KR20180037056A

KR20180037056A - 치료학적 단백질 제형의 제조 방법 및 이러한 방법에 의해 생산된 항체 제형

Info

Publication number: KR20180037056A
Application number: KR1020187007855A
Authority: KR
Inventors: 쥬디 케이 글린; 브라이언 신 첸; 다니엘 패트릭 라카시
Original assignee: 화이자 인코포레이티드
Priority date: 2015-09-22
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2018-04-10
Also published as: CA2999118C; IL258311B; US20230134160A1; RU2018110145A; MX2018003298A; RU2018110145A3; JP2017095440A; JP6925111B2; KR20200035496A; HK1255006A1; AU2016329034A1; EP3352790A1; CN108025072A; AU2016329034B2; WO2017051273A1; IL258311A; CA2999118A1

Abstract

본 발명은 치료학적 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계; 용액중의 단백질을 제1 한외여과 단계에 의해 농축시키는 단계; 1종 이상의 제1 부형제를 포함하는 투석여과 완충액에 의해 투석여과하여, 단백질 및 제1 부형제를 포함하는 투석유물을 수득하는 단계; 투석유물중의 단백질을 제2 한외여과 단계에 의해 추가로 농축시키는 단계; 및 1종 이상의 최종 부형제를 첨가하여, 원하는 단백질 농도를 갖는 단백질 제형을 수득하는 단계를 포함하는, 치료학적 단백질을 포함하는 단백질 제형의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라서, 방법은, 제2 한외여과 단계 이전에, 제2 부형제를 투석여과 단계로부터 수득된 투석유물에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 전술된 방법에 의해 생산된 항체 제형에 관한 것이다.

Description

치료학적 단백질 제형의 제조 방법 및 이러한 방법에 의해 생산된 항체 제형

본 발명은 부형제 및 1종 이상의 치료학적 단백질을 포함하는 단백질 제형의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 치료학적으로 사용하고자 하는 항체 제형의 분야에서 특별히 흥미롭고, 또한 이러한 방법에 의해 생산된 항체 제형에 관한 것이다.

본 발명은 보다 특별히:

● 상기 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;

● 용액중의 단백질을 제 1 한외여과 단계에 의해 농축시키는 단계;

● 이와 같이 수득된 용액을 1종 이상의 제1 부형제를 포함하는 투석여과(diafiltration) 완충액에 의해 투석여과하여, 단백질 및 제1 부형제를 포함하는 투석유물(retentate)을 수득하는 단계;

● 투석유물중의 단백질을 한외여과 장비에서 제2 한외여과 단계에 의해 추가로 농축시키는 단계; 및

● 1종 이상의 최종 부형제를 첨가하여, 원하는 단백질 농도를 갖고 상기 제1 및 최종 부형제를 포함하는 단백질 제형을 수득하는 단계를 순차적으로 포함하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 치료학적 항체를 위한 최종 단백질 제형은 1종 이상의 아미노산, 예컨대 히스티딘(이는 투석여과 단계 동안 첨가됨), 및 안정화제로서 작용하는 당, 예컨대 트레할로스를 포함한다. 트레할로스는 흔히 최종 첨가 단계에서 다른 부형제와 함께 첨가된다.

치료학적 항체에 적용되는 종래의 방법에서, 상기 단계는, 대체적으로 마지막 정제 단계로서 바이러스 보유 여과를 포함하는 다수의 정제 단계에 의해 일단 정제된다면, 단백질 용액에 의해 수행된다. 단백질 용액(또는 "생성물")은 제1 한외여과 단계에 의해 약 5 내지 20 g/ℓ의 농도에서 약 40 내지 100 g/ℓ의 농도(단백질에 따라 달라짐)로 농축된다. 이어서 농축된 생성물은 투석여과 완충액, 예컨대 히스티딘에서 투석여과된다. 몇몇 경우에, 투석여과 완충액은 또 다른 표준 완충액, 예컨대 아세테이트, 트리스 또는 포스페이트일 수 있다. 투석여과 완충액은 최종 단백질 제형 뿐만 아니라, 도넌 효과(Donnan effect)로 인해 요구되는 임의의 잔류 편차(offset)에 기초하여 선택된다. 도넌 효과는 생성물이 농축되어 특정한 하전된 완충액 종, 예를 들어 히스티딘을 배제할 경우 일어난다. 따라서 투석여과 완충액은 단백질 제형에 대해 특정화된 것에 비해 더 높은 완충액 농도 및 더 낮은 pH로 조정된다. 일단 투석여과가 완료되면, 최종 단백질 제형을 위한 원하는 단백질 농도의 약 50%를 초과하는 농도를 위해 생성물은 제2 한외여과 단계를 통과한다. 이어서, 생성물은 한외여과 시스템으로부터 제거되고 시스템은 추가적인 생성물을 회수하기 위해 세정된다. 단백질 제형에서 원하는 농도를 50% 이상 초과하는 최종 농도를 갖고, 모든 세정액은 생성물에 다시 첨가되어 생성물을 과도하게 희석시키지 않으면서 회수를 최대화할 수 있다. 이어서 부형제(당, 계면활성제, 킬레이터 등)는 농축된 용액으로서, 대체적으로 약 4의 희석 비로 첨가되고, 이는 농축된 부형제 용액의 1 단위 부피가 생성물의 3 단위 부피에 첨가됨을 의미한다. 4의 희석 비는 부형제 용액의 당 성분의 최대 용해도에 기초하고, 이는 대체적으로 제한 인자이다. 필요하다면, 생성물은 원하는 최종 농도로 조정하기 위해 제형 완충액에 의해 추가로 희석된다.

따라서 이러한 종래의 방법은, 최종 제형에서 고도로 농축된 단백질을 수득하고자 하는 경우, 및 더욱이 단백질이 특별히 높은 점도를 갖는 경우 적용불가능할 수 있다.

예를 들어, 150 g/ℓ의 원하는 최종 농도를 갖는 치료학적 항체 제형의 경우에, 분자의 점도는 원하는 최종 농도의 50% 이상의 목표치로 농축하는 것을 불가능하게 한다.

본 발명의 목표는 높은 점도를 갖고 고도로 농축된 단백질에 적용될 수 있는 단백질 제형의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목표는, 제조 공정의 전체 수율에 부정적인 영향을 주지 않고 특정 부형제의 과도한 소비로 인해 가외의 비용을 일으키지 않으면서 제작 규모로 상기 방법을 실행하는 것이다. 특별히, 이는 종래의 방법과 유사한 수준에서 특별히 저렴한 당 성분의 사용을 유지하는 것을 목표로 한다.

방법의 모든 단계에 걸쳐 단백질의 안정성을 보존하고 단백질이 응집되지 않도록 보호하는 것이 또한 추가의 목표이다.

본 발명의 제1 양태에 따라서, 제2 한외여과 단계 이전에, 투석여과 단계로부터 수득된 투석유물에 제2 부형제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 상기 유형의 방법을 제공한다.

제2 부형제, 특별히 트레할로스(또는 더욱 일반적으로는 당)의 첨가를 투석여과 후로 옮김으로써, 나머지 부형제는 훨씬 더 높은 농도로 후속 단계에 첨가될 수 있고, 이에 따라 생성물이 덜 희석된다. 결국 이는, 종래의 방법의 경우인 약 50%의 값과 비교하여, 필요한 최대 농도가 원하는 최종 농도의 단지 약 10%(몇몇 경우 5 내지 15%) 이상으로 될 수 있음을 의미한다. 이러한 10% 값은 표준 한외여과 장비에 의해, 심지어 더 높은 분자 점도를 갖고 수득될 수 있다. 이는 또한 세정액으로부터 생성물의 회수를 허용하고, 이에 따라 한외여과/투석여과 공정의 90% 수율을 수득할 수 있도록 한다.

또한, 제2 부형제(당)를 최종 농축 이전에 첨가함은 단백질이 응집되지 못하도록 보호한다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 따라서:

- 방법은, 단계 (e) 이후 및 단계 (f) 이전에, 한외여과 장비를 세정 완충액으로 세정하는 단계를 추가로 포함하여, 단백질의 회수를 향상시키고;

- 세정 완충액은 단백질 제형중의 제1 및 제2 부형제의 농도 각각에 실질적으로 동일한 농도로 제1 및 제2 부형제를 포함하며;

- 제1 부형제는 아미노산, 바람직하게는 히스티딘이고;

- 단백질 제형중 제1 부형제는 16 내지 24 mM, 바람직하게는 17 내지 23 mM, 가장 바람직하게는 약 20 mM의 농도를 가지며;

- 제2 부형제는 당, 바람직하게는 이당류이고;

- 최종 부형제는 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트 80을 포함하며;

- 최종 부형제는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 포함하고;

- 단백질 제형은 110 내지 165 g/ℓ의 단백질 농도를 가지며;

- 단백질은 항체이다.

