CN109022360A - 自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，包括：取人脂肪间充质干细胞经过原代分离培养和传代培养后，进行无血清化，获得多代培养的无血清培养液和多代培养的传代干细胞；合并多代培养的传代干细胞，离心收集得到干细胞上清液；并且，合并所述多代培养的无血清培养液，得到合并培养液；将所述合并培养液和所述细胞上清液混合，再与无血清培养液混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。本发明通过自身的脂肪干细胞代替异基因外周血造血干细胞，作为自身造血干细胞的稳定的来源，方法简单，费用低，大大提高了造血干细胞总数，从而满足了临床的需求。

Description

自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，具体地说，涉及一种自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法。
背景技术
干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
外周造血干细胞移植已成为治疗恶性血液病、淋巴瘤和乳腺瘤等实体瘤的有效方法，尤其多用在多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤和乳腺癌等实体瘤的治疗。1990年以来，自体造血干细胞移植的数量已超过异基因移植。1993年以后，自体外周血干细胞移植的数量又超过了自体骨髓移植。1990～1994年，用于淋巴瘤和乳腺癌患者的自体造血干细胞移植增加了5倍，同期外周血干细胞移植的百分比也由15％增至75％，成为造血干细胞的主要来源，异基因PBSCT病例迅速增加。我国自1995年异体PBSCT成功以采，发展也极为迅速。
但是目前最主要的问题是造血干细胞的数目问题。由于外周血造血干细胞在外周血单个核细胞中的比例低，能够采集到的造血干细胞总数十分有限，不能满足临床需求。但异基因外周血造血干细胞移植存在来源不稳定，费用较高等因素。因而。目前的促进自体外周血造血干细胞的增殖的方法有待改进。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供了一种自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，包括如下步骤：
取人脂肪间充质干细胞经过原代分离培养和传代培养后，进行无血清化，获得多代培养的无血清培养液和多代培养的传代干细胞；
合并多代培养的传代干细胞，离心收集得到干细胞上清液；并且，合并所述多代培养的无血清培养液，得到合并培养液；
将所述合并培养液和所述细胞上清液混合，再与无血清培养液混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。
优选地，所述无血清化，包括：
取传代培养的P3-P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长培养液培养至细胞80％融合时，弃去其中所述细胞生长培养液；
用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，加入无血清培养液培养72小时；
收集得到多代培养的无血清培养液和多代培养的传代干细胞
优选地，所述细胞生长培养液为无血清MSCM培养液。
优选地，所述传代培养中所使用的消化液为0.05％胰蛋白酶-0.25％EDTA混合消化液。
优选地，所述消化液的配制方法，包括：
取0.25g胰蛋白酶粉、20mgEDTA粉末和100ml 0.01mol/L的PBS；
用PBS溶解胰蛋白酶粉，然后将EDTA粉末和其余的PBS加入混合后，置于37℃水浴中，待彻底溶解液体呈透明为止；
用G5抽滤，分装置于4℃冰箱中保存即得到所述消化液。
优选地，所述“将所述合并培养液和所述细胞上清液混合，再与无血清培养液混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖”包括：
将所述合并培养液和所述细胞上清液混合后，进行过滤，得到人脂肪间充质干细胞提取物；
将所述人脂肪间充质干细胞提取物与无血清培养液按照预设比例进行混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。
优选地，所述预设比例为1:1。
优选地，所述“将所述合并培养液和所述细胞上清液混合后，进行过滤，得到人脂肪间充质干细胞提取物”包括：
将所述合并培养液和所述细胞上清液混合后，通过0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，得到上清液滤液；
将所述上清液滤液进行除菌处理，得到所述人脂肪间充质干细胞提取物。
优选地，所述“将所述上清液滤液进行除菌处理，得到所述人脂肪间充质干细胞提取物”包括：
将所述上清液滤液通过0.22μm的微孔滤膜过滤，制备得到所述人脂肪间充质干细胞提取物。
本发明提供的一种自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，包括：取人脂肪间充质干细胞经过原代分离培养和传代培养后，进行无血清化，获得多代培养的无血清培养液和多代培养的传代干细胞；合并多代培养的传代干细胞，离心收集得到干细胞上清液；并且，合并所述多代培养的无血清培养液，得到合并培养液；将所述合并培养液和所述细胞上清液混合，再与无血清培养液混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。通过对传代培养的干细胞进行无血清化，分别合并传代干细胞和上清液，并混合得到外周血干细胞培养基进行培养，从而进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。本发明通过自身的脂肪干细胞代替异基因外周血造血干细胞，作为自身造血干细胞的稳定的来源，方法简单，费用低，大大提高了造血干细胞总数，从而满足了临床的需求。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明的权利要求做进一步的详细说明，可以理解的是，以下仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
