KR102193175B1

KR102193175B1 - 통증조절인자를 함유한 줄기세포유래 엑소좀 및 그 용도

Info

Publication number: KR102193175B1
Application number: KR1020200042397A
Authority: KR
Inventors: 조용우; 최지숙; 김우성; 우창희
Original assignee: 주식회사 엑소스템텍
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2020-04-07
Publication date: 2020-12-18
Also published as: KR102193175B9; JP7473117B2; WO2021206459A1; EP4134087A1; CN115397443A; JP2023521064A; US20230225971A1

Abstract

본 발명은 엑소좀에 기반한 통증 완화 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 엑소좀은 세포증식 및 세포거동 과정에서 분비되는 신경세포 재생 및 통증 완화와 관련된 다양한 사이토카인, 유전자, 생체활성인자 및 단백질 등을 함유하고 있기 때문에 통증을 유발시키는 근본적인 원인을 치유할 수 있다.　

Description

통증조절인자를 함유한 줄기세포유래 엑소좀 및 그 용도{Stem cell-derived exosomes with pain control factors and uses thereof}

본 발명은 염증성 통증 등 다양한 신경병성 통증에 대한 완화 혹은 치유용 약학 조성물에 관한 것이다.

신경병성 통증(neuropathic pain)은 중추나 말초 신경조직들이 다양한 요인(질환에 의한 요인: 뇌출혈/뇌경색, 당뇨병, 대상포진, 관절염 등 / 약물치료에 의한 요인: 다양한 항암치료)들에 의해 손상(통증전달에 관여하는 주요 신경세포체의 염증반응에 인한 지속적 흥분, 사이신경세포 및 교세포 등 그 세포들 사이의 시냅스 구조적 변화, 신경세포 손상 혹은 사멸 등)되면서 발생하는 난치성 통증으로써, 손상이 지속되면 만성 통증으로 발전하기도 한다. 통증의 양상은 외부자극 없이 수시로 발생하는 자발통, 통증에 대한 역치가 낮아져 아픈 자극에 대해 정상보다 더 심한 통증을 느끼는 통각과민, 아프지 않은 자극에 대해서도 통증을 느끼는 이질통 등 다양하다.

통증 완화 혹은 치유하기 위해서 개발된 치료법은 그 정도에 따라 비약물치료법과 약물치료법으로 분류된다. 통증의 정도가 약한 경증의 경우에는 주로 비약물치료법을 통해 통증 완화를 유도하는데, 통증의 확산을 막기 위한 교감신경 블록 혹은 절제방법이나 전기신호로 해당부위를 일시적으로 자극하여 통증신호 전달을 제어하는 방법 등을 이용하여 통증을 경감시킨다. 반면 통증의 정도가 강한 경우에는 약물치료법을 통해 통증 완화를 유도하는데, 주로 항염증제(아스피린, 아세트아미노펜, 이부로펜, 비스테로이드계 등), 항경련제(카바마제핀, 가바펜틴 등), 항우울증제 (벤조다이아제핀 등) 등을 사용하여 각 부위별 통증에 대한 신호전달을 통제하여 증상을 완화시킨다. 결국, 통증 정도에 차이는 있지만, 기본적인 원리는 모두 단순한 신호전달을 차단하는 것으로써 아직까지도 근본적인 치료법이 없다고 볼 수 있다.

최근 근본적인 접근방법으로써 줄기세포를 이용한 통증치료 연구들이 보고되고 있는데, 이들 줄기세포들은 체내 안전성(암세포로의 변이가능성) 및 체내 낮은 생착률 등의 한계점들이 존재하여 가시적인 치료효과를 보기 어렵다. 또한 유일하게 엑소좀을 이용한 조성물로서, 혈액에서 채취한 엑소좀 및 코르티코스테로이드를 사용하여 관절염 통증을 다룬 연구가 보고된 바 있으나, 여기서 엑소좀은 코르티코스테로이드의 치료효과를 상승시키기 위한 병용제로 사용되었을 뿐이고 엑소좀 단독의 통증 치료 효과가 확인된 바가 없으며, 또한 혈액에서 채취한 엑소좀은 자가성 엑소좀으로서 환자 자신에게서 회수할 수 있는 샘플 량의 한계가 있다(국제특허출원 제PCT/EP2010/069426호).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

국제특허출원 제PCT/EP2010/069426호

본 발명은 통증 치료와 관련하여 기개발된 다양한 치료법들의 단점을 보완하기 위하여 연구 노력한 결과, 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 이용하여 통증 완화 및 치유 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 기존의 통증 완화, 개선 혹은 치유를 목적으로 시판되는 약학 조성물을 대체할 수 있는, 통증조절인자를 함유한 줄기세포 엑소좀 기반 약학 조성물을 제공하고, 이를 이용한 염증성 통증 등 다양한 신경병성 통증을 완화, 개선 또는 치유하는 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 하나의 관점은 지방유래 줄기세포(adipose derived stem cells)로부터 유래한 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 통증 완화 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "줄기세포(stem cell)"란 자기 복제 능력뿐만 아니라, 세포가 위치하는 환경의 영향을 받아 필요에 따라 적절한 신호가 주어질 경우, 다중분화능(multi potency)의 특성에 의해 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 특성이 있는 세포이다.

