terpretadas como admissão de que os inventores não se encontram no direito de antedatar tais divulgações. Todas as publicações menciona- das no relatório descritivo acima são incorporadas a este documento à guisa de referência. Diversas modificações e variações da invenção se tornarão aparentes a indivíduos versados na técnica sem que se incor- ra em afastamento do escopo e espírito da invenção. Embora a inven- ção tenha sida descrita em conexão com modalidades preferenciais específicas, deve-se compreender que a invenção, tal como reivindi- cada, não deve ser excessivamente limitada a tais modalidades. Com efeito, várias modificações dos modos descritos para desempenhar-se a invenção que são óbvias a indivíduos versados em biologia vegetal, molecular ou celular e campos relacionados são destinadas a estar dentro dos limites do escopo das seguintes reivindicações. TABELA 1 Expressão de NtAAT (FPKM) durante a cura precoce em tabaco Bur- ley (BU), Virgínia (FC) e Oriental (OR) TABELA 2 Expressão de genes NtAAT na folha, pétala e raiz de plantas Burley (BU) e Virgínia (FC) cultivadas em campo Leaf Folha Petal Pétala Root Raiz

BU FC BU FC BU FC NtAAT1-S 5.2 9.8 17.3 27.6 15.0 11.1 NtAAT1-T 6.6 6.9 52.4 33.5 3.8 4.2 NtAAT2-S 7.6 4.1 152.7 213.0 7.1 6.1 NtAAT2-T 2.1 1.0 68.2 128.7 3.4 4.5 NtAAT3-S 20.5 19.5 25.4 26.0 30.9 18.9 NtAAT3-T 20.9 19.9 37.4 36.9 31.3 24.4 NtAAT4-S 69.0 44.8 42.3 49.8 29.1 24.9 NtAAT4-T 81.5 49.1 43.2 46.9 18.2 18.8

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SEQ ID NO: 1: Sequência nucleotídica de NtAAT2-S atgaacatgtcacaacaatcaccgtcaccgtccgctgaccggaggttgagtgttctggcgagacacct tgaactgtcgtcctccgccaccgtcgaatcctctatcgtcgctgctcctacctctggaaatgctggaa ccaactctgtcttctctcacatcgttcgcgctcccgaagatcctattctcggcgtaactctctctctc tctctctctctctctcttcatccacacacacacgcactcactcacataacatattaagtatatgcgtg ctcaaatgttctgtatgtattcatttgttccgtatcaaatgttctcttgttataagctgaattttaga ggaattgtagtgctatttgctaatcgaaagagcttgatactcattctcttcctattgaattaaatatt ccttttttcttatggatgatgaatttaagacttttttttagtccgatcactacgaaatttcgatttca agttgatagaagtgaaaaatgatggggttaacatatcaattgagcgaataaaaagagaaattcgtgtg ttgatatcttcaaaagtgtatttaaatgtagagatatattgtgatttagtttctgttattatctttgt cttttttctattgaaatttgaatattatttgttgaagtcttcgtgacatatcttggtgttatgttttg gttattaggtcactattgcttacaataaagatagtagccccatgaagttgaatttgggagttggtgca tatcgcacagaggtgatcatcctttttggattttgtatttgcgctattatggtcaatggagcactatt atcagttgctggataatcatcctttttgatatttccttgattgaaatctaaaaacacgaataaaaaga 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MNMSQQSPSPSADRRLSVLARHLELSSSATVESSIVAAPTSGNAGTNSVFSHIVRAPEDPILGVTIAY NKDSSPMKLNLGVGAYRTEEGKPLVLNVVRQAEQLLVNDRSRVKEYLSITGLADFNKLSAKLILGADS PAIQENRVTTVQCLSGTGSLRVGAEFLARHYHQRTIYIPQPTWGNHPKVFTLAGLSVKSYRYYDPATR GLNFQGLLEDLGSAPSGAVVLLHACAHNPTGVDPTIDQWEQIRRLMRSRGLLPFFDSAYQGFASGSLD TDAQSVRMFVADGGEVLVAQSYAKNMGLYGERVGALSIVCRNADVASRVESQLKLVIRPMYSNPPIHG ASIVATILKDRNMYREWTLELKAMADRIIRMRQQLFDALRARGTPGDWSHIIKQIGMFTFTGLNSEQV

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MAIRAAISGRPLKFSSSVGARSLSSLWRNVEPAPKDPILGVTEAFLADPTPHKVNVGVGAYRDNNGKP VVLECVREAERRIAGSFNMEYLPMGGSVNMIEESLKLAYGENSDLIKDKRIAAIQALSGTGACRIFAD FQRRFCPDSQIYIPVPTWSNHHNIWRDAHVPQKMYHYYHPETKGLDFAALMDDIKNAPNGSFFLLHAC AHNPTGVDPTEEQWREISHQFKVKGHFAFFDMAYQGFASGNPEKDAKAIRIFLEDGHPIGCAQSYAKN MGLYGQRVGCLSVVCEDEKQAVAVKSQLQQLARPMYSNPPVHGALVVSTILGDPNLKKLWLGEVKGMA DRIIGMRTALRENLEKLGSPLSWEHITNQIGMFCYSGMTPEQVDRLTKEYHIYMTRNGRISMAGVTTG