本发明提供了一种自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，包括如下步骤：
一种自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，包括如下步骤：
取人脂肪间充质干细胞经过原代分离培养和传代培养后，进行无血清化，获得多代培养的无血清培养液和多代培养的传代干细胞；
合并多代培养的传代干细胞，离心收集得到干细胞上清液；并且，合并所述多代培养的无血清培养液，得到合并培养液；
将所述合并培养液和所述细胞上清液混合，再与无血清培养液混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。
上述，脂肪间质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)是来源于脂肪组织的干细胞，与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。脂肪间质干细胞在组织工程和细胞治疗方面具有广泛的应用前景，吸引了越来越多研究者的关注。脂肪间质干细胞系列产品取自健康成人(18至45岁)抽脂手术所得脂肪组织和合格的实验动物腹股沟处脂肪组织，经传代扩增冻存。检测结果表明，本产品无细菌、真菌、霉菌、支原体和病毒污染，表达多种脂肪间质干细胞的特异性标记，具有良好的增殖和分化潜能。
上述，无血清培养基一般是由基础培养基和替代血清的补充因子组成的。无血清培养技术是细胞培养研究中的一个里程碑。由于无血清培养基全部是由已知成分组成的，不仅为研究和阂明细胞生长、增殖和分化的机制这一生命科学中的根本间题提供了有力的工具，而且为现代生物技术如基因工程、蛋白质工程、细胞工程和单克隆抗体等的应用奠定了基础。
上述，多待培养的传代干细胞具体为，P3-P30代的人脂肪间充质干细胞。
上述，外周血干细胞是存在于外周血中的干细胞。正常情况下，外周血中的干/祖细胞的含量占单个核细胞的0.01％—0.1％相当于骨髓的1％—10％，动员后外周血MNC中CD34+细胞数及CFU—删数均明显高于骨髓。迄今已发现多聚阴离子化合物(如硫酸葡聚糖)、糖皮质激素、细菌内毒素、抗肿瘤药物、四氢叶酸以及造血生长因子等均能有效地动员骨髓和其它部位的造血干/祖细胞进入外周血。
上述，合并多代培养的传代干细胞，具体的，可以为收集得到P4代的无血清培养液，然后将P3～P30代人脂肪间充质干细胞分别得到的无血清培养液收集合并后，即得。
上述，离心的条件，优选为17000g，30分钟。
本发明通过对传代培养的干细胞进行无血清化，分别合并传代干细胞和上清液，并混合得到外周血干细胞培养基进行培养，从而进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。本发明通过自身的脂肪干细胞代替异基因外周血造血干细胞，作为自身造血干细胞的稳定的来源，方法简单，费用低，大大提高了造血干细胞总数，从而满足了临床的需求。
优选地，所述无血清化，包括：
取传代培养的P3-P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长培养液培养至细胞80％融合时，弃去其中所述细胞生长培养液；
用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，加入无血清培养液培养72小时；
收集得到多代培养的无血清培养液和多代培养的传代干细胞。
上述，磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，简称PBS)的是用于生物学研究的一个缓冲溶液。生物学上常用的PBS是中性磷酸盐缓冲溶液。它是一种水基盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，以及(在某些配方)氯化钾和磷酸钾。缓冲液有助于保持恒定的pH值。溶液的渗透压和离子浓度通常与人体pH相近(等渗)。
优选地，所述细胞生长培养液为无血清MSCM培养液。
优选地，所述传代培养中所使用的消化液为0.05％胰蛋白酶-0.25％EDTA混合消化液。
EDTA，即为乙二胺四乙酸是一种有机化合物，其化学式为C10H16N2O8，常温常压下为白色粉末。它是一种能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二价金属离子结合的螯合剂。由于多数核酸酶类和有些蛋白酶类的作用需要Mg2+，故常用做核酸酶、蛋白酶的抑制剂；也可用于去除重金属离子对酶的抑制作用。
优选地，所述消化液的配制方法，包括：
取0.25g胰蛋白酶粉、20mgEDTA粉末和100ml 0.01mol/L的PBS；
用PBS溶解胰蛋白酶粉，然后将EDTA粉末和其余的PBS加入混合后，置于37℃水浴中，待彻底溶解液体呈透明为止；
用G5抽滤，分装置于4℃冰箱中保存即得到所述消化液。
优选地，所述“将所述合并培养液和所述细胞上清液混合，再与无血清培养液混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖”包括：