본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있다. 바람직하게는 상기 줄기세포는 환자의 자가 지방 조직으로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "지방유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)"란 지방조직에서 유래하는 줄기세포로, 지방조직은 많은 양의 조직 채취가 용이하여 줄기세포를 수확하는데 좋은 조건을 가지고 있으며, 지방 유래 줄기세포는 배양 시 안정적인 성장과 증식을 보여주고 분화를 유도하였을 때 다양한 세포로의 분화가 가능하다.

본 발명에서 사용된 용어, "엑소좀 (exosome)"이란 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 면역학적으로 중요한 단백질인 주조직적합체와 열충격 단백질을 포함하여 강력한 항종양 면역 반응을 유도하며, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 통증완화에 관련된 다양한 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 이용하여 통증 치료제의 조성물로 활용할 수 있다.

본 발명의 지방유래 줄기세포로부터 유래한 엑소좀은 통증조절인자를 함유하고 있어, 통증 완화 및 치료에서 중요한 역할을 할 수 있는데, 구체적으로 통증 및 염증 완화에 관련하여 분비되는 대표적인 사이토카인으로서 TIMP-1 (tissue inhibitors of metalloproteinases-1), TIMP-2, IL-1ra (interleukin-1 receptor antagonist), IL-4 (interluekin-4), IL-10 (Interleukin-10), TGF-β (transforming growth factor-β) 등을 포함하며, 이들 사이토카인은 염증반응 억제를 유도하고 염증성 사이토카인을 억제하도록 유도시키는 역할을 가지고 있다.

상기 엑소좀은 당업계에 알려진 엑소좀 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 하기의 단계를 포함하는 추출 방법에 의하여 수득할 수 있다:

1) 인간지방줄기세포를 증식용 배양 배지에 배양한 다음 무혈청 및 무항생제 배지에서 하루 동안 배양하는 단계;

2) 세포 배양 상층액을 회수하는 단계;

3) 회수한 세포 배양 상층액을 원심분리하는 단계; 및

4) 엑소좀을 분리 및 정제하는 단계.

상기와 같이 제조한 엑소좀은 인간지방줄기세포의 배양 과정 중 얻은 배양액을 이용한다는 점에서는 종래 기술들과 유사하지만, 배양액을 그대로 사용하지 않고 배양액 내에 존재하는 나노베지클 형태의 엑소좀을 추출 및 정제하여 통증 치료제로 사용한다는 점에서 차별성이 있다. 이 경우, 엑소좀에 담지된 재생 관련 단백질 및 다양한 성장인자들만을 유효하게 사용할 수 있으므로 항생제 및 혈청을 포함한 배지 성분에 의해 야기되는 문제들을 해결할 수 있다.

상기와 같이 제조한 엑소좀은 줄기세포의 유전정보, 단백질, 성장인자가 담지되었을 뿐 아니라 엑소좀 자체가 캐리어 역할까지 할 수 있다. 약 50 - 200 nm 크기의 지질로 이루어진 엑소좀은 세포 유래 물질이기 때문에 생체 적합하며, 세포의 흡수율 또한 매우 좋다.

본 발명에서 용어 "통증"은 실제적 또는 잠재적 조직 손상을 동반한 불쾌한 감각 및 경험"을 의미하며 신경병성 통증, 급성통증, 만성통증, 체성통증, 연관통, 내장통 및 심인성 통증 등을 포함한다.

신경병성 통증(neuropathic pain)은 신경계의 손상이나 기능적 이상으로 발생하는 통증으로 난치성이며 만성적으로 오래 지속되는 특성으로 인하여 환자의 삶의 질이 현저히 저하되고, 통증 자체뿐만 아니라 수면장애, 우울증과 같은 정서장애, 사회 적응력 저하로 인한 생산성 저하 등의 사회적 문제까지 야기하는 통증 증후군이다. 신경병성 통증은 항암치료로 수반되는 통증, 염증성 통증, 근육성 통증 및 말초신경 손상에 의한 통증 등을 포함한다.