NVGYLANAIHEATKSA SEQ ID NO: 7: Sequência nucleotídica de NtAAT1-T atggcgattcgagccgcgatttccggtcgttccctcaagcatattagctcgtcggtcggagcgcgatc tttgtcgtcgttgtggcgaaacgtcgagccggctcctaaagatcctatccttggcgttaccgaagctt tcctcgccgatcctactccccataaagtcaatgttggcgttgtgagtttttttttcctctttgttttg cttcattttccacctcatttcgtgtatgcaaggatttagcttacttgaccatttcgctatacttccct tggtaggccatagctgtaaaaaatagttttactgtgacgaatcatcgacatatggatacagagtattc taatggagtagtcaacaacataagtcgatctcaatcgctttgggattgagaaagagtttattgattta atttttgtatgcgttccacttttttcaacttgatctatttaagaaaaaaattgaaaaagatttgacct tttttcttaaattatttcttttataaaatttgcttttgtgattattatacagggagcttacagggacg acaacggaaaacccgtggtactggagtgtgtcagagaagcagagcggaggatcgctggcagtttcaac atgtgagtgcttctcctgatttattcatttttttctgttatttatttgtaattaattacgattacgtt aaatttgatctattagaaaatataaacttcagccagtaagattactttttttcttcgaggagtttgag atgtaaaacccaggtcggatgcactgggattcttaagtagtttgtacaaatatattcttaatagtttt gtaaaatttgctgtatacacacacatgtaattaattacctactgatctaggatttataggtagttcgg 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ctgtgtgttttgtatgttgtgcagtatggcaggagttactactggaaatgttggttacttggcaaacg ctattcatgaggttaccaaatcagcttaa SEQ ID NO: 8: Sequência polipeptídica deduzida de NtAAT1-T conforme indicado em SEQ ID NO:7

MAIRAAISGRSLKHISSSVGARSLSSLWRNVEPAPKDPILGVTEAFLADPTPHKVNVGVGAYRDDNGK PVVLECVREAERRIAGSFNMEYLPMGGSVNMIEESLKLAYGENSDLIKDKRIAAIQALSGTGACRIFA DFQRRFCPDSQIYIPVPTWSNHHNIWRDAHVPQKTYHYYHPETKGLDFTALMDDIKNAPNGSFFLLHA CAHNPTGVDPTEEQWREISHHFKVKGHFAFFDMAYQGFASGNPEKDAKAIRIFLEDGHPIGCAQSYAK NMGLYGQRVGCLSVVCEDEKQAVAVKSQLQQLARPMYSNPPVHGALVVSTILGDPNLKKLWLGEVKGM ADRIIGMRTALRENLEKKGSPLSWEHITNQIGMFCYSGMTPEQVDRLTKEYHIYMTRNGRISMAGVTT