첫 번째 바람직한 실시태양에서:

- 항체는 항-PCSK9[전구단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 타입 9(Proprotein Convertase Subtilisin Kexin type 9)] 항체이고;

- 항-PCSK9 항체는 보코시추맙(bococizumab), 에볼로쿠맙(evolocumab)[레파타(REPATHA: 상표명)], 알리로쿠맙(alirocumab)[프랄루언트(PRALUENT: 상표명)], REGN728, 31H4, 11F1, 12H11, 8A1, 8A3, 3C4, 300N, 1D05, LGT209, RG7652, 및 LY3015014로 구성된 군에서 선택되며;

- 항-PCSK9 항체는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변성 영역(VH); 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변성 영역(VL)을 포함하거나; 다르게는 항-PCSK9 항체는 서열번호 3, 4 또는 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열번호 6 또는 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하고;

- 단백질 제형은 135 및 165 g/ℓ, 바람직하게는 142 내지 158 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 150 g/ℓ의 단백질 농도를 가지며;

- 단백질 제형중 제2 부형제는 67.2 내지 100.8 g/ℓ, 바람직하게는 71.4 내지 96.6 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 84 g/ℓ의 농도의 트레할로스이고;

- 최종 부형제는, 단백질 제형중에서 0.16 내지 0.24 g/ℓ, 바람직하게는 0.17 내지 0.23 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 0.2 g/ℓ의 농도를 갖는 폴리소르베이트 80을 포함하며;

- 최종 부형제는, 단백질 제형중에서 0.04 내지 0.06 g/ℓ, 바람직하게는 0.0425 내지 0.0575 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 0.05 g/ℓ의 농도를 갖는 EDTA를 포함하고;

- 단백질 제형은 5.2 내지 5.8, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 가지며;

- 단계 (a)에서 제공된 용액은 5 내지 20 g/ℓ의 단백질 농도를 갖고;

- 단백질은 제1 한외여과 단계에 의해 80 내지 120 g/ℓ, 바람직하게는 90 내지 110 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 100 g/ℓ로 농축되며;

- 단백질은 제2 한외여과 단계에 의해 143 내지 173 g/ℓ, 바람직하게는 150 내지 166 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 158 g/ℓ로 농축되고;

- 투석여과 완충액중 제1 부형제는 단백질 제형중 제1 부형제의 농도에 비해 더 높은 농도를 갖고, 투석여과 완충액중 제1 부형제의 상기 농도는 바람직하게는 29.75 내지 40.25 mM, 가장 바람직하게는 약 35 mM이며;

- 투석여과 완충액은 5.1 내지 5.5, 바람직하게는 약 5.3의 pH를 갖고;

- 투석여과 단계로부터 수득된 투석유물에 제2 부형제를 첨가하는 단계는 제1 첨가제 용액을 투석유물에 첨가함으로써 달성되고, 상기 제1 첨가제 용액은 제2 부형제를 340 내지 460 g/ℓ, 바람직하게는 380 내지 420 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 400 g/ℓ의 농도로 포함하며;

- 제1 첨가제 용액은 투석여과 완충액중 제1 부형제의 농도에 비해 더 낮고 단백질 제형중 제1 부형제의 농도에 비해 더 높은 농도로 제1 부형제를 포함하고, 제1 첨가제 용액중 제1 부형제의 상기 농도는 바람직하게는 25.5 내지 34.5 mM, 가장 바람직하게는 약 30 mM이고;

- 제1 첨가제 용액은 추가로 최종 부형제를 포함하며;

- 제1 첨가제 용액은 약 30 mM의 히스티딘 및 약 400 g/ℓ의 트레할로스를 포함하고;

- 제1 첨가제 용액을 투석유물에 첨가하는 단계는, 제1 첨가제 용액의 1 부피가 투석유물의 동일한 부피의 약 3.15 배에 첨가되는 약 4.15의 희석 비로 수행되고;

- 최종 부형제를 첨가하는 단계는 제2 첨가제 용액을 제2 한외여과 단계로부터 수득된 용액에 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 제2 첨가제 용액은 제1 첨가제 용액중 제2 부형제의 농도에 비해 더 낮고 단백질 제형중 제2 부형제의 농도에 비해 더 높은 농도로 제2 부형제를 포함하고;

- 제2 첨가제 용액은 단백질 제형중 제1 부형제의 농도와 실질적으로 동일한 농도로 제1 부형제를 포함하며;

- 제2 첨가제 용액은 약 20 mM의 히스티딘, 약 84 g/ℓ의 트레할로스, 약 1 g/ℓ의 EDTA 및 약 4 g/ℓ의 폴리소르베이트 80을 포함하고;

- 제2 첨가제 용액을 첨가하는 단계는, 제2 첨가제 용액의 1 부피가 제2 한외여과 단계로부터 수득된 용액의 동일한 부피의 약 19 배에 첨가되는 약 20의 희석 비로 수행된다.

두 번째 바람직한 실시태양에서:

- 항체는 항-IL7R 항체이고;

- 바람직하게는, 항-IL-7R 항체는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(이러한 CDR의 서열의 예는 각각 서열번호 17, 18 및 19임)을 포함하는 중쇄 가변성 영역(VH); 및 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3(이러한 CDR의 서열의 예는 각각 서열번호 20, 21 및 22임)을 포함하는 경쇄 가변성 영역(VL)을 포함하며;

- 더욱 바람직하게는, 항-IL-7R 항체의 VH 영역은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 항-IL-7R 항체의 VL 영역은 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;

- 더 더욱 바람직하게는, 항-IL-7R 항체의 중쇄는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 항 IL-17 항체의 경쇄는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하며;

- 단백질 제형은 110 내지 130 g/ℓ, 바람직하게는 약 120 g/ℓ의 단백질 농도를 갖고;

- 단백질 제형중 제2 부형제는 42 내지 58 g/ℓ, 바람직하게는 약 50 g/ℓ의 농도에서의 수크로스이며;

- 최종 부형제는, 단백질 제형에서 0.017 내지 0.023 g/ℓ, 바람직하게는 약 0.02 g/ℓ의 농도를 갖는 폴리소르베이트 80을 포함하고;

- 최종 부형제는, 단백질 제형에서 0.42 내지 0.58 g/ℓ, 바람직하게는 약 0.5 g/ℓ의 농도를 갖는 EDTA를 포함하며;

- 최종 부형제는, 단백질 제형에서 85 내지 115 mM, 바람직하게는 약 100 mM의 농도를 갖는 아르기닌을 포함하고;

- 단백질 제형은 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 약 7.0의 pH를 가지며;

- 단계 (a)에 제공된 용액은 2.6 내지 3.4 g/ℓ, 바람직하게는 약 3 g/ℓ의 단백질 농도를 갖고;

- 단백질은 제1 한외여과 단계에 의해 36 내지 54 g/ℓ, 바람직하게는 40 내지 50 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 45 g/ℓ로 농축되며;

- 단백질은 제2 한외여과 단계에 의해 170 및 210 g/ℓ, 바람직하게는 약 190 g/ℓ로 농축되고;

- 투석여과 완충액중 제1 부형제는 단백질 제형중 제1 부형제의 농도에 비해 더 높은 농도를 갖고, 투석여과 완충액중 제1 부형제의 상기 농도는 바람직하게는 19 내지 25 mM, 가장 바람직하게는 약 22 mM이며;

- 투석여과 완충액은 아르기닌을 95 내지 125 mM, 바람직하게는 약 110 mM의 농도로 포함하고;

- 투석여과 완충액은 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 약 7.0의 pH를 가지며;

- 투석여과 단계로부터 수득된 투석유물에 제2 부형제를 첨가하는 단계는 제1 첨가제 용액을 투석유물에 첨가함으로써 달성되고, 상기 제1 첨가제 용액은 제2 부형제를 230 내지 320 g/ℓ, 바람직하게는 약 275 g/ℓ의 농도로 포함하고;

- 제1 첨가제 용액은 투석여과 완충액중 제1 부형제의 농도와 실질적으로 동일하고 단백질 제형중 제1 부형제의 농도에 비해 더 높은 농도로 제1 부형제를 포함하고, 제1 첨가제 용액중 제1 부형제의 상기 농도는 바람직하게는 19 내지 25 mM, 가장 바람직하게는 약 22 mM이며;

- 제1 첨가제 용액은 최종 부형제를 추가로 포함하고;

- 제1 첨가제 용액은 약 22 mM의 히스티딘, 110 mM의 아르기닌 및 약 275 g/ℓ의 수크로스를 약 7.0의 pH에서 포함하며;

- 제1 첨가제 용액을 투석유물에 첨가하는 단계는, 제1 첨가제 용액의 1 부피가 투석유물의 동일한 부피의 약 4 배에 첨가되는 약 5의 희석 비로 수행되고;

- 최종 부형제를 첨가하는 단계는 제2 한외여과 단계로부터 수득된 용액에 제2 첨가제 용액을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 제2 첨가제 용액은 EDTA 및 폴리소르베이트 80을 포함하며;

- 제2 첨가제 용액을 첨가하는 단계는, 제2 첨가제 용액의 1 부피가 제2 한외여과 단계로부터 수득된 용액의 동일한 부피의 약 4 배에 첨가되는 약 20의 희석 비로 수행된다.