급성통증은 질병이나 외상에 의한 조직 손상으로 인해 발생하는 침해성 자극에 의해 발생하는　통증으로, 출산　통증, 수술 후　통증, 조직손상 후　통증　등이 있으며, 일반적으로 3 내지 6개월 이내 소실된다. 만성통증은 여러 불분명한 원인에 의해 신경손상과 이에 따른 신경계의 변화에 의해서도 유발되며, 원인이 된 질환이나 손상의 치유기간보다 길게 지속이 된다. 예를 들어, 편두통, 류마티스성통증, 당뇨병성통증, 및 암성　통증이 있으며, 이러한　통증은 환자의 삶의 질을 급격히 떨어뜨리고, 우울증 등을 수반할 수 있다.

체성통증은 표재성 통증(피부의 열상, 타박상 등에 의한 통곽 과민, 이질 통증 등) 및 관절, 인대, 근육 또는 근막에 존재하는 침해 수용체 자극에 의해 발생되는 심재성 통증을 포함한다.

연관통은 병소 부위와 멀리 떨어진 체성조직에 나타나는 통증을 의미하고, 내장통은 내장에 분포된 통각 섬유에 의해 느껴지는 통증이며, 심인성 통증은 충분한 신체적인 원인을 찾을 수 없으며 해부학적으로 설명이 불가능한 통증을 의미한다.

본 발명에 따른 통증 완화 및 치료용 약학적 조성물은 통증에 대한 신호전달을 차단하는 진통제가 아니라 통증조절인자를 포함하는 엑소좀을 투여하는 것에 의하여 통증을 근본적으로 치료한다는 점에서 종래 기술들과 차별성이 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 지방유래 줄기세포로부터 유래한 엑소좀의 약학적으로 유효한 양과 함께 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기에서 약학적으로 유효한 양이란 통증을 개선 및 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포로부터 유래한 엑소좀은 상기 약학적 조성물 중에 1×10⁷　particles/mL 내지 1×10¹⁰　particles/㎏의 농도, 바람직하게는 5×10⁷　particles/mL 내지 1×10⁹　particles/㎏의 농도로 포함될 수 있다. 그러나 상기 엑소좀의 농도는 통증의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 통증을 완화 내지 치료할 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다.

상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명의 조성물 또는 약학적 제제는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여 방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 모든 방식에 의해 투여될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사 등에 의해 투여될 수 있다.

구체적으로, 투여 방법은 이에 제한되지는 않으나, 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 정맥 내로 투여(정맥주사; Intravenous injection)하거나, 통증 부위로 투여(국소 투여; Topical administration) 될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 전술한 지방유래 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 통증 완화 및 치료용 약학적 조성물을 포함하는 통증 완화 또는 치료용 주사제를 제공한다.

상기 주사제는 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)를 더 포함할 수 있다. 즉, 상기 주사제는 인산완충식염수에 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 담지하여 사용할 수 있다.

상기 주사제는 인산완충식염수 대신 하이드로젤을 포함할 수도 있다. 상기 하이드로젤은 히알루론산, 젤라틴, 알지네이트, 키토산, 피브린, 엘라스틴, 콜라겐 및 메틸셀룰로오즈로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 히알루론산 하이드로젤일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 줄기세포유래 엑소좀은 세포증식 및 세포거동 과정에서 분비되는 신경세포 재생 및 통증 완화와 관련된 다양한 사이토카인, 유전자, 생체활성인자 및 단백질 등을 함유하고 있기 때문에 통증을 유발시키는 근본적인 원인을 치유할 수 있다. 또한, 세포 유래 지질 전달체이기 때문에 손상되거나 기능부전인 신경세포로의 침투 및 유효인자 전달 효율이 매우 뛰어나므로 통증 치유에 탁월하다. 이에 따라, 본 발명에서 제시하는 엑소좀 조성물은 향후 통증 완화 및 치료뿐 아니라 신경세포 재생과 관련된 무세포 치료제로서의 적용 등 다양한 신경재생 분야로의 적용 또한 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 인간지방유래 줄기세포로부터 생산된 엑소좀의 기본 특성평가에 대한 결과이다. (a)는 엑소좀의 입자수를 측정한 결과, (b)는 엑소좀의 형태를 확인하고자 TEM을 통해 측정한 현미경 사진, (c)는 (b)를 더욱 확대한 사진, (d~f)는 엑소좀 표면에 발현된 표면마커 (CD9/CD63/CD81)이다.
도 2는 인간지방과 인간제대유래 줄기세포로부터 생산된 엑소좀의 통증조절인자(TIMP-1, TIMP-2, IL-1ra, IL-4, IL-10)를 분석한 결과이다.
도 3은 세포모델에서 엑소좀의 통증완화 효능을 평가한 결과이다. IL-1β를 처리에 의해 염증이 유도된 인간연골세포에서 TRPA1, COX-2, MMP1, MMP3 등의 통증 관련 유전자가 과발현되는 것을 확인하였고, 엑소좀 처리에 의해 유전자 발현 정도가 감소하는 것을 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

