KR20180043834A - 세포 신장 방법들 및 치료 조성물들 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기 세포(MSC)들의 생산을 위한 방법들, 특히 인간들 및 다른 동물들에서 다양한 질병들의 치료에의 사용을 위해 동종 이계 MSC들과 같은 MSC들의 대규모 생산을 위한 방법들을 위한 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 MSC들의 대규모 생산을 위해 적합한 바람직한 공여자 세포들의 선택을 가능하게 하는 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법들에 의해 제조되는 정제된 MSC들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 MSC들의 배양들을 제조하기 위한 방법들에서 혈소판 용해물의 이용 및 세포외 기질-강화 분비물들의 제조에 관한 것이다. 본 발명은 또한 향상된 안정성 특성들을 갖는 배양된 MSC들로부터 분비된 하나 또는 그 이상의 성분(들)을 포함하는 조성물들의 제조를 위한 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 투여하여 통증의 완화를 포함하여 염증 상태를 치료하기 위한 방법들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 투여하여 신경성 통증을 치료하기 위한 방법들에 관한 것이다.

Description

세포 신장 방법들 및 치료 조성물들

본 발명은 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC)들의 생산을 위한 방법들, 특히 인간들과 다른 동물들에서 다양한 질병들의 치료에의 사용을 위한 MSC들의 대규모 생산을 위한 방법들에 관한 것이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 방법들은 치료에의 사용을 위한 동종 이계 MSC들의 효율적인 대규모 생산을 가능하게 한다. 본 발명은 또한 MSC들의 대규모 생산을 위해 적합한 바람직한 공여자 세포들의 선택을 가능하게 하는 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조되는 정제된 MSC들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 MSC들의 배양들을 제조하기 위한 방법들에서 혈소판 용해물(platelet lysate)의 사용 및 세포외 기질-강화 분비물들의 제조에 관한 것이다. 본 발명은 또한 향상된 안정성 특성들을 가지는, 혈관 표피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF)와 같은 배양된 MSC들로부터 분비된 하나 또는 그 이상의 구성 성분(들)을 포함하는 조성물의 제조를 위한 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지(glycoconjugate-enriched conditioned media)를 투여하여 그 통증을 완화시키는 것을 포함하는 염증 상태를 치료하기 위한 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 투여하여 신경성 통증을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

인간들과 동물들에서 다양한 질병들을 치료하기 위한 동종 이계의 중간엽 줄기 세포(MSC)들의 사용은 많은 그룹들에서 빠르게 확장되고 있는 관심 분야이다. 현재, 골관절염, 심근 경색증, 뇌졸중, 그리고 이식편대숙주병(graft-versus-host disease), 크론병, 류마티스 관절염 및 당뇨병과 같은 면역 체계의 분명한 병발이 있는 다른 질병들을 포함하는 다양한 질병들의 치료를 위해 MSC들의 사용을 조사하는 상당한 숫자의 임상 실험들이 있다. MSC들은 뼈와 연골 내의 결합들을 치료하고, 창상 치유에 기여하기 위한 세포 치료 요법으로서나 조직 공학 개발에서 생체 재료와 결합되어 사용되고 있다.

동종 이계 중간엽 줄기 세포들의 상업적 생산을 위해, 단일 공여자로부터의 세포들이 많은 용량들을 생산하도록 충분히 신장될 수 있는 것이 중요하다. 비록 치료 요법에서의 사용을 위해 적합한 MSC들의 생산을 위한 방법들이 알려져 있지만, MSC들의 대규모 생산에 대한 이러한 방법들의 적용에서 한계들이 존재한다. 예를 들면, 하나의 공여자 샘플은 보다 많은 세포 배가(doubling)에 대한 잠재력이 있을 수 있고, 이에 따라 세포들의 대규모 생산을 위해 적합할 수 있는 반면, 다른 공여자 샘플은 제한된 잠재력을 가질 수 있고 적합하지 않을 수 있는 바와 같이 세포를 구현하기 위해 사용되는 다른 조직 샘플들 또는 세포 샘플들 사이에서 증식 잠재력의 불일치가 존재하는 한계가 있다. 사용자가 조기 단계에서 이러한 샘플들 사이를 식별할 수 있는 신뢰성 있는 수단들은 현재 존재하지 않으므로, 하나의 샘플로부터 야기되는 세포들이 허용될 수 있는 숫자의 용량들이 구현되기 이전에 노화될 수 있어, 노력과 자원들을 낭비하게 할 수 있다.

인간과 동물들에서 다양한 질병들을 치료하기 위한 동종 이계의 중간엽 줄기 세포(MSC)들의 사용 이외에도, 다양한 질병들을 치료하기 위해 MSC들로부터의 분비물들의 이용에서 관심도 증가되고 있다. 이들 분비물들은 개시 사항들이 여기에 참조로 포함되는 본 출원인의 계류 중인 PCT 국제 특허출원 공개 WO2013/040649호(발명의 명칭: "치료 방법들 및 조성물들(Therapeutic methods and compositions)")에 기재되어 있는 바와 같이 다양한 형태들을 취할 수 있다.

여기에 설명되는 실시예들에 있어서, 본 발명은 MSC들 및 MSC계 생성물들을 생산하는 향상된 방법들, 특히 MSC들의 대규모 생산, 동종 이계 세포들의 많은 숫자의 용량들의 생산과 같이 MSC들의 대규모 생산에 적용될 때에 알려진 방법들의 한계들의 하나 또는 그 이상을 개선하는 방법들에 대한 요구를 해결한다. 실시예들에 있어서, 본 발명은 MSC-분비 시토카인(cytokine)들과 성장 인자들을 포함하는 조성물들을 생산하는 향상된 방법들, 그리고 이러한 조성물들 및 사용의 용이성, 저장에 대한 조성물들의 안정성, 또는 치료 잠재성과 같은 알려진 방법들과 조성물들의 하나 또는 그 이상의 한계들을 개선할 수 있는 개선된 방법들 또는 조성물들에 대한 요구를 해결한다.

실시예들에 있어서, 본 발명은 그 통증을 완화시키는 것을 포함하여 염증 상태들을 치료하기 위한 개선되거나 선택적인 방법들 및 제제들에 대한 요구를 해결한다. 실시예들에 있어서, 본 발명은 신경성 통증을 치료하기 위한 개선된 방법들 또는 선택적인 방법들과 제제들에 대한 요구를 해결한다.

본 발명자들은 단일 공여자로부터 MSC들의 매우 많은 숫자의 용량들의 생산을 가능하게 하는 방법들을 개발하였다. 상기 방법은 상기 공여자로부터의 큰 부피의 지방 조직을 먼저 수확하는 단계를 수반한다. 이후에 지방 흡인물(lipoaspirate)이 후에 조직 배양 내에 놓이고 신장되는 기질 혈관 분획(stromal vascular fraction: SVF)을 분리시키기 위해 소화된다.

여기서 설명하는 바와 같이, 본 발명자들은 또한 혈소판 용해물(platelet lysate)을 포함하는 배지 내에서 MSC들의 생산을 위한을 혁신적인 방법들을 개발하였다. 본 발명자들은 여기에 설명되는 조건들 하에서와 같이 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내의 MSC들의 성장이 상기 세포들이 조직 배양 배지 내로 고분자량의 당결합체(glycoconjugate)들의 높은 레벨들을 분비하는 놀라운 이점을 가지는 점을 확인하였다. 이는 골관절염(osteoarthritis)을 포함하는 염증 상태들의 치료나 통증의 완화, 또는 신경성 통증의 완화에 대한 추가적인 치료 이점들을 제공하는 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 생산을 가능하게 한다. 이러한 방식으로 생성된 조건 배지는 혈소판 용해물의 부존재에서 MSC들의 성장에 의해 생성된 조건 배지보다 높은 점성도를 가진다. 상기 점성도는 이에 따라 상기 배양으로부터 세포들 및/또는 조건 배지를 수확하기 위한 적절한 시간의 표지로서 기능할 수 있다. 여기서 입증되는 바와 같이, 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor: FGF) 및 표피 성장 인자(epidermal growth factor: EGF)를 함유하는 배지 내에서 배양된 MSC들은 점성이었던 조건 배지를 가져온다.

여기에 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 또한 대규모 제조를 위해 적합한 세포들을 선택하기 위해 다른 공여자들로부터의 세포들 또는 조직 샘플들, 단일 공여자로부터의 세포들 또는 조직 샘플들을 선별하기 위한 방법들을 개발하였다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 대상에서 염증 상태를 치료하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상에 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 염증 상태는 골관절염(osteoarthritis)이다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 배양-신장된(culture-expanded) MSC들의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 배양-신장된 MSC들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지는 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 MSC들을 배양함에 의해 제조된다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 제조를 위한 혈소판 용해물의 사용을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 인간 혈소판 용해물이다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 제조를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC)들을 배양하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 제조를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 FGF 및/또는 EGF를 포함하는 배지 내에서 중간엽 줄기 세포(MSC)들를 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 세포들은 약 80% 이상의 융합(confluence)까지 배양된다. 일 실시예에 있어서, 상기 세포들은 융합 후 1일 내지 10일 동안 배양된다. 일 실시예에 있어서, 상기 세포들은 융합 후 1일 내지 6일 동안 배양된다. 일 실시예에 있어서, 상기 세포들은 융합 후 약 1일 동안, 융합 후 약 2일 동안, 융합 후 약 3일 동안, 융합 후 약 4일 동안, 융합 후 약 5일 동안, 융합 후 약 6일 동안, 융합 후 약 7일 동안, 또는 융합 후 약 8일 동안 배양된다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 적어도 약 1.55센티스토크(centistoke)의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 적어도 약 1.6센티스토크의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 적어도 약 1.7센티스토크의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 적어도 약 1.8센티스토크의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 적어도 약 1.9센티스토크의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 적어도 약 2센티스토크의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 적어도 약 2.1센티스토크의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 적어도 약 2.2센티스토크의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 적어도 약 2.3센티스토크의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 1.5센티스토크 이상의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 1.7센티스토크 이상의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 2센티스토크 이상의 점성도를 가진다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건 배지는 2.5센티스토크 이상의 점성도를 가진다.

일 실시예에 있어서, 상기 MSC들은 지방 조직-유래 MSC들이다. 일 실시예에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 인간 혈소판 용해물이다. 일 실시예에 있어서, 상기 배지는 약 5%v/v 내지 약 10%v/v 혈소판 용해물을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 강화 배지는 프로테오글리칸(proteoglycan), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 및 뮤신(mucin)의 하나 또는 그 이상을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 강화 배지는 케라탄 황산염(keratan sulphate), 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulphate) 또는 아그레칸(aggrecan)을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 배지로부터 세포들을 제거하는 단계를 더 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 배양된 세포들로부터의 분비물들을 포함하는 조건 배지는 혈소판 용해물의 부존재에서 MSC들을 배양하여 제조되는 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 경우에 비해 향상된 안정성을 갖는 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 배양된 세포들로부터의 분비물들을 포함하는 조건 배지는 FGF 및 EGF의 부존재에서 MSC들을 배양하여 제조되는 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 경우에 비해 향상된 안정성을 갖는 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)은 IFN-γ, IL-8, IL-9, IL-12, IL-15, TNF-α, IL-10, MCP-1, RANTES, GM-CSF, IP-10, PDGF-bb, VEGF 및 IL-6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)은 VEGF이다.

일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 1개월 후에 적어도 60%의 활성의 유지를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 1개월 후에 적어도 70%의 활성의 유지를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 1개월 후에 적어도 80%의 활성의 유지를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 1개월 후에 적어도 90%의 활성의 유지를 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 3개월 후에 적어도 60%의 활성의 유지를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 3개월 후에 적어도 70%의 활성의 유지를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 3개월 후에 적어도 80%의 활성의 유지를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 3개월 후에 적어도 90%의 활성의 유지를 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 6개월 후에 적어도 60%의 활성의 유지를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 6개월 후에 적어도 70%의 활성의 유지를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 6개월 후에 적어도 80%의 활성의 유지를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 향상된 안정성은 실온에서 6개월 후에 적어도 90%의 활성의 유지를 포함한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시예에 있어서, 상기 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 조성물은 혈소판 용해물의 부존재 또는 FGF 및 EGF의 부존재에서 MSC들을 배양하여 제조된 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 경우에 비해 향상된 안정성을 갖는 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)은 IFN-γ, IL-8, IL-9, IL-12, IL-15, TNF-α, IL-10, MCP-1, RANTES, GM-CSF, IP-10, PDGF-bb, VEGF 및 IL-6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)은 VEGF이다. 일 실시예에 있어서, 상기 조성물 내의 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)은 상기 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 부존재에서 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들)을 포함하는 조성물에 비하여 향상된 안정성을 가진다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 MSC들을 배양하여 제조된다. 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 FGF 및/또는 EGF를 포함하는 배지 내에서 MSC들을 배양하여 제조된다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 안정한 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 상기 안정성은 실온에서 1개월 후에 적어도 60%의 활성의 유지를 포함하며, 상기 방법은 상기 배양 배지 내로 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 분비를 허용하도록 충분한 시간 동안 혈소판 용해물을 포함하는 배양 배지 내에서 중간엽 줄기 세포(MSC)들을 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 혈소판 용물은 5%v/v 내지 10%v/v의 농도이다. 일 실시예에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 10%v/v의 농도이다. 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 안정한 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 상기 안정성은 실온에서 1개월 후에 적어도 60%의 활성의 유지를 포함하며, 상기 방법은 상기 배양 배지 내로 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 분비를 허용하도록 충분한 시간 동안 FGF 및/또는 EGF를 포함하는 배양 배지 내에서 중간엽 줄기 세포(MSC)들을 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 FGF 및/또는 상기 EGF는 10ng/ml 내지 30ng/ml의 농도이다. 일 실시예에 있어서, 상기 FGF는 20ng/ml의 농도이다. 일 실시예에 있어서, 상기 EGF는 20ng/ml의 농도이다. 일 실시예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)은 IFN-γ, IL-8, IL-9, IL-12, IL-15, TNF-α, IL-10, MCP-1, RANTES, GM-CSF, IP-10, PDGF-bb, VEGF 및 IL-6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)은 VEGF이다. 일 실시예에 있어서, 상기 MSC들은 인간 지방 조직-유래 MSC들이다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 상기 MSC들을 약 80% 이상의 융합의 세포 밀도까지 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 상기 MSC들을 약 85% 이상의 융합의 세포 밀도까지 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 상기 MSC들을 약 90% 이상의 융합의 세포 밀도까지 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 상기 MSC들을 약 95% 이상의 융합의 세포 밀도까지 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 상기 MSC들을 약 100% 이상의 융합의 세포 밀도까지 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 배양은 적어도 약 1.5센티스토크(cSt)의 점성도를 갖는 조건 배지의 제조를 허용하기 위한 충분한 시간 동안이다. 일 실시예에 있어서, 상기 배양은 적어도 약 1.6센티스토크의 점성도를 갖는 조건 배지의 제조를 허용하기 위한 충분한 시간 동안이다. 일 실시예에 있어서, 상기 배양은 적어도 약 1.7센티스토크의 점성도를 갖는 조건 배지의 제조를 허용하기 위한 충분한 시간 동안이다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 배양으로부터 조건 배지를 수집하는 단계를 더 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 배양으로부터 조건 배지 및 배양-신장된 MSC들을 수집하는 단계를 더 포함한다.

실시예들에 있어서, 상기 안정성은, 선택적으로, 실온에서 1개월 후에 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 적어도 70%의 활성의 유지, 실온에서 1개월 후에 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 80%의 활성의 유지, 실온에서 1개월 후에 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 적어도 90%의 활성의 유지, 실온에서 3개월 후에 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 적어도 70%의 활성의 유지, 실온에서 3개월 후에 적어도 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 적어도 80%의 활성의 유지, 실온에서 3개월 후에 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 적어도 90%의 활성의 유지, 실온에서 6개월 후에 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 적어도 60%의 활성의 유지, 실온에서 6개월 후에 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 적어도 70%의 활성의 유지, 실온에서 6개월 후에 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 적어도 80%의 활성의 유지, 또는 실온에서 6개월 후에 상기 하나 또는 그 이상의 MSC-분비 성장 인자(들) 또는 시토카인(들)의 적어도 90%의 활성의 유지를 포함한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 배양-신장된 MSC들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 조성물을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 조성물은 약학 조성물(pharmaceutical composition)이다. 일 실시예에 있어서, 상기 약학 조성물은 주사 가능한 조성물이다. 일 실시예에 있어서, 상기 약학 조성물은 대상의 피부, 잇몸 또는 점막과 같은 국소 적용을 위한 조성물이다. 일 실시예에 있어서, 상기 약학 조성물은 크림, 겔, 액체 또는 로션이다. 일 실시예에 있어서, 상기 약학 조성물은 국소 적용을 위한 겔 또는 크림으로 조제된 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 계면활성제를 포함하지 않는다.

배양-신장된 MSC들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 조성물의 실시예에 있어서, 상기 세포들은 상기 조성물을 함유하는 용기에 유착되지 않는다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 (i) 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지 또는 (ii) 배양-신장된 MSC들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지, 그리고 약학적으로 허용 가능한 운반체(carrier), 부형제(excipient) 또는 보조제(adjuvant)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용에 대한 적합성을 위해 MSC들의 샘플을 선별하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (i) 혈소판 용해물 혹은 1, 2 또는 3의 계대(passage)들을 위한 FCS를 포함하는 배양 배지 내에서 샘플의 세포들을 배양하는 단계, 그리고 (ii) 단계 (i) 후에 동종 이계 혈청(allogeneic serum)을 포함하는 배양 배지 내에서 상기 세포들 또는 이의 부분 표본(aliquot)을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내의 세포들의 지속적 증식은 배양된 MSC들의 많은 숫자의 생산에의 사용을 위해 적합한 샘플을 나타낸다.

일 실시예에 있어서, 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 적합성은 노화 전에 적어도 25의 집단 배가(population doubling)를 위한 능력을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 적합성은 노화 전에 적어도 30의 집단 배가를 위한 능력을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 적합성은 노화 전에 적어도 35의 집단 배가를 위한 능력을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 적합성은 노화 전에 적어도 40의 집단 배가를 위한 능력을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 적합성은 노화 전에 적어도 45의 집단 배가를 위한 능력을 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 MSC들의 샘플은 MSC들의 지방 조직-유래 샘플이다. 일 실시예에 있어서, 상기 MSC들의 샘플은 인간, 개, 말 및 고양이 MSC들로부터 선택된다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 부적합성에 대해 MSC들의 샘플을 선별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 혈소판 용해물 혹은 1, 2 또는 3의 계대를 위한 FCS를 포함하는 배양 배지 내에서 샘플의 세포들을 배양하는 단계, 그리고 (ii) 단계 (i)로부터의 상기 세포들 또는 그 일부를 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함하고, 상기 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내에서 증식하기 위한 상기 세포들의 기능 상실(failure)은 배양된 MSC들의 대규모 숫자의 생산에의 사용을 위한 부적합한 샘플을 나타낸다.