GNVGYLANAIHEVTKSA SEQ ID NO: 9: Sequência nucleotídica de NtAAT3-S atggcaaattcctccaattctgtttttgcgcatgttgttcgtgctcctgaagatcccatcttaggagt acgtccctttccactctttctattttacatttccactgaatatgtttcttctgtggctcctttaataa tcttccgtaaatatacta ttagtggatttgataagctacttctctctccctctctcttttattttcttattttgggttagattaaa atgaacattaattaatgatcagatgatttggttaaagatgatatctaggagatcggcataaataagtt gattggaatgatcgctatagggtttcctattgtatgcattggatcatggatgtgtgcgctaattattt aatagtacttctttctttttactgtgatctggcaattccttattttattcctggtgtagttgatgaaa ggtgtagatttgattctttaacttgctctattgagaaggtaatttgtgcttctcaagtgtttattaat gttgttttcttctgttgtgttacttcattaaaacaggtcacagttgcttataacaaagataccagccc agtgaagttgaatttgggtgttggcgcatatcgcactgaggtctgccacttctactttgtctcgttgt tctttattattattatttttttattatagccaaaaaaagttgccccttgaatggatttggtcctgcta tgtgttgaatccttggttaagtttttctttaataggctccttcacaaggatagaaaattgtagacact gatgcttacacattagtaatattttttcccctgatgcataatgaagtgaaaccacttgtgcttctaaa aaatcatactttggggcaaggtgaagtacacatttttataagtggttgtttttttcttcaatcttgag ttgaatgttagtgttaagtaggagccgcaaacgggcgggtcgggtcggatttggttcagatcgaaaat gggtaatgaaaaaacaggtaaattatctgactcgacccatatttaatacggataaaaacaggttaacc ggcggataatatgggtaaccatattattcatgtcttcttgcatatgatcaattatgggagaattctta gcctcaaatgggaacccccaatttgaggctttacaaatttaaaagttagacccattggttaaccattt tctaaatggataatatggttcttatccatatttgacccatttttaaaaagttcattatccaacccatt ttttagtggataatatgggtgtttaactgatttcttttaaccattttgacacccctagtgttaagctt gaaaacgactaatgcatagtctgatgacaacttgcaggaaggaaagccccttgttcttaatgtggtga gacgggctgaacaaatgctcgtcaatgacacgtaacttgccaaattagaaactagcttacagattttc ttttgagatatgatcacctgataccaagattggaatctaaggctgctatgatgcaggtctcgggtgaa ggagtatctctcaattactggactagcggattttaacaaactgagtgcaaagcttatatttggtgctg acaggtttggagattttttggtgcagttgctcttgataaatgcttgagtcaattttttttaaaaaaaa tgctcactatccatgtcgctctatttaaacctatcttgccaaaccacttgtataaatgaaaatgagcc gtcgatattcttccttccatctagtttgatatttgaattagagattgttgctaaaagggaatgcttta tctctacagcgtagagtaactgaatacctgttaaacatgttcctccgtatttcatcttattatgatgc cttgcatctgaagaaaattgttctagagttaactttctctcctctttgttgtactgattatctgtgtg tggtgaacgcgatatcaggaaatatgtgtcttctgtcactattactccttgttaagtcatatgtaatt gacttgttatgatatcaacagatttacttatgtttagatgtagtttaaatgctttttgtgctgttttg ttgcttatacagccctgccattcaagagaacagggtgactactgttcagtgcttgtcgggcacaggtt ctttgagggttggggctgaatttctggctaagcattatcatgaagttagtattccttgctctctttcc ctttatatgtctaaatcaaatggacacttgtataagcttctactgtttgttttgttgccagcatacca tatatataccacagccaacatggggaaaccatccgaaggttttcactttagccgggctttcagtaaaa tattaccgttactacgacccagcaacacgaggcctggatttccaaggtactactgtaatcactgttct taaagttctacagttgtaagtaagagccgatttctcttttttatggacaagtgaactttctcctggtc gtgtctagaaagatctatattttatgtgtagctagcacaggatctttatttatttaattttgtattct cttggtaaagatataagcatagtttatctgtggcttttcctgtatttgggtgttgcatatcaaattta atcatgaaccctgtaggacttttggatgatcttgctgctgcacccgctggagcaatagttcttctcca tgcatgtgctcataacccaactggcgttgatccaacaaatgaccagtgggagaaaatcaggcagttga tgaggtccaagggcctgttgcctttctttgacagtgcttaccaggtaaagcttatgatgggattttga attcaagtgatacttcgttaagaatgattaccaaataatttgaagcgccaaactatgtattaatgggc tgcccaacggacccttactataatgaatatttttgatattgcagggttttgccagtggcaacctagat gcagatgcacaatctgttcgcatgtttgtggctgatggtggtgaatgtcttgcagctcagagttatgc caaaaacatgggactgtatggggagcgtgttggtgcccttagcattgtaagtccttttgtcggttgta attgctttccctttttagtaagcgataaaattggtggctgaagaactatccatggctatatcatgcta tctatgtctaaagatgattttccttgaaagcataattcaggttatattccctagaaggctaaaaagaa gttgttctgatggtacaatgaacacagtctctagagatattgaaagccaaatttttgaatatggcttc ccctttgattgtaattggaaaacaaagagaaggacagagtggaattagtaccggattgtatgtttagg aaaaagtgtcattttgtttgagttttatcagacagacactaaaagctgactaacagtacaataaaatt ttgtgttgtgttataggtttgcaaagacgcagatgttgcaagcagagtcgaaagccagctaaagctgg ttatcaggccaatgtactctaatccaccaattcatggtgcgtctattgttgctactatactcaaggac aggtttgtgcaactatttacaagattctgttttgctgttagtagatgctataccttctacattttgat gtggtttctcatctaatggtgatagacaaatgtacgatgaatggacaattgagctgaaagcaatggcc gacaggattattagcatgcgccaacaactctttgatgccttgcaagctcgaggtatttgatcttcata tttgttctttctggggaagcatactgtattctgtatgatgggtttgactgctactgcaataggagctt tttcctgaaaagtaccatggtgaaacaaccacggcaactaaatcttttgacttcattgttcagtttag tgctaatgtaagttttattctgttatgcaggtacgacaggtgattggagtcatatcatcaagcaaatt ggaatgtttactttcacaggattaaatactgagcaagtttcattcatgactagagagcatcacattta catgacatctgatgggtaaggacatctgactattgatattttttttatttgtttagtttgttactttg ggttgcttttttctcagtagaaacttaaataattggaacttagaagtccttcgttgattatttcggct tgaattctttaataaggagaatttcagatttatagcttcagtttggagaggaagcataaacaagtctg tcatccatacttaaaatttacagaaaaaagtgcagttctgttttcccccctcccagattagactaatt cccaaaagaacttaccttcaatctatggaacatttagtattctggtatcagttgaaacatctctttgt tgaagttaagattttggttaaaaagatcttcatctctagtaacattttctacattccatttttagaag gaatgattttctcctttctcatttgcaggagaattagcatggcaggccttagttctcgcacaattcct catcttgccgatgccatacatgctgctgttaccaaagcggcctaa SEQ ID NO: 10: Sequência polipeptídica deduzida de NtAAT3-S conforme indicado em SEQ ID NO:9