본 발명의 두 번째 양태에 따라서, 전술된 방법에 의해 생산된 항체 제형이 제공된다.

하나의 바람직한 실시태양에서, 단백질 제형은:

● 135 내지 165 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 150 ㎎/㎖의 항-PCSK9 항체, 및

● 16 내지 24 mM, 바람직하게는 약 20 mM의 히스티딘 완충액을 포함한다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 단백질 제형은:

● 67.2 내지 100.8 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 84 ㎎/㎖의 트레할로스를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 단백질 제형은:

● 0.16 내지 0.24 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 0.2 ㎎/㎖의 폴리소르베이트를 포함한다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 단백질 제형은:

● 135 내지 165 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 150 ㎎/㎖의 항-PCSK9 항체,

● 16 내지 24 mM, 바람직하게는 약 20 mM의 히스티딘 완충액, 및

또 다른 바람직한 실시태양에서, 단백질 제형은:

● 67.2 내지 100.8 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 84 ㎎/㎖의 트레할로스, 및

여전히 바람직한 실시태양에서, 단백질 제형은:

● 16 내지 24 mM, 바람직하게는 약 20 mM의 히스티딘 완충액,

몇몇 실시태양에서, 항체 제형은 5.2 내지 5.8, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 단백질 제형은:

● 110 내지 130 g/ℓ, 바람직하게는 약 120 g/ℓ의 항-IL-7R 항체;

● 17 내지 23 mM, 바람직하게는 약 20 mM의 히스티딘;

● 42 내지 58 g/ℓ, 바람직하게는 약 50 g/ℓ의 수크로스; 및

● 0.017 내지 0.023 g/ℓ, 바람직하게는 약 0.02 g/ℓ의 폴리소르베이트를 포함하고, 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 약 7.0의 pH를 갖는다.

전술된 서열번호 1 내지 12는 하기 표에 기재된다:

전술된 서열번호 13 내지 16은 하기 표에 기재된다:

도 1은 히스티딘 및 히스티딘/트레할로스중의 상이한 단백질 농도에서의 점도를 도시한다.
도 2는 히스티딘중의 상이한 단백질 농도에서의 밀도를 도시한다.
도 3은 히스티딘/트레할로스중의 상이한 단백질 농도에서의 밀도를 도시한다.
도 4는 실험실 규모 C-스크린 공정 플럭스를 도시한다.
도 5는 실험실 규모 C-스크린 공정에서 최종 농축 동안의 공급 유량 및 공급 채널 압력 강하를 도시한다.

하기 정의는 본 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 사용될 것이다.

- 용어 "단백질 제형"은 흥미로운 단백질 및 부형제를 포함하는 최종 생성물을 표기한다. 치료학적 용도를 위한 단백질을 언급하는 경우, 용어 "약물 물질(Drug Substance)"은 "단백질 제형" 대신에 사용될 수 있고, 흥미로운 단백질은 용어 "활성 구성성분" 또는 "생성물"로 표기될 수 있다. "부형제"는 "단백질" 또는 "활성 구성성분"이 아닌 "단백질 제형"의 모든 구성요소로 정의된다. 부형제는 전형적으로 단백질 안정화제, 계면활성제, 아미노산, 예를 들어 단백질 안정화에 기여하는 아미노산 등을 포함한다;

- 투석여과 단계와 관련하여, 용어 "투석유물"은 막의 투석유물 측에 보유되고 막을 통과하기에는 너무 큰 분자, 예컨대 흥미로운 단백질을 함유하는 용액을 지칭한다. 투석유물은 한외여과/투석여과 시스템의 후속 파트로 전달되는 용액이다. 시스템의 투석여과 파트에서 막의 다른 측(투과물 측) 상에서 순환되는 나머지 용액은 "투석여과 완충액"(또는 "기본 완충액")으로서 지칭된다;

- 용어 "농축된 푸울(pool)"은 최종 한외여과 단계로부터 직접적으로 수득된 용액을 표기한다;

- 용어 "최종 부형제"는 최종 한외여과 단계 이후, 즉 최종 농축 단계 이후에 "농축된 푸울"에 첨가되는 부형제를 표기한다;

- 용어 "nx 스파이크(spike)"(n은 수치 값임)는, 특정 부피의 단백질-함유 용액에 n과 동일한 희석 비로 첨가되는 부형제의 용액을 표기하고, 이는 부형제 용액 1 부피가 단백질-함유 용액의 동일한 부피의 n-1 배에 첨가됨을 의미한다. 예를 들어 4x 스파이크는 단백질-함유 용액의 3 부피에 대해 스파이크 1 부피의 비에 따라 첨가되는 용액이다;

- 달리 언급되지 않는다면, 수치 값과 연관된 용어 "대략", "약" 또는 "실질적으로"는 그 값의 ± 5% 범위내임을 의미한다;

- "점도"는 본원에 사용될 경우, "절대 점도(absolute viscocity)" 또는 "동적 점도(kinematic viscosity)"일 수 있다. 때때로 동점도(dynamic viscosity) 또는 단순 점도(simple viscosity)로 지칭되는 "절대 점도"는 유동하는 유체의 저항성을 설명하는 양이다. "동적 점도"은 절대 점도를 유체 밀도로 나눈 값이다. 동적 점도는 모세관 점도계를 사용하여 유체의 저항성 유동을 특징지을 경우 종종 기록된다. 동일한 부피의 2가지 유체를 동일한 모세관 점도계에 놓고 중력에 의해 유동시킬 경우, 점성이 높은 유체는 점성이 더 낮은 유체에 비해 모세관을 통해 유동하는데 걸리는 시간이 더 길다. 한가지 유체가 그의 유동을 완료하는데 200 초가 걸리고 또 다른 유체가 400 초가 걸린다면, 두 번째 유체는 동적 점도 스케일(scale) 상에서 첫 번째 유체에 비해 2 배 점성이 높다. 유체 둘 다 동일한 밀도를 갖는다면, 두 번째 유체는 절대 점도 스케일 상에서 첫 번째 유체에 비해 2 배 점성이 높다. 동적 점도의 치수는 L²/T이고, 여기서 L은 길이를 나타내고, T는 시간을 나타낸다. 동적 점도의 SI 단위는 ㎡/s이다. 흔히, 동적 점도는 센티스트로크(centistokes), cSt로 표시되고, 이는 ㎟/s에 해당한다. 절대 점도의 치수는 M/L/T이고, 여기서 M은 질량을 나타내고, L 및 T는 각각 길이 및 시간을 나타낸다. 절대 점도의 SI 단위는 Pa·s이고, 이는 kg/m/s에 해당한다. 절대 점도는 흔히 센티포아즈(centiPoise) 단위, cP로 표시되고, 이는 밀리파스칼(milliPascal)-초, mPa-s에 해당한다. 본 발명과 관련하여, 항체는 그의 점도가 적어도 20 cP인 경우 고 점도로 여겨진다.

간결성을 위해, 두문자어 "UF", "DF" 및 "UF/DF"(또는 "UFDF")가 상세한 설명을 통해 사용될 수 있고 다음과 같이 이해되어야 한다: "UF"는 "한외여과를 의미하고, "DF"는 "투석여과"를 의미하며, "UF/DF"(또는 "UFDF")는 "한외여과/투석여과"를 의미한다. 단백질 제형의 제조 방법으로서 정의되는 본 발명의 방법은 UFDF 방법으로서 지칭될 수 있다.

이제 본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시될 것이고, 각각은 특정한 치료학적 단일클론 항체 및 이러한 단일클론 항체의 특정한 제형에 관한 것이다. 실시예는 단지 예시할 목적으로 제공되고 본 발명의 범주를 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다.