일 실시예에 있어서, 융합에 도달하기 위한 상기 세포들의 기능 상실은 증식하기 위한 상기 세포들의 기능 상실을 나타낸다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 배양된 MSC들의 대규모 생산을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) MSC들을 포함하는 세포 샘플 또는 조직 샘플을 수득하는 단계를 포함하고, (ii) 배양된 세포 집단을 제공하기 위해 상기 샘플의 적어도 일부를 혈소판 용해물 혹은 1, 2 또는 3의 계대를 위한 FCS를 포함하는 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함하며, (iii) 상기 단계 (ii)로부터의 상기 배양된 세포 집단의 일부를 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함하고, 상기 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내의 세포들의 지속된 증식에 따라, (iv) 배양된 MSC들의 대규모 제조를 제공하기 위해 상기 단계 (i) 또는 상기 단계 (ii)로부터의 상기 배양된 세포 집단의 적어도 일부를 혈소판 용해물 또는 추가적인 계대를 위한 FCS를 포함하는 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 세포 샘플은 지방 조직의 기질 혈관 분획(stromal vascular fraction)을 포한하는 세포 서스펜션(suspension)이다. 일 실시예에 있어서, 상기 세포 샘플은 분리된 MSC들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 세포 샘플은 배양-신장된 MSC들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 단계 (i) 내지 단계 (iv)의 적어도 하나의 세포들은 동결되었던 세포들이다. 일 실시예에 있어서, 상기 단계 (iv)는 10 또는 그 이상의 추가적인 집단 배가를 위하거나; 15 또는 그 이상의 추가적인 집단 배가를 위하거나; 20 또는 그 이상의 추가적인 집단 배가를 위하거나; 25 또는 그 이상의 추가적인 집단 배가를 위하거나; 30 또는 그 이상의 추가적인 집단 배가를 위하거나; 35 또는 그 이상의 추가적인 집단 배가를 위하여 상기 세포 집단을 배양하는 단계를 포한한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 추가적인 계대 그리고, 선택적으로는 상기 수확된 세포들을 MSC들의 치료 용량(therapeutic dose)을 구성하는 개개의 용기들 내로 부분 표본화 하는 단계 후에 배양-신장된 MSC들를 수확하는 단계를 더 포함한다. 일 실시예에 있어서, MSC들의 치료 용량은 약 2백만 내지 약 10백만의 MSC들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, MSC들의 치료 용량은 약 5백만의 MSC들을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 배양-신장된 지방 조직-유래 중간엽 줄기 세포들의 정제된 집단의 제조를 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은,

(i) 대상으로부터의 지방 조직의 샘플을 수득하는 단계를 포함하고;

(ii) 상기 지방 조직을 적어도 부분적으로 소화시키기 위해 적합한 조건들 하에서 상기 지방 조직을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 조건들은 50㎎/L 내지 500㎎/L의 농도로 칼슘을 포함하는 완충제(buffer) 및 0.2%wt/vol 내지 0.02%wt/vol의 농도로 콜라게나아제(collagenase)의 존재에서의 배양을 포함하고;

(iii) 기질 혈관 분획(SVF) 세포들을 수득하기 위해 상기 배양된 지방 조직을 원심 분리하는 단계를 포함하며;

(iv) 원하는 파종(seeding) 밀도로 상기 SVF 세포들을 조직 배양 내로 파종하는 단계를 포함하고;

(v) 상기 배양을 적절한 조건들 하에서 혈청-보강(serum-supplemented) 배지 내에서 적어도 85% 플라스크 융합까지 배양하는 단계를 포함하며;

(vi) 상기 배양으로부터 MSC들을 수확하는 단계를 포함하고;

(vii) 배양-신장된 MSC들을 수득하도록 적어도 10의 집단 배가를 위해 상기 수확된 MSC들 또는 그 자손(progeny)을 계대시키는 단계를 포함한다..

일 실시예에 있어서, 상기 콜라게나아제 농도는 0.05%wt/vol이다. 일 실시예에 있어서, 상기 칼슘은 300㎎/L 내지 400㎎/L의 농도이다. 일 실시예에 있어서, 상기 칼슘은 330㎎/L의 농도이다. 일 실시예에 있어서, 상기 조건들은 오비탈 로터(orbital rotor) 상에서의 혼합을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 파종 밀도는 조직 배양 플라스크의 ㎠ 당 약 5,000 내지 약 15,000의 세포들이다. 일 실시예에 있어서, 상기 조직 배양은 상기 세포들을 마이크로 운반체(microcarrier) 비드(bead)들 또는 디스크들 상에서 배양하는 단계를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 혈청-보강 배지는 FCS 또는 혈소판 용해물을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 FCS는 약 5% 내지 10%의 농도이다. 일 실시예에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 약 5% 내지 10%의 농도이다. 일 실시예에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 10%v/v의 농도이다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법에 있어서, 상기 세포들이 3 이상의 계대를 겪기 이전에, 상기 세포들의 부분 표본은 배양된 MSC들의 대규모 숫자의 생산에의 지속된 사용을 위해 적합한 세포들을 확인하기 위해 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내에서 배양된다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 FCS 또는 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 배양된 MSC들의 대규모 숫자의 생산에의 지속된 사용을 위해 적합한 것으로 확인된 세포들의 지속된 계대 단계들을 더 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 배양-신장된 MSC들을 수득하기 위해 적어도 25의 집단 배가를 위하거나; 적어도 30의 집단 배가를 위하거나; 적어도 35의 집단 배가를 위하거나; 적어도 40의 집단 배가를 위하거나; 적어도 45의 집단 배가를 위하여 수확된 MSC들 또는 그 자손을 계대시키는 단계를 포함한다.

도 1: 송아지 태아 혈청 및 혈소판 용해물 내에서 성장된 MSC들의 배양 배지의 점성도의 비교. MSC들은 10%의 FCS(정사각형들) 또는 10%의 혈소판 용해물(원들)로 보강된 DMEM 내에서 배양되었고, 각각의 배지의 점성도는 융합 후 0일, 1일, 3일 및 6일에 결정되었다. 동작 점성도(kinematic viscosity)는 실험예 5에서 설명한 바와 같이 결정되었고, 센티스토크(cSt)로 시작된다.
도 2: VEGF의 안정성. DMEM 플러스 5%의 혈소판 용해물 내에서 10일 동안 배양된 인간 지방 조직-유래 MSC들의 배양으로부터 수확된 상청액 내의 VEGF의 양은 ELISA를 이용하여 실온(대략 23℃)에서 상청액 조성물의 6개월의 저장에 걸친 다양한 시간들에서 수행된 분석들로 측정되었다.
도 3: 22℃에서 5개월 동안의 저장 후에 점성이 있는(밝은 음영) 및 점성이 없는(어두운 음영) 조건 배지 내의 14의 다른 시토카인들의 퍼센티지 변화의 비교. 값들은 -80℃에서 저장된 출발 물질의 퍼센트 변화로서 나타난다.
도 4: 80% 이하이거나 이상의 융합인 배양들로부터의 조건 배지의 점성도 비교.

약어들

DMEM: 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium)

SVC: 기질 혈관 세포(stromal vascular cell)

SVF: 기질 혈관 분획(stromal vascular fraction)

MSC: 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)

FCS: 송아지 태아 혈청(fetal calf serum)(여기서는 소 태아 혈청(fetal bovine serum)인 FBS로도 언급될 수 있음)

ABC: 탄산수소암모늄 완충제(ammonium bicarbonate buffer)

wt/vol: 중량/부피(weight/volume)

(v/v) 또는 v/v: 부피/부피(volume/volume)

VEGF: 혈관 표피 성장 인자(vascular endothelial growth factor)

(cSt): 센티스토크(centistoke)

본 명세서에 걸쳐, "일" 또는 "하나"의 원소에 대한 언급은 본문에 달리 기재되지 않는 한 복수를 배제하지 않는다. 유사하게, "일 실시예"에 대한 언급은 본문에서 다르게 결정되지 않는 한, 설명되는 하나 또는 그 이상의 다른 실시예들과 결합하여 적용되는 설명된 실시예의 특징을 배제하지 않는다.

본 명세서의 내용에서, "포함하는"이라는 용어는 포함하지만 필연적으로 포함만을 의미하지는 않는다. 또한, "포함하다" 및 "구비하다"와 같은 "포함하는"이라는 단어의 변형들은 대응하여 변화된 의미를 가진다. 따라서, "포함하는"이라는 용어와 이의 변형들은 배타적 의미보다는 포괄적으로 사용되며, 추가적인 정수들이나 특징들이 선택적으로 정수 A를 포함하거나, 정수 A 및 B 등을 포함하는 것으로 설명되는 조성물, 방법 등 내에 제시될 수 있다.

본 명세서의 내용에서, "약" 및 "대략"이라는 용어들은 숙련된 수령자가 주어진 값과 연관시키는 통상의 공차들을 나타내는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서의 내용에서, 범위가 변수에 대해 기재될 경우, 상기 변수가 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하여 상기 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 하위 범위를 포함하는 것과 같이 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 값들뿐만 아니라 기재된 범위 이내의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같이 기재된 범위의 내용에 합당한 정수들 사이의 임의의 값과 범위 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에 포함되는 문헌들, 거동들, 물질들, 장치들, 물품들 또는 이들과 유사한 것들에 대한 임의의 논의는 단지 본 발명에 대한 내용을 제공하는 목적을 위한 것이다. 이들 문제들의 임의의 것이나 모두가 종래 기술 기초의 일부를 형성하거나, 본 출원의 우선인 이전에 본 발명과 관련된 분야에서의 통상적인 일반 지식인 것으로 인정되지 않아야 한다.

본 명세서의 내용에서, "복수의" 및 "다중의"라는 용어들은 하나보다 큰 임의의 숫자를 의미한다.

치료 또는 치료 요업에서나 공여자들로부터의 조직이나 세포들의 수득에서 본 발명의 방법들과 조성물들의 사용에 대한 언급이 인간 및 수의학과 같은 비-인간 적용들에 적용될 수 있는 것으로 이해될 것인 점에 유의해야 한다. 따라서, 다르게 기재되는 경우를 제외하고, 공여자, 환자, 대상 또는 개개의 인간 또는 비-인간에 대한 언급이, 이에 한정되는 것은 아니지만 양, 소, 말, 돼지, 고양이, 개, 영장류, 설치류의 분류들의 구성원들, 특히 양, 소, 말, 돼지, 고양이 및 개들과 같이 이들 분류들의 재배되거나 사육되는 구성원들을 포함하여 사회적, 경제적, 농업적 또는 연구 중요성의 임의의 종들의 개체인 점이 이해될 것이다.

본 발명의 다양한 실시예들이나 측면들의 실험예들이 여기에 설명되는 경우, 대체로 "이와 같은" 또는 "예를 들면", 혹은 "포함하는"을 포함하여 적절한 용어들로 기재될 것이다. 상기 실험예들이 예시 또는 이해의 목적을 위한 것과 같이 포괄적인 가능성으로 설명되며, 본문에 다르게 기재되지 않는 한, 제한적인 것으로 제공되는 것은 아닌 점이 이해될 것이다.

여기에 언급되는 약학 조성물(pharmaceutical composition)은 또한 치료적 사용을 위해 의도된 경우와 같이 약제로 언급될 수 있다. 따라서, 본 발명이 의도된 치료 목적을 위해 약학 조성물의 제조를 위해 설명되는 성분들의 조성물의 사용을 포함하는 것으로 설명되는 경우, 이러한 설명이 본문에 달리 기재되지 않는 한 의도된 치료 목적을 위한 약제의 제조를 위한 사용을 의미하는 점이 이해될 것이다.

본 명세서의 내용에서와 특히 치료적 사용을 위해 배양-신장된(culture-expanded) MSC들의 사용의 내용에서, "용량(dose)"은 개체에 치료 이익을 제공하는 목적을 위해 상기 개체에 투여될 수 있는 배양-신장된 MSC들의 부분 표본(aliquot)이다. 본문에 따라, 여기서 "용량"에 대한 언급은 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지(glycoconjugate-enriched conditioned media)와 같은 추가적인 치료 성분들을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 상기 "용량" 내의 세포들의 실제 숫자는 통상적으로 바람직하게는 약 4백만 내지 약 10백만의 세포들, 또는 바람직하게는 약 5백만의 세포들과 같이 약 2백만 내지 약 20백만의 세포들의 범위 이내이다. "용량"이 한 번 또는 그 이상의 주사들로 투여될 수 있는 점이 이해될 것이다. "용량"은 또한 배양-신장된 MSC들의 적합한 저장의 단위로 여겨질 수 있다.

본 명세서에서 "치료하는", "치료", "치료 요법" 및 이와 유사한 것들과 같은 용어들은 증상들 및/또는 염증성 질환과 같은 상태나 질병의 기저 원인의 완화를 언급한다. 특정 실시예들에 있어서, 치료는 질환의 진행 또는 장애나 손상의 증상들을 늦추거나, 지연시키거나, 중단시키거나, 장애나 손상의 진행을 적어도 일시적으로 반전시킨다. 따라서, 본 발명의 내용에서, "치료"라는 단어나 "치료하는"과 같은 그 파생어들은 치료적 적용과 관련되어 사용될 때에 치료되는 상태와 연관된 통증의 완화, 치료되는 상태의 심각도의 완화, 치료되는 상태의 하나 또는 그 이상의 증상들의 개선 등과 같은 치료 요법의 모든 측면들을 포함한다. "치료"라는 단어 또는 그 파생어들의 사용은 "치료되는" 대상이 전술한 이익들의 임의의 하나 또는 그 이상을 경험할 수 있는 점을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

"방지하는" 및 이와 유사한 용어는 질병의 "방지"의 내용에서 증상들 또는 상기 질병들의 기저 원인의 진행의 방해를 언급한다. 질병의 완전한 방지가 상기 질병들이 동물이나 대상에서 발생되지 않도록 일어날 수 있는 점이 이해될 것이다. 동등하게, 상기 용어가 치료되지 않고 남아 있는 동물이나 대상에서 관찰되는 통상적인 상태의 진행을 방지하는 질병의 기능 상실(failure)과 같이 부분적인 방지를 포함하는 점이 이해될 것이다.

여기서의 설명이 본 발명의 실시예에 의해 제공되는 잠재적인 이점이나 잠재적인 개선점을 기술하는 경우, 모든 실시예들이 이러한 이점이나 개선을 만족시키도록 요구되는 것은 아닌 점이 이해될 것이다.

허용되는 정도까지, 여기서 언급되는 모든 참조 문헌들은 전체적으로 참조로 포함된다.

여기서 설명하는 실시예들에 있어서, 본 발명은 치료 방법들에서의 사용을 위한 것과 같이 배양-신장된 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC)들의 대규모 제조를 위한 개선된 방법들에 관한 것이다. 상기 방법들은 지방 조직의 단일 공여자 제조로부터의 수백만의 MSC들의 치료 용량들의 생산을 가능하게 한다.

중간엽 줄기 세포(MSC)들은 출생 후의 다분화능의 성체 줄기 세포들이다. 중간엽 줄기 세포(MSC)들은 신체의 많은 조직들 내에 존재하며, 조직 복구 및 재생에서 중요한 역할을 한다. 치료 목적을 위해, MSC들은 통상적으로 골수(bone marrow), 태반(placenta), 제대혈(cord blood) 및 지방 조직으로부터 수확된다. 많은 환경들에서, 상기 세포들은 사용 이전에 조직 배양에 의해 신장된다. 본 발명은 이러한 대규모 생산에의 사용을 위해 바람직한 잠재력을 가지는 공여자 세포들의 선택을 위한 방법들을 포함하여 배양-신장된 세포들의 대규모 생산을 위한 개선된 방법들을 제공한다.

지방 조직

본 발명의 내용에서, 상기 중간엽 줄기 세포(MSC)들은 바람직하게는 지방 조직으로부터 유래된다. "유래되는" 상기 MSC들이 본 발명의 방법들이나 조성물들에의 사용을 위해 분리되는 조직 유형을 의미한다. 상기 MSC들은 특히 본 발명의 방법들과 조성물들의 목적을 위해 조직으로부터 분리될 수 있거나, 상기 MSC들은 본 발명의 방법들이나 조성물들과 관련되지 않은 절차에서 조직 소스로부터 이전에 분리되었을 수 있다.

지방 조직은 개, 말 또는 고양이와 같이 인간 지방 조직 또는 포유동물 지방 조직이 될 수 있다. 통상적으로, 상기 지방 조직의 소스는 상기 MSC들의 의도되는 수용자로서 동일한 종들의 것이 될 것이다. 상기 지방 조직은 "백색" 지방 조직 또는 "갈색" 지방 조직을 포함할 수 있다.

풍부한 MSC들과 함께, 지방 조직은 또한 면역 세포들, 혈관, 구강, 근육 세포들, 내피 세포들 및 혈관 주위 세포들을 포함하며, 상기 MSC들과 함께 총괄적으로 기질 혈관 분획(stromal vascular fraction: SVF)으로 언급된다.

지방 조직의 수집 및 처리

지방 조직은 지방 흡인(liposuction)에 의하거나 절제(excision)에 의해 공여자들로부터 수집된다. 배양된 MSC들의 대규모 제조에 관한 본 발명의 방법들에서, 많은 양(약 200그램 내지 2000그램)의 지방 흡인물(lipoaspirate)이 제조될 수 있는 세포들의 숫자에 영향을 미치게 되는 경우에 출발 물질로서 수집되거나, 이용 가능하게 만들어진다.

개들로부터 세포들을 생산하기 위해, 지방 조직은 통상적으로 서혜부 지방체(inguinal fat pad)들 또는 어깨로부터 낫 형상(falciform)의 절제에 의해 수집된다. 말들로부터 세포들을 생산하기 위해, 지방 조직은 통상적으로 꼬리 바닥, 흉부 또는 복부로부터의 절제에 의해 수집된다. 인간들로부터 세포들을 생산하기 위해, 지방 조직은 복부, 대퇴부 또는 엉덩이로부터 수집된다.

상기 지방 조직은 해당 기술 분야에서 쉽게 이용할 수 있는 기술들을 이용하여 지방 조직을 기계적으로 분리함에 의해 최초로 처리될 수 있다. 지방 조직의 기계적 분리를 위한 임의의 적합한 방법은, 예를 들면 칼날로나 가위로 지방 조직을 다지거나, 상기 조직을 분리된 세포들이나 지방 조직의 작은 조각들로 부수기에 충분한 공극 크기를 갖는 지방 조직을 스크린이나 메시를 통과시키거나, 이들 기술들의 결합으로 이용될 수 있다. 바람직한 방법들에서, 기계적인 분리가 이용되는 경우, 상기 지방 조직은 소화 이전에 가위로 미세하게 다져진다.

놀랍게도 상기 지방 조직으로부터 추출되는 세포들의 숫자가 생존 가능한 세포들을 유지하면서 최대화될 수 있고, 이에 따라 다음의 단락들에서 설명하는 바와 같이 최적의 지방 조직 소화의 이용을 통해 SVF 셀 수율과 생존도를 최대화할 수 있는 점이 발견되었다. SVF 수율과 생존도를 최대화하는 것이 작업자에게 중요할 경우, 이러한 방법들이 바람직할 것이다.

지방 조직은 적절한 완충제의 존재에서 콜라게나아제(collagenase)로 배양에 의해 소화된다. 소화에서, 콜라게나아제는 약 0.2%wt/vol, 약 0.15%wt/vol, 약 0.1%wt/vol, 약 0.9%wt/vol, 약 0.08%wt/vol, 약 0.07%wt/vol, 약 0.06%wt/vol, 약 0.05%wt/vol, 약 0.04%wt/vol, 약 0.03%wt/vol, 또는 약 0.02%wt/vol과 같이 약 0.2%중량/부피(wt/vol) 내지 약 0.02% wt/vol의 최종 농도까지 첨가된다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 소화 단계에서 상기 콜라게나아제는 약 0.05%wt/vol의 최종 농도까지 첨가된다.