MANSSNSVFAHVVRAPEDPILGVTVAYNKDTSPVKLNLGVGAYRTEEGKPLVLNVVRRAEQMLVNDTS RVKEYLSITGLADFNKLSAKLIFGADSPAIQENRVTTVQCLSGTGSLRVGAEFLAKHYHEHTIYIPQP TWGNHPKVFTLAGLSVKYYRYYDPATRGLDFQGTTVITVLKVLQLYKHSLSVAFPVFGCCISNLIMNP VGLLDDLAAAPAGAIVLLHACAHNPTGVDPTNDQWEKIRQLMRSKGLLPFFDSAYQGFASGNLDADAQ SVRMFVADGGECLAAQSYAKNMGLYGERVGALSIVCKDADVASRVESQLKLVIRPMYSNPPIHGASIV ATILKDRQMYDEWTIELKAMADRIISMRQQLFDALQARGTTGDWSHIIKQIGMFTFTGLNTEQVSFMT

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MANSSNSVFAHVVRAPEDPILGVTVAYNKDTSPVKLNLGVGAYRTEEGKPLVLNVVRRAEQMLVNDTS RVKEYLSITGLADFNKLSAKLIFGSDSPAIQENRVTTVQCLSGTGSLRVGAEFLAKHYHEHTIYIPQP TWGNHPKVFTLAGLSVKYYRYYDPATRGLDFQGTTVINVLKVLQLYKHSLSVASPVFGCCVSNLIMNP VGLLDDLAAAPAGVIVLLHACAHNPTGVDPTNDQWEKIRQLMRSKGLLPFFDSAYQGFATGNLDADAQ SVRMFVADGGECLAAQSYAKNMGLYGERVGALSIVCKDADVASRVESQLKLVIRPMYSNPPIHGASIV ATILKDRQMYDEWTIELKAMADRIISMRQQLFDALQARGTAGDWSHIIKQIGMFTFTGLNTEQVSFMT

REHHIYMTSDGRISMAGLSSRTIPHLADAIHAAVTKAA SEQ ID NO: 13: Sequência nucleotídica de NtAAT4-S atggtttccacaatgttctctctagcttctgccactccgtcagcttcattttccttgcaagataatct caaggtaatttcatcgtcaattacattatttggaaatttgccttatcttagactattcctaatgaggt ggattcatgctgttgtttgtgtttgaacagtcaaagctaaagctggggactactagccaaagtgcctt tttcgggaaagacttcgtgaaggcaaaggtaggatttttgtgttgtttgtgtacatttggtgagaggt aatagctctactgctatagagaaactccctgtaggt tctgtcctttagagtatagaagagaaggaaagagtttaattgggaataatggtggggatgggatgatt tgcatacaattgaacatgtgtttcttgctttggtatattatgatataggatgatccaatcatgctccg taaatcaactccagaacttattattctttcggcacttactaattataaaaatcgggttggagtcctga aaataagtgattgcctaaccaacttacagaactaattttattatccgtatactcaaatcaaaacgaca ttatgccagtactggtttcttgagagggatgatattagtgtagaattatttataaagttgcagtttaa cgtagggtgttttactaaccagaaaggtgtagatgattccattcagtttattagatgctaagaagtat aacagtgaggcctgtgaaacttctggtagtaccaacgattggggttttatggcgtttaggaatttaga cattaattggcacattttagaacgaaaaatatgacatttaacttacaacagttcttttctgaataaaa 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ctaaacatggacaatttgcgcccttggcaatgacatgtgtgttgcttgcttttcttctctttctattt cttggtaggagtgacttggttctttcaatgtgagcagtcatatttctgaaaatgaaaatcagaggaac ttgggatgtggaagggattggcagaacaagtttgataatgtaatttttcttgtgaggatggaatatgc aaaaataggctgcacgcttgccttttagatctttggttcctatgtcggttgtgaatgtagatttctat ttttcaacattgtctcgcaaggaaaataggattatccagtattggatgtctttcctatgtttgatatg tgtatgtgcagtcttgtttgaccgtcttgctctcttcccacgtctaaaaagagagtctgatgggaaag tttttttccttccagttcttgtgcaagtcattgacatagtttatggcattacttgtttataggctgct cctgaaggatcatttatcttgctccatggctgtgcgcacaacccaactggtattgatcccacaattga acaatgggaaaagattgctgatgtaattcaggagaagaaccacattccattttttgatgtcgcctacc aggtaatctgtgctaaacccaattatttcatttggtgaagctgtaaaatttcaagtttcttagaagtt ttgatggttgtgtgtgcgtgtgaagagaatgaatgatataggaattggttttgaaatagtgaaagatc tctcgtatttcatttgttcttttggtgtgaggagagtatacattgttgttttgatagatgggcaaatt cgatagatgaaggtggttaagccacgtgttactttgtaatttttttttgacaccgtcatggtgtttat caataaaatttactgatttttcagtaaagttattagaacaagataatctgaagtcatttctattcaga 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tacatttctttccctgtacctgcacttctggtgctcatatttgatctctcttcttggccacgcagagc gagaacatgaccaacaagtggcatgtgtacatgacaaaagacgggaggatatcgttggctggattatc agctgctaaatgcgaatatcttgcagatgccataattgactcgtactacaatgtcagctaa