A - 실시예 1

예시적인 실시예 1에서, 흥미로운 단백질은 보코시추맙, 즉 PCSK9(전구단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 타입 9)에 특이적으로 결합하는 PCSK9-표적화 단일클론 항체, 예를 들어 서열번호 12 또는 유니프로트 수탁 번호(Uniprot Accession Number) Q8NBP7이다. 본 방법은 약물 물질중 150 g/ℓ의 생성물 목표 농도를 달성하도록 고안되었고, 이러한 약물 물질은 하기 부형제를 pH 5.5에서 포함한다:

- 20 mM 농도의 히스티딘,

- 84 g/ℓ의 농도의 트레할로스, 및

- 0.2 g/ℓ의 농도의 PS80(폴리소르베이트 80).

단백질 농도에서 ± 8 g/ℓ의 허용 오차, 부형제 농도에서 ± 15%의 허용 오차, 및 pH 값에서 ± 0.2의 허용 오차를 갖고 상기 요건들이 달성되어야 허용가능한 것으로 여겨진다.

수율에 있어서, 본 방법은 90% 이상의 생성물 회수를 달성할 필요가 있다.

바람직한 작동 방식을 정의하고 본 발명의 방법이 상기 요건을 달성하기에 적합함(종래 방법은 그렇지 않음)을 확고히 하기 위해 실험들이 실행되었다. 이들중 몇몇 실험은 하기 상세한 설명에 제시된다.

A.1 재료

실험을 위해 사용되는 출발 물질은 맙셀렉트(MabSelect: 등록상표) 칼럼을 통해 처리되어 사용 이전에 부형제 성분들이 제거된 완전히 정제된 보코시추맙 용액이었다. 맙셀렉트(등록상표) 정제 이후, 용출물을 아세트산에 의해 pH 5.0으로 조정하여, 17.09 g/ℓ의 생성물 농도를 산출하였다.

한외여과/투석여과 장치

펠리콘(Pellicon: 등록상표) 3(30 KDa, C-스크린, 88 ㎠) 재생 셀룰로스 막 또는 사르토콘(Sartocon: 등록상표)(30 KDa E-채널 200 ㎠) 재생 셀룰로스 막이 구비된 GE 크로스플로우(Crossflow: 등록상표) 시스템(300 ㎖ 저장소)을 사용하여 모든 실험을 수행하였고, 막간차압(TMP: TransMembrane Pressure)을 55 psi 미만의 공급 압력에 의해 약 14 내지 22 psi로 유지시켰다. 달리 지정되지 않는다면, 적어도 15 분 동안 세정 완충액을 재순환시킴으로써 모든 세정을 발생시키고, 이후 시스템의 최소 작업량으로 농축시켰다.

A.2 실험 고안 및 결과

트레할로스 용해도의 결정

초기 실험을 완료하여 30 mM 히스티딘 pH 5.35 용액중 트레할로스 용해도의 한계를 평가하였다(단백질 농도가 증가할 경우 히스티딘의 배제를 설명하기 위해 최종 세부기준으로부터 히스티딘 농도 및 pH를 조정한다). 150 g/ℓ의 최종 약물 물질 목표를 수득하기 위해, 농축된 푸울의 최소 농도는 6x 트레할로스/EDTA/PS80 스파이크에 의해 180 g/ℓ, 또는 5x 트레할로스/EDTA/PS80 스파이크에 의해 187.5 g/ℓ일 필요가 있었다. 6x 스파이크를 제공하기 위해 필요한 트레할로스 농도(약 500 g/ℓ)에서, 트레할로스는 연장된 교반 이후 실온(22℃)에서 용해되지 않았고(미립자가 여전히 존재함), 용해시키기 위해 30℃로 가열해야 했다. 용액을 0.22 ㎛의 펄 아크로디스크(Pall Acrodisc: 등록상표) 주사기 필터를 통해 15 psi 압력하에 실온에서 재침전없이 여과시켰다.

그러나, 이러한 제작 방법은 규모를 확대하기에 어려울 수 있고, 따라서 트레할로스 스파이크의 경우 최대 실행 농도는 5x(약 420 g/ℓ의 트레할로스)로 한정될 수 있다.

따라서, 하나의 바람직한 공정에서, 스파이크 용액의 트레할로스 농도는 약 400 g/ℓ일 수 있다.

공정 개발

첫 번째 실험은 상이한 단백질 농도(76.6 내지 114 g/ℓ)에서 투석여과된 용액중 히스티딘 농도를 체크하기 위해 투석여과 용액에서 요구되는 히스티딘 농도를 시험하고, 밀도 측정을 위해 물질을 생성하도록 고안되었다. 345 g/㎡의 적재 용량에서 200 ㎠ 사르토콘(등록상표) E-채널 막을 사용하여 출발 물질을 76.6 g/ℓ로 농축시키고, 이어서 35 mM 히스티딘, pH 5.26 완충액으로 투석여과하였다. 투석여과의 플럭스(flux)는 300 LMH(리터/㎡/시간)의 공급 유량 및 22 psi의 TMP에서 17 LMH였다. 이어서 물질을 추가로 213 g/ℓ로 농축시키고(데이터는 제시되지 않음), 투석여과된 푸울 및 최종 농축된 물질 둘 다의 샘플을 히스티딘 및 트레할로스 농도에 대해 분석하였다(표 1 참조).

두 번째 실험을 수행하여, 트레할로스를 함유하는 투석여과된 물질이 투석여과 완충액중 트레할로스가 없는 물질에 비해 더 낮은 최종 농도를 산출하는지의 여부를 결정하였다. 출발 물질을 114 g/ℓ로 농축시키고 35 mM 히스티딘, pH 5.26 완충액에 의해 투석여과하였다. 투석여과 플럭스는 표 2, 실험 2A에 기재된 작동 조건하에 10 LMH였다. 투석여과된 용액을 55 psi 미만의 공급 압력 및 22 psi의 TMP에서 184.9 g/ℓ로 농축시켰다. 농축된 물질을 저장소로부터 따라내고 35 mM 히스티딘, pH 5.26 세정 용액과 합쳐서 153.7 g/ℓ의 농도를 달성하였다. 푸울을 4x 트레할로스 부형제 완충액(30 mM의 히스티딘, 400 g/ℓ의 트레할로스, pH 5.4)으로 스파이크 처리하여 114 g/ℓ의 최종 단백질 농도를 달성하였다. 이어서 스파이크 처리된 용액을 표 2, 실험 2B에 기재된 작동 조건하에 202.4 g/ℓ로 농축시켰다. 펌프 한계로 인해 농축 단계를 15 LMH의 공급 유량에서 중단하였다.

표 1은 모든 농축된 샘플중 히스티딘 및 트레할로스 농도는 둘 다 최종 목표 세부기준인 20 mM의 히스티딘 및 84 g/ℓ의 트레할로스의 10% 이내였음을 보여준다.

이러한 정보는 75 내지 114 g/ℓ의 투석여과 농도의 허용가능한 작동 범위를 제공한다(이 범위 내에서 최종 부형제 농도가 농도 세부기준을 충족시킴).

[표 1]

초기 평가 부형제 농도 결과

[표 2]

초기 평가 공정 데이터

농축 2 단계의 종결시 단백질 농도의 함수로서의 히스티딘 및 트레할로스 농도의 변화를 평가하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. 출발 물질을 105.9 g/ℓ로 농축시키고, 200 ㎠ 사르토콘(등록상표) E-채널 막을 사용하여 35 mM 히스티딘, pH 5.29 완충액에 의해 투석여과하였다. 투석여과의 플럭스는 300 LMH의 공급 유량 및 22 psi의 TMP에서 12 LMH였다. 이어서 투석여과된 물질을 4x 트레할로스 부형제 용액에 의해 스파이크 처리하였다. 스파이크 용액을 직접 저장소에 첨가하고 15 분 동안 혼합한 다음, 물질을 172, 188 및 209 g/ℓ의 최종 농도로 농축시켰다(표 3 참조). 표 4에 제시된 바와 같이, 히스티딘 농도는 단백질 농도가 증가함에 따라 감소하였지만, 모든 값은 20 mM의 히스티딘 및 84 g/ℓ의 트레할로스 목표 농도의 10% 이내에 속하였다.

[표 3]

추가적 개발 공정 데이터

[표 4]

추가적 개발 부형제 농도 결과

방법을 500 ℓ 파일럿(pilot) 규모[로트(Lot) 12P126J603-MV-B]로 확대시켰다: 공정 세부사항을 위해 표 5를 참조한다. 517 g의 캡토 어드히어(Capto Adhere: 등록상표) 정제된 물질을 0.5 ㎡ 밀리포어(Millipore: 등록상표) V-스크린 막에 의해 107 g/ℓ로 농축시키고, 이어서 35 mM 히스티딘, pH 5.29 완충액에 의해 1000 LMH의 공급 유량 및 40 psi의 공급 압력하에 투석여과하였다. 이어서 투석유물을 4x 트레할로스 용액(30 mM 히스티딘, 400 g/ℓ 트레할로스, pH 5.22)으로 스파이크 처리하였고, 이를 시스템 유지 부피로 고려하여 저장소내로 직접 첨가하였다. 이어서 스파이크 처리된 물질을 202 g/ℓ로 농축시키고, 농축된 생성물을 시스템으로부터 제거하였다. 스키드(skid)를 20 mM 히스티딘, 84 g/ℓ 트레할로스, pH 5.50 완충액에 의해 세정하고, 세정액을 농축된 물질에 첨가하였다. 합쳐진 최종 용액의 측정된 농도는 160 g/ℓ였고, 전체 수율은 97.1 %였다.