< 실시예 1> 다중필터시스템을 이용한 인간 지방유래줄기세포로부터 엑소좀 생산

인간 지방유래 줄기세포(human adipose-derived stem cells, ASC)를 계대(passage) 5까지 증식시키는 과정에서 엑소좀을 생산하였다. 즉, 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 엑소좀을 생산하였다. 구체적으로, 인체 지방유래 줄기세포를 (passage 5) 일반 배양배지 (Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 배양하였다. 그 다음, 무혈청, 무항생제 배지이면서 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 유지하였다. 24시간 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 세포배양 상층액은 bottle top (필터규격: 0.22 um) 필터 시스템을 거쳐 세포 debris 등 1차 불순물을 제거하였다. 여과된 배양액은 300 kDa 크기의 필터가 장착된 tangential flow filtration (TFF)를 통해 2차 불순물 제거 및 엑소좀 농축단계를 동시에 진행하였다. 최종 불순물 제거를 위해 TFF를 몇 차례 반복하여 필터링한 다음, 최종 여과액 (10 mL 내외)을 회수하였다.

< 실시예 2> 생산된 엑소좀의 기본 특성 평가

실시예 1로부터 생산된 엑소좀은 나노입자추적분석기(Nanoparticle tracking analysis)와 투과전자현미경(transmission electron microscope)을 사용하여 입자수, 크기, 모양을 확인하였고, 유세포분석기 (flow cytometry)를 이용하여 엑소좀 표면에 발현된 주요 단백질 마커(CD9, CD63, CD81)를 확인하였다(도 1).

< 실시예 3> 엑소좀의 통증조절인자 평가

엑소좀에 함유된 통증조절인자를 확인하기 위해 사이토카인 분석을 실시하였다(도 2). 이때, 비교 대조군으로 인간 제대유래 줄기세포(human umbilical cord mesenchymal stem cells)로부터 생산된 엑소좀(UC-MSC-Exo)을 사용하였다.

실험 결과, 증식된 지방유래 줄기세포로(ASC-Exo)부터 생산된 엑소좀 내부에는 통증 및 염증발생 동안 과발현되는 MMP(matrix metalloproteinase)를 억제시키는 것으로 알려진 TIMP-1 및 TIMP-2의 함량이 월등히 높은 것으로 분석되었으며, 통증조절 사이토카인으로 알려진 IL-1ra, IL-4, IL-10 및 TGF-β1도 많은 양이 함유된 것을 확인하였다(도 2a). 또한, 제대유래 줄기세포 엑소좀(UC-MSC-Exo)에 비해 지방유래 줄기세포 엑소좀 내부에 TIMP-1, IL-1ra, IL-4, IL-10의 함량이 유의하게 높은 것으로 확인되었다(도 2b) (*P < 0.1, **P < 0.01).

< 실시예 4> 엑소좀에 의한 통증완화 효능평가

통증이 유발된 세포모델을 통해 엑소좀의 통증 유전자 발현 억제 효능을 평가하였다. 세포모델은 인간연골세포(Human chondrocytes)에 염증성 사이토카인으로 알려진 IL-1β를 10 ng/mL의 농도로 6-well plate에 첨가하여 통증이 유발된 모델을 준비하였다. 엑소좀은 2 가지 농도(1×10⁸ particles/mL, 5×10⁸ particles/mL)로 처리하여 2일동안 세포 배양한 후 통증과 관련된 특정 유전자(TRPA1, COX-2, MMP-1, MMP-3)의 발현량을 qRT-PCR을 통해 평가하였다(도 3). 대조군인 정상 인간연골세포에서는 통증 관련 유전자가 낮게 발현되었고 IL-1β에 의해 통증이 유발된 모델에서는 모든 유전자가 높게 발현되었다. 2가지 농도의 엑소좀을 처리하고 난 후, 모든 유전자의 발현량이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었고, TRPA1의 경우에는 정상적인 수치까지 도달하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

지방유래 줄기세포(adipose derived stem cells)로부터 유래한 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 통증 완화 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방유래 줄기세포는 인간 지방유래 줄기세포인 것인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 항염증성 사이토카인을 포함하는 것인 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 항염증성 사이토카인은 TIMP-1, TIMP-2, IL-1ra, IL-4 및 IL-10으로부터 1 이상 선택되는 것인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 통증은 염증성 통증 및 신경병성 통증을 포함하는 것인 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 신경병성 통증은 항암치료로 수반되는 통증, 염증성 통증, 근육성 통증 및 말초신경 손상에 의한 통증으로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택되는 것인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방유래 줄기세포는 상기 조성물을 투여하고자 하는 환자의 자가 지방 조직으로부터 유래한 것인 약학적 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 약학적 조성물을 포함하는 통증 완화 및 치료용 주사제.