SEQ ID NO: 14: Sequência polipeptídica deduzida de NtAAT4-S conforme indicado em SEQ ID NO:13

MVSTMFSLASATPSASFSLQDNLKSKLKLGTTSQSAFFGKDFVKAKSNGRTTMTVAVNVSRFEGITMA PPDPILGVSEAFKADTNELKLNLGVGAYRTEELQPYVLNVVKKAENLMLERGDNKEYLPIEGLAAFNK VTAELLFGADNPVIQQQRVATIQGLSGTGSLRIAAALIERYFPGSKVLISSPTWGNHKNIFNDARVPW SEYRYYDPKTVGLDFAGMIEDIKAAPEGSFILLHGCAHNPTGIDPTIEQWEKIADVIQEKNHIPFFDV AYQGFASGSLDEDASSVRLFAARGMELLVAQSYSKNLGLYGERIGAINVLCSSADAATRVKSQLKRLA RPMYSNPPIHGARIVANVVGIPEFFDEWKQEMEMMAGRIKSVRQKLYDSLSTKDKSGKDWSYILKQIG

MFSFTGLNKAQSENMTNKWHVYMTKDGRISLAGLSAAKCEYLADAIIDSYYNVS SEQ ID NO: 15: Sequência nucleotídica de NtAAT4-T atggcttccacaatgttctctctagcttctgccgctccatcagcttcattttccttgcaagataatct caaggtaatttcattgtgaattacattatttggaaatttgccctatcttagactgttcctaatgaggt ggattcatgctgttgtttgtgtttgaacagtcaaagctaaagctggggactactagccaaagtgcctt tttcgggaaagacttcgcgaaggcaaaggtaggatttttgtgttgtttgtgtacatttggtgagaggt aatagctctactgatatagagcaactccctgtaggttctgtcctttagagtatagaagagaagagaag agtttaattgggaataatggtggggatggaatgatttgcatacaaatgaacatgtgtttcttgctttt ggtgtatgatataggatgatccaatcatgctccgtaaatcaactccagaacttattattctttcggca cttctaattataaaaatctggttggagtaatgaatataagtgattacctaaccaacttacagaattga ttttattatccatatactgaaattcaaaaacggcgttttgccagtactggtttcttgagagggatgat attaatatagaattattttataaagttgcagtttaacgtagggtattttactaactagaaaggtgata gatggttccgttcagtttattagaagtataacagtgaggcctgttaaacttttgctagtatcaatgat tggggttttatggcgtttaggaatttagacatcaattggcacattttagaacgaaaaacatgacattt aagttacatcagttcttttctgaataaaatagtactagtaaataacttgtttgaactttgccatttgc taaaatgtggctcaagatcttcttggtacttctatttgtaatatcagagttataggggtctaattcta ccactgttttgagtcaaaatgttattagtaaagataattctttcttgtcccccttcagtgctaacatt ctcatcttcaattatggtattggtttataaaaaaattgtgcttcagatcactttataaagcaaaaatt atgcctcagtttgtacagcattttgggttttataacattcaattcaacagggctctttaatatctatg tttctactttttgtaatctacatcgagctgtttaatgtgctcaaaggctttaattagtcctcctactc accagatccttagaaaaaagcccagaagagaaaggcaaagacaacgagctcggacagattgctcaatt tatattgcaaaaagatccaaaccctcggggagggaggagcatgaaccaaagatgatacattgatatta ttttctaaatttgggaattgtgatcttatcttaaatttttacttttttctctttttctttttttatag tcaaatggtcggactactatggctgtttctgtgaacgtctctcgatttgagggaataacaatggctcc tcctgaccccattcttggagtttctgaagcattcaaggctgatacaaatgaactgaagcttaaccttg gagttggagcttaccgcacagaagatcttcaaccctatgtcctcaatgttgttaaaaaagtaagtcct cggtctcttgtttatgctcaacgtagtttgtaaactaagagtcacttaaccttgttcccatgtgttcg tcattaaacatagtaataactttctatagttttgcatctgaatgatgaggaaattacttttctgtagg cagaaaaccttatgctagagagaggtgacaacaaagaggtacttgatatactaaattcatcttttggc ctattagtgtctcttggtgccatttcttacttattttttgtccatgaatatatagtatcttccaatag aaggtttggctgcattcaacaaagtcacagcagagttattgtttggagcagataatccagtgattcag caacaaagggtaagtattttggtttttaactcttagcaaaaaagtatcctggaacaaacttgtagatt cagtttccacggattgaatggcattgtatgtttcttgatcaggtggctactattcaaggtctatcagg aactgggtcattgcgtattgctgcagcactgatagagcgttacttccctggctctaaggttttgatat catctccaacctggggtacgtatatagtgctttggattaatttggttgaatctcataatactgatttt tgcagttatgttttgcaggaaatcataagaacattttcaatgatgccagggtgccttggtctgaatat cgatattatgatcccaaaacagttggtctagattttgctgggatgatagaagatataaaggttattat