표 6은 실험에 대한 부형제 농도 및 생성물 품질 결과를 요약하고, 이는 합쳐진 최종 푸울 수준이 종래의 최종 UF 값과 비교될 경우 SEC에 의해 측정된 생성물 품질에 어떠한 유의적인 영향도 주지 않으면서 전술된 목표 농도의 10% 이내에 속하였음을 보여준다.

[표 5]

파일럿 규모 공정 데이터

[표 6]

파일럿 규모 부형제 및 생성물 품질 결과

투석여과 공정의 평가

상이한 농도에서의 단백질 밀도 및 점도

도 1은 (i) 20 mM 히스티딘, pH 5.5 및 (ii) 20 mM 히스티딘, 84 g/ℓ 트레할로스, pH 5.5중 보코시추맙의 점도 대 생성물 농도를 도시한다. 그래프는 약 175 g/ℓ에서 점도가 30 cP 값에 도달함을 보여주는데, 이는 큰 규모에서 실행가능한 UFDF 프로세싱을 위한 컷오프(cutoff)로 고려된다.

(i) 20 mM 히스티딘, pH 5.5 및 (ii) 20 mM 히스티딘, 84 g/ℓ 트레할로스, pH 5.5 용액중 보코시추맙의 밀도를 측정하였고, 이는 도 2 및 도 3에 제시된다. 데이터로부터, 밀도가 히스티딘/트레할로스 완충액에서와 비교하여 히스티딘 완충액에서 약간 더 낮음을 알 수 있고, 이는 예상된 바와 같다.

상기 실험에 기초하여, 약물 물질중의 목표 농도가 트레할로스 부재의 히스티딘 함유 DF 완충액에 의해 제작 규모로 달성될 수 있음이 밝혀졌다.

실험 결과로부터, 본 발명의 방법이 허용가능한 수율, 단백질 및 부형제 최종 농도를 산출할 뿐만 아니라, 종래의 방법과 비교하여 부형제 스파이크 이전에 더 낮은 단백질 농도를 필요로 함을 알 수 있었다(158 g/ℓ 대 188 g/ℓ). 이러한 더 낮은 단백질 농도는 공정이 규모 확대되는 경우 정기적 기반으로 달성하기가 더 쉽다. 또한, 본 발명의 방법은 투석여과 완충액으로부터 트레할로스를 제거함으로써 달성되는 더 우수한 제조 원가로 인해 종래의 방법에 비해 유리하다.

밀리포어(등록상표) V-스크린 막의 대안으로서 밀리포어(등록상표) C-스크린 막을 이용하는 UFDF 공정이 175 g/ℓ를 초과하는 농도를 지속적으로 산출함을 밝혀내었고, 이 농도는 20x 부형제 스파이크 이전에 요구되는 158 g/ℓ 이상을 여전히 유지하면서 세척 푸울(세정액)의 첨가를 허용하기에 충분하다. 공정이 트레할로스 스파이크에 의해 작동됨을 확보하기 위해, C-스크린 막을 이용한 공정을 실험실 규모 및 파일럿 규모 둘 다에서 평가하였다.

밀리포어(등록상표) PLCTK C-스크린 카세트(cassette)를 사용하여, 표 7에 개략화된 한외여과(UF) 운행 조건에 의해 실험실 규모에서 공정을 평가하였다.

횡류 여과(TFF: Tangential flow Filtration) 장비의 경우, 작동 한계로서의 약 50 내지 55 psi의 달성가능한 압력 한계에서 30 내지 300 LMH의 공급 유량 범위를 사용하여 실험실 규모 공정을 수행하였다. 300 LMH의 상위 공급 유량(여기서 대부분의 공정이 발생됨)은 공정 시간에 주요 영향을 미치고, 이때 감소된 공급물 유동에 의해 공정 플럭스가 더 낮아져서, 공정 펌프 시간을 증가시킨다. 30 LMH의 더 낮은 공급 유량은, 증가된 점도가 투석유물 채널을 통한 압력 강하를 증가시키고 이에 따라 더 낮은 유량이 더 점성이 높은 용액을 펌핑할 수 있기 때문에, 달성가능한 최종 농도에 있어서 중요하다.

약 84 g/ℓ의 트레할로스의 존재하에 실험실 규모 공정을 운행하는 동안, 177 g/ℓ의 최종 농도가 30 LMH의 공급 유량 및 50 psi의 공급 압력에 의해 최종 투석유물 푸울에서 달성되었다. 실험실 규모 운행으로부터의 세척 분별물을 표 8에 나타낸 바와 같이 수율에 대해 별도로 측정하였다.

[표 7]

실험실 규모 운행 조건

[표 8]

실험실 규모 개발 실험의 결과

실험실 규모 공정 플럭스 프로파일을 도 4에서 볼 수 있고, 여기서 수직 선은 개방 투석유물(0 psi)에 의해 공급 압력을 약 50 psi 미만으로 유지시키도록 공급 유량을 감소시키는 출발 지점을 지시하고, 이때 공정 플럭스의 감소는 직교류 속도의 감소에 의해 발생된다. 도 5는 최종 농축 동안의 공급 유량 및 공정 공급 채널 압력 강하를 보여준다. 실험실 규모 시스템에서, 공급 압력이 약 50 psi에 접근할 경우 공급 펌프 속도를 감소시킴으로써 유동을 수동으로 조정한다.

파일럿 규모 확인 배치(batch)

C-스크린 막을 갖는 UFDF 공정을 500 ℓ 규모에서 수행하여 최종 농축 목표가 달성될 수 있음을 확인하였다. 공정은 표 9에 제시되고, 파일럿 설비에서 수행된 3개 로트(lot)에 대한 공정 데이터는 표 10에 제시된다. 결과로부터, 공정이 높은 회수율을 달성하였고 농도가 중간 목표 및 최종 목표를 충족시켰음을 알 수 있다. 또한, 로트 13P120J604의 경우 부형제 농도는 21.2 mM의 히스티딘, 85.4 g/ℓ의 트레할로스, 및 0.051 g/ℓ의 EDTA에서 측정되었고, 이는 목표 세부기준의 ± 15% 이내에 속한다.

[표 9]

파일럿 규모 제작을 위한 UFDF 공정 매개변수

[표 10a]

3개의 파일럿 규모 배치에 대한 UFDF 공정 데이터

[표 10b]

A.3 결론

상기-기재된 실험은 92 내지 99%의 단계 수율을 입증하는 한편, 약물 물질 목표를 달성할 수 있었다.

본 실시예는 본 발명에 따른 UFDF 방법이 허용가능한 범위의 pH 및 모든 부형제 농도를 사용하여 매우 농축된(150 g/ℓ) 보코시추맙 약물 물질을 제조하는데 적합함을 입증한다. 이는 동일한 이점을 갖고 다른 단백질에 의해, 특히 특별히 높은 점도를 갖는 단백질에 의해 달성될 수 있다.

B - 실시예 2

예시적인 실시예 2에서, 흥미로운 단백질은 항체 C1GM, 즉 IL-7R에 특이적으로 결합하는 IL-7R 길항물질 단일클론 항체이다. 본 방법은 약물 물질중 120 g/ℓ의 생성물 목표 농도를 달성하도록 고안되었고, 약물 물질은 하기 부형제를 pH 7.0에서 포함한다:

- 20 mM 농도의 히스티딘,

- 100 mM 농도의 아르기닌,

- 50 g/ℓ의 농도의 수크로스,

- 0.02 g/ℓ의 농도의 PS80(폴리소르베이트 80), 및

- 0.5 g/ℓ의 농도의 EDTA.

단백질 농도에서 ± 10 g/ℓ의 허용 오차, 부형제 농도에서 ± 15%의 허용 오차 및 pH 값에서 ± 0.5의 오차 허용을 갖고 상기 요건들이 달성되어야 허용가능한 것으로 여겨진다.

수율에 있어서, 본 방법은 85% 이상의 생성물 회수를 달성할 필요가 있다.