본 발명자들은 향상된 세포 수율 및 생존도가 또한 소화 동안에 칼슘을 함유하는 완충제의 사용에 의해 보조되는 점을 확인하였다. 상기 소화 단계 동안의 칼슘의 농도는 약 50㎎/L, 100㎎/L, 125㎎/L, 150㎎/L, 175㎎/L, 200㎎/L, 225㎎/L, 250㎎/L, 300㎎/L, 325㎎/L, 330㎎/L, 350㎎/L, 375㎎/L, 400㎎/L, 425㎎/L, 450㎎/L, 475㎎/L, 또는 500㎎/L와 같이 약 50㎎/L 내지 약 500㎎/L의 범위이다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 소화에서 칼슘의 농도는 약 330㎎/L이다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 완충제는 칼슘을 함유하는 링거 완충액(Ringers buffer) 또는 칼슘을 함유하는 인산 완충 생리 식염수(phosphate buffered saline: PBS)이다.

상기 지방 조직은 약 37℃와 같은 적절한 온도에서 약 30분 내지 약 120분과 같은 적절한 시간 동안 상기 콜라게나아제의 존재에서 배양된다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 배양은 약 90분 동안이다. 본 발명자들은 너무 많은 혼합이나 너무 철저한 혼합은 세포 생존도에 영향을 미치게 되므로 세포들을 해리시키도록 상기 소화 단계 동안의 세심한 혼합에 의해 향상된 세포 수율과 생존도가 보조되는 점을 확인하였다. 혼합은 상기 배양 동안에, 예를 들면 약 매 15분 간격으로 물질의 부드러운 반전에 의한 것과 같이 수동으로 수행될 수 있다. 혼합은, 예를 들면 오비탈 로테이터(orbital rotator) 상에서 약 50rpm 내지 약 200rpm의 범위로의 혼합과 같이 기계적 수단들에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 혼합은 수동에 의하거나 오비탈 로테이터 상에서 약 100rpm에 의한다.

지방 조직-유래 세포 서스펜션(suspension)의 제조는 원심 분리 단계를 포함할 수 있다. 배지와 같은 액체 내에 현탁된 지방 조직의 분리된 세포들이나 작은 응집체들이나 조각들은 지방-유래의 비지방 세포들을 포함하는 세포 펠릿을 생성하도록 대략 500g에서 10분 동안, 또는 for 충분한 시간 동안 충분한 중력에 있고, 상부가 배지의 층이며, 그 상부에 부유하는 것은 생존 가능한 지방 세포들을 포함하는 층이고, 상단에 부유하는 것은 파열된 지방 세포들로부터 유래되는 지질의 층이다. 원심분리에 후속하여, 상기 지질 층, 상기 지방 세포들 및 배지 층은 바람직하게는 버려질 것이며, 상기 MSC들을 포함하는 SVF로 언급되는 펠릿으로 된 물질이 유지된다. 상기 펠릿으로 된 세포들은 또한 지방-유래의 비지방 세포들로서나 SVF 세포들로서 언급될 수 있다.

조직 배양

상기 SVF 세포들은 조직 배양 내로 놓여진다. 상기 SVF는 MSC들을 포함하여 세포 유형들의 혼합된 집단(population)을 함유한다. 적혈구(RBC)들은 통상적으로 세포 클러스터(cluster)들이 될 수 있는 바와 같이 상기 SVF 내에 존재한다. 상기 RBC들은 통상적으로 적은 숫자로 오염물로서 존재하며, 대부분의 상기 RBC들은 콜라게나아제로의 소화 이전에 상기 지방 조직 조각들을 세척하여 제거되었다. 다른 연구자들은 통상적으로 형광 표시 세포 분류(fluorescence activated cell sorting: FACS) 또는 면역-자기 세포 분리(immune-magnetic cell separation: IMS)에 의하는 바와 같이 조직 배양을 수행하지 이전에 다른 세포 유형들로부터의 상기 MSC들을 정제하거나, 밀도 구배 원심 분리, 적형구들의 용해(lysis)나 제거, 또는 세포 클러스터들의 제거에 의해 부분적으로 정제한다. 본 발명의 방법들에서, 조직 배양 이전에 상기 SVF로부터 상기 MSC들을 더 정제할 필요는 없다. 본 발명자들은 놀랍게도 상기 MSC들의 이전의 정제가 요구되지 않으며, 배양 상에서 향상된 MSC 수율 및 생존도가 상기 MSC들이 배양하기 이전에 상기 SVF로부터 더 정제되지 않을 때에 수득된다는 사실을 확인하였다. 이론에 의해 구속되는 것을 바라지 않고, 일부 알려진 방법들로 수행되는 경우의 용해에 의한 적혈구들을 제거하는 단계에 대하여, 본 발명자들은 용해되는 적혈구들이 MSC 수율과 생존도에 불리하게 영향을 미치는 것으로 추정한다.

상기 SVF 세포들은 조직 배양 플라스크의 ㎠ 당 약 5,000 내지 약 15,000의 세포들의 레벨로 파종된다. 상기 MSC들은 상기 SVF 내에 존재하는 세포들을 가장 빠르게 성장시키며, 다른 세포 유형들보다 빠르게 성장시켜 MSC들의 순수한 집단을 가져온다. 놀랍게도, 경쟁하는 오염물 또는 비-MSC 세포들의 존재에도 불구하고, 신장에 대한 이러한 접근은 조직 배양 이전에 MSC들의 출발 집단을 정제하는 경우보다 높은 세포 수율들을 가져온다.

MSC들을 배양하기 위한 방법들은 해당 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들면, 융합 유착 세포 배양과 같은 유착 세포 배양을 형성하는 세포들을 배양하는 과정을 포함한다. 임의의 적절한 시간 동안이나 이후에, 융합 유착 세포 배양이 될 수 있는 유착 세포 배양으로부터와 같이 세포 상청액(supernatant)의 배양이 수확되며, 지방 조직-유래 분비물들을 포함하는 조성물을 형성하기 위해 상기 상청액으로부터 세포들이 제거된다. 임의의 적절한 배지가 상기 세포들의 배양을 위해 사용될 수 있다. 적절한 배지는 예를 들면, DMEM, RPMI 및 최소 필수영양 배지를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 세포들은 DMEM 내에서 배양된다.

상기 세포 배양은 바람직하게는 멸균 혈청의 존재에 있다. 상기 배양 내의 혈청의 농도는 예를 들면, 약 10% v/v, 약 15%v/v 또는 약 20%v/v와 같이 약 1%부피/부피(v/v) 내지 약 30%v/v의 범위 내의 지방 조직-유래 세포들의 배양을 보조하는 임의의 적합한 농도가 될 수 있다. 상기 혈청은 상업용 송아지 태아 혈청(fetal calf serum) 또는 해당 기술 분야에 알려진 방법들에 의한 것과 같이 하우스에서 제조된 혈청과 같은 지방 조직-유래 세포들을 위한 임의의 적절한 혈청이 될 수 있다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 혈청은 자기 유래이며, 상기 지방 조직이 수득되는 동일한 개체 또는 동종 이계로부터 제조되었다. 통상적으로, 상기 세포들은 5%의 CO₂로 37℃에서 배양된다.

본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 혈청은 다른 종들로부터가 된다. 예를 들면, 세포들은 개, 말 또는 인간이 될 수 있고, 각기 개, 말 또는 인간 이외의 혈청을 함유하는 배지 내에서 배양될 수 있다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 세포들은 송아지 태아 혈청으로 보강된 배지 내에서 배양된다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 배지는 10%의 FCS를 포함한다. 세포들은 최종 생성물로부터 FCS를 제거하도록 최종 계대(passage)와 같이 이후의 계대에서 상기 FCS로부터 동종 이계 혈청(allogeneic serum)으로 전환된다.

배양된 MSC들의 대규모 제조를 위한 방법들에서, 상기 세포들은 통상적으로 37℃의 CO₂ 배양기에서 4일-21일 동안 배양 배지 및 혈청 내에서 적어도 85% 플라스크 융합(confluence)(융합 판단의 방법은 현미경을 통한다)까지 성장된다.

본 발명은 또한 마이크로 운반체(microcarrier)들 상에서, 예를 들면 교반된 생물 반응기(bioreactor) 내에서 배양된 MSC들을 제공한다. 상기 MSC들은 코팅되지 않거나, 콜라겐(collagen)과 같은 특정한 단백질들로 코팅될 수 있고, 그 표면상에 특정한 전하 분포를 가지도록 처리될 수 있는 마이크로 운반체 비드(bead)들(90-400㎛) 상에서 배양될 수 있다. 상기 마이크로 운반체들은 스피너 플라스크(spinner flask), 마이크로 생물 반응기(microbioreactor)들, 교반되는 탱크, 요동 플랫폼(rocking platform)들 또는 미세 중력과 같은 많은 용기들 내에서 세포들의 성장을 위해 이용될 수 있다. 세포들은 또한 피브라-셀®(Fibra-Cel®) 디스크들(뉴 브런즈웍 사이언티픽(New Brunswick Scientific), 에디슨시, 뉴저지주) 상에서 배양될 수 있으며, 현탁되고 교반되는 시스템으로서나 정지 충전층으로서 생물 반응기 내에 유지될 수 있다. MSC들과 같은 배양 내의 세포가 상기 배양 배지 내로 성분들을 분비하므로, 상기 배양으로부터 수득된 액상은 상기 세포들로부터 분비된 성분들을 함유할 것이다. 이들 분비된 성분들은 여기서는 총괄적으로 세크리톰(secretome)으로 언급될 수 있다. 상기 세포를 배양 하는 동안에 발생되는 액상은 여기서 분비물들로서 언급될 수 있거나, 상기 배양 내의 세포들이 지방 조직-유래의 비지방 세포들인 경우에, 지방 조직-유래의 비지방 세포들로부터의 분비물들로서 언급될 수 있다. 선택적으로는, 배양 동안에 발생되고, 선택적으로는 배양으로부터 수득되는 상기 액상은 여기서 조건 배지로도 언급될 수 있다.

혈소판 용해물 내에서 배양된 MSC들 및 고분자량의 당결합체-강화 배지의 생산

본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 세포들은 혈소판 용해물(platelet lysate) 내에서 배양된다. 여기서 설명하는 방법들에서, 혈소판 용해물은 인간 세포들의 조직 배양을 위한 혈청 소스가 바람직하다. 혈소판 용해물은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 또는 약 20%와 같이 약 1%부피/부피(v/v) 내지 약 20%v/v의 농도, 바람직하게는 약 5%v/v와 같이 약 2% 내지 약 7.5%의 농도 범위, 또는 보다 바람직하게는 약 10%와 같이 약 7.5% 내지 15%의 농도 범위로 사용된다.

혈소판 용해물은 혈소판 용해물-보강 배지 내의 세포들의 생장에 의해 상기 세포들의 높은 수율을 가져온다. 본 발명자들은 놀랍게도 높은 레벨들의 세포외 기질(extracellular matrix: ECM) 성분들을 함유하는 조건 배지의 생산을 가증하게 하였다. 여기서 입증되는 바와 같이, 혈소판 용해물 내에서 성장된 세포들은 높은 농도의 세포외 기질(ECM) 성분들을 분비하며, 이들은 프로테오글리칸(proteoglycan)들, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)들 및 뮤신(mucin)들을 포함할 수 있다.

여기의 실험예들에서 설명하는 바와 같이, 본 발명자들은 또한 유사하게 매우 점성인 조건 배지가 표피 성장 인자(epidermal growth factor: EGF) 및/또는 염기성 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor: FGF)를 함유하는 배지 내에서 상기 세포들을 성장시킴에 의해 구현될 수 있는 점을 보여주었다. 상기 배양 배지 내의 EGF의 농도는 약 20ng/ml와 같이 약 10ng/ml 내지 약 30ng/ml의 범위 내에 있을 수 있다. 상기 배양 배지 내의 FGF의 농도는 약 20ng/ml와 같이 약 10ng/ml 내지 약 30ng/ml의 범위 내에 있을 수 있다.

상기 강화 조건 배지는 여기서 대체로 고분자량의 당결합체-강화 배지 또는 ECM 성분들을 포함하는 조건 배지로 언급될 것이다. 동작 점성도(kinematic viscosity)의 예비적인 결과들은 상기 점성도 성분이 GAG, 프로테오글리칸, 아그레칸(aggrecan), 베르시칸(versican), 루미칸(lumican), 뮤신 또는 다른 고분자량의 분자나 분자들의 복합체인 추정을 지지하였다.

본 발명은 또한 이에 따라 고분자량의 당결합체-강화 배지의 생산을 위한 방법들을 제공한다. 이러한 배지는 골관절염(osteoarthritis)을 포함하여 염증 상태들의 치료에 대해 추가적인 치료 이점들을 제공한다. 비록 혈소판 용해물-보강 배지 내에서 MSC들의 배양함에 의한 고분자량의 당결합체-강화 배지의 생산이 여기에 설명되는 본 발명의 방법들에 의한 지방 조직으로부터 수득된 MSC들을 이용하여 본 발명자들에 의해 초기에 개발되었던 점과 관련하여, 본 발명을 완성함으로써, 본 발명자들은 상기 강화 배지를 제조하는 데 사용되는 상기 MSC들이 여기에 설명되는 수집 및 소화 방법들에 의해 지방 조직으로부터 수득되는 경우에만 한정되지는 않는 것으로 여겨진다.

예를 들면, 대규모 MSC 생산의 조직 배양을 위한 지방 조직-유래 SVF의 제조에서, 여기서는 상기 SVF는 바람직하게는 초기 조직 배양 단계들 이전에 MSC들을 분리하기 위해 더 분별되거나 정제되지 않는 것으로 설명된다. 혈소판 용해물-보강 배지 내에서 MSC들을 배양하여 고분자량의 당결합체-강화 배지를 제조하는 방법들에서. 상기 MSC들은 상기 방법에 따라 제조될 수 있거나, 조직 배양에 사용될 수 있는 MSC들을 제공하는 임의의 다른 적합한 방법에 따라 제조되거나 수득될 수 있다.

예를 들면, 상기 바람직한 대규모 방법은 배양을 개시하기 이전에 상기 SVF로부터의 MSC들을 정제하지 않는 반면, 혈소판 용해물-보강 배지 내에서 MSC들을 배양하여 고분자량의 당결합체-강화 배지를 제조하는 방법들에서의 사용을 위한 MSC들은 상기 SVF의 초기 분리 후 및 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에 배치하기 전에 임의의 적합한 수단들에 의해 더 정제될 수 있다.

다른 예로서, 고분자량의 당결합체-강화 배지를 제조하는 방법들에서의 사용을 위한 상기 MSC들은 이전에 정제되었거나 및/또는 세포 배양에 의해 배양-신장된 세포들과 같이 정제되고 저장된 MSC들이 될 수 있거나, 동결 저장으로부터 회수된 세포들이 될 수 있다.

상기 고분자량의 당결합체-강화 배지를 제조하는 방법들에서의 사용을 위한 MSC들이 지방 조직-유래 MSC들에 한정되는 것은 아닌 점에 유의해야 할 것이다. 상기 고분자량의 당결합체-강화 배지를 제조하는 방법들에서의 사용을 위한 MSC들은 이에 따라 MSC들의 임의의 적절한 소스로부터, 예를 들면 골수, 치수(dental pulp), 지방 조직, 인대 조직(chord tissue), 인대 혈액 및 순환 혈액으로부터의 유래될 수 있다.

또한, 본 발명은 이에 따라 MSC들 및 세포외 기질(ECM) 성분들을 포함하는 조건 배지의 결합을 제공하며, 이러한 배지도 여기서 고분자량의 당결합체-강화 배지로 언급될 수 있다. 본 발명자들은 세포들 및 ECM을 포함하는 조건 배지의 이러한 결합의 약학 조성물이 MSC들만의 배양으로부터의 MSC들 단독 또는 조건 배지의 사용에 대해 추가적인 치료 이점들을 제공할 수 있는 것으로 예상한다. 본 발명의 방법은 이에 따라 MSC들 및 ECM 성분들을 포함하는 조건 배지를 포함하는 조성물을 가능하게 하며, 여기서 상기 ECM 성분들을 포함하는 조건 배지는 상기 조성물의 세포들이 신장되었던 경우가 될 수 있거나, MSC들의 신장으로부터의 것이 상기 조성물 내에 포함되지 않는 경우가 될 수 있다. MSC들을 포함하는 조성물 및 이들 MSC들이 신장되었던 ECM 성분들을 포함하는 조건 배지의 사용은 추가적인 이점들을 제공할 수 있다. 상기 MSC들, 상기 고분자량의 당결합체-강화 배지, 또는 이들의 결합은 약학 조성물의 형태가 될 수 있다. 이러한 형태에서, 상기 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 운반체(carrier), 부형제(excipient) 또는 보조제(adjuvant)를 포함할 수 있거나, 적어도 통상적으로 의도되는 대상 내의 치료적 사용과 양립할 수 없는 성분을 포함하지 않을 것이다. 상기 약학 조성물은 주사에 의한 사용을 위한 형태로 될 수 있거나, 국소 적용에 의한 사용을 위한 형태로 될 수 있다. 상기 조성물이 MSC들을 포함하는 경우, 상기 조성물은 통상적으로 주사를 위해 적합한 형태로 될 것이다. 상기 조성물이 국소 적용을 위한 것인 경우, 상기 조성물은 통상적으로 겔, 크림, 액체 또는 로션 제형을 포함할 것이다.

상기 혈소판 용해물은 임의의 적절한 소스로부터 수득될 수 있다. 적절한 상업용 소스는 밀 크릭 라이프 사이언스(Mill Creek Life Sciences)(로체스터시, 미네소타주, 미국)로부터의 PLT 맥스(Max)이다. 상기 혈소판 용해물은 상기 MSC들이 배양되는 경우에 동일하거나 다른 종들로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 상기 MSC들이 배양되는 경우에 동일한 종들로부터 유래된다. 본문에서, "유래되는" 혈소판 용해물은 분리된 혈소판들의 용해를 수반하는 상기 혈액 샘플로부터의 혈소판들의 분리에 의하는 바와 같이 혈액 샘플로부터 제도되었던 혈소판 용해물을 기술한다. 상기 혈소판 용해물이 유래되는 혈액 샘플은 상기 MSC들로서나, MSC들이 지방 조직으로부터 제조되는 경우에 상기 MSC들의 제조를 위한 지방 조직으로서 동일한 개체로부터 유래될 수 있거나 유래되지 않을 수 있다. 통상적으로, 상기 혈액 샘플은 상기 MSC들 또는 상기 지방 조직이 유래되거나 수득되지 않는 경우와 다른 개체로부터 유래된다.