cttcctcacttttgtaatctttgtggttgaaattgtaaagcagcagtgagcagtgtctttttcctttc tccacaagtccattgatggtgcctttgcatgtgggacatgctttgactttcagtcgttgaaggagaga tgcgttattcattctaggatagcattgtatctcccaaatgctttttctgtttcctgctcttccttccc atttttgcatcgatcctgtctctgctaaacatggacaatttgcgcccttggcaaatggcaatgacttg tgtgttgcttttcttctctttctattttttggtaggagtgacttggttctttcagtgtgagcagtcat atttctgaaaatgaaaatcagaggaacttggtgctcacacttagagaaagtttgttatgttttgggat gtgaaaggaattgacagaacaagtttgataatatattttttcttgtgaggatggaatatgctaaaaat aggctgcactctttccttttagatctttagttcctatgtcggttgtgaatgtcgatttctattttcaa cattttctcacgaagaaaataggattatccagtactggatgtctctcctatgtctgatatatgtgtat gtgcagtcttgtttgcccgccttgctctctccccacgtctaaaaacagagtctgatggaaaaggcttt ttccttccagcttttgtgtaagtcattgacatagtttaatgaaactacttgtttataggctgctcctg aaggatcattcatcttgctccatggctgtgcacacaacccaactggtattgatcccacaattgaacaa tgggaaaagattgctgatgtaattcaggagaagaaccacattccattttttgatgttgcctaccaggt aatctgtgctaaacccaattattttcatttggtgaagttgtagaattccaagtttcttagaagttttg atggctgtgtgtgcgtgtgtgaaaagaatgaaagatataggagatggtttcaaaatagtgaaagatct ctcgtatttcatttgtcttttggtgtgtggagactatacattgttgtattgatagatgagcgaatttg attgatgttggtggttaagccacatgtgttactttgtccatatttttttacaccgtcttggtttttat caatgaaatttactgatttttcagtgaaattattagaacaagatcatctgaagtcatttctgttcaga gaattggattgaatagctgtatactataataatcgagatgcctcatctgtctacacgctgcactgcag ggattcgcaagcggcagccttgatgaagatgcctcatctgtgagattgtttgctgcacgtggcatgga gcttttggttgctcaatcatatagtaaaaatctgggtctgtatggagaaaggattggagctattaatg ttctttgctcatctgctgatgcagcgacaaggtacaacggccagcactaataatctacatatttctcc tctgtattggtaaaatgatgttgcactgaagattttggttaatgtatgatgccatttatttatgttat gcatgtgcagttctttccgtgtatgatttgttatacaatatagcaagatgagatgctttaatctcctt tggattttatgtggttgaaccaatataacttttcttctgttaatggatgcatatctactaacttacag ggtgaaaagccagctaaaaaggcttgctcgaccaatgtactcaaatccccccattcacggtgctagaa ttgttgccaatgtcgttggaattcctgagttctttgatgaatggaaacaagagatggaaatgatggca ggaaggataaagagtgtgagacagaagctatatgatagcctctccgccaaggataaaagtggaaagga ctggtcatacattctgaagcagattggaatgttctccttcacaggcctcaacaaagctcaggtaaaac cccgtgaattaagttattgctgttgcggaagccaaatatatagagagtgattaaatcacaactactat atctaaaggtagctangtaaatgagacaataataaaatgaacaccagaaattaatgaggttcggcaaa atttgattttttgcctagttctcggacacaatcaactcaaatttatttcactccaaaaatacaaatga aatactacaagagagaaagaagattcaaatgccttaggaaataagaaggcaagtgagagatgtttaca aatgaacaaaatccttgctatttatagaagagaaatggccttaataatgtcatgcatgacatcatatt aagtgtgaacatgtaatgtaaatgcacgaaaaatgcatctaccaatttcttaaggcttcaaatgttca cactagttcacattaatcttgtcaaaattcaacaattgctgcatcacaatatgcttaaattcaatttg atttggttgacaactttctagctttgatcattcatcacaaagcgcattcttcactcagcacgtatttt tattaagacattctttccttccattctgaccgatttcataagttaaatatgcaaaagatagtgcagtg agagtctccttactggattataactatggactaaagttaaatgcatacatttctttccctgtacttgc acttctcgtgctcatatttgatatctcttcttggctacacagagcgagaacatgaccaacaagtggca tgtgtacatgacaaaagacgggaggatatcgttggctggattatctgctgccaaatgtgaatatcttg cagatgccataattgactcatactacaatgtcagctaa SEQ ID NO: 16: Sequência polipeptídica deduzida de NtAAT4-T conforme indicado em SEQ ID NO:15