하기 기재된 실험에 사용되는 출발 물질은 맙셀렉트(등록상표) 및 Q 막 크로마토그래피를 통해 처리되어진 완전히 정제된 용액이었다.

한외여과/투석여과 장치

펠리콘(등록상표) 3(30 KDa, C-스크린, 88 ㎠) 재생 셀룰로스 막이 구비된 쿼트로플로우(Quattroflow: 상표명) 펌프 시스템 또는 GE 크로스플로우(Crossflow: 등록상표) 시스템(300 ㎖ 저장소)을 사용하여 모든 실험을 수행하였다. 막간차압(TMP)을 55 psi 미만의 공급 압력에 의해 약 14 내지 22 psi로 유지시켰다. 달리 지정되지 않는 다면, 15 분 초과 동안 세정 완충액을 재순환시킴으로써 모든 세정을 발생시키고, 이후 시스템의 최소 작업량으로 농축시켰다.

분석적 검정

써모 사이언티픽 나노드롭(Thermo Scientific Nanodrop) 2000C(상표명), 또는 솔로(Solo) VPE(상표명)[씨 테크놀로지스 인코포레이티드(C Technologies Inc)로부터]를 사용하여, 단백질 농도를 측정하기 위해 UV-가시광선 분광광도법을 수행하였다. 280 nm에서의 흡광 계수는, ARD에 의해 실험적으로 결정할 경우, 1.51 ㎖*mg^-1*cm^-1였다.

실험

실험 1

표 11에 상세화된 바와 같이, 출발 물질을 5%의 2 M NaCl에 의해 스파이크 처리하고 2 M 트리스 염기에 의해 pH 7.0으로 조정하고, 50 g/ℓ로 농축하고, 22 mM 히스티딘, 110 mM 아르기닌 pH 7.0에 의해 투석여과하고, 5x 수크로스 완충액(22 mM 히스티딘, 110 mM 아르기닌, 275 g/ℓ 수크로스 pH 7.0)에 의해 스파이크 처리하고, 약 34 LMH의 공급 유량에서 146.9 g/ℓ로 농축시켰다. 농축된 용액의 pH는 7.00이었다. UF 시스템을 단일 통과 방식으로(재순환 없이) 투석여과 용액에 의해 수세하여, 33 g/ℓ의 농도를 산출하였다. 전체 수율은 약 88%였다.

[표 11]

아르기닌 완충액 pH 7.0에 의한 투석여과 및 농축

표 12 내지 14는 부형제, CGE 및 SEC 검정 결과를 보여준다. 최종 농축된 물질중 히스티딘, 아르기닌, 및 수크로스 농도는 모두 원하는 값의 ± 10% 이내에 속하였다. UF 공정 동안 새로운 응집이 형성되지 않았고, 단편화(fragmentation) 수준에서도 전혀 변화가 없었다.

[표 12]

아르기닌 완충액 pH 7.0에 대한 공정 부형제 농도

[표 13]

아르기닌 완충액 pH 7.0 실험에 대한 nrCGE 및 rCGE 결과

[표 14]

아르기닌 완충액 pH 7.0 실험에 대한 SEC 결과

실험 2

본 실험을 표 15에 상세화된 바와 같이 반복하였고, 유일한 차이는 스파이크 부피가 계산되는 방식이었다. 스파이크 이전에 UF 시스템에서의 총 부피를 저장소 중 부피 + 시스템 유지 부피에 대한 전체 물질 균형(투석여과 농도에 의해 나눠진 총 적재량)으로부터 계산하였다. 5x 수크로스 스파이크 이후, 단백질을 약 34 LMH의 공급 유량 및 50 psi 미만의 공급 압력에서 183.6 g/ℓ로 농축시켰다.

[표 15]

pH 7.0에서 아르기닌 완충액에 의한 투석여과 및 농축

표 16은 최종 물질중 부형제 농도, 히스티딘, 아르기닌 및 수크로스 농도가 원하는 목표 값의 ± 10% 이내에 속하였음을 보여준다. 스파이크 부피가 계산되는 방식에서의 차이는 최종 부형제 농도에 유의적인 영향을 주는 것으로 보이지 않았다.

[표 16]

아르기닌 pH 7.0 완충액에 대한 부형제 농도

실험 3

최종 제형이 정해진 후 실험을 3회 반복하였고, 결과는 표에 상세화되어 있다. 투석여과 이후, 5x 스파이크 용액의 첨가 부피를 실험 2에 개략화된 바와 같이 계산하였다. 단백질을 약 34 LMH의 공급 유량 및 50 psi 미만의 공급 압력에서 190 g/ℓ로 농축시켰다. UF 시스템을 단일 통과 방식으로 20 mM 히스티딘, 100 mM 아르기닌, 50 g/ℓ 수크로스, pH 7.0에 의해 세정하였다. 합쳐진 투석유물 및 세정 푸울중 단백질 농도는 151 g/ℓ였고, 약 84%의 전체 수율을 산출하였다.

[표 17]

pH 7.0에서 아르기닌 완충액에 의한 투석여과 및 농축

표 18은 부형제 농도를 요약하고, 히스티딘, 아르기닌 및 수크로스 농도가 모두 원하는 값의 ± 10% 이내에 속하였음을 보여준다. 표 19 및 표 20은 UFDF 공정 동안 추가적인 응집 또는 단편화가 형성되지 않음을 나타낸다.

[표 18]

아르기닌 pH 7.0 완충액에 대한 부형제 농도

[표 19]

아르기닌 pH 7.0 완충액에 대한 nrCGE 및 rCGE 결과

[표 20]

아르기닌 pH 7.0 완충액에 대한 SEC 결과

상기 실험 3에서 수행된 바와 같은 공정은 부형제 및 흥미로운 단백질 모두에 대해 허용가능한 농도 값을 산출하였고, 응집 또는 단편화의 형성에 영향을 주는 것으로 보이지 않았다. 이러한 공정은 파일럿 규모로 확대되어 예상되는 바와 같이 수행할 것을 보장한다.

파일럿 규모 UFDF 공정

상기 개발된 UF 공정(실험 3)을, 밀리포어(등록상표) C-스크린 재생 셀룰로스 막, 및 500 ℓ 규모의 생물반응기로부터 정제된 물질을 사용하여 파일럿 플랜트(Pilot Plant)에서 시험하였다.

표 21에 상세화된 단위 작동 동안, 2.92 g/ℓ의 출발 생성물 농도에서 86 ℓ의 출발 물질을 5%의 2 M NaCl에 의해 스파이크 처리하고, 이후 44.6 g/ℓ로 농축시켰다. 이어서 물질을 22 mM 히스티딘, 110 mM 아르기닌, pH 7.0에 의해 약 150 LMH의 공급 유량 및 40 psi 미만의 공급 압력에서 투석여과하였다. 8 TOV 투석여과 이후, 투석유물을 22 mM 히스티딘, 110 mM 아르기닌, 275 g/ℓ 수크로스 pH 7.0에 의해 스파이크 처리하고, 10 분 동안 재순환시킨 후, 191.4 g/ℓ로 농축시켰다. 농축 공정을 30 LMH의 투과물 유동 속도 및 50 psi 미만의 공급 압력에서 중단시켰다. 이어서 스키드를 단일 통과 방식으로 20 mM 히스티딘, 100 mm 히스티딘, 50 g/ℓ 수크로스, pH 7.0으로 세정하였다. 전체 수율은 약 87%였다. 전체 UF 공정은 완료하는데 약 5 시간이 걸렸다.

투석유물 푸울, 세정 푸울, 및 추가적인 세정 완충액을 혼합함으로써 135.4 g/ℓ의 농도의 UF 푸울을 생성하였다. 푸울을 밀리포어(등록상표) 05/0.2 um 옵티캡 익스프레스(Opticap Express) SHC를 통해 59 ℓ/㎡의 투과량으로 여과시켰다. 20x EDTA 및 PS80 부형제 완충액을 UF 푸울내로 스파이크 처리하여 129.4 g/ℓ의 최종 농도로 약물 물질을 생산하였다.

[표 21]

파일럿 규모 UF 공정 데이터

부형제 농도는 표 22에 요약되어 있고, 이는 최종 푸울중 히스티딘, 아르기닌, 및 수크로스 농도가 목표 값의 ± 15% 이내에 속하였음을 보여준다. 실험실 규모의 공정 진행 동안 목표 범위는 모든 부형제 농도에 대한 목표 값의 ± 10%로 설정되었지만, 대규모에서 허용 범위는 규모 확대 동안의 관용도(latitude)를 위해 ± 15%로 설정되었다.

표 23 및 표 24는 운행으로부터의 생성물 품질 결과를 요약하고, 이는 응집 또는 단편화의 증가가 검출되지 않았음을 보여준다.