상기 혈소판 용해물은 신선한 전체 혈액으로부터 또는 숙련된 수령자에게 알려진 방법들이나 키트들을 이용하여 신선한 전체 혈액으로부터 또는 저장된 전체 혈액으로부터 제조될 수 있다. 상기 혈소판 용해물은 단일 공여자로부터가 될 수 있거나, 모여진 혈액 또는 세포들로부터가 될 수 있다. 상기 혈소판 용해물은 수집 후 약 5일 내지 7일과 같이 기한이 지난 주입 가능한 전체 혈액이나 혈소판들로부터 제조될 수 있다. 상기 혈소판 용해물은 마코파르마(MacoPharma)(프랑스)로부터의 혈소판 용해물 키트(kit)와 같이 상업적으로 입수 가능한 키트를 이용하여 혈액으로부터 제조될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 구연산염(citrate)과 같은 항응고제의 존재에서 수집된 혈액으로부터 제조된다. 상기 혈액은 이후에 상기 세포들을 용해시키도록 동결 융해(freeze-thawing)가 수행되는 상기 혈소판들(상단 층)의 수집이 수반되는 200g에서 약 20분 동안과 같은 적절한 조건들 하에서 원심 분리된다. 통상적으로, 둘, 셋, 넷, 또는 그 이상의 회와 같이 여러 회의 동결 융해가 수행된다. 용해된 혈소판들은 상기 펠릿으로 된 세포 조각들이 버려지도록, 예를 들면 4000g에서 약 10분 동안 원심 분리된다. 상기 혈소판 용해물은 0.22미크론의 필터와 같이 적합한 기질을 통해 여과함에 의하는 것과 같이 살균될 수 있고, 사용까지 -80℃와 같이 적절한 조건들 하에서 저장될 수 있다.

본 발명의 방법들에서, 세포들이 혈소판 용해물 내에서 배양될 때, 응고를 방지하기 위해 헤파린(heparin)도 통상적으로 상기 세포 배양 배지에 첨가된다. 헤파린은 약 0.6IU/mL 내지 약 5IU/mL의 범위로 상기 세포 배양 배지 내에 포함될 수 있다. 예를 들면 헤파린은 약 0.6IU/mL, 약 0.8IU/mL, 약 1IU/mL, 약 1.5IU/mL, 약 2IU/mL, 약 2.5IU/mL, 약 3IU/mL, 약 2.5IU/mL, 약 4IU/mL, 약 4.5IU/mL, 또는 약 5IU/mL의 농도로 포함될 수 있다. 바람직한 실시예들에 있어서. 헤파린은 약 2IU/mL로 포함된다.

여기서의 실험예들에서 설명되는 바와 같이, 상기 강화 조건 배지는 FCS로 보강된 배지 내에서 MSC들를 배양하여 생성되는 조건 배지(여기에 예시되는 바와 같이 혈소판 용해물, FGF 및 EGF의 부존재에서) 보다 높은 점성도를 가지는 것으로 입증되었다. 상기 점성도는 상기 MSC들의 세포 밀도의 증가와 함께 증가되는 것으로 나타난다. 본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 강화 조건 배지는 적어도 약 1.5센티스토크, 적어도 약 1.6센티스토크, 또는 적어도 약 1.7센티스토크의 점성도를 가진다.

숙련된 수령자는 상기 점성도가 여기의 예들에서 수행되었던 바와 같이 동작 점성도(kinematic viscosity)를 측정함에 의하기 보다는 동적 점성도(dynamic viscosity)를 측정함에 의하는 것과 같이 선택적인 수단들에 의해 측정될 수 있는 점이 이해될 것이다. 이에 따라, 본 발명의 실시예들에서 점성도가 본 발명의 설명되는 특징인 경우, 여기서의 본 발명의 설명되는 특징들을 포함하지만, 상기 점성도가 동적 점성도로 측정되었을 경우에 일어날 수 있는 바와 같이 선택적인 단위로, 예를 들면 센티푸아즈(centipoise: cP)로 기재되는 점성도를 가지는 것으로 언급되는 조성물이 상기 점성도가 센티스토크의 단위로 측정되거나 기재될 때에 적어도 약 1.5센티스토크, 적어도 약 1.6센티스토크, 적어도 약 1.7센티스토크, 또는 여기서 정의되는 바와 같은 다른 값일 경우에 여전히 본 발명의 범주 내에 속하는 것이 이해될 것이다.

여기의 실험예들에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 강화 조건 배지는 혈관 표피 성장 인자(VEGF) 및 다른 시토카인(cytokine)들과 다중의 성장 인자들에 의해 예시되는 분비된 세포 성분들의 향상된 안정성을 제공한다. 실험예들에서, 상기 향상된 안정성은 연장된 기한에 걸쳐 실온에서의 저장 동안에 VEGF 및 다른 시토카인들과 성장 인자들의 안정성을 결정하는 것에 의해 특징지어진다. VEGF와 같은 분비물들의 반감기가 실온에서 몇 시간인 점을 교시하는 문헌으로부터의 예상과는 대조적으로, 실온(대략 23℃이었음)에서 육 개월의 기간 동안의 상기 강화 조건 배지의 저장은 ELISA를 이용하여 측정한 경우에 측정될 수 있는 VEGF의 손실을 가져오지 않았다. 상기 결과들은 또한 다중의 상이한 시토카인들과 성장 인자들이 5개월의 기간에 걸쳐 실온에서 저장될 때에 비점성의 경우보다 점성의 물질 내에서 보다 안정하였던 것을 보여준다.

공여자들의 선별

본 발명자들은 단일 공여자로부터의 세포들을 신장시켜 수득될 수 있는 배양-신장된 MSC들의 용량들의 숫자가 다른 공여자들로부터의 세포들 사이에서 크게 변화되는 점을 확인하였다. 일부 공여자들로부터의 세포들은 한정된 숫자의 세포 배가 후에 성장을 멈추지만, 다른 공여자들로부터의 세포들은 보다 큰 숫자의 세포 배가까지 성장을 계속한다. 본 발명자들은 또한 정해진 개개의 공여 동물의 다른 부위들로부터 수득된 세포들을 신장하여 수득될 수 있는 용량들의 숫자에 변화가 있을 수 있는 점을 확인하였다. 이들 차이들에 대한 원인들은 이해되지 않으며, 얼마나 많은 용량들이 특정한 개별 공여자 또는 공여자 상의 특정한 부위로부터 얻어진 세포들이 되는 특정 세포들의 신장을 생산할 수 있는 지를 예측하도록 상대적으로 조기 단계에서 세포들을 분석하기 위해 현재 이용 가능한 만족스러운 방법들은 존재하지 않는다. 이는 다른 공여자들 또는 부위들로부터의 세포들은 이들이 원하는 숫자의 세포 배가에 도달하지 않을 경우에 성장되고 신장되어야 하며, 이후에 버려져야 하는 것을 의미한다. 그 결과, 적합한 예측 방법의 부존재는 치료 목적들을 위한 것과 같은 MSC들의 대규모 제조를 위해 요구되는 증가된 비용과 증가된 시간을 야기한다.

본 발명자들은 공여자의 세포들이 많은 숫자의 세포들을 제조하기 위해 적합할 것인지를 신속하게 확인하기 위해 다른 공여자들 또는 부위들로부터의 세포들을 선별하기 위한 방법들을 개발하였고 여기서 설명한다.

본 발명자들은 공여자의 세포들이 많은 숫자의 세포들을 제조하기 위해 적합할 것인지를 신속하게 확인하기 위해 다른 공여자들 또는 부위들로부터의 세포들을 선별하기 위한 방법들을 개발하였고 여기에 설명하며, 상기 방법은 상기 세포들이 혈소판 용해물 또는 FBS-보강 배지로부터 배양되는 조직 배양 배지를 동종 이계 혈청-보강 배지로 변화시키는 과정을 수반한다. 약칭되는 용어로서, 이러한 선별 방법은 여기서 '혈청 스위치(serum switch)' 방법으로 언급될 수 있다. 많은 숫자의 세포들의 생산을 위해 적합하지 않은 공여자들로부터의 세포는 혈청의 이러한 변화에 잘 대체할 수 없다. 이들은 복제를 중단하며, 융합에 도달하는 데 실패한다.

상기 조직 배양 배지를 변화시키는 것에 기초하는 선별의 방법들에서, 통상적으로 세포들은 혈소판 용해물 또는 1, 2 또는 3의 계대를 위한, 바람직하게는 2의 계대를 위한 FBS 내에서 배양되고, 이후에 상기 혈소판 용해물 또는 FBS는 동종 이계 혈청을 위해 변화된다. 본 발명의 측면에 사용되는 동종 이계 혈청의 농도는 통상적으로 약 10%v/v 내지 약 20%v/v이다. 대규모 제조를 위해 적합한 세포들은 상기 동종 이계 혈청 내에서 성장을 계속하고 융합에 도달할 것이다. 대부분의 공여자 세포 샘플들은 이들이 융합에 이르는 데 실패하는 상기 동종 이계 혈청 내에서 계속 성장하지 못한다.

이러한 선별 방법의 일 실시예에 있어서, 공여자 샘플로부터의 세포들의 일부는 조기의 계대에서, 예를 들면 2의 계대 후에 이를 테면 희생 테스트 샘플로도 언급될 수 있고, 그 자손(progeny)은 시험 후에 폐기될 수 있는 "테스트" 샘플로서 취해진다. 상기 세포들의 테스트 샘플에 전술한 '혈청 스위치'가 수행된다. 상기 세포들이 이들이 성장을 계속하고 융합에 도달하는 동종 이계 혈청-보강 배지에 대한 변화에 대처할 경우, 그러면 사용자는 그로부터 상기 '테스트' 세포들이 인출되었고, 통상적으로 FBS 또는 혈소판 용해물을 포함하는 배지인 바람직한 성장 배지 내에서 이들 세포들 또는 그 일부의 대규모 배양을 계속하는 상기 샘플로 돌아간다. 여기서 전체적으로 설명하는 바와 같이, 인간 MSC들의 배양을 위한 바람직한 배지는 혈소판 용해물-보강 배지이다.

여기에 설명되는 공여자 세포들 또는 공여자 샘플들을 선별하는 방법들은 이에 따라 사용자가 MSC들의 대규모 생산을 위해 적합하거나 수행하는 공여자 세포들 또는 샘플들과 덜 적합한 것들을 구별하게 한다. 이러한 방식에서, 의도된 용도에 대해 적합하지 않거나 덜 적합한 세포들 또는 샘플들은 이들 세포들을 사용하기 위해 이루어지는 폭넓은 노력들 이전에 폐시될 수 있다. 적합한 물질을 선택하는 이러한 방법은 상기 사용자가 MSC들의 원하는 대규모 생산을 생성하도록 충분한 집단 배가(population doubling)들을 위해 배양되는 능력을 가지는 세포들과 샘플들에 노력을 집중하게 한다. 예상되는 MSC들의 매우 대규모의 생산을 발생시키기 위해, 세포들은 통상적으로 노화 전에 약 10 이상의 집단 배가, 보다 바람직하게는 노화 전에 약 15 이상의 집단 배가, 노화 전에 약 20 이상의 집단 배가, 노화 전에 약 25 이상의 집단 배가, 노화 전에 약 30 이상의 집단 배가, 또는 노화 전에 약 35 이상의 집단 배가를 할 수 있을 필요성이 있었다. 공여자 샘플로부터 야기되는 세포주가 약 10 이하의 집단 배가 후에 노화되는 경우, 더욱이 약 8 또는 7 이하의 집단 배가 후에 노화되는 경우, 이는 통상적으로 MSC들의 대규모 생산을 위해 적합하지 않을 것이다. 여기에 설명되는 바와 같이, 상기 '혈청 스위치' 방법은 작업자가 세포 샘플이 약 1, 2, 3 또는 4 이상의 계대에 대한 필요성이 없이 상대적으로 조기 단계에서 MSC들의 매우 대규모의 생산을 위해 적합하거나 적합하지 않은 것을 확인할 수 있게 한다. 적합한 및 적합하지 않은 세포 샘플들을 구변하는 이러한 능력은 MSC들의 매우 대규모의 생산의 효율을 위해 유리하다.

고농도의 ECM 성분들을 분비하는 혈소판 용해물 내에서 성장된 MSC들

본 발명의 방법들의 개발에서, 본 발명자들은 놀랍게도 MSC들이 혈소판 용해물 내에서 성장할 때, 상기 세포들이 증식하면서 상기 조직 배양 배지가 점성이 되는 점을 발견하였다. 상기 점성의 배지의 분석은 고분자량의 당결합체(glycoconjugate)들이 상기 배지 내에 많은 양으로 존재하였음을 입증하였다(여기의 실험예 4 및 실험예 5 참조). 상기 당결합체들은 프로테오글리칸들, 글리코사미노글리칸들 및/또는 뮤신들을 포함할 수 있다. 상기 당결합체들의 증가는 상기 배지의 점성도의 증가에 따라 동일한 시간에 일어났다. 상기 배지의 다른 분석은 상기 배지의 점성도에 GAG, 프로테오글리칸, 뮤신 또는 다른 고분자량의 분자나 분자들의 복합체가 기여하였던 점과 대부분의 프로테오글리칸 존재가 아그레칸, 베르시칸, 루미칸 또는 비글리칸(biglycan)이 될 수 있는 점을 확인하였다.

본 발명자들은 또한 MSC들이 EGF 및/또는 FGF를 포함하는 배양 배지 내에서 성장될 때, 점성의 조건 배지 또한 상기 세포들이 융합되면 얻어졌던 것을 확인하였다.

또한, 본 발명은 이에 따라 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 제조를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 혈소판 용해물을 포함하는 생장 배지 내에서 MSC들을 신장시키는 단계를 포함한다. 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 MSC들의 성장 또는 신장을 위한 방법들이 여기에 설명된다. 일 실시예에 있어서, 상기 배양 배지는 DMEM이다. 일 실시예에 있어서, 상기 혈소판 용해물 인간 혈소판 용해물이다. 일 실시예에 있어서, 상기 MSC들은 골수로부터 유래되는 MSC들, 치수로부터 유래되는 MSC들, 골수로부터 유래되는 MSC들, 인대 조직으로부터 유래되는 MSC들, 인대 혈액으로부터 유래되는 MSC들, 순환 혈액으로부터 유래되는, 또는 지방 조직-유래 MSC들이다. 일 실시예에 있어서, 상기 MSC들은 지방 조직-유래 MSC들이다. 일 실시예에 있어서, 상기 MSC들은 인간 지방 조직-유래 MSC들이다.

여기의 실험예들에서 나타나는 바와 같이, 상기 배지의 점성도는 상기 MSC들이 증식하면서 증가한다. 본 발명자들은 이러한 점이 상기 세포들이 주어진 계대 내에서 증식하면서 일어나고, 상기 MSC들이 상기 배양 플라스크 내에서 보다 밀집하여 거주하게 되면서 이루어지는 것을 관찰 하였다.

이에 따라, 작업자가, 예를 들면 상기 배양 내의 MSC들이 증식 가능하게 하는 정도를 조절하여 상기 조건 배지가 고분자량의 당결합체들로 강화되는 정도에 대해 통제의 정도를 가하는 것이 가능하다. 예를 들면, 배지가 덜 강화되는 경우, 상기 세포들의 원하는 성장(증식)이 중단되게 될 것이거나, 상기 배양 내의 세포들이 약 70% 또는 그 이하의 융합까지 증식되었을 때에 상기 배지가 상기 작업자에 의해 수확될 것이다. 다른 예로서, 보다 강화되거나 점성인 배지가 원해질 경우, 상기 세포들의 성장(증식)이 약 80% 이상의 융합, 약 85% 이상의 융합, 약 90% 이상의 융합, 약 95% 이상의 융합, 또는 약 100%의 융합 혹은 그 이상까지 계속 허용될 것이므로, 상기 배지는 ECM 성분들로 보다 농축된다.

본 발명은 이에 따라 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지 및 배양-신장된 MSC들을 제거하기 위한 방법들 제공하며, 상기 방법은 혈소판 용해물을 포함하는 생장 배지 내에서 MSC들을 배양 신장시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 이에 따라 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지 및 배양-신장된 MSC들을 포함하는 결합이나 조성물을 제공한다.

조성물로도 언급될 수 있는 이러한 결합은 여기서 염증성 질환, 장애 또는 상태와 같이 장애나 상태로 언급될 수 있는 질병의 치료에서 치료 목적들을 위해 사용될 수 있다. 상기 조성물은 이러한 상태들의 치료를 위한 약제의 제조를 위해 사용될 수 있다.

이와 같은 결합이 상기 세포 성장의 과정 동안에 조직 배양 플라스크와 같은 용기 내에 존재할 것인 점은 분명하다. MSC들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 결합은 또한 상기 MSC들의 성장을 위해 적합한 조건들 하에서 적접한 기간의 배양 후에 상기 용기로부터 상기 세포와 배지를 수확하여 제조될 수 있다.

MSC들과 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 결합은 또한 적합한 용기 내에서 분리된 MSC들과 MSC들이 실질적으로 없는 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 결합하여 제조될 수 있다. 이러한 방식에서, 상기 결합은 상기 세포들이 생성되었던(배양 신장된) 경우와 다른 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지 내의 세포들을 포함한다. 이러한 방식으로 MSC들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 결합을 제조함에 의해, 즉 분리된 MSC들을 사용함에 의해, 작업자는 배지의 부피 당 원하는 숫자의 세포들을 가지는 결합을 제조할 수 있다. 이러한 방식에서, 예를 들면, 동일한 세포들이 생성되었던 상기 배지 내의 MSC들로만 구성된 결합에서 구현되었던 경우 이외에 배지의 부피당 보다 높은 세포 밀도 또는 세포들의 숫자를 갖는 결합이 생성될 수 있다. 유사하게, 동일한 세포들이 생성되었던 상기 배지 내의 MSC들로만 구성된 결합에서 구현되었던 경우 이외에 배지의 부피당 보다 낮은 세포 밀도 또는 세포들의 숫자를 갖는 결합이 생성될 수 있다. 배지의 부피당 세포들의 숫자를 조절하는 능력은, 예를 들면, 치료적 이점이 배지 비율에 대해 선택되는 세포를 가지는 용량을 투여하여 구현될 수 있는 경우의 상황들에서 유리할 수 있다. 분리된 MSC들은 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지와 MSC들의 결합에 첨가될 수 있거나, MSC들이 실질적으로 없는 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지에 첨가될 수 있다.

여기서의 본 발명자들에 의한 확인은 혈소판 용해물 또는 EGF 및/또는 FGF를 포함하는 배양 배지 내의 MSC들의 배양이 여기서는 대체로 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지로 언급되는 고분자량의 당결합체를 함유하는 점성의 조건 배지를 제공하며, 여기서 설명되는 바와 같이 유리한 특성들을 가지는 이러한 물질 또한 생물 반응기로부터와 같이 배양으로부터 세포들이나 조건 배지를 수확하는 적절한 단계를 평가하거나 상기 적절한 단계의 평가에 기여하도록 작업자에 의해 사용될 수 있는 점이다. 예를 들면, 여기의 실험예들에서 입증되는 바와 같이, 약 1.5cSt 또는 그 이상의 점성도를 갖는 조건 배지가 고분자량의 당결합체 내에서 강화되며, VEGF와 같은 상기 MSC들로부터 분비된 성분들의 향상된 안정성을 제공한다. 상기 실험예들은 또한 상기 강화된 물질이 염증 상태들 및 신경성 통증과 같은 질병의 치료에 유리한 점을 입증한다. 또한 상기 실험예들에서 입증되는 바와 같이, 약 1.5cSt 또는 그 이상의 점성도는 통상적으로 약 80% 이상의 융합에서 혈소판 용해물의 존재에서 성장된 MSC들의 배양에서 구현된다. 여기서의 결과들은 이에 따라 작업자가 생물 반응기나 다른 배양 용기나 그릇 내에서와 같이 상기 배양 내에서, 특히 상기 작업자에 의해 원해지거나 요구되는 세포들의 배지의 속성들에 따라 상기 세포들 및/또는 상기 조건 배지를 수확하는 적절한 단계의 표시로서 세포 밀도가 용이하거나 이용 가능하게 결정되지 않을 수 있을 경우에 배양 조건들에서 상기 배지의 점성도를 이용하게 할 수 있다. 이는, 예를 들면, 주어진 시간에서 상기 배양의 액상의 샘플의 점성도를 결정하고, 상기 결정된 점성도에 기초하여, 세포들 또는 배지를 수확하거나, 상기 작업자의 요구 사항들에 따라 상기 배양을 계속함에 의해 구현될 수 있다.