MASTMFSLASAAPSASFSLQDNLKSKLKLGTTSQSAFFGKDFAKAKSNGRTTMAVSVNVSRFEGITMA PPDPILGVSEAFKADTNELKLNLGVGAYRTEDLQPYVLNVVKKAENLMLERGDNKEYLPIEGLAAFNK VTAELLFGADNPVIQQQRVATIQGLSGTGSLRIAAALIERYFPGSKVLISSPTWGNHKNIFNDARVPW SEYRYYDPKTVGLDFAGMIEDIKAAPEGSFILLHGCAHNPTGIDPTIEQWEKIADVIQEKNHIPFFDV AYQGFASGSLDEDASSVRLFAARGMELLVAQSYSKNLGLYGERIGAINVLCSSADAATRVKSQLKRLA RPMYSNPPIHGARIVANVVGIPEFFDEWKQEMEMMAGRIKSVRQKLYDSLSAKDKSGKDWSYILKQIG

MFSFTGLNKAQSENMTNKWHVYMTKDGRISLAGLSAAKCEYLADAIIDSYYNVS SEQ ID NO: 17: Sequência nucleotídica usada para gerar plantas de RNAi de AAT2S/T gctattcaagagaacagagtaacaactgtgcagtgcttgtctggcacaggctcattgagggttggagc tgaatttttggctcgacattatcatcaacgcac

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula vegetal caracterizada pelo fato de que compreen- de: (i) um polinucleotídeo composto, constituído ou essencial- mente constituído por uma sequência com pelo menos 80% de identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15; (ii) um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo estabe- lecido em (i); (iii) um polipeptídeo compreendendo, compreendendo, constituído ou essencialmente constituído por uma sequência com pe- lo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID No: 8, pelo menos 93% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID No: 12 ou pelo menos 94% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16; ou (iv) um construto, vetor ou vetor de expressão que compre- ende o polinucleotídeo isolado estabelecido em (i), em que a referida célula vegetal compreende pelo menos uma modifi- cação que modula a expressão ou atividade do polinucleotídeo ou do polipeptídeo em comparação com uma célula vegetal de controle na qual a expressão ou atividade do polinucleotídeo ou polipeptídeo não foi modificada.

2. Célula vegetal, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que a referida célula vegetal compreende um poli- nucleotídeo composto, constituído ou essencialmente constituído por uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, apro- priadamente, em que a célula vegetal compreende um polinucleotídeo composto, constituído ou essencialmente constituído por uma sequên- cia com pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; ou em que a referida célula vegetal compreende um polipeptí- deo compreendendo, constituído ou essencialmente constituído por uma sequência com pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID No: 8 ou pelo menos 93% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 94% de identidade de sequência ou SEQ ID No: 4, apropriadamente, em que a célula vegetal compreende um polipeptídeo compreendendo, constituído ou essenci- almente constituído por uma sequência com pelo menos 93% de iden- tidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou pelo menos 94% de identi- dade de sequência com SEQ ID No: 4.

3. Célula vegetal, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma modifi- cação é uma modificação do genoma da célula vegetal ou uma modifi- cação do construto, vetor ou vetor de expressão ou uma modificação transgênica; preferencialmente, em que a modificação do genoma da célula vegetal ou a modificação do construto, vetor ou vetor de expressão é uma mutação ou edição.