[표 22]

파일럿 규모 운행 부형제 농도 결과

[표 23]

파일럿 규모 운행 SEC 결과

[표 24]

파일럿 규모 운행 nrCGE 결과

결론

결론적으로, 상기 기재된 실험은 흥미로운 항-IL-7R 항체에 대하여 120 ㎎/㎖ 초과의 약물 물질을 위한 UFDF 공정의 성공적인 공정 개발을 입증하였다. UFDF 공정은 초기 농축, 투석여과, 최종 농축 이전의 수크로스 스파이크, 이어서 잔여 부형제에 의한 스파이크를 포함한다. 개발된 공정에서 pH 및 모든 부형제 농도는 허용가능한 범위내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> PFIZER INC. <120> Method Of Preparing A Therapeutic Protein Formulation And Antibody Formulation Produced By Such A Method <130> PC72213A <140> PCT/IB2016/055355 <141> 2016-09-08 <150> US 62/222,067 <151> 2015-09-22 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Ser Pro Phe Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Pro Leu Tyr Ala Ser Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Asp Ile 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<210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Ile Ser Pro Phe Gly Gly Arg 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Glu Arg Pro Leu Tyr Ala Ser Asp Leu 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Gln Gln Arg Tyr Ser Leu Trp Arg Thr 1 5 <210> 12 <211> 692 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu 20 25 30 Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu 35 40 45 Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe 50 55 60 His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg 85 90 95 Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu 100 105 110 His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly 115 120 125 Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu 130 135 140 Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg 145 150 155 160 Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp 180 185 190 His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val 195 200 205 Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp 210 215 220 Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly 225 230 235 240 Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln 245 250 255 Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg 260 265 270 Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro 275 280 285 Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu 290 295 300 Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp 305 310 315 320 Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val 325 330 335 Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly 340 345 350 Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile 355 360 365 Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly 370 375 380 Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu 385 390 395 400 Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile 405 410 415 His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp 420 425 430 Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr 435 440 445 His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His 450 455 460 Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp 465 470 475 480 Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg 485 490 495 Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His 500 505 510 Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu 515 520 525 Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala 530 535 540 Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr 545 550 555 560 Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro 565 570 575 Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg 580 585 590 Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys 595 600 605 Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val 610 615 620 Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly 625 630 635 640 Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val 645 650 655 Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val 660 665 670 Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser 675 680 685 Gln Glu Leu Gln 690 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Val Gly Trp Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Gly Asp Tyr Met Gly Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Phe 85 90 95 His His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 15 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Val Gly Trp Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Gly Asp Tyr Met Gly Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 210 215 220 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 225 230 235 240 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 245 250 255 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 260 265 270 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 275 280 285 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 290 295 300 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 305 310 315 320 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 325 330 335 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 340 345 350 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 355 360 365 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 370 375 380 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 385 390 395 400 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 405 410 415 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 425 430 <210> 16 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Phe 85 90 95 His His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln Pro 100 105 110 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 115 120 125 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 130 135 140 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 145 150 155 160 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 165 170 175 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 180 185 190 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 195 200 205 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Asp Ser Val Met His 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Leu Val Gly Trp Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Gln Gly Asp Tyr Met Gly Asn Asn 1 5 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Tyr Val Gln 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Gln Ser Tyr Asp Phe His His Leu Val 1 5