통상적인 실시예에 있어서, 상기 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지 및 배양-신장된 MSC들을 포함하는 조성물은 서로에 대해 고유하며, 이는 상기 조성물 내의 세포들이 상기 조성물 내에 이들이 체류하는 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지 내에서 성장되었던 세포들임을 의미한다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 배양 배지로부터 MSC들을 분리하는 단계를 더 포함한다. 본 발명의 방법들에서, 상기 세포들은 취급하는 숙련자에게 알려진 방법들에 의해 상기 배양 배지로부터 분리되거나 수확될 수 있다. 실시예들에 있어서, 본 발명은 이에 따라 MSC들이 실질적으로 없는 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 제조를 제공한다. 본 문에서, 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 제조는 세포 배양으로부터 유착 세포들을 수확하거나 제거하기 위한 통상의 단계들 후에 MSC들을 포함하지 않거나 단지 잔류할 수 있는 남은 오염물 MSC들을 포함하는 경우에 MSC들이 "실질적으로 없는" 것으로 간주될 수 있다. 상기 배지는 MSC들의 함량이 치료에 사용되는 경우에 치료 효과를 가지지 않는 것으로 예상되는 레벨이었을 경우에 MSC들이 "실질적으로 없는" 것으로 간주될 수 있다.

상기 수확된 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지에, 예를 들면 오염 물질의 존재를 제거하거나 감소시키기 위해 하나 또는 그 이상의 다른 처리 단계들이 수행될 수 있다. 본문에서, 오염 물질은 세포 조각들이나 부스러기와 같은 상기 배지의 임의의 바람직하지 않은 성분이 될 수 있다 상기 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지가 치료적 용도를 위해 의도된 경우, 오염물은 또한 상기 배지의 약학적 사용과 양립할 수 없는 임의의 성분, 예를 들면 수용자 동물에 독성이 될 수 있거나, 상기 배지의 치료 효능을 감소시킬 수 있거나, 저장되는 상기 배지의 능력을 감소시킬 수 있는 성분을 포함할 것이다. 본문에서 다른 처리의 예는 상기 배지의 원심 분리 또는 여과를 포함할 수 있다.

상기 수확된 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지는 MSC들이 있거나 없이 임의의 적절한 조건들 하에서 저장될 수 있다. 저장은 통상적으로 -20℃, -10℃ 또는 -80℃에서 동결된다. 선택적으로는, 저장은 4℃에서 수행될 수 있다.

상기 저장은 대상의 치료에서 치료 용량 내에의 사용을 위해 적합할 수 있는 바와 같은 별도의 부분 표본(aliquot)들 또는 바이알(vial)들 내에 있을 수 있다. 다른 예로서, 상기 배지가 즉시 주사 가능한 형태로 저장될 수 있으므로, 작업자에게는 저장으로부터 물질을 회수하고, 치료적 사용 이전에 해동시키거나 요구되는 온도까지 데울 것만이 요구된다. 선택적인 형태에서, 상기 저장은, 예를 들면 사용 이전이나, 예를 들면 연구 목적들을 위해 보다 적합할 수 있게 희석이나 부분 표본화가 더 요구될 수 있는 "벌크(bulk)" 저장이 될 수 있다.

본 발명은 또한 마이크로 운반체들 상에서, 예를 들면 교반되는 생물 반응기 내에서 배양된 MSC들을 제공한다. 상기 MSC들은 코팅되지 않거나 콜라겐과 같은 특정 단백질로 코팅될 수 있고, 그 표면상에 특정 전하 분포를 가지도록 처리될 수 있는 마이크로 운반체 비드들(90－400㎛) 상에서 배양될 수 있다. 상기 마이크로 운반체들은 스피너 플라스크, 마이크로 생물 반응기들, 교반되는 탱크, 요동 플랫폼들 또는 미세 중력과 같은 많은 용기들 내에서 세포들의 성장을 위해 이용될 수 있다. 세포들은 또한 현탁되고 교반되는 시스템으로서나 정지 충전층으로서 생물 반응기 내에 유지될 수 있는 피브라-셀 디스크들 상에서 배양될 수 있다.

조성물들 및 약학 조성물들

본 발명의 방법들은 조성물들의 제조, 특히 약학 조성물들의 제조를 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 MSC들이 실질적으로 없는 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 본 발명의 방법에 의해 제조된 배양-신장된 MSC들을 포함할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지 및 MSC들을 포함할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 MSC들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 결합들과 같은 앞서 언급한 결합들의 임의의 것이 될 수 있다. 본 발명의 조성물은 약학 조성물의 제조를 위해 사용될 수 있다. 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 운반체, 희석제, 부형제 또는 보조제의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.

약학 조성물과 같은 본 발명의 조성물은 동결된 용액으로 상기 사용자에게 공급될 수 있다. 예를 들면, 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지, 배양-신장된 MSC들, 또는 이들의 결합은 시용을 위해 요구되기까지 대략 -20℃에서 저장될 수 있다. 선택적으로는, 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지, 배양-신장된 MSC들, 또는 이들의 결합은 사용을 위해 요구될 때까지 기상으로나 액상으로 보다 낮은 온도에서, 예를 들면 냉동기 내에서 -70℃ 내지 -90℃에서 또는 액체 질소 저장 내에 저장될 수 있다. 세포들을 포함하는 조성물들은 통상적으로 액체 질소 내에 저장될 것이다. 바람직한 실시예에 있어서, 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지, 상기 배양-신장된 MSC들, 또는 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지 및 배양-신장된 MSC들의 결합을 포함하는 조성물은 액체 질소 저장의 액상 내에 저장된다. 바람직한 실시예에 있어서, 지방 조직-유래의 배양-신장된 MSC 세포들을 포함하는 조성물은 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지와 결합되어 저장된다. 선택적으로는, 약학 조성물과 같은 본 발명의 세포가 없는 조성물은 동결 건조 제조로 상기 사용자에게 공급될 수 있다. 예를 들면, 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지는 동결 건조될 수 있고, 사용을 위해 요구될 때까지 대략 4℃, -20℃ 또는 실온에서 저장될 수 있다.

내과 의사, 임상 의사, 수의사, 기술자, 보조자 또는 농부에 의한 치료와 같은 사용 시에, 상기 조성물은 통상적으로 융해 후에 가능한 한 빨리 대상이나 동물에 투여된다. 상기 약학 조성물은 선택적으로 바람직하게는 대략 2℃ 내지 5℃에서 융해와 투여 사이의 짧은 시간 동안에 예를 들면, 얼음 위에, 냉장고 내에 또는 냉장 팩 내에 저장될 수 있다. 본문에서, 짧은 시간은 통상적으로 약 반 시간 이하, 약 한 시간 이하, 또는 약 두 시간 이하와 같이 몇 시간 이하가 될 수 있었다. 동결 보호제(cryoprotectant)들은 통상적으로 상기 세포들에 대해 독성이고 생존도의 손실을 야기하기 때문에, 해동되어 유지된다면, 특히 생존 가능한 세포들을 포함하는 경우에 상기 조성물은 통상적으로 융해 후에 가능한 한 빨리 수용자 동물에 주사된다.

본 발명의 약학 조성물은 "즉시 사용 가능한(ready-to-use)" 형태로 공급될 수 있다. 이러한 실시예들에 있어서, 상기 사용자는 통상적으로 상기 조성물이 투여되기 전에 투여를 위한 허용 가능한 온도까지 융해할 것만이 요구된다. 이러한 실시예들에 있어서, 상기 조성물은 정해진 수용자 대상이나 동물에 대하 적합하도록 미리 측정되거나 미리 결정된, 예를 들면 수용자 종들에 기초하거나, 대품종의 개와 비교하여 소품종의 개 또는 성체 동물과 비교하여 어린 동물과 수용자 개체에 기초하여 미리 결정된 용량과 같이 미리 측정된 용량들로 공급될 수 있다. 상기 미리 측정된 용량은 선택적으로 또는 추가적으로 치료되거나 방지를 위해 의도된 질병이나 상태에 기초할 수 있다. 상기 조성물의 즉시 사용 가능한 형태는 주사기와 같은 주사용 장치와 함께 또는 그 내부에 공급되는 조성물을 포함할 수 있다. 상기 주사용 장치는 개개의 수용자에게 단일의 적용을 전달할 수 있거나, 다중의 수용자들에게 단일 또는 다중의 적용들을 전달할 수 있다. 상기 주사용 장치는, 예를 들면 다른 용량의 범위의 전달을 가능하게 하도록 조정될 수 있다.

상기 약학 조성물이 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지 및 배양-신장된 MSC들의 결합을 포함하는 실시예들에 있어서, 상기 조성물은 사용자에 의한 결합이나 결합을 위한 별도의 조성물들로서 사용자에게 공급될 수 있다. 본문에서 "사용자"에 대한 언급이 상기 치료 조성물을 수용체 대상이나 동물에 실제로 투여하는 개인을 의미하며, 또한 투여를 수행하는 팀이나 그룹의 구성원을 의미하는 점이 이해될 것이다. 예를 들면, 상기 사용자는 임상 의사, 의사, 수의사, 농부, 임상 간호사, 수의학 간호사, 기술 보조자, 또는 농장 노동자와 같이 본 발명의 방법들의 적용을 보조하는 임의의 개인이 될 수 있다.

여기서 설명하는 바와 같이, 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지는 예를 들면, 상기 배지가 실온에서 저장될 때에 VEGF 및 상기 배양된 MSC들로부터 분비된 다른 분자들과 같은 성분들의 유리한 안정성을 입증한다. 그 결과, 본 발명은 또한 동결이 없거나 냉동이 없이 선택적으로 저장될 수 있는 조성물들을 제공한다. 통상적으로, 동결이 없거나 냉동이 없이 저장되는 조성물은 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함할 것이지만, MSC들은 포함하지 않을 것이다.

고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 약학 조성물은 이에 따라 통상적으로 약 20℃ 내지 25℃의 범위가 될 수 있었던 실온에서의 저장을 위해 적합한 조성물을 사용하기 위해 준비되어 제공될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 이러한 적용을 필요로 하는 대상의 피부에 대한 것과 같이 국소 적용을 위한 조성물이 될 수 있다. 국소 적용을 위한 조성물은 예를 들면, 액체, 겔, 크림 또는 로션의 형태를 포함하여 임의의 적절한 형태가 될 수 있다. 국소 적용을 위한 조성물의 형태로 제공되고, 실온에서 저장될 수 있을 때, 본 발명은, 예를 들면, 주사 가능한 조성물 냉동되거나 동결되어 최적으로 저장될 수 있는 조성물에 비하여 용이한 자가 투여와 같이 대상에 의한 용이한 투여를 제공한다.

고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 약학 조성물은 치료적 활성 성분 또는 국소 적용을 위한 구성 성분의 제형을 위해 적합한 바와 같이 임의의 적절한 운반체 물질로 조제될 수 있다. 여기서의 예들에서, 계면활성제를 함유하지 않은 운반체 물질의 사용은 계면활성제를 함유하는 운반체 물질의 사용에 의한 경우보다 높은 레벨들의 VEGF가 검출되게 한다. 이론에 의해 구속되는 것을 원함이 없이, 본 발명자들은 이러한 점이 상기 계면활성제에 의한 상기 VEGF의 결합에 기인할 수 있고, 이에 따라 상기 조성물 내의 검출 가능한 VEGF를 감소시키는 것으로 여긴다. 본 발명자들은 상기 운반체 물질 내 또는 상기 조성물의 조제에서의 포함에 의한 것과 같은 상기 약학 조성물 내의 계면활성제의 존재가 우사하게 상기 약학 조성물 내의 치료적으로 사용 가능한 VEGF를 감소시킬 수 있으므로, 계면활성제를 함유하지 않는 조성물이 계면활성제를 함유하는 조성물에 비해 우수한 치료 생성물을 제공할 수 있는 것으로 여긴다. 이러한 설명이 VEGF를 참조하여 제공되지만, 상기 원리들이 상기 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지 내의 다른 성장 인자들과 시토카인들에 적용되는 것으로 예상된다. 일 실시예에 있어서, 상기 운반체 물질은 계면활성제를 포함하지 않는다. 일 실시예에 있어서, 상기 약학 조성물은 계면활성제를 포함하지 않는다. 일 실시예에 있어서, 상기 운반체 물질은 염류 및 선택적으로는 프로필렌글리콜(propylene glycol)을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 운반체 물질은 솔루겔(Solugel) 또는 이와 유사한 제형이다. 일 실시예에 있어서, 상기 운반체 물질 또는 약학 조성물은 화장품용이나 약학적 점증제(thickener)(들)와 같은 하나 또는 그 이상의 점증제들, 예를 들면 히드록실 에틸 셀룰로오스(hydroxyl ethyl cellulose)를 포함한다.

키트들

본 발명은 또한 (a) (i) 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지, (ii) 배양-신장된 MSC들을 포함하는 조성물, 그리고 (iii) 상기 (i)과 상기 (ii)의 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약학 조성물; 그리고 (b) 염증성 질환의 치료 또는 염증성 질환과 연관된 통증을 완화에서 키트(kit)의 사용을 위한 지시들을 포함하는 키트를 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 키트는 하나 또는 그 이상의 동결된 조성물들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 결합된 조성물의 투여 이전에 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 조성물 및 배양-신장된 MSC들을 포함하는 조성물을 결합시키기 위한 지시들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 하나 또는 그 이상의 주사기들과 같은 하나 또는 그 이상의 주사 장치들을 더 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 주사 장치는 상기 키트의 조성물을 함유한다.

본 발명의 조성물은 MSC들에 의하거나 프로테오글리칸-강화 조건 배지에 의한 치료가 수행되는 의학적 상태의 치료나 방지에 사용될 수 있다. 예를 들면, 여기에 입증되는 바와 같이, 상기 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 조성물은 허용될 수 있는 결과들이 보고되는 환자와 함께 골관절염이 있는 환자에게 투여될 수 있었다. 이에 따라, 본 발명의 조성물은 상기 치료를 요구하는 대상에서 염증성 질환이나 골관절염의 치료나 방지를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 완화를 요구하는 대상에서 염증성 질환이나 골관절염의 완화를 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 예들에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 또한 테니스 팔꿈치(tennis elbow), 건 손상(tendon injury), 동창(chilblains), 건염(tendonitis), 골퍼 손목(golfers wrist), 윤활낭염(bursitis), 근육 또는 종아리 열상(tear)을 치료하기 위해 투여될 때에 상기 환자에게 유익할 수 있었다. 상기 대상은 임의의 동물이 될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 대상은 고양이, 개 및 말로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 대상은 인간이다.

염증성 질환들

상기 약학 조성물은 대상 내에서 염증성 질환의 치료를 위해 및/또는 염증성 질환과 연관된 통증을 완화시키기 위해 투여될 수 있다.

염증은 물리적, 화학적 또는 생물학적 제제에 의해 야기되는 손상이나 비정상적 자극에 대한 반응으로 일어난다. 염증 반응은 국소 반응들 및 결과적인 형태 변화들, 감염성 유기체와 간은 손상을 주는 물질의 파괴나 제거, 그리고 복구 및 치유를 이끄는 반응들을 포함할 수 있다. "염증성(inflammatory)"이라는 용어는 질병에 대해 언급될 때에 부적절하거나 정상적인 방식으로 해결되지 않는 염증에 의해 야기되거나, 이로부터 유래되거나, 이를 가져오는 병리학적 과정들을 언급한다. 염증성 질환들은 전신성이거나 특정한 조직이나 기관들에 대해 국소적일 수 있다.