4. Célula vegetal, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a modificação diminui a expressão ou atividade do polinucleotídeo ou do polipeptídeo em com- paração com a célula vegetal controle; preferencialmente, em que a célula vegetal compreende um polinucleotídeo de interferência compreendendo uma sequência que é pelo menos 80% complementar a pelo menos 19 nucleotídeos de um RNA transcrito do polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1(i).

5. Célula vegetal, de acordo com qualquer uma das reivin-

dicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a expressão modulada ou atividade do polinucleotídeo ou do polipeptídeo modula o nível de aminoácidos em folha curada ou seca derivada da célula vegetal em comparação com o nível de aminoácidos em folha curada ou seca de- rivada de uma planta controle, apropriadamente em que o aminoácido é aspartato ou um metabólito derivado dele; e/ou em que nível de nicotina na folha curada ou seca da célula vegetal é substancialmente o mesmo que o nível de nicotina na folha curada ou seca de uma planta controle; e/ou em que o nível de acrilamida em folha seca ou curada deri- vada da célula vegetal é reduzido em comparação com o nível de acri- lamida em folha curada ou seca derivada de uma planta controle; e/ou em que o nível de amônia em folha curada ou seca derivada da célula vegetal é reduzido em comparação com o nível de aminoáci- dos em folhas curadas ou secas derivadas de uma planta controle.

6. Planta ou parte dela caracterizada pelo fato de que com- preende a célula vegetal, como definida em qualquer uma das reivindi- cações anteriores; preferencialmente, em que a quantidade de aspartato ou metabólito derivado e/ou de amônia é modificada em pelo menos uma parte da planta em comparação com uma planta controle ou parte dela.

7. Material vegetal, material vegetal curado ou material ve- getal homogeneizado, derivado da planta ou de parte dela, como defi- nida na reivindicação 6, preferencialmente, caracterizado pelo que o material vegetal curada é curado pelo ar ou curado pelo sol ou material vegetal curado em estufa; prefe- rencialmente, em que o material vegetal, o material vegetal curado ou ma- terial vegetal homogeneizado compreende biomassa, semente, caule, flores ou folhas da planta ou de parte dela, de acordo com a reivindi-

cação 6.

8. Produto de tabaco caracterizado pelo fato de que com- preende a célula vegetal, como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 5, uma parte da planta, como definida na reivindicação 6, ou o material vegetal, como definido na reivindicação 7.

9. Método para produzir a planta, de acordo com a reivindi- cação 6, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer uma célula vegetal compreendendo um polinu- cleotídeo composto, constituído ou essencialmente constituído por um polinucleotídeo composto, constituído ou essencialmente constituído por uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15; (b) modificar a célula vegetal para modular a expressão do referido polinucleotídeo em comparação com uma célula vegetal con- trole; e (c) propagar a célula vegetal para uma planta.

10. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que a etapa (c) compreende cultivar a planta a partir de um corte ou muda que compõe a célula vegetal; e/ou em que a etapa de modificação da célula vegetal compre- ende modificar o genoma da célula por edição genômica ou engenha- ria genômica; preferencialmente, em que a edição genômica ou engenharia genômica é se- lecionada entre tecnologia CRISPR/Cas, mutagênese mediada por nuclease dedo de zinco, mutagênese química ou por radiação, recom- binação homóloga, mutagênese direcionada por oligonucleotídeo e mutagênese mediada por meganuclease.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou reivindica- ção 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de modificação da célu-

la vegetal compreende transfectar a célula com um construto compos- to, constituído ou essencialmente constituído por uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15 operacionalmente ligado a um promotor constitutivo; e/ou em que a etapa de modificação da célula vegetal compre- ende introduzir um polinucleotídeo compreendendo uma sequência que é pelo menos 80% complementar a um RNA transcrito do polinu- cleotídeo, de acordo com a reivindicação 1(i), na célula; preferencial- mente, em que a célula vegetal é transfectada com um construto que expressa um polinucleotídeo de interferência compreendendo uma sequência que é pelo menos 80% complementar a pelo menos 19 nu- cleotídeos de um RNA transcrito do polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1(i).

12. Método para produzir material vegetal curado com uma quantidade alterada de aspartato ou metabólito derivado ou com uma quantidade alterada de amônia em comparação com o material vegetal controle, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer uma planta ou parte dela, como definida na rei- vindicação 6, ou o material vegetal, como definida na reivindicação 7; (b) opcionalmente, a colheita do material vegetal do mes- mo; e (c) curar o material vegetal; preferencialmente, em que o material vegetal compreende folhas curadas, caules curados ou flores curadas, ou uma mistura destes; e/ou em que o método de cura é selecionado do grupo que consiste em cu- ra pelo ar, cura pelo fogo, cura por fumaça e cura em estufa.