将所述合并培养液和所述细胞上清液混合后，进行过滤，得到人脂肪间充质干细胞提取物；
将所述人脂肪间充质干细胞提取物与无血清培养液按照预设比例进行混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。
优选地，所述预设比例为1:1。
此外，也可以为其他比例，例如，2:1。本发明中所述预设比例为经过多次试验验证的结果，实验证明，预设比例为1:1时，实验最终得到的造血干细胞的增殖数最优。
优选地，所述“将所述合并培养液和所述细胞上清液混合后，进行过滤，得到人脂肪间充质干细胞提取物”包括：
将所述合并培养液和所述细胞上清液混合后，通过0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，得到上清液滤液；
将所述上清液滤液进行除菌处理，得到所述人脂肪间充质干细胞提取物。
优选地，所述“将所述上清液滤液进行除菌处理，得到所述人脂肪间充质干细胞提取物”包括：
将所述上清液滤液通过0.22μm的微孔滤膜过滤，制备得到所述人脂肪间充质干细胞提取物。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
申请人声明，本发明通过上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程。并且即不意味着本发明应依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，其特征在于，包括：
取人脂肪间充质干细胞经过原代分离培养和传代培养后，进行无血清化，获得多代培养的无血清培养液和多代培养的传代干细胞；
合并多代培养的传代干细胞，离心收集得到干细胞上清液；并且，合并所述多代培养的无血清培养液，得到合并培养液；
将所述合并培养液和所述细胞上清液混合，再与无血清培养液混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。
2.如权利要求1所述自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，其特征在于，所述无血清化，包括：
取传代培养的P3-P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长培养液培养至细胞80％融合时，弃去其中所述细胞生长培养液；
用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，加入无血清培养液培养72小时；
收集得到多代培养的无血清培养液和多代培养的传代干细胞。
3.如权利要求2所述自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，其特征在于，所述细胞生长培养液为无血清MSCM培养液。
4.如权利要求1所述自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，其特征在于，所述传代培养中所使用的消化液为0.05％胰蛋白酶-0.25％EDTA混合消化液。
5.如权利要求4所述自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，所述消化液的配制方法，包括：
取0.25g胰蛋白酶粉、20mgEDTA粉末和100ml 0.01mol/L的PBS；
用PBS溶解胰蛋白酶粉，然后将EDTA粉末和其余的PBS加入混合后，置于37℃水浴中，待彻底溶解液体呈透明为止；
用G5抽滤，分装置于4℃冰箱中保存即得到所述消化液。
6.如权利要求1所述自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，所述“将所述合并培养液和所述细胞上清液混合，再与无血清培养液混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖”包括：
将所述合并培养液和所述细胞上清液混合后，进行过滤，得到人脂肪间充质干细胞提取物；
将所述人脂肪间充质干细胞提取物与无血清培养液按照预设比例进行混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。
7.如权利要求6所述自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，所述预设比例为1:1。
8.如权利要求6所述自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，所述“将所述合并培养液和所述细胞上清液混合后，进行过滤，得到人脂肪间充质干细胞提取物”包括：
将所述合并培养液和所述细胞上清液混合后，通过0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，得到上清液滤液；
将所述上清液滤液进行除菌处理，得到所述人脂肪间充质干细胞提取物。
9.如权利要求8所述自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，所述“将所述上清液滤液进行除菌处理，得到所述人脂肪间充质干细胞提取物”包括：
将所述上清液滤液通过0.22μm的微孔滤膜过滤，制备得到所述人脂肪间充质干细胞提取物。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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Application publication date: 20181218

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