염증은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 전신 염증 반응(Systemic Inflammatory Response: SIRS); 알츠하이머 병(Alzheimer's Disease)(및 만성 신경염증(neuroinflammation), 신경 교세포 활성화(glial activation); 증가된 미세 아교 세포(increased microglia)를 포함하는 연관 상태들과 증상들); 신경반 형성(neuritic plaque formation); 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS), 관절염(arthritis)(및 이에 한정되는 것은 아니지만, 급성 관절 염증, 항원-유발 관절염, 만성 림프구성 갑상선염(lymphocytic thyroiditis)과 연관된 관절염, 콜라겐-유발 관절염, 소아 관절염, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염, 예후 및 연쇄상구균(streptococcus) 유발 관절염, 강직성 척추염(spondyloarthropathies) 및 통풍성 관절염(gouty arthritis)을 포함하는 연관 상태들과 증상들), 천식(asthma)(및 기관지 천식(bronchial asthma); 만성 폐쇄성 질환(obstructive airway disease), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 소아 천식 및 직업성 천식(occupational asthma)을 포함하는 연관 상태들과 증상들); 심혈관 질환들(및 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 자가 면역성 심근염(autoimmune myocarditis), 만성 심장 저산소증(chronic cardiac hypoxia), 울혈성 심부전(congestive heart failure), 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 심근증(cardiomyopathy) 및 대동맥 평활근 세포 활성화, 심장 세포 세포예정사(apoptosis) 및 심장 세포 기능의 면역 조절)을 포함하는 심장 세포 기능장애(cardiac cell dysfunction)를 포함하는 연관 상태들과 증상들); 당뇨병(및 자가 면역성 당뇨병, 인슐린-의존형(insulin-dependent)(I형) 당뇨병, 당뇨 치주염(diabetic periodontitis), 당뇨 망막 병증(diabetic retinopathy) 및 당뇨병성 신장 질환(diabetic nephropathy)을 포함하는 연관 상태들); 위장염들(및 셀리악 병(celiac disease), 연관 골감소증(osteopenia), 만성 대장염(colitis), 크론병(Crohn's disease), 염증성 장 질환 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 포함하는 관련 상태들과 증상들); 위궤양(gastric ulcers); 바이러스성 및 다른 유형의 간염과 같은 감염들, 콜레스테롤 결석(cholesterol gallstone)들 및 간 섬유증(hepatic fibrosis); HIV 감염(및 퇴행성 반응들, 신경 퇴행성 반응들 및 HIV 연관 호지킨 병(Hodgkin's Disease)을 포함하는 연관 상태들); 카와사키 증후군(Kawasaki's Syndrome)(및 점막 피부 림프절 증후군, 경부 림프절 비대(cervical lymphadenopathy), 관상 동맥 병변(coronary artery lesions), 부종, 발열, 증가된 백혈구, 경증 빈혈(mild anemia), 피부 박리, 발진, 결막 발적(conjunctiva redness), 혈소판 증가증(thrombocytosis)을 포함하는 연관 질병들과 상태들); 신병증들(당뇨병성 신장 질환, 말기 신장 질환, 급성 및 만성 사구체 신염(chronic glomerulonephritis), 급성 및 만성 간질성 신염(interstitial nephritis), 루푸스 신염(lupus nephritis), 구드파스투어 증후군(Goodpasture's syndrome), 혈액 투석 생존 및 신익혈 재관류 손상(renal ischemic reperfusion injury)을 포함하는 연관 질병들과 상태들); 신경 퇴행성 질환들이나 신경 병리학적 상태들(및 급성 신경퇴화(neurodegeneration), 노화 및 신경 퇴행성 질환에서 IL-I의 유도, 시상하부 신경 세포들의 IL-I 유도 소성 및 만성 스트레스 과민성, 척수병증(myelopathy)을 포함하는 연관 질병들과 상태들); 안병증들(및 당뇨 망막병증, 그레이브스 안병증(Graves ophthalmopathy), 각막 궤양(corneal ulceration)을 포함하는 각막 손상이나 감염과 연관된 염증과 포도막염(uveitis)을 포함하는 연관 질병들과 상태들), 골다공증(및 치주골, 대퇴부, 방사선, 착추또는 손목 뼈 손상이나 골절 발생, 폐경 후의 골 손실, 골절 발생이나 골 손상률을 포함하는 연관 질병들과 상태들); 중이염(성인 또는 소아); 췌장염(pancreatitis) 또는 췌장 소포염(pancreatic acinitis); 치주 질환(및 성인, 조기 발병 및 당뇨성을 포함하는 연관 질병들과 상태들); 만성 폐질환, 만성 축농증, 유리질 막염(hyaline membrane disease), SIDS에서의 저산소증 및 폐질환을 포함하는 폐질환들; 관상 동맥이나 다른 혈관 이식편들의 재협착증(restenosis); 류마티스 관절염, 류마티스 아쇼프체(Aschoff body)들, 류마티스성 질환들 및 류마티스성 심근염을 포함하는 류머티즘(rheumatism); 만성 갑상선염(lymphocytic thyroiditis)을 포함하는 갑상선염; 만성 전립선염(chronic prostatitis), 만성 골반 통증 증후군(pelvic pain syndrome) 및 요로 결석증(urolithiasis)을 포함하는 요로 감염들; 원형 탈모증, 자가 면역성 심근염, 그레이브스 병(Graves' disease), 그레이브스 안병증, 태선 경화증(lichen sclerosis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 건선(psoriasis), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 경피증(systemic sclerosis), 갑상샘 질환들(예를 들어, 갑상선종 및 갑상샘종(하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 갑상샘종)과 같은 자가 면역 질환들을 포함하는 면역계 질환들; 폐 손상(급성 출혈성 폐 손상, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 급성 허혈 재관류(ischemic reperfusion)), 직업적 및 환경적 오염물들에 의해 야기되는 심근 기능장애(myocardial dysfunction)(예를 들어, 독성 오일 증후군 규폐증(silicosis)에 대한 민감성), 방사선 외상, 창상 치유 반응들(예를 들어, 둔부 화상들, 만성 창상들, 수출 창상들 및 척수 손상들)의 효능, 패혈증, 급성 상 반응(예를 들어, 열 반응), 일반 염증 반응, 급성 호흡 곤란 방응, 급성 전신 염증 반응, 창상 치유, 유착, 면역 염증 반응, 신경 내분비 반응, 발열 진행 및 저항, 급성 상 반응, 스트레스 반응, 질병 감수성, 반복 동작 스트레스, 테니스 팔꿈치, 그리고 통증 관리 및 반응을 포함하는 많은 질병들에서 알려져 있다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 염증성 질환은 관절-관련 염증성 질환들, 각막 염증, 피부 염증 또는 창상 치유(wound healing)로부터 선택된다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 관절-관련 염증성 질환은 골관절염과 같은 관절염이다.

특정 실시예들에 있어서, 본 발명의 조성물들은 테니스 팔꿈치의 치료를 위하거나, 건 손상의 치료를 위하거나, 동창의 치료를 위하거나, 발과 같은 건염의 치료를 위하거나, 골퍼 손목의 치료를 위하거나, 전자 점액낭염(trochanteric bursitis)과 같은 윤활낭염의 치료를 위하거나, 아킬레스 건염(Achilles tendonitis)의 치료를 위하거나, 종아리 열상과 같은 근육 열상의 치료를 위하거나를 위한 것이다.

신경성 통증

상기 약학 조성물은 대상에서 신경성 통증의 치료를 위해 투여될 수 있다. 본 발명자는 본 발명의 조성물들이 일부 형태들의 신경성 통증과 같이 식별될 수 있는 임상적 원인이 존재하지 않는 통증이 있는 대상들의 치료에 유용한 점을 확인하였다. 신경성 통증은 말초 레벨, 중심 레벨, 또는 이들 모두에서 신경계의 기능 장애나 질환으로 인한 통증으로 특징지어지는 통증 질환들의 그룹을 언급한다. 이는 시간에 걸쳐 횟수와 강도가 변동되는 많은 증상들과 징후들이 있는 복잡한 실재이다. 상기 신경성 통증 셋의 공통적인 구성 요소들은 꾸준한 신경성 통증; 발작성의 무의식적 공격들; 및 과민성이다.

신경성 통증은 감각 이상(dysaesthesia) 및 전감각(panaesthesia)을 포함하여 개체들에 장애를 초래하고, 심각하며, 다루기 힘들고, 스트레스와 고통을 야기할 수 있다. 감각의 부분적 또는 복합적 손상과 같은 감각 장애(sensory deficit)들 또한 공통적으로 나타난다. 또한, 삶의 질의 감소를 초래하는 만성 신경성 통증과 연계된 상당한 정신적 및 사회적 영향들이 존재한다.

신경성 통증은 일반적인 의료 행위에서 매우 통상적이다. 일부 형태들에서, 상기 신경성 통증은 임의의 식별될 수 있는 임상적인 원인 상태와 연관되지 않는다. 예로서, 본 발명의 조성물들이 신경성 통증으로 여겨지는 만성 테니스 팔꿈치를 완화시키는 데 효과적인 점이 입증된다. 일부 형태들에서, 상기 신경성 통증은 식별될 수 있는 임상적 상태와 연관된다. 삼차 신경병증(trigeminal neuralgia)의 유병률(prevalence)은 100,000명의 집단 당 2.1 내지 4.7명의 사람들이고, 통증성 당뇨병성 밀초신경 병증(diabetic neuropathy)이 11% 내지 16%의 1형 당뇨병뿐만 아니라 II형 당뇨병에서 발생되며, 헤르페스 후 신경통(post-herpetic neuralgia)이 100,000명의 상기 집단 당 대략 34명의 사람들에서 발견된다. 신경성 통증의 치료는 용이하지 않다. 신경성 통증이 있는 환자들이 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)들과 같은 표준 진통제에 항상 반응하지 않는 것은 아니며, 어느 정도까지는 신경성 통증은 아편제(opiates)에 대해 저항성이다. 신경성 통증의 치료를 위해 가장 우수하게 연구되고 가장 길게 사용된 약학 제제들은 심각한 부작용들을 초래할 수 있는 항우울제(antidepressant)들 및 항경련제(anticonvulsant)들이다.

본 발명의 조성물은 임의의 적절한 부위에서 이러한 통증의 치료를 위해 대상에 투여될 수 있다. 투여는 통상적으로 적절한 유형의 주사를 이용하는 것이 될 수 있거나, 국소 적용에 의한 것이 될 수 있다. 예를 들면, 주사는 상기 통증의 부위나 그 부근에 피하로, 근육 내로, 또는 직접 접근 가능한 부위로 될 수 있다. 이러한 유형의 통증은, 예를 들면 턱 통증과 팔이나 어깨 통증과 같이 대상의 몸의 다중의 영역들에서 분명할 수 있기 때문에, 상기 투여는 상기 통증의 하나의 부위나 그 부근이 될 수 있고, 통증으로 괴로운 다른 부위로부터 떨어질 수 있다. 통상적으로, 다중 부위들의 통증이 환자에게 발생될 경우, 상기 투여는 상기 통증의 기원 또는 원발 부위로 확인된 부위나 그 부근이 된다. 이러한 치료의 예시와 같이, 여기서의 예들은 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 크림이나 겔의 국소 적용에 의한 골퍼 손목 및 만성 테니스 팔꿈치의 치료를 보여준다. 상기 국소 치료는 환부에 겔이나 크림을 분지르는 과정을 수반할 수 있거나, 선택적으로는 상기 환부에 이후에 적용되는 드레싱이나 패치에 상기 크림이나 겔을 적용하는 과정을 수반할 수 있다. 치료되는 대상에게는 본 발명의 조성물의 단일 적용이 투여될 수 있거나, 바람직하게는 다중 적용들이 투여될 수 있다.

이하에서 예시의 목적만으로 다음의 실험예들을 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 실험예들은 본 발명을 예시하도록 의도되며, 본 명세서에 걸쳐 개시되는 설명에서 일반적 사항들을 한정하는 것으로 간주되지 않아야 한다.

실험예들

실험예 1: 다른 공여자들로부터의 개 세포들의 선별

지방 조직의 처리

낫 형상의 지방 조직의 샘플들(10g)이 통상적인 탈성화(desex) 과정들들 동안에 다섯의 암컷 개들로부터 수집되었다. 지방 조직의 다섯 샘플들은 별도도 처리되었다. 지방 조직은 식염수로 세정되었고, 이후에 가위를 사용하여 미세하게 다져졌으며, 20ml의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, 시그마(Sigma))와 혼합되었다. 콜라게나아제(시그마)가 0.05%wt/vol의 최종 농도까지 첨가되었고, 상기 샘플은 37℃에서 90분 동안 배양되었다. 배양 동안에 상기 샘플들은 매 15분마다 손으로 부드럽게 뒤집어졌다.

콜라게나아제 처리에 후속하여, 상기 샘플들은 스테인리스 스틸 메시(700㎛ 공극 크기)를 통해 무균으로 여과되었고, 50ml의 원심 분리관들로 이송되었으며, 500g에서 15분 동원 원심 분리되었다.

상기 부유 세포들과 상기 상청액은 폐기되었고, 펠릿으로 된 세포들은 파스퇴르 피펫(pasteur pipette)으로 부드럽게 혼합되었으며, 15ml의 원심 분리관들로 이송되었다.

상기 세포들은 이후에 콜라게나아제를 제거하기 위해 DMEM 내에서 세척되었다. DMEM은 각 관에 14의 최종 부피까지 첨가되었고, 500g에서 10분 동안 원심 분리되었다. 상기 상청액은 폐기되었고, 상기 펠릿으로 된 세포들은 4ml의 DMEM 내에 다시 현탁되었으며, 파스퇴르 피펫으로 혼합되었다.

송아지 태아 혈청 내의 세포들의 신장

각 공여자로부터의 세포 서스펜션들의 부분 표본들(0.5mls)이 DMEM 플러스 10%의 송아지 태아 혈청을 함유하는 조직 배양 플라스크들로 이송되었고, 융합 세포의 단층이 존재할 때(7일 내지 10일)까지 CO₂ 배양기 내에서 37℃에서 배양되었다. 세포들은 3ml의 트립엘이 익스프레스(TrypLE Express)(인비르토겐Invitrogen))로 벗겨졌고, 50ml의 원심 분리관들 내에 부어졌으며, 500×g에서 10분 동안 원심 분리되었다. 세포들은 DMEM 플러스 10%의 송아지 태아 혈청을 함유하는 새로운 조직 배양 플라스크들 내에 놓여졌다.

동종 이계 혈청 내로의 세포들의 이송

송아지 태아 혈청 내에서 배양된 세포들이 융합 시에 벗겨졌고, DMEM 플러스 10% 동종 이계의 개과 혈청(canine serum)을 함유하는 새로운 플라스크들 내로 놓여 졌으며, 7일 내지 14일 동안 배양되었다. 플라스크들은 현미경을 이용하여 조사되었고, 상기 세포들의 융합도는 0% 내지 100%의 범위에서 점수로 기록되었다.

개과 혈청 내의 세포 증식

다음의 단락들에서 설명하는 바와 같이, 상기 여섯의 공여자들의 둘로부터의 세포들은 상기 개과 혈청으로 이송되었을 때에 빠르게 증식하였다. 다른 넷의 공여자들로부터의 세포들은 상기 개과 혈청 내에서 성장하지 않았다.

생성물의 제조

각각의 6의 공여자들로부터의 세포들은 6의 세포주 모두에서 상기 세포들이 7.5-8.5의 집단 배가를 겪었던 시점인 계대 2까지 10%의 FBS를 함유하는 배지 내에서 신장되었다. 계대 3에서, 상기 세포들은 10%의 동종 이계의 개과 혈청을 함유하는 배지 내에 파종되었고, 어떠한 배지 변화들이 없이 융합되거나 14일까지 성장되었다. 상기 공여자들의 둘(1 및 2)의 세포들이 융합까지 성장된 반면, 나머지 4의 공여자들의 세포들은 14일에 융합을 이루지 못하였던 점이 관찰되었다. 상기 세포들을 수확함에 따라, 공여자들 1 및 2로부터의 세포들이 추가적인 2의 집단 배가를 겪었던 점이 관찰되었다. 그러나, 다른 공여자들로부터의 세포들은 반면에 상기 10%의 동종 이계의 개과 혈청을 함유하는 배지 내에서 1 이하의 집단 배가를 겪었다.

6의 공여자들 모두로부터의 세포들이 계대 2로부터 10%의 FBS 배양 배지(개과 혈청으로의 변화 없이) 내에서 신장되었다. 세포들은 융합까지 성장되었고, 배양이 여전히 전형적인l MSC 형태를 가지는 것으로 관찰되었고, 증식되고 융합에 이루는 것으로 관찰되었던 동안에 여러 번 계대되었다. 공여자 1 및 2로부터의 세포들이 계대 6까지 전형적인 방식으로 증식되었고, 13-14의 누적 집단 배가를 가졌던 점이 확인되었다. 따라서, 이들 공여자들(1 및 2)로부터의 세포 치료 생성물들이 13 이상의 배가를 겪었던 계대 5 또는 6의 세포들로부터 제조될 수 있었다. 그러나, 다른 공여자들로부터의 세포들은 계대 5에서 증식이 중단되었다. 그 세포들이 상기 10%의 동종 이계의 개과 혈청을 함유하는 배지 내에서 상대적으로 낮게 수행되었던 동일한 세포 집단들(공여자들)인 그 세포들이 증식이 중단되었던 이들 네 공여자들로부터 유래되는 세포들의 형태 또한 계대 5에서 가시적으로 열화되었다. 따라서, 이들 공여자들로부터 제조된 어떤 세포 치료 생성물은 계대 4에만 있을 수 있었고, 9-10의 누적 집단 배가를 가질 수 있었다.

이에 따라, FBS 내에서 세포들을 계대시키고, 이후에 이들을 동종 이계 혈청에 노출시켜 테스트하는 것은 바이알 당 상품들의 비용을 감소시키킬 수 있고, 연구 및 개발 시간 또한 감소시킬 수 있는 세포들을 보다 높은 계대 숫자들로 신장시키는 능력을 예측하기 위한 방법으로 이용될 수 있었다. 약칭되는 용어로서, 선별의 방법들과 그 변형들은 이에 따라 여기서 '혈청 스위치' 방법으로 언급될 수 있다.

실험예 2: 혈소판 용해물의 생산

혈액이 해당 기술 분야에 알려진 방법에 따라 항응고제로 시트르산염이 사용된 혈액 수집 백들 내에 수집되었다. 상기 혈액은 원심 분리관 내로 분배되었고, 200g에서 20분 동안 원심 분리되었다. 혈소판들을 함유하는 상단 층이 수집되었고, 37℃의 수조 내에서 액체 질소로부터 4 사이클의 동결 융해가 수행되었다. 상기 용해된 혈소판들은 이후에 트롬빈(thrombin) 및 염화칼슘의 첨가에 의해 혈청 전환되었고, 이후에 10분 동안 4000g에서 원심 분리되었으며, 펠릿으로 된 세포 조각들은 폐기되었다.

상기 혈소판 용해물은 이후에 필터(0.22미크론) 멸균되었고, 요구될 때까지 -80℃에서 저장되었다.

실험예 3: 인간 지방-유래 줄기 세포들의 생산

지방 조직의 처리

지방 흡인이 각 환자의 복부와 대퇴부로부터 대략 200그램의 지방 조직을 수집하기 위해 사용되었다. 지방 흡인물은 수집 후에 데워진(37℃) 멸균 링거액(Ringers Solution)(박스터(Baxter))으로 세척하여 즉시 처리되었고, 이후에 멸균 콜라게나아제를 0.05%wt/vol의 최종 농도까지 첨가하여 소화되었다. 샘플은 오비탈 믹서(orbital mixer) 상에서 100rpm으로 부드럽게 혼합하면서 37℃에서 20분 동안 배양되었고, 800미크론 메시를 통해 여과되었으며, 원심 분리관들로 이송되었고, 500g에서 15분 동안 원심 분리되었다.

부유하는 세포들과 상청액은 폐기되었고, 펠릿으로 된 세포들은 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 혼합되었으며, 15ml의 원심 분리관으로 이송되었다.

상기 세포들은 이후에 콜라게나아제를 제거하도록 DMEM 내에서 세척되었다. DMEM은 14ml의 최종 부피까지 첨가되었고, 상기 샘플은 500g에서 10분 동안 원심 분리되었다. 상기 상청액은 폐기되었고, 상기 펠릿으로 된 SVF 세포들은 4ml의 DMEM 내데 다시 현탁되었으며, 파스퇴르 피펫으로 혼합되었다.

세포들의 신장

세포 서스펜션의 부분 표본들(0.5ml)은 DMEM 플러스 5%의 인간 혈소판 용해물을 함유하는 조직 배양 플라스크들로 이송되었고, 융합 세포 단층이 존재하였을 때(7일 내지 10일)까지 CO₂ 배양기 내에서 37℃에서 배양되었다. 세포들은 3ml의 트립이엘 엑스프레스(인비트로겐)로 벗겨졌고, 50ml의 원심 분리관들 내로 부어졌으며, 500×g에서 10분 동안 원심 분리되었다. 세포들은 이들이 대략 8회 배가되었을 때까지 더 계대되었다. 상기 계대된 세포들은 이후에 벗겨졌고, 원심 분리되었다.

세포들의 냉동 보존

상기 펠릿으로 된 세포 샘플들은 크리오스토르(CryoStor) CS10(바이오라이프 솔루션즈(Biolife Solutions), 미국) 내에 다시 현탁되었고, 2ml의 부분 표본들로 저온 바이알(cryovial)들에 이송되었으며, 상기 저온 바이알들은 -80℃ 냉동기 내에서 24시간 동안 분당 대략 1℃로 속도가 조절된 냉동 장치 내에서 동결되었으며, 이후에 장기간의 저장을 위해 액체 질소 듀어(dewar)로 이송되었다.

실험예 4: 고농도의 ECM 성분들을 분비하는 혈소판 용해물 내에서 성장된 MSC들

조건 배지의 생산

3의 계대 후에 실험예 3에서 성장된 세포들로부터 배지가 수집되었고, 점성도에 대해 분석되었다. 세포들은 또한 대조군으로서 10%의 송아지 태아 혈청 내에서 성장되었다. 상기 배양 배지의 점성도는 상기 세포들이 보다 큰 융합에 이르면서 증가되었으며(도 1), FCS 내에서 성장된 배양들에서는 미미하였고, 혈소판 용해물 내에서 성장된 배지들에서는 실질적이었다.