Claims

(a) 1종 이상의 치료학적 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;
(b) 용액중의 단백질을 제1 한외여과 단계에 의해 농축시키는 단계;
(c) 수득된 용액을, 1종 이상의 제1 부형제를 포함하는 투석여과 완충액에 의해 투석여과하여, 상기 단백질 및 제1 부형제를 포함하는 투석유물을 수득하는 단계;
(d) 투석여과 단계로부터 수득된 투석유물에 제2 부형제를 첨가하는 단계;
(e) 상기 투석유물중의 단백질을 제2 한외여과 단계에 의해 한외여과 장비에서 추가로 농축시키는 단계; 및
(f) 1종 이상의 최종 부형제를 첨가하여, 원하는 단백질 농도를 갖고 상기 제1 및 최종 부형제를 포함하는 단백질 제형을 수득하는 단계
를 순차적으로 포함하는, 부형제 및 1종 이상의 치료학적 단백질을 포함하는 단백질 제형의 제조 방법.
제1항에 있어서,
단계 (e) 이후 및 단계 (f) 이전에, 한외여과 장비를 세정 완충액으로 세정하는 단계를 추가로 포함하여, 단백질의 회수를 향상시키는 제조 방법.
제2항에 있어서,
세정 완충액이 제1 부형제 및 제2 부형제를 각각 단백질 제형중 제1 부형제 및 제2 부형제의 농도와 실질적으로 동일한 농도로 포함하는, 제조 방법.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
제1 부형제가 아미노산, 바람직하게는 히스티딘인, 제조 방법.
제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
단백질 제형중 제1 부형제가 16 내지 24 mM, 바람직하게는 17 내지 23 mM, 가장 바람직하게는 약 20 mM의 농도를 갖는, 제조 방법.
제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
제2 부형제가 당, 바람직하게는 이당류인, 제조 방법.
제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
최종 부형제가 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트 80을 포함하는, 제조 방법.
제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
최종 부형제가 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 포함하는, 제조 방법.
제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서,
단백질 제형이 110 내지 165 g/ℓ의 단백질 농도를 갖는, 제조 방법.
제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서,
단백질이 항체인, 제조 방법.
제10항에 있어서,
항체가 항-PCSK9[전구단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 타입 9(Proprotein Convertase Subtilisin Kexin type 9)] 항체인, 제조 방법.
제11항에 있어서,
항-PCSK9 항체가 보코시추맙(bococizumab), 에볼로쿠맙(evolocumab)[레파타(REPATHA: 상표명)], 알리로쿠맙(alirocumab)[프랄루언트(PRALUENT: 상표명)], REGN728, 31H4, 11F1, 12H11, 8A1, 8A3, 3C4, 300N, 1D05, LGT209, RG7652 및 LY3015014로 구성된 군에서 선택되는, 제조 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서,
항-PCSK9 항체가 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변성 영역(VH); 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변성 영역(VL)을 포함하는, 제조 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서,
항-PCSK9 항체가 서열번호 3, 4 또는 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열번호 6 또는 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는, 제조 방법.
제11항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서,
단백질 제형이 135 내지 165 g/ℓ, 바람직하게는 142 내지 158 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 150 g/ℓ의 단백질 농도를 갖는, 제조 방법.
제11항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서,
단백질 제형중 제2 부형제가 67.2 내지 100.8 g/ℓ, 바람직하게는 71.4 내지 96.6 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 84 g/ℓ의 농도의 트레할로스인, 제조 방법.
제11항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서,
최종 부형제가, 단백질 제형중 0.16 내지 0.24 g/ℓ, 바람직하게는 0.17 내지 0.23 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 0.2 g/ℓ의 농도를 갖는 폴리소르베이트 80을 포함하는, 제조 방법.
제11항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서,
최종 부형제가, 단백질 제형중 0.04 내지 0.06 g/ℓ, 바람직하게는 0.0425 내지 0.0575 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 0.05 g/ℓ의 농도를 갖는 EDTA를 포함하는, 제조 방법.
제11항 내지 제18항중 어느 한 항에 있어서,
단백질 제형이 5.2 내지 5.8, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는, 제조 방법.
제11항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서,
단계 (a)에서 제공된 용액이 5 내지 20 g/ℓ의 단백질 농도를 갖는, 제조 방법.
제11항 내지 제20항중 어느 한 항에 있어서,
단백질이 80 내지 120 g/ℓ, 바람직하게는 90 내지 110 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 100 g/ℓ로 제1 한외여과 단계에 의해 농축되는, 제조 방법.
제11항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서,
단백질이 143 내지 173 g/ℓ, 바람직하게는 150 내지 166 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 158 g/ℓ로 제2 한외여과 단계에 의해 농축되는, 제조 방법.
제11항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서,
투석여과 완충액중 제1 부형제가 단백질 제형중 제1 부형제의 농도에 비해 더 높은 농도를 갖고, 투석여과 완충액중 제1 부형제의 상기 농도가 바람직하게는 29.75 내지 40.25 mM, 가장 바람직하게는 약 35 mM인, 제조 방법.
제11항 내지 제23항중 어느 한 항에 있어서,
투석여과 완충액이 5.1 내지 5.5, 바람직하게는 약 5.3의 pH를 갖는, 제조 방법.
제11항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서,
제2 부형제를 투석여과 단계로부터 수득된 투석유물에 첨가하는 단계가 제1 첨가제 용액을 투석유물에 첨가함으로써 달성되고, 상기 제1 첨가제 용액이 제2 부형제를 340 내지 460 g/ℓ, 바람직하게는 380 내지 420 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 400 g/ℓ의 농도로 포함하는, 제조 방법.
제25항에 있어서,
제1 첨가제 용액이 투석여과 완충액중 제1 부형제의 농도에 비해 더 낮고 단백질 제형중 제1 부형제의 농도에 비해 더 높은 농도로 제1 부형제를 포함하고, 제1 첨가제 용액중 제1 부형제의 상기 농도가 바람직하게는 25.5 내지 34.5 mM, 가장 바람직하게는 약 30 mM인, 제조 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서,
제1 첨가제 용액이 최종 부형제를 추가로 포함하는, 제조 방법.
제27항에 있어서,
제1 첨가제 용액이 약 30 mM의 히스티딘 및 약 400 g/ℓ의 트레할로스를 포함하는, 제조 방법.
제25항 내지 제28항중 어느 한 항에 있어서,
제1 첨가제 용액을 투석유물에 첨가하는 단계가, 1 부피의 제1 첨가제 용액이 동일한 부피의 약 3.15 배의 투석유물에 첨가되는 약 4.15의 희석 비로 수행되는, 제조 방법.
제25항 내지 제29항중 어느 한 항에 있어서,
최종 부형제를 첨가하는 단계가 제2 첨가제 용액을 제2 한외여과 단계로부터 수득된 용액에 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 제2 첨가제 용액이 제1 첨가제 용액중 제2 부형제의 농도에 비해 더 낮고 단백질 제형중 제2 부형제의 농도에 비해 더 높은 농도로 제2 부형제를 포함하는, 제조 방법.
제30항에 있어서,
제2 첨가제 용액이 단백질 제형중 제1 부형제의 농도와 실질적으로 동일한 농도로 제1 부형제를 포함하는, 제조 방법.
제31항에 있어서,
제2 첨가제 용액이 약 20 mM의 히스티딘, 약 84 g/ℓ의 트레할로스, 약 1 g/ℓ의 EDTA 및 약 4 g/ℓ의 폴리소르베이트 80을 포함하는, 제조 방법.
제30항 내지 제32항중 어느 한 항에 있어서,
제2 첨가제 용액을 첨가하는 단계가, 1 부피의 제2 첨가제 용액이 동일한 부피의 약 19 배의 제2 한외여과 단계로부터 수득된 용액에 첨가되는 약 20의 희석 비로 수행되는, 제조 방법.
제10항에 있어서,
항체가 항-IL-7R 항체인, 제조 방법.
제10항에 있어서,
항체가 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 갖는, 제조 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서,
단백질 제형이 110 내지 130 g/ℓ, 바람직하게는 약 120 g/ℓ의 단백질 농도를 갖는, 제조 방법.
제34항 내지 제36항중 어느 한 항에 있어서,
단백질 제형중 제2 부형제가 42 내지 58 g/ℓ, 바람직하게는 약 50 g/ℓ의 농도의 수크로스인, 제조 방법.
제34항 내지 제37항중 어느 한 항에 있어서,
최종 부형제가, 단백질 제형중 0.017 내지 0.023 g/ℓ, 바람직하게는 약 0.02 g/ℓ의 농도를 갖는 폴리소르베이트 80을 포함하는, 제조 방법.
제34항 내지 제38항중 어느 한 항에 있어서,
최종 부형제가, 단백질 제형중 0.42 내지 0.58 g/ℓ, 바람직하게는 약 0.5 g/ℓ의 농도를 갖는 EDTA를 포함하는, 제조 방법.
제34항 내지 제39항중 어느 한 항에 있어서,
최종 부형제가, 단백질 제형중 85 내지 115 mM, 바람직하게는 약 100 mM의 농도를 갖는 아르기닌을 포함하는, 제조 방법.
제34항 내지 제40항중 어느 한 항에 있어서,
단백질 제형이 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 약 7.0의 pH를 갖는, 제조 방법.
제34항 내지 제41항중 어느 한 항에 있어서,
단계 (a)에 제공된 용액이 2.6 내지 3.4 g/ℓ, 바람직하게는 약 3 g/ℓ의 단백질 농도를 갖는, 제조 방법.
제34항 내지 제42항중 어느 한 항에 있어서,
단백질이 36 내지 54 g/ℓ, 바람직하게는 40 내지 50 g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 45 g/ℓ로 제1 한외여과 단계에 의해 농축되는, 제조 방법.
제34항 내지 제43항중 어느 한 항에 있어서,
단백질이 170 내지 210 g/ℓ, 바람직하게는 약 190 g/ℓ로 제2 한외여과 단계에 의해 농축되는, 제조 방법.
제34항 내지 제44항중 어느 한 항에 있어서,
투석여과 완충액중 제1 부형제가 단백질 제형중 제1 부형제의 농도에 비해 더 높은 농도를 갖고, 투석여과 완충액중 제1 부형제의 상기 농도가 바람직하게는 19 내지 25 mM, 가장 바람직하게는 약 22 mM인, 제조 방법.
제34항 내지 제45항중 어느 한 항에 있어서,
투석여과 완충액이 아르기닌을 95 내지 125 mM, 바람직하게는 약 110 mM의 농도로 포함하는, 제조 방법.
제34항 내지 제46항중 어느 한 항에 있어서,
투석여과 완충액이 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 약 7.0의 pH를 갖는, 제조 방법.
제34항 내지 제47항중 어느 한 항에 있어서,
제2 부형제를 투석여과 단계로부터 수득된 투석유물에 첨가하는 단계가 제1 첨가제 용액을 투석유물에 첨가함으로써 달성되고, 상기 제1 첨가제 용액이 제2 부형제를 230 내지 320 g/ℓ, 바람직하게는 약 275 g/ℓ의 농도로 포함하는, 제조 방법.
제48항에 있어서,
제1 첨가제 용액이 투석여과 완충액중 제1 부형제의 농도와 실질적으로 동일하고 단백질 제형중 제1 부형제의 농도에 비해 더 높은 농도로 제1 부형제를 포함하고, 제1 첨가제 용액중 제1 부형제의 상기 농도가 바람직하게는 19 내지 25 mM, 가장 바람직하게는 약 22 mM인, 제조 방법.
제48항 또는 제49항에 있어서,
제1 첨가제 용액이 최종 부형제를 추가로 포함하는, 제조 방법.
제50항에 있어서,
제1 첨가제 용액이 약 22 mM의 히스티딘, 110 mM의 아르기닌 및 약 275 g/ℓ의 수크로스를 약 7.0의 pH에서 포함하는, 제조 방법.
제34항 내지 제51항중 어느 한 항에 있어서,
제1 첨가제 용액을 투석유물에 첨가하는 단계가, 1 부피의 제1 첨가제 용액이 동일한 부피의 약 4 배의 투석유물에 첨가되는 약 5의 희석 비로 수행되는, 제조 방법.
제34항 내지 제52항중 어느 한 항에 있어서,
최종 부형제를 첨가하는 단계가 제2 첨가제 용액을 제2 한외여과 단계로부터 수득된 용액에 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 제2 첨가제 용액이 EDTA 및 폴리소르베이트 80을 포함하는, 제조 방법.
제53항에 있어서,
제2 첨가제 용액을 첨가하는 단계가, 1 부피의 제2 첨가제 용액이 동일한 부피의 약 19 배의 제2 한외여과 단계로부터 수득된 용액에 첨가되는 약 20의 희석 비로 수행되는, 제조 방법.
제1항 내지 제54항중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 생산된 높은 점도를 갖는 항체 제형.
단백질 제형이
135 내지 165 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 150 ㎎/㎖의 항-PCSK9 항체;
16 내지 24 mM, 바람직하게는 약 20 mM의 히스티딘;
67.2 내지 100.8 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 84 ㎎/㎖의 트레할로스; 및
0.16 내지 0.24 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 0.2 ㎎/㎖의 폴리소르베이트
를 포함하고, 5.2 내지 5.8, 바람직하게는 약 5.5의 pH를 갖는,
제11항 내지 제33항중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 생산된 높은 점도를 갖는 항체 제형.
단백질 제형이
110 내지 130 g/ℓ, 바람직하게는 약 120 g/ℓ의 항-IL-7R 항체;
17 내지 23 mM, 바람직하게는 약 20 mM의 히스티딘;
42 내지 58 g/ℓ, 바람직하게는 약 50 g/ℓ의 수크로스; 및
0.017 내지 0.023 g/ℓ, 바람직하게는 약 0.02 g/ℓ의 폴리소르베이트
를 포함하고, 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 약 7.0의 pH를 갖는,
제34항 내지 제54항중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 생산된 높은 점도를 갖는 항체 제형.