점성의 조건 배지의 분석

상기 조건 배지의 샘플들은 분석을 위해 호주 단백체 분석 기관(Australian Proteome Analysis Facility: APAF)으로 보내졌다. 상기 분석은 실험예 5에 상세하게 기재된다.

실험예 5: 세포 배양 배지의 점성도의 점진적 증가 조사: 세포외 기질 성분(들) 및/또는 뮤신들을 함유하는 혈소판 용해물 내에서 성장된 중간엽 줄기 세포들로부터의 조직 배양 상청액에 대한 증거

상기 연구는 5% 또는 10%의 혈소판 용해물 배양 배지 내의 지방-유래 줄기 세포들의 성장이 시간에 걸쳐 배양 배지의 점성도를 증가시키는 관찰에 기초하였다. 다음의 단락들에서 설명하는 바와 같이 상기 배양 배지 점성도의 정향화 및 점성도의 증가의 원인의 확인의 두 결과들로 접근되었다.

점성도 측정

점성도는 제조업자의 지시에 따라 동작 점성도를 측정하는 캐논-펜스크 루틴(Cannon-Fenske Routine) 모세관 점성도계(캐논 인스트루먼트 캄퍼니(Cannon Instrument Company), 시리얼 번호: T209)를 이용하여 측정되었다. 간단하게 말하면, 상기 점성도계는 흡인에 의해 대략 5ml의 샘플(배양 배지 또는 재-현탁된 침전물)로 채워졌고, 수조 내에서 40℃에서 적어도 10분 동안 평형이 되게 하였다. 그 온도에서, 상기 샘플은 흡인에 의해 첫 번째 표시된 포인트로 당겨졌고, 상기 메니스커스(meniscus)가 첫 번째 및 두 번째 표시된 포인트들 사이로 이동하는 데 걸리는 시간이 측정되었다(유출 시간). 상기 유출 시간은 이후에 센티스토크(cSt)로 동작 점성도를 얻기 위해 검정 상수(0.009001cSt/s)가 곱해졌다. 점성도는 육 일의 세포 성장에 걸쳐 도식화되었다. 상기 점성도는 매 판단 시에 송아지 태아 혈청 배지 내에서 상대적으로 증가하였다(도 1).

상기 배양 배지 내의 점성도 성분은 다음 단락들에서 설명하는 바와 같이 조사되었다.

아세톤 및 트리클로로아세트산으로의 침전

50ml의 팔콘 튜브(falcon tube) 내에서, 5mL(1부피)의 배양 배지가 -30℃까지 냉각된 20mL(4부피)의 아세톤과 혼합되었다. 혼합물은 와류에 의해 휘저어졌고, 이후에 침전물을 -30℃에서 하룻밤 동안 두었다. 침전물(PT1)은 4600g에서 4℃에서 20분 동안의 원심 분리에 의해 수집되었다. 상청액(SN1)은 제거되었고, 상기 튜브는 상기 펠릿의 완전한 건조를 피하도록 주의하면서 2분까지 동안 상기 침전물을 빼내도록 거꾸로 두었다. PT1은 점성도 측정들 및 효소 소화를 위해 pH 7.8인 100mM의 탄산수소암모늄 내에 재-현탁되었다.

고분자량인 것을 나타내는 상기 배양 배지로부터의 아세톤 침전(80%, -30℃) 침전된 점성도 성분은 약 0.2㎎/ml-0.3㎎/ml의 농도에서 히알루론산(hyaluronic acid)의 점성도와 유사하게 되는 것으로 평가되었다.

펄스 전류 측정 검출(HPAEC-PAD)로 고성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 단당류 분석

25%(v/v)의 트리플루오로 아세트산(TFA)의 저장 용액이 제조되었다. 50㎕의 샘플에, 150㎕의 초순수(MilliQ water) 및 300㎕의 25%(v/v) TFA가 첨가되었다. 샘플들은 100℃에서 4시간 동안 흔들면서 배양되었다. 배양에 후속하여, 샘플들은 진공 원심 분리에 의해 건조되었고, 200㎕의 100μM 2-데옥시(deoxy)-D-글루코오스(glucose)(내부 표준) 내에서 재구성되었다.

샘플들은 펄스 전류 측정 검출로 디오넥스(Dionex) HPLC 계측기 상의 카르보팩(CarboPac) PA1 탄수화물 칼럼 상에서 분석되었다. 천연 단당류(monosaccharide)들이 16mM의 NaOH로 등용매 용리되었다. 산성의 단당류들은 100mM의 NaOH 내에서 아세트산나트륨의 구배 용리를 이용하여 용리되었다. 피크들의 확인은 천연(푸코오스(fucose), 갈락토오스(galactose), 글루코오스, 만노오스(mannose)), 아미노(N-아세틸갈락토사민(acetylgalactosamine), N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine)), 그리고 산성(N-아세틸뉴라민산(acetylneuraminic acid), 글루쿠론산(glucuronic acid)) 단당류들의 알려진 표준들에 대한 비교에 의해 용리 시간으로 결정되었다.

상기 아세톤 침전된 점성도 성분의 단당류 분석은 상기 세포외 기질(ECM)의 주요 성분들로서 프로테오글리칸들에 링크되는 글리코사미노글리칸(GAG)들의 성분들인 상기 단당류들, 글루쿠론산, N-아세틸글루코사민 및 일부 갈락토오스의 존재를 나타내었다. 상기 조성 분석으로부터 이러한 것은 상기 물질 내의 히알루론산, 케라탄 황산염(keratan sulfate) 및/또는 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulphate) GAG들 및/또는 뮤신들 및/또는 다른 당결합체들을 나타낼 수 있었다.

상기 아세톤 침전 물질의 점성도는 후속하는 각기 37℃에서 3일 동안에 별도로 케라타나아제(Keratanase: Kase), 히알루로니다아제(Hyaluronidase: Hase), 콘드로이티나아제(Chondroitinase) ABS(Csase), 엔도(Endo)-β-갈락토시다아제(galactosidase: EBG)로의 효소 처리로 분석되었다. 대조군 배지는 100mM의 탄산수소암모늄 내에서 37℃에서 3일 동안 효소 없이 배양되었다. 동작 점성도의 결과들은 효소들인 케라타나아제, 히알루로니다아제 및 콘드로이티나아제로 점성도의 감소를 보여주었으며, 상기 효소가 상기 침전물 내의 이들의 해당 GAG들에 작용하였던 점을 나타내었다. 이러한 결과는 상기 점성도 성분인 GAG, 프로테오글리칸, 뮤신 또는 다른 고분자량의 분자나 분자들의 복합체의 감소를 뒷받침한다.

콘드로이티나아제, 케라타나아제 및 히알루로니다아제의 이들의 해당 효소들로 콘드로이틴 황산염, 아그레간(Aggregan) 및 히알루론산의 표준 용액들의 효소 소화가 표 1에 정리된 바와 같이 수행되었다.

표 1: 콘드로이틴 황산염, 케라탄 황산염( 아그레칸의 성분) 및 히알루론산의 소화를 위해 최적화된 소화 조건들

효소	효소 농도	반응 완충제	표준
콘드로이티나아제 ABC [20mU/㎕]	5㎕	100mM 아세트산암모늄 pH8	콘드로이틴 황산염(5㎍) 아그레간(10㎍)
케라타나아제 [50mU/㎕]	2㎕	100mM 트리스-HCl pH 7	아그레간(10㎍)
히알루로니다아제 [2U/㎕]	5㎕	100mM 아세트산나트륨 ph\H 5	셀렉트-HA 50K(20㎍)
반응 부피＝20㎕, 37℃ 하룻밤의 배양

상기 GAG 이당류 소화 생성물들은 LC-MS 또는 직접 MS를 이용하여 분석되었고, 이들 조성물은 아세토니트릴(acetonitrile) 내에서 탄산수소암모늄으로 용리시키는 다공성의 흑연화 카본 칼럼 및 서모 벨로스(Thermo Velos) 이온 트랩 질량분석기로 음성 이온 질량분석을 이용하여 분리된 성분들로부터의 MS² 단편화에 의해 확인되었다.

상기 세포 분비물 샘플들은 알파 MEM 배지 플러스 10%의 혈소판 용해물(혈청 전환됨)(스테물레이트(Stemulate), 쿡 레겐텍(Cook Regentec), 블루밍턴시, 인디애나주, 미국) 및 DMEM 배지 플러스 5%의 혈소판 용해물(PLTMax, 밀크릭(Millcreek), 로체스터시, 미네소타주, 미국) 플러스 2IU/mL의 헤파린 내에서 성장된 세포들로부터 생산되었다.

상기 분비된 프로테오글리칸들의 존재를 확인하기 위해, 농축된 세포 분비물/배지 샘플들이 진공 하에서 GAG 분해 효소들, 케라타나아제(Kase), 히알루로니다아제(Hase), 콘드로이티나아제 ABS(Csase), 엔도-β-갈락토시다아제(EBG)로 처리된 PVDF 멤브레인 상으로 고정되었으며, MS에 의해 분석되었다.

소화 생성물들의 제2 단계 MS 스펙트럼들은 질량(m/z 460^2- 및 380^2-m/z)이 아그레칸 표준의 황산화 콘드로이틴 황산염 단편화 스펙트럼들과 부합되었던 점을 보여주었고, 이에 따라 상기 조건 배지 내의 콘드로이틴 황산염의 존재가 확인되었다.

콘드로이틴 황산염은 아그레칸의 GAG 성분이며, 또한 베르시칸과 같은 다른 프로테오글리칸들의 성분이다. 콘드로이틴 황산염의 존재는 이러한 프로테오글리칸들의 하나 또는 혼합물의 존재를 보여준다.

상기 글리칸(glycan) 질량 분석 데이터는 아세톤 침전으로부터 취해진 침전물로부터 소화된 당류들에 대해 결정되었고, 콘드로이틴 황산염의 레벨들은 예상했던 경우보다 낮았다. 그러나 샘플들(50㎕)이 바이오-라드(Bio-Rad) 점적(dot blotting) 장치를 이용하여 진공 하에서 PVDF 멤브레인 상에 점적되었고, 아세톤 침전의 전후에 알시안블루(Alcian blue)(0.1%의 아세트산 내의 0.1%의 알시안블루)로 염색되었으며, 염색 강도가 비교되었을 때, 상기 염색 강도(보다 어두운 청색의 염색 색상)는 아세톤 침전(결과들은 도시되지 않음) 이전의 상기 세포 분비물 샘플들 내에서 보다 높았고, 모든 대전된 거대 분자들(즉, 프로테오글리칸들)이 아세톤에 의해 침전되지는 않았던 점을 시사한다.

단백체(proteomic) 분석은 전체 세포 분비물들 상에서와 세파로오스(Sepharose) 크기 분별에 의해 분리된 상기 고분자량의 단백질들 상에서 수행되었다. 트립신(trypsin) 소화된 펩티드들은 공명 활성화-충돌 유도 해리(CID)와 함께 양성 극성 모드로 온-라인 모세관 역상(RP)(프로테콜(ProteCol) C18, 300㎛ ID, 10㎝, 5㎛의 입자 크기, 300Å의 공극 크기) 액체 크로마토그래피(LC) 질량 분석(MS)을 이용하여 분석되었다. 상기 칼럼은 30%-60%의 용매 B가 수반되는 0%-30%의 용매 B(아세토니트릴 내의 0.1%(v/v) 포름산)에 의해 분리된 100%의 용매 A(0.1%(v/v) 포름산 및 펩티드들 내에서 평형화되었다. 상기 펩티드 혼합물들은 15㎕의 탈이온수 내에서 재구성되었고, 5㎕가 상기 칼럼 상으로 주입되었다.

검출되었던 상기 세포외 기질 프로테오글리칸들은 루미칸, 베르시칸 및 비글리칸이었다. 콘드로이틴 황산염은 베르시칸 뿐만 아니라 아그레칸의 GAG 사슬 성분이다. 아그레칸은 상기 단백체 분석에서 검출되지 않았지만, 상기 단백체 분석은 프로테오글리칸들에 대해 차선이었고, 아그레칸 상의 넓은 당 사슬들은 상기 단백질 성분들의 검출을 억제하였다.

아그레칸 특이적 항체들을 갖는 ELISA 키트는 양 배지 유형들(헤파린이 있거나 없는)로부터와 계대 1-10(결과들은 도시도지 않음)에 걸쳐 조건 배지 내의 50pg/mL－900pg/mL의 아그레칸의 변화하는 레벨들을 확인하였다. 일곱의 다른 지방 조직 공여자들이 테스트되었고, 모든 7의 공여자들로부터의 조건 배지로부터 아그레칸이 검출되었다.

콘드로이틴 황산염은 상기 조건 배지 내에 존재하는 것으로 확인되었다. 콘드로이틴 황산염은 베르시칸 및 아그레칸의 양 프로테오글리칸들의 성분이다. 단백체 분석은 베르시칸, 루미칸 및 비글리칸을 검출하였지만, 아그레칸의 존재는 확인하지 못하였고, 잠재적으로 상기 단백체 분석은 아그레칸 상의 넓은 당 사슬들에 의해 억제되었다. 아그레칸은 양 배지 유형들의 조건 배지 내에서 아그레칸 항체 ELISA 분석에 의해 존재하는 것으로 확인되었고, 부합되는 공백 성장 배지 내에는 존재하지 않았다.

실험예 6: 인간 동종 이계의 지방-유래 MSC들의 산업적 규모의 생산

공여자 선택

지방 조직이 실험예 3에서 설명한 바와 같이 인간 공여자들로부터 수집되었다. 각 공여자로부터의 세포들은 실험예 1에 따라 선별되었다. 상기 '혈청 스위치' 선별 방법에서 허용 가능한 성능과 같이 적절한 성질들을 나타내었던 세포들이 대규모 신장을 위해 수집되었다.

세포들의 신장

세포들은 실험예 3에서 설명한 바와 같이 신장되었고 계대되었다. 열 층의 조직 배양 제조소들이 상기 세포들을 계대시키기 위해 이용되었다. 세포들은 세포들이 약해지거나 노화되는 것으로 나타나지 않고 계대 8까지 계속 계대되었다.

하나의 공여자로부터 생산될 수 있는 바이알들의 계산된 숫자

표 2는 본 발명의 방법들을 이용하여 하나의 공여자로부터 생산될 수 있는 각기 5백만의 세포들을 함유하는 332백만의 바이알들에 대해 나타낸다.

표 2: 하나의 공여자로부터 생산될 수 있는 바이알들의 계산된 숫자

	파종된 세포들	배가의 숫자	세포 산출	바이알들 생산물의 숫자
계대 0	173.5	0.13	189.86	38
계대 1	189.9	3.47	2103.81	421
계대 2	2103.8	3.59	25334.08	5,067
계대 3	25334.1	3.2	232809.73	46,562
계대 4	232809.7	2.5	1316970.73	263,394
계대 5	1316970.7	3	10535765.85	2,107,153
계대 6	10535765.9	2	42143063.41	8,428,613
계대 7	42143063.4	2.5	238397167.31	47,679,433
계대 8	238397167.3	2.8	1660294306.33	332,058,861

실험예 7: MSC들의 신장을 위한 선택적인 조직 배양 배지

인간 세포들이 지방 조직으로부터 분리되었고, 실험예 3에서 설명한 바와 같이 배양되었다. 2의 계대 후에 상기 배지는 하이 글루코오스(High Glucose) DMEM, 10%의 송아지 태아 혈청, 20ng/ml의 표피 성장 인자(EGF), 20ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자 및 2%의 B27 서플리멘트(Supplement)(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))로 대체되었다. 상기 세포들이 융합하게 되면, 상기 조건 배지는 점성으로 되었다.

실험예 8: 동종 이계의 세포들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지로 골관절염이 있는 인간 환자의 치료

지방 조직의 처리

지방 흡인이 환자의 복부 및/또는 대퇴부로부터 832그램의 지방 조직을 수집하기 위해 이용되었다. 지방 흡인물은 수집 후에 즉시 데워진(37℃) 멸균 링거액(박스터)으로 세척하여 처리되었고, 이후에 멸균 콜라게나아제를 0.05%wt/vol의 최종 농도까지 첨가하여 소화되었다. 상기 샘플은 오비탈 믹서 상에서 100rpm으로 부드럽게 혼합하면서 37℃에서 20분 동안 배양되었고, 800미크론 메시를 통해 여과되었으며, 원심 분리관들로 이송되었고, 500g에서 15분 동안 원심 분리되었다. 부유하는 세포들과 상청액은 버려졌고, 펠릿으로 된 세포들은 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 혼합되었으며, 15ml의 원심 분리관으로 이송되었다.

상기 세포들은 이후에 콜라게나아제를 제거하기 위해 DMEM 내에서 세척되었다. DMEM이 14ml의 최종 부피까지 첨가되었고, 상기 샘플은 500g에서 10분 동안 원심 분리되었다. 상기 상청액은 버려졌고, 상기 펠릿으로 된 SVF 세포들은 분류되었고, 8의 별도의 냉동 백들 내로 나누어졌다. 상기 세포들은 백 당 11.5ml-12.5ml의 부피로 크리오스토르 10 내에 저온 보존되었다

세포들의 신장

세포들의 백이 융해되었고, 알파 MEM 및 10%의 인간 혈소판 용해물을 함유하는 T175 조직 배양 플라스크 내에 파종되었다. 상기 혈소판 용해물은 원심 분리 이전에 피브리노겐(fibrinogen)을 제거하기 위해 트롬빈 및 염화칼슘의 첨가에 의해 저리되었다. 세포들은 융합 세포 단층이 존재하였을 때(7일 내지 10일)까지 CO₂ 배양기 내에서 37℃에서 배양되었다. 세포들은 실험예 3에서 설명한 바와 같이 4회 계대되었다. 상기 계대된 세포들은 이후에 벗겨졌고, 원심 분리되었다. 최종 계대로부터 조건 배지가 수집되었고, 상기 세포들의 저온 보존을 위해 사용되었다.

세포들의 저온 보존

상기 펠릿으로 된 세포 샘플들은 1.8mL의 조건 배지 및 0.2mL의 블러드스토르(bloodstor)-100 저온 보존 유체(바이오라이프 솔루션즈, 미국) 내에 다시 현탁되었고, 2ml의 부분 표본들로 저온 바이알들로 이송되었으며, 상기 저온 바이알들은 -80℃의 냉동기 내에서 24시간 동안 분당 대략 1℃로 속도 조절되는 냉동 장치 내에서 동결되었고, 이후에 장기간의 저장을 위해 액체 질소 듀어로 이송되었다.

환자의 치료

무릎의 3등급의 골관절염이 있는 52세 연령의 환자가 신장된 동종 이계 세포들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 단일의 관절 내 주사로 치료되었다. 상기 세포들 및 조건 배지를 함유하는 바이알은 실온에서 해동되었고, 즉시 무릎 관절에 주사되었다. 상기 주사는 1.8mL의 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지 및 0.2mL의 블러드스토르-100 저온 보존 유체 내의 3.9백만의 세포들로 구성되었다.

상기 환자는 상기 주사 후의 1주에 조사되었고, 통증의 상당한 감소가 보고되었다. 상기 환자는 이러한 결과에 만족하였고, 다른 무릎에 주사될 수 있는지를 문의하였다.

실험예 9: 분비물들의 안정성

분비물들의 제조

인간 지방-유래 MSC들(실험예 8에서 설명한 바와 같이 수득됨)이 알파 MEM 플러스 10%의 혈소판 용해물(혈청 전환됨)(스테물레이트, 쿡 레겐텍, 블루밍턴시, 인디애나주, 미국) 내에서나 알파 MEM 플러스 10%의 송아지 태아 혈청 내에서 10층의 세포 제조소 플라스크들 내에서 배양되었다. 상기 배지는 변화되지 않았고, 상기 세포들은 상기 세포들이 80% 내지 100% 융합할 때까지 4일-7일 동안 배양이 유지되었다. 상청액이 수확되었고, 상기 혈소판 용해물 배지로부터는 점성이지만, 상기 송아지 태아 혈청 배지로부터는 점성이 아닌 것으로 관찰되었다. 상기 상청액은 여과가 상기 점성도를 감소시키는 것으로 관찰되었기 때문에 여과되지 않았다.

ELISA에 의한 VEGF의 분석

혈관 표피 성장 인자(VEGF)는 ELISA(R & D 시스템즈, 미니애폴리스시, 미네소타주, 미국)를 이용하여 측정되었다.

바이오플렉스에 의한 분비물들의 분석

열넷의 다른 시토카인들과 성장 인자들이 바이오플렉스(Bioplex) 시스템(바이오라드(Biorad))을 이용하여 측정되었다.

안정성 시험

상기 분비물들의 샘플들은 22℃에서 테스트 튜브들 내에 저장되었고, 규칙적인 간격들로 테스트되었다. 샘플들은 또한 대조군으로서 -80℃에서 저장되었다. 샘플들은 상기 -80℃의 대조군과 비교하여 22℃에서 저장되었다.

결과들

6개월의 기간에 걸쳐 분비물들 내에서 ELISA에 의해 측정된 VEGF의 레벨들은 크게 줄어들지 않았다(도 2).

열넷의 다른 시토카인들과 성장 인자들이 실온에서 5개월의 기간 동안 저장되었던 점성의 조건 배지 및 비점성의 조건 배지 내에서 측정되었다. 각 시토카인 또는 성장 인자의 레벨의 퍼센티지 변화는 출발 시간에서의 레벨과 비교하여 계산되었으며, 측정된 상기 다른 시토카인들과 성장 인자들이 비점성의 조건 배지보다 점성의 조건 배지에서 안정하였던 점이 입증된다(도 3).

중요도

놀랍게도 VEGF의 레벨들은 며칠 이상 동안 실온에서 안정하게 남아 있었다. 문헌들에는 VEGF와 같은 시토카인들과 이러한 실험예에서 분석된 다른 것들의 대부분이 낮은 온도들에서 동결되어 저장되지 않는 한 안정하지 않은 것으로 교시되어 있다(Kisand 등, Porter 등).

실험예 10: 점성도의 측정

지방-유래 세포들이 실험예 8에서 설명한 바와 같이 제조되었다. 세포들은 알파 MEM 플러스 10%의 혈소판 용해물(혈청 전환됨)(스테물레이트, 쿡 레겐텍, 블루밍턴시, 인디애나주, 미국) 내에서나 DMEM 플러스 10%의 송아지 태아 혈청 내에서 배양되었다. 세포들은 계대 4 또는 5까지 배양되었고, 상기 조건 배지는 상기 세포들이 50% 내지 100% 융합되었을 때에 수확되었다. 상기 조건 배지의 점성도는 캐논-페스크 U 점성도계를 이용하여 측정되었다.

결과들

대략 ＞80%의 융합에 도달하게 두었던 모든 배양들은 1.5cSt 보다 큰 점성도를 가졌다. 반면에 80%의 융합 전에 수확되었던 모든 배양들은 1.5cSt 아래의 점성도를 가졌다(도 4).

실험예 11: 계대된 인간 지방-유래 유착 세포들로부터의 분비물들을 포함하는 조성물로 테니스 팔꿈치의 치료

분비물들은 알파 MEM 플러스 10%의 혈소판 용해물 내의 세포들의 성장으로 실험예 9에서 설명한 바와 같이 계대된 인간 지방-유래 유착 세포들로부터 제조되었다.

분비물들은 국소 적용을 위한 겔을 생산하기 위해 솔루겔(존슨 앤 존슨(Johnson & Johnson))로 10 대 1로 혼합되었다. 발병된 지 2년인 테니스 팔꿈치가 있는 72세 연령의 여성이 상기 겔을 팔꿈치에 하루에 두 번 적용하여 치료되었다. 5일 후에 상기 여성은 통증의 상당한 감소를 보고하였고, 볼링을 할 수 있었으며, 상기 치료 이전에는 그녀의 팔꿈치의 통증이 이러한 활동들을 방해하였다.

내측 및 외측의 테니스 팔꿈치가 있는 77세 연령의 제2의 여성 환자가 하루에 두 번의 상기 겔의 적용으로 치료되었다. 상기 환자는 4일 내지 5일에 보다 나은 느낌을 보고하였다. 2.5주 후에 상기 환자는 치료된 팔꿈치가 "편안함 느낌"을 받았기 때문에 상기 겔을 사용하는 것을 중단하였다. 상기 환자는 상기 겔의 적용을 중단한 후의 3주에 상기 팔꿈치 느낌이 어떤 지에서 경과가 없었던 점을 보고하였다. 상기 환자는 자신이 완전히 치유된 것으로 보고하였다. 이러한 개선은 상기 분비물들 치료를 개시하기 이전에 통증으로 볼링을 10엔드를 마치지 못하였지만, 분비물 치료 후에는 21엔드를 마쳤던 것에 의해 입증되는 바와 같이 환자가 자신의 육체적인 능력을 향상시키게 하도록 하였다.

실험예 12: 계대된 인간 지방-유래 유착 세포들로부터의 분비물들을 포함하는 조성물로 건 손상들의 치료

다음의 상태들의 범위의 대상들은 알파 MEM 플러스 10%의 혈소판 용해물 내의 세포들의 성장으로 실험예 10에서 설명한 바와 같이 제조된 솔루겔과 혼합된 계대 인간 지방-유래 세포들로부터의 분비물들을 사용하여 치료되었다. 모든 경우들에서, 상기 겔의 적용은 통상적으로 하루에 두 번으로 환부의 피부에 대한 국소 적용이었다.

동창 및 발의 건염

동창 및 발의 건염이 있었던 75세 연령의 여성. 통증과 염증은 치료의 4일 후에 사라졌다.

골퍼 손목

골퍼 손목에 대해 치료된 75세 연령의 여성. 통증과 염증은 4일 후에 사라졌다.

전자 점액낭염

전자 점액낭염. 통증과 염증은 4일 후에 사라졌다.

아킬레스 건염

수년간 진행되었던 아킬레스 건염이 있었던 74세 연령의 환자가 분비물들을 함유하는 겔로 치료되었다. 상기 환자는 3일 동안의 상기 겔의 사용 후에 사라지지 않았던 불편을 보고하였다. 상기 환자에게 3주 동안에 하루에 두 번 상기 겔의 적용이 계속되었으며, 통증은 재발하지 않았다.

종아리 열상

퇴근에 종아리 열상이 있었던 52세 연령의 환자가 상기 분비물 겔로 치료되었다. 상기 환자는 상기 분비물 겔의 적용에 따라 멘톨(menthol)과 유사한 위로의 이점이 있었던 것과 상기 치료의 개시 이전에 상기 환자에게 영향을 미쳤던 다음 날 아침의 다리의 경직이 신경이 쓰이지 않았던 것을 보고하였다. 상기 환자에게 상기 분비물들 겔이 매일 밤에 다시 적용되었고, 상처가 잘 치유되는 점이 보고되었다. 상기 환자는 상기 치료 동안에, 밤에 한 번 지나친 상기 분비물 겔의 적용이 다음날 아침에 다리의 적용된 부위의 경직의 증가를 수반하였던 점을 보고하였다.

참조 문헌들

Cesaretti, M., E. Luppi, F. Maccari 및 N. Volpi의 "A 96-well assay for uronic acid carbazole reaction"(Carbohydrate Polymers, 2003, 54:59-61).

Kilcoyne, M., J.Q. Gerlach, M.P. Farrell, V.P. Bhavanandan 및 L. Joshi의 "Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format"(Analytical Biochemistry, 2011, 416:18-26).

Kisand, K., Kerna, I.,Kumm, J. 등의 "Impact of cryopreservation on serum concentration of matrix metalloproteinases (MMP)-7, TIMP-1, vascular growth factors (VEGF) and VEGF-R2 in Biobank samples Clinical Chemistry and Laboratory Medicine"(2010, 49(2), pp. 229-235).

Porter AE , Auth J , Prince M , Ghidini A , Brenneman DE, Spong CY의 "Optimization of cytokine stability in stored amniotic fluid"(American Journal of Obstetrics and Gynecology, 2001, 185(2):459-462).

Claims (58)

1. 대상에서 염증 상태를 치료하기 위한 방법에 있어서, 상기 대상에 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지(glycoconjugate-enriched conditioned media)의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 염증 상태는 골관절염(osteoarthritis)인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 배양-신장된(culture-expanded) MSC들의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 배양-신장된 MSC들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지는 혈소판 용해물(platelet lysate)을 포함하는 배지 내에서 MSC들을 배양하여 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 제조를 위한 혈소판 용해물의 용도.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 인간 혈소판 용해물인 것을 특징으로 하는 용도.
8. 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지의 제조를 위한 방법에 있어서, 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)들을 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 MSC들은 지방 조직-유래 MSC들인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 인간 혈소판 용해물인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 8 항에 있어서, 상기 배지는 약 5%v/v 내지 약 10%v/v의 혈소판 용해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 8 항에 있어서, 상기 강화 배지는 프로테오글리칸(proteoglycan), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 및 뮤신(mucin)의 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 8 항에 있어서, 상기 강화 배지는 케라탄 황산염(keratan sulphate), 더마탄 황산염(dermatan sulphate), 헤파린 황산염(heparin sulphate), 루미칸(lumican), 베르시칸(versican), 비글리칸(biglycan), 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulphate) 또는 아그레칸(aggrecan)의 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 8 항에 있어서, 상기 배지로부터 상기 세포들을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 조성물.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 조성물은 MSC들을 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 배양하여 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 배양-신장된 MSC들 및 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 조성물.
18. 제 15 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물(pharmaceutical composition)인 것을 특징으로 하는 조성물.
19. 제 17 항에 있어서, 상기 세포들 상기 조성물을 함유하는 용기 내에 유착되지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
20. 제 15 항 또는 제 17 항에 있어서, 제 8 항의 방법에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
21. 제 15 항 또는 제 17 항에 따른 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지와 약학적으로 허용 가능한 운반체(carrier), 부형제(excipient) 또는 보조제(adjuvant)를 포함하는 약학 조성물.
22. 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 적합성에 대해 MSC들의 샘플을 선별하는 방법에 있어서, (i) 상기 샘플의 세포들을 혈소판 용해물 혹은 1, 2 또는 3의 계대(passage)를 위한 FCS를 포함하는 배양 배지 내에서 배양하는 단계, 그리고 상기 단계 (i) 후에 상기 세포들 또는 그 부분 표본을 동종 이계 혈청(allogeneic serum)을 포함하는 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내의 세포들의 지속된 증식은 배양된 MSC들의 대규모 숫자의 생산에의 사용을 위해 적합한 샘플을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 적합성은 노화 전에 적어도 15의 집단 배가(population doubling)를 위한 능력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 22 항에 있어서, 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 적합성은 노화 전에 적어도 20의 집단 배가를 위한 능력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 22 항에 있어서, 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 적합성은 노화 전에 적어도 25의 집단 배가를 위한 능력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 22 항에 있어서, 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 적합성은 노화 전에 적어도 35의 집단 배가를 위한 능력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 22 항에 있어서, 상기 MSC들의 샘플은 MSC들의 지방 조직-유래 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 22 항에 있어서, 상기 MSC들의 샘플은 인간, 개, 말 및 고양이 MSC들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 배양된 MSC들의 대규모 생산에의 사용을 위한 부적합성에 대해 MSC들의 샘플을 분별하는 방법에 있어서, (i) 상기 샘플의 세포들은 혈소판 용해물 혹은 1, 2 또는 3의 계대를 위한 FCS를 포함하는 배양 배지 내에서 배양하는 단계, 그리고 상기 단계 (i)로부터의 상기 세포들 또는 그 일부를 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내에서 증식되는 상기 세포들의 기능 상실(failure)은 배양된 MSC들의 대규모 숫자의 생산에의 사용을 위해 부적합한 샘플을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 29 항에 있어서, 융합(confluence)에 도달하는 상기 세포들의 기능 상실은 상기 증식되는 세포들의 기능 상실을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 배양된 MSC들의 대규모 생산을 위한 방법에 있어서, (i) MSC들을 포함하는 세포 샘플 또는 조직 샘플을 수득하는 단계를 포함하고, (ii) 배양된 세포 집단을 제공하도록 상기 샘플의 적어도 일부를 혈소판 용해물 혹은 1, 2 또는 3의 계대를 위한 FCS를 포함하는 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함하며, (iii) 상기 단계 (ii)로부터의 상기 배양된 세포 집단의 일부를 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함하고, 상기 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내의 세포들의 지속된 증식에 따라, (iv) 배양된 MSC들의 대규모 제조를 제공하도록 상기 단계 (i) 또는 상기 단계 (ii)로부터의 상기 배양된 세포 집단의 적어도 일부를 혈소판 용해물 또는 추가적인 계대를 위한 FCS를 포함하는 배양 배지 내에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 세포 샘플은 지방 조직의 기질 혈관 분획(stromal vascular fraction of)을 포함하는 세포 서스펜션(suspension)인 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 31 항에 있어서, 상기 세포 샘플은 분리된 MSC들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 31 항에 있어서, 상기 세포 샘플은 배양-신장된 MSC들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 31 항에 있어서, 상기 단계 (i) 내지 상기 단계 (iv)의 적어도 하나의 상기 세포들은 동결되었던 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 31 항에 있어서, 상기 단계 (iv)는 상기 세포 집단을 10 또는 그 이상의 추가적인 집단 배가를 위하거나; 15 또는 그 이상의 추가적인 집단 배가를 위하거나; 20 또는 그 이상의 추가적인 집단 배가를 위하거나; 25 또는 그 이상의 추가적인 집단 배가를 위하거나; 35 또는 그 이상의 추가적인 집단 배가를 위해 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 31 항에 있어서, 상기 방법은 상기 추가적인 계대 및 선택적으로, 상기 수확된 세포들을 MSC들의 치료 용량을 구성하는 개개의 용기들 내로 부분 표본화하는 단계 후에 배양-신장된 MSC들을 수확하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 37 항에 있어서, 상기 MSC들의 치료 용량은 약 2백만 내지 약 200백만의 MSC들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제 37 항에 있어서, 상기 MSC들의 치료 용량은 약 5백만의 MSC들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제 31 항의 방법에 따라 제조되는 MSC들을 포함하는 약학 조성물.
41. 배양-신장된 지방 조직-유래 중간엽 줄기 세포들의 정제된 집단을 제조하기 위한 방법에 있어서,
    (i) 대상으로부터 지방 조직의 샘플을 수득하는 단계를 포함하고;
    (ii) 상기 지방 조직을 적어도 부분적으로 소화시키도록 상기 지방 조직을 적합한 조건들 하에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 조건들은 50㎎/L 내지 500㎎/L의 농도로 칼슘을 포함하는 완충제(buffer) 및 0.2%wt/vol 내지 0.02%wt/vol의 농도로 콜라게나아제(collagenase)의 존재에서의 배양을 포함하고;
    (iii) 기질 혈관 분획(SVF)을 수득하도록 상기 배양된 지방 조직을 원심 분리하는 단계를 포함하며;
    (iv) 원하는 파종 밀도로 상기 SVF 세포들을 조직 배양 내로 파종하는 단계를 포함하고;
    (v) 상기 배양을 적절한 조건들 하에서 적어도 85%의 플라스크 융합까지 혈청-보강 배지 내에서 배양하는 단계를 포함하며;
    (vi) 상기 배양으로부터 MSC들을 수확하는 단계를 포함하고;
    (vii) 배양-신장된 MSC들을 수득하도록 적어도 10의 집단 배가를 위해 상기 수확된 MSC들 또는 그 자손(progeny)을 계대시키는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제 41 항에 있어서, 상기 콜라게나아제 농도는 0.05%wt/vol인 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제 41 항에 있어서, 상기 칼슘은 330㎎/L인 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제 41 항에 있어서, 상기 조건들은 오비탈 로터(orbital rotor) 상에서의 혼합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제 41 항에 있어서, 상기 파종 밀도는 조직 배양 플라스크의 ㎠ 당 약 2,000 내지 약 15,000의 세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
46. 제 41 항에 있어서, 상기 조직 배양은 상기 세포들을 마이크로 운반체(microcarrier) 비드(bead)들 또는 마이크로 운반체 디스크들 상에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
47. 제 41 항에 있어서, 상기 혈청-보강 배지는 10%의 FCS 또는 5% 내지 10%의 혈소판 용해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
48. 제 41 항에 있어서, 상기 세포들이 3의 계대를 겪기 이전에, 배양된 MSC들의 대규모 숫자의 생산에의 지속되는 사용을 위해 적합한 세포들을 확인하도록 상기 세포들의 부분 표본이 동종 이계 혈청을 포함하는 배양 배지 내에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제 48 항에 있어서, 상기 방법은 배양된 MSC들의 대규모 숫자의 생산에의 지속되는 사용을 위해 적합한 것으로 확인된 세포들을 FCS 또는 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 지속적으로 계대시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
50. 대상에서 염증 상태를 치료하거나, 염증 상태와 연관된 통증을 완화시키거나, 신경성 통증을 치료하기 위한 방법에 있어서, 상기 대상에 MSC들의 생체 외의(in vitro) 배양으로부터의 조건 배지를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 국소 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
51. 제 50 항에 있어서, 상기 MSC들은 인간 지방 조직-유래 MSC들인 것을 특징으로 하는 방법.
52. 제 50 항에 있어서, 상기 염증 상태는 윤활낭염(bursitis), 건염(tendonitis), 골퍼 손목(golfers wrist), 테니스 팔꿈치(tennis elbow), 아킬레스 건염(Achilles tendonitis), 종아리 열상(calf tear) 및 동창(chilblains)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
53. 제 50 항에 있어서, 상기 MSC들의 생체 외의 배양은 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서의 배양시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제 53 항에 있어서, 상기 조성물은 고분자량의 당결합체-강화 조건 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
55. 제 50 항에 있어서, 상기 조건 배지를 포함하는 조성물은 배양-신장된 MSC들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
56. 제 55 항에 있어서, 상기 배양-신장된 MSC들은 증식-계대된 MSC들인 것을 특징으로 하는 방법.
57. 안정한 세크리톰(secretome)을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법에 있어서, 상기 안정성은 실온에서 1개월 후에 적어도 60%의 활성의 유지를 포함하고, MSC들을 혈소판 용해물을 포함하는 배지 내에서 세크리톰의 분비물을 상기 배양 배지 내로 허용하도록 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
58. 제 57 항에 있어서, 상기 안정한 세크리톰은 IFN-γ, IL-8, IL-9, IL-12, IL-15, TNF-α, IL-10, MCP-1, RANTES, GM-CSF, IP-10, PDGF-bb, VEGF, IL-6 및 VEGF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 인자들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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